CN117777270A - 一种t细胞受体(tcr)及其用途 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一种T细胞受体(TCR)及其用途，其中，所述TCR包含含有可变区的α链和/或含有可变区的β链，α链的可变区包含氨基酸序列为如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的互补决定区1(CDR1)；和/或氨基酸序列为如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的互补决定区2(CDR2)；和/或氨基酸序列为如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的互补决定区3(CDR3)；所述β链的可变区包含氨基酸序列为如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示的互补决定区1(CDR1)；和/或氨基酸序列为如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示的互补决定区2(CDR2)；和/或氨基酸序列为如SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示的互补决定区3(CDR3)。本申请的TCR能够特异性识别A1101限制性KRASG12V突变，转导本申请的TCR的T细胞(TCR‑T)能够与抗原短肽‑HLA‑A1101复合物结合，可以用于治疗携带KRASG12V突变的恶性肿瘤。
Description
技术领域
本申请涉及医药技术领域，尤其涉及特异性识别A1101限制性KRASG12V突变的TCR及其用途。
背景技术
转移性结直肠癌患者中普遍存在KRAS突变，其中，G12D突变占45％、G12V突变占30％。KRAS是由RAS家族成员基因编码的一种GTP酶蛋白，参与表皮生长因子受体EGFR信号转导，调控细胞生长、分化、增殖和存活。RAS突变导致GTP酶活性缺陷，造成RAF-MAPK细胞信号级联效应过度激活。KRAS突变的肿瘤普遍侵袭性更强预后更差，已有研究表明KRAS结直肠癌患者对EGFR单抗(西妥昔单抗或帕尼单抗)耐药。因此NCCN指南建议所有转移性结直肠癌患者进行RAS基因检测，EGFR单抗仅能应用于RAS野生型的患者。针对KRAS的靶向药开发一直困难重重，KRAS一度被认为是“不可成药的靶点”。对于RAS蛋白的突变形式和信号通路研究，近年来分子生物学已取得重大进展，然而开发相关的靶向药物却依然挑战重重。在化学药开发方向，由于RAS蛋白结构平滑，其表面结合小分子的疏水性口袋并不明显；在生物药开发方向，抗体药需要穿透细胞膜靶向RAS蛋白，因此药物递送效率很低。研发十几年至今，仅有一款针对KRASG12C的小分子靶向药AMG510于2021年5月29日在美国获批上市。然而，G12C突变在肺癌患者中比例较高(约50％)，在结直肠癌患者中仅占10％左右。因此，临床上亟需针对结肠癌KRAS突变的新型药物。
特异性T细胞免疫治疗是指利用针对肿瘤抗原的特异性T细胞来杀伤肿瘤细胞的方法，是一种高度个性化的肿瘤免疫治疗方法。由于肿瘤局部免疫抑制微环境的存在，病人体内的自身T细胞杀伤肿瘤的功能有限。因此，人们试图通过对T细胞进行基因改造的方法提高其杀伤肿瘤的能力。TCR-T和CAR-T均为基因修饰过的细胞治疗药物，通过转入的T细胞受体(T cell receptor，TCR)或嵌合抗原受体(CAR)基因与相应靶点结合后，即可激活T细胞，利用T细胞释放的颗粒酶、穿孔素、细胞因子等清除肿瘤细胞；但TCR-T和CAR-T的显著的不同点在于：CAR-T的靶点是细胞表面的膜蛋白，而TCR-T的靶点则是抗原短肽-MHC复合物(peptide-major histocompatibility complex，pMHC)。
TCR具有主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)限制性，已发现人类MHC(又称为人类白细胞抗原，human leukocyte antigen，HLA)在不同人群中的出现频率有很大差异，中国人群中最常见的HLA类型为A1101以及A2402，白种人最常见HLA类型为A0201。已知的TCR靶点有限，且多为西方人群中分布较多的A0201呈递靶点，如目前国内和国际TCR-T企业集中追捧的NY-ESO-1、HPV E6/E7等均只能针对A0201分型的病人。因此，针对中国人群中更多的HLA-A1101分型开发KRAS突变TCR-T药物，将使得更多中国患者获益。
因此，本领域技术人员致力于筛选可以特异性识别A1101限制性KRASG12V突变的TCR，从而使他们在T细胞免疫治疗中发挥作用。
发明内容
为了解决上述现有技术中，无针对HLA-A1101分型开发KRAS突变TCR-T药物的缺陷，本申请提供了一种T细胞受体(TCR)，能够特异性识别A1101限制性-KRASG12V突变，转导了本申请的TCR的T细胞(TCR-T)能够与抗原短肽KRASG12V-HLA-A1101复合物结合，针对肿瘤抗原特异性杀伤肿瘤细胞，可以用于治疗携带KRASG12V突变的恶性肿瘤。同时，本申请还提供了该T细胞受体的用途。
具体来说，本申请涉及以下方面：
1.一种T细胞受体(TCR)，其中，所述TCR包含含有可变区的α链和/或含有可变区的β链，
α链的可变区包含氨基酸序列为如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的互补决定区1(CDR1)；和/或
氨基酸序列为如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的互补决定区2(CDR2)；和/或
氨基酸序列为如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的互补决定区3(CDR3)。
2.根据项1所述的T细胞受体(TCR)，其中，
所述β链的可变区包含氨基酸序列为如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示的互补决定区1(CDR1)；和/或
氨基酸序列为如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示的互补决定区2(CDR2)；和/或
氨基酸序列为如SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示的互补决定区3(CDR3)。
3.根据项1或2所述的T细胞受体(TCR)，其中，
所述α链的可变区还包括第一先导序列；和/或
所述β链的可变区还包括第二先导序列，
优选地，所述α链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示，或与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，和/或所述β链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示，或与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，
优选地，所述α链还包含α恒定区，和/或所述β链还包含β恒定区，优选地，所述恒定区为小鼠恒定区或人恒定区。
4.根据项1-3中任一项所述的T细胞受体(TCR)，其中，所述TCR是分离的或纯化的或者是重组的；
优选地，所述TCR是人的；
优选地，所述TCR是单克隆的；
优选地，所述TCR是单链；
优选地，所述TCR包含两条链；
优选地，所述TCR为细胞结合的形式或为可溶的形式，优选为可溶的形式；
