TW201625690A - 抗－ｃｌｌ－１抗體及免疫結合物 - Google Patents

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西西莉亞 邱
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Abstract

本發明提供抗-CLL-1抗體及免疫結合物以及其使用方法。

Description

抗-CLL-1抗體及免疫結合物 相關申請案之交叉參考
本專利申請案主張2014年9月12日申請之美國臨時申請案第62/049876號之優先權，該臨時申請案之內容以全文引用的方式併入本文中。
序列表
本申請案含有經由EFS-Web遞交且以全文引用的方式併入本文中之序列表。於2015年8月31日創建之該ASCII複本名稱為P32314-WO_SL_txt.txt且大小為42,697位元組。
本發明係關於抗-CLL-1抗體及免疫結合物以及其使用方法。
CLL-1(亦稱為CLEC12A、MICL及DCAL2)編碼C型凝集素/C型凝集素樣域(CTL/CTLD)超家族之一員。此家族之成員共享共同蛋白質摺疊且具有不同的功能，諸如細胞黏附、細胞-細胞信號傳導、醣蛋白轉換及在發炎及免疫反應中之作用。CLL-1已展示包含單一C型凝集素樣域(預測其不結合鈣或糖)、莖區、跨膜域及含有ITIM基元之短胞質尾的II型跨膜受體。此外，CLL-1存在於正常周邊血液及骨髓(BM)中之單核細胞及粒細胞上，而不存在於非血液組織中。CLL-1亦在急性骨髓白血病(AML)、骨髓增生異常症候群(MDS)及慢性骨髓白血病(CML)細胞上表現。詳言之，CLL-1為在CD34陽性(CD34+)AML 中之一部分CD34+CD38-AML細胞上表現之白血病幹細胞(LSC)相關表面抗原。
基於單株抗體(mAb)之療法已變成癌症之重要治療形式。白血病非常適合此方法，因為血液、骨髓、脾及淋巴結中之惡性細胞可接近，且造血分化之各種譜系及階段具有界限分明之免疫表型，此允許鑑別抗原標靶。大部分急性骨髓白血病(AML)研究集中於CD33上。然而，使用未結合抗-CD33 mAb林妥珠單抗(lintuzumab)之反應已具有針對AML的適度單一藥劑及活性，且當與習知化學療法組合時未能在兩個隨機化試驗中改善患者結果。
在此項技術中需要靶向包括CLL-1之AML的安全且有效藥劑，以診斷及治療CLL-1相關病症，諸如癌症。本發明實現此需要且提供其他益處。
本發明提供抗-CLL-1抗體及免疫結合物以及其使用方法。
本文提供分離之單株抗-CLL-1抗體，其中該抗體結合包含SEQ ID NO：49之胺基酸的抗原決定基及/或結合重疊抗原決定基且不結合包含SEQ ID NO：50及/或SEQ ID NO：51之抗原決定基。在一些實施例中，抗-CLL-1抗體結合包含SEQ ID NO：49之胺基酸的抗原決定基。在一些實施例中，抗-CLL-1抗體結合由SEQ ID NO：49之胺基酸組成或基本上由SEQ ID NO：49之胺基酸組成的抗原決定基。在一些實施例中，抗原決定基藉由羥基自由基足跡分析法確定。
本文進一步提供分離之結合於CLL-1之抗體，其中該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列 之HVR-L3。在一些實施例中，該抗體含有包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-H2。在一些實施例中，該抗體含有包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列之HVR-H2。在一些實施例中，該抗體含有包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列之HVR-H2。在一些實施例中，該抗體含有包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列之HVR-H2。在一些實施例中，該抗體含有包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列之HVR-H2。
在一些實施例中，該抗體包含：(a)包含SEQ ID NO：33之序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：32之序列之輕鏈可變區；(b)包含SEQ ID NO：34之序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：32之序列之輕鏈可變區；(c)包含SEQ ID NO：46之序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：32之序列之輕鏈可變區；或(d)包含SEQ ID NO：48之序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：32之序列之輕鏈可變區。在一些實施例中，該抗體含有包含SEQ ID NO：48之序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：32之序列之輕鏈可變區。在一些實施例中，該抗體含有包含SEQ ID NO：34之序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：32之序列之輕鏈可變區。
本文亦提供分離之結合於CLL-1之抗體，其中該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列之HVR-L3。在一些實施例中，該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：38之序列之重鏈可變區及(b)包含SEQ ID NO：37之序列之輕鏈可變區。
在任一抗體之一些實施例中，抗體結合於重組人類CLL-1。在任一抗體之一些實施例中，抗體結合於重組食蟹獼猴CLL-1。在任一抗體之一些實施例中，抗體結合於人類周邊血液單核細胞(PBMC)之表 面上的內源性CLL-1。在任一抗體之一些實施例中，抗體結合於食蟹獼猴PBMC之表面上的內源性CLL-1。在任一抗體之一些實施例中，抗體結合於癌細胞表面上之內源性CLL-1。在任一抗體之一些實施例中，抗體結合於AML癌細胞表面上之內源性CLL-1。在任一抗體之一些實施例中，抗體結合於HL-60細胞之表面上的內源性CLL-1。在任一抗體之一些實施例中，抗體結合於EOL-1細胞表面上之內源性CLL-1。在任一抗體之一些實施例中，抗體結合於包含K244Q突變之CLL-1(具有K244Q之SEQ ID NO：1)。在任一抗體之一些實施例中，抗體結合包含SEQ ID NO：49之胺基酸的抗原決定基及/或結合重疊抗原決定基。在任一抗體之一些實施例中，抗體不結合包含SEQ ID NO：50及/或SEQ ID NO：51之抗原決定基。在任一抗體之一些實施例中，抗體與R&D System純系687317抗體競爭結合人類CLL-1。在任一抗體之一些實施例中，抗體以小於15nM、小於10nM、小於7nM、小於5nM或小於3nM之Kd結合於內源性人類CLL-1。在任一抗體之一些實施例中，抗體以小於10nM、小於7nM、小於5nM或小於3nM之Kd結合於重組人類CLL-1。在任一抗體之一些實施例中，抗體以小於10nM、小於7nM、小於5nM或小於3nM、小於2nM或小於1nM之Kd結合於重組食蟹獼猴CLL-1。
在任一抗體之一些實施例中，抗體包含一或多個工程改造游離半胱胺酸胺基酸殘基。在一些實施例中，一或多個工程改造游離半胱胺酸胺基酸殘基位於輕鏈中。在一些實施例中，輕鏈中之一或多個工程改造游離半胱胺酸胺基殘基包含根據Kabat編號之V205C。在一些實施例中，輕鏈中之一或多個工程改造游離半胱胺酸胺基殘基包含根據Kabat編號之K149C。在一些實施例中，一或多個工程改造游離半胱胺酸胺基酸殘基位於重鏈中。在一些實施例中，重鏈中之一或多個工程改造游離半胱胺酸胺基殘基包含根據EU編號之A118C。在一些實 施例中，重鏈中之一或多個工程改造游離半胱胺酸胺基殘基包含根據EU編號之S400C。
在任一抗體之一些實施例中，抗體為單株抗體。在任一抗體之一些實施例中，抗體為人類或嵌合抗體。在任一抗體之一些實施例中，抗體為結合CLL-1之抗體片段。在任一抗體之一些實施例中，抗體為IgG1、IgG2a或IgG2b抗體。
本文進一步提供編碼本文所述之抗體的分離核酸。本文亦提供包含編碼本文所述之抗體之核酸的宿主細胞。本文亦提供產生抗體之方法，其包含培養包含編碼本文所述之抗體之核酸的宿主細胞，從而產生抗體。
本文提供包含本文所述之抗體及細胞毒性劑之免疫結合物。詳言之，本文提供具有式Ab-(L-D)p之免疫結合物，其中：(a)Ab為本文所述之抗體；(b)L為連接子；(c)D為細胞毒性劑且該細胞毒性劑為藥物；且(d)p在1-8範圍內。
在任一免疫結合物之一些實施例中，細胞毒性劑係選自類美登素(maytansinoid)、卡奇黴素(calicheamicin)、吡咯并苯并二氮呯及奈莫柔比星(nemorubicin)衍生物。在任一免疫結合物之一些實施例中，D為式A之吡咯并苯并二氮呯： 其中點線指示C1與C2或C2與C3之間視情況存在雙鍵；R2獨立地選自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、 =C(RD)2、O-SO2-R、CO2R及COR，且視情況進一步選自鹵基或二鹵基，其中RD獨立地選自R、CO2R、COR、CHO、CO2H及鹵基；R6及R9獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；R7獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；Q獨立地選自O、S及NH；R11為H或R，或其中Q為O、SO3M，其中M為金屬陽離子；R及R'各獨立地選自視情況經取代之C1-8烷基、C3-8雜環基及C5-20芳基，且視情況關於基團NRR'，R及R'連同其附接之氮原子一起形成視情況經取代之4、5、6或7員雜環；R12、R16、R19及R17係如分別針對R2、R6、R9及R7所定義；R"為C3-12伸烷基，該鏈可雜有一或多個雜原子及/或視情況經取代之芳環；且X及X'獨立地選自O、S及N(H)。
在任一免疫結合物之一些實施例中，D具有以下結構： 其中n為0或1。
在任一免疫結合物之一些實施例中，D具有以下結構：
在任一免疫結合物之一些實施例中，D為奈莫柔比星衍生物。在任一免疫結合物之一些實施例中，D具有以下結構：
在任一免疫結合物之一些實施例中，L可藉由蛋白酶裂解。在任一免疫結合物之一些實施例中，L對酸為不穩定的。在任一免疫結合物之一些實施例中，L包含腙。
在任一免疫結合物之一些實施例中，免疫結合物具有結構：
在任一免疫結合物之一些實施例中，p在2-5範圍內。
在一些實施例中，提供醫藥調配物。在一些實施例中，醫藥調配物包含本文所述之免疫結合物及醫藥學上可接受之載劑。在一些實施例中，醫藥調配物進一步包含其他治療劑。在一些實施例中，其他治療劑為蒽環黴素(anthracycline)。在一些實施例中，蒽環黴素為道諾黴素(daunorubicin)或艾達黴素(idarubicin)。在一些實施例中，其他治療劑為阿糖胞苷(cytarabine)。在一些實施例中，其他治療劑為克拉屈濱(cladribine)。在一些實施例中，其他治療劑為氟達拉賓(fludarabine)或拓朴替康(topotecan)。在一些實施例中，其他治療劑為5-氮雜胞苷(5-azacytidine)或地西他濱(decitabine)。
在一些實施例中，提供治療方法。在一些實施例中，提供治療 CLL-1陽性癌症之方法。在一些實施例中，治療方法包含向個體投與有效量之本文所述之免疫結合物或本文所述之醫藥調配物。在一些實施例中，癌症為癌症。在一些實施例中，癌症為急性骨髓白血病(AML)、慢性骨髓白血病(CML)及/或骨髓發育不良症候群(MDS)。在一些實施例中，癌症為CLL-1陽性。在一些實施例中，CLL-1陽性癌症為AML。在一些實施例中，該方法包含向該個體投與其他治療劑。在一些實施例中，其他治療劑為蒽環黴素。在一些實施例中，蒽環黴素為道諾黴素或艾達黴素。在一些實施例中，其他治療劑為阿糖胞苷。在一些實施例中，其他治療劑為克拉屈濱。在一些實施例中，其他治療劑為氟達拉賓或拓朴替康。在一些實施例中，其他治療劑為5-氮雜胞苷或地西他濱。
在任一方法之一些實施例中，該方法進一步包含向該個體投與PD-1軸結合拮抗劑或其他治療劑。在一些實施例中，PD-1軸結合拮抗劑為PD-1結合拮抗劑。在一些實施例中，PD-1軸結合拮抗劑為PD-L1結合拮抗劑。在一些實施例中，PD-1軸結合拮抗劑為PD-L2結合拮抗劑。
在一些實施例中，提供抑制CLL-1陽性細胞之增殖的方法。在一些實施例中，該方法包含在容許免疫結合物結合於細胞表面上之CLL-1的條件下將細胞暴露於本文所述之免疫結合物，藉此抑制細胞增殖。在一些實施例中，細胞為AML癌細胞。
在一些實施例中，提供一種偵測生物樣品中之人類CLL-1的方法。在一些實施例中，一種方法包含使生物樣品與抗-CLL-1抗體在容許抗-CLL-1抗體結合於天然存在之人類CLL-1的條件下接觸，且偵測抗-CLL-1抗體與該生物樣品中天然存在之人類CLL-1之間是否形成複合物。在一些實施例中，抗-CLL-1抗體為本文所述之抗體。在一些實施例中，生物樣品為AML癌症樣品。
在一些實施例中，提供一種偵測CLL-1陽性癌症之方法。在一些此類實施例中，一種方法包含：(i)向患有或懷疑患有CLL-1陽性癌症之個體投與經標記之抗-CLL-1抗體，及(ii)偵測該個體中經標記之抗-CLL-1抗體，其中偵測該經標記之抗-CLL-1抗體指示該個體中之CLL-1陽性癌症。在一些實施例中，抗-CLL-1抗體為本文所述之抗體。在一些此類實施例中，經標記之抗-CLL-1抗體包含與正電子發射體結合之抗-CLL-1抗體。在一些實施例中，正電子發射體為89Zr。
圖1A-1B展示鼠類(m)6E7、m21C9、m20B1及m28H12之輕鏈可變區序列(A)及重鏈可變區序列(B)的比對。
圖2A-2B展示K1H1、m6E7、人類化(h)6E7.L4H1e及h6E7.L4H1e.A54之輕鏈可變區序列(A)及重鏈可變區序列(B)的比對。
圖3A-3B展示K1H1、m21C9及h21C9.L2H3之輕鏈可變區序列(A)及重鏈可變區序列(B)的比對。
