JP2019533475A - 抗ctla4−抗pd−1二機能性抗体、その医薬組成物および使用 - Google Patents
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Abstract
Description
CTLA4 mAbまたはCTLA4リガンドは、CTLA4の天然的なリガンドとのCTLA4の結合を阻止することができることによって、T細胞の負的調節したシグナルに対するCTLA4の伝達をブロックし、種々の抗原に対するT細胞の反応性を高め、この点についてインビボおよびインビトロの研究結果は基本的に一致している。現在、前立腺癌、膀胱癌、結腸直腸癌、胃腸癌、肝臓癌、悪性黒色腫などの治療のために用いられている臨床試験中にあるCTLA4 mAbは存在する(Grosso JF., Jure−Kunkel MN., CTLA−4 blockade in tumor models: an overview of preclinical and translational research.Cancer Immun. 2013; 13:5. Epub 2013 Jan 22)。
モノクローナル抗体は、現在、癌、炎症、感染症及び他の疾患の治療に使用されてきたが、その多くは単一特異性である。しかし、いくつかの病気は、病気の原因と体内の影響因子が通常、異なるシグナル伝達経路において、異なるタンパク質、異なるサイトカイン、および受容体などの上方または下方制御、インビボ機能の阻害または促進などさまざまな面を含む。したがって、さまざまな異なる要因の遮断は、治療効果を向上させることができる。これは、異なる薬物の組み合わせ、異なる薬物の置き換え、例えば多重特異性抗体による複数のターゲティング戦略などで達成することができる。
二機能性抗体は、二重特異性抗体(Bispecific Antibody)とも呼ばれ、2つの異なる抗原を同時に標的結合する特異的な薬物であり、免疫ソートによる精製で調製される。また、これは、遺伝子工学で得られ、遺伝子工学は、結合部位の最適化、合成形態の考慮、および、収率の点で柔軟性を有するので、一定の利点を有する。現在、その45種類超えの存在形態が証明されている(Muller D, Kontermann RE. Bispecific antibodies for cancer immunotherapy: Current perspectives. BioDrugs 2010; 24:89−98)。現在、開発された複種類の二重特異性抗体は、IgG−ScFv形態、すなわち、Morrisonモデルであり(1997 Coloma MJ, Morrison SL. Design and production of novel tetravalent bispecific antibodies. Nat Biotechnol.Nature Biotechnology, 1997;15:159−163)、天然的に存在しているIgG形態と類似しているため、抗体工学、発現および精製に利点があり、二機能性抗体の理想的な存在形態であることが証明された(Miller BR, Demarest SJら、 Stability engineering of scFvs for the development of bispecific and multivalent antibodies. Protein Eng Des Sel 2010; 23:549−57; Fitzgerald J, Lugovskoy A. Rational engineering of antibody therapeutics targeting multiple oncogene pathways. MAbs 2011; 3:299−309)。
しかし、現在、世界には2つの異なる細胞表面分子に対する抗体が存在するが、市場には同じ細胞上の2つ以上の標的サイトを標的とする二機能性抗体はまた存在していない。同時に、抗PD−1および抗CTLA4の二重機能性抗体薬を開発する必要がある。
2015年6月16日に中国典型培養物保蔵センター(CCTCC)に寄託され、受託番号は、CCTCC NO:C2015105であるハイブリドーマ細胞株LT003(PD−1−14C12)。
ハイブリドーマ細胞株LT003がPD−1に特異的に結合する特異的モノクローナル抗体(14C12と命名)を分泌することができ、そして当該モノクローナル抗体がPDL1へのPD−1の結合を非常に有効的に遮断できることを見出した。
本発明のある態様は、PD−1を標的とする第1タンパク質機能領域と、CTLA4を標的とする第2タンパク質機能領域と、を含む二重特異性抗体である。
前記第1タンパク質機能領域と第2タンパク質機能領域は、直接に接続または接続セグメントによって接続され、好ましくは、前記接続断片が(GGGGS)nであり、nは、正の整数、例えば1、2、3、4、5または6である。
前記第1タンパク質機能領域と第2タンパク質機能領域は、独立して免疫グロブリンまたはその抗原結合断片、例えば、半抗体、Fab、F(ab’)2、または、一本鎖抗体であり、
好ましくは、前記第1タンパク質機能領域は免疫グロブリンであり、前記第2タンパク質機能領域は一本鎖抗体であり、あるいは、
好ましくは、前記第1タンパク質機能領域は一本鎖抗体であり、前記第2タンパク質機能領域は免疫グロブリンである。
前記第1タンパク質機能領域と第2タンパク質機能領域は、独立して1個、2個または2個以上である。
前記免疫グロブリンは、IgG、IgA、IgD、IgEまたはIgMであり、好ましくは、IgG、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4である。
前記一本鎖抗体は、免疫グロブリンの重鎖のC末端に接続されている。免疫グロブリンは二つの重鎖を有するため、一つの免疫グロブリン分子は、二つの一本鎖抗体分子に接続されている。好ましくは、二つの一本鎖抗体分子が同一である。
前記の免疫グロブリンの重鎖可変領域はアミノ酸配列がSEQ ID NO: 29−31であるCDRを含み、その軽鎖可変領域はアミノ酸配列がSEQ ID NO: 32−34であるCDRを含み、および/または、
前記の一本鎖抗体の重鎖可変領域はアミノ酸配列がSEQ ID NO: 35−37であるCDR、又は、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 41とSEQ ID NO: 37であるCDR、または、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 42−44であるCDRを含み、その軽鎖可変領域はアミノ酸配列がSEQ ID NO: 38−40であるCDR、または、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 45−47であるCDRを含む。
前記の免疫グロブリンの重鎖可変領域はアミノ酸配列がSEQ ID NO: 35−37であるCDR、または、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 41とSEQ ID NO: 37であるCDR、または、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 42−44であるCDRを含み、その軽鎖可変領域はアミノ酸配列がSEQ ID NO: 38−40であるCDR、または、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 45−47であるCDRを含み、および/または、
前記の一本鎖抗体の重鎖可変領域はアミノ酸配列がSEQ ID NO: 29−31であるCDRを含み、その軽鎖可変領域はアミノ酸配列がSEQ ID NO: 32−34であるCDRを含む。
前記免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列はSEQ ID NO: 16とSEQ ID NO: 20からなる群から選択され、前記免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列はSEQ ID NO: 18とSEQ ID NO: 22からなる群から選択され、および/または、
前記一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列はSEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 14およびSEQ ID NO: 25からなる群から選択され、前記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列はSEQ ID NO: 4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12およびSEQ ID NO:27からなる群から選択される。
前記免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列はSEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 14およびSEQ ID NO: 25からなる群から選択され、前記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列はSEQ ID NO: 4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12およびSEQ ID NO:27からなる群から選択され、および/または、
前記一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列はSEQ ID NO: 16とSEQ ID NO: 20からなる群から選択され、前記免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列はSEQ ID NO: 18およびSEQ ID NO: 22からなる群から選択される。
前記の免疫グロブリンは非−CDR領域を含み、かつ、前記非−CDR領域は、鼠類以外の種由来、例えばヒト抗体由来である。
前記免疫グロブリンの定常領域はヒト化定常領域であり、例えば、重鎖定常領域は、いずれもIg gamma−1 chain C region、ACCESSION: P01857を採用し、軽鎖定常領域は、いずれもIg kappa chain C region、ACCESSION: P01834を採用した。
前記の二重特異性抗体は、CTLA4タンパク質および/またはPD−1タンパク質に結合するKDが約10−5M未満、例えば、約10−6M、10−7M、10−8M、10−9Mまたは10−10M未満またはそれ以下である。
アミノ酸配列がSEQ ID NO: 29−31であるCDR、
