UA120286C2 - Біспецифічне антитіло проти cd3 і cd20 - Google Patents

Біспецифічне антитіло проти cd3 і cd20 Download PDF

Info

Publication number
UA120286C2
UA120286C2 UAA201708112A UAA201708112A UA120286C2 UA 120286 C2 UA120286 C2 UA 120286C2 UA A201708112 A UAA201708112 A UA A201708112A UA A201708112 A UAA201708112 A UA A201708112A UA 120286 C2 UA120286 C2 UA 120286C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
represented
sequence
amino acid
zeo
variable region
Prior art date
Application number
UAA201708112A
Other languages
English (en)
Inventor
Патрік Енґелбертс
Патрик Энгелбертс
Естер Брей
Эстер Брей
Рік Радемакер
Рик Радемакер
Ізіл Алтінтас
Изил Алтинтас
Давід Сатейн
Давид Сатейн
Сандра Верплуґен
Сандра Верплуген
Рімке ван Дейкхейзен Радерсма
Римке ван Дейкхейзен Радерсма
ден Брінк Едвард ван
Ден Бринк Эдвард Ван
Яніне Схюірман
Янине Схюирман
Паул Паррен
Original Assignee
Ґенмаб А/С
Генмаб А/С
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/EP2015/050276 external-priority patent/WO2015104346A1/en
Application filed by Ґенмаб А/С, Генмаб А/С filed Critical Ґенмаб А/С
Publication of UA120286C2 publication Critical patent/UA120286C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

Винахід стосується біспецифічного антитіла, спрямованого проти CD3ɛ та проти CD20, застосування біспецифічного антитіла при лікуванні захворювання, при якому бажане захворювання опосередковане Т-лімфоцитами специфічно націленими для знищення клітин з експресією CD20.