优选地，所述TCR与抗原短肽-HLA-A1101复合物结合，优选地，所述抗原短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
5.一种核酸分子，其中，所述核酸分子包含编码项1-4中任一项所述的TCR或者所述TCR的α链或β链的核苷酸序列。
6.根据项5所述的核酸分子，其中编码α链的核苷酸序列为如SEQ ID NO:17或SEQID NO:18所示的核苷酸序列；和/或
编码β链的核苷酸序列为如SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列。
7.一种载体，其中，所述载体包含项5或6所述的核酸分子。
8.根据项7所述的载体，其中，所述载体为表达载体；
优选地，所述载体为病毒载体，优选为逆转录病毒载体；
优选地，所述病毒载体为慢病毒载体。
9.一种工程化细胞，其包含项1-4中任一项所述的TCR、项5-6中任一项所述的核酸分子，或项7-8中任一项所述的载体。
10.根据项9所述的工程化细胞，其中，所述TCR对所述细胞是异源的；
优选地，所述工程化细胞是细胞系；
优选地，所述工程化细胞是获自受试者的原代细胞，优选地，所述受试者为哺乳动物受试者，优选为人；
优选地，所述工程化细胞是T细胞或NK细胞，优选地，所述T细胞是从外周血分离的T细胞；
优选地，所述T细胞为CD8+或CD4+。
11.一种生产项9-10中任一项所述的工程化细胞的方法，其包括在体外或离体地将项5-6中任一项所述的核酸分子或者项7-8中任一项所述的载体引入细胞中。
12.根据项11所述的方法，其中，所述载体为病毒载体，并且所述引入是通过转导进行的。
13.一种药物组合物，其包含项1-4中任一项所述的T细胞受体(TCR)、项5-6任一项所述的核酸分子、项7-8中任一项所述的载体或者项9-10中任一项所述的工程化细胞；
优选地，其还包含药学上可接受的载体或佐剂。
14.项1-4中任一项所述的T细胞受体(TCR)、项5-6中任一项所述的核酸分子、项7-8中任一项所述的载体、项9-10中任一项所述的工程化细胞，或项13所述的药物组合物在制备治疗恶性肿瘤的药物中的用途；
优选地，所述恶性肿瘤为结直肠癌、胰腺癌、肺癌、子宫内膜癌、多发性骨髓瘤、食管癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌。
发明效果
本申请的T细胞受体(TCR)，能够特异性识别A1101限制性-KRASG12V突变，转导了本申请的TCR的T细胞(TCR-T)能够与抗原短肽KRASG12V-HLA-A1101复合物结合，针对肿瘤抗原特异性杀伤肿瘤细胞，可以用于治疗携带KRASG12V突变的恶性肿瘤。
并且转导了本申请的TCR的T细胞能够被表达A11和KRASG12V突变的肿瘤细胞特异性激活；并且具有很好的特异性，仅识别KRASG12V突变，而不识别野生型KRAS和KRASG12D突变。
附图说明
图1显示出本申请所述TCR可以正确表达在Jurkat T细胞系中。
图2显示出转导本申请所述TCR的T细胞可以对负载KRASG12V抗原短肽的靶细胞起反应。
图3显示出本申请所述TCR可以正确表达在原代T细胞中。
图4显示出转导本申请所述TCR的T细胞与表达A11和KRASG12V突变的肿瘤细胞共孵育后干扰素-γ的释放。
图5显示出本申请的TCR具备很好的特异性，仅识别KRASG12V突变，而不识别野生型KRAS和KRASG12D突变。
具体实施方式
下面结合附图所描述的实施方式对本申请做以详细说明，其中所有附图中相同的数字表示相同的特征。虽然附图中显示了本申请的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本申请而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。
需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然而所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
本申请提供了一种T细胞受体(TCR)，其中，所述TCR包含含有可变区的α链和/或含有可变区的β链，α链的可变区包含氨基酸序列为如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的互补决定区1(CDR1)；和/或氨基酸序列为如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的互补决定区2(CDR2)；和/或氨基酸序列为如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的互补决定区3(CDR3)，
SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列为：DRVSQS；
SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列为：TSENNYY；
SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列为：IYSNGD；
SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列为：QEAYKQQN；
SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列为：AAVSGGSYIPT；
SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列为：AFMNGETSGSRLT。
在一个实施方案中，所述β链的可变区包含氨基酸序列为如SEQ ID NO:7或SEQ IDNO:8所示的互补决定区1(CDR1)；和/或氨基酸序列为如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示的互补决定区2(CDR2)；和/或氨基酸序列为如SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示的互补决定区3(CDR3)，
SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列为：SGDLS；
SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列为：SQVTM；
SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列为：YYNGEE；
SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列为：ANQGSEA；
SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列为：ASSVGGLAGELLETQY；
SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列为：SVIPHGLYEQY。
在一个实施方案中，所述α链的可变区还包括第一先导序列；和/或所述β链的可变区还包括第二先导序列。所述α链的可变区的第一先导序列和所述β链的可变区的第二先导序列是本领域技术人员公知的，例如所述α链的可变区的第一先导序列可以使用氨基酸序列如SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22所示的先导序列，所述β链的可变区的第二先导序列可以使用氨基酸序列如SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的先导序列，
SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列为：MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQ；
SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列为：MTRVSLLWAVVVSTCLESGM；
SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列为：MGFRLLCCVAFCLLGAGPV；
SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列为：MLSLLLLLLGLGSVF；
在一个实施方案中，所述α链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示，或与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，和/或所述β链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示，或与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列为：MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRVSQSFFWYRQYSGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAAVSGGSYIPTFGRGTSLIVHPY；SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列为：MTRVSLLWAVVVSTCLESGMAQTVTQSQPEMSVQEAETVTLSCTYDTSENNYYLFWYKQPPSRQMILVIRQEAYKQQNATENRFSVNFQKAAKSFSLKISDSQLGDTAMYFCAFMNGETSGSRLTFGEGTQLTVNPD；SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列为：MGFRLLCCVAFCLLGAGPVDSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYQQSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSVGGLAGELLETQYFGPGTRLLVL；SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列为：MLSLLLLLLGLGSVFSAVISQKPSRDICQRGTSLTIQCQVDSQVTMMFWYRQQPGQSLTLIATANQGSEATYESGFVIDKFPISRPNLTFSTLTVSNMSPEDSSIYLCSVIPHGLYEQYFGPGTRLTVT。
所述α链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，可以是与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％序列相同性的氨基酸序列。所述β链的可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，可以是与SEQ IDNO:15或SEQ ID NO:16具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％序列相同性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述α链还包含α恒定区，和/或所述β链还包含β恒定区，优选地，所述恒定区为小鼠恒定区或人恒定区。例如，小鼠α恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示；和/或小鼠β恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:26，即对于上述的TCR的α链的恒定区，可以均具有相同的恒定区，同理，所有TCR的β链的恒定区也可以均具有相同的恒定区。
SEQ ID NO:25所示的氨基酸为：IQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS；
SEQ ID NO:26所示的氨基酸为：EDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYHQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSGLVLMAMVKKKNS。
所述TCR的恒定区可以含有短连接序列，其中半胱氨酸残基形成二硫键，从而连接TCR的两条链。TCR可以在α和β链中的每一个中具有另外的半胱氨酸残基，使得TCR在恒定区中含有两个二硫键。
在一个实施方案中，所述TCR的α链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13且β链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，或者α链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14且β链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。
在一个实施方案中，所述TCR的α链和β链恒定区的残基之间引入人工二硫键，可以引入的二硫键的位置是本领域技术人员公知的。
在一个实施方案中，所述TCR是分离的或纯化的或者是重组的。
在一个实施方案中，所述TCR是人的。
在一个实施方案中，所述TCR是单克隆的。
在一个实施方案中，所述TCR是单链。
在一个实施方案中，所述TCR包含两条链。
TCR可以从生物来源获得，如来自细胞(如来自T细胞(例如细胞毒性T细胞))、T细胞杂交瘤或其他公众可获得的资源，例如，TCR可以源自多个动物物种之一，如人、小鼠、大鼠或其他哺乳动物，如通常来自人。
在一些实施方案中，所述TCR可以是细胞结合的形式的或为可溶形式，优选为可溶的形式。所述TCR为可溶的形式指的是在其疏水芯区域发生突变的TCR，这些疏水芯区域的突变优选为能够使本申请可溶性TCR的稳定性提高的突变。
本申请还提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含编码所述的TCR或或者所述TCR的α链或β链的核苷酸序列。
在一个实施方案中，编码α链的核苷酸序列为如SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列；和/或编码β链的核苷酸序列为如SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列为：ATGAAATCCTTGAGAGTTTTACTAGTGATCCTGTGGCTTCAGTTGAGCTGGGTTTGGAGCCAACAGAAGGAGGTGGAGCAGAATTCTGGACCCCTCAGTGTTCCAGAGGGAGCCATTGCCTCTCTCAACTGCACTTACAGTGACCGAGTTTCCCAGTCCTTCTTCTGGTACAGACAATATTCTGGGAAAAGCCCTGAGTTGATAATGTCCATATACTCCAATGGTGACAAAGAAGATGGAAGGTTTACAGCACAGCTCAATAAAGCCAGCCAGTATGTTTCTCTGCTCATCAGAGACTCCCAGCCCAGTGATTCAGCCACCTACCTCTGTGCCGCTGTATCAGGAGGAAGCTACATACCTACATTTGGAAGAGGAACCAGCCTTATTGTTCATCCGTATATCCAGAATCCAGAGCCCGCCGTGTATCAGCTGAAGGACCCAAGGAGCCAGGATTCCACCCTGTGCCTGTTCACAGACTTTGATAGCCAGATCAACGTGCCCAAGACCATGGAGTCCGGCACCTTCATCACAGACAAGTGCGTGCTGGATATGAAGGCCATGGACTCTAAGAGCAACGGCGCCATCGCCTGGAGCAATCAGACCTCCTTCACATGCCAGGATATCTTTAAGGAGACCAATGCCACATATCCTTCCTCTGACGTGCCATGTGATGCCACCCTGACAGAGAAGTCCTTCGAGACCGACATGAACCTGAATTTTCAGAACCTGTCTGTGATGGGCCTGCGCATCCTGCTGCTGAAGGTGGCCGGCTTCAATCTGCTGATGACCCTGAGGCTGTGGAGCTCC
SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列为：ATGACACGAGTTAGCTTGCTGTGGGCAGTCGTGGTCTCCACCTGTCTTGAATCCGGCATGGCCCAGACAGTCACTCAGTCTCAACCAGAGATGTCTGTGCAGGAGGCAGAGACTGTGACCCTGAGTTGCACATATGACACCAGTGAGAATAATTATTATTTGTTCTGGTACAAGCAGCCTCCCAGCAGGCAGATGATTCTCGTTATTCGCCAAGAAGCTTATAAGCAACAGAATGCAACGGAGAATCGTTTCTCTGTGAACTTCCAGAAAGCAGCCAAATCCTTCAGTCTCAAGATCTCAGACTCACAGCTGGGGGACACTGCGATGTATTTCTGTGCTTTCATGAATGGAGAAACCAGTGGCTCTAGGTTGACCTTTGGGGAAGGAACACAGCTCACAGTGAATCCTGATATCCAGAATCCAGAGCCCGCCGTGTATCAGCTGAAGGACCCAAGGAGCCAGGATTCCACCCTGTGCCTGTTCACAGACTTTGATAGCCAGATCAACGTGCCCAAGACCATGGAGTCCGGCACCTTCATCACAGACAAGTGCGTGCTGGATATGAAGGCCATGGACTCTAAGAGCAACGGCGCCATCGCCTGGAGCAATCAGACCTCCTTCACATGCCAGGATATCTTTAAGGAGACCAATGCCACATATCCTTCCTCTGACGTGCCATGTGATGCCACCCTGACAGAGAAGTCCTTCGAGACCGACATGAACCTGAATTTTCAGAACCTGTCTGTGATGGGCCTGCGCATCCTGCTGCTGAAGGTGGCCGGCTTCAATCTGCTGATGACCCTGAGGCTGTGGAGCTCC
SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列为：ATGGGCTTCAGGCTCCTCTGCTGTGTGGCCTTTTGTCTCCTGGGAGCAGGCCCAGTGGATTCTGGAGTCACACAAACCCCAAAGCACCTGATCACAGCAACTGGACAGCGAGTGACGCTGAGATGCTCCCCTAGGTCTGGAGACCTCTCTGTGTACTGGTACCAACAGAGCCTGGACCAGGGCCTCCAGTTCCTCATTCAGTATTATAATGGAGAAGAGAGAGCAAAAGGAAACATTCTTGAACGATTCTCCGCACAACAGTTCCCTGACTTGCACTCTGAACTAAACCTGAGCTCTCTGGAGCTGGGGGACTCAGCTTTGTATTTCTGTGCCAGCAGCGTAGGCGGGCTAGCGGGAGAACTATTGGAGACCCAGTACTTCGGGCCAGGCACGCGGCTCCTGGTGCTAGAGGATCTGAGGAACGTGACACCCCCTAAGGTGTCTCTGTTCGAGCCCAGCAAGGCCGAGATCGCCAATAAGCAGAAGGCCACCCTGGTGTGCCTGGCAAGGGGCTTCTTTCCTGATCACGTGGAGCTGTCTTGGTGGGTGAACGGCAAGGAGGTGCACAGCGGCGTGTGCACCGACCCACAGGCCTACAAGGAGTCCAATTACTCTTATTGTCTGAGCTCCCGGCTGAGAGTGTCCGCCACATTTTGGCACAACCCTAGAAATCACTTCAGGTGCCAGGTGCAGTTTCACGGCCTGAGCGAGGAGGATAAGTGGCCAGAGGGATCCCCAAAGCCTGTGACCCAGAACATCTCTGCCGAGGCATGGGGAAGGGCAGACTGTGGAATCACATCCGCCTCTTATCACCAGGGCGTGCTGAGCGCCACCATCCTGTACGAGATCCTGCTGGGCAAGGCCACACTGTATGCCGTGCTGGTGAGCGGCCTGGTGCTGATGGCCATGGTGAAGAAGAAGAACTCC
SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列为：ATGCTGAGTCTTCTGCTCCTTCTCCTGGGACTAGGCTCTGTGTTCAGTGCTGTCATCTCTCAAAAGCCAAGCAGGGATATCTGTCAACGTGGAACCTCCCTGACGATCCAGTGTCAAGTCGATAGCCAAGTCACCATGATGTTCTGGTACCGTCAGCAACCTGGACAGAGCCTGACACTGATCGCAACTGCAAATCAGGGCTCTGAGGCCACATATGAGAGTGGATTTGTCATTGACAAGTTTCCCATCAGCCGCCCAAACCTAACATTCTCAACTCTGACTGTGAGCAACATGAGCCCTGAAGACAGCAGCATATATCTCTGCAGCGTTATCCCACACGGACTCTACGAGCAGTACTTCGGGCCGGGCACCAGGCTCACGGTCACAGAGGATCTGAGGAACGTGACACCCCCTAAGGTGTCTCTGTTCGAGCCCAGCAAGGCCGAGATCGCCAATAAGCAGAAGGCCACCCTGGTGTGCCTGGCAAGGGGCTTCTTTCCTGATCACGTGGAGCTGTCTTGGTGGGTGAACGGCAAGGAGGTGCACAGCGGCGTGTGCACCGACCCACAGGCCTACAAGGAGTCCAATTACTCTTATTGTCTGAGCTCCCGGCTGAGAGTGTCCGCCACATTTTGGCACAACCCTAGAAATCACTTCAGGTGCCAGGTGCAGTTTCACGGCCTGAGCGAGGAGGATAAGTGGCCAGAGGGATCCCCAAAGCCTGTGACCCAGAACATCTCTGCCGAGGCATGGGGAAGGGCAGACTGTGGAATCACATCCGCCTCTTATCACCAGGGCGTGCTGAGCGCCACCATCCTGTACGAGATCCTGCTGGGCAAGGCCACACTGTATGCCGTGCTGGTGAGCGGCCTGGTGCTGATGGCCATGGTGAAGAAGAAGAACTCC