圖4展示在EOL-1異種移植模型中用經由在根據EU編號胺基酸殘基118經半胱胺酸工程改造之重鏈(A118C)結合於PNU之ch21C9、ch3H10、ch28H12、ch20B1及ch6E7以10μg/m2處理後，隨時間推移腫瘤體積之改變(mm3)。
圖5展示在HL-60異種移植模型中用經由在根據EU編號胺基酸殘基118經半胱胺酸工程改造之重鏈(A118C)結合於PNU之ch21C9、ch3H10、ch28H12、ch20B1及ch6E7以10μg/m2處理後，隨時間推移腫瘤體積之改變(mm3)。
圖6展示在HL-60異種移植模型中用在根據EU編號胺基酸殘基118經半胱胺酸工程改造之重鏈(A118C)或根據Kabat編號胺基酸殘基號149經半胱胺酸工程改造之輕鏈(K149C)結合於PBD(SG34)之人類化抗體6E7.L4H1e或21C9.L2H3以10μg/m2或20μg/m2處理後，隨時間推 移腫瘤體積之改變(mm3)。以下展示結合於SG34之抗體的結構：
圖7展示在HL-60異種移植模型中用在根據Kabat編號胺基酸殘基號149經半胱胺酸工程改造之輕鏈(K149C)結合於PBD(SG34)之人類化抗體6E7.L4H1e或6E7.L4H1eN54A以5μg/m2、10μg/m2或20μg/m2處理後，隨時間推移腫瘤體積之改變(mm3)。
I.定義
出於本文之目的，「接受體人類構架」為包含來源於如以下所定義之人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之輕鏈可變域(VL)構架或重鏈可變域(VH)構架之胺基酸序列的構架。「來源於」人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之接受體人類構架可包含人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之相同胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列變化。在一些實施例中，胺基酸變化之數目為10個或10個以下、9個或9個以下、8個或8個以下、7個或7個以下、6個或6個以下、5個或5個以下、4個或4個以下、3個或3個以下、或2個或2個以下。在一些實施例中，VL接受體人類構架序列與VL人類免疫球蛋白構架序列或人類共同構架序列一致。
「親和力」係指分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間的非共價相互作用之總和之強度。除非另外指明，否則如本文所用，「結合親和力」係指反映結合對(例如抗體與抗原)成員之間1：1相互作用之固有結合親和力。分子X對其搭配物Y之親和力 一般可由解離常數(Kd)表示。可藉由此項技術中已知之常用方法(包括本文所述之方法)量測親和力。用於量測結合親和力之特定說明性及示例性實施例描述於下文中。
「親和力成熟」抗體係指相較於在一或多個高變區(HVR)中不具有一或多個變化之親本抗體，具有此類變化之抗體，此等變化使抗體對抗原之親和力得到提高。
術語「抗-CLL-1抗體」及「結合於CLL-1之抗體」係指能夠以足夠親和力結合CLL-1之抗體，使得抗體適用作靶向CLL-1中之診斷及/或治療劑。在一個實施例中，如例如藉由放射免疫分析(RIA)所量測，抗-CLL-1抗體與不相關之非CLL-1蛋白質之結合程度小於該抗體與CLL-1之結合的約10%。在某些實施例中，結合於CLL-1之抗體的解離常數(Kd)1μM、100nM、10nM、5nm、4nM、3nM、2nM、1nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM(例如10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。在某些實施例中，抗-CLL-1抗體結合於在來自不同物種之CLL-1中保守的CLL-1之抗原決定基。
術語「抗體」在本文中以最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要該等片段展示所需抗原結合活性。
「抗體片段」係指除完整抗體外之分子，其包含完整抗體之一部分，且結合完整抗體所結合之抗原。抗體片段之實例包括(但不限於)Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；及由抗體片段形成之多特異性抗體。
術語「癌症」及「癌性」係指或描述哺乳動物中通常特徵為不受調控細胞生長/增殖之生理病狀。癌症之實例包括(但不限於)癌瘤、淋巴瘤(例如霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)及非霍奇金氏淋巴 瘤)、母細胞瘤、肉瘤及白血病。此類癌症之更特定實例包括急性骨髓白血病(AML)、骨髓發育不良症候群(MDS)、慢性骨髓白血病(CML)、慢性骨髓單核細胞性白血病、急性前髓細胞性白血病(APL)、慢性骨髓增生病症、血小板性白血病、前驅B細胞急性淋巴母細胞白血病(pre-B-ALL)、前驅T細胞急性淋巴母細胞白血病(preT-ALL)、多發性骨髓瘤(MM)、肥大細胞疾病、肥大細胞白血病、肥大細胞肉瘤、骨髓肉瘤、淋巴性白血病及未分化白血病。在一些實施例中，癌症為骨髓白血病。在一些實施例中，癌症為急性骨髓白血病(AML)。
術語「嵌合」抗體係指重鏈及/或輕鏈之一部分來源於特定來源或物種，而重鏈及/或輕鏈之其餘部分來源於不同來源或物種之抗體。
抗體之「類別」係指其重鏈所具有之恆定域或恆定區之類型。抗體存在五種主要類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且其中若干者可進一步分成亞類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同類別之免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。
如本文所用，術語「細胞毒性劑」係指抑制或預防細胞功能及/或引起細胞死亡或破壞之物質。細胞毒性劑包括(但不限於)放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素)；化學治療劑或藥物(例如甲胺喋呤(methotrexate)、阿德力黴素(adriamicin)、長春花生物鹼(長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、依託泊苷(etoposide))、小紅莓、美法侖(melphalan)、絲裂黴素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、道諾黴素或其他插入劑)；生長抑制劑；酶及其片段，諸如溶核酶；抗生素；毒素，諸如小分子毒素或細菌、真菌、植 物或動物來源之酶促活性毒素，包括其片段及/或變異體；以及以下所揭示之各種抗腫瘤或抗癌劑。
「效應功能」係指可歸因於抗體之Fc區之彼等生物活性，其隨抗體同型變化。抗體效應功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調；及B細胞活化。
藥劑(例如醫藥調配物)之「有效量」係指以所需劑量及持續所需時間段有效達成所希望治療或預防結果之量。
術語「抗原決定基」係指抗體結合之抗原分子上之特定位點。在一些實施例中，抗體結合之抗原分子上的特定位點藉由羥基自由基足跡分析法確定。
本文中之術語「Fc區」用於定義含有至少一部分恆定區之免疫球蛋白重鏈之C端區。該術語包括天然序列Fc區及變異Fc區。在一個實施例中，人類IgG重鏈Fc區自Cys226或自Pro230延伸至重鏈之羧基端。然而，Fc區之C端離胺酸(Lys447)可存在或可不存在。除非本文另外說明，否則Fc區或恆定區中胺基酸殘基之編號係依據EU編號系統，亦稱為EU索引，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。
「構架」或「FR」係指除高變區(HVR)殘基外的可變域殘基。可變域之FR一般由四個FR域：FR1、FR2、FR3及FR4組成。因此，在VH(或VL)中HVR及FR序列一般以如下序列出現：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換使用且係指結構實質上類似於天然抗體結構或具有含有如本文所定義 之Fc區之重鏈的抗體。
術語「CLL-1之糖基化形式」係指藉由添加碳水化合物殘基而經轉譯後修飾之CLL-1的天然存在之形式。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指已引入外源核酸之細胞，包括此類細胞之子代。宿主細胞包括「轉型體」及「轉型細胞」，其包括初級轉型細胞及自其衍生之子代(不考慮繼代次數)。子代之核酸含量可與親本細胞不完全相同，且可能含有突變。本文包括如針對原始轉型細胞篩選或選擇，具有相同功能或生物活性之突變子代。
「人類抗體」為胺基酸序列對應於由人類或人類細胞產生或來源於利用人類抗體譜系或其他人類抗體編碼序列之非人類來源的抗體之胺基酸序列的抗體。人類抗體之此定義特定排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。
「人類共同構架」為表示一系列人類免疫球蛋白VL或VH構架序列中最常出現之胺基酸殘基之構架。一般而言，人類免疫球蛋白VL或VH序列係選自可變域序列之亞群。一般而言，序列亞群為如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991)，第1-3卷中之亞群。在一個實施例中，對於VL，亞群為如Kabat等人，前述中之亞群κ I。在一實施例中，對於VH，亞群為如Kabat等人，前述中之亞群III。
「人類化」抗體係指包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包含至少一個且通常兩個可變域之實質上全部，其中全部或實質上全部HVR(例如CDR)均對應於非人類抗體之HVR，且全部或實質上全部FR皆對應於人類抗體之FR。人類化抗體視情況可包含來源於人類抗體之抗體恆定區之至少一部分。抗體(例如非人類抗體)之「人類化形 式」係指已經歷人類化之抗體。
如本文所用，術語「高變區」或「HVR」係指抗體可變域中在序列上具有高變性及/或形成結構上定義之環(「高變環」)的各區域。一般而言，天然四鏈抗體包含六個HVR；三個位於VH中(H1、H2、H3)，且三個位於VL中(L1、L2、L3)。HVR一般包含來自高變環及/或來自互補決定區(CDR)的胺基酸殘基，後者具有最高的序列可變性及/或與抗原識別相關。示例性高變環出現在胺基酸殘基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。示例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)出現在L1之胺基酸殘基24-34、L2之胺基酸殘基50-56、L3之胺基酸殘基89-97、H1之胺基酸殘基31-35B、H2之胺基酸殘基50-65及H3之胺基酸殘基95-102(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))。除VH中之CDR1之外，CDR一般包含形成高變環的胺基酸殘基。CDR亦包含「特異性決定殘基」或「SDR」，其為接觸抗原之殘基。SDR含於縮寫稱為-CDR或a-CDR之CDR區域內。示例性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2及a-CDR-H3)出現在L1之胺基酸殘基31-34、L2之胺基酸殘基50-55、L3之胺基酸殘基89-96、H1之胺基酸殘基31-35B、H2之胺基酸殘基50-58及H3之胺基酸殘基95-102(參見Almagro及Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008))。除非另外指示，否則在本文中根據前述Kabat等人對可變域中之HVR殘基及其他殘基(例如FR殘基)進行編號。
「免疫結合物」為結合於一或多個異源分子，包括(但不限於)細胞毒性劑之抗體。
「個體(individual)」或「個體(subject)」為哺乳動物。哺乳動物 包括(但不限於)家養動物(例如牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類靈長類動物，諸如猴)、家兔及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)。在某些實施例中，該個體(individual)或個體(subject)為人類。
「分離抗體」為已與其天然環境之組分分離之抗體。在一些實施例中，抗體純化至大於95%或99%之純度，如藉由例如電泳(例如SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如離子交換或逆相HPLC)所測定。關於抗體純度評估方法之綜述，參見例如Flatman等人，J.Chromatogr.B 848：79-87(2007)。
「分離核酸」係指已與其天然環境之組分分離之核酸分子。分離核酸包括通常含有核酸分子之細胞中所含的核酸分子，但該核酸分子存在於染色體外或存在於不同於其天然染色體位置之染色體位置。
「編碼抗-CLL-1抗體之分離核酸」係指編碼抗體重鏈及輕鏈(或其片段)之一或多種核酸分子，包括單一載體或分開載體中之此類核酸分子及存在於宿主細胞中之一或多個位置之此類核酸分子。
如本文所用，術語「CLL-1」係指由細胞中CLL-1前驅蛋白之加工所產生的任何天然成熟之CLL-1。除非另外指示，否則該術語包括來自任何脊椎動物來源，包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類及食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)之CLL-1。該術語亦包括天然存在之CLL-1變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。一示例性人類CLL-1蛋白之胺基酸序列展示在SEQ ID NO：1中。在一些實施例中，人類CLL-1蛋白質序列包含K244Q SNP(SEQ ID NO：1，其中K244為Q)。一示例性細胞外域之胺基酸序列為SEQ ID NO：2之胺基酸。一示例性C型凝集素樣域(CTLD)之胺基酸序列為SEQ ID NO：3之胺基酸。一示例性食蟹獼猴CLL-1蛋白質之胺基酸序列展示於SEQ ID NO：4中。
