CN112480239B - 人乳头瘤病毒特异性t细胞受体及其抗肿瘤用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供人乳头瘤病毒E6基因的T细胞表位特异性T细胞受体鼠源m2P8D TCR，其人源化形式h2P8D TCR，及它们的抗原结合片段，该两种T细胞受体分别由α、β两条肽链组成，还提供编码它们的核酸，包含该核酸的载体，包含该载体的宿主细胞及它们的抗肿瘤用途；还提供人乳头瘤病毒E6基因的T细胞表位特异性T细胞受体鼠源m2P8D TCR，其人源化形式h2P8D TCR及这两者的制备方法。所述两种特异性T细胞受体及其抗原结合片段能够作为免疫效应活化物刺激机体的免疫反应，从而产生抗肿瘤等疾病的作用效果。

Description

人乳头瘤病毒特异性T细胞受体及其抗肿瘤用途
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及能够特异性识别人乳头瘤病毒基因的T细胞表位的T细胞受体(TCR)或其抗原结合片段。
背景技术
2011年，癌症超过心脏病，成为全球第一大死亡原因。WHO在2013年12月公布，全球每年新增癌症患者数已经超过1400万名，这与2008年的统计结果1270万人相比，人数大幅增加。截至2020，癌症每年造成960万人死亡，全球每年约1万亿美金投入癌症诊疗。
在20世纪80年代早期，Allison及其他研究者确定了在T细胞表面负责识别抗原的αβT细胞受体(TCR)的基因结构。80年代后期，Boone、Rosenberg、Old等人分别研究发现，不同肿瘤病人体内均存在一些肿瘤特异性抗原，能够被T细胞所识别并特异性杀伤肿瘤细胞，使得肿瘤免疫治疗的希望重新燃起，大量研究致力于肿瘤治疗性疫苗的研究和开发。2013年免疫抗癌疗法被Science杂志评为年度10大科技突破之首。
近年来，随着干细胞生物学、免疫学、分子技术、组织工程技术等的快速发展，细胞免疫治疗作为一种安全而有效的治疗手段，在肿瘤等治疗中的作用越来越突出。当前，新型细胞治疗技术的研究和开发已经成为解决肿瘤等相关疾病的重要研究领域。
过继性T细胞疗法(Adoptive cell therapy，ACT)是一种高度个性化的癌症治疗方法，它可以通过重建癌症患者体内缺失或较弱的免疫系统，以达到抗肿瘤的效果。ACT疗法的机制为从肿瘤患者体内分离免疫活性细胞，在体外进行扩增和功能鉴定，然后向患者回输，从而达到直接杀伤肿瘤或激发机体的免疫应答而杀伤肿瘤细胞的目的。因此，寻找仅表达在癌症组织上而非正常必需组织上的抗原成为ACT疗法的限制因素。
目前，ACT疗法包括T细胞受体工程化细胞(TCR-T)治疗技术和嵌合抗原受体工程化T细胞(CAR-T)治疗技术。通过这些技术，ACT在多种癌症，例如黑色素瘤、宫颈癌、淋巴瘤、白血病、胆总管癌和成神经细胞瘤中都取得了很好的疗效。
当前，CAR-T在急/慢性粒细胞性白血病、淋巴瘤等疾病的治疗中也实现了重大突破，大大提高了患者生存率及生存质量。然而，在实体瘤治疗研究中，由于有限的特异性靶点使得CAR-T细胞的治疗前景并不明朗。
与CAR-T细胞利用抗体靶向胞外抗原不同，TCR是所有T细胞表面的特征性标志，以非共价键与CD3结合，形成TCR-CD3复合物。外周血中，有90％-95％的T细胞表达TCR。TCR是由α、β两条肽链组成，属于免疫球蛋白超家族，其抗原特异性存在于V区(CDR1、CDR2、CDR3)，其中，TCR拥有的CDR3直接决定了其抗原结合特异性。经过基因改造的TCR的T细胞，可以对肿瘤细胞表面上的抗原分子进行特异性识别，进而针对肿瘤细胞产生免疫反应。
TCR-T细胞免疫治疗最早在20世纪末应用于HIV的治疗中，目前已在骨髓瘤、黑色素瘤、食管癌、肝癌等治疗中表现出积极的治疗前景。近年来，研究发现基于MART-1、MAGE-A4、NY-ESO-1、WT-1等肿瘤抗原而进行了特异性TCR工程化改造的自体免疫细胞在治疗黑色素瘤、食管癌、多发性骨髓瘤、滑膜细胞肉瘤等中表现出了良好的开发前景。
特别地，在2015年报道的用NY-ESO-1特异性的TCR工程化细胞免疫治疗20例多发性骨髓瘤的临床I/II期试验中，有80％的病例在接受了TCR-T治疗后表现出积极的临床治疗效果。当前，TCR-T细胞免疫治疗技术已经成为国际肿瘤及传染病治疗研究的热点领域，一些技术和产品已经进入临床前或临床研究阶段。
人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)现在被公认为是世界上最普遍的性传播疾病相关病原，与多种恶性肿瘤的发生有密切关联，其中95％的宫颈癌患者都是感染HPV所致。多种血清型HPV被发现与多种上皮表面癌症有关：宫颈癌和口咽癌等。目前大约有130种HPV被分离出来，根据致病性不同，这些不同类型的HPV被分类为：皮肤低危型、皮肤高危型、黏膜低危型、黏膜高危型。在一项多达9个国家和地区的病例对照研究中，在高达90.7％的宫颈癌患者中检测到HPV的DNA。在这项对1900多名妇女的研究中，宫颈癌患者中感染的HPV病毒的最普遍的血清型为HPV16和18型。
HPV进入黏膜上皮细胞后，HPV的DNA会整合到宿主细胞基因组中，导致宿主基因突变和表达障碍，并且会转录和表达病毒癌蛋白，从而导致癌症。HPV基因组中主要构成部分为HPV晚期蛋白编码(L)区、早期蛋白编码(E)区和非编码(NCR)3个功能区域。
其中，早期蛋白编码(E)区分为E1、E2、E4、E5、E6及E7等，在HPV复制、繁殖等过程中具有重要作用。晚期蛋白编码(L)区负责编码衣壳蛋白L1、L2，分别对应HPV的主要和次要衣壳蛋白，从而组装成HPV的衣壳。在研究中发现，E6与E7是最主要的致癌蛋白。早期基因产物E6蛋白可与p53蛋白结合，形成复合物，导致p53失活，从而阻碍p53蛋白在细胞癌变过程中的抑制作用。
HPV感染的主要过程如下。HPV感染后HPV E6/E7基因整合到宿主细胞基因组上。随后，HPV E6/E7蛋白会被APC递呈，在感染细胞被破坏后，免疫应答开始启动。HPV抗原会被蛋白酶降解成8-10个氨基酸的短肽，这些短肽片段随后被TAP1和TAP2转运分子转运到内质网，最后和主要组织相容性复合体(MHC，在人体细胞中为人白细胞抗原，即HLA)结合。并经过高尔基体加工，形成MHC复合体表达到APC胞膜上，抗原被递呈给CD8阳性T细胞。MHC复合体和TCR的相互识别作用进而活化T细胞，合成并释放细胞因子杀伤被感染细胞。