アミノ酸配列がSEQ ID NO: 35−37であるCDR、又は、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 41とSEQ ID NO: 37であるCDR、または、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 42−44であるCDR、および、
アミノ酸配列がSEQ ID NO: 32−34であるCDR、又は、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 38−40であるCDR、または、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 45−47であるCDR、
を含み、
かつ、
軽鎖可変領域が、
アミノ酸配列がSEQ ID NO: 32−34であるCDR、
アミノ酸配列がSEQ ID NO: 38−40であるCDR、または、
アミノ酸配列がSEQ ID NO: 45−47であるCDR、
を含み、
好ましくは、軽鎖可変領域のCDRが重鎖可変領域のCDRと同一ではない、
二重特異性抗体に関する。
前記抗体の重鎖可変領域は、
アミノ酸配列がSEQ ID NO: 29−31であるCDR、
アミノ酸配列がSEQ ID NO: 35−37であるCDR、又はアミノ酸配列がSEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 41とSEQ ID NO: 37であるCDR、または、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 42−44であるCDR、および、
アミノ酸配列がSEQ ID NO: 32−34であるCDR、又は、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 38−40であるCDR、または、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 45−47であるCDR、
を含む、単離核酸分子に関する。
前記抗体の軽鎖可変領域は、
アミノ酸配列がSEQ ID NO: 32−34であるCDR、
アミノ酸配列がSEQ ID NO: 38−40であるCDR、または、
アミノ酸配列がSEQ ID NO: 45−47であるCDR
を含む、単離核酸分子に関する。
さらに薬学的に許容されるベクター及び/または賦形剤を任意的に含む、医薬組成物に関する。
試料中のCTLA4のレベルを検出する薬剤、
CTLA4のB7への結合を遮断する薬剤、
CTLA4の活性またはCTLA4のレベルを制御(例えば下方制御)する薬剤、
CTLA4の生体に対する免疫抑制を取り除く薬剤、
Tリンパ球を活性化する薬剤、あるいは、
Tリンパ球におけるIL−2の発現を増加させる薬剤
の調製における使用、
および/または、
PD−1のPDL1への結合を遮断する薬剤、
PD−1の活性またはレベルを制御(例えば下方制御)する薬剤、
PD−1の生体に対する免疫抑制を取り除く薬剤、あるいは、
Tリンパ球におけるIFN−γの発現を増加させる薬剤
の調製における使用に関する。
試料中のCTLA4のレベルを検出する方法、
CTLA4のB7への結合を遮断する方法、
CTLA4の活性またはCTLA4のレベルを制御(例えば下方制御)する方法、
CTLA4の生体に対する免疫抑制を取り除く方法、
Tリンパ球を活性化する方法、あるいは、
Tリンパ球におけるIL−2の発現を増加させる方法、
および/または、
PD−1のPDL1への結合を遮断する方法、
PD−1の活性またはレベルを制御(例えば下方制御)する方法、
PD−1の生体に対する免疫抑制を取り除く方法、あるいは、
Tリンパ球におけるIFN−γの発現を増加させる方法、
からなる群から選択される方法に関する。
本発明のインビトロ試験において、抗CTLA4抗体、抗PD−1抗体および抗CTLA4−抗PD−1二機能性抗体は、いずれもIFN−γの分泌を誘導して免疫反応を活性化することができる。
CTLA4のB7への結合を遮断すること、
CTLA4の活性またはCTLA4のレベルを制御(例えば下方制御)すること、
CTLA4の生体に対する免疫抑制を取り除くこと、あるいは
Tリンパ球を活性化する薬剤こと、または、Tリンパ球におけるIL−2の発現を増加させること、
および/または、
PD−1のPDL1への結合を遮断すること、
PD−1の活性またはレベルを制御(例えば下方制御)すること、
PD−1の生体に対する免疫抑制を取り除くこと、あるいは、
Tリンパ球におけるIFN−γの発現を増加させること、
に用いられる。
重鎖可変領域のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:16に示し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:18に示す。
HCDR1: GFAFSSYD (SEQ ID NO: 29)
HCDR2: ISGGGRYT (SEQ ID NO: 30)
HCDR3: ANRYGEAWFAY (SEQ ID NO: 31)
その軽鎖可変領域の3つのCDR領域のアミノ酸配列は、以下の通りであった。
LCDR1: QDINTY (SEQ ID NO: 32)
LCDR2: RAN (SEQ ID NO: 33)
LCDR3: LQYDEFPLT (SEQ ID NO: 34)
重鎖可変領域のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:20に示し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 22に示す。
その重鎖可変領域の3つのCDR領域のアミノ酸配列は、14C12と同じである。
その軽鎖可変領域の3つのCDR領域のアミノ酸配列は、14C12と同じである。
重鎖可変領域のアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 2に示し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 4に示す。
その重鎖可変領域の3つのCDR領域のアミノ酸配列は、以下の通りであった。
HCDR1: GYSFTGYT (SEQ ID NO: 35)
HCDR2: INPYNNIT (SEQ ID NO: 36)
HCDR3: ARLDYRSY (SEQ ID NO: 37)
その軽鎖可変領域の3つのCDR領域のアミノ酸配列は、以下の通りであった。
LCDR1: TGAVTTSNF (SEQ ID NO: 38)
LCDR2: GTN (SEQ ID NO: 39)
LCDR3: ALWYSNHWV (SEQ ID NO: 40)
重鎖可変領域のアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 6に示し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 8に示す。
その重鎖可変領域の3つのCDR領域のアミノ酸配列は、4G10と同じである。
その軽鎖可変領域の3つのCDR領域のアミノ酸配列は、4G10と同じである。
重鎖可変領域のアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 10に示し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 12に示す。
その重鎖可変領域の3つのCDR領域のアミノ酸配列は、4G10と同じである。
その軽鎖可変領域の3つのCDR領域のアミノ酸配列は、4G10と同じである。
重鎖可変領域のアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 14に示し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 12に示す。
その重鎖可変領域の3つのCDR領域のアミノ酸配列は、以下の通りであった。
HCDR1: GYSFTGYT (SEQ ID NO: 35)
HCDR2: INPYNDIT (SEQ ID NO: 41)
HCDR3: ARLDYRSY (SEQ ID NO: 37)
その軽鎖可変領域の3つのCDR領域のアミノ酸配列は、4G10と同じである。
重鎖可変領域のアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 25に示し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 27に示す。
その重鎖可変領域の3つのCDR領域のアミノ酸配列は、以下の通りであった。
HCDR1: GFTFSDNW(SEQ ID NO: 42)
HCDR2: IRNKPYNYET(SEQ ID NO: 43)
HCDR3: TAQFAY(SEQ ID NO: 44)
その軽鎖可変領域の3つのCDR領域のアミノ酸配列は、以下の通りであった。
LCDR1: ENIYGG(SEQ ID NO: 45)
LCDR2: GAT(SEQ ID NO: 46)
LCDR3: QNVLRSPFTF(SEQ ID NO: 47)
その重鎖可変領域の9つのCDR領域のアミノ酸配列は以下の通りであった。
HCDR1: GFAFSSYD (SEQ ID NO: 29)
HCDR2: ISGGGRYT (SEQ ID NO: 30)
HCDR3: ANRYGEAWFAY (SEQ ID NO: 31)
HCDR4: GYSFTGYT (SEQ ID NO: 35)
HCDR5: INPYNNIT (SEQ ID NO: 36)
HCDR6: ARLDYRSY (SEQ ID NO: 37)
HCDR7: TGAVTTSNF (SEQ ID NO: 38)
HCDR8: GTN (SEQ ID NO: 39)
HCDR9: ALWYSNHWV (SEQ ID NO: 40)
その軽鎖可変領域の3つのCDR領域のアミノ酸配列は、以下の通りであった。
LCDR1: QDINTY (SEQ ID NO: 32)
LCDR2: RAN (SEQ ID NO: 33)
LCDR3: LQYDEFPLT (SEQ ID NO: 34)
その重鎖可変領域の9つのCDR領域のアミノ酸配列は、BiAb001と同じである。
その軽鎖可変領域の3つのCDR領域のアミノ酸配列は、BiAb001と同じである。
その重鎖可変領域の9つのCDR領域のアミノ酸配列は、BiAb001と同じである。
その軽鎖可変領域の3つのCDR領域のアミノ酸配列は、BiAb001と同じである。
その重鎖可変領域の9つのCDR領域のアミノ酸配列は、BiAb001と同じである。
その軽鎖可変領域の3つのCDR領域のアミノ酸配列は、BiAb001と同じである。
その重鎖可変領域の9つのCDR領域のアミノ酸配列は、以下の通りであった。
