CN112851819B - 结合小鼠PD-L1和TGF-β的双特异性抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

结合小鼠PD-L1和TGF-β的双特异性抗体及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种结合小鼠PD‑L1和TGF‑β的双特异性抗体及其制备方法与应用，属于免疫学和抗体工程技术领域。该双特异性抗体包括两条对称分布且成形配对的长链和位于各长链外侧且分别与各长链配对的短链，各长链的氨基酸序列为SEQ ID NO:1且包含如下式I所示多肽链，各短链的氨基酸序列为SEQ ID NO:2且包含如下式II所示多肽链：VHa‑CH1‑X1‑VLb‑X2‑CH2‑CH3，式I；VLa‑CL‑X1‑VHb，式II。本发明公开的双特异性抗体以高亲和力与小鼠PD‑L1以及TGF‑β进行特异性结合，通过调节各抗原所参与的信号传导通路来发挥良好的生物学功能。

Description

结合小鼠PD-L1和TGF-β的双特异性抗体及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种新制备的双特异性抗体，属于免疫学和抗体工程技术领域，具体地涉及一种结合小鼠PD-L1和TGF-β的双特异性抗体及其制备方法与应用。
背景技术
单克隆抗体是仅作用于单一抗原表位的高度特异性抗体，已被广泛用于许多疾病的治疗，例如癌症、炎性疾症、自身免疫性疾病和感染性疾病。但是，这种治疗分子在单独使用时，该治疗分子不能显示出足够的药效。这可能是由于疾病的复杂性。例如，癌症或炎性疾病通常涉及多种疾病介导的分子通路以及信号通路之间的相叉作用。在这些情况下，靶向单一靶标的分子不能提供最佳的治疗效果。通过同时阻断多个靶标或者阻断同一靶标的多个位点处的分子能够改善治疗效果。由于多特异性分子、例如双特异性分子是单一分子，多特异性分子可以使得进行双靶向治疗可以简化新药的开发过程。与使用多个单特异性分子组合相比，使用多特异性分子对于患者和医疗服务提供者都更方便。
已经通过抗体过程开发了大量富于想象力的双特异性抗体样式并且研究了它们在疾病应用上的适应性。如2014年12月03日美国FDA审批安进公司研发的双特异性抗体Blincyto(Blinatumomab)上市，用于急性淋巴细胞白血病的治疗，又如默克公司研发的目前仍处于临床阶段的M7824，M7824是一种新型的双功能融合蛋白，该蛋白由靶向PD-L1蛋白的IgG1单克隆抗体和人类转化生长因子-β(TGF-β)受体II型融合而成。简单来说，这种双功能蛋白既能抑制PD-L1蛋白配体，又能抑制TGF-β通路，双管齐下，能促进免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤。并且，同时靶向这两个系统或可克服肿瘤细胞对PD-1/PD-L1疗法的抗药性。这样就会极大地提升药物的有效率，并降低联合用药的副作用。
PD-1/PD-L1单抗因抗癌谱广、疗效持久、副作用易耐受而备受瞩目。在肿瘤微环境中，过度活化的PD-1/PD-L1通路抑制机体对肿瘤细胞的免疫监视和清除效应。传统认为肿瘤细胞高表达的PD-L1与T细胞表面的PD-1结合而抑制T细胞的免疫活性，PD-1/PD-L1单抗通过阻断这一负性免疫调控信号，解救T细胞，恢复抗肿瘤免疫。但是，从临床疗效看，PD-L1的不能很好的预测患者的疗效，甚至一些肿瘤不表达PD-L1的患者也能获益。
近期研究发现在肿瘤-免疫循环模型中，除了公认的PD-1/PD-L1通路，肿瘤微环境中高表达的TGF-β也可以广泛的调控多种免疫相关的效应细胞活性，重塑肿瘤免疫微环境，共同参与肿瘤细胞免疫逃逸。TGF-β可能成为制约抗肿瘤免疫应答的限速步骤，从而影响PD-1/PD-L1抗体的疗效。
TGF-β具有多种生物学功能，对细胞的生长增殖、分化、凋亡、迁移和免疫都有重要的调节作用。TGF-β存在三个亚型，分别为TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，其三个亚型均可以结合细胞表面相同的受体。TGFBR1和TGFBR2具有相似的配体结合亲和力，对TGF-β1/3具有高亲和力，对TGF-β2具有低亲和力。TGFBR3对TGF-β1/2均具有高亲和力，同时也可以结合TGF-β3。此外，TGF-β在进化上也高度保守，人源的TGF-β1与猪/狗/牛具有100％的氨基酸序列同源性，与小鼠/大鼠/马具有99％的氨基酸序列同源性；人源的TGF-β2与猪/犬/马/牛具有100％的氨基酸序列同源性，与小鼠/大鼠的TGF-β2具有97％的氨基酸序列同源性；人源的TGF-β3与小鼠/狗/马具有100％氨基酸序列同源性，与大鼠具有99％的氨基酸序列同源性，与猪具有98％的氨基酸序列同源性。上述几个物种的TGF-β均具有很强的种属交叉活性。肿瘤组织中TGF-β由肿瘤细胞、免疫细胞和间质细胞产生。高表达的TGF-β不仅促进肿瘤细胞发生上皮间质转化，而且作用于多种肿瘤微环境中的免疫细胞，诱导抑制性肿瘤免疫微环境的产生。
TCGA数据库分析显示，活化的TGF-β信号活化和与肿瘤不良预后相关。活化的TGF-β信号导致PD-1抑制剂的耐药，并且预测PD-1疗效的准确性高于常用的标志物：突变负荷、T细胞杀伤活性，CAF及T细胞炎症反应信号(T cell-inflamed signature)。结肠癌肝转移是重要致死原因，与原发灶相比，转移瘤并无一致性的基因突变。Tauriello等对转移瘤微环境的分析显示T细胞缺乏、TH1型细胞和免疫杀伤细胞活性低，升高的TGF-β表达提示预后不良。通过基因工程技术构建Apc，Kras，TGF R2和p53四重突变小鼠，建立转移癌模型。发现转移癌组织显示微卫星稳定性肠癌的特征：低突变负荷，T细胞耗竭和TGF-β活化。正常肠粘膜和腺瘤的间质有T细胞侵润，而邻近的癌组织则没有。PD-1治疗对这些肿瘤的效果有限，相反，使用TGF-β抑制剂引起持久的T细胞活化，可阻止肝转移；对已进展到肝转移的小鼠，TGF-β抑制剂增加PD-1治疗的敏感性。结果支持肿瘤组织微环境高活性TGF-β引起T细胞耗竭和TH1效应细胞减少，导致免疫逃难机理。