在一个实施方案中，编码α链的核苷酸序列和/或编码β链的核苷酸序列是经密码子优化的。通常，密码子优化涉及使所选择的密码子的百分比与已公开的人类转移RNA的丰度平衡，使得没有一者过载或受限。在一些情况下，这可能是必要的，因为大多数氨基酸由多于一种密码子编码，并且密码子使用因生物而异。经转染的基因与宿主细胞之间的密码子使用差异可能会影响核酸构建体的蛋白质表达和免疫原性。通常，对于密码子优化，选择密码子以选择与人类使用频率平衡的那些密码子。通常，氨基酸密码子的冗余度使得不同的密码子编码一种氨基酸。在一些实施方案中，在选择用于置换的密码子时，可能需要所得突变是沉默突变，使得密码子改变不影响氨基酸序列。通常，密码子的最后一个核苷酸可以保持不变而不会影响氨基酸序列。
本申请提供了一种载体，所述载体包含上述所述的核酸分子。
例如，将编码上述TCR的一条或两条链的一种或多种核酸克隆到合适的一种或多种表达载体中，表达载体可以是任何合适的重组表达载体，并且可以用于转化或转染任何合适的宿主。合适的载体包括设计用于繁殖和扩增或用于表达或用于两者的那些，如质粒和病毒。
所述载体可以含有调节序列(如转录和翻译起始和终止密码子)，其对待引入载体的宿主的类型(例如，细菌、真菌、植物或动物)具有特异性，酌情并考虑载体是基于DNA还是基于RNA。载体也可以含有与编码TCR的核苷酸序列可操作连接的非天然启动子。所述启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，如巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子和在鼠干细胞病毒的长末端重复序列中发现的启动子，也考虑了熟练技术人员已知的其他启动子。
所述载体为表达载体，优选为病毒载体，优选为逆转录病毒载体，进一步优选为慢病毒载体。
本申请还提供了一种包含上述所述核酸分子的宿主细胞，为了重组产生TCR，可以将编码TCR的核酸分离，并且将其插入一种或多种载体中，以在宿主细胞中进一步克隆/或表达。可以使用常规技术(例如，通过使用能够与编码TCR的α链和β链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离和测序这种核酸。在一些实施方案中，提供了制备TCR的方法，其中，所述方法包括在适合于表达TCR分子的条件下培养如上提供的包含编码TCR的核酸的宿主细胞，以及任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收TCR。
所述宿主细胞是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括转化体和转化细胞，其包括原代转化细胞和源自其的后代，不考虑传代次数。后代在核酸含量上可能与亲代细胞不完全相同，但可能含有突变。
本申请还提供了一种工程化细胞，其包含所述的T细胞受体(TCR)、上述核酸分子或者上述载体。
在一个实施方案中，所述TCR对所述细胞是异源的。
在一个实施方案中，所述工程化细胞是细胞系。
在一个实施方案中，所述工程化细胞是获自受试者的原代细胞，优选地，所述受试者为哺乳动物受试者，优选为人。
在一个实施方案中，所述工程化细胞是T细胞，优选是从外周血分离的T细胞。
在一个实施方案中，所述T细胞为CD8+或CD4+。
所述工程化细胞例如可以是细胞群体或者表达TCR的基因工程化细胞，该细胞通常是真核细胞，如哺乳动物细胞，并且通常是人细胞。在一些实施方案中，细胞源自血液、骨髓、淋巴或淋巴器官，是免疫系统的细胞，如先天免疫或适应性免疫的细胞，例如骨髓或淋巴样细胞(包括淋巴细胞，通常是T细胞和/或NK细胞)。其他示例性细胞包括干细胞，如多潜能干细胞和多能干细胞，包括诱导多能干细胞(iPSC)。细胞通常是原代细胞，如直接从受试者分离和/或从受试者分离并冷冻的那些。在一些实施方案中，细胞包括T细胞或其他细胞类型的一个或多个子集，如整个T细胞群、CD4+细胞、CD8+细胞及其亚群。
T细胞和/或CD4+和/或CD8+T细胞的亚型和亚群包括幼稚T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型(如干细胞记忆T(TSCM)、中枢记忆T(TCM)、效应记忆T(TEM)或终末分化的效应记忆T细胞)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关恒定T(MAIT)细胞、天然存在和适应性调节T(Treg)细胞等。
在一些实施方式中，所述工程化细胞是自然杀伤(NK)细胞，优选地，细胞是单核细胞或粒细胞，例如骨髓细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。
本申请提供了一种生产上述所述的工程化细胞的方法，其包括在体外或离体地将上述核酸分子或者上述载体引入细胞中。
所述载体为病毒载体，并且所述引入是通过转导进行的。
本申请提供了一种药物组合物，其包含上述T细胞受体(TCR)、上述核酸分子、上述载体或者上述工程化细胞。
在一个实施方案中，其还包含药学上可接受的载体或佐剂。
所述药学上可接受的载体或佐剂是指药物组合物中除了活性成分之外对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体或佐剂包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
所述药物组合物可以利用定时释放、延迟释放和持续释放递送系统，使得所述组合物的递送发生在待治疗部位的致敏之前并且有足够的时间引起致敏。许多类型的释放递送系统是可用的并且是已知的。此类系统可用避免重复给予所述组合物，从而增加受试者和医生的便利性。
本申请提供了上述所述的T细胞受体(TCR)、上述核酸分子、上述载体、上述工程化细胞或者上述药物组合物在制备治疗恶性肿瘤的药物中的用途。
在一个实施方案中，所述恶性肿瘤为结直肠癌、胰腺癌、肺癌、子宫内膜癌、多发性骨髓瘤、食管癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌。
在一个实施方案中，所述结直肠癌为转移性结直肠癌。
本申请的T细胞受体(TCR)，能够特异性识别A1101限制性-KRASG12V突变，转导了本申请的TCR的T细胞(TCR-T)能够与抗原短肽KRASG12V-HLA-A1101复合物结合，针对肿瘤抗原特异性杀伤肿瘤细胞，可以用于治疗携带KRASG12V突变的恶性肿瘤。
并且转导了本申请的TCR的T细胞能够被表达A11和KRASG12V突变的肿瘤细胞特异性激活；并且具有很好的特异性，仅识别KRASG12V突变，而不识别野生型KRAS和KRASG12D突变。
实施例
本申请对试验中所用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述，在下面的实施例中，如果无其他特别的说明，％表示wt％，即重量百分数。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1：克隆KRASG12V抗原短肽特异性T细胞及TCR基因获得
利用合成短肽SEQ ID NO:27:VVVGAVGVGK(江苏金斯瑞生物科技有限公司)刺激来自于基因型为HLA-A1101的健康志愿者的外周血淋巴细胞。将VVVGAVGVGK短肽与带有生物素标记的HLA-A1101复性，制备pHLA(短肽-人类白细胞抗原复合物)单体。这些单体与用PE标记的链霉亲和素(BD公司)组合成PE(藻红蛋白，Phycoerythrin)标记的四聚体(其中，pHLA单体和四聚体的制作方法参照NIH Tetramer Core Facility公开的protocol，具体步骤见网页https://tetramer.yerkes.emory.edu/support/protocols#1)，富集该四聚体及抗-CD8-FITC(异硫氰酸荧光素)双阳性细胞，获得的双阳性细胞进行流式分选获得单细胞，此即抗原特异性T细胞，将分选获得的单细胞用一步法RT-PCR试剂盒(QIAGEN凯杰，目录号210212)分别扩增TCRα链及β链，将PCR产物测序。将测序结果与IMGT(国际免疫遗传学信息系统)的公开数据库中的序列进行比对，即可以获得TCR(TCR059和TCR076)的α链可变区序列及β链可变区的核苷酸序列及其CDR1、CDR2、CDR3的信息。