HCDR1: GFAFSSYD (SEQ ID NO: 29)
HCDR2: ISGGGRYT (SEQ ID NO: 30)
HCDR3: ANRYGEAWFAY (SEQ ID NO: 31)
HCDR4: GYSFTGYT (SEQ ID NO: 35)
HCDR5: INPYNDIT (SEQ ID NO: 41)
HCDR6: ARLDYRSY (SEQ ID NO: 37)
HCDR7: TGAVTTSNF (SEQ ID NO: 38)
HCDR8: GTN (SEQ ID NO: 39)
HCDR9: ALWYSNHWV (SEQ ID NO: 40)
その軽鎖可変領域の3つのCDR領域のアミノ酸配列は、BiAb001と同じである。
その重鎖可変領域の9つのCDR領域のアミノ酸配列は以下の通りであった。
HCDR1: GFAFSSYD (SEQ ID NO: 29)
HCDR2: ISGGGRYT (SEQ ID NO: 30)
HCDR3: ANRYGEAWFAY (SEQ ID NO: 31)
HCDR4: GFTFSDNW(SEQ ID NO: 42)
HCDR5: IRNKPYNYET(SEQ ID NO: 43)
HCDR6: TAQFAY(SEQ ID NO: 44)
HCDR7: ENIYGG(SEQ ID NO: 45)
HCDR8: GAT(SEQ ID NO: 46)
HCDR9: QNVLRSPFTF(SEQ ID NO: 47)
その軽鎖可変領域の3つのCDR領域のアミノ酸配列は、BiAb001と同じである。
本明細書中で使用される場合、「抗体」という用語は、一般的に2対のポリペプチド鎖(各対は「軽」(L)鎖および「重」(H)鎖を有する。)からなる免疫グロブリン分子を指す。一般的な意味では、重鎖は、抗体における分子量の大きい方のポリペプチド鎖と理解され、軽鎖は抗体における分子量の小さい方のポリペプチド鎖を指す。軽鎖は、κおよびλ軽鎖として分類され得る。重鎖は通常μ、δ、γ、αまたはεとして分類され得、抗体のアイソタイプはそれぞれIgM、IgD、IgG、IgAおよびIgEとして定義される。軽鎖および重鎖内で、可変領域および定常領域は、約12つ以上のアミノ酸の「J」領域を介して連結され、重鎖は約3つ以上のアミノ酸の「D」領域をさらに含む。各重鎖は、重鎖可変領域(VH)および重鎖定常領域(CH)からなる。重鎖定常領域は、3つのドメイン(CH1、CH2およびCH3)からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域(VL)および軽鎖定常領域(CL)からなる。軽鎖定常領域はCLドメインからなる。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞(例えばエフェクター細胞)および古典的な補体系の第一の構成成分(C1q)を含め、宿主組織また因子への免疫グロブリンの結合に介在し得る。VHおよびVL領域は、比較的に保存されるフレームワーク領域(FR)と呼ばれる領域に散在する高い可変性を有する領域(相補性決定領域(CDR)と呼ばれる。)にさらに細かく分けられ得る。各VHまたはVLは、アミノ末端からカルボキシ末端へと次の順序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4で並んでいる、3つのCDRおよび4つのFRからなる。重鎖/軽鎖の各対の可変領域(VHおよびVL)は抗体結合部位をそれぞれ形成する。各領域またはドメインに対するアミノ酸の割り当ては、Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987および1991))またはChothia & Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901−917;Chothiaら(1989)Nature 342:878−883で提供される定義に従う。特に、重鎖は、三つ以上、例えば6、9、12つのCDRを含んでもよい。例えば本発明の二機能性抗体において、重鎖は、IgG抗体の重鎖のC端がもう一つの抗体のScFvと連接されていてもよく、この場合、重鎖が9つのCDRを含む。「抗体」という用語は、抗体を産生させる何らかの具体的な方法に限定されない。例えば、これは、特に、組み換え抗体、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含む。抗体は、異なるアイソタイプの抗体、例えばIgG(例えばIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4サブタイプ)、IgA1、IgA2、IgD、IgEまたはIgM抗体であり得る。
本明細書中で使用される場合、「単抗」または「モノクローナル抗体」という用語は、高度に相同性を有する抗体分子の集団からの抗体または抗体断片を指し、すなわち、可能性のある天然の突然変異を除き、完全に同一の抗体分子集団である。単抗は、抗原上の単一のエピトープに非常に高い特異性を有する。モノクローナル抗体とは対照的に、ポリクローナル抗体は、一般的には、抗原上の異なるエピトープを認識する少なくとも2つ以上の異なる抗体を含む。モノクローナル抗体は、一般的に、最初にKohlerらにより報告されたハイブリドーマ技術を用いて得ることができる(Nature,256:495,1975)が、組み換えDNA技術を使用して得ることもできる(例えば米国特許第4,816,567号を参照のこと。)。
本明細書中で使用される場合、「キメラ抗体」とは、軽鎖または/および重鎖の一部が1つの抗体(それは所定のある種に由来するか、または所定の抗体クラスもしくはサブクラスに属してもよい。)に由来、かつ、軽鎖また/および重鎖の他の部分が別の抗体(それは同じがまたは異なる種に由来するが、同じかまたは異なる抗体クラスまたはサブクラスに属してもよい)に由来したものであるが、いずれにせよ、標的抗原に対する結合活性を保持する抗体を指す(U.S.P 4,816,567,Cabillyら; Morrisonら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 6855 (1984))。
ハイブリドーマ細胞株LT002(CTLA4−4G10)は、2015年6月16日に中国典型培養物保蔵センター(CCTCC)に寄託され、受託番号は、CCTCC NO:C201587であり、アドレス は: 中国 武漢、武漢大学で、郵便番号は、430072である。
ハイブリドーマ細胞株LT003(PD−1−14C12)は、2015年6月16日に中国典型培養物保蔵センター(CCTCC)に寄託され、受託番号は、CCTCC NO:C2015105であり、アドレス は: 中国 武漢、武漢大学で、郵便番号は、430072である。
1. ハイブリドーマ細胞株LT002の調製
抗CTLA4抗体の調製に用いられる抗原CTLA4−mFcは、ヒトCTLA4(GenbankID: NP_005205.2)細胞外ドメインとマウスIgG1Fcの融合タンパク質である。免疫BALB/Cマウス(Guangdong Medical Laboratory Animal Centerから購入)の脾臓細胞をマウス骨髓瘤細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を合成し、現在確立された方法(例えば,Stewart, S.J., “Monoclonal Antibody Production”, in Basic Methods in antibody Production and Characterization, Eds. G.C. Howard and D.R. Bethell, Boca Raton: CRC Press, 2000)に従った。
前記に得られたLT002細胞株を10%の低IgGウシ胎児血清を含むIMDM培地で培養し(1%ストレプトマイシンを含むIMDM培地、5%CO2、37°Cで細胞インキュベータに培養した)、7日後に細胞培養上清を集めて、高速遠心、細孔フィルター膜による真空ろ過、および、HiTrap protein A HPカラムによる精製によって、抗体4G10を調製した。精製した4G10サンプルをSDS−PAGE電気泳動測定した結果を図1に示す。
抗体4G10の配列解析
培養細胞/細菌Total RNA Extraction Kit(Tiangen、カタログ番号DP430)の方法で、実施例1にて培養したLT002細胞株からmRNAを抽出した。
Invitrogen SuperScript(R) III First−Strand Synthesis System for RT−PCRキット取扱説明書に従ってcDNAを合成し、かつ、PCRにより増幅させた。
PCR増幅産物を直接にTAクローニングに供した。具体的な操作は、pEASY−T1 Cloning Kit(Transgen CT101)キット取扱説明書を参照して行う。
重鎖可変領域の核酸配列:(372 bp)
CAGGTCAAGCTGCAGGAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGAGCTTCAATGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAACCTTGAATGGATTGGACTTATTAATCCTTACAATAATATTACTAACTACAACCAGAAGTTCATGGGCAAGGCCACATTTACTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATGGAACTCCTCAGACTGACATCTGAAGACTCTGGAGTCTATTTCTGTGCAAGACTCGACTATAGGTCTTATTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTAT (SEQ ID NO: 1)
これによりコードされるアミノ酸配列:(124 aa)
QVKLQESGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWIGLINPYNNITNYNQKFMGKATFTVDKSSSTAYMELLRLTSEDSGVYFCARLDYRSYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVY (SEQ ID NO: 2)
軽鎖可変領域の核酸配列:(378 bp)
CAGGCTGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGAAACAGTCACACTCACTTGTCGCTCAAGTACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACTTTGCCAACTGGGTCCAAGAAAAACCAGATCATTTATTCACTAGTCTAATAGGTGGTACCAACAACCGAGCTCCAGGTGTTCCTGCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCACAGACTGAGGATGAGGCAATATATTTCTGTGCTCTATGGTACAGCAACCATTGGGTGTTCGGTGGAGGAACCAAACTGACTGTCCTAGGCCAGCCCAAGTCTTCGCCATCAGTCACCCTGTTTCAAGGGCAATTCTGC(SEQ ID NO: 3)
これによりコードされるアミノ酸配列:(126 aa)
QAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNFANWVQEKPDHLFTSLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVLGQPKSSPSVTLFQGQFC(SEQ ID NO: 4)
1. 抗CTLA4ヒト化抗体4G10H1L1、4G10H3L3および4G10H4L3の軽鎖と重鎖配列のデザイン
CTLA4タンパク質の三次元結晶構造(Nat.Struct.Biol. (1997) 4 p.527)および実施例2に得られた抗体4G10の配列に基づき、抗体モデルのコンピューターシミュレーションによって、モデルによって変異をデザインし、抗体4G10H1L1、4G10H3L3および4G10H4L3の可変領域配列(抗体定常領域配列、NCBIのデータベースから、重鎖定常領域はIg gamma−1 chain C region,ACCESSION: P01857、軽鎖定常領域はIg kappa chain C region,ACCESSION: P01834である)を得た。
(1)ヒト化モノクローナル抗体4G10H1L1の重鎖と軽鎖の配列
重鎖可変領域の核酸配列:(345 bp)
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCTCCATGAAGATCTCTTGCAAGGCCAGCGGATACAGTTTCACTGGCTATACCATGAACTGGGTCAAACAGGCTCCAGGACAGGGACTGGAGTGGATCGGGCTGATTAATCCTTACAACAACATCACCAACTACAACCAGAAGTTCATGGGAAAAGCAACCTTTACAGTGGACAAGAGCATTTCCACAGCCTACATGGAACTGAGCCGGCTGACTTCAGACGATAGCGGGGTCTATTTTTGTGCAAGGCTGGATTATCGCTCTTACTGGGGGCAGGGAACTCTGGTCACTGTCTCCGCT(SEQ ID NO: 5)
これによりコードされるアミノ酸配列:(115 aa)
QVQLVESGAELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQAPGQGLEWIGLINPYNNITNYNQKFMGKATFTVDKSISTAYMELSRLTSDDSGVYFCARLDYRSYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO: 6)
軽鎖可変領域の核酸配列:(327 bp)
CAGGCTGTCGTCACTCAGGAACCTTCACTGACTGTGAGCCCAGGAGGAACTGTCACCCTGACATGCGGAAGCTCCACCGGAGCAGTGACCACATCCAACTTCGCCAATTGGGTCCAGGAAAAGCCAGGCCAGGCATTTCGATCCCTGATCGGAGGCACAAACAATCGGGCTTCTTGGGTGCCCGCAAGATTCTCAGGAAGCCTGCTGGGGGGAAAAGCCGCTCTGACCATTAGTGGCGCTCAGCCTGAGGACGAAGCCGAGTACTTCTGCGCTCTGTGGTATAGCAACCACTGGGTGTTTGGCGGGGGAACAAAGCTGACTGTGCTG(SEQ ID NO: 7)
これによりコードされるアミノ酸配列:(109 aa)
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNFANWVQEKPGQAFRSLIGGTNNRASWVPARFSGSLLGGKAALTISGAQPEDEAEYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO: 8)
重鎖可変領域の核酸配列:(345 bp)
CAGGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGGGCCGAAGTGAAGAAACCCGGCGCCTCAGTGAAGGTCAGCTGCAAGGCCAGCGGGTACAGTTTCACTGGATATACCATGAACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCCAGGGGCTGGAGTGGATCGGCCTGATTAACCCTTACAACAACATCACTAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGGAGAGTGACCTTTACAGTGGACACCAGCATTTCCACAGCCTACATGGAACTGTCCCGGCTGAGATCTGACGATACAGGCGTGTACTTCTGCGCTAGGCTGGATTACCGCAGCTATTGGGGACAGGGCACACTGGTGACTGTCAGCGCA(SEQ ID NO: 9)
これによりコードされるアミノ酸配列:(115 aa)
QVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQGLEWIGLINPYNNITNYAQKFQGRVTFTVDTSISTAYMELSRLRSDDTGVYFCARLDYRSYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO: 10)
軽鎖可変領域の核酸配列:(327 bp)
CAGGCTGTCGTCACTCAGGAACCTTCACTGACCGTGTCTCCTGGCGGGACTGTCACCCTGACATGCGGCAGCTCCACAGGGGCCGTGACCACAAGTAACTTCCCAAATTGGGTCCAGCAGAAGCCAGGACAGGCTCCCCGGAGTCTGATCGGAGGCACCAACAACAAGGCCAGCTGGACACCCGCACGGTTCAGCGGCAGCCTGCTGGGCGGCAAGGCCGCTCTGACAATTAGCGGAGCCCAGCCTGAGGACGAAGCCGAGTACTATTGCGCTCTGTGGTACTCCAACCACTGGGTGTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGACTGTGCTG(SEQ ID NO: 11)
これによりコードされるアミノ酸配列:(109 aa)
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNFPNWVQQKPGQAPRSLIGGTNNKASWTPARFSGSLLGGKAALTISGAQPEDEAEYYCALWYSNHWVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO: 12)
(3)ヒト化モノクローナル抗体4G10H4L3の重鎖と軽鎖の配列
重鎖可変領域の核酸配列:(345bp)
CAGGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGGGCCGAAGTGAAGAAACCCGGCGCCTCAGTGAAGGTCAGCTGCAAGGCCAGCGGGTACAGTTTCACTGGATATACCATGAACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCCAGGGGCTGGAGTGGATCGGCCTGATTAACCCTTACAACGACATCACTAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGGAGAGTGACCTTTACAGTGGACACCAGCATTTCCACAGCCTACATGGAACTGTCCCGGCTGAGATCTGACGATACAGGCGTGTACTTCTGCGCTAGGCTGGATTACCGCAGCTATTGGGGACAGGGCACACTGGTGACTGTCAGCGCA(SEQ ID NO: 13)
これによりコードされるアミノ酸配列:(115 aa)
QVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQGLEWIGLINPYNDITNYAQKFQGRVTFTVDTSISTAYMELSRLRSDDTGVYFCARLDYRSYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO: 14)
軽鎖可変領域の核酸配列は、4G10H3L3の軽鎖可変領域配列と同じである。
重鎖定常領域は、いずれもIg gamma−1 chain C region,ACCESSION: P01857を採用する。軽鎖定常領域は、いずれもIg kappa chain C region,ACCESSION: P01834を採用する。
4G10H1L1の重鎖cDNAと軽鎖cDNA、4G10H3L3の重鎖cDNAと軽鎖cDNA、および4G10H4L3の重鎖cDNAと軽鎖cDNAを、別々にpUC57simple(GenScript Corp.より提供)ベクターにクローニングし、それぞれpUC57simple−4G10H1、pUC57simple−4G10L1、pUC57simple−4G10H3、pUC57simple−4G10L3、および、pUC57simple−4G10H4、pUC57simple−4G10L3を得た。そして、別々にpcDNA3.1ベクターにサブクローニングした。組み換えプラスミドを293F細胞にトランスフェクトした後、培養液を集めて精製し、ヒト化抗体4G10H1L1、4G10H3L3および4G10H4L3を得た。精製した4G10H1L1サンプルに対してSDS−PAGE電気泳動検出を行い、得られた結果を図2に示す。精製した4G10H3L3サンプルに対してSDS−PAGE電気泳動検出を行い、得られた結果を図3に示す。
1. ハイブリドーマ細胞株LT003の調製
PD−1−mFc融合タンパク質を抗原とし、免疫BALB/Cマウス(Guangdong Medical Laboratory Animal Centerから購入)の脾臓細胞を、マウス骨髓瘤細胞と融合してハイブリドーマ細胞を合成し、現在、確立された方法(例えば、Stewart,S.J.,“Monoclonal Antibody Production”, in Basic Methods in antibody Production and Characterization, Eds. G.C. Howard and D.R. Bethell, Boca Raton:CRC Press, 2000)に従った。
