CN103476800A - 融合蛋白 - Google Patents
融合蛋白 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103476800A CN103476800A CN2012800181044A CN201280018104A CN103476800A CN 103476800 A CN103476800 A CN 103476800A CN 2012800181044 A CN2012800181044 A CN 2012800181044A CN 201280018104 A CN201280018104 A CN 201280018104A CN 103476800 A CN103476800 A CN 103476800A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fusion rotein
- gly
- albumen
- aminoacid sequence
- autoantibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
Abstract
本发明提供可特别抑制自身抗体,可有效预防或治疗自身抗体类型的自身免疫疾病,及可以对于工业产生足够的量表达的新融合蛋白。融合蛋白,其特征在于,蛋白(X)经由一个或更多氨基酸组成的接头肽(L)连接于蛋白(A),所述蛋白(X)含有被自身抗体识别的位点,所述自身抗体是自身抗体类型的自身免疫疾病的成因,所述蛋白(A)含有呈现抗体-依赖性细胞毒性的抗体重链恒定区的片段,其中蛋白(X)、接头肽(L)和蛋白(A)利用肽键以从N末端到C末端的顺序连接。
Description
【技术领域】
本发明涉及可通过中和自身抗体及抑制自身抗体产生有效预防和治疗自身抗体类型的自身免疫疾病诸如重症肌无力的融合蛋白。更具体而言,本发明涉及具有必需和足够的预防和治疗的强功能且也在保持其稳定的结构的同时表达的结果在细胞之外分泌由此甚至能应对工业产生的融合蛋白。
【背景技术】
免疫系统固有地具有识别及消除与本身不同的外源体诸如细菌或病毒的作用,但有时,其由于先天性或获取的异常与自身正常细胞和组织过度地反应并攻击它们。自身免疫疾病是由该状态造成的疾病的通用名称。在它们之中,由自身抗体(识别自身细胞和组织为抗原的抗体)与自身抗原(自身细胞和组织)反应导致的疾病被称为“自身抗体类型的自身免疫疾病”。自身抗体类型的自身免疫疾病的例包括重症肌无力,自身免疫类型的溶血性贫血,特发性血小板减少性紫癜,自身免疫类型的中性粒细胞减少症,由抗-TSH抗体导致的甲状腺功能亢进或桥本病,自身抗体类型的急性脑炎,及非-疱疹边缘脑炎。
至于自身抗体类型的自身免疫疾病的治疗方法,已常进行甾体剂或免疫抑制剂的施用。但是,任何那些药物不特别抑制作为疾病的根本性的成因的自身抗体,但通常总体抑制免疫反应。因此,关于QOL(生命质量)而言,药物无特异性,且方法不是足够有效的治疗方法。
关于作为自身抗体类型的自身免疫疾病的代表性的例之一的重症肌无力,尚无已-知道的用于根本性的治疗的治疗剂,只有以上甾体剂,以上免疫抑制剂,胆碱酯酶抑制物,血浆交换治疗,用于静脉内注射免疫球蛋白制备物,及胸腺切除术已通常使用(cf.非-专利文献1,非专利文献2,非专利文献3,及非专利文献4)。
以上这些中,使用胆碱酯酶抑制物难以进行其剂量设置。而且,考虑到副作用,静脉内注射硫酸阿托品或呼吸道确保可为有时必需。而且,当长时期高剂量施用时,其效应降低及,且一些情况中,可发生胆碱能危机,这被认为是问题。此剂不旨在治疗性治疗,仅仅是症状性治疗。根本地,应使用达到效应的最小剂量,且如果可能,应避免长期施用。
关于甾体剂,它们的副作用被认为有问题和副作用的控制非常重要。此外,该剂难以长时期持续的施用,与使用非类固醇类免疫抑制剂诸如他克莫司或环孢菌素一起控制是必需的。但是,如已提及,以上剂仅仅用于症状性治疗,而不是根本性的治疗手段。
关于胸腺切除术,尽管其显示一些效应,但患者有切除手术和成本方面的忧虑。有另一问题是其不可应用于其免疫功能尚未发育的小儿童及患免疫缺陷疾病的患者。此外,尽管其呈现一些效应,需要达10年单位的长年直到确认效应。其不能避免共同地进行其他症状性治疗,直到确认效应。有仅在少于50%的患者中确认效应的再一个问题。
关于血浆交换治疗,一次治疗需要高到不小于一百万日元的成本。根据Diagnosis Procedure Combination系统的重症肌无力的医疗消费的补贴仅是约60万日元,医疗现场的负担大。而且,有效应持续时间短至仅约1个月的问题。
作为重症肌无力的治疗方法,近年已确认γ-球蛋白制备物的有效性,一些药学生产商是现在正对其进行临床测试。但是,由于γ-球蛋白制备物是源于人血浆的生物学制备物,可有被未知的病毒等感染的风险。此外,γ-球蛋白制备物的剂量高(400mg/kg,持续施用5天),患者和医疗现场的负担预期会显著地高。另一方面,效应持续时间被认为与血浆交换治疗相同或仅略更长。
总之,重症肌无力治疗中的问题是,至于使用低-分子药物的治疗,其仅仅是临时症状性治疗,而至于血浆交换治疗,γ-球蛋白制备物和胸腺切除术,效应和成本方面的问题仍留待解决。
考虑到以上问题,本发明人认为,如果可以重组蛋白制备仅与已被认为是重症肌无力的成因的抗-乙酰胆碱受体自身抗体反应的抗体,会不给患者造成负担地以小剂量预期有效效应。本发明人由此制备了nAChRα1亚基N-端细胞外区与抗体重链恒定区的融合蛋白作为抗独特型抗体的代用品,以便中和抗-乙酰胆碱受体自身抗体。由于此融合蛋白具有中和自身抗体,并也损伤自身抗体产生细胞的活性,其已被判断对于作为自身抗体类型的自身免疫疾病之一的重症肌无力非常有效。但是,此融合蛋白具有低表达量,且其工业产生处于难的状态(cf.专利文献1)。
【现有技术文献】
【专利文献】
专利文献1:日本专利No.4495776
【非专利文献】
非专利文献1:Trends of clinical test studies for myastheniagravis,Nippon Rinsho,Vol.66,No.6,pp.1155-1157
非专利文献2:High-dose therapy by immunoglobulin,ShinkeiChiryo,Vol.25,No.6,pp.689-692
非专利文献3:“Guideline for the Treatment of Myasthenia gravis(MG)”,Report of1995by the Search and Study Team for SpecialDiseases and Immunological Neural Diseases,Health and WelfareMinistry
非专利文献4:“Current Status of Treatment and Prognosis ofMyasthenia Gravis in Japan”,Memorial Lecture at the Fourth MGForum
【发明内容】
【发明要解决的技术课题】
已基于像那样的现有技术的当前状态创建本发明,且本发明的目的是提供可特别抑制自身抗体,可有效预防或治疗自身抗体类型的自身免疫疾病,及可以对于工业产生足够的量表达的新融合蛋白。本发明的另一目的是提供生产融合蛋白的方法。
【解决课题的技术方案】
以上专利文献1中的融合蛋白可在2点预期其作为重症肌无力的治疗剂的效应:自身抗体的产生的抑制和产生的自身抗体的中和。但是,在受体蛋白与抗体重链恒定区的融合蛋白中,似乎由结构位阻,表达的蛋白的纯度等导致的小表达量是问题。