Mariathasan等分析转移性尿道上皮癌患者接受PD-1免疫治疗的癌组织，有效患者的特征为PD-L1表达，高突变负荷/新抗原，效应性T细胞和肿瘤组织高突变负荷；无效患者的肿瘤组织含致密的间质和CAF高TGF-β活性，T细胞缺乏。小鼠乳腺癌EMT-6模型模拟上皮癌的表型，单独阻断PD-L1或TGF-β的效果均不佳，联合抑制TGF-β和PD-1信号，减少基质细胞的TGF-β活性，促进T细胞进入肿瘤，刺激强烈的免疫应答，导致肿瘤退缩。总之，多项研究显示PD-1或PD-L1抵抗的肿瘤组织TGF-β通路活性显著增加，肿瘤微环境中高表达的TGF-β抑制机体对瘤细胞的免疫反应。TGF-β和PD-1/PD-L1通路对于肿瘤的免疫抑制机制相互独立并且互为补充，共同促进肿瘤逃避机体的免疫监视。协同阻断PD-L1和TGF-β双抑制信号，可更有效的促进Immune Excluded肿瘤向ImmuneInflamed肿瘤的转化，从而提高PD-L1单抗敏感肿瘤的有效率，并可拓宽PD-L1单抗的抗癌谱。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种结合小鼠PD-L1和TGF-β的双特异性抗体及其制备方法与应用。本发明制备的抗体包含至少2个抗原结合位点，其中一个特异性结合小鼠PD-L1，另一个特异性结合TGF-β，其能够作为双特异性抗体发挥协同作用。
为实现上述目的，本发明公开了一种结合小鼠PD-L1和TGF-β的双特异性抗体，它包括两条对称分布且成形配对的长链和位于各所述长链外侧且分别与各所述长链配对的短链，各所述长链的氨基酸序列为SEQ ID NO:1且包含如下式I所示多肽链，各所述短链的氨基酸序列为SEQ ID NO:2且包含如下式II所示多肽链：
VHa-CH1-X1-VLb-X2-CH2-CH3 式I；
VLa-CL-X1-VHb 式II；
其中，所述式I中：
VHa代表抗小鼠PD-L1重链可变区；
CH1、CH2、CH3代表重链恒定区结构域；
VLb代表抗小鼠TGF-β区域的轻链可变区；
所述式II中：
VLa代表抗小鼠PD-L1轻链可变区；
CL代表轻链恒定区；
VHb代表抗小鼠TGF-β区域的重链可变区；
且，所述式I和式II中，X1、X2代表连接肽。
进一步地，式I中所述CH1与式II中所述CL之间化学键连接。
进一步地，两条所述长链的X2之间化学键连接。
进一步地，所述X1的序列信息为GGGGSEAAAKGGGGS。
进一步地，所述X2的序列信息为GYPGGGGS。
与此同时，本发明还公开了一种药物组合物，它包括上述双特异性抗体和药学上可接受的载体。该双特异性抗体可以结合治疗剂、药物前体、肽、蛋白、酶、病毒、脂质、生物反应调节剂、药剂或PEG。同时，该双特异性抗体可以连接至或融合至治疗剂上，该治疗剂包括可检测标记物，如放射性标记物、免疫调节剂、激素、酶、寡核苷酸、光活性治疗剂或诊断剂、细胞毒性剂，其可为药物或毒素，超声增强剂，非放射性标记物，它们的组合和其他这类本领域已知的成分。
此外，本发明还公开了一种上述双特异性抗体在制备免疫活化药物和/或肿瘤免疫治疗药物方面的应用。
本发明还公开了一种上述双特异性抗体在制备抑制TGF-β1诱导的促进肿瘤细胞迁移能力药物方面的应用。
本发明还公开了一种上述双特异性抗体在制备抑制TGF-β1诱导的促进EMT效应药物方面的应用。
本发明还公开了一种上述双特异性抗体在制备抑制TGF-β1诱导的Treg细胞分化药物方面的应用。
本发明还公开了一种上述双特异性抗体在制备逆转TGF-β1抑制的T细胞活化药物方面的应用。
本发明还公开了一种上述双特异性抗体在制备逆转PD-L1抑制的T细胞活化药物方面的应用。
本发明还公开了上述双特异性抗体的制备方法，它包括如下步骤：
1)质粒提取；
2)转染：步骤1)的所述质粒用于转染哺乳动物细胞；
3)细胞培养：步骤2)转染后哺乳动物细胞在37℃、体积分数为5％的CO2培养皿中培养7～10天；
4)离心分离；
5)纯化。
进一步地，步骤2)中所述哺乳动物细胞包括293细胞和/或CHO-S细胞。
进一步地，步骤5)中经纯化处理得到的双特异性抗体经HPLC-SEC检测纯度＞95％，同时不超过100％。
本发明的有益效果主要体现在如下：
1、本发明设计的双特异性抗体具备独特的结构，它与小鼠PD-L1以及TGF-β亲和力较高，不仅可以桥接起治疗学效应细胞，如T细胞、NK细胞和肿瘤细胞，也可以同时阻断驱动肿瘤的两个信号通路，达到协同治疗效应。在部分肿瘤微环境中，同时高表达的TGF-β和PD-1/PD-L1信号抑制了抗肿瘤免疫反应，靶向TGF-β和PD-L1的双特异性抗体在阻断免疫检查点的同时，中和负性因子，纠正肿瘤内的免疫微环境，增强抑瘤活性。更重要的是本申请设计的双特异性抗体抗肿瘤作用强，且无明显的毒副作用。
2、本发明设计的双特异性抗体制备方法简单，表达量高，表达纯度高，易于纯化。
附图说明
图1为本发明设计的双特异性抗体YM101的结构(A)和各组分蛋白一级结构示例性示意图(B)；
图2为采用ELISA检测图1中双特异性抗体YM101与小鼠PD-L1间亲和力测试图；
图3为采用ELISA检测图1中双特异性抗体YM101与小鼠TGF-β间亲和力测试图；其中，图3A代表TGF-β1，图3B代表TGF-β2，图3C代表TGF-β3；
图4为采用双抗原夹心法检测图1中双特异性抗体YM101同时结合小鼠PD-L1和TGF-β能力的测试图；其中，图4A代表PD-L1+TGF-β1，图4B代表PD-L1+TGF-β2，图4C代表PD-L1+TGF-β3；
图5为图1中双特异性抗体YM101对TGF-β信号介导的肿瘤细胞运动能力增强的拮抗作用示意图；其中，图5A代表NF639细胞小室迁移情况；图5B代表4T1细胞小室迁移情况；
图6为图1中双特异性抗体YM101对TGF-β信号介导的肿瘤细胞上皮间质转化过程影响的示意图；其中，图6A代表NF639细胞上皮间质转化标志物表达水平，图6B代表4T1细胞上皮间质转化标志物表达水平；
图7为图1中双特异性抗体YM101对TGF-β信号介导Treg分化过程的拮抗作用示意图；
图8为图1中双特异性抗体YM101对TGF-β信号介导T细胞活化抑制的拮抗作用示意图；
图9为图1中双特异性抗体YM101对PD-L1信号介导T细胞活化抑制的拮抗作用示意图；
