ES2744267T3 - Anticuerpo de doble diana que se dirige a VEGFR-2 y DLL4, y composición farmacéutica que comprende el mismo - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo de doble diana que se dirige a VEGFR-2 y DLL4 que comprende un antagonista de DLL4, el cual está unido a un terminal de un anticuerpo que se une a VEGFR-2, en el que el anticuerpo que se une a VEGFR-2 comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1 a 3, y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4 a 6, en el que el antagonista de DLL4 es el 11º y 12 º dominio tipo EGF de unión a calcio de Notch1 humano, y en el que el antagonista de DLL4 está unido al N-terminal de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo que se une a VEGFR-2.

Description

DES

Anticuerpo de doble diana que se dirige a VEGFR-2 y D

rCampo técnico!

La presente invención se refiere a una forma novedosa DLL4 está unido a un terminal de un anticuerpo que se que codifica el anticuerpo, un vector de expresión r transformadas con el vector de expresión recombinante, usando las células hospedadoras, una composición fa procedimiento de medición de la eficacia antagonista de

ITécnica anterior!

La angiogénesis es un mecanismo en el que se genera existentes por crecimiento, división, migración, y similare procesos del crecimiento normal incluyendo la curación 671, 1997), y además, se sabe que la angiogénesis ano tales como el crecimiento tumoral y la metástasis, degen diabética, psoriasis, artritis reumatoide e inflamación cró

La hipótesis de que el crecimiento tumoral y la metást terapia que se centra en la anti-angiogénesis podría se planteada por el Dr. J. Folkman en 1971. Después de inhibición de los mecanismos de angiogénesis excesiva Kerbel, Nature, 438:967, 2005). Un aspecto progresivo d inductores de la angiogénesis y los inhibidores de la an complejos y de multietapa. Con detalle, diversos induct endotelial vascular (VEGF) secretado por tejidos tumor células endoteliales vasculares periféricas existentes p incrementa la permeabilidad de las células endot metaloproteinasa de matriz (MMP), la cual descompon células endoteliales, de modo que las células endot migran/proliferan hacia el tejido que secreta el induct migradas y proliferadas forman una estructura tubular estructural de la célula endotelial vascular se introduce maduro.

Como se ha descrito anteriormente, se encontró que la s al VEGF se suprime para inhibir finalmente la angiogé diversas enfermedades de degeneración macular relac reumatoide e inflamación crónica, incluyendo crecimien desarrollo de diversos fármacos capaces de inhibir la act

Específicamente, Separación y purificación de proteína N. Ferrara de Genentech en 1989 (Leung y col., Scien también es referido como VEGF-A tiene cuatro isotipos que entre los cuatro isotipos, VEGF165 es el más abun (Tisher y col., J. Biol. Chem., 266:11.947, 1991). Se sab con afinidad significativamente alta; sin embargo, la señ 2 para inducir los mecanismos relacionados con la angi células endoteliales vasculares. Debido a las razones a principales para inhibir el mecanismo de la angiogénesis VEg Fr -2 (Ellis and Hicklin, Nature Rev. Cáncer, 8:579,

Por ejemplo, Avastin (bevacizumab, Genentech) es una col., Biochem. Biophy. Res. Comm., 333:328, 2005), el tratamiento para cáncer colorrectal metastásico en 2004, de mama metastásico Her-2 negativo en 2008, respect (GBM), y cáncer renal. En la actualidad, los ensayos clín para ampliar las indicaciones. Además, Lucentis que se para cortar fragmentos Fab solamente de Avastin para la en la retina para inhibir la angiogénesis excesiva alr degeneración macular senil (Eter y col, Biodrgus, 20:1 macular húmeda relacionada con la edad (húmeda-DMR CIÓN

y composición farmacéutica que comprende el mismo

n anticuerpo de doble diana en el que un antagonista de e a VEGFR-2 para marcar además DLL4 humana, ADN binante que incluye el mismo, células hospedadoras rocedimiento de producción del anticuerpo de doble diana céutica que incluye el anticuerpo de doble diana, y un 4 del anticuerpo de doble diana.

evos vasos sanguíneos a partir de los vasos sanguíneos e una célula endotelial, juega un papel importante en los herida o el ciclo menstrual femenino (Risau, Nature, 386 mente excesiva juega un papel crucial en enfermedades ión macular relacionada con la edad (DMRE), retinopatía (Carmeliet and Jain, Nature, 407:249, 2000).

son dependientes de angiogénesis, y por lo tanto, una nuevo agente terapéutico para los tumores sólidos fue , la investigación de una tecnología relacionada con la traído la atención a muchos investigadores (Ferrara and angiogénesis se determina por equilibrio completo de los énesis, y se desarrolla por procedimientos secuenciales de la angiogénesis que incluyen el factor de crecimiento o dañados se unen a correspondientes receptores de activar las células endoteliales vasculares activas, que es vasculares, y para secretar proteasa tal como membrana basal y la matriz extracelular que rodea las es vasculares escapan de los capilares existentes y e la angiogénesis. Las células endoteliales vasculares vascular, y por último, los piricitos que son un soporte ra conseguir la formación de vaso sanguíneo estable y

lización de VEGF y un receptor de VEGF (VEGFR) unido s, obteniendo de ese modo efectos terapéuticos sobre da con la edad, retinopatía diabética, psoriasis, artritis metástasis de tumor, y por tanto, ha estado en curso el d de VEGF.

rmas de VEGF y clonación de ADNc por el grupo del Dr.

246:1.306, 1989). Hasta ahora se sabe que VEGF que GF121, VEGF165, VEGF189 y VEGF206), y se informa e en todos los tejidos humanos excepto para la placenta e VEGF se une a receptores VEGFR-1 y VEGf R-2/KDR VEGF se transfiere principalmente a través de VEGFR-nesis tales como proliferación, migración, y similares, de rmente descritas, VEGF y VEGFR-2 llegan a ser dianas cido por VEGF y un número de estos tratan con VEGF y ; Youssoufian y col., Clin. Cáncer Res., 13:5544s, 2007).

ticuerpo humanizado que se dirige a VEGF-A (Ferrara y l ha recibido la aprobación de la FDA de EE.UU. para cer de pulmón de células no pequeñas en 2006 y cáncer ente, y se aprueba para tratar glioblastoma multiforme sobre una diversidad de tumores sólidos están en curso rrolló en la misma compañía, es un anticuerpo preparado na permeabilidad de Lucentis cuando se inyecta Lucentis or de la mácula que es un aspecto importante de la 006), y como agente terapéutico para la degeneración el cual ha recibido la aprobación de la FDA de EE.UU. en Como otro anticuerpo para el tratamiento que se dirige a y col., PNAS, 99:11.393, 2002). VEGF-trap es un recepto tipo inmunoglobulina de VEGFR-1 y el tercer dominio tip cual aún no ha recibido la aprobación de la FDA de e E. cáncer de mama metastásico, cáncer de pulmón meta refractario de hormona, y similares.

Mientras tanto, ejemplos de anticuerpos anti-angiogéne incluyen IMC-1121B (documento EP 1916001A2) f PCT/GB02/04619) fabricado por UCB company,

desarrollado por los presentes inventores y ha estado en

IMC-1121B es un anticuerpo monoclonal seleccionado estado en curso en la fase del estadio III para cáncer d para cáncer de estómago en 2010. CDP-791 fabricado curso en la fase del estadio II para cáncer de pulmón de que este anticuerpo no tiene Fc, no se puede esperar citoxicidad dependiente de complemento.

Por último, Tanibirumab (TTAC-0001) desarrollada p seleccionado de una genoteca de ScFv completamente flk-1 de ratón y origin de rata (homólogo de VEGFR-2) mi de las características distinguibles importantes de IMC-En particular, la reactividad cruzada de especies cruza investigación del modelo de enfermedad animal para lle cáncer específico por fases, lo cual hace más fáciles las

Como se ha descrito anteriormente, las investigacio drásticamente durante los últimos cinco años, y un núme y los estudios clínicos.

Mientras tanto, las células diferenciadas en célula punta DLL4 y se unen al receptor Notch 1 presente en las célula de Notch1 se activa se diferencian en células tallo (stalk) lo cual provoca que la ruta de señalización DLL4/Notch VEGF/VEGFR-2 y la angiogénesis (Dufraine y col., Onco

Hasta ahora se sabe que DLL4 es uno de los ligandos p (Notch 1 a 4) y cinco tipos de ligandos de Notch (Jagged señalización de Notch se inicia uniendo un ligando de necesariamente se activa por interacción directa entre 7(9):678, 2006).

Cuando el ligando de Notch se une al receptor Notch, escindir un sitio proximal exterior de la membrana celula gamma-secretasa para escindir un sitio proximal interno dominio intracelular de Notch (NICD) se aísla y migra RBPJ/CSL para inducir la expresión de los genes dia incluyendo Hes y Hey. La ruta de señalización de Notch d con la situación de las correspondientes células, y juega normales y las células madre cancerosas.

Básicamente, todos los receptores Notch son capace combinaciones de diversas uniones están selectivame células. Por ejemplo, DLL4 se expresa fuertemente en c de desarrollo fetal, y se une a Notch1 y Notch4 que se e la unión DLL4-Notch1 es la más importante de una man desarrolla a través de la unión DLL4-Notch1. La anterio de gen, y similares (Duarte y col., Genes Dev, 2004; Gal

Por lo tanto, cuando se suprime la unión DLL4-NotchI, enfermedades tales como tumor, y similares, son capac se inhibe usando Avastin (bevacizumab), y similares, e disminuir la perfusión del tumor, y se disminuye un tam Notch1 expresado en las células periféricas mientras se anormal y en gran medida (hiperexplosión), pero no alc tumor no funcional, y como resultado, se reduce el tam F, existe la VEGF-trap fabricado por Regeneron (Holash ñuelo soluble en una forma en la que el segundo dominio unoglobulina de VEGFR-2 se fusionan a Fc humano, el , pero ha estado en curso en la fase del estadio III para ico, cáncer colorrectal metastásico, cáncer de próstata

ue se dirigen a VEGFR-2 que es un receptor de VEGF icado por Imclone company, CDP-791 (documento irumab (TTAC-0001) (documento WO2008/153237) ensayo clínico, y similares.

na genoteca de Fab completamente humana, el cual ha ma metastásico, y se introdujo en la fase del estadio III UCB es un anticuerpo humanizado, el cual ha estado en ulas no pequeñas en forma de Di-Fab PEGilado. Puesto icidad mediada por célula dependiente de anticuerpo o

s presentes inventores es un anticuerpo monoclonal ana, y es el único anticuerpo que tiene reactividad con as simultáneamente se dirige a VEGFR-2, lo cual es una B fabricado por Imclone (documento WO2008/153237). mostrada por Tanibirumab es posible para realizar una a cabo el desarrollo futuro de agente anti-cáncer para el stigaciones relacionadas.

de VEGF y VEGFR-2 dirigidos se han desarrollado e agentes terapéuticos son desarrollados por el mercado

por señalización VEGF/VEGFR-2 expresan fuertemente cundantes, y las células en las que la ruta de señalización a formar la estructura tubular del vaso sanguíneo normal, a uno de los mecanismos más importantes para la ruta e, 27:5.132~5.137, 2008).

n receptor Notch, y hay cuatro tipos de receptores Notch agged-2, DLL1, DLL3 y DLL4) en mamíferos. La ruta de ch de una célula a un receptor Notch de otra célula, y diferentes células (Bray s J, Nat. Rev. Mol. Cell Biol.,

primer lugar se activa una metaloproteasa ADAM para l receptor Notch y, a continuación, se activa un complejo la membrana celular del receptor Notch, de modo que el o del núcleo. NICD se une a un factor de transcripción e Notch tal como proteínas hélice-bucle-hélice básicas mina la proliferación/diferenciación/apoptosis de acuerdo portante papel en el mantenimiento de las células madre

unirse a todos los ligandos de Notch; sin embargo, ontroladas en microambientes de las correspondientes as epiteliales de angiogénesis durante un procedimiento san en las células endoteliales periféricas; sin embargo, xclusiva (Yan M, Vasc. Cell, 2011), y la angiogénesis se scripción se encuentra bien por el ensayo de deficiencia ol., PNAS, 2004; Krebs y col., Genes Dev., 2004).

puede inhibir la angiogénesis, y por lo tanto, diversas e ser tratadas. Ya se ha demostrado que cuando VEGF l tratamiento de cáncer, se inhibe la angiogénesis para del tumor. Mientras tanto, cuando se inhibe la unión con e a DLL4, los vasos sanguíneos se generan de manera n la función completa, lo cual disminuye la perfusión del del tumor (Thurston y col, Nat. Rev. Cancer, 7(5):327, 2007).