在该环境下,本发明人进行了增强融合蛋白的表达的量和表达的蛋白的纯度的各种调查,并注意到,在专利文献1的融合蛋白中,各受体蛋白和抗体重链恒定区处于复杂的结构,其中,由于它们的位阻,在融合蛋白表达期间得到不正确的二硫键,结果,达不到足够的纯度及表达的量。作为解决以上问题的手段,本发明人想出了在受体蛋白和抗体重链恒定区之间插入柔性的接头肽的融合蛋白。由此,本发明人想到,各受体蛋白和抗体重链恒定区的结构通过插入柔性的接头肽保持固有稳定的结构。本发明人然后想到,作为各区中稳定的结构形成的结果,分泌到细胞外的效应被促进,导致融合蛋白的更多得多的产生,此外,融合蛋白本身的稳定性增强,其中可使得分解的产物的比例显著地小,和纯度的改善现在也变得可能。考虑到以上,本发明人制备了插入此柔性的接头肽的融合蛋白并发现,在此融合蛋白中,相比无接头肽的常规融合的蛋白,表达的量大大增强,及表达的蛋白的纯度也显著地改善。本发明人也发现了,相比无接头肽的常规融合的蛋白,插入柔性的接头肽的融合蛋白,对于自身抗体的中和效应显著地增强,及特异性抑制自身抗体产生细胞的效应也强。本发明人还发现了当抗体重链恒定区(A)定位在C末端侧,相比在N末端侧,更强烈达到细胞毒性。本发明人基于那些发现完成了本发明。
由此,根据本发明,提供融合蛋白,其特征在于,蛋白(X)经由一个或更多氨基酸组成的接头肽(L)连接于蛋白(A),所述蛋白(X)含有被自身抗体识别的位点,所述自身抗体是自身抗体类型的自身免疫疾病的成因,所述蛋白(A)含有呈现抗体-依赖性细胞毒性的抗体重链恒定区的片段,其中蛋白(X)、接头肽(L)和蛋白(A)利用肽键以从N末端到C末端的顺序连接。
而且,根据本发明,也提供生产以上融合蛋白的方法,其特征在于,将编码以上融合蛋白的DNA插入细胞表达载体,并将此载体导入宿主细胞以表达融合蛋白。还提供预防和治疗自身抗体类型的自身免疫疾病的组合物,其特征在于,含有以上融合蛋白作为有效成分。
【发明效果】
本发明的融合蛋白中和患自身抗体类型的自身免疫疾病的患者的身体中存在的自身抗体,也抑制自身抗体产生,由此其可特别抑制自身抗体。此外,本发明的融合蛋白具有高表达量和纯度,并可作为药物以实际生产规模提供。因此,当使用本发明的融合蛋白时,有效预防和治疗各种自身抗体类型的自身免疫疾病诸如重症肌无力现在是可能的。
【附图说明】
图1是实施例中制备的表达融合蛋白α1-Fc的区的模式图。
图2是实施例中制备的表达融合蛋白α1-L-Fc的区的模式图。
图3是实施例中制备的表达融合蛋白α1-L2-Fc的区的模式图。
图4是实施例中制备的表达融合蛋白Fc-L2-α1的区的模式图。
图5显示在瞬时表达之后纯化的融合蛋白α1-Fc和融合蛋白α1-L-Fc的在还原的状态的SDS-PAGE之后的银-染色的像(左侧)和蛋白印迹像(右侧)。
图6显示融合蛋白α1-Fc和融合蛋白α1-L-Fc与蛋白A和α-金环蛇毒素的结合能力。◆显示融合蛋白α1-Fc的结果及▲显示融合蛋白α1-L-Fc的结果。
图7显示融合蛋白α1-Fc和融合蛋白α1-L-Fc与抗-nAChRα1亚基自身抗体的结合能力。◆显示融合蛋白α1-Fc的结果及▲显示融合蛋白α1-L-Fc的结果。
图8A显示融合蛋白α1-Fc与杂交瘤Mab35细胞的结合。融合蛋白的添加的浓度显示于图8A。
图8B显示融合蛋白α1-L-Fc与杂交瘤Mab35细胞的结合。融合蛋白的添加的浓度显示于图8B。
图9显示对于1μg/mL的自身抗体mAb35与TE671细胞结合的,100μg/mL的融合蛋白α1-Fc的结合抑制活性(左侧)和相同的浓度的融合蛋白α1-L-Fc的结合抑制活性(右侧)。
图10显示融合蛋白α1-Fc和融合蛋白α1-L-Fc对由自身抗体mAb35诱导的重症肌无力-样症状的改善效应。横坐标显示时间和纵坐标显示重症肌无力-样症状的分值。◆显示用生理学盐水施用的组,◆显示用静脉内注射用的球蛋白制备物施用的组,Δ及▲各显示用融合蛋白α1-Fc施用的组,及□及■各显示用融合蛋白α1-L-Fc施用的组。
【实施方式】
本发明的融合蛋白具有这样的结构,其中含有被作为自身抗体类型的自身免疫疾病的成因的自身抗体识别的位点的蛋白(X)经由一个或更多氨基酸组成的接头肽(L)连接于含有呈现抗体重链恒定区的抗体-依赖性细胞毒性的片段的蛋白(A)。
蛋白(X)对应于针对自身抗体的自身抗原或其一部分,及作为患者的自身抗原的代用品起到结合于自身抗体的诱饵的作用。由此,当将本发明的融合蛋白施用于患自身抗体类型的自身免疫疾病的患者时,患者身体内的自身抗体将融合蛋白中的蛋白(X)部分识别为自身抗原及结合于此部分。由于结合的自身抗体无法再结合于固有地存在于患者身体的自身抗原,自身抗体可由此方法中和,从而可抑制由患者的自身抗体与自身抗原的结合的自身免疫疾病的症状的产生。尽管自身抗体不是一种特异性抗体,但是由一组各种抗体组成,任何抗体在具有识别自身抗原的功能的视点上共同。因此,当使用发挥自身抗原的诱饵的作用的本发明的融合蛋白时,一种融合蛋白可中和一组各种抗体,由此无需独立地制备对于各各种抗体的各融合蛋白。
本文定义的“抗体”代表IgA、IgD、IgE、IgG、IgM的各类及其各亚类中的全部抗体。“抗体恒定区”代表各类中的抗体或各亚类中的抗体和/或其抗体重链恒定区的组合。添加到抗体重链恒定区的糖链结构无特定限制。
本发明的融合蛋白含有包含抗体重链恒定区的片段的蛋白(A)以及发挥自身抗原的诱饵的作用的蛋白(X)。此蛋白(A)也起到呈现抗体-依赖性细胞毒性(ADCC活性)的作用。自身抗体由血中的B细胞产生。与自身抗体具有相同的抗原结合位点的细胞表面呈递类型的抗体作为B细胞受体存在于B细胞表面。因此,当将本发明的融合蛋白施用于患者时,一部分融合蛋白结合于上述患者身体中的自身抗体,而余下融合蛋白结合于产生自身抗体的B细胞(B细胞受体)表面上的抗体。当本发明的融合蛋白结合于B细胞受体时,效应细胞诸如NK细胞经效应细胞的Fc受体结合于融合蛋白的蛋白(A),呈现抗体-依赖性细胞毒性(ADCC活性),损伤结合于融合蛋白的B细胞,及抑制自身抗体的产生。像这样,根据本发明,结果不仅是身体内存在的自身抗体被中和而抑制自身抗体与自身抗原的结合,而且可选择性地损伤作为自身抗体的产生源的特定B细胞。因此,本发明的融合蛋白可由自身抗体产生的抑制和产生的自身抗体的中和的2种方式预防或治疗自身抗体类型的自身免疫疾病。
本发明的融合蛋白包括柔性的由一个或更多氨基酸组成的接头肽(L)。插入该接头肽的结果,各受体蛋白和抗体重链恒定区的结构成为稳定的结构,由此融合蛋白变得作为整体稳定。
本发明的特征在于以自N末端到C末端(X)-(L)-(A)的顺序的受体蛋白(X),接头肽(L)和抗体重链恒定区(A)序列。理论上,抗体重链恒定区(A)定位在N末端侧和C末端侧的任何侧,但本发明人发现了,抗体重链恒定区(A)应定位在与受体结合中位阻少的C末端侧,为有效达到抗体重链恒定区(A)的抗体-依赖性细胞毒性(ADCC活性)的目的。也假定,当受体蛋白(X)定位在N末端时,也可强烈达到其作为诱饵的效应。
本发明的融合蛋白中的蛋白(X)对应于自身抗原,或其一部分,对应于作为待预防或治疗的患者的自身抗体类型的自身免疫疾病的成因的自身抗体。依赖于待预防或治疗的患者的自身免疫疾病决定蛋白(X)。例如,在预防和治疗重症肌无力的情况中,由于重症肌无力是由这样的病因造成的疾病:抗-烟碱乙酰胆碱受体抗体(自身抗体)以神经-肌肉连接结合作为神经递质乙酰胆碱的肌肉侧的接收器的烟碱乙酰胆碱受体(自身抗原),由此神经/肌肉传递被乙酰胆碱抑制,蛋白(X)可为是自身抗原的烟碱乙酰胆碱受体。类似地,在预防和治疗自身免疫类型的溶血性贫血的情况中,蛋白(X)可为红细胞表面标志物;在预防和治疗特发性血小板减少性紫癜的情况中,蛋白(X)可为血小板表面标志物;在预防和治疗自身免疫类型的中性粒细胞减少症的情况中,蛋白(X)可为嗜中性粒细胞表面标志物;在预防和治疗由抗-TSH抗体导致的甲状腺功能亢进或原发性甲状腺功能减退(桥本病)的情况中,蛋白(X)可为TSH;及在预防或治疗自身抗体类型的脑炎和脑病的情况中,蛋白(X)可为NMDA受体,AMPA受体等。