图10为图1中双特异性抗体YM101在EMT-6原位瘤模型中的体内药效测试图；其中，图10A代表随机分组开始后小鼠肿瘤体积变化示意图；图10B代表随机分组开始后小鼠体重变化示意图；
图11为图1中双特异性抗体YM101在CT26和3LL皮下瘤模型中的体内药效测试图；其中，图11A代表CT26皮下瘤模型，图11B代表3LL皮下瘤模型。
具体实施方式
除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员常理解的相同含义。
本发明公开的双特异性抗体以高亲和力与抗原进行特异性结合，通过调节，如抑制或者激活各抗原所参与的信号传导通路来发挥生物学功能，如发挥效应子功能，具备协同的抗肿瘤活性。且抗体分子中的各条链之间能够正确耦合或配对，容易在体外的细胞培养中表达。
缩写
除非另外说明，否则本说明书中的缩写具有以下含义：
Ig：免疫球蛋白；
VL：轻链可变区；
VH：重链可变区；
LC：轻链；
HC：重链；
Treg细胞：一类具有免疫负调节功能的T细胞亚群，约占外周血CD4+T细胞的5～10％；
293细胞：人肾上皮细胞系；
CHO-S细胞：中国仓鼠卵巢细胞；
NF639：小鼠乳腺癌细胞；
4T1细胞：小鼠乳腺癌细胞；
EMT-6细胞：小鼠乳腺癌细胞；
CT26细胞：小鼠结肠癌细胞；
3LL细胞：小鼠肺癌细胞；
定义
如本文所用，术语“和/或”意指可选项中的任一种或可选项的两种或多种。
术语“抗体”包括全长抗体、全长抗体的抗原结合片段、以及包含抗体CDR、VH区或VL区的分子。抗体的实例包括单克隆抗体、重组产生的抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、免疫球蛋白、合成抗体、包含两个重链和两个轻链分子的四聚体抗体、抗体轻链单体、抗体重链单体、抗体轻链二聚体、抗体重链二聚体、抗体轻链-抗体重链对、胞内抗体、异源偶联抗体、单结构域抗体、单价抗体、单链抗体等。抗体可以是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY)、任何类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2)、或任何亚类(例如IgG2a或IgG2b)的免疫球蛋白分子。在某些实施方式中，本文描述的抗体是IgG抗体，或其类别(例如，人IgG1或IgG4)或亚类。
术语“分离的抗体”是这样的抗体，其已经与天然环境的组分分离和/或回收。
术语“抗原”指引发免疫应答的分子，这种应答可能涉及抗体产生或特异性免疫细胞的活化，或两者兼有。
术语“结合”意指结合作用对抗原是选择性的并且可以与不想要的或非特异性的相互作用区别。“特异性结合”指抗体以小于约1×10-6M、1×10-7M、1×10-8M、1×10-9M、1×10-10M、1×10-11M、1×10-12M或更小的解离常数(KD)与抗原结合，或以比其对非特异性抗原的亲和力大至少两倍的亲和力与抗原结合的能力。
术语“肿瘤”和“癌症”在本文中互换地使用，涵盖实体瘤或液体肿瘤。
术语“癌症”指向或描述哺乳洞中特征通常为细胞生长不受调节的生理疾患。
术语“肿瘤”指所有赘生性细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前和癌性细胞和组织。
术语“抗肿瘤作用”指可以通过多种手段展示的生物学效果，包括但不限于例如，肿瘤体积减少、肿瘤细胞数目减少、肿瘤细胞增殖减少或肿瘤细胞存活减少。
术语“药物组合物”指这样的组合物，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。
术语“治疗”指减缓、中断、阻滞、缓解、停止、降低、或逆转已存在的症状、病症、病况或疾病的进展或严重性。想要的治疗效果包括但不限于防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低病情进展速率、改善或缓和疾病状态、以及环节或改善预后。
术语“预防”包括对疾病或病症或特定疾病或病症的症状的发生或发展的抑制。
术语“T细胞活化”意指诱导、引起或刺激效应或记忆T细胞具有更新、持续或放大的生物学功能。
术语效应子功能：随免疫球蛋白同种型变动的归因于免疫球蛋白Fc区的那些生物活性。
术语“EMT效应”：全称epithelial–mesenchymal trasition，翻译为上皮间质转换，指的是上皮细胞在一些因素的作用下，失去极性及细胞间紧密连接和黏附连接，获得了浸润性和游走迁移能力，变成具备间质细胞形态和特性的细胞的改变。这种行为是可逆的。在EMT的发生过程中，上皮细胞极性丧失，与周围细胞和基质细胞的接触减少，细胞间的相互作用减少，细胞迁移和运动能力增强，同时细胞表型发生改变，丧失上皮表型，如角蛋白丝，E-cadherin，E-cadherin水平下降可以导致细胞的粘附力降低，使细胞获得易于侵袭和转移的特性，E-cadherin表达的丢失已经被认为是EMT最显著的特征。同时细胞获得间质表型，如Vimentin，N-cadherin等表达升高。目前EMT被看成是导致肿瘤进展的病理过程。在肿瘤的恶性演进过程中，EMT使得肿瘤细胞得以侵袭和转移，还可能使肿瘤细胞逃逸某些因素诱导的凋亡。因此，在肿瘤的研究中，EMT的发生预示肿瘤恶性进程。
本申请的实施方案提供了多种双特异性抗体，这些抗体包含两种或多种不同或相同的抗原结合结构域。结合抗原的抗原结合结构域为Fab，或ScFv，或重链可变区(VH)-轻链可变区(VL)之间非共价配对(Fv)。任何上述的抗体或多肽还可包括额外的多肽，例如，抗体N端的信号肽，该信号肽用于指导分泌，或如本文所述的其他异源多肽。
出于比较两种或更多种氨基酸序列的目的，第一氨基酸序列和第二氨基酸序列之间的“序列同源性”百分数(在本文也称为“氨基酸同源性”)可以通过用[第一氨基酸序列中与第二氨基酸序列中相应位置的氨基酸残基相同的氨基酸残基数目]除以[第一氨基酸序列中的氨基酸残基总数]并且乘以[100％]而计算，其中第二氨基酸序列中氨基酸残基的每一删除、插入、替换或添加―与第一氨基酸序列相比―都视作在单一氨基酸残基或位置上的差异，即，视作本发明所定义的“氨基酸差异”。