De forma interesante, cuando un anticuerpo que inhib xenoinjerto usando varias líneas de célula cancerosa crecimiento del cáncer se suprime mucho más fuerteme inhibe VEGF y un anticuerpo que inhibe DLL4 se admini 444(7.122):1.083, 2006). Se sugiere que la señalización VEGF/VEGFR-2, y diversas enfermedades relacionad capaces de ser tratadas eficazmente inhibiendo simultá

Además, se encontró que la inhibición de DLL4 tiene un ruta VEGF/VEGFR-2 como un tumor que es resistente 444(7.122):1.083, 2006; Noguera-Troise y col., Natur significativamente importante para superar la resisten administran fármacos tales como Avastin que bloquea la que Avastin no es eficaz desde el comienzo y resiste gradualmente con el tiempo).

Además, se encontró por el equipo de investigación de frecuencia de las células madre cancerosas en tumor e 2009), lo cual sugiere que es posible la inhibición de DL último, la resistencia a quimioterapia anticáncer y agente que se usan en la actualidad para el tratamiento de c Notch y la inhibición de la ruta DLL4/Notch1 también anticáncer y los agentes terapéuticos de anticuerpo tale Acta., 1.806(2):258, 2010).

El documento US 2010/0260668A1 desvela inmunoglo documento describe proteínas de unión multivalentes de producción, y específicamente usos en la prevención

Como se ha descrito anteriormente, diversas enferme similares, son capaces de ser tratadas eficazmente inhi 2 y DLL4/Notch 1. Sin embargo, aún no se ha producid lo tanto, se requiere urgentemente el desarrollo pertinen

rResumen de la invención!

Los presentes inventores llevaron a cabo una investig diversas enfermedades relacionadas con la angiogén supresora más eficazmente y simultáneamente de d problemas anteriormente descritos, y como resultado, simultáneamente a VEGFR-2 y DLL4 que comprende u anticuerpo que se une a VEGFR-2, en el que el anticuer la cadena pesada que comprende una secuencia selecc región variable de la cadena ligera que comprende una NO: 4 a 6, en el que el antagonista de DLL4 es el 11° y en el que el antagonista de DLL4 está unido al N-termin se une a VEGFR-2, muestra eficazmente un efecto d angiogénesis, y se completa la presente invención.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar A expresión recombinante que incluye el mismo.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar cé recombinante, y un procedimiento de producción del an las células hospedadoras.

Otro objeto de la presente invención es proporciona relacionadas con la angiogénesis que comprende el relacionadas con la angiogénesis es una o más sel metástasis tumoral, degeneración macular relacionada reumatoide e inflamación crónica.

Descripción de los dibujos

FIG. 1 representa la secuencia de aminoácidos de l FIG. 2 es un diagrama de un vector PMC-201 v213 F y DLL4 se administra en experimentos animales de ados en el equipo de investigación de Genentech, el n comparación con un caso en el que un anticuerpo que por separado, respectivamente (Ridgway y col., Nature, a ruta DLL4/Notch1 no se activa simplemente por la ruta n la angiogénesis tales como tumor, y similares, son ente las señalizaciones por dos rutas.

o sobre tanto un tumor que es sensible al inhibidor de la idor de la ruta VEGF/v Eg FR-2 (Ridgway y col., Nature, 4(7.122):1.032. 2006), lo cual proporciona una pista e se da en la actualidad y frecuentemente cuando se (incluyendo dos casos de una resistencia intrínseca en dquirida en la que una eficacia de Avastin está cayendo

omed que la inhibición de DLL4 reduce directamente la e el crecimiento del tumor (Hoey y col., Cell Stem Cell., ra bloquear esencialmente la recurrencia del cáncer. Por péuticos de anticuerpo tales como Herceptin, y similares, tiene mucha relevancia para la ruta de señalización de osible para superar la resistencia de la quimioterapia o Herceptin, y similares (Wang y col., Biochim Biophys

s de dominio variable doble y sus usos. En particular, el iespecíficas modificadas por ingeniería, procedimientos nosis y/o tratamiento de enfermedades.

relacionadas con la angiogénesis tales como tumor, y simultáneamente señales por dos rutas VEGF/VEGFR-esarrollo de fármacos que son eficaces para esto, y por

del desarrollo de un agente terapéutico capaz de tratar les como tumor, y similares, mediante la señalización as, VEGF/VEGFR-2 y DLL4/Notch1 para resolver los contró que un anticuerpo de doble diana que se dirige gonista de DLL4, el cual está unido a un terminal de un e se une a VEGFR-2 comprende una región variable de a del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1 a 3, y una ncia seleccionada del grupo que consiste en las s Eq ID ominio tipo EGF de unión a calcio de Notchl humano, y la región variable de la cadena ligera del anticuerpo que miento de diversas enfermedades relacionadas con la

ue codifica el anticuerpo de doble diana, y un vector de

hospedadoras transformadas con el vector de expresión po de doble diana según la presente invención, usando

composición farmacéutica para tratar enfermedades erpo de doble diana, en la que el las enfermedades adas del grupo que consiste en crecimiento tumoral, la edad (DMRE), retinopatía diabética, psoriasis, artritis

inios 11 y 12 tipo EGF de Notch1 unidos a DLL4.

la presente invención.

FIG. 3 representa los resultados obtenidos expresan usando una célula 293-T y confirmando la producción d PAGE.

FIG. 4 representa los resultados del análisis ELISA anticuerpo de doble diana según la presente invención. FIG. 5 representa los resultados del análisis Biacore doble diana según la presente invención.

FIG. 6 representa los resultados del análisis de citóm anticuerpo de doble diana según la presente invención. FIG. 7 representa los resultados del ensayo de prolifer la presente invención.

FIG. 8 representa los resultados del análisis FACS presente invención suprime de manera competitiva la u FIG. 9 representa los resultados del ensayo de luminis doble diana según la presente invención suprime la act FIG. 10 representa los resultados del análisis de tran dominio intracelular de Notch (NICD) se suprime medi anticuerpo de doble diana según la presente invención FIG. 11 representa los resultados del análisis de tran dominio intracelular de Notch (NICD) se suprime medi del anticuerpo de doble diana según la presente invenc

[Mejor modo]

Siempre que no se defina de otra manera, todos los térmi tienen el mismo significado que entiende generalmente invención. En general, una nomenclatura usada en la pres describen más adelante son bien conocidos en el presente

En una realización para conseguir los objetos de la pr anticuerpo de doble diana que se dirige simultáneamente a el cual está unido a un terminal de un anticuerpo que se un 2 comprende una región variable de la cadena pesada q consiste en las SEQ ID NO: 1 a 3, y una región varia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4 a tipo EGF de unión a calcio de Notch1 humano, y en el que variable de la cadena ligera del anticuerpo de unión a VEG

Se confirmó que el anticuerpo de doble diana según la pre causadas por angiogénesis, inhibiendo más eficazmente la las dianas VEGFR-2 y DLL4. Además, se confirmó a partir el anticuerpo de doble diana según la presente invención HUVEC en comparación con un anticuerpo sencillo que se

En la invención, un término "anticuerpo de doble diana" antagonismo a una o más dianas, y significa que un anticu unión o antagonismo a diferentes dianas se unen uno u o diana se une a un material que tiene antagonismo a la otra

Además, en la presente invención, un término "anticuer monoclonal, en el que se puede usar un fragmento de una incluye dos cadenas ligeras que tienen la longitud complet El fragmento de la molécula de anticuerpo significa un fra antígeno e incluye una cadena sencilla, Fv(scFv), Fab, F(a

Preferentemente, el anticuerpo de doble diana según la di específico a un factor de angiogénesis o un receptor par angiogénesis, es decir, un antagonista a un factor de angi

En el anticuerpo de doble diana según la divulgación, el limitación siempre y cuando sea un anticuerpo que se una preferentemente, Tanibirumab o Bevacizumab, o variante las mismas.

Además, el antagonista de DLL4 es útil sin limitación sie inhibición de la señalización DLL4/Notch1, particularment dominio celular de Notch1, pero la presente invención aleatoriamente el vector según la presente invención n anticuerpo de doble diana purificado a través de SDS-

la afinidad de unión a VEGFR-2 y DLL4 humana, del

la afinidad de unión a DLL4 humana, del anticuerpo de

o de flujo de la afinidad de unión a DLL4 humana, del

ión sobre HUVEC, del anticuerpo de doble diana según

fenómeno que el anticuerpo de doble diana según la n de Notch-Fc a DLL4 humana.

ncia de la luciferasa del fenómeno que el anticuerpo de ción promotor por Notch-1.

rencia Western del fenómeno que un incremento en el e la activación de Notch-1, en el momento de cultivar el UVEC en una placa de cultivo recubierta con hDLL4.

rencia Western del fenómeno que un incremento en el e la activación de Notch-1, en el momento de cocultivo y HUVEC en una línea celular 293 que expresa hDLL4.

s técnicos y científicos usados en la presente memoria experto en la técnica a la que pertenece la presente te memoria y los procedimientos experimentales que se mpo técnico y generalmente se usan.

ente invención, la presente invención proporciona un GFR-2 y DLL4 comprendiendo un antagonista de DLL4, VEGFR-2, en el que el anticuerpo que se une a VEGFR-comprende una secuencia seleccionada del grupo que de la cadena ligera que comprende una secuencia en el que el antagonista de DLL4 es el 11° y 12° dominio ntagonista de DLL4 está unido al N-terminal de la región -2.

te invención tiene un efecto de inhibir las enfermedades giogénesis, y tiene una afinidad de unión a cada una de experimento inhibidor de la proliferación de HUVEC que e excelente capacidad inhibitoria de la proliferación de rige a solamente VEGFR-2, por ejemplo, Tanibirumab.

nifica un anticuerpo que tiene una afinidad de unión o o en el que dos anticuerpos que tienen una afinidad de o un anticuerpo que tiene una afinidad de unión a una ana.