TCR059的α链可变区的核苷酸序列为：SEQ ID NO:28：ATGAAATCCTTGAGAGTTTTACTAGTGATCCTGTGGCTTCAGTTGAGCTGGGTTTGGAGCCAACAGAAGGAGGTGGAGCAGAATTCTGGACCCCTCAGTGTTCCAGAGGGAGCCATTGCCTCTCTCAACTGCACTTACAGTGACCGAGTTTCCCAGTCCTTCTTCTGGTACAGACAATATTCTGGGAAAAGCCCTGAGTTGATAATGTCCATATACTCCAATGGTGACAAAGAAGATGGAAGGTTTACAGCACAGCTCAATAAAGCCAGCCAGTATGTTTCTCTGCTCATCAGAGACTCCCAGCCCAGTGATTCAGCCACCTACCTCTGTGCCGCTGTATCAGGAGGAAGCTACATACCTACATTTGGAAGAGGAACCAGCCTTATTGTTCATCCGTAT；
TCR059的β链可变区的核苷酸序列为：SEQ ID NO:29：ATGGGCTTCAGGCTCCTCTGCTGTGTGGCCTTTTGTCTCCTGGGAGCAGGCCCAGTGGATTCTGGAGTCACACAAACCCCAAAGCACCTGATCACAGCAACTGGACAGCGAGTGACGCTGAGATGCTCCCCTAGGTCTGGAGACCTCTCTGTGTACTGGTACCAACAGAGCCTGGACCAGGGCCTCCAGTTCCTCATTCAGTATTATAATGGAGAAGAGAGAGCAAAAGGAAACATTCTTGAACGATTCTCCGCACAACAGTTCCCTGACTTGCACTCTGAACTAAACCTGAGCTCTCTGGAGCTGGGGGACTCAGCTTTGTATTTCTGTGCCAGCAGCGTAGGCGGGCTAGCGGGAGAACTATTGGAGACCCAGTACTTCGGGCCAGGCACGCGGCTCCTGGTGCTA；
TCR059的α链的互补决定区1(CDR1)的氨基酸序列为：SEQ ID NO:1：DRVSQS；
TCR059的α链的互补决定区2(CDR2)的氨基酸序列为：SEQ ID NO:3：IYSNGD；
TCR059的α链的互补决定区3(CDR3)的氨基酸序列为：SEQ ID NO:5：AAVSGGSYIPT；
TCR059的β链的互补决定区1(CDR1)的氨基酸序列为：SEQ ID NO:7：SGDLS；
TCR059的β链的互补决定区2(CDR2)的氨基酸序列为：SEQ ID NO:9：YYNGEE；
TCR059的β链的互补决定区3(CDR3)的氨基酸序列为：SEQ ID NO:11：ASSVGGLAGELLETQY；
TCR076的α链可变区的核苷酸序列为：SEQ ID NO:30：ATGACACGAGTTAGCTTGCTGTGGGCAGTCGTGGTCTCCACCTGTCTTGAATCCGGCATGGCCCAGACAGTCACTCAGTCTCAACCAGAGATGTCTGTGCAGGAGGCAGAGACTGTGACCCTGAGTTGCACATATGACACCAGTGAGAATAATTATTATTTGTTCTGGTACAAGCAGCCTCCCAGCAGGCAGATGATTCTCGTTATTCGCCAAGAAGCTTATAAGCAACAGAATGCAACGGAGAATCGTTTCTCTGTGAACTTCCAGAAAGCAGCCAAATCCTTCAGTCTCAAGATCTCAGACTCACAGCTGGGGGACACTGCGATGTATTTCTGTGCTTTCATGAATGGAGAAACCAGTGGCTCTAGGTTGACCTTTGGGGAAGGAACACAGCTCACAGTGAATCCTGAT；
TCR076的β链可变区的核苷酸序列为：SEQ ID NO:31：ATGCTGAGTCTTCTGCTCCTTCTCCTGGGACTAGGCTCTGTGTTCAGTGCTGTCATCTCTCAAAAGCCAAGCAGGGATATCTGTCAACGTGGAACCTCCCTGACGATCCAGTGTCAAGTCGATAGCCAAGTCACCATGATGTTCTGGTACCGTCAGCAACCTGGACAGAGCCTGACACTGATCGCAACTGCAAATCAGGGCTCTGAGGCCACATATGAGAGTGGATTTGTCATTGACAAGTTTCCCATCAGCCGCCCAAACCTAACATTCTCAACTCTGACTGTGAGCAACATGAGCCCTGAAGACAGCAGCATATATCTCTGCAGCGTTATCCCACACGGACTCTACGAGCAGTACTTCGGGCCGGGCACCAGGCTCACGGTCACA；
TCR076的α链的互补决定区1(CDR1)的氨基酸序列为：SEQ ID NO:2：TSENNYY；
TCR076的α链的互补决定区2(CDR2)的氨基酸序列为：SEQ ID NO:4：QEAYKQQN；
TCR076的α链的互补决定区3(CDR3)的氨基酸序列为：SEQ ID NO:6：AFMNGETSGSRLT；
TCR076的β链的互补决定区1(CDR1)的氨基酸序列为：SEQ ID NO:8：SQVTM；
TCR076的β链的互补决定区2(CDR2)的氨基酸序列为：SEQ ID NO:10：ANQGSEA；
TCR076的β链的互补决定区3(CDR3)的氨基酸序列为：SEQ ID NO:12：SVIPHGLYEQY。
实施例2：VVVGAVGVGK抗原短肽特异性TCR慢病毒载体构建及慢病毒包装
(1)TCR慢病毒载体构建
将VVVGAVGVGK TCRα和β链可变区序列克隆至基于pLKO的表达质粒(Addgene)，通过多片段重组克隆试剂盒(诺唯赞生物科技公司，目录号C113)标准方法将α或β可变结构域克隆到含有鼠α或β恒定区的基于PLKO的表达质粒中，将连接的质粒转化到感受态大肠杆菌菌株Stbl3细胞(上海唯地生物技术有限公司)中并接种于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB/琼脂平板上。在37℃下过夜孵育之后，挑取单个菌落并在37℃下在10ml的含有100μg/ml氨苄青霉素的LB中振荡过夜生长。使用小提中量试剂盒(天根生化科技公司(TIANGEN)目录号#DP118-02)纯化克隆的质粒并且对质粒进行测序得到VVVGAVGVGK TCR(即TCR059，TCR076)质粒。
(2)慢病毒包装
试验培养基：10％FBS(Lonsera，目录号S711-001)，DMEM(赛默飞公司(ThermoFisher)，目录号C11995500BT)。
准备293T细胞(保藏机构为美国典型培养物保藏中心即ATCC，保藏目录号为CRL-1573)在10cm皿中培养，在不超过80％满度的时候开始质粒转染，病毒包装质粒和VVVGAVGVGK TCR质粒的比例为1:1，共10μg。将上述质粒加在无血清的DMEM培养基中与PEI(polyethylenimine，聚乙烯亚胺)混合，然后将加质粒的混合液加到293T细胞中，37度培养。72h后，将细胞的上清用100kd超滤管浓缩收集病毒载体。
实施例3：表达VVVGAVGVGK抗原短肽特异性TCR的Jurkat细胞系构建及功能鉴定
活化T细胞核因子(NFAT)报告基因表达方法
进行以下试验以证明TCR转导的T细胞对靶细胞特异性的激活反应。利用流式细胞分析技术检测NFAT表达量作为T细胞激活的读出值。
(1)试剂
