CN104558145A - 一种胎球蛋白a重组蛋白及多克隆抗体的制备方法 - Google Patents

一种胎球蛋白a重组蛋白及多克隆抗体的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种胎球蛋白A重组蛋白及多克隆抗体的制备方法，包括：胎球蛋白A抗原表位分析获得目的片段用作胎球蛋白A的重组表达，将选定的目的片段的DNA通过PCR扩增后插入到表达载体，然后进行转化大肠杆菌细胞，表达重组胎球蛋白A，分离纯化后作为抗原去免疫兔子，得到含抗重组胎球蛋白A抗体的抗血清。本发明能很好的保证重组蛋白的表达，表达产量高，有利于大批量的制备重组胎球蛋白A及其抗体，制备的抗体干粉适合于作为诊断原料和疫苗开发。

Description

一种胎球蛋白A重组蛋白及多克隆抗体的制备方法
技术领域
本发明涉及本生物科学技术领域，特别涉及一种重组胎球蛋白A重组蛋白及其多克隆抗体的制备方法。
背景技术
胎球蛋白A(fetuin-A/AHSG)也称之为α-2-HS糖蛋白，是由两个氨基末端抑制域和一个较小的羧基末端域组成的59kDa分子量的糖蛋白；由肝脏合成，分泌至血流，成年哺乳动物体内的浓度范围在0.5-1.0g/L；婴儿期的血清胎球蛋白A含量高，参与蛋白酶抑制活性，与钙代谢和骨生成调节相关；累积于骨和牙齿内，作为生物学上非胶原骨蛋白的主要部分，它在人体血液中的含量与外伤感染、心血管疾病、结石、SARS等疾病相关。AHSG具有高度的遗传多态性，其基因的多态性位点与Ⅱ型糖尿病、血管钙化和SARS的易感性等相关，研究表明，胎球蛋白A是循环中主要的钙化抑制剂；干涉钙盐沉淀；近期研究显示低水平胎球蛋白A的慢性肾脏衰竭患者与心血管病的高死亡率显著相关；另一方面，糖尿病老年人血清胎球蛋白A含量比正常人高，这是独立于胰岛素抑制剂的其他标记物；另外，高胎球蛋白A水平还可作为心血管疾病的的危险标记物。
AHSG有多种生物学功能：能够抑制碱性磷酸钙(basic calciumphosphate,BCP)沉淀，维持体液中钙含量；能够参与巨噬细胞失活，调控炎症程度；能够抑制胰岛素受体自身磷酸化和其酪氨酸激酶的活性，导致产生胰岛素抵抗和Ⅱ型糖尿病；能够与转化生长因子-β(transforminggrowth factor,TGF-β)结合，进而抑制肠肿瘤的生长。因此，测定胎球蛋白A的表达量，有很大的价值，通常测定蛋白浓度的方法是通过ELISA等免疫检测方法来实现的，这就需要效价很高的可用于诊断原料的胎球蛋白抗体。
发明内容
本发明的目的是提供一种胎球蛋白A重组蛋白及多克隆抗体的制备方法，该方法制备的胎球蛋白A重组蛋白表达产量高，抗体干粉可作为血清学检查的诊断原料。
本发明采用的技术方案是：
一种胎球蛋白A重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：
(1)胎球蛋白A抗原表位分析：通过抗原表位分析选择目的片段用作胎球蛋白A的重组表达，所述目的片段的基因序列如序列表中SEQ IDNO.1所示；
(2)重组胎球蛋白A的合成：将选定的目的片段的DNA通过PCR扩增后插入到表达载体，然后进行转化大肠杆菌细胞，大肠杆菌在生长的同时，目的蛋白也将得到表达。
进一步地，步骤(2)中所述的PCR扩增的引物序列为SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。
一种胎球蛋白A重组蛋白抗体的制备方法，将分离纯化后的权利要求1制备的重组胎球蛋白A作为抗原去免疫兔子，得到含抗重组胎球蛋白A抗体的抗血清。
进一步地，得到含抗重组胎球蛋白A抗体的抗血清后，进行分离纯化，得到抗重组胎球蛋白A抗体干粉。
进一步地，所述的重组胎球蛋白A的分离纯化包括：
分离，收集培养的大肠杆菌，离心弃上清；冰上在细胞中加入1/20细胞生长体积的NTA-0Buffer和PMSF，然后向缓冲体系中加入溶菌酶，置冰上冷却处理；将细胞悬浮起来，加入10％Triton X-100,使Triton X-100的终浓度为0.05％，充分混匀，冰上放置15分钟，间或混匀；冰上超声破碎细胞，后用离心机离心取上清再离心一次，再过0.22μm的滤膜过滤；