因此，开发针对整合到被感染细胞的HPV病毒癌基因或其产物的特异性TCR及其抗原结合片段，对于HPV感染密切相关的宫颈癌的治疗将具有重要意义。
发明内容
具体而言，HPV的E6作为抗原时可以使机体产生CD8+CTL(cytotoxic lymphocyte，细胞毒性T淋巴细胞)反应。E6蛋白中的一些多肽可以被HLA分子呈递到细胞表面并被T细胞识别。HPV-16型病毒E6蛋白主要的HLA-A2限制性T细胞表位是位于其第29-38位的多肽(如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列)。
发明人通过特异性T细胞受体(TCR)单细胞筛选技术，筛选出特异性靶向于HPV-16型的E6的上述表位的两种TCR。
本发明的一个实施方式包括提供了靶向HPV-16型的E6表位的特异性T细胞受体及其抗原结合片段。本发明的另一个实施方式包括上述T细胞受体及其抗原结合片段在制备用于治疗携带HPV的E6基因的肿瘤的药物中的用途。
本发明是基于上述的原理作出的，本发明中的HPV的E6抗原(如SEQ ID NO:21所示)多肽特异性TCR或其抗原结合片段通过与HPV的E6抗原(如SEQ ID NO:21所示)多肽和HLA-A2的复合物分子特异性结合，从而刺激T细胞活化，诱导T细胞分泌IFN-γ等细胞因子，进而杀伤表达HPV的E6基因，特别是表达E6多肽(如SEQ ID NO:21所示)及HLA-A2的肿瘤细胞。
在本发明中，表述“HPV的E6抗原特异性TCR”或“鼠源HPV的E6抗原特异性TCR”为针对HPV的E6抗原中HLA-A2限制性的CTL表位多肽(其序列为如SEQ ID NO:21所示)的鼠源TCR，在本发明具体的实施方式中称为2P8D TCR或2P8D。
本申请包括与HPV的E6抗原多肽(如SEQ ID NO:21所示)与HLA-A2的复合物分子特异性结合的TCR或衍生物，也包括与原来的TCR显示实质上功能相同的抗原特异性的TCR片段。
在本发明中，“TCR的片段”或“抗原结合片段”是指TCR的抗原结合片段及TCR类似物，其通常包括至少部分母体TCR的抗原结合区或可变区，例如一个或多个(例如，六个)CDR。所述抗原结合片段或TCR的片段保留母体TCR的至少某些结合特异性，它们的用途也包含在本发明中。
当提及配体/受体、抗体/抗原或其它结合对时，“特异性”结合是指在蛋白和/或其它生物试剂的异质群体中确定是否存在所述蛋白例如(如SEQ ID NO:21所示)多肽与HLA-A2复合物分子的结合反应。因此，在所指定的条件下，特定的配体/抗原与特定的受体/抗体结合，并且并不以显著量与样品中存在的其它蛋白结合。
本发明还提供含有本发明HPV的E6抗原(如SEQ ID NO:21所示)多肽特异性TCR中的一种或两种，或其抗原结合片段的药物组合物。为了制备药物组合物，可以通过使HPV的E6抗原(如SEQ ID NO:21所示)多肽特异性TCR或其抗原结合片段与药用载体或赋形剂混合，制备成各种所需的剂型。作为本发明的药物组合物的剂型的种类，例如可以列举作为口服剂的片剂、粉末剂、丸剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂、小丸剂、舌下片、膏剂等，作为非口服剂，可以列举注射剂、栓剂、经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂等，本领域的技术人员能够根据给药途径和给药对象等选择适当的剂型。
本发明的药物组合物的有效成分的给药量，根据给药对象、对象脏器、症状、给药方法等不同而存在差异，可以考虑剂型的种类、给药方法、患者的年龄和体重、患者的症状等，根据医生的判断来确定。
本发明药物组合物还可以含有其它药剂，包括但不限于细胞毒剂、细胞生长抑制剂、抗血管形成药物或抗代谢药物、靶向肿瘤药物、免疫刺激剂或免疫调节剂或与细胞毒剂、细胞生长抑制剂或其它毒性药物结合的TCR。
具体地，本发明提供以下方案。
1.T细胞受体(TCR)或其抗原结合片段，所述TCR或其抗原结合片段能够与人乳头瘤病毒E6基因的T细胞表位和HLA-A2复合物结合，并且所述TCR包含α链可变区和β链可变区，其特征在于，
所述TCR或其抗原结合片段包含以下的α链互补决定区(CDR)和β链互补决定区(CDR)：
如SEQ ID NO:2所示的α链互补决定区CDR1；
如SEQ ID NO:3所示的α链互补决定区CDR2；
如SEQ ID NO:4所示的α链互补决定区CDR3；和
如SEQ ID NO:6所示的β链互补决定区CDR1；
如SEQ ID NO:7所示的β链互补决定区CDR2；
如SEQ ID NO:8所示的β链互补决定区CDR3，
其中，所述T细胞表位的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。
2.如项1所述的T细胞受体(TCR)或其抗原结合片段，其包含：
如SEQ ID NO:1的序列所示的α链可变区，和
如SEQ ID NO:5的序列所示的β链可变区。
3.根据项1或2所述的TCR或其抗原结合片段，其中，所述TCR为鼠源TCR、人鼠嵌合TCR或人源化TCR，优选选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20所示的序列。
4.多核苷酸，其编码项1-3中任一项所述的TCR或其抗原结合片段，其为选自SEQID NO:10或SEQ ID NO:20的序列。
5.表达载体，其包含项4所述的多核苷酸，所述表达载体为慢病毒载体。
6.宿主细胞，其包含项5所述的表达载体。
7.制备项1-3中任一项所述的TCR或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：
1)培养项6所述的宿主细胞；
2)从所述宿主细胞或其培养基中回收项1-3中任一项所述的TCR或其抗原结合片段。
8.药物组合物，其包含项1-3中任一项所述的TCR或其抗原结合片段，和药学上可接受的载体。
9.项1-3中任一项所述的TCR或其抗原结合片段在制备用于提高T细胞分泌IFN-γ的细胞因子水平的药物中的用途，其中所述药物例如为蛋白类药物、蛋白药物偶联物或TCR与抗原组合的药物。
