CN115850444A - Tcr或其抗原结合片段及其应用 - Google Patents
Tcr或其抗原结合片段及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于T细胞免疫治疗药物技术领域，具体涉及一种T细胞受体(TCR)或其抗原结合片段及其应用，该TCR包含由如SEQ ID NO:37所示序列。该TCR对KRAS‑G12D突变具有很强的特异性，而且能介导T细胞分泌大量的IFN‑γ或IFN‑α细胞因子并杀死发生KRAS‑G12D基因突变的肿瘤细胞。
Description
技术领域
本发明属于T细胞免疫治疗药物技术领域，具体涉及一种TCR或其抗原结合片段及其应用。
背景技术
随着生物医药领域研究的进展，靶向恶性实体瘤的T细胞免疫治疗的靶点选择在不断演变，从最初的谱系抗原变成了病毒抗原，而随着近年来高通量测序技术的出现，靶向肿瘤个体突变成为了新一代T细胞治疗聚焦的靶点。
T细胞治疗目前主要包括TCR-T和CAR-T治疗手段。目前CAR-T技术治疗在白血病、淋巴病瘤等血液瘤的治疗中起到显著效果，大大提高了患者生存率和生存质量，但是针对实体瘤，CAR-T治疗手段由于目前的特异性靶点有限，大大限制了其应用前景。TCR-T技术不同于CAR-T细胞技术，TCR是所有T细胞表面的特征性标志，以非共价键与CD3结合，形成TCR-CD3复合物。外周血中，90％-95％的T细胞表达TCR，经过基因改造的TCR的T细胞，可以对肿瘤细胞表面上的抗原分子进行特异性识别，进而针对肿瘤细胞产生免疫反应。目前，在人类癌症中，KRAS基因为肿瘤学领域最著名的致癌基因之一，KRAS基因突变(KRAS-G12C突变、KRAS-G12D突变、KRAS-G12V突变等)出现在接近90％的胰腺癌中，30％-40％的结肠癌中，17％的子宫内膜癌中，15％-20％的肺癌包括小叶性肺癌中，以及胆管癌、宫颈癌、膀胱癌等。
通过以上所述情况，现需一种可以与KRAS突变多肽特异性结合，并能介导T细胞对KRAS突变的肿瘤细胞进行杀灭的TCR。
发明内容
本发明目的之一在于提供一种TCR，可以靶向特异性识别KRAS-G12D突变位点，与KRAS-G12D突变的多肽与HLA的复合体特异性结合，从而刺激T细胞活化，介导T细胞分泌IFN-γ等细胞因子，进而杀伤表达KRAS-G12D突变基因的肿瘤细胞。该TCR或其抗原结合片段对KRAS-G12D突变的多肽特异性强，而且能介导T细胞分泌大量的IFN-γ细胞因子，杀灭KRAS-G12D突变的肿瘤细胞。
本发明一方面提供了一种TCR，可以从以下两种TCR进行选择：
第一种：TCR的α链可变区可以包含如SEQ ID NO:3所示序列的α链CDR3，TCR的β链可变区包含如SEQ ID NO:12所示序列的β链CDR3。
第二种：TCR可以包含由如SEQ ID NO:37所示序列得到的片段。
本发明另一方面提供了一种抗原结合片段，可以包含上述两种TCR中的任意一种。
本发明再一方面提供了一种多核苷酸，可以从以下两种多核苷酸进行选择：
第一种：可以包含如SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:30所示序列。
第二种：可以包含如SEQ ID NO:38所示序列。
本发明再一方面提供了一种表达载体，可以包含上述两种多核苷酸中任意一种。
本发明再一方面提供了一种工程细胞，可以包含上述的表达载体。
本发明再一方面提供了一种药物组合物，可以包含上述的TCR或上述的抗原结合片段或上述的多核苷酸或上述的表达载体或上述的工程细胞，和药学上可接受的载体和/或稀释剂。
本发明再一方面提供了一种上述的TCR或上述的抗原结合片段或上述的多核苷酸或上述的表达载体或上述的工程细胞在制备用于提高T细胞分泌IFN-γ和/或TNF-α细胞因子水平药物中的应用。
本发明再一方面提供了一种上述的TCR或上述的抗原结合片段或上述的多核苷酸或上述的表达载体或上述的工程细胞在制备用于检测表达KRAS-G12D突变的肿瘤细胞试剂或试剂盒中的应用。