Description

Область техніки, до якої відноситься винахід
Даний винахід відноситься до біспецифічних антитіл, спрямованих проти СОЗ ії СО20, і до застосування таких біспецифічних антитіл, зокрема до їхнього застосування при лікуванні захворювань, при яких потрібно цілеспрямоване специфічне знищення клітин, опосередковуване Т-лімфоцитами, у яких експресується СО20.
Рівень техніки
Поліпептидний комплекс СОЗ, який розташовується в мембрані Т-лімфоцитів і асоційований з Т-клітинним рецептором, відомий уже багато років і цікавий у багатьох відносинах. Відомі специфічні антитіла проти СОЗ3. Описані властивості іп міїго п'яти варіантів з ефекторної функції гуманізованих антитіл ОКТЗ (Хи еї аї., 2000, СеїІ Іттипої. 200 (1):16-26).
Лікування за допомогою спрямованих проти СОЗ моноклональних антитіл ПОКТЗУ1 (Аїа-Аїа) приводить до поліпшення результатів аналізу на С-пептид і клінічних показників протягом щонайменше двох років після виникнення діабету типу 1 без продовження приймання імуносупресивних засобів (Негоїг еї а!., 2005, Оіабеїев, 54 (6):1763-9).
Описані антитіла проти СОЗ, які проявляють перехресну реактивність у відношенні СОЗ яванського макака й/або макака-резусу (МО 2012162067, УМО 2008119567).
Багатообіцяючий підхід в удосконаленні прицільної терапії антитілами полягає в тому, щоб доставляти цитотоксичні клітини специфічно до ракових клітин, у яких експресується відповідний антиген. Ця ідея використання Т-лімфоцитів для ефективного знищення пухлинних клітин описана в роботі 5іаег7, еї. аїЇ.,, 1985, Маїшге 314:628-631. Однак початкові клінічні дослідження принесли результати, які дещо розчаровують: в основному ефективність була низькою, спостерігалися значні побічні ефекти (так звана цитокінова буря, тобто різке збільшення кількості продукованих імунною системою прозапальних речовин - цитокінів) і біспецифічні антитіла проявляли імуногенність (МиПег апа Копіегтапп, 2010, Віодгид5 24: 89- 98). Прогрес у розробці й застосуванні біспецифічних антитіл дозволив частково подолати проблему цитокінової бурі й підвищити клінічну ефективність без токсичності, що змушує обмежувати дозу (Сагрег, 2014, Маї. Кем. Огид Оівсом. 13: 799-801; Її ит апа ТнакКиг, 2011,
Віодгид5 25: 365-379). Для подолання проблеми цитокінової бурі критично важлива відсутність або пригнічення експресії домена Ес, що було описано для катумаксомаба (Вегек еї аї. 2014, Іпі. у. Сбупесої. Сапсег 24 (9): 1583-1589; Маий-5Зогепзеп еї а). 2015, Сапсег СпетоїНег. Рнаптасої. 75: 1065-1073).
В-лімфоцитарний антиген СО20О - це корецептор, розташований на поверхні В-лімфоцитів (позначається також Вр35); він є гідрофобним трансмембранним білком з молекулярною масою приблизно 35 000 Да, який експресується незрілими (пре-В) і зрілими В-лімфоцитами (МаїІепіїпе еї аі. (1989) 9. Віої. Спет. 264 (19):111282-11287; ЕїпіієЇй єї а!., (1988) ЕМВО 3. 7(3):711-717).
СО20 виявлений на поверхні більш ніж 90 95 В-лімфоцитів периферичної крові або лімфоїдних органів; його експресія має місце на ранньому етапі розвитку пре-В-клітин і зберігається до диференціювання плазматичних клітин. СО20О є присутнім як на нормальних, так і на злоякісних
В-клітинах. Зокрема, СО20 експресується в більш ніж 9095 В-лімфоцитів неходжкінських лімфом (МН) (Апаегзоп еї аї. (1984) Віоса 63 (6):1424-1433), однак експресія СО20О відсутня у гемопоетичних стовбурних клітинах, у попередниках В-лімфоцитів (про-В-клітинах), У нормальних плазматичних клітинах або в інших нормальних тканинах (Теадаег еї аї. (1985) .).
Іттипої. 1935 (2):973-979).
У даній області техніки відомі методи лікування ракових, а також аутоімунних захворювань і інших розладів імунної системи, які базуються на використанні СО20 у якості мішені. Наприклад, для лікування таких ракових захворювань, як неходжкінська лімфома (МНІ), хронічний лімфоцитарний лейкоз (СІ) і дрібноклітинна лімфоцитарна лімфома (51) використовувалися або пропонувалося використовувати химерні антитіла проти СО20 за назвою ритуксимаб.
Людські моноклональні антитіла проти СО20, називані офатумумабом, використовувалися або пропонувалися до використання при лікуванні, крім іншого, різних станів, пов'язаних із хронічним лімфоцитарним лейкозом, фолікулярною лімфомою (Р), нейромієлітом зорового нерва (ММО), дифузійним склерозом і розсіяним склерозом з ремітуючим плином (ККМ5).
Людські моноклональні антитіла проти СО20, називані обінутузумабом, використовувалися або пропонувалися до використання при лікуванні хронічного лімфоцитарного лейкозу. Також розробляються гуманізовані антитіла проти СО20, називані окрелізумабом, для лікування розсіяного склерозу з ремітуючим плином.
У роботі саї! єї аї. (2005 Ехрегітепіаї! НептайоіІоду 33: 452) описуються біспецифічні антитіла, спрямовані й проти СОЗ, і проти СО20, отримані в результаті хімічної гетерокон'югації химерних антитіл проти СО20, називаних рітуксимабом (рітуксаном) Кйихітар (Кйихап) з антитілами бо проти СОЗ (Опіпосіопе ОКТ-3).
У роботі 5іаподітаїйєег еї аІ. (2008 Іпі. У. Сапсег: 123, 1181) описуються трифункціональні біспецифічні антитіла проти СО20 і СОЗ Ві20/ЕВТАО5, у яких об'єднані мишачий імуноглобулін
ІдсС2а, специфічний у відношенні СО20, і щурячий імуноглобулін Іде2Б5, специфічний у відношенні СОЗ.
У роботі УМи еї аЇ. (2007 Маї ВіоїесппоЇ. 25: 1290-1297) і в публікації УМО2011014659 описується тетравалентний імуноглобулін (з (імуноглобулін з подвійними варіабельними доменами; ОМО-Ід), який має подвійну специфічність (проти СОЗ і проти СО20).
У публікації УМО 2011090762 описується створення гетеродимерного поліпептиду
Сорзхорг0о.
У публікації МО 2011028952 описується, крім іншого, створення біспецифічних молекул сОр3хСр20 з використанням методики, розробленої у фірмі Хепсог, яка включає одержання антитіл ХтАбБ з модифікованим доменом Ес.
У публікації МО 2014047231 описуються біспецифічні антитіла проти СОЗ3ХхСО20 КЕСМ1979, які одержують способом, розробленим у компанії Кедепегоп РІагтасешцшіісаЇєх, і включають дипептидну модифікацію Еслаар.
У роботі Зип еї аї. (2015, Зсіепсе Тгапвіайопаї! Меадісіпе 7, 287га70) описуються націлені на В- лімфоцити біспецифічні антитіла проти СО20 і СОЗ, залежні від Т-клітин і одержувані з використанням методики "виступ у западину" (Кпорз-іпіо-по!/ев).
Біспецифічні антитіла, які зв'язуються і з СОЗ, і з СО20, можуть бути корисні в терапевтичних підходах, у яких потрібне специфічне націлювання на клітини, у яких експресується СО20, і знищення їх за участю Т-клітин; на сьогоднішній день є потреба в більш ефективних біспецифічних антитілах проти СОЗ і СО20.
Розкриття винаходу
Мета даного винаходу - запропонувати нові ефективні біспецифічні антитіла, які містять першу область, що зв'язує антиген, яка походить із антитіл проти СОЗ, і другу область, що зв'язує антиген, яка походить із антитіл проти СО20.
Нові біспецифічні антитіла проти СОЗ ії СО20 можуть принести користь у терапевтичних планах, у яких передбачається специфічне націлювання на клітини, де експресується СО20, і знищення їх за участю Т-лімфоцитів. Ці нові біспецифічні антитіла проти СОЗ ії СО20 високо
Зо ефективні для знищення клітин, у яких експресується СО20, включаючи клітини, у яких є мале число копій СО20; на тваринних моделях показано, що зазначені антитіла є потужним засобом знищення пухлинних клітин. Перевагою нових біспецифічних антитіл СОЗ ії СО20 за даним винаходом є те, що вони в невеликих дозах викликають швидке й масове знищення потрібних клітин. Нові біспецифічні антитіла проти СОЗ і СО20 за даним винаходом також здатні викликати цитотоксичність із боку як (С04-) Т-лімфоцитів, так і (087) Т-лімфоцитів, завдяки чому вони придатні для мобілізації Т-клітин для знищення пухлин, у яких є присутнім СО20, і лікування інших захворювань, у яких мають значення клітини з експресією СО20, Крім того, нові біспецифічні антитіла проти СОЗ ії СО20 за даним винаходом ефективно знижують кількість В- клітин у лімфоїдних структурах. Відповідно, ціль даного винаходу - запропонувати біспецифічні антитіла проти СОЗ ії СО20, здатні викликати цитотоксичність як з боку (047) Т-лімфоцитів, так і (Сб08:)Т-лімфоцитів. Також ціль даного винаходу - запропонувати біспецифічні антитіла проти
СОозЗ ї СО20, високоефективні для знищення клітин, у яких експресується СО20, наприклад пухлинних клітин з експресією СО20. Також ціль даного винаходу - запропонувати біспецифічні антитіла проти СОЗ і СО20, високоефективні для ліквідації ракових захворювань, при яких експресується СО20.
Ці й інші аспекти даного винаходу докладно описані нижче в даному документі.
Короткий опис ілюстрацій
Фігура 1. Зв'язування біспецифічних антитіл проти СОЗ ії СО20 із клітинами Рацаї (А-РЕ) і
УижЖаї (С0-І). (А) Зв'язування р5іде1-пиСОЗ3-НІТІ 1-РЕАЇ хСО20-708-РЕАК і ІдФ1-708; (В)
Зв'язування Б5Іде1-пиСОЗ-НІІ 1-РЕАЇ хСОр20-2Б2-РЕАК і ІдсС1-2Е2, (С) Зв'язування Б5ІдС1- пиСОЗ3-НІТІ1-РЕАЇхСО20-А8ТХ-РЕАК ії 1951-КТХ, (0) Зв'язування Б5Іде1-пиСОЗ3-НІ1 1 1-
ЕЕАЇ хСО20-1188-РЕАЕК і Ідс1-1188, (Е) Зв'язування Бб5Іде1-пиСОЗ3-НІЇ 1-РЕАГ хСО20-сА101-
ЕЕАК ії Ідб1-БА101, (Р) Зв'язування Б5Іде1-пиСОЗ3-НІТІ 1-РЕАЇ хСО20-2С6-РЕАК і Ідс1-708).
Дані, отримані шляхом проточної цитометрії, представлені як середнє геометричне інтенсивності флуоресценції (А-Е) і середня інтенсивність флуоресценції (Р) при зв'язуванні клітин Юацаї для двох репрезентативних дослідів (один із цих дослідів - Фігури А-Е, інший - РЕ). (б) Зв'язування р5іде1-пиСІ В-13/4-РЕАЇ хСр20-708-РЕАВ (писСІ В-13/4х708),. б5Ідат-пиСІ В-
Т3/А4-РЕАЇ хСО20-2Б2-РЕАВ (писСІ В-Т3/4х2БЕ2), Б5Ііда1-пиСІ В-13/4-ЕЕАЇ хСО20-сА1Т01-РЕАВ (пис В-Т3/4хаАТ01), реідат-писСІ В-13/4-ЕЕАЇ хСО20-1188-РЕАВ (пис В-Т3/4х1188) і бо моноспецифічних бівалентних антитіл ІдС1-708-РЕАК із клітинами Башцаїі. (Н) Зв'язування р5Ідат-пиСО3-НІ І 1-РЕАЇ хСО20-708-РЕАВ, реІдат-пиСО3-НІТ І 1-РЕАЇ хСО20-2Е2-ЕЕАВ, р5Ідат-пиСО3-НІТ І 1-РЕАЇ хСО20-сА101-РЕАВ, р5Ідат-пиСОЗ3-НІТ І 1-РЕАЇ хСО20-ВТХ-ЕЕАВ, р5Ідат-пиСО3-НІТ І 1-РЕАЇ хСО20-1188-ГЕАВ, р5Ідат-пиСО3-НІ І 1-РЕАЇ хСО20-2С6-ЕЕАВ, реІдат-пиСОЗ3-НІ І 1-ЕЕАЇ хб12-ЕЕАК і моноспецифічних бівалентних антитіл Іде1-пиСОЗ3-НІ 1 1-
ЕЕАЇ із клітинами «игКаї. (І) Зв'язування Б51де1-писСІ В-13/4-ЕЕАІ хСО20-708-ЕЕАВ, рз5ІдДа1- пиСІ В-Т3/4-РЕАЇ хСО20-2Р2-РЕАВ, / рзідса1-пиСіІ В-13/4-ЕРЕА! хСО20-сСАТ01-БЕАВ, / р5ІіІда1- пиСІ В-Т3/4-РЕАЇ хСО20-АТХ-ЕЕАН, Біда -писСіІ В-13/4-РЕЕАЇ хбО20-1188-ЕЕАВ, Б5ІдДСа1-пиСІ В-
Т3/А-РЕАЇ хСОр20-2С6-ЕЕАВ, р5Ідат-писСіІ В-13/4-ЕЕАЇ хб12-РЕАК і моноспецифічних бівалентних антитіл Ідс1-пиСІ В-13/4-ЕЕАЇ із клітинами «игКкаї. Дані, отримані шляхом проточної цитометрії (одного репрезентативного досліду), представлені як середня інтенсивність флуоресценції.
Фігура 2. Залежне від концентрації одночасне зв'язування біспецифічних антитіл Бб5Ідсе1- пиСОЗ-НІІ 1-РЕАЇГ хбО20-708-РЕАЕ (проти СОЗ і проти СО20) з Т- і В-лімфоцитами. Одночасне зв'язування біспецифічних антитіл Б5Іде1-пиСОЗ3-НІІ 1-РЕАЇ хСр20-708-РЕАК (проти СОЗ і проти СО20) з Т- і В-лімфоцитами в крові аналізували шляхом проточної цитометрії. Наведені дані, отримані в одному репрезентативному досліді й представлені як число випадків подвійних позитивних подій (подвійного фарбування) (СО19 ї СО4 ЦАЇ або СО19 і СО8 ВІ), визначене за числом подій у верхньому правому квадранті крапкової діаграми для СО4/С019 або СО8/СО19.
Зафарбовані й не зафарбовані значки позначають дані для зразків від різних здорових донорів.
У якості негативного контролю використовували антитіла Ідс1-2Е2 (2Е2, специфічні до СО2О) і реІдат-пиСОЗ3-НІ І 1-ЕЕАЇ хб12-ЕЕАК (СО3хХр12, специфічні до СОЮЗ).
Фігура 3. Індукція цитотоксичності іп міго біспецифічними антитілами проти СОЗ ії СО20 у клітинах ліній з В-клітинної лімфоми людини й лейкозних В-лімфоцитів. (А) Клітини Оацаї інкубували з біспецифічними антитілами Б5Іде1-пиСОЗ3-НІ1 1-РЕАЇ хСОр20-708-РЕАВ (СОо3х708), біспецифічними антитілами р5Іде1-пиСО3-НІТ І 1-РЕАЇ хСО20-1188-РЕАВ (СО3х1188), моноспецифічними антитілами проти СО20 Ідсе1-708 (708), ІДа1-708-ЕЕАВ (708-
ЕЕАК; з неактивною областю Ес), Ід01-1188-Е405Ї або Ідс1-1188-РЕАНВ (1188-РЕАЕК; з неактивною областю Ес), і контрольними біспецифічними антитілами р5Іде1-пиСОЗ3-Н11 1-
ЕЕАЇхр12-РЕАК (СОЗхХБ12); у якості ефекторних клітин служили мононуклеари периферичної
Зо крові (РВМОС). (В) Клітини Вацаї інкубували з біспецифічними антитілами р5Іде1-пиСОЗ3-Н11 1-
ЕЕАЇ хСО20-708-ЕЕАВ (С03х708), моноспецифічними антитілами проти СО20 Іде1-708-РЕАВ (708-РЕАК; з неактивною областю Ес) і біспецифічними антитілами р5Іде1-пиСОЗ3-Н11 1-
ЕЕАЇхр12-РЕАК (СОЗхХБ12); у якості ефекторних клітин служили очищені Т-лімфоцити. (С-Е)
Клітини Вацаї інкубували з біспецифічними антитілами проти СОЗ ї СО20 на основі двох різних гілок, що зв'язуються з СОЗ (гілка Бар пиСОЗ3-НІТІ1-РЕАЇ і гілка Раб ПписІ В-13/4-ЕЕА, представлені на малюнку не зафарбованими й зафарбованими значками, відповідно) і чотирьох різних гілок, що зв'язуються з СО20:708 (В5Іде1-пиСОЗ3-НІЇ 1-РЕАГ хбО20-708-ЕЕАК і В5ІдС1- пиСІ В-Т3/4-РЕАЇ хСО20-708-РЕАВ; ІСІ), 1188 (В5ідсат-пиСОЗ-НІТІ 1-РЕАЇ хобО20-1188-РЕАЕ і
Ввіда1-пиСІ В-13/4-РЕЕАЇ хСО20-1188-РЕАВ; ЦО), сАТОЇ (Ввіда1-пиСОЗ3-НІТІ 1-РЕАЇ хСрг0-
СА1Т01-РЕАК і В5Ідб1-пиСІ В-13/4-РЕАЇ хСр20-сА1Т01-РЕАК; (ЕЇ) ї 2622 (В5Ідб1-пиСО3-НІ1 1 1-
ЕЕАІЇхСО20-2Р2-РЕАК і В5Ідвс1-пиСІ В-13/4-РЕАЇ хСО20-2Б2-БЕАВ; Р). (0-М) Клітинами- мішенями служили В-лімфоцити різних ліній; їх інкубували з антитілами, як зазначено.
Біспецифічні антитіла проти СОЗ і СО20 містили гілку ар пиСОЗ3-НІЇ 1-ЕЕАГ. гаБб і різні гілки
ЕаБ, які зв'язуються з СО20 (708, 1188, 2Е2, СА101 або ЕТХ), як зазначено. Антитілами проти тільки СОЗ служили ІдС1-пиСОЗ3-НІ1 1. У якості ефекторних клітин використовували очищені Т- лімфоцити. (М) Клітини Юацаїі інкубували з біспецифічними антитілами Б5Іде1-пиСОЗ-НТІІ 1-
ЕЕАЇхбО20-708-РЕАВ (С03х708), б5Ідат-пиСОЗ3-НІТІ 1-РЕАЇ хСО20-206-РЕАВ (СО3хХ2С6) і реІдат-пиСОЗ3-НІТІ 1-РЕАЇ хбЬ12-ЕЕАК (СОЗ3хр12); при цьому в якості ефекторних клітин використовували очищені Т-лімфоцити. Дані представлені як середня (за трьома однаковими за вмістом лунками) ступінь (у відсотках) лізису стандартне відхилення (5.0.); усі наведені дані отримані в одному репрезентативному досліді.
Фігура 4. Залежна від дози індукція цитотоксичності іп міго антитілами р5Іде1-пиСОЗ-НТІ 1-
ЕЕАЇхСО20-708-РЕАК з використанням у якості ефекторних клітин очищених сумарних Т- лімфоцитів (203), С004:-Т-лімфоцитів(СО3-ОО8-) і СО8:-Т-лімфоцитів (СО3-С0О8). Клітини
Бацйді інкубували з різними субпопуляціями Т-лімфоцитів, як зазначено, і серійними розведеннями антитіл Б5Іде1-ниСОЗ3-НІІ 1-РЕАЇ хСр20-708-РЕАК або контрольних антитіл
Ідса1-пиСОЗ3-НІІ 1-РЕАЇ хр12-РЕАК і Ід51-708-РЕЕАК (не показане). Дані представлені як середня (за трьома однаковими за вмістом лунками) ступінь (у відсотках) лізису х стандартна помилка середнього (А, В). бо Фігура 5. Кінетика цитотоксичності, залежної від антитіл. Б51д1-пиСіІ В-13/4-ЕЕАЇ хСОг20-
7О08-ЕРЕАК, відносно клітин Рацаді. Клітини ЮБацаі інкубували з антитілами Б5Іде1-писСіІ В-Т3/4-
ЕЕАЇхСО20-708-РЕАК у присутності очищених Т-лімфоцитів, виділених із крові двох різних донорів (А і В). Цитотоксичність визначали через 4, 12, 24, 48 і 72 години інкубації (А) або через 3, 16 і 24 години інкубації (В). Дані представлені як частка загиблих клітин (у відсотках) ж стандартне відхилення для трьох однакових за вмістом лунок з антитілами Бб5Ідсе1-нписСіІ В-Т3/4-
ЕЕАЇ хСО20-708-ЕЕАК для різної тривалості інкубації. Дані, представлені на Фіг. А і В, отримані у двох незалежних дослідах, у яких використовувалися очищені Т-лімфоцити від двох різних донорів.
Фігура 6. Ефективність індукції цитотоксичності іп міго біспецифічними антитілами проти
СОЗ ї 2020 при різному співвідношенні ефекторних клітин і клітин мішеней. Цитотоксичність визначали, використовуючи різні біспецифічні антитіла проти СОЗ і СО20 ї різні значення відношення ефекторні клітини: клітини-мішені (Е/Т). Брали наступні біспецифічні антитіла: реІдат-пиСОЗ3-НІТІ 1-РЕАЇ хСО20-708-РЕАВ (А), Б51да1-пиСО3-НІТІ 1-РЕАЇ хСО20-1188-РЕАВ (В), б5іда1-пиСОЗ3-НІТЇ 1-РЕАГ хСО20-сАТ01-РЕАВ (С), Б5ідат1-нпиСОЗ3-НІТІ 1-РЕАЇ хСО20-8ТХ-
ЕЕАК (0) і р5Ідв1-пиСОЗ3-НІТІ 1-РЕАЇ хСО20-2г2-РЕАВ (Е). Негативним контролем служили антитіла р5Ід1-нпиСІ В-Т3/4-РЕАЇ хЬ12-ЕЕАК при Е/Т1-10:1. Дані представлені як середня (за трьома однаковими за вмістом лунками) ступінь (у відсотках) лізису х стандартне відхилення (5.0.); усі наведені дані отримані в одному репрезентативному досліді Кожна крива представляє певне (зазначене) відношення Е/1.
Фігура 7. Цитотоксичність біспецифічних антитіл проти СОЗ ії СО20 відносно клітин лінії Каїі-
Іис на моделі котрансплантації в мишей МОЮ-5(С210. (А) Середній розмір пухлин у мишей, що одержали контрольний розчин (РВ5) або антитіла Б5ідса1-пиСОЗ3-НІ1 1-РЕАІ хСО20-708-ЕЕАК у зазначених дозах. Планки погрішностей показують стандартну помилку середнього. (В) Розмір пухлини в однієї особини після введення РВ5 або антитіл б5Іде1-пиСОЗ3-НІІ 1-РЕАЇ хСО20-708-
ЕЕАК на 21-й день після інокуляції пухлинних клітин. Статистичний аналіз даних, отриманих на 21-й день, здійснений з використанням критерію Краскела-Уоллеса з наступним апостеріорним критерієм множинних порівнянь Данна ("р«0,01). (С) Аналіз виживання за Капланом-Мейером з порогом відсікання за розміром пухлини 600 мм3. Статистичну значимість різниці у виживанні між групою мишей, що одержали антитіла Б5Іде1-пниСОЗ3-НІ І 1-РЕАЇ хСО20-708-ЕЕАБЕ, і групою
Зо мишей, що одержали РВ5, визначали з використанням критерію Мантеля-Коксу ("р«0,05, р-0,01, п.5. - не значиме). (Ю) Середній розмір пухлин у мишей, що одержали контрольний розчин (РВ5З) або антитіла р5ідс1-пиСІ В-13/4-РЕАЇ хСр20-708-РЕАК, у зазначених дозах.
Планки погрішностей показують стандартну помилку середнього. (ЕЕ) Розмір пухлин в однієї миші в кожній групі на 25-й день після інокуляції пухлинних клітин. Статистичний аналіз даних, отриманих на 21-й день, здійснений з використанням критерію Краскела-Уоллеса з наступним апостеріорним критерієм множинних порівнянь Данна. (Б) Аналіз виживання за Капланом-
Мейером з порогом відсікання за розміром пухлини 500 мм3. Статистичну значимість різниці у виживанні між групами мишей, що одержали антитіла Б5Ідв1-пиСОЗ3-НІ1І 1-РЕАЇ хСОр20-708-
ЕЕАК, і групою мишей, що одержали РВ5, визначали з використанням критерію Мантеля-Коксу
Ср-0,05, и ре 0,01, п.5. - не значиме). (С) Середній розмір пухлин у мишей, що одержали або контрольний розчин (РВ5), або антитіла Б5Іде1-пиСОЗ3-НІ1І1-РЕА! хСО20-708-РЕАК, або антитіла Б5Іде1-нпиСОЗ3-НІІ 1-РЕАЇ хСО20-1188-ЕЕАБЕ, у зазначених дозах. Планки погрішностей показують стандартну помилку середнього. (Н) Розмір пухлини в однієї особини після введення або РВ5, або антитіл. Б51де1-пиСОЗ3-НІТІ 1-РЕАІ хСО20-708-ЕЕАК, або антитіл Б5Іде1-ниСОЗ3-
НІТІ1-ЕЕАГ хбО20-1188-РЕАК на 20-й день після інокуляції пухлинних клітин. Статистичний аналіз даних, отриманих на 20-й день, здійснений з використанням однофакторного дисперсійного аналізу АМОМА з наступним апостеріорним критерієм множинних порівнянь Т'юки
Ср«0,05, "р«0,01). (І) Аналіз виживання за Капланом-Мейером з порогом відсікання за розміром пухлини 500 мм3. Статистичну значимість різниці у виживанні між групою мишей, що одержали антитіла Б5Іде1-пиСОЗ3-НІТІ 1-РЕАГ хСО20-708-РЕАК, і групою мишей, що одержали РВ5, визначали з використанням критерію Мантеля-Коксу (р«к0,05, "реа 0,01, п.5. - не значиме).
Фігура 8. Протипухлинна активність антитіл. Б51де1-пиСОЗ3-НІ1 1-РЕАЇ хСО20-708-РЕАК у мишей НІЗ із ксенотрансплантатами пухлинних клітин лінії Юацаі-Ішс. (А) Середній розмір пухлин у мишей лінії ВКО5-НІЗ із ксенотрансплантатами Оацаїі-Ішс, що одержали контрольний розчин (РВ5), антитіла Бб5Іде1-пиСОЗ3-НІІ 1-РЕАЇ хСО20-708-РЕАК (тАБр2) або контрольні біспецифічні антитіла Б5Ідв1-пиСО3-НІТІ1-ЕЕАІЇ хр12-РЕАК (тАбБі) у зазначених дозах.
Пухлинне навантаження визначали шляхом біолюмінесцентної візуалізації (ВІ). Планки погрішностей показують стандартну помилку середнього. (В) Статистичний аналіз даних, отриманих на 21-й день, здійснений з використанням критерію Краскела-Уоллеса з наступним бо апостеріорним критерієм множинних порівнянь Данна (7 р« 0,01). (С) Популяції лейкоцитів периферичної крові в мишей ВКО5-НІ5З із ксенотрансплантатами Оашцаі-іс антитіла, що одержали, Б5Іде1-пиСОЗ3-НІІ 1-РЕАЇ хСО20-708-РЕАК або контрольні біспецифічні антитіла р5Ідат-пиСОЗ3-НІ І 1-ЕЕАЇ хб12-ЕЕАК, за даними проточної цитометрії, проведеної на 9-день. 95 пСраБ: - сумарна частка (у відсотках) людських лейкоцитів у периферичній крові в мишей. 95 пСО195, 92603: і 96пСОЗ' ЕС" - частка (у відсотках) В-лімфоцитів, Т-лімфоцитів і активованих
Т-лімфоцитів, відповідно, у популяції людських лейкоцитів.
Фігура 9. Вивчення ефекту однократного введення антитіл р5Ідсе1-пиСОЗ-НІ1 1-РЕЕАЇ хСОг20- 7О08-ЕРЕАК у яванського макака. Визначення кількості В-лімфоцитів (клітини СО19-5021) (А) і Т- лімфоцитів (клітини СО4:» і клітини СО8" сумарно) (В) у різні моменти часу в периферичній крові яванських макаків, яким увели різні дози антитіл. рб5Іде1-пиСО3-НІТІ 1-РЕАЇ хСО20-708-РЕАВ (0,01; 0,1; 1 або 10 мг/кг). У дні, позначені -18 ії -11, визначали кількість зазначених клітин до введення антитіл. Кількість В-лімфоцитів (С) і Т-лімфоцитів (0) у відсотках від сумарної популяції лімфоцитів у різні моменти часу в зразках тканини лімфатичних вузлів у яванських макаків, яким увели різні дози антитіл Б5Іде1-нпиСОЗ3-НІІ 1-РЕАЇ хСр20-708-РЕАВ (0,01; 0,1; 1 або 10 мг/кг). Вміст 1-2, 1-6, 1-8, 1--10, ІЄМ-у ії ТМЕ-а у плазмі крові в яванських макаків, яким увели різні дози антитіл б5Іде1-пиСОЗ3-НІІ 1-РЕАЇ хСО20-708-РЕАК (0,01; 0,1; 1 або 10 мг/кг) (Е). Фармакокінетичний профіль антитіл Б51де1-пиСОЗ3-НІІ 1-РГЕАЇ хСр20-708-РЕАК у зразках крові через різні проміжки часу після введення (0-70 діб) (Р). Пунктирною лінією показаний очікуваний фармакокінетичний профіль Ідс1, побудований з використанням двокомпартментної моделі при константі швидкості елімінації Кіо-0,006 год.", обсязі плазми Мо-40 мл'-кг" і масі тіла 3,5 кг.
Фігура 10. Зв'язування біспецифічних антитіл проти СОЗ ії СО20 з СО20 дикого типу й з
СО20-АХР, які експресуються в клітинах НЕК29ЗЕ. Зв'язування біспецифічних антитіл проти сОо3 ї СО20 (р51951-пибО3-НІТІ 1-РЕАЇ хСО20-708-РЕАВ |пиСбОЗхХ7081, Б5Іда1-пиСІ В-Т3/4-
ЕЕАЇ хСО20-708-ЕЕАВ ІпиСІ в-Т13/4х7081, р5ідат-пиСО3-НІТІ 1-РЕАЇ хСО20-2г2-РЕАВ
ІниСОЗхХа 2, б5іІдса1-пиСІ В-1Т3/4-РЕАЇ хСО20-2Е2-ЕЕАВ (пис В-Т3/4х2Е21, бзіда1-пиСОЗ3-НТ 1 1-
ЕЕАЇ хСО20-1188-ЕЕАВ ГниСОЗхХ1188), б5ідса1-пиСіІ В-13/4-ЕЕАЇ хСО20-1188-РЕЕАВ Тисі В- т3/4х11881, б5іда1-пиСОЗ3-НІІ 1-РЕАЇ хбр2г0о-сдлт01-РЕАВ ІнибОЗхХОаАтТОт1|, 651901-пиСО3-
НІІ1-ЕЕАГ хСО20-ВТХ-РЕАВН ІпиСОЗХАТХІ, реідат-пиСОЗ3-НІТІ 1-РЕАЇ хСО20-206-РЕАВ
Зо ІниСбОЗХх2С6ї) з СО20 дикого типу (А) і з мутантним СО20 (СО20-АХР) (В), які експресуються в клітинах НЕК293 за даними проточної цитометрії. Наведені середні значення інтенсивності флуоресценції, отримані в одному репрезентативному досліді.
Фігура 11. Активація Т-лімфоцитів після інкубації мононуклеарів периферичної крові з антитілами Б5Іде1-пиСОЗ3-НІІ 1-РЕАЇ хСОр20-708-РЕАК. Мононуклеари периферичної крові (РВМС), узятої в здорового донора, інкубували з антитілами РВМС Бз5іда1-нпиСОЗ3-НІ11 1-
ЕЕАЇ хСО20-708-ЕРЕАК або з антитілами, що служили позитивним або негативним контролем, і активацію Т-лімфоцитів визначали за результатами вимірювання рівня експресії СОб69 у популяції Т-лімфоцитів (клітини СО287). У цьому експерименті використовували РВМС від п'яти здорових донорів. Тут представлені репрезентативні дані для двох донорів.
Таблиця 1
ПЕЖО Ір МО: | йазва клону 00/00 Послідовність. ши
СжО тб оМО:1 0 ВиСОЯ УН СБК сЕТЕМТУД п шк
СЕКО ІВ МО:2 | посСоЗ МВ ОСОБ? 0 ІВОКУМНУАТ | Н ши
СяБОо ї8 МО:3 0 васоЗ3 УВО СРО УВНОМЕСМаУУВИКАХ, ШИ Ще і
ОСБЕО ІВ МО:4 | посоЗ м СОБІ | ТОАУТТВМУ сш Ши нш
ДИ вчсб3 у СОВ2 от п
СВО 10 оМО:5 вшсра У СОВЗ АБУ 0000000 нини ши ЕБУКОУКЕСБСЬМОРОСЗЬВСЗСВАВОЕТЕМТУВММНУВ
КО ІВ КО: | псоз УНІ ОАРОКСЬКИУАВІВВКУНИХАТУУАОСУКОВЕТІ ВАР рим і Пяя 5КІВУБОМИМОКТЕОТАМУХСУВНОМЕОМВУУВИТАХ
І моОостІтУВВ : виш ння ЕУКІОТКВСССОТУКРОВОЬВОВСААОСЕТЕМТУАММИМВ С ше | ЗКБІТУБОМИМЬКТЕОТАМУУСУВНОМЕСВОУУВИКАХ
МОсОстТЬУТУВВ па
ЯКО Ір МО: 8 восоз УНЗ ОАРОКСЬКИМАВІВОКУМНУАТТУВОВУКОНЕТІВНОС що | ОЗКЗІБТТОММВЬКТЕОТАМУХСУКНОМЕСМЕХУВУТАХ йисбОостіУуТУВа о
ПЕ МКІУЕБСОСІУКРОВБЬНІЗСААЛОВТЕМТУАММИУВ ОО. зво тр Мої месяц ОАРСКСЬКИУАВІНОКУЮНУАТУУАСЕУКОКЕТІВВОЮ ' | ЗКВІГУТОММБІКТЕОТАМУУСУВНОМЕСМВХУВИКАХ і | мсОостМУТУВЕ :
ПТ ОВУ УТОЕРЕЕБУУРОСТУТІТСВЕЕТОАУТТЕМУАНИМ
8ЕО Ір МО:10 висоі У1і 0 ООТРООАКВСОІССТМКВАРСУРАВЕЧОСЦІСОКААТВ
ІТСЛОАВОВОІТРСАТИУ ЗМ КОССТКГТИ, :
ОАУУТОЕРЕЕОУЄРОСТУТЬТСВОБТОАУТТВМУАНИМ вкО ІВ МО:11 висо УБО | ООТРООАЕВСЬІССТМКВАРОУВАВЕОСЕТПСМКАЛЬЕ З нн ТТОДОДООЕВІУЕСАТИХ МІУ КСВОТКІ Р,
Пр ТТ ОДУУТОКРЕББУВРОСТУРИ СКЗ ТОАУТТОМУАМНИ
ОБО ІБ МО:19| висоЗ УЬЗ 00 ООТБРООВЕВСЬІССТИКВАРОТРАВКВОВТСМКВАМІТ ! тТОоЗОБпОКОруУХСсАТИВМИУ СОСОК, ! і ОТ ООСМЕЕМОСІТОТРУКУВІЗСТТУТЬТОВОХРОВКІВ З
Зрілий ОНМрКМІССОБООКМІСВОБОНОЗІКЕРВЕБКОВОХХУ
ОБО І0 МО:13| людський СОЗє | СУРВОВКРЕОАМЕХБСУТКАБУСЕМОМЕМОУМОУАТІУІ : 00 тепсилоні УПІСІТОСІСІЬУТЮВКМВИАКАКРУТНОДСДСВНОВ шин «1 СОМКЕВРРРУРМРОУЄРІНКСОВОСУВСЬКМОВНІ ту тиків Ж перо шия т г Щ Ї ЕКІВІЕБОБОВУКММСМЕВІТМУВОРУСТЬЕОІ ТВО ' ї нх тут мосту юс у мух ет :
Людський СОЗБ | СКНІБОРВСТУВСМОТОТУКОКЕВТУЮУНУВМСОВСУ
Н дало КІЗ іо 4 Б й Й ягня
Н те сх, ли 5 т тя щи тт твутАТІлТ ДІ СО ТАС ШЕ ЛО :
ЗО ТВ ОМО:14 сбпельта ЕВОЗАЖУАСІІМТВУТАТЬБАТОМЕСКАаНВТОВССО :
Н дельта); іі й дати но :
ААПТОДІОВМОСУХОВЬВОВЛОВОКеНІСОМИАВМК : Ки в ладі ьх 3 о в нн си : , р нти тд тут ж тую рт сита укоиквив і т | АДТКОЯУКРЬАРЕВКОТаОСТААЬССТУКОКВЕ ШЕ
Н Талі ку І Й чат щи о пшшт Ук постріл ю і тан | УБИМЕСАГТЯОУНТРРАУВОВВСТУВЬОВУУТУРВОУЬ ка нсуКа па Щ Га з ях їе завис рим ої
ЯЗНОТеНЖНЯ |стотуУІСМУЦНКРОМТКУКВУЄРКВСОВКТИТОВРОВА З
Н А я и нм Я
Н вам дис, плиту Й у вічні зт ; хгкрт рт ие це Я
ОЛаСтТь РОЖНОУО ре ОБРЕУБЬЕРРИРКОТІМІБВТРЕУТСУТУВУВНЕ
Н . ее рт рр та укр тя с "тез ау і і звицюгта 1-х УкЕМИУУПОУКУЧКАКТКрИЕНОТМЕТУВУЮИ ! ака тв щОо:151 БЕНХ о | пЕЕУКЕМАКХУЮОУВИУНКАКТКРЕЕКИО Я СЕ по рони Ох М о і х прожите тих шт сі кет є. ожив Огрд ет тт тих шетурвот Е : р бамінахислотні | УБНОРЮІМОКЕУКСКУМКАЬРАРІЕКТІВКАКСОРАХ
Н Ї епі мячи о - ДИ с ря прут тесті скорУвспіІдосия : озалишки 187 РОМУТЬРРЕВЕЕМТКМОХВЬТСГУКСКУРНОТАУЕНИХ
Н Дитя срок еВуУчт КОТ дю в жару ет стерні цт у шниттипке рі х і : Я їі; Бумерантя уоерРХМУКТТРРУГСОВОСЯККУВКЦТУЮКВРИОООМ
Н пуд фер твваудк Й Й п Й дтп : ва скстемою КУ) тРЕСВУМНЕВЬНМНУТОКВЬВЬОВОЮ ОО рення нин пп о пу и пт ЛЕТКОРОУКЕСАРНОКВТООСТААТССЬМКОТЕРЕРУТ
Н плям я тот Й - чіт тя слот вето рашс Я , Таб ТАЖОЮВА осукосвмітастнттРАУВОВСІ ВІ ВУЧТУВНЕ,
І Е сем їй і г ето КИ му рути тв ти ІІ Н
Н зу ду Ко У ежретрмт тя опи тим 1: ЕТ БА : : о константна |ЗТОТУТСКУМЕКРОМТКУККУЄРКЕСОКТНТСВРСВА
Кік шоттркх дже ит сек піжато те рун т артрити Н Е : сласть важкого ретЕСОсРУУКЬКРРЕРЕСТОЬМІЗВЕРЕУТОСУУУАУЕНЕ ї і поді Н іл - Й мату ришнеуєкммшхоЇ
Тех ж З 'нсоехі1а | лавцюга ООРиУКЕМщУураУвуУнМАКТК ЕОМ ТУ МВ їх й ошТА ІИ ІУ 11 Кажу тпм! пулу пт м пато Тс ВІРУ Н рю со фіаміноКислена і «НОТ, МеСКЕ у кскУуси КАІ АРІ РЕ Ів КАК чЕ ! сут укря пит зв-А но й й пиревеї хти ту ро пт
ПАМИТНК ТТ РОУУТІРОЕВЕЕМТКМОМУЄЬТСТТКОТУРВОТАУЕНКЕ
: Я дз гхужлект ть ше й М паптру ик сток т4ї: нумерентя сосок уКТТеРУБОВОСЗЕКОУЄКЕТУВКВВИООЄМ
Я -3 овен БІС
Н то путем КМ сти и пк тві соицмиуттурет столи : зв системою КМ) зуресеуМмнеАнМнУТОКВЬсЬВРаК шк ! й ут те пт вт ливдшиитевумиВ Н ! ШЩ ШИ ! | кУуСЬУКИЗОСЬМКрасви во САЛО А їх кі : і лузги т ІМ ума пввоУутУУргшниипветтсртумд мо І : з/л ОАРОКОСЕМУАТІЗВУВВУІТУУРОЗУКОВЕТІВВОВАК ОЇ
Ї ет г зро жу кер доти дО й т. рити то туТУТ мимо СУД : оЗКО 10 МОТА7 УНН овосьВ-тяуя МВІХЬОМЕЗІКАНОТАУТІСВНВЕ ХОРУ воостЬ ! ' ! | чУтув і ! МАУ міння пкнюноткннттнннететннн птн рент ЕЕ тЕ тт КЕлКвКИ середови ВК
ШИ ! ОБІЛІЛОБРАТЬВОБРОЕВАТОВСВАБЕВБУТУУННУОЮЮ ! іо тмнут труп кт Ах двЕдпВоВОСтТОКтІТІва
ОБО ІБ МО:18 | У ВиСЬВ-ТЗ/Я | РООАРВОБІХОТЕКЬАБСІРАВЕЗОБОБОТОКТІЛ ою ДО ІК 130 | їх ЯК. сл, і В; до й ноМфівванни мий : | І і БК ДЯ З жива ЕМе Я
ОБЕРЕОКАУТУСЕОСЗСУРИТЕСВОТКОЕМА зн Й ши й х. ат Ус ВОоНІВЕАОМ пи ОПБОМЕКЕМОЗІТОТРУСУНТЗОТРУТТТОВЗОНЬОВЕАОЮ
Н КАМ Зі я -ї : : путі пт РУТ - втік чо ин от тор оту тн ! твалим о ЗеІЕ | ониекМкКеросОоВІРБРЕКОЕМЕКОВОХУУСУвВОМоВ ' сапсипдан) сумна ; лю мМ Атт тот:
Ева ІВ оКНІВ чсввпсилок) ПАЗИНІТКАВУСЕМСМЕМОУМАУАТІУТУОІСТТ ТЬСЯ. сш МО соус пу й тд вт тт пох из яки р ши ЯПВНС ОО тоЕуХЖИЗКМВКАКАКРУТНСАЛАССВОВООМКЕВРЕВ
Н - нях я : : «види тоетхсуттьтут руту нут рани дини ту : ! | какака УРМРОХЕРІВКОСОрЬУВСЬМОВВИ 000 і пн нн докучати рик тт и втерти фтору иС нн ОПСМЕКЕМСВІТОТРУНУВІЯОТТУТТСВОНІССЗЕУСЄЮ І ! І зе Ії ек у У і Н утжІВ Мити ч овес шмил сера Н
Е о Врілий СрЗе 0 ОНМОКМКЕОБООВІ КОРЕКБЕМЕОЛОУЖУСТРВОВМЕЕ : о Врілий СОЗЕ ОВ ; СУЖУСТРВОяНЕК : 01 - ' шт покори хл, сеча СЗеИ А пУуМдУудттуторіІс Іо, : іаБО ТО МО:20 іепсидоні | АБУ СКАВУСЕМСМЕМОСУМАУ А нео нине рол вах » Н І В етческививКдЕрвотвовАСПрІ Мити ї Н ДИ АК рт гу г п Ір. мим РЕ Я ! І макака-резусєу МІУ ИВКМНЕАКАВРИУТКОВМУАСВОКОМИХ ще
Н Ен Н 4 сжк вексстузрт сит мтвет Я і | УВКР Е РІВКСОВОСІ ОКО : ит т ки я птлитрт т я ска тт тив т | АБТКБРБУКРОАРВБКВТОСОТААЬОСЬМКОТЕРВЕВУТ ' г Я окт щі г Н
Е і пе сис ук ох их театр чат хи кеш Н пре ОУБИМЗСАТТВСУНТЕРАУТОВЕСЬТВЕВУТУ РЕНІ, і тів -Ке З: дж яелотх ех ХУ гумтт теру оче цесу тетові, | ОТОТХІСМУЮВКРЕМТКУ КВУЮРКЕСОКТНТСВВОСВХ ' іі кисло 1 на є, тхмтеур і тт Н
ОМ Л Н РЕДОССРЯУБЬРЕРКРКОТІМІЗВТРЕУТСУУУВУВНЕ
: Н Панов ах У Кк дя яки я Уркраяе Н
Н і калу тріх ут, тро Н Й шчлоютаяї шоу прикмети ци
ОБО І оМої21) АЛ ТІЙ7 0 вРБУКРМУУУЮСУЮУНКАКТКРАЕВОУМЕТУ ВУ ЄВА
ХА КО | 477 зм мецаа нія | - й ди Урок варт рати пт мужерани | УЬНОПНОМОКЕУКСКУЄМКАЬРАРІЕКТІЕКАКСОРВЕ
Е ва смстемосмю о ості тнвитихо что тосТукоиецо дики
Е |! РОМ аю КМУ : : БИ сх тож аа НН : РОН М пІУКТТРРУТОВООСКЕТИ, ВЕ пЕосВиООМ ОЇ і | ве; | МОсоеЕММУ КТТРРУПОВОБЗЕБКУ КОТУ пКВКи СА ІЗНУ ! : : се кохакиїе тд І тачсепкую т єр тут А : ОМЕБСЕУМНЕАЛЬНМНУТОКВЬЕВЕРОЮЇ 000000 пиши крути Я ри нуту МЕВКВУ : терАРЕЧКОТИОСТАІ СУКИ дв З скін ух ту д ра У БІС пишучи, : тя «ТКОРЕЧЕАриВВ зЕВБСПІу ВІ ВВУучТУВВВ : т ких Уго КЕ меш пн і Мои м ЗОАТЗОУМТЕРдУ емо м ЕКЕДСОКТНТОВРОВА ! ооо нпевовннни Н реко ее Й грн їх пе пт Н М шу амери ЕМО й гмовгеІХ; Я : ! кап . пог ІСМУМНКВОМТІКУрКК Втечу і
Н ' м ий тихе пери я ти, й і
Н Б ородихя іт енка 7 кр нок т. пт Ми вати і вабив ву ек ето ЗвБУЖБКВРКРКЮТЬМІКЕ тУМатуВУхУВУЄт : 7 пасти ВЕС БУ т ТЕР ЕКОУМА Ту 7 Н
Н І заманикислаожи ВЕГО БУ Кі, й МАКЕТ ВЕБОХ щи шт! : рома т 2 зт гм реву ЕЕ г потр тк ї ЗкАКсСЮ вм і і Е ки 118и- пре ща й хкЕдпіВвАвІАТІВКА дерти ! | залишки 1 1 і СРЕУКУМІ ехо УВА вка ПІДОКИВ І ! туї пе . їн у ТУ мок Мк Й ЕСЕ ВОрІАСКИ і ! з ерацйій - УМ ОоК реч тт ПЕ ВарІ їх
ОБО 10 МО:28 | 347; мумерай: УшвОряві БЕМТКМОУВЬТСЬУКО ПКВВОСОМ о.
ОО МО аг му Й тет пішки г ХБДОТУЮКЕВИОЮСМ ря д пшинУРМИОЮ важке Щ ПпОашЕКУ ВТК : за сист ЧСОРЕМЧУКТТЕРУТОВОСЕ КЕ Ко рі МКУ, т пт лох спині ! ЕВ) носок ИКЕТЕЕ утОоксіВЬВРОК ДИТ ЕвЕВИ ни нет НИПНЄолтлюенКих !
І мив пттеттттттттятттт сш А АБО АЛЬ стат : і | нн ВЕТО СТА деровещит, і і ! сот дл ра ЗО ОІВ, :
Й Н пл родео УК ІдраЕ пояс Ед авУуТУве ! і фен АВТКОР ТЗБУНТЕРДУТОВВСЬХ ВІ, ктТИиТСВоСВА
Н пт х ЗЗСдЕТВОУЇ М пл ее З Увра Ве : рн | тТацітії)- Удав у ТКУркнУКЕКАСОКТИТС вин : і пода Ух Щи а Ка яку сут пІнКраМтКУу ЖАГУ ДВТВЕЧТСуМИАН ОН, ;
Н ху А шт і - СУТ СМУМНЕ чІдВЖВЕЦТОо їх і
Н КЕН ВАВ, ОТО тУсМ криптіІміІВЕтОо атм ' | ОПЕОКОА фара ТБУКЬЕРРКРКОТІМІВВУ ЗУМЗТУКУО ВТ
Н бич з мете г УКТКРВЕКОУМатТУ В; М ! І ОЕБАТ) ТЕЕЕеОЕ5 СУВУНМНАКТКРАВКО акдкпОовви ! Н х зтні вЕЧКЕУК у ВОоУ у ши ТРАРТЕКТ ІЗКАКОСОО я Ї : | (амінекислотні ОРЕУКИМЧУ КЕУКСКУЗМКАСРАРІЕКТ: ЗПІАЧЕНЕА і вар 13118- МнорхмівокКвБУуКкскУ шІТСІУКОСЕУВВрІАУКИЕ, г яко ІВ МО: «З | залишки 1718 УБЕОорМЬк ЗЕБЕМТКМОУВІТСТУКОЕЯ ЗОМ рлшм А роя, зпід! ет вам : кт ТК тУПКе КУ М і і ке чпумера під вот вЕ й СЕКвоУК У Ї і з4!; нумаер КИМ ІТ па гоВЕт Я і мами» ну оЕуМуУКтТтТвЕуО о М ! ща шистеМмлю МООРЕБММУКІ ІНУТОКБІЧЬОРОшК тт ' вини й тече НЕА для дує п тет тА ЕК :
ЦІ УКБОЗУМНЕАІ ТЕТ я АОСЬУКОЕ дя і у пиши Ко АРВВКБТВОСТАВЬС ЗУУтТУваа ! ши АБТКОРЕУЕРГАВВЕ това ВУМ У : і ни ак цтеиду їум ки ЇХ. птервосодо! ! пт Що ск вс, дх прРЕБСОИТНТСрЕСод Я рення тЧасітії)- 1 ЗЯМЗОоАВО тими РЕБСВИТН щ сацео
Н Н мА у Тс . є гКмМих і зувати : тЕтА-КИ рок ТОТТІСМУМНКРОМІКУ ІМІВЕТРЕУТСУУУАУВНЕ Я ! БЕБЕЙА-Кка й есваван БГЕЕРКЕКОТОМІЗВТЕ пусто і да а вчу кРРЕВКОТ ОМ ТУКУуУуВУ і
Н тА кЕБОСеБУКІ КЕ АХТКРЕЕКОХМВ м і зп БАК) РЕЕЖВ /ЛУВМАКТКРЕЕКО кінних зжислотні УКЕНКУУрОУКУВКАКТКРНЕВО КТІДКАКООРЕЕ
Н у руку Же й т уттх и Па А 7 ав с У А и т т7- ща Н ! ізмівокислоті РРЕУКЕ ЧСЕЕУКСКУВМКЕАТРАТ ТЕ чию пІВмВяЕхО
Н і наанння Е од ме гумЕт я КЕ РК тт ця кОм, Н : чайне яишщки 118 Не Віче МБТІ УК точ :
ОБЕО ІВ МО:24 зальники 11 тв БНО ЗЕКЕМТКМОМЗТСУЮ БТУОКОВИООИМ роздля я й ; тчт тури кА спо хе УЖ : р 147: нумсрація ОБОУЖТБвРвОЗЕК парову ВУ х : ! аа; нумех роб МТВ УВуКВе - :
М Н гор АН Е лі. т і і писжаМмОоюх о: МООРЕММУКУТЕ катар тт ї ва пит: ня АТАК Не ТОК Піннттттт ес : і 7 кі І дк ПпПаУМНКАБИМНУТ слини м пет ЕМТТАММКУВ :
Я Ко РУКИ рт «ОСААВСЕТЕМТТА зву
М Еней МОавКОоБОКБСА ет ВЕТІЕКОВ ОО:
Ї | рентний КУКЬЬЕВОСОООМОЕ МітдтУУдпауУкоВЕгт І ще і Н т КЕ Н репу Н М пів ! пер шах ОКОБЕИУАВІВБКУММХАТУ й СМРОМОХУУВИКАХ рення і одер А ПТМ НУМО М АЛЕ г Н , 3 мишача | САВОКСЬК ММК ТАМУ СУ пок ВО. Е : і Вихідна миша дОБІЖСОММИМЬК ЕТ» -жо ши : а з, вити М сту ошКВр ІВ МО:25 ун яв воой ОТУТ МВд рес вч Та АМИУ :
КБ 11 М пОоОпТтьУтиЗ ст тс вУЕТаАМ МЕ. МИ.
ШИ еАТКОНКЯА ТЕО жона ЕЗСВТСОКААТТ
Я нини аАУУТОКААВТЕВ пд пурдВвЕВЗИВ ТО і : Н нт 1У й ще у ска М - ще ї : ст я«шача | ши КБЕТСПІОСТМИККАГ я ТУБССНТКТИ 2224 ши о Вихідна мишаче | ОБКРОНЕХ т "КОД дм Уук у я :
Н - 1 шк х шт и ГАМ їм птн поту м ЕХ :
Н ох | ту ІТСАОТЕПКДІУ ХАІ ТЕ даапЕТЕнОоУдМ !
ЗЕ ТО МО : 2 Є | МЕ, З 23 4 пІсаМтпррАтТЕе ЕТ ЕЕ Ав я БЕ ТК тсрвгУулдлм о і раю ах Н пет ОБІУСТ УКОСИ ре даже ЗУуКкаВЕТІВГАК Я і нення КИМ БНО замастТІспУАпВУКИВ 7 :
С. нина г це З ЕМУТІ ВМТ кптОоУсиУУУсМо : р- оАВОоКаБЕРК. ОСТАБТЕУСАКОТОС У і 7 пе й тот ІМ5І ЕКО АПЕХСАКЬ І
Н РОсБ2О - 708 1 Томи тя шаг чупоспоо | нВуУБОМКВьЬКА вн ідре тп Мер? С : сити сили дити Ам ІМ у КОМУ є ЗСУ чих лі шк шт ду ЗЕ Ж х Н
Ото | | Уясоют Ето тт ЕВАТІБСВАВОБУЄВТТЬАНТОЄ ' | СТ ЕДллОВеАТЬЯБЯРСКВ, ІРАКЕсПВОлОТОЕТІГІВ : ! фен БА цеЮз ІУВАЗМЕАТОЇРАКЕЗОпВИ й : ' пттяяяяняннннниттяя Н петзтяч ст й ЇкКа сеодют теор ї нини | 7ОВ КРООДЕВІЬІХ ОА пиві КСеКУгВЕї шин : ія ецодй 708 0 КРБО ж АУуСОоООКВМИВІТУ пинет ПЕХРОДУ
Я промов Ух Ср БОБЕЕОКАМУ ни КАТЕТ КХВОоА :
Ек отр Мосс ! Іква лу: ЕрРЕсЕ ЕГСАККАТІ, бтовтинт рам серии пИитрКвис Ка. сх пмкУвдДдОаСУ ГЕТЕ :
ШИ | зтантний | СОРКААРЯУТЬКрР тТТрЗКОодММКУдАаЯЖЬВІЯ : ! мол шинньнии Анни мохут тя СИЧ й : пен ша констаитНий р «дО УКАУВтТев ж вето : : ШИ Я шо Н 7 : ТИ КЕ : рен т і донотан ОТУАИКА ОА ВУК ЕсатуюктувртЕСя : і Н тисме: Й т іпаУБСсОоутнЕааУКТИ : і Я БОБ КАВУ СОУ ТВ пит
ОБО І МО:79 | пЕдсевкого УТІТОКЕОТОАУТТОМАМНМ рем А -3 готи ' сти т пе ТАМ ШИН, ! хЖ Вила На ' продов отр фл щі ОКУ ГЕС яти ее Я :
Я Н ЗБсеи З 3 Ах чеше ТУТ РАКЕВОВІ ІК ААТ :
Н : о; пен ОАУ ТОБ ММКАРОУРАВЕВОВІ, : іп «7 Щі ЗІ СЗТММКАРО АВ ит Н пн ООКРОЮДККО,Т сетММ; пУтдСОТИТ ТУ, пишно
Й | З3-1ЕМЕ | ООКРОДА ЕСсдьКУсМииУ косо) по енттетнтнн : 5 асп -ТКМН і фтитд ЕІ КСАТУ ення тини ми АМЯХ : ОО МОСІ 30 5Б А НЕ Н їІТтОодоА Іо ня сАредтутІт "вата МЕ
ЕК; МОМОТ 5 Н рон Пітт ростуУутТітоваБт реж ати?О шко ТОМ і сення краАКБУуВрССТУТІТО Аа осВІ СО КАм :
Н Н сети дм тТОкеа ГУД тукчкттт ке : ! і им ОА чу ТОК т ЗГЕККАРОРАНЕК ОЇ Н : пани иа ваш сх ЕХ росте нин . гот : рт | Ї в. К шОКРОЮА ЕвВЦІо5 ух МУ КОоСс КІтУ «І дотичні
Я ї виср3-тАїЕ вед Ще ЗІЖКЕСАТИХаМІ А ЕДЕМ
ОЗКО 10 ОМО:31 Мі. висоЗ ПІТОАОАРОБВІХ САТ ЗМ
ОКА АЮ М і 141 ЖЕ БАЮА чнадякт пттетрудетттнтнттттятттттнятчнтттннтетттннтннння ;
Кен бро оре житті тт : 33 У поспОо - 708 БОЕТЕНОХА баро тр оМО. 39 1 і
Би МО МО с - я Н Н р Й | сові Й жа ан аа а а А а рин у уп ди п і ! ОУН ОсСрЕо - 708 ІВИМОСТІ : бшКО тп МО: 33 | ни : ре де ІРОН ери І 3 | МИ с. шк що . для пнтттяяяннтнтттттннї рен Тита -- Ш : дащотяоко я» МН ОСОВ2О - 708 АКПІОТаМуУууОМОУ
ОВК ОКО МО: 34 рима ! й Й і СОКУ ї п км срго - 706 | ОоБУББУ щу тт меле їі Н Я
Ком и Фа ж ВО ту - :
ОББИ ХВ ОК | сові | в. ї ї Дол лпуцжтююттттттт в вжюті яю юю А лиття ЖЖ кю ж юю -- Н ни ї полях ше шах : ОМ сСІШО - 708 РАБ ! і со І 0
ОН А Пи о ПА т я п т пої ее тий :
Н ром соай - ТПВ сок ОоМявІ :
Ед мч Кк чу , ро
Н З М ТВ МО:35 і сп Н : ї Н тк т винна нн а пн и реннннннннннннятрнннт р п пдтіІп вда пиві вт живими : | ЕдичмЕВсраьУОравВОВІССДАВСЕТЕ МотАМНяУК : ! нт хх - пост о вд гУтурюурЮ виро струк :
Й і од роКосгвааМгіІвиманіІІ АНУ ВЕТО МеК : : с шутаожуч му лтитий ГУ оо жу : башт тА ОМОУ У оса - оку пора пл уки ши рочків
ОКО ТО КОТОМ ОСОХО 7 КеБУТОММЗБЕАЕОТАСТУСАКОТОУБЕУТУСМОНЮ С і | ШН са : ! Ї дптр : : ! БО тУТИВВ ; пен п в В В их типа діти ! | СЕТМТОЗРАТІВЬЗРІЕККАТІБСКАБОВУБВИ САМУ !
Н М ! А в Й ші :
Я КЛОН У пкт т ож сту ж ска мно торехтрдла дети чиотт І рЕЖО 1 МОТИВ М СО - 982 | КРОСАРАТОТУрАМАТаТРАКЕВОВОяО ТЕГІВ
Н птнАагУую в ГИ перт Ре тв т :
ЗБЕРЕПЕАУХУСОСВаМИРІТЕСОСТВЬБІК 7! і сі дечютт тт труни ПОПОВ ЛВ В нев НН и дл ПЕРЕД вод і фетр : де тя і
Чи СПО - Ка бОКТЕМОоХА :
З одлтзих ту мое» За | 7 Щи :
БО Тр МО: 59 ет :
Н сокі ро спиш сш ще етичної оп сту не Ну ИН і : ОУВОоСБВиО є ке ІМС Й
ЕЕ тт МОЗ. " І : рий ММ Мі сор : : ' ких | ПОП
ІЕЕ ТРК тттж тюжтШтжШжШжШЙжЮШйжЙжтШжтжтЮШЄжШтюжтжтжтжШюШЄфтТОТТЛТ ТП ОТ ТК Ктттттттттт тт о о оп о по од о ви кв приправ р кни нини : т ' прин ост - и пика : : сш осла - ик» і АКоТОохОоМххОМОМ : що ІБоМОаВЯА й й ! і мні и чия з і ЕІ НІ І і
Мілн о по нн нн : нн точна та еко Я
Н -- МИ КОП - ах ОБУ !
СдБО ЗІ МО: пт Н ! р слокі Н ШО ШЕ фунти пен ни ен шо Ше нн в нон пон : 3 І їла те у ся Я : Мі, ша - ак | БАЗ ! і сере ! :
Н мг і питні понлтт тут пон а, пе пт о пе п реф
Т дзлую кв ту ки г срио ЕВ БОоОВаМиРІТ Я бмЕпт ОТ ок. й :
ЕКО ЛІ МО: 30: егЕЗ ! ! І ану Е Шо пишу п ши днини ет нн тт ге тут шепіт АмАМАМІОС і | БУЮІ; УСБУ НЕ ОоБЦКІВОТООЕТВОУНАМНВУК Я : х. затор уми іугАТу ТЕ цпепстейту ум иряк: ої і Я ОАРОКОБЕМУВТІТСКТООУТУХАПВУКОСВЕТІВНКОМУКМ ОЇ
ОВЕО ЇВ ОМО:40 УНН СО2О - ЗІ1ВВ ХО сі вики птоопвитнн пн плани ЗБУТОММБІВАБИМАУТУСАВОУУОАОЗЕХрСУЄМОМ С ! кос гТтУ : пло пп оо вот Мо по о во о пн ор ввва упо нт ст рт паст пис КН ти і ОЕТУМСТОЗРАТІЬВББРОКНАТІВСКАВОВУВВУАМОЮ : і В; : ! Н ме тут им стр мури в ки ск сх : ар птпошегенал гро єте їв крпедорріттуУпАскМВдтотодпкопасвстиЕтІ твої
ВЕ ІБ ОМО:41ї У со - 1185 | КРЕООАРВІТУБАЗМВАТОТВАВЕССООВСТОКТЬТІ В ! : Н де соки пи ик а иНюв хан АК ВІКА АМКУ Я ! Ї ІП шОЕРЕБОКБАУТУСООВКО 1 Рі го ТКУ БІ Ко фу тд норов пити пи
Е У спе - 1189 СЕТРГЕУКА ! бшфЕОТ їІпОМО:49 " - ; опи и ють яхти і : ' Н Ка, і ПН:
Кт я ут ре ут : іт р х: я ! чн сшпвло - 115 я і ВТбтТсУуХ :
ГБО РО ОА секта ту ! : ! І ні АДКех | и аа аа аа а аа а опа ПИ о пана ання і
Я лу т в ти МТМ :
УК осСпоб - 1188 АКрУУБАСВЕУОСБУОМрУ : рошгу г Мібує й я 7 ' :
ОБЕО ТО МО:45 1 ета | : : Н Олек ШИ п пн пере че ос тИщ а ! гул м :
Гоєечих т зму, йо! М Мем 1ї1в8 рес ті Я
БО КО МОЯ сові | :
Н ние : 7 пт тугх 4 7 т мя : ут спо - 1188 ПАБ : соВ2 | :
ПА тво др :
Ї ших я ну Емі, Спо - 1188 і ОО Н бок І От 45 рин : ! СЛ : філджктттттяякютттяя кн тя - ще птжнпентттюитнннтяя ник лини па В Пи и у У
НН А ик р ув дує А МО п сенкан ! І і АУСЬУВ ее мо) во ООМсААВОВІНОсПе ЯН : і ! Я ! ! нн тк зимою тод тіт т тім 0 і іно пт | ЗАВОКСБЕМУВСІВИМООБВІСТАОВБУКОВЕТІЗКОМАК ОС
ЕЕ 10 МО147 1 УК СОО З ря т ку чецій вітали ни
ПИ ще у | ОМЕСХБОоММЕСААКОТАТУ КПВВ ГО і і :
І Н Тоня гніт е Н
І і оостьитУвЕ і Н почавши ни ана а оц нн п нн и о в ЕЕ нт нЕнинмннлнлнлжлїтл нини шими ' Гах т купу тет т тат ти піст ДО хриитуття ї
Н і С ЕТУБТОБРАТІВТЯРОВВАТЬОСВАОВУВОХ АН ОЮ : іх туз жо чули хво Оопе чик т : ! Я А є ОКЕООЗРКОКІХСВАВМКАТОаТвАВЕОВЗОСТОЕТІТІ В С: пт т ду ав чт пла - Зг й у бБЕО тб ЩО: 48 м си Со я та туру Ук зготат ее ТИ те : ру Бр но монМмашу ВБЕРЕСКГАУХХСООАеМИРЕТЕСОЗТКУВІК ; : й - у сргай - 206 | СЕКТОР ! шко ТО ща: нище ; :
Н 7 І Ск ші пплтй
Ер АНА повткр т :
НИ ша ЗА МИ СІЮ - 2сб6 ІБИМОІЦОВві :
ЕКО ТО МО вищ : ож Ту ЗІ тт : і і бихе 20202024
ПІВ Полонка ни ПАЦОКНН НН ОО КО
І бшносопвО - Се о тТкКроМОоХоВБоВТисЬОсМ і
Роже чо зу ше | хх - и пи КЕ Ач на Н ра ТО МО: ві т і
Н й | КО | ї нн пе енент нт Ж яння тя т няття тт КАНТ КУ ую ниття
Н Зк : КУ чуття : ішов ся М СаО - сб | ОБУББУ :
ОБО Ж МОЇ ЗЕ сети і : ! сі п: ди ря :
Я мі. пП2О - 2026 3 рА5 : : І : подо : фетр т деяка МБ ОСОВО - Все |ООВБМИРЕТ
ОО 1 МО о, евал Я
Я і Со і
КК тт ттттттжтютжтюжйЩЙЙЩЙЛЩ Щ ут тткттКтттттттттттжттттктттттттттжткттттттттттттютттттттт т оо пн поповнив нн она їх і ту ях жести КІТ і
Ї дтоктоми ки МО висОЗ-срва | ЛОЖУБКНЯУ ;
І ше м М б:За татн рент пот тт тр тр т пт тенти тт
Р шко кт МО: 58 васьв-т3/а МИ ЗОттТЕВБУЄ
Коди ОК. Е зи ВО от ря Н Н рю Й сові і й Й нн
Креді ий чи травою Оого ШИ Н
Гашк т кас ве пиасів-тайЯ МН о ртоцувБиХї : і аку т ех г І і рим В ОоМО: ло учета і і
Н Н шк Н - - :
Готово тво вини МИЛИ Др р НИ дрова о ВввИ Поні во ооо рфорі вивів пу и и и
ЕК дет тщоітя кі вписьв-т3/4 МН о АКВВЕБУСВВРОУ :
ОБО ТО МО: сттхтя : : ОКО Щ : нини плин а а у шо и и У шо !
І дих стух що: то пи я У Її пБУТУ ! раю АЖ МОУ СЕ ря Н і | СІК ! і іопобЬв-тЗа У рт : : : І : сна | !
Ко онннннннтнннттннннтттттттн вітре Донттттнтнттт етери
Н ; фра тодаотр З й 4 хх а аа Ге "и :
І дю том. ща 0 ІМ ВЕЕ З/ я МІ. го Ех :
БЕ 105 МО пев і
Н МАЛОЇ ї нан нин нон ооо ни в вон по нн нн сплав повна поп пово и нин нн пап нина пив но о ово пи нан ня
І - як І сОоРВЕВОУУТЬРРЕВОКІ ЕМО ТСЬУКОСКУРЕОІВ Е
Н ! сОбпастть Н Н
Ї дру се ши чопатить і те ет и ел тих г поч Ехт кут ту се
ВО ТО КО: теабіютв іо СиЗ ПУТИКОМСОЕММУКТТРВУСОБІВЕКИ ОКО
Н | Дощі С рок ткиктвт т ххх що пет ою му тя Н і | й ОСОБИ МЕВСЗУМНЕАТНМНУ ТОК Н ренти ту ди попити : : дж СбОБКБРОУРТЬРЕБКЕЕМІКМОМВІТССУКОКУВЕА ї ! Область ! і їли чок жк тя -йникі я сут кт хі МІ тисит раху Ху БулеІиЗО КомУЄ ХК ОЖК піку :
ОББО РО МО:61 | табітів!: СНЗ СУМНЕ МООРЕММНУКТТВУСОБ ВЕГО. : ща ТІ 12 зими Кук пт я т де мІпи ок (Си Н і ши щшОососМУкВсБУМНЕАСНМВУ ОКО, ОоК :
КОД НН НН АН НААН А НН А НН АН о А А «АД сосні ін нні А ол А Ан Ана Чон АН в ОО АНА А НИ АН
Н Ух т У тет ма тих хутро Н і -к ооо ТЬиРЕКОБІОТКМОМБЕТССУККЕЕВІТА : й | подасть і . ле це - сдвсттуя бнетічунино
Той чт ще - й Кіш ко Кох с Пе же же мтчиптпхуу гизги тм пакежаочни :
ОВЕО ТВ МОЮ 1 суЗ ІУМБИВБМООРЕММУКТІТеВУГОВОСВРЕЕКОТУКЕК ' С охопьвпідх) СН і утвір віттуля в рікітіогноу т вт сити : й З ! тт рик и МЕТІ Ти Кк Кіт ри р ит дух : і " ксосознвисвУМИЕОСЬНЯНУТОКОМЕООКСК :
дядя шити
У ТНК мм : прфараа анму - ГУгАд хх Ук Н бтебі 000 |АЗТКОРВУКРЕАРЕЗКЕТВОСТААБОСЬМКІ пені й рт те 1 АВТКОЕ ваш й тел щем т жа : пляяяяяня тля нал нлнунняття Н сої пудра и Біо у Я : о Уа та. УНТКРАМГОВЕ партері о і їт СУБ ВОВАЬКВаМ В . чЕБИВСПИиИТАТСвЕгоА :
Н ностантна Ше жкупкпУквивсвиті :
Н шОНІБрваБИте Н "мукнквЕктЕупиникри пи
М Е СТОТХТСМУМНКРОМТК зве теоММчнточНи Сі
Н пас роя ех сту кКквоКрирттмі ЗВ ом я : ! Є Н правам КвоКрКПТМІ й педаго в! ее а и Я "РАЕЕОУМТУВУУВУТТ і ' ажкаг роя щит ТКА ТУ :
ТТ | ОРБУКЕМИЖУУРОУБУНМНАКТКРАКВО свинини
І га - МТ Б ОРЕУКЕМАЖУЄ Чем вити КЛАС : ! т ко, | паницюга МТ Н пи Окис ик пеки що нини СІК їі У БОГ навік ПУ АК х Й оз р, івокислертні. 4 ї. Що «МОУ СТА КцкУрарТ
Н б івМміІінОКисИг туру кує тА, МеМУ БЕК МИ ОТ
Н коамауни ситі вечкЕЕМТ ден рлштеним : і тк зу жовЕВКЕВМТІ т такт Рукав
Н ' пежн ВОМ ак сл ус чі її УКАЗ Е і Й люки Біо тут арені вКЕту ї
Е о озалишки 18 пек тТтРеУгОоВИсаККуУВК ! : ' й хЗ її чав МмІВЬ ЕЕ ще тури ! і с а47; нума рашія МСсо Й хнинУтТОокКерерарОоК вин : рай яку я УКЕСВУОУМНЕАТИМ НУ пт ОУЕН
Я і -в системою 03) хх под хе ААВООМЕОТЕВ : ! за СЕНТ даткОоРЯмЕРІДоаВКАТВО ееуттувадЕЬ : рт За жеАЖЕ и Ю тпедаст, ке вау ува, : резнннтннттнтнннннянннтттннннтя гот тку ТВ : й 1. | УБИМЕСАБТОСУНТЕРАУЬОВЗСЇ коспЕТИТеВВорК
Н вк й УБАМОА кичЕвЕссритТиТтеВвВосоА : комотантна 0 ЗМО АНІх НЕРЯМТКУРКВУКРКВСЕ своих! ! АЖ ані СТРУ ТСН їх з гуУмМтКВим оо.
Н ах | ге ГО ХА ни Ма гі чути х ЗЕВС УМІВ Н і й кож є КЕ кл У 1 ї Н і | бл ст І дк из засне квкотІМмІаВ те дих воля ПО РЕДЬОСеБУКСКРЕ кткКЕвККОохМа КУМ ВУТ Н і сут тку НИ ЕМКУУОСУВУНМАКТКЕВЕВОУМО ТІ Й тм! ввяжого | ОРБУКЕМНУУРСУКУНКА САТРАРІШКТТОКАКООВВК ! | ЕЛ р КЕХКСКУИМКАТВАВІККТТ ОКА Ма : і | панцюннх т НОЖІ МОКЕХКСЕМОМКА СТУКсРУрЕВІАУКИКИ і ща Под яе рокта у в ІБІТСБУКИКурОЮТАУКИЕ :
ОБЕО І0 МО: Ба | К4О5І, ОвОФУТЬРРЕВЕЕМТКМОУВІТСТУК кермо
ОМ Н ш І! гом а у УвЕМа ли: зранку :
Н . зиск твер І : : | самінокислотні : шОовЕММСТТВеИ ТУГУ не : і росамів сКООгЕММ КИ сстпі арх :
Н Н чих 18- р педінМнУТОоКВІ да вОоК Я ! і вЗалишки 118 ОМЕВБСЗУМНЕДТНМВУТО КВ : : ролях с Бош МН Ем
Я ! - пимерація ії 447; омани ; прот
Демо о тони или ЕЕ.
Я за системою Е оз ооквзоозорицім ситий теп ААР ТАК пу г ках х Н
І НІ пив олтдотий ваУукроддевавкитТеНиУА й вин
Н фони АБТЕСЕВУКРОЬАРБО з а аа НИ і пн то лек от ср Хо, х ІК Н пиши : іа М ТЕСТ еВАУрОоВас, БІ ву М: : : Б УБиИМЕОАСТЕОУНТЕВАМО РИБСОКТВТСВВСВВ
Н Е знетвитна УшШИхся КРаМТКУрКВУКРИВСОКТВТСВЕ; очи тет ТСМУМНКРИМТКУОККУЄ метрики і З і ню Кох Ії Що г ше уих МОМ мя Н ! Ї пблаєть оваии БУЕПЕВЕКРКЕОТІМІЗВТВЕМ ТОМУ ВУ м ! ШІ | у ака І их петихм тах тім:
Н кут ОвЕБоОоБреУКТЕ КРЕЕБОУЮВТЖВУСАМУТТ І і важко 1: КЕЕМИУУПИУЄМНМАКТЕВ МВ ОХМВи ОМ
В і БУКВУ ПО ЕУИМА вуттакдЕсирви і пани ООРЕУКЕМИ КСКУЗМКАГРАРІЕКТІВКАКООСРКЕ : с АТ ОУПВОСНІКОКЕУКСКТОМКАСВАЕ с УУрорІдУиЕкО
І я І я Е і ох шо почи ур в УМ
ОББО ІБ МО:65 капак пЕвИх ВЕЕМІКМОУВБТОСУКОКУ РОТА Й ром ГАЮ і шиї врарття Фе НИЙ " синя ро» Н . потні БОМ УтІврвВКМИКХ зр тут УркБникиних Я ізмінокиспотні | РО РРУГОВОСЕЕРІХВВІОТУЮІ !
Н форма нов й Їм ОрРЕММУитТтТРРУТОВИГ сек м !
Н Н тре Т18- МОО ик гетакатстероК !
Е зЗаямшки Л18 і оквевумнеА:НННУ тОокегараво : Е тах ик ек Мп ГІ х :
Н аа в умерацшв р БОС тт : іо Ба Н з ' КИТАЙ пу рих Упої ! г, І -- мой Поу тих у СКУ : ; лепраемою Н тор динапиштииим я по МОХ ЕР : : звн"ао сист кит ву» ААСОС зок увинт - 7 пн по своя ОАБІКСКОУКЕБА ТОБІ умов, :
Я А й МпАТ ТУКА У НА шт аВУ соді т росте КАТ, МЕ Ноя ст як тег тв, Е : Знстанрна | УВИМЗсАЬТУ УОКЕУЄЕРКБСОКТНТСВРОСрА : і кОонсжа ї- Н ТУМНКРЕМТКУОКВУЕЕКВг в: ! ! ше і СТОР ІСКуюнНКрЕ ОО веди
Н Н жд з ерх КК трі Ї шу турне дер є дру МВ Е : : зопасть ; ОЕВрРКРКІТ МІТКУ Н
Н ' АКА С | СІЛ. РОМТКЕРРКРвКИТІ МІВ дуету ' | ; ТЕ Мам Е АК Що шкури ї.1 Н
І і важкого ОбЕСОосЕВУ ЗУБУНМАКТКРЕВКОХОВТУВУУ МІ, ! ' ВеЖЕкИ РЕУКЕМАИУУОаУВУКМАКТКРКЕКОХО вені і і жо пеЕУКЕМАУУраМЕ о ЕдРІККЕТІЕКАКОСВИЕ ! паникита що ово свУувниОАВТ КЕТІ ОКАКСЮ ЩО ! ши шк Нв ОН Ма торт і ещуу ж пом: Б ту зт СУ МБО СУА АТ тімттся яти УКИВУ ва ПІдДдеК МЕ рози БІ ЕД їз Й зеетееиВвЕМт кМОУ ФАК МЕ ТЕ дтенимо
І інокислотні РОУУТЬРЕБАЕЕЙ БоБпОоБУКТУВККІУОКЕВЖОС Е
Н бамІнсКМсплОч МООРЕММУКТТврРУЇОЗВПОБКЕТ УВК !
Н нин МОпВЕММУКЕТ я І
Я залишки 118- МовеБ пиМнУтОокетатарих і
Н ! вали , чЕкчсаУМНЕДІНМНУТ Кк сзіашиоУті; і
Н ! е В дір ХО М КАТА ДС ї
Я баЗт7; нумерація | У ПОН, що з Б серии ВІТА вка Я ее Н : ! свв системою БИ У КЕТІ ССТАдЕССЬУКОЖЕВЕ ру ! : 4 ПИТ Птн АБТІКаРОУКЕГАРВЕКЕТВОС ее пути вчвкі рення іс АЗІКСре МИТЕВАОТОцЕСІ ВІ Ему ТУраВК, : і : з УБИМОСАСТЕОИ ЕРИЯСОКТНТСВРОСгА ! сет луумі су СИ І ОВУБРКсСОКТНТСТВІ : ксНОКаТЕна КЕМТКУрКВУЮЕКаСОКТ
Н Й пн ЗУКЖІСМОМНКЕаМТКУКВУКІ ПО:
Н і Й . ОТОЖ ІСМУуМНКЕ В сЗЕтТрЕУТСУтУудУВНЕ І ' | ооласть мих - ЕКРЕВрВТІМІВВТеЕАРО У Кл :
Мами ЕКЕОСРЗУКЬЕРРЕРКОТІМІВ птшттв
Н Н дк ; ми Вісті, Я кВИБЕОУОВТУВУЧТУ їй : і | вЗПЖКкЕОГО І БЕК геУпоУтУуВиВ КТК ЕОоХОВТу УМ ШЕ м ПРЕУКЕМУХУрОУЮУНМАКТКЕ птаство
Н гррдтідо г рН; ІКАІРАКІВКТТВЕА хек.
Н І паніку шк У МОУ КСКУВМКА РАКІВ КАХ НН !
Н че Й тв КН ООН лях 7 тутвитрии татів х вм!
СЕБЕ Її МО: БгпврАМОв МІЯ ОМОоК МІКМОУЗІТСТУКСКУРЕОІАУКИКУ
ВИ У Мо : БЕ вВМАМИЕ | ттЕРРЕВЕЕМТКМОУЧТ СТУК м, : і К ЗОУХТОеВЕКЕКМТКМО т тен стиуниМо : гамі восхмютва: ці | РОУХТЬЕ Л.ІЕрСОБЕБУВКТУКОВИОЮСМ : свмінскисла й 1 МООРЕММУКТТВрРИПООСЯКЕБУНКІТ : : ик о ЗАМ ЕК з 7 знроннух ; : ' заприики 1 4 5 ж в пУутрушот сто ле : оозанншк їя | УЕБСЯУМНЕАТНМВУТОКИГЯО ! Її яд мів жтуді п ко к У НЯ : 447; нумерація х ПИ і ПИЛИ в Й Щ ши зва си осМмОюЮ БУ; ши
Го «ЛІ
ПІК урварвь пиши ХЕ не на : рака стА АРОСІКрЕ дал. її
ДКС РЕАрОВК ВОСТІ ХВІЗЕУУТУВОЯВЬ тяжко РОУКРГАрІ зисОоввБОсВУшЗБуМУту зоре пет пло жлОк СОУ ВТЕРАМІ ОВО кБСРЕТНТСРРОСВА т т1асі Е УВЖМСАВБОЕМНВ СІК КукекВОК НТ туру пт дгі тов КОМИ ЧчКРЕМТАМІЖКУ ИрОСУУУУВиВ і і коностантвна ' ТОТХІСМУМНКЕЗМК іМмІчВЕТеВИУГСУУУТЕ що!
Н Н о Бехсвоя і е СТУС етпре ту вішак: парти :
Н | , КАТА Ук свРКвКкіУгтІМ - тиви :
Н кпасть Н юМРЕМЕТЕРЕ шко ОВТ У :
Н МАТ З ЗЕ, Кщ ІТТ: іт лья ї- Н і | оса всі веОУЕ МЕУНМАКТКРВЕКОТО: кдЕСОВаВ і:
Н з їх г М кто ЗМ Н ! ! ЕЕ О вЕЗЧКЕМАУ УВУ РАБІВ КТІВКАК Я І Н : І пшЖжк СЕУ КЕМИАГХ "КУ МКАТЕАРІЕК тю у ! я зи Й х ху тяжких ЗО АК. ; і вницюКЕ т ПКТ МОКЕЖКСКУ МК сиКОКурБОТАЧЕИ !
Н і панцике Маг КК паб тТСіЦУкоКуре ЗеНІо
І Я щі ї17о7О мілаю оЕМТКМоМВ ст, ЗАПИ
Н й 2 сап5І, МІ297о "ПОРРаВЕЕМТКМО пучки О е се Ап, МІ житі орванЕЕ НН ай Е сВЕЄ ІБ МО: ЄВ Я кап І РОСХТЬРВБЕ розпалі, і ршЕ 4 Н що ке тн ж М кір тую АСВ ФО : ги і івзишодОать | вижив У их, : і р обаміано Колот | МОоОРЕМНУКТТЕ ІНжТОКЕІІ ВОК :
Н І шкМм 118- | Ва МаЕВЬБАМНУТОКЕ місні і Гоа алишки 4. ОКУ МНЕАТИ пинат : То суч М Ком опору уко вувч вк : : | 4А7е нумевація | сени ВІСК КВК У Й ! : За; ме ' полу до ЗЕ АК ВЕЧчА : ї стемою ЖИ) і сети трІдрашКВинУ діт ТУВин, : : пистаею пити пд КЕ зт Ус. ї Що ! ща ЄмОотЕМОю ОАЕ БУ Є - ІтЕрРАУтОовВОоУВМОЗ цтерягЕд
Н й тт ти А при тВОУВ. ТУБАХ, А и Ми ! : ження Яка АКА ВО ЖИ; Фет финнннтння і їй іа УМЕЙМЕЗА КРАМТКМОоКАуУЮеК ОА ОШ
І ті т суч ктї БМ з й БуттумутянЕ : 1 Н канстзвита Те МОУМНее тела тВвЕУуття щі ї ана СтТОоТУТОсМУу х трат; кох і сте ЗА СЕРЕ КРКТТІ БТУВУУВУт і | стапацть ятт ЗОРОУКЕГДЕРЕКе квЕБОЖО5 ТТЕУУСх хі і Н ох ІЗ ИЯНАНЕСее сЧУувУуннаитквЕ шин ІЗКАКСОВЕК ї | хату тих й СУ ЗЕЧАЖКУ доче ВКА ХМК Іл ня х
Н | важкого НАВИ МУ гм ния Кт ГКУ. ї
Н ЕРЖ рум ку КН АБРАРІЕКТІ чек
Н ПЕШТлУ "пІМІМН ЗУ пОМКАТЕА ва лІттІр Н : | ога - мя МОКЕЖЕСКУЄВКАВ ВІ ЖОБУРБОІАУЕНЕВ : ланцюга о уБНООВІМОКЕУ ВО ТОСТУКОЕХРЕ В вічні й док ВТ ран ЗВЕЕМІКМОУВОТСЇ. ВОТУСКВЕМОСИМ
Я З 10 БО: аз капа ом) а ! вом МІКМ ій ЕЕ ЖЕВИТУСКОЕ ее :
ЗЕ ТЗ ОК КИ отні РОМУТЬЕ СТВРУГОЗОСЕККЕВ.
Не й інаокИиосплОотні і АКТ топлиіь : : (бзманокКи Й | МООРЕММеКТ каві ВеОоК :
Я ше ШИ 1 В нк ее сіє НЕ Н т ока деккіли 202.1
Н Н валик Мм 54 - СКЕУМНКАТ, Мене пет : : Н палиць д щи кас жені дк пут Н
Н - вумензація шва лу т ПУКПУКрКРУХ :
Я 447; нумерац пити АОС ВИОХ пев
Е НЕ що --к ЗКЕТЕС ГТ ААЇ, хви, ! й ск БЦ ру ту о крвнує КВТЕяО тами, і ! прлувемска в па омим сення БОКІВ о І БАКИ Н ва скстемою ви) деЕТКОРЕБАТЕ прЕшдстедет уві зріз кх
Я Інн в якдожот ВКУЖНТ ВЕУ Би касету тиви : птттттттттнятть - тн -х ан вадах пип;сект; мА Ах ет ї
Коня тет канстантна оссвтасвтте кваМтКУпКВиКРКаС за НН,
Н ріщсі кан мучив МІКУоя ТрРЕМТОТУЧАННЕ Н
Н ря аж ТО ТСсМУМАк ва си и м ах - я і Ї ехвуленим, важко ТОгХІСс трривиггІмті чут
Й ООбирпон виною | и У пловЕУук рек виТих ПжОВтТирУУЕНти :
Е ОО зга - КЕЯОБЬ РЕКЕСбРЕУЄТЕЕ 7иМАКТКВВЕКОоКОВТ пек і дини КЕ БА - КАК «дис : і зник а зва Я пОУКЕМИУМ рОМЕУкМАК АБРАЖІВЕКТІЯКАКССИТ :
Н й ТІ лам Го орні ОК ОЕЯ УКХ чохли КОЗА З тал ї СЕСЕОАНа І МеКЕТКСКУСНКАСРЯ УКСЕУРБОЇТАУЕНЕВ : ! з Кг а мів свОо гі. МьнОорнСнеКі КМОУБОТСЬУКСЕТХЕ ВОМ : т КО СО водо гу» чих ш «х ЕФ Н
КО тв ОМО; рама ненв 18 УЖТЬЕвЕВЕВЕМТКМОУ В чеку Я ромен тити кл ВО ІЕЕ кКОЗА ЛА а орав роли й Н
Я залишки 118- РОМУТЬЕ КТТРРУБОВОЗВЕЬСУВК що : У рація и ОРЕБВКТКЕТТРРУ ЦІ пес дір тили ! 347; нумерайв, Ї КОоОоРЕХ НЕАТНМНУТОКО ЕПС нттт ПУЕРЕВУТ і р І ТЕ УМНЕА ТТН : рісротврчерсраия АТАКУ Ш :
Н ! Ре БлЛа) | УчЕБЛОУУМИ пи с гАдій, талія і х НН Спр жах, рідрищке гас; ще ЕФ їх ї
Е жа сять трудо Арки На А и их !
Н Н пет дари Та поле о сао у вт У Що ї ! Мнннннннннннннннння АщКаром й УТРАТ ОВНСМУВВ й ТтТНтТевесвА
Н пиття р ! под 7 пом вкКагІштнтсеть : і петля тях Н сстантна шеМаоАІаОУНтТЕ чІКЖиУвБикКастті дяка ричних їа21 кЕ онстан яма пІнкКраМтТКУпкан БУТСУМУАМЯН І ! ЕІ кое СТУ тосМУукнЕриМт міт ввутиуу шо Н ! Н ващжх Бе ЧСС Й Я АК ; вер і | ЗзаплпЕсть важко зв кевеве сОуКоЕрРЕВОКОТІТМІВ ОТИТ
Н ик уки «ДО Кк - сно КК аа мі жнохчни кввБЕКОжОВБ Ех : ; - Ка ВЕК КОоОвх ПМАКТКВВЕКОХ люду Її : І дя пюеЗ К М вЕгЕо срОУуКУнМдКтТХеЕ такое :
Н зала І тт ЧУ У нМАК пок тир я АЛЕ :
Н ох х тет певно о АеЕАВІВКТІКАК Н : ОО БЕРЕПАМОГгО | ОВЕУКЕМАХУ ОКСКУШВКАВРАБІВКТІ: ОІДУКШЕ І ! роб нви тні попе МскЕКСсКУВМЕ СІУКСЕЖРАОІдУКщЩЕВ : : гу оре й іБоихислойнії. МеНОпАНМОКЕ щ КМУ ТсСБУКОВТеВО срізснулих о: бшкО ТО МО: самінсикис їх фе хтЕвВеаеКЕЕМТкМОУ авто сИ :
Бош МЕ: з НЯ тет вЕКЕ ОНИ й Н р займ 18 : рОУ км Е твоя ГО БЕБІ в й :
Е вони дет Н Мч КТТВРУПІИВО пе хх Тих спек ! і147; нУумеранія І МООРЕММУ КІ т нУтТОокВІ І Он : ! дат ну ІВ БА пихнУТКОІ Мона :
Н КТ 7 вІрі ау МиКАГНМН ПОЛИН : ; і чотрамик КИ) ОУкоСауМі інвес -к і і їжа симствемо І спе г, М, 5, й
Н І тити сЕТЕКг ХА, У, В, БЕ, Т, Ко :
Н зд ху пес тож у М, Ж : і ння васпа У СІВ 3 Збирають з У, 5 рентний і мтс пах - БО щої - : фентяння рожа й дае Хі с б, д, С отд В ши Я
Н "зідни за й Щ з г Н у пенні ї : Мо: | варіан в 7, Кк, М, 8, тот !
Н - їх у ї- ї 7 стю - Н
ЕЕ ОТ ОМО: 0 : віцністю 7 ст , її НЯ ! реве Ох ! зв ав СЕТЕЩИч ХВ, 5, М, 5, А, К, У, У і : псЯтутх УА ОКУ гук бирають з 5, М, ЖЕ та сі ' пкт її ї А ! г ІК - 1. Ки ДОННА ї : - -6Т йасОоз ув о ! Ха збиракн й іо, М, Б те ше: фогннннчяя пк д да Ха з Х М м Я, їх, М, Дан Дивак : і і зізіднр за ! й я у Е сли поль ан Н : вро і варьаніт 8, б, жк л. Ж, М ше іє ву МО:735 " вк г Пс ї4 2 їж сви МО Н ту рум і ам х я хя ді ьо які
ОКО З Ії афі то сБщІ СЕТЕМТКХ.В, т. В.В, М. Я 5,
Н пити ет Па осо Я не» . у З :
Н пе фути ет Н | м сіла тут їх Кк є У : і пани ! насип УНоСсОоВ І 5 Ж. остирають з з їх В та Є мент
На : щи су те гі де з т Е т з, ЩІ днк Н : сети ваеювзіант за «7 З, боб оВК щі
Я оса що; й х ю М, , Єв з її,
Код т Мо: Мімністре тп ли то їх ме рому 4 | фі БЛЄЖю ІВЧЕУМУ:ХАТ, . х п, М, ії, , : і до чне у рекикі й ВЕ х г і
Н пи Му чн осо р Й іменно З Б й щи Сорд г ші : пвомннннннснавнн | виш мн Н де Х 5 сФОома лаку р - ж ОТАК тов 1 тя тут ох й я й й, х, пня : ! заізіант зд " - т ЕВ іс я ДИНИ Дані Я
Н щен ві варьант т Б, Ж, БОБ то ішрм ТЗ Ж . іст МК пе ВО | звінністю (М, і пед нин вва то Мові варіант за іде Ху сбмоаюна св М, Б, Ж, й, МН, М, зх, ; юр УН СОКУ УВХеСМЕОКБУУВНЕАХ, : бвкО ОО ОщМО:77 варіавню за да Хе обирають з А, 5, М, М, Кк, ЇМ, 7,
Пр восЮІ УНН ОСоВУ | УВНОоМеХМБУУВИКАХ, :
СОБКО То МОВ варізнт за де Ху. обирають з Б, 0, А, У, НН, 1, М, ! | абБінністю У, Кк, 0, Б, М, М, В, С, 5 Фа т і 5ЕО їв МО:79 варьит ва (де Хе обирають зе А, Т, б, й, М, С, Є, й іоБасСоа Мн осо і УВНаМтоМВуУ ЗА гАХ», :
ОБО ТО МО:80| варіант за де Хо обирають з Н, 5, Е, М, й, т, Щ,
І роншсСва УЬ СОВі ртТоАУТХаВих, Я
ОБЖ Ї0 ОМО:81) варівнт за де Хо обирають з 5, А, б, В, У, Ж, ї,
Я ШОВ М пОВО | АХО мук М, Е сВака то вва, варіант за дв К.; обирають з С, Ж, Ж, Її, Т, М, й, : і Го даті лшноь ОВІМУВКХ МУ,
ОБКО І0 МО:83) Вон оде Кіз обирають з 0, ЖК, 5, 8, б, У, Б, !
Області, які визначають комплементарність імуноглобулінової молекули антигену (СОК), постачені коментарями згідно з дефініціями Міжнародної системи інформації з імуногенетики (ІМСТ).
Здійснення винаходу
Визначення
Термін "людський СОЗ" (або просто "СО3") у даному документі відноситься до білка З кластера диференціювання (тобто за номенклатурою диференціювальних антигенів лейкоцитів людини), який є частиною білкового комплексу Т-клітинного корецептора; цей білок складається із чотирьох поліпептидних ланцюгів (субодиниці), СОЗб і дві СОЗє). СОЗ є не тільки в людини, але й в інших видів живих організмів; таким чином, термін "СОЗ" у даному документі не обмежується застосовністю до людського СЮОЗ, якщо це не суперечить контексту. У ссавців білковий комплекс СОЗ включає субодиницю СОЗу (гама) яка в людини представлена поліпептидним ланцюгом СОЗу ОпіРгоїкВ/5м/із5-Ргої Мо РО9693, у яванського макака - СОЗу
ОпіРтоїкВ/бугіз5-Ргої Мо 095117), субодиницю СОЗб (дельта), яка в людини представлена поліпептидним ланцюгом СОЗб ОпіРгоїкВ/Зм/із5-Ргої Мо РО4234, у яванського макака СОЗб
ОпіРтоїкВ/Бмгіз5-Ргої Мо 095118), дві субодиниці СЮОЗєЄ (епсилон), які в людини представлені поліпептидним ланцюгом СОЗє ОпіРгоїКкВ/Зміз5-Ргої Мо РО7766б, у яванського макака - СОЗє
ОпіРгоїкВ/бугіз5-Ргої Мо 095115; у макака-резусу СОЗєЄ ОпіРгоїКкВ/Зугіз5-Ргої Мо Б7МСВО), і субодиницею СОЗС (дзета) яка в людини представлена поліпептидним ланцюгом СОЗсС
ОпіРгоїкВ/бміз5-Ргої Мо Р20963, у яванського макака - СОЗС ОпіРгоїКкВ/5м/і55-Ргої Мо 0О09ТКО).
Ці ланцюги асоційовані з молекулою Т-клітинного рецептора (ТС) і беруть участь у генерації сигналу активації в Т-лімфоцитах. Разом ТОК і СОЗ становлять комплекс ТОК.
Термін "людський СО20" (або просто "СО20") у даному документі відноситься до людського білка СО20 (ОпіРгоїКкВ/бм/із5-Ргої Мо РІ11836) і включає будь-які його варіанти, ізоформи й гомологи (в інших видів живих організмів) СО20, які природно експресуються в клітинах, у тому числі в пухлинних клітинах, або ж експресуються в клітинах, трансфікованих геном СО20 або відповідною КДНК. Гомологи в інших видів включають СО20 макака-резусу (Масаса тшиїана;
Коо) ОпіРтоїкВ/5мівзв-Ргої Мо НОУХ РІ).
Термін "химерне антитіло" у даному документі відноситься до антитіл, у яких варіабельна область має не людське походження (наприклад, походить із якого-небудь виду гризунів), а константна область має інше видове походження, наприклад походить із людини. Химерні антитіла можуть бути отримані методами генетичної інженерії, названої в цьому випадку антитільною. Термін "антитільна інженерія" використовується як загальний для різних модифікацій антитіл і має на увазі метод, добре відомий фахівцям у даній області техніки.
Зокрема, химерні антитіла можуть бути отримані за допомогою стандартної технології рекомбінантних ДНК, як це описано в роботі Затьгоок еї а!., 1989, МоЇІесшціаг Сіопіпод: А Іабогаггу
Мапиаї, Мем Могк: Соїідй Зргіпд Нагброг І арогаїгу Рге55, СП. 15. Таким чином, химерне антитіло може бути рекомбінантним антитілом, складеним генетичним або ферментативним шляхом.
Одержання химерних антитіл входить у коло компетенції фахівців у даній області техніки, так що химерні антитіла за даним винаходом можуть бути отримані способами, які відрізняються від тих, що описані в даному документі. Химерні антитіла для терапевтичних застосувань розробляються з метою знизити імуногенність потрібних антитіл. Такі химерні антитіла, як правило, містять варіабельні області не людського походження (наприклад, мишачі), специфічні відносно потрібного антигену, і константні домени легких і важких ланцюгів людських антитіл.
Термін "варіабельна область" або "варіабельний домен" стосовно до химерних антитіл відноситься до тієї області, яка містить ділянки СОК і каркасні ділянки легких і важких ланцюгів імуноглобулінової молекули.
Термін "гуманізоване антитіло" у даному документі відноситься до отриманих методами генетичної інженерії антитіл не людського походження, які містять константні домени людського антитіла й варіабельні домени не людського походження, модифіковані таким чином, що їх амінокислотні послідовності мають високий ступінь гомології з людськими варіабельними доменами. Це досягається шляхом приєднання шести ділянок, що визначають комплементарність антигену (СОК), не людського антитіла, які разом становлять сайт зв'язування антигену, до гомологічної каркасної ділянки (ЕК) людського антитіла-акцептора (див. публікацію УМО 92/22653 і Європейський патент Мо 0629240). Для того, щоб повністю відновити спорідненість зв'язування й специфічність вихідного антитіла, може знадобитися заміна деяких амінокислотних залишків у людських каркасних ділянках на відповідні амінокислотні залишки каркасних ділянок вихідного (тобто не людського) антитіла (реверсії).
Щоб ідентифікувати амінокислотні залишки в каркасних ділянках, важливі для єднальної здатності антитіла, допомагає моделювання структури за сгомологією. Таким чином, гуманізоване антитіло може містити не людські амінокислотні послідовності ділянок СОК, переважно людські каркасні ділянки, у яких за необхідності зроблена одна або більше реверсій амінокислот, що відновлюють нелюдську амінокислотну послідовність, і повністю людські
Зо константні ділянки. Щоб одержати гуманізоване антитіло з якими-небудь кращими властивостями, наприклад афінністю й біохімічними властивостями, за необхідності можуть бути зроблені додаткові модифікації амінокислотної послідовності (не обов'язково зворотні мутації).
Термін "людське антитіло" у даному документі відноситься до антитіл, у яких варіабельні й константні області походять із людських послідовностей імуноглобулінів зародкової лінії.
Людські антитіла можуть включати амінокислотні залишки, не кодовані нуклеотидними послідовностями імуноглобулінів зародкової лінії людини (наприклад, у результаті випадкових мутацій або ж сайт-специфічного мутагенезу іп міго або соматичної мутації іп мімо). Однак у даному документі термін "людське антитіло" не включає антитіла, у яких послідовності СОК, які походять із зародкової лінії іншого виду ссавців, наприклад миші, приєднані до людських каркасних послідовностей. Людські моноклональні антитіла за даним винаходом можуть бути отримані за допомогою різних методик, у тому числі звичайної процедури одержання моноклональних антитіл, наприклад стандартної методики гібридизації соматичних клітин за роботою КоПпіег апа Міїсїеїп, Маїшге 256: 495 (1975). Хоча краща процедура гібридизації соматичних клітин, у принципі можна використовувати будь-яку іншу методику одержання моноклональних антитіл, наприклад вірусну або онкогенну трансформацію В-лімфоцитів або фаговий дисплей з використанням бібліотек генів людських антитіл.
Для одержання гібридом, секретуючих людські моноклональні антитіла, придатна така тваринна система, як мишача. Одержання гібридом у мишей - добре відпрацьована процедура.
У даній області техніки відомі протоколи імунізації й методики виділення імунізованих спленоцитів для злиття. Другі клітини для злиття (наприклад, мишачі мієломні клітини) і методики злиття також добре відомі.
Людські моноклональні антитіла можуть бути отримані з використанням трансгенних або трансхромосомних мишей, що несуть замість деяких елементів мишачої імунної системи відповідні елементи людської імунної системи.
Термін "імуноглобулін" у даному документі відноситься до класу структурно споріднених глікопротеїнів, молекула яких складається із двох пар поліпептидних ланцюгів, з'єднаних дисульфідними зв'язками; ланцюги однієї пари ("легкі" ЇЇ) мають порівняно невелику молекулярну масу, а ланцюги іншої пари ("важкі" Н) - більш високу молекулярну масу. бо Структура імуноглобулінів добре охарактеризована (див., наприклад, Рипдатепіа! ІттипоїЇоду
Сп. 7 (Раш, МУ., ей., 2па4 ед. Камеп Рге55, М.М. (1989)). Коротко, кожний важкий ланцюг, як правило, включає варіабельну область (скорочено позначається Мн або МН) і константну область (скорочено позначається Сн або СН). Константна область важкого ланцюга, як правило, містить три домени - Сні, Сн2 і Сн3. Кожний легкий ланцюг, як правило, включає варіабельну область (скорочено позначається Мі або МІ) і константну область (скорочено позначається Сі або СІ). Константна область легкого ланцюга, як правило, містить один домен - Су. В областях Мн і Мі можна далі виділити ділянки дуже високої варіабельності (названі гіперваріабельними ділянками, а також ділянками, що визначають комплементарність антигену, скорочено - СОК, які різняться за амінокислотною послідовністю й/або утворюють структурно виражені петлі), між якими перебувають ділянки з більш консервативними амінокислотними послідовностями, названі каркасними (ЕК). У кожній з областей Мн і Мі є, як правило, три СОК і чотири ЕК, що розташовуються в наступному порядку (рахуючи від М-кінця поліпептидного ланцюга до його С-кінця): ЕК1, СОКІ1, ЕК2, СОК2, ЕКЗ, СОКЗ, ЕКА (див. також Споїпіа апа І е5к
У. Мої. Віої. 196, 901- 917 (1987)). У даному документі ділянки СОК ідентифікуються (якщо не зазначене інше або якщо це не суперечить контексту) згідно із установленнями ІМСТ (Вгоспеї
Х., Мисі Асіа5 Не. 2008;36 :М/ 503-508; І еїтапс МР., Мисієїс Асіаз5 Незеагсі 1999:27:209-212; див. також в Інтернеті пИр/Лимиму. тд. ога/).
Нумерація амінокислотних залишків у константних областях у даному документі наведена за системою Є), якщо не зазначене інше або якщо це не суперечить контексту (Едеїтап еї аї.,
Ргос Май Асай бсі 0 5 А. 1969 Мау; 63(1):78-85; Кабаї еї аЇ., бедиєпсев5 ої Ргоївіпб5 ої
Іттипоіодісаї! Іпієегеві, Ей Еайоп. 1991 МІН Рибіїсайоп Мо. 91-3242).
Термін "антитіло" (АБ) у контексті даного винаходу відноситься до молекул імуноглобулінів, фрагментів молекул імуноглобулінів або їх похідних, які мають здатність специфічно зв'язуватися з антигеном у типових фізіологічних умовах, причому час напівжиття комплексу антиген-антитіло становить значний проміжок часу, наприклад щонайменше близько 30 хвилин, щонайменше близько 45 хвилин, щонайменше близько однієї години, щонайменше близько двох годин, щонайменше близько чотирьох годин, щонайменше близько 8 годин, щонайменше близько 12 годин, щонайменше близько 24 годин або більше, близько 48 годин або більше, близько 3, 4, 5, 6, 7 або більше діб, або будь-який інший функціонально осмислений і визначений проміжок часу (наприклад, час, достатній для того, щоб індукувати, сприяти, підсилити й/або модулювати фізіологічну відповідь, асоційовану зі зв'язуванням антигену й антитіла, і/або час, достатній для того, щоб дане антитіло мобілізувало ефекторну активність).
Варіабельні області важких і легких ланцюгів молекул імуноглобулінів містять єднальний домен, який взаємодіє з антигеном. Константні області антитіл можуть брати участь у зв'язуванні молекули імуноглобуліну із тканинами або факторами організму-хазяїна, включаючи різні клітини імунної системи (наприклад, ефекторні клітини) і компонента системи комплементу, наприклад С14 - перший компонент класичного шляху активації комплементу. Як відзначалося вище, термін "антитіло" у даному документі включає (якщо не зазначене інше або якщо це не суперечить контексту) фрагменти антитіл, що зв'язують антиген, тобто, що зберігають здатність специфічно зв'язуватися з антигеном. Показано, що функція зв'язування антигену може виконуватися як повнорозмірним антитілом, так і його фрагментами. Приклади антиген- єднальних фрагментів антитіл, охоплюваних терміном "антитіло", включають: (ї) фрагмент Рар" або Бар - одновалентний фрагмент, який складається з доменів Мі, Мн, Сі і Сні або одновалентне антитіло, описане в публікації М/О 2007059782 (компанія Септарб); (ії) фрагменти
Каб)» - двовалентні фрагменти, що містять по два фрагменти Раб, з'єднаних дисульфідним містком у шарнірній ділянці; (ії) фрагмент Ба, який складається в основному з доменів Мн і Сн1; (м) фрагмент Ем, який складається в основному з доменів Мі і Мн однієї "гілки" молекули антитіла; (м) фрагмент ЯАБ (Мага еї аїЇ., Маїшге 341, 544- 546 (1989)), який складається в основному з варіабельних областей важких ланцюгів (домена Мн); подібні структури також називали доменними антитілами (Ноїї еї аї!; Тгтепаз ВіоїесппоЇ. 2003 Мом;21(11):484-90); (мі) наноантитіла (типу верблюжих антитіл) (Кемеїз еї аї; Ехреті Оріп Віо! Тег. 2005 дап;5(1):111-24) і (мі) окремо взята ділянка, яка визначає комплементарність (СОК). Крім того, хоча два домени фрагмента Ем-Мі ії Мн - кодуються окремими генами, їх можна з'єднати, використовуючи методу рекомбінації, синтетичним лінкером, що дозволяє одержати єдиний поліпептидний ланцюг, у якому області Мі ії Мн разом утворюють одновалентну молекулу (названу одноланцюговим антитілом або одноланцюговим Ем (5СЕм) (див., наприклад, роботи Віга еї аї!., 5сіепсе 242, 423- 426 (1988) і Нивюоп еї аі. РМАБ ОБА 85, 5879-5883 (1988)). Такі одноланцюгові антитіла охоплюються терміном "антитіло", якщо не зазначене інше або якщо це не суперечить контексту. Хоча такі фрагменти в цілому включаються в поняття "антитіло", усі вони в сукупності 60 й кожний окремо мають особливі ознаки за даним винаходом, проявляючи різні біологічні властивості й виконуючи різні функції. Нижче в даному документі обговорюються в контексті даного винаходу ці й інші корисні фрагменти антитіл, а також біспецифічні варіанти таких фрагментів. Слід також зазначити, що термін "антитіло", якщо не зазначене інше, включає поліклональні антитіла, моноклональні антитіла (тАбБ»5), антитілоподібні поліпептиди, наприклад химерні антитіла й гуманізовані антитіла, і антитільні фрагменти, що зберігають здатність специфічно зв'язуватися з антигеном (антиген-єднальні фрагменти), одержувані будь-яким відомим методом, наприклад шляхом ферментативного розщеплення, пептидного синтезу й методами генетичної інженерії з використанням рекомбінації. Створене антитіло може належати до будь-якого ізотипу.
Термін "біспецифічне антитіло" у контексті даного винаходу відноситься до антитіл, що мають дві різні антиген-єднальні ділянки, обумовлені різними послідовностями.
У даному документі термін "гілка Бар" або просто "гілка" відноситься, якщо це не суперечить контексту, до однієї пари важкий ланцюг-легкий ланцюг і вживається взаємозамінно з виразом "половинна молекула".
У даному документі термін "область Ес" відноситься, якщо це не суперечить контексту, до області молекули антитіла, що містить щонайменше шарнірну ділянку, домен СН? і домен СНЗ.
У даному документі термін "ізотип" відноситься до класу імуноглобулінів (наприклад Ідс1,
ІЧо2, ІдЗ, Ідс4, ІдО, ІдА, ЧЕ або І9М), який кодується генами константної області важкого ланцюга.
Термін "одновалентне антитіло" у контексті даного винаходу означає, що молекула антитіла здатна зв'язувати одну молекулу антигену й не здатна до перехресного "зшивання" антигеном.
Термін "антитіло проти СО20" або "анти-СО20-антитіло" означає антитіла, описані вище, які специфічно зв'язуються з антигеном СО20.
Термін "антитіло проти СО3" або "анти-СОЗ-антитіло" означає антитіла, описані вище, які специфічно зв'язуються з антигеном СОЗ, зокрема людським СОЗє (епсилон).
Термін "антитіло проти СОЗ ії СО20" або "анти-СОЗхоО20-антитіло" означає біспецифічне антитіло, яке містить дві різні антиген-єднальні ділянки, одна з яких специфічно зв'язується з антигеном СО20 а інша специфічно зв'язується з СОЗ.
В одному із кращих втілень даного винаходу пропоноване біспецифічне антитіло ізольоване.
Зо Термін "ізольоване біспецифічне антитіло" у даному документі відноситься до біспецифічного антитіла, яке практично не містить інших антитіл з іншою антигенною специфічністю (наприклад, ізольоване біспецифічне антитіло, яке специфічно зв'язується з СО20 ії СОЗ, практично не містить моноспецифічних антитіл, що специфічно зв'язуються з СО2О або СОЗ).
Термін "епітоп" ("антигенна детермінанта") означає частину макромолекули антигену (білка), здатну зв'язуватися з відповідним антитілом. Епітоп зазвичай складається з груп, які розташовуються на поверхні антигенної макромолекули, наприклад амінокислотних залишків або бічних ланцюгів цукрів, і, як правило, має специфічну просторову структуру (форму) і специфічне розташування електричних зарядів. Конформаційні й неконформаційні (лінійні) епітопи різняться тим, що в присутності денатуруючих розчинників зв'язування із другими відбувається, а з першими - ні. Епітоп може містити амінокислотні залишки, які безпосередньо беруть участь у зв'язуванні з антитілом, і інші амінокислотні залишки, які не беруть участі у зв'язуванні з антитілом безпосередньо, наприклад амінокислотні залишки, які блокуються або закриваються пептидом, який специфічно зв'язує антиген (іншими словами, амінокислотні залишки в межах області пізнавання антитіла на антигені).
Термін "моноклональне антитіло" у даному документі відноситься до препарату молекул антитіл одного молекулярного складу. Моноклональне антитіло має одну специфічність зв'язування й афінність до конкретного епітопу. Відповідно, термін "людське моноклональне антитіло" відноситься до антитіл, які проявляють одну специфічність зв'язування, у яких варіабельні й константні області походять із послідовностей генів імуноглобулінів зародкової лінії людини. Людські моноклональні антитіла можуть бути отримані за допомогою гібридом злиття, що є результатом, іморталізованих клітин і В-лімфоцитів, отриманих із трансгенних або трансхромосомних тварин видів, відмінних від людини, наприклад трансгенних мишей, у яких геном містить трансген людського важкого ланцюга й трансген людського легкого ланцюга.
Термін "зв'язування" у даному документі в контексті зв'язування антитіла з певним антигеном або епітопом, як правило, означає зв'язування з афінністю, що відповідає Ко близько 107 М або менше, наприклад близько 108 М або менше, наприклад близько 109 М або менше, близько 1079 М або менше або близько 10-! М або ще менше при визначенні цієї величини, наприклад, методом поверхневого плазмонного резонансу (ЗРК) на приладі Віасоге 3000 з використанням антигену в якості ліганда й антитіла в якості аналіта; і зв'язується з певним 60 антигеном з афінністю, що відповідає Ко, щонайменше в 10 разів нижче, наприклад щонайменше в 100 разів нижче, наприклад щонайменше в 1000 разів нижче, наприклад щонайменше в 10 000 разів нижче, наприклад щонайменше в 100 000 разів нижче, ніж афінність при зв'язуванні з не специфічним антигеном (наприклад, з бичачим сироватковим альбуміном або казеїном), відмінним від того певного антигену або від близько спорідненого до нього. У скільки разів зазначена афінність нижче, залежить від Ко для даного антитіла, так що коли Ко для даного антитіла дуже низька (тобто антитіло високо специфічне), то афінність для певного антигену може бути нижче афінності для не специфічного антигену щонайменше в 10 000 разів.
Позначення Ка з розмірністю с" у даному документі відноситься до константи швидкості дисоціації конкретної взаємодії антиген-антитіло. Зазначена величина також позначається Кок.
Позначення Ко з розмірністю М у даному документі відноситься до константи рівноваги (константи дисоціації) для конкретної взаємодії антиген-антитіло. Термін "гетеродимерна взаємодія між першим і другим доменами СНЗ" у даному документі відноситься до взаємодії першого домена СНЗ із другим доменом СНЗ у гетеродимерному білку перший СНЗ/другий
СНЗ.
Термін "гомодимерна взаємодія між першим і другим доменами СНЗ" у даному документі відноситься до взаємодії першого домена СНЗ з іншим першим доменом СНЗ у гомодимерному білюу перший СНЗ/перший СНЗ і взаємодії другого домена СНЗ з іншим другим доменом у гомодимерному білку другий СНЗ/другий СНЗ.
Термін "відновлюючі умови" або "відновлююче середовище/ оточення" відноситься до умов або середовища/оточення, у яких субстрат - тут це залишок цистеїну в шарнірній ділянці молекули антитіла - з більшою ймовірністю відновлюється, ніж окиснюється.
Даним винаходом також пропонуються біспецифічні антитіла, які містять функціональні варіанти областей Мі, Мн або однієї або більше ділянок біспецифічних антитіл за прикладами даного винаходу. Функціональний варіант Мі, Мн, або СОК у випадку біспецифічного антитіла дозволяє кожній "гілці" молекули біспецифічного антитіла зберегти щонайменше значну частку (щонайменше близько 50 95, 6095, 7095, 8095, 9095, 9595 або більше) афінності й/або специфічності/вибірковості вихідного біспецифічного антитіла й у деяких випадках у такого біспецифічного антитіла афінність, вибірковість і/або специфічність можуть бути більше, ніж у вихідного біспецифічного антитіла.
Зо У таких функціональних варіантах, як правило, зберігається значний ступінь ідентичності амінокислотної послідовності вихідному біспецифічному антитілу. Ступінь ідентичності (у відсотках) двох послідовностей є функцією числа ідентичних положень у цих послідовностей (тобто ступінь гомології, 96 - число ідентичних положень/загальне число положень х 100), з урахуванням пропусків у послідовності довжини кожного пропуску, які потрібно вставляти для найкращого вирівнювання двох порівнюваних послідовностей. Ступінь ідентичності у відсотках двох нуклеотидних або амінокислотних послідовностей можна визначити, наприклад, за допомогою алгоритму, запропонованого в роботі Е. Меуег5 апа МУ. МіШег, Сотриї. Аррі. Віовсі 4, 11-17 (1988), який входить у програму АГІСМ (версія 2.0), використовуючи таблицю мас амінокислотних залишків РАМ120, штраф за довжину розриву 12 і штраф за розрив 4. Крім того, ступінь ідентичності у відсотках двох амінокислотних послідовностей можна визначити за допомогою алгоритму, запропонованого в роботі Меедієтап апа Ууип5сй, 9. Мої. Віої. 48, 444- 453 (19790).
Приклади варіантів включають такі, у яких амінокислотні послідовності варіабельних областей важких ланцюгів (МН) і/або варіабельних областей легких ланцюгів (МІ) і/або ділянок, що визначають комплементарність антигену (СОМ), відрізняються від таких вихідного біспецифічного антитіла головним чином у результаті консервативних замін амінокислот; наприклад, зміна 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 або 1 амінокислотного залишку в антитілі-варіанті є консервативними замінами.
У контексті даного винаходу консервативні заміни амінокислотних залишків можна визначити як заміни в межах однієї групи подібних за властивостями амінокислот; ці групи представлені в наведеній нижче таблиці.
Таблиця
Групи амінокислотних залишків, усередині яких заміни вважаються консервативними
Азр (0) та Сім (Е)
Гуз (К), Аго (В), та Нів (Н)
У контексті даного винаходу заміни/мутації амінокислотних залишків записуються в такий спосіб (якщо не зазначене інше). ї) Заміна амінокислотного залишку в даному положенні поліпептидного ланцюга: запис, наприклад, К409К означає, що в положенні 409 замість лізина стоїть аргінін 409. ії) Для певних варіантів використовується певний три- або однобуквений код, включаючи позначення Хаа і Х для зазначення "будь-який амінокислотний залишок". Таким чином, якщо лізин у положенні 409 замінений на аргінін, то це позначається К409К, а якщо замість лізина в положенні 409 може стояти будь-який амінокислотний залишок, то це записується К409Х. У випадку делеції ставиться "зірочка", наприклад якщо лізин у положенні 409 відсутній, то це позначається К409У,
Термін "рекомбінантна клітина-хазяїн" (або просто "клітина-хазяїн") у даному документі відноситься до клітин, у які введений експресійний вектор, наприклад експресійний вектор, що кодує антитіло за даним винаходом. Рекомбінантні клітини-хазяї за даним винаходом включають, наприклад, трансфіковані клітини (трансфектоми) СНО, СНО-5, НЕК, НЕК293, НЕК- 293, Ехрі293Е, РЕК.Сб або М50 і клітини лімфоцитарного ряду.
Термін "лікування" у даному документі відноситься до введення індивідові ефективної кількості терапевтично активних біспецифічних антитіл за даним винаходом 3 метою полегшення, ослаблення, стримування або ліквідації (лікування) симптомів або патологічного стану.
Термін "ефективна кількість" або "терапевтично ефективна кількість" у даному документі відноситься до такої кількості, яка при необхідному дозуванні й протягом проміжку часу, що вимагається, ефективна для досягнення бажаного терапевтичного результату. Терапевтично ефективна кількість біспецифічного антитіла може варіювати залежно від таких факторів, як природа патологічного стану (захворювання), віку, статі й маси тіла індивіда, а також від здатності даного біспецифічного антитіла викликати бажану реакцію в організмі даного індивіда.
Терапевтично ефективна кількість - це також така кількість, у якій токсичні або шкідливі ефекти даного антитіла або фрагмента антитіла переважуються його доброчинною терапевтичною дією.
Термін "антиідиотипічне антитіло" у даному документі відноситься до антитіла, яке розпізнає певні антигенні детермінанти, як правило, асоційовані з антиген-єднальною ділянкою, іншого антитіла.
Інші аспекти й втілення даного винаходу
Як говорилося вище, даний винахід відноситься до біспецифічних антитіл, які містять по дві різні антиген-єднальні ділянки, одна з яких специфічно зв'язується з СОЗ, а інша - з СО20.
Таким чином, даний винахід відноситься до біспецифічного антитіла, яке містить (ї) першу єднальну гілку, яка містить першу антиген-єднальну ділянку, що зв'язується з людським СОЗє (епсилон), причому зазначена перша антиген-єднальна ділянка включає а) діллики СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга (МН), які мають амінокислотні послідовності, представлені ЗЕО ІЮ МО 1, 2 і 3, відповідно; і ділянки СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга (МІ), які мають амінокислотні послідовності, представлені ЗЕО ІЮО МО:4, послідовністю СТМ, і БЕО ІЮ МО:5, відповідно;
Б) ділялнки СОКІ, СОМ2 ії СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга (МН), які мають амінокислотні послідовності, представлені ЗЕО ІЮ МО 1, 2 і 3, відповідно; і ділянки СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга (МІ), які мають амінокислотні послідовності, представлені ЗЕО ІО МО:4, послідовністю СТМ, і 5ЕО ІЮ МО:54, відповідно; с) діллики СОМКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга (МН), які мають амінокислотні послідовності, представлені 5ЕО ІЮ МО 73, 2 ї З, відповідно; і ділянки СОК'І,
СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга (МІ), які мають амінокислотні послідовності,
БО представлені 5ЕО ІЮО МО:4, послідовністю ТМ, і ЗЕО ІЮ МО:5, причому Х»г у послідовності БЗЕО
ІО МО:73 вибирають із М і Р, відповідно; а) діллники СОМКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга (УН), які мають амінокислотні послідовності, представлені 5ЕО ІЮО МО 74, 2 ї 3, відповідно; і ділянки СОК'І,
СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга (МІ), які мають амінокислотні послідовності, представлені 5ЕО ІЮО МО:4, послідовністю ТМ, і ЗЕО ІЮ МО:5, причому Хз у послідовності БЗЕО
ІО МО:74 є А, відповідно; е) діллики СОКІ, СОК2 ії СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга (МН), які мають амінокислотні послідовності, представлені 5Е2О ІЮ МО 1, 75 ї 3, відповідно; і ділянки СОК'І,
СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга (МІ), які мають амінокислотні послідовності, представлені 5ЕО ІЮ МО:4, послідовністю СТМ, і 5ЕО ІЮ МО:5, причому Ха у послідовності ФЕС
ІО МО:75 є Е, відповідно;
У ділянки СОК!І, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга (МН), які мають амінокислотні послідовності, представлені 5Е2 ІЮО МО 1, 2 ї 77, відповідно; і ділянки СОК'І,
СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга (МІ), які мають амінокислотні послідовності, представлені 5ЕО ІЮО МО:4, послідовністю ТМ, і ЗЕО ІЮ МО:5, причому Хв у послідовності БЗЕО
ІО МО:77 вибирають із Е, б, І, К, І. і М, відповідно; 9) діллнки СОМКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга (МН), які мають амінокислотні послідовності, представлені 5Е2 ІЮО МО 1, 2 ї 78, відповідно; і ділянки СОК'І,
СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга (МІ), які мають амінокислотні послідовності, представлені 5ЕО ІЮО МО:4, послідовністю ТМ, ії ЗЕО ІЮ МО:5, причому Х»7 у послідовності БЗЕО
ІО МО:78 є Р, відповідно;
Р) ділянки СОКІ, СОМ2 ії СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга (МН), які мають амінокислотні послідовності, представлені 5Е2 ІЮ МО 1, 2 ї 79, відповідно; і ділянки СОК'І,
СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга (МІ), які мають амінокислотні послідовності, представлені 5ЕО ІЮО МО:4, послідовністю ТМ, і ЗЕО ІЮ МО:5, причому Хв у послідовності БЗЕО
ІО МО:79 вибирають із А і С, відповідно; ї ділянки СОК!І, СОМК2 і СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга (МН), які мають амінокислотні послідовності, представлені 5Е2 ІЮО МО 1, 2 ї 80, відповідно; і ділянки СОК'І,
СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга (МІ), які мають амінокислотні послідовності,
Ко) представлені 5ЕО ІЮО МО:4, послідовністю ТМ, і 5ЕО ІЮО МО:5, причому Хв у послідовності БЗЕО
ІО МО:80 вибирають із М, К і М, відповідно;
І) ділянки СОКІ, СОМ2 і СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга (МН), які мають амінокислотні послідовності, представлені 5ЕО ІЮ МО 55, 56 і 57, відповідно; і ділянки СОК'І,
СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга (МІ), які мають амінокислотні послідовності, представлені ЗЕО ІО МО:58, послідовністю ОЮТ5, і ЗЕО ІО МО:59, відповідно; (ії) другу єднальну гілку, яка містить другу антиген-єднальну ділянку, що зв'язується з людським СО20.
Даним документом пропонуються біспецифічні антитіла з різною афінністю зв'язування з
СОЗзє (епсилон). В одному із втілень даного винаходу переважно, щоб афінність зв'язування
СОЗ3 пропонованим біспецифічних антитілом була нижчою, ніж така вихідної єднальної гілки, спрямованої проти СОЗ3. Експериментальні дані показують, що біспецифічне антитіло проти
СОЗ ії СО20, описане вище в пунктах с) - ії), у якого в гілці, яка зв'язує СЮОЗ, є заміна, що знижує афінність зв'язування СОЗє (епсилон), зберігає здатність убивати пухлинні клітини, властиву вихідному біспецифічному антитілу, спрямованому проти СОЗ і СО20.
В одному зі своїх втілень даний винахід відноситься до біспецифічних антитіл, які містять (і) першу єднальну гілку, яка містить першу антиген-єднальну ділянку, що зв'язується з людським
СОЗзе (епсилон), причому зазначена перша антиген-єднальна ділянка включає а) ділянки СОК'І,
СОК?2 ії СОМКЗ варіабельної області важкого ланцюга (МН), які мають амінокислотні послідовності, представлені ЗЕО ІЮО МО 1, 2 ї З, відповідно; і ділянки СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга (МІ), які мають амінокислотні послідовності, представлені
ЗЕО ІО МО:4, послідовністю СТМ, і ЗЕО ІЮ МО:5 або 5ЕО ІЮ МО:54, відповідно, або б) ділянки
СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга (МН), які мають амінокислотні послідовності, представлені ЗЕО ІЮ МО 55, 56 і 57, відповідно; і ділянки СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга (МГ), які мають амінокислотні послідовності, представлені
ЗЕО ІЮ МО:58, послідовністю ЮТ5, і 5ЕО ІЮ МО:59, відповідно; і ії) другу єднальну гілку, яка містить другу антиген-єднальну ділянку, що зв'язується з людським СО20.
В одному зі своїх втілень даний винахід відноситься до біспецифічних антитіл, які містять першу єднальну гілку, яка містить першу антиген-єднальну ділянку, що зв'язується з людським
СОзЗє (епсилон), причому зазначена перша антиген-єднальна ділянка включає ділянки СОК'І, бо СОМК2 і СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга (МН), які мають амінокислотні послідовності, представлені ЗЕО ІЮ МО 1, 2 ї 3, відповідно, і ділянки СОКІ, СОК2 ії СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга (МГ), які мають амінокислотні послідовності, представлені
ЗЕО ІЮ МО:4, послідовністю ОТМ і 5ЕО ІЮ МО:5, відповідно.
Термін "єднальна гілка, яка містить антиген-єднальну ділянку" означає молекулу антитіла або антитільний фрагмент, що містять антиген-єднальну ділянку. Таким чином зв'язуючими гілками можуть бути, наприклад, шість ділянок СОК легкого й важкого ланцюгів, послідовності важкого й легкого ланцюгів, фрагмент Раб або півмолекули антитіла (тобто містить один важкий і один легкий ланцюг).
