CN107540747A

CN107540747A - 抗人dll4单克隆抗体6f12

Info

Publication number: CN107540747A
Application number: CN201710677651.8A
Authority: CN
Inventors: 李刚; 周慧婷; 汪健; 陈晓岚; 徐利晓; 李梅; 李�根
Original assignee: Affiliated Childrens Hospital of Soochow University
Current assignee: Affiliated Childrens Hospital of Soochow University
Priority date: 2017-08-09
Filing date: 2017-08-09
Publication date: 2018-01-05
Anticipated expiration: 2037-08-09
Also published as: CN107540747B

Abstract

本发明公开了抗人DLL4单克隆抗体6F12，由杂交瘤细胞株分泌得到，杂交瘤细胞株保藏信息为：保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏时间：2017年6月7日；保藏号：CGMCC No.14284；分类命名：分泌抗人DLL4分子单克隆抗体杂交瘤细胞株6F12。本发明的单克隆抗体6F12与DC的结合与商品化的克隆MHD4‑46相比并不会阻断DLL4+DC诱导Naïve T cells向Th1方向分化的能力。

Description

抗人DLL4单克隆抗体6F12

技术领域

本发明涉及一种单克隆抗体，具体涉及抗人DLL4单克隆抗体6F12。

背景技术

Notch信号通路是进化上高度保守的一套信号系统，在细胞增殖、分化和凋亡，以及细胞生长和各种生理功能中均发挥重要作用。Notch信号分子在绝大多数的多细胞生物体内表达。哺乳动物主要表达四种Notch受体（分别为：Notch1、2、3、4）和五种Notch配体（分别为：DLL1、DLL3、DLL4、Jagged1和Jagged2）。

早期研究显示，DLL4在血管内皮细胞内高度选择性表达，对于调控内皮细胞发育至关重要。2004年Amsen及其同事发现通过LPS刺激包含有抗原递呈细胞的骨髓细胞可以诱导DLL4的表达。2007年，Skokos及其同事报道，CD8-DC通过DLL4分子激活Notch信号通路的方式可以诱导细胞向Th1方向分化，而这种方式是非IL-12依赖性的。随后有研究表明，在实验小鼠模型中，DLL4可以调控许多疾病的发病，例如炎症性疾病、呼吸道病毒感染、实验性过敏性结肠炎、实验性自身免疫性脑脊髓炎以及分支杆菌引起的肺肉芽肿。Zhang Yi教授的研究证实了表达DLL4的小鼠树突状细胞（dendritic cell, DCs）可以提高自身反应性T细胞的应答并介导移植物抗宿主反应。但是对人DLL4+ DCs的研究还有待进一步开展。

最近，Zhang Yi教授等人的研究报道了人DLL4+ DCs在调节T细胞向Th1和Th17分化中的关键作用。来自于健康人的外周血中的CD1C+ DCs和浆细胞样DC（pDC）表面不表达DLL4分子。相比之下，进行同种异体造血干细胞移植的患者外周血中的DLL4+ CD1C+ DCs表达的DLL4 mRNA水平比健康人高16倍。在激活TLR信号后，来自于健康人的CD1C+ DCs表达的DLL4水平显著上调。相比之下pDCs上调的程度较低。活化后的DLL4+ DCs比未刺激的DCs能够更好地促进Th1和Th17分化。在DLL4+ DCs刺激活化T细胞的过程中，使用DLL4的中和抗体来阻断Notch信号，可以减少Th1和Th17细胞的产生。因此对于人外周血循环的DCs来说，DLL4是其诱导T细胞向Th1和Th17分化的一个重要功能性分子。这些发现为人类炎症性疾病的治疗和干预提供了可能的途径。

DLL4分子自被发现以来一直被广大科研工作者所关注，针对人DLL4分子也展开了许多方面的功能性研究。在许多功能性研究中，需要通过抗体标记后使用流式细胞仪将DLL4+的目的细胞分选出来。但目前使用的商品化抗人DLL4单克隆抗体还存在一定的局限性。目前许多知名抗体公司用于流式检测的抗人DLL4荧光抗体仅有一个克隆号（MHD4-46），而该克隆号的抗体在Zhang Yi教授发表的文献中明确报道了其具有阻断DLL4信号的功能。目前并没有一株商品化的单克隆抗体可用于标记并通过流式细胞仪分选出DLL4+ DCs的同时保留DLL4的信号功能。因此，研制抗人DLL4+功能性单克隆抗体将有助于更好的研究DLL4分子的生物学功能，为研究提供一种新的手段。

发明内容

本发明的发明目的是提供一种抗人DLL4单克隆抗体6F12以及能产生所述抗人DLL4单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.14284。