10.项1-3中任一项所述的TCR或其抗原结合片段在制备表达人乳头瘤病毒E6基因的T细胞表位的肿瘤细胞的检测试剂中的用途，或在制备检测或诊断肿瘤的试剂中的用途，优选地，所述TCR或其抗原结合片段与人乳头瘤病毒E6基因的T细胞表位和HLA-A2特异性结合，且所述T细胞表位的序列如SEQ ID NO:21所示。
11.项1-3中任一项所述的TCR或其抗原结合片段在制备用于治疗携带如SEQ IDNO:21所示的人乳头瘤病毒E6基因的T细胞表位的肿瘤的患者的抗肿瘤药物中的用途，所述肿瘤优选为宫颈癌和头颈癌。
本发明的优点
通过利用本发明的HPV的E6抗原多肽特异性TCR制备表达该TCR的T淋巴细胞(TCR-T)，可以有效的识别并杀死表达如SEQ ID NO:21所示的HPV的E6抗原TV-10多肽的阳性肿瘤细胞，可以期待其进而抑制肿瘤特别是实体瘤的生长，尤其是宫颈癌及头颈癌，达到肿瘤治疗的效果。
本发明的靶向HPV的E6抗原TV-10多肽表位的特异性T细胞受体及表达其的T细胞具有感染效率高，结合特性高的特性，因此可以利用其进行药物前期研究，在试验模型等中开发靶向与肿瘤生长和进展相关突变的药物。由此，能够用于对于表达HPV的E6抗原的各种肿瘤在各种时期的诊断，治疗的药物的制备，尤其是治疗突变频率较高的实体瘤的药物。
附图说明
图1.E6 TV-10与HLA-A2复合物的分子筛层析及生物素化水平。A图为分子筛层析图；B图为生物素化的E6 TV-10与HLA-A2复合物的分子筛层析，及对应的生物素化水平检测SDS-PAGE图。
图2.E6 TV-10与HLA-A2四聚体(E6-TV-10/HLA-A2)特异性T细胞单细胞分选，及结合验证实验。
图A为免疫了TV-10多肽的脾细胞中的特异性T细胞单细胞分选图。图B为HEK-293T细胞中鼠源m2P8D TCR(有时也记作m2P8D)的表达，及与E6-TV-10/HLA-A2四聚体的结合。
图3.CD8-m2P8D与多肽TV-10/HLA-A2特异性结合的验证，及CD8-m2P8D Jurkat细胞与靶细胞孵育后的细胞因子分泌。图A为HLA-A2/E6-SCT K562细胞中表达HLA-A2的细胞的比例；图B为Jurkat细胞中的m2P8D TCR的表达水平。图C为与HLA-A2/E6-SCT K562细胞孵育后的CD8-m2P8D Jurkat细胞中IL-2分泌水平的ELISA检测。
图4.来源于人的m2P8D TCR-T细胞的感染效率。
图5.m2P8D TCR-T细胞与HLA-A2/E6-SCT K562细胞，或加入多肽TV-10的Caski细胞的相互作用的ELISA检测。
图6.CD8+T细胞来源的m2P8D TCR-T细胞与HLA-A2/E6-SCT K562细胞，或加入多肽TV-10的Caski细胞的相互作用的ELISPOT检测。
图7.PBMC细胞来源的m2P8D TCR-T细胞与HLA-A2/E6-SCT K562细胞，或加入多肽TV-10的Caski细胞相互作用的ELISPOT检测。
图8.人源化h2P8D TCR在HEK-293T细胞中表达与E6-TV-10/HLA-A2四聚体染色结合验证实验。
具体实施方式
本发明通过具体实施方式和附图进一步阐述本发明的技术方案，但是本领域普通技术人员可以理解的是：以下具体实施方式以及实施例旨在阐述本发明，而不应理解为以任何方式限制本发明。本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。
下述实验方法如无特殊说明，均为本领域常规的实验方法，所使用的实验材料如无特别说明，均属于可以容易的从商业公司获取的实验材料。
实施例1.HPV病毒E6抗原TV-10多肽特异性T细胞分选和TCR基因克隆
首先，发明人合成了HPV-16型病毒E6抗原HLA-A2限制性表位多肽，并利用这些多肽免疫小鼠，通过ELISPOT实验选出了其中具有免疫原性的突变多肽。该多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示，即为本发明的HLA-A2限制性表位多肽TV-10，以下有时也称为多肽TV-10或TV-10多肽。
随后，利用其制备了TV-10多肽与小鼠HLA-A2的四聚体，并通过利用CD3、CD8抗体一起染色从免疫后小鼠脾细胞中选取CD3+CD8+T细胞，分选而得到了其中的TV-10表位特异性T细胞。具体如下。
1.TV-10/HLA-A2四聚体的制备
对多肽TV-10与HLA-A2的结合特性及特异性T细胞反应，以及特异性TCR进行了评价和筛选。
按照常规方法分别对β2m(β2-微球蛋白，HLA-A2的轻链基因)(Uniprot:P61769)，及HLA-A2重链基因(Uniprot:P01892)进行了原核密码子优化，得到的β2m核酸序列如SEQID NO:16所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，得到的用于原核表达的带生物素标签的HLA-A2重链基因如SEQ ID NO:14所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
所述带生物素标签的HLA-A2重链基因，是指在重链基因的C端携带有表达生物素特异性结合多肽的序列。所述生物素特异性结合多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示。
委托公司分别合成这些DNA序列(南京金斯瑞公司)，并分别引入酶切位点Nde I和Xho I，其中Nde I酶切位点位于序列的5’端，酶切位点Xho I位于序列的3’端。利用酶切位点Nde I和Xho I，将合成的β2m和HLA-A2重链基因的DNA序列分别克隆入表达载体pET-21a(Invitrogen公司)，建立β2m和HLA-A2重链蛋白的原核重组表达质粒β2m-pET 21a和HLA-A2-pET 21a。
将两种表达质粒分别用热激法转入E.coli.BL21(DE3)感受态细胞(购自天恩泽生物)，加入IPTG进行诱导表达，破碎大肠杆菌并匀浆提取包涵体，获得包涵体状态的β2m和HLA-A2重链的包涵体蛋白。
将1mlβ2m包涵体(30mg/ml溶于含6M Gua-HCl、50mM Tris pH8.0、100mM NaCl、10mM EDTA和10mM DTT的溶解液中)缓慢滴加到分别含5mg上述制备的TV-10多肽(北京中科亚光公司合成)的1L复性液(20mM Tris-HCL，400mM L-精氨酸，EDTA 2mM，GSH/GSSG 5mM/1mM)中。