В одному із втілень даного винаходу перша антиген-єднальна ділянка містить варіабельну послідовність першого важкого ланцюга (МН) і варіабельну послідовність першого легкого ланцюга (МІ), а друга антиген-єднальна ділянка містить варіабельну послідовність другого важкого ланцюга (МН) і варіабельну послідовність другого легкого ланцюга (МІ).
В одному із втілень даного винаходу перша єднальна гілка містить перший важкий ланцюг, який містить варіабельну послідовність першого важкого ланцюга (МН) їі константну послідовність першого важкого ланцюга (СН), і перший легкий ланцюг, який містить варіабельну послідовність першого легкого ланцюга (МІ), ії константну послідовність першого легкого ланцюга (СІ, і (її) друга єднальна гілка містить другий важкий ланцюг, який містить варіабельну послідовність другого важкого ланцюга (МН) і константну послідовність другого важкого ланцюга (СН), і другий легкий ланцюг, який містить варіабельну послідовність другого легкого ланцюга (МУ), ї константну послідовність другого легкого ланцюга (СІ).
В одному із втілень даного винаходу біспецифічне антитіло є повнорозмірним антитілом, наприклад повнорозмірним імуноглобуліном (31 (901), наприклад повнорозмірним дос, (лямбда),к (каппа) або Ідс1 к (каппа), к (каппа).
Перша єднальна гілка
Перша єднальна гілка містить першу антиген-єднальну ділянку, яка зв'язується з людським
СОзЗе (епсилон), причому зазначена антиген-єднальна ділянка містить а) діллики СОКІ, СОК2 ії СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга (МН), які мають амінокислотні послідовності, представлені ЗЕО ІЮ МО 1, 2 і 3, відповідно; і ділянки СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга (МІ), які мають амінокислотні послідовності,
Ко) представлені ЗЕО ІО МО:4, послідовністю ТМ, і 5ЕО ІЮ МО:5, відповідно;
Б) ділялнки СОКІ, СОМ2 ії СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга (МН), які мають амінокислотні послідовності, представлені 5ЕО ІЮО МО 1, 2 і 3, відповідно; і ділянки СОКІ, СОВ2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга (МІ), які мають амінокислотні послідовності, представлені ЗЕО ІО МО:4, послідовністю СТМ, і 5ЕО ІЮ МО:54, відповідно; с) діллики СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга (МН), які мають амінокислотні послідовності, представлені 5ЕО ІЮ МО 73, 2 ї З, відповідно; і ділянки СОК'І,
СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга (МІ), які мають амінокислотні послідовності, представлені 5ЕО ІЮО МО:4, послідовністю ТМ, і ЗЕО ІЮ МО:5, причому Х»г у послідовності БЗЕО
ІО МО:73 вибирають із М і Р, відповідно; а) діллнки СОКІ, СОК2 ії СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга (УН), які мають амінокислотні послідовності, представлені 5ЕО ІЮО МО 74, 2 ї 3, відповідно; і ділянки СОК'І,
СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга (МІ), які мають амінокислотні послідовності, представлені 5ЕО ІЮО МО:4, послідовністю ТМ, і ЗЕО ІЮ МО:5, причому Хз у послідовності БЗЕО
ІО МО:74 є А; е) діллики СОКІ, СОМК2 і СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга (МН), які мають амінокислотні послідовності, представлені 5Е2О ІЮ МО 1, 75 ї 3, відповідно; і ділянки СОК'І,
СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга (МІ), які мають амінокислотні послідовності, представлені 5ЕО ІЮО МО:4, послідовністю ТМ, і ЗЕО ІЮ МО:5, причому Ха у послідовності БЗЕО
ІО МО:75 є Е;
У ділянки СОК!І, СОМК2 ії СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга (МН), які мають амінокислотні послідовності, представлені 5Е2 ІЮО МО 1, 2 ї 77, відповідно; і ділянки СОК'І,
СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга (МІ), які мають амінокислотні послідовності, представлені 5ЕО ІЮО МО:4, послідовністю ТМ, і ЗЕО ІЮ МО:5, причому Хв у послідовності БЗЕО
ІО МО:77 вибирають із Е, б, І, К, І. і М, відповідно; 9) діллнки СОКІ, СОК2 ії СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга (УН), які мають амінокислотні послідовності, представлені 5Е2 ІЮО МО 1, 2 ї 78, відповідно; і ділянки СОК'І,
СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга (МІ), які мають амінокислотні послідовності, представлені 5ЕО ІЮО МО:4, послідовністю ТМ, ії ЗЕО ІЮ МО:5, причому Х»7 у послідовності БЗЕО
ІО МО:78 є Р; бо Р) ділянки СОКІ, СОК2 ії СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга (МН), які мають амінокислотні послідовності, представлені 5Е2 ІЮ МО 1, 2 ї 79, відповідно; і ділянки СОК'І,
СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга (МІ), які мають амінокислотні послідовності, представлені 5ЕО ІЮО МО:4, послідовністю ТМ, і ЗЕО ІЮ МО:5, причому Хв у послідовності БЗЕО
ІО МО:79 вибирають із А і С, відповідно; ї діллики СОКІ, СОМК2 і СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга (УН), які мають амінокислотні послідовності, представлені 5Е2 ІЮО МО 1, 2 ї 80, відповідно; і ділянки СОК'І,
СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга (МІ), які мають амінокислотні послідовності, представлені 5ЕО ІЮО МО:4, послідовністю ТМ, і ЗЕО ІЮ МО:5, причому Хв у послідовності БЗЕО
ІО МО:80 вибирають із М, К і М, відповідно; або ) діллики СОК!І, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга (МН), які мають амінокислотні послідовності, представлені 5ЕО ІЮ МО 55, 56 і 57, відповідно; і ділянки СОВ'І,
СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга (МІ), які мають амінокислотні послідовності, представлені ЗЕО ІО МО:58, послідовністю ОЮТ5, і ЗЕО ІО МО:59, відповідно.
В одному із втілень даного винаходу перша єднальна гілка містить першу антиген-єднальну ділянку, яка зв'язується з людським СОЗяє (епсилон), причому зазначена перша антиген- єднальна ділянка включає а) ділянки СОМКІ, СОК2 їі СОМЗ варіабельної області важкого ланцюга (МН), які мають амінокислотні послідовності, представлені ЗЕО ІЮО МО 1, 2 ії 3, відповідно; і ділянки СОК1Т, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга (МІ), які мають амінокислотні послідовності, представлені 5ЕО ІЮ МО:4, послідовністю ТМ, і ЗЕО ІЮ МО:5 або
ЗЕО ІЮ МО:54, відповідно, або Б) діллнки СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга (МН), які мають амінокислотні послідовності, представлені ЗЕО ІЮО МО 55, 56 і 57, відповідно; і ділянки СОК1Т, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга (МІ), які мають амінокислотні послідовності, представлені 5ЕО ІЮ МО:58, послідовністю ЮТ5, і 5ЕО ІЮО МО:59, відповідно.
В одному із втілень даного винаходу перша єднальна гілка містить першу антиген-єднальну ділянку, яка зв'язується з людським СОЗє (епсилон), причому зазначена перша антиген- єднальна ділянка включає а) ділянки СОКІ, СОМК2 і СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга (МН), які мають амінокислотні послідовності, представлені ЗЕО ІЮО МО 1, 2 ії 3, відповідно; і ділянки СОК1Т, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга (МІ), які мають
Ко) амінокислотні послідовності, представлені 5ЕО ІЮ МО:4, послідовністю ТМ, і ЗЕО ІЮО МО:5 або
ЗЕО ІЮ МО:5, відповідно.
Шість послідовностей СОК за пунктом (а), наведеним вище, походять із мишачого антитіла, яке позначають 5РЗ4. Створений гуманізований варіант цього антитіла, і в даному документі такі гуманізовані антитіла позначаються пиСОЗ3; вони також описані в публікації УМО 2015001085 (компанія Сепіпаб).
Шість послідовностей СОК за пунктом (Б), наведеним вище, походять із пиСіІ В-13/4, яке є гуманізованим варіантом мишачого антитіла СІ В-13/4 проти СОЗ апіїроду (див. роботу Раїтеп еї а!., ВНе5 Іттипої. 1991, 142 (9):749-63, яка включається в даний документ шляхом відсилання у всій повноті, у тому числі опис послідовностей). Коротко, послідовності варіабельних областей важких (МН) і легких (МІ) ланцюгів мишачого СІ В-13/4 (опублікованих у роботі Рагтеп еї аї. (1991)) вирівнювали з послідовностями варіабельних областей важких і легких ланцюгів людського репертуару, використовуючи програму ІМОеТ5 М-ОШОЕ5БТ. Було виявлено, що найближчою зародковою лінією людини для гена МН є ІСНМЗ3-21701, і для гена І Н-ІСКМЗ3- 11701(45К4702). У мишачих послідовностях варіабельних областей легких і важких ланцюгів усі амінокислотні залишки, які відрізнялися, були замінені на відповідні амінокислотні залишки, властиві людському антитілу, за винятком тих, які перебували в межах ділянок СОК СІ В-Т3/4.
Для послідовності МН не знайшлося спорідненого У-сегмента, тому для четвертої каркасної ділянки (ЕК4) важкого ланцюга використовували загальну послідовність. МОСТІ МУЗ.
Обидві послідовності клонували в придатному експресійному векторі й одержували експресію в котрансфікованих клітинах НЕК29ЗРЕ. В писіІ В-13/4 є варіабельна область важкого ланцюга, яка містить послідовність, представлену ЗЕО ІЮ МО:17 (МН пПисСІ В-13/4) і варіабельна область важкого ланцюга, яка містить послідовність, представлену 5ЕО ІЮ МО:18 (МІ писСІ В-13/4). В пиСІ В-Т3/4 є послідовності ділянок СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, представлені БЕО ІЮ МО:55, 56 і 57, відповідно, і послідовності ділянок СОКІ, СОК2 ії СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, представлені 5ЕО ІЮ МО:58, послідовністю ОТ5 і ЗЕО ІЮ
МО:59, відповідно.
Різні гуманізовані антитіла пиСОЗ ї пиСІ В-13/4 зв'язуються з людським СОЗе (епсилон).
В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла за будь-яким з описаних у даному документі втілень містять першу варіабельну послідовність важкого ланцюга (МН), бо причому зазначена амінокислотна послідовність МН щонайменше на 90 96, щонайменше на
95 965, щонайменше на 97 95 або щонайменше на 99 95 ідентична амінокислотній послідовності, представленій послідовностями УН, обраними із групи, яка складається з: а) послідовності УН, представленої 5ЕО ІЮ МО:6; р) послідовності МН, представленої 5ЕО ІЮ МО:7; с) послідовності УН, представленої 5ЕО ІЮ МО:8; а) послідовності УН, представленої 5ЕО ІЮ МО:9; і е) послідовності УН, представленої ЗЕО ІЮ МО:17.
В одному із втілень даного винаходу послідовність МН першої антиген-єднальної ділянки вибирають із групи, яка складається з: а) послідовності УН, представленої 5ЕО ІЮ МО:6; р) послідовності МН, представленої 5ЕО ІЮ МО:7; с) послідовності УН, представленої ЗЕО ІЮ МО:8; а) послідовності УН, представленої 5ЕО ІЮ МО:9; е) послідовності УН, представленої ЗЕО ІЮ МО:17.
В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла за будь-яким з описаних у даному документі втілень містять першу варіабельну послідовність легкого ланцюга (МІ) першої антиген-єднальної ділянки, причому зазначена амінокислотна послідовність МІ. щонайменше на 90956, щонайменше на 9595, щонайменше на 9795 або щонайменше на 99595 ідентична амінокислотній послідовності, представленій послідовностями Мі, обраними із групи, яка складається з: а) послідовності МІ, представленої 5ЕО ІЮ МО:10; р) послідовності МІ, представленої ЗЕО ІЮ МО:11; с) послідовності МІ, представленої 5ЕО ІЮО МО:12; і а) послідовності МІ, представленої ЗЕО ІЮО МО:18.
В одному із втілень даного винаходу послідовність МІ першої антиген-єднальної ділянки вибирають із групи, яка складається з: а) послідовності МІ, представленої 5ЕО ІЮ МО:10; р) послідовності МІ, представленої ЗЕО ІЮ МО:11; с) послідовності МІ, представленої 5ЕО ІЮО МО:12; і
Ко) а) послідовності МІ, представленої ЗЕО ІЮО МО:18.
В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла за будь-яким з описаних у даному документі втілень містять першу варіабельну послідовність важкого ланцюга (МН) і першу варіабельну послідовність легкого ланцюга (У), причому зазначені послідовності МН і МІ. першої антиген-єднальної ділянки вибирають із групи, яка складається з: а) послідовності МН, представленої БЕО ІЮ МО:6, і послідовності МІ, представленої 5ЕО І1Ю
МО:10; р) послідовності УН, представленої 5ЕО ІЮО МО:8, і послідовності МІ, представленої ЗЕО ІЮ
МО:10; с) послідовності МН, представленої 5ЕО ІЮО МО:9, і послідовності МІ, представленої ЗЕО ІЮ
МО:10; а) послідовності МН, представленої ЗЕО ІЮО МО:6, і послідовності МІ, представленої ЗЕО ІЮ
МО:11; е) послідовності УН, представленої 5ЕО ІЮ МО:6, і послідовності МІ, представленої 5ЕО ІЮ
МО:12;
І) послідовності МН, представленої 5ЕО ІЮ МО:7, і послідовності МІ, представленої ЗЕО ІЮ
МО:10; 9) послідовності МН, представленої ЗЕО ІЮО МО:7, і послідовності МІ, представленої ЗЕО ІЮ
МО:11;
Р) послідовності УН, представленої 5ЕО ІЮО МО:7, і послідовності МІ, представленої ЗЕО ІЮ
МО:12; ї) послідовності МН, представленої 5БЕО ІЮ МО:8, і послідовності МІ, представленої 5ЕО ІЮ
МО:11;
Ї) послідовності МН, представленої БЕО ІЮО МО:8, і послідовності МІ, представленої БЕО ІЮ
МО:12;
К) послідовності УН, представленої БЕО ІЮ МО:9, і послідовності МІ, представленої ЗЕО ІЮ
МО:11;
І) послідовності МН, представленої 5БЕО ІЮ МО:9, і послідовності МІ, представленої 5ЕО ІЮ
МО:12; і т) послідовності МН, представленої БЕО ІЮ МО:17, і послідовності МІ, представленої 5Е0О бо ІО МО:18.
В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла за будь-яким з описаних у даному документі втілень містять першу варіабельну послідовність важкого ланцюга (МН) і першу варіабельну послідовність легкого ланцюга (У), причому зазначені послідовності МН і МІ. першої антиген-єднальної ділянки вибирають із групи, яка складається з: а) послідовності МН, представленої 5ЕО ІЮ МО:6, і послідовності МІ, представленої 5ЕО ІЮ
МО:10; р) послідовності МН, представленої ЗЕО ІО МО:17, і послідовності МІ, представленої БЕО ІЮ
МО:18.
В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла за будь-яким з описаних у даному документі втілень містять першу варіабельну послідовність важкого ланцюга (МН) і першу варіабельну послідовність легкого ланцюга (МІ), представлені ЗЕО ІО Мо: 17 та 18.
В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла за будь-яким з описаних у даному документі втілень містять першу антиген-єднальну ділянку, амінокислотна послідовність якої щонайменше на 90 95 ідентична послідовності варіабельної області важкого ланцюга, представленої ЗЕО ІЮ МО:б, і щонайменше на 90 95 ідентична послідовності варіабельної області легкого ланцюга, представленої ЗЕО ІЮ МО:10. В одному із втілень даного винаходу відмінності в послідовностях є в каркасних ділянках і відсутні в ділянках СОК. Відповідно, в одному зі своїх втілень даний винахід відноситься до біспецифічних антитіл, які містять першу антиген-єднальну ділянку, амінокислотна послідовність якої щонайменше на 90 95 ідентична послідовності варіабельної області важкого ланцюга, представленої 5ЕБЕО ІЮ МО:6, і щонайменше на 9095 ідентична послідовності варіабельної області легкого ланцюга, представленої 5ЕБЕО ІЮО МО:10, причому послідовності ділянок СОК важкого ланцюга представлені БЕО ІЮ МО:1, 2 ї 3, а послідовності ділянок СОК легкого ланцюга представлені
ЗЕО ІЮ МО:4, послідовністю ТМ і ЗЕО ІЮ МО:5, і у всіх цих послідовностях СОК немає мутацій.
В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла за будь-яким з описаних у даному документі втілень містять першу антиген-єднальну ділянку, амінокислотна послідовність якої щонайменше на 95 95 ідентична послідовності варіабельної області важкого ланцюга, представленої 5ЕО ІЮ МО:б, і щонайменше на 95 95 ідентична послідовності варіабельної області легкого ланцюга, представленої ЗЕО ІО МО:10. В одному зі своїх втілень даний винахід відноситься до біспецифічних антитіл, які містять першу антиген-єднальну ділянку, амінокислотна послідовність якої щонайменше на 95 95 ідентична послідовності варіабельної області важкого ланцюга, представленої 5ЕО ІЮО МО:б, і щонайменше на 9595 ідентична послідовності варіабельної області легкого ланцюга, представленої ЗЕО ІЮ МО:10, причому послідовності ділянок СОК важкого ланцюга представлені 5ЕО ІЮО МО:-1, 2 і 3, а послідовності ділянок СОК легкого ланцюга представлені БЕО ІЮ МО:4, послідовністю ЗТМ і ЗЕО 1Ю МО:5, їі у всіх цих послідовностях СОК немає мутацій.
В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла за будь-яким з описаних у даному документі втілень містять першу антиген-єднальну ділянку, амінокислотна послідовність якої щонайменше на 97 95 ідентична послідовності варіабельної області важкого ланцюга, представленої 5ЕО ІЮ МО:б, і щонайменше на 97 95 ідентична послідовності варіабельної області легкого ланцюга, представленої ЗЕО ІО МО:10. В одному зі своїх втілень даний винахід відноситься до біспецифічних антитіл, які містять першу антиген-єднальну ділянку, амінокислотна послідовність якої щонайменше на 97 95 ідентична послідовності варіабельної області важкого ланцюга, представленої 5ЕО ІЮО МО:б, і щонайменше на 97 95 ідентична послідовності варіабельної області легкого ланцюга, представленої ЗЕО ІЮ МО:10, причому послідовності ділянок СОК важкого ланцюга представлені 5ЕО ІЮО МО:-1, 2 і 3, а послідовності ділянок СОК легкого ланцюга представлені ЗЕО ІЮ МО:4, послідовністю ТМ і 5ЕО ІЮ МО:5, і у всіх цих послідовностях СОК немає мутацій.
В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла за будь-яким з описаних у даному документі втілень містять першу антиген-єднальну ділянку, амінокислотна послідовність якої щонайменше на 9895 ідентична послідовності варіабельної області важкого ланцюга, представленої 5ЕО ІЮ МО:б, і щонайменше на 98 95 ідентична послідовності варіабельної області легкого ланцюга, представленої ЗЕО ІО МО:10. В одному зі своїх втілень даний винахід відноситься до біспецифічних антитіл, які містять першу антиген-єднальну ділянку, амінокислотна послідовність якої щонайменше на 98 95 ідентична послідовності варіабельної області важкого ланцюга, представленої 5ЕО ІЮО МО:б, і щонайменше на 98 95 ідентична послідовності варіабельної області легкого ланцюга, представленої ЗЕО ІЮ МО:10, причому послідовності ділянок СОК важкого ланцюга представлені 5ЕО ІЮО МО:-1, 2 і 3, а послідовності ділянок СОК легкого ланцюга представлені БЕО ІЮ МО:4, послідовністю ТМ і 5ЕО ІО МО:5, і у бо всіх цих послідовностях СОК немає мутацій.
В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла за будь-яким з описаних у даному документі втілень містять першу антиген-єднальну ділянку, амінокислотна послідовність якої щонайменше на 99 95 ідентична послідовності варіабельної області важкого ланцюга, представленої 5ЕО ІЮ МО:б, і щонайменше на 99 95 ідентична послідовності варіабельної області легкого ланцюга, представленої ЗЕО ІО МО:10. В одному зі своїх втілень даний винахід відноситься до біспецифічних антитіл, які містять першу антиген-єднальну ділянку, амінокислотна послідовність якої щонайменше на 99 95 ідентична послідовності варіабельної області важкого ланцюга, представленої 5ЕО ІЮО МО:б, і щонайменше на 99 95 ідентична послідовності варіабельної області легкого ланцюга, представленої ЗЕО ІЮ МО:10, причому послідовності ділянок СОК важкого ланцюга представлені 5ЕО ІЮО МО:-1, 2 і 3, а послідовності ділянок СОК легкого ланцюга представлені БЕО ІЮ МО:4, послідовністю ТМ і 5ЕО ІО МО:5, і у всіх цих послідовностях СОК немає мутацій.
У даному документі пропонуються біспецифічні антитіла за даним винаходом, у яких амінокислотні послідовності варіабельних областей легких і важких ланцюгів можуть варіювати в межах щонайменше 90 95-вої ідентичності вихідним послідовностям. Переважно, щоб такі антитіла-варіанти мали деякі властивості вихідних антитіл. У деяких втіленнях даного винаходу зазначені послідовності варіюють тільки в каркасних ділянках, так що послідовності ділянок
СОК ідентичні до відповідних ділянок вихідного антитіла.
В одному зі своїх втілень у біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень даного винаходу перша антиген-єднальна ділянка містить амінокислотну послідовність варіабельної області важкого ланцюга, представлену 5ЕБЕО ІЮ МО:б, і амінокислотну послідовність варіабельної області легкого ланцюга, представлену 5ЕО ІЮ
МО:10.
В одному із втілень даного винаходу перша єднальна гілка біспецифічного антитіла за будь- яким з описаних у даному документі втілень, походить із мишачого антитіла.
В одному із втілень даного винаходу перша єднальна гілка біспецифічного антитіла за будь- яким з описаних у даному документі втілень, походить із гуманізованого антитіла.
В одному із втілень даного винаходу перша єднальна гілка біспецифічного антитіла за будь- яким з описаних у даному документі втілень, походить із повнорозмірного антитіла.
Зо В одному із втілень даного винаходу перша єднальна гілка біспецифічного антитіла за будь- яким з описаних у даному документі втілень, походить із повнорозмірного Ідс1,А (лямбда) або
ІЧДС1,к (каппа).
Друга єднальна гілка
Антитіла проти СО20, придатні для використання в якості другої єднальної гілки біспецифічних антитіл за даним винаходом, є антитілами проти СО20, які зв'язуються з епітопом людського СО20, який не містить або в якому не потрібно залишків аланіна в положенні 170 або проліна в положенні 172 поліпептидного ланцюга, але містить або в ньому потрібні залишки аспарагіна в положеннях 163 і 166. Прикладами таких антитіл є антитіла, позначені 2Е2 і 708, описані в публікації УМО 2004035607 (сСептарБб) і антитіло, позначене 2С6, описане в публікації
УМО 2005103081 (Септаб). Амінокислотні послідовності ділянок СОК антитіл 2Е2, 708 і 206 представлено в таблиці 1.
Також антитілами проти СО20, придатними для використання в якості другої єднальної гілки біспецифічних антитіл за даним винаходом, є антитіла проти СО20, які зв'язуються з епітопом людського СО20, який не містить або в якому не потрібно залишків аланіна в положенні 170 або проліна в положенні 172 поліпептидного ланцюга. Приклад такого антитіла - антитіло, позначене 1188, яке описане в публікації МО 2004035607 (Септаб). Амінокислотні послідовності ділянок СОК антитіл 1188 представлено в таблиці 1.
Також антитілами проти СО20, придатними для використання в якості другої єднальної гілки біспецифічних антитіл за даним винаходом, є антитіла проти СО20 з низькою функціональною швидкістю дисоціації, що означає, що ці антитіла після зв'язування з СО20 повільно дисоціюють з комплексу, що утворився.
Константа швидкості дисоціації (Ка або Кої) можна визначити методом, наведеним під заголовком "Швидкість дисоціації фрагментів Е(ар)», спрямованих проти СО20" у Прикладі 5, описаному в публікації МОЮ 2004035607. Таким чином в одному із втілень даного винаходу антитіла проти СО20О характеризуються Ка-1,0 х 107 с" або менше, наприклад 8,0 х 105 с" або менше, наприклад від 8,0 х 105с7 до 4,0 х 10527 при визначенні зазначеним вище методом.
Також антитілами проти СО20, придатними для використання в якості другої єднальної гілки біспецифічних антитіл за даним винаходом, є антитіла проти СО20, у яких є шість амінокислотних послідовностей СОМ антитіл, позначених 1188 і описаних у публікації УМО 60 2004035607. Амінокислотні послідовності ділянок СОК антитіл 1188 наведено в таблиці 1.
В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла за будь-яким з описаних у даному документі втілень містять другу антиген-єднальну ділянку, яка зв'язується 3 людським
СО20 ї містить ділялнки СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга (МН), амінокислотні послідовності яких вибирають із: () ділялнка СОКІ (МН) - 5ЕО ІЮ МО:32, ділянка СОК2 (МН) - 5ЕО ІЮ МО:33, ділянка СОКЗ (МН) - БЕО ІЮ МО:34, (ії) ділянка СОКІ (МН) - БЕО ІЮ МО:38, ділянка СОК2 (МН) - БЕО ІЮ МО:39, ділянка СОКЗ (МН) - БЕО ІЮ МО:34, (ії) ділялнка СОКІ (МН) - БЕО ІЮО МО:42, ділянка СОК2 (МН) - БЕО ІО МО:43, ділянка СОКЗ (МН) - ЗЕО ІЮ МО:44, або (м) ділянка СОКІ (МН) - 5ЕО ІО МО:49, ділянка СОК2 (МН) - БЕО ІОЮО МО:50, ділянка СОКЗ (МН) - БЕО ІЮ МО:С51.
В одному із кращих втілень даного винаходу біспецифічне антитіло за будь-яким з описаних у даному документі втілень містить другу антиген-єднальну ділянку, яка містить ділянку СОК1 (МН) - ЗЕО ІЮО МО:32, ділянку СОК2 (МН) - БЕО ІО МО:33, і ділянку СОКЗ (УН) - БЕО ІЮ МО:З4.
В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла за будь-яким з описаних у даному документі втілень містять другу антиген-єднальну ділянку, яка зв'язується 3 людським
СО20 і містить ділянки СОК1, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга (МН), ділянки
СОКІ, СОК2 ії СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга (ІН), амінокислотні послідовності яких вибирають із: і. ділянка СОК1 (МН) - ЗЕО ІЮ МО:32, ділянка СОМ2 (МН) - БЕО ІЮО МО:33, ділянка СОКЗ (МН) - ЗЕО ІЮО МО:34, ділянка СОКІ (МІ) - БЕО ІЮ МО:35, ділянка СОН2 (МІ) - СА5 і ділянка СОКЗ (МУ) - БЕО ІО МО:З6, і. ділянка СОК1 (МН) - ЗЕО ІЮ МО:38, ділянка СОК2 (МН) - ЗЕО ІЮ МО:39, ділянка СОКЗ (УН) - ЗЕО ІЮ МО:34, ділянка СОКІ1 (МІ) - 5ЕО ІО МО:35, ділянка СОК2 (МІ) - САЗ і ділянка СОКЗ (МУ) - БЕО ІО МО:З6, ії. ділянка СОКІ1 (МН) - БЕО ІЮО МО:42, ділянка СОК2 (МН) - БЕО ІО МО:43, ділянка СОКЗ (МН) - БЕО ІЮО МО:44, ділянка СОКІ (МІ) - БЕО ІЮО МО:45, ділянка СОК2 (МІ) - САЗ Її ділянка
СОВЗ (МІ) - БЕО І МО:46, ім. ділянка СОКІ (МН) - 5ЕО ІЮ МО:49, ділянка СОК2 (МН) - 5ЕО ІЮО МО:50, ділянка СОКЗ (МН) - БЕО ІЮО МО:51, ділянка СОКІ (МІ) - БЕО ІЮО МО:52, ділянка СОК2 (МІ) - САЗ Її ділянка
СОВЗ (МІ) - БЕО ІО МО:53, м. ділянка СОМ (МН) - БЕО ІЮ МО:32, ділянка СОК2 (МН) - ЗЕО ІЮО МО:33, ділянка СОКЗ (МН) - ЗЕО ІЮО МО:34, ділянка СОКІ (МІ) - БЕО ІЮ МО:45, ділянка СОК2 (МІ) - СА5 і ділянка СОКЗ (МУ) - БЕО І МО:46, м. ділянка СОКІ (МН) - 5ЕО ІЮО МО:32, ділянка СОК2 (МН) - БЕО ІЮ МО:33, ділянка СОКЗ (МН) - БЕО ІЮО МО:34, ділянка СОКІ (МІ) - БЕО ІЮО МО:52, ділянка СОК2 (МІ) - САЗ Її ділянка
СОВЗ (МІ) - БЕО ІО МО:53, мі. ділянка СОКІ (МН) - БЕО ІЮ МО:38, ділянка СОК2 (МН) - БЕО ІЮО МО:39, ділянка СОКЗ (МН) - БЕО ІЮО МО:34, ділянка СОКІ (МІ) - БЕО ІЮО МО:45, ділянка СОК2 (МІ) - САЗ Її ділянка
СОВЗ (МІ) - БЕО І МО:46, мії. ділянка СОКІ (МН) - 5ЕО ІО МО:38, ділянка СОК2 (МН) - 5ЕО ІЮО МО:39, ділянка СОКЗ (МН) - БЕО ІЮО МО:34, ділянка СОКІ (МІ) - БЕО ІЮО МО:52, ділянка СОК2 (МІ) - САЗ Її ділянка
СОВЗ (МІ) - БЕО ІО МО:53, їх. ділянка СОКІ (МН) - 5БЕО ІО МО:42, ділянка СОК2 (МН) - БЕО ІО МО:43, ділянка СОВЗ (МН) - БЕО ІЮО МО:44, ділянка СОКІ (МІ) - БЕО ІЮО МО:35, ділянка СОК2 (МІ) - ВАЗ Її ділянка
СОВЗ (МІ) - БЕО ІО МО:З6, х. ділянка СОКІ (МН) - ЗЕО ІО МО:42, ділянка СОК2 (МН) - 5БЕО ІЮ МО:43, ділянка СОКЗ (МН) - ЗЕО ІЮ МО:44, ділянка СОКІ (МІ) - БЕО І МО:52, ділянка СОК2 (МІ) - БАЗ і ділянка СОКЗ (МУ) - БЕО ІО МО:53, хі. ділянка СОКІ (МН) - 5БЕО ІО МО:49, ділянка СОК2 (МН) - БЕО ІО МО:50, ділянка СОКЗ (МН) - БЕО ІЮО МО:51, ділянка СОКІ (МІ) - БЕО ІЮО МО:35, ділянка СОК2 (МІ) - ВАЗ Її ділянка
СОВЗ (МІ) - БЕО ІО МО:36, або хії. ділялнка СОКІ (МН) - БЕО ІО МО:49, ділянка СОК2 (МН) - БЕО ІЮ МО:50, ділянка СОКЗ (МН) - БЕО ІЮО МО:51, ділянка СОКІ (МІ) - БЕО ІЮО МО:45, ділянка СОК2 (МІ) - САЗ Її ділянка
СОВЗ (МІ) - БЕО ІОЮ МО:46.
В одному із кращих втілень даного винаходу біспецифічні антитіла за будь-яким з описаних у даному документі втілень містять другу антиген-єднальну ділянку, яка містить ділянку СОК1 (МН) з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО:32, ділянку СОК2 (МН) з амінокислотною 60 послідовністю ЗЕО ІЮО МО:33, ділянку СОКЗ (МН) з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮО МО:34,
ділянку СОКІ (МІ) з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО:35, ділянку СОМК2 (М) з амінокислотною послідовністю БАЗ і ділянку СОКЗ (МІ) з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ
МО:З6.
В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла за будь-яким з описаних у даному документі втілень містять амінокислотну послідовність варіабельної області важкого ланцюга, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 97 95 або щонайменше на 99 95 ідентичну амінокислотній послідовності, представленій ЗЕО ІЮ МО:27, і амінокислотну послідовність варіабельної області легкого ланцюга, щонайменше на 90 9565, щонайменше на 95 965, щонайменше на 97 95 або щонайменше на 99 95 ідентичну амінокислотній послідовності, представленій ЗЕО ІЮ МО:28.
В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла за будь-яким з описаних у даному документі втілень містять амінокислотну послідовність варіабельної області важкого ланцюга, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 97 95 або щонайменше на 99 95 ідентичну амінокислотній послідовності, представленій ЗЕО ІЮ МО:37, і амінокислотну послідовність варіабельної області легсого ланцюга, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 965, щонайменше на 97 95 або щонайменше на 99 95 ідентичну амінокислотній послідовності, представленій ЗЕО ІЮ МО:28.
В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла за будь-яким з описаних у даному документі втілень містять амінокислотну послідовність варіабельної області важкого ланцюга, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 97 95 або щонайменше на 99 95 ідентичну амінокислотній послідовності, представленій ЗЕО ІЮ МО:40, і амінокислотну послідовність варіабельної області легкого ланцюга, щонайменше на 90 9565, щонайменше на 95 965, щонайменше на 97 95 або щонайменше на 99 95 ідентичну амінокислотній послідовності, представленій ЗЕО ІЮ МО:А41.
В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла за будь-яким з описаних у даному документі втілень містять амінокислотну послідовність варіабельної області важкого ланцюга, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 97 95 або щонайменше на 99 95 ідентичну амінокислотній послідовності, представленій ЗЕО ІЮ МО:47, і амінокислотну послідовність варіабельної області легсого ланцюга, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 965, щонайменше на 97 95 або щонайменше на 99 95 ідентичну амінокислотній послідовності, представленій ЗЕО ІЮ МО:48.
В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла за будь-яким з описаних у даному документі втілень містять амінокислотну послідовність варіабельної області важкого ланцюга, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 97 95 або щонайменше на 99 95 ідентичну амінокислотній послідовності, представленій ЗЕО ІЮ МО:27, і амінокислотну послідовність варіабельної області легкого ланцюга, щонайменше на 90 9565, щонайменше на 95 965, щонайменше на 97 95 або щонайменше на 99 95 ідентичну амінокислотній послідовності, представленій ЗЕО ІЮ МО:А41.
В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла за будь-яким з описаних у даному документі втілень містять амінокислотну послідовність варіабельної області важкого ланцюга, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 97 95 або щонайменше на 99 95 ідентичну амінокислотній послідовності, представленій ЗЕО ІЮ МО:27, і амінокислотну послідовність варіабельної області легкого ланцюга, щонайменше на 90 9565, щонайменше на 95 965, щонайменше на 97 95 або щонайменше на 99 95 ідентичну амінокислотній послідовності, представленій ЗЕО ІЮ МО:48.
В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла за будь-яким з описаних у даному документі втілень містять амінокислотну послідовність варіабельної області важкого ланцюга, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 97 95 або щонайменше на 99 95 ідентичну амінокислотній послідовності, представленій ЗЕО ІЮ МО:37, і амінокислотну послідовність варіабельної області легсого ланцюга, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 965, щонайменше на 97 95 або щонайменше на 99 95 ідентичну амінокислотній послідовності, представленій ЗЕО ІЮ МО:А41.
В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла за будь-яким з описаних у даному документі втілень містять амінокислотну послідовність варіабельної області важкого ланцюга, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 97 95 або щонайменше на 99 95 ідентичну амінокислотній послідовності, представленій ЗЕО ІЮ МО:37, і амінокислотну послідовність варіабельної області легкого ланцюга, щонайменше на 90 9565, щонайменше на 95 965, щонайменше на 97 956 або щонайменше на 99 95 ідентичну амінокислотній послідовності, представленій ЗЕО ІЮ МО:48. бо В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла за будь-яким з описаних у даному документі втілень містять амінокислотну послідовність варіабельної області важкого ланцюга, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 97 95 або щонайменше на 99 95 ідентичну амінокислотній послідовності, представленій ЗЕО ІЮ МО:40, і амінокислотну послідовність варіабельної області легкого ланцюга, щонайменше на 90 9565, щонайменше на 95 965, щонайменше на 97 95 або щонайменше на 99 95 ідентичну амінокислотній послідовності, представленій ЗЕО ІЮ МО:28.
В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла за будь-яким з описаних у даному документі втілень містять амінокислотну послідовність варіабельної області важкого ланцюга, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 97 95 або щонайменше на 99 95 ідентичну амінокислотній послідовності, представленій ЗЕО ІЮ МО:40, і амінокислотну послідовність варіабельної області легкого ланцюга, щонайменше на 90 9565, щонайменше на 95 965, щонайменше на 97 95 або щонайменше на 99 95 ідентичну амінокислотній послідовності, представленій ЗЕО ІЮ МО:48.
В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла за будь-яким з описаних у даному документі втілень містять амінокислотну послідовність варіабельної області важкого ланцюга, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 97 95 або щонайменше на 99 95 ідентичну амінокислотній послідовності, представленій ЗЕО ІЮ МО:47, і амінокислотну послідовність варіабельної області легкого ланцюга, щонайменше на 90 9565, щонайменше на 95 965, щонайменше на 97 95 або щонайменше на 99 95 ідентичну амінокислотній послідовності, представленій ЗЕО ІЮ МО:28.
В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла за будь-яким з описаних у даному документі втілень містять амінокислотну послідовність варіабельної області важкого ланцюга, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 97 95 або щонайменше на 99 95 ідентичну амінокислотній послідовності, представленій ЗЕО ІЮ МО:47, і амінокислотну послідовність варіабельної області легсого ланцюга, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 965, щонайменше на 97 95 або щонайменше на 99 95 ідентичну амінокислотній послідовності, представленій ЗЕО ІЮ МО:А41.
В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла за будь-яким з описаних у даному документі втілень містять другі послідовності варіабельних областей легкого й важкого
Зо ланцюгів, причому зазначені послідовності другої антиген-єднальної ділянки вибирають із групи, яка складається з: () амінокислотної послідовності варіабельної області важкого ланцюга, представленої ЗЕО
ІО МО:27, і амінокислотної послідовності варіабельної області легкого ланцюга, представленої
ЗЕО ІЮ МО:28, (ії) амінокислотної послідовності варіабельної області важкого ланцюга, представленої ЗЕО
ІО МО:37, і амінокислотної послідовності варіабельної області легкого ланцюга, представленої
ЗЕО ІЮ МО:28, (ії) амінокислотної послідовності варіабельної області важкого ланцюга, представленої ЗЕО
ІО МО:40, і амінокислотної послідовності варіабельної області легкого ланцюга, представленої
ЗЕО ІЮ МО:С41, (ім) амінокислотної послідовності варіабельної області важкого ланцюга, представленої ЗЕО
ІО МО:47, і амінокислотної послідовності варіабельної області легкого ланцюга, представленої
ЗЕО ІЮ МО:48, (м) амінокислотної послідовності варіабельної області важкого ланцюга, представленої ЗЕО
ІО МО:27, і амінокислотної послідовності варіабельної області легкого ланцюга, представленої
ЗЕО ІЮ МО:С41, (м) амінокислотної послідовності варіабельної області важкого ланцюга, представленої ЗЕО
ІО МО:27, і амінокислотної послідовності варіабельної області легкого ланцюга, представленої
ЗЕО ІЮ МО:48, (мі) амінокислотної послідовності варіабельної області важкого ланцюга, представленої
ЗБО ІЮ МО:37, і амінокислотної послідовності варіабельної області легкого ланцюга, представленої 5ЕО ІЮ МО:41, (мії) амінокислотної послідовності варіабельної області важкого ланцюга, представленої
ЗБО ІЮ МО:37, і амінокислотної послідовності варіабельної області легкого ланцюга, представленої ЗЕО ІЮ МО:48, (їх) амінокислотної послідовності варіабельної області важкого ланцюга, представленої ЗЕО
ІО МО:40, і амінокислотної послідовності варіабельної області легкого ланцюга, представленої
ЗЕО ІЮ МО:28, (х) амінокислотної послідовності варіабельної області важкого ланцюга, представленої ЗЕО 60 ІО МО:40, і амінокислотної послідовності варіабельної області легкого ланцюга, представленої
ЗЕО ІЮ МО:48, (хі) амінокислотної послідовності варіабельної області важкого ланцюга, представленої ЗЕО
ІО МО:47, і амінокислотної послідовності варіабельної області легкого ланцюга, представленої
ЗЕО ІЮ МО:28, або (хії) амінокислотної послідовності варіабельної області важкого ланцюга, представленої
ЗБО ІЮ МО:47, і амінокислотної послідовності варіабельної області легкого ланцюга, представленої 5ЕО ІЮ МО:41.
В одному із втілень даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень друга антиген-єднальна ділянка містить амінокислотну послідовність варіабельної області важкого ланцюга, представлену 5ЕБЕО ІЮ МО:27, і амінокислотну послідовність варіабельної області легкого ланцюга, представлену 5ЕО ІЮ МО:28.
В одному із втілень даного винаходу друга єднальна гілка біспецифічних антитіл за будь- яким з описаних у даному документі втілень походить із людського антитіла.
В одному із втілень даного винаходу друга єднальна гілка біспецифічних антитіл за будь- яким з описаних у даному документі втілень походить із повнорозмірного антитіла.
В одному із втілень даного винаходу друга єднальна гілка біспецифічних антитіл за будь- яким з описаних у даному документі втілень походить із ЇДС1,к (каппа).
Формати біспецифічні антитіла
Даним винаходом пропонуються біспецифічні антитіла, спрямовані проти СОЗ і СО20, які ефективно сприяють знищенню пухлинних клітин, у яких експресується СО20, яке відбувається при участі Т-лімфоцитів. Залежно від того, які потрібні функціональні властивості молекул антитіл для їхнього конкретного використання, вибирають певні антиген-єднальні ділянки з набору антитіл або антиген-єднальних ділянок, одержуваного за даним винаходом. У даній області техніки відома безліч різних типів і застосувань біспецифічних антитіл (їх огляд див., наприклад, у роботах Копіептпапп; Огид Оізсом Тодау, 2015 9диІ;20(7):838-47 і МАре5, 2012 Маг-
Арг4(2):182-97.
Біспецифічні антитіла за даним винаходом не обмежуються ніяким їхнім конкретним типом або способом одержання.
Приклади біспецифічних антитіл, які можна використовувати за даним винаходом,
Зо включають: (ії) одиночне (індивідуальне) антитіло, у молекулі якого є дві гілки з різними антиген- єднальними ділянками; (ії) одноланцюгове антитіло, що володіє специфічністю до двох різних епітопів, наприклад два фрагменти 5сЕмз5 з'єднані тандемно додатковим пептидом-лінкером; (її) антитіла з подвійним варіабельним доменом (0МО-Ід), у яких кожен з легких і важких ланцюгів містить два варіабельні домени, розташованих один за одним, між якими є короткий сполучний пептидний ланцюжок (УмМи еї аїЇ., Сепегайоп апа СНагасієгігайоп ої а Юца! Магабіє Ротаїп
Іттиподіобиїйїп (Ома-ід м) Моїесціє, Іп: Апіїбоду Епдіпеегіпд, Зргіпдег Вепіп Неїдеїрегоа (2010)); (ім) хімічно з'єднаний фрагмента (БабБ)2; (м) тандемне димерне антитіло (Тапдар), що є продуктом злиття двох одноланцюгових димерних антитіл з утворенням біспецифічного антитіла, у якому є по два єднальні центри для кожного з антигенів-мішеней; (мі) антитіло типу "Пехібоду" яке представляє собою комбінацію одноланцюгових фрагментів Ем (5сЕм) з димерним антитілом, що дає полівалентну молекулу; (мі) одержуваний методом "замок на причалі" ("досК-апа-оск, або ОМ) з використанням заякорюючого домена кінази А і димерної регуляторної субодиниці протеїнкінази, залежної від циклічного аденозинмонофосфата, тривалентний біспецифічний єднальний білок, який складається із двох однакових фрагментів
Еаь ї з'єднаного з ними одного іншого фрагмента Раб; (мії) так звані "молекули Зсогріоп", які містять, наприклад два фрагменти 5сЕм, злиті на обох кінцях з людським фрагментом Раб; і (їх) димерні антитіла.
В одному із втілень даного винаходу пропоноване біспецифічне антитіло є димерним антитілом, антитілом, отриманим методом Сто55пар, або біспецифічним антитілом, отриманим шляхом контрольованого обміну фрагментів баб (як, наприклад, описане в публікації УМО 2011131746 (компанія Септаб)).
Приклади різних груп біспецифічних антитіл включають (не обмежуючись перерахованим тут) (ї) молекули, подібні до імуноглобулінів С (Ід), з комплементарними доменами СНЗ для посилення гетеродимеризації; (ії) націлені на дві мішені рекомбінантні молекули, подібні дос, у яких кожна з половин молекули містить фрагмент Раб (або його частину) щонайменше двох різних антитіл; (ії) молекули типу "злитий до", у яких повнорозмірні молекули імуноглобуліну С злиті з додатковим фрагментом Раб (або його частиною); (ім) молекули типу "злитий Ес", у яких одноланцюгові молекули Ем або стабілізовані димерні антитіла злиті з константними доменами важкого ланцюга, областями Ес або їх частинами; (м) молекули типу "злитий Раб", у яких різні бо фрагменти Раб злиті разом і з константними доменами важкого ланцюга, областями Ес або їх частинами; (мі) антитіла на основі 5СсЕм, димерних антитіл і важких ланцюгів (наприклад, доменні антитіла ДАБ, наноантитіла), у яких різні одноланцюгові молекули Ем або різні димерні антитіла або різні домени важких ланцюгів (наприклад, доменні антитіла дАБ, наноантитіла) злито один з одним або з іншим білком, або молекула-носій злита з константними доменами важкого ланцюга, областями Ес і або їх частинами.
Приклади молекул, подібних імуноглобулінів З (дО), з комплементарними доменами СНЗ включають (не обмежуючись перерахованим тут) трифункціональні антитіла, одержувані з використанням квадром Тгіотар/Очаадгота (виробництво Тгіоп Рпагта/Егезепіц5 Віоїтеси; ВКосне, див. МО 2011069104); молекули, отримані методом "виступ у западині" ("КпоБз-іпіо-поЇев5") (виробництво Сепепіесй, див. МУО 9850431); антитіла, отримані методом Сго55МАБ5 (виробництво Коспе, див. УМО 2011117329) і молекули, отримані з використанням електростатичної відповідності (виробництво Атдеп; див. Європейський патент Мо 1870459 і публікацію М/О 2009089004; Спидаі, див. патент США Мо 201000155133; Опсотей, див. публікацію МО 2010129304), молекули І Ш2-У (які мають "лейцинову блискавку" на кінці домена
С(Н)З) (виробництво Сепепіесії, див. роботу УмгапікК еї аї. У. Віої. Спет. 2012, 287(52): 43331-9, дої: 10.1074/рс.М112.397869. Ериб 2012 Мом. 1), антитіла на основі Іде (БІС -спрямовані на дві мішені й РІС - з використанням пептидного заякорювання) (виробництво РІагтабсіпе, див. публікації МИО 2010134666 і УМО 2014081202), молекули, отримані з використанням обміну ланцюгів (методика Зеєедроду) (виробництво ЕМО бегопо; див. публікацію ММО 2007110205), молекули, отримані з використанням технологічної платформи Вісіопіс5 (виробництво Мегив; див. публікацію М/О 2013157953), молекули Есладр (виробництво Кедепегоп; див. публікацію
МО 201015792), біспецифічні ІдС1 і Ідс2 (виробництво Ріїйгег/Кіпас див. публікацію УМО 11143545), молекули Агутеїгіс"М зсапноїд, одержувані з використанням амінокислотних замін у домені з(Н)З Ідс1 (виробництво 7утемогк5/Мегск; див. публікацію М/О 2012058768), молекули тАбБ-Рм (виробництво Хепсог; див. публікацію МО 2011028952), бівалентні біспецифічні антитіла (див. публікацію УМО 2009080254) і молекули, отримані з використанням технологічної платформи ЮиоВоадуф (виробництво Септаб А/5; див.публікацію МО 2011131746).
Приклади рекомбінантних молекул, подібних Ідс, які націлені на дві мішені, включають (не обмежуючись перерахованим тут) націлені на дві мішені молекули ОТ-Ід (див. публікацію УМО
Зо 2009058383), антитіла "Тм/о-іп-опе" з біфункціональними фрагментами Раб (виробництво
Сепепіесії; див. Во5ігот, еї а. 2009. Зсіепсе 323, 1610-1614.), поперечно-зшиті моноклональні антитіла (виробництво Каптапо5 Сапсег Сепіег), молекули тАб2 (виробництво Е-5їаг; див. публікацію УМО 2008003116), молекули 7уроду, у яких модульовані розпізнаючі домени приєднані до М- ї С-кінців і легких, і важких ланцюгів повнорозмірного антитіла 7упдепіа (див.
ІГаНіємг еї аі. Мабр5х. 2013 Маг-Арг.;5(2):208-18), молекули із спільними легкими ланцюгами (виробництво СтгисеПМеги5, див. патент США Мо 7,262,028), молекули "каппа/лямбда" із спільними важкими ланцюгами (кАВодіеє виробництва Моміттипе; див. публікацію М/о 2012023053) і молекули СомХ-Боду, у яких використовується ковалентне приєднання функціональних частин до імуноглобуліну-основи (виробництво СоуХ/Рії2ег; див. Борраїарцаї,
М.В., ег а). 2007. Віоогд. Мед. Спет. Гей. 17,501-506.).
Приклади молекул типу "злитий ДС" включають (не обмежуючись перерахованим тут) молекули з подвійними варіабельними доменами (0МО-Ід) (виробництво АБбБоїї див. патент
США Мо 7,612,181), гетеротетрамерні антитіла (доибіе-пеад) з подвійними варіабельними доменами (виробництво Опііемег; Запоїї Амепії5; див. публікацію М/О 20100226923), біспецифічні молекули, подібні (3 (виробництво ІтСіопе/Еїї І Шу; див. І еул5 еї аЇ. Маї Віотесппої. 2014
Ееб.;32(2):191-8), триспецифічні молекули Т52АБ (виробництво Медіттипе/А7; див. Оітавзві еї аї.
У Мої Віої. 2009 Осі 30:;393(3):672-92), біспецифічні молекули В5АБ (виробництво 7утодепеїісв; див. МО 2010111625), молекули НЕКСИГ ЕЗ (виробництво Віодеп Ідес; див. патент США Мо 007951918), злиті молекули, які містять 5сЕм (виробництво Момагіі5), злиті молекули, які містять 5сЕм (виробництво Спапод2лпои Адат Віоїеспй пс, див. патент Китаю Мо 102250246) і тетравалентні молекули ТмАБ (Коспе; див. публікації УМО 2012025525 і УМО 2012025530).
Приклади злитих молекул на основі Ес включають (але не обмежуються перерахованим тут) злиті молекули ЗСЕмМ/Ес (див. Реагсе еї аїЇ., Віоспет Мо! Віо! Іпї 1997 Зер;42(6):1179-88), молекули ЗСОКРІОМ (виробництво Етегдепі ВіобоЇшіоп5/Тгиріоп, див. ВіапКепе5Пір 3.ММ. еї аї.
ААСЕ. 100 (п Аппиаї тееїіпд 2009 (Арзігасі Ж 5465); виробництво 7утодепеїіс5/ВМ5, див. МО 2010111625), молекули Есо-САКТ, одержувані з використанням технологічної платформи САКТ (Оцаї Айіпку Кеїагдеїйпд ТесппоЇоду) (виробництво Масгосепісв; див. публікації ЛО 2008157379 і МО 2010080538) і димерні молекули Юиа(ЗсЕм)2-Раб (виробництво Маїйопа! Кезеагс! Сепіевг
Тог Апіібоду Меадісіпе, Китай). бо Приклади злитих біспецифічних антитіл на основі баб включають (але не обмежуються перерахованим тут) молекули К(ар)2 (виробництво Медагех/АМСЕМ; див. Оео еї аї. . Іттипої. 1998 Рер. 15;160(4):1677-86.), молекули "подвійної дії", або Віз-Раб (виробництво Сепепіесі; див. Вовігот еї аїІ. 2009. Зсіепсе 323, 1610-1614.), молекули, одержувані методом "замок на причалі" ("досК-апа-ІоскК, або ОМ) (виробництво ІттипоМеаіс5; див. публікації УМО 2003074569 і УМО 2005004809), бівалентні біспецифічні молекули (виробництво Віоїеспої; див. Зспоопіапв, 9.
Іттипої. 2000 Оес. 15и165(12):7050-7.) і молекули Раб-Ем (виробництво ОСВ-СеїНесі; див. УМО 2009040562 АТ).
Приклади ЗсЕм-антитіл, димерних і доменних антитіл включають (не обмежуючись перерахованим тут) біспецифічні антитіла, які зв'язуються з Т-лімфоцитами (молекули ВІТЕ) (виробництво Місготеї; див. МО 2005061547), тандемні димерні молекули Тападб (виробництво Айітеа); див. Ге Заї! еї аї., Ргоївіп Епд Оез 5еї. 2004 Арг.;17(4):357-66.), молекули, одержувані з використанням технологічної платформи БАКТ (виробництво Масгосепісв5; див. публікації УМО 2008157379 і ММО 2010080538), одноланцюгові димерні антитіла (див. І амтепсе,
ЕЕВБ5 ей. 1998 Арг. 3;:425(3):479-84), антитіла, подібні Т-клітинному рецептору (ТОК) (виробництво АЇїЇТ, Кесеріогі одієє), злитий білок сироватковий альбумін людини5ЗсЕм (виробництво Мег'тітаскК; див. МО 2010059315), мультимер однодоменних антитіл СОМВОВСУ (виробництво Ерідеп Віоїесй; див. 2йпи еї а). Іттипої Сей ВіоЇ. 2010 Апа.;88(6):667-75.), наноантитіла проти двох мішеней (виробництво АбБіупх; див. Нтійа еї аіІ., ЕАБЕВ 3. 2010) і спрямовані проти двох мішеней однодоменні антитіла, які містять тільки важкі ланцюги.
В одному з аспектів даного винаходу пропоновані біспецифічні антитіла містять першу область Ес, яка містить першу ділянку СНЗ, і другу область Ес, яка містить другу ділянку СНЗ, причому амінокислотні послідовності першої й другої ділянок СНЗ відрізняються й такі, що гетеродимерна взаємодія між зазначеними першою і другою ділянками СНЗ сильніша, ніж кожна з гомодимерних взаємодій між зазначеними першою і другою ділянками СНЗ. Більш докладно про ці взаємодії й можливості їх досягнення повідомляється в публікаціях УМО 2011131746 і УМО 2013060867 (компанія Септаб), які включаються в даний документ шляхом відсилання.
Як говориться далі в даному документі, стабільні біспецифічні антитіла проти СОЗ і СО20 можуть бути отримані з високим виходом, якщо застосовувати специфічний спосіб з використанням одного гомодимерного вихідного антитіла проти СО20 і одного гомодимерного
Зо вихідного антитіла проти СОЗ, які містять лише небагаточисельні консервативні асиметричні мутації у ділянках СНЗ. Термін "асиметричні" стосовно до мутацій у даному документі означає, що в послідовностях зазначених першої й другої ділянок СНЗ є амінокислотні заміни в не однакових положеннях.
В одному з аспектів даного винаходу біспецифічні антитіла за будь-яким з його втілень, описаних у даному документі, містять перший і другий важкі ланцюги, причому кожен із зазначених першого й другого важких ланцюгів містить щонайменше шарнірну ділянку й ділянку
СН? ії СНЗ, і в зазначеному першому важкому ланцюзі замінений щонайменше один амінокислотний залишок у положенні, відповідному до положень, обраних із групи, яка складається з 7366, І 368, К370, 0399, Е405, 407 і К.409 важкого ланцюга людського ІдДС1, а в зазначеному другому важкому ланцюзі замінений щонайменше один амінокислотний залишок у положенні, відповідному до положень, обраних із групи, яка складається з 7366, І 368, КЗ370, 0399, Е405, 407 і К409 важкого ланцюга людського ІдО1, але в зазначених першому й другому важких ланцюгах заміни мають місце не в однакових положеннях.
В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла за будь-яким з описаних у даному документі втілень містять перший й другий важкі ланцюги, у яких (ї) амінокислотний залишок у положенні, що відповідає 405 важкого ланцюга людського ІДС1, є залишком лейцину (ГУ у зазначеному першому важкому ланцюзі, а амінокислотний залишок у положенні, що відповідає К409 важкого ланцюга людського ІДО1, є залишком аргініну (К) у зазначеному другому важкому ланцюзі або (ії) амінокислотний залишок у положенні, що відповідає К409 важкого ланцюга людського ДС1, є залишком аргініну (К) у зазначеному першому важкому ланцюзі, а амінокислотний залишок у положенні, що відповідає Е405 важкого ланцюга людського ІдДО1, є залишком лейцину (І) у зазначеному другому важкому ланцюзі.
У одному із втілень даного винаходу у біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень перша область Ес містить амінокислотну заміну у положенні, обраному з групи, яка складається з 366б-го, 368-го, 370-го, 399-го, 405-го, 407-го і 409-го положень, і друга область Ес містить амінокислотну заміну в положенні, обраному з групи, яка складається з 366-го, 368-го, 370-го, 399-го, 405-го, 407-го і 409-го положень, причому заміни у першій і другій областях Ес мають місце не в однакових положеннях.
В одному із втілень даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у бо даному документі втілень перша область Ес містить амінокислотну заміну в положенні 366, а
Зо зазначена друга область Ес містить амінокислотну заміну в положенні, обраному із групи, яка складається з 368-го, 370-го, 399-го, 405-го, 407-го й 409-го положень. В одному із втілень даного винаходу амінокислоту для заміни в положенні 366 вибирають із Аа, А5р, Сім, Нів, Авп,
Уа! або сСіп.
В одному із втілень даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень перша область Ес містить амінокислотну заміну в положенні 368, а зазначена друга область Ес містить амінокислотну заміну в положенні, обраному із групи, яка складається з 366-го, 399-го, 405-го, 407-го й 409-го положень.
В одному із втілень даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень перша область Ес містить амінокислотну заміну в положенні 370, а зазначена друга область Ес містить амінокислотну заміну в положенні, обраному із групи, яка складається з 366-го, 368-го, 399-го, 405-го, 407-го й 409-го положень.
В одному із втілень даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень перша область Ес містить амінокислотну заміну в положенні 399, а зазначена друга область Ес містить амінокислотну заміну в положенні, обраному із групи, яка складається з 366-го, 368-го, 370-го, 405-го, 407-го й 409-го положень.
В одному із втілень даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень перша область Ес містить амінокислотну заміну в положенні 405, а зазначена друга область Ес містить амінокислотну заміну в положенні, обраному із групи, яка складається з 366-го, 368-го, 370-го, 399-го, 407-го й 409-го положень.
В одному із втілень даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень перша область Ес містить амінокислотну заміну в положенні 407, а зазначена друга область Ес містить амінокислотну заміну в положенні, обраному із групи, яка складається з 366-го, 368-го, 370-го, 399-го, 405-го й 409-го положень.
В одному із втілень даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень перша область Ес містить амінокислотну заміну в положенні 409, а зазначена друга область Ес містить амінокислотну заміну в положенні, обраному із групи, яка складається з 366-го, 368-го, 370-го, 399-го, 405-го й 407-го положень.
Таким чином, в одному із втілень даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з
Зо описаних у даному документі втілень амінокислотні послідовності зазначених першої й другої ділянок СНЗ містять асиметричні мутації, тобто мутації в цих двох ділянках СНЗ відбуваються в різних положеннях послідовності, наприклад в одній ділянці СНЗ мутація має місце в положенні 405, а в іншій ділянці СНЗ мутація має місце в положенні 409.
В одному із втілень даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень у першій області Ес у положенні 409 її амінокислотної послідовності перебуває залишок амінокислоти, відмінної від І ув, І еи або Меї, наприклад су, Аа, маї, Пе, 5ег,
Тиг, Ріє, Аго, Ні, Ар, Авп, Сім, Сіп, Рго, Тгр, Туг або Сувх, а в зазначеній другій області Ес є амінокислотна заміна в положенні, обраному із групи, яка складається з 366-го, 368-го, 370-го, 399-го, 405-го й 407-го положень. В одному з таких втілень даного винаходу в зазначеній першій області Ес у положенні 409 її амінокислотної послідовності перебуває залишок амінокислоти, відмінної від Гуз, І еи або Меї, наприклад Су, Аа, Маї, Пе, Зег, ТНг, Ре, Аго, Ні, Авр, Авп, СИ,
Сп, Ріо, Тгр, Туг або Сувх, а в зазначеній другій області Ес у положенні 405 перебуває залишок амінокислоти, відмінної від Рпе, наприклад Су, Аа, Маї, Ме, зег, ТАг, Гуз, Аго, Ні, Ар, Авп, СІМ,
Сіп, Ро, Ттр, Тут, Сув, Гу5 або І еи. В іншому втіленні даного винаходу в зазначеній першій області Ес у положенні 409 її амінокислотної послідовності перебуває залишок амінокислоти, відмінної від І уз, І ей або Меї, наприклад су, Аа, Маї, Пе, Зег, ТНг, Рпе, Аго, Ні, Авр, Авп, СІМ,
Сп, Ріо, Тгр, Туг або Сувх, а в зазначеній другій області Ес у положенні 405 перебуває залишок амінокислоти, відмінної від Рпеє, Агу або Су, наприклад І! еи, Аа, Маї, Ме, Зег, Тпг, Меї, Гуз, Нів,
Авр, Азп, Сім, СіІп, Рго, Тгр, Туг або Сув.
В іншому втіленні даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень у зазначеній першій області Ес у положенні 405 її амінокислотної послідовності перебуває залишок Рпе, у положенні 409 перебуває залишок амінокислоти, відмінної від І ух, І ей або Меї, наприклад су, Аа, Маї, Пе, Зег, ТНг, Рпе, Аго, Ні, Авр, Азп, СІМ,
Сп, Ріо, Тгр, Туг або Сувх, а в зазначеній другій області Ес у положенні 405 перебуває залишок амінокислоти, відмінної від Ре, наприклад Су, Аа, Маї, Пе, 5ег, ТНг, ГГ ув, Агу, Нів, А5р, Авп, СІМ,
Сп, Рго, Тгр, Туг, ем, Меї або Суб», і в положенні 409 перебуває Гуз. В іншому втіленні даного винаходу в зазначеній першій області Ес у положенні 405 її амінокислотної послідовності перебуває залишок Ріпе, у положенні 409 перебуває залишок амінокислоти, відмінної від Гуз,
Ї ем або Меї, наприклад Су, Аа, Маї, Пе, Зег, Тпг, Ріє, Ага, Ні, Азр, Азвп, Сім, Сп, Рго, Тгр, Туг 60 або Сув, а в зазначеній другій області Ес у положенні 405 перебуває залишок амінокислоти,
відмінної від Рпе, Агу або Су, наприклад / еи, Аа, Маї, Пе, Зег, Тпг, Меї, Гуз, Ні, А5р, Авп, СІМ,
Сп, Рго, Тгр, Туг або Суб, і в положенні 409 перебуває І ув.
В іншому втіленні даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень у зазначеній першій області Ес у положенні 405 її амінокислотної послідовності перебуває залишок Ре, у положенні 409 - залишок амінокислоти, відмінної від
Гуз, Геи або Меї, наприклад СУ, Аа, Маї, Пе, 5ег, Тпг, Ре, Аго, Ні, А5р, Азп, Сім, СіІп, Рго, Тгр,
Туг або Су, а в зазначеній другій області Ес у положенні 405 перебуває залишок Геи у положенні 405 і в положенні 409 - залишок ГІ у5. В іншому втіленні даного винаходу в зазначеній першій області Ес у положенні 405 її амінокислотної послідовності перебуває залишок Ре і в положенні 409 - залишок Агуд, а в зазначеній другій області Ес у положенні 405 перебуває залишок амінокислоти, відмінної від Ріпе, Агуд або Су, наприклад Г еи, Аа, Маї, Пе, 5ег, Тпг, Гув,
Меї, Ні, Авр, Авп, СИМ, Сп, Рго, Тгр, Туг або Суз, і в положенні 409 перебуває залишок І у5. В іншому втіленні даного винаходу в зазначеній першій області Бс у положенні 405 її амінокислотної послідовності перебуває залишок Рпе і в положенні 409 - залишок Ам, а в зазначеній другій області Ес у положенні 405 перебуває залишок Їеи і в положенні 409 - залишок Гуз.
В іншому втіленні даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень у зазначеній першій області Ес у положенні 409 перебуває залишок амінокислоти, відмінної від Гуз, І еи або Меї, наприклад Су, Аа, Маї, Пе, 5ег, Тпг, Ре, Ага, Нів,
Авзр, Ап, Сім, Сіп, Рго, Тгр, Туг або Сув, а в зазначеній другій області Ес у положенні 409 перебуває залишок Гуз, у положенні 370 - залишок ТПг і в положенні 405 - залишок І еи. В іншому втіленні даного винаходу в зазначеній першій області Бс у положенні 409 її амінокислотної послідовності перебуває залишок Агу, а в зазначеній другій області Ес у положенні 409 перебуває залишок Гух, у положенні 370 - залишок ТПг ії в положенні 405 - залишок І еи.
У ще одному втіленні даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень у зазначеній першій області Ес у положенні 370 її амінокислотної послідовності перебуває залишок Гуз, у положенні 405 - залишок Ріе і в положенні 409 - залишок Агд а в зазначеній другій області Ес у положенні 409 перебуває залишок Гуз, у
Зо положенні 370 - залишок ТпПг і в положенні 405 - залишок Г еи.
В іншому втіленні даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень у зазначеній першій області Ес у положенні 409 перебуває залишок амінокислоти, відмінної від І ух, І еи або Меї, наприклад Су, Аа, Маї, Пе, Зег, Тпг, Рпе, Ага, Нів,
Авр, Ап, Сім, Сіп, Рго, Тгр, Туг або Сув, а в зазначеній другій області Ес у положенні 409 перебуває залишок Гуз і а) у положенні 350 перебуває залишок Пе і в положенні 405 - залишок
Ї ем або Б) у положенні 370 перебуває залишок ТпНг і в положенні 405 - залишок Г еи.
В іншому втіленні даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень у зазначеній першій області Ес у положенні 409 перебуває залишок
Агод, а в зазначеній другій області Ес у положенні 409 перебуває залишок Гуз і а) у положенні 350 перебуває залишок Пе і в положенні 405 - залишок І ем або Б) у положенні 370 перебуває залишок Тпг і в положенні 405 - залишок Г еи.
В іншому втіленні даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень у зазначеній першій області Ес у положенні 350 перебуває залишок
Тпг, у положенні 370 - залишок Гуз, у положенні 405 - залишок Рпе і в положенні 409 - залишок
Агд, а в зазначеній другій області Ес у положенні 409 перебуває залишок Гуз і а) у положенні 350 перебуває залишок Пе і в положенні 405 - залишок І ем або Б) у положенні 370 перебуває залишок Тпг і в положенні 405 - залишок Г еи.
В іншому втіленні даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень у зазначеній першій області Ес у положенні 350 перебуває залишок
Тиг, у положенні 370 - залишок Гуз, у положенні 405 - залишок Рпе і в положенні 409 - залишок
Агод, а в зазначеній другій області Ес у положенні 350 перебуває залишок Іе, у положенні 370 - залишок ТНг, у положенні 405 - залишок Г еи і в положенні 409 - залишок ГГ ув.
В одному із втілень даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень у зазначеній першій області Ес у положенні 409 її амінокислотної послідовності перебуває залишок амінокислоти, відмінної від Гу, Ії еи або Меї, а в зазначеній другій області Ес у положенні 405 перебуває залишок амінокислоти, відмінної від Ре, наприклад відмінної від Ріє, Агуд або су; або в зазначеній першій ділянці СНЗ у положенні 409 перебуває залишок амінокислоти, відмінної від І ує, Ге або Меї, а в зазначеній другій ділянці
СНЗ у положенні 407 перебуває залишок амінокислоти, відмінної від Туг, А5р, Сім, Ре, Гуз, Сп, 60 Аго, Зег або ТНг.
В одному із втілень даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень у зазначеній першій області Ес у положенні 409 її амінокислотної послідовності перебуває залишок амінокислоти, відмінної від І ух, І еи або Меї, а в зазначеній другій області Ес у положенні 407 перебуває залишок амінокислоти, відмінної від Туг, А5р, Сім,
Рпе, Гу, Сп, Аго, Зег або ТНг.
В одному із втілень даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень у зазначеній першій області Ес у положенні 407 її амінокислотної послідовності перебуває залишок Туг і в положенні 409 - залишок амінокислоти, відмінної від
Гуз, Гей або Меї, а в зазначеній другій області Ес у положенні 407 перебуває залишок амінокислоти, відмінної від Туг, А5р, СІМ, Рпе, Гу, СіІп, Агу, Зег або Тпг і у положенні 409 - залишок Гуз.
В одному із втілень даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень у зазначеній першій області Ес у положенні 407 її амінокислотної послідовності перебуває залишок Туг і в положенні 409 - залишок Агоу, а в зазначеній другій області Ес у положенні 407 перебуває залишок амінокислоти, відмінної від Туг, А5р, Сім, Ре,
Гуз, СІп, Аго, Зег або ТНг і в положенні 409 - залишок І ув.
В іншому втіленні даного винаходу в зазначеній першій області Ес у положенні 409 її амінокислотної послідовності перебуває залишок амінокислоти, відмінної від І ух, Їеи або Меї, наприклад Су, Аа, Маї, Пе, 5ег, Тпг, Ріє, Аго, Ні, Ар, Азп, Сім, СіІп, Рго, Тгр, Туг або Суб, а в зазначеній другій області Ес у положенні 407 перебуває залишок амінокислоти, відмінної від Туг,
Азр, Сім, Рпе, Гуз, СіІп, Аго, Зег або Тпг, наприклад І ей, Меї, Су, Аа, Маї, Пе, Ні, Азп, Рго, Тгр або Сух. В іншому втіленні даного винаходу в зазначеній першій області Ес у положенні 409 її амінокислотної послідовності перебуває залишок амінокислоти, відмінної від Гу, Ге або Меї, наприклад Су, Аа, Маї, Пе, 5ег, Тпг, Ріє, Аго, Ні, Ар, Азп, Сім, СіІп, Рго, Тгр, Туг або Суб, а в зазначеній другій області Ес у положенні 407 перебуває залишок Аїа, Су, Ні, Пе, Гей, Меї, Авп, ма! або Ттр.
В іншому втіленні даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень у зазначеній першій області Ес у положенні 409 її амінокислотної послідовності перебуває залишок амінокислоти, відмінної від Гу, ей або Меї, наприклад Су,
Аа, маї, Пе, Зег, Тиг, Ріє, Аго, Ні, Ар, Азп, Сім, Сп, Рго, Тгр, Туг або Суб, а в зазначеній другій області Ес у положенні 407 перебуває залишок Су, І ем, Меї, Азп або Ттгр.
В іншому втіленні даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень у зазначеній першій області Ес у положенні 407 її амінокислотної послідовності перебуває залишок Туг і в положенні 409 перебуває залишок амінокислоти, відмінної від І ух, І ей або Меї, наприклад Су, Аа, Маї, Пе, бег, ТНг, Рпе, Ага, Ні, А5р, Авп, СІМ,
Сп, Ріо, Тгр, Туг або Сувх, а в зазначеній другій області Ес у положенні 407 перебуває залишок амінокислоти, відмінної від Туг, А5р, Сім, Рпе, Гуз, СіІп, Агро, Зег або Тнг, наприклад І ем, Меї, сту,
Аа, маї, Пе, Ні, Азп, Рго, Тгр або Сузх і в положенні 409 - залишок І ув.
В іншому втіленні даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень у зазначеній першій області Ес у положенні 407 її амінокислотної послідовності перебуває залишок Туг і в положенні 409 перебуває залишок амінокислоти, відмінної від І ух, І ей або Меї, наприклад су, Аа, Маї, Пе, Зег, ТНг, Рпе, Аго, Ні, Авр, Азп, СІМ,
Сп, Ріо, Тгр, Туг або Сувх, а в зазначеній другій області Ес у положенні 407 перебуває залишок
Аа, Су, Ні, Пе, І ей, Меї, Азп, Маї або Тгр і в положенні 409 - залишок І ув.
В іншому втіленні даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень у зазначеній першій області Ес у положенні 407 її амінокислотної послідовності перебуває залишок Туг і в положенні 409 перебуває залишок амінокислоти, відмінної від І ух, І ей або Меї, наприклад су, Аа, Маї, Пе, Зег, ТНг, Рпе, Аго, Ні, Авр, Азп, СІМ,
Сп, Ріо, Тгр, Туг або Сувх, а в зазначеній другій області Ес у положенні 407 перебуває залишок
Су, Геи, Меї, Азп або Ттгр і в положенні 409 - залишок І уз.
В іншому втіленні даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень у зазначеній першій області Ес у положенні 407 її амінокислотної послідовності перебуває залишок Туг і в положенні 409 перебуває залишок Аго, а в зазначеній другій області Ес у положенні 407 перебуває залишок амінокислоти, відмінної від Туг, А5р, СІМ,
Ре, Гу, Сп, Аго, бег або ТНг, наприклад І ем, Меї, Су, Аа, Маї, Пе, Ні, Азп, Рго, Тгр або Суз і в положенні 409 - залишок ГГ ув.
В іншому втіленні даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень у зазначеній першій області Ес у положенні 407 її амінокислотної послідовності перебуває залишок Туг і в положенні 409 перебуває залишок Аго, а в зазначеній 60 другій області Ес у положенні 407 перебуває залишок Аа, Су, Ні, Пе, І ей, Меї, Азп, Маї або Тгр і в положенні 409 - залишок Г ув.
В іншому втіленні даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень у зазначеній першій області Ес у положенні 407 її амінокислотної послідовності перебуває залишок Туг і в положенні 409 перебуває залишок Аго, а в зазначеній другій області Ес у положенні 407 перебуває залишок Су, І ем, Меї, Азп або Тгр і в положенні 409 - залишок Гуз.
В іншому втіленні даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень у зазначеній першій області Ес у положенні 409 її амінокислотної послідовності перебуває залишок амінокислоти, відмінної від Гу, Ге або Меї, наприклад Су,
Аа, маї, Пе, Зег, Тиг, Ріє, Аго, Ні, Ар, Азп, Сім, Сп, Рго, Тгр, Туг або Суб, а в зазначеній другій області Ес () у положенні 368 перебуває залишок амінокислоти, відмінної від Ре, І еи і Меї, наприклад
Су, Аа, Маї, Пе, Зег, ТНг, Гув, Аго, Ні, Ар, Азп, Сім, Сіп, Рго, Тгр, Туг або Суб; або (ії) у положенні 370 перебуває залишок Тгр або (ії) у положенні 399 перебуває залишок амінокислоти, відмінної від А5р, Су, Рго, СіІй або
Сп, наприклад Ре, ГІ ем, Меї, Су, Аа, Маї, Пе, Зег, ТАг, Гуз, Агу, Ні, Авп, Тгр, Туг або Сув; або (ім) у положенні 366 перебуває залишок амінокислоти, відмінної від І ух, Агу, 5ег, Тиг або
Тгр, наприклад Ре, ГІ еи, Меї, Аа, Маї, Су, Пе, Авп, Ні, Ар, Сім, Сп, Рго, Туг, або Сув.
В одному із втілень даного винаходу в першій області Ес у положенні 409 її амінокислотної послідовності перебуває залишок Аго, Аа, Ні або Су, а в другій області Ес () у положенні 368 перебуває залишок Гуз, Сп, Аа, Азр, Сім, Су, Ні, Пе, Азп, Агоу, Зег, ТНг, ма! або Ттгр; або (ії) у положенні 370 перебуває залишок Тгр; або (ії) у положенні 399 перебуває залишок Аа, Су, Пе, Гей, Меї, Ап, Зег, ТПг, Тгр, Ре, Ні,
І уз, Агд або Туг; або (ім) у положенні 366 перебуває залишок Аїа, Авр, Сім, Ні, Азп, Маї, СіІп, Рпе, Су, Пе, Гени,
Меї або Туг.
В одному із втілень даного винаходу в першій області Ес у положенні 409 її амінокислотної послідовності перебуває залишок Аго, а в другій області Ес
Зо (ї) у положенні 368 перебуває залишок Азр, Сім, Су, Азп, Аго, Зег, ТПг, Ма! або Тгр; або (ії) у положенні 370 перебуває залишок Тгр; або (ії) у положенні 399 перебуває залишок Ре, Нів, І уз, Агд або Туг; або (ім) у положенні 366 перебуває залишок Аа, Ар, Си, Ні, Азп, Маї, сп.
На додаток до зазначених вище амінокислотних замін у першій і другій областях Ес можуть бути заміни, делеції або інсерції в порівнянні з послідовностями Ес дикого типу.
В іншому втіленні даного винаходу зазначені перша й друга гілки Бар (або константні домени важких ланцюгів) які містять першу й другу області Ес, включають, за винятком зазначених мутацій, послідовність СНЗ, яку незалежно вибирають із наступного: (41 т(а)) (ЗЕО ІЮ МО:60), (41 т(ю) (ЗЕО ІО МО:61) і (до т(ах) (ЗЕО ІЮО МО:62).
В одному із втілень даного винаходу ні перша, ні друга із зазначених областей Ес не містить послідовність Суз-Рго-5ег-Суз у середній ("серцевинній") частині шарнірної ділянки.
В іншому втіленні даного винаходу й перша, і друга зазначені області Ес містять послідовність Суз-Рго-5ег-Суз у середній ("серцевинній") частині шарнірної ділянки.
В особливих конкретних втіленнях даного винаходу обидві гілки Раб або одна з них містять амінокислотну послідовність константної області важкого ланцюга, який незалежно вибирають із послідовностей 5ЕО ІЮ МО:63, 64, 65, 66,67, 68, 69, 70 і 71 (див. таблицю 1).
В одному із втілень даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень (а) перша антиген-єднальна ділянка містить ділянки СОКІ, СОК2 і
СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга (МН) з амінокислотними послідовностями,
БО представленими ЗЕО ІЮ МО:1, 2 і 3, відповідно, і діллнки СОКІ, СОМК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга (МІ) з амінокислотними послідовностями, представленими 5ЕО ІЮ
МО:4, послідовністю ТМ і послідовністю 5ЕО ІЮО МО:5, відповідно, і (б) друга антиген-єднальна ділянка, яка зв'язується з людським СО20, містить ділянку МН СОКІ з амінокислотною послідовністю, представленою ЗЕ ОО МО:32, ділянку МН СОК2 з амінокислотною послідовністю 5ЕО ОО МО:33, ділянку МН СОКЗ з амінокислотною послідовністю, представленою 5ЕСО ІО МО:34, ділянку МІ СОКІ! з амінокислотною послідовністю, представленою 5ЕСО 10 МО:35, ділянку МІ СОК2 з амінокислотною послідовністю, представленою послідовністю БАЗ, і ділянку М СОМКЗ з амінокислотною послідовністю, представленою 5ЕО ІЮ МО:З6, відповідно. бо В одному із втілень даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень (а) перша антиген-єднальна ділянка містить амінокислотну послідовність важкого ланцюга (УН), представлену 5ЕО ІЮО МО:6, і амінокислотну послідовність легкого ланцюга (М), представлену 5ЕО ІЮ МО:10, і (Б) друга антиген-єднальна ділянка містить амінокислотну послідовність важкого ланцюга (МН), представлену 5ЕБО ІЮ МО:27, і амінокислотну послідовність легкого ланцюга (МІ), представлену ЗЕО ІЮ МО:28.
В одному із втілень даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень перша антиген-єднальна ділянка є гілкою Раб, яка походить з Ідо1- пиСОЗ3-НІ1 1-РЕАЇГ,, а друга антиген-єднальна ділянка є гілкою Раб, яка походить з Ід01-708-
ЕЕАВ.
В одному із втілень даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень перша єднальна гілка є половинною молекулою антитіла (тобто містить один важкий ланцюг і один легкий), яка походить з Ідс1-пиСОЗ3-НІІ 1-ЕЕАЇ, а друга єднальна гілка є половинною молекулою антитіла, яка походить з Їде1-708-ЕЕАВ.
В одному із втілень даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень перша єднальна гілка є половинною молекулою антитіла, яка походить з ЇдДе1-пиСОЗ3-НТЇ 1-ЕЕАК, а друга єднальна гілка є половинною молекулою антитіла, яка походить з ЇдДо1-708-ЕЕАЇ.
Методи одержання біспецифічних антитіл
Для одержання біспецифічних антитіл за даним винаходом можна застосовувати такі традиційні методи, як метод гібридних гібридом і метод хімічної кон'югації (Магміп апа 2йи (2005) Асіа РІаптасої біп 26649). У результаті того, що в клітині-хазяїні відбувається коекспресія двох антитіл, які складаються із різних важких і легких ланцюгів, виходить суміш, яка містить крім бажаних біспецифічних антитіл можливі антитільні продукти; із цієї суміші потрібні біспецифічні антитіла виділяють за допомогою, наприклад, афінної хроматографії або подібних методів.
Для одержання біспецифічних антитіл за даним винаходом корисні також підходи, які сприяють формуванню функціональних біспецифічних продуктів з використанням коекспресії різних антитільних конструкцій, наприклад метод, описаний у роботі І іпапоїег еї аї. (1995 ..
Ітітипої. 155:219). При використанні злиття щурячих і мишачих гібридом, які продукують різні
Зо антитіла, число гетеродимерних білків обмежене, оскільки має місце краще спарювання важких і легких ланцюгів через видові обмеження. Інший підхід, що сприяє кращому утворенню гетеродимерів у порівнянні з гомодимерами, полягає в застосуванні концепції "виступи в западини" ("Кпор-іпю-ПпоїЇе"), згідно з якою в перший поліпептид важкого ланцюга вводиться виступаюча структура, а в другому поліпептиді важкого ланцюга створюється відповідне поглиблення, так що при взаємодії двох важких ланцюгів занурення зазначеного виступу в цю западину при взаємодії двох важких ланцюгів дає перевагу утворенню гетеродимерів і перешкоджає утворенню гомодимерів. Виступаючі структури створюються шляхом заміни амінокислотних залишків з необ'ємними бічними ланцюгами, що розташовуються на поверхні взаємодії важких ланцюгів у першому поліпептиді, на амінокислотні залишки з більшими бічними ланцюгами. На поверхні взаємодії другого поліпептиду створюється відповідна "западина" у точності або майже в точності однакових розмірів з виступом шляхом заміни амінокислотних залишків з об'ємними бічними ланцюгами на менші (див. патент США Мо 5,731,168). У Європейському патенті Мо 1870459 (компанія Спидаї) і в публікації М/ЛО 2009089004 (компанія Атдеп) описуються інші підходи, які сприяють утворенню гетеродимерів при коекспресії різних антитільних доменів у клітинах-хазяїнах. Ці методи включають заміну одного або більше амінокислотних залишків на поверхні взаємодії в обох доменах СНЗ на амінокислотні залишки, що несуть електричний заряд, так що утворення гомодимерів електростатично невигідне, а утворенню гетеродимерів виникаючі електростатичні сили, навпаки, сприяють. У публікації М/О 2007110205 (компанія МегсК) описується ще один підхід, у якому використовується те, що відмінності між доменами СНЗ в ІдА і в ЇдО можуть сприяти гетеродимеризації.
Інший метод одержання біспецифічних антитіл іп міго описаний у публікації МО 2008119353 (компанія Септарб); у ньому біспецифічне антитіло утворюється шляхом обміну фрагмента Бар або половинної антитільної молекули (обмін важкого ланцюга й приєднаного легкого ланцюга) між двома моноспецифічними 19дс4 або антитілами, подібними /дс4, при інкубації в відновлюючи умовах. У результаті виходить біспецифічне антитіло із двома гілками ЕаБ, які містять різні амінокислотні послідовності.
Методи, переважні для одержання біспецифічних антитіл, спрямованих проти СОЗ і СО20, за даним винаходом, включають методи, які описані в публікаціях УМО 2011131746 і УМО бо 13060867 (компанія Септарб) і включають наступні етапи:
а) одержання першого антитіла, яке містить область Ес, яка містить перший домен СНЗ; р) одержання другого антитіла, яке містить область Ес, яка містить другий домен СНЗ, причому перше антитіло спрямоване проти СОЗ, а друге - проти СО20 або навпаки; причому амінокислотні послідовності зазначених першого й другого доменів СНЗ відрізняються і є такими, що гетеродимерна взаємодія між зазначеними першим і другим доменами СНЗ сильніша, ніж кожна з гомодимерних взаємодій зазначених першого й другого доменів СНЗ; с) інкубування зазначеного першого антитіла разом із зазначеним другим антитілом в відновлюючи умовах; і а) одержання зазначеного біспецифічного антитіла, спрямованого проти СОЗ і СО20.
В одному із втілень даного винаходу зазначені перше й друге антитіла інкубують разом у відновлюючих умовах, достатніх для того, щоб залишки цистеїна в шарнірній ділянці перетерпіли ізомеризацію дисульфідного зв'язку, і при цьому взаємодія між зазначеними першим і другим антитілами в гетеродимерному антитілі, що утворюється така, що через 24 години при концентрації глутатіона (З5Н) 0,5 мМ і температурі 37 "С не відбувається обміну фрагментів Раб.
Не вдаючись у теоретичні міркування, відзначимо, що на етапі с) у важких ланцюгах дисульфідні зв'язки в шарнірній ділянці відновлюються й тепер залишки цистеїна здатні утворювати дисульфідний зв'язок між важкими ланцюгами із залишками цистеїна іншої вихідної антитільної молекули (початково з іншою специфічністю). В одному із втілень цього методу, відновлюючі умови на етапі с) включають додавання відновлюючого агента, наприклад відновлюючого агента, якого вибирають із групи, яка складається з 2-меркаптоетиламіна (2-
МЕА), дитіотреїтола (ОТТ), дитіоеритритола (ОТЕ), глутатіона, трис(2-карбоксиетилуфосфіну (ТСЕР), І-цистеїна й бета-меркаптоетанола; переважно відновлюючий агент вибирають із групи, яка складається з 2-меркаптоетиламіна, дитіотреїтола й трис(2-карбоксиетилуфосфіну. В іншому кращому втіленні цього методу етап с) включає зміну умов назад на не відновлюючі або менш відновлюючі, наприклад шляхом видалення відновлюючого агента, наприклад шляхом знесолення.
Для здійснення цього методу можна використовувати будь-які з описаних вище антитіл
Зо проти СОЗ і СО20, включаючи перше й друге антитіла проти СОЗ і проти СО20, відповідно, що містять першу й/або другу область Ес. Приклади таких першої й другої областей Ес, у тому числі комбінації таких першої й другої областей Ес, включають будь-які з описаних вище. В одному конкретному втіленні даного винаходу перше й друге антитіла проти СОЗ і СО20, відповідно, можна вибрати таким чином, щоб одержати біспецифічні антитіла, описані в даному документі.
В одному із втілень цього методу зазначені перше й/або друге антитіла є повнорозмірними.
Області Ес першого й другого антитіл можуть бути будь-якого ізотипа, включаючи (але не обмежуючись перерахованим тут) Ідс1, Ідс2, Ід3 або Ідс4. В одному із втілень цього методу області Ес і першого, і другого антитіл відносяться до ізотипу (ДС1. В іншому втіленні цього методу одна з областей Ес зазначених антитіл відноситься до ізотипу ІДС, а інша - до ізотипу
Ідс4. В останньому втіленні цього методу одержуване біспецифічне антитіло містить область
Ес ізотипа Ідс1 і область Ес ізотипа Ідса4 і тому може мати цікаві проміжні властивості відносно активації ефекторних функцій.
В іншому втіленні цього методу один з вихідних білків-антитіл сконструйований таким чином, що він не зв'язує протеїн А, що дозволяє відокремити гетеродимерний білок від зазначеного гомодимерного, пропускаючи продукт через стовпчик із протеїном А.
Як говорилося вище, амінокислотні послідовності першого й другого доменів СНЗ гомодимерного вихідного антитіла різні й притому такі, що гетеродимерна взаємодія зазначених першого й другого доменів СНЗ сильніша, ніж кожна з гомодимерних взаємодій зазначених першого й другого доменів СНЗ. Докладніше про ці взаємодії й про їхнє досягнення говориться в публікаціях МО 2011131746 і МО 2013060867 (компанія Сепітаб), які повністю включаються в даний документ шляхом відсилання.
Зокрема, можна з високим виходом одержати стабільні біспецифічні антитіла проти СОЗ і
СО20 застосовуючи описаний вище метод за даним винаходом з використанням двох гомодимерних вихідних антитіл, які здатні зв'язуватися з СОЗ і СО20, відповідно, і в яких є лише декілька відносно консервативних асиметричних мутацій у доменах СНЗ. У цьому випадку термін "асиметричні" стосовно до мутацій означає, що в амінокислотних послідовностях зазначених першого й другого СНЗ є амінокислотні заміни в не однакових положеннях.
Біспецифічні антитіла за даним винаходом можна також одержати шляхом коекспресії в бо одній клітині конструкцій, що кодують перший і другий поліпептиди. Таким чином, в іншому своєму аспекті даний винахід відноситься до способу одержання біспецифічних антитіл, причому зазначений спосіб включає наступні етапи: а) одержання першої полінуклеотидної конструкції, яка кодує перший поліпептид, що містить першу область Ес і першу антиген-єднальну ділянку важкого ланцюга першого антитіла, причому зазначена перша область Ес містить перший домен СНЗ; р) одержання другої полінуклеотидної конструкції, яка кодує другий поліпептид, що містить другу область Ес і другу антиген-єднальну ділянку важкого ланцюга другого антитіла, причому зазначена друга область Ес містить другий домен СНЗ; при цьому амінокислотні послідовності зазначених першого й другого доменів СНЗ відрізняються і є такими, що гетеродимерна взаємодія між зазначеними першим і другим доменами СНЗ сильніша, ніж кожна з гомодимерних взаємодій зазначених першого й другого доменів СНЗ; а також в амінокислотній послідовності зазначеного першого гомодимерного білка в положенні 409 перебуває залишок амінокислоти, відмінної від ух, Ге або Меї, а в амінокислотній послідовності зазначеного другого гомодимерного білка є амінокислотні заміни в положеннях, обраних із групи, яка складається з 366-го, 368-го, 370-го, 399-го, 405-го й 407-го положень; за необхідності зазначені перша й друга нуклеотидні конструкції кодують амінокислотні послідовності легких ланцюгів зазначених першого й другого антитіл; с) коекспресію зазначених першої й другої полінуклеотидних конструкцій у клітинах-хазяїнах і а) одержання зазначеного гетеродимерного білка з культури цих клітин.
Таким чином, даний винахід відноситься також до рекомбінантних еукаріотичних або прокаріотичних клітин-хазяїв, які продукують біспецифічні антитіла за даним винаходом.
В одному із втілень даного винаходу пропоновані біспецифічні антитіла одержують яким- небудь зі способів за даним винаходом.
Придатні для одержання антитіл експресійні вектори, які включають промотори, енхансери й ін., і придатні для цього клітини-хазяї добре відомі в даній області техніки. Приклади таких клітин-хазяїв включають дріжджові й бактеріальні клітини, а також клітини ссавців, наприклад клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО) або лінія клітин, отримана з ембріональних нирок
Зо людини (НЕК).
В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла за будь-яким з описаних у даному документі втілень містять перший і другий домени СНЗ, які (за винятком мутацій, що обговорювалися) містять амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:60 (41 т(а)).
В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла за будь-яким з описаних у даному документі втілень містять першу й другу області Ес, з яких жодна не містить послідовність Суз-Рго-5ег-Суз у шарнірній ділянці.
В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла за будь-яким з описаних у даному документі втілень містять першу й другу області Ес, які обидві містять послідовність
Сув-Рго-5ег-Сух у шарнірній ділянці.
В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла за будь-яким з описаних у даному документі втілень містять першу й другу області Ес, які є областями Ес людського антитіла.
В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла за будь-яким з описаних у даному документі втілень містять першу й другу області Ес, які (за винятком мутацій, що обговорювалися) містять амінокислотну послідовність, незалежно обрану із групи, яка складається з послідовностей 5ЕО ІЮ МО:63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 і 71.
В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла за будь-яким з описаних у даному документі втілень містять першу й другу області Ес, у яких перша і друга антиген- єднальні ділянки містять амінокислотні послідовності варіабельних областей важких ланцюгів
БО (МН) людських антитіл і за необхідності амінокислотні послідовності варіабельних областей легких ланцюгів (МІ) людських антитіл.
В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла за будь-яким з описаних у даному документі втілень містять першу й другу області Ес, у яких перша і друга антиген- єднальні ділянки походять із важких ланцюгів антитіл.
В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла за будь-яким з описаних у даному документі втілень містять першу й другу області Ес, у яких перша і друга антиген- єднальні ділянки містять перший й другий легкі ланцюги.
В іншому втіленні даного винаходу спосіб коекспресії за даним винаходом включає будь-яку з інших ознак, наведених вище в описі способу іп міїго. 60 В іншому своєму аспекті даний винахід відноситься до експресійних векторів, які містять першу й другу полінуклеотидні конструкції, згадані вище в даному документі. В іншому втіленні даного винаходу використовуваний експресійний вектор також містить нуклеотидну послідовність, яка кодує константну область легкого ланцюга, важкого ланцюга або й легкого, і важкого ланцюгів антитіла, наприклад людського антитіла.
Експресійним вектором за даним винаходом може бути будь-який придатний вектор, включаючи хромосомні, нехромосомні або синтетичні полінуклеотиди (нуклеотидні послідовності, які включають потрібний набір регуляторних елементів, необхідних для експресії). Приклади таких векторів включають похідні вірусу 5М40, бактеріальні плазміди, фагову ДНК, бакуловіруси, дріжджові плазміди, вектори, отримані з комбінації плазмід і фагової
ДНК, вірусні полінуклеотиди (РНК або ДНК). В одному із втілень даного винаходу полінуклеотид, який кодує антитіло проти СО20 або СОЗ, утримується в плазмідному векторі (гола" ДНК або
РНК), який включає, наприклад лінійний експресійний елемент (як описано, наприклад, у роботі
Зуке5 апа Уоппвіоп, Маї Віоїесп 17, 355- 59 (1997)) векторами є наночастинки з компактизованою ДНК або РНК (описані, наприклад, у патенті США Мо 6,077, 835 і/або в публікації МО 00/70087), плазмідні вектори, наприклад рВК322, рОсС 19/18 або рос 118/119, мінімізовані вектори МІОСЕФ (описані, наприклад, у роботі Зспакому»кі еї аї., Мої Тег З, 793-800 (2001)) або осаджувані полінуклеотидні конструкції, які наприклад осаджуються фосфатом кальцію (описані, наприклад, у публікації МЛО 200046147, і в роботах Вепмепізіу апа Кезпеї,
РМАБ5 БА 83, 9551- 55 (1986), М/ідіег єї аї., Сеї! 14, 725 (1978) і Согаго апа Реагхоп, Зотаїс СеїЇ
Сепеїіс5 7, 603 (1981)). Такі полінуклеотидні вектори і їх використання добре відомі в даній області техніки (див., наприклад, патенти США МоМо 5,589,466 і 5,973,972).
В одному із втілень даного винаходу використовуваний вектор придатний для експресії антитіл проти СО20 і/або СОЗ у бактеріальних клітинах. Приклади таких експресійних векторів включають Віпезсгірі (Зігаїадепе), вектори рІМ (див. Мап НеекКе 85 Зспивіег, 9. ВіоІЇ. Спет. 264, 5503- 5509 (1989), вектори рЕТ (компанія Момадеп, Мадитсон, шт. Вісконсин, США) і т. п.
Також або альтернативно за даним винаходом можна використовувати вектори, придатні для експресії в дріжджовій системі. Можна використовувати будь-який вектор, що підходить для експресії в дріжджовій системі. Придатні для даного винаходу вектори включають, наприклад, вектори, які містять конститутивні або індуковані промотори, наприклад промотор гена альфа-