备选地，两种氨基酸序列之间的序列同一性程度可以使用已知的计算机算法进行计算，诸如NCBI胚细胞v2.0。例如，在WO 04/037999，EP 0 967 284，EP 1 085 089，WO 00/55318，WO 00/78972，WO 98/49185和GB 2 357 768-A中描述了用于确定序列同一性程度的一些其它的技术、计算机算法和设置。
通常，出于按照上文列出的计算方法来确定两种氨基酸序列之间的“序列同一性”的百分数的目的，将具有最大氨基酸残基数目的氨基酸序列视作“第一”氨基酸序列，并且将另一种氨基酸序列视作“第二”氨基酸序列。
此外，在确定两种氨基酸序列之间的序列同一性程度时，专业技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸替换，其通常可以描述为这样的氨基酸替换，即其中氨基酸残基被具有相似化学结构的另一种氨基酸残基替换，并且其对所述多肽的功能、活性或其它生物学特性几乎没有或者基本上没有影响。这种保守氨基酸替换是本领域内公知的，例如，从WO04/037999,GB-A-3357 768,WO 98/49185,WO 00/46383和WO 01/09300中可知；并且可以基于WO 04/037999以及WO 98/49185和其中所引用的其它参考文献的相关教导而选择这种替换的或优选类型和/或结合。
“保守氨基酸替换”是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替换。具有类似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义，其包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸，谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)，β-支链的侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，免疫球蛋白多肽的非必需氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替换。在另一些实施方案中，一串氨基酸可被结构上类似的氨基酸串替换，后者在顺序上和/或侧链家族的组成上不同。
在下表1中提供了的保守性氨基酸替换的非限制性实例，其中相似性得分为0或更高表示在这两个氨基酸之间有保守替换。
表1保守性氨基酸替换表
在一些实施方案中，所述保守替换优选地是这样的替换，即，其中下列组(a)–(e)内的一个氨基酸被同组内的另一氨基酸残基替换：(a)小的脂肪族、非极性或弱极性的残基：Ala，Ser，Thr，Pro和Gly；(b)极性、带负电荷的残基及其(不带电荷的)酰胺：Asp，Asn，Glu和Gln；(c)极性、带正电荷的残基：His，Arg和Lys；(d)大的脂肪族、非极性残基：Met，Leu，Ile，Val和Cys；以及(e)芳族残基：Phe，Tyr和Trp。
特别优选的保守替换如下：Ala替换成Gly或替换成Ser；Arg替换成Lys；Asn替换成Gln或替换成His；Asp替换成Glu；Cys替换成Ser；Gln替换成Asn；Glu替换成Asp；Gly替换成Ala或替换成Pro；His替换成Asn或替换成Gln；Ile替换成Leu或替换成Val；Leu替换成Ile或替换成Val；Lys替换成Arg，替换成Gln或替换成Glu；Met替换成Leu，替换成Tyr或替换成Ile；Phe替换成Met，替换成Leu或替换成Tyr；Ser替换成Thr；Thr替换成Ser；Trp替换成Tyr；Tyr替换成Trp；和/或Phe替换成Val，替换成Ile或替换成Leu。
为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
实施例1结合小鼠PD-L1和TGF-β的双特异性抗体YM101构建：
本发明利用常用的分子克隆技术，构建了结合小鼠PD-L1和TGF-β的双特异性抗体，该双特异性抗体含有四条多肽链，并且可以和两种抗原结合，抗原A为PD-L1，抗原B为TGF-β；具体是将双抗体对应的各条链的编码基因的DNA序列克隆至pcDNA3.1(-)真核表达载体(市售，购买于Invitrogen公司，货号：V79520)中。其中所得双特异性抗体包括图1所示结构，其具体序列信息如下表2。
表2双抗体对应序列信息
结合上述表2及图1可知，本发明构建的双特异性抗体包括两条对称分布且成形配对的长链和位于各所述长链外侧且分别与各所述长链配对的短链，各所述长链的氨基酸序列为SEQ ID NO:1且包含如下式I所示多肽链，各所述短链的氨基酸序列为SEQ ID NO:2且包含如下式II所示多肽链：
VHa-CH1-X1-VLb-X2-CH2-CH3 式I；
VLa-CL-X1-VHb 式II；
其中，所述式I中：
VHa代表抗小鼠PD-L1重链可变区；
CH1、CH2、CH3代表重链恒定区结构域；
VLb代表抗小鼠TGF-β区域的轻链可变区；
所述式II中：
VLa代表抗小鼠PD-L1轻链可变区；
CL代表轻链恒定区；
VHb代表抗小鼠TGF-β区域的重链可变区；
且，所述式I和式II中，X1、X2代表连接肽。
其中，式I中所述CH1与式II中所述CL之间化学键连接，如图1所示，为双硫键，两条所述长链的X2之间化学键连接，结合图1可知，左右两边各两条双硫键键接。
结合表2可知，发明还优选多肽链中所述X1的序列信息为GGGGSEAAAKGGGGS。所述X2的序列信息为GYPGGGGS。
实施例2结合小鼠PD-L1和TGF-β的双特异性抗体YM101的制备、表达及纯化：
按常规的质粒提取方法进行质粒的提取，并用于转染293细胞或CHO-S细胞，转染试剂可以是Lipofectamine2000(Thermo fisher,货号11668019)。转染后的293细胞或CHO细胞在37℃、体积分数为5％的CO2摇床中悬浮震荡培养7～10天。通过3000xg离心力离心处理收获上清并用0.22μm滤膜过滤。通过蛋白A亲和层析和阳离子交换层析纯化得到双特异性抗体。