1小时后，按照β2m：HLA-A2重链＝1:1的摩尔比将HLA-A2的重链包涵体缓慢滴加到上述复性液中，复性8小时以上。浓缩：使用超滤杯使复性后的样品通过10kDa滤膜以浓缩样品，并通过浓缩换液为20mM Tris-Cl，50mM NaCl，pH8.0的缓冲液；两次换液：将样品浓缩至约20ml后，加入至200ml含20mM Tris-Cl，50mM NaCl，pH8.0的缓冲液；之后浓缩至约20ml后再次加入20mM Tris-Cl，50mM NaCl，pH8.0的缓冲液至100ml，并最终浓缩至约10-20ml体积，得到TV-10/HLA-A2复合物。
将样品取出后4℃12000rpm离心10min，将上清转移到超滤管中浓缩到约0.5-1ml，过superdex200分子筛(购自GE Healthcare)对上述TV-10/HLA-A2复合物进行纯化。根据280nm的光吸收值收集了TV-10/HLA-A2复合物的蛋白峰(峰值约在15.8mL)完成纯化。将经过分子筛纯化后的蛋白样品收集于超滤浓缩管中，浓缩至约500μL，之后4℃下离心去除沉淀，得到TV-10/HLA-A2复合物蛋白样品。
(2)生物素化反应
使用步骤(1)得到的TV-10/HLA-A2复合物蛋白样品，配制如下的生物素化反应体系(500μl)。
生物素化反应体系(购自AVIDITY公司)：总计500μl
蛋白样品1mg/ml 200μl，Buffer A(N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液)50μl，Buffer B(ATP，生物素)50μl，200μM生物素，Bir-A酶(3mg/ml)20μl，用20mM Tris-Cl，50mM NaCl，pH8.0补足到500μl。配完后混匀，置冰上，于4℃冷库孵育过夜。
将上述生物素化反应体系样品过Superdex200分子筛，进行生物素化后的复合物纯化，以去除多余的生物素，同上操作，得到生物素化的TV-10/HLA-A2复合物蛋白约0.1-0.2mg，TV-10/HLA-A2复合物蛋白峰的峰值约在15.1mL(示于图1)。
生物素化效率检测：将上述生物素化的TV-10/HLA-A2复合物浓缩到约500μl，取样进行SDS-PAGE shift试验验证生物素化效果。
设一个样品及两个对照，共三组：
A(MHC)组.生物素化的TV-10/HLA-A2复合物样品8μl+分子筛缓冲液2μl；
B(+SA)组.生物素化的TV-10/HLA-A2复合物样品8μl+链霉亲和素2μl(20mg/ml)；
C(SA)组.链霉亲和素2μl+分子筛缓冲液8μl。
将上述三支样品置冰上孵育30min后进行SDS-PAGE鉴定，结果示于图1中。
结果显示：根据280nm的光吸收值和对应的SDS-PAGE，观察到TV-10/HLA-A2复合物在生物素化后在SDS-PAGE中的条带滞后，这是由于其与链霉亲和素结合成为大分子，从而造成了条带滞后。
通过SDS-PAGE条带灰度，观察到TV-10/HLA-A2复合物在生物素化后条带灰度明显降低，可以判断，TV-10/HLA-A2复合物能够被高效地生物素化(如图1所示)。
(3)TV-10/HLA-A2四聚体的制备
将生物素化的TV-10/HLA-A2复合物分子进行超滤浓缩，按照链霉亲和素-PE：TV-10/HLA-A2复合物＝1:5的摩尔比，向生物素化的TV-10/HLA-A2复合物分子中加入链霉亲和素-PE进行四聚化，最后置4℃孵育过夜，得到TV-10/HLA-A2-PE四聚体备用。
3.TV-10多肽免疫HLA-A2转基因小鼠
在本部分中，使用了TV-10多肽对HLA-A2转基因小鼠(C57BL/6-Mcph1Tg(HLA -A2.1)1Enge,购自Jackson Lab公司)免疫，诱导小鼠体内产生针对TV-10多肽的特异性T细胞，以便进一步获得针对TV-10多肽为特异性的TCR。
具体地，取化学合成的TV-10多肽(序列如SEQ ID NO:21所示)(委托合成：中科亚光)100μg溶于100μL PBS，并与等体积的弗氏完全佐剂(Sigma公司)混合并进行乳化。将乳化的多肽和弗氏完全佐剂混合液采用背部皮下多点注射方法，进行HLA-A2转基因小鼠免疫。
第一次免疫起一周后，利用同样方法取TV-10多肽100μg溶于100μL PBS，并与等体积的弗氏不完全佐剂(Sigma公司)混合乳化，以同样的方法进行注射而实施了加强免疫。加强免疫一周以后处死小鼠，取脾脏，并研磨获得小鼠脾细胞。
4.TV-10/HLA-A2-PE四聚体特异性T细胞分选及单细胞TCR基因扩增及测序
经PBS清洗重悬，取以上经过TV-10多肽免疫后获得的小鼠脾细胞约1x107，在200-250g离心10min；用含有0.5％BSA的PBS洗三次，200-250g离心10min。
将TV-10/HLA-A2-PE四聚体(由上述四聚体制备中获得)、PerCP-Cy5-CD8(购自BD公司)和FITC-CD3荧光抗体(购自BD公司)按照1:1:1的摩尔比与脾细胞在25℃条件下共同孵育20分钟；用含0.5％BSA的PBS洗三次，200-250g离心10min；用含0.5％BSA的PBS重悬细胞。
之后对上述细胞进行流式细胞技术单细胞分选。其中，对照组为不染色四聚体的阴性对照，实验组为E6-TV-10/HLA-A2四聚体染色组，横坐标为E6-TV-10/HLA-A2四聚体，纵坐标为CD8染色。选取淋巴细胞亚群，选择CD3+CD8+T细胞，分选得到TV-10/HLA-A2-PE四聚体阳性的CD8+T细胞，结果示于图2A。
将单个阳性细胞分选至含有细胞裂解液(购自天根生物)和RNA酶抑制剂(购自康为世纪生物)的96孔板中。之后对每个孔内的TV-10/HLA-A2-PE四聚体阳性T细胞提取总RNA，进行5’RACE TCR基因扩增，具体如下所述。
5’RACE分为三个步骤：反转录(RT-PCR)、第一轮PCR扩增和第二轮PCR扩增。以下使用了Takara公司D315-FullRACE Kit并按照说明书进行操作。
(1)RT-PCR：使用的下游引物是TCR基因恒定区特异性引物GSP1(购自Takara公司)，上游引物为3’末端带有寡聚鸟嘌呤脱氧核糖核酸(Oligo dG)的靶开关引物(target-switching primer)(Takara公司)。