" incluye tanto anticuerpo policlonal como anticuerpo olécula de anticuerpo así como una forma completa que dos cadenas pesadas que tienen la longitud completa. ento que necesariamente posee una función de unión a , F(ab')² , un dominio único, y similares.

lgación tiene una forma en la que un anticuerpo que es tal factor de angiogénesis se une a un antagonista de nesis o un receptor para tal factor de angiogénesis.

ticuerpo específicamente unido a VEGFR-2 es útil sin VEGFR-2 para inhibir la señalización VEGF/VEGFR-2, e los mismos, pero la presente invención no se limita a

e y cuando sea una sustancia que tenga propiedad de se prefiere un receptor soluble del cual se suprime un se limita a las mismas. Más preferentemente, como antagonista de DLL4, se pueden usar particularmente el (en lo sucesivo referido en el presente documento como

La presente descripción desvela que es posible que el a o similares, de una cadena pesada o una cadena ligera d se puede unir a un N-terminal de la cadena pesada o acuerdo con una realización de la invención, el antagoni la cadena ligera del anticuerpo que se une a VEGFR-2.

El anticuerpo de doble diana más preferido referido com forma en la que el antagonista de DLL4, en particular, el particular, el N-terminal de la cadena ligera, del anticue que el anticuerpo específico a VEGFR-2 es Tanibirumab

La "angiogénesis" de la presente invención significa un f se proliferan y reconstituyen para formar un nuevo vaso factores de angiogénesis que fomentan la generación estabilidad del vaso sanguíneo, y la formación de vaso de angiogénesis incluyen los miembros del factor de cre familia del factor de crecimiento placentario (PIGF), la fa DLL4, la familia del factor de crecimiento de fibroblastos de crecimiento de fibroblasto (ácido (aFGF) y básico (bF (G-CSF), factor de crecimiento de hepatocito (HGF)/fact factor de crecimiento placentario, factor de crecimiento de crecimiento derivado de plaquetas, en particular, proliferina, factor de crecimiento transformante alfa (TG factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-alfa), factor de cr vascular (VPF), y similares, pero no está particularmente

Un término: "antagonista de angiogénesis" de la prese polinucleótido, polipéptido, proteína aislada, proteína re anticuerpo de doble diana, el cual inhibe directa o indire vaso sanguíneo, o la permeabilidad indeseable del vaso material que se une al factor de angiogénesis o un recep ejemplo, el inhibidor de angiogénesis incluye anticuerpo VEGF-A o un receptor soluble de VEGF-A (por ejemplo, trap, angiopoyetina 2, señuelo del receptor soluble Not ligandos de sus materiales, pero la presente invención n

Como se ha descrito anteriormente, preferentemente, la en la forma de un anticuerpo de diana doble que se dirige el cual está unido a un terminal de un anticuerpo que se 2 comprende una región variable de la cadena pesada consiste en las SEQ ID NO: 1 a 3, y una región va seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: tipo EGF de unión a calcio de Notch1 humano, y en el qu variable de la cadena ligera del anticuerpo de unión a V

En particular, el anticuerpo específico a VEGFR-2 pre pesada de la SEQ ID NO: 1 y una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 2 y una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 3 y una región v descripción también desvela un anticuerpo específico a variable. Se desvelan además fragmentos o modificaci siempre y cuando se posea la afinidad de unión a VEGF el 12° dominio tipo EGF de un receptor Notchl a DLL4 uelo mínimo de notchl").

onista de DLL4 esté unido a un N-terminal o C-terminal, icuerpo específicamente unido a VEGFR-2 sin limitación, dena ligera, o a un N-terminal de la cadena ligera. De e DLL4 está unido al N-terminal de la región variable de

C-201 proporcionado en la presente invención tiene una elo mínimo de Notch1 a DLL4 está ligado al terminal, en specíficamente unido a VEGFR-2. Además se describe s variantes.

eno celular en el que las células endoteliales vasculares íneo a partir de la red de vaso sanguíneo existente. Los aso sanguíneo, el crecimiento de célula endotelial, la íneo están implicados en la angiogénesis. Los factores nto endotelial vascular (VEGF) y la familia de VEGF, la del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), ), el ligando de TIE (angiopoyetina), efrina, Del-1, factor , folistatina, factor estimulante de colonia de granulocito dispersión (SF), interleuquina-8 (IL-8), leptina, midkina, lula endotelial derivada de plaquetas (PD-ECGF), factor -BB o PDGFR-beta, pleiotrofina (PTN), progranulina, ), factor de crecimiento transformante beta (TGF-beta), iento endotelial vascular (VEGF)/factor de permeación ado a los mismos.

vulgación significa un material de bajo peso molecular, inante, anticuerpo, o un conjugado del mismo para un ente la generación del vaso sanguíneo, la formación de uíneo. Además, el inhibidor de angiogénesis incluye un l mismo para impedir que se active la angiogénesis. Por tros antagonistas a agentes de angiogénesis tales como ceptor KDR soluble o un receptor soluble Flt-1), VEGF-o fragmentos que mantienen la afinidad de unión a los limita a las mismas.

ente invención proporciona el anticuerpo de doble diana GFR-2 y DLL4 que comprende un antagonista de DLL4, VEGFR-2, en el que el anticuerpo que se une a VEGFR-comprende una secuencia seleccionada del grupo que de la cadena ligera que comprende una secuencia en el que el antagonista de DLL4 es el 11° y 12° dominio ntagonista de DLL4 está unido al N-terminal de la región -2.

temente consiste en una región variable de la cadena na ligera de la SEQ ID NO: 4, una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 5, o una región variable le de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 6. La presente R-2 que incluye además la región constante en la región de aminoácidos del anticuerpo específico a VEGFR-2 [Tabla

Además, el señuelo mínimo de Notch1 para DLL4 segú secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7. Sin emba a presente invención preferentemente consiste en una , También es obvio para los expertos en la técnica que siempre y cuando se mantenga un antagonismo a DLL4, variantes que tienen variaciones, deleción, e inserción de

En el anticuerpo de doble diana según la invención, el antagonista de DLL4 pueden estar ligados uno con otro conector, unión químicamente directa, fusión genética, pueden estar ligados por la unión por el conector, más pr de aminoácido preferible según la presente invención tien

Ta mbién se incluyen en el ámbito de la presente invención inoácidos.

nticuerpo que se une específicamente a VEGFR-2 y el iante diversos procedimientos tales como la unión por un imilares. Preferentemente, el anticuerpo y el antagonista rentemente, por un conector de aminoácido. El conector una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8.

2

Por lo tanto, una cadena ligera-un conector de aminoácid diana en el que el señuelo mínimo de Notch1 a DLL4 es doble diana según la presente invención, por el conecto SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10.

Tabla 3 Secuencias de aminoácidos de una estructur del anticuerpo de doble diana según la presente i unido a roteína señuelo mínimo de Notch1 del anticuerpo de doble ligado al N-terminal de la cadena ligera del anticuerpo de e aminoácido tiene una secuencia de aminoácidos de la

ue comprende la región variable de la cadena ligera nción, en la que el señuelo mínimo de Notch1 está

misma

Además, la presente invención proporciona secuencias d y un vector recombinante que incluye las mismas.

La secuencia de polinucleótidos que codifica el anticu olinucleótidos que codifican el anticuerpo de doble diana

o de doble diana se puede derivar fácilmente de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 1 a 10 codificante de polinucleótidos se deja que se coloque en la producción del anticuerpo de doble diana según la pre

Un término: "vector recombinante" en la presente invenci diana en una célula hospedadora apropiada, e indica una esenciales ligados de manera operativa uno a otro para

Un término: "ligado de manera operativa" en la presente expresión del ácido nucleico y las secuencias de ácido manera funcional una con otra para realizar las funcione se puede llevar a cabo usando tecnologías recombinante específica a sitio y el enlace se pueden llevar a cabo fácil

Los vectores de expresión apropiados de la presente in membrana o secreción además de elementos de control un codón de terminación, señal de poliadenilación y un p generalmente se consideran como partes de las sec inmunológica, y cuando se administra una construcción y debería estar en la estructura con las secuencias c inducible. Las células procariotas tienen promotores de l mismos. Las células eucariotas tienen el promotor de virus de ratón (MMTV), el promotor del virus de la inmunod repeticiones terminales largas (LTR) de VIH, el promotor promotor del virus de epstein barr (EBV), el promotor del de la p-actina, los promotores derivados de hemoglobi humana, pero la presente invención no se limita a las mis

El vector de expresión puede incluir un marcador selectiv un vector. El marcador selectivo es para investigar una los marcadores que proporcionan un fenotipo marcado resistencia a un agente citotóxico, o expresión de una pr expresan el marcador seleccionable sobreviven en el am una célula transformada. Además, en el caso en el que el incluir un origen de replicación que es una secuencia de

Como vector de expresión recombinante para la inserció como plásmido, virus, cósmido, y similares. El vector re tipo siempre y cuando exprese el gen deseado en dive eucariotas, y produce la proteína deseada; sin embargo, el promotor que presenta fuerte actividad mientras prod estado natural.

Para expresar el anticuerpo de doble diana según la pr hospedador/vector de expresión. Ejemplos de un vector incluyen las secuencias reguladoras de expresión deriv adenoasociado, citomegalovirus, y retrovirus, pero la p expresión útil en un hospedador bacteriano incluye plásmi pRSET, pBluescript, pGEX2T, vector pUC, col E1, pCR1 tiene un intervalo grande de hospedador, tal como RP4, de fago lambda tal como gt10, gt11, NM989 y otros A filamentoso. Un vector de expresión útil para una célula útil para una célula de insecto es pVL94l.

Según otra realización de la presente invención, la pres transformada con el vector recombinante. El vector reco transformante. Las células hospedadoras apropiadas Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptomyces sp., P Además, la célula hospedadora puede ser una célula euc tal como Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Sc eucariotas inferiores y células eucariotas superiores de derivadas de plantas y mamíferos. Preferentemente, est célula NSO, SP2/0, una célula de ovario de hámster chino MDCK, línea de célula de mieloma, célula HuT 78 y célula a las mismas. En particular, se prefiere una célula CHO.

