CN116239690B - 一种抗cd123的纳米抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗CD123的纳米抗体及其制备方法和应用，涉及生物医药领域。本发明从双峰驼VHH免疫文库中筛选到的抗CD123纳米抗体，其可特异性的结合CD123抗原，且亲和力较好，人源化后通过抗体亲和力的测定可知，人源化纳米抗体亲和力在10‑12～10‑9M数量级之间，都属于高亲和力纳米抗体。此外，将筛选获得的纳米抗体作为抗原结合结构域构建嵌合抗原受体，并利用CRISPR/Cas9RNPs系统敲除T细胞的TRAC和B2M基因，制备通用型CAR‑T细胞，对CD123阳性的急性髓系白血病细胞系具有明显的杀伤活性，并且最大限度地降低移植物抗宿主反应。

Description

一种抗CD123的纳米抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体而言，涉及一种抗CD123的纳米抗体及其制备方法和应用。
背景技术
急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)是一种异质性血液系统恶性肿瘤，其特征是骨髓中出现不同成熟阶段的异常原始细胞，干扰正常的造血功能。据美国癌症协2022年初公布的最新数据显示，美国新发白血病病例约60650例，死亡约24000例，其中急性髓性白血病占20050例。人们第一次被诊断出患有AML时的平均年龄约为68岁，发病较晚，但AML也可能发生在儿童身上。目前，由于针对AML化疗方案仅对少数的患者有效，异基因造血干细胞移植(HSCT)仍然是AML主要的治疗手段，但只有少数患者符合条件。此外，50-70％的患者在接受化疗和异基因造血干细胞移植后出现复发，复发患者治疗后的二次缓解率低于50％，5年生存率低至27％。因此，复发性和难治性使得AML在很大程度上仍然无法治愈。
随着过继细胞治疗(adoptive cellular therapy,ACT)的发展，在恶性血液肿瘤中，自体嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞疗法在抗肿瘤方面显示出较好的效果，提高了多种血液瘤患者的缓解率及生存率，使血液瘤的治疗方式发生了较大的变化，并推动了其他免疫细胞疗法的发展。迄今为止，最成功的CAR-T细胞治疗是自体CD19-CAR-T细胞治疗复发或难治性CD19阳性急性淋巴细胞白血病患者。多个研究机构开发了多种不同的CD19-CAR-T结构和制备方法，且疗效显著。尽管CAR-T细胞在淋巴细胞白血病和多发性骨髓瘤等血液瘤表现出较好治疗效果，但在AML中由于靶抗原的识别困难，CAR-T细胞疗法面临各种挑战，目前，极少有获批CAR-T细胞疗法用于治疗AML。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗CD123的纳米抗体及其制备方法和应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了一种抗CD123的纳米抗体，所述纳米抗体包括：CDR1～3的氨基酸序列如以下任一项所示的重链可变区：(1)如SEQ ID No.1～3所示；(2)如SEQ ID No.6～8所示；(3)如SEQ ID No.11～13所示；(4)如SEQ ID No.16～18所示；(5)如SEQ ID No.21～23所示；(6)如SEQ ID No.26～28所示；(7)如SEQ ID No.31～33所示；(8)如SEQ ID No.36～38所示；(9)如SEQ ID No.41～43所示；(10)如SEQ ID No.46～48所示；(11)如SEQ ID No.51～53所示；(12)如SEQ ID No.56～58所示；(13)如SEQ ID No.61～63所示；(14)如SEQ ID No.66～68所示；(15)如SEQ ID No.71～73所示；(16)如SEQ ID No.76～78所示；(17)如SEQ ID No.81～83所示；(18)如SEQ ID No.86～88所示；(19)如SEQ IDNo.91～93所示；(20)如SEQ ID No.96～98所示；(21)如SEQ ID No.101～103所示。