本发明再一方面提供了一种上述的TCR或上述的抗原结合片段或上述的多核苷酸或上述的表达载体或上述的工程细胞在制备用于治疗携带KRAS-G12D突变导致的疾病的药物中的应用。
本发明有益效果在于：本发明提供的TCR对KRAS-G12D突变多肽有很强的特异性，而且能介导T细胞分泌大量的IFN-γ或IFN-α细胞因子杀死KRAS-G12D突变的肿瘤细胞。
附图说明
图1为实施例中的KT13对KRAS-G12D突变多肽特异性结合流式细胞检测结果图；
图2为实施例中的KT13对不同浓度的KRAS-G12D突变多肽特异性活化结果图；
图3为实施例中的KT13介导T细胞分泌IFN-γ细胞因子情况；
图4为实施例中的KT13介导T细胞分泌IFN-α细胞因子情况；
图5为实施例中的KT1对KRAS-G12D突变细胞杀伤情况。
具体实施方式
本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，并且无意于限制本公开。除非在上下文中具有明显不同的含义，否则单数形式的表达包括复数形式的表达。如本文所使用的，应当理解，诸如“包括”、“具有”、“包含”之类的术语旨在指示特征、数字、操作、组件、零件、元件、材料或组合的存在。在说明书中公开了本发明的术语，并且不旨在排除可能存在或可以添加一个或多个其他特征、数字、操作、组件、部件、元件、材料或其组合的可能性。如在此使用的，根据情况，“/”可以被解释为“和”或“或”。
本发明中，术语“抗原结合片段”是指TCR的抗原结合片段及TCR类似物，其通常包括至少部分母体TCR的抗原结合区或可变区，例如一个或多个CDR。TCR的片段保留母体TCR的至少某些结合特异性。
本发明目的在于提供一种TCR，本发明目的之一在于提供一种TCR，可以靶向特异性识别KRAS-G12D突变位点，与KRAS-G12D突变的多肽与HLA的复合体特异性结合，从而刺激T细胞活化，介导T细胞分泌IFN-γ等细胞因子，进而杀伤表达KRAS-G12D突变的肿瘤细胞。该TCR或其抗原结合片段对KRAS-G12D突变的多肽特异性强，而且能介导T细胞分泌大量的IFN-γ细胞因子。
本发明一方面提供了一种TCR，TCR包含α链可变区和β链可变区，本发明中的TCR可以从以下几种TCR进行选择：
第一种TCR：
第一种TCR中，α链可变区至少包含如SEQ ID NO:3所示序列的α链CDR3，β链可变区至少包含如SEQ ID NO:12所示序列的β链CDR3。
进一步地，第一种TCR中的α链可变区还可以包含：如SEQ ID NO:1所示序列的α链CDR1和/或如SEQ ID NO:2所示序列的α链CDR2；β链可变区还可以包含：如SEQ ID NO:10所示序列的β链CDR1和/或如SEQ ID NO:11所示序列的β链CDR2。
进一步地，第一种TCR中的α链可变区还可以包含：如SEQ ID NO:4所示序列的α链FR1、如SEQ ID NO:5所示序列的α链FR2、如SEQ ID NO:6所示序列的α链FR3和如SEQ ID NO:7所示序列的α链FR4中一种或多种；β链可变区还可以包含：如SEQ ID NO:13所示序列的β链FR1、如SEQ ID NO:14所示序列的β链FR2、如SEQ ID NO:15所示序列的β链FR3和如SEQ IDNO:16所示序列的β链FR4中一种或多种。
具体地，上述TCR的中的α链和β链的CDR3属于可变区的高变区，在TCR识别MHC-抗原肽复合体时，CDR3直接与抗原肽相结合，直接影响TCR对KRAS-G12D突变的识别能力。在TCR的的α链和β链的的高变区中，还包含CDR1和CDR2两个高变区，CDR1和CDR2高变区相对于CDR3比较稳定，在TCR识别MHC-抗原肽复合体时，CDR1和CDR2两个高变区识别和结合MHC分子抗原结合槽的侧壁。
