CN117659164A - 识别ebv抗原的t细胞受体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了识别EBV抗原的T细胞受体及其应用，所述TCR包含含有可变区的α链和/或含有可变区的β链，α链的可变区包含氨基酸序列为如SEQ ID NO:4所示的互补决定区3(CDR3)或由如SEQ ID NO:4所示的互补决定区3(CDR3)组成；和/或所述β链的可变区包含氨基酸序列为如SEQ ID NO:7所示的互补决定区3(CDR3)或由如SEQ ID NO:7所示的互补决定区3(CDR3)组成，所述的TCR能够与EBV抗原短肽特异性结合，转录所述TCR的T细胞能够特异性识别HLA‑DP5呈递的抗原短肽，并且可以被表达HLA‑DP5和EBNA1的肿瘤细胞特异性激活，产生杀伤功能。

Description

识别EBV抗原的T细胞受体及其应用
技术领域
本申请涉及医药技术领域，尤其涉及识别EBV抗原的T细胞受体及其应用。
背景技术
EBV是已知的八种人类疱疹病毒之一，一种双链DNA病毒，γ-疱疹病毒亚科嗜淋巴细胞病毒属成员，具其有约173kb的线性双链DNA基因组，涵盖大约100种蛋白质的编码基因和许多非编码RNA和microRNA(miRNA)的基因。病毒携带者和患者是该病的传染源，主要途径为唾液传播，也可以血液传播。EBV具有生产性(溶解性)周期和非生产性(潜伏)期。EBV在B淋巴细胞建立长期潜伏感染和口腔黏膜上皮的生产性感染。只有溶解性周期才会产生感染性病毒，并伴随细胞裂解。EBV DNA作为线性基因组包装在感染性病毒颗粒中，但作为封闭的环状染色质基因组(称为“episome”)持续存在于潜伏感染细胞的细胞核中的染色体外，是一种载体状态，建立潜伏感染，有选择地进入一种潜伏期，仅表达一些潜伏蛋白。根据细胞类型，EBV感染的细胞经历四种不同的潜伏期程序(0，I，II，III)，具有不同的潜伏期蛋白表达模式。III型潜伏期与EBV感染的原代B细胞有关，表达所有九种已知的潜伏蛋白，由六种核抗原(EBNA1/2/3A/3B/3C/EBNA LP)和三种膜蛋白(LMP1/2A/2B)组成。受EBV感染的原代B细胞离开静息状态，成为增殖淋巴母细胞并转化为淋巴母细胞系(LCL)。随后，类似于抗原激活的B原代细胞，EBV感染的淋巴母细胞可能进入卵泡，其中一些细胞接收生存信号并在生发中心分化成为记忆B细胞，在生发中心的细胞显示出受限的EBV基因表达模式(EBNA1、LMP1、LMP2)，这被称为II型潜伏期。这是在鼻咽癌，胃癌和霍奇金淋巴瘤中观察到的典型潜伏期形式。LMP1和LMP2通过模拟CD40L介导的辅助T细胞信号，使生发中心受感染的B细胞能够存活，并进一步分化为记忆B细胞，仅表达EBNA1(I型潜伏期)或根本不表达潜伏蛋白(0型潜伏期)。伯基特淋巴瘤中一般是潜伏期I的潜伏期形式。如上所述，EBNA1是除潜伏期0以外的，在其他所有潜伏期中表达的病毒蛋白，也存在于所有EBV阳性肿瘤中，并且还代表一些肿瘤中唯一的潜伏蛋白。EBNA1对于病毒基因组维持和控制病毒基因表达至关重要，没有EBNA1，病毒就无法持续存在，因此可以作为将病毒相关癌细胞与正常细胞区分开来的标志物，从而为靶向治疗干预提供了机会。
EBV的感染呈全球性分布，通常其感染是无症状的，但是EBV具有强大的淋巴细胞生长转化能力，这与一些恶性肿瘤，例如淋巴瘤密切相关。EBV相关的淋巴瘤预后极差，传统的手术、化疗及放疗疗效不佳，并伴严重的不良反应，所以当务之急是需要探索新的治疗EBV相关肿瘤的手段。
特异性T细胞免疫治疗是指利用针对肿瘤抗原的特异性T细胞来杀伤肿瘤细胞的方法，是一种高度个性化的肿瘤免疫治疗方法。由于肿瘤局部免疫抑制微环境的存在，病人体内的自身T细胞杀伤肿瘤的功能有限。因此，人们试图通过对T细胞进行基因改造的方法提高其杀伤肿瘤的能力。TCR-T和CAR-T均为基因修饰过的细胞治疗药物，通过转入的T细胞受体(T cell receptor,TCR)或嵌合抗原受体(CAR)基因与相应靶点结合后，即可激活T细胞，利用T细胞释放的颗粒酶、穿孔素、细胞因子等清除肿瘤细胞。但CAR-T细胞治疗实体瘤和血液肿瘤的问题在于靶抗原都是细胞表面蛋白，而表面蛋白抗原通常不会在实体瘤上表达。所以即使CAR-T细胞对肿瘤细胞产生强大的杀伤效果，如果没有适当的、特定的细胞表面靶蛋白，CAR-T细胞疗法也无法产生真正的影响。而TCR-T细胞的靶点则是抗原短肽-MHC复合物(peptide-major histocompatibility complex,pMHC)。由于MHC分子可以递呈从细胞表面或细胞内的蛋白抗原获得的肽链，因此除了表面抗原外，TCR还可以靶向实体瘤常见表达的细胞内抗原，所以TCR可以靶向比CAR更多的抗原。
TCR具有MHC限制性，所以就需要确保所选择的病毒抗原能够被MHC限制性递呈。MHC在不同物种中有不同的名称，在人类中MHC又叫做人类白细胞抗原(human leukocyteantigen，HLA)，可以分为HLAI类或HLA II类，CD4 T细胞主要鉴别抗原递呈细胞表面的HLAII类分子；CD8 T细胞主要鉴别靶细胞表面的HLAI类分子。目前的TCR-T细胞疗法用于EBV相关癌症治疗的研究主要集中在CD8 T细胞上，但是EBNA1存在甘氨酸和丙胺酸重复序列(GAr)结构域，可能阻止其对HLA I类抗原处理途径的蛋白酶体降解，使得CD8 T细胞很少对EBNA1表位有反应，限制了EBV特异性CD8 T细胞对仅表达EBNA1肿瘤细胞的杀伤。因此需要将注意力转向CD4 T细胞，但是对于CD4 T细胞的表位的研究，也几乎完全集中在HLA基因分型为DPB1*0401递呈的EBV抗原短肽上，因为等位基因频率在不同人群之间表现出显着差异，中国人群中HLA-DPB表达频率最高的基因分型是DPB1*0501。所以，找到合适的针对在中国人群中频率更高的HLA-DP5分型限制性的，靶向EBNA1的CD4 T细胞反应表位尤为重要，开发相应的TCR-T药物也将使得更多中国患者获益。
因此，本领域技术人员致力于筛选可以特异性识别HLA-DP5限制性EBNA1特异性的CD4 TCR，从而使他们在T细胞免疫治疗中发挥作用。
发明内容
本申请的目的在于提供一种识别EBV抗原的T细胞受体(TCR)及其应用，本申请所述的TCR可以与EBV抗原短肽结合，转录了所述TCR的T细胞能够被特异性激活并且对表达HLA-DP5和EBV(EBNA1)的肿瘤细胞具有很强的杀伤作用。
本申请具体技术方案如下：
1.一种识别EBV抗原的T细胞受体(TCR)，其中，所述TCR包含含有可变区的α链和/或含有可变区的β链，α链的可变区包含氨基酸序列为如SEQ ID NO:4所示的互补决定区3(CDR3)或由如SEQ ID NO:4所示的互补决定区3(CDR3)组成；和/或
所述β链的可变区包含氨基酸序列为如SEQ ID NO:7所示的互补决定区3(CDR3)或由如SEQ ID NO:7所示的互补决定区3(CDR3)组成。
2.根据项1所述的T细胞受体(TCR)，其中，所述α链的可变区包含含有氨基酸序列为如SEQ ID NO:2所示的互补决定区1(CDR1)或由如SEQ ID NO:2所示的互补决定区1(CDR1)组成；和/或