第二方面，本发明实施例提供了一种分离的核酸，其编码如前述任意实施例所述的抗CD123的纳米抗体。
第三方面，本发明实施例提供了一种重组载体，其含有如前述实施例所述的分离的核酸。
第四方面，本发明实施例提供了一种宿主细胞，其含有如前述实施例所述的重组载体。
第五方面，本发明实施例提供了一种抗CD123的纳米抗体的制备方法，其包括：培养如前述实施例所述的宿主细胞，以获得所述抗CD123的纳米抗体。
第六方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的抗CD123的纳米抗体在制备预防或治疗肿瘤的产品中的应用。
第七方面，本发明实施例提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域包括如前述实施例所述的抗CD123的纳米抗体。
第八方面，本发明实施例提供了一种CAR-T细胞，其包括如前述实施例所述的嵌合抗原受体。
第九方面，本发明实施例提供了一种细胞注射液，其包括如前述实施例所述的抗CD123的纳米抗体或如前述实施例所述的分离的核酸或如前述实施例所述的重组载体或如前述实施例所述的宿主细胞或如前述实施例所述的嵌合抗原受体或如前述实施例所述的CAR-T细胞。
本发明具有以下有益效果：
本发明从双峰驼VHH免疫文库中筛选到的抗CD123纳米抗体，其可特异性的结合CD123抗原，且亲和力较好，人源化后通过抗体亲和力的测定可知，人源化纳米抗体亲和力在10-12～10-9M数量级之间，都属于高亲和力纳米抗体。
此外，将筛选获得的纳米抗体作为抗原结合结构域构建嵌合抗原受体，并利用CRISPR/Cas9 RNPs系统敲除T细胞的TRAC和B2M基因，制备通用型CAR-T细胞，对CD123阳性的急性髓系白血病细胞系具有明显的杀伤活性，并且最大限度地降低移植物抗宿主反应。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为pcDNA3.1-hFc-His真核表达载体结构示意图；
图2为SDS-PAGE鉴定纯化后的纳米抗体-hFc融合蛋白；
图3为间接ELISA鉴定重组纳米抗体与抗原的反应性；
图4为ELISA鉴定重组纳米抗体与抗原的反应性；
图5为CD123纳米抗体与的AML天然靶细胞特异性结合鉴定；
图6为CD123-CAR结构示意图；
图7为流式细胞术检测B2M和TRAC敲除效率；
图8为CD123 UCAR-T细胞与AML天然细胞的体外共培养；
图9为THP-1异种移植模型中验证Universal CAR-T细胞抗肿瘤活性；
图10为MV411异种移植模型中验证Universal CAR-T细胞抗肿瘤活性。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
急性髓系白血病细胞表面表达多种抗原，包括CD123、CD34、CD33和CLL1等。CD123(白细胞介素3受体)，是一种存在于细胞表面的分子，它有助于传递白细胞介素3的信号。编码受体的基因位于X和Y染色体的假常染色体区域。该受体属于I型细胞因子受体家族，是一种异二聚体，具有与常见的β亚基(CD131)配对的独特α链。α亚基基因长40kb，有12个外显子。研究表明，CD123在急性髓系白血病(AML)、原始浆细胞样树突状细胞瘤(BPDCN)、急性淋巴细胞性白血病/淋巴瘤(ALL)、毛细胞白血病(HCL)、系统性肥大细胞增多症(SM)等肿瘤细胞上过表达，促进肿瘤细胞的过度增殖。
本申请发明人发现部分AML患者在接受诱导治疗和自体CAR-T治疗后均显示出高效的抗肿瘤活性。因此，利用纳米抗体文库筛选到CD123特异性纳米抗体，并进行人源化，通过抗体亲和力的测定可知，人源化纳米抗体亲和力在10-12～10-9M数量级之间，都属于高亲和力纳米抗体。
