CN104870476A - 靶向vegfr-2和dll4的双靶向抗体及包含它的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种靶向VEGFR-2的抗体，更具体地，涉及新形式的双靶向抗体，其中人Notch的钙结合EGF样结构域11和12结合到Tanibirumab轻链的N端，编码该抗体的基因，包括该基因的重组表达载体，使用该重组表达载体遗传修饰的宿主细胞以及通过培养该宿主细胞生产双靶向抗体的方法，包括该双靶向抗体的药物组合物，以及测量该双靶向抗体的DLL4拮抗剂效力的方法，其中Notch1活性是通过共培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和表达人DLL4的细胞系(hDLL4)来测量。本发明的双靶向抗体的优势在于更有效地同时打断VEGF/VEGFR-2和DLL4/Notch1两不同信号转导路径，能够治疗各种血管生成相关的疾病，如肿瘤，特别是，能够克服由于单独使用新血管的治疗剂造成的抗性，并通过直接靶向癌症干细胞能够从根本上防止癌症复发。

Description

靶向VEGFR-2和DLL4的双靶向抗体及包含它的药物组合物

技术领域

本发明涉及一种新形式的双靶向抗体，其中DLL4的拮抗剂结合到靶向VEGFR-2的抗体的末端以额外靶向人DLL4，编码该抗体的DNA，包括它的重组表达载体，转化了该重组表达载体的宿主细胞，使用该宿主细胞生产双靶向抗体的方法，包括该双靶向抗体的药物组合物，以及测量该双靶向抗体的DLL4拮抗剂功效的方法。

背景技术

血管生成是内皮细胞通过生长、分裂、迁移等从现有的血管生成新血管的机制，其在正常生长过程中起重要作用包括伤口愈合或女性月经周期(Risau,Nature,386:671,1997)，而且，已知异常过度血管在疾病，如肿瘤生长和转移，年龄相关性黄斑变性(ARMD)，糖尿病性视网膜病，银屑病，类风湿性关节炎，慢性炎症中至关重要的作用(Carmeliet and Jain,Nature,407:249,2000)。

假设肿瘤生长和转移是血管生成依赖性的，因此，Dr.J.Folkman在1971年提出了关注于抗血管生成的治疗可能是用于治疗实体瘤的新治疗剂。此后，对于涉及抑制过多的血管生成机制的技术的研究吸引了众多研究者的关注(Ferrara and Kerbel,Nature,435:967,2005)。血管生成的进展方面是通过血管生成诱导剂和血管生成抑制剂的综合平衡来确定的，并且由复杂的多步骤顺序过程影响进展。详细地说，由肿瘤或受伤组织分泌的各种血管生成诱导剂(包括血管内皮生长因子(VEGF))被结合到相应的现有外周血管内皮细胞的相应受体以活化血管内皮细胞，从而增加血管内皮细胞的通透性，以及分泌蛋白酶如基质金属蛋白酶(MMP)，其分解基底膜和细胞外基质周围的血管内皮细胞，使得血管内皮细胞从现有的毛细血管逸出和朝向分泌血管生成诱导剂的组织迁移/增生。迁移和增殖的血管内皮细胞形成血管内管结构，最后，引入作为血管内皮细胞的结构支撑的周细胞以实现稳定且成熟的血管形成。

如上所述，已发现VEGF和结合至VEGF的VEGF受体(VEGFR)的信号途径受抑制，最终抑制血管生成，从而获得对各种疾病的治疗效果，如年龄相关的黄斑变性，糖尿病性视网膜病，牛皮癣，类风湿关节炎和慢性炎症，包括肿瘤生长和转移，因此，一直在进行能够抑制VEGF活性的各种药物的开发。

具体地，在1989年由来自Genentech的N.Ferrara博士组通过蛋白质分离、纯化和cDNA克隆形成VEGF(Leung et al.,Science,246:1306,1989)。迄今已知也被称作VEGF-A的VEGF具有四种同种型(VEGF121、VEGF165、VEGF189和VEGF206)，并且据报道，在这四种同种型中，VEGF 165在除了胎盘外的所有人体组织中是最丰富的(Tisheret al.,J.Biol.Chem.,266:11947,1991)。已知VEGF以显著高的亲和力结合受体VEGFR-1和VEGFR-2/KDR；然而，VEGF的信号转导主要通过VEGFR-2转移以诱导与血管生成相关的机制，例如血管内皮细胞的增殖、迁移等。由于上述原因，VEGF和VEGFR-2成为用于抑制VEGF诱导的血管生成机制的主要靶标，并且若干论文是针对于VEGF和VEGFR-2(Ellisand Hicklin,Nature Rev.Cancer,8:579,2008；Youssoufian et al.,Clin.CancerRes.,13:5544s,2007)。

例如，阿瓦斯汀(贝伐单抗，Genentech)是一种靶向VEGF-A的人源化抗体(Ferrara et al.,Biochem.Biophy.Res.Comm.,333:328,2005)，分别在2004年获得美国FDA批准用于转移性结肠癌的治疗，在2006年批准用于非小细胞肺癌，和在2008年批准用于Her-2阴性转移性乳腺癌，并且被批准用于治疗多形性成胶质细胞瘤(GBM)和肾癌。目前，对各种实体瘤的临床试验正在进行中，以扩大适应症。此外，同一家公司开发的Lucentis，是通过从阿瓦斯汀仅切割Fab片段所制备的抗体(Eter et al,Biodrgus,20:167,2006)，在为了抑制作为老年性黄斑变性的主要样态的黄斑周围的过度血管生成而被注入视网膜时，Lucentis具有良好透气性，它作为治疗剂用于湿性年龄相关的黄斑变性(湿ARMD)，已于2006年获得美国FDA批准。

作为另一种靶向VEGF的用于治疗的抗体，有Regeneron公司生产的VEGF-trap(Holash et al.,PNAS,99:11393,2002)。VEGF-trap是VEGFR-1的第二免疫球蛋白结构域和VEGFR-2的第三免疫球蛋白结构域融合到人Fc的可溶性诱饵受体，其尚未得到美国FDA批准，但已经进行到转移性乳腺癌、转移性肺癌、结直肠癌、激素难治性前列腺癌等的三期阶段。

同时，靶向VEGFR-2(它是VEGF受体)的抗血管生成的抗体的例子，包括由Imclone公司生产的IMC-1121B(EP 1916001A2)，由UCB公司生产的CDP-791(PCT/GB02/04619)，由本发明人开发并已进入临床试验的Tanibirumab(TTAC-0001)(WO2008/153237)等等。

IMC-1121B是选自人Fab文库的单克隆抗体，其已经进行到转移性乳腺癌的三期阶段，并在2010年进入胃癌的三期阶段。由UCB生产的CDP-791是人源化抗体，其以PEG化的Di-Fab形式已经进行到非小细胞肺癌的二期阶段。由于该抗体不具有Fc，因此可能无法预期抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或补体依赖性细胞毒性。