具体地，上述TCR中的FR(FR1、FR2、FR3、FR4)为骨架区，用于连接CDR区，相对稳定。上述第一种TCR中的FR区除了可以分别选择上述的序列之外，还可以分别选择与上述FR1、FR2、FR3和FR4序列同一性≥80％以上的序列，比如≥80％、85％、90％或95％的序列，来源可以是鼠源，也可以是人源(但是不排除其他的来源，比如兔源、猪源等动物源)。在某些具体实施中，上述α链和β链的FR区的序列与CDR区的序列可以按照FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4进行排列，分别构成两种TCR的α链可变区和β链可变区，α链可变区包含如SEQ IDNO:8所示序列，编码β链可变区包含如SEQ ID NO:17所示。
具体地，TCR除了包含上述的α链可变区和β链可变区外，α链还包含α链恒定区，β链还包含β链恒定区，α链恒定区和β链恒定区的来源可以是鼠源，也可以是人源或者人鼠嵌合(但是不排除其他的来源，比如兔源、猪源等动物源)，几乎是不会发生突变的区域。另外，TCR的α链和β链还可以包括信号肽，可以有助于TCR穿膜；信号肽可以为本领域所已知的信号肽。在一些具体实施例中，α链可以包含如SEQ ID NO:9所示序列，β链可以包含如SEQ IDNO:18所示序列。
第二种TCR：
第二种TCR包含如SEQ ID NO:37所示序列。
具体地，第二种TCR中，包含如SEQ ID NO:37所示序列包含第一种TCR中的α链可变区和β链可变区。
具体地，第二种TCR中，TCR序列还可以是与SEQ ID NO:37所示序列同一性≥80％的序列，如同一性≥80％、85％、90％、95％的序列。
具体地，上述TCR中，关于α链或β链的可变区和恒定区的来源，α链可变区或β链可变区来自鼠源、人源(但是不排除其他的来源，比如兔源、猪源等动物源)，α链或β链恒定区来源可以是与α链或β链可变区来源相同，也可以不同。
本发明再一方面提供了一种抗原结合片段，包含上述的两种TCR中任意一种。
本发明再一方面提供了一种多核苷酸，可以从以下几种多核苷酸中进行选择：
第一种多核苷酸：
第一种多核苷酸至少包含如SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:30所示序列。
进一步地，第一种多核苷酸可以还包含如SEQ ID NO:19所示序列、如SEQ ID NO:20所示序列、如SEQ ID NO:22所示序列、如SEQ ID NO:23所示序列、如SEQ ID NO:24所示序列、如SEQ ID NO:25所示序列、如SEQ ID NO:28所示序列、如SEQ ID NO:29所示序列、如SEQID NO:31所示序列、如SEQ ID NO:32所示序列、如SEQ ID NO:33所示序列和如SEQ ID NO:34所示序列中一种或多种。在一些具体实施例中，第一种多核苷酸还可以包含如SEQ IDNO:26所示序列和/或SEQ ID NO:27所示序列；在一些具体实施例中，第一种多核苷酸还可以包含如SEQ ID NO:35所示序列和/或SEQ ID NO:36所示序列；在一些具体实施例中，第一种多核苷酸还可以包含如SEQ ID NO:26所示序列和/或SEQ ID NO:27所示序列和/或如SEQID NO:35所示序列和/或如SEQ ID NO:36所示序列。
第二种多核苷酸：
第二种多核苷酸包含如SEQ ID NO:38所示序列。
具体地，第二种多核苷酸包含第一种多核苷酸的序列，即包含如SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:30所示序列。
具体地，上述的多核苷酸还可以包含其他(除了上述的多核苷酸)任何编码上述任意一种TCR的核苷酸，比如包含如SEQ ID NO:21所示序列密码子优化后的序列，包含如SEQID NO:30所示序列密码子优化后的序列，包含如SEQ ID NO:38所示序列密码子优化后的序列。
本发明再一方面提供了一种表达载体，可以包含上述的两种多核苷酸中任意一种。
进一步地，表达载体选择慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体、DNA载体、RNA载体和质粒中的任一种。
具体地，慢病毒载体可以选自以下群组：人免疫缺陷病毒1(HIV-1)、人免疫缺陷病毒2(HIV-2)、维斯纳-梅迪病毒(visna-maedivirus，VMV)病毒、山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。