通过在280nm处的UV吸光度以及每种蛋白对应的消光系数测定纯化的双抗体浓度。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析纯化后的蛋白，得到双特异性抗体分子量约为203KD。
通过高性能尺寸排阻色谱法(HPLC-SEC)测试各种双抗体的高聚体含量。收获上清液中双抗体含量在30～80mg/L，最终纯化获得经过HPLC-SEC检测的纯度＞95％的双特异性抗体。
实施例3结合小鼠PD-L1和TGF-β的双特异性抗体YM101的PD-L1端亲和力检测：
本实施例利用酶联免疫实验(ELISA)检测双特异性抗体和PD-L1之间的亲和力。
其中小鼠PD-L1(50010-M03H,Sino Biological)(200ng每孔，每孔100ul)包被聚丙烯酰胺平板，4℃过夜。用含0.05％Tween20的PBS洗板，含3％BSA的PBS在37℃的条件下封闭3小时。随后，加入100uL YM101或者其他抗体，37℃的条件下孵育1小时。洗板，加入100uLHRP标记的抗hIgG的二抗(1:5000,A80-319P,Bethyl)，37℃的条件下孵育1小时。洗板，每孔加入100uL ELISA显色底物(555214,BD Biosciences)。室温下反应15分钟，每孔加入100ul的2mol/L的HCl终止显色。在450nm的波长下检测吸光度值(Molecular Devices)。结果如图2所示，由图2可知，YM101可以有效的和PD-L1结合，其中，KD＝71pM。
其中，PBS-Tween20洗液：包含磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾，25℃时pH值＝7.3±0.2。
BSA的PBS：主要由氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、BSA组成，不含钙离子、镁离子，该试剂经过过滤除菌，常用于细胞培养过程中细胞的洗涤或其它常规用途，且BSA指牛血清清白蛋白。
实施例4结合小鼠PD-L1和TGF-β的双特异性抗体YM101的TGF-β端亲和力检测：
本实施例利用酶联免疫实验(ELISA)检测双特异性抗体和TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3之间的亲和力。
具体的，用TGF-β1(Z03411,Genscript)，TGF-β2(Z03429,Genscript),TGF-β3(Z03430,Genscript)(200ng每孔，每孔100uL)包被聚丙烯酰胺平板，4℃过夜。用含0.05％Tween20的PBS洗板，含3％BSA的PBS在37℃的条件下封闭3小时。随后，加入100uL YM101或者其他抗体，37℃的条件下孵育1小时。洗板，加入100uL HRP标记的抗hIgG的二抗(1:5000,A80-319P,Bethyl)，37℃的条件下孵育1小时。洗板，每孔加入100uL ELISA显色底物(555214,BD Biosciences)。室温下反应15分钟，每孔加入100ul的2mol/L的HCl终止显色。在450nm的波长下检测吸光度值(Molecular Devices)。如图3所示，结合图3可知，YM101可以有效的和TGF-β1(KD＝418pM)，TGF-β2(KD＝261pM)，TGF-β3(KD＝1719pM)结合。
实施例5结合小鼠PD-L1和TGF-β的双特异性抗体YM101同时结合PD-L1和TGF-β1的检测：
本实施例利用酶联免疫实验(ELISA)检测双特异性抗体同时结合PD-L1和TGF-β的能力。
生物素(Biotin)标记的PD-L1的按照Biotin标记试剂盒说明书制备(Biotinlabeling Kit-NH2,LK03,Dojindo)。用TGF-β1(Z03411,Genscript)，TGF-β2(Z03429,Genscript)，TGF-β3(Z03430,Genscript)(200ng每孔，每孔100ul)包被聚丙烯酰胺平板，4℃过夜。用含0.05％Tween20的PBS洗板，含3％BSA的PBS在37℃的条件下封闭3小时。随后，加入100uL YM101(200ng/mL)或者其他抗体，37℃的条件下孵育1小时。洗板，加入100uLBiotin标记的PD-L1，37℃的条件下孵育1小时。洗板，加入100uL过氧化物酶标记的链霉亲和素(1:5000,SA00001-0,Proteintech)。洗板，每孔加入100ul ELISA显色底物(555214,BDBiosciences)。室温下反应15分钟，每孔加入100ul的2mol/L的HCl终止显色。如图4所示，结合图4可知，YM101可以同时有效的和PD-L1以及TGF-β1(KD＝104pM)，TGF-β2(KD＝5348pM)，TGF-β3(KD＝729pM)结合。
实施例6表面等离子共振检测双特异性抗体YM101的PD-L1端亲和力：
本实施例采用蛋白A芯片以捕获法的方式固定YM101，抗原PD-L1作为分析物分别检测其与YM101结合的动力学和亲和力数据。
检测PD-L1抗原与YM101结合活性时，采用1×HBS-EP+buffer稀释YM101和PD-L1抗原，YM101抗体的捕获浓度为2μg/mL，PD-L1抗原与YM101结合的检测起始浓度均为5nM，在此基础上，2倍梯度稀释，即PD-L1抗原稀释的浓度分别为5nM、2.5nM、1.25nM、0.625nM、0.3125nM。样品检测前先进行5次Start up(1×HBS-EP+buffer)以平衡系统，然后进行Y101-IGY的捕获，捕获浓度为2mg/mL，流速10mL/min，结合120s；抗原依次从低浓度到高浓度开始进样，流速30mL/min，结合120s，解离600s；采用pH1.5甘氨酸(Glycine)溶液再生芯片，再生流速10μL/min，再生时间30s。检测结束后，采用软件Biacore T200 EvaluationSoftware以1:1Binding拟合方式对结果图谱进行数据拟合，得到抗体与抗原结合的动力学数据Ka、Kd和亲和力数据KD。结果如表3所示，由表3可知，YM101可以有效的和PD-L1结合。
表3.BIACORE检测YM101和PD-L1结合能力