包含含有氨基酸序列为如SEQ ID NO:3所示的互补决定区2(CDR2)或由如SEQ IDNO:3所示的互补决定区2(CDR2)组成。
3.根据项1或2所述的T细胞受体(TCR)，其中，所述β链的可变区包含含有氨基酸序列为如SEQ ID NO:5所示的互补决定区1(CDR1)或由如SEQ ID NO:5所示的互补决定区1(CDR1)组成；和/或
包含含有氨基酸序列为如SEQ ID NO:6所示的互补决定区2(CDR2)或由如SEQ IDNO:6所示的互补决定区2(CDR2)组成。
4.根据项1-3中任一项所述的T细胞受体(TCR)，其中，
所述α链的可变区还包括第一先导序列；和/或
所述β链的可变区还包括第二先导序列。
5.根据项1-4中任一项所述的T细胞受体(TCR)，其中，所述α链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示或者与SEQ ID NO:10具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，和/或所述β链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示或者与SEQ ID NO:11具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
6.根据项1-5中任一项所述的T细胞受体(TCR)，其中，所述α链还包含α恒定区和/或所述β链还包含β恒定区，优选的，所述恒定区为小鼠恒定区或人恒定区。
7.根据项1-6中任一项所述的T细胞受体(TCR)，其中，所述TCR是分离的或纯化的或者是重组的。
8.根据项1-7中任一项所述的T细胞受体(TCR)，其中，所述TCR是人的。
9.根据项1-8中任一项所述的T细胞受体(TCR)，其中，所述TCR是单克隆的。
10.根据项1-9中任一项所述的T细胞受体(TCR)，其中，所述TCR是单链。
11.根据项1-10中任一项所述的T细胞受体(TCR)，其中，所述TCR包含两条链。
12.根据项1-11中任一项所述的T细胞受体(TCR)，其中，所述TCR为细胞结合的形式或为可溶的形式，优选为可溶的形式。
13.根据项1-12中任一项所述的T细胞受体(TCR)，其中，所述TCR与抗原短肽-HLA-DP5复合物结合，优选的，所述抗原短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
14.一种核酸分子，其中，所述核酸分子包含编码项1-13中任一项所述的TCR或者所述TCR的α链或β链。
15.根据项14所述的核酸分子，其中编码α链的核苷酸序列包含如SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列或由如SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列组成；和/或
编码β链的核苷酸序列包含如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列或由如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列组成。
16.一种载体，其中，所述载体包含项14或15所述的核酸分子。
17.根据项16所述的载体，其中，所述载体为表达载体。
18.根据项16或17所述的载体，其中，所述载体为病毒载体，优选为逆转录病毒载体。
19.根据项18所述的载体，其中，所述病毒载体为慢病毒载体。
20.一种工程化细胞，其包含项1-13中任一项所述的TCR、项14-15中任一项所述的核酸分子或者项16-19中任一项所述的载体。
21.根据项20所述的工程化细胞，其中，所述TCR对所述细胞是异源的。
22.根据项20或21所述的工程化细胞，其中，所述工程化细胞是细胞系。
23.根据项20-22中任一项所述的工程化细胞，其中，所述工程化细胞是获自受试者的原代细胞，优选的，所述受试者为哺乳动物受试者，优选为人。
24.根据项20-23中任一项所述的工程化细胞，其中，所述工程化细胞是T细胞，优选是从外周血分离的T细胞。
25.根据项24所述的工程化细胞，其中，所述T细胞为CD8+或CD4+。
26.一种生产项20-25中任一项所述的工程化细胞的方法，其包括在体外或离体地将项14-15中任一项所述的核酸分子或者项16-19中任一项所述的载体引入细胞中。
27.根据项26所述的方法，其中，所述载体为病毒载体，并且所述引入是通过转导进行的。
28.一种药物组合物，其包含项1-13中任一项所述的T细胞受体(TCR)、项14-15任一项所述的核酸分子、项16-19中任一项所述的载体或者项20-25中任一项所述的工程化细胞。
29.根据项28所述的药物组合物，其还包含药学上可接受的载体或佐剂。
30.项1-13中任一项所述的T细胞受体(TCR)、项14-15中任一项所述的核酸分子、项16-19中任一项所述的载体、项20-25中任一项所述的工程化细胞或者项28-29中任一项所述的药物组合物在制备治疗与EBV相关的疾病的药物中的用途。
31.根据项30所述的用途，其中，与EBV相关的疾病为鼻咽癌、胃癌、霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、移植后淋巴细胞增殖性疾病、鼻型结外自然杀伤/T细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤或滤泡树突状细胞肉瘤。
发明的效果
本申请所述的TCR能够与EBV抗原短肽特异性结合，转录所述TCR的T细胞能够特异性识别HLA-DP5呈递的抗原短肽，并且可以被表达HLA-DP5和EBNA1的肿瘤细胞特异性激活，产生杀伤功能。
附图说明
图1是使用流式细胞仪鉴定转染阳性率的示意图。
图2是转导本申请所述的TCR的T细胞对负载VFLQTHIFAEVLKDAIKDLV抗原短肽的靶细胞起反应的NFAT的表达的示意图。
图3是使用流式细胞仪鉴定TCR转染效率的示意图。
图4是转导TCR的T细胞释放细胞因子比例的示意图。
图5是不同组细胞的肿瘤细胞满度示意图。
具体实施方式
下面结合附图所描述的实施方式对本申请做以详细说明，其中所有附图中相同的数字表示相同的特征。虽然附图中显示了本申请的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本申请而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。
需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然而所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