(2)第一轮PCR：以上述(1)得到的TCR的cDNA为模板，上游引物为外层接头引物1(5’RACE outer Primer,Takara公司)，下游引物为在恒定区GSP1上游的一段TCR恒定区的特异性引物(购自Takara公司)，得到TCR的α链或β链第一轮PCR产物。
(3)第二轮PCR：以上述(2)得到的TCR的α链或β链第一轮PCR产物为模板，上游引物为内层的接头引物2(5’RACE inner Primer,Takara公司))，下游引物为恒定区GSP2上游的一段TCR恒定区特异性引物(购自Takara公司D315-FullRACE Kit)，分别得到TCR的α链或β链第二轮PCR产物。
将扩增之后的含有TCRα链和β链可变区基因的第二轮PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在500bp位置分别获得了TCRα链或β链可变区目的基因。将目的条带进行回收，并用T4连接酶将目的基因片段连接到T载体(pMD18T，Takara)。之后将连接产物转化DH5α细胞(购自天根生物)，并进行单克隆基因测序(委托睿博兴科)。
经过上述过程对所获得的TV-10多肽特异性T细胞进行单细胞TCR基因扩增测序，并结果分析后，选取其中高频率出现的α链和β链组合为新的TCR，命名为m2P8D TCR，并进一步对其进行了结合及功能验证。本发明的m2P8D TCR具有如SEQ ID NO:1的序列所示的α链可变区，和如SEQ ID NO:5的序列所示的β链可变区。
实施例2.TV-10多肽/HLA-A2四聚体与表达m2P8D TCR的细胞结合实验
在本实施例中，发明人进一步确认了所筛选的m2P8D TCR具有针对TV-10多肽/HLA-A2的特异性结合。
1.m2P8D TCR结合特异性验证
首先，将m2P8D TCR的α链和β链可变区(V区)(氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1，SEQID NO:5所示，与人TCR的α链和β链恒定区(C区)基因(泓讯生物公司合成)连接，得到m2P8D嵌合TCRα和β链序列，嵌合序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，其核酸序列如SEQ IDNO:10所示。
并将m2P8D TCR的α链和β链中间以P2A序列(P2A序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示)连接的方式，以慢病毒表达质粒pCDH(购自Invitrogen)为出发质粒，构建了嵌合m2P8D TCR慢病毒表达载体，即慢病毒表达载体m2P8D-pCDH。
分别将m2P8D-pCDH慢病毒表达载体与表达CD3和CD8的CD3-CD8-pCDH质粒(购自南京金斯瑞公司)按照数量1:1的比例共转染HEK-293T细胞(购自ATCC)。共转染24小时后，将细胞在200-250g离心10min；用含有0.5％BSA的PBS洗三次，在200-250g离心10min，得到了表达m2P8D TCR的HEK-293T细胞。
然后，本发明人为了进一步验证m2P8D TCR与TV-10多肽/HLA-A2的结合，将上述制备的TV-10多肽/HLA-A2的四聚体与表达m2P8D TCR的293T细胞进行染色分析，以评价其结合特异性。
具体而言，将该共转染得到的HEK-293T细胞与上述制备的TV-10/HLA-A2-PE四聚体，以及PerCP-Cy5-CD8和FITC-CD3抗体(均为BD公司)按照1:1:1摩尔比共同孵育30min；用含0.5％BSA的PBS洗三次，200-250g离心10min；用含0.5％BSA的PBS重悬细胞，用于检测TV-10/HLA-A2阳性的T细胞频率。
采用流式细胞技术进行了分析。其中，mock组为不染色四聚体的HEK-293T细胞(阴性对照)，m2P8D组为用E6-TV-10/HLA-A2四聚体染色的HEK-293T细胞，横坐标为E6-TV-10/HLA-A2四聚体，纵坐标为CD3染色，结果示于图2B。
结果显示，m2P8D组中能够结合E6-TV-10/HLA-A2-PE四聚体的细胞约占CD8阳性细胞的比例为30.9％。由此可知，在HEK-293T细胞中的细胞水平的结合实验表明，m2P8D TCR能够特异性结合E6-TV-10/HLA-A2复合物。
实施例3.表达m2P8D TCR的效应细胞与表达E6-TV-10/HLA-A2的靶细胞作用
本实施例中，将m2P8D TCR基因导入Jurkat T细胞系(购自上海细胞库)，作为效应细胞；将E6-TV-10/HLA-A2导入K562细胞(购自上海细胞库)，作为靶细胞。通过检测效应细胞和靶细胞作用后IL-2的水平，对m2P8D TCR与表达E6-TV-10/HLA-A2的靶细胞的作用进行评价。具体操作如下。
1.E6-TV-10/HLA-A2靶细胞制备
按照真核细胞表达密码子优化编码多肽TV-10及HLA-A2重链和β2m的基因的DNA序列，依次连接得到的核酸序列称为TV-10/HLA-A2-E6 SCT，序列如SEQ ID NO:12所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
由泓讯生物公司合成上述DNA，并分别引入酶切位点Eco RI和Bam HI，其中Eco RI酶切位点位于序列的5’端，酶切位点Bam HI位于序列的3’端。
利用酶切位点Eco RI和Bam HI将合成的TV-10/HLA-A2-E6 SCT DNA序列克隆入表达载体pCDH(Addgene公司)，建立了TV-10/HLA-A2-E6 SCT的真核重组表达质粒HLA-A2-E6SCT-pCDH。之后将质粒HLA-A2-E6 SCT-pCDH通过DNA电转仪转入K562细胞，48小时后收集细胞用PBS清洗两次，通过anti-HLA-A2抗体对电转后的K562细胞(SCT-K562)进行染色并流式细胞检测分析。
mock组：对于K562细胞，不转入质粒HLA-A2-E6 SCT-pCDH。HLA-A2/E6-SCT K562组：转入质粒HLA-A2-E6 SCT-pCDH的SCT K562细胞，结果示于图3A。
结果显示，99％以上的电转后的HLA-A2-E6 SCT K562细胞能够表达HLA-A2，所得到的HLA-A2-E6 SCT K562靶细胞备用(图3A)。