PD−1−mFcを抗原としてマイクロタイタープレートに被覆し、間接ELISA法によってスクリーニングし、PD−1と特異的に結合する新規な抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を得た。
競合ELISAでリガンドPDL1−hFc(PDL1 Genebank ID:NP_054862.1)と競合してPD−1と結合するモノクローナル抗体を分泌できるハイブリドーマ細胞株をスクリーニングし、限界希釈法により安定的なハイブリドーマ細胞株を得、かつ、限界希釈法によりLT003安定細胞株(PD−1‐14C12)を得、これにより分泌されたモノクローナル抗体を14C12と命名した。
ハイブリドーマ細胞株LT003(PD−1−14C12)は、2015年6月16日に中国典型培養物保蔵センター(CCTCC)に寄託され、受託番号は、CCTCC NO:C2015105であり、アドレス は: 中国 武漢、武漢大学で、郵便番号は、430072である。
前記に得られたLT003細胞株を10%の低IgGウシ胎児血清を含むIMDM培地で培養し(1%ストレプトマイシンを含むIMDM培地、5%CO2、37°Cで細胞インキュベータに培養)、7日後に細胞培養上清を集めて精製し、抗体14C12を得た。
抗体14C12の配列の取得
培養細胞/細菌Total RNA Extraction Kit(Tiangen、カタログ番号DP430)の方法で、実施例4で得られたハイブリドーマ細胞株LT003からmRNAを抽出した。
Invitrogen SuperScript(R) III First−Strand Synthesis System for RT−PCRキット取扱説明書に従ってcDNAを合成し、かつ、PCRにより増幅させた。
PCR増幅産物を直接にTAクローニングに供した。具体的な操作は、pEASY−T1 Cloning Kit(Transgen CT101)キット取扱説明書を参照する。
TAクローニングの産物を直接に配列決定に供し、配列決定結果を以下に示す。
重鎖可変領域の核酸配列:(354 bp)
GAGGTCAAACTGGTGGAGAGCGGCGGCGGGCTGGTGAAGCCCGGCGGGTCACTGAAACTGAGCTGCGCCGCTTCCGGCTTCGCCTTTAGCTCCTACGACATGTCATGGGTGAGGCAGACCCCTGAGAAGCGCCTGGAATGGGTCGCTACTATCAGCGGAGGCGGGCGATACACCTACTATCCTGACTCTGTCAAAGGGAGATTCACAATTAGTCGGGATAACGCCAGAAATACTCTGTATCTGCAGATGTCTAGTCTGCGGTCCGAGGATACAGCTCTGTACTATTGTGCAAACCGGTACGGCGAAGCATGGTTTGCCTATTGGGGACAGGGCACCCTGGTGACAGTCTCTGCC(SEQ ID NO: 15)
これによりコードされるアミノ酸配列:(118 aa)
EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSSYDMSWVRQTPEKRLEWVATISGGGRYTYYPDSVKGRFTISRDNARNTLYLQMSSLRSEDTALYYCANRYGEAWFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO: 16)
軽鎖可変領域の核酸配列:(318 bp)
GACATTAAGATGACACAGTCCCCTTCCTCAATGTACGCTAGCCTGGGCGAGCGAGTGACCTTCACATGCAAAGCATCCCAGGACATCAACACATACCTGTCTTGGTTTCAGCAGAAGCCAGGCAAAAGCCCCAAGACCCTGATCTACCGGGCCAATAGACTGGTGGACGGGGTCCCCAGCAGATTCTCCGGATCTGGCAGTGGGCAGGATTACTCCCTGACCATCAGCTCCCTGGAGTATGAAGACATGGGCATCTACTATTGCCTGCAGTATGATGAGTTCCCTCTGACCTTTGGAGCAGGCACAAAACTGGAACTG(SEQ ID NO: 17)
これによりコードされるアミノ酸配列:(106 aa)
DIKMTQSPSSMYASLGERVTFTCKASQDINTYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDEFPLTFGAGTKLEL(SEQ ID NO: 18)
1. ヒト化抗体14C12H1L1の軽鎖および重鎖配列のデザイン
PD―1タンパク質の三次元結晶構造(Shinohara Tら、 Structure and chromosomal localization of the human PD―1 gene(PDCD1). Genomics 1995, 23(3):704−6)および実施例5にて得られた抗体14C12の配列に基づき、抗体モデルのコンピューターシミュレーションによって、モデルによって変異をデザインし、抗体14C12H1L1の可変領域配列を得た。
デザインした可変領域配列は、以下の通りであった。
重鎖可変領域の核酸配列:(354 bp)
GAAGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGGGGAGGGCTGGTGCAGCCCGGCGGGTCACTGCGACTGAGCTGCGCAGCTTCCGGATTCGCCTTTAGCTCCTACGACATGTCCTGGGTGCGACAGGCACCAGGAAAGGGACTGGATTGGGTCGCTACTATCTCAGGAGGCGGGAGATACACCTACTATCCTGACAGCGTCAAGGGCCGGTTCACAATCTCTAGAGATAACAGTAAGAACAATCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCTGAGGACACCGCACTGTACTATTGTGCCAACCGCTACGGGGAAGCATGGTTTGCCTATTGGGGGCAGGGAACCCTGGTGACAGTCTCTAGT (SEQ ID NO: 19)
これによりコードされるアミノ酸配列:(118 aa)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSSYDMSWVRQAPGKGLDWVATISGGGRYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNNLYLQMNSLRAEDTALYYCANRYGEAWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO: 20)
軽鎖可変領域の核酸配列:(321 bp)
GACATTCAGATGACTCAGAGCCCCTCCTCCATGTCCGCCTCTGTGGGCGACAGGGTCACCTTCACATGCCGCGCTAGTCAGGATATCAACACCTACCTGAGCTGGTTTCAGCAGAAGCCAGGGAAAAGCCCCAAGACACTGATCTACCGGGCTAATAGACTGGTGTCTGGAGTCCCAAGTCGGTTCAGTGGCTCAGGGAGCGGACAGGACTACACTCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCTGAGGACATGGCAACCTACTATTGCCTGCAGTATGATGAGTTCCCACTGACCTTTGGCGCCGGGACAAAACTGGAGCTGAAG(SEQ ID NO: 21)
これによりコードされるアミノ酸配列:(107 aa)
DIQMTQSPSSMSASVGDRVTFTCRASQDINTYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVSGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDMATYYCLQYDEFPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO: 22)
重鎖定常領域は、Ig gamma−1 chain C region,ACCESSION: P01857を採用し、軽鎖定常領域は、Ig kappa chain C region,ACCESSION: P01834を採用した。
14C12H1L1の重鎖cDNAと軽鎖cDNAをそれぞれpcDNA3.1ベクターにクローニングし、抗体14C12H1L1の組換え発現プラスミドを得た。組換えプラスミドを293F細胞にトランスフェクションした。293F細胞培養液を精製して測定した。測定した結果は図4に示すように、還元型タンパク質試料の目的タンパク質は、約24.5kDと49KDにあったが、非還元型タンパク質試料の目的タンパク質は、約147 kDにあった。
1. 配列デザイン
本発明における二機能性抗体BiAb001、BiAb002、BiAb003、BiAb004、BiAb007およびBiAb010の構造モードは、Morrisonモード(IgG−scFv)に属し、すなわち、1つのIgG抗体の2本の重鎖のC端は、いずれも別の抗体のscFv断片に接続され、その重鎖と軽鎖の主な組成デザインが、下記の表1に示す。
(1)右下に「V」というマークを付いているのは、対応の重鎖の可変領域または対応の軽鎖の可変領域を意味する。「V」というマークを付いていないのは、対応の重鎖または軽鎖が定常領域の全長を含むことを意味する。これらの可変領域または全長のアミノ酸配列およびコードされる核酸配列は、いずれも前記の実施例に記載の対応の配列を参照する。
(2)Linker1のアミノ酸配列は(GGGGS)3(SEQ ID NO: 23)である。
Linker2のアミノ酸配列は(GGGGS)4(SEQ ID NO: 24)である。
(3)8D2H14L2の重鎖可変領域(8D2H14V)のアミノ酸配列:
EVQLVESGGGLVQPGGSSRLSCAASGFTFSDNWMNWVRQAPGKGLEWLAQIRNKPYNYETYYSASVKGRFTISRDDSKNSVYLQMNSLKTEDTGVYYCTAQFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO: 25)である。
8D2H14Vをコードする核酸配列:
GAGGTGCAGCTGGTCGAATCTGGAGGAGGACTGGTGCAGCCTGGAGGAAGCTCCCGGCTGTCATGTGCCGCTAGCGGCTTCACCTTTTCCGACAACTGGATGAATTGGGTGCGACAGGCACCAGGCAAAGGACTGGAGTGGCTGGCTCAGATCCGGAACAAGCCCTACAATTATGAAACATACTATAGCGCCTCCGTGAAAGGCCGGTTCACTATTAGTAGAGACGATTCTAAGAACAGCGTGTACCTGCAGATGAATAGCCTGAAGACAGAGGATACTGGCGTCTACTATTGCACAGCACAGTTTGCCTATTGGGGACAGGGCACCCTGGTGACAGTCTCTAGT(SEQ ID NO: 26)
(4)8D2H14L2の軽鎖可変領域(8D2L2V)のアミノ酸配列:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSENIYGGLNWYQRKPGKSPKLLIYGATNLASGVSSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCQNVLRSPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO: 27)
8D2L2Vをコードする核酸配列:
GACATCCAGATGACTCAGAGCCCCTCAAGCCTGTCTGCAAGTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACATGTCGCACCTCCGAAAACATCTACGGGGGACTGAATTGGTATCAGCGCAAGCCCGGCAAATCCCCTAAGCTGCTGATCTACGGCGCTACCAACCTGGCATCTGGGGTGTCCTCTCGATTTTCAGGGAGCGGCAGCGGCACCGACTATACTCTGACCATTAGTTCACTGCAGCCTGAGGATGTGGCCACATACTATTGCCAGAATGTCCTGAGATCACCATTCACTTTTGGGAGCGGAACCAAACTGGAAATTAAG(SEQ ID NO: 28)
BiAb001の重鎖cDNA配列と軽鎖のcDNA配列をそれぞれpUC57simple(GenScript Corp.より提供)ベクターにクローニングし、それぞれpUC57simple−BiAb001H、pUC57simple− BiAb001Lプラスミドを得た。
前述したBiAb001の発現および精製方法で精製した抗体BiAb002,BiAb003、BiAb004、BiAb007とBiAb010を得た。
精製した試料にそれぞれ還元型タンパク質電気泳動ローディング緩衝液、非還元型タンパク質電気泳動ローディング緩衝液を加え、沸騰した後、SDS−PAGE電気泳動検出を行った。BiAb002、BiAb003、BiAb004、BiAb007およびBiAb010の電気泳動図は、それぞれ図6、図7、図8、図9および図10に示すように、還元型タンパク質試料の目的タンパク質は、23.6 kDと75.8 kDにあったが、非還元型タンパク質試料(単一抗体)の目的タンパク質は、199 kDにあった。
Fortebio分子間相互作用機で抗体と抗原を結合する動的パラメータを測定した。
1. 抗体4G10およびヒト化抗体4G10H1L1、4G10H3L3、4G10H4L3の抗原CTLA4との結合の動的パラメータの測定
1.1. TEV タンパク質酵素でCTLA4−mFcタンパク質を切断し、かつカラム精製してCTLA4抗原を得た。
1.2. 抗体4G10をアミノカップリングによりAR2Gセンサーの表面に固定化し、エタノールアミンによりブロックし、PBSTでバランスした後、抗原CTLA4と結合し、CTLA4をPBSTで2倍希釈し、濃度は268.1、134.1、67、33.5、16.8、8.38、4.19、0nMであり、PBSTにて解離させた。ヒト化4G10H1L1、4G10H3L3、4G10H4L3の検出方法は4G10と類似し、抗原濃度は、180、90、45、22.5、11.25、5.625、2.813、0nMであった。
1.3 抗体4G10およびそのヒト化抗体4G10H1L1、4G10H3L3、4G10H4L3の抗原と結合する動的パラメータ測定結果は、下記の表1に示し、動的特性パラメーター測定結果は、それぞれ図11、図12、図13および図14に示す。
2.1.TEVタンパク質酵素でPD−1−mFcタンパク質を切断し、カラム精製してPD−1抗原を得た。
2.2.抗原PD−1(抗原濃度:1 μg/ml)をビオチンで標識してSAセンサー表面に固定化し、PBSTでバランスした後、それぞれ抗体14C12、14C12H1L1と結合し、抗体をPBSTで200nMから3倍希釈してPBSTにて解離させた。
2.3 抗体14C12、14C12H1L1の抗原と結合する動的パラメータ検出結果を下記の表1に示し、動的特性パラメーター検出結果をそれぞれ図15、図16に示す。
3.1 抗原CTLA4(抗原濃度:1 μg/ml)をビオチンで標識してSAセンサー表面に固定化し、PBSTでバランスした後、それぞれ抗体BiAb001、BiAb002、BiAb003、BiAb004、BiAb007およびBiAb010と結合し、抗体をPBSTで200nMから3倍希釈してPBSTにて解離させた。
3.2 抗体BiAb001、BiAb002、BiAb003、BiAb004、BiAb007およびBiAb010の抗原CTLA4と結合する動的パラメータ検出結果を下記の表1に示し、動的特性パラメーター検出結果を、それぞれ図17−図21に示す。
4.1抗原PD−1(抗原濃度:1 μg/ml)をビオチンで標識してSAセンサー表面に固定化し、PBSTでバランスした後、それぞれ抗体BiAb001、BiAb002、BiAb003、BiAb004、BiAb007およびBiAb010と結合し、抗体をPBSTで200nMから3倍希釈してPBSTにて解離させた。
4.2抗体BiAb001、BiAb002、BiAb003、BiAb004、BiAb007およびBiAb010の抗原PD−1と結合する動的パラメータ検出結果を下記の表2に示し、動的特性パラメーター検出結果をそれぞれ図22−図27に示す。
抗体4G10及びそのヒト化抗体は、いずれも抗原に対してよい親和性を有する。14C12と14C12H1L1は、いずれも抗原PD−1に対して良い親和性を有する。
二機能性抗体は、いずれも抗原CTLA4、PD−1に対して良い親和性を有する。
1. ヒト化抗体4G10H1L1、4G10H3L3の抗原CTLA4との結合活性
1.1 間接ELISA法でヒト化抗体4G10H1L1、4G10H3L3のCTLA4との結合活性を測定した。
ELISAプレートに抗原を加えてインキュベートし、4℃で一晩置き、1%のBSAで37℃、2時間ブロッキングした後、それぞれ、抗体に加え、37℃で30 minインキュベートし、HRPで標識したヒツジ抗ヒトIgG(H+L)二次抗体(Jackson,109−035−088)を添加し、TMB(Neogen,308177)で5 min発色反応を行い、かつ、マイクロプレートリーダーで450nm波長における吸光度を測定した。
測定結果を図28に示す。図面からわかるように、ヒト化抗体4G10H1L1、4G10H3L3は、いずれも有効的にCTLA4タンパク質と結合でき、かつその結合效率は、投与量に依存し、各投与量の蛍光強度を表3に示す。結合された抗体に対して蛍光定量分析を行い、曲線シミュレーションより計算した抗体4G10H1L1、4G10H3L3の結合效率EC50は、それぞれ0.048、0.067nMであった。
B7/1−hFc(B7/1Genbank ID:NP_005182.1)でELISAプレートを4℃で一晩被覆し、1%BSAで2時間ブロッキングした後、抗体を加え、それぞれCTLA4−mFcの抗原抗体混合液(希釈濃度は表4に示す)と37℃で30minインキュベートした後、酵素標識二次抗体を添加して37℃で1hインキュベートし、37℃で30 minインキュベートした。マイクロプレートリーダーで450nmにおける吸光度値を測定した(表4に示す)。
抗体のB7−1と競合して抗原CTLA4を結合する測定結果を図29に示す。図面からわかるように、抗体4G10H1L1、4G10H3L3は、効果的にB7−1と競合してCTLA4タンパク質と結合することができ、かつ、その結合効率が投与量に依頼し、各投与量の蛍光強度は、表4に示す。結合された抗体4G10H1L1、4G10H3L3に対して蛍光定量分析を行い、曲線シミュレーションによる結合效率EC50は、それぞれ1.297nM、1.229nMであった。
2.1. 間接ELISA法でモノクローナル組換え抗体14C12および14C12H1L1のPD−1との結合活性をそれぞれ測定し、具体的な方法は、以下の通りであった。
ELISAプレートにPD−1−mFcを加えてインキュベートし、4℃で一晩置き、1%のBSAで37℃、2時間ブロッキングした後、それぞれ抗体に加え、37℃で30 minインキュベートし、HRPで標識したヒツジ抗ヒトIgG(H+L)二次抗体(Jackson,109−035−088)を添加し、TMB(Neogen,308177)で5 min発色反応を行い、かつ、マイクロプレートリーダーで450nm波長における吸光度を測定した。
抗体14C12、14C12H1L1の抗原PD−1と結合した結果を図30に示す。図面からわかるように、抗体14C12、14C12H1L1は、いずれも効果的にPD−1タンパク質と結合することができ、かつ、その結合效率が投与量に依存し、各投与量の蛍光強度は、表5に示す。結合された抗体14C12、14C12H1L1に対して蛍光定量分析を行い、曲線シミュレーションによる14C12、14C12H1L1抗体の結合效率EC50は、それぞれ0.175nM、0.043nMであった。
PD−1−hFcまたはPD−1−mFcでELISAプレートを4℃で一晩被覆し、1%BSAで2時間ブロッキングした後、異なる濃度の抗体14C12および14C12H1L1をそれぞれPDL1−hFcおよびPDL1−mFcと10min混合し(希釈濃度は表6に示す。)、37℃で30minインキュベートした後、酵素標識二次抗体を添加して37℃で30 minインキュベートした。マイクロプレートリーダーで450nmにおける吸光度値を測定した(表6に示す)。
抗体14C12およびヒト化抗体14C12H1L1の抗原PD−1と結合した結果を図31に示す。図面からわかるように、14C12およびヒト化抗体14C12H1L1は、いずれも効果的にPDL1と競合してPD−1タンパク質と結合することができ、かつ、その結合效率は、投与量に依存し、各投与量の蛍光強度は表6に示す。結合された抗体14C12およびヒト化抗体14C12H1L1に対して蛍光定量分析を行い、曲線シミュレーションによる抗体14C12および14C12H1L1の結合效率EC50は、それぞれ0.853 nM、0.37 nMであった。