本申请提供了一种识别EBV抗原的T细胞受体(TCR)，其中，所述TCR包含含有可变区的α链和/或含有可变区的β链，α链的可变区包含氨基酸序列为如SEQ ID NO:4所示的互补决定区3(CDR3)由如SEQ ID NO:4所示的互补决定区3(CDR3)组成；和/或
所述β链的可变区包含氨基酸序列为如SEQ ID NO:7所示的互补决定区3(CDR3)或由如SEQ ID NO:7所示的互补决定区3(CDR3)组成。
SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列为：AAKIYNNNDMR
SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列为：ASSLASVAGGYT
在一些实施方式中，所述α链的可变区包含含有氨基酸序列为如SEQ ID NO:2所示的互补决定区1(CDR1)或由如SEQ ID NO:2所示的互补决定区1(CDR1)组成；和/或
包含含有氨基酸序列为如SEQ ID NO:3所示的互补决定区2(CDR2)或由如SEQ IDNO:3所示的互补决定区2(CDR2)组成。在一些实施方式中，所述β链的可变区包含含有氨基酸序列为如SEQ ID NO:5所示的互补决定区1(CDR1)或由如SEQ ID NO:5所示的互补决定区1(CDR1)组成；和/或
包含含有氨基酸序列为如SEQ ID NO:6所示的互补决定区2(CDR2)或由如SEQ IDNO:6所示的互补决定区2(CDR2)组成。
SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列为：TTSDR
SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列为：LLSNGAV
SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列为：SGHTA
SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列为：FQGNSA
所述T细胞受体或TCR是呈递在主组织相容性复合体(MHC)上的特异性抗原肽的唯一受体，在免疫系统中，通过抗原特异性的TCR与pMHC复合物的结合引发T细胞与抗原呈递细胞(APC)直接的物理接触，然后T细胞及APC两者的其他细胞表面分子就发生相互作用，这就引起了一系列后续的细胞信号传递和其他生理反应，从而使得不同抗原特异性的T细胞对靶细胞发挥免疫效应。
所述TCR是含有可变α和β链或可变γ和δ链的分子，并且所述分子能够结合至MHC分子的肽特异性结合，在一些实施方案中，TCR呈αβ形式。通常，以αβ和γδ形式存在的TCR在结构上总体上相似，但是表达它们的T细胞可以具有不同的解剖学位置或功能，TCR可以在细胞表面上发现或以可溶形式发现。通常，在T细胞(T淋巴细胞)的表面上发现TCR，在此处它通常负责识别结合至主要组织相容性复合物(MHC)分子的抗原。
TCR的可变结构域含有互补决定区(CDR)，其通常是肽、MHC和/或MHC-肽复合物的抗原识别以及结合能力和特异性的主要贡献者，TCR的CDR或其组合形成给定TCR分子的全部或基本上全部的抗原结合位点，TCR的可变区内的各个CDR通常由框架区(FR)隔开。其中，CDR3是负责抗原结合或特异性的主要CDR，或者在给定TCR可变区上在三个CDR中对于抗原识别和/或对于与肽-MHC复合物的经加工肽部分的相互作用最重要，在一些情况下，α链的CDR1可以与某些抗原肽的N末端部分相互作用；在一些情况下，β链的CDR1可以与某些抗原肽的C末端部分相互作用；在一些情况下，CDR2对于MHC-肽复合物的MHC部分的相互作用或识别具有最强的作用或者是主要的负责CDR；在一些情况下，β链的可变区抗原含有其他高变区(CDR4或HVR4)，其通常参与超抗原结合而非抗原识别。
在一些实施方式中，所述α链的可变区还包括第一先导序列；和/或
所述β链的可变区还包括第二先导序列。
所述α链的可变区的第一先导序列和所述β链的可变区的第二先导序列是本领域技术人员公知的，例如所述α链的可变区的第一先导序列可以使用氨基酸序列如SEQ IDNO:8所示的先导序列，所述β链的可变区的第二先导序列可以使用氨基酸序列如SEQ IDNO:9所示的先导序列。
SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列为：MKKLLAMILWLQLDRLSG
SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列为：MGTRLLFWVAFCLLGADHT
在本申请中，所述先导序列指的是信号肽，其是引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短(长度5-30个氨基酸)肽链。
在一些实施方式中，所述α链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:10、所示或者与SEQ ID NO:10具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，和/或所述β链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示或者与SEQ ID NO:11具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列为：
ELKVEQNPLFLSMQEGKNYTIYCNYSTTSDRLYWYRQDPGKSLESLFVLLSNGAVKQEGRLMASLDTKARLSTLHITAAVHDLSATYFCAAKIYNNNDMRFGAGTRLTVKPN
SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列为：
GAGVSQSPRYKVTEKGKDVELRCDPISGHTALYWYRQSLGQGLEFLIYFQGNSAPDKSGLPSDRFSAERTGGSVSTLTIQRTQQEDSAVYLCASSLASVAGGYTFGSGTRLTVV
所述α链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:10具有至少90％序列同一性的氨基酸序列例如可以是与SEQ ID NO:10具有至少90％序列同一性、至少91％序列同一性、至少92％序列同一性、至少93％序列同一性、至少94％序列同一性、至少95％序列同一性、至少96％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性、至少99％序列同一性或100％序列同一性的氨基酸序列；
所述β链的可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:11具有至少90％序列同一性的氨基酸序列例如可以是与SEQ ID NO:11具有至少90％序列同一性、至少91％序列同一性、至少92％序列同一性、至少93％序列同一性、至少94％序列同一性、至少95％序列同一性、至少96％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性、至少99％序列同一性或100％序列同一性的氨基酸序列。
