CN107474144A - nAChR‑α1‑ECD蛋白及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种nAChR‑α1‑ECD蛋白,其特征在于,其氨基酸系列为SEQ ID 1,其中,该蛋白的分子量为28.7kDa,等电点为6.0。并且还提供该蛋白的制备方法,该方法包括:步骤一,体外合成SEQ ID 1氨基酸序列对应的cDNA序列SEQ ID 2;步骤二,将上述SEQ ID 2序列插入表达载体pCold II中,插入位点为Nde I/Hind III;步骤三,将步骤二中得到的pCold II‑AChR‑α1‑ECD质粒转化BL21(DE3)感受态细胞,用含氨苄青霉素平板过夜培养,挑选单克隆菌落,用异丙基‑β‑D‑硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导扩增做表达小试,得到AChR‑α1‑ECD BL21(DE3)表达的大肠杆菌菌株;步骤四,AChR‑α1‑ECD BL21(DE3)表达的大肠杆菌菌株进行放大发酵;步骤五,裂解大肠杆菌菌体,获取包涵体溶液;以及后续的分离、纯化和复性步骤。
Description
技术领域
本发明涉及一种nAChR-α1-ECD蛋白及其制备方法,属于医学检测领域。
背景技术
上海长海医院神经内科1978年开始开展重症肌无力(MG)临床试验研究,曾采用电鳐及人类肌肉提取nAChR抗原,检测重症肌无力nAChR抗体(nAChR-Ab)。该方法因取材日益受限不得已停用。
然而,目前市场上还没有人体AChR-Ab的临床检测试剂盒销售,沿用老办法继续使用动物或人体肌肉提取,操作复杂、成本高,而且也无法满足现实中大量病患检测的需求。而直接根据人体nAChR的氨基酸序列人工合成后进行基因表达,虽然能得到目标蛋白,但往往因为目标蛋白的性质原因而难以分离或者分离的纯度不高、收率低。
发明内容
本发明是为了解决上述问题而进行的,目的在于提供一种nAChR-α1-ECD蛋白及其制备方法。
一种nAChR-α1-ECD蛋白,其特征在于,其氨基酸系列为SEQ ID1,其中,该蛋白的分子量为28.7kDa,等电点为6.0。
本发明还提供一种nAChR-α1-ECD蛋白的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤一,体外合成SEQ ID 1氨基酸序列对应的cDNA序列SEQ ID 2;
步骤二,将上述SEQ ID 2序列插入表达载体pCold II中,插入位点为Nde I/HindIII;
步骤三,将步骤二中得到的pCold II-AChR-α1-ECD质粒转化BL21(DE3)感受态细胞,用含氨苄青霉素平板过夜培养,挑选单克隆菌落,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导扩增做表达小试,得到AChR-α1-ECD BL21(DE3)表达的大肠杆菌菌株;
步骤四,AChR-α1-ECD BL21(DE3)表达的大肠杆菌菌株进行放大发酵;
步骤五,裂解大肠杆菌菌体,获取包涵体溶液;
步骤六,包涵体溶液的上清液上样到cOmplete His柱,采用梯度浓度咪唑溶液洗脱,收集50mmol/L和250mmol/L咪唑洗脱液即为较纯的目标蛋白组分;
步骤七,将步骤六中得到的目标蛋白组分依次用4mol/L尿素、2mol/L尿素、500mg/L半胱氨酸溶液复性;
步骤八,将步骤七中获得的复性后蛋白上样到Ni螯合柱,依次采用梯度浓度咪唑洗脱,收集500mmol/L咪唑的洗脱液,并浓缩透析即得目标蛋白。
本发明提供的nAChR-α1-ECD蛋白的制备方法还可以具有这样的特征,其特征在于:其中,步骤四中放大发酵的具体操作为:按照100mL小试表达的大肠杆菌菌株接种于1L含氨苄青霉素50μg/mL的LB培养基中的比例进行接种,摇菌扩增细菌至600nm波长的光密度为1.0时,加入IPTG溶液止终浓度为0.1mM IPTG,37℃诱导表达3小时。