具体地，本发明实施例提供了一种抗CD123的纳米抗体，所述纳米抗体包括：CDR1～3的氨基酸序列如以下任一项所示的重链可变区(VHH)：(1)如SEQ ID No.1～3所示；(2)如SEQ ID No.6～8所示；(3)如SEQ ID No.11～13所示；(4)如SEQ ID No.16～18所示；(5)如SEQ ID No.21～23所示；(6)如SEQ ID No.26～28所示；(7)如SEQ ID No.31～33所示；(8)如SEQ ID No.36～38所示；(9)如SEQ ID No.41～43所示；(10)如SEQ ID No.46～48所示；(11)如SEQ ID No.51～53所示；(12)如SEQ ID No.56～58所示；(13)如SEQ ID No.61～63所示；(14)如SEQ ID No.66～68所示；(15)如SEQ ID No.71～73所示；(16)如SEQ IDNo.76～78所示；(17)如SEQ ID No.81～83所示；(18)如SEQ ID No.86～88所示；(19)如SEQID No.91～93所示；(20)如SEQ ID No.96～98所示；(21)如SEQ ID No.101～103所示。
在一些实施例中，所述纳米抗体还包括骨架区，其重链可变区的结构为：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
在一些实施例中，所述纳米抗体还包括1个铰链区和2个恒定区(CH2和CH3)。
优选地，所述纳米抗体为单价纳米抗体、多价纳米抗体和融合型纳米抗体中的至少一种。
单价纳米抗体：是用特异性的抗原从纳米抗体库中筛选得到的抗原特异性的纳米抗体，因其表面有大量的亲水残基，能保持严格的单体结构，且仅以这种单体形式就能高特异性、高亲和力地与其抗原相结合。
多价纳米抗体：多价抗体是识别同一种表位的单价抗体的聚合物，比对应的单价纳米抗体具有更高的抗原亲和力。多特异性抗体是识别不同表位的单价抗体的聚合物，能结合不同靶目标或同一靶目标的不同表位，比单价抗体具有更高的抗原识别能力。而纳米抗体结构简单，只有一个结构域，可通过短小的连接序列聚合在一起，从而转换成多价和多特异性的形式。
融合型纳米抗体：纳米抗体具有严格的单体特点且其相对分子质量很小，很容易通过基因工程技术与其他结构(如BSA、IgG-Fc等)结合形成新的融合分子，如能延长其半衰期的酶、抗菌肽或显影物质等。在新的融合分子中，纳米抗体与其靶抗原定向结合，与纳米抗体融合的部分就能发挥相应的功能。在临床，医生希望药物能在体内停留足够长的时间，然而纳米抗体的血液清除速度却很快，不利于它所携带的药物发挥作用。所以，通过基因技术将纳米抗体VHH和寿命较长的分子融合在一起，可以提高纳米抗体在血液中的存在时间即延长其半衰期，从而达到更好的治疗效果。
在一些实施例中，当所述纳米抗体为单价纳米抗体时，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.4、9、14、19、24、29、34、39、44、49、54、59、64、69、74、79、84、89、94、99、104、106、108、110、112和114中任意一项所示。
本发明实施例还提供了一种分离的核酸，其编码如前述任意实施例所述的抗CD123的纳米抗体。
本发明实施例还提供了一种重组载体，其含有如前述任意实施例所述的分离的核酸。
所述重组载体为表达载体或克隆载体，优选为表达载体，可以指任何重组的多核苷酸构建体，该构建体可通过转化，转染或转导的方式将目的DNA片段直接或间接(如包装成病毒)导入宿主细胞内，进行目的基因表达。其中一种类型的载体是质粒，即环状双链DNA分子，可将目的DNA片段连接至质粒环中。另一种类型的载体为病毒载体，其可将目的DNA片段连接包装至病毒基因组中(如腺病毒，腺相关病毒，逆转录病毒，慢病毒，溶瘤病毒)。这些载体进入宿主细胞后，可以进行目的基因的表达。
