CN113501879B

CN113501879B - 一种解除肿瘤免疫微环境中免疫抑制的双功能抗体及其应用和制备方法

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Publication number: CN113501879B
Application number: CN202110744676.1A
Authority: CN
Inventors: 姜钰超; 程硕
Original assignee: Bagate Biotechnology Shanghai Co ltd
Current assignee: Bagate Biotechnology Shanghai Co ltd
Priority date: 2021-06-30
Filing date: 2021-06-30
Publication date: 2022-09-06
Anticipated expiration: 2041-06-30
Also published as: CN113501879A

Abstract

本发明提供了一种解除肿瘤免疫微环境中免疫抑制的双功能抗体及其应用和制备方法。该双功能抗体为PD‑L1抗体可变区和TGF‑βs抗体可变区组合形成的二硫键稳定的双功能scDb‑CH3结构，包括PD‑L1抗体可变区、TGF‑βs抗体可变区、可产生二硫键的人IgG 1的铰链结构域、人IgG1的CH3结构域和连接肽。本发明提供的双功能抗体设计成二硫键稳定的二价形式以增强对靶点的亲合力，具有比IgG类抗体更小的基因，能同时阻断PD‑L1和TGF‑β信号通路，可以实现低剂量高药效的效果；此外，该双功能抗体选择肿瘤高表达的PD‑L1作为靶点，使得其具有靶向富集于肿瘤微环境而不阻断非病理生理过程中TGF‑β信号的作用，提高了药物的靶向性和安全性，为治疗肿瘤提供更多高效和安全的选择。

Description

一种解除肿瘤免疫微环境中免疫抑制的双功能抗体及其应用和制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种解除肿瘤免疫微环境中免疫抑制的双功能抗体及其应用和制备方法。

背景技术

令人熟知的，程序性死亡因子1受体(programmed cell death-1，PD-1)/程序性死亡受体-配体1(programmed cell death-ligand 1，PD-L1)免疫抑制信号通道会抑制T细胞扩增，降低效应T细胞功能，引起免疫耐受，促进T细胞凋亡，会严重削弱肿瘤浸润T细胞的肿瘤杀伤效果。已有众多已上市的PD-1和PD-L1抗体药物针对广泛的肿瘤适应症均有显著疗效，这是生物制药领域的巨大进步，这也促使业内更加关注解除肿瘤免疫微环境中免疫抑制，恢复“免疫正常化”的药物开发。

在肿瘤发展早期，TGF-βs有抑癌作用。但随着肿瘤发展，TGF-βs对肿瘤的促进作用是多方面的。首先，TGF-βs信号可作用于肿瘤微环境(TME)中的免疫细胞。一方面，分泌的TGF-βs会抑制效应性T细胞和天然杀伤细胞(NK)的细胞毒性，这就减弱了TME中固有免疫细胞的抗肿瘤能力；另一方面，调节性T细胞(Tregs)通过在微环境中促进TGF-βs的递呈和激活，抑制CD8⁺T细胞的功能；同时，激活的TGF-βs通过诱导FOXP3的表达，使初始CD4⁺T细胞分化为调节性T细胞，从而形成正反馈，促进肿瘤逃逸免疫监管。其次，TGF-βs信号可以通过诱导HMGA2、Snail1/2等转录因子的表达，诱发上皮-间质转化(EMT)，进而逃逸凋亡作用。EMT是肿瘤侵袭和迁移的重要病理特征，也是癌细胞扩散的先决条件。同时，微环境中存在的EGF和PDGF等生长因子，也会与TGF-βs共同作用诱导EMT。另外，TGF-βs表达上调，也会促进VEGF-A等因子的分泌，刺激新生血管生成，从而为癌细胞的生长和转移提供助力。近期的研究还表明，TGF-βs信号通路还与肿瘤细胞的耐药性相关。比如，它可以使肿瘤细胞避开一些化疗药物的杀伤作用，它也可以通过上调蛋白激酶Cα表达增强肿瘤细胞的耐药性。更为重要的线索是，于2018年在nature杂志由Daniele V.f.Tauriello等人发表的TGF-βdrivesimmune evasion in genetically reconstituted colon cancer metastasis以及同年在nature杂志由Sanjeev Mariathasan等人发表的TGF-βattenuates tumour response toPD-L1 blockade by contributing to exclusion of T cells共同阐述了肿瘤基质(tumor stroma)中的TGF-β信号是造成免疫豁免(immune exclusion)的决定因素，联合TGF-β抑制以及PD-1/PD-L1抗体的免疫治疗在小鼠肿瘤模型中呈现出更强的响应。

以往研究显示，TGF-βs单药治疗的响应率并不高，这可能与它不是肿瘤驱动因素有关。此外，由于TGF-β信号在非病理生理过程中的作用，系统抑制TGF-β信号传导会伴随不良事件的发生。传统的TGF-β信号通路的抗体或小分子药物具有广泛全身性的阻断效果，对非肿瘤相关的TGF-β信号阻断会影响正常生理学功能而导致的副反应，如已经开展临床实验的抗体药物Fresolimumab和小分子药物Galunisertib。

因此，联合疗法已成为了这个领域主要发展方向之一，包括与免疫检查点抑制剂(如PD-1/L1抗体)、细胞毒性药物、放疗、癌症疫苗等联用。如礼来公司正在开展TGF-βs受体Ⅰ抑制剂(galunisertib)与抗PD-L1抗体度伐利尤单抗(durvalumab)联用，拟治疗转移性胰腺癌患者。从已有的临床研究数据来看，PD-L1抗体与TGF-βs抗体联合使用的抗肿瘤效果比单药治疗明显。

但传统的IgG类似结构的双功能抗体具有较大的编码基因，一方面较大的基因载荷会给含有双功能抗体基因的病毒制备带来更大难度，同时也会降低双功能抗体的表达水平。相反的，有研究为了减小抗体基因，妥协的只采用PD-1/L1抗体的scFv结构，由于scFv相比IgG抗体阻断PD-1与PD-L1结合的能力通常弱许多，因此可能存在肿瘤治疗效果的显著劣势。

发明内容

为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了一种解除肿瘤免疫微环境中免疫抑制的双功能抗体及其应用和制备方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面是提供一种解除肿瘤免疫微环境中免疫抑制的双功能抗体，其为PD-L1抗体可变区和TGF-βs抗体可变区组合形成的二硫键稳定的双功能scDb(singlechain diabody)-CH3结构，包括PD-L1抗体可变区、TGF-βs抗体可变区、可产生二硫键的人IgG 1的铰链结构域、人IgG1的CH3结构域和连接肽。

进一步地，上述PD-L1抗体可变区的制备方法包括如下步骤：

步骤一，化学合成编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的PD-L1基因片段、编码氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的人IgG1 Fc基因片段，并化学合成氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的融合蛋白信号肽基因序列的引物用于表达载体构建；

步骤二，将PD-L1基因片段和人IgG1 Fc基因片段进行拼接，将拼接产物克隆到pCDNA3.1质粒中，然后转染受体细胞进行培养，培养完成后收集上清，获得纯化后的重组PD-L1-huIgG1 Fc融合蛋白；

步骤三，采用上述重组PD-L1-huIgG1 Fc融合蛋白对小鼠进行免疫获取脾脏细胞，提取cDNA；以该cDNA为模板，采用PCR扩增提取重链可变域基因(VH基因)和轻链κ链可变域基因(VK基因)；将等量的VH基因和VK基因混合后为模板，通过重叠PCR扩增获得scFv基因片段；

步骤四，构建scFv免疫文库并筛选获得具有阻断活性的克隆抗体并测序获得PD-L1抗体可变区序列。

进一步地，上述PD-L1抗体可变区包括重链可变区和轻链可变区；该重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:4、8和12，轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:6、10和14。

进一步地，上述连接肽选自氨基酸序列为SEQ ID NO.29、31、34。

进一步地，上述TGF-βs抗体可变区包括TGF-β抗体的重链可变区和TGF-β抗体的轻链可变区；该TGF-β抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.30，该TGF-β抗体的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.32。

进一步地，上述人IgG 1的铰链结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO.33；人IgG1的CH3结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO.35。

进一步地，上述双功能抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO:36，核苷酸序列为SEQ IDNO:37。

本发明的第二方面是提供上述双功能抗体的制备方法，合成PD-L1抗体可变区、TGF-βs抗体可变区、可产生二硫键的人IgG 1的铰链结构域、人IgG1的CH3结构域和连接肽，然后通过化学合成的方式合成该双功能抗体bsDHC。

本发明的第三方面是提供上述双功能抗体在制备治疗肿瘤药物中的应用。

本发明的第四方面是提供一种治疗肿瘤的药物，其包括上述双功能抗体，并将其作为活性成分。

本发明的第五方面是提供一种表达上述双功能抗体的CAR-T细胞。

进一步地，CAR(嵌合抗原受体)由依次连接的人CD8信号肽、GC33单链抗体、人CD8铰链区、人CD8跨膜区、人41BB胞内区、人CD3ζ胞内区、P2A自切割肽、人IgGκ信号肽和上述双功能抗体组成。