術語「CLL-1陽性癌症」係指包含在表面上表現CLL-1之細胞的癌症。在一些實施例中，細胞表面上CLL-1之表現例如在諸如免疫組織化學、FACS等方法中使用CLL-1之抗體來測定。或者，認為CLL-1mRNA表現與細胞表面上CLL-1表現相關且可藉由選自原位雜交及RT-PCR(包括定量RT-PCR)之方法測定。
術語「CLL-1陽性細胞」係指在表面上表現CLL-1之細胞。
如本文所用，術語「單株抗體」係指自實質上均質抗體之群體獲得之抗體，亦即除可能變異抗體(例如含有天然存在之突變或在產生單株抗體製劑期間出現之變異抗體，此等變異體一般以較小量存在)之外，構成該群體之個別抗體相同及/或結合相同抗原決定基。相比於通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑，單株抗體製劑之各單株抗體係針對抗原上之單一決定子。因此，修飾語「單株」指示抗體如自實質上均質之抗體群體獲得之特性，且不應理解為需要藉由任何特定方法產生該抗體。舉例而言，根據本發明使用之單株抗體可藉由多種技術製得，包括(但不限於)融合瘤方法、重組DNA方法、噬菌體呈現方法及利用含有所有或部分人類免疫球蛋白基因座之轉殖基因動物的方法，此類方法及其他製備單株抗體之示例性方法在本文中描述。
「裸抗體」係指未與異源部分(例如細胞毒性部分)或放射性標記結合之抗體。裸抗體可存在於醫藥調配物中。
「天然抗體」係指具有變化結構之天然存在之免疫球蛋白分子。舉例而言，天然IgG抗體為約150,000道爾頓(dalton)之雜四聚體醣蛋白，其由二硫化物鍵結之兩條相同輕鏈及兩條相同重鏈構成。自N端至C端，各重鏈具有可變區(VH)，亦稱為可變重鏈域或重鏈可變域，接著為三個恆定域(CH1、CH2及CH3)。類似地，自N端至C端，各輕鏈具有可變區(VL)，亦稱為可變輕鏈域或輕鏈可變域，接著為恆 定輕鏈(CL)域。抗體輕鏈可基於其恆定域之胺基酸序列歸為兩種類型中之一種，稱為κ及λ。
術語「藥品說明書」用於指通常包括於治療性產品之商業包裝中之說明書，其含有關於適應症、用法、劑量、投藥、組合療法、與使用此類治療性產品有關之禁忌症及/或警告之資訊。
相對於參考多肽序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義為在比對參考多肽序列與候選序列且必要時引入間隙以達成最大序列一致性百分比之後，且在不將保守性取代視為序列一致性之一部分之情況下，候選序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致的胺基酸殘基之百分比。用於測定胺基酸序列一致性百分比之目的之比對可以此項技術之技能範圍內之多種方式達成，例如使用公開可獲得之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可確定用於比對序列之適當參數，包括在所比較序列之全長內達成最大比對所需的任何演算法。然而，出於本文之目的，使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生胺基酸序列一致性%值。ALIGN-2序列比較電腦程式由Genentech,Inc.設計，且原始程式碼已在U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559申請用戶文檔，其中其註冊在美國版權註冊第TXU510087號下。ALIGN-2程式可公開獲自Genentech,Inc.,South San Francisco,California，或可自原始程式碼編寫。ALIGN-2程式應經編寫可用於UNIX操作系統，包括數位UNIX V4.0D。所有序列比較參數由ALIGN-2程式設定且不變化。
在採用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情形下，既定胺基酸序列A相對於、與或針對既定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性%(或者其可表述為，既定胺基酸序列A具有或包含相對於、與或針對既定胺基酸序列B的胺基酸序列一致性一定%)如下計算：100乘以分數X/Y
其中X為在A與B之比對程式中藉由序列比對程式ALIGN-2如一致匹配所得到之胺基酸殘基數目，且其中Y為B中之胺基酸殘基之總數目。應瞭解，在胺基酸序列A之長度與胺基酸序列B之長度不相等之情況下，A相對於B之胺基酸序列一致性%將不等於B相對於A之胺基酸序列一致性%。除非另外特定陳述，否則本文所使用之所有胺基酸序列一致性%值如剛剛前段中所描述使用ALIGN-2電腦程式獲得。
術語「醫藥調配物」係指所呈形式允許其中所含活性成分之生物活性有效發揮，且不含對調配物將投與之個體具有不可接受毒性之其他組分的製劑。
「醫藥學上可接受之載劑」係指醫藥調配物中除活性成分外之對個體無毒的成分。醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
如本文所用，「治療(treatment)」(及其語法變化形式，諸如「治療(treat)」或「治療(treating)」)係指試圖改變所治療個體之自然病程的臨床介入且可出於防治目的或在臨床病理學之病程期間進行。所需治療作用包括(但不限於)預防疾病發生或復發、緩解症狀、減輕疾病之任何直接或間接病理性後果、預防轉移、減緩疾病進展速率、改善或緩和疾病病況及緩解或改善預後。在一些實施例中，本發明之抗體用於延遲疾病發展或減慢疾病進展。
「化學治療劑」係指適用於治療癌症之化合物。化學治療劑之實例包括烷基化劑，諸如噻替派(thiotepa)及環磷醯胺(cyclosphosphamide)(CYTOXAN®)；烷基磺酸鹽，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，諸如苯唑多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)及尤利多巴(uredopa)；乙烯亞胺及甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺(altretamine)、三伸乙基三聚氰胺(triethylenemelamine)、三 伸乙基磷醯胺(triethylenephosphoramide)、三伸乙基硫代磷醯胺(triethylenethiophosphoramide)及三羥甲基三聚氰胺；多聚乙醯(尤其布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氫大麻酚(屈大麻酚(dronabinol)，MARINOL®)；β-拉帕酮；拉帕醇；秋水仙鹼；樺木酸；喜樹鹼(包括合成模擬拓朴替康(HYCAMTIN®)、CPT-11(伊立替康(irinotecan，CAMPTOSAR®))、乙醯基喜樹鹼(acetylcamptothecin)、東莨菪素(scopolectin)及9-胺基喜樹鹼)；苔蘚蟲素(bryostatin)；海洋抑素(callystatin)；CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin))、卡折來新(carzelesin)及比折來新(bizelesin)合成類似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸；替尼泊甙(teniposide)；念珠藻環肽(cryptophycin)(尤其克瑞托欣(cryptophycin)1及克瑞托欣8)；海兔毒素(dolastatin)；倍癌黴素(duocarmycin)(包括合成類似物KW-2189及CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；盤克斯塔叮(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海綿抑素(spongistatin)；氮芥，諸如苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷醯胺(chlorophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、二氯甲基二乙胺氧化物鹽酸鹽、美法侖、新恩比興(novembichin)、芬司特瑞(phenesterine)、潑尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亞硝基脲，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，諸如烯二炔抗生素(例如卡奇黴素，尤其卡奇黴素γ1I及卡奇黴素ΩI1(參見例如Nicolaou等人，Angew.Chem Intl.Ed.Engl.,33：183-186(1994))；CDP323、口服α-4整合素抑制劑；達米辛(dynemicin)，包括達米辛A；埃斯培拉黴素(esperamicin)；以及新抑癌蛋白發色團及相 關色蛋白烯二炔抗生素發色團)、阿克拉黴素(aclacinomysin)、放射菌素(actinomycin)、安麯黴素(authramycin)、偶氮絲胺酸(azaserine)、博來黴素(bleomycins)、放線菌素C(cactinomycin)、卡拉比辛(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycin)、放線菌素d(dactinomycin)、道諾黴素、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、小紅莓(包括ADRIAMYCIN®)、嗎啉基-小紅莓、氰基嗎啉基-小紅莓、2-吡咯啉基-小紅莓、小紅莓HCl脂質體注射液(DOXIL®)、脂質體小紅莓TLC D-99(MYOCET®)、聚乙二醇化脂質體小紅莓(CAELYX®)及去氧小紅莓(deoxydoxorubicin))、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、艾達黴素、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycin)(諸如絲裂黴素C)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycins)、培洛黴素(peplomycin)、泊非羅黴素(porfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、奎那黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑黴素(streptonigrin)、鏈脲菌素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、左柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如甲胺喋呤、吉西他濱(gemcitabine)(GEMZAR®))、喃氟啶(tegafur)(UFTORAL®))、卡培他濱(capecitabine)(XELODA®)、埃坡黴素(epothilone)及5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)；葉酸類似物，諸如迪諾特寧(denopterin)、甲胺喋呤、蝶羅呤(pteropterin)、曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉賓、6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine)、硫米嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、雙去氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱 (enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素，諸如卡魯睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸鹽(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾內酯；抗腎上腺劑，諸如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如亞葉酸；乙醯葡醛酯；醛磷醯胺糖苷；胺基乙醯丙酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；貝斯布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；艾達曲克(edatraxate)；得弗伐胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾弗鳥胺酸(elfornithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；埃坡黴素(epothilone)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲(hydroxyurea)；蘑菇多醣(lentinan)；氯尼達明(lonidainine)；類美登素，諸如美登素(maytansine)及安絲菌素(ansamitocin)；丙脒腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫比達摩(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；噴司他丁(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基醯肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK®多醣複合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)；雷佐生(razoxane)；根瘤菌素(rhizoxin)；西索菲蘭(sizofiran)；螺旋鍺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2'-三氯三乙胺；單端孢黴烯(尤其T-2毒素、弗納庫林(verracurin)A、桿孢菌素(roridin)A及胺癸叮(anguidine))；尿烷(urethan)；長春地辛(vindesine)(ELDISINE®、FILDESIN®)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside)(「Ara-C」)；噻替派；紫杉醇(taxoid)，例如太平洋紫杉醇(TAXOL®)、太平洋紫杉醇及多烯紫杉醇(docetaxel)(TAXOTERE®)之經白蛋白工程改造之奈米粒子調 