本发明实施例还提供了一种宿主细胞，其含有如前述任意实施例所述的重组载体。具体地，宿主细胞包括原核宿主细胞、真核宿主细胞以及噬菌体中的至少一种。所述原核宿主细胞可以为大肠杆菌、链霉菌或枯草杆菌等。所述真核宿主细胞可以为293细胞、293T细胞、293FT细胞、CHO细胞、COS细胞、Per6，酿酒酵母、毕赤酵母、汉森酵母、假丝酵母、部分昆虫细胞以及植物细胞。293系列细胞，Per6细胞和CHO细胞是用于生产制备抗体或重组蛋白的常用哺乳动物细胞，为本领域普通技术人员所熟知。
本发明实施例还提供了一种抗CD123的纳米抗体的制备方法，其包括：培养如前述实施例所述的宿主细胞，以获得所述抗CD123的纳米抗体。具体地，本发明对宿主细胞的培养条件没有具体地限定，基于常规技术知识可获得能够使得宿主细胞表达产生所述抗CD123的纳米抗体的培养条件。
本发明实施例还提供了如前述实施例所述的抗CD123的纳米抗体在制备预防或治疗肿瘤的产品中的应用。
优选地，所述产品包括：免疫细胞、试剂、试剂盒、药物和药物组合物中的至少一种。
优选地，所述肿瘤包括急性髓系白血病(AML)、原始浆细胞样树突状细胞瘤(BPDCN)、急性淋巴细胞性白血病/淋巴瘤(ALL)、毛细胞白血病(HCL)和系统性肥大细胞增多症(SM)中的至少一种。
本发明实施例提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域包括如前述任意实施例所述的抗CD123的纳米抗体。
优选地，所述嵌合抗原受体还包括信号肽、铰链区、跨膜区和信号转导结构域。
优选地，所述信号转导结构域包括CD3ζ。
优选地，所述信号转导结构域还包括4-1BB胞内区。
本发明实施例还提供了一种CAR-T细胞，其包括如前述实施例所述的嵌合抗原受体。
在一些实施例中，所述CAR-T细胞包括通用型CAR-T细胞和自体CAR-T细胞中的至少一种。
自体CAR-T细胞疗法具有不会发生免疫排斥反应、可以在体内持续存在较长时间等优势。但自体CAR-T细胞治疗存在一些局限性，例如制备成本高、多线治疗的AML患者T细胞数量少或化疗后T细胞功能受损导致其质量下降、患者T细胞功能障碍，以及制造周期长，使得患者错过最佳治疗时间。随着ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等多种基因编辑技术的快速发展，运用基因编辑技术敲除CAR-T细胞表面的T细胞受体(TCR)、HLA分子β2微球蛋白(B2M)和CD52等，以最大限度的降低GVHD风险。这种通用型CAR-T(UCAR-T)细胞疗法的开发可以克服大多数自体CAR-T细胞治疗缺点，如进行标准化流程的规模化和工业化制造，并降低了成本，可以从单个供体制备大量CAR-T细胞。同种异体CAR-T细胞可冻存，使患者能立即获得治疗，不错过最佳治疗时机。它简化了在单个细胞产品中引入多种修饰的过程，以及基于供体选择和处理CAR-T细胞产品的标准化。自体CAR-T细胞通常只为该患者制备一次CAR-T产品，而同种异体细胞在需要的情况下可以使用这些现成的产品重复给药。
本发明实施例提供了一种细胞注射液，其包括如前述任意实施例所述的抗CD123的纳米抗体或如前述任意实施例所述的分离的核酸或如前述任意实施例所述的重组载体或如前述任意实施例所述的宿主细胞或如前述任意实施例所述的嵌合抗原受体或如前述任意实施例所述的CAR-T细胞。
本发明实施例还提供了一种药物组合物，其包括：如前述任意实施例所述的抗CD123的纳米抗体、如前述任意实施例所述的分离的核酸、如前述任意实施例所述的重组载体、如前述任意实施例所述的宿主细胞、如前述任意实施例所述的嵌合抗原受体和如前述任意实施例所述的CAR-T细胞中的至少一种。
此外，本发明实施例还提供了如前述任意实施例所述的抗CD123的纳米抗体或如前述任意实施例所述的分离的核酸或如前述任意实施例所述的重组载体在制备用于检测CD123的产品中的应用。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1 CD123重组蛋白的制备