Зо фактора, промотор гена алкогольоксидази й вектор рон (див. їхній огляд у роботах ЕР. А!йзиреї еї аї., ед. Сцтепі Ргоїосої!в5 іп Моіесціаг Віоіоду, Стеепе Рибіїзпіпа апа УМіеу Іпіегзсіепсе Мем/ МоїКк (1987), і Огапі єї аї.,, Меїпоавз іп Епгутої 153, 516- 544 (1987)).
Також або альтернативно за даним винаходом можна використовувати вектори, придатні для експресії в клітинах ссавців, наприклад вектор, який містить ген глутамінсинтетази, яка служить селективним маркером; такі вектори описані в роботі Веббіпдіоп (1992) Віотесппоїоду (МУ) 10:169-175.
Полінуклеотид і/або вектор може також містити нуклеотидну послідовність, яка кодує амінокислотну послідовність, що визначає секрецію/локалізацію, яка направляє поліпептид, що наприклад перебуває в процесі утворення, у периплазматичний простір або із клітини в культуральне середовище. Такі послідовності відомі в даній області техніки; вони включають лідерні пептиди секретованих білків або сигнальні пептиди білків, що транспортуються.
Експресійний вектор за даним винаходом може містити або бути асоційованим з будь-яким придатним промотором, енхансером і іншими елементами, які сприяють експресії. Приклади таких елементів включають сильні промотори (наприклад, промотор/енхансер негайних ранніх генів цитомегаловіруса людини (СММ ІЕ), а також промотори КМ, 5М40, 51 3-3, ММТМ і НІМ
ГТК), послідовності - сигнали термінації й поліаденілювання, оріджини реплікації для плазмідних продуктів у клітинах Е. соїї, гени стійкості до антибіотиків у якості селективних маркерів і/або полілінкнери для клонуючих векторів. Полінуклеотиди можуть також містити індуковані промотори на противагу конститутивним промоторам (як в СММ ІЕЕ).
В одному із втілень даного винаходу експресійний вектор, який кодує антитіло проти СО20 іМабо СОЗ, може бути введений і/або доставлений у клітину-хазяїн або тварина-хазяїн за допомогою вірусного вектора.
В іншому своєму аспекті даний винахід відноситься до клітин-хазяїв, які несуть першу й другу полінуклеотидні конструкції, зазначені вище в даному документі.
Таким чином, даний винахід також відноситься до рекомбінантних еукаріотичних або прокаріотичних клітин-хазяїв, які продукують біспецифічні антитіла за даним винаходом, наприклад до трансфектом.
Перше антитіло, специфічне до СО20, може експресуватися в рекомбінантних еукаріотичних або прокаріотичних клітинах-хазяїнах, наприклад у трансфектомах, які продукують антитіла за 60 даним винаходом, описані в даному документі, або біспецифічні антитіла за даним винаходом,
описані в даному документі. Аналогічно, антитіло, специфічне до СОЗ, може експресуватися в рекомбінантних еукаріотичних або прокаріотичних клітинах-хазяїнах, наприклад "у трансфектомах, які продукують антитіла за даним винаходом, описані в даному документі, або біспецифічні антитіла за даним винаходом, описані в даному документі.
Приклади клітин-хазяїв включають клітини дріжджів, бактерій, рослин і ссавців, наприклад
СНО, СНО-5, НЕК, НЕК293, НЕК-293Е, Ехрі293Е, РЕК.Сб або М50 або лімфоцитарні клітини.
Наприклад, в одному із втілень даного винаходу клітина-хазяїн може містити першу й другу полінуклеотидні конструкції, стабільно інтегровані в клітинний геном. В іншому втіленні даного винаходу пропонуються клітини-хазяї, які містять не інтегрований у клітинний геном полінуклеотид, наприклад плазміду, косміду, фагміду або лінійний експресійний елемент, який включає першу й другу полінуклеотидні конструкції, що обговорювалися вище.
В іншому своєму аспекті даний винахід відноситься до трансгенних тварин (не до людини) або рослин, які несуть полінуклеотиди, що кодують один або два набори важких і легких ланцюгів людських антитіл, і в такої тварини або рослини утворюються біспецифічні антитіла за даним винаходом.
В іншому своєму аспекті даний винахід відноситься до гібридом, які продукують антитіла для використання в біспецифічних антитілах за даним винаходом, описаних у даному документі. В іншому своєму аспекті даний винахід відноситься до трансгенних тварин (не до людини) або рослин, які несуть полінуклеотиди, що кодують один або два набори важких і легких ланцюгів людських антитіл, і в такої тварини або рослини утворюються антитіла для використання в біспецифічних антитілах або біспецифічні антитіла за даним винаходом.
В одному зі своїх аспектів даний винахід відноситься до полінуклеотидних конструкцій, які кодують одну або більше амінокислотних послідовностей, представлених у таблиці 1.
В одному зі своїх аспектів даний винахід відноситься до експресійного вектора, який містить () нуклеотидну послідовність, яка кодує амінокислотну послідовність важкого ланцюга першої єднальної гілки за будь-яким з описаних у даному документі втілень даного винаходу; (ї) нуклеотидну послідовність, яка кодує амінокислотну послідовність легкого ланцюга першої єднальної гілки за будь-яким з описаних у даному документі втілень даного винаходу; (ії) нуклеотидну послідовність, яка кодує амінокислотну послідовність важкого ланцюга другої єднальної гілки за будь-яким з описаних у даному документі втілень даного винаходу; (м) нуклеотидну послідовність, яка кодує амінокислотну послідовність легкого ланцюга другої єднальної гілки за будь-яким з описаних у даному документі втілень даного винаходу; (м) полінуклеотид, представлений у пункті (і), і полінуклеотид, представлений у пункті (Ії); (м) полінуклеотид, представлений у пункті (ії), і полінуклеотид, представлений у пункті (ім). (мії) полінуклеотид, представлений у пунктах (Її), (ії), (ії) ї (ім).
В одному зі своїх аспектів даний винахід відноситься до способу одержання біспецифічних антитіл за будь-яким з описаних у даному документі його втілень, і цей спосіб включає наступні етапи а) культивування клітин-хазяїв, описаних у даному документі, які несуть експресійний вектор, описаний у даному документі, і в яких експресується перше антитіло, описане в даному документі, і виділення/очищення зазначеного антитіла з культурального середовища;
Б) культивування клітин-хазяїв, описаних у даному документі, які несуть експресійний вектор, описаний у даному документі, і в яких експресується друге антитіло, описане в даному документі, і виділення/очищення зазначеного антитіла з культурального середовища; с) інкубація зазначеного першого антитіла разом із зазначеним другим антитілом у відновлюючих умовах достатніх для того, щоб залишки цистеїна в шарнірній ділянці перетерпіли ізомеризацію дисульфідного зв'язку, і а) одержання зазначеного біспецифічного антитіла.
В одному зі своїх аспектів даний винахід відноситься до клітин-хазяїв, які несуть експресійний вектор, описаний вище. В одному із втілень даного винаходу клітини-хазяї є рекомбінантними еукаріотичними або прокаріотичними клітинами або рекомбінантними клітинами мікроорганізмів.
Області Ес
В одному з варіантів даного винаходу пропоновані біспецифічні антитіла проти СОЗ ії СО20 також містять першу й другу області Ес, які можуть утримуватися в першій і другій галузях Раб, що відповідно також містять першу і другу антиген-єднальні ділянки, описані вище (або навпаки).
В іншому варіанті даного винаходу пропоновані біспецифічні антитіла проти СОЗ і СО20 містять першу й другу гілки Раб, які містять першу і другу антиген-єднальні ділянки, відповідно. бо Біспецифічні антитіла проти СОЗ ії СО20 за даним винаходом також містять першу й другу області Ес. В одному з варіантів даного винаходу пропоноване біспецифічне антитіло проти
СОзЗ ї С020 містить першу гілку Гар, яка включає першу антиген-єднальну ділянку й першу область Ес, і другу гілку баб, яка включає другу антиген-єднальну ділянку й другу область Ес.
В іншому варіанті даного винаходу пропоновані біспецифічні антитіла проти СОЗ і СО20 містять другу гілку Раб, яка містить другу антиген-єднальну ділянку й першу область Ес, і першу гілку Раф, яка містить першу антиген-єднальну ділянку й другу область Ес.
Кожна з першої й другої областей Ес може бути будь-якого з ізотипів, які включають (не обмежуючись перерахованим тут) Ід, Ідс2, доз і дося, і в кожній із цих областей можуть бути одна або більше мутацій або модифікацій. В одному із втілень даного винаходу обидві - і перша, і друга - області Ес відносяться до ізотипу Ід04 або похідного від нього, за необхідності з однією або більше мутаціями або модифікаціями. В одному із втілень даного винаходу обидві - і перша, і друга - області Ес відносяться до ізотипу ЇДО1 або похідного від нього, за необхідності з однією або більше мутаціями або модифікаціями. В іншому втіленні даного винаходу одна із зазначених областей Ес відноситься до ізотипу ДС, а інша - до ізотипу Ідс4, або до відповідних похідних цих ізотипів за необхідності з однією або більше мутаціями або модифікаціями.
В одному із втілень даного винаходу в одній або в обох областях Ес є мутація, яка ліквідує сайт приєднання вуглеводу до залишку аспарагіна, або якось інакше змінює властивості імуноглобуліну у відношенні глікозилювання. Наприклад, в області Ес ІдсС1 можна зробити мутацію М2970), яка ліквідує сайт глікозилювання за участю залишку аспарагіна. Відповідно в одному з конкретних втілень даного винаходу одна або обидві області Ес містять послідовність, властиву ЇДС1 дикого типу з мутацією М2970О (5ЕО ІЮО МО:66, див. таблицю 1).
В одному із втілень даного винаходу в однієї або в обох областей Ес недостатня ефекторна функція. Наприклад, одна або обидві області Ес можуть відноситися до ізотипу 954 або до іншого ізотипу, наприклад ІдсС1, Ід2 або Ідс3, з такою мутацією, що ослаблена або навіть відсутня здатність опосередковувати ефекторні функції, наприклад антитілозалежну клітинноопосередковану цитотоксичність (АЮСС). Такі мутації описані, наприклад у роботах раІгАсдца МУ. Р. еї аї., У. Іттипої. 177 (2):1129-1138 (2006) і Нелагей М., У.Міго!.; 75 (2493:12161- 12168 (2001). В одному із втілень даного винаходу одна або обидві області Ес містять
Зо послідовність ЇДО1 дикого типу (ЗЕО ІЮ МО:63, див. таблицю 1).
У біспецифічних антитілах за даним винаходом область Ес може бути модифікована. За наявності такої модифікації біспецифічне антитіло стає інертним, тобто таким, що не активується. Терміни "інертний"/"інертність" або "що не активується" у даному документі відносяться до області Ес, щонайменше не здатної зв'язуватися ні з яким Есу-рецептором клітинної поверхні, викликати перехресне зв'язування з Ес-рецептором при участі Ес або викликати перехресне зв'язування з антигеном-мішенню через дві області Ес індивідуальних антитіл, або не здатної зв'язуватися з фактором комплементу С14. Інертність області Ес гуманізованого або химерного антитіла проти СОЗ переважно перевірялася з використанням антитіло в моноспецифічній формі.
Можливі кілька варіантів для того, щоб зробити область Ес неактивною для взаємодії з Есу- рецепторами й фактором С1д, з метою розробки терапевтичних антитіл. Приклади таких варіантів описані в даному документі.
Таким чином, в одному із втілень даного винаходу пропоновані антитіла містять модифіковану область Ес, причому модифікація така, що ці антитіла викликають менш інтенсивну проліферацію Т-лімфоцитів, опосередковувану Ес, ніж антитіла дикого типу, а саме слабкіше щонайменше на 50 95, щонайменше на 60 95, щонайменше на 70 95, щонайменше на 80 956, щонайменше на 90 95, щонайменше на 99 95 або 100 95 при визначенні проліферації Т- лімфоцитів шляхом функціонального аналізу з використанням мононуклеарів периферичної крові (РВМО).
Таким чином, в області Ес можна модифікувати амінокислотні залишки, які відіграють важливу роль у взаємодіях антитіла з фактором комплементу С14 і Есу-рецепторами. Приклади амінокислотних залишків, які підлягають модифікації, включають 1234, 1235 і РЗ331. Їхні комбінації, наприклад 1234Р//235Е/Р3315, можуть призвести до глибокого зниження зв'язування з людськими СО64, СОЗ2А, СО16 і С14.
Таким чином, в одному із втілень даного винаходу амінокислотний залишок щонайменше в одному положенні поліпептидного ланцюга, що відповідає І 234, І 235 і РЗ31, можебути А, А і 5, відповідно (Хи еї аї., 2000, СеїЇ Іттипої. 200 (1):16-26; Одапезуап еї аї., 2008, Асіа Сгувзі. (064):700-4). До порушення взаємодії області Ес з Есу-рецепторами й фактором С14 можуть приводити також амінокислотні заміни 234 і 1235Е (Сапіпєїй еї аї.,, 1991, 9. Ехр.Меа. 60 (173):1483-91; Оипсап еї а!., 1988, Маїшге (332):738-40). Таким чином, в одному із втілень даного винаходу амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають 1234 і 1235, можуть бути представлені Е ї Е, відповідно. Амінокислотна заміна Ю0265А може приводити до зниження зв'язування з усіма Есу-рецепторами й запобігати антитілозалежній клітинноопосередкованій цитотоксичності (АОСС). (Зпієїд5 еї аї., 2001, 9. Віої. Спет. (276):6591-604). Таким чином, в одному із втілень даного винаходу амінокислотний залишок у положенні, що відповідає 0265, може бути представлений А. Зв'язування з фактором комплементу С14 відсутнє при мутаціях у положеннях 0270, К322, РЗ329 і РЗ31. Заміни в цих положеннях - 0270А або КЗ322А, або РЗ29А, або РЗЗ1А можуть знижувати активність антитіла у відношенні цитотоксичності, залежної від комплементу (СОС) (Ідизодіє Е.Б., еї аї., 2000, 9. Іттипої. 164: 4178-84). Таким чином, в одному із втілень даного винаходу амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають 0270, КЗ322,
РЗ329 і Р331, можуть бути представлені А, А, А і А, відповідно.
Інший підхід для мінімізації взаємодії між областю Ес, з одного боку, і Есу-рецепторами й фактором С14, з іншого боку, полягає в ліквідації сайту глікозилювання в молекулі антитіла.
Заміна в положенні М297 на, наприклад, СО), А або Е знищує сайт глікозилювання, який критично важливий для взаємодії області Ес імуноглобулінів С з їхніми гамма-рецепторами. Таким чином, в одному із втілень даного винаходу амінокислотний залишок у положенні, що відповідає М297, може бути представлений с, С), А або Е (І еартап еї аї., 2013, Мабв»; 5(6):896-903). Звести до мінімуму взаємодію між областю Ес і Есу-рецепторами дозволяють також наступні мутації:
Р2З8А, АЗ27О, РЗ29А або Е23ЗР//234У/І 235А/5236аеї (Зпієїа5 еї аї., 2001, 9. Віої. Спет. (276):6591-604).
Інший підхід заснований на тому, що людські антитіла підкласів Ідса2 і І(д54 від природи дуже слабко взаємодіють із фактором комплементу С1а4 і Есу-рецепторами, хоча повідомлялося про їхню взаємодію з Есу-рецепторами (Раїтеп еї а!., 1992, у. Сііп. Іпмеві. 90: 1537-1546; Вгинпз еї аї., 2009, Віоса 113: 3716-3725). В антитілах обох зазначених ізотипів можна зробити мутації, які ліквідують ці залишкові взаємодії, у результаті чого зменшуються небажані побічні ефекти, обумовлені зв'язуванням області Ес з її рецепторами. У випадку Ідс2 цими мутаціями є І 234А ї 05237А, а у випадку ІдсС4-1235Е. Таким чином, в одному із втілень даного винаходу амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають 1234 і (3237 важкого ланцюга людського 3092, можуть бути представлені А і А, відповідно. В одному із втілень даного винаходу амінокислотний залишок у положенні, що відповідає 235 важкого ланцюга людського Ід, може бути представлений Е.
Інші підходи, що також дозволяють звести до мінімуму взаємодію антитіл Іде2 з фактором комплементу Ст14 і Есу-рецепторами, включають методи, описані в публікації ЛО 2011066501 і в роботі іде, 5., еї аІ., 2010, Ргоївіп 5сіепсе (19):753-62.
Для взаємодії з фактором комплементу С14 і Есу-рецепторами важлива також шарнірна ділянка молекули антитіла (Вгекке еї а!., 2006, 9. Іттипої. 177:1129-1138; СаІгасдца М/.Р., еї аї., 2006, У. Іттипої. 177:1129-1138). Відповідно, мутації в цій ділянці або її делеція можуть впливати на ефекторні функції антитіл.
Термін "перехресне зв'язування" у даному документі відноситься до непрямого - через область Ес антитіла - зв'язування гілки (однієї або обох, моновалентно або бівалентно) Раб, що зв'язала антиген-мішень, з поверхнею клітини, яка несе рецептор для області Ес. Таким чином, антитіло, яке зв'язало "свій" антиген-мішень на клітині, яка несе цей антиген, може стати містком (тобто перехресно зв'язати) між клітиною, яка несе антиген-мішень, і клітиною, у якій експресується рецептор для області Ес.
Термін "неспецифічна цитотоксичність/неспецифічне знищення клітин" у даному документі відноситься до ліквідації клітин за рахунок цитотоксичної функції Т-лімфоцитів або інших ефекторних клітин за допомогою активації зазначених клітин, яка не залежить від пухлинного антигену-мішені. Таким чином, неспецифічна цитотоксичність означає, що ефекторні клітини, наприклад цитотоксичні лімфоцити, активуються й викликають загибель клітин не залежно від зв'язування з пухлиною-мішенню, наприклад шляхом зв'язування антитіл з СОЗ їі Есу- рецепторами.
Таким чином, в одному із втілень даного винаходу пропоновані біспецифічні антитіла містять перший й другий імуноглобулінові важкі ланцюги, причому принаймні в одному із зазначених першого й другого імуноглобулінових важких ланцюгів один або більше амінокислотних залишків у положеннях, що відповідають 1 234, 1235, 0265, М297 і РЗЗ1 важкого ланцюга людського Ідс1, відмінний від залишків І, І, О, М і Р, відповідно.
В одному із втілень даного винаходу й у першому, і в другому важких ланцюгах один або більше амінокислотних залишків, що відповідають 1234, 1235, 0265, М297 і РЗ31 важкого ланцюга людського Ідс1, відмінний від залишків І, І, О, М і Р, відповідно. бо В іншому втіленні даного винаходу щонайменше в однго із двох (першого й другого) важких ланцюгів один або більше амінокислотних залишків, що відповідають 1 234, І 235 і 0265 важкого ланцюга людського ІдДС1, відмінний від залишків Г, Ї. і О, відповідно, а амінокислотні залишки, що відповідають М297 і РЗЗ31 важкого ланцюга людського Ідс1, представлені М і Р, відповідно.
Формулювання "амінокислотний залишок, відповідний до положень" у даному документі відноситься до порядкового номера положення амінокислотного залишку у важкому ланцюзі людського ІдО1. Відповідні положення амінокислотних залишків в інших імуноглобулінах можна визначити шляхом вирівнювання з людським ІдДе1. Якщо не зазначене інше або якщо це не суперечить контексту, у даному документі для амінокислотних послідовностей константних областей використовується нумерація амінокислотних залишків згідно з індексом БО (як описано в роботі Кабваї, Е.А. еї а!., 1991, бБедиепсез ої ргоїеіп5 ої іттипоїіодісаї! іпіегев5і. П'яте видання - Міністерство охорони здоров'я й соціального забезпечення США, публікація Мо 91- 3242 Національних інститутів здоров'я (МІН), стор. 662, 680, 689). Таким чином, амінокислотний залишок або ділянка (відрізок) в одній амінокислотній послідовності, "відповідний" положенню амінокислотного залишку або ділянки (відрізка) іншої амінокислотної послідовності, - це залишок/ділянка, яка збігається (стоїть в одній колонці) з амінокислотним залишком/ділянкою при вирівнюванні цих двох послідовностей з використанням стандартних алгоритмів і програм, наприклад АГІСМ, Сіивіам/ або їм подібних, як правило, при параметрах за замовчуванням, і характеризується щонайменше 50 95-вою, щонайменше 80 95-вою, щонайменше 90 95-вою або щонайменше 95 95-вою ідентичністю важкого ланцюга людського ІдО1. У даній області техніки вважається загальновідомим, як вирівнювати амінокислотні послідовності або їх ділянки й у такий спосіб визначати відповідні положення амінокислотних залишків.
У контексті даного винаходу амінокислотні залишки визначають, як описано вище.
Формулювання "амінокислотний залишок відмінний/не є" стосовно до амінокислотних залишків важкого ланцюга слід розуміти так, що даний амінокислотний залишок може бути будь-яким за винятком конкретно зазначеного. Наприклад, якщо сказано, що амінокислотний залишок у положенні, що відповідає І 234 важкого ланцюга людського ІЇде1 відмінний від І /не є
Ї, то це означає, що даний амінокислотний залишок може бути залишком будь-якої із природних або не природних амінокислот, але не І.
В одному із втілень даного винаходу щонайменше в одному із двох зазначених (першому й другому) важких ланцюгів амінокислотний залишок у положенні, що відповідає 0265 важкого ланцюга людського Ідс1 відмінний від О.
В одному із втілень даного винаходу щонайменше в одному із двох зазначених (першому й другому) важких ланцюгів амінокислотний залишок у положенні, що відповідає 0265 важкого ланцюга людського Ідс1, відмінний від О, і амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають М297 і РЗЗ31 важкого ланцюга людського Іде, відмінні від М і Р, відповідно.
В одному із втілень даного винаходу щонайменше в одному із двох зазначених (першому й другому) важких ланцюгів амінокислотний залишок у положенні, що відповідає 0265 важкого ланцюга людського ІдДС1, є залишком гідрофобної або полярної амінокислоти.
Термін "гідрофобний" у даному документі стосовно до амінокислотного залишку відноситься до залишків амінокислот, обраних із групи, яка складаєтьсяз А, С, Е, с, Н.І, ЇЇ, М, КК, Т, М, М/ і У.
Таким чином, в одному із втілень даного винаходу щонайменше в одному із двох зазначених (першому й другому) важких ланцюгів амінокислотний залишок у положенні, що відповідає 0265 важкого ланцюга людського ІдсС1, є залишком амінокислоти, яку вибирають із групи, яка складаєтьсязА, С, Е.О, Н.І, ГГ, М, ЕЙ, Т, М, Мі М.
Термін "полярний" у даному документі стосовно до амінокислотного залишку відноситься до залишків амінокислот, обраних із групи, яка складається з С, 0, Е, Н.К, М, О, КЕ, 5 і Т. Таким чином, в одному із втілень даного винаходу щонайменше в одному із двох зазначених (першому й другому) важких ланцюгів амінокислотний залишок у положенні, що відповідає 0265 важкого ланцюга людського ІДС1, є залишком амінокислоти, яку вибирають із групи, яка складається з
С,Е, Н,К,М,О,К, ІТ.
В іншому втіленні даного винаходу щонайменше в одному із двох зазначених (першому й другому) важких ланцюгів амінокислотний залишок у положенні, що відповідає 0265 важкого ланцюга людського ІдО1, є залишком аліфатичної не несучої електричного заряду, ароматичної або кислотної амінокислоти.
Термін "аліфатичний не несучий електричного заряду" у даному документі стосовно до амінокислотного залишку відноситься до залишків амінокислот, обраних із групи, яка складається з А, 0, І, Ї і М. Таким чином, в одному із втілень даного винаходу щонайменше в одному із двох зазначених (першому й другому) важких ланцюгів амінокислотний залишок у положенні, що відповідає 0265 важкого ланцюга людського ІдДС1, є залишком амінокислоти, яку 60 вибирають із групи, яка складається зА, С, 1, І і М.
Термін "ароматичний" у даному документі стосовно до амінокислотного залишку відноситься до залишків амінокислот, обраних із групи, яка складається з Е, Т і МУ. Таким чином, в одному із втілень даного винаходу щонайменше в одному із двох зазначених (першому й другому) важких ланцюгів амінокислотний залишок у положенні, що відповідає 0265 важкого ланцюга людського
ІДОС1, є залишком амінокислоти, яку вибирають із групи, яка складається з НЕ, Т і МУ.
Термін "кислотний" у даному документі стосовно до амінокислотного залишку відноситься до залишків амінокислот, обраних із групи, яка складається з О і Е. Таким чином, в одному із втілень даного винаходу щонайменше в одному із двох зазначених (першому й другому) важких ланцюгів амінокислотний залишок у положенні, що відповідає 0265 важкого ланцюга людського
ІЧО1, є залишком амінокислоти, яку вибирають із групи, яка складається зр і Е.
В одному конкретному втіленні даного винаходу щонайменше в одному із двох зазначених (першому й другому) важких ланцюгів амінокислотний залишок у положенні, що відповідає 0265 важкого ланцюга людського ІдС!і, є залишком амінокислоти, яку вибирають із групи, яка складається зА, Е, БЕ, 0, І, 1, Т, М і МУ.
В одному із втілень даного винаходу в обох зазначених (першому й другому) важких ланцюгах амінокислотний залишок у положенні, що відповідає 0265 важкого ланцюга людського
ІДС1, відмінний від О.
В одному із втілень даного винаходу в обох зазначених (першому й другому) важких ланцюгах амінокислотний залишок у положенні, що відповідає 0265 важкого ланцюга людського
ІЧО1, відмінний від 0, і амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають М297 і РЗ331 важкого ланцюга людського Ідс1, є М і Р, відповідно.
В одному із втілень даного винаходу в обох зазначених (першому й другому) важких ланцюгах амінокислотний залишок у положенні, що відповідає 0265 важкого ланцюга людського
ІЧО1, є залишком гідрофобної або полярної амінокислоти.
Таким чином, в одному із втілень даного винаходу в обох зазначених (першому й другому) важких ланцюгах амінокислотний залишок у положенні, що відповідає 0265 важкого ланцюга людського ІдДС1, є залишком амінокислоти, яку вибирають із групи, яка складається з А, С, Е, б,
Н.І, С, М, В, Т.М, Мі хм.
Таким чином, в одному із втілень даного винаходу в обох зазначених (першому й другому)
Зо важких ланцюгах амінокислотний залишок у положенні, що відповідає 0265 важкого ланцюга людського ІдДО1, є залишком амінокислоти, яку вибирають із групи, яка складається з С, Е, Н, К,
М, О, К, З і Т. В одному із втілень даного винаходу в обох зазначених (першому й другому) важких ланцюгах амінокислотний залишок у положенні, що відповідає 0265 важкого ланцюга людського ІдДС1, є залишком амінокислоти, яку вибирають із групи, яка складається з А, С, Е, б,
Н.І, С, М,к, ТМ, Мі м.
В одному із втілень даного винаходу в обох зазначених (першому й другому) важких ланцюгах амінокислотний залишок у положенні, що відповідає 0265 важкого ланцюга людського
ІДОС1, є залишком амінокислоти, яку вибирають із групи, яка складається з С, Е,Н,К, М, О,К, 5 і т.
В іншому втіленні даного винаходу в обох зазначених (першому й другому) важких ланцюгах амінокислотний залишок у положенні, що відповідає 0265 важкого ланцюга людського ЇдДС1, є залишком аліфатичної не несучої електричного заряду, ароматичної або кислотної амінокислоти.
Таким чином, в одному із втілень даного винаходу в обох зазначених (першому й другому) важких ланцюгах амінокислотний залишок у положенні, що відповідає 0265 важкого ланцюга людського ІдДС1, є залишком амінокислоти, яку вибирають із групи, яка складається зА, б,1,Ї і
М.
Таким чином, в одному із втілень даного винаходу в обох зазначених (першому й другому) важких ланцюгах амінокислотний залишок у положенні, що відповідає 0265 важкого ланцюга людського ІдО1, є залишком амінокислоти, яку вибирають із групи, яка складається з Е, Т і МУ.
Таким чином, в одному із втілень даного винаходу в обох зазначених (першому й другому) важких ланцюгах амінокислотний залишок у положенні, що відповідає 0265 важкого ланцюга людського ІдО1, є залишком амінокислоти, яку вибирають із групи, яка складається зр і Е.
В одному конкретному втіленні даного винаходу в обох зазначених (першому й другому) важких ланцюгах амінокислотний залишок у положенні, що відповідає 0265 важкого ланцюга людського ІдДС1, є залишком амінокислоти, яку вибирають із групи, яка складається з А, Е, Е, с,
ІС, Т,МіМ.
В іншому втіленні даного винаходу в щонайменше одному із зазначених (першому й другому) важких ланцюгів амінокислотний залишок у положенні, що відповідає М297 важкого 60 ланцюга людського Ідс1, відмінний від М.
В одному із втілень даного винаходу щонайменше в одному із двох зазначених (першому й другому) важких ланцюгів амінокислотний залишок у положенні, що відповідає М297 важкого ланцюга людського ІдДС1 відмінний від М, ї амінокислотний залишок у положенні, що відповідає
РЗ31 важкого ланцюга людського ІдС1, є Р.
В одному із втілень даного винаходу в обох зазначених (першому й другому) важких ланцюгах амінокислотний залишок у положенні, що відповідає М297 важкого ланцюга людського
ІДС1, відмінний від М.
В одному із втілень даного винаходу в обох зазначених (першому й другому) важких ланцюгах амінокислотний залишок у положенні, що відповідає М297 важкого ланцюга людського
ІЧО1, відмінний від М, їі амінокислотний залишок у положенні, що відповідає РЗЗ1 важкого ланцюга людського Ідс1, є Р.
В іншому втіленні даного винаходу щонайменше в одному із двох зазначених (першому й другому) важких ланцюгів амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають 1234 і 1235 важкого ланцюга людського Ідс1, відмінні від І. і І, відповідно.
В одному із втілень даного винаходу щонайменше в одному із двох зазначених (першому й другому) важких ланцюгів амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають 1234 і 1235 важкого ланцюга людського ІдсС1, відмінні від Ї і Ї, відповідно, і амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають М297 і РЗЗ1 важкого ланцюга людського Ідс1, є М і Р, відповідно.
В одному із втілень даного винаходу щонайменше в одному із двох зазначених (першому й другому) важких ланцюгів амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають І 234 і | 235 важкого ланцюга людського ІдС1і, є залишками амінокислот, які вибирають із групи, яка складаєтьсязА, С.О, Е, Б, С, Н.І, К, М, М, Р, О, В, 5, Т, М, М.
В одному із втілень даного винаходу щонайменше в одному із двох зазначених (першому й другому) важких ланцюгів амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають 1234 і 1235 важкого ланцюга людського ІдС1, є залишками гідрофобних або полярних амінокислот.
Таким чином, в одному із втілень даного винаходу щонайменше в одному із двох зазначених (першому й другому) важких ланцюгів кожний з амінокислотних залишків у положеннях, що відповідають 234 і 1235 важкого ланцюга людського ЇДС1, є залишком амінокислоти, яку вибирають із групи, яка складається з А, С, Е, б, Н, І, М, К, Т, М, М/ і М.
Таким чином, в одному із втілень даного винаходу щонайменше в одному із двох зазначених (першому й другому) важких ланцюгів кожний з амінокислотних залишків у положеннях, що відповідають 234 і 1235 важкого ланцюга людського ДС1, є залишком амінокислоти, яку вибирають із групи, яка складаєтьсяз С.О, Е, Н, К, М, О, ЕК, 5, та Т.
В одному з конкретних втілень даного винаходу щонайменше в одному із двох зазначених (першому й другому) важких ланцюгів амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають
І 234 і 1235 важкого ланцюга людського Їдс1, є залишками амінокислот, які вибирають із групи, яка складаєтьсязА, С.О, Е, БЕ, С, Н.І. К, М, М, ОО, Б, 5, Т, М, М і У.
В одному із втілень даного винаходу в обох зазначених (першому й другому) важких ланцюгах амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають 1 234 і 1235 важкого ланцюга людського Ід, відмінні від ГІ. і І, відповідно.
В одному із втілень даного винаходу в обох зазначених (першому й другому) важких ланцюгах амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають 1 234 і 1235 важкого ланцюга людського ІдДС1, відмінні від Ї і Г, відповідно, і амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають М297 і РЗ31 важкого ланцюга людського Іде, є М і Р, відповідно.
В одному із втілень даного винаходу в обох зазначених (першому й другому) важких ланцюгах амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають 1 234 і 1235 важкого ланцюга людського ІдО1, є залишками гідрофобних або полярних амінокислот.
В одному із втілень даного винаходу в обох зазначених (першому й другому) важких ланцюгах кожний з амінокислотних залишків у положеннях, що відповідають І 234 і І 235 важкого ланцюга людського ІдДс1, є залишком амінокислоти, яку вибирають із групи, яка складається з А,
С,Б,б, Н.І, М, КК, Т.М, ММ і М.
В одному із втілень даного винаходу в обох зазначених (першому й другому) важких ланцюгах кожний з амінокислотних залишків у положеннях, що відповідають І 234 і І 235 важкого ланцюга людського ІДС1, є залишком амінокислоти, яку вибирають із групи, яка складається з
С,0,Е,Н,К,М, 0, Кк, БІТ.
В одному конкретному втіленні даного винаходу в обох зазначених (першому й другому) важких ланцюгах кожний з амінокислотних залишків у положеннях, що відповідають і 234 і І 235 важкого ланцюга людського ІдС!і, є залишком амінокислоти, яку вибирають із групи, яка складаєтьсязА, С.О, Е, Б, б, Н.І, К, М, М, О.К, 5, Т.М, ММ і М. бо В іншому втіленні даного винаходу щонайменше в одному із двох зазначених (першому й другому) важких ланцюгів амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають 1234 і 1235 важкого ланцюга людського ЇдДС1, є залишками аліфатичних не несучих електричного заряду, ароматичних або кислотних амінокислот.
Таким чином, в одному із втілень даного винаходу щонайменше в одному із двох зазначених (першому й другому) важких ланцюгів кожний з амінокислотних залишків у положеннях, що відповідають 234 і 1235 важкого ланцюга людського ДС1, є залишком амінокислоти, яку вибирають із групи, яка складається зА, о, Її М.
Таким чином, в одному із втілень даного винаходу щонайменше в одному із двох зазначених (першому й другому) важких ланцюгів кожний з амінокислотних залишків у положеннях, що відповідають 234 і 1235 важкого ланцюга людського ЇДС1, є залишком амінокислоти, яку вибирають із групи, яка складається з Е, Т і МУ.
Таким чином, в одному із втілень даного винаходу щонайменше в одному із двох зазначених (першому й другому) важких ланцюгів кожний з амінокислотних залишків у положеннях, що відповідають 234 і 1235 важкого ланцюга людського ДС1, є залишком амінокислоти, яку вибирають із групи, яка складається зр і Е.
В одному з конкретних втілень даного винаходу щонайменше в одному із двох зазначених (першому й другому) важких ланцюгів кожний з амінокислотних залишків у положеннях, що відповідають 234 і 1235 важкого ланцюга людського ДС1, є залишком амінокислоти, яку вибирають із групи, яка складаєтьсязА, О, Е, Б, б, І, Т, М і МУ.
В одному із втілень даного винаходу щонайменше в одному із двох зазначених (першому й другому) важких ланцюгів амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають 1234 і 1235 важкого ланцюга людського Ідс1, Є Е і Е або А і А, відповідно.
В одному із втілень даного винаходу щонайменше в одному із двох зазначених (першому й другому) важких ланцюгів амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають 1234 і 1235 важкого ланцюга людського ІДС, є Е ї Е або А ії А, відповідно, і амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають М297 і РЗЗ1 важкого ланцюга людського Ідс1, є М і Р, відповідно.
В одному із втілень даного винаходу в обох зазначених (першому й другому) важких ланцюгах амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають 1 234 і 1235 важкого ланцюга людського ІДС1, Є Б Ї ЕЕ або А і А, відповідно.
Зо В одному із втілень даного винаходу в обох зазначених (першому й другому) важких ланцюгах амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають 1 234 і 1235 важкого ланцюга людського ДОСІ, є Е їі Е або А і А, відповідно, і амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають М297 і РЗЗ31 важкого ланцюга людського Іде, є М і Р, відповідно.
В одному з конкретних втілень даного винаходу щонайменше в одному із двох зазначених (першому й другому) важких ланцюгів амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають
І 234 і 1235 важкого ланцюга людського Ідс1, є Е і Е, відповідно.
В одному із втілень даного винаходу в обох зазначених (першому й другому) важких ланцюгах амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають 1 234 і 1235 важкого ланцюга людського ІДС, є Е і Е, відповідно.
В одному із втілень даного винаходу щонайменше в одному із двох зазначених (першому й другому) важких ланцюгів щонайменше амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають
І 234 і 1235 важкого ланцюга людського ІДС, є А і А, відповідно.
В одному із втілень даного винаходу в обох зазначених (першому й другому) важких ланцюгів щонайменше амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають 1234 і 1235 важкого ланцюга людського Ідс1, є А і А, відповідно.
В одному із втілень даного винаходу щонайменше в одному із двох зазначених (першому й другому) важких ланцюгів амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають 1234, І 235 і 0265 важкого ланцюга людського Ідс1, відмінні від Г., Г. і О, відповідно.
В одному із втілень даного винаходу щонайменше в одному із двох зазначених (першому й другому) важких ланцюгів амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають 1234, 1235 і 0265 важкого ланцюга людського Ідс1, відмінні від Г., Ї. ї О, відповідно, і амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають М297 і РЗЗ3З1 важкого ланцюга людського ІДС1, є М і Р, відповідно.
В одному із втілень даного винаходу щонайменше в одному із двох зазначених (першому й другому) важких ланцюгів амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають І 234 і | 235 важкого ланцюга людського ІдсС!ї, є залишками амінокислот, які вибирають із групи, яка складаєтьсяз А, С.О, Е, Е, б, Н.І, К, М, М, Р, О, ЕК, 5, Т, У, М їі МУ, і амінокислотний залишок у положенні, що відповідає 0265 є залишком амінокислоти, яку вибирають із групи, яка складаєтьсязА, С,Е, Б, б, Н,І,К, І, М, М, Р, ОЙ, К, 5, Т, М, М і МУ. бо В одному із втілень даного винаходу щонайменше в одному із двох зазначених (першому й другому) важких ланцюгів амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають 1234, І 235 і ра265 важкого ланцюга людського Ідс1, є залишками гідрофобних або полярних амінокислот.
Таким чином, в одному із втілень даного винаходу щонайменше в одному із двох зазначених (першому й другому) важких ланцюгів амінокислотний залишок у положенні, що відповідає 0265 важкого ланцюга людського ІдсС1, є залишком амінокислоти, яку вибирають із групи, яка складаєтьсязА, С, БЕ, б, Н, І, І, М, ЕК, Т, М, М, і кожний з амінокислотних залишків у положеннях, що відповідають 1234 і 235 важкого ланцюга людського ІДС1, є залишком амінокислоти, яку вибирають із групи, яка складається з А, С, Е, б, Н, І, М, К, Т, М, М/ і М.
Таким чином, в одному із втілень даного винаходу щонайменше в одному із двох зазначених (першому й другому) важких ланцюгів кожний з амінокислотних залишків у положеннях, що відповідають 234 і 1235 важкого ланцюга людського ДОСІ, є залишком амінокислоти, яку вибирають із групи, яка складається з С.О, Е, Н,К, М, О, ЕК, 5 і Т, ії амінокислотний залишок у положенні, відповідному 0265 важкого ланцюга людського ЇдДС1, є залишком амінокислоти, яку вибирають із групи, яка складається з СЕ, Н,К, М, О, К, 51 т.
В одному з конкретних втілень даного винаходу щонайменше в одному із двох зазначених (першому й другому) важких ланцюгів кожний з амінокислотних залишків у положеннях, що відповідають 234 і 1235 важкого ланцюга людського ДОСІ, є залишком амінокислоти, яку вибирають із групи, яка складається з А, С, О, Е, Е, б, Н.І, К, М, М, ОО, К, 5, Т, М ММ, Її амінокислотний залишок у положенні, що відповідає 0265 важкого ланцюга людського ІдДС1, є залишком амінокислоти, яку вибирають із групи, яка складаєтьсяз А, С, Е, Е, б, Н.І, К, Г, М, М,
ОО, К,5,Т,М, МІ У.
В одному із втілень даного винаходу в обох зазначених (першому й другому) важких ланцюгах амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають 1234, 1235 і 0265 важкого ланцюга людського Ідс1, є залишками гідрофобних або полярних амінокислот.
В одному із втілень даного винаходу в обох зазначених (першому й другому) важких ланцюгах амінокислотний залишок у положенні, що відповідає 0265 важкого ланцюга людського
ІДОС1, є залишком амінокислоти, яку вибирають із групи, яка складається зА, С, ГЕ, б, Н.І, Г, М,
Е, Т, М, М ї У, ї кожний з амінокислотних залишків у положеннях, що відповідають 1 234 і 1235 важкого ланцюга людського ІдС!і, є залишком амінокислоти, яку вибирають із групи, яка складаєтьсязА, С, ЕЕ, б, Н.І, М, К, Т, М, М і М.
В одному із втілень даного винаходу в обох зазначених (першому й другому) важких ланцюгах кожний з амінокислотних залишків у положеннях, що відповідають І 234 і І 235 важкого ланцюга людського ІДС1, є залишком амінокислоти, яку вибирають із групи, яка складається з
С,0б,Е, Н,К,М, О, ЕК, 5 і Т, і амінокислотний залишок у положенні, що відповідає 0265 важкого ланцюга людського ІДС1, є залишком амінокислоти, яку вибирають із групи, яка складається з
С,Е, Н,К,М, 0, Кк, ІТ.
В одному з конкретних втілень даного винаходу в обох зазначених (першому й другому) важких ланцюгах кожний з амінокислотних залишків у положеннях, що відповідають 1 234 і 1235 важкого ланцюга людського ІдС!і, є залишком амінокислоти, яку вибирають із групи, яка складається з А, С.О, Е, ГЕ, б, Н.І, К, М, М, О, К, 5, Т, М, МУ ї У, і амінокислотний залишок у положенні, що відповідає 0265 важкого ланцюга людського ІдДС1, є залишком амінокислоти, яку вибирають із групи, яка складаєтьсязА, С,Е, Е.С, Н.І,К, І, М, М, ОО, Б, 5, Т, М, М/ і Х.
В іншому втіленні даного винаходу щонайменше в одному із двох зазначених (першому й другому) важких ланцюгів амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають 1234, | 235 і р265 важкого ланцюга людського ІДС1, є залишками аліфатичних не несучих електричного заряду, ароматичних або кислотних амінокислот.
Таким чином, в одному із втілень даного винаходу щонайменше в одному із двох зазначених (першому й другому) важких ланцюгів амінокислотний залишок у положенні, що відповідає 0265 важкого ланцюга людського ІдС!і, є залишком амінокислоти, яку вибирають із групи, яка складається з А, 0, І, Ї. і М, ї кожний з амінокислотних залишків у положеннях, що відповідають
І 234 і 1235 важкого ланцюга людського ІдО1, є залишком амінокислоти, яку вибирають із групи, яка складається зА, С, ЇЇ М.
Таким чином, в одному із втілень даного винаходу щонайменше в одному із двох зазначених (першому й другому) важких ланцюгів кожний з амінокислотних залишків у положеннях, що відповідають І 234, 1235 і 0265 важкого ланцюга людського ЇДС1, є залишком амінокислоти, обраної із групи, яка складається з Е, Т і МУ.
Таким чином, в одному із втілень даного винаходу щонайменше в одному із двох зазначених (першому й другому) важких ланцюгів кожний з амінокислотних залишків у положеннях, що відповідають І 234, 1235 і 0265 важкого ланцюга людського ЇДС1, є залишком амінокислоти, бо обраної із групи, яка складається з Ю і Е.
В одному з конкретних втілень даного винаходу щонайменше в одному із двох зазначених (першому й другому) важких ланцюгах амінокислотний залишок у положенні, що відповідає р265 важкого ланцюга людського ІдДС1, є залишком амінокислоти, яку вибирають із групи, яка складається з А, Е, Е, 0, І, С, Т, М ї МУ, і кожний з амінокислотних залишків у положеннях, що відповідають 234 і 1235 важкого ланцюга людського ДС1, є залишком амінокислоти, яку вибирають із групи, яка складаєтьсязА, О, Е, Б, б, І, Т, М і МУ.
В одному із втілень даного винаходу в обох зазначених (першому й другому) важких ланцюгах амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають 1234, 1235 і 0265 важкого ланцюга людського Іде, відмінні від Г, Ї. і О, відповідно.
В одному із втілень даного винаходу в обох зазначених (першому й другому) важких ланцюгах амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають 1234, 1235 і 0265 важкого ланцюга людського Ідс1, відмінні від Г.,, Г. і О, відповідно, і амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають М297 і РЗЗ31 важкого ланцюга людського Іде, є М і Р, відповідно.
В одному із втілень даного винаходу в обох зазначених (першому й другому) важких ланцюгах амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають 1234, 1235 і 0265 важкого ланцюга людського ІдсС1, є залишками аліфатичних не несучих електричного заряду, ароматичних або кислотних амінокислот.
В одному із втілень даного винаходу в обох зазначених (першому й другому) важких ланцюгах амінокислотний залишок у положенні, що відповідає 0265 важкого ланцюга людського
ІДОС1, є залишком амінокислоти, яку вибирають із групи, яка складається зд, о, І, |. і М, ії кожний з амінокислотних залишків у положеннях, що відповідають 234 і 1235 важкого ланцюга людського ІдДО1, є залишком амінокислоти, яку вибирають із групи, яка складається зА, С, Її М.
В одному із втілень даного винаходу в обох зазначених (першому й другому) важких ланцюгах кожний з амінокислотних залишків у положеннях, що відповідають 1234, І 235 і 0265 важкого ланцюга людського ІдсС1, є залишком амінокислоти, яку вибирають із групи, яка складається з рі Е.
В одному з конкретних втілень даного винаходу в обох зазначених (першому й другому) важких ланцюгах амінокислотний залишок у положенні, що відповідає 0265 важкого ланцюга людського ІдДС1, є залишком амінокислоти, яку вибирають із групи, яка складається з А, Е, Е, б,
І, С, т, М 'ї МУ, ї кожний з амінокислотних залишків у положеннях, що відповідають 1 234 і 1235 важкого ланцюга людського ІдС!і, є залишком амінокислоти, яку вибирають із групи, яка складаєтьсязА, ОО, Е, Б, 0,1, Т, Мі М.
В одному із втілень даного винаходу щонайменше в одному із двох зазначених (першому й другому) важких ланцюгів амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають 1234, І 235 і р265 важкого ланцюга людського Ідс1, є залишком Е, Е їі А або А, А і А, відповідно.
В одному із втілень даного винаходу щонайменше в одному із двох зазначених (першому й другому) важких ланцюгів амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають 1234, І 235 і
Юр265 важкого ланцюга людського дДсС1, є залишком Е, Е їі А або А, А і А, відповідно, і амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають М297 і РЗЗ1 важкого ланцюга людського
ІЧДСТ1, є М і Р, відповідно.
В одному із втілень даного винаходу в обох зазначених (першому й другому) важких ланцюгах амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають 1234, 1235 і 0265 важкого ланцюга людського ІдДс1, є залишком Е,Е і А або А, А і А, відповідно.
В одному із втілень даного винаходу в обох зазначених (першому й другому) важких ланцюгах амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають 1234, 1235 і 0265 важкого ланцюга людського Ідс1, є залишком Е, ЕЕ ї А або А, А і А, відповідно, і амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають М297 і РЗЗ1 важкого ланцюга людського Ідс1, є М і Р, відповідно.
В одному з конкретних втілень даного винаходу щонайменше в одному із двох зазначених (першому й другому) важких ланцюгів амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають
І 234, 1235 і 0265 важкого ланцюга людського ІдО1, є залишком Е, Е і А, відповідно.
В одному з конкретних втілень даного винаходу в обох зазначених (першому й другому) важких ланцюгах амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають 1234, 1235 і 0265 важкого ланцюга людського Ідс1, є залишком РЕ, Е і А, відповідно.
В одному з конкретних втілень даного винаходу щонайменше в одному із двох зазначених (першому й другому) важких ланцюгів амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають
І 234, 1235 і 0265 важкого ланцюга людського ІдО1, є залишком А, А і А, відповідно.
В одному з конкретних втілень даного винаходу в обох зазначених (першому й другому) важких ланцюгах амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають 1234, 1235 і 0265 важкого ланцюга людського ІдДС1, є залишком А, А і А, відповідно. бо В іншому втіленні даного винаходу щонайменше в одному із двох зазначених (першому й другому) важких ланцюгів амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають 1234, І 235, ра265, М297, і РЗ31 важкого ланцюга людського Ідс1, є залишками РЕ, Е, А, о і 5, відповідно.
В одному із втілень даного винаходу в обох зазначених (першому й другому) важких ланцюгах амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають І 234, 1235, 0265, М297 і РЗ331 важкого ланцюга людського Ідо1, є залишками РЕ, Е, А, О і 5, відповідно.
В одному з конкретних втілень даного винаходу пропоновані антитіла містять варіабельну область важкого ланцюга, представлену 5ЕО ІЮ МО:8, варіабельну область легкого ланцюга, представлену 5ЕО ІО МО:10, і щонайменше в одному з важких ланцюгів амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають 1 234, І 235 і 0265 важкого ланцюга людського ІдДО1, є залишком
Е, Е і А, відповідно.
В іншому втіленні даного винаходу пропоновані антитіла містять варіабельну область важкого ланцюга, представлену 5ЕО ІЮ МО:8, варіабельну область легкого ланцюга, представлену 5ЕО ІО МО:12, і щонайменше в одному з важких ланцюгів амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають 1 234, І 235 і 0265 важкого ланцюга людського ІдДО1, є залишком
Е, Е і А, відповідно.
В іншому втіленні даного винаходу пропоновані антитіла містять варіабельну область важкого ланцюга, представлену 5ЕО ІЮ МО:б, варіабельну область легкого ланцюга, представлену 5ЕО ІО МО:10, і щонайменше в одному з важких ланцюгів амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають 1 234, І 235 і 0265 важкого ланцюга людського ІдДО1, є залишком
Е, Е і А, відповідно.
В іншому втіленні даного винаходу пропоновані антитіла містять варіабельну область важкого ланцюга, представлену 5ЕО ІЮ МО:б, варіабельну область легкого ланцюга, представлену 5ЕО ІО МО:12, і щонайменше в одному з важких ланцюгів амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають 1 234, І 235 і 0265 важкого ланцюга людського ІдДО1, є залишком
Е, Е і А, відповідно.
В іншому втіленні даного винаходу пропоновані антитіла містять варіабельну область важкого ланцюга, представлену 5ЕО ІЮ МО:9, варіабельну область легкого ланцюга, представлену 5ЕО ІО МО:10, і щонайменше в одному з важких ланцюгів амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають 1 234, І 235 і 0265 важкого ланцюга людського ІдДО1, є залишком
Е, Е і А, відповідно.
В іншому втіленні даного винаходу пропоновані антитіла містять варіабельну область важкого ланцюга, представлену 5ЕО ІЮ МО:9, варіабельну область легкого ланцюга, представлену 5ЕО ІО МО:12, і щонайменше в одному з важких ланцюгів амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають 1 234, І 235 і 0265 важкого ланцюга людського ІдДО1, є залишком
Е, Е і А, відповідно.
В одному з варіантів даного винаходу пропоновані біспецифічні антитіла містять константний домен легкого А-ланцюга людського Ід С2/Лді-Сз (5ЕО ІЮ МО:29).
Було створено кілька варіантів антитіл з однією або більше амінокислотних замін в області
Ес. Якщо область Ес, що не активується, антитіло не взаємодіє з рецепторами для Ес, наявними на клітинах крові, наприклад на моноцитах, або з компонентом системи комплементу С14 для класичної активації комплементу. Зниження активності області Ес перевіряли у варіантів антитіл, які містять різні комбінації амінокислотних замін в області Ес. В амінокислотній послідовності області Ес робили якнайбільше п'ять амінокислотних замін, які включали мутації
М2970, І 234А, І 235А, І 234Е, І235Е, 0265А і РЗ3315. Заміни в одному або більше із цих п'яти положень робили в поліпептгидному ланцюзі Ідс1(К409Е) і/або Ідс1(Е4051). Були отримані антитіла пис В-13/4 з наступними варіантами області Ес: М2970О (відноситься до заміни М2970, названий Ідс1-писСІ В-13/4-М2970), І ЕГЕ (відноситься до заміни І 234Г// 235Е, названий Ідс1- пиСІ В-Т3/4-І ЕГЕ), ГАГА (відноситься до заміни І 234АЛ 235А, названий Ідс1-писСіІ В-Т3/4-І АЇ А),
ІРСЕМО (відноситься до заміни І234Р/235Е/М2970, названий /дс1-писСіІ В-13/4-І РІГ ЕМО),
ГРГЕВА (відноситься до заміни І 234Е/ 235Е/0265А, названий Ідсе1-пиСіІ В-13/4-І ЕГЕБА), БА (відноситься до заміни 0265А, названий Ідс1-писСІ В-13/4-0А), БАРЗ (відноситься до заміни р265А/РЗ315, названий Ідс1-пиСіІ В-13/4-ЮАРЗ), САМО (відноситься до заміни 0265А/М2970О, названий Ідс1-нисСі В-13/4-ЮАМО), ГРГЕРБ5 (відноситься до заміни 1234Е/235Е/РЗЗ315, названий ІЧе1-пиСІ В-13/4-І РІГ ЕР) і ГРГЕОАМОРБ (відноситься до заміни
І 234Г//. 235Е/0265А/М2970/РЗ3315, названий Ідс1-писСіІ В-13/4-І Р ЕОАМОРБ).
Зокрема у варіантах антитіла І(д9с51-пиСОЗ комбінація із трьох амінокислотних замін, що включає мутації І 234Е, І 235Е і 0265А, позначувана І ЕГЕВА або ЕЕА, уведена в поліпептидний ланцюг Ідс1(К409К) і Ідс1(Е405І), у результаті чого вийшли антитіла з областю Ес, яка не активується, . У позначеннях отриманих варіантних антитіл, які не активуються на кінці (через 60 дефіс) стоїть "ГЕАК" або "РЕА! ", відповідно.
В одному з варіантів даного винаходу в пропонованих біспецифічних антитілах модифікований легкий й/або важкий ланцюг для посилення експресії й/або збільшення виходу продукту. В одному із втілень даного винаходу в пропонованих біспецифічних антитілах модифікований легкий ланцюг. Такі модифікації відомі в даній області техніки; їх можна здійснити, застосовуючи методи, описані, наприклад, у роботі 2Ппепд, Г., Соадага, 5.-Р.,
Ваштапп, І., « Неутопоа, 4.-Ї. (2004). Ехргев5віоп ітргометепі апа теспапівіїс вішау ої Те геїго- дів!5-аІ(дегазе саїаус апіроду 1011 ру 5йе-дігесівєй тиїадепевів.дуошйтаї! ої МоїІесшіаг Віоіоду, 341(3), 807-14.
В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла за будь-яким з описаних у даному документі втілень містять перший важкий ланцюг і перший легкий ланцюг, у якому амінокислотний залишок у положенні, що відповідає Т41 амінокислотної послідовності легкого
Х-панцюга (ЗЕО ІЮО МО:10) першого легкого ланцюга, відмінний від Т.
В одному із втілень даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень амінокислотний залишок у положенні, що відповідає Т41 амінокислотної послідовності легкого А-ланцюга (ЗЕО ІО МО:10), є залишком амінокислоти, обраної зН, І, К, 1, ОЙ, К ім.
В одному із втілень даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень амінокислотний залишок у положенні, що відповідає Т41 амінокислотної послідовності легкого А-ланцюга (5ЕО ІЮ МО:10), є Н, К або ЕК.
В одному із втілень даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень амінокислотний залишок у положенні, що відповідає Т41 амінокислотної послідовності легкого А-ланцюга (5ЕО ІЮ МО:10), є К.
В одному із втілень даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень амінокислотний залишок у положенні, що відповідає 10 амінокислотної послідовності легкого А-ланцюга (ЕС ІО МО:10) першого легкого ланцюга, відмінний від РЕ, і один або більше амінокислотних залишків у положеннях, що відповідають Т41,
К55 ї 197 амінокислотної послідовності легкого А-ланцюга (ЗЕО ІЮ МО:10) першого легкого ланцюга, відмінні від Т, К і Г, відповідно.
В одному із втілень даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають Е10, ТА1, К55 і
І 97 амінокислотної послідовності легкого А-ланцюга (ЗЕО ІЮ МО:10) першого легкого ланцюга, відмінні від Е, Т, К і С, відповідно.
В одному із втілень даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають Е10, ТА1, К55 і
І 97 амінокислотної послідовності легкого А-ланцюга (5ЕО ІО МО:10) першого легкого ланцюга, є залишками амінокислот Г., К, М і Н, відповідно.
В одному із втілень даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають К2З3 і АЗ5 амінокислотної послідовності легкого А-ланцюга (ЗЕСО ІО МО:10) першого легкого ланцюга, відмінні від К і А, відповідно.
В одному із втілень даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають К2З3 і АЗ5 амінокислотної послідовності легкого А-ланцюга (ЗЕО ІЮ МО:10) першого легкого ланцюга, є А і
Р, відповідно.
В одному із втілень даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають Е10, К23, АЗ5,
К47, 071, А82, 083, 586, І87 і Е89 амінокислотної послідовності легкого А-ланцюга (ЗЕО ІЮ
МО:10) першого легкого ланцюга, відмінні від Е, К, А, К, 0, А, 0, 5, І ї Е, відповідно.
В одному із втілень даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають Е10, К23, АЗ5,
К47, 071, А82, 083, 586, І87 і Е89 амінокислотної послідовності легкого А-ланцюга (ЗЕО ІЮ
МО:10) першого легкого ланцюга, є |, А, Р, Т, о, Р, Е, А, Е і М, відповідно.
В одному із втілень даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень () амінокислотний залишок у положенні, що відповідає Е10 амінокислотної послідовності легкого А-ланцюга (5ЕО ІЮ МО:10) першого легкого ланцюга, відмінний від Е, або (ї) амінокислотний залишок у положенні, що відповідає К55 амінокислотної послідовності легкого А-ланцюга (5ЕО ІЮ МО:10) першого легкого ланцюга, відмінний від К, або (ії) амінокислотний залишок у положенні, що відповідає Е10 амінокислотної послідовності бо легкого А-ланцюга (5ЕО ІЮ МО:10) першого легкого ланцюга, відмінний від Е, амінокислотний залишок у положенні, що відповідає К55 амінокислотної послідовності легкого А-ланцюга (ЗЕО
ІО МО:10) першого легкого ланцюга, відмінний від К.
В одному із втілень даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень () амінокислотний залишок у положенні, що відповідає Е10 амінокислотної послідовності легкого А-ланцюга (5ЕО ІЮ МО:10) першого легкого ланцюга, є І, або (ї) амінокислотний залишок у положенні, що відповідає К55 амінокислотної послідовності легкого А-ланцюга (5ЕО ІЮ МО:10) першого легкого ланцюга, є М, або (ії) амінокислотний залишок у положенні, що відповідає Е10 амінокислотної послідовності легкого А-ланцюга (5ЕО ІЮ МО:10) першого легкого ланцюга, є І, амінокислотний залишок у положенні, що відповідає К55 амінокислотної послідовності легкого А-ланцюга (5ЕО ІЮ МО:10) першого легкого ланцюга, є М.
В одному із втілень даного винаходу пропоновані біспецифічні антитіла містять перший легкий ланцюг, у якому амінокислотний залишок у положенні, що відповідає ТАТ, є залишком амінокислоти, обраної з Н, І, К, І, 0, К ії М, наприклад обраної з Н, К і К, наприклад є К. В одному із втілень даного винаходу пропоновані біспецифічні антитіла містять перший легкий ланцюг, в амінокислотній послідовності якої є залишки амінокислот Г, К, М ї Н у положеннях, що відповідають Е10, Т41, К55 і І 97 легкого А-ланцюга (ЗЕО ІЮО МО:10). В одному із втілень даного винаходу пропоновані біспецифічні антитіла містять перший легкий ланцюг, у якому амінокислотний залишок у положенні, що відповідає К23, є залишком амінокислоти, обраної з А,
С, Н,К, 0, 5, і Т, наприклад з А і С, і в якій амінокислотний залишок у положенні, що відповідає
АЗ5, є залишком амінокислоти, обраної зі, І, М, Р, М, с, Е і МУ, наприклад зі, Ї, М, Р і М.
В одному із втілень даного винаходу пропоновані біспецифічні антитіла містять перший легкий ланцюг, у якому амінокислотний залишок у положенні, що відповідає К23, є залишком А або С, наприклад А, і амінокислотний залишок у положенні, що відповідає АЗ5, є залишком Р.
В одному із втілень даного винаходу пропоновані біспецифічні антитіла містять перший легкий ланцюг, у якому амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають Е10, К23, АЗ5,
К47, 071, АВ2, О83, 586, 187 і Е89 легкого А-ланцюга (ЗЕО ІЮ МО:10) відмінні від Е, К, А, К, 0, А,
ОБ, 5,1 ї Е, відповідно.
Зо В одному із втілень даного винаходу пропоновані біспецифічні антитіла містять перший легкий ланцюг, у якому амінокислотний залишок у положенні, що відповідає К23, є залишком амінокислоти, обраної з А, б, Н, К, 0, 5, і Т, наприклад з А і б, амінокислотний залишок у положенні, що відповідає АЗ5, є залишком амінокислоти, обраної з І, Її, М, Р, М, б, Б ї М, наприклад з І, Ї, М, Р, ії амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають Е10, К47, 071,
А82, 083, 586, І87 і Е89 легкого А-ланцюга (5ЕО ІЮ МО:10) є І, Т, б, Р, Е, А, Е і У, відповідно.
В одному із втілень даного винаходу пропоновані біспецифічні антитіла містять перший легкий ланцюг, у якому амінокислотний залишок у положенні, що відповідає К23, є залишком А або с, і амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають Е10, АЗ5, 47, 071, А82, 083,
З86, І87 і 89 легкого А-ланцюга (5ЕО ІЮО МО:10) є Ї, Р, Т, о, Р, Е, А, Е і У, відповідно.
В одному з варіантів даного винаходу в пропонованих біспецифічних антитілах модифікований перший й/або другий легкий ланцюг для підвищення афінності антитіл.
В одному з варіантів даного винаходу в пропонованих біспецифічних антитілах модифікований легкий ланцюг першої й/або другої єднальної гілок для зниження афінності антитіл. У деяких обставинах зниження афінності може бути кращим і приводити до збільшення ефективності. Зокрема, низька афінність першої єднальної гілки (з'єднуючої людський СОЗЕ (ерзйоп)) може впливати на рухливість Т-лімфоцитів у кровотоці й у місці розташування пухлини, приводячи до кращої мобілізації Т-лімфоцитів проти пухлинних клітин (див. Мейо еї а!.,, МоїІесшаг Іттипоіоду 44 (2007). Це, зокрема. може виявитися корисним у випадку біспецифічних антитіл, у яких антитіла проти СОЗ використовуються в якості однієї з єднальних гілок. Модифікації, що ведуть до зниження афінності антитіл відомі в даній області техніки; див., наприклад, Уерзіег еї аї. Іпі. У. Сапсег Зиррі. 1988;3:13-6.
В одному із втілень даного винаходу пропоновані біспецифічні антитіла містять перший легкий ланцюг, у якому () амінокислотний залишок у положенні, що відповідає ЕТО легкого А-ланцюга (ЗЕО ІЮ
МО:10), відмінний від Е, або (ї) амінокислотний залишок у положенні, що відповідає К55 легкого А-ланцюга (ЗЕО ІЮ
МО:10), відмінний від К, або (ії) амінокислотний залишок у положенні, що відповідає Е1О0 легкого А-ланцюга (ЗЕО ІЮ
МО:10), відмінний від Е, і амінокислотний залишок у положенні, що відповідає К55 легкого А- 60 ланцюга (ЗЕО ІЮ МО:10), відмінний від К. 5О0
В одному із втілень даного винаходу пропоновані антитіла містять константну область легкого ланцюга (І С), у якому () амінокислотний залишок у положенні, що відповідає Е1О0 легкого А-ланцюга (ЗЕО ІЮ
МО:10), є І, або (ї) амінокислотний залишок у положенні, що відповідає К55 легкого А-ланцюга (ЗЕО ІЮ
МО:10), є М, або (ії) амінокислотний залишок у положенні, що відповідає Е1О0 легкого А-ланцюга (ЗЕО ІЮ
МО:10), є ГІ, ї амінокислотний залишок у положенні, що відповідає К55 легкого А-ланцюга (ЗЕ
ІО МО:10), є М.
В одному із втілень даного винаходу пропоновані біспецифічні антитіла містять легкий ланцюг, у якому амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають Е10, Т41, К55 і 197 амінокислотної послідовності легкого А-ланцюга (ЗЕ ІЮО МО:10) відмінні від Е, Т, К і 1, відповідно. Такі модифікації служать двом цілям: підвищенню рівня експресії й зниженню афінності.
В одному із втілень даного винаходу пропоновані біспецифічні антитіла містять перший легкий ланцюг, у якому амінокислотні залишки в положеннях, що відповідають Е10, Т41, К55 і
Г97 амінокислотної послідовності легкого А-ланцюга (ЗЕО ІО МО:10), є Г, К, М ії Н, відповідно.
Такі модифікації служать двом цілям: підвищенню рівня експресії й зниженню афінності.
В іншому варіанті даного винаходу були зроблені мутації в ділянках СОК пиСОЗ для оптимізації афінності зв'язування гілки, яка зв'язує СОЗ, наприклад для зниження афінності зв'язування гілки, яка зв'язує СОЗ.
Таким чином в одному із втілень даного винаходу гілка, яка зв'язує СОЗ, біспецифічного антитіла за даним винаходом містить шість амінокислотних послідовностей СОР, обраних з переліку послідовностей СОК, представленого нижче в таблиці 2.
Таблиця 2
ЗЕО І МО ЗЕО І МО ЗЕО І МО ЗЕО І МО ЗЕО І МО
Продовження таблиці 2 11111121111111180 1111141 | см | 5 111111211171711111801 17111181 | см | 5 2 11111121117111111801 11111411 см | 782 2 111111211171711111801 11111411 см | 83
В одному із втілень даного винаходу ці шість послідовностей СОМ. можуть бути вбудовані в будь-яку з каркасних послідовностей варіабельних областей важкого (МН) і легкого (М) ланцюгів пиИСОЗ (УНІ, МН2, МНІЗ ії МНА, і МІ, МІ 2, і МІ З, відповідно), заміняючи послідовності
СОК писСО3. В одному із втілень даного винаходу ці шість послідовностей СОК вбудовані в каркасні послідовності МНІ і М 1 пиСО3.
В іншому втіленні даного винаходу гілка, яка зв'язує СОЮЗ, містить шість послідовностей
СОК, обраних з таблиці 2, де
Хі в ЗЕЕО ІО МО:72 вибирають із М, Н.Е, Т, Р, І, 0,0,К, М, , А, Сі г;
Хг2 в ЗЕО ІЮ МО:73 вибирають ізМ, А, Н, ОО, Р, БЕ, М, М, 1, ММ, 0, Е ЇЇ С;
Ха в ЗЕО ІЮ МО:75 вибирають із М, ОО, М, І, А, І, М, О, Т,К, ЕЕ, Б, Е,Е, М, Сі р;
Х5 в ЗЕЕО ІО МО:76 вибирають із М, І, М, ММ, Н, М, б, Е,К,5,М, Кк, 0,0, С,Е Р;
Хіо в ЗЕО ІЮ МО:81 вибирають із А, б, К, М, Б, Е, М, Н.М, М, Р, О,0,КІії;
Хіг в ЗЕО ІЮ МО:83 вибирають ізО,К, ОО, 0, М, Е, Т, М, М, 5, Р, ММ, Е і М.
З такими варіантами послідовностей СОК антитіла пйпиСОЗ мають знижену афінність зв'язування в порівнянні з пиСОЗ, у якому послідовності СОК дикого типу. Зазначені шість послідовностей СОК можуть бути вбудовані в будь-яку з каркасних послідовностей варіабельних областей важкого (МН) і легкого (М) ланцюгів пиСОЗ: УНІ, МН2, УНЗ ії УНАЯ, і МІ1,
МІ2 ї МІ3, відповідно, заміняючи послідовності СОК в пиСОЗ. В одному із втілень даного винаходу ці шість послідовностей СОК вбудовані в каркасні послідовності МНІ і М1 пиСО3. В іншому втіленні даного винаходу ці шість послідовностей СОМ вбудовані в каркасні послідовності МНІ і МТ пиСОЗ, де залишок амінокислоти Т у положенні 41 МІ 1 (ЗЕО ІЮ МО:10) замінений на залишок амінокислоти К.
В іншому втіленні даного винаходу гілка, яка зв'язує СОЗ містить шість послідовностей СОК, обраних з наведених у таблиці, де
Хі в ЗЕО ІО МО:72 вибирають ізі, Р,О,0,К, М, 5,0, А, Сів;
Хг2 в ЗЕЕО ІО МО:73 вибирають із 5, М, 5, А,К, М, К, Н.О, Р, І, Б, М, М, І, М, О,ЕЇ С;
Хз в ЗЕО ІЮ МО:74 вибирають із М, ММ, 5, О.М, ТТ, 5, Р, І, А, КК с;
Коо) Ха в ЗЕО ІЮ МО:75 вибирають із ММ, І, А, І.М, 0, Т,К,К, ОО, БЕ, Е, М, Сі Р;
Х5 в ЗЕЕО ІО МО:76 вибирають із С, Е, Р і т:
Хв в ЗЕО ІО МО:77 вибирають ізА, 5, М, М,К,І, Т.І, Р.О, С, о, М, М, БЕ, і К;
Х? в ЗЕО ІО МО:78 вибирають із Р, С, 5, і Т;
Хв в ЗЕО ІО МО:79 вибирають ізА, Т, б, І, М, С, Р, Б, ОО, Н.Е, К,Е, УМ, і м;
Хо в ЗЕО ІО МО:80 вибирають і Р, І, Т, С, А, І. 1,0, МЕ, М,К,К, сі Р;
Хіо в ЗЕО ІЮ МО:81 вибирають ізЕ, Н.І, М, М, М, Р,О,0,Кії;
Хії в ЗЕО ІЮ МО:82 вибирають із Е, М, І, Т, М, М, А, 5, М, Б, МЕ, К, Р, Кі;
Хіг в ЗЕО ІЮ МО:83 вибирають із С, М, М, М, Т, 5, Н.Е, Р, М, Гі М.
З такими варіантами послідовностей СОК антитіла пйпиСОЗ мають знижену афінність зв'язування в порівнянні з пиСОЗ, у якому послідовності СОМК дикого типу. Зазначені шість послідовностей СОК можуть бути вбудовані в будь-яку з каркасних послідовностей варіабельних областей важкого (МН) і легкого (М) ланцюгів пиСОЗ: УНІ, МН2, УНЗ і МНа, і МІ 1,
МІ2 ї МІ3, відповідно, заміняючи послідовності СОК в пиСОЗ. В одному із втілень даного винаходу ці шість послідовностей СОК вбудовані в каркасні послідовності МНІ і М1 пиСО3. В іншому втіленні даного винаходу ці шість послідовностей СОМ вбудовані в каркасні послідовності МНІ і МТ пиСОЗ, де залишок амінокислоти Т у положенні 41 МІ 1 (ЗЕО ІЮ МО:10) замінений на залишок амінокислоти К.
У ще одному втіленні даного винаходу гілка, яка зв'язує СЮОЗ містить шість послідовностей
СОК, обраних з послідовностей СОК, представлених у таблиці 3, де
Хг2 в ЗЕО ІО МО:73 вибирають із М і Р;
Хз в БЕО ІЮО МО:74 є А;
Ха в БЕО ІО МО:75 є Е;
Хв в ЗЕО ІО МО:77 вибирають із ГЕ, б, І, К, ГІ. і М;
Х? в БЕО ІО МО:78 є Р;
Хв в ЗЕО ІО МО:79 вибирають із А і о; і
Хо в ЗЕО ІО МО:80 вибирають із М, К і М.
Таблиця З
ЗЕО І МО ЗЕО І МО ЗЕО ІЮ МО ЗЕО ІЮ МО ЗЕО І МО
17177112 11111804 1 см 11 5
З такими варіантами послідовностей СОК антитіла пиСОЗ мають знижену афінність зв'язування в порівнянні з пиСОЗ, у якому послідовності СОК дикого типу. Зазначені шість послідовностей СОК можуть бути вбудовані в будь-яку з каркасних послідовностей варіабельних областей важкого (МН) і легкого (МІ) ланцюгів пиИСОЗ: УНІ, УН2, МНЗ і УНА, і МІ,
МІ2 ї МІ3, відповідно, заміняючи послідовності СОК в пиСОЗ. В одному із втілень даного винаходу ці шість послідовностей СОК вбудовані в каркасні послідовності МНІ і М1 пиСО3. В іншому втіленні даного винаходу ці шість послідовностей СОМ вбудовані в каркасні послідовності МНІ і МТ пиСОЗ, де залишок амінокислоти Т у положенні 41 МІ 1 (ЗЕО ІЮ МО:10) замінений на залишок амінокислоти К.
В іншому втіленні даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень перша єднальна гілка походить із антитіла проти СОЗ, що володіє афінністю зв'язування з людським СОЗеє(епсілон) (КО) вище 3,4 х 108М, наприклад від 3,5 х 108
М до 9,9 х 1089М, або від 1,0 х 107М до 9,9 х 107 М при визначенні шляхом інтерферометричного аналізу в біошарі (ВІ І).
В іншому втіленні даного винаходу одне або обоє антитіла, що є частинами біспецифічного антитіла, сконструйовані так, щоб послабити або ж підсилити зв'язування з неонатальним рецептором для області Ес (РсКп) з метою управляти часом напівжиття біспецифічних антитіл у сироватці крові. Методики продовження або скорочення часу напівжиття антитіл у сироватці
Ко) крові добре відомі в даній області техніки. Див., наприклад, роботи Ваїгасдца еї аї. 2006, . Віо|.
Спет., 281:23514-24; Ніпіоп еї аІ. 2006, 9У. Іттипої., 176:346-56; і 7аіем5Ку еї аІ. 2010 Маї.
Віотесппої., 28:157-9.
В одному з варіантів даного винаходу біспецифічні антитіла за будь-яким з описаних у даному документі втілень містять першу константну область важкого ланцюга (НС) і першу константну область легкого ланцюга (ІС), причому амінокислотні залишки в положеннях, відповідних до положень 1234, І 235 і 0265 важкого ланцюга людського Їде (5ЕО ІЮ МО:15) в обох (першому й другому) важких ланцюгах є залишками амінокислот РЕ, Е і А, відповідно.
В одному з варіантів даного винаходу біспецифічні антитіла за будь-яким з описаних у даному документі втілень містять першу й другу константні області важкого ланцюга (НС) і першу й другу константні області легкого ланцюга (ІС), причому амінокислотні залишки в положеннях, відповідних до положень 1234 і 1235 важкого ланцюга людського їдс1 (ЗЕО ІЮ
МО:15) в обох (першому й другому) важких ланцюгах є залишками амінокислот Е і Е, відповідно.
В одному з варіантів біспецифічних антитіл за будь-яким з описаних у даному документі втілень даного винаходу перша єднальна гілка є гілюою Раб, яка походить з ЇдДе1-пиСОЗ3-НІ1 1-
ЕЕАК, а друга єднальна гілка є гілкою Раб, яка походить з Ід051-708-ЕЕАЇ.
У даному документі позначення "пиСОЗ3-НІ1 1" відноситься до гуманізованих антитіл 5РЗ4, спрямованих проти СОЗ, у яких ділянки МНІ і МІ/1 є представленими в таблиці 1 як послідовності «ЕС ІЮ МО: 6 і БЕО ІО МО: 10. Позначення "РГЕАГ" відноситься до мутацій І 234Е,
Ї235Е, 0265А і Е405І| у константній області антитіла, а позначення ""ТЕАК" відноситься до мутацій І 234, І 235Е, О0265А і К409К у константній області антитіла; положення амінокислотних залишків відповідають положенням в амінокислотній послідовності людського Їде1. Позначення "ІДЯ1" відноситься до константних областей антитіл, які походять з людського ІдсС1 без зазначених мутацій. Позначення "708" відноситься до антитіла проти СО20, у якому послідовності УН і МІ. є послідовностями, представленими в таблиці 1 як послідовності ФЕО ІЮ
МО: 27 і ЗЕО ІО МО: 28.
В одному із втілень даного винаходу в біспецифічних антитілах за будь-яким з описаних у даному документі втілень перша єднальна гілка є половинною молекулою антитіла, яка походить з Їде1-пиСОЗ3-НТЇ 1-ЕЕАК, а друга єднальна гілка є половинною молекулою антитіла, яка походить з ЇдДО1-708-ЕЕАЇ.
В одному з варіантів біспецифічних антитіл за будь-яким з описаних у даному документі втілень даного винаходу перша єднальна гілка є гілюою Раб, яка походить з ЇдДе1-пиСОЗ3-НІ1 1-
ЕЕАЇГ, а друга єднальна гілка є гілкою Раб, яка походить з ІЇІ4051-708-ЕЕАВ.
В одному з варіантів біспецифічних антитіл за будь-яким з описаних у даному документі втілень даного винаходу перша єднальна гілка є половинною молекулою антитіла (тобто містить один важкий і один легкий ланцюги), яка походить з Ідс1-пиСОЗ3-НІ1 1-ЕЕАЇ, а друга єднальна гілка є половинною молекулою антитіла (гілка Раб і гілка Ес), яка походить з Ід01-708-
ЕЕАВ.
В одному з варіантів даного винаходу біспецифічні антитіла за будь-яким з описаних у даному документі втілень містять першу й другу константні області важкого ланцюга (НС) і першу й другу константні області легкого ланцюга (С), причому амінокислотні залишки в положеннях, відповідних до положень 1 234, І 235 і 0265 важкого ланцюга людського 91 (ЗЕО
ІЮ МО:15) в обох (першій й другій) константних областях важких ланцюгів є залишками амінокислот РЕ, Е і А, відповідно; і в першій константній області важкого ланцюга амінокислотний залишок у положенні, що відповідає Е405 амінокислотної послідовності важкого ланцюга людського їДС1 (5ЕО ІЮ МО:15) є залишком амінокислоти І; і в другій константній області важкого ланцюга амінокислотний залишок у положенні, що відповідає ДО409 амінокислотної послідовності важкого ланцюга людського Ідсе1 (5ЕО ІЮ МО:15) є залишком амінокислоти ЕК; і (і) у першій константній області легкого ланцюга амінокислотні залишки в положеннях, що
Ко) відповідають Е10, ТА1, К55 і І 97 легкого А-ланцюга (5ЕО ІЮ МО:10) є залишками амінокислот Ї,
К, М ї Н, відповідно, або (ії) у першій константній області легкого ланцюга амінокислотний залишок у положенні, що відповідає Т41 легкого А-ланцюга (5ЕО І МО:10) є залишком амінокислоти К.
Інші варіанти біспецифічних антитіл
Біспецифічні антитіла за даним винаходом можуть бути будь-якого ізотипа. Вибір ізотипа, як правило, визначається бажаними ефекторними функціями, у числі яких, наприклад, індукція антитілозалежної клітинноопосередкованої цитотоксичності (АОСС). Прикладами ізотипів є ізотипи ІДС1, ІдСс2, ІдОЗ і Ідс4. Можна використовувати кожну з константних областей легкого ланцюга імуноглобулінів людини - к (каппа) або А (лямбда). Ефекторні функції антитіл за даним винаходом можна змінювати, вибираючи ізотип, наприклад Ідс1, Ідс2, Ідс3, Ідс4, Ід, ІдЧА, Ід4ЧЕ або ІДМ залежно від терапевтичного застосування. В одному із втілень даного винаходу обидві області Ес пропонованих антитіл відносяться до ізотипу (ДО1, наприклад Ідс1,к. В одному із втілень даного винаходу одна із двох областей Ес біспецифічного антитіла відноситься до ізотипу ЇДС1, а інша - до ізотипу Ідс4. За необхідності область Ес може бути модифікована в шарнірній ділянці й/або в домені СНЗ, як описано в даному документі.
В одному із втілень даного винаходу пропоновані антитіла є повнорозмірними антитілами, що переважно відносяться до ізотипу Їдсе1, зокрема Ідс1,к або його варіанту. В іншому втіленні даного винаходу пропоновані антитіла містять фрагмент антитіла або одноланцюгове антитіло.
Антитільні фрагменти можна одержати, наприклад, шляхом поділу молекули антитіла на фрагменти з використанням звичайно застосовуваних у таких випадках методик і наступного їх скринінга для використання в такий же спосіб, як описано в даному документі для цільних антитіл. Наприклад, шляхом обробки антитіла пепсином можна одержати фрагменти Е(аб)».
Отримані в результаті впливи пепсину фрагменти Б(аб)2 можна обробити агентом, що відновлює, наприклад дитіотреїтолом, для відновлення дисульфідних містків, і тоді виходять фрагменти Раб". Шляхом обробки антитіл папаїном можна одержати фрагменти Раб. Фрагменти
Кав)г можуть бути також отримані шляхом з'єднання фрагментів Рар' тіоефірним або дисульфідним зв'язком. Антитільні фрагменти також можна одержати шляхом експресії нуклеотидних послідовностей, що кодують ці фрагменти, у рекомбінантних клітинах (див., наприклад, Емапз5 еї аї., У. Іттипої. Меїй.184, 1233-38 (1995)). Наприклад, химерний ген, що 60 кодує частину фрагмента Е(ар)2, може включати послідовності ДНК, які кодують домен СНІ і шарнірну ділянку важкого ланцюга, за якою розташовується кодон, що зупиняє трансляцію, щоб одержати такий укорочений антитільний фрагмент.
Біспецифічні антитіла проти СО ії СО20 за даним винаходом також можуть бути отримані з одноланцюгових антитіл. Одноланцюгові антитіла - це поліпептиди, у яких області Ем важкого й легкого ланцюгів з'єднані. В одному із втілень даного винаходу пропоновані антитіла містять одноланцюгові Ем (5СЕм), у яких важкий і легкий ланцюги області Ем антитіла проти СО20 за даним винаходом з'єднані за допомогою гнучкого пептидного лінкера (який складається, як правило, з 10, 12, 15 або більше амінокислотних залишків) в один поліпептидний ланцюг.
Способи одержання таких антитіл описані, наприклад. у патенті США Мо 4,946,778, а також у роботах: РінсКійип А. "Те РІаптасоїоду ої Мопосіопа! Апіїродібє5", мої. 113, Козепбигуд апа
Мооге еав5. 5ргіпдег-Мепаяд, Мем Моїк, рр. 269-315 (1994); Віга еї а!., Зсіепсе 242, 423-426 (1988);
Нивюп єї аі., РМАБ ОБА 85, 5879-5883 (1988) і Мсосанетпу еї а!., Маїшге 348, 552-554 (1990).
Біспецифічне антитіло може бути утворене із двох областей Мн і Мі - з одноланцюгового антитіла проти СО20 і одноланцюгового антитіла проти СОЗ або ж полівалентне антитіло може бути утворене з більш ніж двох ланцюгів Мн і Мі.
В одному із втілень даного винаходу одна із двох областей Ес або обидві ці області моноклональних антитіл проти СОЗ і проти СО20 для одержання біспецифічних антитіл за даним винаходом мають недостатню ефекторну функцію.
Кон'югати
В іншому варіанті даного винаходу пропонуються біспецифічні антитіла проти СОЗ ії СО20, з'єднані (кон'юговані) з однією або більше структурами, які мають терапевтичне призначення, наприклад із цитокінами, імуносупресорами, імуностимулюючими агентами й/або радіоактивними ізотопами. У даному документі такі кон'югати називаються імунокон'югатами, або лікарськими кон'югатами. Імунокон'югати, які включають один або більше цитокінів, називаються імунотоксинами.
В одному із втілень даного винаходу перша й/або друга області Ес кон'юговані з лікарським агентом або із проліками, або містять групу, що є для них акцептором. Такою акцепторною групою може бути, наприклад, неприродна амінокислота.
Композиції
Зо В іншому своєму аспекті даний винахід відноситься до фармацевтичної композиції, яка містить: - біспецифічне антитіло проти СОЗ ії СО20 за будь-яким з описаних у даному документі втілень даного винаходу; - фармацевтично прийнятний носій.
Фармацевтична композиція за даним винаходом може містити одне біспецифічне антитіло за даним винаходом або комбінацію різних біспецифічних антитіл за даним винаходом.
Пропонована фармацевтична композиція може бути виготовлена звичайно застосовуваними для одержання подібних складів методами, описаними, наприклад, у роботі
Ветіпдюп: Те 5сієпсе апа Ргасіїсе ої Рнаптасу, 191п Еайіоп, Сеппаго, Ед., Маск Рибіївпіпа Со.,
Еазюп, РА, 1995. Фармацевтична композиція за даним винаходом може включати розріджувачі, наповнювачі, солі, буферні агенти, детергенти (наприклад неіїонні детергенти, наприклад
Тмжееп-20 або Тмееп-80) агенти, що стабілізують (наприклад, цукри або вільні амінокислоти), консерванти, фіксатори тканин, солюбілізуючі агенти й/або інші речовини, придатні для включення у фармацевтичні композиції.
Фармацевтично прийнятні носії включають будь-які (і всі) придатні за даним винаходом розчинники, дисперсійні середовища, покриваючі матеріали, антибактеріальні й фунгіцидні агенти, речовини, що забезпечують потрібний осмотичний тиск, антиоксиданти й речовини, що сповільнюють усмоктування, і інші ексципієнти, фізіологічно сумісні з біспецифічними антитілами за даним винаходом. Приклади водних і неводних носіїв, придатних для використання у фармацевтичних композиціях за даним винаходом, включають воду, фізіологічний розчин, фізіологічний розчин, забуферений фосфатом, етиловий спирт, декстрозу, багатоатомні спирти (наприклад, гліцерин, пропіленгліколь, полієтиленгліколь і т. п.), і їх суміші, рослинні олії, колоїдні розчини карбоксиметилцелюлози, трагакантову камедь і придатні для ін'єкцій складні органічні ефіри (наприклад, етилолеат) і/або різні буферні розчини.
Фармацевтично прийнятні носії включають стерильні водяні розчини або дисперсії й стерильні порошки для приготування стерильних розчинів або дисперсій для негайного використання при ін'єкціях. Потрібна плинність досягається шляхом використання, наприклад, речовин, що утворюють оболонку, наприклад лецитина; забезпеченням потрібного розміру часток (у випадку дисперсій) і шляхом використання поверхнево-активних речовин. бо Фармацевтичні препарати біспецифічних антитіл за даним винаходом також можуть містити фармацевтично прийнятні антиоксиданти, наприклад (1) водорозчинні антиоксиданти, наприклад аскорбінову кислоту, цистеїна гідрохлорид, бісульфат натрію, метабісульфіт натрію, сульфіт натрію й ін.; (2) жиророзчинні антиоксиданти, наприклад аскорбілпальмітат, бутилгідроксианізол, бутилгідрокситолуол, лецитин, пропілгалат, альфа-токоферол і ін.; і (3) хелатуючі агенти, що утворюють комплекси з металами, наприклад лимонна кислота, етилендиамінтетраоцтова кислота (ЕЮОТА), сорбіт, виннокам'яна кислота, фосфорна кислота й ін.
Фармацевтичні препарати біспецифічних антитіл за даним винаходом також можуть містити речовини, які забезпечують потрібний осмотичний тиск, наприклад цукри, багатоатомні спирти (наприклад, маніт, сорбіт, гліцерин) або хлорид натрію.
Фармацевтичні препарати біспецифічних антитіл за даним винаходом також можуть містити один або більше допоміжних інгредієнтів залежно від обраного шляху введення препарату, наприклад консерванти, змочуючі агенти, емульгуючі агенти, диспергуючі агенти, консерванти або забуферюючі речовини, які можуть збільшити строк зберігання або ефективність фармацевтичної композиції. Біспецифічні антитіла за даним виготовленням можуть бути отримані разом з носіями, що перешкоджають їхньому занадто швидкому вивільненню, наприклад у складі препаратів з уповільненим рівномірним вивільненням активного інгредієнта, у тому числі імплантованих форм, пластирів і наклейок для черезшкірного введення й систем з інкапсульованим (ув'язненим у мікрочастинки) активним інгредієнтом. Такі носії включають желатин, гліцерилмоностеарат, гліцерилдистеарат, біосумісні полімери, здатні до біологічної деградації (наприклад, етиленвінілацетат, поліангідриди, полігліколева кислота, колаген, складні поліортоефіри й полімолочна кислота), самі по собі або з воском, або інші матеріали, відомі в даній області техніки. Методи одержання таких складів загальновідомі фахівцям у даній області техніки.
Стерильні розчини для ін'єкцій можуть бути отримані шляхом включення активної речовини в потрібну кількість придатного розчинника за необхідності з одним або декількома перерахованими вище інгредієнтами й наступною стерилізацією шляхом мікрофільтрації.
Дисперсії одержують, як правило, шляхом включення активної речовини в стерильний носій, що містить основне дисперсійне середовище й потрібну кількість інших інгредієнтів, наприклад із
Зо числа згаданих вище. У випадку стерильних порошків для приготування стерильних розчинів для ін'єкцій методи їх одержання включають висушування у вакуумі й ліофілізацію (заморожування-висушування), у результаті чого можна одержати порошок, який містить крім активного інгредієнта будь-який бажаний додатковий інгредієнт із попередньо стерилізованого профільтрованого їхнього розчину.
Фактичний вміст (доза) активних інгредієнтів у фармацевтичній композиції може варіювати таким чином, щоб забезпечити терапевтично ефективну кількість активного інгредієнта, тобто кількість, достатню для досягнення бажаного терапевтичного ефекту в даного індивіда при даному складі композиції й даному способі її ведення пацієнтові, без токсичного ефекту. Вибір дози залежить від різних фармакокінетичних факторів, у тому числі від активності використовуваної композиції за даним винаходом, шляху й тривалості введення, швидкості виведення з організму використовуваної сполуки, тривалості курсу лікування, інших лікарських препаратів, речовин і/або матеріалів, використовуваних у комбінації з даною композицією, віку, статі, маси тіла, загального стану здоров'я й конкретного стану пацієнта, його анамнезу й інших подібних факторів, добре відомих в області медицини.
Фармакологічні композиції за даним винаходом можна вводити в організм пацієнта будь- яким придатним способом. В одному із втілень даного винаходу пропонована фармацевтична композиція вводиться парентерально. Термін "парентеральне введення" у даному документі означає способи введення крім травного тракту й місцевого застосування (зазвичай шляхом ін'єкції) і включає введення в поверхневі шари шкіри, внутрішньовенні, внутрішньом'язові, інтраартеріальні, інтратекальні, інтракапсулярні, внутрішньоочноямкові, інтракардіальні, інтрадермальні, внутрішньоочеревинні, внутрішньосухожильні, транстрахеальні, підшкірні, внутрішньошкірні, внутрішньосуглобні, субкапсулярні, субаракноїдальні, інтраспинальні, внутрічерепні, інтраторакальні, епідуральні й інтрастернальні ін'єкції й інфузії.
В одному із втілень даного винаходу пропоновану фармацевтичну композицію вводять шляхом внутрішньовенних або підшкірних ін'єкцій або інфузій.
Застосування
В одному зі своїх аспектів даний винахід відноситься до біспецифічних антитіл, композицій або фармацевтичних композицій за будь-яким з описаних у даному документі втілень даного винаходу для використання як медикаменту. 60 В одному зі своїх аспектів даний винахід відноситься до біспецифічних антитіл, композицій або фармацевтичних композицій за будь-яким з описаних у даному документі втілень даного винаходу для лікування захворювань.
В одному зі своїх аспектів даний винахід відноситься до біспецифічних антитіл, композицій або фармацевтичних композицій за будь-яким з описаних у даному документі втілень даного винаходу для застосування в індивідів, які цього потребують.
В одному із втілень даного винаходу захворювання, яке підлягає лікуванню є злоякісним новоутворенням зі зрілих В-клітин.
В одному із втілень даного винаходу захворювання, яке підлягає лікуванню є раковим захворюванням, наприклад неходжкінською лімфомою або В-клітинним лейкозом.
Біспецифічні антитіла за даним винаходом можна використовувати для ряду цілей. Зокрема, біспецифічні антитіла за даним винаходом можна використовувати для лікування різних ракових захворювань, включаючи метастазуючі й резистентні форми.
Зокрема, біспецифічні антитіла за даним винаходом можуть бути корисні в планах лікування, у яких бажане специфічне націлювання й опосередковане Т-лімфоцитами знищення клітин, у яких експресується СО20; у таких терапевтичних планах і показаннях біспецифічні антитіла за даним винаходом можуть бути більш ефективні, ніж звичайні антитіла проти СО20.
Біспецифічні антитіла за даним винаходом також можуть бути додатково корисні в лікуванні й діагностиці різних захворювань, пов'язаних з СО20. Наприклад, ці біспецифічні антитіла можна використовувати, щоб викликати іп мімо або іп міго одну або більше із наступних біологічних активностей: пригнічення росту й/(або диференціювання клітин, у яких експресується
СО20; знищення клітин, у яких експресується СО20; опосередкування фагоцитозу або антитілозалежної клітинноопосередкованої цитотоксичності (АООСС) відносно клітин, у яких експресується СО20, у присутності людських ефекторних клітин; опосередкування цитотоксичності, залежної від комплементу (СОС), відносно клітин, у яких експресується СО20, у присутності комплементу; опосередкування апоптоза клітин, у яких експресується СО20; і/або індукування переносу в ліпідні "плоти" (рафти) клітинної мембрани після зв'язування СО20.
В іншому втіленні даного винаходу пропоновані біспецифічні антитіла використовуються, щоб впливати на імунологічні реакції, опосередковані Т-лімфоцитами, запалення й перебудову мікрооточення.
Зо В одному з конкретних втілень даного винаходу біспецифічні антитіла використовуються іп мімо для лікування, запобігання й діагностики різних захворювань, пов'язаних з СО20. Приклади захворювань, пов'язаних з СО20, включають, крім іншого, В-клітинну лімфому, наприклад неходжкінську лімфому (МН), В-клітинний лейкоз і розлади імунної системи, наприклад аутоїмунні захворювання, наприклад перераховані нижче.