蛋白(X)没必需是全受体或全标志物,但可为其一部分,其中含有自身抗体的识别位点。例如,在重症肌无力的情况中,以上烟碱乙酰胆碱受体是由4种亚基组成的五聚体蛋白,及在它们之中,自身抗体的识别位点存在于α1亚基的同种型1(仅在骨骼肌中表达的同种型及由SEQ ID NO:13显示)和同种型2(在骨骼肌,脑,心脏,肾和肺中表达的同种型,及由SEQ ID NO:14显示)的N-端细胞外区。因此,在重症肌无力的情况中,蛋白(X)可为烟碱乙酰胆碱受体α1(nAChRα1)亚基或其一部分。为了更具有特异性,其可为同种型1和/或其同种型2的nAChRα1亚基或一部分及,为了更具有特异性,其可由nAChRα1亚基的同种型1和/或同种型2的N-端细胞外区的氨基酸序列组成。
在像这样的氨基酸序列中,一个或几个(诸如1~20,优选1~10,及更优选1~7)氨基酸可被删除,添加和/或取代,只要不损伤其同源性。关于其范围,一例是具有70%或更高,优选80%或更高,及更优选90%或更高序列同一性的氨基酸序列。氨基酸序列的同源性可通过使用同源性计算算法NCBI BLAST(美国生物技术信息中心基本局部比对搜索工具)在期望值是10,允许间隔,矩阵是BLOSUM62及关掉过滤的条件下计算。为了更具有特异性,导入像那样的缺失,添加和/或取代的氨基酸序列可通过使用可商购的试剂盒诸如定点诱变试剂盒(生产自Takara Bio Inc.)或QuickChange定点诱变试剂盒(生产自STRATAGENE)取代对应DNA序列而容易制备。利用人工基因合成技术直接制备以上氨基酸序列也是可能的。
本发明的融合蛋白中的蛋白(A)是含有抗体重链恒定区的片段的蛋白,且其可为,例如,抗体重链Fc区,抗体重链恒定区或其一部分。“抗体”包括IgA,IgD,IgE,IgG和IgM的全部类和也包括其全部亚类。“抗体重链恒定区”是排除抗体重链的可变区的部分。例如,当所述类是IgG时,抗体重链恒定区包含CH1区,铰链区,CH2区和CH3区的组合。抗体重链恒定区也可为以上各类或其各亚类或重链恒定区的组合。例如,当该类是IgG时,抗体重链Fc区包含铰链区,CH2区和CH3区的组合。在人抗体IgG1的情况中,可特别例示SEQID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸序列。SEQ ID NO:11和SEQID NO:12是人抗体IgG1Fc区的序列。SEQ ID NO:11被认为是亚洲人中多见的类型而SEQ ID NO:12被认为是欧洲和美洲人中多见的类型。
本发明的融合蛋白中的肽接头(L)由一个或更多氨基酸,优选5~45,更优选10~20,及最优选16个氨基酸组成。此肽接头可含有Gly-Ser元件或Ser-Gly。
肽接头(L)的特定例包括含有由下列表示的氨基酸序列的序列:
式(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n,
式Pro-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n,
式Gly-Ser(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n,
式(Ser-Ser-Ser-Ser-Gly)n,或者
式(Ser-Ser-Ser-Ser-Gly)n-Ser-Pro
(式中,n是1~8的整数)。
以上中,优选由第1和第2式表示的氨基酸序列。式中的重复数n优选是1~4的整数,更优选是3。
肽接头(L)的其他特定例包括含有具有基于氨基酸Gly和/或氨基酸Ser的结构的序列的肽接头(诸如含有具有以下序列的序列的肽接头:Gly-Gly-Ser-Ser-Arg-Gly-Gly,Gly-Gly-Ser-Ser-Arg-Ser-Ser-Ser-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly或Glu-Phe-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly)。
肽接头(L)的仍其他特定例包括具有以下氨基酸序列或含有基于以下序列应用改良的氨基酸序列的那些。
(A)Asp-Ala-Ala-Ala-Lys-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Asp-Ala-Ala-Ala-Arg-Glu-Ala-Ala-Ala-Arg-Asp-Ala-Ala-Ala-Lys
(B)Asn-Val-Asp-His-Lys-Pro-Ser-Asn-Thr-Lys-Val-Asp-Lys-Arg
本发明的融合蛋白的特定例是由SEQ ID NO:10的氨基酸序列组成的蛋白。此融合蛋白具有蛋白(X)、接头肽(L)和蛋白(A)利用肽键以从N末端到C末端的顺序连接的结构。蛋白(X)对应于由nAChRα1亚基的同种型1的N-端细胞外区的氨基酸序列中的第1~第210位的氨基酸组成的氨基酸序列。接头肽(L)对应于Pro-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3。蛋白(A)对应于SEQ ID NO:11的氨基酸序列。在此融合蛋白的氨基酸序列中,如上所述,一个或几个(诸如1~20,优选1~10,更优选1~7,及最优选1~3)氨基酸可被删除,添加和/或取代,只要不损伤同源性。
本发明的融合蛋白可根据常规公知的基因加工技术生产。由此,例如,如果必需扩增编码蛋白(X)的DNA,编码接头肽(L)的DNA和编码蛋白(A)的DNA,那些DNA彼此结合,将得到的DNA插入细胞表达载体,并将宿主细胞用该载体转染以表达融合蛋白,由此可生产本发明的融合蛋白。DNA的扩增可由,例如,PCR方法进行。扩增的DNA的结合可,例如,由重叠延伸PCR方法进行。设计待表达的融合蛋白的氨基酸序列,以便直接制备人工合成基因也是可能的。优选的是,表达载体包括用于增强表达效率的启动子诸如CMV或SV40和用于自培养上清液容易回收表达的融合蛋白的分泌信号序列诸如抗体重链信号序列或抗体κ链信号序列。也优选的是,将Kozak序列插入用于增强表达的蛋白量的转录起始密码子的上游。在本融合蛋白的情况中,作为膜蛋白的nAChRα1亚基存在于N末端侧,此外,本膜蛋白在N末端侧具有细胞外区,因此,表达的蛋白和信号序列的兼容性是良好的,当使用nAChRα1亚基的原信号序列时导致良好分泌表达。至于表达宿主细胞,可使用哺乳动物细胞,酵母,动物细胞,昆虫细胞,植物细胞,细菌细胞(大肠埃希氏菌(Escherichia coli)等)等。在它们之中,优选动物细胞且特别优选CHO细胞,HEK293细胞,等。而且,当表达融合蛋白的核酸序列插入到染色体中时,作为转基因动物的表达也是可能的。表达的融合蛋白可由常规手段回收和可由,例如,蛋白A柱方法手段纯化。