配物(ABRAXANETM))；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；6-硫代鳥嘌呤(6-thioguanine)；巰基嘌呤(mercaptopurine)；甲胺喋呤；鉑劑，諸如順鉑(cisplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)(例如ELOXATIN®)及卡鉑；長春花(vincas)，其防止微管蛋白聚合形成微管，包括長春鹼(VELBAN®)、長春新鹼(ONCOVIN®)、長春地辛(ELDISINE®、FILDESIN®)及長春瑞賓(NAVELBINE®)；依託泊苷(VP-16)；異環磷醯胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；甲醯四氫葉酸(leucovorin)；諾凡特龍(novantrone)；依達曲沙(edatrexate)；道諾黴素；胺基喋呤(aminopterin)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(difluoromethylornithine，DMFO)；類視黃素，諸如視黃酸，包括貝瑟羅汀(bexarotene)(TARGRETIN®)；雙膦酸鹽(bisphosphonate)，諸如氯屈膦酸鹽(clodronate)(例如BONEFOS®或OSTAC®))、依替膦酸鹽(etidronate)(DIDROCAL®)、NE-58095、唑來膦酸(zoledronic acid)/唑來膦酸鹽(zoledronate)(ZOMETA®)、阿侖膦酸鹽(alendronate)(FOSAMAX®)、帕米膦酸鹽(pamidronate)(AREDIA®)、替魯膦酸鹽(tiludronate)(SKELID®)或利塞膦酸鹽(risedronate)(ACTONEL®)；曲沙他濱(troxacitabine)(1,3-二氧戊環核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，尤其抑制與異常細胞增殖相關之信號傳導路徑中基因表現之反義寡核苷酸，諸如PKC-α、Raf、H-Ras及表皮生長因子受體(EGF-R)；疫苗，諸如THERATOPE®疫苗及基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN®疫苗、LEUVECTIN®疫苗及VAXID®疫苗；拓撲異構酶1抑制劑(例如LURTOTECAN®)；rmRH(例如ABARELIX®)；BAY439006(索拉非尼(sorafenib)；Bayer)；SU-11248(舒尼替尼(sunitinib)、SUTENT®，Pfizer)；哌立福新(perifosine)、COX-2抑制劑((例如塞內昔布(celecoxib)或依他昔布(etoricoxib))、蛋白體抑制劑(例如PS341)；硼 替佐米(bortezomib)(VELCADE®)；CCI-779；替吡法尼(tipifarnib)(R11577)；索拉非尼(orafenib)、ABT510；Bcl-2抑制劑，諸如奧利默森鈉(oblimersen sodium)(GENASENSE®)；匹蒽醌(pixantrone)；EGFR抑制劑(參見以下定義)；酪胺酸激酶抑制劑；絲胺酸-蘇胺酸激酶抑制劑，諸如雷帕黴素(rapamycin)(西羅莫司(sirolimus)、RAPAMUNE®)；法呢基轉移酶抑制劑，諸如洛那法尼(lonafarnib)(SCH 6636、SARASARTM)；以及以上任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物；以及以上藥劑中之兩者或兩者以上之組合，諸如CHOP(環磷醯胺、小紅莓、長春新鹼及潑尼龍之組合療法的縮寫)；以及FOLFOX(奧沙利鉑(ELOXATINTM)與5-FU及甲醯四氫葉酸組合之治療方案的縮寫)。
如本文所定義之化學治療劑包括用來調節、減輕、阻斷或抑制可促進癌症生長之激素作用的「抗激素劑」或「內分泌治療劑」。其本身可為激素，包括(但不限於)：具有混合促效劑/拮抗劑型態之抗雌激素，包括他莫昔芬(tamoxifen)(NOLVADEX®)、4-羥基他莫昔芬、托瑞米芬(toremifene)(FARESTON®)、艾多昔芬(idoxifene)、曲洛昔芬(droloxifene)、雷諾昔酚(raloxifene)(EVISTA®)、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)及選擇性雌激素受體調節劑(SERM)(諸如SERM3)；不具有促效劑特性之純抗雌激素，諸如氟維司群(fulvestrant)(FASLODEX®)及EM800(此類藥劑可阻斷雌激素受體(ER)二聚、抑制DNA結合、增加ER轉換及/或遏制ER含量)；芳香酶抑制劑，包括類固醇芳香酶抑制劑，諸如福美司坦(formestane)及依西美坦(AROMASIN®)，及非類固醇芳香酶抑制劑，諸如阿那曲唑(anastrazole)(ARIMIDEX®)、來曲唑(letrozole)(FEMARA®)及胺魯米特(aminoglutethimide)，及其他芳香酶抑制劑，包括伏羅唑(vorozole)(RIVISOR®)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)(MEGASE®)、法屈唑(fadrozole)及4(5)-咪唑；釋放促黃體激素之激素促效劑，包括亮丙立德(leuprolide)(LUPRON®及ELIGARD®)、戈舍瑞林(goserelin)、布舍瑞林(buserelin)及曲特瑞林(tripterelin)；性類固醇，包括助孕素(諸如乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)及乙酸甲羥孕酮(medroxyprogesterone acetate))、雌激素(諸如二乙基己烯雌酚(diethylstilbestrol)及普雷馬林(premarin))及雄激素/類視黃素(諸如氟甲睾酮(fluoxymesterone)、所有反式視黃酸及非瑞替尼(fenretinide))；奧那司酮(onapristone)；抗孕酮；雌激素受體下調劑(ERD)；抗雄激素，諸如氟他胺(flutamide)、尼魯胺(nilutamide)及比卡魯胺(bicalutamide)；以及以上任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物；以及以上藥劑中之兩者或兩者以上的組合。
如本文針對佐劑療法所用，術語「免疫抑制劑」係指用來遏制或遮蔽本文中所治療之哺乳動物之免疫系統的物質。此將包括遏制細胞因子產生、下調或遏制自身抗原表現或遮蔽MHC抗原之物質。此類藥劑之實例包括2-胺基-6-芳基-5-取代之嘧啶(參見美國專利第4,665,077號)；非類固醇消炎藥(NSAID)；更昔洛韋(ganciclovir)、他克莫司(tacrolimus)、糖皮質激素(諸如皮質醇或醛固酮)、消炎藥(諸如環加氧酶抑制劑、5-脂肪加氧酶抑制劑或白三烯受體拮抗劑)；嘌呤拮抗劑，諸如硫唑嘌呤(azathioprine)或黴酚酸嗎啉乙酯(mycophenolate mofetil，MMF)；烷基化劑，諸如環磷醯胺；溴麥角隱亭(bromocryptine)；達那唑(danazol)；胺苯碸(dapsone)；戊二醛(其遮蔽MHC抗原，如美國專利第4,120,649號中所述)；針對MHC抗原及MHC片段之抗個體基因型抗體；環孢素A；類固醇，諸如皮質類固醇或糖皮質類固醇或糖皮質激素類似物，例如潑尼松(prednisone)、甲基潑尼龍(methylprednisolone)，包括SOLU-MEDROL®甲基潑尼龍丁二酸鈉及地塞米松(dexamethasone)；二氫葉酸還原酶抑制劑，諸如甲 胺喋呤(口服或皮下)；抗瘧疾劑，諸如氯奎寧(chloroquine)及羥基氯奎(hydroxychloroquine)；柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)；來氟米特(leflunomide)；細胞因子或細胞因子受體抗體，包括抗干擾素-α、干擾素-β或干擾素-γ抗體、抗腫瘤壞死因子(TNF)-α抗體(英利昔單抗(infliximab)(REMICADE®)或阿達木單抗(adalimumab))、抗-TNF-α免疫黏附素(依那西普(etanercept))、抗-TNF-β抗體、抗-介白素-2(IL-2)抗體及抗-IL-2受體抗體及抗-介白素-6(IL-6)受體抗體及拮抗劑(諸如ACTEMRATM(托西利單抗(tocilizumab)))；抗-LFA-1抗體，包括抗-CD11a及抗-CD18抗體；抗-L3T4抗體；異源抗淋巴細胞球蛋白；全-T抗體，較佳抗-CD3或抗-CD4/CD4a抗體；含有LFA-3結合域之可溶性肽(WO 90/08187，公開於7/26/90)；鏈激酶；轉化生長因子-β(TGF-β)；鏈道酶(streptodornase)；來自主體之RNA或DNA；FK506；RS-61443；苯丁酸氮芥；去氧斯匹胍素(deoxyspergualin)；雷帕黴素；T細胞受體(Cohen等人，美國專利第5,114,721號)；T細胞受體片段(Offner等人，Science,251：430-432(1991)；WO 90/11294；Ianeway,Nature,341：482(1989)；及WO 91/01133)；BAFF拮抗劑，諸如BAFF抗體及BR3抗體及zTNF4拮抗劑(評述參見Mackay及Mackay,Trends Immunol.,23：113-5(2002)且亦參見下文定義)；干擾T細胞輔助信號之生物製劑，諸如抗-CD40受體或抗-CD40配位體(CD154)，包括CD40-CD40配位體(例如Durie等人，Science,261：1328-30(1993)；Mohan等人，J.Immunol.,154：1470-80(1995))及CTLA4-Ig(Finck等人，Science,265：1225-7(1994))之阻斷抗體；及T細胞受體抗體(EP 340,109)，諸如T10B9。本文中之一些較佳免疫抑制劑包括環磷醯胺、苯丁酸氮芥、硫唑嘌呤、來氟米特、MMF或甲胺喋呤。
術語「PD-1軸結合拮抗劑」係指抑制PD-1軸結合搭配物與一或多種其結合搭配物之相互作用，以便移除由PD-1信號傳導軸上信號傳 導引起之T細胞功能障礙的分子-結果為恢復或增強T細胞功能(例如增殖、細胞因子產生、標靶細胞殺死)。如本文所用，PD-1軸結合拮抗劑包括PD-1結合拮抗劑、PD-L1結合拮抗劑及PD-L2結合拮抗劑。
術語「PD-1結合拮抗劑」係指減少、阻斷、抑制、消除或干擾由PD-1與一或多種其結合搭配物(諸如PD-L1、PD-L2)之相互作用產生之信號轉導的分子。在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑為抑制PD-1與一或多種其結合搭配物之結合的分子。在一特定態樣中，PD-1結合拮抗劑抑制PD-1與PD-L1及/或PD-L2之結合。舉例而言，PD-1結合拮抗劑包括抗-PD-1抗體、其抗原結合片段、免疫黏附素、融合蛋白、寡肽及降低、阻斷、抑制、廢除或干擾由PD-1與PD-L1及/或PD-L2之相互作用產生之信號轉導的其他分子。在一個實施例中，PD-1結合拮抗劑減少藉由或經由在經由PD-L1介導信號傳導之T淋巴細胞上表現的細胞表面蛋白質介導之負共刺激信號，以便降低功能異常T細胞之功能異常程度(例如增強對抗原識別之效應反應)。在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑為抗-PD-1抗體。在一特定態樣中，PD-1結合拮抗劑為本文中所描述之MDX-1106(尼沃單抗(nivolumab))。在另一特定態樣中，PD-1結合拮抗劑為本文中描述之MK-3475(拉立珠單抗(lambrolizumab))。在另一特定態樣中，PD-1結合拮抗劑為本文中描述之CT-011(皮立珠單抗(pidilizumab))。在另一特定態樣中，PD-1結合拮抗劑為本文中描述之AMP-224。
術語「PD-L1結合拮抗劑」係指降低、阻斷、抑制、消除或干擾由PD-L1與其結合搭配物中之任一或多者(諸如PD-1、B7-1)之相互相用引起的信號轉導的分子。在一些實施例中，PD-L1結合拮抗劑為抑制PD-L1與其結合搭配物之結合的分子。在一特定態樣中，PD-L1結合拮抗劑抑制PD-L1與PD-1及/或B7-1之結合。在一些實施例中，PD-L1結合拮抗劑包括抗PD-L1抗體、其抗原結合片段、免疫黏附素、融 合蛋白、寡肽及其他降低、阻斷、抑制、消除或干擾由PD-L1與其結合搭配物中之一或多者(諸如PD-1、B7-1)之相互相用引起的信號轉導之分子。在一個實施例中，PD-L1結合拮抗劑降低藉由或經由在經由PD-L1介導信號傳導之T淋巴細胞上表現的細胞表面蛋白質介導之負共刺激信號，以便降低功能異常T細胞之功能異常程度(例如增強對抗原識別之效應反應)。在一些實施例中，PD-L1結合拮抗劑為抗PD-L1抗體。在一特定態樣中，抗-PD-L1抗體為本文中描述之YW243.55.S70。在另一特定態樣中，抗-PD-L1抗體為本文中描述之MDX-1105。在再一特定態樣中，抗-PD-L1抗體為本文中描述之MPDL3280A。在再一特定態樣中，抗-PD-L1抗體為本文中描述之MEDI4736。