在本申请中，所述“同一性”指在氨基酸序列的背景下是指，当针对最大对应进行比对时，两个序列中相同的残基的数目。存在许多本领域已知的可以用于测量氨基酸同一性百分比的不同算法(即，基础局部比对工具(Basic Local Alignment Tool)或)。除非另外指出，否则使用特定程序或算法的默认参数。
在一些实施方式中，所述α链还包含α恒定区和/或所述β链还包含β恒定区，优选地，所述恒定区为小鼠恒定区或人恒定区，
例如，小鼠α恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；和/或
小鼠β恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列为：
IQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列为：
EDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYHQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSGLVLMAMVKKKNS
所述TCR的恒定区可以含有短连接序列，其中半胱氨酸残基形成二硫键，从而连接TCR的两条链。TCR可以在α和β链中的每一个中具有另外的半胱氨酸残基，使得TCR在恒定区中含有两个二硫键。
在一些实施方式中，所述TCR的α链和β链恒定区的残基之间引入人工二硫键，可以引入的二硫键的位置是本领域技术人员公知的。
在一些实施方式中，所述TCR是分离的或纯化的或者是重组的。
在一些实施方式中，所述TCR是人的。
在一些实施方式中，所述TCR是单克隆的。
在一些实施方式中，所述TCR是单链。
在一些实施方式中，所述TCR包含两条链。
TCR可以从生物来源获得，如来自细胞(如来自T细胞(例如细胞毒性T细胞))、T细胞杂交瘤或其他公众可获得的资源，例如，TCR可以源自多个动物物种之一，如人、小鼠、大鼠或其他哺乳动物，如通常来自人。
在一些实施方式中，所述TCR可以是细胞结合的形式的或为可溶形式，优选为可溶的形式。
所述TCR为可溶的形式指的是在其疏水芯区域发生突变的TCR，这些疏水芯区域的突变优选为能够使本申请可溶性TCR的稳定性提高的突变。
在一个实施方案中，所述TCR能够与抗原短肽-HLA-DP5复合物结合，优选地，所述抗原短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
抗原短肽-HLA-DP5复合物是指HLA-DP5和抗原短肽结合的复合物。蛋白质在细胞中被蛋白酶体降解为不同长度的多肽，一部分多肽与HLA结合形成复合物被递呈至细胞表面。所述TCR识别的抗原短肽-HLA-DP5复合物可以表达于细胞膜上，也可以以可溶性蛋白的形式存在于溶液中。
在本申请中，DP5由A链和B链组成，A链为DPA1*0202，B链为DPB1*0501，所述TCR可以特异性地识别HLA-DPA1*0202/HLA-DPB1*0501复合物。
其中，对于DP5的A链，所述HLA-DPA1*0202的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，其氨基酸序列为：
MRPEDRMFHIRAVILRALSLAFLLSLRGAGAIKADHVSTYAMFVQTHRPTGEFMFEFDEDEQFYVDLDKKETVWHLEEFGRAFSFEAQG
GLANIAILNNNLNTLIQRSNHTQAANDPPEVTVFPKEPVELGQPNTLICHIDRFFPPVLNVTWLCNGEPVTEGVAESLFLPRTDYSFHKFHYLTF
VPSAEDVYDCRVEHWGLDQPLLKHWEAQEPIQMPETTETVLCALGLVLGLVGIIVGTVLIIKSLRSGHDPRAQGPL
对于DP5的B链，所述HLA-DPB1*0501的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，其氨基酸序列为：
MMVLQVSAAPRTVALTALLMVLLTSVVQGRATPENYLFQGRQECYAFNGTQRFLERYIYNREELVRFDSDVGEFRAVTELGRPEAEYW
NSQKDILEEKRAVPDRMCRHNYELDEAVTLQRRVQPKVNVSPSKKGPLQHHNLLVCHVTDFYPGSIQVRWFLNGQEETAGVVSTNLIRNGD
WTFQILVMLEMTPQQGDVYICQVEHTSLDSPVTVEWKAQSDSARSKTLTGAGGFMLGLIICGVGIFMHRRSKKVQRGSA
SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列为：
VFLQTHIFAEVLKDAIKDLV
本申请提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含编码上述所述的TCR或者所述TCR的α链或β链。
在一些实施方式中，其中编码α链的核苷酸序列包含SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列或由如SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列组成；和/或
编码β链的核苷酸序列包含如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列或由如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列组成。
其中，SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列为：
ATGAAGAAGCTACTAGCAATGATTCTGTGGCTTCAACTAGACCGGTTAAGTGGAGAGCTGAAAGTGGAACAAAACCCTCTGTTCCT
GAGCATGCAGGAGGGAAAAAACTATACCATCTACTGCAATTATTCAACCACTTCAGACAGACTGTATTGGTACAGGCAGGATCCTGGGA
AAAGTCTGGAATCTCTGTTTGTGTTGCTATCAAATGGAGCAGTGAAGCAGGAGGGACGATTAATGGCCTCACTTGATACCAAAGCCCGT
CTCAGCACCCTCCACATCACAGCTGCCGTGCATGACCTCTCTGCCACCTACTTCTGTGCCGCCAAAATATACAATAACAATGACATGCGC
TTTGGAGCAGGGACCAGACTGACAGTAAAACCAAATATCCAGAATCCAGAGCCCGCCGTGTATCAGCTGAAGGACCCAAGGAGCCAGG