将购买的编码人源pMD18-CD123(IL3RA)质粒分别作为模板进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳，得到的胞外域(ECD)片段，再以pcDNA3.1载体为骨架，将CD123的胞外域克隆到C端携带Fc或His标签的pcDNA3.1表达载体中。其中Fc标签包括人源Fc(hFc)和鼠源Fc(mFc)。然后，通过瞬时转染293FT，使用FreeStyleTM无血清培养基(Life Technologies)摇瓶培养5-7天，收集上清，通过Protein A/G或镍柱亲和层析以及分子筛色谱柱纯化携带Fc或His标签的重组CD123蛋白。
实施例2 噬菌体纳米抗体文库的构建、淘选和ELISA初步筛选
(1)双峰驼免疫
将表达纯化的CD123胞外域重组蛋白取2mg，向其中加入2mL弗式完全佐剂后，使用乳化仪充分乳化；在双峰驼颈部皮下多点注射免疫，之后每隔两周免疫一次(2mg蛋白)，并使用弗式不完全佐剂，一共免疫4次，最后一次免疫后采集外周血检测效价。冲击免疫后一周采集双峰驼外周血分离淋巴细胞。
(2)纳米抗体文库构建
待骆驼达到一定免疫效价，对其进行最后一次冲击免疫，7天后用采血袋采集外周血200mL，进行淋巴细胞的分离。取出上述分离的淋巴细胞，按照Promega的RNA提取试剂盒步骤进行RNA提取。淋巴细胞的RNA提取后立即用TaKaRa逆转录试剂盒进行逆转录cDNA，随后利用巢式PCR扩增VHH基因；将扩增的VHH基因插入pMECS噬菌体展示载体中，电转化TG1感受态细胞。取电转后的培养菌液，利用LB/Amp-GLU培养基进行倍比稀释(10倍稀释)，再取10-4、10-5、10-6、10-7稀释度的稀释液100μL涂布于LB/Amp-GLU平板上，37℃倒置培养，培养8h后计数不同稀释度菌落数，以进行抗体文库库容量的计算，即为3.68×109。同时，随机选取50个形态大小相似的菌落培养4h，进行菌液PCR，以鉴定文库阳性率，即该文库的插入率达到96％。
(3)针对CD123纳米抗体的筛选
首先，进行辅助噬菌体的制备、浓缩以及噬菌体文库救援。纳米抗体噬菌体文库的淘选步骤如下：①抗原包被：用PBS将CD123-mFc重组蛋白稀释后，每孔20μg(后续两轮淘选的抗原包被量分别为10μg/孔、5μg/孔)包被于96孔酶标板中，4℃过夜包被；②洗涤：过夜包被后弃去孔中的液体，每孔用200μL PBST洗涤5次；③封闭：每孔加入200μL 5％脱脂奶粉，放置于37℃封闭1h；④洗涤：弃去孔内液体，每孔用200μL PBST洗涤3次；⑤重组噬菌体的孵育：用5％脱脂奶粉稀释重组噬菌体到5×1011pfu/mL，每孔加入100μL，室温孵育2h；⑥洗涤：弃去孔内液体，每孔用200μL PBST洗涤15次。按照每孔100μL加入现配的0.1M三乙胺，室温放置10min，洗脱液吸到1.5mL离心管并迅速加入等体积1M Tris-HCl(pH＝7.4)进行中和；⑦重组噬菌体滴度测定：收集中和后噬菌体溶液，进行噬菌体滴度测定；将剩余噬菌体溶液侵染2mL处于对数生长期的TG1，37℃静置30min；加入8mL 2×YT/Amp GLU培养基，放于37℃220rpm培养至对数生长期；⑧救援：加入8mL的2×YT氨苄抗性培养基，加入4％葡萄糖，37℃220rpm培养；⑨噬菌体浓缩：步骤见1.2.7.2；⑩重复上述步骤①-⑨，进行第二轮和第三轮筛淘。
(4)特异性重组噬菌体富集情况的检测
抗原包被：用PBS将两种抗原稀释后，每孔400ng包被于96孔酶标板中，4℃过夜包被。洗涤：过夜包被后弃去孔中的液体，每孔用200μL PBST洗涤三次。封闭：每孔加入200μL5％脱脂奶粉，放置于37℃封闭1h。洗涤：弃去孔内液体，每孔用200μL PBST洗涤三次。重组噬菌体的孵育：稀释噬菌体浓缩液(1:10)，每孔加入100μL，37℃孵育1h。洗涤：弃去孔内液体，每孔用200μL PBST洗涤三次。二抗：HRP标记的鼠抗M13二抗1:2000稀释，100μL/孔，37℃孵育1h。洗涤：弃去孔内液体，每孔用200μL PBST洗涤三次。显色：每孔加入TMB显色液100μL，室温避光放置10-15min。终止并读数：显色后每孔加入2M H2SO4 50μL，终止反应；在450nm处读取吸光值。分析数据。
(5)特异性纳米抗体的测序分析