现在,会例证用于预防和治疗自身抗体类型的自身免疫疾病的组合物,其特征在于包含本发明的融合蛋白作为有效成分。该组合物的特定制备形式的例是注射剂和粘膜吸收体。在注射的情况中,将稳定剂诸如糖,多元醇,白蛋白或表面活性剂,等张化剂诸如盐,等添加到以上-制备的本发明的融合蛋白,得到的产物是为保存冷冻干燥的,及通过在使用时溶解于注射用水而施用。尽管对于冷冻干燥的产品中本发明的融合蛋白的含量无特定限制,其例如是0.01~200mg/g和优选是0.1~100mg/g。尽管对溶解的注射剂中融合蛋白的含量无特定限制,其例如是0.01~200mg/mL和优选0.1~100mg/mL。注射剂的情况中施用方法的例包括静脉内施用,肌内施用和皮下施用。在粘膜吸收体的情况中,将本发明的融合蛋白,例如,与赋形剂和稳定剂一起制造成剂型,以便给持续的-释放粘膜吸收体制备物,且其可经口腔粘膜,鼻粘膜,眼睑,等施用。尽管对粘膜吸收体中本发明的融合蛋白的含量无特定限制,其例如是0.1~300mg/mL和优选0.5~100mg/mL。本发明的组合物的剂量依赖于目标的治疗效果,施用方法,治疗时期,龄,体重,等改变,且其对于成年通常是10μg/kg~50mg/kg/天。
【实施例】
在下文会通过实施例更详细说明本发明,但本发明不限于这些例。
(1)α1-Fc融合蛋白的表达载体的构建(比较例)
基于已-知道的烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)α1亚基的同种型1蛋白序列信息(登录号No.:P02708-2)从nAChRα1亚基提取信号序列和N-端细胞外区的序列。也基于人抗体IgG1恒定区的蛋白序列信息(登录号No.:P01857)提取Fc区的序列。那之后,设计462个残基的蛋白序列,其中二者序列融合。
为了进行使用中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)的融合蛋白的表达,进行适合于CHO细胞的核酸序列的优化及制备核酸序列,其中利用人工基因合成技术将限制酶识别序列及kozak序列加到5’侧而将终止密码子和限制酶识别序列加到3’侧(SEQ ID NO:1)。
将得到的人工合成基因用限制酶处理及插入在作为用于动物细胞的表达载体的pEE12.4的hCMV-MIE启动子控制下,以构建用于包含人nAChRα1亚基的同种型1的N-端细胞外区和人抗体IgG1重链Fc区的融合蛋白α1-Fc(SEQ ID NO:2)的分泌和表达的载体pEE12.4-A1Fc。蛋白表达区的模式图显示于图1。
(2)α1-L-Fc融合蛋白的表达载体的构建(本发明的例)
对含有SEQ ID NO:1的kozak序列的nAChRα1亚基区,由PCR方法使用(1)中制备的人工合成基因作为模板;使用SEQ ID NO:3的引物和添加了编码柔性的接头(L)(Pro-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3)的核酸序列的SEQ ID NO:4的引物作为引物组;及使用Toyobo的“KOD-加-Neo”(货号No.:KOD-401)作为DNA聚合酶进行核酸扩增,从而制备SEQ ID NO:5的核酸序列。
另一方面,对抗体IgG1Fc区,由PCR方法使用SEQ ID NO:1的人工合成基因作为模板;使用添加了编码柔性的接头序列的核酸序列的SEQ ID NO:6的引物及SEQ ID NO:7的引物作为引物组;及使用Toyobo的KOD-加-Neo作为DNA聚合酶进行核酸扩增,从而制备SEQ ID NO:8的核酸序列。
由重叠延伸PCR方法使用SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8的混合的溶液作为模板;使用SEQ ID NO:3的引物和SEQ ID NO:7的引物作为引物组;及使用Toyobo的KOD-加-Neo作为DNA聚合酶进行核酸扩增,从而制备SEQ ID NO:9的核酸序列。
将得到的核酸扩增产物用限制酶处理及插入在作为用于动物细胞的表达载体的pEE12.4的hCMV-MIE启动子控制下而构建用于融合蛋白α1-L-Fc(SEQ ID NO:10)的分泌和表达的载体pEE12.4-A1LFc,其中人nAChRα1亚基的同种型1的N-端细胞外区和人抗体IgG1重链Fc区由柔性的接头序列(L)连接。蛋白表达区的模式图显示于图2。
(3)融合蛋白α1-Fc和融合蛋白α1-L-Fc的瞬时表达的确认
使用Invitrogen的表达系统“Free Style MAX293表达系统”(货号No.:K9000-10),用(1)和(2)中制备的融合蛋白表达载体pEE12.4-A1Fc和pEE12.4-A1LFc转染HEK293细胞而表达融合蛋白α1-Fc和融合蛋白α1-L-Fc。然后将它们通过使用GE HealthCare的纯化柱“HiTrap蛋白A HP柱”(货号No.:17-0402-01)纯化而得到融合蛋白α1-Fc和融合蛋白α1-L-Fc。
在SDS-PAGE之后利用银染及蛋白印迹进行各融合蛋白的表达的确认。对于蛋白印迹,使用HRP-标记的抗-人IgG抗体。结果显示于图5。图5中由箭标显示的条带对应于融合蛋白。自此结果确认,当插入柔性的接头(L)时,融合蛋白的表达的量显著地增加。
(4)α1-L2-Fc融合蛋白的表达载体的构建(本发明的例)
制备了表达融合蛋白α1-L2-Fc(SEQ ID NO:15)的载体,其中将(2)中制备的α1-L-Fc的柔性的接头(L)(Pro-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3)修饰为柔性的接头(L2)((Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3)。
由相同的PCR方法进行编码融合蛋白(SEQ ID NO:18)的基因序列的制备,其中将人工合成基因(SEQ ID NO:1)用作模板,并将(2)中的SEQ ID NO:4和6的引物用SEQ ID NO:16和17取代。
将得到的核酸扩增产物用限制酶处理及插入在作为用于动物细胞的表达载体的pEE12.4的hCMV-MIE启动子控制下而构建用于融合蛋白α1-L2-Fc的分泌和表达的载体pEE12.4-A1L2Fc,其中人nAChRα1亚基的同种型1的N-端细胞外区和人抗体IgG1重链Fc区由柔性的接头序列(L2)连接。蛋白表达区的模式图显示于图3。
(5)Fc-L2-α1融合蛋白的表达载体的构建(比较例)
制备了表达融合蛋白Fc-L2-α1(SEQ ID NO:19)的载体,其中(4)中制备的α1-L2-Fc的nAChRα1亚基和抗体重链恒定区以与夹柔性的接头(L2)的(4)相反的顺序融合。
由PCR方法,以与(2)和(4)中相同的方式,使用SEQ ID NO:1的人工合成基因作为模板进行载体制备。
将得到的核酸扩增产物用限制酶处理及插入在作为用于动物细胞的表达载体的pEE12.4的hCMV-MIE启动子控制下而构建用于融合蛋白Fc-L2-α1的分泌和表达的载体pEE12.4-FcL2A1,其中人抗体IgG1重链Fc区和人nAChRα1亚基的同种型1的N-端细胞外区由柔性的接头序列(L2)连接。蛋白表达区的模式图显示于图4。
(6)融合蛋白α1-Fc,α1-L-Fc,α1-L2-Fc和Fc-L-α1的稳定的表达株的构建
将(1),(2),(4)和(5)中制备的各融合蛋白表达载体pEE12.4-A1Fc,pEE12.4-A1LFc,pEE12.4-A1L2Fc和pEE12.4-FcL2A1通过电穿孔方法转移进CHO-K1细胞,在甲硫氨酸硫砜亚胺(MSX)选择下温育及克隆而制备转化体。使得到的转化体(在下文中,各它们会被缩写为“α1-Fc表达细胞”,“α1-L-Fc表达细胞”,“α1-L2-Fc表达细胞”,及“Fc-L2-α1表达细胞”)经历以下实验。