3.1. 間接ELISA法で抗体BiAb001、BiAb002、BiAb003およびBiAb004の、抗原CTLA4との結合活性をそれぞれ測定し、測定方法は、本実施例における1.1を参照する。
抗体BiAb001、BiAb002、BiAb003およびBiAb004の抗原PD−1との結合を測定した結果を図32に示す。図面からわかるように、抗体BiAb001、BiAb002、 BiAb003およびBiAb004は、いずれも効果的にPD−1タンパク質と結合することができ、かつ、その結合效率は、投与量に依存し、各投与量の蛍光強度は表7に示す。結合された抗体BiAb001、BiAb002、BiAb003およびBiAb004に対して蛍光定量分析を行い、曲線シミュレーションによる抗体の結合效率EC50は、下記の表7に示す。
抗体BiAb001、BiAb002、BiAb003およびBiAb004の、抗原PD−1と結合した結果を図33に示す。図面からわかるように、抗体BiAb001、BiAb002、BiAb003およびBiAb004は、いずれもPD−1タンパク質と効果的に結合し、かつ、その結合效率が投与量に依存し、各投与量の蛍光強度は、表7に示す。結合された抗体BiAb001、BiAb002、BiAb003およびBiAb004に対して蛍光定量分析を行い、曲線シミュレーションによる結合效率EC50は下記の表8に示す。
測定結果は図34に示す。図面からわかるように、抗体BiAb001、BiAb002、 BiAb003およびBiAb004は、いずれも効果的に抗原CTLA4と結合することができ、CTLA4のB7/1との結合を抑制し、かつ、CTLA4のB7/1との結合に対する抗体の抑制效率は、投与量に依存し、各投与量の吸光強度は、表9に示す。結合された抗体BiAb001、BiAb002、BiAb003およびBiAb004に対して吸光強度定量分析を行い、曲線シミュレーションによって結合EC50を得った(表9)。
測定結果は、図35に示す。図面からわかるように、抗体BiAb001、BiAb002、BiAb003およびBiAb004は、いずれも効果的に抗原PD−1と結合し、PD−1とそのリガンドPDL1との結合を抑制することができ、かつ、PD−1とそのリガンドPDL1の結合に対する抗体の抑制效率は、投与量に依存し、各投与量の吸光強度は、表10に示す。結合された抗体BiAb001、BiAb002、BiAb003およびBiAb004に対して吸光強度定量分析を行い、曲線シミュレーションによる抗体の結合效率EC50を得った(表10)。
まず、CTLA4、PD−1抗原を発現する宿主細胞293Tをそれぞれ構築し、本発明にて調製したヒト化抗体を用いて当該宿主細胞を標識した。そして、フローサイトメトリー法で細胞表面の天然立体配座抗原に対する抗体の特異的結合能を分析および検証する。
CTLA4またはPD−1のベクターpLenti6.3−CTLA4、pLenti6.3−PD−1(ベクターpLenti6.3は、Invitrogenから購入したものである)を293T細胞にトランスフェクションし、スクリーニングによりCTLA4を安定的に発現するクローン集団293T−CTLA4細胞およびPD−1を安定的に発現するクローン集団293T−PD−1細胞をそれぞれ得た。
通常のトリプシン消化法で前記工程にて得られた抗原を発現する宿主細胞を消化し、かつ各回収チュープにおける細胞数を2×105とし、PBS(1%BSA)で濃度が勾配した抗体希釈液をそれぞれ調製し、氷上で対応する抗原を発現する293T細胞と2時間インキュベートし、100 μL FITCヒツジ抗ヒトIgG(1:500)を各チュープに加え、氷上で1時間インキュベートし、PBSで3回洗った後、300 μL PBSを添加し、細胞を再懸濁させ、フローサイトメータでFITCチャンネルを用いて蛍光シグナルを測定した。
ヒト化抗体4G10H1L1、4G10H3L3の、293T−CTLA4細胞と結合する結果は、それぞれ図36、図37に示す。図面からわかるように、4G10H1L1および4G10H3L3抗体は、効果的に宿主細胞293T− CTLA4表面のターゲットCTLA4タンパク質と結合することができ、かつ、その結合效率は投与量に依存し、各投与量の蛍光強度は、表11に示す。結合された4G10H1L1および4G10H3L3抗体に対して蛍光定量分析を行い、曲線シミュレーションによる4G10H1L1および4G10H3L3抗体の結合效率EC50は、それぞれ7.58nM、10.54nMであった。
Ficoll−Paque Plus(GE Healthcare LOT No.:171440−02)を採用してPBMCを分離させ、PBMCからCD4+細胞を分離した。PHA(50 μl/ml)で3日間刺激した後PBSで1回洗い、異なる濃度を有する抗体を加え、氷上で1.5時間インキュベートした。インキュベートが完了した後、PBSで1回洗い、FITCで標識された抗ヒト二次抗体IgG(Jackson immunoresearch lot.102155)を加えた。氷上でかつ遮光下で1時間インキュベートした後、PBSで1回洗ってフローサイトメータで測定した。
ここで、用いられる対照抗体Nivolumabは抗PD−1の抗体であり、市販されており、これについての情報は、http://www.drugbank.ca/drugs/DB09035を参照してもよい。
対照抗体Ipilimumabは、抗CTLA4の抗体であり、市販されており、これについての情報もhttp://www.drugbank.ca/drugs/DB06186を参照してもよい。
1. Ficoll−Paque Plus(GE Healthcare LOT No.:171440−02)を採用してPBMCを分離させ、分離されたPBMCにIL−4(Peprotech K2513、1000U/ml)とGM−CSF(Peprotech H1513、1000U/ml)を添加して6日間誘導した後、TNF−α(Peprotech G1513、200U/ml)を添加して3日間誘導し、DC細胞を得た。
DC細胞とT細胞を混合して培養した後のIFN−γの分泌検出結果は、ぞれぞれ図50−図53に示す。DC細胞とT細胞を混合して培養した後のIL−2の分泌検出結果はそれぞれ図54−図56に示す。
(実施例10と同じ方法で)分離して得たPBMCをPHA(上海疾控生物科技有限公司、50 μl/mL)で3日間刺激した後、96ウェルプレートに刺激によって成熟したPBMC(ボランティア血液ドナーから、5×104 cells/ウェル)、Raji細胞(ATCC由来、5×104 cells/孔)、および、MDA−MB−231細胞(ATCC由来)(1×104 cells/孔)を加えると共に、抗体(100nm)を添加して均一になるように混合して共培養した。3日間後、ELISAキットを採用してIL−2(Dakewe Groupから購入)の分泌量を測定し、具体的な手順は、キットの取扱説明書に従って行った。
PD−1 HuGEMMマウス(ヒトPD−1遺伝子導入マウス)右側皮下にMC38腫瘍細胞(1×106/匹)を接種し、平均腫瘍体積が約144mm3に達すると、腫瘍体積によってマウスをランダムに4つの実験群に分け、腹腔内投与した。各群は、いずれも8匹のマウスであった。具体的な分類と投与量は以下の通りであった。
Isotype Control群(投与量2.67mg/kg),
BiAb004高投与量群(投与量2.67mg/kg),
BiAb004低投与量群(投与量0.267mg/kg),
前記の3つの群は、いずれも周2回、合計5回で投与した。各群に投与した後、腫瘍のサイズを周2回で測定した。
結果は図60に示す。
結果からわかるように、
BiAb004高投与量群およびBiAb004低投与量群の腫瘍体積は、いずれも統計的にIsotype control群(P<0.001、<0.05)より有意に小さい。BiAb004低投与量群は、PD−1 HuGEMMマウスMC38腫瘍モデルにおいて、統計的に有意な抗腫瘍効果を示す。
Claims (25)
- PD−1を標的とする第1タンパク質機能領域と、
CTLA4を標的とする第2タンパク質機能領域と、を含む二重特異性抗体。 - 前記第1タンパク質機能領域と第2タンパク質機能領域は、直接に接続または接続断片によって接続され、好ましくは、前記接続断片が(GGGGS)nであり、nは、正の整数、例えば1、2、3、4、5または6である、請求項1に記載の二重特異性抗体。
- 前記第1タンパク質機能領域と第2タンパク質機能領域は、独立して免疫グロブリンまたはその抗原結合断片、例えば、半抗体、Fab、F(ab’)2、または、一本鎖抗体であり、
好ましくは、前記第1タンパク質機能領域が免疫グロブリンであり、前記第2タンパク質機能領域が一本鎖抗体であり、あるいは、
好ましくは、前記第1タンパク質機能領域は一本鎖抗体であり、前記第2タンパク質機能領域は免疫グロブリンである、請求項1または2に記載の二重特異性抗体。 - 前記第1タンパク質機能領域と第2タンパク質機能領域は、独立して1個、2個または2個以上である、請求項1〜3の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
- 前記免疫グロブリンは、IgG、IgA、IgD、IgE、または、IgMであり、好ましくはIgGである、請求項3または4に記載の二重特異性抗体。
- 前記一本鎖抗体は、免疫グロブリンの重鎖のC末端に接続されている、請求項3〜5の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
- 本発明の一つの実施形態において、
前記の免疫グロブリンの重鎖可変領域はアミノ酸配列がSEQ ID NO: 29−31であるCDRを含み、その軽鎖可変領域は、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 32−34であるCDRを含み、および/または、
前記の一本鎖抗体の重鎖可変領域はアミノ酸配列がSEQ ID NO: 35−37であるCDR、又は、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 41とSEQ ID NO: 37であるCDR、または、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 42−44であるCDRを含み、その軽鎖可変領域はアミノ酸配列がSEQ ID NO: 38−40であるCDR、または、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 45−47であるCDRを含み、
あるいは、
本発明の別の実施形態において、
前記の免疫グロブリンの重鎖可変領域はアミノ酸配列がSEQ ID NO: 35−37であるCDR、又は、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 41とSEQ ID NO: 37であるCDR、または、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 42−44であるCDRを含み、その軽鎖可変領域はアミノ酸配列がSEQ ID NO: 38−40であるCDR、または、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 45−47であるCDRを含み、および/または、