術語「PD-L2結合拮抗劑」係指降低、阻斷、抑制、消除或干擾由PD-L2與其結合搭配物中之任一或多者(諸如PD-1)之相互相用引起的信號轉導之分子。在一些實施例中，PD-L2結合拮抗劑為抑制PD-L2與其結合搭配物中之一或多者結合的分子。在一特定態樣中，PD-L2結合拮抗劑抑制PD-L2與PD-1之結合。在一些實施例中，PD-L2拮抗劑包括抗-PD-L2抗體、其抗原結合片段、免疫黏附素、融合蛋白、寡肽及其他降低、阻斷、抑制、消除或干擾由PD-L2與其結合搭配物中之任一或多者(諸如PD-1)之相互相用引起的信號轉導之分子。在一個實施例中，PD-L2結合拮抗劑降低藉由或經由在經由PD-L2介導信號傳導之T淋巴細胞上表現的細胞表面蛋白質介導之負共刺激信號，以便降低功能異常T細胞之功能異常程度(例如增強對抗原識別之效應反應)。在一些實施例中，PD-L2結合拮抗劑為免疫黏附素。
術語「可變區」或「可變域」係指涉及抗體結合於抗原之抗體重鏈或輕鏈域。天然抗體之重鏈及輕鏈(分別為VH及VL)可變域一般具有類似結構，其中各結構域均包含四個保守構架區(FR)及三個高變 區(HVR)(參見例如Kindt等人Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91頁(2007))。單一VH或VL域可足以賦予抗原結合特異性。此外，可使用來自結合抗原之抗體的VH或VL域分離結合特定抗原之抗體以分別篩選互補VL或VH域之文庫。參見例如Portolano等人，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352：624-628(1991)。
如本文所用，術語「載體」係指一種核酸分子，其能夠傳送其所連接之另一種核酸分子。該術語包括呈自我複製核酸結構之載體以及併入其已引入之宿主細胞之基因組中的載體。某些載體能夠引導其可操作地連接之核酸的表現。此類載體在本文中稱為「表現載體」。
「烷基」為含有正鏈、第二、第三或環狀碳原子之C1-C18烴。實例為甲基(Me、-CH3)、乙基(Et、-CH2CH3)、1-丙基(n-Pr、正丙基、-CH2CH2CH3)、2-丙基(i-Pr、i-丙基、-CH(CH3)2)、1-丁基(n-Bu、正丁基、-CH2CH2CH2CH3)、2-甲基-1-丙基(i-Bu、異丁基、-CH2CH(CH3)2)、2-丁基(s-Bu、第二丁基、-CH(CH3)CH2CH3)、2-甲基-2-丙基(t-Bu、第三丁基、-C(CH3)3)、1-戊基(正戊基、-CH2CH2CH2CH2CH3)、2-戊基(-CH(CH3)CH2CH2CH3)、3-戊基(-CH(CH2CH3)2)、2-甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH2CH3)、3-甲基-2-丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2)、3-甲基-1-丁基(-CH2CH2CH(CH3)2)、2-甲基-1-丁基(-CH2CH(CH3)CH2CH3)、1-己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)、3-己基(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))、2-甲基-2-戊基(-C(CH3)2CH2CH2CH3)、3-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)、4-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2)、3-甲基-3-戊基(-C(CH3)(CH2CH3)2)、2-甲基-3-戊基(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2)、2,3-二甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH(CH3)2)、3,3-二甲基-2-丁基(-CH(CH3)C(CH3)3。
如本文所用，術語「C1-C8烷基」係指具有1至8個碳原子之直鏈或分支鏈、飽和或不飽和烴。代表性「C1-C8烷基」包括(但不限於)-甲基、-乙基、-正丙基、-正丁基、-正戊基、-正己基、-正庚基、-正辛基、-正壬基及-正癸基；而分支鏈C1-C8烷基包括(但不限於)-異丙基、-第二丁基、-異丁基、-第三丁基、-異戊基、2-甲基丁基；不飽和C1-C8烷基包括(但不限於)-乙烯基、-烯丙基、-1-丁烯基、-2-丁烯基、-異丁烯基、-1-戊烯基、-2-戊烯基、-3-甲基-1-丁烯基、-2-甲基-2-丁烯基、-2,3-二甲基-2-丁烯基、-1-己基、2-己基、-3-己基、-乙炔基、-丙炔基、-1-丁炔基、-2-丁炔基、-1-戊炔基、-2-戊炔基、-3-甲基-1丁炔基。C1-C8烷基可未經取代或經一或多個包括(但不限於)以下各基之基團取代：-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-SO3R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2及-CN；其中各R'獨立地選自H、-C1-C8烷基及芳基。
如本文所用，術語「C1-C12烷基」係指具有1至12個碳原子之直鏈或分支鏈、飽和或不飽和烴。C1-C12烷基可未經取代或經一或多個包括(但不限於)以下各基之基團取代：-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-SO3R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2及-CN；其中各R'獨立地選自H、-C1-C8烷基及芳基。
如本文所用，術語「C1-C6烷基」係指具有1至6個碳原子之直鏈或分支鏈、飽和或不飽和烴。代表性「C1-C6烷基」包括(但不限於)-甲基、-乙基、-正丙基、-正丁基、-正戊基及-正己基；而分支鏈C1-C6烷基包括(但不限於)-異丙基、-第二丁基、-異丁基、-第三丁基、-異戊基及2-甲基丁基；不飽和C1-C6烷基包括(但不限於)-乙烯基、-烯丙 基、-1-丁烯基、-2-丁烯基及-異丁烯基、-1-戊烯基、-2-戊烯基、-3-甲基-1-丁烯基、-2-甲基-2-丁烯基、-2,3-二甲基-2-丁烯基、-1-己基、2-己基及-3-己基。C1-C6烷基可未經取代或經一或多個如上針對C1-C8烷基所述之基團取代。
如本文所用，術語「C1-C4烷基」係指具有1至4個碳原子之直鏈或分支鏈、飽和或不飽和烴。代表性「C1-C4烷基」基團包括(但不限於)-甲基、-乙基、-正丙基、-正丁基；而分支鏈C1-C4烷基包括(但不限於)-異丙基、-第二丁基、-異丁基、-第三丁基；不飽和C1-C4烷基包括(但不限於)-乙烯基、-烯丙基、-1-丁烯基、-2-丁烯基及-異丁烯基。C1-C4烷基可未經取代或經一或多個如上針對C1-C8烷基所述之基團取代。
「烷氧基」為單一鍵結於氧之烷基。示例性烷氧基包括(但不限於)甲氧基(-OCH3)及乙氧基(-OCH2CH3)。「C1-C5烷氧基」為具有1至5個碳原子之烷氧基。烷氧基可未經取代或經一或多個如上針對烷基所述之基團取代。
「烯基」為含有正鏈、第二、第三或環狀碳原子及至少一個不飽和位點，亦即碳-碳sp 2 雙鍵的C2-C18烴。實例包括(但不限於)：乙烯或乙烯基(-CH=CH2)、烯丙基(-CH2CH=CH2)、環戊烯基(-C5H7)及5-己烯基(-CH2CH2CH2CH2CH=CH2)。「C2-C8烯基」為含有2至8個正鏈、第二、第三或環狀碳原子及至少一個不飽和位點，亦即碳-碳sp2雙鍵的烴。
「炔基」為含有正鏈、第二、第三或環狀碳原子及至少一個不飽和位點，亦即碳-碳sp參鍵的C2-C18烴。實例包括(但不限於)：乙炔基(-C≡CH)及炔丙基(-CH2C≡CH)。「C2-C8炔基」為含有2至8個正鏈、第二、第三或環狀碳原子及至少一個不飽和位點，亦即碳-碳sp參鍵的烴。
「伸烷基」係指具有1-18個碳原子且具有藉由自母烷烴之同一個或兩個不同碳原子移除兩個氫原子所衍生之兩個單價自由基中心的飽和、分支鏈或直鏈或環狀烴基。典型伸烷基包括(但不限於)：亞甲基(-CH2-)、1,2-乙基(-CH2CH2-)、1,3-丙基(-CH2CH2CH2-)、1,4-丁基(-CH2CH2CH2CH2-)及其類似基團。
「C1-C10伸烷基」為式-(CH2)1-10-之直鏈飽和烴基。C1-C10伸烷基之實例包括亞甲基、伸乙基、伸丙基、伸丁基、伸戊基、伸己基、伸庚基、伸辛基、伸壬基及伸癸基。
「伸烯基」係指具有2-18個碳原子且具有藉由自母體烯之同一個或兩個不同碳原子移除兩個氫原子所衍生之兩個單價自由基中心的不飽和、分支鏈或直鏈或環狀烴基。典型伸烯基包括(但不限於)：1,2-伸乙基(-CH=CH-)。
「伸炔基」係指具有2-18個碳原子且具有藉由自母體炔之同一個或兩個不同碳原子移除兩個氫原子所衍生之兩個單價自由基中心的不飽和、分支鏈或直鏈或環狀烴基。典型伸炔基包括(但不限於)：伸乙炔(-C≡C-)、炔丙基(-CH2C≡C-)及4-戊炔基(-CH2CH2CH2C≡C-)。
「芳基」係指碳環芳族基。芳基之實例包括(但不限於)苯基、萘基及蒽基。碳環芳族基或雜環芳族基可未經取代或經一或多個包括(但不限於)以下各基之基團取代：-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2及-CN；其中各R'獨立地選自H、-C1-C8烷基及芳基。
「C5-C20芳基」為碳環芳環中具有5至20個碳原子之芳基。C5-C20芳基之實例包括(但不限於)苯基、萘基及蒽基。C5-C20芳基可經如上針對芳基所述取代或未經取代。「C5-C14芳基」為碳環芳環中具有5至 14個碳原子之芳基。C5-C14芳基之實例包括(但不限於)苯基、萘基及蒽基。C5-C14芳基可經如上針對芳基所述取代。
「伸芳基」為具有兩個共價鍵且可呈如以下結構中所示之鄰、間或對組態之芳基： 其中苯基可未經取代或經至多四個包括(但不限於)以下各基之基團取代：-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2及-CN；其中各R'獨立地選自H、-C1-C8烷基及芳基。
「芳基烷基」係指其中鍵結於碳原子、通常末端或sp3碳原子之氫原子之一經芳基置換的非環狀烷基。典型芳基烷基包括(但不限於)苯甲基、2-苯基乙-1-基、2-苯基乙烯-1-基、萘基甲基、2-萘基乙-1-基、2-萘基乙烯-1-基、萘并苯甲基、2-萘并苯基乙-1-基及其類似基團。芳基烷基包含6至20個碳原子，例如芳基烷基之烷基部分，包括烷基、烯基或炔基，為1至6個碳原子且芳基部分為5至14個碳原子。
「雜芳基烷基」係指其中鍵結於碳原子、通常末端或sp3碳原子之氫原子之一經雜芳基置換的非環狀烷基。典型雜芳基烷基包括(但不限於)2-苯并咪唑基甲基、2-呋喃基乙基及其類似基團。雜芳基烷基包含6至20個碳原子，例如雜芳基烷基之烷基部分，包括烷基、烯基或炔基為1至6個碳原子且雜芳基部分為5至14個碳原子及1至3個選自N、O、P及S之雜原子。雜芳基烷基之雜芳基部分可為具有3至7個環成員之單環(2至6個碳原子)或具有7至10個環成員之雙環(4至9個碳原子及1至3個選自N、O、P及S之雜原子)，例如：雙環[4,5]、[5,5]、 [5,6]或[6,6]系統。
「經取代之烷基」、「經取代之芳基」及「經取代之芳基烷基」分別意謂烷基、芳基及芳基烷基，其中一或多個氫原子各獨立地經取代基置換。典型取代基包括(但不限於)-X、-R、-O-、-OR、-SR、-S-、-NR2、-NR3、=NR、-CX3、-CN、-OCN、-SCN、-N=C=O、-NCS、-NO、-NO2、=N2、-N3、NC(=O)R、-C(=O)R、-C(=O)NR2、-SO3 -、-SO3H、-S(=O)2R、-OS(=O)2OR、-S(=O)2NR、-S(=O)R、-OP(=O)(OR)2、-P(=O)(OR)2、-PO- 3、-PO3H2、-C(=O)R、-C(=O)X、-C(=S)R、-CO2R、-CO2 -、-C(=S)OR、-C(=O)SR、-C(=S)SR、-C(=O)NR2、-C(=S)NR2、-C(=NR)NR2，其中各X獨立地為鹵素：F、Cl、Br或I；且各R獨立地為-H、C2-C18烷基、C6-C20芳基、C3-C14雜環、保護基或前藥部分。如上所述之伸烷基、伸烯基及伸炔基亦可類似地經取代。
「雜芳基」及「雜環」係指其中一或多個環原子為雜原子，例如氮、氧及硫之環系統。雜環自由基包含3至20個碳原子及1至3個選自N、O、P及S之雜原子。雜環可為具有3至7個環成員之單環(2至6個碳原子及1至3個選自N、O、P及S之雜原子)或具有7至10個環成員之雙環(4至9個碳原子及1至3個選自N、O、P及S之雜原子)，例如：雙環[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系統。
示例性雜環描述於例如Paquette,Leo A.,「Principles of Modern Heterocyclic Chemistry」(W.A.Benjamin,New York,1968)，尤其章節1、3、4、6、7及9；「The Chemistry of Heterocyclic Compounds,A series of Monographs」(John Wiley & Sons,New York,1950至今)，尤其第13、14、16、19及28卷；及J.Am.Chem.Soc.(1960)82：5566。
雜環之實例包括(作為實例而非限制)吡啶基、二氫吡啶基、四氫吡啶基(哌啶基)、噻唑基、四氫噻吩基、硫氧化四氫噻吩基、嘧啶 基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、四唑基、苯并呋喃基、噻萘基、吲哚基、吲哚烯基、喹啉基、異喹啉基、苯并咪唑基、哌啶基、4-哌啶酮基、吡咯啶基、2-吡咯啶酮基、吡咯啉基、四氫呋喃基、雙四氫呋喃基、四氫哌喃基、雙四氫哌喃基、四氫喹啉基、四氫異喹啉基、十氫喹啉基、八氫異喹啉基、吖辛因基、三嗪基、6H-1,2,5-噻二嗪基、2H,6H-1,5,2-二噻嗪基、噻吩基、噻嗯基、哌喃基、異苯并呋喃基、烯基、基、啡噁噻基、2H-吡咯基、異噻唑基、異噁唑基、吡嗪基、噠嗪基、吲哚嗪基、異吲哚基、3H-吲哚基、1H-吲唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、酞嗪基、啶基、喹喏啉基、喹唑啉基、啉基、喋啶基、4aH-咔唑基、咔唑基、β-咔啉基、啡啶基、吖啶基、嘧啶基、啡啉基、啡嗪基、啡噻嗪基、呋呫基、啡噁嗪基、異烷基、烷基、咪唑啶基、咪唑啉基、吡唑啶基、吡唑啉基、哌嗪基、吲哚啉基、異吲哚啉基、啶基、嗎啉基、噁唑啶基、苯并三唑基、苯并異噁唑基、羥吲哚基、苯并噁唑啉基及靛紅醯基。