Un término "transformación en una célula hospedadora" e los expertos en la técnica. Además, la secuencia líder -terminal del anticuerpo de doble diana, lo cual es útil en e invención.

s un vector de expresión capaz de expresar una proteína strucción génica que incluye los elementos controladores esar los insertos génicos.

ención significa que las secuencias de regulación de la leico que codifican la proteína diana están ligadas de nerales. Un enlace operable con el vector recombinante gen bien conocidas en la técnica, y la escisión de ADN e usando enzimas generalmente conocidas en la técnica.

ión pueden incluir secuencia señal para la dirección de expresión tales como promotor, un codón de iniciación, ciador. El codón de iniciación y el codón de terminación ias de nucleótidos que codifican una proteína diana a, la función se debería mostrar en un sujeto inyectado cantes. Un promotor general puede ser constitutivo o c, T3 y T7, pero la presente invención no se limita a los de mono (SV40), el promotor del virus del tumor mamario iencia humana (VIH), por ejemplo, el promotor de las virus Moloney, el promotor de citomegalovirus (CMV), el del sarcoma de rous (RSV), y también tiene el promotor humana, creatina de músculo humano, metalotioneina .

ra la selección de una célula hospedadora que contiene a transformada con el vector, en la que se pueden usar leccionable tal como resistencia a fármaco, auxotrofía, a de superficie. Puesto que únicamente las células que te tratado con el agente selectivo, es posible seleccionar tor es un vector de expresión replicable, el vector puede os nucleicos específica que inicia la replicación.

genes extraños, se pueden usar diversos vectores tales binante no está específicamente limitado en vista de un células hospedadoras de células procariotas y células prefiere un vector capaz de poseer fuerte expresión con en masa la proteína extraña en una forma similar a un

nte invención, se pueden usar diversas combinaciones xpresión que es apropiado para el hospedador eucariota de SV40, virus del papiloma bovino, adenovirus, virus nte invención no se limita a las mismas. El vector de bacterianos obtenidos de Escherichia coli, tal como pET, R322, pMB9 y derivados de los mismos, plásmido que fago que incluye significativamente diversos derivados fagos tales como M13 y ADN fago de cadena sencilla vadura es 2 plásmido y derivados del mismo. Un vector

invención también proporciona una célula hospedadora ante se inserta en la célula hospedadora para formar un vector pueden incluir una célula procariota tal como domonas sp., Proteus mirabilis o Staphylococcus sp. a incluyendo hongos tales como Aspergillus sp., levadura accharomyces sp. y Neurospora crassa, y otras células insecto. Además, las células hospedadoras pueden ser isponibles una célula de riñón de mono 7 (COS7), una O), W138, una célula de riñón de cría de hámster (BHK), K293, y similares, pero la presente invención no se limita

presente invención puede incluir cualquier procedimiento en el que los ácidos nucleicos están introducidos en un realizar seleccionando tecnología convencional apropiada la técnica. El procedimiento para la transformación incluy fosfato de calcio (CaPO⁴), deposición de cloruro de c transformación mediada por Agrobacterium, transformació sulfato de dextrano, lipofectamina y sequedad/inhibición; si

Según otra realización de la presente invención, la prese del anticuerpo de doble diana según la presente invenció con el vector recombinante.

El anticuerpo de doble diana según la invención preferent por un procedimiento recombinante génico. Específicamen la cadena pesada o una región entera de la cadena pesa región variable de la cadena ligera o una región entera de l dos vectores, por separado, en el que el conector de amin de DLL4 pueden estar ligados a un sitio que corresponde inducir la expresión en un sistema de expresión celular, pr la presente invención, pero la presente invención no se lim

Específicamente, el procedimiento de producción del ant recombinante insertando secuencias de nucleótidos que invención en un vector; transformar el vector recombinant aislar y purificar el anticuerpo de doble diana a partir del tr

Más específicamente, el anticuerpo de doble diana se pue el vector recombinante expresado en un medio nutriente, seleccionar apropiadamente dependiendo de una célula h medio, tiempo de incubación y similares, se pueden control y el desarrollo de las células y la producción en masa de la

El péptido o la proteína producida de manera recombinan del medio o de la degradación celular. En el caso de un tip aislar de la membrana usando una solución tensioactiva a Las células usadas en la expresión del anticuerpo de dob químicos tales como purificación por congelación-descon descomposición celular, y se pueden aislar y purificar por t col., "Molecular Cloning: A laborarory Manual", 2a ed., C "Guide to Protein Purification Methods Enzymology", Vol. disponibles la electroforesis, la centrifugación, la filtraci (cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de de exclusión por tamaño, y similares), el enfoque isoeléctri presente invención no se limita a las mismas.

Según otra realización de la presente divulgación, la pres angiogénesis o tratar el cáncer, la composición que incluy la presente invención incluye "prevención" y "tratamiento"; en los que el cáncer se inhibe o retrasa mediante la inyec presente invención, y "tratamiento" significa todos los comp o cambian de una manera ventajosa mediante la inyecci presente invención.

Los cánceres o tumores capaces de ser tratados por la co limitados, pero incluyen tumor sólido y cáncer de la sangre colón, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer de mam cáncer bronquial, cáncer nasofaríngeo, cáncer de laringe, cáncer de cuello de útero, cáncer de cerebro, cáncer de tiroides, cáncer paratiroideo, cáncer de riñón, cáncer esof cáncer rectal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de cuell melanoma, fibrosarcoma, rabdomiosarcoma, astrocitoma,

La composición anti-cáncer de la presente invención pued Para la administración oral, se pueden usar un aglutin solubilizante, un dispersante, un estabilizante, un agente una inyección, se pueden mezclar para ser usados un solubilizante, un agente isotónico, un estabilizante. Para la un excipiente, un lubricante, un conservante, y similares.

anismo, una célula, un tejido, o un órgano, y se puede endiendo de la célula hospedadora como se conoce en lectroporación, fusión de protoplastos, precipitación de o (CaCh), agitación con fibras de carburo de silicio, ediada por polietilenglicol (PEG), polietilenimina (PEI), mbargo, la presente invención no se limita a los mismos.

invención proporciona un procedimiento de producción ncluyendo cultivar células hospedadoras transformadas

ente se obtiene mediante la expresión y la purificación la secuencia de gen que codifica una región variable de del anticuerpo y la secuencia de gen que codifica una adena ligera se puede expresar en un vector único o en cido y/o la secuencia génica que codifica el antagonista N-terminal de la cadena pesada o la cadena ligera para ciendo de ese modo el anticuerpo de doble diana según a las mismas.

erpo de doble diana puede incluir: producir un vector odifican el anticuerpo de doble diana de la presente n una célula hospedadora y cultivar el transformante; y formante incubado.

producir en masa cultivando el transformante que tiene el que el medio y la condición de incubación se pueden pedadora. Condiciones tales como temperatura, pH del apropiadamente para ser apropiadas para el crecimiento oteína en el momento de cultivar.

como se ha descrito anteriormente se puede recuperar coplado a membrana, el péptido o la proteína se puede piada (por ejemplo: tritone-X 100) o escisión enzimática. diana se pueden destruir por diversos medios físicos o ación, tratamiento sónico, daño mecánico y agente de nología de aislamiento bioquímico general (Sambrook y Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deuscher, M., 2. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)). Están en gel, la precipitación, la diálisis, la cromatografía inidad, cromatografía inmunoabsorbente, cromatografía y diversos cambios y procedimientos complejos, pero la

e invención proporciona una composición para inhibir la l anticuerpo de doble diana. Un término "anti-cáncer" en el que "prevención" significa todos los comportamientos n de la composición que contiene los anticuerpos de la amientos en los que los síntomas del cáncer se mejoran de la composición que contiene los anticuerpos de la

sición de la presente invención no están particularmente referentemente, ejemplos de cáncer incluyen cáncer de cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de hígado, ncer pancreático, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, óstata, cáncer de huesos, el cáncer de piel, cáncer de ico, cáncer de conductos biliares, cáncer de testículos, e útero, cáncer de uréter, osteosarcoma, neurocitoma, roblastoma, neuroglioma y similares.

cluir además un vehículo farmacéuticamente aceptable. e, un lubricante, un desintegrante, un excipiente, un suspensión, pigmento, aromatizante, y similares. Para ente tampón, un conservante, un lenitivo, un agente inistración tópica, se pueden usar una sustancia básica, composición farmacéutica de la presente invención se puede mezclar con el vehículo farmacéuticamente acepta Por ejemplo, para administración oral, la formulación se suspensión, jarabe, oblea y similares. Para inyección, la f unitaria o en una forma de dosificación múltiple. Ademá tensioactivo que facilita el movimiento incluyendo el pa incluyen materiales derivados de esteroides, lípidos cati trimetilamonio (DOTMA), diversos compuestos tales com

Según otra realización de la presente invención, la presen su uso en un procedimiento de tratamiento de cáncer anticuerpo de doble diana o la composición que contiene sujeto. La composición que contiene el anticuerpo de do en una cantidad farmacéuticamente eficaz para tratar la c del cáncer. La cantidad de administración puede variar se corporal de un paciente, características y gravedad de tratamientos, tipo de administración y vía, y similares, y se correspondiente. La composición de la presente inv farmacológicos y fisiológicos anteriormente descritos, composición de la presente invención se puede administ adicional, y se puede administrar secuencialmente o sim La administración puede ser una administración única o obtiene el efecto máximo con una cantidad mínima sin e anteriormente descritos, y puede ser fácilmente determin

En la presente invención, un término "sujeto" significa un que aliviar, inhibir o tratar, o con dicho riesgo, administran preferentemente, un ser humano.

En la presente invención, un término "administración" sig sujeto mediante cualquier procedimiento apropiado, en diana de la presente invención se puede administrar por c a un tejido deseado. Se puede usar administración intramuscular, administración subcutánea, administració administración intranasal, administración intrapulmonar, limita a las mismas. Sin embargo, puesto que la proteín que se proporcione una composición oral mediante el r formule para proteger la composición de ser digerida en e administrar mediante cualquier aparato en el que un age

Además, la presente divulgación proporciona un procedi anticuerpo de doble diana, incluyendo el procedimiento q línea celular que expresa DLL4 humana (hDLL4) o una l umbilical humana (HUVEC).

En la presente divulgación, la actividad de Notch 1 se c cuándo el ligando de Notch se une al receptor Notch, en p un sitio proximal exterior de la membrana celular del rece secretasa para escindir un sitio proximal interno de la m intracelular de Notch (NICD) se aísla y migra dentro del para inducir la expresión de los genes diana de Notch tal y Hey.

La medición de la cantidad de expresión de NICD se rea consiste en SDS-PAGE, transferencia Western, tinción ensayo ELISA (medidas directas), y ensayo de lucifera procedimiento conocido para medir la expresión de proteí cantidad de expresión de NICD se midió preferentemente

Específicamente, el cocultivo de la línea celular que exp con HUVEC se puede realizar incluyendo las etapas de ( que sobreexpresa hDLL4 (293-hDLL4) y el anticuerpo de en la etapa (a) para conseguir el cocultivo. Se confirm activación de Notch-1 se redujo por el anticuerpo de dobl los Ejemplos de la presente invención.

