CN102286107A - 一种高效表达重组丙型肝炎病毒多表位抗原的方法和应用 - Google Patents

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杨杰
雷荣悦
周强
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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种高效表达重组丙型肝炎病毒(HCV)多表位抗原的方法和应用。具体地，所述重组HCV多表位抗原包含了HCV基因组中的Core蛋白和/或NS3蛋白的优势抗原表位，其特征在于，通过引入寡聚(PDDDDPG)结构，调节融合蛋白等电点，促进包涵体形成，以避免目标蛋白的细胞毒性及大肠杆菌蛋白酶对目标蛋白的降解，寡聚结构后引入Xa因子酶切位点(IEGR)，目的蛋白C末端添加有His标签。本发明提供的产品，具有表达量高，产品均一性强，纯化步骤简单，易于操作的优点。

Description

一种高效表达重组丙型肝炎病毒多表位抗原的方法和应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种高效表达重组丙型肝炎病毒多表位抗原的方法和应用。
背景技术
我国为丙型肝炎(HCV)的高发区，约有5000万感染者，占到全球40％的份额。丙肝是肝硬化及肝癌的主要原因，在输血等治疗中有极高的传染率。公众对丙肝认知水平也较低，在83％的有丙肝高危险人群中，仅有5％检测过丙肝。目前既没有非常明确的药物，也缺少有效的疫苗加以预防和阻止其进一步传播。因此，HCV的早期诊断对于筛查HCV的传染源、指导临床治疗和预后判断有重大意义，其中HCV的血源筛查是控制丙肝蔓延的最重要手段和政府高度重视的措施。
丙型肝炎发病缓慢、迁延，血液中病毒滴度极低，对于检测技术灵敏度要求较高。HCV的Core和NS3蛋白含有较强的优势抗原表位，其相应的抗体出现早/阳性率高，能够有效的满足血源筛查的需求，是目前第二代、第三代HCV免疫诊断的重要成分。J.A.NEVILLE et al(1997)Journal of Clinical Microbiology 35：3062；Maarit
Figure BSA00000536263300011
et al(2009)Virology Journal6：84。当前强生分公司Ortho和Abott公司HCV诊断试剂中，所用到的Core蛋白和NS3蛋白，各自由大肠杆菌和酵母表达系统分别表达。
国内一些研究将Core蛋白和NS3蛋白串联表达，所得重组抗原可以有效的检测出血清中的HCV抗体，能够满足检测需求。李暐东等，(2000)中国病毒学15：204；宋晓国等，(2001)军事医学科学院院刊25：91；CN200410066472.3，CN200780007977.4，CN200910260058.9。这些文献所公开的丙肝融合蛋白的制备方法，均是通过常规的分子生物学手段，将目的基因构建至一定的载体中进行表达。
Core、NS3蛋白两者联合表达对大肠杆菌有一定的细胞毒性，并且产物容易被大肠杆菌中的蛋白酶所降解，用上述公开的常规分子生物学手段进行目的蛋白表达时，产品得率低、均一性差，为下游的分离纯化带来困难，并且所获抗原用以Elisa检测时，本底值较高，容易引起结果的误判。
本发明选取HCV中的Core蛋白和/或NS3蛋白中的优势抗原表位进行串联表达，构建目的蛋白，并且在上述目的蛋白的N端，引入寡聚(PDDDDPG)结构调节融合蛋白等电点，促进包涵体形成，以避免目标蛋白的细胞毒性及大肠杆菌蛋白酶对目标蛋白的降解。考虑到后续纯化工艺，在寡聚结构后引入Xa因子酶切位点(IEGR)，在目的蛋白C末端后，添加His标签。
发明内容