作為實例而非限制，碳鍵結之雜環鍵結在吡啶之位置2、3、4、5或6處、噠嗪之位置3、4、5或6處、嘧啶之位置2、4、5或6處、吡嗪環之位置2、3、5或6處、呋喃、四氫呋喃、硫代呋喃、噻吩、吡咯或四氫吡咯之位置2、3、4或5處、噁唑、咪唑或噻唑之位置2、4或5處、異噁唑、吡唑或異噻唑之位置3、4或5處、氮丙啶之位置2或3處、氮雜環丁烷之位置2、3或4處、喹啉之位置2、3、4、5、6、7或8處或異喹啉之位置1、3、4、5、6、7或8處。更通常，碳鍵結之雜環包括2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、5吡啶基、6-吡啶基、3-噠嗪基、4-噠嗪基、5-噠嗪基、6-噠嗪基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基、6-嘧啶基、2-吡嗪基、3-吡嗪基、5-吡嗪基、6-吡嗪基、2-噻唑基、4-噻唑基或5-噻唑基。
作為實例而非限制，氮鍵結之雜環鍵結在氮丙啶、氮雜環丁 烷、吡咯、吡咯啶、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑啶、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、吲哚啉、1H-吲唑之位置1處、異吲哚或異吲哚啉之位置2處、嗎啉之位置4處及咔唑或β-咔啉之位置9處。更通常，氮鍵結之雜環包括1-氮丙啶、1-氮雜環丁烷基、1-吡咯基、1-咪唑基、1-吡唑基及1-哌啶基。
「C3-C8雜環」係指其中一至四個環碳原子獨立地經來自由O、S及N組成之群之雜原子置換的芳族或非芳族C3-C8碳環。C3-C8雜環之代表性實例包括(但不限於)苯并呋喃基、苯并噻吩、吲哚基、苯并吡唑基、香豆素基、異喹啉基、吡咯基、噻吩基、呋喃基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、三唑基、喹啉基、嘧啶基、吡啶基、吡啶酮基、吡嗪基、噠嗪基、異噻唑基、異噁唑基及四唑基。C3-C8雜環可未經取代或經至多七個包括(但不限於)以下各基之基團取代：-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2及-CN；其中各R'獨立地選自H、-C1-C8烷基及芳基。
「C3-C8雜環基」係指如上文所定義之C3-C8雜環基，其中雜環氫原子之一經一鍵置換。C3-C8雜環基可未經取代或經至多六個包括(但不限於)以下各基之基團取代：-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2及-CN；其中各R'獨立地選自H、-C1-C8烷基及芳基。
「C3-C20雜環」係指其中一至四個環碳原子獨立地經來自由O、S及N組成之群之雜原子置換的芳族或非芳族C3-C8碳環。C3-C20雜環可 未經取代或經至多七個包括(但不限於)以下各基之基團取代：-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2及-CN；其中各R'獨立地選自H、-C1-C8烷基及芳基。
「C3-C20雜環基」係指如上文所定義之C3-C20雜環基團，其中雜環氫原子之一經一鍵置換。
「碳環」意謂作為單環，具有3至7個碳原子或作為雙環，具有7至12個碳原子之飽和或不飽和環。單環碳環具有3至6個環原子，更通常具有5或6個環原子。雙環碳環具有7至12個環原子，例如配置為雙環[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系統，或9或10個環原子，配置為雙環[5,6]或[6,6]。單環碳環之實例包括環丙基、環丁基、環戊基、1-環戊-1-烯基、1-環戊-2-烯基、1-環戊-3-烯基、環己基、1-環己-1-烯基、1-環己-2-烯基、1-環己-3-烯基、環庚基及環辛基。
「C3-C8碳環」為3、4、5、6、7或8員飽和或不飽和非芳族碳環。代表性C3-C8碳環包括(但不限於)-環丙基、-環丁基、-環戊基、-環戊二烯基、-環己基、-環己烯基、-1,3-環己二烯基、-1,4-環己二烯基、-環庚基、-1,3-環庚二烯基、-1,3,5-環庚三烯基、-環辛基及-環辛二烯基。C3-C8碳環基可未經取代或經一或多個包括(但不限於)以下各基之基團取代：-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2及-CN；其中各R'獨立地選自H、-C1-C8烷基及芳基。
「C3-C8碳環基」係指如上文所定義之C3-C8碳環基團，其中碳環氫原子之一經一鍵置換。
「連接子」係指包含共價附接抗體於藥物部分之共價鍵或原子 鏈的化學部分。在各種實施例中，連接子包括二價自由基，諸如烷二基、芳二基、雜芳二基、諸如-(CR2)nO(CR2)n-之部分、烷基氧基(例如聚伸乙基氧基、PEG、聚亞甲基氧基)及烷胺基(例如聚伸乙基胺基、JeffamineTM)之重複單元以及二酸酯及醯胺，包括丁二酸酯、順丁烯二醯胺、二乙醇酸酯、丙二酸酯及己醯胺。在各種實施例中，連接子可包含一或多個胺基酸殘基，諸如纈胺酸、苯丙胺酸、離胺酸及高離胺酸。
術語「對掌性」係指具有鏡像搭配物之非重疊性特性的分子，而術語「非對掌性」係指在其鏡像搭配物上可重疊之分子。
術語「立體異構體」係指具有一致的化學構成但在原子或基團在空間中之配置方面不同的化合物。
「非對映異構體」係指具有兩個或兩個以上對掌性中心且其分子並不互為鏡像之立體異構體。非對映異構體具有不同物理特性，例如熔點、沸點、光譜特性及反應性。可在諸如電泳及層析之高解析度分析程序下分離非對映異構體之混合物。
「對映異構體」係指化合物之兩個互為不可重疊鏡像的立體異構體。
本文中使用之立體化學定義及慣例一般遵循S.P.Parker編輯，McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill Book Company,New York；及Eliel,E.及Wilen,S.,Stereochemistry of Organic Compounds(1994)John Wiley & Sons,Inc.,New York。許多有機化合物以光學活性形式存在，亦即其能夠使平面偏振光之平面旋轉。在對光學活性化合物之描述中，使用前綴D及L或R及S表示分子圍繞其對掌性中心之絕對組態。採用前綴d及l或(+)及(-)指明平面偏振光由化合物引起旋轉之跡象，其中(-)或l意謂化合物為左旋的。具有前綴(+)或d之化合物為右旋的。對於既定化學結構，此等立體異構 體為一致的，例外之處在於其互為鏡像。特定立體異構體亦可稱為對映異構體，且此類異構體之混合物通常稱為對映異構體混合物。對映異構體之50：50混合物稱為外消旋混合物或外消旋體，其可在化學反應或製程中尚未具有立體選擇或立體特異性時出現。術語「外消旋混合物」及「外消旋體」係指兩種對映異構物質之等莫耳混合物，其缺乏光學活性。
「離去基」係指可經另一官能基取代之官能基。某些離去基為此項技術中熟知，且實例包括(但不限於)鹵基(例如氯基、溴基、碘基)、甲烷磺醯基(甲磺醯基)、對甲苯磺醯基(甲苯磺醯基)、三氟甲基磺醯基(三氟甲磺酸酯基)及三氟甲基磺酸酯基。
術語「保護基」係指通常用以阻斷或保護特定官能基同時使化合物上之其他官能基反應的取代基。舉例而言，「胺基保護基」為附接於胺基，阻斷或保護化合物中之胺基官能基之取代基。適合胺基保護基包括(但不限於)乙醯基、三氟乙醯基、第三丁氧羰基(BOC)、苯甲氧羰基(CBZ)及9-茀基亞甲氧基羰基(Fmoc)。關於保護基及其使用之一般描述，參見T.W.Greene,Protective Groups in Organic Synthesis,John Wiley & Sons,New York,1991或隨後版本。
II.組合物及方法
在一個態樣中，本發明部分基於結合於CLL-1之抗體及包含此類抗體之免疫結合物。本發明之抗體及免疫結合物適用於例如診斷或治療CLL-1陽性癌症。
本發明提供抗-CLL-1抗體及免疫結合物以及其使用方法。
本文提供分離之單株抗-CLL-1抗體，其中該抗體結合包含SEQ ID NO：49之胺基酸的抗原決定基及/或結合重疊抗原決定基且不結合包含SEQ ID NO：50及/或SEQ ID NO：51之抗原決定基。在一些實施例中，抗-CLL-1抗體結合包含SEQ ID NO：49之胺基酸的抗原決定基。 在一些實施例中，抗-CLL-1抗體結合由SEQ ID NO：49之胺基酸組成或基本上由其組成之抗原決定基。在一些實施例中，抗原決定基藉由羥基自由基足跡分析法確定。在一些實施例中，如藉由羥基自由基足跡分析法所確定的抗原決定基具有超過約1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0任一者之[抗原速率常數]/[抗原與抗體複合物速率常數]比率。在一些實施例中，如藉由羥基自由基足跡分析法所確定的抗原決定基具有超過約2.0之[抗原速率常數]/[抗原與抗體複合物速率常數]比率。
羥基自由基足跡分析法可如實例中所述進行。舉例而言，在Brookhaven國家實驗室使用X28c光束線將樣品暴露於羥基自由基達0、10、15及20毫秒(ms)之時間間隔。經標記之樣品可使用PNG酶F去糖基化。樣品可使用含三氯乙酸之丙酮沈澱，且進行LC-MS分析。接著樣品可進行還原及烷基化，使用胰蛋白酶消化，接著液相層析連同高解析度質譜分析(LC-MS)。可使用ProtMapMS分析MS資料，產生各肽之劑量反應曲線。游離抗原之結果可針對各複合物形式比較。基於同源性之抗原模型可使用Swiss-Model軟體產生且可定位三個複合物中之每一者的溶劑保護區。可萃取所選離子層析圖(SIC)且針對肽離子之未氧化及所有氧化形式(具有特定m/z)積分。此等峰面積值可用於以劑量反應(DR)曲線圖形式表徵反應動力學，其量測完整肽隨著羥基自由基暴露之喪失。相較於游離抗原，複合物中之溶劑保護區經歷逐漸氧化反應，且氧化速率(稱為速率常數，RC)之差異可用來突出抗原決定基之位置。
在任一抗體之一些實施例中，抗體結合於重組人類CLL-1。在任一抗體之一些實施例中，抗體結合於重組食蟹獼猴CLL-1。在任一抗體之一些實施例中，抗體結合於人類周邊血液單核細胞(PBMC)之表面上的內源性CLL-1。在任一抗體之一些實施例中，抗體結合於食蟹 獼猴PBMC之表面上的內源性CLL-1。在任一抗體之一些實施例中，抗體結合於癌細胞表面上之內源性CLL-1。在任一抗體之一些實施例中，抗體結合於AML癌細胞表面上之內源性CLL-1。在任一抗體之一些實施例中，抗體結合於HL-60細胞之表面上的內源性CLL-1。在任一抗體之一些實施例中，抗體結合於EOL-1細胞表面上之內源性CLL-1。在任一抗體之一些實施例中，抗體結合於包含K244Q突變之CLL-1(具有K244Q之SEQ ID NO：1)。在任一抗體之一些實施例中，抗體結合包含SEQ ID NO：49之胺基酸的抗原決定基及/或結合重疊抗原決定基。在任一抗體之一些實施例中，抗體不結合包含SEQ ID NO：50及/或SEQ ID NO：51之抗原決定基。在任一抗體之一些實施例中，抗體與R&D System純系687317抗體競爭結合人類CLL-1。在任一抗體之一些實施例中，抗體以小於15nM、小於10nM、小於7nM、小於5nM或小於3nM之Kd結合於內源性人類CLL-1。在任一抗體之一些實施例中，抗體以小於10nM、小於7nM、小於5nM或小於3nM之Kd結合於重組人類CLL-1。在任一抗體之一些實施例中，抗體以小於10nM、小於7nM、小於5nM或小於3nM、小於2nM或小於1nM之Kd結合於重組食蟹獼猴CLL-1。
在一些實施例中，抗體之特徵如本文在以下實例中所述測定。
抗體6E7及其他實施例
在一些實施例中，本發明提供一種抗-CLL-1抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下各者之HVR：(a)包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列之HVR-L3。在一些實施例中，包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之 HVR-H2。在一些實施例中，HVR-H2包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列。在一些實施例中，HVR-H2包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列。在一些實施例中，HVR-H2包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列。在一些實施例中，HVR-H2包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-H3。在一個實施例中，該抗體含有包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-H3。在另一個實施例中，該抗體含有包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-H3及包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列之HVR-L3。在另一個實施例中，該抗體含有包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列之HVR-L3及包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列之HVR-H2。在另一個實施例中，該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-H3。在一些實施例中，HVR-H2包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列。在一些實施例中，HVR-H2包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列。在一些實施例中，HVR-H2包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列。在一些實施例中，HVR-H2包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列。