纯化，将Ni-NTA树脂装入合适的层析柱，用10倍柱床体积的NTA-0Buffer冲洗，然后将样品加到Ni-NTA层析柱中，流速控制在0.5ml/min，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分析蛋白质的结合情况；层析用10倍柱床体积的NTA-0Buffer冲洗，流速控制在1ml/min，后用20mM、60mM、200mM和500mM咪唑溶液洗Ni-NTA柱，直至检测G250不变蓝为止，分别收集流出液体，SDS/PAGE分析，确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。
进一步地，所述免疫兔子的具体方法为：取纯化后的重组胎球蛋白A免疫家兔，免疫剂量为500－600ug/只，第一次免疫用弗氏完全佐剂，以后用不完全弗氏佐剂，免疫间隔时间为2－3周，免疫3－4次，兔子背部多点注射，静脉采血，得到含抗重组胎球蛋白A抗体的抗血清。
进一步地，所述含抗重组胎球蛋白A抗体的抗血清进行分离纯化的具体步骤为：将抗血清过Protein A柱；吸附后进行洗脱；收集的解吸液，透析、冷冻干燥，既得重组胎球蛋白A抗体干粉。
本发明提供的胎球蛋白A抗体的制备方法，通过对胎球蛋白A的抗原表位分析，把两端没有免疫原性的位点去掉，而对可产生较强免疫原性位点的基因片段选择合适的引物(参见序列表SEQ ID No.2和SEQ ID No.3)进行扩增，并采用该位点的氨基酸序列制备重组蛋白片段，用此片段免疫动物得到特异性针对该位点的抗体。在重组蛋白制备的中采用大肠杆菌表达系统，能很好的保证重组蛋白的表达，表达产量高，有利于大批量的制备重组胎球蛋白A及其抗体，适合于作为诊断原料和疫苗开发的技术。
附图说明
图1为本发明实施例提供的胎球蛋白A重组蛋白的电泳图。
图2为本发明实施例提供的全长表达的胎球蛋白A制备的多克隆抗体和优化后的片段表达的胎球蛋白A制备的多克隆抗体的免疫胶乳实验对比结果图。
具体实施方式
实施例1一种胎球蛋白A重组蛋白及其多克隆抗体的制备方法
(一)抗原表位分析
采用DNAStar软件进行抗原表位分析，分析结论，SEQ ID No.1的抗原性良好，抗原决定簇主要集中在N端22个氨基酸和C端50个氨基酸，根据抗原决定簇分析结果，考虑将SEQ ID No.1进行原核表达，并根据序列设计特异性引物。
(二)表达载体的构建
1、基因获取
1.1RNA提取：利用TRIzol法提取U251细胞总RNA
1)取106-107个细胞于EP管中，PBS清洗后，加入1ml TransZol，吹吸混匀，然后室温孵育5min；
2)加入0.2ml氯仿，涡旋剧烈震荡15s，室温孵育3min；
3)11000rmp 4℃离心15min，此时溶液分为3层，RNA主要在上层水相中；
4)将无色的水相转移到新的1.5mL EP管中，加入500ul异丙醇，室温孵育10min；
5)11000rmp 4℃离心10min，去上清，在侧管和底管形成胶状沉淀；
6)加1ml 75％乙醇(用DEPC处理的水配制，并现配现用)，剧烈涡旋至管底的胶状沉淀悬其并分散为止；
7)8000rmp 4℃离心5min，弃上清，室温晾干沉淀，沉淀溶于30-100ulRNA溶解液中，保存样品于-70℃长期备用。
1.2利用RT-PCR法获取目的基因
1)RT：按表1将溶液依次从多至少加入PCR管中；
表1
RNA 20ul
Random primer 10ul
2×TS Reaction Mix 100ul
TransScriptTM RI/RT Enzyme Mix 10ul
RNase-free Water 60ul
2)用移液枪混匀后分装于10个PCR管中，放入PCR仪中，25℃孵育10min，42℃孵育30min，85℃加热5min，得到cDNA；
3)PCR(200ul体系)
按表2体系将溶液依次从多至少加入PCR管中(模板cDNA最后加入)；
表2
cDNA 5ul
AHSG-F(50μM) 2ul
AHSG-R(50μM) 2ul
10×Taq Buffer 20ul
2.5mM dNTP Mixture 16ul
Taq DNA Polymerase 2ul
dH2O 153ul
加完用移液枪混匀后，以下列程序进行PCR扩增。
2、亚克隆构建pet28a-AHSG表达载体
2.1PCR目的片段和pet28a空载体分别用BamHI和Sail双酶切，酶切体系如下表3；