本发明的目的就是提供一种高效表达重组丙型肝炎病毒多表位抗原的方法。
本发明的另一个目的就是提供优化的重组丙肝抗原Core和/或NS3的编码序列和重组丙肝抗原的获得，以及用于该方法的表达载体及工程菌株。
由此提供下述发明：
一种高效表达重组丙型肝炎病毒多表位抗原的方法，包含丙肝病毒Core蛋白和/或NS3蛋白，其特征在于，上述目的蛋白的N端引入寡聚(PDDDDPG)m结构调节融合蛋白等电点，寡聚结构后连接Xa因子酶切位点(IEGR)，目的蛋白C末端添加有His标签。
根据本发明任意一项所述的重组丙型肝炎病毒多表位抗原，包含Core蛋白和/或NS3蛋白优势抗原片段，Core蛋白源自如如SEQ ID NO.1所述的天然Core蛋白，NS3蛋白片段源自如SEQ ID NO.2所述的天然NS3蛋白。
根据本发明任意一项所述的重组丙型肝炎病毒多表位抗原，其中所述的目的蛋白，N端引入寡聚(PDDDDPG)m，寡聚结构后连接Xa因子酶切位点(IEGR)，目的蛋白C末端添加有His标签，即从N末端至C末端为(PDDDDPG)m-IEGR-Core-NS3-His6，其中m表示(PDDDDPG)的重复单元数。
根据本发明任意一项所述的重组丙型肝炎病毒多表位抗原，其中所述的Core蛋白征段源自如SEQ ID NO.1所述的天然Core蛋白，所述Core蛋白片段，经至少如下方式修饰：
a.RKTKRNTNRRPE(9-20残基)；
b.KDRRSTGKAWGKPGRPWPLYGNEGL(67-91残基)
c.HRSRNVGKVIDTLTCGFADLMGYIPVV(114-140残基)
根据本发明任意一项所述的重组丙型肝炎病毒多表位抗原，其中所述的NS3蛋白片段源自如SEQ ID NO.2所述的天然NS3蛋白，所述NS3蛋白片段，经至少如下方式修饰：
a.TLDVVTRSPTFSDNSTPPAV PQTYQVGYLH(9-38残基)；
b.TGVRTVMTGEA(89-99残基)；
c.DIEEVGLGR EGEIPFYGRA IPLSC  (180-203残基)
根据本发明任意一项所述的重组丙型肝炎病毒多表位抗原，其中所述的寡聚(PDDDDPG)m，m表示(PDDDDPG)的重复单元数，优选地，m值取自0～5范围内任意整数，更优选地，m值为3。
根据本发明任意一项所述的重组丙型肝炎病毒多表位抗原，系通过构建表达载体，并选择适宜的工程菌株进行目标蛋白的表达，分离包涵体，变性、复性包涵体，纯化目的蛋白等步骤，具体的操作方式，是本技术领域人员所熟知的。
发明的有益效果
本发明与现有技术相比，具有以下优点及突出性效果：本发明中，借助寡聚(PDDDDPG)m，可以将目的蛋白等电点由9.45，调节至中性，由此促进目的蛋白以包涵体的形式存在，避免了目标蛋白的细胞毒性及大肠杆菌蛋白酶对目标蛋白的降解，由此提高了目的蛋白的产量及产品的稳定性。同时，本发明在寡聚结构后引入Xa因子酶切位点(IEGR)，这样在包涵体复性之后，可以切除寡聚(PDDDDPG)m，由此避免了N端酸性氨基残基对目的蛋白潜在负面影响，并且目的蛋白C末端后添加His标签，有利于目的蛋白最终的分离纯化。
附图说明
图1：Core-NS3重组抗原表达载体示意图
图2：含(PDDDDPG)m结构，目的蛋白表达产物SDS-PAGE分析图
图3：不含(PDDDDPG)m结构，目的蛋白表达产物SDS-PAGE分析图
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