Además, según el procedimiento para medir la eficacia caracteriza por que la actividad de Notch 1 se mide por l anteriormente descrito para tener diversas formulaciones. de formar como comprimidos, trociscos, cápsulas, elixir, ulación se puede preparar en una única ampolla de dosis a composición anti-cáncer normalmente puede incluir un a través de las membranas. Ejemplos del tensioactivo cos tales como cloruro de N-[1-(2,3-dioleoil)propil-N,N,N-emisuccinato de colesterol, fosfatidil glicerol y similares.

invención proporciona una composición farmacéutica para inhibición del crecimiento del cáncer administrando el anticuerpo de doble diana de la presente invención a un diana según la presente invención se puede administrar la cancerosa o su metástasis o para inhibir el crecimiento diversos factores tales como tipo de cáncer, edad y peso síntomas, tipos del presente tratamiento, el número de eden determinar fácilmente por los expertos en la técnica ión se puede administrar junto con los ingredientes se pueden administrar secuencialmente. Además, la en combinación con el agente terapéutico convencional neamente con los agentes terapéuticos convencionales. ltiple. Es importante administrar una cantidad a la cual se tos secundarios en consideración con todos los factores por los expertos en la técnica.

amífero que padece de una afección o trastorno que hay el anticuerpo de doble diana según la presente invención,

ca una introducción de un material predeterminado en un que la composición que contiene el anticuerpo de doble lquier vía general siempre y cuando la composición llegue aperitoneal, administración intravenosa, administración intradérmica, administración oral, administración tópica, inistración intrarrectal, pero la presente invención no se e digiere en el caso de la administración oral, se prefiere brimiento de un agente activo sobre la misma o que se stómago. Además, la composición farmacéutica se puede activo es movible a una célula diana.

ento de medición de la eficacia antagonista de DLL4 del mide la actividad de Notch 1 mediante el cocultivo de una a celular recombinante con células endoteliales de vena

cteriza midiendo una cantidad de expresión de NICD, y er lugar se activa una metaloproteasa ADAM para escindir r Notch y, a continuación, se activa un complejo gammarana celular del receptor Notch, de modo que el dominio leo. NICD se une a un factor de transcripción RBPJ/CSL mo proteínas hélice-bucle-hélice básicas incluyendo Hes

mediante un procedimiento seleccionado del grupo que munohistoquímica, inmunotinción, inmunofluorescencia, (medida indirecta), pero se puede realizar por cualquier en la técnica sin limitación. En la presente divulgación, la r transferencia Western.

a DLL4 humana (hDLL4) o la línea celular recombinante ultivar HUVEC; y (b) hacer reaccionar la línea celular 293 ble diana y realizar el tratamiento en la HUVEC cultivada que la cantidad de expresión de NICD mostrada por la iana PMC-201 mediante el procedimiento de cocultivo en

agonista de hDLL4 del anticuerpo de doble diana que se antidad de expresión de NICD, la actividad del promotor de NICD se puede medir con la cantidad de NICD usan antagonista de hDLL4 del anticuerpo de doble diana se de doble diana PMC-201 en placas recubiertas con hDL confirma en otros Ejemplos de la presente invención.

En lo sucesivo en el presente documento, la presente i siguientes Ejemplos. Sin embargo, los siguientes ejem invención, y será obvio para los expertos de la técnica q limitado por estos ejemplos.

Ejemplo 1 Producción del vector de expresión para la 201

El ADN que codifica el señuelo mínimo de Notch1 (domi a hDLL4 se obtuvo mediante la síntesis génica (incluy identificar las secuencias de bases de aminoácidos (FIG.

Secuencias de bases de 77 aminoácidos se clonaron con Tanibirumab (véase TTAC0001 desvelado en la solicitud conector G4S (S GGGG SGGGGS GS) que consiste e anticuerpo de doble diana PMC-201 con expresión optim 2). El vector recombinante confirmado se denominó "PM

Ejemplo 2: Producción e identificación del anticuerp

Se indujo la expresión aleatoria del vector de expresión transducción, y se confirmó la ocurrencia de la expresión usó mediante lipofectamine™ 2000 (Invitrogen N.° 1166 En resumen, se inocularon 5 x 105 células 293T por p (Welgene, República de Corea) y, a continuación, se dej °C durante 24 horas, consiguiendo de ese modo cultivo 80 % a 90 %. Se diluyeron 2 |jg del vector recombinante medios aMEM libres de suero, respectivamente, y se dej

Se mezcló una solución en dilución de ADN con solució temperatura ambiente durante 20 minutos, para formar e existente se separó de la célula incubada, se añadieron medio aMEM libre de suero a cada pocillo, y se incubó e al mismo 1 ml de medio aMEM que contenía 20 % de s Después, solamente se separó el sobrenadante, y se co SDS-PAGE se realizó mediante procedimientos conocido 12 % SDS-poliacrilamida, membrana de PVDF (Millip humana de cabra conjugado con HRP, y el anticuerpo EE.UU).

Como resultado, se confirmó por SDS-PAGE y transfere expresaba, y se obtuvieron anticuerpos purificados que proteína rápida (FPLC) usando columna de afinidad de P por tamaño (FIG. 3).

Ejemplo 3: Ensayo de afinidad de unión del anticuerp

3-1: Ensayo de afinidad de unión a VEGFR-2 y hDLL4

Se realizó un ensayo de afinidad de unión que confirma VEGFR-2 y hDLL4 usando ELISA. 1 jg/m l de los domini en el presente documento como VEGFR-2 ECD) y DLL4 pocillos a temperatura ambiente durante 2 horas, y se real 2 horas, usando leche desnatada al 2 %/PBS.

Después las placas tras terminar el bloqueo se lavaron c preparados a diversas concentraciones (0,18 a 3.000 VEGFR-2 ECD o hDLL4, y se dejaron reaccionar a te completara la reacción, el producto se lavó con PBS y, a IgG humana de cabra conjugado con HRP (Pierce, Ee . temperatura ambiente durante 30 minutos. Se indujo una Biosciences N.° 555214, EE.UU.) y se paró añadiendo 5 la reacción colorimétrica se realizó a absorbancia de 450 n procedimiento del ensayo de luciferasa, y la eficacia e medir tratando y cultivando la HUVEC y el anticuerpo midiendo la cantidad de NICD en la HUVEC, como se

ción se describirá con más detalle en referencia a los se proporcionan solamente para ilustrar la presente o se interpreta el ámbito de la presente invención está

ucción temporal del anticuerpo de doble diana PMC-

tipo EGF de unión a calcio 11 y 12 de un Notch1) unido optimización génica, GeneArt, Alemania) después de SEQ ID NO: 7) del correspondiente dominio.

-terminal de la cadena ligera del vector de expresión de atente internacional N.° PCT/KR07/003077), usando un aminoácidos para producir un vector de expresión del a en la línea celular 293-T (ATCC, CRL-11268 ™) (FIG.

1-v213".

doble diana PMC-201

pletado PMC-201-v213 en una célula 293T mediante SDS-PAGE y transferencia Western. La transducción se , EE.UU.), y se siguió por la instrucción del fabricante. en placas de 6 pocillos que contenían medio aMEM reposar en incubadora humidificado de CO² (5 %) a 37 o que tenía una densidad celular de aproximadamente C-201-v213) y 6 j l de lipofectamin™ 2000 en 250 j l de emperatura ambiente durante 5 minutos.

dilución de lipofectamin™ 2000 y se dejó reaccionar a plejo de ADN- lipofectamin™ 2000. Después el medio j l del complejo ADN-lipofectamin™ 2000 y 500 j l de incubadora de CO² a 37 °C durante 6 horas. Se añadió fetal bovino dializado y se incubó durante 48-72 horas. ó por SDS-PAGE si el anticuerpo se expresaba o no. El la técnica, y se usaron muestras tal como sigue: gel de N.° IPVH00010, EE. UU.), anticuerpo anti-IgG(kappa) IgG(Fc) humana de cabra conjugado con HRP (Pierce,

Western que el anticuerpo de doble diana PMC-201 se n pureza del 95 % o más por cromatografía líquida de ína A, columna de SP-sefarosa, y columna de exclusión

doble diana PMC-201

i el anticuerpo de doble diana PMC-201 se unía o no a xtracelulares 1 a 3 de VEGFR-2 (en lo sucesivo referido ividieron cada uno y se recubrieron en una placa de 96 na reacción de bloqueo a temperatura ambiente durante

BS, se añadieron Tanibirumab y PMC-201 previamente l) a temperatura ambiente a pocillos recubiertos con ratura ambiente durante 1 hora. Después de que se tinuación, se añadió dilución 1:2.000 de anticuerpo anticomo un anticuerpo secundario y se dejó reaccionar a cción colorimétrica por el reactivo de sustrato TMB (BD e solución de ácido sulfúrico 2N (H²SO⁴). La medida de 650 nm usando un lector de microplaca (Tecan, Suiza).

Como resultado, se confirmó que Tanibirumab y PMC-2 se confirmó que solamente el PMC-201 tenía afinidad d

3-2: Análisis de afinidad de PMC-201 y DLL4 humana

Para calcular la Kd (constante de disociación) de PMC-2 y se usó chip CM5. La constante de disociación es sim enzima a un sustrato en un complejo de enzima-sustr cuando se disminuye la constante de disociación.

La muestra se inmovilizó usando EDC (N-etil-N'-(dime Hidroxisuccinimida) 100 mM, y clorhidrato de etanolami Healhcare), e hidróxido de sodio 20 mM como tampón continuación, la muestra de análisis se diluyó 1:40 en ac a 4000 UR (Unidad de respuesta). Un tampón para me EP (GE Healthcare). Se diluyeron en serie DLL4 que te 156,3, 312,5 nM como antígeno para tener un volumen cinco concentraciones de siete concentraciones y se generación usado mediante la confirmación con aproxi sodio, después la muestra (156,3 nM) se sometió a una preliminar antes del análisis real. La afinidad de la mue de flujo del análisis era de 30 pl/min, una sección de unió

Como resultado del análisis de la afinidad para cada lo anticuerpo de doble diana PMC-201 de la presente inve

3-3: Medida de la afinidad de unión de hDLL4 y PMC-2

Se usaron ELISA y Biacore para medir la afinidad de un realizó análisis FACS para confirmar si PMC-201 se uní

En primer lugar, para producir el conjunto 293 y una líne ID NO: 12), la secuencia codificante de hDLL4 (secuenci se clonó en las posiciones BamHI y EcoRI de la enzima para construir pcDNA-hDLL4. Después, el vector pc transducción se usó utilizando lipofectamine™ 2000 (In del fabricante. En resumen, se inocularon 1 x 106 célul aMEM (Welgene, República de Corea) y, a continuación °C durante 24 horas para tener densidad celular de a pcDNA3.1) y 40 pl de lipofectamin™ 2000 en 1 ml de ambiente durante 5 minutos y, a continuación, la soluci lipofectamin™ 2000, y se dejó reaccionar a temperatura lipofectamin™ 2000. Después de que el medio existen complejo ADN-lipofectamin™ 2000 y 9 ml del medio incubadora humidificada de CO² a 37 °C durante 6 hor que contenía 10 % de suero fetal bovino dializado. Des se separaron por Tripsina-EDTA y, a continuación, se añ dializado y neomicina (G418, 500 pg/ml) y se incubaron del que se incrementó la concentración de G418 e aproximadamente 1 semana hasta que se formaron las que tenían colonias formadas en las mismas, y se movi contenía 10 % de suero fetal bovino dializado y neomic desarrollo se recogieron y se incubaron en un estado d

Después de 1 semana, se realizó análisis FACS con conjunto para confirmar la expresión de hDLL4, y 23 ti en placa de 6 pocillos y placa de 100 mm, respectivam suero fetal bovino dializado y neomicina (G418, 500 pg/ favorable hDLL4 entre las colonias sencillas, y se deno eficacia antagonista de DLL4 de PMC-201.