试验培养基：10％FBS(Lonsera，目录号S711-001)，RPMI1640(赛默飞公司(ThermoFisher)，目录号C11875500BT)
(2)方法
靶细胞制备
本实验中所用的靶细胞为T2-A11细胞(T2细胞保藏于ATCC，保藏目录号为CRL-1992，T2-A11细胞是参考Cancer Biology&Therapy，8:21，2025-2032在T2细胞基础上构建的)。在实验培养基中制备靶细胞，靶细胞浓度调至1.6×106个/毫升，每孔取50微升从而得80000个细胞/孔。
效应细胞制备
本实验的效应细胞为转导了本申请TCR的Jurkat-CD8-NFAT(JK8NF)细胞，并以未转染本申请TCR的JK8NF细胞作为对照组。
将JK8NF细胞(Jurkat细胞保藏于ATCC，保藏目录号为TIB-152，JK8NF细胞是参考Cancer Res 2006；66(23):11455-61，Front.Immunol.11:633.在Jurkat细胞基础上构建的)按MOI(感染复数)＝10加入实施例2中获得的携带本申请TCR基因的慢病毒，72小时后用流式细胞仪鉴定转染阳性率100％左右(其结果如图1所示)，将扩大培养后的效应细胞浓度调至1.6×106个/毫升，每孔取50微升从而得80000个细胞/孔。
短肽溶液制备
将原浓度5mg/ml短肽(VVVGAVGVGK)浓度稀释为400μg/ml，然后按10倍比例依次往下稀释成40μg/ml、4μg/ml、0.4μg/ml、0.04μg/ml、0.004μg/ml、0.0004μg/ml、0.00004μg/ml。
每孔取50微升使短肽在96孔板中的终浓度分别为100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml、0.001μg/ml、0.0001μg/ml、0.00001μg/ml。
最终每孔加50μl靶细胞，50μl效应细胞，50μl相应浓度短肽稀释液和50ul培养基于96孔平底板中，与37度细胞培养箱中孵育12h。
(3)结果
通过如上所述方法检验本申请TCR转导的T细胞对负载VVVGAVGVGK抗原短肽的靶细胞起反应的NFAT的表达。利用Graphpad prism8绘制NFAT的表达水平曲线，其结果如图2所示。
从图2可以看出，转导本申请TCR的T细胞对负载其特异的短肽的靶细胞有很好的激活反应。
实施例4：表达VVVGAVGVGK抗原短肽特异性TCR的原代T细胞体外功能鉴定
IFN gamma ELISPOT方法
(1)试剂
试验培养基：ELISPOT试剂盒(BD，目录号551849)，10％FBS(赛默飞公司(ThermoFisher)，目录号10099-044)，RPMI1640(赛默飞公司(ThermoFisher)，目录号C11875500BT)
(2)方法
效应T细胞制备
本实验的效应细胞(T细胞)为转导了本申请TCR的T细胞，并以同一志愿者未转染本申请TCR的T细胞作为对照T细胞(TCR阴性对照组)。
将志愿者的外周血经过密度梯度离心，获得外周血单个核细胞，将外周血单个核细胞按照24孔板每孔5.0×105/500μl置于孔中，共收集1x106细胞，用抗CD3/CD28磁珠刺激T细胞后置于37℃，5％CO2培养箱中培养。24h后观察细胞成团情况，按MOI(感染复数)＝2加入实施例3中获得的TCR慢病毒转导后，在含有200IU/ml IL-2的含10％FBS的1640培养基扩增直至转导后3-4天后，用流式细胞仪鉴定TCR转染效率(其结果如图3所示)。将扩大培养后的效应细胞浓度调至5.0×104个阳性细胞/毫升，每孔取100微升从而得5000个阳性细胞/孔。
在T2-A11靶细胞阳性对照组中，针对T2-A11+KRASG12V，TCR-T细胞数为2000个/孔。
靶细胞制备
本实验中所用的靶细胞SW 620(购自：ATCC，货号：CCL-227)，本身表达G12V突变，不表达A11，因此通过慢病毒载体过表达A11基因构建SW620-A11细胞，SW620-A11细胞为一个靶细胞组，SW620细胞为靶细胞阴性对照组，细胞数为50000个细胞/孔。上述两组同时加入HLA I类中和抗体(抗-HLA I，克隆号W6/32，购买自Biolegend，目录号311402)作为上述两组的对照组。本实验中所用的T2-A11细胞为靶细胞阳性对照组(T2细胞保藏于ATCC，保藏目录号为CRL-1992，T2-A11细胞是参考Cancer Biology&Therapy，8:21，2025-2032在T2细胞基础上构建的)，所用细胞数为20000个细胞/孔。
短肽溶液制备
将原浓度5mg/ml短肽(VVVGAVGVGK)浓度稀释成4μg/ml，取50微升使短肽在96孔板中的终浓度1μg/ml。
ELISPOT检测
按照生产商(BD，目录号551849)提供的说明书，如下所述准备孔板：以每块板5毫升无菌PBS按1：400稀释抗人IFN-γ捕捉抗体，然后将50微升的稀释捕捉抗体等分加入各孔。4℃下孵育孔板过夜。孵育后，洗涤孔板以除去多余的捕捉抗体。加入200微升含有10％FBS的PBS，温下温育孔板2小时以封闭孔板。倒掉封闭液，弹和轻拍ELISPOT孔板以除去任何残余的封闭液。
然后加入对应靶细胞和效应细胞及对应的短肽，温育孔板过夜(37℃/5％CO2)第二天，弃培养基，用双蒸水洗涤孔板2次，再用洗涤缓冲液洗涤3次，在纸巾上轻拍以除去残余的洗涤缓冲液。然后用含有10％FBS的PBS按1：400稀释检测抗体，按100微升/孔加入各孔。室温下温育孔板2小时，再用洗涤缓冲液洗涤3次，在纸巾上轻拍孔板以除去过量的洗涤缓冲液。
用含有10％FBS的PBS按1：200稀释链霉亲和素-碱性磷酸酶，将100微升稀释的链霉亲和素-碱性磷酸酶加入各孔并在室温下温育孔板1小时。然后用洗涤缓冲液洗涤3次PBS洗涤3次，在纸巾上轻拍孔板以除去过量的洗涤缓冲液和PBS。洗涤完毕后加入试剂盒提供的BCIP/NBT溶液100微升/孔进行显影。在显影期间用锡箔纸覆盖孔板避光，静置5-15分钟。在此期间常规检测显影孔板的斑点，确定终止反应的最佳时间。去除BCIP/NBT溶液并用双蒸水冲洗孔板以中止显影反应，甩干，然后将孔板底部去除，在室温下干燥孔板直至每个孔完全干燥，再利用免疫斑点平板计数仪计数孔板内底膜形成的斑点。通过ELISPOT实验(如上所述)检验本发明TCR转导的T细胞的功能。利用graphpad prism6绘制各孔中观察到的ELISPOT斑点数量。
(3)结果
从图4可以看出，表达VVVGAVGVGK-A1101抗原短肽特异性TCR的T细胞TCR059和TCR076对SW620-A11细胞系有很强的激活反应，对照T细胞则没有激活反应。加入HLA I类中和抗体之后可以抑制TCR059和TCR076对SW620-A11细胞系的识别。
实施例5：VVVGAVGVGK抗原短肽特异性TCR的交叉反应鉴定活化T细胞核因子(NFAT)报告基因表达方法
进行以下试验以证明VVVGAVGVGK抗原短肽特异性TCR对野生型KRAS以及KRASG12D突变没有交叉反应。
利用流式细胞分析技术检测NFAT表达量作为T细胞激活的读出值。
(1)试剂
试验培养基：10％FBS(Lonsera，目录号S711-001)，RPMI1640(赛默飞公司(ThermoFisher)，目录号C11875500BT)。
(2)方法
靶细胞制备
本实验中所用的靶细胞为T2-A11细胞(T2细胞保藏于ATCC，保藏目录号为CRL-1992，T2-A11细胞是参考Cancer Biology&Therapy，8:21，2025-2032在T2细胞基础上构建的)。在实验培养基中制备靶细胞，靶细胞浓度调至1.6×106个/毫升，每孔取50微升从而得80000个细胞/孔。
效应细胞制备
本实验的效应细胞为转导了本申请TCR的Jurkat-CD8-NFAT(JK8NF)细胞，并以未转染本申请TCR的JK8NF细胞作为对照组。