进一步，上述CAR为GC33-BBz-bsDHC，其核酸序列为SEQ ID NO.39。

本发明的第六方面是提供上述CAR-T细胞的制备方法，将含有编码上述CAR的核苷酸序列的慢病毒转染至T细胞中。

本发明的第七方面是提供一种含有上述双功能受体的核苷酸序列的双功能溶瘤病毒。

本发明的第八方面是提供一种治疗肿瘤的生物制剂，包括上述CAR-T细胞或双功能溶瘤病毒。

本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明提供的双功能抗体设计成二硫键稳定的二价形式以增强对靶点的亲合力，具有比IgG类抗体更小的基因，能同时阻断PD-L1和TGF-β信号通路，可以实现低剂量高药效的效果；此外，该双功能抗体选择肿瘤高表达的PD-L1作为靶点，使得其具有靶向富集于肿瘤微环境而不阻断非病理生理过程中TGF-β信号的作用，提高了药物的靶向性和安全性，为治疗肿瘤提供更多高效和安全的选择。

附图说明

图1是本发明一实施例中重组PD-L1-huIgG1 Fc融合蛋白的电泳结果显示图；

图2是本发明一实施例中双功能抗体的结构示意图；

图3是本发明一实施例中重组bsDHC融合蛋白的电泳结果显示图；

图4显示了本发明一实施例中成熟DC细胞和naive CD4⁺T细胞共培养体系加入抗体六小时后的细胞状态；

图5显示了本发明一实施例中加入抗体三天后的成熟DC细胞和naive CD4⁺T细胞共培养体系上清中IL-2的检测结果；

图6显示了本发明一实施例中加入抗体五天后的成熟DC细胞和naive CD4⁺T细胞共培养体系上清中IFN-γ的检测结果；

图7显示了本发明一实施例中bsDHC阻断A549细胞释放IL-11的结果；

图8是本发明一实施例中慢病毒包装株质粒pCCL-GC33-BBz的结构示意图；

图9是本发明一实施例中慢病毒包装株质粒pCCL-GC33-BBz-bsDHC的结构示意图；

图10是本发明一实施例中GC33-BBz CAR-T和GC33-BBz-bsDHC CAR-T细胞中CAR阳性率的检测结果；

图11是本发明一实施例中GC33-BBz CAR-T和GC33-BBz-bsDHC CAR-T细胞对HepG2靶细胞的杀伤能力的检测结果；

图12是本发明一实施例中GC33-BBz CAR-T和GC33-BBz-bsDHC CAR-T细胞分泌的IFN-γ、IL-2和TNF-α的检测结果；

图13显示了本发明一实施例中GC33-BBz CAR-T和GC33-BBz-bsDHC CAR-T分别与HepG2靶细胞孵育后CD107a阳性细胞占CD8阳性细胞的比例；

图14显示了本发明一实施例中GC33-BBz CAR-T、GC33-BBz-bsDHC CAR-T和对照T细胞在小鼠体内的抑瘤效果。

具体实施方式

本发明提供了一种解除肿瘤免疫微环境中免疫抑制的双功能抗体及其应用和制备方法，该双功能抗体由由抗PD-L1抗体可变区和TGF-βs抗体可变区组合形成的二硫键稳定的双功能scDb(single chain diabody)-CH3结构(简称bsDHC，bispecific scDb-Hinge-CH3)。本发明人设计这种双功能抗体的最终目的是以CAR-T细胞或溶瘤病毒感染细胞分泌到肿瘤微环境中增强CAR-T或溶瘤病毒的肿瘤治疗效果。因此在结构设计方面首先要考虑到这种双功能抗体的编码基因要尽量的小，以避免过大的基因负载影响病毒制备的效率；此外基于CAR-T细胞分泌或溶瘤病毒感染细胞分泌的双功能抗体总量相对较少，为使肿瘤微环境中的低浓度药物发挥较强的功能，因此将该双功能抗体设计成二硫键稳定的二价形式以增强对靶点的亲合力(avidity)，最终实现低剂量强药效之目的；考虑到TGF-β信号在非病理生理过程中的作用，设计双功能抗体时将另一个靶点选择为肿瘤高表达的PD-L1，这使得双功能抗体会靶向富集于肿瘤微环境而不阻断非病理生理过程中TGF-β信号的作用，提高了药物的靶向性和安全性。

下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。

实施例1

本实施例构建重组PD-L1-huIgG1 Fc融合蛋白，其具体的方法如下：

1.合成PD-L1 19位至238位氨基酸区间的基因序列及PD-L1-huIgG1 Fc融合蛋白的表达载体构建

通过化学合成的方式合成人程序性死亡配体-1(PD-L1)(NCBI accession NP_054862)的第19位苯丙氨酸至第238位精氨酸区间的基因序列，该基因序列编码的氨基酸序列为FTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNER(SEQID NO:1)。通过化学合成的方式合成人IgG1重链恒定区(UniProtKB/Swiss-Protaccession No.P01857.1)的第100位脯氨酸至第330位赖氨酸区间的基因序列，该基因序列编码的氨基酸序列为PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDQLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:2)。化学合成含融合蛋白信号肽(具有氨基酸序列为MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ ID NO:3))基因序列的引物用于表达载体构建。通过分子克隆，将PD-L1基因片段与人IgG1 Fc基因片段进行拼接。拼接产物用TaKaRa无缝克隆试剂盒克隆到pCDNA3.1(Thermo)中。

2.重组PD-L1-huIgG1 Fc融合蛋白的表达与纯化

以上述构建的表达载体转染293T细胞(ATCC)5天后，收集培养上清，用AKTA avant(GE)纯化重组PD-L1-huIgG1 Fc融合蛋白。由于糖基化修饰等原因，重组PD-L1-huIgG1 Fc融合蛋白经还原SDS-PAGE电泳后通过考马斯亮蓝染色显示其大小约60-70k道尔顿左右，结果如图1所示。

实施例2

本实施例提供抗人PD-L1鼠源抗体，其制备方法如下：

1.免疫动物

将2mg/mL的上述重组PD-L1-huIgG1 Fc融合蛋白作为抗原与等体积的完全弗氏佐剂(Sigma-Aldrich)混合乳化，取10只6周大雌性Balb/c小鼠进行皮下免疫。在初次免疫后，每十天时间进行一次加强免疫，共执行四次皮下免疫，第五次免疫时直接用MSLN-huIgG1Fc融合蛋白进行脾脏冲击免疫。

2.血清效价检测

每次加强免疫前尾静脉取血50μL，离心去除细胞，保留血清。ELISA微孔板中加入重组PD-L1 50ng/孔，4℃包被过夜。PBS清洗三遍，加入1％BSA/PBS，200μL/孔，37℃封闭1小时。加入梯度稀释的小鼠血清，37℃结合1小时。PBST清洗三遍，加入HRP-山羊抗小鼠IgG 37℃结合1小时。PBST清洗三遍，加入100μL/孔TMB显色液，37℃显色10分钟，加入100μL/孔ELISA终止液，酶标仪读取OD450数值。

3.构建免疫文库

3.1小鼠脾细胞总cDNA获取

利用PD-L1-huIgG1 Fc融合蛋白直接进行腹腔注射方式进行冲击免疫，四天后处死小鼠，取脾脏。用细胞筛网(BD)研磨整个脾脏，获取脾脏细胞。用PBS冲洗两遍后，1000g离心10分钟，获取脾脏细胞。使用Trizol RNA提取试剂盒抽提总RNA。

以所述RNA为模板，使用SuperScript^TMIV First-Strand Synthesis System试剂盒合成第一链cDNA。

3.2抗体基因扩增与轻重链拼接

以所述cDNA为模板，使用重链可变域上游引物和下游引物PCR扩增重链可变域基因(VH基因)，使用轻链可变域上游引物和下游引物引物PCR扩增卡帕链可变域基因(VK基因)。在50μL反应体系中，分别加入25μL phusion master mix，上游引物2.5μL(25pmol)，下游引物2.5μL(25pmol)，1.5μL DMSO，0.5μL cDNA和18μL ddH₂O。按以下程序进行PCR反应：98℃预变性1分钟后进入温度循环，98℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分钟，循环30次，72℃最终延伸10分钟。

使用DNA胶回收试剂盒回收扩增得到的VH基因和VK基因。将等量的VH基因和VK基因混合后为模板，利用上游引物scFv-F和下游引物scFv-R通过重叠PCR扩增scFv基因。在50μL反应体系中，分别加入25μL phusion master mix，上游引物2.5μL(25pmol)，下游引物2.5μL(25pmol)，1.5μL DMSO，0.5μL cDNA和18μL ddH₂O。按以下程序进行PCR反应：98℃预变性1分钟后进入温度循环，98℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分钟，循环30次，72℃最终延伸10分钟。

使用DNA胶回收试剂盒回收扩增得到的scFv基因片段。

3.3构建免疫文库

分别使用SfiI DNA内切酶消化scFv基因片段和pcomb3XTT载体(美国Scripps研究所)。在50μL反应体系中，分别加入SfiI 2μL，10×缓冲液5μL，DNA 3μg，加ddH₂O至50μL。充分混匀后，50℃孵育3小时。

使用DNA胶回收试剂盒回收酶切后的scFv基因片段和pcomb3X载体。使用T4连接酶环化酶切后的scFv基因片段和酶切后的pcomb3X载体。在50μL反应体系中，分别加入T4连接酶1μL，10×缓冲液5μL，scFv基因100ng，pComb3X载体500ng，加ddH₂O至50μL。充分混匀后，4℃孵育16小时。取少量产物通过琼脂糖凝胶电泳验证连接效率。

将10μL上述连接环化产物加入自制的TG1电转化感受态中，然后使用电转仪进行电击转化。取出10μL电转化后的细菌通过合理的稀释并在含有氨苄青霉素的平板上划线，以此计数并统计噬菌体抗体文库的大小。剩余的电转化后的细菌加入含100μg/mL氨苄青霉素和2％葡萄糖的2×YT培养基，置于加热培养箱培养。培养结束后在4℃以4000G离心10分钟，在沉淀菌中补充适量甘油储存于-80℃作为抗体菌种库。通过多次电转化积累获得scFv免疫文库。