本发明再一方面提供了一种工程细胞，包含上述的表达载体。具体地，工程细胞可以是宿主细胞，将上述表达载体导入宿主细胞进行编码得到TCR多肽；也可以是T细胞，将上述表达载体(装载了目的基因)转染T细胞得到TCR-T细胞用于KRAS-G12D突变多肽的识别和杀灭。
本发明再一方面提供了一种药物组合物，其包含上述的TCR或上述的抗原结合片段或上述的多核苷酸或上述的表达载体或上述的工程细胞，和药学上可接受的载体和/或稀释剂。
具体地，药学上可接受的载体和/或稀释剂指的是可以将上述的TCR或上述的抗原结合片段或上述的多核苷酸或上述的表达载体或上述的工程细胞制备成各种所需的剂型。例如可以列举作为口服剂的片剂、粉末剂、丸剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂、小丸剂、舌下片、膏剂等，作为非口服剂，可以列举注射剂、栓剂、经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂等，本领域的技术人员能够根据给药途径和给药对象等选择适当的剂型。
本发明再一方面提供了一种上述的TCR或上述抗原结合片段或上述的多核苷酸或上述的表达载体或上述的工程细胞在制备用于提高T细胞分泌IFN-γ和/或TNF-α细胞因子水平药物中的应用。
进一步地，用于提高T细胞分泌IFN-γ和/或TNF-α细胞因子水平药物的包含细胞类药物、蛋白类药物、ADC药物或TCR与抗原组合药物。
本发明再一方面提供了一种上述的TCR或上述的抗原结合片段或上述的多核苷酸或上述的表达载体或上述的工程细胞在制备用于检测表达KRAS-G12D突变的肿瘤细胞试剂或试剂盒中的应用。
具体地，涉及到的试剂盒具体可以是分成各种小盒子，然后盛装有各种检测试剂。检测试剂和检测试剂盒可以间接或直接的应用在表达KRAS-G12D突变的各种恶性肿瘤，比如括胰腺肿瘤、结直肠恶性肿瘤、子宫内膜恶性肿瘤、肺部恶性肿瘤、胆管恶性肿瘤癌、宫颈恶性肿瘤等。
本发明再一方面提供了一种上述的TCR或上述的抗原结合片段或上述的多核苷酸或上述的表达载体或上述的工程细胞在制备用于治疗携带KRAS-G12D突变导致的疾病的药物中的应用。
进一步地，携带KRAS-G12D突变导致的疾病包括胰腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肺癌、胆管癌、宫颈癌或膀胱癌。
具体地，在上述应用中，对于KRAS-G12D突变的多肽进行HLA限制性T细胞表位多肽的多肽，选择亲和力较强的HLA-A1101，即KRAS-G12D突变后的多肽是由HLA-A1101分子呈递，但是不排除选择其他HLA分子，比如HLA-A11系列其他小分子。
具体地，在上述应用中，TCR选择上述两种TCR中任意一种；多核苷酸选择上述两种多核苷酸中任意一种。在上述应用中，TCR或抗原结合片段或多核苷酸或表达载体或工程细胞可以是添加辅料后组成药物，也可以是与其他活性药物或者检测试剂联用，比如现有的一些化疗药物，如烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、植物类抗癌药、激素、免疫制剂等；也可以和手术联合治疗。具体情况根据肿瘤情况进行用药或者联合用药。
具体地，上述应用中，KRAS-G12D突变的多肽分别可以是9个多肽，也可以是10个多肽的或者其他数量多肽，KRAS-G12D突变的10个数量多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示。
为了更好地理解本发明，下面结合具体示例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的示例。
以下实施例中，验证涉及的KRAS-G12野生型多肽(简称KRAS-G12)，序列如SEQ IDNO:39所示；验证涉及的KRAS-G12C突变多肽(简称KRAS-G12C)，序列如SEQ ID NO:40所示；验证涉及的KRAS-G12D突变多肽(简称KRAS-G12D)，序列如SEQ ID NO:41所示；验证涉及的KRAS-G12V突变多肽(简称KRAS-G12V)，序列如SEQ ID NO:42所示。