ATTCCACCCTGTGCCTGTTCACAGACTTTGATAGCCAGATCAACGTGCCCAAGACCATGGAGTCCGGCACCTTCATCACAGACAAGTGC
GTGCTGGATATGAAGGCCATGGACTCTAAGAGCAACGGCGCCATCGCCTGGAGCAATCAGACCTCCTTCACATGCCAGGATATCTTTAA
GGAGACCAATGCCACATATCCTTCCTCTGACGTGCCATGTGATGCCACCCTGACAGAGAAGTCCTTCGAGACCGACATGAACCTGAATT
TTCAGAACCTGTCTGTGATGGGCCTGCGCATCCTGCTGCTGAAGGTGGCCGGCTTCAATCTGCTGATGACCCTGAGGCTGTGGAGCTCC
SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列为：
ATGGGCACCAGGCTCCTCTTCTGGGTGGCCTTCTGTCTCCTGGGGGCAGATCACACAGGAGCTGGAGTCTCCCAGTCCCCCAGTAAC
AAGGTCACAGAGAAGGGAAAGGATGTAGAGCTCAGGTGTGATCCAATTTCAGGTCATACTGCCCTTTACTGGTACCGACAGAGCCTGGG
GCAGGGCCTGGAGTTTTTAATTTACTTCCAAGGCAACAGTGCACCAGACAAATCAGGGCTGCCCAGTGATCGCTTCTCTGCAGAGAGGA
CTGGGGGATCCGTCTCCACTCTGACGATCCAGCGCACACAGCAGGAGGACTCGGCCGTGTATCTCTGTGCCAGCAGCTTAGCGAGCGTC
GCAGGGGGCTACACCTTCGGTTCGGGGACCAGGTTAACCGTTGTAGAGGATCTGAGGAACGTGACACCCCCTAAGGTGTCTCTGTTCGA
GCCCAGCAAGGCCGAGATCGCCAATAAGCAGAAGGCCACCCTGGTGTGCCTGGCAAGGGGCTTCTTTCCTGATCACGTGGAGCTGTCTT
GGTGGGTGAACGGCAAGGAGGTGCACAGCGGCGTGTGCACCGACCCACAGGCCTACAAGGAGTCCAATTACTCTTATTGTCTGAGCTCC
CGGCTGAGAGTGTCCGCCACATTTTGGCACAACCCTAGAAATCACTTCAGGTGCCAGGTGCAGTTTCACGGCCTGAGCGAGGAGGATAA
GTGGCCAGAGGGATCCCCAAAGCCTGTGACCCAGAACATCTCTGCCGAGGCATGGGGAAGGGCAGACTGTGGAATCACATCCGCCTCTT
ATCACCAGGGCGTGCTGAGCGCCACCATCCTGTACGAGATCCTGCTGGGCAAGGCCACACTGTATGCCGTGCTGGTGAGCGGCCTGGTG
CTGATGGCCATGGTGAAGAAGAAGAACTCC
所述核酸分子可以包含天然和/或非天然存在的核苷酸和碱基的那些，例如包括具有骨架修饰的那些，所述核酸分子指的是核苷酸的聚合物，核苷酸的此类聚合物可以含有天然和/或非天然核苷酸，并且包括但不限于DNA、RNA和PNA。核苷酸序列指的是构成核酸分子的线性序列。
在一些情况下，核酸分子含有cDNA，在一些情况下，可以修饰核酸分子以用于本申请所述的构建体中，如用于密码子优化。在一些情况下，出于克隆到载体的目的，可以将序列设计为含有末端限制性位点序列。
在一些情况下，编码TCR的核酸分子可以从多种来源获得，如通过一种或多种给定细胞内的或从所述一种或多种给定细胞中分离的编码核酸的聚合酶链式反应(PCR)扩增获得。
在一个实施方式中，编码α链的核苷酸序列和/或编码β链的核苷酸序列是经密码子优化的。通常，密码子优化涉及使所选择的密码子的百分比与已公开的人类转移RNA的丰度平衡，使得没有一者过载或受限。在一些情况下，这可能是必要的，因为大多数氨基酸由超过一种密码子编码，并且密码子使用因生物而异。经转染的基因与宿主细胞之间的密码子使用差异可能会影响核酸构建体的蛋白质表达和免疫原性。通常，对于密码子优化，选择密码子以选择与人类使用频率平衡的那些密码子。通常，氨基酸密码子的冗余度使得不同的密码子编码一种氨基酸。在一些实施方案中，在选择用于置换的密码子时，可能需要所得突变是沉默突变，使得密码子改变不影响氨基酸序列。通常，密码子的最后一个核苷酸可以保持不变而不会影响氨基酸序列。
本申请提供了一种载体，所述载体包含上述所述的核酸分子。
例如，将编码上述TCR的一条或两条链的一种或多种核酸克隆到合适的一种或多种表达载体中，表达载体可以是任何合适的重组表达载体，并且可以用于转化或转染任何合适的宿主。合适的载体包括设计用于繁殖和扩增或用于表达或用于两者的那些，如质粒和病毒。
所述载体可以含有调节序列(如转录和翻译起始和终止密码子)，其对待引入载体的宿主的类型(例如，细菌、真菌、植物或动物)具有特异性，酌情并考虑载体是基于DNA还是基于RNA。载体也可以含有与编码TCR的核苷酸序列可操作连接的非天然启动子。所述启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，如巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子和在鼠干细胞病毒的长末端重复序列中发现的启动子，也考虑了熟练技术人员已知的其他启动子。
在一些实施方式中，所述载体为表达载体。在一些实施方式中，所述载体为病毒载体，优选为逆转录病毒载体。在一些实施方式中，所述病毒载体为慢病毒载体。
本申请提供了一种工程化细胞，其包含上述所述的TCR、上述所述的核酸分子或者上述所述的载体。在一些实施方式中，所述TCR对所述细胞是异源的。在一些实施方式中，所述工程化细胞是细胞系。在一些实施方式中，所述工程化细胞是获自受试者的原代细胞，优选地，所述受试者为哺乳动物受试者，优选为人。在一些实施方式中，所述工程化细胞是T细胞，优选是从外周血分离的T细胞。在一些实施方式中，所述T细胞为CD8+或CD4+。
所述工程化细胞例如可以是细胞群体或者表达TCR的基因工程化细胞，该细胞通常是真核细胞，如哺乳动物细胞，并且通常是人细胞。在一些实施方式中，细胞源自血液、骨髓、淋巴或淋巴器官，是免疫系统的细胞，如先天免疫或适应性免疫的细胞，例如骨髓或淋巴样细胞(包括淋巴细胞，通常是T细胞和/或NK细胞)。其他示例性细胞包括干细胞，如多潜能干细胞和多能干细胞，包括诱导多能干细胞(iPSC)。细胞通常是原代细胞，如直接从受试者分离和/或从受试者分离并冷冻的那些。在一些实施方式中，细胞包括T细胞或其他细胞类型的一个或多个子集，如整个T细胞群、CD+细胞、CD8+细胞及其亚群。