将JK8NF细胞(Jurkat细胞保藏于ATCC，保藏目录号为TIB-152，JK8NF细胞是参考Cancer Res 2006；66(23):11455-61，Front.Immunol.11:633.在Jurkat细胞基础上构建的)按MOI(感染复数)＝10加入实施例2中获得的携带本申请TCR基因的慢病毒，72小时后用流式细胞仪鉴定转染阳性率100％左右(其结果如图1所示)，将扩大培养后的效应细胞浓度调至1.6×106个/毫升，每孔取50微升从而得80000个细胞/孔。
短肽溶液制备
将原浓度5mg/ml短肽(VVVGAVGVGK(G12V)，VVVGAGGVGK(WT)VVVGADGVGK(G12D))浓度稀释为400μg/ml，然后按10倍比例依次往下稀释成40μg/ml、4μg/ml、0.4μg/ml、0.04μg/ml、0.004μg/ml、0.0004μg/ml、0.00004μg/ml。
每孔取50微升使短肽在96孔板中的终浓度分别为100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml、0.001μg/ml、0.0001μg/ml、0.00001μg/ml。
最终每孔加50μl靶细胞，50μl效应细胞，50μl相应浓度短肽稀释液和50ul培养基于96孔平底板中，与37度细胞培养箱中孵育12h。
(3)结果
通过如上所述方法检验本申请TCR转导的T细胞对负载KRASG12V，KRASWT以及KRASG12D三种抗原短肽的靶细胞起反应的NFAT的表达。利用Graphpad prism8绘制NFAT的表达水平曲线，其结果如图5所示。
从图5可以看出，本申请的TCR具备很好的特异性，仅识别KRASG12V突变，而不识别野生型KRAS和KRASG12D突变。
综上所述，本申请转导所述TCR的T细胞能够被表达A11+KRASG12V突变的复合物的肿瘤细胞特异性激活；并且具有很好的特异性，仅识别KRASG12V突变，而不识别野生型KRAS和KRASG12D突变。
以上所述，仅是本申请的较佳实施例而已，并非是对本申请作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本申请技术方案内容，依据本申请的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本申请技术方案的保护范围。
序列表
Claims (14)
1.一种T细胞受体(TCR)，其中，所述TCR包含含有可变区的α链和/或含有可变区的β链，
α链的可变区包含氨基酸序列为如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的互补决定区1(CDR1)；和/或
氨基酸序列为如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的互补决定区2(CDR2)；和/或
氨基酸序列为如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的互补决定区3(CDR3)。
2.根据权利要求1所述的T细胞受体(TCR)，其中，
所述β链的可变区包含氨基酸序列为如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示的互补决定区1(CDR1)；和/或
氨基酸序列为如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示的互补决定区2(CDR2)；和/或
氨基酸序列为如SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示的互补决定区3(CDR3)。
3.根据权利要求1或2所述的T细胞受体(TCR)，其中，
所述α链的可变区还包括第一先导序列；和/或
所述β链的可变区还包括第二先导序列，
优选地，所述α链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示，或与SEQID NO:13或SEQ ID NO:14具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，和/或所述β链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示，或与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，
优选地，所述α链还包含α恒定区，和/或所述β链还包含β恒定区，优选地，所述恒定区为小鼠恒定区或人恒定区。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的T细胞受体(TCR)，其中，所述TCR是分离的或纯化的或者是重组的；
优选地，所述TCR是人的；
优选地，所述TCR是单克隆的；
优选地，所述TCR是单链；
优选地，所述TCR包含两条链；
优选地，所述TCR为细胞结合的形式或为可溶的形式，优选为可溶的形式；
优选地，所述TCR与抗原短肽-HLA-A1101复合物结合，优选地，所述抗原短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
5.一种核酸分子，其中，所述核酸分子包含编码权利要求1-4中任一项所述的TCR或者所述TCR的α链或β链的核苷酸序列。
6.根据权利要求5所述的核酸分子，其中编码α链的核苷酸序列为如SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列；和/或
编码β链的核苷酸序列为如SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列。
7.一种载体，其中，所述载体包含权利要求5或6所述的核酸分子。
8.根据权利要求7所述的载体，其中，所述载体为表达载体；
优选地，所述载体为病毒载体，优选为逆转录病毒载体；
优选地，所述病毒载体为慢病毒载体。
9.一种工程化细胞，其包含权利要求1-4中任一项所述的TCR、权利要求5-6中任一项所述的核酸分子，或权利要求7-8中任一项所述的载体。
10.根据权利要求9所述的工程化细胞，其中，所述TCR对所述细胞是异源的；
优选地，所述工程化细胞是细胞系；
优选地，所述工程化细胞是获自受试者的原代细胞，优选地，所述受试者为哺乳动物受试者，优选为人；
优选地，所述工程化细胞是T细胞或NK细胞，优选地，所述T细胞是从外周血分离的T细胞；
优选地，所述T细胞为CD8+或CD4+。
11.一种生产权利要求9-10中任一项所述的工程化细胞的方法，其包括在体外或离体地将权利要求5-6中任一项所述的核酸分子或者权利要求7-8中任一项所述的载体引入细胞中。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述载体为病毒载体，并且所述引入是通过转导进行的。
13.一种药物组合物，其包含权利要求1-4中任一项所述的T细胞受体(TCR)、权利要求5-6任一项所述的核酸分子、权利要求7-8中任一项所述的载体或者权利要求9-10中任一项所述的工程化细胞；
优选地，其还包含药学上可接受的载体或佐剂。
14.权利要求1-4中任一项所述的T细胞受体(TCR)、权利要求5-6中任一项所述的核酸分子、权利要求7-8中任一项所述的载体、权利要求9-10中任一项所述的工程化细胞，或权利要求13所述的药物组合物在制备治疗恶性肿瘤的药物中的用途；
优选地，所述恶性肿瘤为结直肠癌、胰腺癌、肺癌、子宫内膜癌、多发性骨髓瘤、食管癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌。
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