最后，由本发明人开发的Tanibirumab(TTAC-0001)是选自全长人单链抗体库的单克隆抗体，并且是唯一的与小鼠和大鼠来源的flk-1(VEGFR-2同源物)具有反应性而同时靶向VEGFR-2的抗体，这是与Imclone生产的IMC-1121B重要区别的特征之一(WO2008/153237)。具体地，通过Tanibirumab抑制跨物种的交叉反应性可能使研究进入到动物疾病模型，以进行对特定癌症分期的抗癌剂的未来发展，这使得相关研究更容易。

如上所述，针对于VEGF和VEGFR-2的研究在过去的五年急剧发展，通过市场和临床研究开发出许多治疗剂。

与此同时，通过VEGF/VEGFR-2信号分化成Tip细胞的细胞强烈表达DLL4并结合到存在于周围细胞中的Notch1受体，Notch1信号途径被激活的细胞分化成柄CellIs以形成正常的血管管结构，这证明了DLL4/Notch1信号传导途径是对VEGF/VEGFR-2路径和血管生成最重要的机制之一(Dufraine et al.,Oncogene,27:5132～5137,2008)。

迄今已知DLL4是Notch受体的配体之一，在哺乳动物中有四种Notch受体(Notch 1至4)和5种Notch配体(Jagged-1、Jagged-2、DLL1、DLL3和DLL4)。Notch信号传导途径被一个细胞的Notch配体结合至其它细胞的Notch受体发起，并且仅由不同细胞之间的直接相互作用所必然激活(Bray SJ,Nat Rev Mol Cell Biol.,7(9):678,2006)。

当Notch配体结合于Notch受体时，ADAM金属蛋白酶首先被激活，裂解Notch受体的细胞膜外近侧的位点，然后γ分泌酶复合物被激活，裂解所述Notch受体的细胞膜内侧的位点，使得Notch胞内结构域(NICD)被分离并迁移到细胞核中。NICD结合到RBPJ/CSL转录因子以诱导Notch靶基因的表达，如包括Hes和Hey的碱性螺旋-环-螺旋蛋白。Notch信号传导途径根据相应细胞的情况确定增殖/分化/凋亡，并对维持正常干细胞和癌干细胞起着重要作用。

基本上，所有Notch受体都能够被结合到所有Notch配体；然而，在相应的细胞的微环境中，各种结合的组合受到选择性控制。例如，在胎儿发育过程期间，DLL4在血管生成内皮细胞上强烈表达，并结合在外周内皮细胞中表达的Notch1和Notch4；然而，DLL4-Notch1结合以独特的方式是最重要的(Yan M,Vasc Cell,2011)并且通过DLL4-Notch1结合使血管生成进展。上述描述在基因缺陷测试等中普遍发现的(Duarte et al.,Genes Dev,2004；Gale et al.,PNAS,2004；Krebs et al.,Genes Dev,2004)。

因此，当DLL4-Notch1结合被抑制时，会抑制血管生成，因此，能够治疗诸如肿瘤等的各种疾病。已经证明，当在癌症治疗中使用Avastin(贝伐单抗)等抑制VEGF时，血管生成受到抑制，肿瘤的灌注减少并且肿瘤大小减小。同时，当与Notch1的结合在周细胞中表达，而靶向DLL4被抑制，异常且大量生成血管(高度芽生)，但没有实现完整的功能，这减少了非功能性肿瘤灌注，并且结果是，肿瘤尺寸减小(Thurston et al,,Nat RevCancer,7(5):327,2007)。

有趣的是，当将抑制VEGF和DLL4的抗体给药于Genentech公司的研究小组执行的使用若干肿瘤细胞系的异种移植动物实验中时，相比于单独给予抑制VEGF的抗体和抑制DLL4的抗体的情况，癌症的生长非常强烈地受到抑制(Ridgway et al.,Nature,444(7122):1083,2006)。表明通过DLL4/Notch1路径的信号不是简单地被VEGF/VEGFR-2途径激活，以及通过同时抑制两条路径的信号传导，可以有效地治疗诸如肿瘤的各种血管生成相关的疾病。

此外，人们发现，DLL4抑制对于对VEGF/VEGFR-2路径抑制剂敏感的肿瘤和对VEGF/VEGFR-2路径抑制剂抵抗的肿瘤两者都有效果(Ridgway et al.,Nature.,444(7122):1083,2006；Noguera-Troise et al.,Nature.,444(7122):1032.2006)，这提供了克服给予诸如阻断VEGF的Avastin药物时当前频繁发生的抵抗(包括Avastin从开始就没有效的固有抵抗和Avastin的效力随时间逐渐下降的获得性抵抗两种情形)的显著重要的线索。

此外，从Oncomed研究小组发现，DLL4抑制直接减少在肿瘤中癌干细胞的频率并抑制肿瘤生长(Hoey et al.,Cell Stem Cell.,2009)，这表明DLL4抑制能够基本上阻断癌症复发。最后，对目前用于癌症治疗的抗癌化学疗法和抗体治疗剂(例如赫赛汀等)的抗性与Notch信号传导途径很大的相关性并且抑制DLL4/Notch1路径也可以克服对抗癌化学疗法和抗体治疗剂(例如赫赛汀等)的抗性(Wang et al.,Biochim Biophys Acta.,1806(2):258,2010)。

如上所述，诸如肿瘤等的各种血管生成相关的疾病，能够通过同时抑制由血管内皮生长因子的两个路径VEGF/VEGFR-2和DLL4/Notch 1而被有效治疗。然而，尚未开发出对此有效的药物，并因此，迫切需要相关的发展。

发明内容

本发明人对开发能够治疗各种与血管生成相关的疾病如肿瘤等的治疗剂进行了研究，通过更有效且同时抑制VEGF/VEGFR-2和DLL4/Notch1两种路径的信号传导来解决上述问题，结果发现，同时靶向VEGFR-2和DLL4的双靶向抗体有效地发挥了治疗各种血管生成相关的疾病的效果，从而完成了本发明。

本发明的一个目的是通过使抗体结合VEGFR-2和拮抗剂结合DLL4来提供同时靶向VEGFR和DLL4的双靶向抗体。

本发明的另一个目的是提供一种编码该双靶向抗体的DNA，和包括它的重组表达载体。

本发明的另一个目的是提供一种转化有该重组表达载体的宿主细胞，以及通过使用该宿主细胞生产根据本发明的双靶向抗体的方法。

本发明的另一个目的是提供一种用于治疗血管生成相关的疾病的药物组合物，其包含双靶向抗体。

附图说明

图1表示结合至DLL4的Notch1的EGF样结构域11和12的氨基酸序列。

图2是根据本发明的载体PMC-201v213的图表。

图3表示通过使用293-T细胞，并由SDS-PAGE确认纯化的双靶向抗体的生产，随机表达根据本发明的载体所获得的结果。

图4表示根据本发明的双靶向抗体与VEGFR-2和人DLL4的结合亲和力的ELISA分析结果。

图5表示根据本发明的双靶向抗体与人DLL4的结合亲和力的Biacore分析结果。

图6表示根据本发明的双靶向抗体与人DLL4的结合亲和力的流式细胞仪分析结果。

图7表示根据本发明的双靶向抗体对HUVEC的增殖测定法的结果。

图8表示根据本发明的双靶向抗体竞争性抑Notch-Fc与人DLL4结合的现象的FACS分析结果。

图9表示根据本发明的双靶向抗体抑制由Notch 1活化启动子的现象的萤光素酶发光测定法的结果。

图10表示在涂布hDLL4的培养皿中的培养根据本发明的双靶向抗体和HUVEC时，通过激活Notch-1增加notch胞内结构域(NICD)被抑制的现象的印迹分析的结果。