在以下实施例中，涉及的基因扩增、测序及分析方法按照以下步骤进行：
(1)RT-PCR：使用的下游引物是TCR基因恒定区特异性引物(Ca_RV1primer,Cb_RV1primer)，上游引物为含外层接头以及TCR信号肽起始20bp序列(AL primers,BLprimers)(具体按照文献《Hamana H,Shitaoka K,Kishi H,Ozawa T,Muraguchi A.Anovel,rapid and efficient method of cloning functional antigen-specific T-cell receptors from single human and mouse T-cells.BiochemBiophys ResCommun.2016Jun 10；474(4):709-714.doi:10.1016/j.bbrc.2016.05.015.Epub 2016May4.PMID:27155153》记载的内容实施例)；
(2)第二轮PCR：以上述(1)得到的TCR的PCR产物为模板，上游引物为外层接头引物(P2A-Cprimer)，下游引物为在α链恒定区上游的一段TCR恒定区的特异性引物(Ca_RV2primer)得到TCRα链第二轮PCR产物；上游引物为外层接头引物(BES-AP primer)，下游引物为在β链恒定区上游的一段TCR恒定区的特异性引物(Cb_RV2 primer)，得到TCRβ链第二轮PCR产物(具体按照文献《Hamana H,Shitaoka K,Kishi H,Ozawa T,Muraguchi A.Anovel,rapid and efficient method of cloning functional antigen-specific T-cell receptors from single human and mouse T-cells.BiochemBiophys ResCommun.2016Jun 10；474(4):709-714.doi:10.1016/j.bbrc.2016.05.015.Epub 2016May4.PMID:27155153》记载的内容实施)；
(3)将扩增之后的含有TCRα链和β链可变区基因的第二轮PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在500bp-750bp位置获得了TCRα链或β链可变区目的基因；
(4)将目的条带进行一代测序(北京擎科公司)，TCR序列分析后，选取其中高频率出现的TCR克隆，命名为KT13。
上述的涉及基因扩增、测序及分析方法的实施步骤中使用的扩增体系如下表1所示(具体按照文献《Hamana H,Shitaoka K,Kishi H,Ozawa T,Muraguchi A.A novel,rapidand efficient method of cloning functional antigen-specific T-cell receptorsfrom single human and mouse T-cells.BiochemBiophys Res Commun.2016Jun 10；474(4):709-714.doi:10.1016/j.bbrc.2016.05.015.Epub 2016May 4.PMID:27155153》记载的内容实施)。
表1扩增体系
以下实施例中，涉及的人PBMC细胞和人外周血均来源志愿者。