通过ELISA检测结果，将大于阴性值3倍以上的克隆确定为的阳性，并送菌液测序、比对分析，最终得到21条CD123纳米抗体序列，纳米抗体的序列如下表所示。
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实施例3CD123特异性纳米抗体的表达、纯化及与抗原的反应性
基于pcDNA3.1真核表达载体构建Nanobody-hFc融合蛋白表达平台，并分别将CD123特异性纳米抗体序列克隆到pcDNA3.1-hFc-His载体上(图1)。将构建的表达载体利用HEK293T真核蛋白表达系统表达及纯化。SDS-PAGE结果显示，亲和层析纯化后获得了较高纯度的Nanobody-hFc融合蛋白，条带大小均在55kDa左右(图2)。
为鉴定重组纳米抗体-hFc融合蛋白与抗原的反应性，提前将200ng/well的CD123重组蛋白包被于酶标板，4℃过夜后封闭板子，并加入不同量的重组纳米抗体(稀释量：102～10-5μg/mL)，加入二抗洗涤、显色、终止反应，并使用酶标仪在450nm处的光密度(OD450)测量，使用四参数非线性回归曲线拟合确定结合能力。结果显示，CD123的21个重组纳米抗体均与CD123重组蛋白均有较高的特异性结合(图3)。
为进一步鉴定出高亲和力的纳米抗体，利用ELISA方法，将纳米抗体定量后，包被于酶标板中，通过加入不同浓度的CD123重组蛋白鉴定出高亲和力纳米抗体。实验表明初步筛选获得的21种纳米抗体中有5种对CD123抗原展示出了较高的亲和力(图4)，分别Nb109#、Nb110#、Nb129#、Nb135#和Nb196#。
实施例4 纳米抗体对细胞内源表达的CD123的结合分析
选取CD123表达阳性的人急性髓系白血病细胞系MV411和THP-1，以及CD123表达阴性的人淋巴瘤细胞Raji以及人多发性骨髓瘤细胞系RPMI-8226进行流式分析。
结果如图5所示：CD123表达阳性的MV411和THP-1细胞能够被优选的5种CD123纳米抗体染成几乎100％的阳性，CD123表达阴性的人淋巴瘤细胞Raji以及人多发性骨髓瘤细胞系RPMI-8226细胞染色呈阴性。说明几个CD123纳米抗均能够特异性识别细胞内源表达的CD123分子。
实施例5CD123纳米抗体人源化改造及其亲和力测定
将CD123的5个纳米抗体可变区的氨基酸序列与人源的进行比对，保留原纳米抗体的CDR区序列，人源抗体的框架区依次替换以得到人源化的抗体氨基酸序列，最后通过计算机模拟修正部分免疫原性高的序列位点。根据此方法，得到了以下5条人源化的序列，分别命名为hu109、hu110、hu129、hu135和hu196。将设计的人源化嵌合0抗体合成至pcDNA3.1-hFc-His载体上，利用HEK293T真核蛋白表达系统表达及纯化，5株纳米抗体的序列如下表所示。
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通过表面等离子共振验证人源化纳米抗体和单克隆抗体的亲和力，并确定其结合动力学常数(Kd)。使用GE BiacoreTM8K仪器，将抗小鼠IgG抗体利用氨基偶联试剂盒中的偶联缓冲液将其固定在CM5芯片表面，再将CD123(ECD)-mFc以2倍系列稀释捕获到CM5芯片上；之后让纯化的人源化CD123纳米抗体和B7-H3单克隆抗体流过芯片的表面，机器读取Ka(1/Ms)、kd(1/s)、KD(M)，即测量到重组人源化抗体的亲和力。亲和力测定结果显示，CD123的5个候选人源化纳米抗体均能够特异性结合CD123(ECD)-mFc蛋白，亲和力在10-12～10-9M数量级之间，都属于高亲和力抗体，尤其亲和力最高的huNb129高达8.49×10-12M数量级，往后依次为huNb135(3.28×10-11)、huNb196(2.66×10-10)、huNb109(8.15×10-10)、huNb110(1.71×10-9)；动力学特征显示，5个人源化纳米抗体均具有比较慢的解离速率，检测的具体数据见表1。
表1人源化抗体的亲和力数据汇总表
抗体 Ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