4.鼠源免疫抗体噬菌体文库的筛选与鉴定

4.1 PD-L1-huIgG1 Fc融合蛋白的生物素化

应用EZ-Link SuLfo-NHS-LC-Biotin(Thermo)对应标准操作程序对PD-L1-huIgG1Fc融合蛋白进行随机生物素化。用ELISA方法验证生物素化的PD-L1-huIgG1 Fc融合蛋白与PD-1-his蛋白(华津生物)的结合活性。

4.2生物淘选

以PD-L1-huIgG1 Fc融合蛋白为目标蛋白应用生物淘选对上述鼠源免疫抗体文库进行生物淘选获得与PD-L1-huIgG1 Fc融合蛋白(尤其是PD-L1胞外域)结合的抗体：将抗体菌种库复苏并生长至对数期后应用M13KO7辅助噬菌体挽救抗体文库，离心后用含有氨苄青霉素和卡那霉素的2×YT培养基重悬并在30℃过夜扩增；PEG/NaCl沉淀噬菌体，用甘油/PBST溶解噬菌体沉淀获得免疫库噬菌体悬液；酪蛋白封闭的噬菌体投入酪蛋白封闭的生物素化的huIgG1 Fc蛋白(自制)和酪蛋白封闭的Dynabeads M-270链霉亲合素共孵育体系中，收集上清噬菌体悬液；进一步，将收集到的噬菌体悬液投入酪蛋白封闭的生物素化的PD-L1-huIgG1 Fc融合蛋白和酪蛋白封闭的Dynabeads M-270链霉亲合素共孵育体系中，用PBST清洗磁珠去除无法与PD-L1-huIgG1 Fc融合蛋白结合的噬菌体；用100mM三乙胺洗脱与磁珠结合的噬菌体后用1M Tris-HCl(pH＝6.4)中和；留取10μL洗脱的噬菌体溶液用于测定输出噬菌体总量，剩余噬菌体溶液用于感染对数增长的TG1，过夜扩增后视为下一轮淘选使用的抗体文库；生物淘选共执行三轮，PD-L1-huIgG1 Fc抗原浓度分别为100nM、10nM和1nM。

4.3 PD-L1胞外域特异性结合克隆的筛选

将第三轮生物淘选结束后获得的抗体文库进行稀释涂布于含有氨苄青霉素的平板上获得单克隆，挑选单克隆在深孔板中过夜培养。次日利用-20℃冰箱对深孔板进行反复三次冻融，离心上清用于后续ELISA反应。

PD-L1-his(ACRO biosystem)蛋白过夜包被96孔板，50ng/孔。PBS清洗三遍，加入1％BSA/PBS，200μL/孔，37℃封闭1小时。PBS清洗三遍后加入100μL离心上清37℃孵育1小时，PBST清洗三遍后加入100μL 1:10000稀释HRP偶联的山羊抗鼠IgG(Fab特异性的)(Thermo)。PBST清洗三遍，加入100μL/孔TMB显色液，37℃显色10分钟，加入100μL/孔ELISA终止液，酶标仪读取OD₄₅₀数值。选择OD₄₅₀读值大于0.4的克隆作为阳性克隆，并对阳性克隆进行测序。该筛选步骤重复两次独立实验以保证数据准确。根据ELISA结果，共有39个阳性克隆。

4.4筛选具有阻断活性的克隆

PD-1-huIgG1 Fc(华津生物)过夜包被96孔板，50ng/孔。PBS清洗三遍，加入1％BSA/PBS，200μL/孔，37℃封闭1小时。PBS清洗三遍。将上述39个阳性克隆的上清各100μL和50ng PD-L1-his混合静置5分钟，然后将其加入到已经封闭好的96孔板中，37℃孵育1小时，PBST清洗三遍后加入100μL 1:10000稀释的HRP偶联的鼠抗his-tag抗体37℃孵育1小时。PBST清洗三遍，加入100μL/孔TMB显色液，37℃显色10分钟，加入100μL/孔ELISA终止液，酶标仪读取OD₄₅₀数值。对照为不加阳性克隆培养上清的孔。该筛选步骤重复两次独立实验以保证数据准确。OD₄₅₀读值小于对照孔读值的克隆为具有阻断活性的克隆。最终获得3个具有阻断活性的克隆3E11、3G10和2G3，对其进行测序，得到其可变区序列：

(1)克隆3E11

重链氨基酸序列为：

EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGRGLEWIGRIDPNSGGTKYNEKFKSKATLTVDKPSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARRAHRGFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:4)；

重链核酸序列为：

GAGGTGCAGCTTCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTTGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACGAGGCCTTGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTAATAGTGGTGGTACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAACCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTATTGTGCAAGGAGGGCTCATCGAGGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACCGTTTCCTCA(SEQ ID NO:5)；

轻链氨基酸序列为：

DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:6)；

轻链核酸序列为：

GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA(SEQ ID NO：7)。

(2)克隆3G10

重链氨基酸序列为：

QIQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGRGLEWIGRIDPNSGGTKYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARSGLGRGFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:8)；

重链核酸序列为：

CAGATCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTTGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACGAGGCCTTGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTAATAGTGGTGGTACTAAGTACAATCAAAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAACAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGGTCAGGGCTGGGACGAGGATTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCCTCA(SEQ ID NO:9)；

轻链氨基酸序列为：

DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGHTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPRTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:10)；

轻链核酸序列为：

GATGTTGTGATGACCCAAACTCCTCTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTTCACAGTAATGGACACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATAAAA(SEQ ID NO:11)；

(3)克隆2G3

重链氨基酸序列为：

QIQLQQSGAELMKPGASVKISCKASGYTFTDYNIHWVKQSHGKSLEWIGRINPYNGDTFYNQKFKGKATLTVDKSSSTAHMELLSLTSEDSAVYYCGRMGYDAWFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:12)；

重链核酸序列为：

CAGATCCAACTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGATGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACTACAACATACACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGACGTATTAATCCTTACAATGGTGATACTTTCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAATCCTCTAGCACAGCCCACATGGAGCTCCTGAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTATTGTGGAAGAATGGGGTACGACGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA(SEQ ID NO:13)；

轻链氨基酸序列为：

DIQMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVGTAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCQQYSSYPLTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:14)；

轻链核酸序列为：

GACATCCAGATGACACAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGGGTACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGCAATCTCCTAAACTACTGATTTACTGGGCATCCACCCGGCACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATTAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGATTATTTCTGTCAGCAATATAGCAGCTATCCTCTCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATCAAA(SEQ ID NO:15)。

以上三个抗体克隆的轻重链CDR氨基酸坐标(IMGT系统)整理如下表1-2：

表1抗体重链CDR氨基酸坐标(IMGT系统)

表2抗体轻链CDR氨基酸坐标(IMGT系统)

实施例3

本实施例基于实施例2提供一种解除肿瘤免疫微环境中免疫抑制的双功能抗体，其设计和制备过程如下：

1.双功能抗体的结构设计

设计由抗PD-L1抗体可变区和TGF-βs抗体可变区组合形成的二硫键稳定(通过含半胱氨酸的铰链区形成二硫键)的双功能scDb(single chain diabody)-CH3结构(下称bsDHC,bispecific scDb-Hinge-CH3)，具体的由PD-L1抗体的轻链可变区、L1短连接肽、TGF-β抗体的重链可变区、L2长连接肽、TGF-β抗体的轻链可变区、L3短连接肽、PD-L1抗体的重链可变区、可产生二硫键的人IgG 1的铰链结构域、L4短连接肽、人IgG1的CH3结构域，如图2所示。上述结构的氨基酸序列如下表3。

表3双功能抗体中各个结构的序列信息

2.采用实施例2中的克隆2G3的重链序列和轻链序列作为上述的PD-L1抗体的重链可变区和PD-L1抗体的轻链可变区与其它结构通过化学合成的方式合成双功能抗体bsDHC，其中TGF-β抗体可变区序列来源于申请号为US11350906的美国专利。该双功能抗体bsDHC的序列信息如下：

bsDHC的氨基酸序列为：

DIQMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVGTAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCQQYSSYPLTFGGGTKLEIKGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSNVISWVRQAPGQGLEWMGGVIPIVDIANYAQRFKGRVTITADESTSTTYMELSSLRSEDTAVYYCASTLGLVLDAMDYWGQGTLVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGETVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSLGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRAPGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYADSPITFGQGTRLEIKGGGGSQIQLQQSGAELMKPGASVKISCKASGYTFTDYNIHWVKQSHGKSLEWIGRINPYNGDTFYNQKFKGKATLTVDKSSSTAHMELLSLTSEDSAVYYCGRMGYDAWFAYWGQGTLVTVSAEPKSCDKTHTCPPCGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO.36)；

bsDHC的核酸序列为：

GACATCCAGATGACACAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGGGTACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGCAATCTCCTAAACTACTGATTTACTGGGCATCCACCCGGCACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATTAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGATTATTTCTGTCAGCAATATAGCAGCTATCCTCTCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATCAAAGGCGGCGGAGGATCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCAGTAGCAATGTTATCAGCTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTGGATGGGGGGGGTCATCCCTATTGTTGATATTGCGAACTACGCACAGAGATTCAAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACTAGTACAACTTACATGGAGTTGAGCAGCCTGAGGTCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGCACACTTGGTCTCGTCCTGGATGCTATGGACTACTGGGGTCAGGGTACGTTGGTCACCGTCTCCTCAGGCAGCACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGCTCTACCAAGGGCGAAACGGTACTCACGCAGTCTCCAGGTACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTCTTGGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCTGGTCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCACCTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGTACCGACTTCACTCTCACCATCAGCCGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATGCTGACTCACCGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAAGGGGGAGGCGGCAGCCAGATCCAACTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGATGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACTACAACATACACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGACGTATTAATCCTTACAATGGTGATACTTTCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAATCCTCTAGCACAGCCCACATGGAGCTCCTGAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTATTGTGGAAGAATGGGGTACGACGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCGGCGGCGGCAGCAGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCCAGCCCCGCGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCCGCGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCCGCTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAG(SEQ ID NO.37)。