图11表示在表达hDLL4的293细胞系中，共培养根据本发明的双靶向抗体和HUVEC时，通过激活Notch-1增加notch胞内结构域(NICD)被抑制的现象的印迹分析的结果。

具体实施方式

只要没有以其他方式限定，那么在本说明书中使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域技术人员通常的理解相同的含义。通常，在本说明书和下面描述的实验方法中所使用的命名法是在本技术领域中公知且通常使用的。

在一个用于实现本发明目的的实施方式中，本发明提供一双靶向抗体，其中DLL4的拮抗剂结合到特异性结合于VEGFR-2的抗体的末端。

已确认的是，根据本发明的双靶向抗体通过更有效地抑制血管生成而具有抑制由血管生成引起的疾病的效果，并且对VEGFR-2和DLL4每种靶标都具有结合亲和力。此外，从HUVEC增殖抑制实验中证实，相比于只单一靶向VEGFR-2的抗体如Tanibirumab，根据本发明的双靶向抗体具有优异的HUVEC增殖抑制能力。

在本发明中，术语“双靶向抗体”是指对一种或多种靶标具有结合亲和力或拮抗作用的抗体，并且是指这样的抗体，其中与不同的靶标具有结合亲和力或拮抗作用的两种抗体彼此结合或对一个靶标具有结合亲和力的抗体结合至对另一个靶标具有拮抗作用的物质。

另外，在本发明中，术语“抗体”包括多克隆抗体和单克隆抗体两者，其中可使用抗体分子的片段，以及包括具有全长的两条轻链和具有全长的两条重链的完整形式。抗体分子的片段是指拥有抗原结合功能所必需的片段，并且包括单链、Fv(scFv)、Fab、F(ab’)、F(ab’)₂、单结构域等。

优选地，根据本发明的双靶向抗体具有其中对血管生成因子特异的抗体或这种血管生成因子的受体结合到血管生成拮抗剂的形式，即，血管生成因子的拮抗剂或这样的血管生长因子的受体。

在根据本发明的双靶向抗体中，可使用特异性结合VEGFR-2的抗体而没有限制，只要它是结合至VEGFR-2来抑制VEGF/VEGFR-2信号转导的抗体，优选Tanibirumab抗体或贝伐单抗，或其变体，但本发明不限于此。

此外，可使用DLL4的拮抗剂而没有限制，只要它是具有抑制DLL4/Notch1信号转导性质的物质，特别是，优选其中的Notch1的细胞结构域缺失的可溶性受体，但本发明并不限于此。更优选地，作为DLL4的拮抗剂，可以特别使用DLL4的Notch1受体的第十一和第十二EGF样结构域(以下，称为“notch1最小诱饵”)。

虽然DLL4的拮抗剂能与特异结合于VEGFR-2的抗体的重链或轻链的N-末端或C-末端结合，优选地，可以与重链或轻链的N-末端结合，并且更优选地，与轻链的N-末端结合而没有限制。

在本发明中提供的称作PMC-201的最优选的双靶向抗体具有这样的形式，其中DLL4的拮抗剂，特别是DLL4的Notch1最小诱饵链接到特异性结合VEGFR-2的抗体的末端，特别是轻链的N末端，其中，其特征在于，所述VEGFR-2特异性抗体是Tanibirumab及其变体。

本发明的“血管生成”是指这样的细胞现象，其中血管内皮细胞增殖并重构以从现有的血管网络形成新的血管。促进血管发生、内皮细胞生长、血管稳定性和血管形成的血管生成因子参与血管生成。血管生成因子包括血管内皮生长因子(VEGF)和VEGF家族，胎盘生长因子(PIGF)家族，血小板源性生长因子(PDGF)家族，DLL4，成纤维细胞生长因子家族(FGF)，TIE配体(血管生成素(angiopoietin))，肝配蛋白，Del-1，成纤维细胞生长因子(酸性(aFGF)和碱性(bFGF))，卵泡抑素，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，肝细胞生长因子(HGF)/分散因子(SF)，白介素-8(IL-8)，瘦素，中期因子，胎盘生长因子，血小板源性内皮细胞生长因子(PD-ECGF)，血小板源性生长因子，特别是PDGF-BB或PDGFR-β，多营养因子(PTN)，颗粒素蛋白前体(progranulin)，增殖蛋白，转化生长因子-α(TGF-α)，转化生长因子-β(TGF-β)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，血管内皮生长因子(VEGF)/血管渗透因子(VPF)等的成员，但不特别限定于此。

本发明的术语：“血管生成拮抗剂”是指直接或间接抑制血管发生、血管形成或不希望的血管通透性的低分子量材料、多核苷酸、多肽、分离的蛋白质、重组蛋白、抗体或其缀合物或双靶向抗体。此外，血管生成抑制剂包括结合到血管生成因子或其受体以阻断血管生成被激活的物质。例如，血管生成抑制剂包括血管生成剂的抗体或其它拮抗剂，例如VEGF-A或VEGF-A的可溶性受体(例如，可溶性KDR受体或Flt-1可溶性受体)，VEGF-捕获物，血管生成素2，Notch1可溶性受体诱饵，或其保持了与其材料的配体的结合亲和力的片段，但本发明不局限于此。

如上所述，优选地，本发明提供了双靶向抗体，其采用这样的形式，即DLL4的拮抗剂特别是DLL4的Notch1最小诱饵连接到特异性结合VEGFR-2的抗体末端，其中该VEGFR-2特异性抗体优选Tanibirumab或其变体，并优选由具有选自SEQ ID NO：1至3的任一序列的重链可变区和具有选自SEQ ID NO：4至6的任一序列的轻链可变区组成。

具体地讲，VEGFR-2特异性抗体优选由SEQ ID NO：1的重链可变区和SEQ ID NO：4的轻链可变区，SEQ ID NO：2的重链可变区和SEQ IDNO：5的轻链可变区，或SEQ ID NO：3的重链可变区和SEQ ID NO：6的轻链可变区组成，并且VEGFR-2特异性抗体可另外在可变区包括恒定区。此外，对本领域技术人员显而易见的是只要拥有与VEGFR-2的结合亲和力，那么其片段或氨基酸修饰也包括在本发明的范围内。

表1

[表1]

根据本发明结合至VEGFR-2的抗体的Hv和Lv的序列

此外，根据本发明的DLL4的Notch1最小诱饵优选由SEQ ID NO：7的氨基酸序列组成。然而，本领域技术人员显而易见的是，只要保留了对DLL4的拮抗作用，那么具有氨基酸的变化、缺失和插入的变体也包括在本发明的范围内。