捕获物 检测物 Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M)
YM101 PD-L1 5.945×105 7.128×10-3 1.199×10-8
实施例7表面等离子共振检测双特异性抗体YM101的TGF-β端亲和力：
本实施例采用蛋白A芯片以捕获法的方式固定YM101，抗原TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3作为分析物分别检测其与YM101结合的动力学和亲和力数据。
检测TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3抗原与YM101结合活性时，采用1×HBS-EP+buffer稀释YM101和TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3抗原，YM101抗体的捕获浓度为2μg/mL，TGF-β1抗原与YM101结合的检测起始浓度均为5nM，在此基础上，2倍梯度稀释，即TGF-β1抗原稀释的浓度分别为5nM、2.5nM、1.25nM、0.625nM、0.3125nM；TGF-β2、TGF-β3抗原与YM101结合的检测起始浓度均为20nM，在此基础上，2倍梯度稀释，即TGF-β2、TGF-β3抗原稀释的浓度分别为20nM、10nM、5nM、2.5nM、1.25nM。样品检测前先进行5次Start up(1×HBS-EP+buffer)以平衡系统，然后进行YM101的捕获，捕获浓度为2mg/mL，流速10mL/min，结合120s；抗原依次从低浓度到高浓度开始进样，流速30mL/min，结合120s，解离600s；采用pH1.5 Glycine甘氨酸(Glycine)溶液再生芯片，再生流速10μL/min，再生时间30s。检测结束后，采用软件BiacoreT200 Evaluation Software以1:1Binding拟合方式对结果图谱进行数据拟合，得到抗体与抗原结合的动力学数据Ka、Kd和亲和力数据KD。结果如表4所示，YM101可以有效的和TGF-β结合。
表4.BIACORE检测YM101和TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3结合能力
实施例8双特异性抗体YM101对TGF-β信号增强的肿瘤细胞运动能力的拮抗作用：
本实施例采用将生长状态良好的NF639细胞或者4T1细胞的培养基更换为含1％FBS的培养基，同时加入终浓度为10ng/mL的TGF-β1以及终浓度为100nM的YM101或抗PD-L1单抗或抗TGF-β单抗或hIgG，同时设置未加TGF-β1及抗体组作为对照。细胞继续培养96小时后，用胰酶消化并收集、计数各实验组细胞。按照5×104个细胞/孔接种到Transwell上室，上室中加入250μL含1％FBS的培养基，下室中加入750μL含20％FBS的培养基，将Transwell小室中的细胞继续培养12小时。到达培养时间后，细胞用4％多聚甲醛固定20分钟。弃去多聚甲醛，用结晶紫染色液染色15分钟。用PBS将小室洗涤3次，并用棉签小心擦去上室侧未迁移至下室的肿瘤细胞。显微镜下拍照，并取6个视野对迁移至小室下室侧的肿瘤细胞进行计数，并计算各组肿瘤细胞迁移至下室的细胞数平均值。如图5所示，TGF-β1可显著促进NF639细胞或者4T1细胞迁移能力，同时TGF-β1+抗TGF-β单抗及TGF-β1+YM101组中细胞数量较TGF-β1+hIgG组显著下降，降至与TGF-β1组相近水平，表明抗TGF-β单抗及YM101可抑制TGF-β1诱导的促进肿瘤细胞迁移能力，而阿替利珠单抗(Tecentriq)则无此抑制效应。
其中，NF639细胞和4T1细胞在实验前一天用含1％FBS的培养基饥饿处理。随后用TGF-β1以及YM101或抗PD-L1抗体或抗TGF-β抗体或hIgG处理4天，未用TGF-β1处理过的细胞作为对照组。按50000/孔的数量种到Transwell上室。
实施例9双特异性抗体YM101对TGF-β信号介导的肿瘤细胞上皮间质转化的拮抗作用：
本实施例采用将生长状态良好的NF639或者4T1细胞的培养基更换为含1％FBS的培养基，同时加入终浓度为10ng/mL的TGF-β1以及终浓度为100nM的YM101或抗PD-L1单抗或抗TGF-β单抗或hIgG，同时设置未加TGF-β1及抗体组作为对照。细胞继续培养96小时后，用胰酶消化并收集各实验组细胞；ProteinExt@Mammalian Total Protein Extraction Kit(DE101-01,Transgen)提取各实验组细胞总蛋白，并用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定各实验组总蛋白的浓度。取各实验组细胞总蛋白30ug点入电泳槽中，在150V电压下电泳30分钟。转膜；剪一张与凝胶尺寸相近的PVDF膜，左上角剪一缺口作为标记，将PVDF膜浸泡于100％甲醇溶液中5～10min，直到膜变半透明。用纯水冲洗膜2次。浸泡在盛转膜缓冲液的盒中。打开电泳仪，20V转30分钟。封闭：取出PVDF膜，用洗涤液TBST清洗，然后浸入封闭液，用镊子将膜移至含有25mL封闭液的平皿中，用脱色摇床室温缓慢摇匀1小时。一抗孵育：一抗1:1000浓度，用TBST稀释，4摄氏度过夜孵育。二抗孵育：二抗1:2000浓度，用TBST稀释，并与膜接触，室温下摇床缓慢摇匀1小时。孵育后，用TBST室温下在摇床上洗3次，每5min。显影：显影液(34577，Thermo Scientific)的A液和B液在容器里体积1:1混合，1min后，将膜与显色液充分接触。根据信号强弱调整曝光时间。
由图6可见，相比未采用TGF-β处理的NF639细胞或者4T1细胞(TGF-β组)，用TGF-β1处理后(TGF-β1+hIgG组)，NF639细胞或者4T1细胞的E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达下调，而N-钙粘蛋白(N-cadherin)及波形蛋白(Vimentin)，锌指转录因子(Snail)则表达上调，表明TGF-β1可显著促进NF639细胞或者4T1细胞的EMT效应，与TGF-β1+hIgG组相比，TGF-β1+抗TGF-β及TGF-β1+YM101组中细胞的E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达上调，而N-钙粘蛋白(N-cadherin)及波形蛋白(Vimentin)，锌指转录因子(Snail)则表达下调，表明抗TGF-β及YM101均可抑制TGF-β1诱导的促进EMT效应，而抗PD-L1单抗则无此抑制效应。