El análisis FACS se llevó a cabo para confirmar que PM En primer lugar, se incubó un número suficiente (1 x 1 produjo como célula sencilla con tripsina-EDTA y se a mezcló bien, seguido de centrifugación a 1.200 rpm dur el fondo en primer lugar se tiñeron con concentración 10 20 minutos, se lavaron con tampón 1xFACS, y se tiñero ían afinidad de unión similar en VEGFR-2; sin embargo, n similar en hDLL4 (FIG. 4).

LL4 humana, se usó BIACORE® 3000 (GE Healthcare), valor de Km, y se usó como índice de afinidad de una a afinidad entre la enzima y el sustrato se incrementa

opropil) Carbodiimida) 400 mM, se diluyeron NHS (N-(pH 8,5) que son un kit de acoplamiento de amina (GE neración, y 1XPBS como tampón de inmovilización y, a 0 mM (pH 5,0) (GE Healhcare). La muestra se inmovilizó dsorción de la muestra de análisis era un tampón HBS-oncentraciones de medida de 4,9, 9,7, 19,5, 39,1, 78,1, e 200 pl usando un tampón HBS-EP. Se seleccionaron ron. Se seleccionó una concentración del tampón de ente 10 % más de una línea base usando hidróxido de de unión y una etapa de disociación para experimento análisis se midió bajo condiciones en las que una tasa de 60 segundos, y una disociación era de 300 segundos.

confirmó cada afinidad en PMC-201 y Notch-1 Fc, y el tenía afinidad en comparación con Notch-1 Fc (FIG. 5).

resada sobre la superficie celular

PMC-201 a hDLL4 inmovilizada en una fase sólida, se a hDLL4 expresada sobre la superficie celular (FIG. 6).

lar que expresa hDLL4 (secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 11) en la que se realizó la optimización del gen tricción de pcDNA3.1 (+) por Geneoptimizer de GeneArt DLL4 se sometió a transducción en células 293. La n N.° 11668-019, EE.UU.), y se siguió por la instrucción en placas de pocillos de 100 mm que contenían medio cubaron en incubadora humidificada de CO² (5 %) a 37 adamente 20 %. Se diluyeron 16 pg del vector (DLL4 io aMEM libre de suero y se incubaron a temperatura dilución de ADN se mezcló con solución en dilución de iente durante 20 minutos para formar un complejo ADN-separa de la células incubadas, se añadieron 1 ml del libre de suero a cada pocillo, y se incubaron en un continuación, el medio se reemplazó con medio DMEM el medio se incubó a 37 °C durante 72 horas, las células n medio DMEM que contenía 10 % de suero fetal bovino pués de 72 horas, el medio se reemplazó con un medio g/ml, y se incubó bajo la misma condición durante ias. Cada colonia se trató con Tripsina-EDTA en placas a placa de 24 pocillos. Se añadieron medio DMEM que 418, 500 pg/ml) y se incubaron, y todas las colonias en nto.

erpo anti-hDLL4 (Biolegend EE.UU.) en un estado en colonias sencillas se seleccionaron y se subincubaron y se incubaron en medio DMEM que contenía 10 % de e seleccionó un tipo de célula que expresaba de manera 293-hDLL4 y se usó para el análisis relacionado con la

se unía de manera favorable al conjunto de 293-DLL4. ás por muestra de FACS) del conjunto 293-DLL4, y se 2 ml de tampón 1x FACS (0,2 % de BSA en PBS) y se minutos. Se descargó un sobrenadante y las células en e PMC-201, Notch-1 Fc y Tanibirumab con hielo durante egundo lugar (20 minutos en hielo) con anticuerpo anti-Fc humano con PE y se lavaron. Después, citometría de f

Como resultado obtenido al medir si PMC-201 se unía o n que PMC-201 tenía afinidad de unió similar a Notch-1 Fc

Ejemplo 4: Análisis de la capacidad de proliferación diana PMC-201

Se realizó análisis de la capacidad de proliferación celul de la célula endotelial de la vena umbilical humana (HUV de doble diana PMC-201 según la presente invención.

(Invitrogen, EE.UU.) que contenía 20 % de suero fetal (Hyclone, EE.UU.), 100 pg/ml de estreptomicina (Hyclon (Upstate Biotechnology, EE.UU.) 5 unidades/ml de hepari aire mezclado humidificado con CO² al 5 %. Estas células células/pocillo durante 24 horas para analizar la tasa de con medio M199 dos veces, y se incubaron bajo una con contenía 1 % de suero fetal bovino (Hyclone, EE.U concentraciones de anticuerpos en células durante 30 mi EE. UU.). Después de la incubación durante 48 horas, la horas, se midió la absorbancia a 450 nm de longitud, y se bajo cada condición.

Como resultado, se confirmó a partir del ensayo de la c incubada que el anticuerpo de doble diana PMC-201 pod HUVEC inducida por VEGF en comparación con el anticu

Ejemplo 5: Análisis de la capacidad de unión a DLL4

Se realizó análisis FACS para confirmar si PMC-201 se u celular 293-hDLL4. En primer lugar, se incubó un número hDLL4 y se trataron con Tripsina-EDTA para aislarse en c 1 X FACs (0,2 % de BSA en PBS). Después, las células rpm durante 3 minutos y, a continuación, se descargó el s 201 y 1 pg/ml de rhNotch1-Fc que se había marcado co en primer lugar se tiñeron en hielo durante 30 minutos, s de flujo (FACSCalibur).

Como resultado, se confirmó que la unión de rhNotc consideración con la media geométrica por PMC-201. anticuerpo rhNotch1-Fc, el cual es similar a un grupo de

Ejemplo 6 Análisis de la actividad del promotor por N

Se incubaron 1x105 células LS174T (línea celular de cánc 10 % de suero fetal bovino durante 24 horas, y se mezcla el kit de ensayo de indicador Cignal (N.° 336841 CCS Invitrogen) con 100 pl de medios opti-MEM y se dejó rep de opti-MEM para transfección para incubar células duran un medio MEM que contenía 10 % de suero fetal bovi mezclaron Tanibirumab y PMC-201 (cada uno de 20 mg/ durante 1 hora, a continuación, se cocultivaron con célul Notch Cignal durante 24 horas. DAPT (5 mM) no se trató LS174T transfectadas, y se cocultivaron durante 24 horas

En general se sabe que DAPT N-[N-(3,5-Difluorofenacet Notch 1 e inhibe la actividad de Y-secretasa para disminui col., EMBO Rep., :3(7):688, 2002; Ie-Ming Shih and Tian-

Después del cocultivo durante 24 horas, las células se s sistema de ensayo de indicador de luciferasa doble (N.° con otro y, a continuación, se midió la cantidad de luminis

Como resultado, se confirmó que la activación del prom células LS174T se disminuyó en células tratadas con el tratamiento con DAPT, en comparación con el grupo com

Ejemplo 7: Análisis del incremento en el dominio intr se usó FACSCalibur para la medición.

hDLL4 expresada sobre la superficie celular, se confirmó . 6).

UVEC después de tratamiento del anticuerpo doble

ra confirmar el cambio en la capacidad de proliferación (Lonza, Suiza), después del tratamiento del anticuerpo ncubó HUVEC usando medio M199 libre de rojo fenol ino (Hyclone, EE.UU.), 100 unidades/ml de penicilina E.UU.), 3 pg/ml de factor de crecimiento de fibroblasto Sigma-Aldrich, EE. UU.), en un incubadora a 37 °C con ncubaron en placas de 24 pocillos a densidad de 2 x 104 ervivencia de HUVEC. Después, las células se lavaron ón de baja concentración de suero en medio M199 que durante 6 horas. Se trataron previamente diversas s, y se trataron con 20 ng/ml de VEGF (R&D systems, lulas se trataron con WST-8 (Dojindo, Japón) durante 2 paró una con otra la capacidad de proliferación celular

idad de proliferación celular sobre HUVEC inicialmente nhibir más fuertemente la capacidad de proliferación de parental Tanibirumab (FIG. 7).

ana competitiva usando FACS

no de manera competitiva a hNotch1-Fc unido a la linea iente (1 x 106 o más células por muestra FACS) de 293-as sencillas y, a continuación, se añadió 2 ml de tampón illas aisladas se recuperaron y se centrifugaron a 1.200 nadante. Se añadieron 16 pg/ml de Tanibirumab o PMC-xa-488 (Zenon, N.° Z-25402) a las células en el fondo, aron con tampón 1x FACS, y se midieron por citometría

c unida a la HUVEC se disminuyó cuatro veces en ntras tanto, Tanibirumab no pudo inhibir la unión del uerpo no tratado (FIG. 8).

-1

e colon; ATCC, CL-188™) en medio RPMI que contenía 0,8 pg del ADN indicador de Notch Cignal contenido en L, Q iAGEN) y 2 pl de lipofectamine (N.° 11668-500; durante 20 minutos y, a continuación, se añadió 400 pl horas. Después de 6 horas, el medio se reemplazó con y se incubaron durante la noche. Al siguiente día, se y se trataron previamente en 1x105 células 293-hDLL4 S174T sometidas a transfección con ADN indicador de iamente y la célula 293-hDLL4 se mezcló con las células

-alanil]-S-fenilglicina t-butil éster) inhibe la actividad de incremento en la producción de NICD (Andrea Geling y ang, Cáncer Research, 67:1.879, 2007).

tieron a lisis usando un tampón de lisis contenido en el E1910;Promega), y un sustrato y ATP se mezclaron uno cia usando Luminómetro.

de NICD mostrada por la activación de Notch-1 de las uerpo de doble diana PMC-201, similar a los grupos de tivo que tenía anticuerpo no tratado (FIG. 9).

ular de Notch (NICD) por activación de Notch-1Se recubrió 1 |jg/ml de concentración de hDLL4 recombi se lavó con 1xPBS. Se trataron IgG humana (hIgG), Tani y se separaron las soluciones de anticuerpo tratadas. S PMC-20l (20 jg/m l) y se trataron en placas de 6 pocillo células se sometieron a lisis usando un tampón de lisis proteasa), y se recogió la solución celular y se transfirió y se enfrió en hielo. La proteína se cuantificó usando el pr el mismo procedimiento que la transferencia Western de

En este caso, un anticuerpo principal era dilución 1:1 escindido, el anticuerpo de p-actina (Conejo) estaba en de TBST, y un anticuerpo secundario era dilución 1:1.00

Como resultado, Se confirmó que una cantidad de NICD se disminuía disminuyó significativamente por el antic comparación con Tanibirumab que es un anticuerpo par

Mientras tanto, se realizó un procedimiento de análisis d sin recubrimiento de hDLL4 tal como sigue.

En primer lugar, se incubó 5x105 células/pocillo de HU trataron 2,5x105 células/pocillo de 293-hDLL4 (línea c trataron PMC-201 (10 jg/m l) DAPT (5 uM) durante 1 hor tratadas con DAPT se añadieron a HUVEC inicialmente anticuerpo, y se cocultivaron durante 24 horas. Como gru con HUVEC.