本发明公开的杂交瘤细胞株的制备方法包括以下步骤：

（1）构建高表达人DLL4分子的转基因细胞：将人DLL4 CDS全长序列克隆入真核表达载体；转染仓鼠卵巢母细胞CHO细胞，通过药物和流式细胞仪筛选获得高表达DLL4分子的转基因细胞CHO/DLL4；用转基因细胞CHO/DLL4免疫BALB/C小鼠；

（2）获取融合细胞生长克隆：从免疫合格小鼠无菌取出脾脏细胞作为抗原致敏的B细胞，按照常规方法，将B细胞与骨髓瘤细胞AG8株融合，然后利用常规的融合细胞HAT筛选方法进行筛选，进而获取融合细胞生长克隆；

（3）应用Western Blot和流式细胞仪等生化和免疫学技术筛选和鉴定后，挑选出具有高抗体分泌水平的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为分泌抗人DLL4分子单克隆抗体杂交瘤细胞株6F12。

上述杂交瘤细胞株的保藏信息为，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏时间：2017年6月7日；保藏号：CGMCC No.14284；分类命名：分泌小鼠抗人DLL4分子单克隆抗体杂交瘤细胞株6F12。

上述技术方案中，步骤（1）中高表达人DLL4分子的转基因细胞CHO/DLL4具有较强的免疫原性，并且所表达的抗原分子的空间构型能以自然状态暴露于细胞膜表面，从而可更有效地激发机体的免疫反应。

上述技术方案中，步骤（1）中，制备CHO/DLL4细胞的方法可以按照本领域技术人员熟知的DNA操作技术（例如参见Sambrook et al., Molecular Cloning: A LaboratoryManual, Cold Spring Harbour，1989）进行基因的分离、核苷酸片段的切割与连接、克隆和表达载体的构建及扩增、核苷酸序列的分析与鉴定、细胞的转化和培养。

本发明还公开了由上述杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体，为抗人DLL4单克隆抗体，命名为单克隆抗体6F12。

采用上述杂交瘤细胞株制备单克隆抗体的方法有以下两种：

1）在杂交瘤培养液中接种上述杂交瘤细胞，培养后培养液中分离纯化所需单克隆抗体；

2）在动物腹腔内接种上述杂交瘤细胞，动物腹水液中分离和纯化所需单克隆抗体。

本发明还提供了所述单克隆抗体6F12的重链可变区氨基酸序列：SEQ.ID.NO:1；轻链可变区氨基酸序列：SEQ.ID.NO:2。

SEQ.ID.NO:1：

EVHVKQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYLLHWVKQKPGQGLEWIGYIIPYNDGTRYNEKFKGKATLTSDKSSNTAYMELSSLTSEDSAVYYCAREGTGTGAFDYWGQGTSLTVSS

对应于：

Glu Val His Val Lys Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser ValLys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Leu Leu His Trp ValLys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Ile Pro Tyr Asn AspGly Thr Arg Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys SerSer Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val TyrTyr Cys Ala Arg Glu Gly Thr Gly Thr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly ThrSer Leu Thr Val Ser Ser

SEQ.ID.NO:2：

DIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVNYMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWSSYPYTFGGGTKLEIK

对应于：

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu LysVal Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln GlnLys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser GlyVal Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile SerArg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr ProTyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

本发明进一步公开了一种检测DLL4蛋白的表达水平的试剂，由上述单克隆抗体6F12与分散介质混合制备得到；所述分散介质包括缓冲液。

本发明还公开了上述单克隆抗体6F12在检测DLL4蛋白的表达水平中的应用。

本发明还公开了上述单克隆抗体6F12在分选DLL4+DC中的应用。

本发明与现有技术相比具有下列优点：

本发明所述抗人DLL4单克隆抗体6F12可识别不同的DLL4分子抗原结合位点；其对细胞上DLL4蛋白具有高效价，高特异性和高识别能力，可用于科研Western Blot检测DLL4蛋白的表达水平。并且通过体外实验发现，单克隆抗体6F12与DC的结合与商品化的克隆MHD4-46相比并不会阻断DLL4+DC诱导Naïve T cells向Th1方向分化的能力；可用于流式细胞仪分选DLL4+DC，并且不会对下一步的DLL4+DC诱导Naïve T cells向Th1方向分化的功能性实验造成影响。

附图说明

图1 为实施例一中以流式细胞术分析商品化抗人DLL4抗体对转基因细胞CHO/DLL4上DLL4分子的识别结果图；

图2 为实施例一中6F12杂交瘤细胞株染色体的核型分析图（放大1000倍）；

图3 为实施例一中以Western Blot分析单克隆抗体6F12识别抗原的结果图；

图4为实施例一中以流式细胞术分析单克隆抗体6F12对转基因细胞CHO/DLL4上DLL4分子的识别结果图；

图5为实施例一中以流式细胞术分析单克隆抗体6F12识别的抗原位点的竞争性抑制的结果图；

图6为实施例二中以流式细胞术分析抗人DLL4单克隆抗体6F12对DLL4阳性的mDC诱导CD4+ Naïve T cell向Th1方向分化过程的作用。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例一抗人DLL4单克隆抗体的制备