T细胞和/或CD+和/或CD8+T细胞的亚型和亚群包括幼稚T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型(如干细胞记忆T(TSCM)、中枢记忆T(TCM)、效应记忆T(TEM)或终末分化的效应记忆T细胞)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关恒定T(MAIT)细胞、天然存在和适应性调节T(Treg)细胞等。
在一些实施方式中，细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，细胞是单核细胞或粒细胞，例如骨髓细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。
本申请提供了一种生产上述所述的工程化细胞的方法，其包括在体外或离体地将上述所述的核酸分子或者上述所述的载体引入细胞中。
在一些实施方式中，所述载体为病毒载体，并且所述引入是通过转导进行的。
本申请提供了一种药物组合物，其包含上述所述的T细胞受体(TCR)、上述所述的核酸分子、上述所述的载体或者上述所述的工程化细胞。
在一些实施方式中，其还包含药学上可接受的载体或佐剂。
所述药学上可接受的载体或佐剂是指药物组合物中除了活性成分之外对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体或佐剂包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
所述药物组合物可以利用定时释放、延迟释放和持续释放递送系统，使得所述组合物的递送发生在待治疗部位的致敏之前并且有足够的时间引起致敏。许多类型的释放递送系统是可用的并且是已知的。此类系统可用避免重复给予所述组合物，从而增加受试者和医生的便利性。
本申请提供了上述所述的T细胞受体(TCR)、上述所述的核酸分子、上述所述的载体、上述所述的工程化细胞或者上述所述的药物组合物在制备治疗与EBV相关的疾病的药物中的用途。
在一个实施方案中，与EBV相关的疾病为鼻咽癌、胃癌、霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、移植后淋巴细胞增殖性疾病、鼻型结外自然杀伤/T细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤或滤泡树突状细胞肉瘤。
本申请所述的TCR能够与EBV阳性肿瘤细胞的抗原短肽特异性结合，转导了所述TCR的T细胞能够被特异性激活并且对靶细胞具有很强的杀伤作用，所述的TCR可以用于鼻咽癌等EBV阳性的肿瘤的免疫治疗。
实施例
本申请对试验中所用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述，在下面的实施例中，如果无其他特别的说明，％表示wt％，即重量百分数。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1：克隆VFLQTHIFAEVLKDAIKDLV抗原短肽特异性T细胞及TCR基因获得
利用合成短肽VFLQTHIFAEVLKDAIKDLV(SEQ ID NO:1，江苏金斯瑞生物科技有限公司)刺激来自于基因型为HLA-DP5的健康志愿者的外周血淋巴细胞。在磷酸缓冲液中将VFLQTHIFAEVLKDAIKDLV短肽负载至带有生物素标记的HLA-DP5蛋白上，按照本领域常规的方法制备pHLA单体。按照本领域常规的方法将这些单体与用APC标记的链霉亲和素(BD公司)组合成APC标记的四聚体，按照本领域常规的方法富集该四聚体及抗-CD4-FITC双阳性细胞，即为特异性T细胞，获得的双阳性细胞进行流式分选获得单细胞，将分选获得的单细胞用一步法RT-PCR试剂盒(QIAGEN凯杰，目录号210212)分别扩增TCRα链及β链，将PCR产物测序。将测序结果与IMGT(国际免疫遗传学信息系统)的公开数据库中的序列进行比对，即可以获得TCRα链可变区序列及β链可变区的核苷酸序列及其CDR1、CDR2、CDR3的信息，分别如SEQ ID NO:14-15以及SEQ ID NO:2-7所示。
实施例2：VFLQTHIFAEVLKDAIKDLV抗原短肽特异性TCR慢病毒载体构建及慢病毒包装
(1)TCR慢病毒载体构建
将VFLQTHIFAEVLKDAIKDLV TCRα和β链可变区序列克隆至基于pLKO的表达质粒(Addgene)，通过多片段重组克隆试剂盒(诺唯赞生物科技公司，目录号C113)标准方法将α或β链可变结构域克隆到含有鼠α或β恒定区的基于PLKO的表达质粒中，将连接的质粒转化到感受态大肠杆菌菌株Stbl3细胞(北京全式金生物技术股份有限公司)中并接种于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB/琼脂平板上。在37℃下过夜孵育之后，挑取单个菌落并在37℃下在10ml的含有100μg/ml氨苄青霉素的LB中振荡过夜生长。使用小提中量试剂盒(天根生化科技公司(TIANGEN)目录号#DP118-02)纯化克隆的质粒并且对质粒进行测序得到VFLQTHIFAEVLKDAIKDLVTCR(即TCR-VFL)。
(2)慢病毒包装
试验培养基：10％FBS(ExCell，目录号FSP500)，DMEM(赛默飞公司(ThermoFisher)，目录号C11995500BT)
准备293T细胞(保藏机构为美国典型培养物保藏中心即ATCC，保藏目录号为CRL-1573)在10cm皿中培养，在不超过80％满度的时候开始质粒转染，病毒包装质粒和VFLQTHIFAEVLKDAIKDLV TCR质粒的比例为1:1，共10μg。将上述质粒加在无血清的DMEM培养基中与PEI(polyethylenimine，聚乙烯亚胺)混合，然后将加质粒的混合液加到293T细胞中，37度培养。72h后，将细胞的上清用100kd超滤管浓缩收集病毒载体。
实施例3：表达VFLQTHIFAEVLKDAIKDLV抗原短肽特异性TCR的Jurkat细胞系构建及功能鉴定
活化T细胞核因子(NFAT)报告基因表达方法
进行以下试验以证明TCR转导的T细胞对靶细胞特异性的激活反应。利用流式细胞分析技术检测NFAT表达量作为T细胞激活的读出值。
(1)试剂
试验培养基：10％FBS(ExCell，目录号FSP500)，RPMI1640(赛默飞公司(ThermoFisher)，目录号C11875500BT)
(2)方法
靶细胞制备
本实验中所用的靶细胞为293T-CIITA-DP5细胞(293T细胞保藏于ATCC，保藏目录号为CRL-3216。在实验培养基中制备靶细胞，靶细胞浓度调至1.0×106个/毫升，每孔取50微升从而得50000个细胞/孔。
效应细胞制备
本实验的效应细胞为转导了本申请TCR的J.RT3-T3.5-CD4-NFAT-ZsGreen(JK4NF)细胞，并以未转染本申请TCR的JK4NF细胞作为对照组。
将JK4NF细胞(J.RT3-T3.5细胞保藏于ATCC，保藏目录号为TIB-152)按MOI(感染复数)＝1加入实施例2中获得的携带本申请TCR基因的慢病毒，72小时后用流式细胞仪鉴定转染阳性率，其结果如图1所示，从图1可以看出，转染阳性率为100％左右，将扩大培养后的效应细胞浓度调至1.0×106个/毫升，每孔取50微升从而得50000个细胞/孔。