2.m2P8D TCR慢病毒制备及Jurkat T细胞感染
m2P8D TCR慢病毒制备
将实施例2中的表达质粒m2P8D-pCDH与慢病毒包装质粒PLP1、PLP2和VSVG(均购自Addgene公司)按照PLP1:PLP2:VSVG:m2P8D-pCDH＝1:1:1:1的比例混合，并取30μl稀释到DMEM培养基(1.25ml)中。
取30ul聚醚酰亚胺(PEI，1μg/μl)加入到DMEM(1.25ml)中。将PEI/DMEM溶液全部加入到已经配好的DNA溶液中，室温孵育15分钟后加入293T细胞(上海细胞库)中并混匀。
6小时后，小心吸出培养液，加入25ml新的培养液继续培养。64小时后，收集含有病毒的上清液，即为m2P8D TCR慢病毒上清。
将m2P8D TCR慢病毒按照1:1体积比加入到Jurkat T细胞中，混匀，设无病毒感染孔做对照，置于37℃、5％CO2孵箱中培养。24小时后，换成完全培养基继续培养。病毒感染72小时后，收集细胞用PBS清洗两次，并在2μg/ml嘌呤霉素的选择压力下继续培养，以提高TCR的表达效率，得到表达m2P8D TCR的Jurkat T细胞(图3B)。
3.表达m2P8D TCR的效应细胞与表达E6-TV-10/HLA-A2的靶细胞相互作用检测
将上述表达m2P8D TCR的Jurkat T细胞(已培养至14天)进行培养，在检测与靶细胞作用的当天或者第二天利用流式细胞术进行阳性率检测，确认TCR的表达。mock组：对于Jurkat T细胞，不转入m2P8D TCR慢病毒。m2P8D组：转入m2P8D TCR慢病毒的Jurkat T细胞，结果示于图3B。
结果表明，m2P8D组中有74.6％的细胞为E6-TV-10/HLA-A2四聚体染色阳性。
ELISA
将上述E6-TV-10/HLA-A2 K562靶细胞的细胞悬液吸至15ml(相应地，也可使用50ml)离心管中，室温200-250g离心10分钟。用移液枪吸除上清液，加1ml 1640完全培养基重悬细胞进行细胞计数。将准备好的细胞悬液铺至96孔板内，每孔100μl细胞悬液(2×105个细胞)，每孔做三个重复。
按下述分组将靶细胞与效应细胞按1:1的比例混合，在37℃下培养20h后，取96孔板培养孔的上清，并于500g转速离心5min去掉残留的细胞，将上清加入包被有抗IL-2抗体的ELISA检测板(BD公司)，检测上清中的IL-2水平，示于图3C。
其中，mock处理：只有效应细胞而未加入任何靶细胞的孔。K562处理：加入未经转入的K562细胞。HLA-A2-E6 SCT K562处理：加入转入质粒HLA-A2-E6SCT-pCDH的SCT K562细胞。Jurkat组：未转入m2P8D TCR慢病毒表达载体的Jurkat T细胞。CD8-m2P8D Jurkat组：表达m2P8D TCR的Jurkat T细胞。
结果表明，表达m2P8D TCR的Jurkat T细胞与表达E6-TV-10/HLA-A2的靶细胞孵育后能够产生较高水平的IL-2，而未转入m2P8D TCR的Jurkat T细胞与靶细胞孵育后，其IL-2水平与不加靶细胞的对照无显著差异(图3C)。
因此，m2P8D TCR能够特异性识别表达HLA-A2-E6的靶细胞，并特异性刺激效应细胞分泌细胞因子IL-2，具有潜在的靶细胞杀伤活性和肿瘤治疗价值。
实施例4.m2P8D TCR-T细胞制备及其与靶细胞的免疫反应
本实施例中，将m2P8D TCR基因导入从HLA-A2遗传背景的健康志愿者中分离的外周血单个核细胞(PBMC)或分离的CD8+T细胞作为TCR-T效应细胞。
为了评价m2P8D TCR-T细胞对靶细胞的作用活性，本实施例采用两种靶细胞体系。
第一种即为上述Jurkat效应细胞反应活性评价中用到的HLA-A2-E6 SCT K562细胞。第二种是HLA-A2遗传背景的HPV阳性宫颈癌细胞系即Caski细胞(记作+Caski)加入合成的E6-TV-10多肽(记作+E6)，以评价m2P8D TCR-T细胞对呈递E6-TV-10的宫颈癌肿瘤细胞的杀伤活性。
同时，关于靶细胞，准备了表达NY-ESO-1的抗原表位/HLA-A2 SCT的K562细胞，以及加入NY-ESO-1多肽的Caski细胞作为TV-10的特异性对照。其中，所述NY-ESO-1多肽的序列如SEQ ID NO:23所示。
具体操作如下。
1.效应细胞的制备及TCR表达效率检测
采集三名健康志愿者(D1、D2和D3)的外周血淋巴细胞，得到PBMC。并取部分PBMC通过磁珠(Biolegend公司)负选分离其中的CD8 T细胞。
用包被有anti-CD3/anti-CD28的微球(ThermoFisher)按照1:1的数量比例加入到PBMC或CD8 T细胞中活化培养过夜，之后将m2P8D TCR慢病毒按照1:1体积比加入到PBMC或CD8 T细胞中，混匀，设无病毒感染孔做对照，置于37℃、5％CO2孵箱中培养。24小时后，换成完全培养基继续培养至第10天。将anti-CD3/anti-CD28的微球在磁场条件下除掉，并用与细胞培养相同的培养基进行两次清洗，得到本实施例的m2P8D TCR-T效应细胞。将上述利用PBMC或CD8 T细胞制备的，表达m2P8DTCR-T细胞(已培养至10天)进行培养，利用E6-TV-10/HLA-A2四聚体染色与实施例2相同地进行了流式细胞检测，结果示于图4，确认了m2P8D TCR的表达(右上象限)。
其中，图4A中，D1-m2P8D-PBMC，D2-m2P8D-PBMC，D3-m2P8D-PBMC分别表示由志愿者D1、D2和D3的PBMC制备的TCR-T细胞。第一行为无关四聚体染色检测，第二行为E6-TV-10/HLA-A2四聚体检测m2P8D TCR的表达水平。
图4B中，D1-m2P8D-CD8，D2-m2P8D-CD8，D3-m2P8D-CD8分别表示由志愿者D1、D2和D3的CD8 T细胞制备的TCR-T细胞。第一行为无关四聚体染色检测，第二行为E6-TV-10/HLA-A2四聚体检测m2P8D TCR的表达水平。
结果表明，利用PBMC细胞制备的来自三名志愿者的TCR-T细胞中均能够检测到具有4％-5％的不同阳性率的E6-TV-10/HLA-A2四聚体阳性T细胞，而CD8+T细胞制备的TCR-T细胞中具有8％-11％的不同阳性率的E6-TV-10/HLA-A2四聚体阳性T细胞。可知表达m2P8DTCR的效应细胞无论来源于PBMC细胞还是CD8+T细胞，都能够特异性结合E6-TV-10/HLA-A2。