3.重组bsDHC融合蛋白的表达与纯化

化学合成含融合蛋白信号肽(具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列)基因序列的引物用于表达载体构建。通过分子克隆，将bsDHC基因片段扩增后运用TaKaRa无缝克隆试剂盒克隆到pCDNA3.1中。

以此表达载体转染293T细胞(ATCC)5天后，收集培养上清，利用用重力柱(生工)和protein L填料(生工)纯化重组bsDHC融合蛋白。重组bsDHC融合蛋白经非还原SDS-PAGE电泳后通过考马斯亮蓝染色后结果如图3所示。

实施例4

本实施例对实施例3提供的基于克隆2G3的双功能抗体(即重组bsDHC融合蛋白)进行体外生物学功能评价，具体的操作步骤和结果如下：

1.混合淋巴反应

1.1.分选并培养Naive CD4⁺T细胞：

进行Naive CD4⁺阳性细胞分选：复苏6管2×10⁷细胞/管PBMC细胞(妙顺生物)，离心去冻存液，加入适量X VIVO-15培养基重悬细胞沉淀，将密度调整为1×10⁷细胞/40μL。取足够的淋巴细胞转移入1.5mL无菌离心管中(1×10⁷/40μL每管)，在管中加入10μL Naive CD4⁺T cell Biotin-Antibody Cocktail II(美天旎)，用手指轻弹几下混匀，放于4℃冰箱中静置5分钟后加入30μl缓冲液。随后在管中加入20μl Naive CD4⁺T cell MicroBeadCocktail II(美天旎)。混合均匀并在4℃冰箱中静置10分钟，每管加入400μl 4℃预冷的XVIVO-15培养基。将LS分离柱安装到磁铁上，用3mL X VIVO-15润洗LS柱子。将所有细胞依次流经LS分离柱(LS柱最大上样量为2×10⁹个细胞)，收集流穿液。再次用3mL缓冲液流穿LS分离柱并收集流穿液。从流穿液中取50ul细胞悬液计数并记录细胞密度及活率。将流穿液以1200g离心5分钟，弃上清，使用X VIVO-15(含10％FBS和1％双抗)按照1×10⁶/ml进行重悬，37℃、5％CO₂培养箱进行培养。

次日进行CD4⁺阳性率检测：取大约1×10⁵的细胞悬液，进行阳性率检测，1200g离心5分钟，弃上清，管中残留约50μl液体，轻弹重悬细胞。在管加入anti-CD4 Antibody-FITC(BD)、anti-CD45RA Antibody-PE(BD)、anti-CD3 antibody-APC(BD)各2μl抗体混匀并常温避光孵育15分钟。每管加入1mL生理盐水重悬细胞，1200g离心5分钟，弃上清，轻弹重悬细胞。重复清洗步骤。200μl生理盐水重悬细胞，上机检测。流式结果显示CD4⁺细胞比例约95％。确认Naive CD4⁺T细胞表型后即可开展混合淋巴反应。

Naive CD4⁺T细胞冻存：在完成CD4⁺阳性率检测后，使用台盼蓝对继续培养的细胞进行计数，并1200g离心5分钟。以2×10⁶每支密度冻存，共冻存六支。

1.2.分选单核细胞并诱导其成为成熟DC细胞：

第一天进行CD14阳性细胞分选和DC诱导分化。复苏5管2×10⁷细胞/管PBMC细胞(妙顺生物)，离心去冻存液，加入适量X VIVO-15培养基重悬细胞沉淀，将密度调整为1×10⁷细胞/80μL。取足够的淋巴细胞转移入1.5mL无菌离心管中(1×10⁷/80μL每管)，每1×10⁷细胞加入20μL CD14 MicroBeads(美天旎)，用手指轻弹几下混匀，放于4℃冰箱中静置15分钟。每管分别加入1mL X VIVO-15，吹打混匀5～6下，合并入15mL离心管中，300g离心10分钟。将分离柱安装到磁铁上，用3mL X VIVO-15润洗LS柱子。弃上清，每1×10⁸个细胞加入500μL X VIVO-15重悬细胞(不足1×10⁸按1×10⁸计算)，吹打混匀，过柱子(LS柱最大上样量为2×10⁹个细胞)，再加入X VIVO-15冲洗柱子，共冲洗3次，每次3mL。将柱子取下，加入5mLX VIVO-15，推至15ml离心管中，加入盖子轻轻颠倒混匀。取50μl细胞悬液计数并记录细胞密度及活率。根据细胞密度统计15ml离心管中细胞总数。1500rpm离心5分钟，去上清，轻弹使细胞沉淀分散，用DC诱导分化培养基(50ng/ml IL-4(华津生物)、50ng/ml GM-CSF(华津生物)、10％FBS和1％双抗的X VIVO-15培养基(lonza))重悬细胞，使细胞密度为2E5/ml。将细胞悬液加入96孔板中培养，即2×10⁴/100ul每个孔，共铺一整个96孔板。

单核细胞分离培养两天后，DC诱导分化培养基对原培养体系进行半数换液。

单核分离培养五天后，先用DC诱导分化培养基对原培养体系进行半数换液。配置四因子母液：在已包含IL4和GMCSF的培养基里加入终浓度为50ng/ml的LPS(Sigma)和100ng/ml的TNFα(华津生物)。在培养基里补20％体积的四因子母液，因此最终工作浓度是50ng/ml IL-4、50ng/ml GM-CSF、10ng/ml LPS和20ng/ml的TNFα，诱导过夜。次日诱导成熟的DC细胞可直接用于混合淋巴反应。

1.3.在成熟DC细胞和naive CD4⁺T细胞共培养体系中加入抗体

去除诱导成熟的DC细胞的原培养基，每孔加入60μl X VIVO-15培养基(含10％FBS和1％双抗)。复苏naive CD4⁺T细胞：打开水浴锅，设置温度为37℃。从液氮灌中取出冻存的细胞，迅速放入水浴锅中并快速晃动，在1分钟内使细胞溶液完全溶解。取1支15ml离心管，加入10ml的生理盐水，将细胞冻存悬液加入离心管，500g离心5分钟。弃上清，轻弹离心管使细胞团分散，细胞计数。并使用X VIVO-15培养基(含10％FBS和1％双抗)调整细胞密度为1×10⁵/100μl。按DC:T＝1:5(2×10⁴：1×10⁵)比例，将1×10⁵/100μl每孔的naive CD4⁺T细胞加入含成熟DC细胞的96孔板中。

在共培养体系中加入不同浓度的抗体：为不影响细胞培养体系，确保总体积为200μl，加入各抗体体积不超过10μl。阳性对照IgG(atezolizumab，华津生物)、bsDHC和IgGisotype(华津生物)三组均分成10μg/ml，1μg/ml，0.1μg/ml三个浓度梯度，每个组别三个复孔。加样完成后，轻轻混匀。细胞置于培养箱中培养。六小时后通过显微镜进行观察，三组结果如图4所示。

1.4.IL-2和IFN-γ细胞因子检测

在共培养三天时取共培养上清检测IL-2分泌，结果如图5。在共培养五天时取共培养上清稀释50倍检测IFN-γ分泌，结果如图6所示。

2.bsDHC阻断A549细胞释放IL-11实验

详细操作步骤如下：按每孔加1×10⁴个A549细胞加入96孔板中，37℃培养24小时；第二天，预混2.0ng/mL的TGF-β1(华津生物)与不同剂量的bsDHC(10μg/mL、1μg/mL、0.333333μg/mL、0.111111μg/mL、0.03703704μg/mL、0.0123456μg/mL、0.004μg/mL、0.00137μg/mL)或者10μg/ml的抗体同型对照(isotype)；放置于37℃孵育1小时；将预混液加入A549细胞中；将样品放置于37℃培养箱中，培养72小时；72小时后收集上清，取人IL-11检测试剂盒(百奥莱博)中的ELISA板，按说明书加入待测样本及标准品；用封板膜覆盖板子，37℃孵育45分钟；移除所有液体并对孔板进行洗涤，一共洗涤4遍，每一遍每孔加入1×WashBuffer并静置30秒；每孔加入100μl一抗，37℃孵育45分钟；移除所有液体并对孔板进行洗涤，一共洗涤4遍，每一遍每孔加入1×Wash Buffer并静置30秒；每孔加入100μl一抗，37℃孵育45分钟；移除所有液体并对孔板进行洗涤，一共洗涤4遍，每一遍每孔加入1×WashBuffer并静置30秒；每孔加入100μl TMB显色液，10分钟；加入终止液，OD₄₅₀读板，结果如图7所示。