(7)融合蛋白α1-Fc,α1-L-Fc,α1-L2-Fc和Fc-L2-α1的表达温育
将(6)中制备的各α1-Fc表达细胞,α1-L-Fc表达细胞,α1-L2-Fc表达细胞,及Fc-L2-α1表达细胞通过使用9L的Invitrogen的“CD-CHO培养基”(货号No.:12490-025)作为初期培养基温育以产生各蛋白。温育条件是于37℃pH7.1及,在温育的第5~第9天期间,添加50mL/L/天的Invitrogen的“CHO CD EfficientFeed B”(货号No.:A1024-01)及进行10天温育。通过将培养物以3500G离心5分钟而沉淀温育的细胞及由其回收上清液来获得融合蛋白表达培养物的上清液。
(8)融合蛋白α1-Fc,α1-L-Fc,α1-L2-Fc和Fc-L2-α1的纯化和表达的量的计算
对于(7)中获得的融合蛋白表达培养物的各上清液,将用0.45μm的滤器过滤处理之后的装溶液载到GE Healthcare的“Mab选择SuRe”(货号No.:11-0026-01),用10-柱体积的PBS洗涤及用2.5-柱体积的20mM柠檬酸缓冲剂(pH=3.0)洗脱,并将洗出液用洗出液的1/10量的1M Tris-HCl(pH=9.0)立即中和而纯化融合蛋白。将得到的洗出液通过使用日本Millipore的“Amicon Ultra-15,Ultracel-50K”(货号No.:UFC905024)浓缩,进行用PBS的取代及通过使用0.22μm的无菌过滤膜进行过滤处理,之后使其经历以下实验。
测量得到的洗出液级分扪在280nm(OD280)处的吸光度,并对各表达株通过使用各融合蛋白的吸收系数(α1-Fc:0.57mg/mL/OD280,α1-L-Fc:0.59mg/mL/OD280,α1-L2-Fc:0.59mg/mL/OD280,Fc-L2-α1:0.59mg/mL/OD280),洗出液量及温育的液体量计算每1L的温育的液体的融合蛋白的表达的量。
结果,融合蛋白的表达的量是:α1-Fc表达细胞是72mg/L,α1-L-Fc表达细胞是1587mg/L,α1-L2-Fc表达细胞是1249mg/L,及Fc-L2-α1表达细胞是356mg/L,并确认,表达的量通过柔性的接头肽插入融合蛋白的结合位点而显著地增强。在它们之中,使用Pro-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3作为柔性的肽接头的融合蛋白表达株是优良的。
(9)融合蛋白α1-Fc和融合蛋白α1-L-Fc与α-BTX的结合能力的确认
关于(8)中获得的融合蛋白α1-Fc和融合蛋白α1-L-Fc,用ELISA方法确认其与α-金环蛇毒素(在下文中,其会被缩写为“α-BTX”)及与蛋白A的结合能力。α-BTX是具有通过与α1结构域结合抑制神经传递的作用的物质。因此,作为确认融合蛋白与α-BTX的结合能力的结果,现在可能确认是否融合蛋白的α1结构域的结构正确地形成。而且,蛋白A将融合蛋白经Fc固定于板。因此,尽管此实验的主要目的是确认上述融合蛋白的α1结构域结构的形成,在此实验中确认是否融合蛋白作为Fc的结构保留也是可能的。
将ICN Biochemicals的“蛋白A”(货号No.:987015)以1μg/mL的浓度固定于Nalge Nunc的“C8Maxisorp Nunc-免疫模块”(货号No.:445101)中,然后通过使用添加1%的BSA的PBS进行阻断,向其中添加经历4倍稀释系列的(8)中制备的各融合蛋白作为样品之后再洗涤,然后以1μg/mL的浓度添加Invitrogen的“α-金环蛇毒素,生物素-XX”(货号No.:B1196),最后用ICN Biochemicals的“过氧化物酶-亲和素”(货号No.:191370)进行反应。为了检测,使Funakoshi的“TMB溶液”(货号No.:N301)作为底物反应和通过使用1%硫酸溶液停止反应。那之后,测量在450nm处波长的吸光度。
结果显示于图6。对于任何融合蛋白,观察到浓度-依赖性反应。自此结果确认,各融合蛋白结合α-BTX和也结合蛋白A。由此确认,融合蛋白α1-Fc和融合蛋白α1-L-Fc二者均保留nAChRα1亚基细胞外区和作为Fc的结构。顺便而言,当比较两种融合蛋白时,与α-BTX的结合曲线显著地移位到融合蛋白α1-L-Fc中的更低浓度侧,由此判断,当插入柔性的接头肽时,每蛋白浓度的结合能力增强到约100倍或更高的程度。此结果提示,当插入柔性的接头肽时,目标的融合蛋白的结构稳定性增加和纯度升高。
(10)融合蛋白α1-Fc和融合蛋白α1-L-Fc与抗-nAChR自身抗体的结合能力的确认
将自ATCC获得的大鼠抗-nAChR(α1亚基)自身抗体产生杂交瘤Mab35(TIB-175)(在下文中,其会被缩写为“Mab35细胞”)在Invitrogen的“杂交瘤-SFM”(货号No.:12045-01)中温育,并将培养物的上清液用GE Healthcare的“HiTrap蛋白G HP柱”(货号No.:17-0405-01)处理,由此获得是抗-nAChR自身抗体的单克隆抗体(在下文中,其会被缩写为“mAb35”)。
将得到的mAb35以1μg/mL的浓度固定于Nalge Nunc的C8Maxisorp Nunc-Immunomodule中,并通过使用添加1%的BSA的PBS阻断。那之后,添加经历4倍稀释系列的(8)中制备的融合蛋白α1-Fc和融合蛋白α1-L-Fc,最后通过使用HRP-标记的抗-人IgG1Fc抗体进行反应。为检测,使Funakoshi的“TMB溶液”作为底物反应和通过使用1%硫酸溶液停止反应。那之后,测量在450nm处波长的吸光度。
结果显示于图7。融合蛋白α1-Fc和融合蛋白α1-L-Fc二者显示浓度-依赖性反应。当比较二者时,与自身抗体的结合曲线显著地移位到融合蛋白α1-L-Fc中的更低浓度侧,由此判断,当插入柔性的接头肽时,每蛋白浓度的结合能力(比活性)增强到约100倍或更高程度。此结果提示,当内部插入柔性的接头肽时,不仅目标的融合蛋白的表达的量而且其结构稳定性增加,且与自身抗体的反应性显著地增强。
(11)融合蛋白α1-Fc和融合蛋白α1-L-Fc与自身抗体产生细胞的结合能力的确认
在活体中,自身抗体在B细胞中产生。在自身抗体产生B细胞的细胞表面的细胞膜上,与自身抗体相同的抗体呈递为B细胞受体。由此,在(10)中使用的杂交瘤Mab35的细胞膜上,杂交瘤Mab35也呈递与B细胞的情况相同的mAb35抗体是可能的。
现在,使经HBSS/BSA洗涤的2×105Mab35细胞与稀释10倍至10ng/mL~1mg/mL范围内的(8)中制备的各融合蛋白α1-Fc和融合蛋白α1-L-Fc反应作为样品。那之后,添加PE-标记的抗-人IgG抗体作为检测试剂,并通过使用Beckman-Coulter的“Cytomice FC500”进行检测。
结果显示于图8A和图8B。各融合蛋白以浓度-依赖性方式移位到右侧,由此确认,各融合蛋白以浓度-依赖性方式与Mab35细胞结合。由于融合蛋白α1-L-Fc移位更多,确认,当插入柔性的接头肽时,与自身抗体产生细胞的结合能力增强到约100倍或更高程度。
(12)融合蛋白α1-Fc和融合蛋白α1-L-Fc作为诱饵的作用的确认
类似于人肌肉细胞的nAChRα1亚基存在于自ATCC获得的人成神经细胞瘤细胞(TE-671)(在下文中,其会被缩写为“TE671细胞”)中。因此,确认(8)中制备的融合蛋白α1-Fc和融合蛋白α1-L-Fc与自身抗体mAb35与TE671细胞的键的结合-抑制的活性。