以下实施例中，涉及的物料的核酸序列或氨基酸序列如下表2所示，其中，KT13TCRα链可变区指的是上述第一种TCR中由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示序列按照FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的排列顺序构成的片段；KT13TCRβ链可变区指的是上述第一种TCR中由SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQID NO:16所示序列按照FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的排列顺序构成的片段；全长KT13TCR序列指的是KT13α链可变区和β链可变区分别连接其他结构后的完整结构的TCR，为上述第二种TCR，包含如SEQ ID NO:37所示序列，其由如SEQ ID NO:38所示序列编码得到。
表2实施例涉及的物料的氨基酸序列和核酸序列
| 物料 | 氨基酸序列 | 核酸序列 |
| KRAS-WT | SEQ ID NO:39 | - |
| KRAS-G12C | SEQ ID NO:40 | - |
| KRAS-G12D | SEQ ID NO:41 | - |
| KRAS-G12V | SEQ ID NO:42 | - |
| KT13TCRα链可变区(αV区) | SEQ ID NO:8 | SEQ ID NO:26 |
| KT13TCRβ链可变区(βV区) | SEQ ID NO:17 | SEQ ID NO:35 |
| 全长KT13TCR序列 | SEQ ID NO:37 | SEQ ID NO:38 |
以下实施例中，KRAS-G12、KRAS-G12V、KRAS-G12C、KRAS-G12D多肽委托金瑞斯生物技术有限公司合成。
以下实施例中，KRAS-G12/HLA-A1101的四聚体、KRAS-G12C/HLA-A1101的四聚体、KRAS-G12D/HLA-A1101的四聚体和KRAS-G12V/HLA-A1101的四聚体均使用日本MBL公司的QuickSwitchTM Quant Tetramer Kit制备而成，该试剂可以简单地在研究室内制备四聚体试剂。具体制备过程如下，50ul的QuickSwitchTetramer中分别加入1ulKRAS-G12多肽和1ulKRAS-G12V多肽置换剂、1ulKRAS-G12多肽和1ulKRAS-G12C多肽置换剂、1ulKRAS-G12多肽和1ulKRAS-G12D多肽置换剂分别得到KRAS-G12/HLA-A1101四聚体、KRAS-G12C/HLA-A1101四聚体、KRAS-G12D/HLA-A1101四聚体和KRAS-G12V/HLA-A1101四聚体，室温放置4个小时在4℃保存备用。
实施例1特异性TCR筛选
(1)通过预测软件(HLAthena)预测KRAS-G12D突变蛋白的免疫原性，分析获得具有免疫原性的抗原肽序列，KRAS-G12D突变的序列如SEQ ID NO:20所示；
(2)合成相关短肽，纯度为85％，合成后的多肽使用DMSO溶解为10mM的溶液；
(3)体外刺激扩增KRAS特异性T细胞：收集健康人的外周血，检测其HLA的基因亚型，选择HLA-A1101阳性的外周血样本；分离HLA-A1101阳性的外周血中的单核细胞、初始T细胞，将单核细胞培养液中加入800U/mlIL-4和800U/mlGM-CSF，培养4天，使其分化为DC细胞，然后在DC细胞培养液中分别加入上述KRAS-G12D突变多肽(浓度为10uM)，放入孵箱静置培养16小时；随后，将加载上述突变肽的DC细胞与初始T细胞混合，继续培养3周；培养后的T细胞产物，通过流式细胞术检测特异性T细胞的含量；
(4)取1×107的扩增后T细胞，250g离心10min，弃去上清，加入100ul的抗体染液(含1ug/ml KRAS-G12D/HLA-A1101四聚体、1ug/mlAPC-CD3抗体的PBS)，室温孵育30min；用5ml含0.5％BSA的PBS洗三次，250g离心10min；用1ml含0.5％BSA的PBS重悬细胞后，使用流式细胞分选仪器，分选单个特异性T细胞；
(5)对分选的特异性T细胞提取总RNA，然后进行RT-PCR扩增获得TCR基因序列，通过一代测序、IMGT数据库比对，分析TCR的序列结构，得到KT13可变区由如SEQ ID NO:26所示序列编码的α链可变区和如SEQ ID NO:35所示序列编码的β链可变区组成。