实施例5

本实施例构建自分泌双功能抗体的CAR-T并对其功能进行验证，具体的实验步骤和结果如下：

1.确定CAR结构基因序列、制备含CAR元件的慢病毒包装主质粒

1.1.CAR结构设计

从uniprot蛋白数据库中确定人CD8信号肽、CD8铰链区、人CD8跨膜区、人41BB胞内区和人CD3ζ胞内区氨基酸序列。从专利US07919086B2中获取抗人GPC3抗体(GC33克隆)的氨基酸序列。对照组以依次连接的人CD8信号肽、GC33单链抗体、人CD8铰链区、人CD8跨膜区、人41BB胞内区、人CD3ζ胞内区的氨基酸序列在网站sg.idtdna.com上进行密码子优化，获得更适合在人类细胞表达的核酸序列并命名为GC33-BBz。实验组以依次连接的人CD8信号肽、GC33单链抗体、人CD8铰链区、人CD8跨膜区、人41BB胞内区、人CD3ζ胞内区、P2A自切割肽、人IgGκ信号肽和上述bsDHC氨基酸序列在网站sg.idtdna.com上进行密码子优化，获得更适合在人类细胞表达的核酸序列并命名为GC33-BBz-bsDHC。

1.2.含CAR元件的慢病毒包装主质粒制备

将上述密码子优化后的GC33-BBz核酸序列(SEQ ID NO.38)和GC33-BBz-bsDHC核酸序列(SEQ ID NO.39)委托华津生物进行基因合成，并构建至pCCL慢病毒载体(华津生物)，将含有CAR序列的慢病毒载体分别命名为pCCL-GC33-BBz(如图8所示)和pCCL-GC33-BBz-bsDHC(如图9所示)。载体构建过程挑选测序正确的克隆，接种菌液至300ml 2YT培养基中，过夜摇菌并利用质粒大提试剂盒(上海生工)完成大提质粒。其中GC33-BBz核酸序列和GC33-BBz-bsDHC核酸序列分别如下：

GC33-BBz核酸序列：

ATGGCTCTGCCTGTGACCGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCTCGGCCTACCGGTGACGTGGTGATGACCCAGAGCCCTCTGAGCCTGCCTGTGACCCCTGGCGAGCCTGCCAGCATCAGCTGCCGGAGCAGCCAATCTCTGGTGCACTCCAACGCCAACACCTACCTGCATTGGTACCTGCAGAAACCCGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCTAATCGGTTTAGCGGAGTTCCAGATAGATTCAGCGGATCTGGCTCCGGCACCGACTTCACACTGAAGATCAGCAGAGTGGAAGCCGAGGATGTGGGCGTGTACTACTGCAGCCAGAACACCCACGTGCCACCTACATTCGGCCAGGGCACAAAGCTGGAAATCAAGGGCGGAGGAGGATCTGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGAGGCGGATCTCAGGTGCAGCTGGTCCAGTCTGGCGCTGAGGTGAAGAAACCTGGCGCCAGCGTGAAAGTGTCCTGCAAGGCCTCTGGTTATACCTTTACCGACTACGAGATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGCCAGGGCCTGGAATGGATGGGCGCCCTGGACCCCAAGACCGGCGACACCGCTTACAGCCAGAAGTTCAAGGGCAGAGTGACACTGACCGCTGATGAGAGCACAAGCACAGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTACCAGATTCTACAGCTACACCTACTGGGGCCAAGGCACACTCGTCACCGTGTCGTCGACGACAACTCCAGCACCCAGACCCCCTACACCTGCTCCAACTATCGCAAGTCAGCCCCTGTCACTGCGCCCTGAAGCCTGTCGCCCTGCTGCCGGGGGAGCTGTGCATACTCGGGGACTGGACTTTGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAGGTTCAGTGTCGTGAAGAGAGGCCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCTTTCATGAGGCCCGTGCAGACTACCCAGGAGGAAGATGGATGCAGCTGTAGATTCCCTGAAGAGGAGGAAGGAGGCTGTGAGCTGAGAGTGAAGTTCTCCCGAAGCGCAGATGCCCCAGCCTATCAGCAGGGACAGAATCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGACGGGAGGAATACGATGTGCTGGACAAAAGGCGGGGCAGAGATCCTGAGATGGGCGGCAAACCAAGACGGAAGAACCCCCAGGAAGGTCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCTGAGGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGCGAAAGAAGGAGAGGAAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGGCTGAGTACAGCAACAAAAGACACCTATGACGCTCTGCACATGCAGGCTCTGCCACCAAGATGA(SEQ ID NO.38)；

GC33-BBz-bsDHC核酸序列：

ATGGCTCTGCCTGTGACCGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCTCGGCCTACCGGTGACGTGGTGATGACCCAGAGCCCTCTGAGCCTGCCTGTGACCCCTGGCGAGCCTGCCAGCATCAGCTGCCGGAGCAGCCAATCTCTGGTGCACTCCAACGCCAACACCTACCTGCATTGGTACCTGCAGAAACCCGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCTAATCGGTTTAGCGGAGTTCCAGATAGATTCAGCGGATCTGGCTCCGGCACCGACTTCACACTGAAGATCAGCAGAGTGGAAGCCGAGGATGTGGGCGTGTACTACTGCAGCCAGAACACCCACGTGCCACCTACATTCGGCCAGGGCACAAAGCTGGAAATCAAGGGCGGAGGAGGATCTGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGAGGCGGATCTCAGGTGCAGCTGGTCCAGTCTGGCGCTGAGGTGAAGAAACCTGGCGCCAGCGTGAAAGTGTCCTGCAAGGCCTCTGGTTATACCTTTACCGACTACGAGATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGCCAGGGCCTGGAATGGATGGGCGCCCTGGACCCCAAGACCGGCGACACCGCTTACAGCCAGAAGTTCAAGGGCAGAGTGACACTGACCGCTGATGAGAGCACAAGCACAGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTACCAGATTCTACAGCTACACCTACTGGGGCCAAGGCACACTCGTCACCGTGTCGTCGACGACAACTCCAGCACCCAGACCCCCTACACCTGCTCCAACTATCGCAAGTCAGCCCCTGTCACTGCGCCCTGAAGCCTGTCGCCCTGCTGCCGGGGGAGCTGTGCATACTCGGGGACTGGACTTTGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAGGTTCAGTGTCGTGAAGAGAGGCCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCTTTCATGAGGCCCGTGCAGACTACCCAGGAGGAAGATGGATGCAGCTGTAGATTCCCTGAAGAGGAGGAAGGAGGCTGTGAGCTGAGAGTGAAGTTCTCCCGAAGCGCAGATGCCCCAGCCTATCAGCAGGGACAGAATCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGACGGGAGGAATACGATGTGCTGGACAAAAGGCGGGGCAGAGATCCTGAGATGGGCGGCAAACCAAGACGGAAGAACCCCCAGGAAGGTCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCTGAGGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGCGAAAGAAGGAGAGGAAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGGCTGAGTACAGCAACAAAAGACACCTATGACGCTCTGCACATGCAGGCTCTGCCACCAAGAAGAGCCAAGCGGGGCTCTGGCGAGGGCAGAGGCTCTCTGCTGACCTGCGGAGATGTGGAAGAAAATCCCGGCCCTATGGAGACACCAGCTCAGCTGCTGTTCCTCCTCCTGCTGTGGCTCCCTGACACAACCGGCGACATCCAGATGACACAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGGGTACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGCAATCTCCTAAACTACTGATTTACTGGGCATCCACCCGGCACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATTAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGATTATTTCTGTCAGCAATATAGCAGCTATCCTCTCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATCAAAGGCGGCGGAGGATCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCAGTAGCAATGTTATCAGCTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTGGATGGGGGGGGTCATCCCTATTGTTGATATTGCGAACTACGCACAGAGATTCAAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACTAGTACAACTTACATGGAGTTGAGCAGCCTGAGGTCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGCACACTTGGTCTCGTCCTGGATGCTATGGACTACTGGGGTCAGGGTACGTTGGTCACCGTCTCCTCAGGCAGCACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGCTCTACCAAGGGCGAAACGGTACTCACGCAGTCTCCAGGTACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTCTTGGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCTGGTCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCACCTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGTACCGACTTCACTCTCACCATCAGCCGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATGCTGACTCACCGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAAGGGGGAGGCGGCAGCCAGATCCAACTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGATGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACTACAACATACACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGACGTATTAATCCTTACAATGGTGATACTTTCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAATCCTCTAGCACAGCCCACATGGAGCTCCTGAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTATTGTGGAAGAATGGGGTACGACGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCGGCGGCGGCAGCAGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCCAGCCCCGCGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCCGCGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCCGCTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAGTGA(SEQ ID NO.39)。

2.慢病毒进行包装和CAR-T的制备

2.1.含两种不同CAR元件的慢病毒包装

利用第三代的慢病毒包装系统(慢病毒主质粒、pMD2.G、pMDLg-pRRE、pRSV-Rev)进行病毒包装。提前准备三个慢病毒包装辅助质粒，与pCCL-GC33-BBz和pCCL-GC33-BBz-bsDHC慢病毒主质粒一起完成病毒包装。用阳离子聚合物PEI包装含CAR元件的慢病毒，流程如下：分别用无血清DMEM稀释PEI和四个慢病毒包装质粒混合物；然后将PEI/DMEM加入质粒/DMEM混合物，涡旋震荡混匀，在室温下静置15分钟；将质粒-PEI复合物加入预先铺板的293T细胞。转染后16h换液，在48h后收集病毒上清，0.45μm滤器过滤，将病毒原液以12000g过夜离心沉淀病毒，次日弃上清用PBS溶液重悬病毒，置于-80℃冰箱储存。