В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла використовуються для лікування неходжкінської лімфоми (МНІ)) або В-клітинного лейкозу.
В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла використовуються для лікування, що не піддаються терапії антитілами проти СО20 неходжкінської лімфоми (МНІ) або В- клітинного лейкозу, наприклад МНІ. або В-клітинного лейкозу, резистентних до ритуксимабу або офатумумабу, або неагресивної В-клітинної лімфоми, резистентної до ритуксимабу.
В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла використовуються для лікування гострого лімфобластного лейкозу (АГ), наприклад рецидивуючого або рефрактерного АГ.
В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла використовуються для лікування хронічного лімфобластного лейкозу (СС), наприклад рецидивуючого або рефрактерного СІ.
В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла використовуються для лікування фолікулярної лімфоми (ГЕ), наприклад рецидивуючої або рефрактерної РІ...
В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла використовуються для лікування лімфоматоїдного гранулематоза І ступеню диференціювання в дорослих; екстранодальної
МК/ІТ-клітинної лімфоми назального типу в дорослих; анапластичної крупноклітинної лімфоми; ангіоїмунобластної Т-клітинної лімфоми; лімфоми бБеркитта із залученням сусідніх груп лімфовузлів стадії Ії у дорослих; дифузної крупноклітинної лімфоми із залученням сусідніх груп лімфовузлів стадії І у дорослих; дифузної змішано-клітинної лімфоми із залученням сусідніх груп лімфовузлів стадії Ії у дорослих; дифузної дрібноклітинної лімфоми з розсіченими ядрами із залученням сусідніх груп лімфовузлів стадії І у дорослих; імунобластної крупноклітинної лімфоми із залученням сусідніх груп лімфовузлів стадії ІІ у дорослих; лімфобластної лімфоми із залученням сусідніх груп лімфовузлів стадії І у дорослих; фолікулярної лімфоми першого ступеня диференціювання із залученням сусідніх лімфовузлів І! стадії; фолікулярної лімфоми другого ступеня диференціювання із залученням сусідніх лімфовузлів Ії стадії; фолікулярної лімфоми третього ступеня диференціювання із залученням сусідніх лімфовузлів І! стадії; бо мантійноклітинної лімфоми із залученням сусідніх лімфовузлів І! стадії; лімфоми із клітин маргінальної зони із залученням сусідніх лімфовузлів І! стадії; дрібноклітинної лімфоцитарної лімфоми із залученням сусідніх лімфовузлів І! стадії; шкірної В-клітинної неходжкінської лімфоми; інфекції вірусом Епштейна-Барр; екстранодальної лімфоми з В-клітин маргінальної зони лімфоїдної тканини слизуватих; печінково-селезінкової лімфоми; внутрішньоочноямкової лімфоми; нодальної лімфоми з В-клітин маргінальної зони; лімфоми Беркитта без залучення сусідніх лімфовузлів ІІ стадії в дорослих; дифузної крупноклітинної лімфоми без залучення сусідніх лімфовузлів ІІ стадії в дорослих; дифузної змішано-клітинної лімфоми без залучення сусідніх груп лімфовузлів стадії І у дорослих; дифузійної дрібноклітинної лімфоми з розсіченими ядрами без залучення сусідніх груп лімфовузлів стадії ІІ у дорослих; імунобластної крупноклітинної лімфоми без залучення сусідніх груп лімфовузлів стадії ПП у дорослих; лімфобластної лімфоми без залучення сусідніх груп лімфовузлів стадії І у дорослих; фолікулярної лімфоми першого ступеня диференціювання без залучення сусідніх лімфовузлів ЇЇ стадії; фолікулярної лімфоми другого ступеня диференціювання без залучення сусідніх лімфовузлів ІЇ стадії; фолікулярної лімфоми третього ступеня диференціювання без залучення сусідніх лімфовузлів І! стадії; мантійноклітинної лімфоми без залучення сусідніх лімфовузлів ЇЇ стадії; лімфоми із клітин маргінальної зони без залучення сусідніх лімфовузлів І! стадії; дрібноклітинної лімфоцитарної лімфоми без залучення сусідніх лімфовузлів І! стадії; нешкірної екстранодальної лімфоми; периферичної Т-клітинної лімфоми; посттрансплантаційного лімфопроліферативного розладу; прогресуючого волосатоклітинного лейкозу (первинне лікування); рецидивуючої лімфоми Беркитта в дорослих; рецидивуючої дифузійної змішано- клітинної лімфоми в дорослих; рецидивуючої дифузійної дрібноклітинної лімфоми з розсіченими ядрами в дорослих; рецидивуючого лімфоматоїдного гранулематоза Ш ступеню диференціювання в дорослих; рецидивуючої ходжкінської лімфоми в дорослих; рецидивуючої імунобластної крупноклітинної лімфоми в дорослих; рецидивуючої лімфобластної лімфоми в дорослих; рецидивуючих Т-клітинних лейкозу/лімфоми в дорослих; рецидивуючої шкірної Т- клітинної неходжкінської лімфоми; рецидивуючої фолікулярної лімфоми першого ступеня диференціювання; рецидивуючої фолікулярної лімфоми другого ступеня диференціювання; рецидивуючої фолікулярної лімфоми третього ступеня диференціювання; рецидивуючої мантійноклітинної лімфоми; рецидивуючої лімфоми із клітин маргінальної зони; рецидивуючої
Зо фунгоїдної (грибоподібної) гранулеми/синдрому Сезарі; рецидивуючої дрібноклітинної лімфоцитарної лімфоми; рефрактерного волосатоклітинного лейкозу; лімфоми тонкого кишечнику; селезінкової лімфоми із клітин маргінальної зони; лімфоми Беркитта стадії І у дорослих; дифузійної крупноклітинної лімфоми стадії І у дорослих; дифузійної змішано- клітинної лімфоми стадії І у дорослих; дифузійної дрібноклітинної лімфоми з розсіченими ядрами стадії І у дорослих; ходжкінської лімфоми стадії І у дорослих; імунобластної крупноклітинної лімфоми стадії І у дорослих; лімфобластної лімфоми стадії | в дорослих; Т- клітинного лейкозу/лімфоми стадії І у дорослих; шкірної Т-клітинної неходжкінської лімфоми стадії І у дорослих; фолікулярної лімфоми першого ступеня диференціювання стадії | у дорослих; фолікулярної лімфоми другого ступеня диференціювання стадії І у дорослих; фолікулярної лімфоми третього ступеня диференціювання стадії | у дорослих; мантійноклітинної лімфоми стадії І; лімфоми із клітин маргінальної зони стадії І; дрібноклітинної лімфоцитарної лімфоми стадії І; фунгоїдної (грибоподібної) гранулеми/синдрому Сезарі стадії
ІА; фунгоїдної (грибоподібної) гранулеми/синдрому Сезарі стадії ІВ; ходжкінської лімфоми стадії
ІП у дорослих; Т-клітинного лейкозу/лімфоми стадії ІП у дорослих; шкірної Т-клітинної неходжкінської лімфоми стадії І у дорослих; фунгоїдної (грибоподібної) гранулеми/синдрому
Сезарі стадії ПА; фунгоїдної (грибоподібної) гранулеми/синдрому Сезарі стадії ІВ; лімфоми
Беркитта стадії ІМ у дорослих; дифузійної крупноклітинної лімфоми стадії ІМ у дорослих; дифузійної змішано-клітинної лімфоми стадії ІМ у дорослих; дифузійної дрібноклітинної лімфоми з розсіченими ядрами стадії ІМ у дорослих; ходжкінської лімфоми стадії ІМ у дорослих; імунобластної крупноклітинної лімфоми стадії ІМ у дорослих; лімфобластної лімфоми стадії ІМ у дорослих; Т-клітинного лейкозу/лімфоми стадії ІМ у дорослих; шкірної Т-клітинної неходжкінської лімфоми стадії ІМ у дорослих; фолікулярної лімфоми першого ступеня диференціювання стадії
ІМ у дорослих; фолікулярної лімфоми другого ступеня диференціювання стадії ІМ у дорослих; фолікулярної лімфоми третього ступеня диференціювання стадії ІМ ов дорослих; мантійноклітинної лімфоми стадії ІМ; лімфоми із клітин маргінальної зони стадії ІМ; дрібноклітинної лімфоцитарної лімфоми стадії ЇМ; фунгоїдної (грибоподібної) гранулеми/синдрому Сезарі стадії ІМА; фунгоїдної (грибоподібної) гранулеми/синдрому Сезарі стадії ІМВ; Т-клітинного лейкозу з великих зернистих лімфоцитів; лімфоми яєчка; нелікованого волосатоклітинного лейкозу; або макроглобулінемії Вальденстрема. бо В одному з конкретних втілень даного винаходу пропоновані антитіла використовуються для лікування або запобігання неходжкінської лімфоми (МНІ), оскільки ці антитіла викликають зменшення кількості пухлинних клітин, що несуть СО20.
Неходжкінська лімфома (МНІ)) - це один з типів В-клітинних лімфом. Лімфоми, наприклад В- клітинні лімфоми - це група споріднених ракових захворювань, які виникають у результаті злоякісної трансформації клітин крові, названих лімфоцитами. Нормальна функція лімфоцитів полягає в тому, щоб захищати організм від чужорідних організмів - мікробів, вірусів, грибів, а також від раку. Існує безліч різновидів і стадій дозрівання лімфоцитів і, відповідно, існує безліч різних лімфом. Злоякісні лімфоцити здатні, як і нормальні, переміщатися в різні ділянки організму. Як правило, лімфомні клітини утворюють пухлини в лімфатичній системі: у кістковому мозку, лімфатичних вузлах, селезінці й крові. Однак ці клітини можуть мігрувати в інші органі.
Певним типам лімфом властива тенденція до росту в тих місцях, де перебувають відповідні нормальні клітини. Наприклад, фолікулярні неходжкінські лімфоми розвиваються, як правило, у лімфатичних вузлах.
У неопластичних (тобто туморогенних - тих, що дають початок розвитку пухлині) В- лімфоцитах, асоційованих з неходжкінської лімфомою, рівень експресії СО20 зазвичай підвищений. Відповідно, антитіла, які зв'язуються з СО20, за даним винаходом можна використовувати для виснаження пухлинних клітин, що несуть СО20, які приводять до неходжкінської лімфоми, і в такий спосіб для запобігання або лікування цього захворювання.
Біспецифічні антитіла за даним винаходом також можна використовувати для того, щоб блокувати або придушити інші ефекти, обумовлені СО20. Наприклад, відомо, що СО20 експресується в В-лімфоцитах, є присутнім на їхній клітинній поверхні й бере участь у проліферації й/або диференціюванні цих клітин. Оскільки В-лімфоцити мають імуномодулюючу функцію, СО20О є важливою мішенню для терапії з використанням антитіл для націлювання на
В-лімфоцити, наприклад щоб інактивувати або вбити В-лімфоцити, які відіграють роль в аутоїмунних розладах. Такі аутоїмунні розлади включають, наприклад, перераховані вище захворювання.
Відповідно, даний винахід відноситься до способу знищення пухлинних клітин, у яких експресується СО20, що включає введення індивідові, який цього потребує ефективної кількості біспецифічних антитіл за даним винаходом.
Даний винахід також відноситься до способу лікування раку, який включає: а) вибір індивіда, який страждає на ракове захворювання, при якому у пухлинних клітинах експресується СО20О, і
Б) уведення обраному індивідові біспецифічних антитіл за даним винаходом або фармацевтичної композиції за даним винаходом.
Даний винахід також відноситься до використання біспецифічних антитіл, які зв'язуються з людськими СОЗ ії СО20, для одержання лікарського засобу для лікування раку, наприклад за показниками при певних ракових захворюваннях, згаданих у даному документі.
Даний винахід також відноситься до біспецифічних антитіл для використання при лікуванні раку, наприклад за показниками при певних ракових захворюваннях, згаданих у даному документі.
В одному із втілень даного винаходу пропоновані біспецифічні антитіла призначені для використання при лікуванні злоякісних новоутворень зі зрілих В-лімфоцитів. В одному із втілень даного винаходу пропоновані біспецифічні антитіла призначені для використання при лікуванні пухлин, у яких експресується СО20. В одному із втілень даного винаходу пропоновані біспецифічні антитіла призначені для використання при лікуванні В-клітинної лімфоми. В одному із втілень даного винаходу пропоновані біспецифічні антитіла призначені для використання при лікуванні В-клітинної лімфоми, наприклад неходжкінської лімфоми (МН). В одному із втілень даного винаходу пропоновані біспецифічні антитіла призначені для використання при лікуванні лімфобластного лейкозу/лімфоми з попередників В-клітин. В одному із втілень даного винаходу пропоновані біспецифічні антитіла призначені для використання при лікуванні В-клітинного хронічного лімфоцитарного лейкозу (СІ! 1). В одному із втілень даного винаходу пропоновані біспецифічні антитіла призначені для використання при лікуванні дрібноклітинної лімфоцитарної лімфоми (5113. В одному із втілень даного винаходу пропоновані біспецифічні антитіла призначені для використання при лікуванні В-клітинного пролімфоцитарного лейкозу. В одному із втілень даного винаходу пропоновані біспецифічні антитіла призначені для використання при лікуванні мантійноклітинної лімфоми (МСІ).В одному із втілень даного винаходу пропоновані біспецифічні антитіла призначені для використання при лікуванні фолікулярної лімфоми (Б), включаючи це захворювання з низьким ступенем диференціювання, із середнім ступенем диференціювання й з високим ступенем бо диференціювання. В одному із втілень даного винаходу пропоновані біспецифічні антитіла призначені для використання при лікуванні В-клітинної ходжкінської лімфоми. В одному із втілень даного винаходу пропоновані біспецифічні антитіла призначені для використання при лікуванні імунологічних розладів, у яких відіграють роль В-лімфоцити, у яких експресується
СО20. В одному із втілень даного винаходу пропоновані біспецифічні антитіла призначені для використання при лікуванні псоріазу.В одному із втілень даного винаходу пропоновані біспецифічні антитіла призначені для використання при лікуванні склерозів. В одному із втілень даного винаходу пропоновані біспецифічні антитіла призначені для використання при лікуванні запальних захворювань кишечника.
Для зазначених вище застосувань кращі антитіла Б5Іде1-пиСОЗ3-НІІ 1-РЕАЇ хСр2г0-708-
ЕЕАК, хоча можна використовувати будь-яке з біспецифічних антитіл проти СОЗ ї СО20, описаних у даному документі.
Біспецифічні антитіла за даним винаходом придатні для численних діагностичних і терапевтичний застосувань іп мімо і іп міїго, які включають діагностування й лікування розладів за участю клітин, у яких експресується СО20. Наприклад, ці антитіла можна вводити в клітини в культурі, наприклад іп міго або ех мімо, або людям, наприклад іп мімо, з метою лікування, запобігання й діагностування різноманітних розладів. У даному документі термін "Індивід/пацієнт/ухворий" включає людей і тварин, у яких розвивається відповідна реакція на біспецифічні антитіла проти СОЗ і СО20. Кращі за даним винаходом індивіди включають людей з розладами, які можна купірувати або послабити шляхом пригнічення або регуляції В- лімфоцитів (нормальних або злоякісних).
В одному зі своїх аспектів даний винахід відноситься до діагностичної композиції, яка містить біспецифічні антитіла за будь-яким з описаних у даному документі втілень. В одному із втілень даного винаходу ця діагностична композиція служить супутнім діагностичним засобом, який використовується для виявлення й відбору індивідів, яким може принести користь лікування з використанням біспецифічних антитіл.
В одному із втілень даного винаходу пропоновані біспецифічні антитіла використовуються для лікування індивідів з онкогенним розладом, наприклад розладом, що відрізняється наявністю пухлинних клітин, у яких експресується СО20, включаючи, наприклад, В-клітинні лімфоми, наприклад неходжкінську лімфому. Приклади онкогенних захворювань, які можна
Зо лікувати й/або попереджати, включають В-клітинні лімфоми, наприклад неходжкінську лімфому в тому числі лімфобластний лейкоз/лімфому з попередників В-клітин і новоутворення зі зрілих
В-лімфоцитів, наприклад хронічний В-клітинний лімфоцитарний лейкоз (СІ )/дрібноклітинну лімфоцитарну лімфому (5/3, В-клітинний пролімфоцитарний лейкоз, лімфоплазмоцитарну лімфому, мантійноклітинну лімфому, (МСІ), фолікулярну лімфому (РІ), включаючи це захворювання з низьким ступенем диференціювання, з середнім ступенем диференціювання й з високим ступенем диференціювання, шкірну лімфому із центральних клітин фолікула, лімфому з В-клітин маргінальної зони (тип МАЇТ, нодальний або селезінковий), волосатоклітинний лейкоз, дифузійну крупноклітинну В-клітинну лімфому (ОЇ ВСІ), лімфому
Беркитта, плазмоцитому, плазмоклітинну мієлому, посттрансплантаційний лімфопроліферативний розлад, макроглобулінемію Вальденстрема, злоякісну меланому й анапластичну крупноклітинну лімфому (АГ СІ).
Інші приклади В-клітинних неходжкінських лімфом: лімфоматоїдний гранулематоз, первинна ефузійна лімфома, внутрішнсудинна крупноклітинна В-клітинна лімфома, медіастинальна крупноклітинна В-клітинна лімфома, хвороба важких ланцюгів (включаючи у-, р-, і с-варіанти), лімфоми, викликані імуносупресорами, наприклад лімфома, індукована циклоспорином, і лімфома, індукована метотрексатом.
В іншому втіленні даного винаходу пропоновані біспецифічні антитіла використовуються для лікування В-клітинних ходжкінських лімфом.
Приклади імунологічних розладів, у яких відіграють роль В-лімфоцити з експресією СО20 і які можна лікувати й/(або попереджати, включають аутоїмунні розлади, наприклад псоріаз, псоріатичний артрит, дерматит, системну склеродермію й склерози, запальні захворювання кишечника (ІВО), хвороба Крона, виразковий коліт, респіраторний дистрес-синдром, менінгіт, енцефаліт 9 у тому числі синдром хронічної утоми/міалгічний енцефаліт (СЕБ/МЕ)) і синдром хронічної утоми/міалгічний енцефаліт (СЕБЗ/МЕ), увеїт, гломерулонефрит, екзему, астму, атеросклероз, недостатність адгезії лейкоцитів, розсіяний склероз, синдром Рейно, синдром
Шегрена, юнацький діабет, хвороба Рейтера, хвороба бБехчета, нефрит з імунними комплексами, ІдА-нефропатію, ІдМ-полінейропатію, імуноопосередковану тромбоцитопенію, наприклад гостру ідіоспатичну тромбоцитопенічну пурпуру й хронічну ідіопатичну тромбоцитопенічну пурпуру, гемолітичну анемію, міастенію, вовчаковий нефрит, системний бо червоний вовчак, ревматоїдний артрит (КА), атопічний дерматит, пемфігоїд, хворобу Грейвса, бо тиреоїдит Хасімото, гранулематоз Вегенера, синдром Оменна, хронічну ниркову недостатність, гострий інфекційний мононуклеоз, інфекцію вірусом імунодефіциту людини (НІМ) і захворювання, асоційовані з герпесвірусами. Інші приклади: важкий гострий респіраторний дистрес-синдром і хореоретиніт. Також інші захворювання й розлади включають такі, які викликані або опосередковані вірусним ураженням В-лімфоцитів, наприклад інфекцію вірусом
Епштейна-Барр (ЕВМ).
Інші приклади запальних, імунологічних і/або аутоїмунних розладів, при яких виражені аутоантитіла й/або надмірна активність В-лімфоцитів і які можна лікувати й/або попереджати, включають наступні захворювання: васкуліт і інші судинні розлади, наприклад, мікроскопічний поліангіїт, синдром Черга-
Штраусса й інші васкуліти, пов'язані з антинейтрофільними цитоплазматичними антитілами (АМСА), вузликовий поліартеріїт, есенційний кріоглобулінемічний васкуліт, шкірний лейкоцитокластичний ангіїт, хвороба Кавасакі, артеріїт Такаясу, гігантоклітинний артеріїт, пурпуру Геноха-Шенлейна, первинний або ізольований церебральний ангіїт, вузликову еритему, облітеруючий тромбоангіїт, тромботичну тромбоцитопенічну пурпуру (включаючи гемолітичний уремічний синдром) і вторинні васкуліти, у тому числі шкірний лейкоцитокластичний ангіїт (наприклад, вторинний відносно гепатиту В, гепатиту С, макроглобулінемії Вальденстрема, В- клітинних неоплазій, ревматоїдного артриту, синдрому Шегрена або системного червоного вовчака); інші приклади: вузликова еритема, алергійний васкуліт, панікуліт, хвороба Вебера-
Крісчена, гіперглобулінемічна пурпура й хвороба Бюргера; шкірні захворювання, наприклад, контактний дерматит, лінійний Ід-дерматоз, вітиліго, гангренозна піодермія, набутий бульозний епідермоліз, вульгарна пузирчатка (пемфігої, у тому числі рубцевий пемфігоїд і бульозний пемфігоїд), осередкове облисіння (у тому числі універсальна й тотальна алопеція), герпетиформний дерматит, поліморфна еритема й хронічна аутоїмунна кропивниця (у тому числі ангіоневротичний набряк й уртикарний васкуліт); імуноопосредованні цитопенії, наприклад, аутоїмунна нейтропенія й істинна еритроцитарна аплазія; порушення сполучної тканини, наприклад, нейролюпус (енцефалопатія при системному червоному вовчаку), дискоїдний червоний вовчак, лімітована склеродермія (синдром СКЕ5Т),
Зо змішане захворювання сполучної тканини, поліміозит/дерматоміозит, міозит з тільцями включення, вторинний амілоїдоз, кріоглобулінемія типу І ії Ії, фіброміалгія, антифосфоліпідний синдром, вторинна гемофілія, рецидивуючий поліхондрит, саркоїдоз, синдром м'язової скутості й ревматична лихоманка; інші приклади: еозинофільний фасциїт; міозит і юнацький дерматоміозит; артрити, наприклад анкілозуючий спондиліт, юнацький хронічний артрит, хвороба Стилла дорослих і синдром пустульоз-гіперостоз-остеїт (БАРНО); інші приклади: сакроїлеїт, реактивний артрит, синдром Стилла й подагра; гематологічні розлади, апластична анемія, первинна гемолітична анемія (у тому числі хвороба холодових аглютинінів, гемолітична анемія, вторинна відносно хронічного лімфоцитарного лейкозу або системного червоного вовчаку; полінейропатія з органомегалією (синдром РОЕМ5), перніциозна анемія й гіперглобулінемічна пурпура Вальденстрема; інші приклади: агранулоцитоз, аутоїмунна нейтропенія, паранеопластичний синдром, хвороба
Франкліна, хвороба Селігмана, хвороба важких цд-ланцюгів, паранеопластичний синдром, вторинний відносно тімоми й лімфом, і утворення інгібіторів фактора МІ згортання крові; ендокринопатії, наприклад, поліендокринопатія й хвороба Адісона; інші приклади: аутоїмунна гіпоглікемія, аутоїмунний гіпотиреоїдизм, аутоїмунний інсуліновий синдром, тиреоїдит де Кервена й резистентність до інсуліну, опосередкована антитілами до рецептора інсуліну; шлунково-кишкові й печіночні розлади, наприклад целіакія, хвороба Уіпла, первинний біліарний цироз, хронічний активний гепатит і первинний склерозуючий холангіт; інші приклади: аутоїмунний гастрит; нефропатії, наприклад швидко прогресуючий гломерулонефрит, постстрептококовий нефрит, синдром Гудпасчера, мембранозний гломерулонефрит і кріоглобулінемічний нефрит; інші приклади: ліпоїдний нефроз; неврологічні розлади, наприклад аутоімунні нейропатії множинний мононеврит, міастенічний синдром Ламберта-Ітона, хорея Сіденгама, спинна сухотка й синдром Гійена-
Барре; інші приклади: мієлопатія/тропічний спастичний парапарез, міастенія, гостра запальна демієлінізуюча полінейропатія й хронічна запальна демієлінізуюча полінейропатія; серцеві й легеневі розлади, наприклад, фіброзний альвеоліт, облітеруючий бронхіоліт, бо алергійний аспергільоз, муковісцидоз, синдром Лефлера, міокардит і перикардит; інші приклади:
гіперчутливий пневмоніт і паранеопластичний синдром, вторинний відносно раку легені; алергійні захворювання, наприклад, бронхіальна астма й синдром Баклі (гіпер-ІДЕ-синдром); інші приклади: скороминуча сліпота; офтальмологічні захворювання, наприклад, ідіопатичний хоріоретиніт; інфекційні захворювання, наприклад, інфекція парвовірусом В (у тому числі папульозно- геморагічний синдром типу "шкарпеток і рукавичок" (РРОББ)); гінекологічні й акушерські захворювання, наприклад, звичний викидень, синдром втрати плода й внутрішньоутробна затримка розвитку плода; інші приклади: паранеопластичний синдром, вторинний відносно гінекологічних новоутворень; розлади чоловічої репродуктивної функції, наприклад, паранеопластичний синдром, вторинний відносно новоутворень у яєчках; розлади, пов'язані із трансплантацією, наприклад, відторгнення трансплантата (алло- або ксенотрансплантата), реакція "трансплантат проти хазяїна" (у тому числі хронічна).
В одному із втілень даного винаходу захворювання, що підлягає лікуванню пропонованим у даному документі способом є запальним, імунологічним і/або аутоїмунним розладом, обраним з виразкового коліту, хвороби Крона, юнацького діабету, розсіяного склерозу, імуноопосредованної тромбоцитопенії, наприклад гострої ідіопатичної тромбоцитопенічної пурпури і хронічної ідіопатичної тромбоцитопенічної пурпури, гемолітичної анемії (у тому числі аутоїмунної гемолітичної анемії), міастенії, системного склерозу і вульгарної пузирчатки (пемфігоїду).
В іншому втіленні способів лікування за даним винаходом в процесі лікування відслідковується ефективність терапії, наприклад у заздалегідь визначені моменти часу, шляхом визначення пухлинного навантаження/маси пухлин або рівня експресії СО20 у відповідних пухлинних клітинах.
Схеми приймання лікарського препарату в зазначених вище способах лікування й застосуваннях підбирають так, щоб забезпечити оптимальну бажану реакцію організму (наприклад, терапевтичну відповідь). Наприклад, лікарський препарат може бути введений однократно болюсно, у кілька приймань протягом якогось проміжку часу або дозу пропорційно зменшують або збільшують відповідно до терапевтичної необхідності. Композиції для
Зо парентерального введення можуть бути представлені стандартною лікарською формою для полегшення введення й уніфікованості дозування.
Ефективні дозування й схеми приймання для біспецифічних антитіл за даним винаходом залежать від природи й характеру захворювання або стану, що підлягає лікуванню; їхнє визначення входить у компетенцію фахівців у даній області техніки. Приміром, діапазон терапевтично ефективної кількості сполуки за даним винаходом (наведені цифри не мають обмежуючого характеру) становить близько 0,001 - 10 мг на 1 кг маси тіла, наприклад близько 0,001 - 5 мг/кг, наприклад близько 0,001 - 2 мг/кг, наприклад близько 0,001 - 1 мг/кг, наприклад близько 0,001 мг/кг, близько 0,01 мг/кг, близько 0,1 мг/кг, близько 1 мг/кг або близько 10 мг/кг.
Інший зразковий діапазон терапевтично ефективної кількості біспецифічних антитіл за даним винаходом (наведені цифри не мають обмежуючого характеру) становить близько 0,1 - 100 мг на 1 кг маси тіла, наприклад близько 0,1 - 50 мг/кг, наприклад близько 0,1 - 20 мг/кг, наприклад близько 0,1 - 10 мг/кг, наприклад близько 0,5 мг/кг, наприклад близько 0,3 мг/кг, близько 1 мг/кг, наприклад близько З мг/кг, близько 5 мг/кг або близько 8 мг/кг.
Рядовий фахівець у даній області техніки - лікар або ветеринар - без зусиль визначить і призначить ефективну кількість потрібної фармацевтичної композиції. Наприклад, лікар або ветеринар може почати лікування біспецифічними антитілами за даним винаходом в складі фармацевтичної композиції з дози більш низької, ніж потрібно для досягнення бажаного терапевтичного ефекту, і поступово збільшувати дозу доти, поки цей ефект не буде досягнутий.
Як правило придатною добовою дозою біспецифічних антитіл за даним винаходом буде така їхня кількість, яка складе найменшу дозу, достатню для виникнення терапевтичного ефекту.
Уведення препарату за даним винаходом може здійснюватися, наприклад, парентерально, наприклад внутрішньовенно, внутрішньом'язово або підшкірно. В одному із втілень даного винаходу пропоновані біспецифічні антитіла вводять шляхом інфузії в дозуванні, розрахованому в мг/м? на тиждень. Таке дозування може грунтуватися на дозуванні в мг на 1 кг маси тіла, наведеному вище, за формулою доза (мг/м?) - доза (мг/кг) х 70:1,8. Таке введення можна повторювати, наприклад 1-8 разів, наприклад 3-5 разів. Уведення препарату за даним винаходом може здійснюватися шляхом безперервної інфузії протягом 2-24 годин, наприклад протягом 2-12 годин. В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла вводять шляхом повільної безперервної інфузії протягом тривалого проміжку часу, наприклад протягом 60 більше 24 годин, щоб зменшити токсичні побічні ефекти.
В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла вводять у дозуванні, розрахованому на введення один раз на тиждень фіксованої дози до 8 разів, наприклад від 4 до б разів. Таку схему введення за необхідності можна повторювати один або більше разів наприклад через б або 12 місяців. При тому використовується фіксоване дозування, яке визначають, наприклад, виходячи з дозування в мг/кг маси тіла, наведеного вище, прийнявши масу тіла рівну 70 кг. Дозування можна визначити або підібрати шляхом вимірювання кількості біспецифічних антитіл за даним винаходом в крові після їхнього введення, наприклад, взявши в пацієнта біологічний зразок і використовуючи антиїідіотипічні антитіла, спрямовані проти антиген-єднальної ділянки біспецифічних антитіл за даним винаходом, взаємодіючої з антигеном СО20.
В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла вводять як підтримуючу терапію, наприклад один раз на тиждень протягом 6 місяців або довше.
Біспецифічні антитіла за даним винаходом можна також уводити профілактично, щоб знизити ризик розвитку раку, відстрочити прояви прогресування ракового захворювання й/або знизити ризик рецидивування у випадку, коли таке захворювання перебуває в стадії ремісії.
Біспецифічні антитіла за даним винаходом можна також уводити в рамках комбінованої терапії, тобто поєднувати їх з іншими терапевтичними агентами, придатними для лікування захворювання або стану, які підлягають впливу цими антитілами. Відповідно, в одному із втілень даного винаходу лікарський препарат, який містить біспецифічні антитіла, призначений для комбінації з одним або більше іншими терапевтичними агентами, наприклад із цитотоксичними, хіміотерапевтичними або антиангіогенними агентами.
При такій комбінованій терапії введення зазначених агентів може бути одночасним, роздільним або послідовним. Для одночасного введення зазначені агенти можуть входити до складу однієї композиції або роздільних композицій - залежно від конкретного випадку. Таким чином, даним винаходом також пропонуються способи лікування розладів, у яких відіграють роль клітини з експресією СО20, описані вище, і ці способи включають уведення біспецифічних антитіл за даним винаходом в комбінації з одним або більше додатковими терапевтичними агентами, як описано нижче.
В одному із втілень даного винаходу пропонується спосіб лікування розладів, у яких відіграють роль клітини з експресією СО20, в індивідів, і цей спосіб включає введення індивідові, який цього потребує терапевтично ефективної кількості біспецифічних антитіл за даним винаходом й за необхідності щонайменше одного додаткового терапевтичного агента або антитіла, що зв'язується з іншим епітопом СО20, ніж зазначені антитіла.
В одному із втілень даного винаходу пропонується спосіб лікування або запобігання раку, що включає введення індивідові, який цього потребує терапевтично ефективної кількості біспецифічних антитіл за даним винаходом й щонайменше одного додаткового терапевтичного агента.
В одному із втілень даного винаходу такий додатковий терапевтичний агент вибирають із інгібітора тирозинкінази (ТКІ), наприклад іматиніба (Сіїмес, Сівеемес 5ТІ571), і ірутиніба (РОІ- 32765, Ітргиміса) або лапатиніба (РТК787/2К222584).
В одному із втілень даного винаходу такий додатковий терапевтичний агент вибирають із інгібіторів тирозинкінази Брутона (ВТК), наприклад ірутиніб.
В одному із втілень даного винаходу такий додатковий терапевтичний агент вибирають із інгібіторів протеасом (РІ), наприклад карфілзоміб.
В одному із втілень даного винаходу такий додатковий терапевтичний агент вибирають із імуномодулюючих агентів (ІМІО), наприклад помалідоміда, талідоміда або леналідоміда.
В одному із втілень даного винаходу такий додатковий терапевтичний агент вибирають із інгібіторів фосфоїнозитид-3-кінази, наприклад іделалісиба або дувелісиба.
В одному із втілень даного винаходу такий додатковий терапевтичний агент вибирають із інгібіторів кінази Аєйгога А, наприклад алісертиба.
В одному із втілень даного винаходу такий додатковий терапевтичний агент вибирають із агентів, які пригнічують В-клітинну лімфому-2 (Всі-2), наприклад венетоклакса.
В одному із втілень даного винаходу такий додатковий терапевтичний агент вибирають із інгібіторів гістон-деацетилази (НОАС), наприклад панобіностата.
Фармацевтичні композиції за даним винаходом також можна використовувати в комбінованій терапії, тобто поєднувати з іншими агентами. В одному із втілень даного винаходу такі додаткові терапевтичні агенти включають один або більше хіміотерапевтичних агентів із класів алкилюючих агентів, антиметаболітів, інгібіторів мітозу, протипухлинних антибіотиків, інгібіторів топоізомерази або аналогів платини. Прикладами таких хіміотерапевтичних агентів є бо доксорубіцин (адріаміцин), цисплатин (платинол), блеоміцин (бленоксан), кармустин (гліадел),
циклофосфамід (цитоксан, процитокс, неозар), бендамустин і хлорамбуцил (лейкеран).
В іншому втіленні даного винаходу біспецифічні антитіла вводять у комбінації із хлорамбуцилом; циклофосфамідом, гідроксидаунорубіцином, онковіном, преднізоном або преднізолоном (СНОР); циклофосфамідом і преднізолоном; циклофосфамідом, вінкристином і преднізоном; циклофосфамідом, вінкристином, доксорубіцином і преднізоном; флударабіном і алкилюючим агентом; етопозидом, преднізолоном, вінкристином, циклофосфамідом (|і доксорубіцином (ЕРОСН); гемцитабіном і оксаліплатином (СетоОх); гемцитабіном, дексаметазоном і цисплатином (СОР) або в комбінації с іншими зазвичай застосовуваними схемами лікування неходжкінських лімфом, що включають кілька препаратів, як описано, наприклад, у роботі Моп-НодоКіп'є І утрпотавх: МакКіпа 5епзе ої Оіадпові5, Тгтєайтепі, апа
Орійопзв, І оїтаіпе допп5юп, 1999, Отейу апа Авзосіаїев, Іпс.
В одному із втілень даного винаходу такі додаткові терапевтичні агенти вибирають із антиметаболітів, наприклад, метотрексата, б-меркаптопурина, б-тіогуаніна, цитарабіна, флударабіна, 5-фторурацила, декарбазина, гідроксисечовини, аспарагінази, гемцитабіна або кладрибіна.
В іншому втіленні даного винаходу такі додаткові терапевтичні агенти вибирають із алкилюючих агентів, наприклад мехлоретаміна, тіотепи, хлорамбуцила, мелфалана, кармустина (ВМО), ломустина (ССМІО), циклофосфаміда, бусульфана, дибромманіта, стрептозотоцина, дакарбазина (ОТІС), прокарбазина, мітоміцина С, цисплатина й інших похідних платини, наприклад карбоплатина.
В іншому втіленні даного винаходу такі додаткові терапевтичні агенти вибирають із антимітотичних агентів, наприклад таксанів (наприклад, доцетаксела й паклітаксела) і алкалоїдів барвінку (винкаалкалоїдів, наприклад віндезина, вінкристина, вінбластина й вінорелбіна).
В іншому втіленні даного винаходу такі додаткові терапевтичні агенти вибирають із інгібіторів топоїзомерази, наприклад топотекана або іринотекана, або із цитостатичних агентів, наприклад етопозида й теніпозида.
В іншому втіленні даного винаходу пропонується спосіб лікування розладів, у яких відіграють роль клітини з експресією СО20, в індивідів, який включає введення індивідові, який
Зо цього потребує терапевтично ефективної кількості біспецифічних антитіл за даним винаходом й щонайменше одного агента, який пригнічує ангіогенез, неоваскуляризацію й/або інші процеси формування нових судин.
Прикладами таких агентів, що пригнічують ангіогенез, є інгібітори урокінази; інгібітори матриксних металопротеаз (наприклад, марімастат, неовастат, ВАМ 12- 9566, ДС 3340, ВМ5- 215291 і подібні агенти); агенти, які пригнічують міграцію й проліферацію клітин ендотелія судин (наприклад, ТМР-470, скваламін, 2-метоксиестрадіол, комбретастатини, ендостатин, ангіостатин, пеніциламін, 5СНб6б6336 (Зспегіпда-Ріоцопй Согр, Мадісон, шт. Нью-Джерсі, США),
К115777 (дапозеп РПІагтасецііїса, Іпс, Титусвіл, шт. Нью-Джерсі, США) і подібні агенти); антагоністи ангіогенних факторів росту (наприклад, 206474, 506668, антитіла проти ангіогенних агентів і/або їх рецепторів (наприклад, проти фактора росту ендотелія судин (МЕСЕ), наприклад бевацизумаб; проти основного фактора росту фібробластів (БЕСР) і проти ангіопоетина-1); талідомід, аналоги талідоміда (наприклад, СС-5013), семаксаніб (Зидеп-505416, 505402), антиангіогенні рибозими (наприклад, ангіозим), а-інтерферон (наприклад, ага-інтерферон), сурамін і подібні агенти), інгібітори МЕСЕ-В-кінази й інші антиангіогенні інгібітори тирозинкіназ (наприклад, 50011248), інгібітори сигнального шляху виживання клітин за участю інтегрина, специфічного до клітин ендотелія судин (наприклад вітаксин і подібні агенти), антагоністи міді/хелатуючі агенти (наприклад, тетратіомолібдат, каптоприл і подібні агенти),карбокисамідо- триазол (САЇ), АВТ-627, СМ101, інтерлейкін-12 (ІІ -12), ІМ862, РМО145156Е, а також нуклеотидні сполуки, які пригнічують ангіогенез (наприклад, антизначеннєва КкДНК МЕСЕ, кДНК, що кодує ангіостатин, кКДНК, що кодує ро5і3, і КДНК, що кодує дефектний рецептор МЕСЕ-2).
Інші приклади таких агентів, що пригнічують ангіогенез, неоваскуляризацію й/або інші процеси формування нових судин: антиангіогенні похідні гепарину (наприклад гепариназа І), темозоломід, МК4, фактор пригнічення міграції макрофагів, інгібітори циклооксигенази-2, інгібітори фактора 1, індукованого гіпоксією, антиангіогенні соєві ізофлавони, олтипраз, фумагілін і їх аналоги, аналоги соматостатина, пентозанполісульфат, текогалан натрію, далтепарин, тумстатин, тромбоспондин, ММ-3, комбрестатин, канстатин, авастатин, антитіла проти інших мішеней, наприклад проти інтегрина альфа-м/бета й проти кініностатина.
В одному із втілень даного винаходу терапевтичний агент, призначений для застосування в комбінації з біспецифічними антитілами, для лікування згаданих вище розладів є протираковим бо імуногенним агентом, наприклад раковим антигеном/пухлиноасоційованим антигеном
(наприклад, молекулою адгезії епітеліальних клітин (ЕРСАМ/ТАСЗТО1), муцином-ї (МОСТІ), карциноембріональним антигеном (СЕА), пухлиноасоційованим глікопротеїном-72 (ТАа-72), глікопротетном-100 (ар100), МеІап-А, МАНТ-1, КОК, КСАБІ, МОА?7, асоційованими з раком вірусними вакцинами (наприклад, папіломавірусною (вірусу людини) вакциною) або пухлинними білками теплового шоку,
В одному із втілень даного винаходу терапевтичний агент, призначений для застосування в комбінації з біспецифічними антитілами, для лікування згаданих вище розладів є протираковим цитокіном, хемокіном або їх комбінацією. Приклади придатних для цього цитокінів і факторів росту включають у-інтерферон, інтерлейкіни 1-2, І -4, 1-6, 11 -7, 11-10, 1-12, 11-13, 11-15, 11-18,
І -23, 1-24, 1-27, І -2ва, І -286Б, 1/-29, фактор росту кератиноцитів (КОЕ), а-інтерферон (наприклад, ІМЕа2б), В-інтерферон, колонієстимулюючий фактор гранулоцитів-макрофагів (ЗМ-
С5Е), СО401, ліганд РІЗ (фактор проліферації гемопоетичних клітин), фактор росту стовбурних клітин, анцестим, альфа-фактор некрозу пухлин (ТМЕа). Придатні для цього хемокіни включають хемокіни, що не містять послідовність с1ши-І еи-Агуд (ЕЕ), наприклад ІР-10, МОР-3,
МІС і 5ОБЕ-1а із сімейств СХС і С-С людських хемокінів. Придатні для зазначеної мети цитокіни включають їхні похідні, варіанти, фрагменти й цитокінні злиті білки.
В одному із втілень даного винаходу терапевтичний агент, призначений для застосування в комбінації з біспецифічними антитілами, для лікування згаданих вище розладів є регулятором (регулюючим агентом) клітинного циклу/апоптоза. Термін "регулятор (регулюючий агент) клітинного циклу/апоптоза" включає речовини, мішенню яких є регулятори клітинного циклу/апоптоза або які модулюють дію регуляторів клітинного циклу/апоптоза, наприклад (ї) сас- (наприклад, М5С 663284), (ії) інгібітори кіназ, залежних від цикліна, які викликають надмірну стимуляцію клітинного циклу (наприклад, флавопіридол (1868275, НМК1275), 7- гідроксистауроспорин (0СМ-01, КМУ-2401) і росковітин (К-росковитин, СУС202)), і (ії) 25 модулятори тіломерази (наприклад, ВІВК1532, 5ОТ-095, ОКМ163 і композиції, описані, наприклад, у патентах США Мо 6,440,735 і 6,713,055). Приклади (які не мають обмежувального характеру) речовин, що впливають на механізми апоптоза, включають споріднений факторові некрозу пухлин (ТМЕ) ліганд, який викликає апоптоз (ТКА )/апоптозний ліганд-2 (Аро-2І), антитіла, активуючі рецептори ТКАЇ/,, у-інтерферон (ІЕМ-у) і антисмисловий Всі-2.
В одному із втілень даного винаходу терапевтичний агент, призначений для застосування в комбінації з біспецифічними антитілами, для лікування згаданих вище розладів є гормональним регулюючим агентом, наприклад агентом, корисним при антиандрогенній і антиестрогенній терапії. Прикладами таких гормональних регулюючих агентів є тамоксифен, ідоксифен, фулвестрант, дролоксифен, тореміфен, ралоксифен, диетилстильбестрол, етинілестрадіол/естиніл, андрогени (наприклад, флутамід/еулексин), прогестини (наприклад, гідроксипрогестерона капроат, медроксипрогестерон/провера, мегестролацетат/мегас), адренокортикостероїди (наприклад, гідрокортизон, преднізолон), рилізинг-фактор лютеїнізуючого гормону (і його аналоги й інші його агоністи, наприклад бусерелін і госерелін), інгібітори ароматази (наприклад, анастразол/аримідекс, аміноглутетимід/цитраден, екземестан) або інгібітори гормонів (наприклад, октреотид/сандостатин).
В одному із втілень даного винаходу терапевтичний агент, призначений для застосування в комбінації з біспецифічними антитілами, для лікування згаданих вище розладів є інгібітором молекул - контрольних точок імунної відповіді, наприклад блокатори активності Т-лімфоцит- зв'язаного імуноглобуліну 4 (СТІ А-4) (наприклад, іпілімумаб), білка РО-1 (наприклад пембролізумаб), першого ліганда програмованої смерті (РО-І 1), домена імуноглобуліну Т-клітин і домена З муцина (ТІМ3), інгібуючого рецептора Т-клітин і МК-клітин (ТІСІТ), лімфоцитарний інгібуючий рецептор (ВТІА), супресор активації Т-клітин, що містить М-домен імуноглобуліну (МІЗТА) або ген активації лімфоцитів (І АС-3).
В одному із втілень даного винаходу терапевтичний агент, призначений для застосування в комбінації з біспецифічними антитілами, для лікування згаданих вище розладів є полінуклеотидом із протираковим ефектом або інгібіторною РНК із протираковим ефектом.
Приклади інших протиракових агентів, які відносяться до терапевтичних агентів, призначених для застосування в комбінації з біспецифічними антитілами, для лікування згаданих вище розладів, - це агенти, які викликають диференціювання, аналоги ретиноєвої кислоти (наприклад, транс-ретиноєва кислота, цис-ретиноєва кислота й подібні агенти), аналоги вітаміну Ю (наприклад, сеокальцитол і подібні агенти), інгібітори рецепторних тирозинових протеїнкіназ ЕГЬВЗ і ЕгЬВ4, рецептор інсуліноподібного фактора росту (ІСЕ-ІК), рецептор інсуліну, рецептори тромбоцитарного фактора росту РОСЕК-а і РОСЕК-В, РІК2, ЕКЯ, рецептори фактора росту фібробластів ЕСЕКІ, ЕСЕК2, ЕСЕКЗ і ЕСЕК4, ТЕКА, ТЕКС, КОМ (наприклад, 60 антитіла проти КОМ), Зеа, Тіє, Тів2, Ері, Кеї, Коз, АК, ГТК, РТК? і подібні агенти.
Приклади інших протиракових агентів, які відносяться до терапевтичних агентів, призначених для застосування в комбінації з біспецифічними антитілами, для лікування згаданих вище розладів - естамустин і епірубіцин.
Приклади інших протиракових агентів, які відносяться до терапевтичних агентів, призначених для застосування в комбінації з біспецифічними антитілами, для лікування згаданих вище розладів - 17-аліламіногелданаміцин, подібний інгібітору білка теплового шоку
НЗРОО, антитіла, спрямовані проти пухлинних антигенів (наприклад, РБА, СА125, КБА), інтегрини (наприклад, інтегрин ВІ) або інгібітори молекул адгезії ендотеліальних клітин судин (МСАМ).
Приклади інших протиракових агентів, які відносяться до терапевтичних агентів, призначених для застосування в комбінації з біспецифічними антитілами, для лікування згаданих вище розладів, - інгібітори кальциневрина (наприклад, валсподар, РОС 833 і інші агенти, які пригнічують експресію гена МОМБ-1 або інгібуючі р-глікопротеїн), інгібітори мішені рапаміцина (ТОК) (наприклад, сиролімус, еверолімус і рапаміцин) і інгібітори механізмів міграції лімфоцитів у лімфатичні вузли (хомінга) (наприклад, ЕТУ720), ії агенти, які впливають на сигнальні клітинні механізми, наприклад інгібітори молекул клітинної адгезії (наприклад, антитіла проти антигену, асоційованого з функцією лімфоцитів (І ЕА)).
У ще одному втіленні даного винаходу біспецифічні антитіла вводять хворим у комбінації із променевою терапією й/або аутологічною або алогенною трансплантацією стовбурних клітин або кісткового мозку.
У ще одному втіленні даного винаходу біспецифічні антитіла вводять хворим у комбінації з одним або більше антитіл, обраних з антитіл проти СО25, антитіл проти СО19, антитіл проти
СО20 (наприклад, офатумумаб або ритуксимаб), антитіл проти СО21, антитіл проти СО22, антитіл проти СОЗ37, антитіл проти СОЗ8, антитіл проти інтерлейкіна-бК (ІІ6К), антитіл проти
І8, антитіл проти І/15, антитіл проти І/15К, антитіл проти СО4, антитіл проти СО11а (наприклад, ефалізумаб), антитіл проти інтегрина альфа-4/бета-1 (Мі А4) (наприклад, наталізумаб) і цитотоксичного Т-лімфоцит-зв'язаного імуноглобуліну 4 (СТІ А4-ід).
В іншому втіленні даного винаходу біспецифічні антитіла вводять хворим у комбінації з одним або більше антитіл, наприклад антитіла проти СТІ А-4 (СО0152), антитіла проти РО-1
Зо (20279), антитіла проти РО-І1 (20274), антитіла проти ГАО-3 (СО0223), антитіла проти ТІМ3З, антитіла проти СЕАСАМ'І (СО6ба), антитіла проти МІ5ТА, антитіла проти ТІСІТ, антитіла проти
ВТ А(СО272).
В іншому втіленні даного винаходу біспецифічні антитіла вводять хворим у комбінації з одним або більше антитіл-агоністів, які специфічні до ко-стимулюючих рецепторів на клітинах імунної системи, наприклад антитіла проти 4-18 (СО137) (наприклад, урелумаб), антитіла проти ОХ40 (СО134), антитіла проти СО40, антитіла проти СО27. В іншому втіленні даного винаходу біспецифічні антитіла вводять хворим у комбінації з одним або більше антитіл, які викликають виснаження або поляризацію макрофагів ІІ, наприклад антитіла проти колонієстимулюючого фактора-1 (С5Б-18, СО115).
В іншому втіленні даного винаходу біспецифічні антитіла вводять хворим у комбінації з одним або більше антитіл, які зв'язуються з молекулами, які беруть участь у регуляції механізмів уродженого імунного захисту, наприклад антитіла проти СО47, антитіла проти
СО200, антитіла проти СО200Е, антитіла проти інгібуючих рецепторів клітин-кілерів (КІК), антитіла проти рецепторів СЮО9А/МКО2, антитіла проти СОЗО5 (І АІКТ).
В іншому конкретному втіленні даного винаходу біспецифічні антитіла вводять хворим у комбінації з одним або більше антитіл, обраних з антитіл проти СО19, антитіл проти СО21, антитіл проти СО22, антитіл проти СОЗ37 і антитіл проти СО38 для лікування злоякісних захворювань.
В іншому конкретному втіленні даного винаходу біспецифічні антитіла вводять хворим у комбінації з антитілами проти СО2, наприклад офатумумабом.
У ще одному конкретному втіленні даного винаходу біспецифічні антитіла вводять хворим у комбінації з одним або більше антитіл, обраних з антитіл проти ІІ.6Е, антитіл проти І! 8, антитіл проти І/15, антитіл проти І/15К, антитіл проти СО4, антитіл проти СО11а (наприклад, ефалізумабом), антитіл проти інтегрина альфа-4/бета-1 (МІ А4) (наприклад, наталізумабом), та
СТІ А4-ід для лікування запальних захворювань.
В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла призначені для використання в комбінації з одним або більше терапевтичних антитіл, наприклад занолімумабом, даратумумабом (дарзалексом), ранібізумабом, німотузумабом, панітумумабом, пи806, даклізумабом (зенапаксом), базиліксимабом (симулектом), інфліксимабом (ремікейдом), 60 адалімумабом (хумірой), наталізумабом (тізабрі), омалізумабом (ксолером) і/або ефалізумабом
(раптівой).
В одному із втілень даного винаходу біспецифічні антитіла призначені для використання в комбінації з одним або більше кон'югатів антитіл з лікарськими агентами (АОС), наприклад з кон'югатами брентуксимаб-ведотин (адцетрис), інотузумаб-озогаміцин (СМСО-544), полатузумаб- ведотин (КО7593), колтуксимаб-равтансин (ЗАКЗ419), індатуксимаб-равтансин (ВТ-062), інотузумаб-озогаміцин (СМСО-544), денінтузумаб-мафодотин (526М-СО19), полатузумаб-ведотин (КО7596) або з антитілами, специфічними до СО37, кон'юЮгованими з лікарським агентом (наприклад, ІМОМ529 або АО567Е).
В іншому втіленні даного винаходу біспецифічні антитіла використовують у комбінації із протизапальними або імуносупресивними агентами. Наприклад, така комбінована терапія може включати композицію за даним винаходом й, щонайменше, один протизапальний або імуносупресивний агент. В одному із втілень даного винаходу такі терапевтичні агенти включають один або більше протизапальних агентів, наприклад стероїдних препаратів або нестероїдних протизапальних засобів (М5АЇ!ІЮ). Кращі за даним винаходом агенти включають, наприклад, аспірин і інші саліцилати, інгібітори циклооксигенази-2, наприклад целекоксиб (целебрекс), нестероїдні протизапальні засоби, наприклад ібупрофен (мотрин, адвіл), фенопрофен (налфон), напроксен (напросин), суліндак (кліноріл), диклофенак (вольтарен), піроксикам (фелден), кетопрофен (орудіс), дифлунізал (долобід), набуметон (релафен), етодолак (лодін), оксапрозин (даупро) і індометацин (індоцин).
В іншому втіленні даного винаходу такі терапевтичні агенти включають один або більше базисних протиревматичних препаратів (ОМАКО), наприклад метотрексат (ревматрекс), гідроксихлорохін (плакеніл), сульфасалазин (асульфідин), інгібіторів синтезу піримідинів, наприклад лефлуномід (араву), агенти, що блокують рецептор інтерлейкіна-1 (1-1), наприклад анакінра (кінерет), агенти, що блокують фактор-альфа-фактор некрозу пухлин (ТМЕ-о), наприклад етанерсепт (енбрел), інфліксимаб (ремікейд) і адалімумаб.
В іншому втіленні даного винаходу такі терапевтичні агенти включають один або більше імуносупресивних агентів, наприклад циклоспорин (сандімун, неорал) і азатіоприн (імурал).
В одному з конкретних втілень даного винаходу біспецифічні антитіла вводять хворому в комбінації з антитілами проти СО25 для лікування неакантолітичної пузирчатки (бульозного
Зо пемфігоїда), наприклад в індивідів із хворобою "трансплантат проти хазяїна".
Променева терапія - хірургічне втручання
В одному із втілень даного винаходу пропонується спосіб лікування розладів, у яких відіграють роль клітини з експресією СО20, що включає введення індивідові, який цього потребує терапевтично ефективної кількості біспецифічних антитіл проти СОЗ і СО20 за даним винаходом й променеву терапію.
В одному із втілень даного винаходу пропонується спосіб лікування або запобігання раку, що включає введення індивідові який цього потребує терапевтично ефективної кількості біспецифічних антитіл проти СОЗ і СО20 за даним винаходом й променеву терапію.
В одному із втілень даного винаходу пропонується застосування біспецифічних антитіл за даним винаходом для одержання фармацевтичної композиції для лікування раку, яку потрібно вводити хворому в комбінації із променевою терапією.
Променева терапія включає вплив випромінювання або відповідне введення хворому радіоактивних фармацевтичних препаратів. Джерело випромінювання може бути зовнішнім або внутрішнім стосовно тіла пацієнта (лікування за допомогою випромінювання може бути у формі класичної дистанційної променевої терапії (ЕВЕКТ) або контактної (джерело випромінювання контактує із тканиною-мішенню), названої також брахітерапією (ВТ)). Радіоактивні елементи, які можна використовувати для практичного здійснення зазначених методів, включають, наприклад, радій, цезій-137, іридій-192, америцій-241, золото-198, кобальт-57, мідь-б7, технецій-99, йод-123, йод-131 і індій-111.
В іншому втіленні даного винаходу пропонується спосіб лікування або запобігання раку, який включає введення індивідові, який цього потребує терапевтично ефективної кількості біспецифічних антитіл проти СОЗ ії СО20 за даним винаходом в комбінації з хірургічним втручанням.
Діагностичне застосування
В одному зі своїх аспектів даний винахід відноситься до діагностичної композиції, що містить біспецифічні антитіла проти СОЗ і СО20, описані в даному документі, і до її застосування.
В іншому своєму аспекті даний винахід відноситься до набору для визначення перехресного зв'язування між клітинами, у яких експресується СОЗ, і клітинами, у яких експресується СО20, у зразку, який походить з організму хворого, наприклад у зразку крові, тканини лімфатичного 60 вузла або кісткового мозку; зазначений набір включає ї) біспецифічні антитіла за будь-яким з описаних у даному документі втілень даного винаходу; і її) інструкції з використання зазначеного набору.
В одному із втілень даного винаходу пропонується набір для діагностування раку, який включає ємність, що містить біспецифічні антитіла проти СОЗ і СО20, і один або більше реагентів для визначення перехресного зв'язування між клітинами, у яких експресується СОЮЗ, і клітинами, у яких експресується СО20. Ці реагенти включають, наприклад, флуоресцентні мітки, ферментативні мітки або інші детектовані мітки. Ці реагенти також включають вторинні або третинні антитіла, або реагенти ферментативної реакції, у результаті якої утворюється візуалізований продукт.
В іншому своєму аспекті даний винахід відноситься до способу, який дозволяє визначити, чи відбувається перехресне зв'язування між клітинами, у яких експресується СОЮЗ, і клітинами, у яких експресується СО20, у зразку, який походить з організму пацієнта, наприклад у зразку крові, тканини лімфатичного вузла або кісткового мозку, після введення йому біспецифічних антитіл за будь-яким з описаних у даному документі втілень даного винаходу; зазначений спосіб включає наступні етапи: () контактування зразка з біспецифічними антитілами за будь-яким з описаних у даному документі втілень даного винаходу в умовах, у яких можливе утворення комплексу між зазначеним біспецифічних антитілом, клітинами, у яких експресується СОЮЗ, і клітинами, у яких експресується СО20; (ії) проведення аналізу, який дозволяє визначити, чи утворювався такий комплекс.
Виявлення зазначеного комплексу може бути здійснене методами, відомими в даній області техніки, наприклад методом, описаним у Прикладі 5.
В іншому своєму аспекті даний винахід відноситься до антіїдіотипічних антитіл, які зв'язуються з першою антиген-єднальною ділянкою за будь-яким з описаних у даному документі втілень даного винаходу або із другою антиген-єднальною ділянкою за будь-яким з описаних у даному документі втілень даного винаходу.
Далі даний винахід ілюструється наведеними нижче прикладами, які не слід уважати обмежуючими обсяг винаходу.
Приклади
Приклад 1. Одержання гуманізованих антитіл проти СОЗ і варіантів антитіл, які не активують
Гуманізація антитіл проти СОЗ
Гуманізацію мишачих антитіл 5РЗА4А проти СОЗ (див. патент США Мо 8236,308; у даному документі ці антитіла позначаються Ідс1-СО03) здійснювали в компанії Апійоре (Кембридж,
Великобританія), застосовуючи вдосконалений метод з використанням послідовностей зародкової лінії (перенесення СОК; див. Європейський патент Мо 0629240). Цим методом було отримано чотири різні поліпептидні ланцюги варіабельної області важкого ланцюга (МН; 5ЕО ІЮ
МО:6, 7, 8 і 9) та три різні поліпептидні ланцюги варіабельної області легкого ланцюга (МІ; ЗЕО
ІО МО:10, 11 ї 12). У результаті з'єднання цих чотирьох УН і трьох МІ. ланцюгів вийшли 12 різних антитіл. Гуманізовані варіанти позначаються в даному документі "пиСОЗ3". Таким чином, гуманізовані варіанти, які містять варіабельні області важких і легких ланцюгів за даним винаходом, позначаються в даному документі в такий спосіб: наприклад "(дсе1-ниСОЗ3-НІІ 1" значить, що даний варіант відноситься до ізотипу ІдДС1, є гуманізованим антитілом 5Р34 проти
СОЗ і містить амінокислотну послідовність варіабельної області важкого ланцюга "Н1", представлену ЗЕО ІЮ МО:6, і амінокислотну послідовність варіабельної області легкого ланцюга "1", представлену 5ЕО ІЮО МО:10. У такий спосіб "НІ" відноситься до варіабельної області важкого ланцюга УНІ, "І 1" відноситься до варіабельної області легкого ланцюга МІ і т.п.
Зокрема, варіанти Іде1-пиСОЗ3-НІЇ1 (гуманізоване антитіло проти СОЗ, що містить амінокислотну послідовність МНІ, представлену 5ЕО ІЮ МО:6, і амінокислотну послідовність
МІ1, представлену ЗЕО ІЮ МО:10), Іде1-пиСО3-НІ112 (гуманізоване антитіло проти СОЮЗ, що містить амінокислотну послідовність МНІ, представлену 5ЕБО ІЮ МО:6, і амінокислотну послідовність М/2, представлену ЗЕО ІЮ МО:11), Іде1-пиСОЗ3-НІТІ З (гуманізоване антитіло проти СОЗ, що містить амінокислотну послідовність МНІ, представлену 5ЕБЕО ІЮО МО:6, і амінокислотну послідовність МІ 3, представлену 5ЕО ІЮ МО:12), ІД01-пиСОЗ3-НЗІ З (гуманізоване антитіло проти СОЗ, що містить амінокислотну послідовність МНЗ, представлену ЗЕО ІО МО:8, і амінокислотну послідовність МІ 3, представлену 5ЕО ІЮ МО:12), ІД61-пиСОЗ3-НАЇ 1 (гуманізоване антитіло проти СОЗ, що містить амінокислотну послідовність МН4, представлену ЗЕО ІО МО:9, і амінокислотну послідовність МІ 1, представлену 5ЕО ІЮ МО:10), Ід01-пиСОЗ3-НЗІ 1 (гуманізоване антитіло проти СОЗ, що містить амінокислотну послідовність МНЗ, представлену 5ЕО ІЮО МО:8, і бо амінокислотну послідовність МІ 1, представлену 5ЕО ІЮ МО:10), Ід01-пиСОЗ3-НЗІ З (гуманізоване антитіло проти СОЗ, що містить амінокислотну послідовність МНЗ, представлену ЗЕО ІО МО:8, і амінокислотну послідовність МІ/З3, представлену 5ЕБЕО ІЮ МО:12) ії Ідб1-пиС0р3-НАІ З (гуманізоване антитіло проти СОЗ, що містить амінокислотну послідовність МН4, представлену
ЗБО 10 МО:9, і амінокислотну послідовність МІЗ3, представлену ЗЕО ІЮ МО:12) використовувалися в якості першої антиген-єднальної ділянки біспецифічних антитіл за даним винаходом. У даному документі позначення "Іде1-пиСО3" відноситься до Ідс1-пиСОЗ3-НІ111, якщо не дане інше визначення.
У деяких прикладах у якості першої антиген-єднальної ділянки біспецифічних антитіл за даним винаходом використовувалися антитіла проти СОЮЗ, які містять амінокислотні послідовності важкого й легкого ланцюгів пиСІ В-13/4 (5ЕО ІОЮО МО:17 і 18, відповідно). Антитіла писСІ В-13/4 - це гуманізований варіант мишачих антитіл проти СОЗ СІ В-13/4 (див. Раїтеп еї аї.,
Вез Іттипої. 1991, 142(9):749-63). Обидві зазначені послідовності (ЗЕО ІЮ МО:17 ії 18) клонували у відповідному експресійному векторі рсОМАЗ.3 (виробництво Іпмігодеп) і одержували експресію шляхом котрансфекції в клітинах НЕК29ЗЕ. Одержувані в результаті антитіла проти СОЗ позначаються Ідс1-писСІ В-Т3/4.
Гуманізовані антитіла проти СОЗ описуються також у публікації УМО 2015001085.
Антитіла проти СО20
Антитіла проти СО20, що використовувалися в якості другої єднальної гілки біспецифічних антитіл за даним винаходом, також описуються в публікаціях ЛО 2004035607 і МО 2005103081 (обидві - компанія Сепітаб).
Контрольні антитіла
У прикладах за даним винаходом для контролю використовувалися наступні антитіла.
Антитіла проти СОЗ
І421-СО3 (вихідне антитіло 5РЗ4 проти СОЗ, у якому амінокислотні послідовності варіабельних областей важкого й легкого ланцюгів представлені 5ЕО ІЮ МО:25 і 5ЕО ІЮ МО:26, відповідно)
Іда1-пиСОЗ(НІ1 1). (амінокислотні послідовності варіабельних областей важкого й легкого ланцюгів представлені 5ЕО ІЮ МО:6 і БЕО ІЮ МО:10, відповідно)
Ідс1-пиСІ В-Т3/4
Зо реІдат-пиСОЗ3-НІ І 1-ЕЕАЇ хб12-ЕЕАК (біспецифічне антитіло, у якому другою гілкою служить антитіло р12, специфічне до др12 (див. Ваграв, С.Р. 9. Мої. Віої. 1993 Арг. 5; 230(3):812-23).
Іда1-пиСОЗ3-НІЇ 1-РЕАГ.
Ідс1-пиСІ В-13/4-ЕЕАГ
Антитіла проти СО20
І3421-708 (амінокислотні послідовності варіабельних областей важкого й легкого ланцюгів представлені ЗЕО ІЮ МО:27 і БЕО ІЮ МО:28, відповідно)
Ідс1-1188 (амінокислотні послідовності варіабельних областей важкого й легкого ланцюгів представлені ЗЕО ІЮ МО:40 і БЕО ІЮ МО:41, відповідно)
Ідс21-2Е2 (амінокислотні послідовності варіабельних областей важкого й легкого ланцюгів представлені ЗЕО ІЮ МО:37 і БЕО ІЮ МО:28, відповідно)
Ід21-ЕТХ (амінокислотні послідовності варіабельних областей важкого й легкого ланцюгів ритуксимаба)
Ідс1-САТ101 (амінокислотні послідовності варіабельних областей важкого й легкого ланцюгів обінутузумаба, СНЕМВІ 1743048, патент США Мо 8883980, з доменом Ес людського ЇДС1 дикого типу)
Ідс21-2С6 (амінокислотні послідовності варіабельних областей важкого й легкого ланцюгів представлені ЗЕО ІЮ МО:47 і БЕО ІЮО МО:48, відповідно).
Ідса1-708-РЕЕАВ
Ідс21-1188-РЕАВ
Ідс1-2Б2-РЕАВ
Ідс1-СА101-РЕАВ
Ідс1-206-РЕАВ
Таблиця 4. Кількісне визначення зв'язування антитіл 708 проти СО20 на В-клітинах різних ліній
У якості показника експресії СО20 кількісно визначали зв'язування антитіл 788 проти СО20 на людських В-лімфоцитах різних ліній, які використовувалися в прикладах за даним винаходом, застосовуючи метод проточної цитометрії з набором ОІРІКІТФ (Оако; номер за каталогом КОО78), як описано в роботі Ропсеїеї, Сагауоп, 1985, 9. Іттипої. Меїй.85: 65-74. Для цього людські В-лімфоцити різних ліній інкубували з антитілами 708 у насичуючій концентрації бо 708, і шляхом проточної цитометрії визначали число молекул7Ов8, які зв'язалися.
Для цього аналізу брали антитіла 708 проти людського СО20, сконструйовані так, що експресувався мишачий домен Ес (10 мкг/мл, ттідое1-708 (див. ОмегаїЇК еї а. 2012, 9. Іттипої. 189: 3430-3438).
В-АЇ ЇЇ - лейкозні (гострий лімфобластний лейкоз) В-лімфоцити; АВС-ОІ ВСІ - активовані лімфомні (дифузійна крупноклітинна лімфома) В-лімфоцити; (зС-РІВСІЇ - дифузійна крупноклітинна лімфома з В-клітин зародкового центру лімфатичного вузла; РІ - фолікулярна лімфома.
Клітинна 5О 000-100 000 100 000-200 000 2200000
Тип лімфоми пінія АВСтна одну АВС на одну АВС на одну клітину клітину клітину о ЛімфомабБеркитта рацаїї//// | ''/ї1777777717х Її о ЛімфомаБеркита | Ва | /7777777777717711111117Хх1 11
ВАШ 777701 Майтявї7 | 7/7 Х 77717771 АВС-РІВСІ о Осчуїї7//Ї 71171711 х о ебрівсь о 85ШОНЯ | 77771711 х в 77777777 мим Її! 111г1111111Ї1х "АВС - антитілозв'язуюча здатність
Приклад 2. Одержання біспецифічних антитіл шляхом обміну фрагментами Раб, індукованого 2-меркаптоетиламіном
Цей метод іп міго одержання біспецифічних антитіл описаний у публікації УМО 2008119353 (компанія Септаб) і про нього повідомляли мап дег Меші-Коїї5споїеп еї аї. (бсіеєпсе. 2007 бер. 14; 317(5844):1554-7). У даному прикладі біспецифічне антитіло утворюється шляхом обміну фрагмента Раб або половинної антитільної молекули (обмін важкого ланцюга й приєднаного легкого ланцюга) між двома моноспецифічними Ід54 або антитілами, подібними Ідс4, при інкубації в умовах, що помірно відновлюють. Не вдаючись у теоретичні міркування, можна сказати, що реакція обміну фрагментів Раб відбувається в результаті ізомеризації дисульфідних зв'язків і внутрішні дисульфідні зв'язки в шарнірній ділянці важкого ланцюга моноспецифічного антитіла відновлюються, так що тепер залишки цистеїна здатні утворювати дисульфідний зв'язок між важкими ланцюгами із залишками цистеїна іншої вихідної антитільної молекули (початково з іншою специфічністю). Одержуваний у результаті продукт є біспецифічних антитілом, у якому дві гілки Раб мають різну специфічність.
Знання того, як відбувається обмін фрагментами Раб у випадку природних Ідс4ї, лягло в основу методу одержання стабільних біспецифічних антитіл на основі Ідс1 (див. М/О 2011131746; Септаб)). Біспецифічні антитіла, отримані цим методом, як описано нижче, не беруть участь в обміні фрагментами Бар ідс4. У даному методі використовуються комплементарні домени СНЗ, які сприяють утворенню гетеродимерів за певних умов. Щоб одержати цим методом біспецифічні антитіла, були отримані молекули ІдДС1 з певними мутаціями в домені СНЗ: в одному з вихідних антитіл Ідсе1 зробили мутації Т3501І, К3701 і 4051.
Зо (або як мінімум Е4051І)), а в іншому вихідному антитілі (91 - мутацію КА0О9К.
Щоб утворювалися біспецифічні антитіла, ці два вихідні антитіла в концентрації 0,5 мг/мл кожне (еквімолярна концентрація) інкубували з 2-меркаптоетиламін гідрохлоридом (МЕА-НСІ) у концентрації 25 мМ у розчині ТгіЗ-ЕЮОТА (сумарний обсяг 100 мкл) за температури 37 "С протягом 90 хвилин. Реакція відновлення припинялася коли відновлюючий агент 2-МЕА видаляли за допомогою спін-стовпчиків (центрифужні фільтри Місгосоп, ЗОК, виробництво
МійПіроге) за протоколом виробника.
Приклад 3. Створення мутантів для оптимізації одержання гуманізованих антитіл проти СОЗ
Одержання плазмід, які кодують мутантний пиСОЗ3-1 1
Для підвищення рівня експресії Ї951-пиСО3-НІ1 1 при тимчасовій трансфекції були отримані кілька варіантів І(І301-пиСОЗ3-НІ11 з мутаціями в 1 легкого ланцюга (див. таблицю 5). Вибір амінокислотних залишків грунтувався на порівнянні з послідовностями зародкової лінії або на наявності рідкісних амінокислотних залишків у послідовності пиИСОЗ3-11 у комбінації з даними про кристалічну структуру гомологічних антитіл. Обрані послідовності синтезували за допомогою сервісу Сепеагі (ІШйе ТесппоЇодієх, Німеччина). Вектор рі3ЗІ кодує константний домен легкого лямбда-ланцюга людського Ідіс2/ЛдієЗ (ЗЕО ІЮ МО:29). раз кодує константну область важкого ланцюга Ідс1т() (ЗЕО І МО:15).
Таблиця 5
Назва антитіла після
Конструкти, що кодують М ш . о. й легкий ланцюг утації в легкому ланцюзі коекспресії із плазмідою, що кодує УНІ важкого ланцюга різі -пиСО3-МІ 1 - Іда1-нпиСО3-НТІІ 1 різі -пиСО3-МІ 1-Е101. о Іда1-ниСОЗ3-НІ1 1-І 2101. різі -пиСО3-МІ 1-В2ЗА В2ЗА Ідса1-пиСОЗ3-НІЇ 1-І В23А різі -пиСОЗ3-МІ 1-АЗБР АЗОР Ідса1-пиСОЗ3-НІЇ 1-І АЗБОР р3зі-пиСО3-МІ 1-ТАЯК так Ідс1-пиСОо3-НІ 1- ТАК різі -пиСО3-МІ 1-КО5М КБ5БМ Ідса1-пиСОЗ3-НІ1 1-І К55М різі -пиСОЗ3-МІ 1-197Н Г97Н Ідса1-пиСОЗ3-НІ11 1-11 97Н р3зі-пиСО3-МІ 1-ї КМН ЕТО, ТАК, КОМ, 1 97Н Іда1-ниСО3-НІІ1-Г І КМН різі -пиСОЗ-МІ 1- ЕТО, В47тТ, 0712, АВ2Р, О8ЗЕ,
ТСРЕДЕУ З86А, І87Е, ЕВ9У Ідс1-пиСО3-НІ 1- ТаРЕАЕУ різі -пиСОЗ-МІ 1- ЕТО, В2ЗА, АЗБР, В47Т, 071, Іда1-ниСО3-НТІ 1 1-
ГАРТаРЕАЕУ АВ2Р, О8ЗЕ, 5864А, І87Е, Е89У І АРТОРЕАЕУ
Тимчасова експресія в клітинах Ехрі293Е
Для окремо взятого антитіла проводили тимчасову трансфекцію клітин Ехрі293Е плазмідами, що кодують важкий ланцюг (НС) і легкий ланцюг (І С) у системі експресії Егеезіує (Се їесппоїодіех, США), використовуючи набір Ехрітесіатіпе 293 (І їе їесппоіодіе5). Усього брали 1,5 мкг плазміди, що кодує важкий ланцюг, і 1,5 мкг плазміди, що кодує легкий ланцюг, і розводили в 150 мкл середовища Оріі-МЕМ (Сібсо, США). Для одержання трансфекційної суміші реагенти Ехрігтесіатіпе 293 роводили в 150 мкл середовища Орії-МЕМ і інкубували протягом 5 хвилин за кімнатної температури. Потім розчини ДНК в Орії-МЕМ і Ехрітесіатіпе 293 в Орії-МЕМ змішували, інкубували протягом 20 хвилин за кімнатної температури й додавали 2,55 мл експресійного середовища Ехрі293, що містить 7,5 х 105 клітин Ехрі29ЗЕ ї 50 од./мл пеніциліну-стрептоміцину. Клітини інкубували за температури 37 "С в атмосфері, що містить 895 СО» і тримали на орбітальному шейкері (200 об./хв.). Для посилення експресії через 21 годину після трансфекції додавали 15 мкл суміші "Еппапсег 1" із зазначеного набору 150 мкл суміші "Еппапсег 2". Клітини інкубували протягом 4 діб, після чого збирали супернатант.
Отримані супернатанти центрифугували при 3000 д і проводили стерильну фільтрацію на мікропористому фільтрі (0,2 мкм). Рівень експресії |до визначали за допомогою приладу Осівї
ЕЕО (ГРоперіо, США), використовуючи біосенсори проти людського Ідс (Бопебіо, США).
Визначення концентрації Ід
Рівень експресії антитіл Ї(У1-пиСО3-НІ111 становив 72 мкг/мл. У випадку мутантного Ідс1- пиСОЗ-НІІ 1-ГТ41К спостерігався в 4 рази вищий рівень експресії Їд (295 мкг/мл). Подібний рівень експресії (311 мкг/мл) спостерігався для мутантного Іде1-пиСОЗ3-НІ11І1-Г І КМН, у якому крім інших мутацій була заміна ТА1К. При перевірці будь-якої мутації окремо виявилося, що інші мутації в цих конструктах (Іде1-пиСОЗ3-НІ11-Г ЕТО, Іда1т-ниСОЗ3-НІ1Т11-ІК55М, Ідат-пиСоЗ-
НІ 1-71 97Н) не супроводжувалися посиленням експресії в порівнянні з Їде1-пиСО3-НІ11.
До посилення експресії приводила також комбінація мутацій К2ЗА і АЗ5Р. Для варіанта
Ідс1-пиСО3-НІЇ 1-4 ТОРЕАЕМ, у якому немає мутацій К2ЗА і АЗ5Р, не спостерігалося посилення експресії (її рівень для цих антитіл становив 83 мкг/мл), а для варіанта І(де1-пиСОЗ-
НІІ1-- АРТОРЕАБЕУ, що містив додаткові мутації К2ЗА і АЗБР, відзначалося трикратне
Зо посилення експресії (237 мкг/мл). Окремо К2ЗА або АЗ5Р не викликали посилення експресії (56 мкг/мл і 81 мкг/мл, відповідно).
Приклад 4. Зв'язування біспецифічних антитіл проти СО20 ії СОЗ з клітинами Рашдаі ії Уигкаї
Зв'язування /р5іде1-пиСОЗ3-НІТІ 1-РЕАЇ хСО20-708-РЕАК із о клітинами ліній Рацаї (Американська колекція типових культур, АТССФ ССІ -2137м, походження - лімфома Беркитта людини), що не мають СОЗ, але несуть людський СО20, і лінії дигкаї (Німецька колекція мікроорганізмів і клітинних культур, О5МАФ АСС 2827М, походження - гострий Т-клітинний лейкоз), що несуть людський СОЗ, але, що не мають СО20, визначали методом проточної цитометрії. На додаток до мутацій, що не активують, І 234, І 235Е, О0265А в обох галузях, у цих біспецифічних антитілах була мутація Е4051 в одній галці і мутація К409К в іншій галці.
Клітини (1 х 105 клітин на одну лунку) інкубували в 96-ямкових полістиролових круглодонних планшетах (Сгеїпег Біо-опе, номер за каталогом 650101) з антитілами в серійних розведеннях (від 0,041 мкг/мл до 30 мкг/мл із трикратним розведенням Ц(А-Е) і від 0,00061 мкг/мл до 10 мкг/мл із чотириразовим розведенням (Р-ІЇ) в 100 мкл фізіологічного розчину, забуференого фосфатом (РВ5), що містив 0,1 95 бичачого сироваткового альбуміну (В5А) і 0,02 95 азиду (далі цей розчин називається "Суферний розчин для фарбування") за температури 4 "С протягом 30 хвилин.
Клітини два рази промивали буферним розчином для фарбування й потім інкубували з 50 мкл вторинних антитіл за температури 4 "С протягом 30 хвилин. У якості вторинних антитіл у всіх експериментах використовували козячі антитіла проти людського дс Е(ар')г, кон'юговані з
В-фікоеритрином (номер за каталогом 109-116-098, дасквоп Іттипогезеагсі І арогайюгієв, Іпс.,
Вест-Гроув, шт. Пенсільванія, США), розведені 1:200 буферним розчином для фарбування.
Клітини два рази промивали буферним розчином для фарбування, ресуспендували в 30 мкл буферного розчину для фарбування й аналізували за допомогою приладу іОце 5сгеепег (Іпсеїйїсуї Согрогайоп, США) (див. Фіг. ТА-Е) або ресуспендували в 100 мкл буферного розчину для фарбування й аналізували за допомогою проточного цитофлуориметра ГАСЗСапої! (ВО
Віозсіепсе5) (див. Фіг. 1Е-І). Криві зв'язування аналізували шляхом нелінійного регресійного аналізу (сигмоїдні криві "доза-відповідь" з різним нахилом), використовуючи програмне забезпечення СгарпРай Ргізт М75.04 (СгарпРад Зоймаге, Сан-Дієго, шт. Каліфорнія, США).
Фіг. 1 (А-Е) демонструє, що для біспецифічних антитіл р5Ідсе1-пиСОЗ-НІІ 1-РЕАІ хСО20-708-
ЕБЕАК ії 0 ре5іде1-пиСО3-НІТІ 1-РЕАЇ хСО20-2Б2-РЕАК спостерігається залежне від дози зв'язування із клітинами Юацаі з більш високим максимумом зв'язування, ніж для моноспецифічних бівалентних антитіл проти СО20 Іде1-708 і Іде1-2Е2. Для Б5Іде1-пиСОЗ-
НІ 1-РЕАГ хбО20-1188-РЕЕАВ, Б5ідат1-пиСОЗ3-НІТІ 1-РЕАЇ хСО20-АТХ-РЕАК і /Б5ідб1-пиСОЗ3-
НІ 1-РЕАЇ хСО20-сА1Т01-РЕАК, максимум зв'язування був подібний з таким для бівалентних моноспецифічних антитіл проти СО20 1дс1-1188, Ідс21-КТХ і Ідс1-5А101. Максимум зв'язування для Бб5Іде1-пиСОЗ3-НІТІ 1-РЕАЇ хСОр20-1188-ЕЕАРВ, р5іда1-пиСОЗ3-НІЇ 1-РЕАЇ хСОг20-
ВАТХ-РЕАВ, Б5іда1-пиСОЗ3-НІТІ 1-РГЕАЇ хСО20-4А101-РЕАК і бівалентних моноспецифічних антитіл проти СО20 Ідс1-1188, ІДа1-КТХ і І(д61-СА101 був нижче, ніж такий для Б5Іде1-пиСОЗ3-
НІІ1-РЕА!хбО20-708-РЕАВ, Б5іда1-пиСОЗ3-НІІ1-РЕАЇ хбО20-2Б2-РЕАК і 0/0 бівалентних моноспецифічних антитіл проти СО20 Іде1-708 і І(д051-2Е2. Максимум зв'язування для пиСОЗ3-
НІТІ1-ЕЕАГ хбО20-2С6-ЕЕАК рівняється з таким для моноспецифічних антитіл проти СО20 Ідо1- 708.
Зо Фіг. 15 демонструє зв'язування із клітинами Ррацаї біспецифічних антитіл проти СОЗ ії СО20, що містять специфічний до СОЗ фрагмент Раб писСіІ В-13/4. Для антитіл р5Ідсе1-писСІ В-Т3/4-
ЕЕАЇ хСО20-708-РЕАК і р5Іде1-пиСІ В-13/4-РЕАЇ хСО20-2Е2-РЕАК. спостерігалося зв'язування, порівнянне з таким для моноспецифічних антитіл проти СО20 Ідс1-708. Що стосується біспецифічних антитіл проти СОЗ ї СО20, що містять специфічний до СОЗ фрагмент Бар пиСОз3-
НІ, то зв'язування р5Ідв1-пиСІ В-Т13/4-ЕЕАЇ хСО20-1188-РЕАК і 0 р5Ідв1-пиСІ В-Т3/4-
ЕЕАЇ хСО20-сАТ101-РЕАК було нижчим, ніж таке для моноспецифічних антитіл проти СО20
І3а1-708 і біспецифічних антитіл проти СОЗ і СО20, що містять специфічний до СО2О фрагмент
Еар 708 або 2Е2.
Фіг. 1Н ії І демонструє зв'язування із клітинами Чигкаї біспецифічних антитіл проти СОЗ і
СО20, що містять специфічний до СОЗ фрагмент Бар пиСОЗ3-НІ1Ї 1 або писСіІ В-13/4, відповідно.
Для всіх біспецифічних антитіл проти СОЗ ї СО20, що містять специфічний до СОЗ фрагмент
Бар, який походить з ІдСа1-пиСОЗ3-НІТІ1-РЕАЇ, спостерігалося порівнянне зв'язування із клітинами УигКкаї незалежно від походження фрагмента Раб, специфічного до СО20О (Фіг. 1Н).
Подібним чином для всіх біспецифічних антитіл проти СОЗ і СО20, що містять специфічний до
СОЗ фрагмент Бар, який походить з Ідс1-пиСіІВ-13/4-ЕЕАЇ спостерігалося порівнянне зв'язування (Фіг. 105). Моноспецифічні бівалентні вихідні антитіла проти СОЗ3-ІИ1-пиСОЗ3-НІ11 1 ї
Ідс1-пиСІ 8-3 - зв'язувалися із клітинами «игКаї з більш низькими значеннями ЕсС»вз, ніж біспецифічні антитіла проти СОЗ і СО20.
Приклад 5. Одночасне зв'язування Б5Іде1-пиСОЗ3-НІІ 1-РЕАІ хСО20-708-РЕАК з Т- і В- клітинами, залежне від концентрації
На поверхні людських В-лімфоцитів експресується антиген СО20, а експресія СОЗ відсутня.
На Т-лімфоцитах, навпаки, несуть на своїй поверхні антиген СОЗ, а експресії СО20 немає.
Біспецифічне антитіло Б5Іде1-нпиСОЗ3-НІТІ 1-РЕАЇ хСО20-708-ЕЕАК пізнає й СОЗ ї СО20 і тому здатне зв'язуватися як з Т-, так і з В-лімфоцитами. Для того, щоб продемонструвати одночасне зв'язування біспецифічних антитіл р5Ідв1-пиСО3-НІТІ1-РЕАЇ хСО20-708-РЕАК з В- і Т- клітинами, інкубували 100 мкл гепаринізованої цільної крові від здорового донора в присутності зазначених антитіл у різних концентраціях (від 0,001 мкг/мл до 100 мкг/мл в 10-кратних розведеннях, які отримували шляхом додавання різних обсягів нерозбавленого препарату антитіл до зразків крові) за температури 37 "С протягом 2 годин. У якості негативного контролю бо служили антитіла 222 (проти СО20) ії Б51951-пиСОЗ3-НІЇ 1-ЕЕАЇ хр12-ЕЕАК, які пізнають тільки
СО20 або тільки СОЗ, відповідно, і тому не здатні зв'язуватися одночасно з Т- і В-лімфоцитами.
Клітини промивали два рази буферним розчином для фарбування шляхом центрифугування при 1200 об./хв. протягом З хв. і інкубували з антитілами, специфічними до СО4 (СО4-РЕ;
Весіоп біскіпзоп, номер за каталогом 555347) або СО8 (СО8-РЕ; Міпйепуї, номер за каталогом
ВУМ135/80) (щоб ідентифікувати різні субпопуляції Т-лімфоцитів) і СО19 (СО19-АРС; ВАКО, номер за каталогом С7224) (щоб ідентифікувати В-клітини) протягом 30 хвилин за температури 4 "С. Перед проведенням аналізу еритроцити піддавали лізису шляхом додавання 100 мкл буферного розчину для лізису еритроцитів (10 мМ КНСОзо,01 мМ ЕОТА/155 мМ МНасІ, розчинені в дистильованій воді) (КНСОз - виробництво Зідта, номер за каталогом РеО144;
ЕОТА-РГОКА, номер за каталогом 036; МНАСІ-Бідта, номер за каталогом А-5666). Зразки аналізували методом проточної цитометрії за допомогою цитофлуориметра Расзсапіо І, обладнаного автоматичним планшетним завантажником (Весіоп ОісКіпб5оп). Для кількісного визначення числа випадків подвійного фарбування (подвійних позитивних подій) СО4-0019- або СО8:-С019: антитіл, що вказують на одночасне зв'язування, Б5Іде1-пиСОЗ3-НІ 1 1-
ЕЕАЇхСО20-708-РЕЕАК з людськими Т- або В-лімфоцитами, проводили аналіз квадрантів гистограми розподілу клітин СО4/С019 ії СО8/С019.
Фіг. 2А і 28 демонструють, що подвійні позитивні акти СО4-С019: і 20802019, що свідчать про утворення двоклітинних комплексів з Т- і В-лімфоцитів, спостерігалися тільки в присутності біспецифічних антитіл проти СОЗ і СО20; це говорить про те, що зазначені біспецифічні антитіла зв'язуються одночасно й з Т-, і з В-клітинами. Кількість, що утворюються двоклітинних комплексів залежала від концентрації антитіл і відбувалася як у випадку Т-клітин, що несуть бра (бр4:-Т-лімфоцити) (Фіг. 2А), так і у випадку Т-клітин, що несуть СО8 (СО8:-Т-лімфоцити) (Фіг. 28).
Приклад 6. Індукція цитотоксичності біспецифічними антитілами проти СОЗ і СО20 іп міго
Визначали іп міго цитотоксичність, викликану біспецифічними антитілами проти СОЗ ії СО20, використовуючи в якості клітин-мішеней пухлинні клітини різних ліній і в якості ефекторних клітин мононуклеари периферичної крові (РВМС) або очищені Т-лімфоцити.
Клітини-мішені. Використовували наступні лінії пухлинних клітин: Оацаі і Каїї (описані вище),
ОСІ-Гу7 (Німецька колекція мікроорганізмів і клітинних культур (0О5М2); номер за каталогом
Зо АСС 688; походження - дифузійна крупноклітинна лімфома з В-клітин (ВСІ), 5ИО-ОНІ -4 (05М2; номер за каталогом АСС 495; походження - ОРІ ВСІ), ВІ-1 (0О5М7; номер за каталогом
АСС 585; походження - ОІ ВСЦ), МАЇ М-16 (05М7; номер за каталогом АСС 680; походження - гострий лімфобластний лейкоз із В-клітин (В-АГ3) ії МУБО-МНІ. (О5М2, номер за каталогом АСС 58; походження - неходжкінська лімфома (МНІ))). Клітини (у кількості по 5 х 105 клітин) збирали в середовищі КРМІ- (АРМІ-1640 |містить 25 мМ НЕРЕЗ та І -глутамін; виробництво І оп7а, номер за каталогом ВЕ12-115РІ, з додаванням бичачої сироватки (10 95) (Сірсо; номер за каталогом 10371-029|, 25 000 одиниць пеніциліну й 25 000 мкг стрептоміцину (Гоп7а; номер за каталогом 17-603ЕЇ); центрифугували при 1200 об./хв. протягом 5 хвилин, ресуспендували в 1 мл КРМІ-, додавали 100 мккКІі »'Стг (Хром-51; Регкіп ЕІтег, номер за каталогом МЕ7ОЗ30002МС) і інкубували за температури 37 "С на водяній лазні зі струшуванням протягом 1 години. Клітини два рази промивали в РВ5 шляхом центрифугування при 1200 об./хв. протягом 5 хвилин, після чого ресуспендували в КРМІ": і підраховували методом виключення барвника (трипанового синього).
Клітинна суспензія містила 1 х 10» клітин в 1 мл.
Ефекторні клітини. Свіжі мононуклеари периферичної крові виділяли з 40 мл світлого (лейкоцитарного) шару центрифугованої крові (Запдціп), використовуючи градієнт щільності фікола (І0п7ла; середовище для виділення лімфоцитів, номер за каталогом 17-829Е) за інструкцією виробника. Потім клітини ресуспендували в КРМІ-, і підраховували, використовуючи розчин Тюрка, щоб виключити еритроцити, і доводили вміст клітин до 10 х 105 клітин/мл.
Очищені Т-лімфоцити одержували з лейкоцитарного шару, використовуючи суміш
Козецезеріт Нитап Т СеїЇ Епгісптепі СосКаї (5їетсеїЇ ТесппоЇодіех, номер за каталогом 15061) або з РВМС, використовуючи набір для виділення людських Т-клітин Юупабеаайб5Ф
Опіоиспеа "м Нитап Т сеїЇ5 (Іпмігодеп; номер за каталогом 1134403) за інструкціями виробника.
Клітини два рази промивали РВЗ і підраховували, використовуючи розчин Тюрка, і доводили їхню концентрацію до 1 х 105 клітин/мл.
Визначення цитотоксичності. У лунки 9б6-ямкового круглодонного планшета вносили по 50 мкл клітин-мішеней, мічених г'Сг, і додавали по 50 мкл антитіл (кінцева концентрація від 10 пг/мл до 10 мкг/мл) в ЕРМІ-. Потім клітини інкубували за кімнатної температури протягом 10 хвилин. бо Додавали по 50 мкл ефекторних клітин (співвідношення кількостей ефекторних клітин і клітин-мішеней, як зазначено), Т/йоп-х-100 (кінцева концентрація 1,790; для визначення максимального лізису) або КРМІ-: (для визначення фонового лізису). Клітини інкубували за температури 37 "С, в атмосфері, що містить 595 СО», протягом 24-48 годин. Клітини осаджували шляхом центрифугування при 1200 об./хв. протягом З хвилин і збирали по 75 мкл супернатанта в пробірки обсягом 1,4 мл (Місгопіс; номер за каталогом МР226ЕМ), і визначали радіоактивність за допомогою лічильника гамма-випромінювання (РегКкіп ЕІтег). Специфічний лізис (у відсотках) розраховували в такий спосіб: специфічний лізис, 95 - (срт зразка - срт тільки клітин-мішеней)Хсрт при максимальному лізисі - срт тільки клітин-мішеней) х 100 (Срт- число відліків на хвилину).
Фіг. З демонструє, що всі біспецифічні антитіла, що містять фрагмент Раб, специфічний до
СОЗ (половину молекули) (який походить з Ідс1-пиСОЗ3-НІ І 1-РЕАЇГ. або Ідс1-писСіІ В-1Т3/4-РЕАЇ) і фрагмент Раб, специфічний до СО20 (половину молекули) (який походить з І9051-0020-708-
ЕЕАВ, Ідс1-С020-1188-ЕЕАВ, Ідс1-С020-262-РЕАВ, Іда1-0020-8ТХ-ЕЕАВ, Ідс1-С0020-206-
ЕЕАК або Ідб1-0020-СА101-РЕАК), здатні викликати цитотоксичність у лініях В-клітин, що випробовувалися, як з РВМС (фіг. ЗА, ЗМ), так і з очищеними Т-лімфоцитами (Фіг. 38-31, ЗМ) у якості ефекторних клітин. Моноспецифічні бівалентні антитіла з інертними доменами Ес (Ідс1- 7О08-ЕЕАВ, Іда1-1188-ЕЕАВ, Іда1-нпиСО3-НІ І 1-РЕАЇ., Ідс1-пиСіІ В-13/4-ЕЕАЇ)) не мали здатність викликати цитотоксичність у відношенні В-клітин зазначених вище ліній, опосередковану Т- лімфоцитами або РВМС. Це свідчить, що у випадку біспецифічних антитіл проти СОЗ і СО20 цитотоксичність залежала від зв'язування цих антитілі з СО, і з СО20. Як описувалося раніше моноспецифічні бівалентні антитіла проти СО20 з активним фрагментом Ес (Іде1-708 і Іде1- 1188-4051) мали здатність викликати антитілозалежну клітинноопосередковану цитотоксичність із РВМС відносно клітин Юацаі (Фіг. ЗА, ЗМ). При цьому домінуючими ефекторними клітинами були натуральні кілери (МК-клітини). Біспецифічні антитіла проти СОЗ і
СО20 проявляли обговорювану активність при концентраціях нижче, ніж моноспецифічні бівалентні антитіла проти СО20. Фіг. 3С-3ЗЕ показують, що СО-єднальний фрагмент, який походить з ІдсС1-пиСіІ В-13/4, і СО-єднальний фрагмент, який походить з ІдДС1-нпиСОЗ3-НІІ 1, викликали цитотоксичність із подібною ефективністю. Фіг. 305-3М також показують, що подібні
Зо результати були отримані відносно ліній пухлинних клітин, отриманих із широкого набору ліній
В-клітин. Ці клітинні лінії походили з різних В-клітинних пухлин (див. таблицю 4). У цій таблиці також представлені рівні експресії СО20 на клітинах цих ліній.
Приклад 7. Індукція цитотоксичності іп міго антитілами Б51де1-пиСОЗ3-НІТІ 1-РЕАЇ хСО20- 7О08-ЕЕАК з використанням у якості ефекторних клітин людських СО4-- і СЮО8:-Т лімфоцитів
Щоб з'ясувати, чи можуть антитіла Б5Іде1-пиСОЗ3-НІ11 1-РЕАІ хСО20-708-РЕАК викликати цитотоксичну активність і СО4-, ії СО8-Т-лімфоцитів, було проведене визначення цитотоксичного ефекту з різними субпопуляціями Т-лімфоцитів, які були при цьому ефекторними клітинами.
Клітинами-мішенями служили клітини лінії бацсй, підготовлені, як описано вище.
Мононуклеарні клітини периферичної крові (РВМСОС) виділяли з лейкоцитарного шару, використовуючи середовище для виділення лімфоцитів, як описано вище.
Т-лімфоцити (загальну популяцію Т-лімфоцитів, популяції СО4-- або СО8:- Т-клітин) виділяли з РВМС, використовуючи набори для виділення клітин ЮупабеадйбзФ Опіоиспеа тм
Нитап Т сеїї5, СупареаазФб Опіоиспей "М Нитап СО4 Т сеї або бупабреадбзФ Опіоиспеа тм
Нитап СО8 Т сеїЇ5 (Іпмігодеп, номера за каталогом 113440, 113520 і 113480, відповідно).
Чистоту будь-якої фракції виділених клітин перевіряли шляхом проточної цитометрії. Щоб ідентифікувати різні субпопуляції Т-лімфоцитів, клітини інкубували з антитілами проти СОЗ (СО3-РЕВ-СР; Весіоп Ріскіпбоп, номер за каталогом 345766) і проти СО8 (СО8-АРС; Весюп
Оіскіпбоп, номер за каталогом 555369) за температури 4 "С протягом 30 хвилин. Зразки аналізували шляхом проточної цитометрії за допомогою цитофлуориметра Расзсапіо І, обладнаного автоматичним планшетним завантажником (Весіоп БОісКіп5оп). Для кількісного визначення частоти подій СОЗ-- (загальна популяція Т-лімфоцитів), подвійних позитивних подій бр3-008: (популяція СО8--Т-лімфоцитів) і подій СО3-С0О8- (популяція СО4--Т-лімфоцитів), проводили аналіз квадрантів гістограми розподілу клітин СОЗ/СО8.
До клітин Юацаї додавали Т-лімфоцити загальної популяції в співвідношенні ефекторні клітини: клітини-мішені (Е/Т) ї- 10:11, СО4--Т-лімфоцити в співвідношенні Е/1-8:1 ії СО8:-Т- лімфоцити в співвідношенні Е/1-4:1 або 8:1 (як зазначено на Фіг. 4А); визначення цитотоксичності проводили, як описано вище. Щоб перевірити, чи пригнічують СО4--Т- лімфоцити активність СО8:-Г-лімфоцитів, коли їх додають у якості ефекторних клітин, визначення цитотоксичності проводили, використовуючи в якості ефекторних клітин тільки бо СОр8:-Т-лімфоцити (Е/71-4:1) або СО8:-Т-лімфоцити (Е/1-4:1) разом з СО4--Т-лімфоцитами
(Е/Т-8:1) (див. Фіг. 4В).
Фіг. 4А демонструє, що антитіла Б5Іде1-пиСОЗ3-НІІ1-РЕАЇ хСО20-708-РЕАК викликали цитотоксичність, залежну від Т-лімфоцитів, відносно клітин ЮБацаї при використанні в якості ефекторних клітин загальної популяції Т-лімфоцитів СО4--Т-лімфоцитів або СО8:-Т-лімфоцитів.
Антитіла Б5Іде1-пиСОЗ3-НІЇ 1-РЕАЇ хр12-РЕАК і Ідавс1-708-БЕАК, які служили при цьому негативним контролем, не викликали цитотоксичності відносно клітин Бацаї (ці дані не показані), а це свідчить, що цитотоксичність залежала від пізнавання біспецифічними молекулами й СОЗ, і
СО20. Фіг.4В8 демонструє, що додавання до ефекторних клітин, представлених СО8:-Т- лімфоцитами, СО4--Т-лімфоцитів не знижувало ефективності антитіл. Б5Іде1-пиСОЗ-НІ1 1-
ЕЕАЇ хСО20-708-ЕЕАВ.
З таблиці 6 видно, що чистота виділених клітинних фракцій становила «90 95 або вище.
Таблиця 6 соди їй Я . а Ср4кт-клітини сор кТ-клітини осратклтиниї 77771192 17111119561 11111106 совтхлини 333031 710890010111180| 86
Приклад 8. Кінетика індукції цитотоксичності іп мійго антитілами р5іІдс1-пиСІ В-Т3/4-
ЕЕАЇ хСО20-708-ЕЕАБК при використанні Т-лімфоцитів у якості ефекторних клітин
Щоб визначити кінетику цитотоксичності, викликаної антитілами р5Ідс1-писСіІ В-13/4-
ЕЕАЇ хСО20-708-ЕЕАК іп міїго, клітини лінії Сацаї інкубували з Б5іде1-пиСіІ В-Т3/4-ЕЕАЇ хСОг20- 7О08-РЕАК у присутності очищених Т-лімфоцитів, і в різні моменти часу визначали цитотоксичність. Визначення цитотоксичності проводили, як описано вище, за тим виключенням, що супернатанти збирали не тільки через 24 години, але також у різні моменти часу від З до 24 годин після інкубації.
На Фіг 5 представлені результати двох не залежних експериментів, у яких використовувалися очищені Т-лімфоцити від двох різних донорів. При використанні очищених Т- клітин від першого донора цитотоксичність, залежна від дози, спостерігалася через 12 годин, і вона була ще більш виражена через 48-72 години (Фіг. 5А). У присутності очищених Т-клітин від другого донора антитіла викликали цитотоксичність уже через З години після інкубації, і її виразність зростала після 16-24 годин інкубації (Фіг. 58).
Приклад 9. Ефективність індукції цитотоксичності іп міго біспецифічними антитілами проти
СОз ії 2020 при різних співвідношеннях ефекторних клітин і клітин-мішеней
Зо Щоб визначити ефективність індукції цитотоксичності біспецифічними антитілами проти СОЗ і СО20, які містять фрагменти Раб, що зв'язують СО20, які походять з різних антитіл проти СО20, проводили визначення цитотоксичності, як описано вище, використовуючи різні співвідношення ефекторні клітини: клітини-мішені (ЕХ). Ефекторними клітинами служили мононуклеари периферичної крові (РВМС), а клітинами-мішенями - клітини лінії Оацаі.
Як показує Фіг. 6, навіть при співвідношенні Е/Ї від 10:1 до 25:1, спостерігалася загибель клітин, викликана біспецифічними антитілами проти СОЗ і СО20.
Приклад 10. Цитотоксичність біспецифічних антитіл проти СОЗ ї СО20 відносно клітин лінії
Ваї-Інс на моделі котрансплантації в мишей МОЮ-5СІЮ
Протипухлинну ефективність іп мімо антитіл р5Іде1-пиСОЗ3-НІІ 1-РЕАЇ хСО20-708-ЕЕАВ, реІдат-пиСО3-НІ І 1-РЕАЇ хСО20-1188-РЕАК і р5Ідо1-пиСІ В-1Т3/4-РЕАЇ хСО20-708-РЕАВ визначали за допомогою моделі підшкірної котрансплантації клітин лінії На)і-Інс. У цій моделі не стимульовані людські мононуклеари периферичної крові (РВМС; вони служили джерелом людських Т-лімфоцитів) уводили піддослідним тваринам (тут - самкам мишей лінії МОО-5СІЮ віком 6-11 тижнів; МОЮ.С.В-17-Рукасзсіа/У, Спапевз-Кімег І абогаїогіеї) разом з пухлинними клітинами - аналогічно моделі, описаній в роботі Вгізспм/єїп єї аї. (Мої. Іттипої. 43 (2006), 1129- 1143). Кожній особині в День 0 у правий бік уводили підшкірно суміш, яка містила 5 х 105 РВМС і 5 х 105 клітин Каїї-Інс в 200 мкл РВ5 з 0,1 95 В5А. У межах години після цієї ін'єкції тварин розділяли на групи, яким призначалася різна обробка (по 4-5 особин у групі |Фіг. 7А-Р| або по 10 особин у групі |Фіг. 7-ІЇ); у кожній групі тваринам уводили внутрішньовенно одну дозу (100-150 мкл) біспецифічних антитіл в РВ5. Ці різні за обробкою групи піддослідних тварин представлено в таблиці 7 (для експериментів, проілюстрованих Фіг. 7А, В, С), таблиці 8 (для експериментів, проілюстрованих Фіг. 70, Е, Е) і таблиці 8.1 (для експериментів, проілюстрованих Фіг. 7, Н, Ї).