在根据本发明的双靶向抗体中，特异地结合到VEGFR-2的抗体和DLL4的拮抗剂可以通过各种方法彼此连接，例如通过接头结合、化学直接结合、基因融合等。优选地，抗体和拮抗剂可以通过经由接头(更优选通过氨基酸接头)结合而进行连接。根据本发明优选的氨基酸接头具有SEQ IDNO：8的氨基酸序列。

表2

[表2]

根据本发明的Notch1最小诱饵及氨基酸接头的氨基酸序列

因此，一种双靶向抗体的轻链-氨基酸接头-Notch1最小诱饵蛋白，其中DLL4的Notch1最小诱饵经由具有SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的氨基酸序列的氨基酸接头连接到根据本发明的双靶向抗体的轻链N-末端。

表3

[表3]

根据本发明的连接有双靶向抗体的轻链可变区-Notch1最小诱饵的结构的氨基酸序列

(氨基酸接头序列加下划线)

另外，本发明提供了编码所述双靶向抗体的多核苷酸序列和包括它的重组载体。

编码双靶向抗体的多核苷酸序列可以由本领域技术人员容易地衍生自SEQ ID NO：1至10的氨基酸序列。此外，允许编码前导序列的多核苷酸定位在双靶向抗体的N末端，其可用于生产根据本发明的双靶向抗体。

术语：“重组载体”在本发明中是一种能够在适当的宿主细胞中表达靶蛋白的表达载体，并指示包括彼此有效连接以表达基因插入物的必需控制元件的基因构建体。

在本发明中的术语“有效连接”是指核酸表达调控序列和编码靶蛋白的核酸序列彼此功能性地连接，以便执行普通功能。与重组载体的有效连接可以通过使用本领域公知的基因重组技术来进行，并且可以通过使用本领域公知的酶容易地进行位点特异性DNA切割和连接。

本发明的合适的表达载体除了表达控制元件，如启动子、起始密码子、终止密码子、聚腺苷酸化信号和增强子以外，还可以包括用于膜靶向或分泌的信号序列。起始密码子和终止密码子一般被认为是编码免疫学靶标蛋白的核苷酸序列部分，并且当给予基因构建体时，在被注入的主体中应表现出功能，并应与编码序列一起在框内。一般的启动子可以是组成型或诱导型的。原核细胞具有lac、tac、T3和T7启动子，但本发明不限于此。真核细胞具有猴病毒40(SV40)启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)启动子，例如，HIV长末端重复序列(LTR)启动子、莫洛尼病毒启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、人类疱疹病毒(EBV)启动子、劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子，并且还具有β-肌动蛋白启动子，人血红蛋白-、人肌酸-、人金属硫蛋白-源性启动子，但本发明不限于此。

表达载体可以包括筛选标记，用于选择含有载体的宿主细胞。筛选标记用于筛选转化有载体的细胞，其中，可以使用提供可选择标志物表型如药物抗性、营养缺陷型、细胞毒性剂抗性，或表达表面蛋白质的标记物，由于在用筛选剂处理过的环境中只有表达该筛选标记的细胞存活，因此能够筛选转化细胞。此外，在载体是可复制的表达载体的情况下，载体可以包括复制起点，该复制起点是启动复制的特定的核酸序列。

作为插入外源基因的重组表达载体，可以使用各种载体，例如质粒、病毒、粘粒等。重组载体的种类没有特别限制，只要它在原核细胞和真核细胞的各种宿主细胞中表达目的基因，并产生所希望的蛋白质；然而，优选的是强表达载体，其具有展现出强活性的启动子，而同时以类似于天然状态的形式大规模生产外源蛋白。

为了表达根据本发明的双靶向抗体，可以使用各种表达宿主/载体组合。适合于真核宿主的表达载体的实例包括来自SV40的表达调控序列，牛乳头状瘤病毒，腺病毒，腺相关病毒，巨细胞病毒和逆转录病毒，但本发明不限于此。在细菌宿主中可用的表达载体包括从大肠杆菌获得的细菌质粒，如PET、pRSET、pBluescript、pGEX2T、pUC载体、col E1、pCR1、pBR322，pMB9和它们的衍生物，具有大范围宿主的质粒如RP4，明显包括各种噬菌体λ衍生物的噬菌体DNA如gt10、gt11、NM989，和其它DNA噬菌体如M13和丝状单链DNA噬菌体。。在酵母细胞中可用的表达载体为2质粒或其衍生物。在昆虫细胞中可用的载体是pVL941。

根据本发明的另一个实施方式，本发明提供转化有重组载体的宿主细胞。重组载体插入到宿主细胞中形成转化体。载体的合适的宿主细胞可以包括原核细胞如大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，链霉菌属，假单胞菌属，变形杆菌或葡萄球菌属。此外，宿主细胞可以是真核细胞，包括真菌如曲霉属，酵母菌如巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母裂殖酵母属和粗糙脉孢菌，以及其它低等真核细胞和来自昆虫的高等真核细胞。此外，宿主细胞可以衍生自植物和哺乳动物。优选地可利用猴肾细胞7(COS7)，NSO细胞，SP2/0，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，W138，婴儿仓鼠肾(BHK)细胞，MDCK，骨髓瘤细胞系，HuT 78细胞和HEK293细胞，但本发明不限于此。特别是，CHO细胞是优选的。

术语“转化到宿主细胞中”在本发明中可以包括将核酸导入生物体、细胞、组织或器官中的任何方法，并且可以根据本领域已知的宿主细胞通过选择适当的标准技术来进行。用于转化的方法包括电穿孔、原生质体融合、磷酸钙(CaPO₄)沉淀、氯化钙(CaCl₂)沉淀、用碳化硅纤维搅拌、农杆菌介导的转化、聚乙二醇(PEG)、聚乙酰亚胺(PEI)、硫酸葡聚糖、脂质体和干燥/抑制介导的转化；然而，本发明不限于此。

根据本发明的另一个实施方式，本发明提供生产根据本发明的双靶向抗体的方法，包括培养转化有重组载体的宿主细胞。

根据本发明的双靶向抗体优选通过基因重组方法经表达和纯化得到。具体地，编码抗体的重链可变区或重链的整个区域的基因序列和编码轻链可变区或轻链的整个区域的基因序列可以在一个单独的载体或分别在两个载体中表达，其中氨基酸接头和/或编码DLL4的拮抗剂的基因序列可连接到对应于所述重链或轻链的N末端的位点以诱导在细胞表达系统中的表达，从而产生根据本发明的双靶向抗体，但本发明不限于此。

具体而言，产生双靶向抗体的方法可包括：通过将编码本发明的双靶向抗体的核苷酸序列插入到载体中制备重组载体；将重组载体转化到宿主细胞中并培养转化体；和从培养的转化体中分离并纯化双靶向抗体。

更具体地，双靶向抗体可以通过在营养培养基中培养具有表达的重组载体的转化体而大量生产，其中可根据宿主细胞适当选择培养基和孵育条件。可以适当地控制诸如培养基的温度、pH值、培养时间等条件，以适合于在培养时的细胞生长和发育以及蛋白质的大规模生产。