通过分子生物学常规手段，构建含Core蛋白表达载体，和含有Core-NS3(如图1所示)蛋白的表达载体，两个目的蛋白均使用pET21b质粒、Bl21(DE3)Rosctta感受态细胞为表达菌株。具体操作：将pET21b-Core和pET21b-Core-NS3质粒转化到Bl21(DE3)Rosctta感受态细胞中(氨苄青霉素和氯霉素双抗性)。LB培养基中37度200rpm培养到OD600约0.6时，加入1mM IPTG诱导2小时。图2中的2，4泳道为Core过表达的结果，6，8泳道为Core-NS3过表达的结果。1，3，5，7分别为2，4，6，8诱导前的对照。由SDS-PAGE图可见，经诱导后，目的蛋白实现大量表达，并且表达产物均一。Core蛋白序列为SEQ ID NO.3，NS3蛋白序列为SEQ ID NO.4。
实施例2
通过分子生物学常规手段，构建含Core-NS3的表达载体，其中Core-NS3蛋白N端没有连接(PDDDDPG)m；对照组构建空白载体，即载体中不含Core-NS3蛋白。两者均采用pET21b质粒、Bl21(DE3)Rosetta感受态细胞为表达菌株。将将含有Core-NS3质粒和空白质粒转化到BL21(DE3)rosetta细胞中以后，挑单克隆接种到LB培养基中37度培养至OD600约0.6时加入1mM IPTG诱导两个小时。诱导结束以后取全菌电泳，同时以没有诱导的细菌做为对照，如图3所示，空白载体组的两个克隆都有蛋白表达，而Core-NS3组的两个克隆都没有表达。其中Core-NS3组的编号1的克隆上了两次样。在加入IPTG诱导后，Core-NS3组细菌基本停止了生长，而空白载体仍然继续生长。由此表明，在该系统中，直接进行Core-NS3目的蛋白表达，由于细胞毒性等原因，或抑制表达菌株生长。Core蛋白序列为SEQ ID NO.3，NS3蛋白序列为SEQ ID NO.4。
Figure ISA00000536263500011
Figure ISA00000536263500021
Figure ISA00000536263500031
Figure ISA00000536263500041
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Claims (7)

1.一种高效表达重组丙型肝炎病毒多表位抗原的方法，包含丙肝病毒Core蛋白和/或NS3蛋白，其特征在于，上述目的蛋白的N端引入寡聚(PDDDDPG)m结构调节融合蛋白等电点，寡聚结构后连接Xa因子酶切位点(IEGR)，目的蛋白C末端添加有His标签。
2.根据权利要求1所述的重组丙型肝炎病毒多表位抗原，其中，所述Core蛋白源自如SEQ ID NO.1所述的天然Core蛋白
3.根据权利要求1所述的重组丙型肝炎病毒多表位抗原，其中，所述NS3蛋白源自如SEQ ID NO.2所述的天然NS3蛋白。
4.根据权利要求1所述的重组丙型肝炎病毒多表位抗原，其中，所述N端寡聚结构(PDDDDPG)m，m表示(PDDDDPG)的重复单元数，优选地，m值取自0～5范围内任意整数，更优选地，m值为3。
5.根据权利要求2所述的重组丙型肝炎病毒多表位抗原，其中，所述的Core蛋白，经至少如下方式修饰：
a.RKTKRNTNRRPE(9-20残基)；
b.KDRRSTGKAWGKPGRPWPLYGNEGL(67-91残基)；
c.HRSRNVGKVIDTLTCGFADLMGYIPVV(114-140残基)。
6.根据权利要求3所述的重组丙型肝炎病毒多表位抗原，其中，所述的NS3蛋白，经至少如下方式修饰：
a.TLDVVTRSPT FSDNSTPPAV PQTYQVGYLH(9-38残基)；
b.TGVRTVMTGEA(89-99残基)；
c.DIEEVGLGR EGEIPFYGRA IPLSC(180-203残基)。
7.根据权利要求1-6所述的重组丙型肝炎病毒多表位抗原，用以制备丙型肝炎的核酸疫苗、多肽疫苗以及HCV抗原或抗体的检查试剂。
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