短肽溶液制备
将原浓度5mg/ml短肽(VFLQTHIFAEVLKDAIKDLV)浓度稀释为200μg/ml，然后按10倍比例依次往下稀释成20μg/ml、2μg/ml、0.2μg/ml、0.02μg/ml、0.002μg/ml、0.0002μg/ml、0.00002μg/ml。
每孔取100微升使短肽在96孔板中的终浓度分别为10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml、0.001μg/ml、0.0001μg/ml、0.00001μg/ml。
最终每孔加50μl靶细胞，50μl效应细胞，100μl相应浓度短肽稀释液于96孔平底板中，与37度细胞培养箱中孵育12h。
(3)结果
通过如上所述方法检验本申请TCR转导的T细胞对负载VFLQTHIFAEVLKDAIKDLV抗原短肽的靶细胞起反应的NFAT的表达。利用Graphpad prism8绘制NFAT的表达水平曲线，其结果如图2所示。
从图2可以看出，转导本申请TCR的T细胞对负载其特异的短肽的靶细胞有很好的激活反应。
实施例4：表达VFLQTHIFAEVLKDAIKDLV抗原短肽特异性TCR的原代T细胞体外功能鉴定
胞内染色方法
进行以下试验以证明VFLQTHIFAEVLKDAIKDLV抗原短肽特异性TCR对HLA-DP5阳性EBNA1阳性的靶细胞产生特异性的激活反应。
(1)试剂
试验培养基：10％FBS(赛默飞公司(ThermoFisher)，目录号10099-044)，RPMI1640(赛默飞公司公司(ThermoFisher)，目录号C11875500BT)，Cytofix/CytopermTMFixation/Permeabilization Kit(美国BD公司(Becton,Dickinson and Company)，目录号554714)
(2)方法
效应T细胞制备
本实验的效应细胞(T细胞)为转导了本申请TCR的T细胞，并以同一志愿者未转染本申请TCR的T细胞作为对照组。
将基因型为HLA-DP5的健康志愿者的外周血经过密度梯度离心，获得外周血单个核细胞，将外周血单个核细胞通过EasySepTMHuman CD4 T Cell Isolation Kit(STEMCELL公司，目录号17952)分选获得原代CD4 T细胞，并将原代CD4 T细胞按照24孔板每孔5.0×105/500μl置于孔中，共收集1x106细胞，用T Cell TransAct磁珠刺激T细胞后置于37℃，5％CO2培养箱中培养。24h后观察细胞成团情况，按MOI(感染复数)＝1加入实施例2中获得的TCR慢病毒转导后，在含有200IU/ml IL-2的含10％FBS的1640培养基扩增直至转导后3-4天后，用流式细胞仪鉴定TCR转染效率(其结果如图3所示)。将扩大培养后的效应细胞浓度调至5.0×105个阳性细胞/毫升，每孔取100微升从而得50000个阳性细胞/孔。
靶细胞制备
本实验中所用的靶细胞是C666-1(保藏于ATCC，鼻咽癌细胞，天然表达HLA-DP分子)通过慢病毒载体过表达EBNA1基因构建的C666-1-EBNA1细胞作为靶细胞，细胞数为50000个细胞/孔。同时加入HLA-DP中和抗体(Anti-HLA-DP抗体[B7/21]，购买自abcam公司，目录号ab20897)作为阴性对照组。
细胞共培养
每孔加100μl靶细胞，100μl效应细胞，于96孔平底板中，每孔加入BD GolgiStopTM(0.66μl/ml培养基)、BD GolgiPlug(1μl/ml培养基)，混匀，37℃共孵育12小时。阴性对照组加入Anti-DP抗体。
流式细胞术检测
收集共孵育后的细胞，将其从96孔平底板转移至96孔V底板中，并用抗体PE anti-human CD4 Antibody(购买自Biolegend，目录号357404)和APC anti-mouse-TCRβchainAntibody(购买自Biolegend，目录号109212)对细胞的表面标记物进行染色，在4℃下孵育20分钟，并用1×PBS洗涤一遍。
按照生产商(BD，目录号554714)提供的说明书，进行胞内染色步骤。在上述96孔V底板中，每孔加入100μl Fixation/Permeabilization solutuon，在4℃孵育20分钟。然后每孔加入250μl 1×BD Perm/WashTM buffer清洗细胞两次。接着，用1×BD Perm/WashTMbuffer以1:100的比例稀释抗体Pacific BlueTManti-human IFNγAntibody、PE/Cyanine7anti-human IL-2Antibody、Alexa700anti-human TNF-αAntibody，对细胞的胞内物质进行染色，在4℃下孵育30分钟，并用用1×BD Perm/WashTMbuffer清洗细胞一次。最后用1×PBS重悬细胞，进行流式细胞术分析。通过胞内染色(如上所述)检验本发明TCR转导的T细胞的功能。利用Graphpad prism8绘制各孔中T细胞释放的细胞因子比例，其结果如图4所示。
(3)结果
从图4可以看出，表达VFLQTHIFAEVLKDAIKDLV抗原短肽特异性TCR的T细胞TCR-VFL对C666-1-EBNA1细胞系有很强的激活反应，对照T细胞则没有激活反应。加入HLA-DP中和抗体之后可以抑制TCR-VFL对C666-1-EBNA1细胞系的识别。
实施例5：表达VFLQTHIFAEVLKDAIKDLV抗原短肽特异性TCR的原代T细胞体外功能鉴定
A.Incucyte实时活细胞分析
方法
进行以下试验以证明VFLQTHIFAEVLKDAIKDLV抗原短肽特异性TCR对HLA-DP5阳性EBNA1阳性的靶细胞的杀伤作用。
利用Incucyte实时活细胞分析系统检测肿瘤细胞的生长曲线
(1)试剂
试验培养基：10％FBS(赛默飞公司(ThermoFisher)，目录号10099-044)，RPMI1640(赛默飞公司公司(ThermoFisher)，目录号C11875500BT)
(2)方法
靶细胞制备
本实验中所用的靶细胞为C666-1-EBNA1细胞，其是使用C666-1(购买自浙江美森细胞科技有限公司，货号CTCC-400-0109)通过慢病毒载体过表达EBNA1基因构建得到的细胞。在实验培养基中制备靶细胞，靶细胞浓度调至2.0×105个/毫升，每孔取100微升从而得20000个细胞/孔。
效应T细胞制备
本实验的效应细胞(T细胞)为转导了本申请TCR的T细胞，并以同一志愿者未转染本申请TCR的T细胞作为对照组。
将基因型为HLA-DP5的健康志愿者的外周血经过密度梯度离心，获得外周血单个核细胞，将外周血单个核细胞按照24孔板每孔1.0×106/500μl置于孔中，共收集2x106细胞，用T Cell TransAct磁珠刺激T细胞后置于37℃，5％CO2培养箱中培养。24h后观察细胞成团情况，按MOI(感染复数)＝1加入实施例2中获得的TCR慢病毒转导后，在含有200IU/ml IL-2的含10％FBS的1640培养基扩增直至转导后3-4天后，用流式细胞仪鉴定TCR转染效率，其结果如图3所示。将扩大培养后的效应细胞浓度调至6×105个阳性细胞/毫升。