2.2.GC33-BBz CAR-T和GC33-BBz-bsDHC CAR-T的制备

将两种CAR-T细胞分别命名为GC33-BBz CAR-T和GC33-BBz-bsDHC CAR-T。提前一天包被Retronectin(TAKARA)、抗人CD3抗体(北京同立海源)及CD28抗体(北京同立海源)在6孔板中，4℃过夜，用前PBS洗两次备用。采用常规方法采血并分离PBMC，使用StemCell T细胞分选试剂盒分选T细胞，计数，将获得T细胞按1×10⁶个/ml密度重悬在含有5％人AB血清(华津生物)和100IU/ml白细胞介素-2(ACRO)的X-VIVO15培养基中，置入包被的培养板培养。开始培养以后24小时，加入5μg/ml的凝聚胺(Sigma)溶液并按MOI3加入慢病毒，混匀，37℃感染24小时。然后离心收集细胞沉淀，更换为5％人AB血清和100IU/ml白细胞介素-2的X-VIVO15培养基培养。后续培养通过补加培养基将细胞保持密度为1×10⁶个/ml，72小时后利用流式细胞术检测scFv表达以检测CAR分子转导效率。阳性率检测分别使用biotin-protein L(ACRO)和streptavidin-PE(生工)检测单链抗体的κ轻链可变区。

如图10所示，GC33-BBz CAR-T和GC33-BBz-bsDHC CAR-T细胞阳性率分别为49.39％和30.89％。由于GC33-BBz CAR-T细胞CAR阳性率高于GC33-BBz-bsDHC CAR-T细胞的CAR阳性率，在GC33-BBz CAR-T细胞中加入对照T细胞将其CAR阳性率调节为30.89％，冻存两组CAR-T细胞用于后续实验。

3.GC33-BBz CAR-T和GC33-BBz-bsDHC CAR-T的体外功能研究

3.1.两组CAR-T细胞体外杀伤靶细胞的比较：

用5-羧基荧光素琥珀酰亚胺基(CFSE)将效应细胞染色，分别取三组效应细胞(GC33-BBz CAR-T、GC33-BBz-bsDHC CAR-T和对照T细胞)与HepG2靶细胞(中科院上海药物所)以2:1，5:1，10:1的效靶比混合共培养(两组CAR-T细胞CAR阳性率已调节一致)。经过4小时共培养后，将细胞用Annexin V及PI试剂盒(翊圣)染色。使用流式细胞术对细胞杀伤进行检测，结果见图11。各效靶比下，GC33-BBz-bsDHC CAR-T杀伤能力均显著高于GC33-BBzCAR-T，尤其是在效靶比较低时两组CAR-T细胞的杀伤能力差异更显著。

3.2.两组CAR-T细胞与靶细胞共孵育产生细胞因子分泌的对比：

将两组CAR-T细胞分别与HepG2靶细胞过夜共培养，用LEGENDplex HU Th1 Panel(BioLegend)试剂盒对IL-2、IFNγ、TNFα三个细胞因子进行定量检测。选择2:1的效靶比进行共培养，分别将GC33-BBz CAR-T细胞、GC33-BBz-bsDHC CAR-T细胞和对照T细胞与HepG2过夜共培养(两组CAR-T细胞CAR阳性率已调节一致)。具体操作如下：

效应细胞复苏和细胞密度调整：打开水浴锅，设置温度为37℃。从液氮中取出冻存的CAR-T细胞，迅速放入水浴锅中并快速晃动，在1分钟内使细胞溶液完全溶解。取1支15ml离心管，加入10ml的生理盐水，将细胞冻存悬液加入离心管，500g离心5分钟。弃上清，轻弹离心管使细胞团分散，并向离心管内加入5ml培养基(X-VIVO15+5％FBS)轻轻吹打混匀悬液，并计数；GC33-BBz CAR-T和GC33-BBz-bsDHC CAR-T细胞计数；调整细胞密度至4×10⁵/ml,每孔96板加50μl细胞。

HepG2靶细胞准备：取生长状态良好的靶细胞，消化和台酚蓝计数检测细胞活率，500g离心5分钟，弃上清。用X-VIVO-15/5％FBS培养基重悬，调整细胞密度至2×10⁵/ml。

效靶细胞混合：将处理好的效应细胞和靶细胞，每孔96板效应细胞和靶细胞各加50μl，混匀后37℃孵育过夜孵育。收集细胞培养物上清10μl进行多因子检测，多因子检测按照LEGENDplex HU Th1 Panel提供的操作说明开展。

如图12所示，两组CAR-T分泌的IFN-γ水平基本一致，GC33-BBz-bsDHC CAR-T细胞分泌的IL-2和TNF-α较GC33-BBz CAR-T细胞显著更低；IL-2分泌下降可能会减少细胞因子风暴副作用的产生。

3.3.两组CAR-T细胞脱颗粒能力对比：

CD107a位于胞内的细胞毒颗粒表面，在加入含有莫能菌素的蛋白转运抑制剂(GolgiStop)情况下，通过对细胞膜表面CD107a阳性率检测即可分析培养后的T细胞活化情况。通常CD107a阳性细胞占CD8阳性细胞比例越高杀伤肿瘤的能力越强。将已知GPC3阳性的HepG2作为靶细胞，同时将GC33-BBz CAR-T细胞、GC33-BBz-bsDHC CAR-T细胞和对照T细胞作为效应细胞与靶细胞共孵育4小时(两组CAR-T细胞CAR阳性率已调节一致)，经流式检测CD107a阳性细胞占CD8阳性细胞比例。具体操作如下：

效应细胞复苏和细胞密度调整：打开水浴锅，设置温度为37℃。从液氮中取出冻存的L6 CART细胞，迅速放入水浴锅中并快速晃动，在1分钟内使细胞溶液完全溶解。取1支15ml离心管，加入10ml的生理盐水，将细胞冻存悬液加入离心管，500g离心5分钟。弃上清，轻弹离心管使细胞团分散，并向离心管内加入5ml培养基(X-VIVO15+5％FBS)轻轻吹打混匀悬液，并计数；GC33-BBz CAR-T和GC33-BBz-bsDHC CAR-T细胞计数；调整效应细胞密度至4×10⁶/ml,每孔96板加50μl细胞。

HepG2靶细胞准备：取生长状态良好的靶细胞，消化和台酚蓝计数检测细胞活率，500g离心5分钟，弃上清。用X-VIVO-15/5％FBS培养基重悬，4×10⁶/ml，每孔96板加50μl细胞。

效靶细胞混合：将处理好的效应细胞和靶细胞，每孔96板效应细胞和靶细胞各加50μl，每1ml培养基中加入1μl GolgiPlug(BD)，每孔加入2μl CD107a抗体-PE(eBioscience)，37℃孵育4小时。收集细胞，加入1ml PBS。500g离心5分钟。弃去上清，PBS洗细胞一次，500g离心5分钟。弃上清，每管加入适量特异性CD3抗体-APC(BioLegend)和CD8抗体-PerCP(BioLegend)各2μl。重悬体积100μl，冰上避光孵育30分钟。每管用1ml生理盐水清洗细胞1次，500g离心5分钟。仔细吸去上清。适量生理盐水重悬，流式细胞仪检测CD3、CD8和CD107a的阳性率。

如图13所示，GC33-BBz-bsDHC CAR-T与靶细胞孵育组CD107a阳性细胞占CD8阳性细胞比例要显著高于GC33-BBz CAR-T与靶细胞孵育组，提示了GC33-BBz-bsDHC CAR-T的靶细胞杀伤能力更强。

4.GC33-BBz CAR-T和GC33-BBz-bsDHC CAR-T的动物体内药效对比

探索HepG2细胞皮下成瘤的NSG小鼠单次静脉注射给予GC33-BBz CAR-T和GC33-BBz-bsDHC CAR-T细胞后的药效差异。主要通过测量皮下瘤体大小来评估肿瘤负荷。

试验方案如下：参照上述实施例中描述CAR-T制备流程，提前制备足量的GC33-BBzCAR-T和GC33-BBz-bsDHC CAR-T用于开展体内药效实验。从45只HepG2细胞皮下成瘤(瘤体体积为100～150mm³)的NSG小鼠中挑选30只分为三组，每组10只，每组平均瘤体体积约140mm³。三组小鼠分别尾静脉注射1×10⁶(以CAR阳性细胞计)的GC33-BBz CAR-T、GC33-BBz-bsDHC CAR-T和对照T细胞，单次静脉给药，给药容量为200μl/只。其后每三到四天测量皮下瘤体大小，观测至第13天结束实验。如图14所示，由于1×10⁶每只的给药剂量为低剂量，GC33-BBz CAR-T相比对照T细胞未有明显抑瘤效果，但GC33-BBz-bsDHC CAR-T相比对照T细胞有明显抑瘤效果，可见bsDHC元件的加入能显著增强GC33-BBz-bsDHC CAR-T细胞的抑瘤效果。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 拜盖特生物科技（上海）有限公司