如上所述的重组产生的肽或蛋白可以从培养基或细胞分解来回收。在膜结合型的情况下，所述肽或蛋白质可以通过使用合适的表面活性剂溶液(例如Triton-X100)或酶促裂解与膜分离。用于表达双靶向抗体的细胞可通过各种物理或化学的手段被破坏，如冻融纯化、声波处理、机械损伤和细胞分解剂，并且可以并通过一般的生化分离技术(Sambrook et al.,MolecularCloning:A laborarory Manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)；Deuscher,M.,Guide to Protein Purification Methods Enzymology,Vol.182.Academic Press.Inc.,San Diego,CA(1990))被分离。电泳、离心、凝胶过滤、沉淀、渗析、层析法(离子交换层析、亲和层析、免疫层析、尺寸排阻层析等)、等电聚焦以及各种变化和复杂的方法是可用的，但本发明并不限于此。

根据本发明的另一个实施方式，本发明提供了一种用于抑制血管生成或治疗癌症的组合物，该组合物包括双靶向抗体。本发明中的术语“抗癌”包括“预防”和“治疗”；其中“预防”是指通过注射含有本发明抗体的组合物使癌症的所有行为得到抑制或延迟，并且“治疗”是指通过注射含有本发明抗体的组合物使癌症症状的所有行为以有利的方式得到改善或改变。

能够被本发明的组合物治疗的癌症或肿瘤没有特别的限制，但包括实体瘤和血液肿瘤。优选地，癌症的实例包括结肠癌、结肠直肠癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、支气管癌、鼻咽癌、喉癌、胰腺癌、膀胱癌、胰脏癌、宫颈癌、脑癌、前列腺癌、骨癌、皮肤癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾癌、食道癌、胆道癌、睾丸癌、直肠癌、头颈癌、宫颈癌、输尿管癌、骨肉瘤、神经细胞瘤、黑色素瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、星形细胞瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤等。

本发明的抗癌组合物可另外包含药学上可接受的介载体。对于口服给药，可以使用粘合剂、润滑剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、色素、调味剂等。对于注射剂，可以混合使用缓冲剂、防腐剂、安抚剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂。对于局部给药，可以使用碱性物质、赋形剂、润滑剂、防腐剂等等。本发明中的药物组合物可以与上述药物可接受的介载体混合以具有各种配方。例如，对于口服给药，制剂可以形成为片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、晶片等。对于注射，制剂可以以单一单位剂量安瓿或以多剂量形式来制备。此外，抗癌组合物可以典型地包括一种促进运动(包括通过膜)的表面活性剂。表面活性剂的实例包括类固醇源性材料，阳离子脂质如N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)，各种化合物如胆固醇半琥珀酸酯、磷脂酰甘油等。

根据本发明的另一个实施方式，本发明提供通过向受试者给予本发明的双靶向抗体或含有该双靶向抗体的组合物来治疗癌症和抑制癌细胞生长的方法。可以以治疗癌细胞或其转移或抑制癌生长的药学上有效量给予含有根据本发明的双靶向抗体的组合物。给药量可根据各种因素变化，如癌症类型、患者的年龄和体重、症状的特征和严重程度、目前的治疗种类、治疗次数、给药类型和途径等，并且可以由相应领域中的专家很容易地确定。本发明的组合物可与上述的药理学或生理学成分一起给药，或者可以顺序地给予。另外，本发明的组合物可以与另外的常规治疗剂组合给予，并且可以与常规的治疗剂顺序给予或同时给予。给药可以是单一或多次给药。考虑所有上述因素，给予能获得最大效果而没有副作用的最小量的量是重要的，并且可以容易地由本领域的技术人员来确定。

在本发明中，术语“受试者”是指罹患了需要通过给予根据本发明的双靶向抗体而得以减轻、抑制或治疗的疾病或病症，或有此类风险的哺乳动物，优选人类。

在本发明中，术语“给药”是指通过任何适当的方法向受试者导入预定材料，其中可以通过任何一般路线给予含有本发明双靶向抗体的组合物，只要该组合物到达期望的组织。可以使用腹膜内给药、静脉内给药、肌内给药、皮下给药、皮内给药、口服给药、局部给药、鼻内给药、肺内给药、直肠内给药，但本发明不限于此。然而，由于在口服给药的情况下蛋白质会被消化，口服组合物优选是通过在其上包被活性剂来提供，或被配制以保护该组合物免于在胃中被消化。此外，该药物组合物可通过活性剂可以在其中移动到靶细胞的任何装置来给予。

另外，本发明提供一种测量双靶向抗体的DLL4拮抗剂功效的方法，该方法包括通过共培养表达人DLL4(hDLL4)的细胞系或重组细胞系与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，测量Notch 1活性。

在本发明中，Notch 1活性由测量NICD的表达量所表征，并且当Notch配体结合于Notch受体，ADAM金属蛋白酶被首先激活，裂解Notch受体的细胞膜外近端的位点，然后γ分泌酶复合物被激活，裂解Notch受体的细胞膜内近端位点，使得Notch胞内结构域(NICD)被分离并迁移到细胞核。NICD结合到RBPJ/CSL转录因子以诱导Notch靶基因的表达，如包括Hes和Hey的碱性螺旋-环-螺旋蛋白。

NICD的表达量的测量是通过选自SDS-PAGE、Western印迹、免疫组织化学染色法、免疫染色法、免疫荧光法、ELISA测定法(直接测量)，和荧光素酶检测(间接测量)组成的组中的方法执行的，但也可以通过本领域中测量蛋白质表达的已知方法来进行而不受限制。在本发明中，NICD的表达量优选通过Western印迹来测量。

具体地，表达人DLL4(hDLL4)的细胞系或重组细胞系与HUVEC的共培养可以通过包括以下步骤来执行：(a)培养HUVEC；和(b)将过表达hDLL4的293细胞系(293-hDLL4)和双靶向抗体反应并在步骤(a)培养的HUVEC中进行处理，以达到共培养。经证实，通过Notch-1激活所显现出的NICD的表达量被本发明实施例中的共培养方法所产生的双靶向抗体PMC-201所减少。

此外，根据用于测量双靶向抗体的hDLL4拮抗剂功效的方法(其表征为Notch 1的活性是通过NICD的表达量来测量)，NICD启动子活性可通过使用荧光素酶测定法利用NICD的量来测量，并且双靶向抗体的hDLL4拮抗剂功效可以通过在hDLL4包被的板上处理并培养HUVEC和双靶向抗体PMC-201并测量HUVEC中的NICD量来测量，如在本发明其他实施例中所确认。

以下，参考以下实施例对本发明进行更详细说明。然而，提供以下实施例仅仅是用于例示本发明，对本领域技术人员显而易见的是，本发明的范围不应解释为受限于这些实施例。

实施例1：用于瞬时生产双靶向抗体PMC-201的表达载体的制备

在鉴定出相应结构域的氨基酸碱基序列(图1和SEQ ID NO：7)后，通过基因合成(包括基因优化，GeneArt，德国)获得编码结合到hDLL4的Notch1最小诱饵(Notch1的钙结合EGF样结构域11和12)的DNA。