在一些實施例中，HVR-H2包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列之HVR-L3。在一個實施例中，該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-L1； (b)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個態樣中，本發明之抗體包含(a)包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VH HVR序列的VH域：(i)包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包含選自SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-H3；及(b)包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VL HVR序列的VL域：(i)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-L2，及(c)包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列之HVR-L3。在一些實施例中，該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列之HVR-L3。在一些實施例中，該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列之HVR-L3。在一些實施例中，該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列之 HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列之HVR-L3。在一些實施例中，該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列之HVR-L3。在一些實施例中，該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列之HVR-L3。
在任一以上實施例中，抗-CLL-1抗體人類化。在一個實施例中，抗-CLL-1抗體包含如任一以上實施例中之HVR且進一步包含人類接受體構架，例如人類免疫球蛋白構架或人類共同構架。在某些實施例中，人類接受體構架為人類VLκI共同(VLKI)構架及/或VH構架VH1。在某些實施例中，人類接受體構架為包含任一以下突變之人類VLκI共同(VLKI)構架及/或VH構架VH1。
在另一個態樣中，抗-CLL-1抗體包含與SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：46及/或SEQ ID NO：48之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的重鏈可變域(VH)序列。在某些實施例中，與SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：46及/或SEQ ID NO：48之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VH序列相對於參 考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗-CLL-1抗體保留結合於CLL-1之能力。在某些實施例中，SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：46及/或SEQ ID NO：48中總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：46及/或SEQ ID NO：48中總計1至5個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR外部區域中(亦即在FR中)。視情況，抗-CLL-1抗體包含SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33及/或SEQ ID NO：34之VH序列，包括該序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，VH包含一個、兩個或三個選自以下各者之HVR：(a)包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列之HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列之HVR-H2，及(c)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-H3。在一些實施例中，HVR-H2包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列。在一些實施例中，HVR-H2包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列。在一些實施例中，HVR-H2包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列。在一些實施例中，HVR-H2包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列。在一些實施例中，HVR-H2包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列。
在另一個態樣中，提供一種抗-CLL-1抗體，其中該抗體包含與SEQ ID NO：30及/或SEQ ID NO：32之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的輕鏈可變域(VL)。在某些實施例中，與SEQ ID NO：30及/或SEQ ID NO：32之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VL序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗-CLL-1抗體保留結合於CLL-1之能力。在某些實施例中，SEQ ID NO：30及/或SEQ ID NO：32中總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實 施例中，SEQ ID NO：30及/或SEQ ID NO：32中總計1至5個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR外部區域中(亦即在FR中)。視情況，抗-CLL-1抗體包含SEQ ID NO：30及/或SEQ ID NO：32之VL序列，包括該序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，VL包含一個、兩個或三個選自以下各者之HVR：(a)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個態樣中，提供一種抗-CLL-1抗體，其中該抗體包含如以上提供之任一實施例中之VH及如以上提供之任一實施例中之VL。
在一個實施例中，該抗體分別包含SEQ ID NO：31及SEQ ID NO：30中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體分別包含SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：32中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體分別包含SEQ ID NO：34及SEQ ID NO：33中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO：46及SEQ ID NO：33中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO：48及SEQ ID NO：33中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。
在另一個態樣中，本文提供與本文提供之抗-CLL-1抗體結合於相同抗原決定基之抗體。舉例而言，在某些實施例中，提供與包含分別SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：46及/或SEQ ID NO：48之VH序列及SEQ ID NO：30及/或SEQ ID NO：32之VL序列的抗-CLL-1抗體結合於相同抗原決定基之抗體。
本文提供含有包含如圖2A中所描繪之根據Kabat編號的HVR1-LC、HVR2-LC及HVR3-LC之輕鏈可變結構域及包含如圖2B中所描繪 之根據Kabat編號的HVR1-HC、HVR2-HC及HVR3-HC之重鏈可變域的抗體。在一些實施例中，抗體含有包含如圖2A中所描繪之HVR1-LC、HVR2-LC及/或HVR3-LC序列及FR1-LC、FR2-LC、FR3-LC及/或FR4-LC序列的輕鏈可變域。在一些實施例中，抗體含有包含如圖2B中所描繪之HVR1-HC、HVR2-HC及/或HVR3-HC序列及FR1-HC、FR2-HC、FR3-HC及/或FR4-HC序列的重鏈可變域。
在本發明之另一態樣中，根據任一以上實施例之抗-CLL-1抗體為單株抗體，包括人類抗體。在一個實施例中，抗-CLL-1抗體為抗體片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、雙功能抗體或F(ab')2片段。在另一實施例中，抗體為實質上全長抗體，例如IgG1抗體、IgG2a抗體或如本文所定義之其他抗體類別或同型。
抗體20B1及其他實施例
在一些實施例中，本發明提供一種抗-CLL-1抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下各者之HVR：(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-L3。
在一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-H3。在一個實施例中，該抗體含有包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-H3。在另一個實施例中，該抗體含有包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-H3及包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-L3。在另一個實 施例中，該抗體含有包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-L3及包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-H2。在另一個實施例中，該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-H3。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-L3。在一個實施例中，該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個態樣中，本發明之抗體包含(a)包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VH HVR序列的VH域：(i)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包含選自SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-H3；及(b)包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VL HVR序列的VL域：(i)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L2，及(c)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-L3。在一些實施例中，該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序 列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-L3。
在任一以上實施例中，抗-CLL-1抗體人類化。在一個實施例中，抗-CLL-1抗體包含如任一以上實施例中之HVR且進一步包含人類接受體構架，例如人類免疫球蛋白構架或人類共同構架。在某些實施例中，人類接受體構架為人類VLκI共同(VLKI)構架及/或VH構架VH1。在某些實施例中，人類接受體構架為包含任一以下突變之人類VLκI共同(VLKI)構架及/或VH構架VH1。
在另一個態樣中，提供一種抗-CLL-1抗體，其中該抗體包含如以上提供之任一實施例中之VH及如以上提供之任一實施例中之VL。
在一個實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO：36及SEQ ID NO：35中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。
在另一個態樣中，本文提供與本文提供之抗-CLL-1抗體結合於相同抗原決定基之抗體。舉例而言，在某些實施例中，提供與包含分別SEQ ID NO：36之VH序列及SEQ ID NO：35之VL序列的抗-CLL-1抗體結合於相同抗原決定基之抗體。
本文提供含有包含如圖1A中所描繪之根據Kabat編號的HVR1-LC、HVR2-LC及HVR3-LC之輕鏈可變結構域及包含如圖1B中所描繪之根據Kabat編號的HVR1-HC、HVR2-HC及HVR3-HC之重鏈可變域的抗體。