本发明提供的nAChR-α1-ECD蛋白的制备方法还可以具有这样的特征,其特征在于:其中,步骤五中的具体操作为:将菌体重悬于50mmol/L Tris,500mmol/L NaCl的PH为8.0的缓冲液中,冰水浴条件下超声裂解细胞。
本发明提供的nAChR-α1-ECD蛋白的制备方法还可以具有这样的特征,其特征在于:其中,步骤六中的梯度浓度咪唑溶液洗脱的溶液分别为20mmol/L咪唑溶液、50mmol/L咪唑溶液、250mmol/L咪唑溶液、500mmol/L咪唑溶液。
本发明提供的nAChR-α1-ECD蛋白的制备方法还可以具有这样的特征,其特征在于:其中,步骤七中的梯度浓度咪唑洗脱的溶液分别为20mmol/L咪唑溶液、500mmol/L咪唑溶液。
发明的作用与效果
根据本发明所涉及的nAChR-α1-ECD,因为在人体AChR-α1-ECD氨基酸序列的N端插入His序列,便于后期的蛋白过柱纯化。
附图说明
图1是本发明的SEQ ID 2序列插入表达载体的过程示意图;
图2是本发明的SEQ ID 2大肠杆菌转化及表达实验的电泳检测结果照片;
图3是本发明的SEQ ID 2大肠杆菌菌株摇瓶放大发酵后经裂解的电泳实验结果照片
图4是本发明的大肠杆菌菌体裂解获取包涵体后的电泳实验结果照片;
图5是.包涵体增溶验证后的电泳实验结果照片;
图6是AChR-α1-ECD蛋白纯化后的电泳实验结果照片;
图7是AChR-α1-ECD蛋白复性后的电泳实验结果照片;
图8是AChR-α1-ECD蛋白复性后蛋白纯化后的电泳实验结果照片;
图9是大肠杆菌转化及表达结果验证实验的电泳结果照片;以及
图10是AChR-α1-ECD蛋白性质验证实验的电泳结果照片。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解,以下实施例结合附图对本发明的nAChR-α1-ECD蛋白及其制备方法作具体阐述。
实施例中出现的试剂除特别表明来源外,均为商业购买。
IPTG,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷。
LB培养基,Luria-Bertani培养基。
mM即mmol/L。
Tris即三(羟甲基)氨基甲烷缓冲溶液。
Gua-HCl即盐酸胍。
M即mol/L。
EDTA即乙二胺四乙酸。
DTT即二硫苏糖醇。
WB,即Westernblot蛋白质印迹缩写。
1.载体构建
在AChR-α1-ECD的蛋白基础上设计以下的SEQ ID 1序列,
SEQ ID 1:
MNHKVHHHHHHMSEHETRLVAKLFKDYSSVVRPVEDHRQVVEVTVGLQLIQLINVDEVNQIVTTNVRLKQGDMVDLP RPSCVTLGVPLFSHLQNEQWVDYNLKWNPDDYGGVKKIHIPSEKIWRPDLVLYNNADGDFAIVKFTKVLLQYTGHIT WTPPAIFKSYCEIIVTHFPFDEQNCSMKLGTWTYDGSVVAINPESDQPDLSNFMESGEWVIKESRGWKHSVTYSCCP DTPYLDITYHFVMQRL*
其中的划线部分AChR-α1-ECD蛋白中的第21-255位共235个氨基酸,为其胞外段,MNHKVHHHHHHM系列为其N端插入的His序列,便于后期的蛋白过柱纯化。
根据SEQ ID 1氨基酸序列,设计并体外合成相应cDNA序列SEQ ID 2,体外合成采用常规的方法完成。
SEQ ID 2:
ATGAATCACAAAGTGCATCATCATCATCATCATATGTCAGAACATGAAACCCGCTTAGTTGCCAAACTGTTTAAAGATTATAGTAGCGTGGTGCGTCCGGTGGAAGATCATCGTCAGGTGGTTGAAGTGACCGTTGGCTTACAGCTGATTCAGCTGATTAATGTGGATGAAGTTAATCAGATTGTTACCACCAATGTTCGTCTGAAACAGGGCGATATGGTTGATCTGCCGCGCCCGTCTTGTGTGACCTTAGGTGTGCCGCTGTTTTCTCATCTTCAGAATGAGCAGTGGGTTGATTATAATCTGAAGTGGAATCCGGATGATTATGGCGGCGTTAAGAAAATTCATATTCCGAGCGAGAAGATTTGGCGCCCGGATCTGGTGCTGTATAATAACGCCGATGGCGATTTCGCCATTGTTAAATTCACCAAAGTTCTGCTGCAATATACCGGTCATATTACCTGGACTCCGCCGGCCATCTTCAAGAGCTATTGTGAAATTATTGTGACCCATTTCCCGTTTGATGAACAGAATTGTAGCATGAAACTGGGCACCTGGACCTATGATGGTAGTGTGGTTGCAATTAATCCGGAAAGCGATCAGCCGGATCTGAGCAATTTCATGGAATCAGGCGAATGGGTTATTAAAGAAAGTCGCGGCTGGAAACATAGCGTGACCTATAGCTGTTGTCCGGATACTCCGTATCTCGATATTACCTATCATTTCGTTATGCAGCGCCTGTAA
将上述SEQ ID 2序列插入表达载体:pCold II,插入位点为Nde I/Hind III,如图1所示。
通过质粒转化细菌,使其表达AChR-α1-ECD,同时在其N端插入His序列,便于后期的蛋白过柱纯化。
该蛋白氨基酸数:247氨基酸(247aa),分子量:28.7kDa,等电点:6.0。
2大肠杆菌BL21(DE3)转化及表达验证
将pCold II-AChR-α1-ECD质粒转化BL21(DE3)感受态细胞,用含氨苄青霉素平板过夜培养,挑选单克隆菌落,用IPTG诱导扩增做表达小试。
分别对
A:未用IPTG诱导的细菌裂解液
B:用IPTG诱导的细菌裂解液
B1-4:4个挑取的单菌落克隆分别用IPTG诱导的细菌裂解液
C:用IPTG诱导的细菌裂解液上清
D:用IPTG诱导的细菌裂解液沉淀
MK:标准蛋白
进行电泳检测验证大肠杆菌转化及表达结果,结果如图2所示,经分析表明:
1)经转化的细菌可以表达分子量为28kDa左右的蛋白,提示为目的蛋白。
2)目的蛋白存在于细菌裂解液沉淀中,提示蛋白以包涵体形式存在。
3.AChR-α1-ECD BL21(DE3)表达菌株摇瓶放大发酵
将100mL小试表达的菌液接种至1L LB培养基中(含氨苄青霉素50μg/mL),摇菌扩增细菌至波长600nm的光密度OD为1.0时,加入终浓度为0.1mM IPTG,37℃诱导表达3小时。收取菌液并裂解跑胶,验证蛋白表达情况。
分别对
A:未用IPTG诱导的细菌裂解液
B:用IPTG诱导的细菌裂解液
C:用IPTG诱导的细菌裂解液上清
D:用IPTG诱导的细菌裂解液沉淀
MK:标准蛋白
进行电泳检测验证大肠杆菌转化及表达结果,结果如图3所示,经分析表明:经放大摇菌后,目的蛋白仍存在于细菌裂解液沉淀中(即图3中的箭头指示的电泳带),以包涵体形式存在。
4.AChR-α1-ECD蛋白纯化
4.1大肠杆菌菌体裂解获取包涵体
步骤1),将菌体重悬于缓冲液(50mM Tris,500mM NaCl,PH8.0)中,冰水浴条件下超声裂解细胞。
步骤2),超声结束后离心,将上清(A)移至锥形瓶1储存,将沉淀(包涵体)用包涵体洗涤液(20mM Tris,50mM NaCl,5mM EDTA,1%Triton100,PH 8.0)重悬(B),转移至250mL烧杯中超声。
步骤2)超声结束后离心,将上清(C)移至锥形瓶2储存,将沉淀(包涵体)用缓冲液(50mM Tris,500mM NaCl,PH 8.0)重悬,转移至250mL烧杯中超声1次。超声结束后取200μLbuffer1包涵体重悬液(D)待测。
步骤2)超声结束后离心,将上清移至锥形瓶3储存,将沉淀(包涵体)用包涵体增溶液增溶。先将沉淀用玻璃棒搅松,加包涵体增溶液(50mM Tris,6M Gua-HCl,5mM EDTA,PH8.0,用前加1M DTT至终浓度10mM(100×))溶解搅拌。在磁力搅拌器上室温搅拌过夜。