使用由13个氨基酸组成的G4S接头(S GGGG SGGGGS GS)，将77个氨基酸碱基序列克隆至Tanibirumab的轻链N-末端(参见在国际专利申请号PCT/KR07/003077中公开的TTAC0001)以生产在293-T细胞系(ATCC，CRL-11268^TM)具有优化表达的双靶向抗体PMC-201表达载体(图2)。经确认的重组载体命名为“PMC-201-v213”。

实施例2：双靶向抗体PMC-201的生产和鉴定

诱导转导到293T细胞中的完整表达载体PMC-201-v213的随机表达，并通过SDS-PAGE和Western印迹确认表达的发生。使用lipofectamine^TM2000(Invitrogen#11668-019，USA)并按照生产商的说明进行转导。简言之，将每孔5×10⁵个293T细胞接种到含有αMEM培养基(Welgene，韩国)的6孔板中，然后于37℃在CO₂(5％)加湿培养箱中静置24小时，从而实现具有约80％至90％的细胞密度的致密培养。将2μg重组载体(PMC-201-v213)和6μl lipofectamine^TM 2000分别在250μl无血清αMEM培养基中稀释，并在室温下放置5分钟。

将DNA稀释溶液与lipofectamine^TM 2000稀释溶液混合并使其在室温下反应20分钟，形成DNA-lipofectamine^TM 2000复合物。从孵育的细胞中除去现有培养基后，向每个孔中加入500μl的DNA-lipofectamine^TM 2000复合物和500μl无血清αMEM培养基，并于37℃在CO₂培养箱中孵育6小时。向其中加入1ml含有20％经透析的胎牛血清的αMEM培养基，并孵育48-72小时。然后，仅分离上清液，并通过SDS-PAGE确认是否表达了所述抗体。SDS-PAGE是通过本领域中已知的方法进行，所用样品如下：12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶，PVDF膜(Millipore#IPVH00010，美国)，HRP-缀合的山羊抗-人IgG(κ)抗体，以及HRP缀合的山羊抗人-IgG(Fc)抗体(Pierce，美国)。

结果是，通过SDS-PAGE和Western印迹可以确认表达了双靶向抗体PMC-201，并且通过使用蛋白A亲和柱、SP-琼脂糖柱和大小排阻柱的快速蛋白质液相色谱(FPLC)，获得了具有95％或更高纯度的纯化抗体(图3)。

实施例3：双靶向抗体PMC-201的结合亲合力测试

3-1：与VEGFR-2和hDLL4的结合亲和力测试

使用ELISA进行结合亲和力测定法，确认双靶向抗体PMC-201是否结合到VEGFR-2和hDLL4。将1μg/ml的VEGFR-2的细胞外结构域1-3(以下，称为VEGFR-2 ECD)和DLL4各自分开并在室温下在96孔平板中包被，持续2小时，在室温下用2％脱脂奶/PBS进行封闭反应2小时。

在完成对板的封闭后，用PBS洗涤，在室温下向包被有VEGFR-2 ECD或hDLL4的孔中加入各种浓度(0.18至3000ng/ml)预先制备的Tanibirumab和PMC-201，并使其在室温下反应1小时。反应结束后，将产物用PBS洗涤，然后加入HRP-缀合的山羊抗-人IgG抗体(Pierce，美国)的1：2000稀释溶液作为二级抗体并在室温下反应30分钟。比色反应通过TMB底物试剂(BD Biosciences#555214，USA)诱导并通过加入50μl的2N硫酸(H₂SO₄)溶液终止。比色反应的测量是用酶标仪(Tecan，瑞士)在450nm和650nm的吸光度下进行。

结果是，可以确认，Tanibirumab和PMC-201对VEGFR-2具有类似的结合亲和力；然而，可以确认只有PMC-201对hDLL4具有结合亲和力(图4)。

3-2：PMC-201和人DLL4的亲和力分析

为了计算PMC-201对人DLL4的Kd(解离常数)，使用3000(GE Healthcare)，并使用CM5芯片。解离常数类似于Km值，并用作在酶-底物复合物中酶对底物的亲和指数。酶与底物之间的亲和力随着解离常数减小而增加。

使用Amine Coupling试剂盒(GE Healthcare)中的400mM的EDC(N-乙基-N'-(二甲氨基丙基)碳二亚胺)，100mM的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)和1M乙醇胺盐酸盐(pH 8.5)固定样品，20mM氢氧化钠作为发生缓冲液，1XPBS作为固定化缓冲液被稀释，然后将分析样品在10mM醋酸盐(pH 5.0)(GE Healthcare)中1:40稀释。将样品固定在4000RU(反应单位)。用于测量分析样品吸附的是HBS-EP缓冲液(GE Healthcare)。使用HBS-EP缓冲液将具有测量浓度为4.9、9.7、19.5、39.1、78.1、156.3、312.5nM的DLL4作为抗原进行系列稀释，以具有200μl的终体积。从7个浓度中选择5个浓度并拟合。在实际分析之前将样品(156.3nM)进行用于预备实验的结合步骤和解离步骤后，通过确认是否发生比使用氢氧化钠碱的基准线高10％左右来选择所使用的发生缓冲液的浓度。在分析流速是30μl/min，结合区间为60秒而解离区间为300秒的条件下测量分析样品。

对于每个批次的亲和力的结果，在PMC-201和Notch-1 Fc中确认了每种亲和力，并且本发明的双靶向抗体PMC-201具有比Notch-1 Fc高的亲和力(图5)。

3-3：在细胞表面上表达的hDLL4和PMC-201的结合亲和力的测量

使用ELISA和Biacore来测量PMC-201与固定在固相上的hDLL4的结合亲和力，并进行FACS分析以确认PMC-201是否结合在细胞表面上表达的hDLL4(图6)。

首先，为了产生293池和表达hDLL4(SEQ ID NO：12的氨基酸序列)的细胞系，通过GeneArt的Geneoptimizer将已进行基因优化的hDLL4的编码序列(SEQ ID NO：11序列)克隆到pcDNA3.1(+)的限制性内切酶BamHI和EcoRI的位置来构建pcDNA-hDLL4。然后，将pcDNA-hDLL4载体转导293细胞。使用lipofectamine^TM 2000(Invitrogen#11668-019，USA)并按照制造商的说明进行转导。简言之，将1×10⁶的293细胞接种到含有αMEM培养基(Welgene，韩国)的100mm孔中，然后于37℃在CO₂(5％)湿度培养箱中孵育24小时，以便具有约20％的细胞密度。将16μg载体(DLL4pcDNA3.1)和40μl的lipofectamine^TM 2000在1ml无血清αMEM培养基中稀释并在室温孵育5分钟，随后将DNA稀释溶液与lipofectamine^TM 2000稀释溶液混合，并在室温反应20分钟，以形成DNA-lipofectamine^TM2000复合物。从培养的细胞中除去现有培养基后，加入1ml的DNA-lipofectamine^TM2000复合物和9ml无血清αMEM培养基，并于37℃在CO₂湿度培养箱中孵育6小时，然后，将培养基替换为含有10％透析过的胎牛血清的DMEM培养基。然后，将培养基在37℃孵育72小时，用Trypsin-EDTA分离细胞，然后，加入含有10％透析过的胎牛血清和新霉素(G418，500μg/ml)的DMEM培养基并孵育。72小时后，将培养基替换为其中的G418浓度增加至1mg/ml的培养基，并在相同的条件下孵育约1周，直到形成菌落。在其中形成有菌落的板中用Trypsin-EDTA处理各菌落，并将其转移到24孔板中。加入含有10％透析过的胎牛血清和新霉素(G418，500μg/ml)的DMEM培养基并孵育，收集所有生长的菌落并以池状态孵育。