Щонайменше, два рази на тиждень у мишей визначали обсяг пухлин. Обсяг пухлини (мм3) розраховували за результатами вимірів кронциркулем (РІ ЕХХ) у такий спосіб: 0,52 х (довжина) х (ширина).
Клітини Каї-Іис одержували шляхом трансфекції вектором д9УМІ2, який кодує люциферазу (сТ5, Сан-Дієго, США). Клітини промивали, культивували в середовищі КРМІ (Гоп7а, ВЕ12- 115), яке містило 1095 донорської бичачої сироватки з іонами заліза (сірсо, номер за каталогом 10371-029), пеніцилін/стрептоміцин, пируват натрію й 1 мкг/мл пуроміцина (5ідта,
Цвіндрехт, Нідерланди; номер за каталогом Р-8833). Клітини збирали в логарифмічну фазу росту й підраховували за допомогою барвника (трипанового синього).
Для кожного експерименту людські мононуклеари периферичної крові виділяли з лейкоцитарного шару крові здорового донора, як описано вище, і перед використанням промивали. Усі клітини промивали в РВ5, що містить 0,1 96 В5А, фільтрували через клітинне сито й ресуспендували в РВ5, що містить 0,1 95 В5А, у концентрації 50 х 1059 клітин/мл.
Результати цих дослідів представлені на Фіг. 7. Антитіла В5Іда1-нпиСОЗ3-НІІ 1-РЕАЇ хСО20- 7О08-ЕЕАК у дозі 0,05 мг на 1 кг маси тіла й 0,5 мг/кг викликали виражене зменшення пухлин із клітин Каїї-Ішс. У дозі 0,005 мг/кг антитіла р5Ідс1-пиСОЗ3-НІ1І1-РЕАЇ хСО20-708-РЕАК не впливали на пухлинний ріст (Фіг. 7А). У День 21 після інокуляції пухлинних клітин (останній день, у який усі групи мишей зберігали вихідний склад) середній розмір пухлин у тварин, які одержали 0,5 мг/кг антитіл б5Іде1-пиСОЗ3-НІ1І 1-РЕАІ хСО20-708-ЕЕАК, був значно меншим, ніж у мишей контрольної групи, які одержали РВ5 (Фіг. 7В) (р«е0,01; критерій Краскела-Уоллеса з наступним апостеріорним критерієм множинних порівнянь Данна). Аналіз виживання за
Капланом-Мейєром показав, що виживання без пухлин після введення Б5Іде1-пиСОЗ-НІ11 1-
ЕЕАЇ хСО20-708-РЕАК (0,5 мг/кг ії 0,05 мг/кг) було значне кращим, ніж після введення РВ5 (р«0,01 ї р«е0,05 для груп, що одержували зазначені антитіла в дозі 0,5 мг/кг ії 0,05 мг/кг відповідно; критерій Мантеля-Кокса) (Фіг. 7).
Подібним чином уведення антитіл Бб5Ідс1-пиСіІ В-13/4-РЕАЇ хСО20-708-РЕАВ у дозі 0,05
Зо мг/кг ії 0,5 мг/кг значно пригнічувало пухлинний ріст (Фіг. 70) У День 25 після інокуляції пухлинних клітин (останній день, у який усі групи мишей зберігали вихідний склад) середній розмір пухлин у тварин, які одержали 0,05 мг/кг і 0,5 мг/кг антитіл Б5Іде1-НпиСІ В-Т3/4-
ЕЕАЇ хСО20-708-ЕЕАБЕ, був значно меншим, ніж у мишей контрольної групи, які одержали РВЗ (Фіг. 7Е) (р«е0,05; критерій Краскела-Уоллеса з наступним апостеріорним критерієм множинних порівнянь Данна). Аналіз виживання за Капланом-Мейєром показав, що виживання без пухлин після введення р5ідсе1-пиСі В-13/4-РЕАЇ хСр20-708-РЕАК (0,5 мг/кг і 0,05 мг/кг) було значне кращим, ніж після введення РВЗ (р«е0,01; критерій Мантеля-Кокса) (Фіг. 7).
Фіг. 75 демонструє, що і антитіла б51де1-пиСОЗ3-НІ11 1-РЕАЇ хСО20-708-ЕЕАК у всіх узятих дозах, і антитіла р5Іде1-пиСОЗ-НІІ 1-РЕАЇ хСО20-1188-РЕАК у дозі 0,05 мг/кг викликали затримку пухлинного росту. У день 20 після інокуляції пухлинних клітин (останній день, у який усі групи мишей зберігали вихідний склад) середній розмір пухлин у тварин, які одержали 0,005 мг/кг, 0,05 мг/кг ії 0,5 мг/кг антитіл б5Іде1-пиСОЗ3-НІ1І 1-РЕАГ хСО20-708-ЕЕАБЕ, і в особин, які одержали 0,05 мг/кг б5Іде1-пиСОЗ3-НІТІ 1-РЕАЇ хСО20-1188-РЕАК, був значно меншим, ніж у мишей контрольної групи, які одержали РВ5З (р«е0,05 для всіх груп, крім тієї, де миші одержали 0,005 мг/кг антитіл б5Ід1-пиСОЗ3-НІТІ 1-РЕАЇ хСО20-708-ЕЕАК, для якої р«е0,01; однофакторний дисперсійний аналіз АМОМА, з наступним апостеріорним критерієм множинних порівнянь Тьюки) (Фіг. 7Н). Аналіз виживання за Капланом-Мейєром показав, що виживання без пухлин у всіх групах, крім тієї, у якій миші одержали Б5Іде1-пиСОЗ3-НІІ 1-РЕАЇ хСр20-708-ЕЕАК у дозі 0,005 мг/кг, було значне кращим, ніж у контрольній групі, у якій тваринам уводили РВ5 (ре«е0,05; критерій Мантеля-Кокса) (Фіг. 71).
Таблиця 7 шк о ООН С: ЗЛЯ ПОЛОООООООООООО
Таблиця 8 шк І ПО 2: ЗОН ПО
Таблиця 8.1 шк о ООН С: ЗЛЯ ПООООООООООО 6 |рвідсі-пиСОЗ-НІЛ-РЕАІХСО20-1188-РЕАВ 0 | мкг(боО5 мг «о
Приклад 11. Протипухлинна активність антитіл Б51де1-нпиСО3-НІ1І 1-РЕАЇ хСО20-708-ЕЕАК у гуманізованих мишей із ксенотрансплантатами
Протипухлинну активність іп мімо антитіл Б5Іде1-пиСОЗ3-НІІ 1-РЕАЇ хСО20-708-РЕАВ визначали на моделі - мишах з гуманізованою імунною системою (НІ5) яким інокулювали людські пухлинні клітини лінії Сацаї-шШс (ВВа5-НІ5-Юацаї-Інс) (ці експерименти були проведені в компанії Ахепіх5, Париж, Франція) У цих експериментах одержували людські гемопоетичні
СбО34з-клітини-попередники (5 001 ох 105 клітин) з пуповинної крові й уводили їх (внутрішньопечіночно) новонародженим мишам ВАЇ В/с Надгіті! Рма ІІ -2Нус Іт1Содп БІКРОМОЮ (ВКО5), як описано в роботі І едгапа еї аІ. (РМА5. 108 (2011), 13224-13229). Через 14 тижнів методом проточної цитометрії підтверджували, що відбулася гуманізація мишей ВКО5. Потім піддослідних тварин розділяли на три групи по 7 особин у кожній виходячи із частки (у відсотках) людських СОЗ3-Т-лімфоцитів у популяції людських СО45:-клітин (29,5ж47,5 для контрольної групи особин, що одержували РВ5; 28,4-49,4 для групи особин, які одержували реІдат-пиСОЗ3-НІ І 1-РЕАЇ хб12-ЕЕАК, і 28,3:211,6 для групи особин, які одержували р5Ідс1- пиСОЗ3-НІІ 1-РЕАЇ хСО20-708-РЕАК. На 15-ий тиждень мишам ВАЕС5-НІЗ уводили шляхом внутрішньовенної ін'єкції 5 х 106 клітин Юацаї-Ішс в 100 мкл РВ5; цей день уведення вважався
День 0. У День З їі в День 7, мишам ВКО5-НІ5, що несли клітини Юашаді-їис уводили шляхом внутрішньовенної ін'єкції біспецифічні антитіла в дозі 1 мг на 1 кг маси тіла (мг/кг). Ці різні за обробкою групи піддослідних тварин представлено в таблиці 9. Пухлинний ріст визначали раз на тиждень (починаючи від Дня 2) шляхом біолюмінесцентної візуалізації (ВІЇ). Мишам уводили (внутрішньоочеревенно) 100 мкл Ю-люциферина світлячка (30 мг/мл; Саїїрег І Мезсіепсевб) і вимірювали люмінесценцію за допомогою системи біолюмінесцентної візуалізації Віозрасе (РегкіпЕЇІтег). Крім того, у День 9 у кожної піддослідної особини брали зразок крові й шляхом проточної цитометрії визначали частку (у відсотках) різних популяцій лейкоцитів (сумарні людські лейкоцити - популяція пНСО453п0045; В-лімфоцити - популяція пНСО3-НСО19; Т- лімфоцити - популяція ПСОЗпСО19: і активовані Т-лімфоцити - популяція ПСОЗСО19-Е5С,
Зо Для фарбування використовували наступні антитіла: анти-пСОр45 клон НІЗО, мічені АіІеха Ріпоге 700 (ВіоїЇ едепа, номер за каталогом 304023; кінцеве розведення 1:50; анти-тСО45 клон 30-Е11, мічені алофікоцианіном (АРС)-еРіного 780 (еріозсіепсе, номер за каталогом 47-0451-80; кінцеве розведення 1:200); анти-пСОЗ клон ОСНТІ, мічені еРійогт 450 (еВіозсіепсе, номер за каталогом 48-0038-80; кінцеве розведення 1:50), анти-пСО19 клон НІВ19 мічені фікоеритрином (РЕ) (Весіоп Оіскіпзоп, номер за каталогом 561741; кінцеве розведення 1:25).
Результати цих експериментів представлені на Фіг. 8. Фіг. ВА демонструє, що антитіла ре5Ідат-пиСОЗ3-НІТІ 1-РЕАЇ хСО20-708-РЕАК у дозі 1 мг/кг викликали виражене зниження пухлинного навантаження. Контрольні біспецифічні антитіла Б5іде1-ниСОЗ3-НІ1І 1-ЕЕАЇ хб12-
ЕЕАК не пригнічували пухлинний ріст. Порівняння статистичними методами (критерій Краскела-
Уоллеса з наступним апостеріорним критерієм множинних порівнянь Данна) пухлинного навантаження в День 21 показало, що в групі мишей, які одержали Б5Ід51-пиСОЗ3-Н11 1-
ЕЕАЇ хСО20-708-ЕРЕАЕ, пухлинне навантаження значно менше, ніж у контрольній групі особин,
які одержали РВ5 (р «х 0,01). Різниця між тваринами, які одержали Б5Ідсе1-пиСОЗ-НТІІ 1-
ЕЕАЇхХЬ12-ЕЕАБЕ, і контрольними тваринами, які одержали РВ5, була незначною (Фіг. 88).
На Фіг. 8С, показана частка (у відсотках) різних популяцій людських лейкоцитів за даними проточної цитометрії. Частка циркулюючих у крові піддослідних мишей людських лейкоцитів (клітини НСО457) була порівнянна у всіх групах. Але в мишей, які одержали Б519д51-пиСОЗ3-Н11 1-
ЕЕАЇхСО20-708-РЕАК, частка людських В-лімфоцитів була сильно знижена (р-0,0012, у порівнянні з мишами, які одержали РВ5; критерій Манна-Уїітній Уведення контрольних біспецифічних антитіл Б51де1-пиСОЗ-НІІ 1-ЕЕАЇ хр12-ЕЕАК не впливало на частку людських В- лімфоцитів. Частка активованих Т-лімфоцитів (популяція пПСОЗ3-Е5С"-клітин у мишей, які одержали Б51де1-пиСОЗ3-НІ1 1-РЕАЇ хСО20-708-ЕЕАК, була підвищена (р-0,0093, у порівнянні з мишами, які одержали РВ5; критерій Манна-Уїтній). У результаті введення контрольних біспецифічних антитіл Б51де1-пиСОЗ3-НІЇ 1-ЕЕАЇ хр12-ЕРЕАБК кількість активованих Т-лімфоцитів змінювалося незначно. Це свідчить, що активація Т-лімфоцитів після введення біспецифічних антитіл проти СОЗ ії СО20 залежала від зв'язування не з одним тільки СОЗ, а з СОЗ і з СО20 разом.
Таблиця 9 шини пи З: З ВИ ПО
Приклад 12. Пілотне дослідження з метою з'ясування фармакологічних і фармакокінетичних властивостей біспецифічних антитіл проти СОЗ і СО20 у яванського макака
В описаному нижче дослідженні визначали профіль безпеки, фармакокінетичні показники й індукцію виснаження В-клітин у яванського макака під дією одного з біспецифічних антитіл проти сОз ї СО20 за даним винаходом, а саме б5Іде1-нпиСОЗ3-НІТІ 1-РЕАІ хСО20О-708-ЕРЕАВ.
У завдання цього дослідження входило встановити фармакокінетичні властивості, токсикологічні й фармакологічні ефекти антитіл. р5Іде1-пиСО3-НІТІ 1-РЕАІ хСО20-708-РЕАК. щу самок яванського макака (Масаса їазсісціагіз з острова Маврикій; вік - 2-3 роки; маса тіла 2,5-3 кг) після однократної внутрішньовенної (у хвостову вену) ін'єкції зазначених антитіл. Дане дослідження проводили в компанії Спагіе5 Кімег І арогайгіе5, Транент, Великобританія). Вихідні антитіла ізотипа (Де1 ІдсС1-ниСОЗ3-НІ111 і Іде1-708, на основі яких одержували біспецифічні антитіла за даним винаходом, мають, як було показано, перехресну реактивність з антитілами яванського макака проти СОЗ ії СО20, відповідно. Вісім самок яванського макака розділили на чотири групи, які відрізнялися за дозою антитіл Б51де1-пиСОЗ3-НІ1І 1-РЕАЇ хСр20-708-ЕЕАБЕ, яка вводиться, а саме 0,01 мг на 1 кг маси тіла, 0,1 мг/кг, 1 мг/кг або 10 мг/кг. У кожній групі тварин одну особину умертвляли через 28 діб після введення антитіл, а другу особину - коли кількість
В-лімфоцитів у неї досягало рівня, порівнянного з таким до введення антитіл, що визначали шляхом проточної цитометрії (піддослідні тварини, умертвлені по закінченні періода відновлення,скорочено КА). У ході даного дослідження всі практичні дії/методики й процедури проводилися згідно із Правилами належної лабораторної практики Організації ОЕСО) відповідно до настанов Міністерства охорони здоров'я Великобританії.
У різні моменти часу після введення антитіл аналізували популяції Т- і В-лімфоцитів у периферичній крові шляхом проточної цитометрії. В-клітини ідентифікували, використовуючи маркери клітинної поверхні СО19 і СО21 (клітини СО19-С0215); загальну кількість Т-лімфоцитів визначали як суму кількостей клітин СО4- ії СО8». Як видно на Фіг. 9А, уведення антитіл р51дсое1- пиСОЗ3-НІТІ 1-РЕАЇ хСО20-708-РЕАК у дозах 1 мг/кг і 10 мг/кг приводило до виснаження В- лімфоцитів у циркулюючій крові до не детектованого рівня вже в перший з узятих для вимірів моментів часу (1 доба після введення антитіл). При дозах 0,01 мг/кг і 0,1 мг/кг виснаження В- клітин було лише частковим або взагалі не відбувалося. Стан виснаження В-лімфоцитів зберігався 4-6 тижнів (28-42 доби) після введення антитіл у групі мавп, які одержали їх у дозі 1 мг/кг, після чого відбувалося відновлення рівня В-лімфоцитів до рівня, відзначеного перед уведенням антитіл, причому рівень В-клітин відновлювався через 9 тижнів (63 доби) (63 дауз) після введення антитіл. У групі тварин, які одержали антитіла в дозі 10 мг/кг, відновлення рівня
В-лімфоцитів тільки починалося через 9-10 тижнів (70 діб) після введення антитіл. У всіх групах мавп спостерігалося тимчасове скорочення числа Т-лімфоцитів у циркулюючій крові через 1 добу після введення антитіл (Фіг. 98). При наступному вимірюванні (3 доби після введення антитіл) рівень Т-клітин ставав таким, яким він був до введення антитіл і далі залишався незмінним аж до закінчення дослідження.
У всіх піддослідних тварин брали шляхом біопсії тканину поверхневих лімфатичних вузлів (приблизно по 20 мг із лівих і правих пахових і пахвових) у різні моменти часу після введення антитіл. Біоптати гомогенізували шляхом проточної цитометрії визначали частоту зустрічі В- і Т- лімфоцитів (у відсотках від загальної популяції лімфоцитів, яку ідентифікували на підставі даних за прямим і бічним розсіюванням (ЕБО-550).В-клітини ідентифікували, використовуючи маркери клітинної поверхні СО19 ї СО21 (клітини СО19-С021); загальну кількість Т-лімфоцитів визначали як суму кількостей клітин СО4: і СО8». Як видно на Фіг. 9С, уведення антитіл р51дсое1- пиСОЗ3-НІТІ 1-РЕАЇ хСО20-708-РЕАК у дозах 1 мг/кг і 10 мг/кг приводило до виснаження В- лімфоцитів до не детектованого рівня вже в перший з узятих для вимірів моментів часу (7 діб після введення антитіл). Після введення зазначених доз антитіл стан виснаження В-лімфоцитів зберігався 7 тижнів, після чого починалося відновлення вихідного рівня цих клітин, але через 13-14 тижнів (84-95 діб) після введення антитіл воно було ще неповним. У групах тварин, що одержали антитіла в дозах 0,01 мг/кг ії 0,1 мг/кг, максимальне виснаження В-лімфоцитів спостерігалося на 16-й день після введення антитіл, причому в мавп, які одержали антитіла в дозі 0,01 мг/кг, повне відновлення вихідного рівня В-клітин відзначалося через 28 діб після введення антитіл, а в групі особин, які одержали антитіла в дозі 0,1 мг/кг, спостерігалося його часткове відновлення через 14 тижнів (95 діб) після введення антитіл. Істотних змін частоти Т- лімфоцитів у лімфатичних вузлах ні при одній з узятих доз антитіл не відзначалося (Фіг. 903.
Визначали рівень цитокінів (1-2, ІІ -6, 1-8, 1-10, ТЄМ-у і ТМЕ-а) у плазмі крові, застосовуючи стандартні аналітичні методи. Уведення антитіл Б5Іде1-пиСОЗ-НІ11 1-РЕЕАЇ хСО20-708-РЕАВ викликало тимчасове підвищення рівнів зазначених цитокінів у плазмі крові, яке, очевидно, залежало від дози антитіл (Фіг УЕ). Через 24 години після введення антитіл рівні всіх цих цитокінів верталися до тих значень, які спостерігалися до введення антитіл.
Визначали фармакокінетичний профіль антитіл б5Іде1-нпиСО3-НІТІ 1-РЕАІ хСО20-708-ЕЕАВ, аналізуючи зразки плазми крові, узяті до введення антитіл і в різні моменти часу протягом 70 діб після введення антитіл. Сумарну концентрацію зазначених біспецифічних антитіл визначали шляхом імуно-ПЦР. Фармакокінетичні параметри розраховували шляхом некомпартментового аналізу (Рпоепіх М/пМопі іп). Отримані результати представлено в таблиці 10. Судячи зі
Зо значень площі під кривою АШсСо-«, нормалізованих за дозою (АсСо-»/доза), має місце нелінійне зростання експозиції аналіта в плазмі крові. Зростання значень АОСо-« більше пропорційного вказує на те, що в кліренсі антитіл б51де1-пиСОЗ3-НІ11 1-ЕЕАЇІ хСО20-708-ЕЕАК бере участь їхня мішень. Крім того, фармакокінетичний профіль Б51де1-пиСОЗ3-НІ111-РЕАІ хСО20-708-РЕАВ свідчить про швидший первісний розподіл і кліренс у порівнянні з тим, що спостерігається при введенні яванському макаку звичайних моноклональних антитіл типу Ідс1 (Фіг. 9БЕ).
Також у яванського макака визначали імунну відповідь на введений лікарський агент (АБА), тобто поява в сироватці крові антитіл проти Б5Іде1-пиСОЗ3-НІІ 1-РЕАЇ хСО20-708-ЕРЕАК (ці дані не показані). Антитіла, спрямовані на введені біспецифічні антитіла, з'являлися у всіх піддослідних тварин, крім тих, які одержували дозу 10 мкг, починаючи із Дня 15 і були присутні далі.
Таблиця 10
Фармакокінетичні параметри антитіл р5Ідат-пиСОЗ3-НІТ 1 1-РЕАЇхСО20-708-РЕАК у яванського макака
Параметр Розмірність знак 2 указує ідентифікаційний номер особини уа - обсяг розподілу препарату; Стах - максимальна концентрація в плазмі крові; Їлах - Час досягнення максимальної концентрації; АОСо - площа під кривою концентрація-час від нуля нескінченно з екстраполяцією кінцевої фази. Дані для кожної особини в групі (зао дозою) показані окремо (номер особини зверху стовпчика)
Приклад 13. Ідентифікація амінокислотних залишків СО20, які брали участь у зв'язуванні з біспецифічними антитілами проти СО20 і СОЗ
Дослідження, проведені раніше, показали, що для розпізнавання СО20 ритуксимабом критично важливі залишок аланіна в положенні 170 (А170) і особливо залишок проліна в положенні 172 (Р172) амінокислотної послідовності позаклітинної петлі СО20О (Роїуак еї аї. 2002,
Віоса 99: 3256-3262; Регоза вї а. 2005, Віоса 107: 1070-1077). Після створення мутацій А1705 і
Р1725 (мутація "АхР") у позаклітинному домені СО2О ритуксимаб повністю втрачав здатність зв'язуватися з СО20, який експресувався в клітинах лінії НЕК29ЗЕ. У мишачих моноклональних антитіл тАБ ВІ також сильно знижене зв'язування з мутантним СО20-АхР, хоча все-таки спостерігається залишкове зв'язування. Напроти, на зв'язування антитіл Ід1-2Е2, ІД21-708 і
Ідс1-2С06 з СО20 мутація АХР не впливає. А от заміна залишків аспарагіна в положенні 163 або 166 на аспарагінову кислоту (М163О або М1660, відповідно) повністю ліквідувала зв'язування
СО20 з Ід01-206 і знижувала його не менше ніж на 75 95 у випадку Ідс1-2Е2 і ІдДб1-708. У випадку трьох мутацій: заміна треоніна на лізин у положенні 159 (Т159К) на додаток до мутацій
М163О та М1660 (Т159К/М1630/М166О0, "КОЮ"; було відсутнє зв'язування СО20 з моноклональними антитілами 2Е2, 708 і 206. Мутація КОО лише помірно впливала на зв'язування ритуксимаба й антитіл ВІ1 (Тееїїпд еї аІ. 2006, Тпе доигпаї! ої Іттипоіоду 177: 362- 25. 371).
Щоб вивчити зв'язування біспецифічних антитіл проти СОЗ і 2020 з СО20 дикого типу (мМ/)), мутантним СО20-АхР і СО20-КОО, був сконструйований експресійний вектор для СО2О шляхом ампліфікації нуклеотидної послідовності, що кодує СО20О0, використовуючи придатні праймери, сайти рестрикції й послідовність Козака для оптимальної експресії. Амплифікований фрагмент
Зо розщеплювали й лігували в експресійний вектор рЕЕ12.4 (Гопла, Слау, Великобританія).
Проводили трансформацію клітин Е. соїї, з колоній бактеріальних клітин відбирали ті, у яких мала місце інсерція, і в результаті було відібрано два клони для секвенування з метою підтвердження потрібної послідовності. Отриману векторну конструкцію позначили
РЕЕ12.4С0О20Н5-СА. Щоб створити мутації АхР або КОЮ в області позаклітинної петлі людського СО20, здійснювали мутагенез. Результати мутагенезу перевіряли шляхом розщеплення ферментами рестрикції й секвенування. Здійснювали тимчасову експресію отриманих нуклеотидних конструкцій у клітинах НЕК29ЗЕ і проводили аналіз методом проточної цитометрії через 24 години після трансфекції.
Олігонуклеотидні праймери для полімеразної ланцюгової реакції (РСК). Олігонуклеотидні праймери для даного експерименту були синтезовані й кількісно охарактеризовані в компанії
Іводеп ВМ (Маарсен, Нідерланди). Отримані праймери розбавляли водою до концентрації 100 пмоль/мкл і до використання зберігали за температури -20 "С. Нуклеотидні послідовності праймерів наведено в таблиці 11.
Визначення оптичної щільності полінуклеотидів. Оптичну щільність визначали на спектрофотометрі ОПгозрес 2100 рго Сіазвіс (Атегзпат Віозсіепсе5, Уппсала, Швеція) за інструкціями виробника. Концентрацію ДНК визначали за даними вимірів оптичної щільності при довжині хвилі 260 нм (00260), прийнявши, що 1 одиниця 00260-50 мкг/мл. Розчин порівняння був такий же, який використовували для розчинення полінуклеотидів.
Виділення плазмідної ДНК із культури Е.соїї. Плазмідну ДНК виділяли з культур клітин Б.соїї за допомогою наборів виробництва Оіадеп (М/езібигуд ВУ, Лейден, Нідерланди), за інструкціями виробника. Для одержання значної кількості плазмідної ДНК брали набір Ні-б5реєд ріазтій Махі
КІ або Ні-5реєа ріазтій Міді КЕ (Оіадеп). Для маломасштабного виділення (наприклад з 2 мл культури Е.соїї) використовували набір Оіаргер Зріп Міпіргер Кії (Оіадеп) і ДНК елюювали 50 мкл розчину ТЕ (Ттгіз-НСІ 10 мМ рН 8,0; ЕОТА 1 мМ).
Ампліфікація шляхом полімеразної ланцюгової реакції. РСК проводили за інструкціями виробника для ДНК-полімерази Ріш-Тигроє Ноївіаг (5ігаїадепе, Амстердам, Нідерланди). Кожна реакційна суміш (20 мл) містила 1 х буферний розчин для РСК, 200 мМ суміші дезоксинуклеотидтрифосфатів, по 6,7 пмоль прямого й зворотного праймерів, приблизно 1 нг
ДНК-матриці й 1 одиницю ДНК-полімерази Ріи-ТигробЄ Ноївіагі. Реакцію здійснювали в ампліфікаторі із градієнтним нагріванням Т-дгадіепі Тпеппосусіег 96 (Віотеїга стр, Геттінген,
Німеччина), використовуючи З30-циклову програму: 2 хв. при 195 "С, потім 30 циклів: 30 с при -95 С; відпалювання: 30 с при градієнті 45-65 "С і елонгація: 2 хв. при 72 "С потім фінальна елонгація 10 хв. при 72 "С; продукт зберігали при 4 "С. Після завершення процесу реакційну суміш аналізували шляхом гель-електрофореза.
Електрофорез в агарозному гелі. Електрофорез в агарозному гелі проводили згідно з керівництвом .).ЗатбгооК, О.Кивззеї| "МоїІесшаг Сіопіпд Гарогаїгу Мапиа! (3-е видання), використовуючи гелі обсягом 50 мл у буферному розчині 1хТАЕ (Тгів/оцтова кислота/ЕЮОТА).
Візуалізація ДНК досягалася шляхом включення до складу гелю бромистого етидія й спостереження при висвітленні ультрафіолетовим світлом. Зображення гелів одержували за допомогою камери ССО і аналізатора зображень Сепебпоте (Зупдепе, Кембридж,
Великобританія).
Розщеплення ферментами рестрикції. Використовували ферменти рестрикції, надані компанією Мем/ Епдіапа Віоїаб5 (Беверлі, шт. Массачусетс, США), згідно з рекомендаціями
Зо постачальника. Як правило, на 100 нг субстрату брали 5 одиниць ферменту (ферментів) у придатному буферному розчині (кінцевий обсяг 10 мл). Обсяг реакційної суміші брали відповідно до конкретної необхідності. Реакційну суміш інкубували за температури, рекомендованої виробником, протягом не менше 60 хвилин.
Якщо даний фрагмент потрібно було розщеплювати двічі ферментами рестрикції, несумісними за вимогами для кожного з них до буферного розчину або за температурою, розщеплення проводили послідовно, створюючи для кожного ферменту сприятливі умови по черзі.
Обробка лужною фосфатазою. Використовували лужну фосфатазу креветки (ОВ,
Клівленд, шт. Огайо, США) згідно з рекомендаціями постачальника. Цей фермент відщеплює 5'- фосфатні групи з кінців фрагмента ДНК, тим самим запобігаючи самолігуванню. Це особливо важливо, коли самолігування фрагмента ДНК може привести до утворення здатного до реплікації вектора. Лужна фосфатаза активна в більшості буферних розчинів, використовуваних для ферментів рестрикції; її додавали в реакційну суміш у міру необхідності. Після розщеплення
ДНК лужну фосфатазу інактивували, підвищуючи температуру до 70 "С на 15 хвилин.
Очищення продуктів полімеразної ланцюгової реакції й реакції розщеплення ферментами рестрикції. Для очищення використовували набір МіпЕІше РСЕК Ритгійсайоп Кії (наданий Оіадеп) згідно з інструкціями виробника. Коротко, робили наступне. Зразки ДНК розводили в п'ятикратному обсязі буферного розчину для зв'язування І. (Оіадеп), завантажували в спін- колонку, розміщену в центрифужну пробірку типу Еррепаогї і центрифугували в настільній центрифузі. Колонку промивали два рази буферним розчином ІІ (Оіадеп), а саме: після завантаження буферного розчину колонку в пробірці центрифугували й рідину із пробірки відкидали; колонку висушували шляхом центрифугування без буферного розчину; ДНК зі стовпчика елююювали буферним розчином для елююювання й елюат збирали для центрифугування. Виділену ДНК кількісно визначали шляхом ультрафіолетової спектроскопії й перевіряли шляхом електрофореза в агарозному гелі.
Виділення фрагментів ДНК із агарозного гелю. За необхідності (тобто коли було присутньо багато різних фрагментів) зразки розщепленої ДНК розділяли шляхом гель-електрофореза, потрібний фрагмент вирізали з гелю й виділяли з нього ДНК за допомогою набору ОЇІАЕХ ЇЇ деї ехігасіоп Кії (Оіадеп) згідно з інструкціями виробника. Коротко робили наступне: з агарозного бо гелю вирізали потрібні смуги й розплавляли гель у придатному буферному розчині за температури 155 "С. Додавали смолу ОІАЕХ ІІ ії інкубували протягом 5 хвилин. Осаджували смолу ОІАЕХ ЇЇ шляхом центрифугування (1 хвилина при 14000 49 і кімнатній температурі) і два рази промивали 500 мкл буферного розчину РЕ (Оіадеп, номер за каталогом 19065). Останній осад висушували у витяжній шафі й ДНК елююювали буферним розчином ТЕ в обсязі й за температури, що залежать від розмірів ДНК.
Лігування фрагментів ДНК. Лігування здійснювали, використовуючи набір ОпціскК І іїдайоп Кії (Мем/ Епдіапа Віоїарв) згідно з інструкціями виробника. Для кожного акту лігування ДНК-вектор змішували із приблизно трикратним молярним надлишком ДНК-вставки, причому сумарна кількість ДНК була менша 200 нг в обсязі 10 мкл, до якого додавали воду, скільки було потрібно.
До цієї суміші додавали 10 мкл буферного розчину для лигування (2 х ОпціскК І ідайоп Вийег) і 1 мкл ДНК-лігази фага Т4 (Оціск); отриману суміш інкубували за кімнатної температури протягом 5-30 хвилин.
Трансформація бактеріальних клітин. Зразками ДНК трансформували компетентні клітини
Е.соїї Опе Зпої ОН5БО-Т1К (Іпмігодеп, Бреда, Нідерланди), застосовуючи метод теплового шоку згідно з інструкціями виробника. Коротко, робили наступне: 1-5 мкл розчину ДНК (як правило, 2 мкл суміші для лігування ДНК) додавали до аліквоти бактеріальних клітин, компетентних для трансформації, і отриману суміш інкубували на льоді протягом 30 хвилин; потім клітини піддавали тепловому шоку, поміщаючи їх на 30 секунд у водяну лазню з температурою 42 С, після чого інкубували на льоді ще 5 хвилин; клітини залишали для відновлення, інкубуючи їх у неселективному культуральному середовищі (50С) при перемішуванні й температурі 377 протягом 1 години, а потім клітини розподіляли на агарових дисках, які містять відповідний селективний агент (ампіцилін у концентрації 50 мкг/мл), і диски інкубували за температури -37 "С протягом 16-18 годин або доти, поки не з'являлися колонії бактерій.
Скринінг бактеріальних колоній з використанням полімеразної ланцюгової реакції. Серед колоній бактеріальних клітин шукали ті, у яких були присутні вектори, які містять потрібні нуклеотидні послідовності, застосовуючи метод скринінга колоній з використанням полімеразної ланцюгової реакції (РСК). Реакційну суміш для РСК, що містить 0,5 обсягу суміші з набору
Ноїстапад Мавіег Міх Кії (Оіадеп), по 4 пмоль прямого й зворотного праймерів і воду до обсягу 20 мкл, поміщали в пробірку для РСК. До кожної колонії доторкалися кінчиком піпетки на 20
Зо мкл, опускали кінчик в 2 мл середовища ІВ у культуральній пробірці (для вирощування бактерій, що несуть відповідну плазміду) і ресуспендували в 20 мкл суміші для РОК. Реакцію здійснювали в ампліфікаторі із градієнтним нагріванням Т-дгадіепі Тпегтосусієг 96 (Віотейна стр, Геттінген, Німеччина), використовуючи 35-циклову програму: 15 хв. при 495 "С, потім 35 циклів: 30 с при 94 "С; відпалювання: 30 с при 55 "С і елонгація: 2 хв. при 72 "С, потім фінальна елонгація 10 хв. при 72 "С; зберігання при 4 "С. Після завершення процесу реакційну суміш аналізували шляхом електрофореза в агарозному гелі. У таблиці 11 наведені пари, що використовувалися в цьому аналізі праймерів.
Секвеновані ДНК. Для проведення секвенування зразки плазмідної ДНК посилали в компанію АСОММА (Берлін, Німеччина). Послідовності аналізували з використанням пакета програм Месіогпії (Іп'огтах, Фредерік, шт. Меріленд, США).
Таблиця 11 бОр20н5-Са- бОр20н5-Са- бОр20н5-Са-
Тт159К-М1630- 43 стсаСАадатсатааАатТатосаАтатаасиа7астатсааСсСацАТа
Мм1660 В бОр20н5-Са-
Тт159К-М1630- 43 САТССОЯЙЧИСССАСААаСССТАСАТСИАСАТСТАСОЯАСТОаСИда
М1660 г
Мутагенез. Мутагенез здійснювали з використанням набору ОцікспапдеФ ХІІ. Зйе-бігесієй
Мшигадепевівз Кії (Зігаїадепе Еигоре, номер за каталогом 200517-5, лот 1120630) за інструкціями виробника.
Після проведення реакції мутагенезу реакційну суміш концентрували (осадження етиловим спиртом) і використовували для трансформації компетентних клітин Е.соїї Опезпої ОН5Ба-ТІВ або шляхом електропорації відповідно компетентних клітин ЕПІесігоїеп-Біце?т. Перед трансфекцією проводили скринінг колоній з використанням РСК і розщеплення ДНК ферментами рестрикції.
Трансфекція клітин НЕК293Е. Клітини НЕК2О9ЗЕ були надані компанією Іпмігодеп; їх трансфекцію здійснювали згідно з інструкціями виробника, використовуючи фектин.
Зв'язування антитіл проти СО20. Клітини НЕК2ОЗЕ поміщали в буферний розчин для фарбування (фізіологічний розчин, який забуферений фосфатом (РВБ) і містить 0,1 95 бичачого сироваткового альбуміну (В5А) і 0,02 95 азиду натрію (МаМ»з)) і завантажували в круглодонні планшети (1-3 х 105 клітин на 1 лунку в обсязі 100 мкл). Потім додавали в лунки по 50 мкл біспецифічних антитіл проти СОЗ і СО20 у серійних розведеннях (0,0015-10 мкг/мл, трикратне розведення); інкубували за температури 4 "С протягом 30 хвилин.
Клітини промивали два рази буферним розчином для фарбування, після чого інкубували в 50 мкл вторинних антитіл за температури 4 "С протягом 30 хвилин. У якості вторинних антитіл використовували козячі антитіла проти людського дО Е(аб)2, кон'юговані з К-фікоеритрином, як описано вище. Потім клітини промивали один раз буферним розчином для фарбування, ресуспендували в 150 мкл буферного розчину для фарбування й аналізували за допомогою проточного цитофлуориметра БАСЗСапіо-720 (Весіоп бісКіпзоп, Сан-Дієго, шт. Каліфорнія,
США); при високій швидкості потоку - 10 000 подій на зразок. Криві зв'язування аналізували шляхом нелінійного регресійного аналізу (сигмоїдні криві "доза-відповідь" з різним нахилом), використовуючи програмне забезпечення сСгарпРай Ргізт М75.04 (СгарпРад боїмаге, Сан-
Дієго, шт. Каліфорнія, США).
Усі біспецифічні антитіла проти СОЗ і 2020 ефективно зв'язувалися із клітинами НЕК2ОЗЕ, у яких експресувався СО20 дикого типу (Фіг. 10А). Як видно з Фіг. 108 і таблиці 12, антитіла р5Ідат-пиСО3-НІ І 1-РЕАЇ хСО20-708-РЕАВ, реІдат-пиСО3-НІТ І 1-РЕАЇ хСО20-2Е2-ЕЕАВ, р5Ідат1-пиСОЗ3-НІТІ 1-РЕАЇ хСО20-1188-РЕАК.:ЧУо і р5Ід1-пиСО3-НІТІ 1-РЕАЇ хСО20-206-РЕАВ ефективно зв'язувалися з мутантним варіантом АхР. Подібним чином антитіла Б5Іде1-писСіІ В- 3/4-РЕАЇ хСО20-708-РЕАВ, Б5іда1-пиСІ В-3/4-ЕЕАЇ хСО20-2Р2-БЕАК і 0 р5Ідв1-пиСІ В-3/4-
ЕЕАЇ хСО20-1188-РЕАК ефективно зв'язувалися з СО20О-АхР. Як і очікувалося, р5Ідсе1-пниСОЗ3-
НІТІ1-ЕЕАГ хСО20-ВТХ-ЕЕАК зовсім не зв'язувалися з мутантним варіантом АХхР, як було раніше
Ко) показано для вихідних антитіл Ідс1--ТХ. Антитіла Бб5Іде1-пиСОЗ3-НІТІ 1-РЕАІЇ хСО20-сА101-
ЕЕАК зв'язувалися з СО20-АХР значно гірше, ніж з не мутантним СО20.
Антитіла Б5Ід51-пиСОЗ3-НІТІ 1-РЕАІ хСО20-708-ЕЕАВ, Бзідат-пиСОЗ3-НІЇ 1-РЕАЇ хСО20-2Е2-
ЕЕАК і Б5іде1-пиСО3-НІТІ 1-РЕАЇ хСО20-2С6-ЕЕАБЕ, а також р5Ідв1-пиСІ В-3/4-РЕАЇ хСОр20-708-
ЕЕАК і рзіде1-пиСіІ В-3/4-ЕЕАЇ хСО20-2г2-ЕЕАК втрачали здатність зв'язуватися з СО20 після виникнення в ньому мутацій КОЮ (див. таблицю 12); тим самим підтверджувалося, що ці біспецифічні антитіла, моновалентно зв'язуючі СЮО20, мають властивості зв'язування, порівнянні з такими вихідних антитіл Ідсе1-708, ІдДа1-2Е2 і Ідс1-2С6, відповідно. Що стосується антитіл р5Ідат-пиСОЗ3-НІ І 1-РЕАЇ хСО20-1188-ЕЕАК і Б51д1-пиСіІ В-3/4-РЕАЇ хСОр20-1188-ЕЕАБЕ, то при наявності мутації КОО вони частково втрачали здатність зв'язуватися з СО20.
Таблиця 12. Зв'язування біспецифічних антитіл проти СОЗ ії СО20 з мутантними варіантами бог20
Зв'язування біспецифічних антитіл проти СОЗ ї СО20 з мутантними варіантами СО20, які експресуються в клітинах НЕК293, визначали шляхом проточної цитометрії. Наведені тут числа - це відношення (у відсотках) зв'язування даного антитіла з мутантним варіантом СО20 до його зв'язування з СО20О дикого типу (м/) при концентрації 10 мкг/мл, розраховане за формулою (МЕЇ зв'язування з мутантним СО20)МЕ! зв'язування з уУЛСЮО20) х 10095; (МЕ! - середня інтенсивність флуоресценції). . о. . Зв'язування з мутантним СО20
РОТИ о ВвІдсі-пиСОЗ-НТ-РЕАІХСр2о-2г2-РЕАВ 7777777 Ї77771714777717771171980щ
Приклад 14. Визначення спорідненості зв'язування СОЗ методом біошарової інтерферометрії
Для визначення спорідненості зв'язування біспецифічних антитіл проти СОЗ ії СО20 з СОЗ, застосовували метод біошарової інтерферометрії, використовуючи обладнання ЕогіеВіо Осіеї
НТХ. З біосенсорами, покритими антитілами проти людського Ес (АНС) (Рогпебіо, Портсмут,
Великобританія; номер за каталогом 18-5060) контактували (іммобілізація) протягом 600 секунд (с) біспецифічні антитіла проти СОЗ ї СО20 (1 мкг/мл) для зрушення при іммобілізації 1 нм.
Після встановлення базового рівня (200 с) визначали асоціацію (1000 с) і дисоціацію (2000 с) розчинного СОЗєЄ27-О5Ка, використовуючи концентрації від 1 нМ до 1000 нМ. Білок СОЗє27- оЗКа складається з є-пептиду людського СОЗ (амінокислотні залишки з 1-го по 27-й), з'єднаного 3 М-кінцем легкого каппа-ланцюга (5ЕО ІЮ МО: 402). Для розрахунків використовували теоретичне (за амінокислотною послідовністю) значення молекулярної маси СОЗє27-55Ка, а саме 27,1 кДа. Досліди проводили при перемішуванні за допомогою обертаючого шейкера (1000 об/хв.) за температури 30 "С.
Отримані дані аналізували за допомогою програмного забезпечення Еогіебіо Оаїа Апаїувів зопмаге м8.1, використовуючи модель 1:1 і повну відповідність при часі асоціації 1000 с і часі дисоціації 200 с. Криві за даними, які реєструвалися, коректували шляхом вирахування значень за референсною кривою (біспецифічні антитіла проти СО20 і СОЗ без СОЗє27-о5Ка), вісь У вирівнювали за останніми 10 с базового рівня й застосовували міжетапні коректування й фільтрацію шумів методом Савицького-Голея. Криві за даними, які реєструвалися, із сигналом менше 0,05 нм в аналіз не включали.
Значення константи дисоціації (КО) для всіх біспецифічних антитіл проти СОЗ ї СО20 були в межах подвоєного значення КО вихідних антитіл Ідсе1-пиСОЗ-НІ1 1-ЕЕАЇ.
Таблиця 13
Константи дисоціації (Ко), швидкості асоціації (Коп) і швидкості дисоціації (Ка) для вибіркових біспецифічних антитіл проти СОЗ і СО20 комі | юхллюх | кої
Іда1-пиСОЗ3-НІЇ 1-РЕАГ. 1,4Е-08 З2Е05 4,5Е-03
Ввіда1-пиСОЗ3-НІТІ 1-РЕАЇ хСО20-2г2-РЕАВ 1,5Е-08 2,71Е-4-05 41-03
Ввіда1-пиСОЗ3-НІТІ 1-РЕАГ хСО20-сА1Т101-РЕАВ 1,5Е-08 2,71Е-4-05 4,0Е-03
Ввіда1-нпиСОЗ3-НІТІ 1-РЕАЇГ хСО20-1188-РЕЕАВ 1,2Е-08 41Е--05 4,8Е-03
Ввіда1-пиСОЗ3-НІТІ 1-РЕАЇ хСО20-206-РЕАВ 0,81Е-08 З,ЗЕ05 2,7Б-03
Ввіда1-пиСОЗ3-НІТІ 1-РЕАГ хСО20-ВТХ-РЕАВ 11-08 3,9Е--05 4,3Е-03
Ввіда1-пиСОЗ3-НІТІ 1-РЕАЇГ хСО20-708-РЕАВ 11-08 З3,8Е-05 4, ЗЕ-03
Ввіда1-пиСОЗ3-НІТІ 1-РЕАЇГ хСО20-612-РЕАВ 2,1Е-08 1,7Е--05 З,7Е-03
Приклад 15. Антитіла В5Іде1-пиСО3-НІІ 1-РЕАЇ хСО20-708-ЕРЕАВ викликають активацію Т- лімфоцитів у присутності В-лімфоцитів
Здатність біспецифічних антитіл проти СЮОЗ і СО20 викликати активацію Т-лімфоцитів у
Зо присутності В-лімфоцитів визначали шляхом інкубації мононуклеарів периферичної крові (РВМС) з антитілами р5іде1-нпиСОЗ3-НІІ 1-РЕАЇ хСО20-708-РЕАК. Про активацію Т-лімфоцитів судили за експресією СОб9.
Виділені, як описано вище, із крові здорових донорів РВМС поміщали в 96-ямкові круглодонні культуральні планшети (Сгеїіпег Біо-опе, номер за каталогом 650180) у кількості 100 000 клітин на лунку й інкубували з антитілами р5Іда1-пиСОЗ3-НІІ 1-РЕАЇ хСО20-708-РЕАВ, розведеними в середовищі КРМІ-- (кінцева концентрація антитіл 0,1 - 1000 нг/мл). Кінцевий обсяг умісту однієї лунки становив 100 мкл. Негативним контролем служили бівалентні антитіла проти СОЗ з неактивними доменами Ес Іда1-ниСОЗ3-НІ11І1-ЕЕАЇГ. і Ідс1-писСіІ В-13/4-ЕЕАЇ, а також для контролю ізотипа антитіла Ідс1-012-РЕАГ. Позитивним контролем служили бівалентні антитіла проти СОЗ ІЗЕ-пиСіІ В-13/4, про яких відомо, що вони викликають активацію
Т-лімфоцитів, і бівалентні антитіла проти СОЗ з активним доменом Ес Ідс1-пиСіІ В-13/4-Е405І..
РВМС інкубували з антитілами за температури 37 С в атмосфері, що містить 595 СО»,
протягом 16-24 годин.
Для активації Т-лімфоцитів РВМС промивали два рази буферним розчином для фарбування й ресуспендували в буферному розчині для фарбування (кінцевий обсяг 50 мкл), що містить мишачі антитіла проти людського СОб69, мічені алофікоцианіном (АРС), у кінцевому розведенні 1100 (ВО Ріагтіпдеп, номер за каталогом 340560) і мишачі антитіла проти людського СО28, мічені фікоеритрином (РЕ), у кінцевому розведенні 1:40 (Мійепу Віобїесі, номер за каталогом 130-092-921). Через 30 хвилин за температури 4"С клітини промивали два рази, ресуспендували в 150 мкл буферного розчину для фарбування й аналізували за допомогою проточного цитофлуориметра РАСБЗСапіо!! (ВО Віозсіепсе5). У популяції клітин СО28- визначали середню інтенсивність флуоресценції, обумовлену АРС (СО69); С028 служив маркером для ідентифікації Т-лімфоцитів.
Як видно з Фіг. 11, антитіла б5Іде1-ниСОЗ3-НІТІ 1-РЕАЇ хСО20-708-РЕАК викликали залежну від їхньої дози активацію Т-лімфоцитів, на яку вказує підвищення рівня експресії СОб69 у Т- клітинах периферичної крові. Активація Т-лімфоцитів також спостерігалася після інкубації з антитілами ІДЕ-пиСІ В-Т13/4 ї Ідс1-ни-СІ 83/4-Е4051Ї, що служили позитивним контролем. На противагу цьому антитіла Іде1-пиСОЗ3-НІІ 1-РЕАЇГ., дат -писСіІ В-Т3/4-РЕАГ. і Іде1-612-ЕЕАЇ,, що служили негативним контролем, не викликали експресію СОб9.
ПЕРЕЛІК. ПОСЛІДОВНОСТЕЙ «1105 ГЕНМАБ АЙС «1205 БІСПЕЦИФІЧНІ АНТИТІЛА ПРОТИ Со3 ї с020 «1305 Р/0090-МО кібо» 87 «ЙО» Патентована верстя 3.5 «105 їі «2115 8 «912» Білок «2135 «с «4005 1 с1у Ре тб РБе Аза ТВг оТуг АТа 1 5 «2105 2 -2115 10 «2412» Білок «-2135 Миша хатня сХМи5 Ми5сии5) «4005 2
Те Акад Бек мує Тук дяй Абй тТуг АТа те 1 5 10 210» З «Р1ї» 16 к?1їйх Біпок «2135 Миша хатня ЄМи5 Мис и53 «4005 3 май Ага Ні біу дзп Ре біу дп бег тує Ма! его отгр вве АТа туг 1 5 10 15 «210» 4 «2115 9 кеїй» Біпок «21315 Миша хатня (ми5 мМми5ешій5) «4005 Я
Те б1у АзТа ма! таготвгобегодей туг 1 З «2105 5 «2115 8 «812» Біпок «2132 Миїща хатня (Ми5 Ми5си1Тне) «8005 5
Аїа ївеи Тер тує бег д5п Бей тер ма 1 5
«210з в «11» 125 «й?» Білок «2135» Миша хатня (Ми5 Мизси1с053 «4005 56 сін Ууаї гуз їбецй уаї СТИ бе с1у біу аіу бе уаї бій Рго біу біу
Її 5 НК; 15 чек реч Ако їви бек сСує Аза Аа Зег бі Ре Тйг о РНе Ап тТпгоОтуг
Аіа меї Аб5поТкр Ма! Аго біп АТа Рго сбіу губ сіу бе бій стер Уа
АТа Аго Ії Аку бег ору5 Туг Ази Ап тує АТа тиг тус тує Аза АБр бо
Зег Ма! вух АвБр. АгО Рпе Тнг о їТе бег Агу Азродер 5ег буз Зег 5ег 65 70 75 80
Сец туго Сец біп Мет Ап АЙ ен ух тк бів Азр тп АтТа Меї тує 85 90 95 тТуг Ссуз Маї Аго Ні СІу А5п РНе с1іу А5п 5ег Туг Уа! 5ек Тер РБе що 105 110
АЇїа туг тер сіу біп біу тб вес уаї тйг оуа! 5ег 5ег 115 129 125 «10 и «211» 125 «212 Білок «135 Миша хатня (Ми5 Мизсуи53 «4005 7 сін ма! Гуз цей маї бі 5ес сіу с1у б1у їец маї їув о Рго с1у Аго 1 5 10 15 заг бен Аг Сен 5егоСуз АТа АТа 5ег соіу Ре тпг Рпе Аби тНг туг 20 25 зо
АТа Меє дзп тгр ма! Аг сій Аїа Рго біу уз 61Уу тей осі тероуаї 35 до 45
АїТа Ага Іїе Агд Бек Гуз тур Авп оди туго АЗа Тк туго Туг АТа дер 50 55 бо зак Уа! вуз Азр о Аго Ре Тиготіє 5ег Ак Азр А5р бек Гуз 5ег Те 655 70 75 80
Сен тує Сец біп Меї йєп Ази без гу« ТВг о біч А5р о ТАг Аба Месє туг 85 90 95
Тук сує уаї Ага ніх с1у А5п Ре біу Авп 5ег Туг ма! бег Тер вве 100 105 110
АЗфа тук тер біу сіп бі Тйговбе Маї тпг Уа! бегобек 115 129 125 «2105 8. «вії» 125 «212» Білок «213» Миша хатня (Миз Музси1и53 «4005 58 сі маї Суз Сей маї біц бег сіу біу с1у бен Маї цу5з Рго сіу Ага
І 5 10 45 чег Бец Ага Се бег о Сує Аза А1їа бег су РНе Тс Ра Абп тик Оотує діа меб о Абп Тер ома! АгО сій Аїа Рго сСіу бух бІіу їв оіцу Тер Уа!
Азіча Ага І1е Аго бек суб Тук деп дп туго Аїа тйгоТуг туго Ада дБр бо 5зег Ма! цує дер Аг РНе ТНг тів баг Ак Ар о Адяр зег Гук век ї1е 55 70 75 80 вен тТуг Сеги біп Меж дп баг сечу вуз ТВг обід АЗзр ТНК АТа мех Туг 85 90. 25
Туг Сує маї дгд Ні с1у д5п Ре сіу А5поЯвг о Тукоуаї бег Тер. рве 108 105 10
Аїа тує тетровіу оТй біу Тиг бен Уа! Таб омаї бак оз5ег 115 120 125 «2105 9 «ві» 125 «2195 Білок «21325 Миша хатня (Ми5 Му5сиТиЗ «00» З бій ма! уз ви ма! сій бег б1у сту бу їец о маї 1їу5 РКО су Ага, 1 З 10 15 бек гей Ага бе ЗегобСуз діа АТа зегобіу Ре тк оРвне делотйтг тує
Аа Меб деп тер Маії Ага біпоАїа рРго бім їу5 біу геу ги Тгр Уа!
АТа Аг І1е Агу бег оту Туг А5зп дп о Туг АЇа Тк тує Туг АТа Ар зо 55 60 «аг оуа! ув Ар Аг Рпе тТиг о їТе Зег Або Ар Ар обеб руб б5ег тів 65 70 75 во мен Туг Се біп Меб А5п 5ег Сей був тпг бій Ар тАж АТа меє туг 85 90 95 тут суз маї Ага ніх біу д5п Ре ЄТу д5позегоТук о уа!ї 5ег ТерорРве 100 105 по да Тук Тктробіїу бій су ТНг омМмеї уаї тб Ууаї 5ег 5ег
ТІ5 120 125 «2105 10 «рії» 1095 «2125 Білок «2135 Миша хатия (Мн5 Мис ше «4005 10 сій Аза уаї ма! тиг бів б1й РО 5ег Ре бег Ма! его Рго Ту СТУ 1 5 10 15
Те омаї твйгобен тйгоСуб Агу бекозеє тв обі АТа ма1ї Те тег озег 20 25 30
АБпотуг Аа Абп Тер ма! біп діп тТвкорго сіу біп Аїа РНе Аг сту 35 40 45 бе те сіу б1у Трг йхп губ Агу Аа Рго о б1іу маї Рго Ала дго Рпе 65о
Зек су бек реч тіє Ссіу А5р Гуз АТа АТа пец о тйг їЛе тве сту АТа б5 70 75 850 ор АТа дер А5р бі Бек І1е Туг Ре Суз АТа їеи тер туг б5ег дей 855 90 95
Мей Тер омаі Ре б1у б1іу ТУ тб оГух беш тиг омаї гец 100 105 «210» 11 «115 09 «212» Білок «2135 Миша хатня (Мих Мизеційя) «А0ОО» 4 бій АТа ма! уаї тб обіп біц рко баг Ре 5ек Уа! 5ег Рго Ту с1у 1 5 10 15
Тиг маї Ти Гей тТагоСує дб беє Звг о твг б1у АТа маі Те твгобег
Азп отут діа Ав Тгр о Ууаї сіп бій Тигб оРго о1у бТа АТа Ре Аг су гГеч тів біу а1у ТигоАхп Суб Аг Аїд вго оту маї Рго АТа Аго РНе зо 55 6о зе б1у зе ТІ сец сп1Ту Ап о гуз АТа АТа Сен Те о тТе твг о1у АТа 65 70 75 80
Сіп Аїд Ар о АБросіїц 5ег оті Туг РПе суб Аїа сеп тгротук бек Ап 85 90 95
Кей тр оуа!ї Рйе боту б1у ТУ тк обу гей тис маї гео 100 105 «210ю 15 «1їз3 09 «214» Білок «2135 Миша хатня (Мих МизсиТч53 -005 1472 сіп АТа маї ма! Тс осів с1б Рго бег Ре 5ег маї 5екгоРго сіу Фу ії 5 10 15
Тигомаії тб сей тс сСуз Аг бего5ек отак б1у АТа уаї таб отв бе 20 25 30
А5п о туг АТа Ап Тер ма! бій сій таб орго оту сій АТа РВе Аго бу 35 40 45
Гец тіє ТУ оту ТВ Ап Ку Аго АТасРгОо с1у уаї Ргб Аїа дго РВе 60 чего сСіу его ІЇе Гей сіу д5п бу АТа АТа се тик о т1е твг с1у Аїа 65 70 25 80 бій АТа Ар о Азр о біз чего А5р тує тук Суб АТа теп Тго туг Бек Ап 85 90 95 ен ткрома! Ре сіу сту сіу Тйгобуз веци так Уа ву 100 105 «2105 13 «2115 186 «212» Біпок «213» Людина розумна (Нопю: зартепвь) «В00х 3 сій Адхросіу деп оси бів Меб біх с1у тіествб обіп тає Рко туго був 1 5 юю їх ма! 5ег тів 5ег п01у тт твгомаї ї1іє рей тп оСує Рго бій Туг рРго 20 25 30 сіу зег біц ї16 сем Тер бій Ні А5по Ар огуз Азп т1іе с о1у 01у АБр «ІЧ дер Ар Був АЗИ ті біу 5аг Ар бі Ар Ніє ре бек сви Су 60 сіц Рпе бЗег біз бен біц сіб бек бі Тут тТукоуа!ї Су5 тує рго Ага 655 70 75 8о сту бег гбуз Рго іш сАєр АТа АБИ Рйе Тук сец Ту цен Аго АЇТа Аг 85 90 а5 чаї сух бін Ази Суб Меї бій Меї Або уаї Мех бек уаї Ата тик ї1е 100 105 116 ма! ІТе маї дер ІїТе суб тів тн біу сіу їги рей зей іви муаї тує 115 Т2о 125
ТУуг тер обег цу5 А5п Ага уз АТа цує АТа іу5 Ро маї Те дга оту 130 135 140
АТа оту Аїа с1у сіу с Аго б1п Аг б1у бій Аби вуб С1И дго ро РГО 145 150 155 1650
Рго Маї Рго А5п РГО Ар туг сій Рго І12 Ак уз б1у б1й го Ар 165 170 175 ем туго бек Ту Кей Ап. бій Аго Аг 11е 180 185 «310» ТА. «211: 150 «Ти» Білок «2335 Людина розумна Сното заріепе) «3005 14 випе руз ІТ6 Рго їТїе сім бій Сей сі дер АРО Ма! Ре Маї Азп Су 1 5 10 15 деп оте ес віє тТиг оТгромаї бін сіу тк омаї б1у тиг огбеу грец, бек дво Іа Твг Ага їеу АЗробеу С1іу уз дга Ті Меч АвроРго Аго су тіе с туй Адгу сСух Аяй со1у тйг одер о т116є туго руб А5р буз бін бек тик 60
Уаї іп ма! нНіз тує Ага мес Су бій бег о Су5 маї бі Гец дер рго 655 70 75 80
Аїа тйг Уаї Аїа б! те т11є мМаї тик Ар Уаї тіеє Аіа тт ге свй 55 90 95 це АТа Кеш біу Маї Рйе Су РНе Аа оту сні бій Тв Ту Аго її ей 109 105 о 5ег сі Аїа дія Авротвго бій АТа бе вен Аго деп Ар обіп уаї Туг 115 120 125 біп Рго цец Аг Ар Аг А5роАяр АТа сій тукобеакє нів рей бтусоту
І30 135 140
Азп Тгр о АТа Аго Ап ув 145 150 «2105 15 «21ї1х 330 «219 Білок -2135 Людина розумна (Ното зарівпв) «400» 15
АТа зек тТБгогув біу Рко 5ег маї Рпе Рго цеч АТа Рго бек зег Був 1 5 10 15
Зег Тпг о бБег б1іу сіу ТнгоАїа Аїа гей СТУ Суб ген уаії губ А5р туг
Ре рко біШш Рго мді Тйг ма! бек То Ап бак С1у Аа Гец ТВгс 5ег сбіу маї ні тТБг оРпе Ргсо Аїа ма! Геу сій б5ег бек сіу їв Туг 5ег 25 Ге18) їей обег зег уді ума! ТгоУуаї Рго зер бБег зег бе сту так ооТп о тог 65 70 75 ко
Туг ІчІЇе Суб Аза уді Ай Ні уз ро 5ег дБ тп обує уаї д5р Су 85 ФО 95 дга маї бій Рго їу5 бек Суб Ар бує ТНК онНІіб ТагоСу5 Ргао РгОо Су 100 105 1
Рго Аїд Рго бЇім ей ївеи біу б1іу Рго бег ма! Ріпа рен РПе Рго РгО 115 120 125
ГУуб Рго уз Ар ОТГ о вец омет тіе зег о Аго ТАгорго бій маї тиф сСуз 130 135 140
Ууаї ма! ма! Авв Ууді бегонії бін Ар Рго сім маї у Рпе деп гр 145 150 155 160
Тук Уаї А5р сіу маї бій ма! ні Ап о Аіа вує ТНг губ РГО Агд бі 165 170 175 сїй бій Туг Ап 5ег тйг тТуг Ага Уа! Уаї бег ма! рец тик Ууаї Кей 150 185 190 ні біб АБ5р о ттр Се дп о1у уз іш Тук Гу Су гу маї 5вг деп 195 200 205
КУу5 Аїа їеи Рго АТа РКО т1іе СТЧ руз Тк І1е 5ег суб АТа їу5 О1У 210 215 2750 бій Рго Аго ої РГО спо мМаї Туг Твгоцец Рго Рго 5ег Аг сту св 225 230 235 24й
Ме тп цу Аби бій маї бек рей тик Суз Гей ма! їу5 с1у РПЄ туг 245 250 255 вго бБег о А5р 116 діа Маії сій Тер бін б5егоА5п о о1іу біп Рго бір Ах 260 255 270
Аби отут цує ТК тис РКО РгГО Маї цей А5р 5ег дер сіу бЗег РПпе Рпе 275 280 285 це туг бег мує Те Твг уаї А5р Гу 5ег Агд тер біп біп оїу Авп 290 235 ЗО чаї Ре зег сСує чек ма! Мех нів сій АТа се Ні5 Аби Ніє туго тАг 305 310 315 Зо біп Гуз бег тей 5Зег бе бег о Рго Оу Гуз 325 330 сіб» 16 «2115 330 «2125 Білок «2135 Людина розумна (Ното зарієпе) «МНН» 16
Аіа бек Тбгобу5 б1у вко 5ек уаї Рре рРго Сей АЗа РгОо 5ег бег | ув ї 5 10 15
Зег тик ек сіу біу тйг АТЗ Аїа цец сіу суб їец уаї Гуз Абр туг
Ре РКО 5Ій Бко ма! ТНК о Маї бек тир оАб5и 5егооту Аїа бей Тис 5ег с1іу мМаї нів Тиг о рРПе Рго Аїа Уаї мем біп Заг бек с1у Кей тує бег 6о0 іїеу бек б5ег маї ма! тТнг Уа! Рго 5ек 5ег бек рей біу тйг бій тик 55 70 75 80 туг Ії1е Суз Азп о маї Аб5поНії су Рго бЗег одей Тег оїуз маї дер ух 85 90 935 дкд ма! бій вРгоіу5 бек Суб Ар оцух ТигОНіб те обу рго РгГО Суб о 105 110
РгОо АТа Рго бі Ре сій су б1у Рго 5ег маї РМе цеу РМ РгО РКО 115 120 125 іїу5 Рго Гуз Ар ТИ їеш мет їі бег Ага Тис о РГО Є Ма! Те Сує 130 135 140 уаї Уаї Уаі Аїа маї б5ег ні сіш Адзр Рго сій Уа! ух Рле деп Тер 145 150 155: 160 тує ма! дер бі маї сій маї ні д5поАТа вуз ТНс туз Рго Агу сі 165 170 175. сій бів туго Ай баг Тв ТугоАгуо Ма! ма1ї 5ег Уа! сен Твг омаї гей 180 85 190 ні 41 АхроТгрогаенойвп біу му5 ій Тук уз Суз Гу5 Маї 5аг Азп 195 200 205 кКув Ай це виб Аа оРГО 116 б1 зує тв о тіе бек вуз діа ух су 2 215 22о біпоРгОо Аг бі Бго біп Уаф Тугє Тк о вБеш РКО Бго 5ег го вів бід 225 230 235 240
Мес тТйг бух Ап біп Уа! бег цей тТагоСух еп Маії уз бі Рйе Туг 285 250 255
Рго 5ег Ар тів Аїд ма! бій тТРробіш бек Ап сту бій РО ОТ, АБИ 250 255 270
Аби Тук фу Те тТвгб оРго Рго Уаї бен Азробег д5р ім бек РНе рРре 275. 280 285
Мей тує баг обу ве) Твг Ома! Ар буб5 его Аг Тгрооіп сій оту деп 290 295 300
Уа! Рпе 5ег Сух заг уа! Мек ні бі Аїа це Ні деп оНів тує тн 305 310 315 320 оіп уз 5ег сечу 5егогецр бег Рго Оу гу 325 330 «-2105 17 «115 119 «2195 Білок «213» Миша хатня (Ми5 Ми5сці ня) «а00х 17 сій ма! сів бей ма! біб 5ег б1у бу біу цен уаї губ орРго СТУ СТУ ї В 10 5 заг о Еби Аго Сецпозеє сув АТа АТа бек соту Рйе тп Рйе бег зет туг еТу Мех Рпе тгрома! Аг б1й АТа РгОо с1у уз б1у Сен ост ттр ма!
АТїа тк отїіє бег алго туг бек о Агу туго тіе Тук туг Рго Азр. 5ег Ма? бо
Буз біу дго РИЄ тТиг ОІТе 5ег ОА дероАвИ Аза туз Ап озег о їви тує 65 70 75 80
Мем біт Ме Ап бегоїєп Агу Аїа бТш Ар тиг Аза уаї Туг Тує Су 85 90 95
Та аго Ака РгГО Бе отТуг б1у Зег 5ек рго А5р тує тгробіу бів бу 100 105 110
ТА" іен уаії так ма! Заг зег- 115 «210 18 «2115 306 «212» Білок -2135 Миша хатня (мМи5 Ми5сців5і «002 18 сі тіє маї се таб ств 5егоРго Аїя тб ово 5егоїе) бег о Рго С1у 1 5 10 15 біш Аго Ала тк оїенозегк Суб бЗег Аїда беє 5ек о б5егоуаї Тир туго уаї 2 25 30 ні5 Тер отує бій біп суб Рго бІУ бій АТа РРО Аго ів їец те Туг 35 40 45
Азр тТЬг Бег Суб Гец Аїа бег б1у їі Рго АТа Аго РНе хег о біу 5ег 50 вет 60
Оу бек бу тик др РНе тТиг оСец о їйг о ІТї2 бего5ег без ЄбТн Рго си 65 70 75 80
АБроРпе АТа Уа! Тук тує Суб Рпе біп бТу 5ег Сі Тук Рго рен о тнг 85 90 95
Рпе С1у бег о оіу тиг ку ем бі Мек Ака 100 105 «2105 15 «211» 177
«2125 Білок «213» Явканський макак (масаса БазстсиТагі5) «400» 19 сіп Ар сіу ап боїв бій Меї сіу бек ї1Їе тб обіп тп оРго Туг бій 1 5 10 15 маї 5ег їТє 5ег сіу тиготаг о маї тіе рей твгосСух 5егоб1п Ні гей
Оіу бак бін АТа бій Тер бів Ні Азпобіу уз дп цу5 бі А5р бег до 45
СІМ А5роАгу цен РИе ге РГО біш Ре бег бій Меє бі0 бів б5ег бу бо
Тук тує маії Су5 туго оРгоОо Аг сіу 5ек А5п Рго СТО А5роАТа 5ек Ні 65 70 75 80
Ні5 бец Туг ен ух діа Ага ма)! Суб біш Ази оСух Меб і Меж Авр 85 90 95
Уа! мес Аїа уаї Аїа тТпг ІІе ма! Ті муаї АБроїТа су5 її Тиг се 100 105 110 е1у еп рей бе іеи о маї тує тує теробек уз деп Агоа Гуз Аа губ 115 120 125
АїІа бух Рго Ма! Тк о Ако СУ АТа о1у АТа с1у С1у Аго бій Ага су 130 135 140 сій ди вуз 1 Ага го Рго оРго ма! Рбо дп о бго дб тус сти вро. 145 ї50 155 160 тіе Ага суб біу бТй о1й Аб5р Сей Туг беє с1у Сец Азпоб1й дго Ага 165 170 175 те. «2105 20 «115 177 «из Білок «2135 Макака резус (Масаса Мира «4005 50 сіп аєр СТУ Ап бій сію меє с1у 5ек ї1е твгобій Твгобго тує нів і 5 10 15 ма! 5ег жт1е 5ек біу тк отвгомаї тів цейш тре Су бег Сію нів Геу с1у бЗег бій ма1 сп тгросіп ні Азпосіу ув Ап губ би АБр 5ег сіУ А5р Ага ген РНе гей рго бій Ре б5ег обід Мебє біб бій б5еє б1у 50 тТуг тує маї суб туг Рго Аго сту бЗег д5и Рго бін А5р АТа бег НІВ 55 о 75 80 нт ре туго мен цуз Ааїа Аго ма! суб сі Аєп Суб Меб сти Мек. А5р 85 90 95 ма! Мес Аїя Ма! Аіїа так т1Те уа! тіе Маї Авр Бі Су5 тіє тб меу 100 юю 110 сту ен Гем їей без ува! Туг тує Ткробек Гуз АБ ОАгГЯ Туз Аїа уз 115 120 125
АТа гу Рго ма! Тйг Ага біу АТа б1у АТа біу сіу Аг біп Ага осіу 130 135 140 сій Ап рух СОіц де РКО Ргро Рго маї РгОо Ап РКО АВ тує іш ргО 145 150; 155 160
І1Тї2е Ас туз Ту бій біб Азр ей Тук о зек біу бен АБИ. Та Ага САгО 155 170 175 пе «2х 21 «21їЇ»х 330 «2125 Білок х2ї3» Людина розумна (нНомо зартепв) «ОО 21
АТа зег Тйг Гуз сіу Рго зег маї Ре РКО Ге Аїа гРго баг его губ 1 5 10 15 5ег Тпг 5ег біу б1у ТпгоАта АТа сем сіу сує рей уаї Куз Ар о туг 20 25 30
РМе Рго бів Рго маї тб Ма! бек тир Аби 5ег су АТя бец тТиг бек 35 о 45 сіу Уаї нтіз Тс о Рйе Рго АТа ма! Гей бів 5зебоб5ег б1у ей тТук бек бо цев б5ег бек уаї Уаї тиб уаї Бго бек бек 5ег Ген сіу тпгобіпй те 65 70 75 80 тук їТе Суз д5п Уа! азп о Ні ух Рго бег Ап ТВгобуз Уа! Абр гу 85 90 25
Ака ма! біш Рго буб5 5ег Суб др губ тТпгонНів Тпгб Суб рРгОо Рго Су 100 105 10
Вко Аїа Рго бі без сей сіу сіу Рго 5ег ма! РНе бен вне бро РгОо 115 120 125 мух рРго Ку Ар о Тиг бен МмеЄ Ті бек Аго ТагоБго біц Маї Тиг о сСух 138 135 140 ма! Уаї Уаї дер ма! бег ні бін дер оРГО Сів ма! фу Ре дзп Тер 145 159 155 ї160
Туг ма! Ар сіу Уді сбіу ді ні Ап Аа гує ТИгГОоїу5 РгОо Аго оо 165 170 175 біч біп отуг деп обег о Тве Туг Аг Уа! Уа! бек омаї тес тйг о Ууйї ген 180 185 190
Ні сій Ахр Тир осей Ав бу уз сій туго суз Суб іує Уа! бег Ап 195 200 205 цу Аїа Сей Бго Афа РгГо ї1е біш їу5 Тк о ЇїТе Заг ої у5 Аа вуз С1уУ 210 215 220 бій Рко АкЯ біз Рго біп маї Туг Тйгогео рго вро 5ег Ага 16 С 225 230 235 250
Мес ТК огУ5 АБИ сій маї Зег бен тТпеосух їв маі уз сіу впе тус 245 250 255
Рго зекго Ар тіе Аїа ма! біц ТтРр осі 5еб АБ бі сІй Рго Сі Ап 250 255 270
Ап оту Су ТНгОТВС Рго Рко УаїЇ гей А5р бег А5р о біу еко рРНе гец 275 280 285 іеп туг Зег уз їен Тйгоуаї дер уз бек Аг ТерооТа ой ТУ АБИ 290 295 306
Уа! Ре зег оСує его маї Ммеє Ні бій Аїа збе Ні АБп ні Туг о Тиг 305 310 315 320 сІп буз 5ег геу зеє сви бек Рго сту ув 325 330 «105 77 «7115: 330 кб?» Білок х2ї35 Людина розумна (Ното 5арівейв3 «4а00ю 2 діа бек тк у5 сбіу Рго Зек маї Рпе рго без Аїа Рго 5ег 5ег цу 1 5 10 15 бег Тгобег о біу сім ТВг о АТа Аїа Сей о сбіу Суз беу Маї буз А5р Туг
Рве Ргб сій Реб о уаї тйг ма! его тир од5п 5ег о біу АТа Сем тпгозег 4й 45.
Ту маї нів ТР ОоРйе рго Аїа Уа! їец с10 5егобег С1У сей Туб зег 650
Гецо5ег 5ег ма! Маї тйе Маї Рго 5ег бег бег гемо с1у Ти сТа ТА 55 70 75 80 тут ї1е бує Ап Маї деп нія ух Рго чег дб Тигоїуб Уаї др суб 855 90 а5
Ага хаї від го уз век Суб Ар. ує ТК нів твпг Су РРО врко Су що 105 110
РгГО АТа РКО бі зей гени біу б1у Рго 5вб ма! Ре веу РНе рео РО 115 120 125 їуб РгГО ув Ар Тиг сен Мет ТТе бек Аго тб оРго бів ма1ї тве Суб 130 135 150 ма! маї Маї А5р Уаї 5ег нів сій Ар РГО бТч Уаї рух РБе дз тер 145 150 155 160 тТуг маі Ар сіу маї сіш ма! нів Абп Аа 1у5 Тйг обу Рго Ага би 165 170 175 бів бій тук Аби об5ег тиг о Туг о Агу Уа! маї 5ег о маї Гей твг о МУаї Бей 180 185 190 ні5 бій Азротерогец АБ о сіу бує 01 тує су Суз Суб маії 5ег Ахп 195 200 295
Гуз дід цей Рго Аа РгОо ІТе бій уз Тв те зег суб Ата Гуз Ту 21 215 220 с1й вго Аг сій РРО сТй Уа! Туг о твк гей РГО РгО 5ег Агд 619 б 225 230 235 240 меж тик Су АЗп бій маї бег ге Тпг о Сух цей Уа! Суб сіу Рйе Туг 2А5 250 255
Рго бег Ар т116 Аїа ма! бій Тгробіш бег АБ сіу сій Рго бій АБп 250 265 279
Ап отуг губ Тис ТИР ово Рго с уаї бе д5р бак Ар о б1у бег РВе. РАЄ
Ти 280 285 рец тує бег Ага ге тнг ма! дер Гуз бак Агу Тгробів бів су дво 290 295 300
Уа! рРНе баг Сує бек уаї меї ніє бій Аїях ей ні5 АБИ Ні Туб Те 305 31О з15 320 зій бух бак бе бек гей бек рго Б1у ув 325 330 «Ні» 23 «2115: 330 «2125 Білок «13» Людина розумна Сното зартієпе) «005 23
А1а бек тпг суб біу Рго 5ек ма! РМіе Рго гей АТа Рго Зег бег ув 1 з 19 15
Зег тнг обЗег о сіу с1у тик АЇа АТа цен біу суб їеи Ууаї їуб5 Ар тут
РПе РгО бій Рго Ма! Тпгомаї б5егоТер Або бек б1у діа їец тв 5есг сСіу Улі! ніх тт Ре Рго АТа маї ген бій 5ег чег біу щей Тук 5ег
Бо ей 5ег его маї Уа! тіж ма! Рго 5зег 5ег баг цей с1у тик ста таг 65 70 75 80
Тук її Сух Ази Уаї АзпонНіб5 їу5 Рко бБег Аза ТИг обуз ма! Абріуз 83 90 95
Аго Уа! біб РКО бу 5ег Суб Аяр Був Тпг нт ТК Суз Рго Рго Су 100 105 10
Рго АТа Рго біб Рпе ої біу сіу Рго 5екго ма! РБе ївуи РНе Рго РО 115 120 125
Гуз Рго Ту Ар отТвНе Сей Меї тТє бек Ага Таг РКО ої Уаї Твго Суб 130 135 140 уаї маії ха! АТа маї б5ег нів бій дб РРО бю Маї ру5 Ре д5ИЙ тер 145 150 155 160
Тук Маї Ар біу ма! Сі Уа! нів А5а Аїа уз ТИК оїуб5 Рко Ага су 165 170 175 бій сп туго АбБп обег ТВготук Агу Ма! Ма! бег Ма! цей трг Маї їец 180 185 199 ніє сій Ар Тер огез ап бу у бій туго бух Суб Суб Уді 5атоА5п 195 200 205 уз АЇїа сей Рго Аза Рко ті Ст цуз ТНг ше бебє Гу АТа сує сіу 245 229
СТІй Рго Акад бій Рго бій уз! Тугє та їец Рсо бго бек Аг сі су 225 230 235 240
Меї тнгогу5 ди біп маї 5ег їец тйг о Сує се ма1ї суб б1у вне тус 245 250 255
Рго б5ег А5Зр ше АТа ума! бі тер об) 5Зес два Ст1у бій Рго 61 Авп 250 285 270 деп туго Су5 ТВг оте РГО Рго ма! Сей дер бег А5р б1у бег Ре Гцву 275 280 285 бе Туг Бег Цу5 Сен Твг о Уаї Ар су бег Аг тер бій сп сіу деп 295 300 ма1 Ре бег Су заг омаі! Ммек ніз сін АТа Геу ні деп нів туго Тег 305 31 315 320 біп іух 5ег о їеу зЗегогеи б5ег рго біу Гу 325 330 «2105 24 «2115 330 «21 Білок «213» Людина розумна (Ното зарівп5) «400йж А
Аїа бег Тит оцуз б1у Рго бег Уаї РПпе Рго їес АТа Рго 5ег бег Гу і 5 40 15 чего тк бегооту о1у тик Аза Аїа ген сту Су Сей ма1ї Су АБротує вйе вро б1ш РГО Маї Тег ма! беб теродбпобзег 5іу АТа зви те баг с1іу Маї Ні тТйг бе Рго Аїа уді їецз біпобек 5ес сіу бец Ттуг 5ег
БО
Сем БегобЗекоуаї маї тнгома! РгОо 5ег б5егоб5ег о гец бу тагобіп тпе 655 70 75 80
Тує тів Су5 Ап Ма! Аб5п Ні рує РРО бег Ап Тис губ уаї А5р Гу 85 Ай, 95 дгоа Уаї сім Рго був бег Суб А5р Гуз Тігонів тйг Суб рго рко Су 100 105 110
Бгто Аа го бій Ре бій біу с1у Рго 5егоуаї Ре сей вНе Рго рРгО 115 120 125 іу5 Рго Бу Азр Тйг Гей меж Іте 56 Аго стпг РРО су маї тиг суб 130 135 140 маї маї маї А1їа ма! Зег о ніб сій А5р Рго сто Маї гу РНе дзй Тгр 145 156 155 ї60 тук Уа! Ар сіу Маї би Маї Ні5 Ап Аїа ух Тйг огує РгОо Аго Ти 165 170 175 сі бів Туг А5побег Твготує Ага ма! Уа! 5еб уаї ей тс уаї їв 180 185 190 ніх біп А5ротррогец Ази СТУ Гуз віп Туг бу Суз Гуз уаії заг деп
Т95 200 205 іїує Аіа ген рРгО АТа рРго т11е бій вуз тб о Ііе 5ег ух АТа Куб біу 210 25 220 біп РКО Ага біцфрРго бій ма! Тук тб о гГец ро РГО Зек Ако СТО ой
Ки 230 235 240 мес тне о цуз дп бо1й Уаї Зек бей тк Суз бец маї буз бу Рпе тує 245 250 255
Рго Зег д5р тів АТа маї сТй тТгробі 5ег о А5п Ту біп РгО би Аби 250 265 ий
АБп оту гує ТИС тт РгОо Рго маї бе А5робег Ар біу бег РПе Рпе 275 280 285 рен отуг бек деЯ іви Твгомаї Ар огув5 б5ег Аг тер біп бій о1у Авт 290 295 зоа уаї! вве бек Суб 5ег уд! Мек нів бі АдТЯ бец Ні А5понНів тує Так 305 310 315 320 сіп уз зЗекг зей бек бец бег Рго С1у Гуз 325 330 «ій» 25 «?1їз 125 «12» Білок «13» Мищша хатня (Моз МизсиТц85) «4005 25 сі Уаї бух бен ївц 01 бек біу біу С1у їги мМаії Сбіп Рго 1ух С1у і 5 10 15 его гей губ5 Мец 5ег Суб А)Їа Аїа Зек біу Рпе ТЕг о Рне д5п о тТйг тус 2 25 30
Аїа Мек дчп Тгр Уа! Аго бТп АТа Рго б1у Ту су бе) си тер Уа! 35 40 45
АЇа Аго їТе Аго бег тує туг деп Аби туго АТа тТВготує тує АТа Ар 50 55 60
Зег ма! бує Абр Агу РНе Тик їТе бег аг Ар о А5робег сій чего те 70 75 850 ре Тут бен біп мет А5п Ап Сей губ ТВг обі А5ротпк АТа Ммеї тус 85 8) 95
Туг о буз Маї Аг нів біу Ап Ре сіу Аби беє Тук ма! бер тгрорпе 100 105 пло
АТа тує тгробіу бій сту так обен ма! тв Уаї бег АТа 115 120 125 «йо» 26 -2115 14109 «912з Білок «2135 Миша хатня (Ми5 Ми5зсии53 «ок 25 бій АТа уаї маї те сбіп біб бек аїа ей ТВг тнє хек о Рго с1у Сів 1 5 10 15 те омаї таб рен ответ Сує аг Ззег о зеготвс б1у Аа маї Те тА заг деп тує Аа Азп о тТероуаї с1в бі бує Рго Аб5ронів гей Ре тре оту мен їїє б1у бу тпг дп суб Аго Аа вго б1іу Маї Рго Аїд дго РЯе 55: 60 чек біу баг бен те біу дер суб АТа АТа гецп тиг ї1е тТНк су АТа 65 70 75 80 бів тйг обі А5робіШ Аїа ї116 Туг Ре Суз АТа еп Тгр тук бег д5а 85 90 95
Бей Тгроуаї Рпе сіу сту б1іу тТвк офуз ви твгомаї ей 100 105 «2102 27 «11» 125 каіїйз» Білок «2135 Людина розумна (нНото зарієпв) «4003 27 сім ма! біп без ма! сін бек сіу с1у сіу їец маї бій Рго Ар Ага 1 5 10 15 зек сец лгу Сей бек Су5 Аа АТа бегсооїу РМе твке ОРЕ Ні дер тур 20 25 30
Аїа мех ні5 тТгр Уа! Аго біп Аїа Рго С1у ту Ту дей Ти Тгр чаї 35 до 45 зЗзек тб тТе 5ег о тТгродб5п обего біу тТпг оті б0іу тус Аїа Ар о 5ег Уа! 50 55. 60 уз С1у Ага Рйе тТиг оті бек лагу Ар АЗп діа гу А5И бек Гей Туг 65 70 75 80 цеш бій Ме й бер о геви Ага АТа сій д5ротпг АТа тен Тує тТук Су 85 чо 95
Аіа уз Азротіе біп туго бі А5п тує Тук Тук о сіу Мет Ар маї тер 100 105 110 сім ст" сіу тиб тб Уа! тТнг Уа! 5аг Зег 115 120 «210: 28 «?115 107 «2125 Білок «2135 Людина розумна (Ношо заріеп5) «АВО» 28 бій їТе маї Кей ТВйеосій зег РгГО Аїа тиг оцей 5егоїеу 5ег рРго су
І 5 1 15 біз Адгу Аїа Тс оби бек Суб дгЯ діа 5еб біб бег о маї 5ег беє тує 5 30
Бей АТа тїкротуг бій сів цу5 Рго б1у сп Аза Рго Агд бе реш Те туго АБр АТа его дп о Агу Аа тик о сіу І1е Рго Аїа Ага Ре 5ег СТУ 5а 55 ва зег сіу зег о біу тиг о д5р оре тег ореу тик її чег зег тей сш во 65 70 75 80 бій а5рорне Аїа ма! тує тус Сув о біп СТй Ага 5ег ди тро рРго їТе 85 90 95
Тк Ре сту бТп сім тВг ага гепооїч Те Гуз 100 105 «2405 25 «2іїз Л06
«212» Білок «2Ї3: Людина розумна (ното 5артіеп5) «4005 259 сіу біп Рго уз Аїа АТа Рго бег о уа! ТНпг о рецш РНе Рго Рго бег 5ег 1 5 о 15 сій бін бен бій АТа дп о вБу5 Аїа твг оїео уаї Суб гео тхТїе б5ег Азр 28 25 30
Ре тує ро сіу с АТа Уа! тигомаї Аза Тер гу Аа Ар бек бег рго ма! ув АТа сіу маї біз твг оте отак оРго бек ої уз бій 5ег Ази Ав 50. 55 во сув тус АТа та 5ег бег туг ей б5ес цен те Рго сій біп тгр су 55 70 75 50 бег Ні5 Аг бек Тук бек Суз біп Уаї Тг Ні бій сту 5ег Тг Маї 85 90 95 сів вух тв" уа! АТа рРго ти" сто Суб 5ег 100 105 «205 3 «211» 7109 «212» Білок «еї3» Миша хатня (Му5 Музсціч5) «а00х 30 саїп Аіа маї уаф так бій бій Рго Зекоїей беє Маї бег Рго с1у Ту 1 5 10 15
Те уаі Так оБец тиг Суб Ага 5егобагє тТпг о с1у Аїа маї ТВбОТвР. 5ес 29 а 30
Ави туг АЇа Аби тгрома!ї сбіп сій вуб5 єго оту бій АТа РНе Ага сту 35 40 АВ ме Іїїе сіу б1у Трг АБИ АБИ Агу АТа Рго сту Уаї Рго АТа дга Рпе 60
Зег с1у 5ег цей їТЇе СТу А5р ух АТа Аїд сем тп ті тйг СТУ Аїа 65 70 75 Во іп АТа Ар АБробіу бе тіє Тук РНе бу5 АТа ей тгротТуг бек Ап 85 90 95
Ні Ткромаї Ра біу бі бу Те Гуз грец тик Уаі ев 100 105 кій» 31 «211» 109 «2125 Білок «9135 Миша хатня (Ми5 Ми5си!65) «-4005 31 бів Аїа Уа! Маї тн бій сій Рго Бек Рпе б5ег о уаї 5ег Рго біу с1у 1 5 10 15
Яйг ма! ТВг обец тйг Суб Аго 5ес бес Те ст1Уу АТа Маї те оте 5ес 29 25 за
Ап туго АТа дп тгромаї бій бій їу5 Рго Ту б АТа Ре Ага біу їси ЇїІе біу біу ТИг Ап Гуз Ако Аа Бго біу Уа! РгОо АТа Ага РПЄ 5о 5ег біу зЗег цен тІ1є сіу А5р обу АЇа діа еп Тк оті ТАК сТу АТа 65 70 75 50 сіп Аа А5р Ав сів зег тів Тує Ре Су АТа сей Тгротуг бе деп 85 90 95
Бец Тгроуаї Ре сіу бу біу Тйговуз Сей ТВгоУаї ве 109 105 «00» 32 -21ї5 8 «21и5 Білок к2135 Людина розумна (Ното 5арівепеь) «АМЮу 32 зІу вйе Тйг вне нів др тук АТа 1 5 «2105 33 115 В «125 Білок «2135 Людина розумна (Ното зарієпз) «АЮ» 33
ТТе бек Тгр о А5п о 5екосіу тйг пе 1 5
«2102 34 «Ф1їЇ» 15 «12» Білок «2135 Людина розумна (СНото зартеп5) «400» 34
Аіа пух А5р ї1ї6 біп Тук біу Ай туго тТуб тук оту мех АБр Уа ї 5 в 15 «240» 35 «21їз 6 «2175 Віпок «2135. людина розумна (ношо 5артепв) «005 35 с1й баг уа! бег о бег Туг 1 5 «2105 36 «211» 9 «212» Білок як2135 Людина розумна (Мото зарієн») «4005 36 біп бій Аго бег Аба Тер обко тіє тиг 1 5 «210» 37 «21із 122 кій» Білок «2135 Людина розумна (Ното зарієн5) «005 37 сій уаї сій ей ма! біб бек обіу біу 0Ту ви маї бій Рго біу АгО 1 ? Мо) 15 з«ег вен Ага іви бек оСує Аїа Аїа бек бу Ре Те оРНе Ай др туг
Аїа мек ні5 Тер оуа! Аго біп Аїа Рго Ту Бу зіу Ге бів Ткромаї чего те 112 озер Тер АБИ 5ег сІу бег тів б1іу Туг Аіа др 5ек маї 5) бух с1У Агу Ре ТВг оті 5ег Аго дер АЗпП АТа туз ух Зег о вей с туг 55 7 75 80 їеи біп мес дп бек Бей Аг Аа сіш Ар; тиг Аїа гецотуг Туг Суз 85 90 95
Аїа су Азр їїве б1Їп Туг 6ТУу А5поТує Туг Туг біу Меж Азр Уаї Тер 100 105 110
Фіу віп б1у тіс оте маї тб МУаї б5ег баг 115 129 «е10з 38 «211» 8 «2125: Білок «213ю людина розумна (Ношто зарієп5) -4005 38 оіУ Ре тйг о РВе Аби Або Туг АїТа 1 5 «2105 39 «215 В «2125 Білок 2135 Людина розумна (Ноше 5арівпь) «4005 3 те зак о тероАБи 5еб біу 5ег тТіє 1 5 «231025 0 «2115 125 «212» Білок «2135 Людина розумна (Ното зарієпе) «1005 40 біш ма! сбіп реп маії сіб 5ес біу с1у сту гецу мМаї нія Рго с1у біу 1 5 10 15 зек ген Ага вен бек Су5 Тк о оїу бек ЄТу РНе ТК оРПпе бег Тугк Ні
Аїа мес Ні5 Тер Уа? Аго біп Аа рго СТУ бух б1у цей с10 тгроуа! зег їіє тїіе сіу тик осіу с1у Маї тпг Тук Туг АТа Ар 5ег маї су 60
СТ1у Аг Ре Твг ЇЇї6е бек Аго АБрод5а маї Су деп оЗег сей ту тей 65 70 75 5о0 стя меж Азп 5егоїец о Аго Аїя бі) дер Мет АТа маї Тук Тук Сує АЇїа 85 90 95
Ага др тує туг с с1у АТа біу 5ег РНе Туг А5росіу сей туг сіу меє 1600 105 лі
А5зр о уаї Терор бі бів біу ТВготвгоуа! Те мУаї беє бес 115 120 1955 «05 41 «115 07 «І?» Білок «213» людина розумна (нНото зарієпь) «41005 41 сСіФ тїіе ма! Бей тб о Сій бекобго діа Тгб о бенобзек о бей 5ег рРко бу
І 5 10 15 бій Ага Аїа тн осей бес сух Ага А1а 5ек бій зак уді бег б5ег тук іеш АТа теротує біп о сіп груз обго б1у бій АТа Рго АгО ен без Те о 45
Туг д5р Аїа бек Ап Агу Аїа тб біу т11е рго АТа Агу Рае бег 01У 6О «ек біу 5ег б1у ТіК дер Рпе ТК оце твгс тів 5ег о 5ег їв бі Ро 55 70 75 80 сій ар вне Аїд ма! Туг туго Суб іп біподгд 5екодер їгр ого ГСеи 85 до 95
Те вве б1у сіу біу тіпг окуз' уаї би тів ву 100 105 «2105 42 «2315 8 «2125 Білок жда13» Людина розумна (Ното зартейві «4005 42 сту Ре Тк РНе зекотує Ні Аїа
І 5 -105 43 «115 7 «ТИ» Білок «вї135 Людина розумна (нотшо зарівня) «4005 43
Те сіу тий бі боту маї так 1 5 «1Оз 44 «-2115 19 «212» Білок «2135 Людина розумна (ното 5аріепе) «00» 44
Аїа АгЯ Ар туго тує бІМ АТа сту 5ег о РНе туго Аб5р су Се тугосіу 1 5 іт; 15 меб дер ха! «210з 45 к21її» 56 «д12» Білок «213» Людина розумна СНойо 5арієйз) «400» 45 біп бек уаї 5Зег бег тус 1 5 «10з 46 «2115 9 «212» Білок «2132 Людина розумна (нопюо 5арзтеп5) «4005 46 сіп бій Ага 5ег дБр о ТгроРро бец те 1 5 «2105 47 «2115 423 12 Білок «2135 Людина розумна (Нотео 5артейв «Ой» 47
Аїа Маї сіп їви маї бін 5ег біу с1у біу сеи маї біп око сту дк і 5 10 ї5 бЗег Гей Аго Бей бек Суз діа АТа 5ег с1у Ре тпг Ре сіу дер тук
ТВт Ме Ні Тер Уа! Ага бій Аза вго бу су. Ту ге сі Тер Уаї бек бІу ї1їе 5ег Тгродзп заг оту бек її біу тук АТа Ар 5ег Уа бо
Гуз біу Ага Ре тиг о тІїе 5ег Агд Ар Ап АТа ув Аблоб5ег ії ви Ту 55 70 75 о це бій мех дп чек оїейп о Аго АЇа бій дер тб о Аїа ем тук Тугосуб 85 90 35
ТВж о су5 Ар Ап біп тує сіу бе обіу зек То тТук обу Гей сту Уа! 100 105 о ткр сту біп сі тик гео Уа! тб ма! 5ек 5ет 115 120 «105 48 «211» 107 «242» Білок «2135 Людина розумна (Ното зарієпе) ка0Ох 46: сі тіе Маї бе) Тк осЇп бег Рго діа ТВгобен бег о гбви беговго сіу 1 5 10 ї5 сій го Аїа тт СбецобЗеб Суз Аго Аа зЗеб бів 5ев Уа! бер б5ег тТуг 20 23 30 беш Аїа то Тук о б1п ЄТп Суб Рго С1у бій АТасРро Ага Ген сечу Те туп А5р.Аїа бек Ап АгГЯ Аїа тТнг о1у ІТ6 РгОо А1а Аго Ре 5ег су 60 зек біу с бЗег б1іу тік А5р вве те Ббеб тТиг о їїе 5ег 5ег ген бів РгО 65 70 75 о сім а5р Рпе А1їа маї тує туг Суз бів бій Ага багодби Терорко Сей 85 90 95
Ти оРНе сбіу біу б1у тиготТує мМаї біц ге ух
То 105 «210» 49 «г1ї» 8 «212» Білок «21315 Людина розумна (Ното 5аріепв) «4005 49 о1у РМе Те Рпе Ту АБротук Тиг 1 5
«2105 50 «211 8 «19» Білок «213 Людина розумна (ното 5арієпз5) «4005 50
ІТе зег ТгроАби б5ег біу 5ег те 1 5 «Ці» 51 «2315 16 «2Т25 Біпок «2135 Людина розумна СНошто 5зарієп5) «4005 51
ТВг о буз А5ЗроАзи Ста тус біж бег о біу бек Тпг тує біу ре с1у Маї 1 5 10 15 -205 572 «ії 8 «2125 Білок «7135 Дюдина розумна (ното «арієепв) «00 52 сіп бегомаії бегобег Тукг 1 5 «210» 53 «21їх 9 «Ф1й» Білок «213» Людина розумна СНното заріенпе) «4005 Щ 53 іп біпсдго Зег дей Тео Рго Ге Твг 1 5 «2105 54 «11» 9 «122 Білок «2135 Миша хатня (Ми5 Мичсцін53 «0» УА
АЗіа ге Тгротує зЗег о дяп ні теромаї 1 5 «10 55 «2115 8 «2125 Білок «-21їх Миша хатня (миє Ми5сиіцЧ53 «а00хж 55 біу вне тис РНе 5зег о бег Туг о1у 1 5 «2105 56 «е11ї1з В «212» Білок «2135 Миша хатня (Ми5 Ми5си 5) «А9Ох 56 ті 5ег дго туго зе Аг тує тт 1 5 «2105057 «211» 12 «ій Біпоко «2135 Миша хатня (Мих Ми5сци5) «4005 57 діа дга Аго Рго греч тує с1у б5ег о бЗег Рго Аб5р туг 1 У 10 «2105 58 «11» 5 «2125 Білок «213» Миша хатня (Му5 Ми5си1й53 «А0ОО» 55
Зек бЗег уаії Так отуг ї 5 «105 59 к2іію 9 «й12» Білок «2135 Миша хатня (Ми5 Мис и53 «Ай» 59 ве сій с1у бе сту тує рго ївец те 1 5 -210» 60 «2115 7 «Рід Білок «2135 Людина розумна (Ното 5артепеі «-400» 650 оту бій орко Ага бій рго біпомаї тує тйг оїец Рго РО 5ег Або АБо ї 5 10 15 біш фев тиг о Буз Ап бій Уа! бег ей Трг Суб сеу маї бує СЄ1у рРНе о 25 30 тТуг рго 5ег д5р Те АТ Маї боти Тгробіо его А5п оту б1й Рго ст 35 40 45
Ап А5п тує Су5 Тйг о ТигоРКО РгОо Ууаї Сей Авр 5аг дяр біу 5ег РПе 50 55 бо
Рпе сей тує бек губ вен Тйг о уаї Аброгув бек Аго тер обія іп оту 55 70 75 80 деп ма! Рне Заг бСуз 5ег Уа! Меє нНі5 бій Аїа цей Ні Ази НІВ тТук 85 0 95
Те бів їу5 б5ег ген озЗег о гву бер Рг бі Суз 106 105 «2» 51 «9115 107 «?ї2з Білок «2135 Людина розумна (Ното заріепе) «4005 61 се1у бій Рго Алед бій вкго бій омаї Тук тат беи о Рго РКО 5ег о Аго сти 1 5 ях) 15 сід Ммеї ТйгР гу5 деп осій ма! 5ег Геш ТК Суз сей маї уз о1у Ре 75 30
Туг Рко Бег А5р Ів: АТа Ммаї бін Тгросбім 5екодепо бу сп ро сти
Ап Ази о туг бу5 ТВгОотТвг о Бго РРО Уа! Сей А5р бек Ар біу зег РН 33 50
РНе їви Туг бер гу грец Тигб оуа! АБр бух бек Аг тросі ЄТА су 70 75 0
Авп о маї Рйє бег сСух 5ег Ма! Мебє ніб5 ої АТа Пец ніє Ап Ні Туг 85 90 95
ТВгГ бій гу 5ег сец бег ей бег РгО бу Гуз 100 105 «10» 82 «21їз 107 «12» Білок -21535 Людина розумна (Ното зарієне) «4005. 652 біу бій РРО АдгО сій Рео бій Ма? Тук Тк о бев Рго Рго 5ег Акд Азр 1 5 о 15 сім їей тнк бує дей Сіл хуаї бек зе тато суз їви маї губ оту рве тТуг вго баг Ар оті Аїа суд! біш Тер бій зЗег А5п біу бій Рго бу деп ОА ОТУК Дух ТАК отак РКО Рго Уа! Сецоазр Бек А5р СТУ 5ег Ре 50
Ре цем Туг бек Бу цей ТНгоУуат Ар бух бег Аго Теробіп Сіп о сіу 655 70 75 80
Аби уаї! РНе 5ег Суб бег уаї Мек о ніз бїй с1у рей ні д5а нів тує 835 90 95 так бій суб 5ег се бег о беу бек Рго біу Суб 100: 105 «2105 53 «2115 330 жа?» Білок «213» «Людина розумна («Ното зарівпь) «400» 63:
Аіа бек Тиг оСує Сіу Рго 5ек ма! вРре рРго Гец АТа РГО 5еаг бек (1у5 1 5 хе; 15 зег твг обегобіу с1у тТпг АТа АлЛа бе сіу Суб Гей Уа! губ Ар Туг 20 25 30
Ве рко бій Рко ма! тис омаї бек о тгродей его бу Аїа вед те «ег 35 40 45
Сіу уаї нів Тит РБЄ РРО АТа ма!ї їеу стій веб веб сіу бец ту чер 50 35 о йем бег бегоуа!ї ма! тп Уа! Рго 5ег бег 5егїей бу тигосТВ Тв 55 70 75 80
ТУР те Суб Ай Уаї АП Ні5 Цуз Рго 5ег А5п Тйгоїух Маї Абр Гу 85 90 95
Ага Ма! бій РО Куб бек Су А5рогбу5 те ні тиг Суз Рго РКО сСув 160 105 1ю
Рго Аїа Рго бій сей бец 01у біу Рго бег ма! Ре їеи Рпе Рго РгГО 115 120 125 уб вго уз Ар Тс їєн Ммеє 11 бек Аго тТВс о Рсо бій Уаї Тагс сСуз 130 135 140 ма! ма!ї маії А5р о уаї бег ні біц А5р РКО бій Маії Гу5 РПе дб Тер 145 150 155 160 тТуг уаї Азр сІу маї с?тш уаї ні д5й Аа Су Твгогуз РгО АгЯ Ти 165 170 175 біш сій Туг деп Зег тб Туг с Аго уаї Маї 5ег Уа! цен тпг о Уаї Гец 180 185 Т90 ні5 біп Ар тер ген А5п о біу Суб сіб Тугб уз бух рух Маї 5ег дви 195 200 205 іїуз АТа ей Рго АЗїа Рко ч1іе біб дуб тк оті 5екг 1уз Аза гСу5 біу 210 215 220 сіпорко Абу бій Рго біз Маї тує ТБгоїео Рго рго беб Ага он б 225 230 235 240 мес тик муз Азп Осій Уаї 5ег о гецш Тиг Су5 гєц Уаї гув бтіу РН тує 245 250 255
Рго 5ег А5р ї1їе Аїа маї сш Теробі бег Ап бу бІй Рго Он А5п 2560 2655 270 дей туго суб ТТН тт РРО Рго Ма! ви Адєр зе дер о со1у баг рРпе. РАе 75 280 285 цемотук зак суб ен ТНгоУа! д5росув зей АкЯ трробін ота с1у АБ 790 295 з00 ма! РНе бег Суб бег ма! Меї ні єї АТа сви Ніє дей Ні Тук таг 305 310 315 320 сіп рух 5ег сен Бег грец 5аг Рго с1у гу 325 330 «2105 64 «211» 330 «212з Білок «213» Людина розумна (ното завівйе)
«00» 64
Аїа бег Тйг уч о1у Рко бек ма! Райе Рго гей Аїд Рго бег чего Су 1 5 о 15 дер тТйг бек біу б1у тйг АТа Аїа се) біу Суб5 се Уаї уз АБротуг
Ре вго бін Рро Уа! тТакоуаї бес Тбр Аби бек біу А1їа гей тнг 5аг сіу маї Ні ТйгоРВе Рго Аіа маії Ге сіл 5ег зег о1у гей Туг Зек зо 55. 60 ї2и чего 5егомаї уаї тег оуаї его бек обег 5ег бви біу Твг сів тв 65 70 75 о
Тус Іїе Суб Аб5п Ма! Ази Ні цу5 Ргро 5зек Ап Тгогу5 Уа! Авр гу 90 95
Ага ма! сії Рко ух 5ег Суб Ар Гу ТНгоніє ТвгоСух Рго Рго Суб 100 105 110
РгГОо Аіа РГО Сі гей вбеу Б1уУ біу Рго 5Зегоуа)ї Ре бе РБе рго рго 115 120 125
Су Рго уз Ар Те Се меї те бек Ага ТНгоРго 61 хаї Тк Суб 130 135 140 уаї Уаї уЩі! Ар маї 5есг Ні біш Ар РГО сій Уа! уз Рйе Ап тер 145 150 55 150 тук Уа! др оіу уаї ой Маї ні дб Аа уз ТВгосбуз Рго Ага 1 165 170 175 бій біп туг Ап о Зег ТНготуг дго Уа! ма! 5ег уаї сей Твгомаї зей 1580 185 150 нів аіп дер Тер Ген деп біу Суб бій туго буз Сух Був уаї 5ег Авп 195 200 205 іїу5 Аїа фей РГО діа рРго їіе сій ту Тіг о ЇїТе 5ег гу5 АТа бух С1У 210 215 220 біп рРго Акад біо Рко біп уа! тує тйгоїей Рго Рго Б5ег Аг би СТИ 225 230 235 240
Мех тт о їу5 дп о біп Уа! бек оіец тТвг оСуз це Уаї Суз Б1у Рпе туг 245 250 255 вро бек Ар Ії АТа маї 010 Тгробід 5ек Ап бІУу ой РгОо 10 сАви 250: 255 770 деп Тут вух Тйготйгобго Ркго Узі цец Аб5р о бег А5р о1у бек Рпе гей 275 280 285 ве тук 5бк сук вей тТвигоуаї дер вуз бег Ага Тер бій біта сіу Ап 290 295 300
Ууаї ве заг Суз бек Уа! Мет ні си аіа сей нів дзпонів тує тиг 305 310 315 320 бій вух бег Сец его гец зекг Рго су Гу 325 330 -2105 65 «із 330 «225 Білок «2132 Людина розумна СНото зарієей5) «4005 55 діа бек Тк омсуз БІ Рго зако Уа! Рпе Рго Бей АТа Рго б5еб бег Су 1 5 10 15 его Тит бЗег сїу б1у ТК Аїа Аїа без б1у Суз сви уаї Кує др о туг
Рпе вРго біш Ро ма! тк оУаї заг о тгроАдБп бек сту АТа цец тпг озег сіу УаДї 5 Тс Ре Рго Аза маі! без сілпобег бег біу бен Туг бег во їец 5ег 5зек Уа! Маї Тис маї Рго 5ег бек заг Бей о біу тпг о біп таке 05 7 75 ва
Тут 112 Суб5 Аяп о Маії Ап оНіб (ух ро б5ег ода ТНК рух маї Азр Гу 85 Фо 95
Ага ма! 61) Рко вуз бек буз А5р о ку5 ТИ Ні ТВг Су Рко Рго Сув 100 195 110
Рго АТа РО бій їеу бец б1у б1у Рго бзег маї Ре геу рРМйе РгОсРКГО 115 120 125 був Рго цу5 Ад5р о Тпг їецп мет ті 5ег дго Тс овго бі маї тпгосСуб 130 135 140
Ууаї Уа! ма! Ар Уа! бек ні бій Азо Рго бій Ма1ї уз РП АБИ тер 145 150 155 150
ТтТуг Уаї дер сту ма! бій маї ні Ай АТа муз ТТГ Ту РгОо го ій 165 170 195 «То біп тує А5позер Твт о тук Аго Маї маії бек Уа! цей тик мУаї ге 180 185 190
Ні бій Ар отгроїец ап сіу був бі Туг Суз Суз Туз уаї Бек АБп 195 250 205
Суз діа Кей РГО АТа рго їі бій бу Тнпг о ї11їе 5аг о сув АТа ту с1у 210 215 220 сій вто Ака бі рго СТ Уді туг ТАгоцев его рго 5ег Аго оц оц 225 230 235 240
Ме ївг о цуз Ап біп ума! бег Гей ТвгоСух бец Ма! муз С1у Ре тус 245 250 235 рго загар тів АТа уаї оїй тео біц б5ег дз с1у сій Ргро бій дп 260 265 270
Ап отує цу ТВЄ ОТГ о Рго Рго Уаі сец Ар бег Абр. біу Бег РНе РКе 275 280 285
Мен тує зег Агд бен Тс Уаї Ар ув 5ег Ааго тер бій біпобо1у Ап 290 255 БІВ)
Уа! Ре бек Сух 5ек ма! мес сні бій АТа їеи Ні Ап нів тує ТАг 305 310 315 320 сіп бує зег Ген Бег це зег рго Сіу цу 325 330 «2105 66 «?Р1їз 330 «217 Білок «213» людина розумна (Ношто зарівпв) «400» 86
АТа 5ег Тк Суб біу Рго б5егомаї РНе РГО гей Аїа рРгГОо чего 5ек Гуз і зу 10 15 зес тийгобек сіу б1їу тег АТа АТа сце сіу Суз ген ма1ї Гу5 Ар отуг за пе Рго сій го уд! Тег оМаї 5ег Трр Ап бек о оіу Ага Гей тТйг 5ег сіу Уа! нія тТнгоРНе Рго Аїа маї гей сій бек озег бТу се Тур б5ег бо
Іес бек бак омаї маї Те ма! Рго бегобег 5еб Ге о біу ТОК стій те 65 70 75 80
Тусг 11е Су5 Азпоуаї Азп Ні ух Рго бек деп Тс огу5 Ууаї Абр гу 55 90 55
Ага ма! ЄЇїм вго цуз бек су дер руб тик ні тн обу Рко Рго сСуз 100 105 110
Рго Аїа рго біц їец бен біу 01Уу Рго Зег Маї Ре Гей РНе Рко Рго 115 120 125 іїу5 Рго уз Ар Тпг бен Меї тів Зег о Абу тб Рго вії Ма! Тв Су 130 135 140 уаї маї Уа! А5р ма! бек ні су А5р Ро бій ма1ї уз вне Аби того 145 156 155 160
Тук Уа! дер сіу маї сту Ууаї ні Аби АЇТа уз ТНГ о цу Рго Аг9 б 1655 170 175 бій біп Тук ота бег ТНК оТуг Адка уаї Уа! 5ек маї їей тар оУуді Гец 150 185 190
Ні біп ар Тер Гей АБИ біу Муз сій Туг цу Суб уз маї 5ег Ав та5 200 205
Муз АЇа Бей Рго Аа Рко їТе біш суб тПгоІЇв 5Зег їуз АТа гу с1у 210 215 220 сіп го Ага біч Рго бій маї тук твгбореу рго Рго ер Ага віц соти 285 230 235 240
Мес Те о Куз Аби іп Ма! бегоїеу Тг о Суз ей уаї суб Ту РН стуг 245 250 255 рРго бег Аяр о ІТе Аїа ма! бій теробій 5егодзп сіу ой Рго ОТ Ап 2650 2655 275
Авп тує губ Тк отв Рго РРО Ма! їву а5розег А5р Сс1у бег Рне РНе 275 280 285 іга тТуг чего муз вецотТвго ма! АБО вуз зек о дго Теробіп б1а б1у Ап 290 кт595 300 уаї вне 5емосСує бек ма! Меж нів біц Азїа бе Ні А5поні5 Туг тиг 305 310 315 320 біп губ 5ег ве бек бен Бек Рго сіу Му 325 330 «2105 67 «2115 330 «212» Білок «213» Людина розумна (ношо хзарівйв) «4005 67 діа бек То цу5 бі Рго бек маії Рпе Рго їец АТа рРго зег 5ег Гу 1 5 іо 15 чего тпсобег біу біу тийг АТа Аїа їец сіу Су5 їви Маї сух дер отут
Ре Рко 61 РКО Уа! ТВг омаї бек ТгроА5п о 5ег Ту АЇїа гбгу Твг бе сіу ма! ні ТВг о Рпе Рго АТа бакї ме біп 5ег бек біу Ге Туг 5ег бо ес бек бег маї маї тис ма1ї Рго зас обЗеє ав Єви б1у те ста тТЬг 05 7 75 80
Туг Те сут Абп уаЇ Ап ні Туз РГО 5ег дБ Твпговує Уа! Авр уз 85 90 95 дга ма! бі вко бух 5ек Суз АБО туї Тпг о Ні ТНг Суб РКО СРгО Суз 100 105 119
РРО АЇа Рго бТо Ре 10 С1уУсоТу Рго бег уаї Ре це Ре РГО РГО 115 120 125 ух РГО муз Авр Тг ОКей Меє 116 5ег дгуд тиг о Рго сти маї тег Суз 130 135 140 уаї Ууаї ма! АТа маї 5егоніб сій Авр.оРГО біш Уа! Бу РНе Ап Тер 145 150 155 т6о тТук'уаії д5р сту уаї біб Уаії ні дп АТа куз Тгоїу5 рРгГО Аго бій 105 170 175 ої Є тує бій бек тк туго дру ма! ма! 5ег о маї сей те маї сей 180 185 190 нів бів др тгрогец Ап сту їу5 би Туг Гуз Суб був уаї БегоАза 195 200 205 ру А1а кеи рРго Аїд бег їі бі цу5 ТВг Іфе бег 1у5 Аїа Бу5 о1у 210 215 220
Єїа Рго Ага бій рго бій Ма! тук о тТвг обем Рко Рго 5ег Агу бін он 225 230 235 240
Меї ТНг вуз А5по бій Уа! 5ег ге ТпгобСуз бец маї уз біу Ре Тут 245 250 255
Рго 5ег Азр о х1іе Азїа ма! бі ткр бій бег Абп о о1у оп Рго бій деп 780 25У 279
Ап тут Су5 Трг ота оРго Ргосуа! сей А5в 5ег А5р с1у ек РВе Ре 275 280 285 їви тує б5атіу5 тен ТНг Уа? А5р ім бек Ага Тер обій ста Ту АЗп 790 295 300 маії Рпе 5ег Суз б5ег уаі Мет Ні біч Аїа беу Ні сд5п НТ Тук тТиг 305 310 315 320 сіп уз бек бе 5ек рец бек рго Оу вуз 325. 330 «2105 68 «її» 330 «125 Білок «еі3з Людина розумна СНойо 5аріопе) «4005. 68
Ата 5Бег тик обу біу Рго бег уд! Ре Рго Бец діа РгГО 5ег бес Гу 1 З не; 15
Бек Те бзег біу біу ти АТа Аїа ген сіу Су5 ен суаї гу д5ротус 29 25 30
Ре РгОо зіц вго ма! Тк оуаї зег Тгр дп о б5ег о оіу АТа бе ТК 5ег сіу уді ні те оРйе Рго АТа уаї сем біп 5ег б5ег сіу цецп туг вес 25 бо цей бег о бег Уа! маї ТК оУаї Рго б5ег обег о 5ег сем Сіу твгобіп те 65 70 75 80
Туг Т1е Су5 А5помаї Азпонів у РгО 5ек АЗп о тТИг о Суз маї АБр гу 85 90 95 длго маї бі РгО уз бе Суб АЗр о цув Тг Ні Тег сСує РгО РГО Суб 180 105 110 рго Аіа Рго бій зей сей біу 01іУу бго бег Уа! Ре се РМпе Рго РгО
ТІВ 120 125 су Рго їу5 Ар Тиг гей омеї їт1іе 5ег Ага тТйг овРго бій Уа! тв су 139 135 140
Уаї Уаї Маї др Ма! 5ег Ні сі д5р о Рго біб ма! Суз Рйе деп Тр 145 150 155 160 тТуг уаї д5р о о1у чаї бої Уа! нів А5а діа уз Тк о Гу5 РКО Аг би 165 170 175 сш бій туг бій 5еє Таготуг Або Уаї ма! 5ег о маї бец тпгома!ї ги 180 185 190 ні біп Ар оТгробец Ап сі ух Ти туго суб Суз їу5 Уа! 5ег Ап 195 200 205 їу5 АТа гей Рго АЇїа Рго ї1е бі Гу таб І1е 5ег о бу5 Аа су 01уУ
РИ) 2515 220 сіпорго Аг бій Рго бій Маї Туг о тТвВгореу Рго Рго 5ег Ак січ со 225 230 235 240
Мек ТігоБу5 АБп сій маї зег бен тТиг о Суз їей уаї цу сіу Рае туг 245 250 255
Рго Зег дер ч11е Аїа ма! бій тросі бек Азп сіу бій вго СТу Ап 250 255 270
Авп о Туг бує ТВготйРоРго Ро Ма! Сен Ар Зег Ар бу бег РНе Гей 275 г8О 285 рено тук ек Туз цей тіг Уа! А5роіуз бег дго Тер біп сіп б1У Авп 290 295 300
Ууаї Ре бек Суз Зек ма! Мет Ні5 бін Аїа Меп снів Ази Ні ТугГ тат 305 З10 315 320 сіпоіуб чек ре баг їв бек о рго біу ув 325 330 «2405 659 «21ї1х 330 «212» Білок «213» пюдина розумна (ното зарівпе) «4005 59
Аі1а зек тиг су5 01у РКО его Уа! Ре РгГО Се о Аїа РКО бер баг гу і 5 10 15 его твго5еб сту біу тТвг о АТа АТа Гец о оіу Суз Ге Уаї ву Азр. тут 0
Ре рго сіц Рко маї Тс омМаї бек Тгр о дп ек бт1у Аа іїви так зЗег сіу ма! Нтє тпе РП РО АТа маї се сій Зег чес б1у сво тує бат бо іец зек его уаі уаї тТйгомаї Рго бек б5ег бек їеи сту ті бій тр 65 70 75 80 тує ті Су А5п о ма! дп онів бух рРго 5ег Ап тТйг о бу5 маї Ар о Гуз 85 90 95
Акад Уаї бін рго цуб бег Суб Ар огуз ТИС Ні ТИг Сує Рго рго Су 100 105 о
Рго Аїа Рго бі рем їеш о біу сту Рго 5ег ма! Рпе гей Ре РРО РгОо 115 120 125 ув Рго ув Ар Тйг бен Ме т1е 5ег АКОо Тпг Рго біц Уа! Тпг осуз 130 135 140 муаї Уа! Уа! А5р ма! зегоніз біб Ар оРГО он ма! фу РНе Авпотер 145 150 155 160 туго уа! А5р о б1у маї б16 мМаї ні А5п діа гу ТИг о гу5 РГО Ако су 165 170 175 сти сій туго сій 5ег так отуг Агд Уа! Маї бег ма! гей Тк Уві! ем 180 185 150 нів біп од5о о терогей деп сту їуб5 сін туго губ Суз ух ма! 5ег Авп 195 200 205 муз АТа цей Рго Аїа Рго ї1Те бТй Су5 тб от1е 5ег оїуб5 Аїа 1у5 Ту 210 215 220 бій рго ага бід Рго бій Маї тук тий бем Рго Рго 5ег Аг бій бі 225 230 235 240 мет те гу деп тп ак 5ег о їво тТйгоСуз ен оуа! Гу сіу РНе туг 245 250 255
Рго бЗег Ар т1Тїе Аїа ма! СТИ Тер бій бег аб5побіу біп Рро бу дей 250 265 270 депотук бує тТвготве РгооРго уаї беб дер бе Авр бІу 5ег Ре РПе 275 289 285 це тує б5ег Аго тей Твг омаї А5рогух век Ак тер ооїп с1п Ту АБп 290 295 300 уаі Рйе 5ак бує 5ег муаї мек нія бІш діа ге нія А5п ні тТуг тТАг 305 310 315 320 біп бух бегорец Зек Гей 5ег ко оТу Гу 325 330 каіб» 70 к?ії» 330 киї2» Білок «2135 Людина розумна (ното 5зарівйз3 жах 70
АЇа зег Ти уз Су Рго 5ег уа! РВйе Рго бец АТя Рго бег б5ег уз 1 5 10 15 зекг тнє 5ег о біу Ту Тис оАЇа АЇа їєи біу Сух бец уаї Гує двр тук 755 30
Рпе РгО ОТО го маї ЛЬгомуаї бек тер деп тег сбіу АТа ген Тиг 5ег а1у ча! Ні тТве о рРре Рго АТа Уа! Ген бій 5ег зег сіу цей Ттуг 5ег 6о0
Се бег бек уа! уаї тис Ма! Рго бек о5ег 5ег ге б1у тргосій те 05 70 75 о
Тут тів Суя Ап о маї Азп о Нія Суз Рго бек деп ТВговуз Уа! Азр о Гуз 85 90 95
Ага ма! бій вго Суб его Суб Азрогу5 ТК нів Таб о Сух РгО РГО Су5 100 105 110
Рго АТа рРго сій Рпе сій о1у о1у Рго 5ег о уа! РВе тей РН РгО РГО 115 120 125 їу5 га суз Ар Тс бен меї Ті бег Ага ТВгорго біз Уаї Тнг о сСуз 130 135 140
Уа! маї Уа! Аїа уа! бек нів бім дер Рго біц маї (ує Ре Аєп о тгр 155 150 155 1695
Тук Маї А5р о сіу уаї бін уаї нНіз А5п діа ух Тигогух РгО Ага б1у 165 170 175 бій бій тук бій чЗес Тиготук Абу Уа! Маї бег уаії Се тиг омаї гей 180 185 190
Ні5 ОТ А5р отеросец деп стіу руб 019 тує губ Суб 1у5 Маї 5егс Ап 195 290 205
Су А1а гей Рго АТа зЗег ї11іе бій бух ТготТе 5ег о буз АТа бу Сі1у 210 215 220 сіп Рго Агу бів реко біп уаї Туг ТВгобен Рго Рго 5ег Агу бий см 275 230 235 240
Мек Тег о Суз А5п сій Уаї б5ег бе тТве Суб сец Ууаї уз С1у РНе тТук 245 250 255
Рго зег А5р тІіє6 Аїа ма! сів Тгробіу бег Аби с1у СІЙ РКО СИ АБИ 250 255 270
Ап ОотТуг ву ТАЄ Тйг Бго вго У! цеу Азр 5ег Ар с1у бег рРре г ец 275 280 285 меш Тут 5ековув рей тт ма! др оцуз заго Аго тТеробіп біп сту Аза 298 295 з00 чаї епе 5ек Суз бек уа! мех ніх бі АЇа бен Ні АБИ Ні туг тТАг 305 10 з15 320 сі цуз бек оСей бег гей бег Рго б1у Гуз 325 330 «2105 У «її 330 «212» Білок «2135 Людина розумна (Ното 5зарієйв) «НЮ» 71
АЇа его тт рух О1іу Рго бЗесг уаї! Рйе Рго бец Аа Рго 5аг Заг уз 1 5 тки 15 зек тп зекг біу сбіу ТНг АТа Аа се) біу Сує те маї Туз АБЮ Отут 20 25 30 пе РГО б1шШ РО Ма! ТНБ ма! бе тб о Абп бек біУ АтТа бе Ттиг бег 35 40 45 сіу Уаі Ніз Тиг о РМКе Рго Аіа Ма! іец біп бегобег о біу їви Тугобев 50 55 6О ес 5егозег о уаії Маї ТНК оМаї Ргб о 5егобег бек геу сіу так сій тег 65 7 75 88 тус те суз Ап оУаї АЗИ Ні уз Рко Зег деп тиг обу мМаї Абр гу 85 о 95
Ага хаї би РГО Гуз 5ек Суб Азр Муз тВг Ні Тк обуз Рго рРго Сух їщю 105 119
Бго Аїд РгГО ОЇ РаЄ со16 б1у біу Рго 5егоуаї вне сви РВе РРО Рго 120 125
Муз Рго Гуз Аяр Тс оце Меї їі 5ек Ага тк оРгОо біц ма! тб суб 130 135 140 ма! маї Маії Аїа Уа! 5ег нів СТ Азр Рго 01 Маї 1у5 Рпе Ав тТгр 145 ї50 155 160 тук ма! Ар Сіу маї сіц Уаї ні5 Асп АТа (ух Твгоцуб Рго Ага сти 165 17 175 сіш біпотук бій бег Твготує Адгу Уаї Уаї 5егоуаї Бей тс маї Те 180 1855 1950
Ніз біп Ар Тго Бен Ази біу уз бій туго гув Суб Ту маї 5ег Ап 195 200 205 вує Аїа Бец рго Аїа бег тіє бі їує тТпг о Ііе бег губ АТа Гуз у 2 215 220 бІп РО Ага бі РО бів Уді тує Тгоген бро рго 5ег Аго бі бів 225 230 235 2 мес тб о руз дей сій Ма! баб їео тає Суб рен омаії 1у5 біу Рпе Туг 245 250 299
Рго 5ег Ар тів Аїа маї бий тер біно5ег дп біу бій Рго 91а АБ 260 2655 270 дп тую бу ТР ОТНРоРКО Рго Уаї ей од5робег А5р о1уУ бБег орпе рРпєе 280 285 меш тук зег Ага Деу тис Ма! А5рогу5 5ег ага тер оїй біп оту А5п 290 295 300 маії Ре зег Суб 5ек уаї мех ні5 сіц Аза теп нів дп о Нія Тук ТЕГ 305 310 315 320 сіп уз Зек о гецд б5ег о Гефобек Рго сіу Бу 325 330 «210 072 «2115 8 «12» Білок «дІ3я Миша хатня (Ми Ми5сні0й53 «ей «ваї5 різне «222» (53.05) «2235 де хХ обрано з поміж м; Н, Р, т. Р, 1, 0, 0, Кк, М, 5, 5, я, ста в «005 72 сіу ве тик Ре Хаа тийге Тук Аа 1 5 «210 73 «її» 8
«92195 Білок «2135 Миша хатня (Ми5 Мизси НІ5) «од» «ії» їн ОСОБЛИВОСТІ «дод (635.08) «223» де Х обрано з поміж 5, М, б, А, К, М, В, НН, 0, Р, Ж, Є, м, х, М, м, В, е та с «1005 73 біу РНе тйг РНе Ап Хаа тує Аа 1 5 «2103 74 «211 8 «12» Білок «2135 Миша хатня (Ми5 Михсуціце) «20х «22їз ТНШІ ОСОБЛИВОСТІ «йййж (7.07 «223» де х обрано з поміж в, Н, М, М, М, б, 0, М, т, 5 1, В, т, А, Кк, В та Є «ц00х 74
Оіу Ре Так о РНе АБ Твт Хаа Аїа 1 5 «9105 75 «21» Ю «212» Біпок -2135 Миша хатня (Ми5 мМмизсии5) «220» «221» ІНШІ ОСОБЛИВОСТІ сей. 70.7 «23» де хХ обрано з поміж 5, м, 0, М, її, А, І, М, Б, т, К, В, б. Кк, ЕЕ, М, Є та Р «8005 25 ї16 аку 5ек цу Туг Ап Хаа Туг Аїа те 1 З о «й10з. 76 «2115 «2175 ВБіпок «213» Миша хатня (Ми5 Ми5сИи 5)
«бе» «221ї- ІНШІ ОСОБЛИВОСТІ «2225 (935.9) «223» де Х обрано з поміж м, С, Ж, М, НН.
М, б, Б, К, 5, М, К, 0,0, с, ЕЕ, Р та т «005 76 їТе Ага бек руб тТук Аби Ап тує хаа пр 1 Я о «20 7 са11» 16 «2Т2х Білок «2135 Мища хатня (Ме5 Ми5сии53 «в20х «221 ІНШІ ОСОБЛИВОСТІ «22905 (3)..03) «223» де Х обрано з поміж А, 5, М, М, Кк, , т, І, Р, 0, С, б, у.
М, Б, та В «4005 77 чаї Аг хаа с1у Ап вве сіу Аби 5ег тує маї бег отр Ре Ата туг 1 5 16 15 «105 76 -2315 16 «212» Білок «213» Миша хатня (Ми5 Миесо1и53 «2» «різ» ЖТНШЕІ ОСОБЛИВОСТІ хай Су... (73 «223» де х обрано з споміж Р, 0, А, Ж, НН, її, М, М, Е5 ї, Б, М, м, В, С, 5 та т «3005 7Ув маї Ага ні5 сіу Ап Рпе хХаа Ай чег туго Маї бек тер РВе АТа туг 1 5 10. 15 «21ій» 79 «2115 16 «2125 Білок кгі3» Миша хатня (Ми5 Мизсиїц«) «гай» к221» ІНШІ ОСОБЛИВОСТІ: «айй» (12 ..5123
«223» де х обрано з поміж А, Т, б, , М, С, Р, Б, 0, Н, К, К,
ЕЕ м, ста «4005 79 уаї Аго ні оту депорйЄ Ту дбп о 5еготуг узі Хад Тер Ре АТа туг 1 5 10 15 «210» о «2115 16 «125 Біпок «2135 Миша хатня (Мих МиЗсиТи5) «их «221» ТНШт ОСОБЛИВОСТІ «222» Х163..(16) «2235 де х обрано з поміж нн. 5. Б, М, М, ТУ С, А дя В, Оу М,
Е, М. Кк, КК, б та в «4005 80
Ма! Ага ні сб1іу дей Рае біу дб5п обаготуєг уаї! еко ткроРНе дія Хай 1 5 10 15 -210х:5 81 «211» з «ТИ» Білок «2135. Миша хатня (Ми Ми5сиін5) «220» «2915 ІНШІ ОСОоБЛИВОСТЕ «пай (6У.:. (63 «223» де Х обрано з поміж 525, б, В М, Б, І, Е, М, Я, М, ХУ,
Р, 9, 6, К та «аз ві
ТВе біу АТа Ма! Тк охаа бек деп тТуг
А 5 «210» 8 «2115 9 «їй Білок «21і13» Миша хатня (Ми Ми5сиТне) «9205 «221 ЖНншШт ОСОБЛИВОСТІ кедах (23.23 «223» де Х обрано з поміж с, Б, Ж, Т, т, М, М, А, 5, М, б, М, є, Кк, в, В тА В «4005 82
Аїа Хай тгр Тут бек Аби сец терома! 1 5 «210» 83 «2115 9 «2422 Білок «йі3» Миша хатня (Му Мозси 1 п53 «2205 «еРіх ЛНШтІ ОСОБЛИВОСТІ «й (73. .7) «23» де хХ обрано 3 поміж 0, Кк, 0, Кк, б, М, Е, Т, М, У, 5, Р,
Ж, Є та М «400» 83
АТїа цей Тгр туг бек деп о хХаа тгр ма 1 5 «2105 84 -211» 45 «2122 ДНК «213» Штучні послідовності кгОх «Ух Праймер «А0О» 84 дача сссастоасто соссдадсе соасадттота ча 42 «210» 85 -21ї5 42 «212» ДиК «213» Штучні послідовності «РО» «2235 Праймер «400» 85 тстасаасєто соаосссадс васадсауса адаадаасяс се 42 «-2105 86. «211з 43 «12» ДНК «13» Штучні послідовності 220» «2235: Праймер к«а00» 85 стсвдсаЯесо тадаєдісца тохадчастї дсоодсссад аа 43 «Ох 87 «-2115 43
«к2ї2» ДНК «213» Штучні послідовності «2205 «2235 Праймер «4005. ВИ саєссадуєс саєсааосссї асакссасає стасдаєтеос чад 43