分别对
MK:标准蛋白
上清(A)
重悬(B)
上清(C)
包涵体重悬液(D)
进行电泳检测验证大肠杆菌转化及表达结果,结果如图4所示,经分析表明:目的蛋白表达在包涵体中。
4.2.包涵体增溶验证
将前一天增溶过夜的包涵体溶液移至50mL离心管,12000rpm×20min离心,取上清跑胶验证。
分别对
A:前一天增溶过夜的包涵体溶液
MK:标准蛋白
进行电泳检测验证大肠杆菌转化及表达结果,结果如图5所示,经分析表明:目的蛋白存在于经增溶的包涵体溶液中。
4.3.AChR-α1-ECD蛋白纯化
上一步中获得的包涵体增溶上清上样到cOmplete His柱。采用梯度浓度咪唑溶液洗脱,以获得较纯的目的蛋白组分。
分别对
A:上样(25ml)
B:流穿液(50ml)
C:流穿液(50ml)
D:流穿液(50ml)
E:流穿液(50ml)(8M 尿素)
F:20mM咪唑洗脱液(40ml)
G:50mM咪唑的洗脱液洗脱(40ml)
H:50mM咪唑的洗脱液洗脱(30ml)
I:250mM咪唑洗脱液(40ml)
J:500mM咪唑洗脱液(40ml)
MK:蛋白标准
进行电泳检测验证大肠杆菌转化及表达结果,结果如图6所示,经分析表明:目的蛋白主要在50mM和250mM咪唑洗脱液中洗脱获得。流穿液可以进一步挂柱纯化。收集G、H、I组分做后期蛋白透析复性。
4.4.AChR-α1-ECD蛋白复性
将上述G、H、I组分置于透析袋中,依次用4M尿素、2M尿素、500mg/L半胱氨酸溶液过夜复性。
分别对
A:复性后蛋白上清(还原)
B:复性后蛋白上清(非还原)
MK:蛋白标准Marker
进行电泳检测验证大肠杆菌转化及表达结果,结果如图7所示,图中的箭头处即为目标蛋白,经分析表明:经复性后,还原状态下电泳可得到目的蛋白片段。
4.5.复性后蛋白纯化
将上一步中获得的复性后蛋白上样到Ni螯合柱,依次采用梯度浓度咪唑洗脱。
分别对
A:上样(50ml)
B:流穿(50ml)
C:流穿(40ml)
D:20mM咪唑洗脱液(30ml)
E:500mM咪唑洗脱液1(30ml)
F:500mM咪唑洗脱液2(30ml)
MK:标准蛋白
进行电泳检测验证大肠杆菌转化及表达结果,结果如图8所示,经分析表明:目的蛋白主要存在于流穿液和500mM咪唑洗脱液中。此步可以省略,复性后的溶液可以直接透析至最终体系,不需要下一步柱回收,因为WB已经验证(流穿和挂在柱上的目的蛋白WB都呈阳性),并且后面柱回收的时候没有纯化效果。
4.6.获取AChR-α1-ECD蛋白产品
浓缩透析上述4.5步骤中的E、F组分至20mM Tris,150mM NaCl,500mg/Lcysteine,pH 8.5溶液中跑胶验证终组分。
分别对
MK:标准蛋白
A:E组分浓缩透析液(还原)
B:E组分浓缩透析液(非还原)
C:F组分浓缩透析液(还原)
D:F组分浓缩透析液(非还原)
进行电泳检测验证大肠杆菌转化及表达结果,结果如图9所示,经计数和分析表明:
组分 | E | F |
蛋白浓度(mg/mL) | 0.5 | 0.28 |
体积(mL) | 18 | 12 |
蛋白量(mg) | 9 | 3.36 |
分装(mL/管) | 0.2 | 0.2 |
管数(管) | 90 | 60 |
5.蛋白性质验证
利用免疫印迹法,用商品化的抗体验证前述纯化的蛋白。
为验证前述纯化蛋白的性质,我们自Alomone labs公司购买了Anti-NicotinicAcetylcholine Receptor α1(extracellular)抗体(ANC-001)。该抗体是由nAChR-α1亚基的22-34氨基酸肽段免疫兔子所得,作为nAChR-α1-ECD特异性抗体验证本实验所纯化的蛋白性质,为后期筛选患者阳性血清奠定坚实基础。Western blot结果如图10所示:
1:蛋白质标准品
2:无蛋白的阴性溶液
3:纯化过柱后的E1蛋白组分(对应于前述E:500mM咪唑洗脱液1)
4:纯化过柱后的E2蛋白组分(对应于前述F:500mM咪唑洗脱液2)
5:无关蛋白