1周后，在池状态中用抗hDLL4抗体(Biolegend，USA)进行FACS分析以确认hDLL4表达，选择23种单菌落并分别在6孔板和100mm板中继代孵育，并在含有10％透析过的胎牛血清和新霉素(G418，500μg/ml)的DMEM培养基中孵育。从单菌落中选择一种有利地表达hDLL4的细胞，并命名为293-hDLL4，并将其用于PMC-201的DLL4拮抗剂功效相关分析。

进行FACS分析以确认PMC-201有利地结合293-DLL4池。首先，孵育足够数量(每种FACS样品为1×10⁶或更多)的293-DLL4池，并用Trypsin-EDTA制成单细胞，向孔中加入2ml的1×FACS缓冲液(PBS中的0.2％BSA)并混合，然后以1200rpm离心3分钟。丢弃上清液并将底部的细胞首先用10nM浓度的冰冷的PMC-201、Notch1 Fc和Tanibirumab染色20分钟，用1X FACS缓冲液洗涤，并用PE-抗人Fc抗体进行二次染色(在冰上20分钟)并洗涤。然后，使用流式细胞仪；FACSCalibur进行测量。

作为通过测量PMC-201是否结合到在细胞表面上表达的hDLL4所获得的结果，可以确认，PMC-201与Notch-1 Fc具有相似的结合亲和力(图6)。

实施例4：用双靶向抗体PMC-201处理后，HUVEC增殖能力的分析

进行细胞增殖能力分析以确认在用根据本发明的双靶向抗体PMC-201处理后，人脐静脉内皮细胞(HUVEC)(Lonza，瑞士)的增殖能力的变化。使用含有20％胎牛血清(Hyclone，美国)，100单位/ml青霉素(Hyclone，美国)，100μg/ml链霉素(Hyclone，美国)，3ng/ml成纤维细胞生长因子(Upstate Biotechnology，美国)，5单位/ml肝素(Sigma-Aldrich，美国)的不含酚红的M199培养基(Invitrogen，美国)，在37℃用5％CO₂加湿混合空气孵育HUVEC。将这些细胞在24孔板中以2×10⁴细胞/孔的密度孵育24小时，以分析HUVEC的存活率。然后，细胞用M199培养基洗涤两次，并在含1％胎牛血清(Hyclone，美国)的M199培养基的低血清浓度条件下孵育6小时。在孔中对各种浓度的抗体预处理30分钟，并用20ng/ml的VEGF(R&D系统，美国)处理。孵育48小时后，用WST-8(Dojindo，日本)处理细胞2小时，然后测量450nm波长处的吸光度，并且将在各条件下的细胞增殖能力进行相互比较。

结果是，由对最初孵育的HUVEC的细胞增殖能力测定法确认，相比于亲本抗体Tanibirumab，该双靶向抗体PMC-201可以更强烈抑制VEGF诱导的HUVEC增殖能力(图7)。

实施例5：使用FACS的竞争性人DLL4结合亲和力的分析

进行FACS分析以确认PMC-201是否与结合到293-hDLL4细胞系的hNotch1-Fc竞争性地结合。首先，孵育足够数量(每FACS样品为1×10⁶或更多的细胞)的293-hDLL4并用Trypsin-EDTA处理，以分离成单个细胞，然后，加入2ml的1×FACS缓冲液(在PBS中0.2％BSA)。然后，回收分离的单细胞并在1,200rpm离心3分钟，然后弃去上清液。向底部的细胞中加入16μg/ml的Tanibirumab或PMC-201和1μg/ml具有标记的Alexa-488(Zenon，#Z-25402)的rhNotch1-Fc，主要在冰上染色30分钟，用1XFACS缓冲液洗涤，并通过流式细胞仪(FACSCalibur)进行测量。

结果是，可以确认，考虑到几何平均值，结合到HUVEC的rhNotch1-Fc的结合因PMC-201而降低了四倍以上。同时，在Tanibirumab的情况下，与未处理抗体组类似，Tanibirumab未能抑制rhNotch1-Fc的结合(图8)。

实施例6：通过Notch1的启动子活性的分析

将1×10⁵的LS174T细胞(结肠癌细胞系；ATCC CL-188^TM)在含有10％牛胎儿血清的RPMI培养基中孵育24小时，并将0.8μg在Cignal ReporterAssay Kit(#336841CCS-014L，QIAGEN)在所含的Notch Cignal报告DNA和2μl脂质体(#11668-500；Invitrogen)与100μl的OPTI-MEM培养基混合，并使其静置20分钟，然后加入400μl的Opti-MEM用于转染以孵育细胞6小时。6小时后，将培养基替换为含有10％胎牛血清的MEM培养基，并孵育过夜。第二天，混合Tanibirumab和PMC-201(各为20mg/ml)，并在1×10⁵的293-hDLL4细胞中预处理1小时，然后与转染有Notch Cignal报告DNA的LS174T细胞共培养24小时。DAPT(5mM)没有预处理而293-hDLL4细胞与经转染的LS174T细胞混合，并共培养24小时。

通常已知DAPT N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰]-S-苯基甘氨酸叔丁酯)抑制Notch 1活性，并且抑制γ分泌酶的活性以降低NICD生产的增加(Andrea Geling et al.,EMBO Rep.,:3(7):688,2002；Ie-Ming Shih and Tian-LiWang,Cancer Research,67:1879,2007)。

共培养24小时后，使用在Dual-Luciferase Reporter Assay System(目录#E1910；Promega)中所含的裂解缓冲液裂解细胞，并将底物与ATP彼此混合，然后使用光度计测量发光量。

结果是，可以确认与具有未处理抗体的比较组相比，类似于DAPT处理组，在经双靶向抗体PMC-201处理的细胞中，通过Notch-1活化LS174T细胞展现的NICD的启动子活化降低(图9)。