Claims (5)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Біспецифічне антитіло, яке містить (ї) першу єднальну гілку, яка включає першу антиген- єднальну ділянку, що зв'язується з людським СОЗеє (епсилон), причому зазначена перша антиген-єднальна ділянка містить (а) ділянки СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга (МН), амінокислотні послідовності яких представлені ЗЕО ІЮ МО':1, 2 ї 3, відповідно, і ділянки СОМК1Т/СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга (ІН), амінокислотні послідовності яких представлені БЕО ІЮ МО:4, послідовністю ТМ і 5ЕО ІЮО МО:5, відповідно, або (б) ділянки СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга (МН), амінокислотні послідовності яких представлені 5ЕО ІЮ МО:55, 56 і 57, відповідно, і ділянки СОКІ, СОМ і СОМКЗ варіабельної області легкого ланцюга (ІН), амінокислотні послідовності яких представлені 5ЕО ІЮ МО:58, послідовністю ЮТ5 і ЗЕО ІО МО:59, відповідно, і (і) другу єднальну гілку, яка включає другу антиген-єднальну ділянку, що зв'язується з людським СО20.
2. Біспецифічне антитіло за пунктом 1, де (ї) зазначена перша зв'язуюча гілка містить перший важкий ланцюг, який містить першу варіабельну послідовність важкого ланцюга (МН) і першу константну послідовність важкого ланцюга (СН), і перший легкий ланцюг, який містить першу варіабельну послідовність легкого ланцюга (МІ), і першу константну послідовність легкого ланцюга (СІ), ії (ії) зазначена друга зв'язуюча гілка містить другий важкий ланцюг, який містить другу варіабельну послідовність важкого ланцюга (МН) і другу константну послідовність важкого ланцюга (СН), і другий легкий ланцюг, який містить другу варіабельну послідовність легкого ланцюга (МІ) і другу константну послідовність легкого ланцюга (СІ) їі у якому зазначена перша антиген-єднальна ділянка містить варіабельну послідовність першого важкого ланцюга (МН) і варіабельну послідовність першого легкого ланцюга (МІ), і зазначена друга антиген-єднальна ділянка містить варіабельну послідовність другого важкого ланцюга (МН) і варіабельну послідовність другого легкого ланцюга (МІ), і в якому кожна із зазначених варіабельних послідовностей містить три послідовності СОК: СОКІ, СОК2 ії СОКЗ, відповідно, - і чотири каркасні послідовності: ЕК1, ЕК2, ЕКЗ і ЕКА4, відповідно.
3. Біспецифічне антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, у якому зазначена амінокислотна послідовність МН першої антиген-єднальної ділянки щонайменше на 90 956, щонайменше на 95 965, щонайменше на 97 95 або щонайменше на 99 95 ідентична амінокислотній послідовності, або послідовність МН є представлена послідовностями УН, вибраними із групи, яка складається 3: а) послідовності УН, представленої 5ЕО ІЮ МО:6; р) послідовності МН, представленої 5ЕО ІЮ МО:7; с) послідовності УН, представленої ЗЕО ІЮ МО:8; а) послідовності УН, представленої 5ЕО ІЮ МО:9; і е) послідовності УН, представленої ЗЕО ІЮ МО:17.
4. Біспецифічне антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, у якому зазначена амінокислотна послідовність МІ першої антиген-єднальної ділянки щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 965, щонайменше на 97 95 або щонайменше на 99 95 ідентична амінокислотній послідовності, або послідовність МІ. є представлена послідовностями МІ, вибраними із групи, яка складається 3: а) послідовності МІ, представленої 5ЕО ІЮ МО:10; р) послідовності МІ, представленої ЗЕО ІЮ МО:11; с) послідовності МІ, представленої 5ЕО ІЮО МО:12; і БО а) послідовності МІ, представленої ЗЕО ІЮО МО:18.
5. Біспецифічне антитіло за будь-яким з пунктів 2-4, у якому відповідні каркасні послідовності ЕКТ, ЕКЗ, ЕКЗ ї ЕКА послідовностей МН і МІ. першої антиген-єднальної ділянки щонайменше на 90956, щонайменше на 95595, щонайменше на 9795 або щонайменше на 99 95 ідентичні відповідним амінокислотним каркасним послідовностям КІ, ЕК2, ЕКЗ ї ЕК4 зазначених послідовностей УН і МІ. і у якому у послідовностях СОК немає мутацій.
6. Біспецифічне антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, у якому зазначені послідовності УН і
МІ. першої антиген-єднальної ділянки вибирають із групи, яка складається з: а) послідовності МН, представленої БЕО ІЮО МО:6, і послідовності МІ, представленої ЗЕО ІЮ МО:10; БЮ) послідовності МН, представленої 5ЕО ІЮ МО:8, і послідовності МІ, представленої ЗЕО ІЮ МО:10; с) послідовності МН, представленої 5Е0О ІЮ МО:9, і послідовності МІ, представленої ЗЕО ІЮ МО:10; а) послідовності МН, представленої 5Е6Е20 ІЮ МО:6, і послідовності МІ, представленої ЗЕО ІЮ МО:11; е) послідовності МН, представленої БЕО ІЮО МО:6, і послідовності МІ, представленої ЗЕО ІЮ МО:12; І) послідовності МН, представленої 5ЕО ІЮ МО;:7, і послідовності МІ, представленої БЕО ІЮ МО:10; 9) послідовності МН, представленої 5Е6ЕО ІЮ МО:7, і послідовності МІ, представленої 5ЕО ІЮ МО:11; Р) послідовності МН, представленої ЗЕО ІЮ МО:7, і послідовності МІ, представленої ЗЕО ІЮ МО:12; ї) послідовності МН, представленої БЕО ІЮ МО:8, і послідовності МІ, представленої ЗЕО ІЮ МО:11; ) послідовності МН, представленої БЕО ІЮ МО:8, і послідовності МІ, представленої ЗЕО ІЮ МО:12; К) послідовності МН, представленої БЕО ІЮО МО:9, і послідовності МІ, представленої ЗЕО ІЮ МО:11; Ко) І) послідовності МН, представленої БЕО ІЮ МО:9, і послідовності МІ, представленої ЗЕО ІЮ МО:12; і т) МН представленої ЗЕО ІО МО:17, і послідовності МІ, представленої ЗЕО ІЮ МО:18.
7. Біспецифічне антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, у якому друга антиген-єднальна ділянка походить із антитіла, що зв'язується з епітопом людського СО20, у якому не міститься або не потрібно залишку аланіну в положенні 170 або залишку проліну в положенні 172 амінокислотної послідовності.
8. Біспецифічне антитіло за пунктом 7, у якому друга антиген-єднальна ділянка походить із антитіла, що зв'язується з епітопом людського СО20, у якому є або потрібен залишок аспарагіну в положенні 163 і залишок аспарагіну в положенні 166 амінокислотної послідовності.
9. Біспецифічне антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, у якому друга антиген-єднальна ділянка, яка зв'язується з людським СО20, містить: () ділянку СОКІ1 варіабельної області важкого ланцюга, представлену 5ЕО ІЮ МО:32, ділянку СОК2 варіабельної області важкого ланцюга, представлену 5ЗЕО ІЮ МО:33, ділянку СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, представлену ЗЕО ІЮ МО:34, ділянку СОКІ1 варіабельної області легкого ланцюга, представлену ЗЕО ІЮ МО:35, ділянку СОК2 варіабельної області легкого ланцюга, представлену БАБ5, і ділянку СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, представлену ЗЕО ІО МО:36, (ії) ділянку СОКІ1 варіабельної області важкого ланцюга, представлену 5ЕО ІЮ МО:38, ділянку СОК2 варіабельної області важкого ланцюга, представлену 5ЗЕО ІЮ МО:39, ділянку СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, представлену ЗЕО ІЮ МО:34, ділянку СОКІ1 варіабельної області легкого ланцюга, представлену ЗЕО ІЮ МО:35, ділянку СОК2 варіабельної області легкого ланцюга, представлену БАБ5, і ділянку СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, представлену ЗЕО ІЮО МО:36, (ії) ділянку СОКІ варіабельної області важкого ланцюга, представлену 5ЕО ІЮ МО:42, ділянку СОК2 варіабельної області важкого ланцюга, представлену 5ЗЕО ІЮ МО:43, ділянку СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, представлену ЗЕО ІЮ МО:44, ділянку СОКІ1 варіабельної області легкого ланцюга, представлену ЗЕО ІЮ МО:45, ділянку СОК2 варіабельної області легкого ланцюга, представлену БАБ5, і ділянку СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, представлену ЗЕО ІЮ МО:46,
(м) ділянку СОКІ1 варіабельної області важкого ланцюга, представлену 5ЕО ІЮ МО:49, ділянку СОК2 варіабельної області важкого ланцюга, представлену 5ЗЕО ІЮ МО:50, ділянку СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, представлену ЗЕО ІЮ МО:51, ділянку СОКІ1 варіабельної області легкого ланцюга, представлену ЗЕО ІЮ МО:52, ділянку СОК2 варіабельної області легкого ланцюга, представлену БА5, і ділянку СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, представлену ЗЕО ІЮО МО:53, (М) ділянку СОКІ варіабельної області важкого ланцюга, представлену 5ЕО ІЮ МО:32, ділянку СОК2 варіабельної області важкого ланцюга, представлену 5ЗЕО ІЮ МО:33, ділянку СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, представлену ЗЕО ІЮ МО:34, ділянку СОКІ1 варіабельної області легкого ланцюга, представлену ЗЕО ІЮ МО:45, ділянку СОК2 варіабельної області легкого ланцюга, представлену БА5, і ділянку СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, представлену ЗЕО ІЮ МО:46, (м) ділянку СОКІ1 варіабельної області важкого ланцюга, представлену 5ЕО ІЮО МО:32, ділянку СОК2 варіабельної області важкого ланцюга, представлену 5ЗЕО ІЮ МО:33, ділянку СОНКЗ варіабельної області важкого ланцюга, представлену ЗЕО ІЮ МО:34, ділянку СОКІ1 варіабельної області легкого ланцюга, представлену ЗЕО ІЮ МО:52, ділянку СОК2 варіабельної області легкого ланцюга, представлену БАБ5, і ділянку СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, представлену ЗЕО ІЮО МО:53, (мі) ділянку СОКІ1 варіабельної області важкого ланцюга, представлену ЗЕО ІЮ МО:38, ділянку СОК2 варіабельної області важкого ланцюга, представлену 5ЗЕО ІЮ МО:39, ділянку СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, представлену ЗЕО ІО МО:34, ділянку СОКІ1 варіабельної області легкого ланцюга, представлену ЗЕО ІЮ МО:45, ділянку СОК2 варіабельної області легкого ланцюга, представлену БАБ5, і ділянку СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, представлену ЗЕО ІЮ МО:46, (мії) ділянку СОКІ1 варіабельної області важкого ланцюга, представлену ЗЕО ІЮ МО:38, ділянку СОК2 варіабельної області важкого ланцюга, представлену 5ЗЕО ІЮ МО:39, ділянку СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, представлену ЗЕО ІЮ МО:34, ділянку СОКІ1 варіабельної області легкого ланцюга, представлену ЗЕО ІЮ МО:52, ділянку СОК2 варіабельної області легкого ланцюга, представлену БАБ5, і ділянку СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, Ко) представлену ЗЕО ІЮО МО:53, (їх) ділянку СОКІ1 варіабельної області важкого ланцюга, представлену 5ЕО ІЮ МО:42, ділянку СОК2 варіабельної області важкого ланцюга, представлену 5ЗЕО ІЮ МО:43, ділянку СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, представлену ЗЕО ІЮ МО:44, ділянку СОКІ1 варіабельної області легкого ланцюга, представлену ЗЕО ІЮ МО:35, ділянку СОК2 варіабельної області легкого ланцюга, представлену БА5, і ділянку СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, представлену ЗЕО ІЮО МО:36, (б) ділянку СОКІ варіабельної області важкого ланцюга, представлену 5ЕО ІЮ МО:42, ділянку СОК2 варіабельної області важкого ланцюга, представлену 5ЗЕО ІЮ МО:43, ділянку СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, представлену ЗЕО ІЮ МО:44, ділянку СОКІ1 варіабельної області легкого ланцюга, представлену ЗЕО ІЮ МО:52, ділянку СОК2 варіабельної області легкого ланцюга, представлену БАБ5, і ділянку СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, представлену ЗЕО ІЮО МО:53, (хі) ділялику СОКІ варіабельної області важкого ланцюга, представлену 5ЕО ІЮО МО:49, ділянку СОК2 варіабельної області важкого ланцюга, представлену 5ЗЕО ІЮ МО:50, ділянку СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, представлену ЗЕО ІЮ МО:51, ділянку СОКІ1 варіабельної області легкого ланцюга, представлену ЗЕО ІЮ МО:35, ділянку СОК2 варіабельної області легкого ланцюга, представлену БАБ5, і ділянку СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, представлену 5ЕО ІЮО МО:36, або (хі) ділянку СОКІ1 варіабельної області важкого ланцюга, представлену ЗЕО ІЮ МО:49, ділянку СОК2 варіабельної області важкого ланцюга, представлену 5ЗЕО ІЮ МО:50, ділянку СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, представлену ЗЕО ІЮ МО:51, ділянку СОКІ1 варіабельної області легкого ланцюга, представлену ЗЕО ІЮ МО:45, ділянку СОК2 варіабельної області легкого ланцюга, представлену БАБ5, і ділянку СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, представлену 5ЕО ІЮ МО:46.
10. Біспецифічне антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, у якому друга антиген-єднальна ділянка, яка зв'язується з людським СО20, містить: () послідовність МН, яка щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 97 95 або щонайменше на 99 95 ідентична амінокислотній послідовності, представленій 5ЕО ІЮ МО:27, і послідовність МІ, яка щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 97 95 або 60 щонайменше на 99 95 ідентична амінокислотній послідовності, представленій ЗЕО ІЮ МО:28,
(ії) послідовність УН, яка щонайменше на 90 956, щонайменше на 95 965, щонайменше на 97 9о або щонайменше на 99 95 ідентична амінокислотній послідовності, представленій 5ЕО ІЮ МО:37, і послідовність МІ, яка щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 96, щонайменше на 97 956 або щонайменше на 99 95 ідентична амінокислотній послідовності, представленій ЗЕО ІЮ МО:28, (ії) послідовність МН, яка щонайменше на 90 96, щонайменше на 95 956, щонайменше на 97 95 або щонайменше на 99 95 ідентична амінокислотній послідовності, представленій ЗЕО ІЮ МО:40, і послідовність МІ, яка щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 96, щонайменше на 97 956 або щонайменше на 99 95 ідентична амінокислотній послідовності, представленій ЗЕО ІЮ МО:41, (м) послідовність МН, яка щонайменше на 90 96, щонайменше на 95 965, щонайменше на 97 9о або щонайменше на 99 95 ідентична амінокислотній послідовності, представленій 5ЕО ІЮ МО:47, і послідовність МІ, яка щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 96, щонайменше на 97 956 або щонайменше на 99 95 ідентична амінокислотній послідовності, представленій 5ЕО ІЮ МО:48, (м) послідовність МН, яка щонайменше на 90 96, щонайменше на 95 95, щонайменше на 97 95 або щонайменше на 99 95 ідентична амінокислотній послідовності, представленій 5ЕО ІЮ МО:27, і послідовність МІ, яка щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 96, щонайменше на 97 956 або щонайменше на 99 95 ідентична амінокислотній послідовності, представленій ЗЕО ІЮ МО:41, (м) послідовність МН, яка щонайменше на 90 96, щонайменше на 95 96, щонайменше на 97 9о або щонайменше на 99 95 ідентична амінокислотній послідовності, представленій 5ЕО ІЮ МО:27, і послідовність МІ, яка щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 96, щонайменше на 97 956 або щонайменше на 99 95 ідентична амінокислотній послідовності, представленій ЗЕО ІЮ МО:48, (мії) послідовність МН, яка щонайменше на 90 96, щонайменше на 95 96, щонайменше на 97 9о або щонайменше на 99 95 ідентична амінокислотній послідовності, представленій 5ЕО ІЮ МО:37, і послідовність МІ, яка щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 96, щонайменше на 97 956 або щонайменше на 99 95 ідентична амінокислотній послідовності, представленій ЗЕО ІЮ Зо МО:41, (мії) послідовність МН, яка щонайменше на 90 956, щонайменше на 95 956, щонайменше на 97 Фо або щонайменше на 9 995 ідентична амінокислотній послідовності, представленій 5ЗЕО ІЮ МО:37, і послідовність МІ, яка щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 96, щонайменше на 97 956 або щонайменше на 99 95 ідентична амінокислотній послідовності, представленій ЗЕО ІЮ МО:48, (їх) послідовність МН, яка щонайменше на 90 96, щонайменше на 95 96, щонайменше на 97 9о або щонайменше на 99 95 ідентична амінокислотній послідовності, представленій 5ЕО ІЮ МО:40, і послідовність МІ, яка щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 96, щонайменше на 97 956 або щонайменше на 99 95 ідентична амінокислотній послідовності, представленій ЗЕО ІЮ МО:28, (х) послідовність МН, яка щонайменше на 90 96, щонайменше на 95 95, щонайменше на 97 95 або щонайменше на 99 95 ідентична амінокислотній послідовності, представленій 5ЕО ІЮ МО:40, і послідовність МІ, яка щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 96, щонайменше на 97 956 або щонайменше на 99 95 ідентична амінокислотній послідовності, представленій ЗЕО ІЮ МО:48, (хі) послідовність МН, яка щонайменше на 90 96, щонайменше на 95 96, щонайменше на 97 9о або щонайменше на 99 95 ідентична амінокислотній послідовності, представленій ЗЕО ІЮ МО:47, і послідовність МІ, яка щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 96, щонайменше на 97 956 або щонайменше на 99 95 ідентична амінокислотній послідовності, представленій ЗЕО ІЮ БО МО:28, або (хі) послідовність МН, яка щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 96, щонайменше на 97 9о або щонайменше на 99 95 ідентична амінокислотній послідовності, представленій 5ЕО ІЮ МО:47, і послідовність МІ, яка щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 96, щонайменше на 97 956 або щонайменше на 99 95 ідентична амінокислотній послідовності, представленій 5ЕО ІЮ МО:41.
11. Біспецифічне антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, у якому друга антиген-єднальна ділянка, яка зв'язується з людським СО20, містить: () послідовність МН 5ЕО ІО МО:27 і послідовність МІ. 5ЕО ІЮ МО:28, (ії) послідовність МН ЗЕО ІЮО МО:37 і послідовність МІ ЗЕО ІЮ МО:28, 60 (ії) послідовність МН 5ЕО ІЮО МО :40 і послідовність МІ. ЗЕО ІО МО:41,
(м) послідовність МН ЗЕО ІО МО:47 і послідовність МІ. 5ЕО ІЮ МО:48, (м) послідовність МН 5ЕО ІЮО МО:27 і послідовність МІ 5ЕО І МО:41, (м) послідовність МН ЗЕО ІО МО:27 і послідовність МІ. 5ЕО ІЮ МО:48, (мі) послідовність МН ЗЕО ІЮ МО:37 і послідовність МІ. ЗЕО 1О МО:41, (мії) послідовність МН 5ЕО ІЮ МО:37 і послідовність МІ. ЗЕО ІЮ МО:48, (їх) послідовність МН ЗЕО ІО МО:40 і послідовність МІ ЗЕО ІО МО:28, (х) послідовність МН 5ЕО ІО МО:40 і послідовність МІ. ЗЕО ІЮ МО:48, (хі) послідовність МН 5ЕО ІЮО МО:47 і послідовність МІ 5ЕО ІЮ МО:28 або (хії) послідовність МН ЗЕО ІЮ МО:47 і послідовність МІ. ЗЕО ІЮ МО:41.
12. Біспецифічне антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, у якому (а) перша антиген- єднальна ділянка містить ділянки СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга (МН), амінокислотні послідовності яких представлені ЗЕО ІЮ МО:1, 2 і З, відповідно, і ділянки СОВІ, СОК2 ії СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга (МІ), амінокислотні послідовності яких представлені 5ЕО ІЮ МО:4, послідовністю ЗТМ ії 5ЕО І МО:5, відповідно, і (Б) друга антиген-єднальна ділянка, яка зв'язується з людським СО20, містить ділянку СОКІ1 варіабельної області важкого ланцюга (МН), представлену 5ЕО ІЮ МО:32, ділянку СОК2 варіабельної області важкого ланцюга (УН), представлену ЗЕО ІЮ МО:33, ділянку СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга (УН), представлену 5ЕО ІЮ МО:34, ділянку СОКІ1 варіабельної області легкого ланцюга (МУ), представлену ЗЕО ІЮ МО:35, ділянку СОК2 варіабельної області легкого ланцюга (МІ), представлену послідовністю БАБ5, і ділянку СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга (МІ), представлену ЗЕО ІЮ МО:З6, відповідно.
13. Біспецифічне антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, у якому (а) перша антиген- єднальна ділянка містить послідовність МН, представлену ЗЕО ІЮ МО:6, і послідовність МІ, представлену ЗЕО ІЮ МО:10, ї (Б) друга антиген-єднальна ділянка містить послідовність МН, представлену ЗЕО ІЮО МО:27, і послідовність МІ, представлену ЗЕО ІЮ МО:28.
14. Біспецифічне антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, у якому перша антиген-єднальна ділянка є половинною антитільною молекулою, яка походить з Іде1-пиСОЗ-НІ І 1-ЕЕАЇ, і друга антиген-єднальна ділянка є половинною антитільною молекулою, яка походить з Ідс1-708- ЕЕАК, або в якому перша зв'язуюча гілка є половиною молекули антитіла, отриманою з Ідс1- Зо пиСОЗ-НТІІ 1-РЕАК, і друга зв'язуюча гілка є половиною молекули антитіла, отриманого з Іда1- 7О08-ЕЕАЇ.
15. Біспецифічне антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, у якому (ї) у зазначеному першому важкому ланцюзі амінокислотний залишок у положенні, відповідному до положення Е405 в амінокислотній послідовності важкого ланцюга людського ІдДсС1, є залишком амінокислоти | і в зазначеному другому важкому ланцюзі амінокислотний залишок у положенні, відповідному до положення К409 в амінокислотній послідовності важкого ланцюга людського ЇДО1, є залишком амінокислоти К або (ії) у зазначеному першому важкому ланцюзі амінокислотний залишок у положенні, відповідному до положення К409 в амінокислотній послідовності важкого ланцюга людського ІдДС1, є залишком амінокислоти К і в зазначеному другому важкому ланцюзі амінокислотний залишок у положенні, відповідному до положення Е405 в амінокислотній послідовності важкого ланцюга людського ЇДО1 є залишком амінокислоти ЇЇ при нумерації відповідно до індексу ЄС.
16. Біспецифічне антитіло за будь-яким з пунктів 1-15, у якому біспецифічне антитіло містить першу константну область важкого ланцюга (НС) і першу константну область легкого ланцюга (С), причому амінокислотні залишки в положеннях, відповідних до положень І 234, І 235 і 0265 амінокислотної послідовності важкого ланцюга людського Ідс1 (ЗЕО ІЮ МО:15), в обох (першому й другому) важких ланцюгах є залишками амінокислот РЕ, Е і А, відповідно при нумерації відповідно до індексу ЄС.
17. Біспецифічне антитіло за будь-яким з пунктів 1-16, у якому біспецифічне антитіло містить першу й другу константну область важкого ланцюга (НС) і першу й другу константну область легкого ланцюга (ІС), причому амінокислотні залишки в положеннях, відповідних до положень 234, 1235 і 0265 амінокислотної послідовності важкого ланцюга людського ДС! (5ЕО ІЮ МО:15), в обох (першому й другому) важких ланцюгах є залишками амінокислот Е,Е і А, відповідно, і в якому у зазначеній першій константній області важкого ланцюга амінокислотний залишок у положенні, відповідному до положення Е405 в амінокислотній послідовності важкого ланцюга людського ІдДС1, є залишком амінокислоти Г, і в зазначеній другій константній області важкого ланцюга амінокислотний залишок у положенні, відповідному до положення К409 в амінокислотній послідовності важкого ланцюга людського Ідс1і (560 ІЮ МО:15), є залишком амінокислоти К.
18. Конструкція нуклеїнової кислоти, яка кодує біспецифічне антитіло, описане в будь-якому з пунктів 1-17.
19. Композиція, яка містить біспецифічне антитіло за будь-яким з попередніх пунктів 1-17.
20. Фармацевтична композиція, яка містить біспецифічні антитіла за будь-яким з пунктів 1-17 і фармацевтично прийнятний носій.
21. Біспецифічне антитіло за будь-яким з пунктів 1-17, композиція за пунктом 19 або фармацевтична композиція за пунктом 20 для застосування як медикаменту.
22. Біспецифічне антитіло за будь-яким з пунктів 1-17, композиція за пунктом 19 або фармацевтична композиція за пунктом 20 для застосування при лікуванні захворювань.
23. Біспецифічне антитіло за пунктом 22, у якому воно застосовуються для лікування раку.
24. Біспецифічне антитіло для застосування за пунктом 22, у якому воно застосовується для лікування В-клітинних злоякісних новоутворень, таких як неходжкінська лімфома або В- клітинний лейкоз.
25. Спосіб лікування захворювань, який включає введення біспецифічного антитіла за будь- яким з пунктів 1-17, композиції за пунктом 19 або фармацевтичної композиції за пунктом 20 індивідові, який цього потребує.
26. Застосування біспецифічного антитіла за будь-яким з пунктів 1-17 для виготовлення медикаменту.
27. Застосування біспецифічного антитіла за будь-яким з пунктів 1-17 для виготовлення медикаменту для лікування раку.
28. Застосування за пунктом 26 або 27, у якому це застосування призначене для лікування В- клітинних злоякісних новоутворень.
29. Застосування за пунктом 28, у якому це застосування призначене для лікування неходжкінської лімфоми або В-клітинного лейкозу.
30. Спосіб або застосування за будь-яким з пунктів 21-29, у якому цей спосіб або це застосування біспецифічних антитіл за будь-яким з пунктів 1-17 використовується в комбінації з одним або більше інших терапевтичних засобів, наприклад хіміотерапевтичних агентів.
31. Спосіб одержання біспецифічного антитіла за будь-яким з пунктів 1-17, який включає етапи: а) культивування клітини-хазяїна, яка містить експресійний вектор, який містить: Зо () послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує послідовність важкого ланцюга першої зв'язуючої гілки, як визначено в будь-якому з попередніх пунктів 1-10; (ї) послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує послідовність легкого ланцюга першої зв'язуючої гілки, як визначено в будь-якому з попередніх пунктів 1-10; і очищення зазначеного антитіла з культурального середовища; р) культивування клітини-хазяїна, яка містить експресійний вектор, який містить: (ії) послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує послідовність важкого ланцюга другої зв'язуючої гілки, як визначено в будь-якому з попередніх пунктів 11-17; (ім) послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує послідовність легкого ланцюга другої зв'язуючої гілки, як визначено в будь-якому з попередніх пунктів 11-17; і очищення зазначеного антитіла з культурального середовища; с) інкубації зазначеного першого антитіла разом із зазначеним другим антитілом у відновлюючих умовах, достатніх для того, щоб залишки цистеїну в шарнірній ділянці зазнали ізомеризації дисульфідного зв'язку, і а) одержання зазначеного біспецифічного антитіла.
32. Діагностична композиція, яка містить біспецифічне антитіло за будь-яким з пунктів 1-17.
33. Спосіб для визначення того, чи відбувається перехресне зв'язування клітин, у яких експресується СОЮЗ, і клітин, у яких експресується СО20, у зразку, узятому в індивіда, наприклад у зразку крові, тканини лімфатичного вузла або кісткового мозку, після введення цьому індивідові біспецифічних антитіл за будь-яким з пунктів 1-17, причому зазначений спосіб включає наступні етапи: () контактування зразка з біспецифічним антитілом за будь-яким з пунктів 1-17, в умовах, у яких може утворюватися комплекс між зазначеним біспецифічним антитілом, клітиною, яка експресує СОЗ, і клітиною, яка експресує СО20; і (і) аналіз на предмет того, чи утворився комплекс.
34. Набір для визначення перехресного зв'язування між клітинами, які експресують СОЮЗ, і клітинами, які експресують СО20 в узятому в індивіда зразку, наприклад у зразку крові, тканини лімфатичного вузла або кісткового мозку, причому цей набір включає: ї) біспецифічне антитіло за будь-яким з пунктів 1-17; і її) інструкції із застосування зазначеного набору. (510)
ре шо І А | 7 е созхсо20 ш 1950000 я сОо б де 800000: ю в'еф У | ; сво 6500000. є ж Бе е 400000 й 57 200000 йо Оле прентннньня шия
0.01 п ' 10 100 Концентрація антитіл (МАВ), мкг/мл ЕХ ше ; в | як соЗз хСО20 З 1000000 ак СПО Фе 5000005 й ик І. ля ш: жк кА й ж ре ш 400000 і вж Ж щ-- ши Се: 200000 ж и : ж га в У у еечвх вади пи поси кий н и Я п 0 1 160 т00 Концентрація антитіл ПАБ) мкг/мл С ктх о є срзхсо20 Ж то000005 «ек со20
БЕ. ооо: ша й же 400000 дит Шу» 900000- шує я ЕФ: дк Ж по 9.4 1 10 150 Концентрація. антитіл пабі, мкг/мл в; ліве Й ШИ я СОЗ х СООО. в 000006. -- сОо2а В шт я- 8000005 ве Б: - - 65000005 ш ЕЕ, ри х ях 200000 д- й З ВЕ ери: НЙ Сн рн кран
0.01 01 1 10 190 Концентрація антитіл (птАВ), мкг/л Е АТО ше 0006 -щ- СОЗ х СО20 Ф 100060 щу х ! як СОЗО Е Ной о ЖЕ 6500000: Ж ве 400000 що 200000 й рк:-ящ, 0010 1 ча 700 Концентрація. антити (тАб), мкг/мл Е 206 й що ше - со х СО20 щ 3000005 ши І т ц- я 1вб1-708-БЕАК По єю й ср т в ж 200090- що, дО Оу я паща | й Фе ж пу Ве ; Бе 10000043 / Ю до В. У и я. я т о іо м - ; стен ем ши НН СН А Є Ми Концентрація. антитіл ппАБІ, МкМл
Фіг. 1 (продовження)
б ва | рий о яа- 1901-708-БЕДВ 200000. Ш/ до лк посі В-т3аХх?ОВ 5 ЛИ Июд - писів-тзіахово 5 100000 /А БД се. посув-тзіаходіої А уд Ул «вк пОССВ-тЗХ1В8 ві 5 Шо о я Кк к ї- У ще З ка 5 З У ач «5 кВ З "х концентрація. актитіл ТА), МкоМл
Фіг. 1 (продовження) й пПиСОЗ3-НІ Я Гілка Бар пами ягід 1-пиСОЗ-НІЇ1-РЕА до 80000: Гілка, спенифічна до 2020 ВЕ Й: в 708 о бообо; а ШИЙОВ ск оов2
В. СЕ; й што ра у - БАТО1 т 5. 40000- / ее втТх як В. щ ж 1188 7 Ех 20000 ІЙ зе 2с6 М й ж ор12 04 сеннееттттттт є « з" Кк Мо Кох З є о Конневтрація. антитія (Ар, мкг/мл
Фіг. 1 (продовження)
і нисСі.В-Т3/4 Плка баб 80000 ки 1д01-пиСІ В-ТЗМ-БЕАЕ ще о, Гілка, специфічна до 020 ві а АВ тов ЕЕ: ИЙ роко «-- 40000. ді щ-- САТО1 її. А й жк 1188 7 20000 "а, 4 як в12 и НА СВК й Концентрація. антитіл (АВ), мкг/мл
Фіг. 1 (продовження)
А Кий х 400 -СОЗ х 0020 ті а. - 2Е2 бу 300 р а -О х "ШИ о. / й І ; ДИчНИ СО ан | че Без моноклональних КЕ 100 ря КО антитіл во ре: Ех в; з З т 0 ї | де 00001 0.01 1 100 10000 Концентрація. антитіл ПОПАВ), МКГ/МЛ в ж я всбОзхс020 х 150 а - "?2Е? Я / 100 | со ше р. ; обріхр12 рх їх у я с ех Ей: У ,
ще. - | т !
ВО. І Й й фрез моноклональних ож ЗО ІЙ С, антитіп В ше М, ФО ф-т СН
0.000171 0.01 1 100 10000 Концентрація. антитіл ПАБ), МКГ/МЛ
Фіг. 2
1005 т т ан Сріх р - Тай т ей й СО3Х ТОВ - М, ук ее і ж хх є ж ї-й ЛЕ тов МК дя Ї . і як І і сл дао и В й В, 50. у: ел -7О8-БЕАВБ вк 1Ж ОТ о - ле С003х 1188 Б 1 ай ее 1188-Е4ОБІ. В | аа жа - 1188 РЕАК ши пре етевщрятя ї- ке -- Без моноклональних ше и А НО ИН У антитіл У а іч , ! Концентрація. антитіл (ПАБ), мкг/мл В ШЕ -к- СОЗ х 708 г Вот Я М ах к ч м ів КОСИ що У й «У Концентрація. антитіл (ТАБ), мкг/мл
Фіг. З
С СОЗ х СО20 (708) БЕ рий ще 0 ях и я ко км ква в «ее щу КЗ юю - 7 Концентрація. антитіл (тАб), мкг/мл
В. СОЗ х СО20 (1188) 1005 сере . о (ен
5. й " а У, щ І ж ЕЙ) пиво и ж и а и п ж м пр ЧР о м пр ЯР и У ок кю о Фе Фе 8? ФУ в Р У Фу Концентрація. антитіл (ТАБ), мкг/мл
Фіг. З (продовження)
Е СОЗ х СО20 (6А101) тд БО. о. би Що Бо /Й д хе лк З й бан, кА т ко кю в кВ СЯ кою з Концентрація: антитіл4тАВІ), мкг/мл Е СО х СО20 (2Е2) 700 в я. іл су о ей т я 0 іони іа ххтьтхалалієіііїіртіеткік гі тьєхтй с ве м «ню в Фе о З 5 вих й Концентрація. антитіл (тАб), мкг/мл
Фіг. З (продовження)
о кі й а- СО3 х 708 Е Є ян Шо тож в й СО М ти ри й -- СОЗхр1? д- й ої шо я ПОН КЕН т сх Кк Кк М КУ У 87 й й Концентрація. антитіл (ТАБ), мкг/мл Н ОсІ-цут Ще х 100. на е- СО3х 708 ше и ек со3хво ту як 708 ее 90. . шо Б'є Її н -- СОЗ пава я г ИН ке жо. Ї баня а в12 МЕ жк устя нн Ку ке що ше ко с Фе" су Концентрація. антитіл (ТАБ), мкг/мл
ФІГ. З (продовження)
І Каїї 100 -- СсОоЗ3х 708 нИшН -ке СОЮЗ х 12 5-90 | -- СсОЗ де ! - - ща рр В нити ше ММ чн чн ни НК ох Концентрація. антитіл (ТАБ), мкг/мл З Раїі 100- Е як сОоЗзх ВВ в й- СО х БІ пт ! ! Кк Кк Кк Кк З КН Зо " Концентрація. антитіл (тАб), мкг/мл
ФІГ. «З (продовження)
К 8ц-оні4 я е- СОЗ3х 708 С я- СсОЗ3х 1188 52504 в в г: сок Ср3хві2
В. Н.ї ПИ. ооо) Ж є ор ще чних «с з о: шу с Концентрація. антитіл (ПАБ), мкг/мл
І. УІ5Ц-МНІ. 100 Е -- СсОоЗ3х 78 Га я- СОо3х 18 МЕ Бо. ке СОЗ3ЗХ ВІ? в сон ИЙ Шик зи кляк жи же шк Кк Кк С о 5 є К » 5 80 Концентрація: антитіл (ТАВ), мкг/мл
Фіг. «З (продовження)
М МАїМ-16 100 -- Со х ТХ - - --жк- СО3х2Б2 Ши зе а Я гечий ан Й ен. - 003 х САТ Бе в. Я зк сОоЗзх 1188 БЕ нут нн Я в СОЗ х 708 5 я зв | ж- сСОо3х 12 «х с М к с ху 5 5; » «ее Концентрація. антитіл (тАВ), мкг/мл М 80 що як сОоЗхТОВ 2 60. - -- созхосв 8 40- и й і і й - вен ТИ ТО/- ШИН се сен ве ОН й с ши на К 00001 0011 100 10000 Концентрація антитіл (таб), мкг/мл
ФІГ. З (продовження)
А й «К в Сумарна кіпькість х т. ї РАДО Т-лімфоцитів (1011)
5-8. й-н-ія ТО СО 16) в 5 - 1 й Моне, їй ек а А БВ -- СОВ'(4М) й Ко Е 0 в пе | Й ле ех іч и А, и, НН; НН КОС М ї о оз Концентрація; антитіл (ТАб), мкг/мл 100 | й ! ! | я СВ - | з - соя ср кед т і. «и а с д ж 50 і ЕІ КЕ, й і А ! ще І ри о мими мА ми ОН; СУ зу ФУ Концентрація. антитіл (ТАБ), мкг/мл
А 100 у: » х и «В. 4 години г ра і "й ЖК 12 годин яд че -«е- бАтодини зх 50 в. Пооевде одщно 79- 48 Один Те «Й Ж у енших ; ши чи ЧА и і НИ НК ФО ов в НИ ОН З У ку Концентрація. антитіл (тАб), мкг/мл В І х с. зон В 100 до Я З години ЗЕ шип «Вк тАТодиИНИ бі 50 ЕІ хе 51 ВА. вн з-д ШИ В нти сутінннис» У ки ни чн ни У Є 5 Фу Концентрація. антитіл (тАб), мкг/мл
Фіг. 5
А сОоз3зхСо20 (708)
г т б т н-- -2- 0 В оосннань пНАНИИМННИЙ ід Кк Відношення БТ Кк сх шо м каз Оля Вали «о 5 їху й тефекторні кпітини; «У й ! соя ; клітини-маені) «онцентрація. антитіл (ТАБ), МКГ/МЛ дя Концентрація. антитіл (ТАБ), МКМЛО в. 100 25 в созхсо20 (1188) яке 10 100 яке 101 (019 х СО) т "Ще Бе " т Х і вх 1. й и- цЯАНУ ще І -- | - Кк їй їх с ! К х к Кк з 8 з У й Концентрація: антитіл (ТАБ, мкг/мл с сОоЗзхсО20 (АТО) 100 т х дв І т а: сн ще 8504 ВЕ | т ни ще м що о Відношення ЕТ
(ж. ще . Кк й Теж 5 о: З | (ефекторні клітини: Концентрація антитіл (пав) мк/мл клітини-мішені) я ЛО НИ но як 251 В! сопзхеро (КТ) те 101 100 як 101 (р12 х СОЗ) 5 це щ й хі
55. 50. | ї . зе | ; - пе ох ех це м о Фо 5 ФУ: й «ее Концентрація. антитіл (ТАБ), мкг/мл
Фіг. б (продовження)
Е СсоЗ3хСО20 (2Е2) Відношення Є/Т 1005 Ї (ефекторні юттини: 17 рам с клітини-мішені) х і : в як 1001 Е жах ж І ен уни - жк 25 ве З0Ч - я " ій «кій . СЕН м й. -- В око 0 В що тонн шо 10 (віх СО) « 5 їх й: - о Концентрація. антитіл (ТАбВ), мкг/мл
ФІГ. 6 (продовження)
А в - 1009- /й до БО0- я Ж шк що зу 0 7 т4 21 Час, що пройшов після введення пухлинних клітин (доби) -- РВ5 яко Ввід пис 1-КЕД ж СО20-708-РЕАВ О.005 мг/кг ЕК бе воСВІЛ Р ЕАСХ СО20-7Б8-РЕАЯ 0,05 мг/кг як Овід ВН СОЗ НТ 1 ЕАЇ х СІРО-7ОВ-БЕАДВ Об мет В ше 20005 т 15004 те 1000 Бе -дк ШУ д г 5004 о | й хе , а о : Я (5 до «е «г ху «о Ф а що Шо г - дО х А с а Я о ня Я ЩЕ с ке Я У ке Хе кА ще . к ох о г ж 28 чі чі 7
С Ф : - і щ С щі я т Е б 7 14.21 28 35 Час, що пройшов після введення
-. раб пухлинних клітин (доби) - Ввід 1-ниСОЗ 1 1-ЕЕАС х СО2О-708-БЕАК 0005 мг/кг (Не значимо) я- ВІДО СОЗНМ І 1-КЕА х СО2О-708-КЕАК 0:05 мг/кг (7) - ВІДО 1-пИІСТ3-Н 1 ЕАЇ х СО2О-70О8-КЕАВ. О 5 мг С
ФІГ. 7 (продовження)
22000 їй ж Ді 1000 Ух хо дич сія О зт т іо фр ЙЙрЙ кетттеюя 00000744 21 28 35 час, що пройшев після введення пухлинних клітин (доби) -- еВ яко ВІДО ОСІ В-ТЗМ-РЕАЕ х БТ2- РЕД ОБ мМгукг як Бвіда1- пОССВ-Т3М-КЕДІ. х Б12-ЕЕАВ 0,05 мг/кг -к ВІДНО ВТ З ЕЕА ХХ СПО ОВ РЕА ОБ МКГ ЖК обвід Т-пОСЬВ-Т З-Д, х СІ20-7 08 КАТ ОО мг/кг Е - 3000: Е ! ! і і: 2000 «и т в 1000 во 01-82 ож ж ж со с с я жи МИША НИ су Фе се? ще хе «в Фе й ХЕ з ях й ча АХ су ж я хе й Фу . о мА х о а ве ще с лк У У М ее оф «о й (зу У Х ж ку я щ- в - ве
ФІГ. 7 (продовження)
Е є 100 : : А м шк Е х во тех У 1 понотннтаонно. З 40 ку й | їй 7 14 21 28 Час, що пройшов після введення пухлинних клітин (доби) - РВ5
-. ред 1-пиСі В-Т3/4-ЕЕДІ, х СО2О-708-ЕЕАЕ 0.05 мг/кг (7) - Бад 1-пиСІ В-Т/А-РЕАЇ, х СО20-708-РЕАК 0.5 мук ех Ввід пис В-Т3/4-ЕЕДС х Б12-КЕЕАК 0.05 міукг (Не значимо) ет» реідб 1-пиСі В-ТЗА-ЕЕАІ. х 5Б12-ЕЕАВ 0.5 мг/кг (Не значимо)
ФІГ. 7 (продовження)
б -б 1500 7 0004 5 1 ЕВ; -- й ді ше Й І 07 14 21 28 35 45 Час; що пройшов після введення «РВЕ пухлинних клітин (доби) як ВВІДСИпИСТІЗЗАНТ1-РЕАС х СО20-708-ЕЕАК 0.5 мг/кг як Вас ЛОСЮВВМЕЛУКЕАХІ, х СО2О-7О8-ЕЕАК ОО5 мг/кг яко рБіІДСЛЛОСЮВН ТТ ЕК, х 020-708 0005 Мгукг я оВІДС пи СЮЗ НА ЕАЕ х СПО ВВ-РЕАН ОВ агукг те радо СОН УЕЕАЇ, х СО2о-14188-ЕЕДА 0.05 Мгукг як репо Со -РЕАЄ х СО20-1188-ЕАВ 005 мг/кг Н ові щоб" 25005 Кк УЖЕ СХ оо 15004 7 Я ЕЕ 1О004 Ж щ- б я ж хх т шо 5004 а: їх чо а : . А ні с ! ЛИН о. фо «е -е «е яе КУ Ку о о не м за а и и Й с вв кро З ще де ЕЯй Кк КК як; ее г и сй до з У 7 М а аа АЮ ев . Че) г х оз - я Си о зо ее: пк еш Ое к Оу до Кк «й о У й га Ж 2 рах НЯ ОХ ко Я о в ох Мк «ВВ й 5 Б ча
ФІГ. 7 (продовження)
Й Е Бе їй яв жк ж " ! май пане»
у. І ОБ нн т 50 і: е з ши - ав го щ 0 7 14 21 28 35 492 49 56 Час, ща пройшов пісня введення пухлинних клітин доби) хаккх Рв Й кан: ДЕД» ВНСОЗАНІТ1-РЕДІ хС20-708-ЕЕАВ О.005 ме/ке (Не значимої б ввід. пОСОЗАНЛ-РЕАГХООО-7ОВ-РЕАВ Об меле С я Біде 1- НОСОВ-НЛІ 1 ЕЕДІ хСОП20-708-КЕАВ 0,5 мг/кг (3 и Біде. ВиСОВ-НИЛЕЕАХОЮВ20-1188-РЕАР 0,005 мг/кг (7 б Ввід. НОСОВ Л-ЕЕАХСО20О1188-КЕАВ, 0.05 мг/кг 1) ввіде1- пиСОЗАНТ 1УБЕАГХСПоО-1188-ЕЕАВ 0.5 мг/кг 173
ФІГ. 7 (продовження)
А вкОз-НІЗ-Оаивічис є ІЧ З 100000 С - 5 10000 г Ка) : ся щ 1000 ф-т в ттттжттттутююття
0. ї. 14 21 Час, що пройшов після введення пухлинних клітин (деби) » Деве ЛІКУВАННЯ - рьв3 -к- радості поСОЗНТ 1-Х БТ2-КЕАК (ТАБ) -к-о ред пи СОЮЗНИКА сх СО29-708-РЕАК (ппАБ) в День 21 1000000:
Га . В ще . Кк" в 90000: а ЖЕ ! КУ, ев От гу й як о є 10000 я й я кої т по їх з » їжу о 100055 рн рчнтттннтн тр ння х ок в ж НИ Фе вхЗ
ФІГ. 8 г Рівень гуманізації В-лімфоцити чо0ч в во що г: Ї о о Хей и : ге пдойрня ! о тв 8 501 --6. оо о й о по о о дою ЕЕ а в | 600- - о в'я
Бо . па оо і Во 204 0 9? І) ух " я і пе по ЗИМА - ЕВ їх Я Ки юю ху са ща «МЕ У" Є а хе нс хе «г Фе е « «є Т-пімфоцити | «Активовані Т-лімфоцити 100 16 й че 14 й и і ве - ВО Я .
З. вожа- ве о с: о 60- шу 0» яке ппнннікутнннннях --е СД нен --е- т я
ЗВ. 58) оо: є 0.8 Гах ІФ: меш ДІ: - Ще. о те Е що У Ж 024 о | о о 0 : ! по Бади ще сор : о Ф - ю са « ся
Фіг. 8 (продовження)
В-пімфонити А ща д 000 й : і я 500- г-- Ап 03 У ООН дея юю м в 00 Бинт ренеттнятртенттттретт т ткттттренттттт вентет ут ет ртктттнтт Час (доби) т-ь- сОозхос20 001 мг/кг й СПаЗХСОгО мгукг о- СОЗхСО20 0,1 мг/кг хе СпахсСо2го 10 мг в Т-пімфоцити (СОЯ рів СВ) 10000- АД щ ше. сим т що | КА З в! А г де , з ооо. /В Де еСВ дк бали В 1 : Я ня ГЖе ня ; сек й "жі х ; до т х восої (5 ЛИ ОВО Во п М ЕВ иИ 9 и: і ; и й у, У 5 ве У М: Час (доби) Фіг, 9 с Б-лімфоцити ред ЕсЯ 5304 пе ЕЕ -
52. ВМ - Б кц г кут пеня 25104 ри І и рннЙ са пиши нн и ПИ Б дя 00 фра Шо й потен пом внно Уннннінннню питво он соти нини типове плення) о 14 28 42 56 то 84 98 Час (доби) я СО3хХСО29 0.01 мгукг й СОозХСроо мкг -к СІВЗХОО20 04 Мгукг т созхор2о 10 мг/кг в Т-лімфоцити (СО рів СОВ8") та 4 т- о 1005 "в Ж, | вл сс ПЕ де ЖЕ вої бота но ЛЕ що с: с Н - 0 0 14 26 42 56 то 84 98 Час (доби)
Фіг. 9 (продовження!
Е 10000- й й ков. ВО іде Й - 5О00- щу ру ех ВД ДСН нн 0 ССР БІВ. 64000029 04000020 Час (години) Час (години) сф п.-в 2.05 П--1о 4000: К ! ще и: ЧИ в щі А с: лу чо а А Ши і 0.5 їя | Шо 10004 ДИС Ши Шк може - о ВО репеттсеннннниг 00 Я од о ши ше 0 "М ЧУас (години). Час (години) боб й що 500 Ул З що Кк ЮК | шЕ , і Я й зо. До вся щі й Мов В ВАВ нні ві ге Срок ді ЗД дев вові НН, ПЕ пн попе пси ово плин милим овєтви пити пс пи пк плас авираваснкя 0 1020 0 10 20 Час (години) Час (години) тк сО3хСо20 0.01 мг/кг жк СОЗ3ХСО2О 1 мг/кг я СОо3х0020 0,1 мг/кг х- СОоЗзхСО20 10 мг/кг
Фіг. 9 (продовження)
Е 10000 ;ї се Ша Е 10004 000 ши я 10048
5. мій з г к : че
0.01 ! сек и Й : рр рр . 0 14 28 42 56 70 Час (доби) -- 0.03 мг/кг -3- 01 мкг 1 мг/кг 5-10 мкг --- очікувана крива для ДО дикого типу (10 мг/кг)
ФІГ. 9 (продовження)
А Зв'язування:з. СО2О дикого типу созХхО2о: 000 -8- ниСозх?ОоВ ший ою а посіВ-ТЗИХТОВ - ДИ етсс яй- пИСОЗХОК? в'я 40090 / лій се Я ПиСІВ-ТЗ/АХоЕ? Я дк й ЩЕ -- ВоСОЗХІ1ВВ - ЛИ яко росі В-Т3іахл Ва ша со а яко ВИСОЗХСАТОЇ те ст я писСОЗХВТХ а а | ж пиСозхаСв
0.600101 04 1 10 106 Концентрація біспецифічних антитій гмкглал) в созхсого; Зв'язування з СО20-АХР овичуаия ту ШЕ пу | -« писорзх?рВ а 000001 Ще е- писіВ-тзахОВ ЕЕ - Ж фе зн посОзхов2 5 40000. иа ж посі в-туіахако Ж й був - - висох ВВ ї і, йде щи я Я вВосСі вл ва 5 70000 у а ЖО-ж- висозходіої о шо в ра «в писоЗхвтТХ в4--« ЖЕ Ж рн усна ЕВ посоЗзхосе
0.о01 1 ал З 10 Концентрація біспецифічних антитіл (мкглмт
Фіг. 10
Донор 1 хо 10000 же - й БА. 75004 в. Ь шою 50003 у Ав 0250041 ; / 0 1 ке 190 000 Канцентрація моноклональних антитіл ПАЮ, НОМ Донор 2 2 20000 о Ф З ту» 19900 по й ке оо (Ве й пов й. і ся Їжа все дес й -- фс 10000 кох сьо ; : те 5000 дл 1 19 100 7обо канцентрація. моноклональних антитіл (МАВ, німл -е- р5ідС1-пиСО3-НІ1-БЕДІ. х СО20-708-ЕЕДВ -йк ідЕ-пиасів-Т3/І4 жк Їдсе1-писСі В-Т3/4-Е405І. КУ Ідб1-нисСі В-Т3/А-БЕАІ. те Ідб1-пиСО3-НІІ1-ЕЕАІ, ха 1д1-512-ЕЕАІ.
Фіг. 11
UAA201708112A 2015-01-08 2016-01-08 Біспецифічне антитіло проти cd3 і cd20 UA120286C2 (uk)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/EP2015/050276 WO2015104346A1 (en) 2014-01-09 2015-01-08 Humanized or chimeric cd3 antibodies
DKPA201500413 2015-07-15
DKPA201500412 2015-07-15
DKPA201500415 2015-07-16
DKPA201500416 2015-07-16
PCT/EP2016/050296 WO2016110576A1 (en) 2015-01-08 2016-01-08 Bispecific antibodies against cd3 and cd20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA120286C2 true UA120286C2 (uk) 2019-11-11