表3
体系加完后，用枪轻轻吹吸混合均匀，37℃水浴酶切20min。
2.2PCR扩增片段/载体酶切产物回收
1)酶切片段切胶，放置干净离心管称重；
2)凝胶回收试剂盒回收PCR片段和酶切后的载体。
2.3目的片段和载体酶切产物做连接反应，反应体系如下表4：
表4
试剂 目的片段 载体 Buffer T4连接酶
加样量(μL) 14 2 2 2
用枪轻轻吹吸混匀后，22℃连接2小时以上。
2.4转化和阳性克隆筛选
1)从-80℃冰箱中取出感受态细胞至冰上融化；
2)加入连接产物(10μL)，轻轻吹吸使DNA与感受态细胞充分混匀；
3)冰上30min，42℃热击90s，冰上1min；
4)加入800μL预热的LB培养基，置37℃摇床中158转/min震荡45min；
5)6000r离心4min；
6)在超净台里面吸掉800μL上清，剩余菌液混匀，涂至含有相应抗生素的平板上；
7)倒置平板，于37℃恒温培养箱中培养，12～16小时后可出现菌落；
8)对于阳性克隆的筛选，分装40ul不加抗生素的LB培养基至PCR管，每种克隆挑取6个单菌落至PCR管混匀，放置于37℃摇床中220转/min震荡2h。每管取2ul作为模板进行菌液PCR，其中PCR回收产物和H2O分别作为阳性和阴性对照的模板；
9)PCR反应完后进行琼脂糖凝胶电泳检测，PCR结果呈阳性，则选择呈阳性结果的相应PCR管的单克隆菌液接种至3ml加相应抗生素的LB培养基中培养过夜，然后保种，并提取质粒同时送测序，待测序正确后进入蛋白表达阶段。
(三)胎球蛋白A重组蛋白的表达及分离纯化
1)将上述(二)中获得的表达质粒，CaCl2法转化大肠杆菌BL21，获得人胎球蛋白A表达菌株，命名为pET-胎球蛋白A/BL21；
2)挑取单菌落，于小试管内进行IPTG诱导实验，即37℃培养至OD600为0.6后，加入1mM IPTG，37℃继续培养3h。将全菌液收集后破碎，SDS-PAGE电泳检测，选取表达量高的单菌落进行大量表达；
3)将含有pET-胎球蛋白A/BL21，接种至含卡那的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，以0.2％接种于自动诱导培养基中，37℃培养至OD为0.6；降温至20℃，培养过夜；离心收集菌体，将菌体悬浮于相应的裂解缓冲液中，洗涤一次，再次将菌体悬浮于预冷的相应的裂解缓冲液中。超声波破碎细菌，在4℃以20000g高速离心30min收集上清，进行层析纯化；
4)镍离子亲和层析，将Ni-NTA树脂装入合适的层析柱，用10倍柱床体积的NTA-0Buffer冲洗，然后将样品加到Ni-NTA层析柱中，流速控制在0.5ml/min左右，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分析蛋白质的结合情况；层析用10倍柱床体积的NTA-0Buffer冲洗，流速控制在1ml/min左右，后用20mM、60mM、200mM和500mM咪唑溶液洗Ni-NTA柱，直至检测G250不变蓝为止，分别收集流出液体，SDS/PAGE分析，确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。结果表明，目的蛋白胎球蛋白A主要集中于200mM咪唑洗脱峰，纯度大于90％；如图1重组胎球蛋白A的表达纯化情况，泳道1为蛋白电泳条带，可以看出胎球蛋白A表达量很大，足够满足制备抗体的需要。
(四)重组胎球蛋白A多克隆抗体制备
1、免疫
免疫兔子的具体步骤为：取步骤(三)中纯化后的重组胎球蛋白A免疫家兔，免疫剂量为500－600ug/只，第一次免疫用弗氏完全佐剂，以后用不完全佐剂，免疫间隔时间为2－3周，免疫3－4次，兔子背部多点注射，静脉采血，得到含抗重组胎球蛋白A抗体的抗血清。
2、纯化
将抗血清用TBS缓冲溶液以1：5的比例进行稀释，再用0.22μm滤膜进行过滤；以每分钟0.5ml的速度将抗血清上到Protein A柱上，用TBS缓冲溶液清洗柱子至A280<0.008，然后加pH2.7甘氨酸洗脱缓冲溶液，以0.5ml/min的速度洗脱至所有蛋白均流下来；用已经加入100ul中和缓冲溶液的1.5ml EP管分管收集洗脱液，收集的洗脱液最终用0.01×PBS透析，透析后的蛋白质溶液经冻干成粉状，既得重组胎球蛋白A抗体干粉。