<120> 一种解除肿瘤免疫微环境中免疫抑制的双功能抗体及其应用和制备方法

<160> 39

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 220

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser

1 5 10 15

Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu

20 25 30

Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln

35 40 45

Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg

50 55 60

Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala

65 70 75 80

Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys

85 90 95

Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val

100 105 110

Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro

115 120 125

Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys

130 135 140

Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys

145 150 155 160

Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr

165 170 175

Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr

180 185 190

Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile

195 200 205

Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg

210 215 220

<210> 2

<211> 231

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

1 5 10 15

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

20 25 30

Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

35 40 45

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

50 55 60

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

65 70 75 80

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

85 90 95

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

100 105 110

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

115 120 125

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys

130 135 140

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

145 150 155 160

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

165 170 175

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

180 185 190

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

195 200 205

Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 3

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 3

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser

<210> 4

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 4

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Pro Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Ala His Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 5

<211> 351

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

gaggtgcagc ttcagcagtc tggggctgag cttgtgaagc ctggggcttc agtgaagctg 60

tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactgga tgcactgggt gaagcagagg 120

cctggacgag gccttgagtg gattggaagg attgatccta atagtggtgg tactaagtac 180

aatgagaagt tcaagagcaa ggccacactg actgtagaca aaccctccag cacagcctac 240

atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attattgtgc aaggagggct 300

catcgagggt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ccgtttcctc a 351

<210> 6

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 6

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser

85 90 95

Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 7

<211> 336

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

gatgttgtga tgacccagac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60

atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120

tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240

agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttccg 300

tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336

<210> 8

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 8

Gln Ile Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Gly Thr Lys Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Leu Gly Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 9

<211> 354

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

cagatccaac tgcagcagcc tggggctgag cttgtgaagc ctggggcttc agtgaagctg 60

tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactgga tgcactgggt gaagcagagg 120

cctggacgag gccttgagtg gattggaagg attgatccta atagtggtgg tactaagtac 180

aatcaaaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccag cacagcctac 240

atgcagctca acagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aaggtcaggg 300

ctgggacgag gatttgctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc ctca 354

<210> 10

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 10

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly His Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser

85 90 95

Thr His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 11

<211> 336

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

gatgttgtga tgacccaaac tcctctctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60

atctcttgca gatctagtca gagccttgtt cacagtaatg gacacaccta tttacattgg 120

tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240

agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttcct 300

cggacgttcg gtggaggcac caagctggaa ataaaa 336

<210> 12

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 12

Gln Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala His

65 70 75 80

Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Gly Arg Met Gly Tyr Asp Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

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Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 13

<211> 354

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

cagatccaac tgcagcagtc tggagctgag ctgatgaagc ctggggcctc agtgaagata 60

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catggaaaga gccttgagtg gattggacgt attaatcctt acaatggtga tactttctac 180

aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca aatcctctag cacagcccac 240

atggagctcc tgagcctgac atctgaggac tctgcagtct attattgtgg aagaatgggg 300

tacgacgcct ggtttgctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgca 354

<210> 14

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 14

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

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Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

gacatccaga tgacacagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60

atcacctgca aggccagtca ggatgtgggt actgctgtag cctggtatca acagaaacca 120

gggcaatctc ctaaactact gatttactgg gcatccaccc ggcacactgg agtccctgat 180

cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccattagcaa tgtgcagtct 240

gaagacttgg cagattattt ctgtcagcaa tatagcagct atcctctcac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggaaatcaa a 321

<210> 16

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 16

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp

1 5

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<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 17

Ile Asp Pro Asn Ser Gly Gly Thr

1 5

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<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 18

Ala Arg Arg Ala His Arg Gly Phe Ala Tyr

1 5 10

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

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Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr

1 5 10

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

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Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

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Ala Arg Ser Gly Leu Gly Arg Gly Phe Ala Tyr

1 5 10

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

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Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly His Thr Tyr

1 5 10

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<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 23

Ser Gln Ser Thr His Val Pro Arg Thr

1 5

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<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

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Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn

1 5

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<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 25

Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr

1 5

<210> 26

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 26

Gly Arg Met Gly Tyr Asp Ala Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

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Gln Asp Val Gly Thr Ala

1 5

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

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Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu Thr

1 5

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 29

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Asn

20 25 30

Val Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Val Ile Pro Ile Val Asp Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Arg Phe

50 55 60

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65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Thr Leu Gly Leu Val Leu Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 31

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 31

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr

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Lys Gly

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 32

Glu Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Gly Ser Ser

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

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<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 34

Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 35

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu

1 5 10 15

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

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Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

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Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 36

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

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Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

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Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

115 120 125

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Asn

130 135 140

Val Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

145 150 155 160

Gly Gly Val Ile Pro Ile Val Asp Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Arg Phe

165 170 175

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Thr Tyr

180 185 190

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

195 200 205

Ala Ser Thr Leu Gly Leu Val Leu Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

210 215 220

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys

225 230 235 240

Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Thr Val Leu Thr Gln

245 250 255

Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser

260 265 270

Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Gly Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln

275 280 285

Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser

290 295 300

Arg Ala Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

305 310 315 320

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val

325 330 335

Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala Asp Ser Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly

340 345 350

Thr Arg Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Gln Leu Gln

355 360 365

Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser

370 375 380

Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn Ile His Trp Val

385 390 395 400

Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asn Pro

405 410 415

Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr

420 425 430

Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala His Met Glu Leu Leu Ser

435 440 445

Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Arg Met Gly Tyr

450 455 460

Asp Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

465 470 475 480

Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Gly

485 490 495

Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

500 505 510

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

515 520 525

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

530 535 540

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

545 550 555 560

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

565 570 575

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

580 585 590

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

595 600 605

Ser Pro Gly Lys

610

<210> 37

<211> 1836

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 37

gacatccaga tgacacagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60

atcacctgca aggccagtca ggatgtgggt actgctgtag cctggtatca acagaaacca 120

gggcaatctc ctaaactact gatttactgg gcatccaccc ggcacactgg agtccctgat 180

cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccattagcaa tgtgcagtct 240

gaagacttgg cagattattt ctgtcagcaa tatagcagct atcctctcac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggaaatcaa aggcggcgga ggatcccagg tgcagctggt gcagtctggg 360

gctgaggtga agaagcctgg gtcctcggtg aaggtctcct gcaaggcttc tggatacacc 420

ttcagtagca atgttatcag ctgggtgcgc caggcccctg gacaagggct cgagtggatg 480

gggggggtca tccctattgt tgatattgcg aactacgcac agagattcaa gggcagagtc 540

acgattaccg cggacgaatc cactagtaca acttacatgg agttgagcag cctgaggtct 600

gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgcgagc acacttggtc tcgtcctgga tgctatggac 660

tactggggtc agggtacgtt ggtcaccgtc tcctcaggca gcacaagcgg ctctggcaag 720

cctggatctg gcgagggctc taccaagggc gaaacggtac tcacgcagtc tccaggtacc 780

ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc ctctcctgca gggccagtca gagtcttggc 840

agcagctact tagcctggta tcagcagaaa cctggtcagg ctcccaggct cctcatctat 900

ggtgcatcca gcagggcacc tggcatccca gacaggttca gtggcagtgg gtctggtacc 960

gacttcactc tcaccatcag ccgactggag cctgaagatt ttgcagttta ttactgtcag 1020

cagtatgctg actcaccgat caccttcggc caagggacac gactggagat taaaggggga 1080

ggcggcagcc agatccaact gcagcagtct ggagctgagc tgatgaagcc tggggcctca 1140

gtgaagatat cctgcaaggc ttctggatac acattcactg actacaacat acactgggtg 1200

aagcagagcc atggaaagag ccttgagtgg attggacgta ttaatcctta caatggtgat 1260

actttctaca accagaagtt caagggcaag gccacattga ctgtagacaa atcctctagc 1320

acagcccaca tggagctcct gagcctgaca tctgaggact ctgcagtcta ttattgtgga 1380

agaatggggt acgacgcctg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct 1440

gcagagccca agagctgcga caagacccac acctgccccc cctgcggcgg cggcagcagc 1500

ggcggcggca gcggcggcca gccccgcgag ccccaggtgt acaccctgcc ccccagccgc 1560

gaggagatga ccaagaacca ggtgagcctg acctgcctgg tgaagggctt ctaccccagc 1620

gacatcgccg tggagtggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc 1680

cccgtgctgg acagcgacgg cagcttcttc ctgtacagca agctgaccgt ggacaagagc 1740

cgctggcagc agggcaacgt gttcagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 1800

tacacccaga agagcctgag cctgagcccc ggcaag 1836

<210> 38

<211> 1482

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 38

atggctctgc ctgtgaccgc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgctcgg 60

cctaccggtg acgtggtgat gacccagagc cctctgagcc tgcctgtgac ccctggcgag 120

cctgccagca tcagctgccg gagcagccaa tctctggtgc actccaacgc caacacctac 180

ctgcattggt acctgcagaa acccggccag agcccccagc tgctgatcta caaggtgtct 240

aatcggttta gcggagttcc agatagattc agcggatctg gctccggcac cgacttcaca 300

ctgaagatca gcagagtgga agccgaggat gtgggcgtgt actactgcag ccagaacacc 360

cacgtgccac ctacattcgg ccagggcaca aagctggaaa tcaagggcgg aggaggatct 420

ggcggcggcg gcagcggcgg aggcggatct caggtgcagc tggtccagtc tggcgctgag 480

gtgaagaaac ctggcgccag cgtgaaagtg tcctgcaagg cctctggtta tacctttacc 540

gactacgaga tgcactgggt gcggcaggcc cctggccagg gcctggaatg gatgggcgcc 600

ctggacccca agaccggcga caccgcttac agccagaagt tcaagggcag agtgacactg 660

accgctgatg agagcacaag cacagcctac atggaactga gcagcctgag aagcgaggac 720

accgccgtgt actattgtac cagattctac agctacacct actggggcca aggcacactc 780

gtcaccgtgt cgtcgacgac aactccagca cccagacccc ctacacctgc tccaactatc 840

gcaagtcagc ccctgtcact gcgccctgaa gcctgtcgcc ctgctgccgg gggagctgtg 900

catactcggg gactggactt tgcctgtgat atctacatct gggcgccctt ggccgggact 960

tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc accctttact gcaggttcag tgtcgtgaag 1020