前記の一本鎖抗体の重鎖可変領域はアミノ酸配列がSEQ ID NO: 29−31であるCDRを含み、その軽鎖可変領域はアミノ酸配列がSEQ ID NO: 32−34であるCDRを含む、
請求項3〜6の何れか一項に記載の二重特異性抗体。 - 本発明の一つの実施形態において、
前記免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列はSEQ ID NO: 16とSEQ ID NO: 20からなる群から選択され、前記免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列はSEQ ID NO: 18とSEQ ID NO: 22からなる群から選択され、および/または、
前記一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列はSEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 14およびSEQ ID NO: 25からなる群から選択され、前記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列はSEQ ID NO: 4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12およびSEQ ID NO:27からなる群から選択され、
あるいは、
本発明の別の実施形態において、
前記免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列はSEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 14およびSEQ ID NO: 25からなる群から選択され、前記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列はSEQ ID NO: 4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12およびSEQ ID NO:27からなる群から選択され、および/または、
前記一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列はSEQ ID NO: 16およびSEQ ID NO: 20からなる群から選択され、前記免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列はSEQ ID NO: 18およびSEQ ID NO: 22からなる群から選択される、請求項3〜7の何れか一項に記載の二重特異性抗体。 - 前記の免疫グロブリンは非−CDR領域を含み、かつ、前記非−CDR領域は、鼠類以外の種由来、例えばヒト抗体由来である、請求項1〜8の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
- 前記の二重特異性抗体は、CTLA4タンパク質および/またはPD−1タンパク質に結合するKDが約10−5M未満、例えば、約10−6M、10−7M、10−8M、10−9Mまたは10−10M未満またはそれ以下である、請求項1〜9の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
- 抗体の重鎖可変領域をコードすることが可能な核酸配列を含む単離核酸分子であって、
前記抗体の重鎖可変領域は、
アミノ酸配列がSEQ ID NO: 29−31であるCDR、
アミノ酸配列がSEQ ID NO: 35−37であるCDR、又は、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 41とSEQ ID NO: 37であるCDR、または、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 42−44であるCDR、および、
アミノ酸配列がSEQ ID NO: 32−34であるCDR、又は、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 38−40であるCDR、または、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 45−47であるCDR、
を含む、単離核酸分子。 - 抗体の軽鎖可変領域をコードすることが可能な核酸配列を含む単離核酸分子であって、
前記抗体の軽鎖可変領域は、
アミノ酸配列がSEQ ID NO: 32−34であるCDR、
アミノ酸配列がSEQ ID NO: 38−40であるCDR、または、
アミノ酸配列がSEQ ID NO: 45−47であるCDR、
を含む、単離核酸分子。 - 請求項11及び/または請求項12に記載の単離核酸分子を含むベクター。
- 請求項11及び/または請求項12に記載の単離核酸分子、あるいは、請求項13に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 請求項1〜10の何れか一項に記載の二重特異性抗体を調製する方法であって、請求項14に記載の宿主細胞を適切な条件で培養する工程、および、細胞培養物から前記二重特異性抗体を回収する工程を含む、方法。
- 二重特異性抗体および複合部分を含む複合体であって、前記二重特異性抗体は請求項1〜10の何れか一項に記載の二重特異性抗体であり、前記複合部分は検出可能な標識であり、好ましくは、前記複合部分が放射性同位体、蛍光物質、発光性物質、色素または酵素である、複合体。
- 請求項1〜10の何れか一項に記載の二重特異性抗体、あるいは、請求項16に記載の複合体を含む、キットであって、
好ましくは、前記キットが前記二重特異性抗体を特異的に認識する第2抗体をさらに含み、任意的に、前記第2抗体は、検出可能な標識、例えば放射性同位体、蛍光物質、発光性物質、色素または酵素をさらに含む、キット。 - 試料中のCTLA4および/PD−1の存在またはそのレベルを検出するために用いられるキットの製造における、請求項1〜10の何れか一項に記載の二重特異性抗体の使用。
- 請求項1〜10の何れか一項に記載の二重特異性抗体あるいは請求項16に記載の複合体を含み、
さらに、薬学的に許容されるベクター及び/または賦形剤を任意的に含む、医薬組成物。 - 腫瘍または貧血を、予防および/または治療、あるいは、診断する薬剤の調製における、請求項1〜10の何れか一項に記載の二重特異性抗体もしくは請求項16に記載の複合体の使用であって、好ましくは、前記腫瘍が、メラノーマ、腎臓腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、結腸直腸癌、消化器癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌および白血病からなる群から選択されるものである、使用。
- 請求項1〜10の何れか一項に記載の二重特異性抗体あるいは請求項16に記載の複合体の、
試料中のCTLA4のレベルを検出する薬剤、
CTLA4のB7への結合を遮断する薬剤、
CTLA4の活性またはCTLA4のレベルを制御(例えば下方制御)する薬剤、
CTLA4の生体に対する免疫抑制を取り除く薬剤、
Tリンパ球を活性化する薬剤、あるいは、
Tリンパ球におけるIL−2の発現を増加させる薬剤
の調製における使用、
および/または、
PD−1のPDL1への結合を遮断する薬剤、
PD−1の活性またはレベルを制御(例えば下方制御)する薬剤、
PD−1の生体に対する免疫抑制を取り除く薬剤、あるいは、
Tリンパ球におけるIFN−γの発現を増加させる薬剤
の調製における使用。 - 有効量の請求項1〜10の何れか一項に記載の二重特異性抗体あるいは請求項16に記載の複合体を、細胞またはニーズがある被験者にインビボまたはインビトロで投与する工程を含む、
試料中のCTLA4のレベルを検出する方法、
CTLA4のB7への結合を遮断する方法、
CTLA4の活性またはCTLA4のレベルを制御(例えば下方制御)する方法、
CTLA4の生体に対する免疫抑制を取り除く方法、
Tリンパ球を活性化する方法、あるいは、
Tリンパ球におけるIL−2の発現を増加させる方法、
および/または、
PD−1のPDL1への結合を遮断する方法、
PD−1の活性またはレベルを制御(例えば下方制御)する方法、
PD−1の生体に対する免疫抑制を取り除く方法、あるいは、
Tリンパ球におけるIFN−γの発現を増加させる方法、
からなる群から選択される、方法。 - 腫瘍または貧血を、予防および/または治療、あるいは、診断するために用いられ、好ましくは、前記腫瘍が、メラノーマ、腎臓腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、結腸直腸癌、消化器癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌および白血病からなる群から選択されるものである、請求項1〜10の何れか一項に記載の二重特異性抗体あるいは請求項16に記載の複合体。
- 試料中のCTLA4のレベルを検出すること、
CTLA4のB7への結合を遮断すること、
CTLA4の活性またはCTLA4のレベルを制御(例えば下方制御)すること、
CTLA4の生体に対する免疫抑制を取り除くこと、
Tリンパ球を活性化する薬剤こと、あるいは、
Tリンパ球におけるIL−2の発現を増加させること、
および/または、
PD−1のPDL1への結合を遮断すること、
PD−1の活性またはレベルを制御(例えば下方制御)すること、
PD−1の生体に対する免疫抑制を取り除くこと、あるいは、
Tリンパ球におけるIFN−γの発現を増加させること、
に用いられる、請求項1〜10の何れか一項に記載の二重特異性抗体あるいは請求項16に記載の複合体。 - 有効量の請求項1〜10の何れか一項に記載の二重特異性抗体あるいは請求項16に記載の複合体を、ニーズがある被験者に投与する工程を含む、腫瘍または貧血を、予防および/または治療、あるいは、診断するための方法であって、
好ましくは、前記腫瘍が、メラノーマ、腎臓腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、結腸直腸癌、消化器癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌および白血病からなる群から選択されるものである、方法。
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