向用HBSS/BSA洗涤的2×105TE671细胞添加100μg/mL的融合蛋白α1-Fc或融合蛋白α1-L-Fc。至于对照,添加不含融合蛋白的HBSS/BSA。在进一步向其添加1μg/mL的mAb35抗体之后,添加PE-标记的大鼠IgG抗体作为检测试剂,并通过使用“Cytomics FC500”进行检测。
结果显示于图9。当使用融合蛋白α1-Fc时,仅以100μg/mL浓度观察到一些抑制效应注意,而当使用融合蛋白α1-L-Fc时,以100μg/mL的浓度观察到足够的抑制效应。自此结果确认由柔性的接头肽的内部插入所至的抑制活性的显著增强。
(13)融合蛋白α1-Fc,融合蛋白α1-L-Fc,及融合蛋白Fc-L2-α1的ADCC活性的确认
将Mab35细胞(2×105细胞)用HBSS/BSA洗涤及于37℃在HBSS/BSA中温育30分钟,向其中加入Dojinsha的荧光染料“钙黄绿素-AM”(货号No.:C326)使得浓度为10μM,其中将钙黄绿素-AM掺入细胞。那之后,将那些Mab35细胞接种到96-孔板使达到10000细胞/孔,然后向其中以各种浓度添加(8)中制备的融合蛋白α1-L-Fc或对照抗体(阿瓦斯丁或Enbrel)和自ATCC获得的人自然杀伤NK92细胞(CRL-2407)(在下文中,其会被缩写为“NK92细胞”),然后于37℃温育4小时。在温育之后,以300×G进行离心分离5分钟,以沉淀细胞,并测量各上清液液体的荧光(Ex=485nm,Em=540nm)。结果,尽管甚至在添加仅NK92细胞(未添加抗体等)的组中注意到依赖于NK92细胞数的方式的非常弱的细胞毒性(天然杀伤),在施用融合蛋白α1-L-Fc的组中注意到最高的约73%的强细胞毒性,及在将25倍量的NK92细胞(即效应细胞(E))加入Mab35细胞(即靶细胞(T))的组中注意到强细胞毒性(未显示数据)。自以上初步实验的结果,在E/T比是25的条件下比较融合蛋白α1-Fc,融合蛋白α1-L-Fc和融合蛋白Fc-L2-α1之间的细胞毒性。
结果,在融合蛋白α1-Fc,融合蛋白α1-L-Fc及融合蛋白Fc-L2-α1中分别观察到51.8%,73.2%和32.9%的细胞毒性值。另一方面,在无抗体添加的组,添加阿瓦斯丁的组及添加Enbrel的组中分别观察到17.9%,12.5%和6.9%的细胞毒性值。
自那些结果确认,当抗体重链恒定区未定位在N末端侧而是定位在C末端侧时呈现更高细胞毒性。也确认,甚至在抗体重链恒定区定位在C末端侧的情况中,细胞毒性由柔性的接头肽的内部插入而进一步增强。
(14)对重症肌无力的体内测试的确认
为了实验,准备36只11周龄的雌性Lewis大鼠(Nippon LSC)。作为用于重症肌无力的动物模型,使用自身抗体-诱导大鼠模型。将作为由杂交瘤Mab35产生的针对大鼠nAChR的自身抗体的mAb35以1.25mg/kg的剂量腹膜内施用给全部大鼠,由此诱导病态状态。在自mAb35施用4,12,24和32小时之后静脉内施用各以下物质。给对照组,施用1mL的PBS各时间(对照组,6大鼠)。对于各时间以2.5mg/大鼠(α1-L-Fc2.5,6只大鼠)或10mg/大鼠(α1-L-Fc10,6只大鼠)的剂量施用(8)中制备的α1-L-Fc。类似地,对于各时间以2.5mg/大鼠(α1-Fc2.5,6大鼠)或10mg/大鼠(α1-Fc10,6大鼠)的剂量施用(8)中制备的α1-Fc。而且,对于各时间以80mg/大鼠的剂量(IVIG,6只大鼠)施用作为用于静脉内注射的人免疫球蛋白制备物的用于静脉内注射的捐赠的Venoglobulin IH5%(生产自Tanabe Mitsubishi)。
在诱导病态状态之后直到96小时的时期期间,评价肌肉症状分值(MG评分)。肌肉症状分值如下:0分是无异常;1分是前肢的握力降低;2分是前肢的握力消失;3分是除了前肢握力消失之外,后肢肌肉强度降低及步行障碍;及4分是除了前肢握力消失之外,后肢麻痹。以由Steel检验(SAS临床前Package5.00.010720版,Windows(注册商标)版本,SAS系统Release8.02TS水平02M0(SAS学会日本))进行对照组与施用各物质的组的比较的方式进行肌肉症状分值的统计学分析。结果以(平均值)±(标准误差)给出,并将小于5%的显著性水平(*)判断为显著差异。
结果显示于表1和图10。图10显示mAb35-诱导的大鼠重症肌无力模型中α1-L-Fc和α1-Fc的效应。如显示于图10,在对照组中观察到该变化,肌肉症状分值自病态状态诱导之后24小时增加,在56小时之后达到最高及然后降低。显示了α1-L-Fc和α1-Fc抑制肌肉症状分值的增加及像这样的阻遏依赖于剂量的趋势。表1显示在自病态状态诱导56小时之后的平均分值,其中对照组的肌肉症状分值成为最高。显示α1-L-Fc和α1-Fc均通过对各时间10mg/大鼠的施用显著地抑制肌肉症状。
表1:在自病态状态诱导56小时之后的肌肉症状分值
肌肉症状分值 | |
对照 | 2.3±0.6 |
α1-L-Fc2.5 | 0.6±0.3 |
α1-L-Fc10 | 0.3±0.2* |
α1-Fc2.5 | 1.1±0.4 |
α1-Fc10 | 0.3±0.2* |
IVIG | 0.9±0.2 |
在以上例中,对使用重复数n是3的接头肽(柔性的接头(L)(Pro-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3)或柔性的接头(L2)((Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3))的情况确认了效应。本领域技术人员可从那些结果容易预测,甚至在接头肽的重复数n是1~8的整数或,特别是,1~4的整数的情况中也会与接头肽的重复数n是3的情况达到相同的优良效果。这是因为,接头肽的长度已被认为通常是从约5个残基(换言之,以上构成单元中重复数n是1)至约20个残基(换言之,以上构成单元中重复数n是4)。
【工业实用性】
根据本发明,可以实际生产规模提供可由2种方式(即自身抗体产生的抑制和产生的自身抗体的中和)预防或治疗自身抗体类型的自身免疫疾病的融合蛋白作为药物。因此,本发明的融合蛋白可广泛用于有效预防和治疗各种自身抗体类型的自身免疫疾病诸如重症肌无力。
【序列表说明】
SEQ ID NO:3,4,6,7,16和17是引物序列。
Claims (12)
1.融合蛋白,其特征在于,蛋白(X)经由一个或更多氨基酸组成的接头肽(L)连接于蛋白(A),所述蛋白(X)含有被自身抗体识别的位点,所述自身抗体是自身抗体类型的自身免疫疾病的成因,所述蛋白(A)含有呈现抗体-依赖性细胞毒性的抗体重链恒定区的片段,其中蛋白(X)、接头肽(L)和蛋白(A)利用肽键以从N末端到C末端的顺序连接。
2.权利要求1的融合蛋白,其中接头肽(L)含有由式(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n(式中,n是1~8的整数),或式Pro-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n表示的氨基酸序列(式中,n是1~8的整数)。
3.权利要求2的融合蛋白,其中接头肽(L)含有由式(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n(式中,n是1~4的整数),或式Pro-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n(式中,n是1~4的整数)表示的氨基酸序列。