对比实施例1采用全长表达的胎球蛋白A制备多克隆抗体
采用全长表达的胎球蛋白A制备的多克隆抗体对兔子进行免疫，其余方法步骤与实施例1相同。
用全长表达的胎球蛋白A制备的多克隆抗体和优化后的片段表达的胎球蛋白A制备的多克隆抗体，分别与梯度浓度的天然胎球蛋白A蛋白做免疫胶乳凝集实验，方法如下：取过量的多克隆抗体偶联到等量适量胶乳微球上，离心洗脱过量抗体，制备成偶联抗体的胶乳颗粒。梯度天然稀释胎球蛋白A蛋白，置于生化仪上准备反应，分别测试两种抗体的反应度，以蛋白浓度为横坐标，两种抗体的反应度为纵坐标作图，见图2，可见两种抗体的反应线性都很好，但是反应度，实施例1采用的优化后的片段表达的胎球蛋白A制备的多克隆抗体的反应度明显好于全长表达的胎球蛋白A制备的多克隆抗体。
最后所应说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (7)

1.一种胎球蛋白A重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)胎球蛋白A抗原表位分析：通过抗原表位分析选择目的片段用作胎球蛋白A的重组表达，所述目的片段的基因序列如序列表中SEQ IDNO.1所示；
(2)重组胎球蛋白A的合成：将选定的目的片段的DNA通过PCR扩增后插入到表达载体，然后进行转化大肠杆菌细胞，大肠杆菌在生长的同时，目的蛋白也将得到表达。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的PCR扩增的引物序列为SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。
3.一种胎球蛋白A重组蛋白抗体的制备方法，其特征在于，将分离纯化后的权利要求1制备的重组胎球蛋白A作为抗原去免疫兔子，得到含抗重组胎球蛋白A抗体的抗血清。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，得到含抗重组胎球蛋白A抗体的抗血清后，进行分离纯化，得到抗重组胎球蛋白A抗体干粉。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的重组胎球蛋白A的分离纯化包括：
分离，收集培养的大肠杆菌，离心弃上清；冰上在细胞中加入1/20细胞生长体积的NTA-0Buffer和PMSF，然后向缓冲体系中加入溶菌酶，置冰上冷却处理；将细胞悬浮起来，加入10％Triton X-100,使Triton X-100的终浓度为0.05％，充分混匀，冰上放置15分钟，间或混匀；冰上超声破碎细胞，后用离心机离心取上清再离心一次，再过0.22μm的滤膜过滤；
纯化，将Ni-NTA树脂装入合适的层析柱，用10倍柱床体积的NTA-0Buffer冲洗，然后将样品加到Ni-NTA层析柱中，流速控制在0.5ml/min，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分析蛋白质的结合情况；层析用10倍柱床体积的NTA-0Buffer冲洗，流速控制在1ml/min，后用20mM、60mM、200mM和500mM咪唑溶液洗Ni-NTA柱，直至检测G250不变蓝为止，分别收集流出液体，SDS/PAGE分析，确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。
6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述免疫兔子的具体方法为：取纯化后的重组胎球蛋白A免疫家兔，免疫剂量为500－600ug/只，第一次免疫用弗氏完全佐剂，以后用不完全弗氏佐剂，免疫间隔时间为2－3周，免疫3－4次，兔子背部多点注射，静脉采血，得到含抗重组胎球蛋白A抗体的抗血清。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述含抗重组胎球蛋白A抗体的抗血清进行分离纯化的具体步骤为：将抗血清过Protein A柱；吸附后进行洗脱；收集的解吸液，透析、冷冻干燥，既得重组胎球蛋白A抗体干粉。
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