其中，NF639和4T1在实验前一天用含1％FBS的培养基饥饿处理。随后用TGF-β1以及YM101或抗PD-L1抗体或抗TGF-β抗体或hIgG处理4天，未用TGF-β1处理过的细胞作为对照组。4天后收集细胞沉淀，裂解蛋白，进行Western blotting。
实施例10双特异性抗体YM101对TGF-β信号介导Treg分化过程的拮抗作用：
本实施例采用分离小鼠脾细胞，经过红细胞裂解液(C3702-120ml,Beyotime)处理后，细胞计数并调整密度为106/mL。用抗CD3抗体(100302,BioLegend)包被96孔板，4℃过夜孵育。在2ug/mL抗CD28抗体，10ng/mLTGF-β1，100IU/ml IL-2的诱导培养基中，加上YM101或抗PD-L1抗体或抗TGF-β抗体或PD-L1抗体加上抗TGF-β抗体或IgG，未加TGF-β-的作为阴性对照。诱导时间为6天。6天后离心，先进行细胞活力染色(Fixable Viability Stain 700,564997,BD Biosciences)，表面染色(抗CD4抗体,100510,BioLegend；抗CD25抗体，102038,BioLegend)。随后对细胞进行破膜固定(eBioscienceTM FOXP3/Transcription FactorStaining Buffer Set,00-5523-00,Invitrogen)。最后，流式上机，检测Treg细胞(CD4+CD25+Foxp3+)比例。如图7所示，相比未用TGF-β处理组，用TGF-β1处理后(TGF-β1+hIgG组)，Treg水平增加，表明TGF-β1可诱导Treg的分化。与TGF-β1+hIgG组相比，TGF-β1+抗TGF-β及TGF-β1+YM101组中细胞的Treg水平下降，表明抗TGF-β单抗及YM101均可抑制TGF-β1诱导的Treg细胞分化。
其中，5ug/mL抗CD3抗体包板，在2ug/mL抗CD28抗体，10ng/mL TGF-β1，100IU/mLIL-2的诱导培养基中，加上YM101或抗PD-L1抗体或抗TGF-β抗体或PD-L1抗体加上抗TGF-β抗体或hIgG，未加TGF-β-的作为阴性对照。诱导时间为6天。6天后检测Treg细胞(CD4+CD25+Foxp3+)的比例。
实施例11双特异性抗体YM101对TGF-β信号介导T细胞活化抑制的拮抗作用：
本实施例公开了取小鼠脾脏，利用DynabeadsTMUntouchedTMMouse T Cells Kit(11413D,Invitrogen)分离小鼠T细胞，细胞计数并调整密度为106/mL。2ug/mL抗CD3(100302,BioLegend)包被96孔板，加入2ug/mL抗CD28抗体(102116,BioLegend)，10ng/mLTGF-β1，YM101或抗PD-L1抗体或抗TGF-β抗体或IgG，未加TGF-β-的作为阴性对照。4天后离心取细胞上清，利用Multi-Analyte Flow Assay Kit(741044,MU Th Cytokine Panel,BioLegend)检测T细胞活化相关细胞因子的水平。如图8所示，相比未用TGF-β处理组，用TGF-β1处理后(TGF-β1+hIgG组)，细胞因子水平下降，表明TGF-β1可抑制T细胞活化。与TGF-β1+hIgG组相比，TGF-β1+抗TGF-β及TGF-β1+YM101组中细胞因子水平增加，表明抗TGF-β单抗及YM101均可逆转TGF-β1抑制的T细胞活化。
其中，分离小鼠脾细胞，2ug/mL抗CD3抗体包板，加入2ug/mL抗CD28抗体，10ng/mLTGF-β1，YM101或抗PD-L1抗体或抗TGF-β抗体或hIgG，未加TGF-β的作为阴性对照。4天后检测T细胞活化相关细胞因子的水平。
实施例12双特异性抗体YM101对PD-L1信号介导T细胞活化抑制的拮抗作用：
本实施例公开了取小鼠脾脏，利用DynabeadsTMUntouchedTMMouse T Cells Kit(11413D,Invitrogen)分离小鼠T细胞，细胞计数并调整密度为106/mL。2ug/mL抗CD3(100302,BioLegend)包被96孔板，加入2ug/mL抗CD28抗体(102116,BioLegend),2ug/mLPD-L1，YM101或抗PD-L1抗体或抗TGF-β抗体或IgG，未加TGF-β-的作为阴性对照。4天后离心取细胞上清，利用Multi-Analyte Flow Assay Kit(741044,MU Th Cytokine Panel,BioLegend)检测IL-2的水平。如图9所示，相比未用PD-L1处理组，用PD-L1处理后(PD-L1+hIgG组)，IL-2水平下降，表明PD-L1可抑制T细胞活化。与PD-L1+hIgG组相比，PD-L1+抗PD-L1单抗及PD-L1+YM101组中IL-2水平增加，表明抗PD-L1单抗及YM101均可逆转PD-L1抑制的T细胞活化。
其中，分离小鼠脾细胞，2ug/mL抗CD3抗体包板，加入2ug/mL抗CD28抗体，2ug/mLPD-L1，YM101或抗PD-L1抗体或抗TGF-β抗体或hIgG，未加TGF-β-的作为阴性对照。4天后检测细胞上清IL-2的水平。
实施例13双特异性抗体YM101在EMT-6原位瘤模型中的体内药效：