1、转基因细胞CHO/DLL4的建立

（1）人DLL4基因的克隆

包含有人DLL4 全长CDS片段的质粒由厦门大学韩家淮实验室惠赠。以设计的带有限制性酶切位点的引物（表1）进行PCR扩增，反应条件为94℃变性60s，55℃退火60s，72℃延伸2min，共35 个循环后，再于72℃延伸5 min，得到全长片段；PCR产物通过回收试剂盒进行纯化。

表1 扩增引物序列

编号	核酸序列
		正向引物	5’- CGCGGATCCATGGCGGCAGCGTCCC -3’
反向引物	5’- CCGGAATTCTTATACCTCCGTGGCAATGACAC -3’

（2）人DLL4表达载体的构建

分别用限制性内切酶BamH I和EcoR I对回收的PCR产物和表达载体pcDNA3.1进行切割，反应后的PCR产物和表达载体通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，将含有目的条带的凝胶切下，利用回收试剂盒进行回收。在T4连接酶的作用下将PCR产物与表达载体链接，并转化感受态菌Top10。将转化后的细菌涂于含氨苄的平板上，培养过夜后挑取阳性菌落，煮菌并进行PCR鉴定，排除假阳性菌落后，保种并送测序。测序结果通过NCBI网站上Blast比对，选取序列一致无任何突变的克隆。利用质粒提取试剂盒将构建好的质粒进行提取，表达载体命名为pcDNA3.1/DLL4。

（3）稳定表达人DLL4的CHO转基因细胞的构建

将表达载体pcDNA3.1/DLL4用脂质体法转染预铺于6孔板中的CHO细胞，整个过程按试剂盒Lipofectamine(TM) 3000 操作手册进行。转染过夜后更换含10%FBS的1640培养基至2ml/孔，继续培养至48h后取部分细胞利用流式细胞术检测GFP阳性率。通过GFP阳性率来判断表达载体转染的效率。同时将部分细胞按适当比例稀释后，重新铺于6孔板中，使用含600mg/L G418（通过预筛选确定适宜的G418浓度）的选择性培养基，筛选培养；待具有抗性的转基因细胞生长至足够数量，利用商品化的抗人DLL4抗体标记，通过分选流式细胞仪将高表达人DLL4的转基因CHO细胞群体分选出来。分选获得的细胞通过亚克隆，挑选出单克隆细胞株。流式细胞仪检测挑选的单克隆细胞株上人DLL4的表达水平，挑选出阳性率和表达水平最高的克隆，参见图1。

2、分泌特异性鼠抗人DLL4抗体的杂交瘤细胞株的制备

使用如上得到的高表达人DLL4分子的转基因细胞（CHO/DLL4）作为免疫原，三次免疫接种Balb/c小鼠（10⁷/500ul/只）（间隔3周）。末次免疫后第四天，取小鼠脾脏细胞与P3X63Ag8小鼠骨髓瘤细胞株进行细胞融合（共10块96孔板）。以高表达人DLL4分子的CHO/DLL4为阳性对照以及CHO/mock为阴性对照，细胞按1：1的比例混合后，用间接免疫荧光法对杂交瘤培养物上清进行初步筛选。筛选出阳性阴性比例复合1：1特征的克隆。阳性克隆经复筛和亚克隆后获得稳定地分泌特异性鼠抗人DLL4抗体的杂交瘤细胞株6F12。

杂交瘤细胞经体外持续传代后，仍能稳定地分泌特异性抗体；对杂交瘤细胞株的染色体分析显示，参见图2，这两组杂交瘤细胞的染色体数目为80-110。

3、抗人DLL4单克隆抗体的生产与特性鉴定

（1）采用腹水体内诱生方法生产单克隆抗体

取6-8周龄的雌性Balb/c小鼠，腹腔内注入Pristane （0.5ml/只）。一周后腹腔内接种杂交瘤细胞（1×10⁶/只），同时再次腹腔内注射Pristane与福氏不完全佐剂的等体积混合物（0.2ml/只）。5-10天后收获腹水，并离心取上清于-80℃保存。