4.权利要求1的融合蛋白,其中蛋白(X)是烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)α1亚基或其一部分。
5.权利要求1的融合蛋白,其中蛋白(X)是由人nAChRα1亚基的SEQ ID NO:13的氨基酸序列组成的同种型1和/或由人nAChRα1亚基的SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成的同种型2,或其一部分,或由在所述氨基酸序列中的任何一个中一个或几个氨基酸被删除,添加和/或取代的氨基酸序列组成。
6.权利要求1的融合蛋白,其中蛋白(X)由人nAChRα1亚基的同种型1和/或同种型2的N-端细胞外区的氨基酸序列组成,或由在所述氨基酸序列中一个或几个氨基酸被删除,添加和/或取代的氨基酸序列组成。
7.权利要求1的融合蛋白,其中蛋白(A)含有抗体重链Fc区,抗体重链恒定区,或其一部分,或其组合。
8.权利要求1的融合蛋白,其中蛋白(A)含有人抗体IgG重链恒定区,或IgG亚基重链恒定区的部分的组合。
9.权利要求1的融合蛋白,其中蛋白(A)由SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸序列组成,或由在所述氨基酸序列中一个或几个氨基酸被删除,添加和/或取代的氨基酸序列组成。
10.权利要求1的融合蛋白,其中融合蛋白由SEQ ID NO:10的氨基酸序列组成,或由在SEQ ID NO:10的氨基酸序列中一个或几个氨基酸被删除,添加和/或取代的氨基酸序列组成。
11.生产权利要求1的融合蛋白的方法,其特征在于,将编码权利要求1的融合蛋白的DNA插入细胞表达载体,并将此载体导入宿主细胞以表达融合蛋白。
12.预防和治疗自身抗体类型的自身免疫疾病的组合物,其特征在于,含有权利要求1的融合蛋白作为有效成分。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2011-088762 | 2011-04-13 | ||
JP2011088762A JP4857396B1 (ja) | 2011-04-13 | 2011-04-13 | 融合蛋白質 |
PCT/JP2012/058912 WO2012141026A1 (ja) | 2011-04-13 | 2012-04-02 | 融合蛋白質 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103476800A true CN103476800A (zh) | 2013-12-25 |
CN103476800B CN103476800B (zh) | 2016-07-06 |
Family
ID=45604521
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201280018104.4A Active CN103476800B (zh) | 2011-04-13 | 2012-04-02 | 融合蛋白 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9243071B2 (zh) |
EP (1) | EP2698386B8 (zh) |
JP (1) | JP4857396B1 (zh) |
CN (1) | CN103476800B (zh) |
ES (1) | ES2655941T3 (zh) |
WO (1) | WO2012141026A1 (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107474144A (zh) * | 2017-09-14 | 2017-12-15 | 上海长海医院 | nAChR‑α1‑ECD蛋白及其制备方法 |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9629877B2 (en) | 2013-05-14 | 2017-04-25 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Human application of engineered chimeric antigen receptor (CAR) T-cells |
CN104693270B (zh) * | 2013-12-10 | 2018-10-16 | 清华大学 | 一种用于融合蛋白的连接肽 |
EP3715374A1 (en) | 2019-03-23 | 2020-09-30 | Ablevia biotech GmbH | Compound for the sequestration of undesirable antibodies in a patient |
EP3715376A1 (en) * | 2019-03-23 | 2020-09-30 | Ablevia biotech GmbH | Compound for the prevention or treatment of myasthenia gravis |
WO2022063879A1 (en) | 2020-09-23 | 2022-03-31 | Ablevia Biotech Gmbh | Compound for the sequestration of undesirable antibodies in a patient |
WO2022063880A1 (en) | 2020-09-24 | 2022-03-31 | Ablevia Biotech Gmbh | Compound for the prevention or treatment of myasthenia gravis |
WO2023112028A1 (en) * | 2021-12-13 | 2023-06-22 | Canopy Immuno-Therapeutics Ltd. | Ig-like fusion proteins and use thereof |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011013470A1 (ja) * | 2009-07-30 | 2011-02-03 | 日本製薬株式会社 | 自己抗体産生阻害剤 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0977800A (ja) | 1995-09-12 | 1997-03-25 | Takeji Nishikawa | 融合蛋白質、並びに落葉状天疱瘡の治療薬、治療器具、診断剤及び抗体測定方法 |
EP2706116A1 (en) * | 2001-01-17 | 2014-03-12 | Emergent Product Development Seattle, LLC | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins |
DE10160248A1 (de) * | 2001-12-07 | 2003-06-26 | Alexander Cherkasky | Fusionsproteinen enthaltend Fc-Regionen |
AU2003208839A1 (en) | 2002-02-13 | 2003-09-04 | Micromet Ag | De-immunized (poly)peptide constructs |