本实施例按照培养条件培养足够的EMT-6细胞，在细胞处于对数生长期时，收集细胞，计数。以5×104/只的量将EMT-6细胞接种在小鼠右侧脂肪垫上。接种后，待肿瘤生长到100mm3大小时(约接种后7天)，每8只小鼠分为一组，随机分为生理盐水组，1mg/kg YM101治疗组，3mg/kg YM101治疗组，9mg/kg YM101治疗组，27mg/kg YM101治疗组。随后隔日给药，共给药六次，待小鼠肿瘤体积超过2500mm3时终止实验，对小鼠进行安乐死处理。如图10所示，不同剂量的YM101均可有效抑制小鼠肿瘤的生长。其中，9mg/kg YM101和27mg/kg YM101抑制效果最好。在治疗过程中，小鼠没有出现明显体重下降，耐受整个治疗过程。其中，本实施例试验用小鼠为同种类型，同种大小。
实施例14双特异性抗体YM101在CT26和3LL皮下瘤模型中的体内药效：
本实施例按照培养条件培养足够的CT26和3LL细胞，在细胞处于对数生长期时，收集细胞，计数。以1×106/只的量将CT26或者3LL细胞接种在小鼠右侧腹股沟处。接种后，待肿瘤生长到100mm3大小时(约接种后7天)，每8只小鼠分为一组，随机分为生理盐水组，6.6mg/kg抗PD-L1单抗治疗组，6.6mg/kg抗TGF-β单抗治疗组，9mg/kg YM101治疗组(其中抗体均为等摩尔量)。随后隔日给药，共给药六次，待小鼠肿瘤体积超过2500mm3时终止实验，对小鼠进行安乐死处理。如图11所示，YM101和抗PD-L1单抗均可有效抑制小鼠肿瘤的生长。其中YM101的抗肿瘤作用要强于抗PD-L1单抗。其中，本实施例试验用小鼠为同种类型，同种大小。
以上实施例仅为最佳举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。除上述实施例外，本发明还有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims (9)

1.一种结合小鼠PD-L1和TGF-β的双特异性抗体，其特征在于，它包括两条对称分布且成形配对的长链和位于各所述长链外侧且分别与各所述长链配对的短链，各所述长链的氨基酸序列包含如下式I所示多肽链，各所述短链的氨基酸序列包含如下式II所示多肽链：
VHa-CH1-X1-VLb-X2-CH2-CH3式I；
VLa-CL-X1-VHb式II；
其中，所述式I中：
VHa代表抗小鼠PD-L1重链可变区；
CH1、CH2、CH3代表重链恒定区结构域；
VLb代表抗小鼠TGF-β区域的轻链可变区；
所述式II中：
VLa代表抗小鼠PD-L1轻链可变区；
CL代表轻链恒定区；
VHb代表抗小鼠TGF-β区域的重链可变区；
且，所述式I和式II中，X1、X2代表连接肽；
式I中所述CH1与式II中所述CL之间化学键连接；
两条所述长链的X2之间化学键连接；
所述X1的序列信息为GGGGSEAAAKGGGGS；
所述X2的序列信息为GYPGGGGS；
所述长链的氨基酸序列为：
ALTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFTFSDRGMHWVRQAPGKGLEWVGAISRRGSTTTYAPAVKGRATITRDNGQSTVRLQLNNLTAEDTATYFCAKNDDSVGIVTTSTIDAWGHGTEVIVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGGGGSEAAAKGGGGSETVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSLGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRAPGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYADSPITFGQGTRLEIKGYPGGGGSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEAPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；
所述短链的氨基酸序列为：
QAALTQPSSVSANLGGTVKITCSGGSGSYGWYQQKAPGSAPVSLIYDNTNRPSDIPSRFSGALSGSTATLTITGVQAEDEAVYYCGSRDSSNAGSVFGAGTTLTVLRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSEAAAKGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSNVISWVRQAPGQGLEWMGGVIPIVDIANYAQRFKGRVTITADESTSTTYMELSSLRSEDTAVYYCASTLGLVLDAMDYWGQGTLVTVSS。
2.一种药物组合物，其包括权利要求1所述双特异性抗体和药学上可接受的载体。
3.一种权利要求1所述双特异性抗体在制备用于治疗肿瘤免疫药物方面中的应用，其特征在于，所述肿瘤包含乳腺癌、结肠癌或肺癌中的任意一种。
4.根据权利要求3所述双特异性抗体在制备用于治疗肿瘤免疫药物方面中的应用，其特征在于，所述药物为用于抑制TGF-β1诱导的促进肿瘤细胞迁移能力。
5.根据权利要求3所述双特异性抗体在制备用于治疗肿瘤免疫药物方面中的应用，其特征在于，所述药物为用于抑制TGF-β1诱导的促进EMT效应。
6.根据权利要求3所述双特异性抗体在制备用于治疗肿瘤免疫药物方面中的应用，其特征在于，所述药物为用于抑制TGF-β1诱导的Treg细胞分化。
7.根据权利要求3所述双特异性抗体在制备用于治疗肿瘤免疫药物方面中的应用，其特征在于，所述药物为用于逆转TGF-β1抑制的T细胞活化。
8.根据权利要求3所述双特异性抗体在制备用于治疗肿瘤免疫药物方面中的应用，其特征在于，所述药物为用于逆转PD-L1抑制的T细胞活化。
9.一种权利要求1所述双特异性抗体的制备方法，其特征在于，它包括如下步骤：
1)构建质粒；
2)转染：步骤1)的所述质粒用于转染哺乳动物细胞；
3)细胞培养：步骤2)转染后哺乳动物细胞在37℃、体积分数为5％的CO2培养皿中培养7～10天；
4)离心分离；
5)纯化；步骤2)中所述哺乳动物细胞包括293细胞和/或CHO-S细胞；步骤5)中经纯化处理得到的双特异性抗体经HPLC-SEC检测纯度>95％。
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