腹水液经去除纤维蛋白和盐析处理后，以蛋白 G亲和柱层析法纯化。收集蛋白峰流出液，对磷酸盐缓冲液（PBS）透析后用751紫外分光光度计测定抗体蛋白浓度为0.8~1.8mg/ml。SDS-PAGE结果表明， 6F12分泌的鼠抗人DLL4抗体可识别人DLL4重组蛋白（参见图3）。间接免疫荧光法分析结果表明，纯化的单克隆抗体的效价在1:10000以上（参见图4）。

（2）Ig亚类鉴定

采用试纸快速测定（Argen公司）法鉴定Ig亚类，结果显示6F12为小鼠IgG2b型抗体。

（3）抗体识别抗原位点的竞争性抑制试验

在LPS和R848刺激活化24h后的人PBMC中（1x10⁶/管）悬液加入单克隆抗体6F12（1：500，每管2ug），4℃孵育30分钟。洗细胞后依次加入Lin、HLA-DR、CD1C、CD123、DLL4荧光抗体，4℃孵育30分钟。再次洗涤后用流式细胞仪分析，同时设阳性和阴性对照，结果见图5。

实施例二单抗对DC的体外生物学效应

本实施例描述本发明的抗人DLL4单克隆抗体对DLL4阳性的mDC诱导CD4+ Naïve Tcell向Th1方向分化过程的作用

新鲜人外周血通过Ficoll分离获得人PBMC。使用美天妮的商品化分选试剂盒（CD1c⁺Dendritic Cell Isolation Kit），按美天妮提供的实验方案从PBMC中分选CD1c⁺ DC，获得的细胞通过流式细胞仪检测，纯度在90%以上。使用含10% FBS的RPMI-1640培养基进行培养，加入R848（终浓度为1ug/ml）和LPS（终浓度为100ng/ml）对DC刺激24h。

第2天采用另一份新鲜人外周血通过Ficoll分离获得人PBMC。使用Stem Cell的商品化分选试剂盒（EasySep Human CD4⁺ T cell Isolation Kit），按Stem Cell提供的实验方案从PBMC中分选CD4⁺T cell，获得的细胞通过流式细胞仪检测，纯度在95%以上。使用CFSE对分选获得的细胞进行标记。标记完成后按T cell：DC为10：1的比例，铺于U型底96孔（CD4⁺ T cell为1x10⁶/孔）进行混合培养。培养第4天进行补液。实验共设三组，分别为：对照组；加入6F12（2ug/孔）；加入6F12（2ug/孔）。

培养7天后收集细胞，使用eBioscience的商品化固定和破膜剂，按eBioscience提供的实验方案对细胞先进行CD4的细胞膜染色，再进行IFNg细胞内染色。流式检测结果显示，与对照组相比，6F12抗体作用组的T细胞中CFSE Low群体细胞内IFNg的表达水平和比例没有明显的改变（参见图6），独立重复实验显示各组间不具有统计学差异。说明单克隆抗体6F12与DC的结合并不会阻断DLL4⁺ DC诱导Naïve T cells向Th1方向分化的能力。

SEQUENCE LISTING

<110> 苏州大学附属儿童医院

<120> 抗人DLL4单克隆抗体6F12

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Glu Val His Val Lys Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met

1 5 10 15 20

Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Leu Leu His Trp Val Lys Gln Lys

25 30 35 40

Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Ile Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Arg Tyr

45 50 55 60

Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly

85 90 95 100

Thr Gly Thr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Leu Thr Val Ser Ser

105 110 115

<210> 2

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr

1 5 10 15 20

Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

25 30 35 40

Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg

45 50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly

85 90 95 100

Thr Lys Leu Glu Ile Lys

105

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

CGCGGATCCATGGCGGCAGCGTCCC 25

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

CCGGAATTCTTATACCTCCGTGGCAATGACAC 32

Claims

1.一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.14284。

2.由权利要求1所述杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体。

3.根据权利要求2所述单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的制备方法为在杂交瘤培养液中接种权利要求1所述杂交瘤细胞株，培养后将培养液分离纯化制备单克隆抗体。

4.根据权利要求2所述单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的制备方法为在动物腹腔内接种权利要求1所述杂交瘤细胞株，将动物腹水液分离、纯化制备单克隆抗体。

5.一种检测DLL4蛋白的表达水平的试剂，其特征在于，所述检测DLL4蛋白的表达水平的试剂由权利要求2所述单克隆抗体与分散介质混合制备得到。

6.根据权利要求5所述检测DLL4蛋白的表达水平的试剂，其特征在于，所述分散介质包括缓冲液。

7.一种氨基酸序列，其特征在于，所述氨基酸序列为SEQ.ID.NO:1。

8.一种氨基酸序列，其特征在于，所述氨基酸序列为SEQ.ID.NO:2。

9.权利要求2所述单克隆抗体在检测DLL4蛋白的表达水平中的应用。

10.权利要求2所述单克隆抗体在分选DLL4+DC中的应用。