2.效应细胞与K562靶细胞或Caski靶细胞的反应检测
之后，分别利用不同的T细胞检测方法(IFN-γ-ELISPOT和IFN-γ-ELISA)对m2P8DTCR-T细胞与HLA-A2/E6-SCT K562细胞或Caski细胞作用，检测分泌的IFN-γ的水平。
将利用三名志愿者的PBMC或CD8+T细胞制备的m2P8D TCR-T细胞，按照1:1的比例与HLA-A2-E6 SCT K562细胞或加入E6-TV-10多肽(10μg/ml终浓度)的Caski靶细胞混合。另外，将利用三名志愿者的PBMC或CD8+T细胞制备的m2P8D TCR-T细胞，与PBMC原代细胞作为抗原呈递细胞(APC)按照1:1的比例混合孵育，并加入E6-TV-10多肽(10μg/ml终浓度)。
为了证明TV-10多肽的特异性，还准备了以下对照：
对于K562细胞，准备了表达NY-ESO-1的抗原表位/HLA-A2 SCT(HLA-A2-NYESOSCT)的K562细胞，代替HLA-A2-E6 SCT K562细胞而作为特异性对照。所述细胞的制备方法如实施例3中的HLA-A2-E6 SCT K562细胞的制备过程，不同的是，将其中的E6-TV10肽序列替换为多肽NY-ESO-1序列SLLMWITQC(如SEQ ID NO:23所示)，对应地，用于连接表达载体pCDH的核酸序列及其编码的氨基酸序列分别为如SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25所示的序列。
同时，对于Caski细胞，用加入NY-ESO-1多肽(如SEQ ID NO:23所示)代替E6-TV-10多肽而作为特异性对照。
需要说明的是，对于Caski细胞，E6-TV-10多肽与NY-ESO-1多肽的加入量为每孔分别加入10μg/ml终浓度，在靶细胞与效应细胞混合前添加到靶细胞的培养基中。
混合物按照100μl体积1×105细胞数/孔加入到96孔细胞培养板，用于ELISA检测上清中分泌的IFN-γ水平；或加入到预包被有anti-IFN-γ抗体的ELISPOT板中，用于ELISPOT检测。
效应细胞与靶细胞混合后置37℃100％湿度5％CO2细胞培养箱中继续培养18小时。
取96孔板培养孔的上清，于500g转速离心5min去掉残留的细胞，将上清加入包被有抗IFN-γ抗体(BD公司)的ELISA检测板(BD公司)，检测上清中的IFN-γ水平，操作参照说明书，结果示于图5。
图5A中，D1-m2P8D，D2-m2P8D，D3-m2P8D表示由志愿者D1、D2和D3的PBMC细胞制备的m2P8D TCR-T细胞。control：TCR-T细胞仅与培养基孵育；+HLA-A2-E6 SCT K562：指进一步加入HLA-A2-E6 SCT K562细胞。+HLA-A2-NYESO SCT K562：指进一步加入表达NY-ESO-1表位多肽的NY-ESO-1/HLA-A2 SCT K562细胞。+Caski：指进一步加入Caski细胞。+Caski+E6肽：指进一步加入TV-10多肽及Caski细胞。+Caski+NYESO肽：指进一步加入NY-ESO-1肽及Caski细胞。
图5B中，D1-m2P8D，D2-m2P8D，D3-m2P8D表示由志愿者D1、D2和D3的CD8+T细胞制备的m2P8D TCR-T细胞，其他缩写与图A相同。
结果表明，不论是三名志愿者来源的PBMC(图5A)或CD8+T细胞(图5A)制备的m2P8DTCR-T细胞，在与表达HLA-A2-E6的K562细胞或呈递TV-10多肽的Caski靶细胞孵育后均产生了高水平的IFN-γ。同时，对于TV-10特异性，观察到m2P8D TCR-T细胞当与NY-ESO-1/HLA-A2 SCT K562细胞，以及加入NY-ESO-1多肽的Caski细胞作用时，均不能分泌IFN-γ。由此可知，ELISA实验表明m2P8D TCR-T细胞与表达HPV E6-TV-10的靶细胞的作用是特异性的，并由此分泌IFN-γ进而杀伤靶细胞。
ELISPOT实验中，平行地，增加了PBMC原代细胞作为抗原呈递细胞(APC组)加入E6肽或者NY-ESO-1多肽进行试验，以评价效应细胞的活性。将ELISPOT实验的结果示于图6、图7。
图6A为ELISPOT检测结果照片，其中，D1-m2P8D，D2-m2P8D，D3-m2P8D表示由志愿者D1、D2和D3的CD8+细胞制备的m2P8D TCR-T细胞。mock：仅m2P8DTCR-T细胞；+HLA-A2 E6SCT：加入HLA-A2-E6 SCT K562靶细胞；+Caski：加入Caski细胞；+Caski+E6肽：加入Caski细胞及TV-10多肽。+HLA-A2 NYESO SCT：加入NY-ESO-1/HLA-A2 SCT K562靶细胞，+APC指只加入PBMC原代细胞作为抗原呈递细胞：+APC+E6肽：加入PBMC原代细胞作为抗原呈递细胞及TV-10多肽，其他与图5相同。图6B为图6A相应的ELISPOT反应斑点数的统计图。
图7A为ELISPOT检测结果照片，其中，D1-m2P8D，D2-m2P8D，D3-m2P8D表示由志愿者D1、D2和D3的PBMC细胞制备的m2P8D TCR-T细胞。关于各组的处理均与图6相同。图7B为7A图相应的ELISPOT反应斑点数的统计图。
结果表明，由人PBMC(图6A)或CD8+T细胞(图7A)制备的m2P8D TCR-T细胞，不论与表达HLA-A2-E6 SCT K562靶细胞或利用HLA-A2呈递了外来的E6-TV-10多肽的Caski靶细胞孵育时，均能够产生IFN-γ斑点。
对于TV-10特异性，当m2P8D TCR-T细胞与表达NY-ESO-1/HLA-A2 SCT的K562细胞，或加入NY-ESO-1多肽的Caski细胞作用时均不能产生IFN-γ斑点。对斑点数的计数同样说明了上述结论(图6B和图7B)。
因此，ELISPOT实验表明m2P8D TCR-T细胞能够特异性与表达HPV E6-TV-10的靶细胞作用，形成分泌IFN-γ的斑点。
综上所述，证明了m2P8D TCR-T细胞能够特异性识别呈递HPV E6-TV-10/HLA-A2的靶细胞，并能够特异性分泌细胞因子IFN-γ。鉴于CD8+T细胞对靶细胞的潜在细胞毒性作用，可推断本发明的m2P8D TCR-T细胞具有潜在的靶细胞杀伤活性和肿瘤治疗价值。