Después del cocultivo durante 24 horas, las células se s Na3VO4 1 mM, 1x cóctel inhibidor de proteasa), y se re se calentó a 95 °C durante 10 minutos y se enfrió en cuantificación BCA, y se midió NICD mediante el mismo

Como resultado, se confirmó que una cantidad de NICD se disminuyó para ser menos del 50 % del anticuerpo d con hIgG (FIG. 11).

rAplicabilidad industrial!

El anticuerpo de doble diana según la presente inve señalización de dos rutas, VEGF/VEGFR-2 y DLL4/Notc con la angiogénesis tales como tumor, y similares, y en p terapéutico neovascular solo, y previniendo fundamental directamente dirigidas.

Por lo tanto, el anticuerpo de doble diana según la pres mismo se pueden usar eficazmente para el tratami particularmente, cáncer.

La presente invención se ha descrito en detalle basán expertos en la técnica que estas tecnologías específic ámbito de la presente invención está limitada a las rea invención estará definido por las reivindicaciones adjunt

<110> PharmAbcine Inc.

<120> Anticuerpo biespecífico que se dirige a VEG mismo

<130> PP-B1277

<150> KR 2012-0132431

<151> 21-11-2012

<160> 12

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 122

con placas de 6 pocilios durante la noche (16 horas), y ab, PMC-201 (20 jg/m l) en cada pocillo durante 1 hora, zclaron uno con otro 5x105 HUVEC y IgG, Tanibirumab, pectivamente. Después de 24 horas de incubación, las 1 % de SDS, Na3VO4 1 mM, 1x cóctel de inhibidor de ubo Eppendorf, y se calentó a 95 °C durante 10 minutos imiento de cuantificación BCA, y se midió NICD mediante plo 2.

de anticuerpo (Va11744) (D3B8) (Conejo) de Notch1 ón 1:2.000 en leche desnatada conteniendo 5 % 0,05 % anti-IgG de conejo (R&D HAF008).

trada por la activación de hNotch-1 en la célula HUVEC de doble diana PMC-201 que se dirige a DLL4 en (FIG. 10).

ección de solamente NICD por cultivo celular y cocultivo

en placas de 6 pocillos durante 24 horas. Después, se 293 de sobreexpresión de DLL4 humana) y hIgG, Se s anticuerpos (hIgG, PMC-201) y las células 293-hDLL4 bada en placas de 6 pocillos, sin separar la solución de mparativo, se trató la línea de célula 293-T y se cocultivó

eron a lisis usando un tampón de lisis (final 1 % de SDS, la solución celular y se transfirió a un tubo Eppendorf, y La proteína se cuantificó usando el procedimiento de edimiento que la transferencia Western del Ejemplo 2.

trada por la activación de hNotch-1 en la célula HUVEC le diana PMC-201 que se dirige a DLL4 en comparación

puede inhibir más eficazmente y simultáneamente la tando de ese modo diversas enfermedades relacionadas lar, superando la resistencia causada usando un agente e la recurrencia del cáncer por células madre de cáncer

invención y la composición farmacéutica que incluye el de enfermedades relacionadas con la angiogénesis,

en sus características particulares, y es obvio para los n realizaciones simplemente preferibles y, por tanto, el ones. Por lo tanto, el ámbito sustancial de la presente u equivalente.

y DLL4 y composición farmacéutica que comprende el <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cadena pesada variable de anti-VEGFR-2

<400> 1

Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln

1 5

Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser 20

Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Trp

35

Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly 50 55

Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

65 70

Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met 85

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

100

Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

115

<210>2

<211> 116

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cadena pesada variable de anti-VEGFR-2

<400> 2

Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu

10 15

Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly 25 30

His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

45

lie Asn Pro Gly Asn Gly His Thr

60

Arg Val Thr lie Thr Val Asp Lys 75 80 Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp

90 95

lie Trp Gly Pro Ser Leu Thr Ser 105 110

Thr Leu

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser 1 5

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys

20

Trp Met His Trp Val Arg Gln

35

Gly Glu lie Asn Pro Gly Asn 50 55 Lys Ser Arg Val Thr lie Thr 65 70

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg 85

Ala Lys lie Trp Gly Pro Ser

100

Gln Gly Thr Leu

115

<210>3

<211> 116

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cadena pesada variable de anti-VEGFR-2 <400>3

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser 1 5

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys 20

Trp Met His Trp Val Arg Gln

35

Gly Glu lie Asn Pro Gly Asn 50 55 Lys Ser Arg Val Thr lie Thr

65 70

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg 85

Ala Lys lie Trp Gly Pro Ser

100

Gln Gly Thr Leu

115

<210>4

<211> 113

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

10 15

Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr

25 30

Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 45

His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

60

Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 75 80 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 90 95

Thr Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 105 110

Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

10 15

Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30

Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 45

His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

60

Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 75 80 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

90 95

Thr Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 105 110

<220>

<223> cadena ligera variable de anti-VEGFR-2

<400>4

Ser Gly Val Gly Ser Asn Phe Met

1 5

Val Ser Pro Gly Lys Thr Ala Arg

20

Gly Asp Val Asn Val His Trp Tyr

35 40 Val Leu Val Met Tyr Tyr Asp Ala

50 55

Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly 65 70

Gly Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala

85

Arg Thr Ser Glu Tyr Val Phe Gly

100

Gly

<210>5

<211> 108

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cadena ligera variable de anti-VEGFR-2

<400> 5

Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro Pro

1 5

Thr Ala Arg lie Thr Cys Arg Gly

20

His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly

35 40 Tyr Asp Ala Asp Arg Pro Ser Gly

50 55

Asn Ser Gly Asn Thr AlaT

65 70

Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser

10 15

Thr Cys Arg Gly Asp Asn Leu

30

Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro

45

Arg Pro Ser Gly lie Pro Glu

60

Thr Ala Thr Leu Thr lie Ser

75 80

Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp

90 95

Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

110

Val Ser Val Ser Pro Gly Lys

10 15

Asn Leu Gly Asp Val Asn Val

30

Ala Pro Val Leu Val Met Tyr

45

Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

60

LeuThr lieSer Gly Val Glu AlaGly 75 80

Asp Glu

Ala Asp

85

Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val

100

<210>6

<211> 109

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

Thr

Ser GluTyr

Val Leu Gly

<220>

<223> cadena ligera variable de anti-VEGFR-2

<400>6

Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro

1 5

Thr Ala Arg lie Thr Cys Arg

20

His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro

35

Tyr Asp Ala Asp Arg Pro Ser

50 55 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr

65 70

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys

85

Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys

100

<210>7

<211> 77

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> señuelo mínimo de Notch1

<400> 7

Asp Val Asp Glu Cys Ser Leu

1 5

Lys Cys lie Asn Thr Leu Gly

20

Tyr Thr Gly Pro Arg Cys Glu

35

Pro Cys Gln Asn Asp Ala Thr

50 55 Cys lie Cys Met Pro Gly Tyr

65 70

<210>8

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> conector de aminoácido

<400> 8

Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210>9

<211> 198

Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Lys

10 15

Asp Asn Leu Gly Asp Val Asn Val 25 30

Gln Ala Pro Val Leu Val Met Tyr 45

lie Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

60

Thr lie Ser Gly Val Glu Ala Gly 75 80 Val Trp Asp Arg Thr Ser Glu Tyr

90 95

Glu lie Lys Arg Thr

105

Ala Asn Pro Cys Glu His Ala Gly 10 15

Phe Glu Cys Gln Cys Leu Gln Gly 25 30

Asp Val Asn Glu Cys Val Ser Asn 45

Leu Asp Gln lie Gly Glu Phe Gln

60

Gly Val His Cys Glu

75

ly Gly Gly Gly Ser Gly Ser

10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> anticuerpo biespecífico (señuelo mínimo d <400>9

Asp Val Asp Glu Cys Ser Leu

1 5

Lys Cys lie Asn Thr Leu Gly

20

Tyr Thr Gly Pro Arg Cys Glu

35

Pro Cys Gln Asn Asp Ala Thr 50 55 Cys lie Cys Met Pro Gly Tyr

65 70

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 85

Pro Pro Ser Val Ser Val Ser

100

Arg Gly Asp Asn Leu Gly Asp

115

Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu 130 135 Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe

145 150

Thr Leu Thr lie Ser Gly Val 165

Cys Gln Val Trp Asp Arg Thr

180

Lys Val Thr Val Leu Gly

195

<210> 10

<211> 199

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> anticuerpo biespecífico (señuelo mínimo d <400> 10

tchl de la cadena ligera)

Ala Asn Pro Cys Glu His Ala Gly 10 15

Phe Glu Cys Gln Cys Leu Gln Gly 25 30

Asp Val Asn Glu Cys Val Ser Asn 45

Leu Asp Gln lie Gly Glu Phe Gln

60

Gly Val His Cys Glu Ser Gly Gly 75 80 Gly Ser Asn Phe Met Leu Thr Gln 90 95

Gly Lys Thr Ala Arg lie Thr Cys 105 110

Asn Val His Trp Tyr Gln Gln Arg 125

Met Tyr Tyr Asp Ala Asp Arg Pro

140

Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala 155 160 Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr

170 175

Glu Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr 185 190

tch1 de la cadena ligera)

Asp Val Asp Glu Cys Ser Leu G 1 5

Lys Cys lie Asn Thr Leu Gly S

20

Tyr Thr Gly Pro Arg Cys Glu l

35

Pro Cys Gln Asn Asp Ala Thr C 50 55

Cys lie Cys Met Pro Gly Tyr G

65 70

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly S 85

Pro Pro Ser Val Ser Val Ser P

100

Arg Gly Asp Asn Leu Gly Asp V 115 1 Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu V 130 135

Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe S

145 150

Thr Leu Thr lie Ser Gly Val G 165

Cys Gln Val Trp Asp Arg Thr S

180

Lys Val Glu lie Lys Arg Thr

195

<210> 11

<211> 2058

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> secuencia de ADN de DLL4 humana

<400> 11

atggccgctg ccagcagatc tgcctctggc tgg cagcagagag ccgccggaag cggcgtgttc cag cggggcgtgc tggccagcgg cagaccttgt gaa tgcctgaagc acttccaggc cgtggtgtcc ccc acacccgtgc tgggcaccaa cagcttcgcc gtg a Asn Pro Cys Glu His Ala Gly