实施例2KT13结合特异性验证
将KT13α链和β链可变区(V区)与TCR的α链和β链的恒定区(C区)基因连接，然后将α链和β链进行连接，得到全长KT13TCR序列，全长KT13TCR序列基因如SEQ ID NO:38所示；以慢病毒表达质粒pWPXL(购自Addegene公司)为骨架载体，分别构建KT13慢病毒表达载体，即慢病毒表达载体pWPXL-KT13TCR；分别将pWPXL-KT13TCR慢病毒表达载体分别与慢病毒包装质粒pMD2.G和psPAX2质粒按照质量1:0.5:1的比例共转染293T细胞，两天后收取病毒上清；使用病毒上清感染Jurkat细胞，感染后24小时换液，培养2-3天后，得到了表达KT13TCR的Jurkat细胞，用于下游实验。
(1)Jurkat细胞活化CD69
将上述表达KT13TCR的Jurkat细胞与表达A1101基因的K562细胞以1:1的细胞数量比进行混合，分别加入终浓度为10uM的KRAS-G12D多肽，6小时后回收细胞；然后加入50ul的含PE-CD69抗体的细胞染液，室温孵育30min；接着用含0.5％BSA的PBS洗三次，200g-250g离心10min；接着用含0.5％BSA的PBS重悬细胞，用于下游检测；采用流式细胞技术进行了Jurkat细胞活化分析，检测Jurkat细胞活化分析CD69的表达情况；
表达KT13TCR的Jurkat细胞分析结果如图1所示，结果显示，KT13TCR在KRAS-G12D的刺激后，会发生特异性活化，因此其为KRAS-G12D特异性TCR。
(2)不同浓度KRAS-G12D多肽活化程度
将上述表达KT13TCR的Jurkat细胞与表达A1101基因的K562细胞以1:1的细胞数量比进行混合，分别加入终浓度为10μM、1μM、0.1μM、0.01μM、0.001μM和0.0001μM的KRAS-G12D多肽，6小时后回收细胞；然后加入50ul的含PE-CD69抗体的细胞染液，室温孵育30min；接着用含0.5％BSA的PBS洗三次，200g-250g离心10min；接着用含0.5％BSA的PBS重悬细胞，用于下游检测；采用流式细胞技术进行了Jurkat细胞活化分析，检测Jurkat细胞活化分析CD69的表达情况；
表达KT13TCR的Jurkat细胞分析结果如图2所示，结果显示，随着肽浓度降低KT13TCR在KRAS-G12D的刺激后，活化程度会发生改变，因此其亲和性较高。
实施例3IFN-γ和TNF-α的分泌水平测试
利用人PBMC的T细胞制备的KT13-T细胞，与分别加载了KRAS-G12、KRAS-G12C、KRAS-G12D和KRAS-G12V多肽的A1101-K562细胞1:1混合，并按100μl体积2×105细胞数/孔加入到96孔板内，每个样本做三个重复，其中PMA/离子霉素(ION)组按照每250μl细胞培养基中加入1μlPMA/伊屋诺霉素混合液(250×)提前稀释成工作液，并作为阳性刺激对照；在37℃下培养24h后，取96孔板培养孔的上清，并于500g转速离心5min去掉残留的细胞，将上清加入包被有抗IFN-γ抗体或者抗TNF-α抗体的ELISA板中，检测上清中的IFN-γ水平和TNF-α水平，结果如图3和图4所示，KT13-T细胞在KRAS-G12D的刺激后，会分泌IFN-γ或TNF-α，因此KT13为KRAS-G12D的特异性TCR。
实施例4细胞杀伤实验
利用人PBMC的T细胞制备的KT13-T细胞，与分别加载了KRAS-G12、KRAS-G12D多肽的A1101-K562细胞按照不同比例混合(1:1、2:1、5:1、10:1)混合，并按100μl体积2×104、4×104、1×105和2×105细胞数/孔加入到96孔板内，每个样本做三个重复，其中PMA/离子霉素(ION)组按照每250μl细胞培养基中加入1μlPMA/伊屋诺霉素混合液(250×)提前稀释成工作液，并作为阳性刺激对照；在37℃下培养24h后，取96孔板培养孔的上清，并于500g转速离心5min去掉残留的细胞，检测上清中LDH含量，结果如图5所示，KT13具有KRAS-G12D的特异性杀伤能力。