实施例7：通过活化Notch-1增加Notch胞内结构域(NICD)的分析

将1μg/ml浓度的重组hDLL4包被6孔板过夜(16小时)，并用1XPBS洗涤。在各孔中处理人IgG(hIgG)、Tanibirumab、PMC-201(20μg/ml)1小时，并除去处理抗体溶液。将5×10⁵的HUVEC分别和IgG、Tanibirumab、PMC-201(20μg/ml)彼此混合并在6孔板中处理。孵育24小时后，使用裂解缓冲液(最终1％SDS，1mMNa₃VO₄，1×蛋白酶抑制剂混合物)裂解细胞，收集细胞溶液并转移到Eppendorf管中，在95℃加热10分钟并在冰上冷却。用BCA定量法对总蛋白进行定量并使用与实施例2的Western印迹相同的方法测量NICD。

这里，初级抗体为将切割的Notch1(Val1744)(D3B8)抗体(兔)以1：1000、β-肌动蛋白抗体(兔)以1：2000在含有5％0.05％TBST的脱脂乳中稀释，和二级抗体为将抗兔IgG(R&D HAF008)以1：1000稀释使用。

结果是，可以确认，相比于亲本抗体Tanibirumab，在HUVEC细胞中通过hNotch-1活化表现出的NICD的量被靶向DLL4的双靶向抗体PMC-201显著降低(图10)。

同时，进行如下的分析方法检测仅由细胞培养和共培养而不包被hDLL4的NICD。

首先，将5×10⁵细胞/孔的HUVEC接种于6孔板中24小时。然后，处理2.5×10⁵细胞/孔的293-hDLL4(人DLL4过表达293细胞系)和hIgG、PMC-201(10μg/ml)DAPT(5μM)1小时，并在6孔板中将抗体(hIgG，PMC-201)和用DAPT处理的293-hDLL4细胞加入到最初孵育的HUVEC中，不除去抗体溶液，并共培养24小时。作为比较组，处理293-T细胞系并与HUVEC共培养。

共培养24小时后，用裂解缓冲液(最终1％SDS，1mM的Na₃VO₄，1×蛋白酶抑制剂混合物)裂解细胞，收集细胞溶液并转移到Eppendorf管中，在95℃下加热10分钟并在冰上冷却。用BCA定量法对总蛋白进行定量并使用与实施例2的Western印迹相同的方法测量NICD。

结果是，可以确认，相比于hIgG，HUVEC细胞中通过Notch-1活化表现出的NICD的量被靶向DLL4的双靶向抗体PMC-201降低到小于50％(图11)。

工业实用性

根据本发明的双靶向抗体可更有效且同时抑制VEGF/VEGFR-2和DLL4/Notch1两个信号转导路径，从而治疗各种血管生成相关的疾病，如肿瘤等，特别是，克服了由于单独使用新血管的治疗剂造成的抗性，并通过直接靶向癌症干细胞从根本上防止癌症复发。

因此，根据本发明的双靶向抗体和包括它的药物组合物可有效地用于治疗血管发生相关的疾病，特别是癌症。

本发明已经基于其特定特征进行了详细描述，并且对本领域技术人员显而易见的是，这些特定技术只是优选实施例，并且因此本发明的范围并不限于这些实施例。因此，本发明的实质范围由所附权利要求及其等同物限定。

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电子附件。

Claims (22)

1.一种靶向VEGFR-2和DLL4的双靶向抗体。

2.根据权利要求1的双靶向抗体，其中所述抗体包含DLL4拮抗剂，该DLL4拮抗剂与结合VEGFR-2的抗体的末端结合。

3.根据权利要求2的双靶向抗体，其中所述结合VEGFR-2的抗体是Tanibirumab或其变体。

4.根据权利要求2的双靶向抗体，其中所述DLL4拮抗剂是人类Notch1的第十一和第十二钙结合EGF样结构域。

5.根据权利要求2的双靶向抗体，其中所述DLL4拮抗剂与结合VEGFR-2的抗体的轻链可变区N-末端结合。

6.根据权利要求5的双靶向抗体，其中所述DLL4拮抗剂通过氨基酸接头与结合VEGFR-2的抗体结合。

7.根据权利要求3的双靶向抗体，其中所述结合VEGFR-2的抗体包含：包含选自SEQ ID NO：1至3的序列的重链可变区，和包含选自SEQID NO：4至6的序列的轻链可变区。

8.根据权利要求7的双靶向抗体，其中所述结合VEGFR-2的抗体包括：包含SEQ ID NO：1的序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO：4的序列的轻链可变区；

包含SEQ ID NO：2的序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO：5的序列的轻链可变区；或

包含SEQ ID NO：3的序列的重链可变区，其包含SEQ ID NO：6的序列的轻链可变区。

9.根据权利要求4的双靶向抗体，其中作为DLL4的拮抗剂的人类Notch1的第十一和第十二钙结合EGF样结构域包含SEQ ID NO：7的序列。

10.编码根据权利要求1至9中任一项的双靶向抗体的DNA。

11.一种重组表达载体，包含根据权利要求10的DNA。

12.由根据权利要求11的重组表达载体转化的宿主细胞。

13.一种生产根据权利要求1至9中任一项的双靶向抗体的方法，包括培养根据权利要求12的宿主细胞，然后从培养物中分离双靶向抗体。

14.根据权利要求13的方法，还包括使用具有蛋白质A亲和色谱、SP琼脂糖凝胶色谱和大小排阻色谱的快速蛋白液相色谱法纯化所述双靶向抗体。

15.一种用于治疗血管发生相关疾病的药物组合物，包含根据权利要求1至9中任一项的双靶向抗体。

16.根据权利要求15的组合物，所述血管发生相关疾病是选自肿瘤生长、肿瘤转移、年龄相关的黄斑变性(ARMD)、糖尿病性视网膜病、银屑病、类风湿性关节炎和慢性炎症的组中的一种或多种。

17.根据权利要求16的组合物，所述癌症是选自结肠癌、结肠直肠癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、支气管癌、鼻咽癌、喉癌、胰脏癌、膀胱癌、胰腺癌、宫颈癌、脑癌、前列腺癌、骨癌、皮肤癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾癌、食道癌、胆道癌、睾丸癌、直肠癌、头颈癌、宫颈癌、输尿管癌、骨肉瘤、神经细胞瘤、黑色素瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、星形细胞瘤、神经母细胞瘤和神经胶质瘤的组中的一种或多种。

18.一种测量根据权利要求1至9中任一项的双靶向抗体的DLL4拮抗剂功效的方法，包括通过共培养表达人DLL4(hDLL4)的细胞系或具有人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的重组细胞系，测量Notch 1的活性。

19.根据权利要求18的方法，其中测量Notch 1的活性是通过测量NICD的表达量来实现的。

20.根据权利要求19的方法，其中测量NICD的表达量是通过使用选自SDS-PAGE、Western印迹、免疫组织化学染色法、免疫染色法、免疫荧光法、ELISA测定法(直接测量)和荧光素酶测定法来实现的。

21.根据权利要求18的方法，其中所述重组细胞系是过表达hDLL4的293细胞系(293-hDLL4)。

22.根据权利要求18的方法，其中所述共培养物包括(a)培养HUVEC；和(b)将过表达hDLL4的293细胞系(293-hDLL4)和双靶向抗体反应并在步骤(a)中培养的HUVEC中进行处理以实现共培养。