10 15

e Glu Cys Gln Cys Leu Gln Gly

5 30

p Val Asn Glu Cys Val Ser Asn

45

u Asp Gln lie Gly Glu Phe Gln

60

y Val His Cys Glu Ser Gly Gly

75 80

y Ser Asn Phe Met Leu Thr Gln

90 95

y Lys Thr Ala Arg lie Thr Cys

5 110

n Val His Trp Tyr Gln Gln Arg

125

t Tyr Tyr Asp Ala Asp Arg Pro

140

y Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala

155 160

a Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr

170 175

u Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr

5 190

tgc tgctgctggt ggctctgtgg 60 agc tccaggagtt catcaacgag 120 gct gccggacctt cttcagagtg 180 cct gcacctttgg caccgtgtcc 240 acg atagcagcgg cggaggcaga 300 aaccccctgc agctgccctt caacttcacc tggc gcctggcacg cccctggcga cgacctgagg cctg agcaagatcg ccatccaggg cagcctggcc gtgg accagcaccc tgacccggct gcggtacagc taca ggcgacaact gcagccggct gtgcaagaag cgga cagcccgacg gcaacctgag ctgcctgcct ggat atctgcctga gcggctgcca cgagcagaac ggct tgcagacctg gctggcaggg cagactgtgc aacg cacggcacct gtagcacccc ctggcagtgc acct tgtgatcagg acctgaacta ctgcacccac caca agcaacagcg gccagcggag ctacacctgt acct tgcgagctgg aactgagcga gtgcgacagc aacc gaccaggaag atggctacca ctgcctgtgc cccc cacagcaccc tgtcctgcgc cgactccccc tgct aaccagggcg ccaactacgc ctgcgagtgc cccc aagaaagtgg accggtgcac ctccaacccc tgcg ggccccagcc ggatgtgcag atgcaggcct ggct gtgtccgact gcgcccggaa tccttgtgcc cacg ggcctgatgt gcacctgtcc tgccggcttc agcg atcgatgcct gcgcctccag cccctgcttc aacc accgacacct tcgtgtgcaa ctgcccctac ggct gtgggcctgc cccccagctt tccttgggtg gccg ctgctggtcc tgctgggaat ggtggccgtg gctg gacgacggca gccgcgaggc catgaacaac ctga cctgccgccc agctgaagaa caccaaccag aaaa gacaagagca actgcggcaa gcagcagaac caca cctctgggca gaggcaccat gcctggcaag ttcc aaggcccccc tgagactgca cagcgagaag cccg cccagagaca gcatgtacca gagcgtgtgc ctga atcgccaccg aagtgtga

<210> 12

<211> 686

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

ggca ccttcagcct gatcatcgag 360 gccc tgcctcccga cgccctgatc 420 caga actggctgct ggacgagcag 480 gtga tctgcagcga caactactac 540 gacc acttcggcca ctacgtgtgc 600 accg gcgagtactg ccagcagccc 660 tgca gcaagcccgc cgagtgcctg 720 tgca tcccccacaa cggctgccgg 780 gacg agggctgggg cggactgttc 840 ccct gcaagaacgg cgccacatgc 900 agac ccggctacac cggcgtggac 960 tgcc ggaatggcgg cagctgcaag 1020 ggct actacggcct gcactgcgag 1080 aacg gcggctcctg cagagagcgg 1140 aatt tcaccggcag caactgcgag 1200 aatg gcggacagtg cctgaacaga 1260 accg gcacctattg cgagctgcac 1320 ggca cctgtcacga cctggaaaac 1380 cgga gatgcgaagt gcggaccagc 1440 gcca cctgttacac cgacctgagc 1500 gtgg gcagcagatg cgagttcccc 1560 tctc tgggcgtggg cctggctgtg 1620 cggc agctgagact gagaaggccc 1680 gact tccagaagga caacctgatc 1740 gagc tggaagtcga ctgcggcctg 1800 ctgg actacaacct ggcccctggc 1860 caca gcgacaagag cctgggcgag 1920 tgcc ggatcagcgc catctgcagc 1980 tccg aggaacggaa cgagtgcgtg 2040 2058<220>

<223> secuencia de aminoácido de DLL4 human <400> 12

Met Ala Ala Ala Ser Arg Ser

1 5

Val Ala Leu Trp Gln Gln Arg

20

Gln Leu Gln Glu Phe lie Asn

35

Pro Cys Glu Pro Gly Cys Arg 50 55 Phe Gln Ala Val Val Ser Pro

65 70

Thr Pro Val Leu Gly Thr Asn 85

Gly Gly Gly Arg Asn Pro Leu

100

Gly Thr Phe Ser Leu lie lie

115

Leu Arg Pro Glu Ala Leu Pro 130 135 lie Gln Gly Ser Leu Ala Val

145 150

Thr Ser Thr Leu Thr Arg Leu 165

Asp Asn Tyr Tyr Gly Asp Asn

180

Asp His Phe Gly His Tyr Val

195

Leu Pro Gly Trp Thr Gly Glu 210 215 Gly Cys His Glu Gln Asn Gly

225 230

Cys Arg Pro Gly Trp Gln Gly 245

Asn Gly Cys Arg His Gly Thr

260

Asp Glu Gly Trp Gly Gly Leu

275

Thr His His Ser Pro Cys Lys Ser Gly Trp Ala Leu Leu Leu Leu

10 15

Ala Gly Ser Gly Val Phe Gln Leu 25 30

Arg Gly Val Leu Ala Ser Gly Arg

45

Phe Phe Arg Val Cys Leu Lys His

60

Pro Cys Thr Phe Gly Thr Val Ser 75 80 Phe Ala Val Arg Asp Asp Ser Ser

90 95

Leu Pro Phe Asn Phe Thr Trp Pro 105 110

Ala Trp His Ala Pro Gly Asp Asp

125

Asp Ala Leu lie Ser Lys lie Ala 140

Gln Asn Trp Leu Leu Asp Glu Gln 155 160 Tyr Ser Tyr Arg Val lie Cys Ser

170 175

Ser Arg Leu Cys Lys Lys Arg Asn 185 190

Gln Pro Asp Gly Asn Leu Ser Cys

205

Cys Gln Gln Pro lie Cys Leu Ser 220

Cys Ser Lys Pro Ala Glu Cys Leu 235 240 Leu Cys Asn Glu Cys lie Pro His

250 255

Ser Thr Pro Trp Gln Cys Thr Cys 265 270

Cys Asp Gln Asp Leu Asn Tyr Cys

285

Gly Ala Thr Cys Ser Asn Ser Gly 290 295 Gln Arg Ser Tyr Thr Cys Thr C 305 310

Cys Glu Leu Glu Leu Ser Glu C 325

Gly Ser Cys Lys Asp Gln Glu A

340

Gly Tyr Tyr Gly Leu His Cys G 355 3 Ser Pro Cys Phe Asn Gly Gly S 370 375 Asn Tyr Ala Cys Glu Cys Pro P 385 390

Lys Lys Val Asp Arg Cys Thr S 405

Cys Leu Asn Arg Gly Pro Ser A

420

Thr Gly Thr Tyr Cys Glu Leu H 435 4 Cys Ala His Gly Gly Thr Cys H 450 455 Thr Cys Pro Ala Gly Phe Ser G 465 470

lie Asp Ala Cys Ala Ser Ser P 485

Thr Asp Leu Ser Thr Asp Thr P

500

Val Gly Ser Arg Cys Glu Phe P 515 5 Trp Val Ala Val Ser Leu Gly V 530 535 Leu Gly Met Val Ala Val Ala V 545 550

Asp Asp Gly Ser Arg Glu Ala M 565

Asp Asn Leu lie Pro Ala Ala G

580

Glu Leu Glu Val Asp Cys Gly L 595 6 Gln Asn His Thr Leu Asp Tyr A 610 615 Gly Thr Met Pro Gly Lys Phe P 300

g Pro Gly Tyr Thr Gly Val Asp 315 320 p Ser Asn Pro Cys Arg Asn Gly 330 335

y Tyr His Cys Leu Cys Pro Pro 5 350

s Ser Thr Leu Ser Cys Ala Asp

365

s Arg Glu Arg Asn Gln Gly Ala 380

n Phe Thr Gly Ser Asn Cys Glu 395 400 n Pro Cys Ala Asn Gly Gly Gln 410 415

t Cys Arg Cys Arg Pro Gly Phe 5 430

l Ser Asp Cys Ala Arg Asn Pro

445

p Leu Glu Asn Gly Leu Met Cys 460

g Arg Cys Glu Val Arg Thr Ser 475 480 s Phe Asn Arg Ala Thr Cys Tyr 490 495

l Cys Asn Cys Pro Tyr Gly Phe 5 510

l Gly Leu Pro Pro Ser Phe Pro

525

y Leu Ala Val Leu Leu Val Leu 540

g Gln Leu Arg Leu Arg Arg Pro 555 560 n Asn Leu Ser Asp Phe Gln Lys 570 575

u Lys Asn Thr Asn Gln Lys Lys 5 590

p Lys Ser Asn Cys Gly Lys Gln

605

u Ala Pro Gly Pro Leu Gly Arg 620

s Ser Asp Lys Ser Leu Gly Glu

Lys Ala Pro Leu Arg Leu His S 645

Ala lie Cys Ser Pro Arg Asp S

660

Ser Glu Glu Arg Asn Glu Cys V 675 6 Glu Lys Pro Glu Cys Arg lie Ser

650 655

Met Tyr Gln Ser Val Cys Leu lie 665 670

lie Ala Thr Glu Val ***

685

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo de doble diana que se dirige a VEGFR-2 y DLL4 que comprende un antagonista de DLL4, el cual está unido a un terminal de un anticuerpo que se une a VEGFR-2,

en el que el anticuerpo que se une a VEGFR-2 comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1 a 3, y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las s Eq ID NO: 4 a 6,

en el que el antagonista de DLL4 es el 11° y 12 ° dominio tipo EGF de unión a calcio de Notchl humano, y en el que el antagonista de DLL4 está unido al N-terminal de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo que se une a VEGFR-2.

2. El anticuerpo de doble diana según la reivindicación 1, en el que el antagonista de DLL4 está unido al anticuerpo de unión a VEGFR-2 por el conector de aminoácido.

3. El anticuerpo de doble diana según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo que se une a VEGFR-2 comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 1 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 4;

una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 2 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 5; o

una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 3 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 6.

4. El anticuerpo de doble diana según la reivindicación 1, en el que el antagonista de DLL4 es el 11° y 12 ° dominio tipo EGF de unión a calcio de Notch1 humano comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 7.

5. El ADN que codifica el anticuerpo de doble diana según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Un vector de expresión recombinante que comprende ADN según la reivindicación 5.

7. Una célula hospedadora transformada con el vector recombinante según la reivindicación 6.

8. Un procedimiento de producción de un anticuerpo de doble diana según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que comprende cultivar la célula hospedadora según la reivindicación 7 y aislar el anticuerpo de doble diana del cultivo.

9. Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de enfermedades relacionadas con la angiogénesis que comprende el anticuerpo de doble diana según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el las enfermedades relacionadas con la angiogénesis es una o más seleccionadas del grupo que consiste en crecimiento tumoral, metástasis tumoral, degeneración macular relacionada con la edad (DMRE), retinopatía diabética, psoriasis, artritis reumatoide e inflamación crónica.

10. La composición para su uso en el tratamiento de enfermedades relacionadas con la angiogénesis según la reivindicación 9, en la que el tumor es uno o más seleccionados del grupo que consiste en cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer bronquial, cáncer nasofaríngeo, cáncer de laringe, cáncer pancreático, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de cuello de útero, cáncer de cerebro, cáncer de próstata, cáncer de huesos, el cáncer de piel, cáncer de tiroides, cáncer paratiroideo, cáncer de riñón, cáncer esofágico, cáncer de conductos biliares, cáncer de testículos, cáncer rectal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de cuello de útero, cáncer de uréter, osteosarcoma, neurocitoma, melanoma, fibrosarcoma, rabdomiosarcoma, astrocitoma, neuroblastoma y neuroglioma.