Claims (15)
1.TCR，其特征在于，包含α链可变区和β链可变区；α链可变区包含如SEQ ID NO:3所示序列的α链CDR3，β链可变区包含如SEQ ID NO:12所示序列的β链CDR3。
2.根据权利要求1所述的TCR，其特征在于，α链可变区还包含：如SEQ ID NO:1所示序列的α链CDR1和/或如SEQ ID NO:2所示序列的α链CDR2；β链可变区还包含：如SEQ ID NO:10所示序列的β链CDR1和/或如SEQ ID NO:11所示序列的β链CDR2。
3.根据权利要求1或2所述的TCR，其特征在于，α链可变区还包含：如SEQ ID NO:4所示序列的α链FR1、如SEQ ID NO:5所示序列的α链FR2、如SEQ ID NO:6所示序列的α链FR3和如SEQ ID NO:7所示序列的α链FR4中一种或多种；β链可变区还包含：如SEQ ID NO:13所示序列的β链FR1、如SEQ ID NO:14所示序列的β链FR2、如SEQ ID NO:15所示序列的β链FR3和如SEQ ID NO:16所示序列的β链FR4中一种或多种。
4.TCR，其特征在于，包含由如SEQ ID NO:37所示序列编码得到的片段。
5.抗原结合片段，其特征在于，包含权利要求1至4中任一权利要求所述的TCR。
6.多核苷酸，其特征在于，包含如SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:30所示序列。
7.根据权利要求6所述的多核苷酸，其特征在于，还包含如SEQ ID NO:19所示序列、如SEQ ID NO:20所示序列、如SEQ ID NO:22所示序列、如SEQ ID NO:23所示序列、如SEQ IDNO:24所示序列、如SEQ ID NO:25所示序列、如SEQ ID NO:28所示序列、如SEQ ID NO:29所示序列、如SEQ ID NO:31所示序列、如SEQ ID NO:32所示序列、如SEQ ID NO:33所示序列和如SEQ ID NO:34所示序列中一种或多种。
8.多核苷酸，其特征在于，包含如SEQ ID NO:38所示序列。
9.表达载体，其特征在于，包含权利要求6至8任一权利要求所述的多核苷酸。
10.工程细胞，其特征在于，包含权利要求9所述的表达载体。
11.药物组合物，其特征在于，包含权利要求1至4中任一权利要求所述的TCR或权利要求5所述的抗原结合片段或权利要求6至8中任一权利要求所述的多核苷酸或权利要求9所述的表达载体或权利要求10所述的工程细胞，和药学上可接受的载体和/或稀释剂。
12.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的TCR或权利要求5所述的抗原结合片段或权利要求6至8中任一权利要求所述的多核苷酸或权利要求9所述的表达载体或权利要求10所述的工程细胞在制备用于提高T细胞分泌IFN-γ和/或TNF-α细胞因子水平药物中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，用于提高T细胞分泌IFN-γ和/或TNF-α细胞因子水平药物的包括蛋白类药物、ADC药物或TCR与抗原组合药物。
14.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的TCR或权利要求5所述的抗原结合片段或权利要求6至8中任一权利要求所述的多核苷酸或权利要求9所述的表达载体或权利要求10所述的工程细胞在制备用于检测表达KRAS-G12D突变的肿瘤细胞试剂或试剂盒中的应用。
15.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的TCR或权利要求5所述的抗原结合片段或权利要求6至8中任一权利要求所述的多核苷酸或权利要求9所述的表达载体或权利要求10所述的工程细胞在制备用于治疗携带KRAS-G12D突变导致的疾病的药物中的应用。
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