细胞共培养及活细胞实时分析
于96孔板中每孔加20000个靶细胞，10000个效应细胞(1:2组)或4000个效应细胞(1:5组)，将96孔板放置于Incucyte机器中，每隔小时拍照一次，连续拍照72h。
(3)结果
表达VFLQTHIFAEVLKDAIKDLV抗原短肽特异性TCR的T细胞TCR-VFL可以显著抑制C666-1-EBNA1肿瘤细胞的生长。利用Incucyte分析并导出每孔的肿瘤细胞满度(即肿瘤细胞面积占每孔总面积的比例)，其结果如图5所示。
从图5可以看出，对于TCR-VFL组，肿瘤细胞满度显著降低，说明表达VFLQTHIFAEVLKDAIKDLV抗原短肽特异性TCR的T细胞TCR-VFL可以显著抑制C666-1-EBNA1肿瘤细胞的生长。
综上所述，本申请转导所述TCR的T细胞能够特异性识别HLA-DP5呈递的VFLQTHIFAEVLKDAIKDLV短肽，并且可以被表达HLA-DP5和EBNA1的肿瘤细胞特异性激活，产生杀伤功能。
以上所述，仅是本申请的较佳实施例而已，并非是对本申请作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本申请技术方案内容，依据本申请的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本申请技术方案的保护范围。

Claims (12)

1.一种识别EBV抗原的T细胞受体(TCR)，其中，所述TCR包含含有可变区的α链和/或含有可变区的β链，α链的可变区包含氨基酸序列为如SEQ ID NO:4所示的互补决定区3(CDR3)或由如SEQ ID NO:4所示的互补决定区3(CDR3)组成；和/或
所述β链的可变区包含氨基酸序列为如SEQ ID NO:7所示的互补决定区3(CDR3)或由如SEQ ID NO:7所示的互补决定区3(CDR3)组成。
2.根据权利要求1所述的T细胞受体(TCR)，其中，所述α链的可变区包含含有氨基酸序列为如SEQ ID NO:2所示的互补决定区1(CDR1)或由如SEQ ID NO:2所示的互补决定区1(CDR1)组成；和/或
包含含有氨基酸序列为如SEQ ID NO:3所示的互补决定区2(CDR2)或由如SEQ ID NO:3所示的互补决定区2(CDR2)组成；
优选地，所述β链的可变区包含含有氨基酸序列为如SEQ ID NO:5所示的互补决定区1(CDR1)或由如SEQ ID NO:5所示的互补决定区1(CDR1)组成；和/或
包含含有氨基酸序列为如SEQ ID NO:6所示的互补决定区2(CDR2)或由如SEQ ID NO:6所示的互补决定区2(CDR2)组成；
优选地，所述α链的可变区还包括第一先导序列；和/或
所述β链的可变区还包括第二先导序列；
优选地，所述α链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示或者与SEQ ID NO:10具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，和/或所述β链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示或者与SEQ ID NO:11具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的T细胞受体(TCR)，其中，所述α链还包含α恒定区和/或所述β链还包含β恒定区，优选的，所述恒定区为小鼠恒定区或人恒定区；
优选地，所述TCR是分离的或纯化的或者是重组的；
优选地，所述TCR是人的；
优选地，所述TCR是单克隆的；
优选地，所述TCR是单链；
优选地，所述TCR包含两条链；
优选地，所述TCR为细胞结合的形式或为可溶的形式，优选为可溶的形式。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的T细胞受体(TCR)，其中，所述TCR与抗原短肽-HLA-DP5复合物结合，优选的，所述抗原短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
5.一种核酸分子，其中，所述核酸分子包含编码权利要求1-13中任一项所述的TCR或者所述TCR的α链或β链；
优选地，其中编码α链的核苷酸序列包含如SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列或由如SEQID NO:14所示的核苷酸序列组成；和/或
编码β链的核苷酸序列包含如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列或由如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列组成。
6.一种载体，其中，所述载体包含权利要求5所述的核酸分子。
7.根据权利要求6所述的载体，其中，所述载体为表达载体；
优选地，所述载体为病毒载体，优选为逆转录病毒载体；
优选地，所述病毒载体为慢病毒载体。
8.一种工程化细胞，其包含权利要求1-4中任一项所述的TCR、权利要求5所述的核酸分子或者权利要求6-7中任一项所述的载体。
9.根据权利要求8所述的工程化细胞，其中，所述TCR对所述细胞是异源的；
优选地，所述工程化细胞是细胞系；
优选地，所述工程化细胞是获自受试者的原代细胞，优选的，所述受试者为哺乳动物受试者，优选为人；
优选地，所述工程化细胞是T细胞，优选是从外周血分离的T细胞；
优选地，所述T细胞为CD8+或CD4+。
10.一种生产权利要求8-9中任一项所述的工程化细胞的方法，其包括在体外或离体地将权利要求5所述的核酸分子或者权利要求6-7中任一项所述的载体引入细胞中；
优选地，所述载体为病毒载体，并且所述引入是通过转导进行的。
11.一种药物组合物，其包含权利要求1-4中任一项所述的T细胞受体(TCR)、权利要求5所述的核酸分子、权利要求6-7中任一项所述的载体或者权利要求8-9中任一项所述的工程化细胞；
优选地，其还包含药学上可接受的载体或佐剂。
12.权利要求1-4中任一项所述的T细胞受体(TCR)、权利要求5中任一项所述的核酸分子、权利要求6-7中任一项所述的载体、权利要求8-9中任一项所述的工程化细胞或者权利要求11所述的药物组合物在制备治疗与EBV相关的疾病的药物中的用途；
优选地，与EBV相关的疾病为鼻咽癌、胃癌、霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、移植后淋巴细胞增殖性疾病、鼻型结外自然杀伤/T细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤或滤泡树突状细胞肉瘤。
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