Family

ID=56355550

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201708112A UA120286C2 (uk) 2015-01-08 2016-01-08 Біспецифічне антитіло проти cd3 і cd20

Country Status (14)

Country Link
US (2) US10544220B2 (uk)
EP (1) EP3242682A1 (uk)
JP (3) JP6853176B2 (uk)
KR (2) KR20240064746A (uk)
CN (2) CN107660214B (uk)
AU (2) AU2016205967B2 (uk)
BR (1) BR112017014551A2 (uk)
CA (1) CA2973159A1 (uk)
EA (1) EA201791554A1 (uk)
IL (2) IL253166B (uk)
MX (2) MX2017008875A (uk)
SG (1) SG11201705496SA (uk)
UA (1) UA120286C2 (uk)
WO (1) WO2016110576A1 (uk)

Families Citing this family (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6514103B2 (ja) 2012-07-06 2019-05-15 ゲンマブ ビー．ブイ． 三重変異を有する二量体タンパク質
CN113248615A (zh) * 2013-07-05 2021-08-13 根马布股份公司 人源化或嵌合cd3抗体
PT3083689T (pt) 2013-12-17 2020-08-27 Genentech Inc Anticorpos anti-cd3 e métodos de utilização
TW201625690A (zh) 2014-09-12 2016-07-16 建南德克公司 抗－ｃｌｌ－１抗體及免疫結合物
US10323094B2 (en) 2015-06-16 2019-06-18 Genentech, Inc. Humanized and affinity matured antibodies to FcRH5 and methods of use
JP6996983B2 (ja) 2015-06-16 2022-02-21 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｃｌｌ－１抗体及び使用方法
EP3916018A1 (en) 2015-06-16 2021-12-01 Genentech, Inc. Anti-cd3 antibodies and methods of use
CN108368172B (zh) 2015-07-15 2022-06-14 根马布股份公司 人源化或嵌合cd3抗体
IL307276A (en) 2015-08-28 2023-11-01 Amunix Operating Inc Chimeric polypeptide composition and methods for its preparation and use
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
EP3252078A1 (en) * 2016-06-02 2017-12-06 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody and anti-cd20/cd3 bispecific antibody for treatment of cancer
EP3904880A1 (fr) * 2016-09-30 2021-11-03 Centre national de la recherche scientifique Marqueurs membranaires
KR20240029119A (ko) * 2016-11-15 2024-03-05 제넨테크, 인크. 항-cd20/항-cd3 이중특이적 항체에 의한 치료를 위한 투약
MX2019006954A (es) * 2016-12-20 2019-08-01 Hoffmann La Roche Terapia de combinacion de anticuerpos biespecificos anti-cd20/anti-cd3 y agonistas de 4-1bb (cd137).
KR20200014304A (ko) * 2017-06-02 2020-02-10 에프. 호프만-라 로슈 아게 암의 치료를 위한 제ii형 항-cd20 항체 및 항-cd20/항-cd3 이중특이적 항체
KR20200041897A (ko) 2017-08-01 2020-04-22 에이비 스튜디오 인코포레이티드 이중특이 항체 및 그의 용도
CN116333131A (zh) * 2017-08-04 2023-06-27 健玛保 与pd-l1和cd137结合的结合剂及其用途
WO2019034580A1 (en) * 2017-08-14 2019-02-21 Morphosys Ag HUMANIZED ANTIBODIES FOR CD3
CN107501412A (zh) * 2017-10-11 2017-12-22 深圳精准医疗科技有限公司 突变型双特异性抗体及其应用
AU2019218959A1 (en) 2018-02-08 2020-09-03 Genentech, Inc. Bispecific antigen-binding molecules and methods of use
KR20200119275A (ko) * 2018-02-09 2020-10-19 젠맵 에이/에스 Cd3 및 cd20에 대해 지정된 이중특이적 항체를 포함하는 제약 조성물 및 그의 용도
US11203646B2 (en) 2018-03-14 2021-12-21 Novimmune Sa Anti-CD3 epsilon antibodies and methods of use thereof
EP3569617A1 (en) * 2018-05-18 2019-11-20 Trion Research GmbH Pharmaceutical preparation for use in treating epstein- barr virus positive patients with reactivation phenomenon- associated diseases
CN110540593B (zh) * 2018-05-29 2022-05-17 上海药明生物技术有限公司 新型的抗cd3/抗cd20双特异性抗体
US20210277118A1 (en) * 2018-06-21 2021-09-09 Daiichi Sankyo Company, Limited Compositions including cd3 antigen binding fragments and uses thereof
CN109836502B (zh) * 2018-11-12 2021-09-07 浙江大学 一种双特异性抗体及其应用
US11639388B2 (en) * 2019-02-22 2023-05-02 Wuhan Yzy Biopharma Co., Ltd. CD3 antigen binding fragment and application thereof
CN110551221B (zh) * 2019-07-02 2021-03-05 广州爱思迈生物医药科技有限公司 一种双特异性抗体及其制备方法与应用
CA3149333A1 (en) 2019-08-15 2021-02-18 Genmab A/S Pharmaceutical compositions comprising bispecific antibodies directed against cd3 and cd20 and their uses
CN111100204B (zh) * 2019-11-26 2022-03-11 山东立菲生物产业有限公司 靶向cd20的抗体、其制备方法和应用
CN117417448A (zh) 2019-12-13 2024-01-19 基因泰克公司 抗ly6g6d抗体及使用方法
CN113402612A (zh) * 2020-03-17 2021-09-17 西比曼生物科技（香港）有限公司 靶向cd19和cd20的联合嵌合抗原受体及其应用
IL296362A (en) 2020-03-18 2022-11-01 Genmab As Antibodies that bind to b7h4
CN115916166A (zh) 2020-05-08 2023-04-04 健玛保 针对cd3和cd20的双特异性抗体
US10981996B1 (en) 2020-06-01 2021-04-20 Abexxa Biologics, Inc. Antibodies targeting a complex comprising non-classical HLA-I and neoantigen and their methods of use
US11976120B2 (en) * 2020-06-01 2024-05-07 Boehringer Ingelheim International Gmbh Antibodies targeting a complex comprising non-classical HLA-I and neoantigen and their methods of use
EP4210742A1 (en) 2020-09-10 2023-07-19 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating follicular lymphoma
CA3192251A1 (en) 2020-09-10 2022-03-17 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating diffuse large b-cell lymphoma
KR20230066391A (ko) 2020-09-10 2023-05-15 젠맵 에이/에스 여포성 림프종을 치료하기 위한 조합 요법에서의 cd3 및 cd20에 대한 이중특이적 항체
AU2021342342A1 (en) 2020-09-10 2023-04-13 Genmab A/S Bispecific antibodies against CD3 and CD20 for treating chronic lymphocytic leukemia
CA3192255A1 (en) 2020-09-10 2022-03-17 Brian Elliott Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating diffuse large b-cell lymphoma
US20230312759A1 (en) * 2020-09-10 2023-10-05 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating diffuse large b-cell lymphoma
JP2024506831A (ja) 2021-01-28 2024-02-15 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド サイトカイン放出症候群を治療するための組成物及び方法
US20240139322A1 (en) * 2021-03-10 2024-05-02 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute Inc. Compositions and methods to reduce therapeutic t cell toxicity
WO2022189667A1 (en) * 2021-03-12 2022-09-15 Genmab A/S Non-activating antibody variants
US20230241211A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating diffuse large b-cell lymphoma
WO2023144306A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating diffuse large b-cell lymphoma
WO2023201226A1 (en) 2022-04-11 2023-10-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for universal tumor cell killing
WO2023198839A2 (en) 2022-04-13 2023-10-19 Genmab A/S Bispecific antibodies against cd3 and cd20
TW202406571A (zh) 2022-04-13 2024-02-16 美商建南德克公司 莫蘇妥珠單抗之醫藥組成物及其使用方法
WO2024102948A1 (en) 2022-11-11 2024-05-16 Celgene Corporation Fc receptor-homolog 5 (fcrh5) specific binding molecules and bispecific t-cell engaging antibodies including same and related methods
WO2024130032A1 (en) * 2022-12-14 2024-06-20 Evolveimmune Therapeutics, Inc. Bispecific antibody fusion molecules and methods of use thereof

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2330130B1 (en) * 2002-10-17 2014-08-27 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against CD20
ES2856451T3 (es) * 2005-10-11 2021-09-27 Amgen Res Munich Gmbh Composiciones que comprenden anticuerpos específicos para diferentes especies, y usos de las mismas
CA2689695A1 (en) * 2007-05-31 2008-12-04 Genmab A/S Transgenic animals producing monovalent human antibodies and antibodies obtainable from these animals
US20100291023A1 (en) * 2007-05-31 2010-11-18 Genmab A/S Method for extending the half-life of exogenous or endogenous soluble molecules
WO2008145137A2 (en) * 2007-05-31 2008-12-04 Genmab A/S Recombinant non glycosylated monovalent half-antibodies obtained by molecular engineering
AU2009299794B2 (en) * 2008-10-01 2015-08-13 Amgen Research (Munich) Gmbh Cross-species-specific single domain bispecific single chain antibody
TW201109438A (en) 2009-07-29 2011-03-16 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
US20130089554A1 (en) 2009-12-29 2013-04-11 Emergent Product Development Seattle, Llc RON Binding Constructs and Methods of Use Thereof
SG10201800757TA (en) * 2010-04-20 2018-02-27 Genmab As Heterodimeric antibody fc-containing proteins and methods for production thereof
JP6278598B2 (ja) * 2010-11-30 2018-02-14 中外製薬株式会社 細胞傷害誘導治療剤
WO2012143524A2 (en) * 2011-04-20 2012-10-26 Genmab A/S Bispecific antibodies against her2 and cd3
PT2714733T (pt) * 2011-05-21 2019-05-23 Macrogenics Inc Moléculas de ligação a cd3 com capacidade para ligar a cd3 humana e não humana
DK2748201T3 (en) 2011-08-23 2018-02-12 Roche Glycart Ag BISPECIFIC T-CELL ACTIVATING ANTIGIN BINDING MOLECULES
JP6514103B2 (ja) 2012-07-06 2019-05-15 ゲンマブ ビー．ブイ． 三重変異を有する二量体タンパク質
JOP20200236A1 (ar) * 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
EP2961773B1 (en) 2013-02-26 2019-03-20 Roche Glycart AG Bispecific t cell activating antigen binding molecules
CN104936985A (zh) 2013-02-26 2015-09-23 罗切格利卡特公司 双特异性t细胞活化性抗原结合分子
CN113248615A (zh) 2013-07-05 2021-08-13 根马布股份公司 人源化或嵌合cd3抗体
JP2016531100A (ja) * 2013-07-12 2016-10-06 ザイムワークス，インコーポレイテッド 二重特異的なｃｄ３及びｃｄ１９抗原結合構築物
PT3083689T (pt) * 2013-12-17 2020-08-27 Genentech Inc Anticorpos anti-cd3 e métodos de utilização
TWI754319B (zh) 2014-03-19 2022-02-01 美商再生元醫藥公司 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物
EP3221359B1 (en) 2014-11-17 2020-05-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for tumor treatment using cd3xcd20 bispecific antibody
WO2017210485A1 (en) 2016-06-01 2017-12-07 Xencor, Inc. Bispecific antibodies that bind cd20 and cd3 for use in the treatment of lymphoma
WO2019034580A1 (en) * 2017-08-14 2019-02-21 Morphosys Ag HUMANIZED ANTIBODIES FOR CD3
KR20230066391A (ko) * 2020-09-10 2023-05-15 젠맵 에이/에스 여포성 림프종을 치료하기 위한 조합 요법에서의 cd3 및 cd20에 대한 이중특이적 항체

Also Published As

Publication number Publication date
EP3242682A1 (en) 2017-11-15
KR20170128222A (ko) 2017-11-22
AU2016205967B2 (en) 2021-11-11
JP6853176B2 (ja) 2021-03-31
MX2022004082A (es) 2022-05-03
JP2018508188A (ja) 2018-03-29
JP7177317B2 (ja) 2022-11-24
IL253166A0 (en) 2017-08-31
MX2017008875A (es) 2017-09-27
WO2016110576A1 (en) 2016-07-14
EA201791554A1 (ru) 2017-12-29
AU2022200871A1 (en) 2022-03-03
SG11201705496SA (en) 2017-08-30
CN107660214A (zh) 2018-02-02
CN107660214B (zh) 2022-02-08
JP2023002615A (ja) 2023-01-10
US10544220B2 (en) 2020-01-28
CA2973159A1 (en) 2016-07-14
CN114478792A (zh) 2022-05-13
JP2021104020A (ja) 2021-07-26
US20170355767A1 (en) 2017-12-14
IL289946A (en) 2022-03-01
IL253166B (en) 2022-02-01
KR102663073B1 (ko) 2024-05-07
AU2016205967A1 (en) 2017-07-27
US20200199231A1 (en) 2020-06-25
BR112017014551A2 (pt) 2018-05-15
KR20240064746A (ko) 2024-05-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA120286C2 (uk) Біспецифічне антитіло проти cd3 і cd20
JP7351533B2 (ja) 改変キメラ抗原受容体（ｃａｒ）ｔ細胞のヒト応用
UA124631C2 (uk) Антитіло до pd-1
UA126964C2 (uk) Конструкція біспецифічного антитіла, що зв'язується з дпб3 (dll3) і кд3 (cd3)
JP2021121208A (ja) 改変ｔ細胞に関する方法および組成物
UA125818C2 (uk) Химерні рецептори антигенів на основі однодоменних антитіл і способи їх застосування
JP2022031906A (ja) 治療用細胞の活性化及び排除のための二重コントロール
US20220281945A1 (en) Construction of chimeric antigen receptor targeting cd20 antigen and activity identification of engineered t cells thereof
ES2945313T3 (es) Construcciones de anticuerpos biespecificos para CDH3 y CD3
UA127200C2 (uk) Молекула антитіла до pd1
UA125382C2 (uk) Антитіла проти людського vista та їх застосування
UA125611C2 (uk) Біспецифічні молекули, що мають імунореактивність відносно pd-1 і ctla-4, і способи їх застосування
UA121914C2 (uk) Молекула, що зв'язує pd1 і lag3
UA124615C2 (uk) АНТИТІЛО ПРОТИ ПОДІБНОГО ДО Fc-РЕЦЕПТОРА БІЛКА 5 (FcRH5)
UA124734C2 (uk) Антитіло проти с5 і його застосування
UA126280C2 (uk) Біспецифічні конструкції антитіл, які залучають т-клітини
UA123104C2 (uk) Піролобензодіазепінові кон'югати антитіло-лікарський засіб і способи їх застосування
UA124417C2 (uk) БІСПЕЦИФІЧНИЙ КОНСТРУКТ АНТИТІЛА, ЩО ЗВ'ЯЗУЄ EGFRvIII І CD3
UA125718C2 (uk) Композиції антитіл до ror1 і пов'язані з ними способи
UA125898C2 (uk) Антитіла до tigit
IL300420B1 (en) Preparations and methods for inhibiting antigens of a certain lineage
UA122676C2 (uk) Біспецифічна антигензв'язувальна молекула проти folr1 і cd3, що активує t-клітини
UA125962C2 (uk) Біспецифічна антигензв'язуюча молекула до ox40 та фібробласт-активуючого білка (fap)
UA118749C2 (uk) Конструкція антитіла до cdh19 і cd3
JP2020525032A (ja) キメラ抗体免疫エフェクター細胞エンゲージャー及びその使用方法