实施例5.人源化h2P8D TCR及其与HPV E6-TV-10/HLA-A2的结合分析
鼠源TCR由于其异源性，用于临床治疗的一个潜在风险在于：其可能产生特异性抗体，从而使之在治疗过程中被清除，进而将会减弱其治疗效果。因此，发明人在本实施例中进一步对鼠源m2P8D TCR进行了人源化改造而获得了人源化TCR。
具体地，保留了鼠源m2P8D TCR与抗原结合的CDR区，将其骨架区替换为人源TCR的骨架区。发明人将人源化的m2P8D TCR命名为h2P8D TCR，其α和β链序列如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示。
进一步地，将上述h2P8D TCR的α链和β链中间以P2A序列连接，连接后的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示，并以慢病毒表达质粒pCDH(购自Invitrogen)为出发质粒，与实施例1同样地操作，构建了嵌合h2P8D TCR慢病毒表达载体，即慢病毒表达载体h2P8D-pCDH。
与实施例1同样地操作，分别将h2P8D-pCDH慢病毒表达载体与表达CD3和CD8的CD3-CD8-pCDH质粒(购自南京金斯瑞公司)按照数量1:1的比例共转染HEK-293T细胞(购自ATCC)。
在共转染24小时后，将细胞在200-250g离心10min；用含有0.5％BSA的PBS洗三次，在200-250g离心10min，由此得到了表达h2P8D TCR的HEK-293T细胞，记作h2P8D TCR HEK-293T细胞。
然后，本发明人验证了h2P8D TCR与TV-10多肽/HLA-A2的结合。通过分别同上地将实施例1制备的TV-10多肽/HLA-A2的四聚体与表达h2P8D TCR HEK-293T细胞进行染色分析，而评价其结合特异性。
具体而言，将h2P8D TCR HEK-293T细胞与上述制备的TV-10/HLA-A2-PE四聚体，以及PerCP-Cy5-CD8和FITC-CD3抗体(BD公司)按照1:1:1摩尔比共同孵育30min；用含0.5％BSA的PBS洗三次，200-250g离心10min；用含0.5％BSA的PBS重悬细胞，检测了TV-10/HLA-A2阳性的T细胞频率。采用流式细胞技术进行了分析，结果示于图8。对照组：不染四聚体的阴性对照，实验组为E6-TV-10/HLA-A2四聚体染色组，横坐标为E6-TV-10/HLA-A2四聚体，纵坐标为CD3染色。
结果显示，h2P8D TCR HEK-293T细胞中，能够结合E6-TV-10/HLA-A2-PE四聚体的细胞约占CD3阳性细胞的31.3％(10.1％/(10.1％+22.1％))。
由此可知，细胞水平的结合实验表明，与鼠源m2P8D TCR类似，人源化的h2P8DTCR也能够与E6-TV-10/HLA-A2复合物特异性结合。因此，基于已证实的鼠源m2P8DTCR的特性，推断人源化h2P8D TCR也具有潜在的临床应用价值。
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Claims (14)

1.T细胞受体(TCR)或其抗原结合片段，所述TCR或其抗原结合片段能够与人乳头瘤病毒E6基因的T细胞表位和HLA-A2复合物结合，并且所述TCR包含α链可变区和β链可变区，其特征在于，
所述TCR或其抗原结合片段包含以下的α链互补决定区(CDR)和β链互补决定区(CDR)：
如SEQ ID NO:2所示的α链互补决定区CDR1；
如SEQ ID NO:3所示的α链互补决定区CDR2；
如SEQ ID NO:4所示的α链互补决定区CDR3；和
如SEQ ID NO:6所示的β链互补决定区CDR1；
如SEQ ID NO:7所示的β链互补决定区CDR2；
如SEQ ID NO:8所示的β链互补决定区CDR3，
其中，所述T细胞表位的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。
2.如权利要求1所述的T细胞受体(TCR)或其抗原结合片段，其包含：
如SEQ ID NO:1的序列所示的α链可变区，和
如SEQ ID NO:5的序列所示的β链可变区。
3.根据权利要求1或2所述的TCR或其抗原结合片段，其中，所述TCR为鼠源TCR、人鼠嵌合TCR或人源化TCR。
4.根据权利要求1或2所述的TCR或其抗原结合片段，其可变区选自SEQ ID NO:9、或SEQID NO:19所示的序列。
5.多核苷酸，其编码权利要求1-4中任一项所述的TCR或其抗原结合片段，其为选自SEQID NO:10或SEQ ID NO:20的序列。
6.表达载体，其包含权利要求5所述的多核苷酸，所述表达载体为慢病毒载体。
7.宿主细胞，其包含权利要求6所述的表达载体。
8.制备权利要求1-4中任一项所述的TCR或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：
1)培养权利要求7所述的宿主细胞；
2)从所述宿主细胞或其培养基中回收权利要求1-4中任一项所述的TCR或其抗原结合片段。
9.药物组合物，其包含权利要求1-4中任一项所述的TCR或其抗原结合片段，和药学上可接受的载体。
10.权利要求1-4中任一项所述的TCR或其抗原结合片段在制备用于提高T细胞分泌IFN-γ的细胞因子水平的药物中的用途。
11.权利要求10所述的用途，其中所述药物为蛋白类药物、蛋白药物偶联物或TCR与抗原组合的药物。
12.权利要求1-4中任一项所述的TCR或其抗原结合片段在制备表达人乳头瘤病毒E6基因的T细胞表位的肿瘤细胞的检测试剂中的用途，其中所述肿瘤细胞为HLA-A2阳性，所述TCR或其抗原结合片段与人乳头瘤病毒16型E6基因的T细胞表位和HLA-A2特异性结合，且所述T细胞表位的序列如SEQ ID NO:21所示。
13.权利要求1-4中任一项所述的TCR或其抗原结合片段在制备用于治疗携带如SEQ IDNO:21所示的人乳头瘤病毒E6基因的T细胞表位的肿瘤的患者的抗肿瘤药物中的用途，其中所述肿瘤为HLA-A2阳性。
14.权利要求13所述的用途，其中所述肿瘤为宫颈癌和头颈癌。
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