PT1641483E (pt) * | 2003-06-12 | 2008-04-29 | Lilly Co Eli | Proteínas de fusão |
WO2010138123A1 (en) * | 2009-05-28 | 2010-12-02 | Proteomtech, Inc. | P53 fusion proteins and methods of making and using thereof |
-
2011
- 2011-04-13 JP JP2011088762A patent/JP4857396B1/ja active Active
-
2012
- 2012-04-02 EP EP12770896.4A patent/EP2698386B8/en active Active
- 2012-04-02 ES ES12770896.4T patent/ES2655941T3/es active Active
- 2012-04-02 US US14/110,287 patent/US9243071B2/en active Active
- 2012-04-02 CN CN201280018104.4A patent/CN103476800B/zh active Active
- 2012-04-02 WO PCT/JP2012/058912 patent/WO2012141026A1/ja active Application Filing
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011013470A1 (ja) * | 2009-07-30 | 2011-02-03 | 日本製薬株式会社 | 自己抗体産生阻害剤 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
ELLISON,J.W.等: "Full=Ig gamma-1 chain C region", 《GENBANK DATABASE》, 8 February 2011 (2011-02-08) * |
YU,X.等: "immunoglobulin heavy chain, partial [Homo sapiens]", 《GENBANK DATABASE》, 27 October 2010 (2010-10-27) * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107474144A (zh) * | 2017-09-14 | 2017-12-15 | 上海长海医院 | nAChR‑α1‑ECD蛋白及其制备方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2698386B8 (en) | 2018-02-07 |
EP2698386A1 (en) | 2014-02-19 |
CN103476800B (zh) | 2016-07-06 |
JP2012219082A (ja) | 2012-11-12 |
US9243071B2 (en) | 2016-01-26 |
EP2698386A4 (en) | 2014-12-03 |
ES2655941T3 (es) | 2018-02-22 |
US20140335085A1 (en) | 2014-11-13 |
JP4857396B1 (ja) | 2012-01-18 |
WO2012141026A1 (ja) | 2012-10-18 |
EP2698386B1 (en) | 2017-12-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN109715667B (zh) | 抗-gprc5d抗体、结合gprc5d和cd3的双特异性抗原结合分子及其用途 | |
US11845793B2 (en) | Anti-ROR1 antibodies | |
CN108738323B (zh) | 抗trem2抗体及其使用方法 | |
CN103476800A (zh) | 融合蛋白 | |
JP7104624B2 (ja) | トランスフォーミング増殖因子ベータ応答性ポリペプチド及びその使用方法 | |
CN104968683A (zh) | 用于选择针对bcma的抗体的方法 | |
CN102741283A (zh) | 具有高阻断活性的抗-C5a结合部分 | |
US20230272089A1 (en) | Il2rg binding molecules and methods of use | |
US20230279128A1 (en) | Ifngr2 binding molecules and methods of use | |
US20210214434A1 (en) | Variants with fc fragment having an increased affinity for fcrn and an increased affinity for at least one receptor of the fc fragment | |
US20230272090A1 (en) | Il2rb binding molecules and methods of use | |
CN111133007A (zh) | 与胞外酶结合的重链抗体 | |
JP4495776B1 (ja) | 融合蛋白質 | |
CN105916883B (zh) | 双功能融合蛋白及其制备方法和用途 | |
CN104231086B (zh) | 双功能融合蛋白及其制备方法和用途 | |
CN104817641A (zh) | 新型抗人il-23受体抗体 | |
ES2701064T3 (es) | Novedoso anticuerpo antirreceptor IL-23 humano | |
CN113348182B (zh) | Lag-3抗体及其医药用途 | |
CN109641958A (zh) | huTNFR1相互作用的单价抑制剂 | |
CN112930358A (zh) | 抗TNFα/抗IL-17A天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗体及其制备 | |
CN106062193B (zh) | 与人tlr2及人tlr4结合的双特异性抗体 | |
CN114920838B (zh) | 一种抗il-17a的单域抗体及其用途 | |
US20210388083A1 (en) | Engineered fc | |
TW202340240A (zh) | 多特異性抗體及其藥物用途 | |
KR20230029671A (ko) | 항-인간 nr1 항체 유도체 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20230202 Address after: Osaka, Japan Patentee after: TAKEDA PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Address before: Tokyo Patentee before: NIHON PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. |
|
TR01 | Transfer of patent right |