agaggccgga agaagctgct gtacatcttc aagcagcctt tcatgaggcc cgtgcagact 1080

acccaggagg aagatggatg cagctgtaga ttccctgaag aggaggaagg aggctgtgag 1140

ctgagagtga agttctcccg aagcgcagat gccccagcct atcagcaggg acagaatcag 1200

ctgtacaacg agctgaacct gggaagacgg gaggaatacg atgtgctgga caaaaggcgg 1260

ggcagagatc ctgagatggg cggcaaacca agacggaaga acccccagga aggtctgtat 1320

aatgagctgc agaaagacaa gatggctgag gcctactcag aaatcgggat gaagggcgaa 1380

agaaggagag gaaaaggcca cgacggactg taccaggggc tgagtacagc aacaaaagac 1440

acctatgacg ctctgcacat gcaggctctg ccaccaagat ga 1482

<210> 39

<211> 3453

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 39

atggctctgc ctgtgaccgc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgctcgg 60

cctaccggtg acgtggtgat gacccagagc cctctgagcc tgcctgtgac ccctggcgag 120

cctgccagca tcagctgccg gagcagccaa tctctggtgc actccaacgc caacacctac 180

ctgcattggt acctgcagaa acccggccag agcccccagc tgctgatcta caaggtgtct 240

aatcggttta gcggagttcc agatagattc agcggatctg gctccggcac cgacttcaca 300

ctgaagatca gcagagtgga agccgaggat gtgggcgtgt actactgcag ccagaacacc 360

cacgtgccac ctacattcgg ccagggcaca aagctggaaa tcaagggcgg aggaggatct 420

ggcggcggcg gcagcggcgg aggcggatct caggtgcagc tggtccagtc tggcgctgag 480

gtgaagaaac ctggcgccag cgtgaaagtg tcctgcaagg cctctggtta tacctttacc 540

gactacgaga tgcactgggt gcggcaggcc cctggccagg gcctggaatg gatgggcgcc 600

ctggacccca agaccggcga caccgcttac agccagaagt tcaagggcag agtgacactg 660

accgctgatg agagcacaag cacagcctac atggaactga gcagcctgag aagcgaggac 720

accgccgtgt actattgtac cagattctac agctacacct actggggcca aggcacactc 780

gtcaccgtgt cgtcgacgac aactccagca cccagacccc ctacacctgc tccaactatc 840

gcaagtcagc ccctgtcact gcgccctgaa gcctgtcgcc ctgctgccgg gggagctgtg 900

catactcggg gactggactt tgcctgtgat atctacatct gggcgccctt ggccgggact 960

tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc accctttact gcaggttcag tgtcgtgaag 1020

agaggccgga agaagctgct gtacatcttc aagcagcctt tcatgaggcc cgtgcagact 1080

acccaggagg aagatggatg cagctgtaga ttccctgaag aggaggaagg aggctgtgag 1140

ctgagagtga agttctcccg aagcgcagat gccccagcct atcagcaggg acagaatcag 1200

ctgtacaacg agctgaacct gggaagacgg gaggaatacg atgtgctgga caaaaggcgg 1260

ggcagagatc ctgagatggg cggcaaacca agacggaaga acccccagga aggtctgtat 1320

aatgagctgc agaaagacaa gatggctgag gcctactcag aaatcgggat gaagggcgaa 1380

agaaggagag gaaaaggcca cgacggactg taccaggggc tgagtacagc aacaaaagac 1440

acctatgacg ctctgcacat gcaggctctg ccaccaagaa gagccaagcg gggctctggc 1500

gagggcagag gctctctgct gacctgcgga gatgtggaag aaaatcccgg ccctatggag 1560

acaccagctc agctgctgtt cctcctcctg ctgtggctcc ctgacacaac cggcgacatc 1620

cagatgacac agtctcacaa attcatgtcc acatcagtag gagacagggt cagcatcacc 1680

tgcaaggcca gtcaggatgt gggtactgct gtagcctggt atcaacagaa accagggcaa 1740

tctcctaaac tactgattta ctgggcatcc acccggcaca ctggagtccc tgatcgcttc 1800

acaggcagtg gatctgggac agatttcact ctcaccatta gcaatgtgca gtctgaagac 1860

ttggcagatt atttctgtca gcaatatagc agctatcctc tcacgttcgg aggggggacc 1920

aagctggaaa tcaaaggcgg cggaggatcc caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag 1980

gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc tcctgcaagg cttctggata caccttcagt 2040

agcaatgtta tcagctgggt gcgccaggcc cctggacaag ggctcgagtg gatggggggg 2100

gtcatcccta ttgttgatat tgcgaactac gcacagagat tcaagggcag agtcacgatt 2160

accgcggacg aatccactag tacaacttac atggagttga gcagcctgag gtctgaggac 2220

acggccgtgt attactgtgc gagcacactt ggtctcgtcc tggatgctat ggactactgg 2280

ggtcagggta cgttggtcac cgtctcctca ggcagcacaa gcggctctgg caagcctgga 2340

tctggcgagg gctctaccaa gggcgaaacg gtactcacgc agtctccagg taccctgtct 2400

ttgtctccag gggaaagagc caccctctcc tgcagggcca gtcagagtct tggcagcagc 2460

tacttagcct ggtatcagca gaaacctggt caggctccca ggctcctcat ctatggtgca 2520

tccagcaggg cacctggcat cccagacagg ttcagtggca gtgggtctgg taccgacttc 2580

actctcacca tcagccgact ggagcctgaa gattttgcag tttattactg tcagcagtat 2640

gctgactcac cgatcacctt cggccaaggg acacgactgg agattaaagg gggaggcggc 2700

agccagatcc aactgcagca gtctggagct gagctgatga agcctggggc ctcagtgaag 2760

atatcctgca aggcttctgg atacacattc actgactaca acatacactg ggtgaagcag 2820

agccatggaa agagccttga gtggattgga cgtattaatc cttacaatgg tgatactttc 2880

tacaaccaga agttcaaggg caaggccaca ttgactgtag acaaatcctc tagcacagcc 2940

cacatggagc tcctgagcct gacatctgag gactctgcag tctattattg tggaagaatg 3000

gggtacgacg cctggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgcagag 3060

cccaagagct gcgacaagac ccacacctgc cccccctgcg gcggcggcag cagcggcggc 3120

ggcagcggcg gccagccccg cgagccccag gtgtacaccc tgccccccag ccgcgaggag 3180

atgaccaaga accaggtgag cctgacctgc ctggtgaagg gcttctaccc cagcgacatc 3240

gccgtggagt gggagagcaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac cccccccgtg 3300

ctggacagcg acggcagctt cttcctgtac agcaagctga ccgtggacaa gagccgctgg 3360

cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 3420

cagaagagcc tgagcctgag ccccggcaag tga 3453

Claims

1.一种解除肿瘤免疫微环境中免疫抑制的双功能抗体，其特征在于，为PD-L1抗体可变区和TGF-βs抗体可变区组合形成的二硫键稳定的双功能scDb-CH3结构bsDHC，包括PD-L1抗体可变区、TGF-βs抗体可变区、可产生二硫键的人IgG1的铰链结构域、人IgG1的CH3结构域和连接肽；

所述PD-L1抗体可变区包括重链可变区和轻链可变区；

所述重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:4，所述轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:6；或，

所述重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:8，所述轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:10；或，

所述重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:12，所述轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:14；

所述TGF-βs抗体可变区包括TGF-β抗体的重链可变区和TGF-β抗体的轻链可变区；所述TGF-β抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.30，所述TGF-β抗体的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.32。

2.根据权利要求1所述的双功能抗体，其特征在于，所述连接肽的氨基酸序列为SEQ IDNO.29、31、34。

3.根据权利要求1所述的双功能抗体，其特征在于，所述人IgG 1的铰链结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO.33；所述人IgG1的CH3结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO.35。

4.如权利要求1-3任一项所述双功能抗体的制备方法，其特征在于，合成PD-L1抗体可变区、TGF-βs抗体可变区、可产生二硫键的人IgG 1的铰链结构域、人IgG1的CH3结构域和连接肽，然后通过化学合成的方式合成所述双功能抗体bsDHC。

5.如权利要求1-3任一项所述双功能抗体在制备治疗肿瘤药物中的应用。

6.一种治疗肿瘤的药物，其特征在于，包括如权利要求1-3任一项所述双功能抗体，并将其作为活性成分。

7.一种表达如权利要求1-3任一项所述双功能抗体的CAR-T细胞。

8.根据权利要求7所述的CAR-T细胞，其特征在于，CAR由依次连接的人CD8信号肽、GC33单链抗体、人CD8铰链区、人CD8跨膜区、人41BB胞内区、人CD3ζ胞内区、P2A自切割肽、人IgGκ信号肽和所述双功能抗体组成。

9.一种含有编码如权利要求1-3任一项所述双功能抗体的核苷酸序列的双功能溶瘤病毒。

10.一种治疗肿瘤的生物制剂，其特征在于，包括如权利要求7-8任一项所述的CAR-T细胞或者如权利要求9所述的双功能溶瘤病毒。