huNb129 1.76×106 1.50×10-5 8.49×10-12
huNb135 1.09×106 3.57×10-5 3.28×10-11
huNb196 1.53×106 4.06×10-4 2.66×10-10
huNb109 7.37×105 6.01×10-4 8.15×10-10
huNb110 2.87×105 4.91×10-4 1.71×10-9
实施例6 CAR结构设计与慢病毒包装
根据实施例5，优选亲和力最高的人源化纳米抗体序列huNb129构建CD123-CAR，结构如下：CD8αsignal peptide-CD123 nanobody-CD8αhinge-CD28αTm-4-1BB-CD3ζ-P2A-EGFP(图6)。将HEK293T细胞作为慢病毒包装的细胞，利用三质粒包装系统(psPAX2、pMD2.G、CAR-T vector)进行慢病毒包装，48h后收集上清病毒液，超速离心浓缩后，提前包被RetroNectin蛋白并加入浓缩病毒感染T细胞，感染48h后，通过流式细胞术评估CAR-T细胞的转染效率在85.76％。
实施例7 通用型(Universal)CAR-T细胞制备
应用Cas9/RNPs电穿孔的方法，将靶向TRAC、B2M的sgRNA及Cas9蛋白电转到CAR-T细胞中，制备通用型CD123的UCAR-T细胞。扩增72h后，利用流式细胞术对CAR-T细胞表达的TCR和β-2-Microglobulin进行检测。流式结果显示，敲除TRAC基因的T细胞达到了61.11％，而B2M的也达到了62.75％(图7)，后续并通过磁珠分选，得到TRAC-/B2M-阴性的CAR-T细胞。
实施例8 通用型CAR-T细胞体外对靶细胞杀伤效果评价
为评估UCAR-T细胞的功能，将CD123 UCAR-T细胞与表达荧光素酶的AML抗原阳性细胞系MV411和THP-1，以及抗原阴性的Daudi、Raji细胞共培养，以确定UCAR-T细胞利用抗原特异性方式裂解AML细胞的能力。将未处理的T细胞作为对照(Mock T cell)，分别按照效靶比1.25:1、2.5:1、5:1、10:1接种细胞于96孔板，培养体系中不加IL-2，共同培养24h后，收集培养上清，利用ELISA试剂盒检测上清中IL-2、IFN-γ和TNF-α细胞因子的含量。同时，用多功能酶标系统检测荧光素酶值，以评价UCAR-T细胞对AML天然细胞的杀伤效果。结果显示，UCAR-T细胞以剂量依赖性方式杀死表达CD123抗原阳性的靶细胞，而对阴性的Daudi和Raji几乎没有作用，说明UCAR-T有良好的特异性(图8)。此外，UCAR-T细胞均产生促炎细胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α，以响应CD123+阳性的AML靶细胞(图9)。
实施例9 异种移植物小鼠模型抗肿瘤实验
采用异种移植物小鼠模型来评估CD123通用型CAR-T的体内抗肿瘤活性。采用两种急性髓系白血病模型进行评估。
通过NCG小鼠尾静脉注射5×106个THP-1-mCherry.ffLuc细胞建立了急性髓系白血病(AML)小鼠肿瘤模型，以验证CD123 Universal CAR-T的体内效果。在接种后第5天将NCG小鼠随机分成3组，每组5只，并经尾静脉分别注射1×107个Mock T细胞、1×107个CD123UCAR-T细胞，并设置注射PBS的对照组。每天观察小鼠的生长状态和存活情况，记录生存期。结果表明，UCAR-T治疗组观察到明显的肿瘤进展的延缓，荷瘤小鼠的生存时间明显延长。在第15天使用流式细胞仪检测小鼠外周血中mCherry阳性肿瘤细胞的相对百分比，治疗组的肿瘤细胞百分比更低(图9)。