6:纯化过柱后的E1蛋白组分(对应于前述E:500mM咪唑洗脱液1)
7:纯化过柱后的E2蛋白组分(对应于前述F:500mM咪唑洗脱液2)
ANC-001与纯化的两个组分均可特异性地结合(图10中的3、4),但不能与无关蛋白(图10中的5)结合。
本蛋白表达含His标签,为证实该蛋白为质粒转化细菌所得,我们用抗His抗体亦可与本实验纯化两个组分结合(图10中的6、7),获得28kD附近的条带。说明该条带即为质粒转化细菌所得。
实施例的作用与效果
根据本发明所涉及的nAChR-α1-ECD,因为在人体AChR-α1-ECD氨基酸序列的N端插入His序列,便于后期的蛋白过柱纯化。
实施例中,通过载体构建、大肠杆菌BL21(DE3)转化及表达验证、AChR-α1-ECDBL21(DE3)表达菌株摇瓶放大发酵、AChR-α1-ECD蛋白纯化、蛋白性质验证表明通过在人体AChR-α1-ECD氨基酸序列的N端插入His序列所得到的nAChR-α1-ECD蛋白不仅可以成功在大肠杆菌的质粒中得到表达而且后续分离也比较方便,操作也简单,后续的免疫印迹法实验也证实了本发明提供的蛋白确实是可以起到原先人类肌肉提取nAChR抗原相同的检测作用。
Claims (6)
1.一种nAChR-α1-ECD蛋白,其特征在于,其氨基酸系列为SEQ ID 1,其中,该蛋白的分子量为28.7kDa,等电点为6.0。
2.一种nAChR-α1-ECD蛋白的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤一,体外合成SEQ ID 1氨基酸序列对应的cDNA序列SEQ ID 2;
步骤二,将上述SEQ ID 2序列插入表达载体pCold II中,插入位点为Nde I/Hind III;
步骤三,将步骤二中得到的pCold II-AChR-α1-ECD质粒转化BL21(DE3)感受态细胞,用含氨苄青霉素平板过夜培养,挑选单克隆菌落,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导扩增做表达小试,得到AChR-α1-ECD BL21(DE3)表达的大肠杆菌菌株;
步骤四,AChR-α1-ECD BL21(DE3)表达的大肠杆菌菌株进行放大发酵;
步骤五,裂解大肠杆菌菌体,获取包涵体溶液;
步骤六,包涵体溶液的上清液上样到cOmplete His柱,采用梯度浓度咪唑溶液洗脱,收集50mmol/L和250mmol/L咪唑洗脱液即为较纯的目标蛋白组分;
步骤七,将步骤六中得到的目标蛋白组分依次用4mol/L尿素、2mol/L尿素、500mg/L半胱氨酸溶液复性;
步骤八,将步骤七中获得的复性后蛋白上样到Ni螯合柱,依次采用梯度浓度咪唑洗脱,收集500mmol/L咪唑的洗脱液,并浓缩透析即得目标蛋白。
3.根据权利要求2所述的nAChR-α1-ECD蛋白的制备方法,其特征在于:
其中,步骤四中放大发酵的具体操作为:
按照100mL小试表达的大肠杆菌菌株接种于1L含氨苄青霉素50μg/mL的LB培养基中的比例进行接种,摇菌扩增细菌至600nm波长的光密度为1.0时,加入IPTG溶液止终浓度为0.1mM IPTG,37℃诱导表达3小时。
4.根据权利要求1所述的nAChR-α1-ECD蛋白的制备方法,其特征在于:
其中,步骤五中的具体操作为:
将菌体重悬于50mmol/L Tris,500mmol/L NaCl的PH为8.0的缓冲液中,冰水浴条件下超声裂解细胞。
5.根据权利要求1所述的nAChR-α1-ECD蛋白的制备方法,其特征在于:
其中,步骤六中的梯度浓度咪唑溶液洗脱的溶液分别为20mmol/L咪唑溶液、50mmol/L咪唑溶液、250mmol/L咪唑溶液、500mmol/L咪唑溶液。
6.根据权利要求1所述的nAChR-α1-ECD蛋白的制备方法,其特征在于:
其中,步骤七中的梯度浓度咪唑洗脱的溶液分别为20mmol/L咪唑溶液、500mmol/L咪唑溶液。
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