随后，为进一步验证Universal CAR-T在体内抗肿瘤效果，选取了CD123高表达的MV411-mCherry.ffLuc细胞系细胞建立了另一个急性髓系白血病(AML)小鼠肿瘤模型。经NCG小鼠尾静脉接种MV411-mcherry.ffLuc细胞后第5天，随机将成瘤的NCG小鼠分成3组，每组5只，并经尾静脉分别注射1×107个Mock T细胞、1×107个CD123 UCAR-T细胞，设置注射PBS的对照组，每日观察小鼠健康状态和存活情况，记录生存时间。结果表明，UCAR-T治疗组观察到明显的肿瘤进展的延缓，小鼠的生存时间明显延长。在第15天流式细胞仪检测UCAR-T治疗组小鼠外周血中mCherry阳性的肿瘤细胞比例相比对照组的细胞百分比更低(图10)。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (15)

1.一种抗CD123的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包括：CDR1~3的氨基酸序列如以下任一项所示的重链可变区：
如SEQ ID No.1~3所示；
如SEQ ID No.6~8所示；
如SEQ ID No.31~33所示；
如SEQ ID No.46~48所示；
如SEQ ID No.101~103所示。
2.根据权利要求1所述的抗CD123的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体还包括骨架区。
3.根据权利要求1所述的抗CD123的纳米抗体，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸列如SEQ ID No.4、9、34、49、104、106、108、110、112和114中任意一项所示。
4.一种分离的核酸，其特征在于，其编码如权利要求1~3任一项所述的抗CD123的纳米抗体。
5.一种重组载体，其特征在于，其含有如权利要求4所述的分离的核酸。
6.一种宿主细胞，其特征在于，其含有如权利要求5所述的重组载体。
7.一种抗CD123的纳米抗体的制备方法，其特征在于，其包括：培养如权利要求6所述的宿主细胞，以获得所述抗CD123的纳米抗体。
8.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域包括如权利要求1~3任一项所述的抗CD123的纳米抗体；所述抗CD123的纳米抗体的CDR1~3的氨基酸序列如SEQ ID No.31~33所示，所述嵌合抗原受体还包括信号肽、铰链区、跨膜区和信号转导结构域。
9.根据权利要求8所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述信号转导结构域包括CD3ζ。
10.根据权利要求8所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述信号转导结构域还包括4-1BB胞内区。
11.一种CAR-T细胞，其特征在于，其包括如权利要求8~10任一项所述的嵌合抗原受体。
12.根据权利要求11所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞包括通用型CAR-T细胞和自体CAR-T细胞中的至少一种。
13.如权利要求1~3任一项所述的抗CD123的纳米抗体或如权利要求4所述的分离的核酸或如权利要求5所述的重组载体或如权利要求6所述的宿主细胞或如权利要求8~10任一项所述的嵌合抗原受体或如权利要求11或12所述的CAR-T细胞在制备预防或治疗肿瘤的产品中的应用；所述肿瘤为急性髓系白血病（AML）、原始浆细胞样树突状细胞瘤（BPDCN）、急性淋巴细胞性白血病/淋巴瘤（ALL）中的至少一种。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述产品包括：免疫细胞、试剂、试剂盒、药物和药物组合物中的至少一种。
15.一种细胞注射液，其特征在于，其包括如权利要求1~3任一项所述的抗CD123的纳米抗体或如权利要求4所述的分离的核酸或如权利要求5所述的重组载体或如权利要求6所述的宿主细胞或如权利要求8~10任一项所述的嵌合抗原受体或如权利要求11或12所述的CAR-T细胞。
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