在本發明之另一態樣中，根據任一以上實施例之抗-CLL-1抗體為單株抗體，包括人類抗體。在一個實施例中，抗-CLL-1抗體為抗體片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、雙功能抗體或F(ab')2片段。在另一實施例中，抗體為實質上全長抗體，例如IgG1抗體、IgG2a抗體或如 本文所定義之其他抗體類別或同型。
抗體21C9及其他實施例
在一些實施例中，本發明提供一種抗-CLL-1抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下各者之HVR：(a)包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列之HVR-L3。
在一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H3。在一個實施例中，該抗體含有包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H3。在另一個實施例中，該抗體含有包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H3及包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列之HVR-L3。在另一個實施例中，該抗體含有包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列之HVR-L3及包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-H2。在另一個實施例中，該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H3。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列之HVR-L3。在一個實施例中，該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR- L1；(b)包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個態樣中，本發明之抗體包含(a)包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VH HVR序列的VH域：(i)包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包含選自SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H3；及(b)包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VL HVR序列的VL域：(i)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列之HVR-L2，及(c)包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列之HVR-L3。在一些實施例中，該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列之HVR-L3。
在任一以上實施例中，抗-CLL-1抗體人類化。在一個實施例中，抗-CLL-1抗體包含如任一以上實施例中之HVR且進一步包含人類接受體構架，例如人類免疫球蛋白構架或人類共同構架。在某些實施例中，人類接受體構架為人類VLκI共同(VLKI)構架及/或VH構架VH1。在某些實施例中，人類接受體構架為包含任一以下突變之人類VLκI共同(VLKI)構架及/或VH構架VH1。
在另一個態樣中，抗-CLL-1抗體包含與SEQ ID NO：38及/或SEQ ID NO：40之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的重鏈可變域(VH)序列。在某些實施例中，與SEQ ID NO：38及/或SEQ ID NO：40之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VH序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗-CLL-1抗體保留結合於CLL-1之能力。在某些實施例中，SEQ ID NO：38及/或SEQ ID NO：40中總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，SEQ ID NO：38及/或SEQ ID NO：40中總計1至5個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR外部區域中(亦即在FR中)。視情況，抗-CLL-1抗體包含SEQ ID NO：38及/或SEQ ID NO：40之VH序列，包括該序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，VH包含一個、兩個或三個選自以下各者之HVR：(a)包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列之HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-H2，及(c)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H3。
在另一個態樣中，提供一種抗-CLL-1抗體，其中該抗體包含與SEQ ID NO：37及/或SEQ ID NO：39之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的輕鏈可變域(VL)。在某些實施例中，與SEQ ID NO：37及/或SEQ ID NO：39之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VL序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗-CLL-1抗體保留結合於CLL-1之能力。在某些實施例中，SEQ ID NO：37及/或SEQ ID NO：39中總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，SEQ ID NO：37及/或SEQ ID NO：39中總計1至5個胺基酸已經 取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR外部區域中(亦即在FR中)。視情況，抗-CLL-1抗體包含SEQ ID NO：37及/或SEQ ID NO：39之VL序列，包括該序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，VL包含一個、兩個或三個選自以下各者之HVR：(a)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個態樣中，提供一種抗-CLL-1抗體，其中該抗體包含如以上提供之任一實施例中之VH及如以上提供之任一實施例中之VL。
在一個實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO：38及SEQ ID NO：37中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO：40及SEQ ID NO：39中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。
在另一個態樣中，本文提供與本文提供之抗-CLL-1抗體結合於相同抗原決定基之抗體。舉例而言，在某些實施例中，提供與包含分別SEQ ID NO：38及/或SEQ ID NO：40之VH序列及SEQ ID NO：37及/或SEQ ID NO：39之VL序列的抗-CLL-1抗體結合於相同抗原決定基之抗體。
本文提供含有包含如圖3A中所描繪之根據Kabat編號的HVR1-LC、HVR2-LC及HVR3-LC之輕鏈可變結構域及包含如圖3B中所描繪之根據Kabat編號的HVR1-HC、HVR2-HC及HVR3-HC之重鏈可變域的抗體。在一些實施例中，抗體含有包含如圖3A中所描繪之HVR1-LC、HVR2-LC及/或HVR3-LC序列及FR1-LC、FR2-LC、FR3-LC及/或FR4-LC序列的輕鏈可變結構域。在一些實施例中，抗體含有包含如圖3B中所描繪之HVR1-HC、HVR2-HC及/或HVR3-HC序列及FR1-HC、FR2-HC、FR3-HC及/或FR4-HC序列的重鏈可變域。
在本發明之另一態樣中，根據任一以上實施例之抗-CLL-1抗體為單株抗體，包括人類抗體。在一個實施例中，抗-CLL-1抗體為抗體片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、雙功能抗體或F(ab')2片段。在另一實施例中，抗體為實質上全長抗體，例如IgG1抗體、IgG2a抗體或如本文所定義之其他抗體類別或同型。
抗體28H12及其他實施例
在一些實施例中，本發明提供一種抗-CLL-1抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下各者之HVR：(a)包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列之HVR-L3。
在一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列之HVR-H3。在一個實施例中，該抗體含有包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列之HVR-H3。在另一個實施例中，該抗體含有包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列之HVR-H3及包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列之HVR-L3。在另一個實施例中，該抗體含有包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列之HVR-L3及包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列之HVR-H2。在另一個實施例中，該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列之HVR-H3。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至 少兩個或全部三個選自以下各者之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列之HVR-L3。在一個實施例中，該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個態樣中，本發明之抗體包含(a)包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VH HVR序列的VH域：(i)包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包含選自SEQ ID NO：29之胺基酸序列之HVR-H3；及(b)包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VL HVR序列的VL域：(i)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列之HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-L2，及(c)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列之HVR-L3。在一些實施例中，該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列之HVR-L3。
在任一以上實施例中，抗-CLL-1抗體人類化。在一個實施例中，抗-CLL-1抗體包含如任一以上實施例中之HVR且進一步包含人類 接受體構架，例如人類免疫球蛋白構架或人類共同構架。在某些實施例中，人類接受體構架為人類VLκI共同(VLKI)構架及/或VH構架VH1。在某些實施例中，人類接受體構架為包含任一以下突變之人類VLκI共同(VLKI)構架及/或VH構架VH1。
在另一個態樣中，提供一種抗-CLL-1抗體，其中該抗體包含如以上提供之任一實施例中之VH及如以上提供之任一實施例中之VL。
在一個實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO：42及SEQ ID NO：41中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。
在另一個態樣中，本文提供與本文提供之抗-CLL-1抗體結合於相同抗原決定基之抗體。舉例而言，在某些實施例中，提供與包含分別SEQ ID NO：42之VH序列及SEQ ID NO：41之VL序列之抗-CLL-1抗體結合於相同抗原決定基之抗體。
本文提供含有包含如圖1A中所描繪之根據Kabat編號的HVR1-LC、HVR2-LC及HVR3-LC之輕鏈可變結構域及包含如圖1B中所描繪之根據Kabat編號的HVR1-HC、HVR2-HC及HVR3-HC之重鏈可變域的抗體。
在本發明之另一態樣中，根據任一以上實施例之抗-CLL-1抗體為單株抗體，包括人類抗體。在一個實施例中，抗-CLL-1抗體為抗體片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、雙功能抗體或F(ab')2片段。在另一實施例中，抗體為實質上全長抗體，例如IgG1抗體、IgG2a抗體或如本文所定義之其他抗體類別或同型。
在另一態樣中，根據任一以上實施例之抗-CLL-1抗體可合併如以下所述之單一或組合之任一特徵。
1.抗體親和力
在某些實施例中，本文提供之抗體的解離常數(Kd)1μM、100nM、50nM、10nM、5nM、1nM、0.1nM、0.01nM 或0.001nM且視情況可10-13M(例如10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。
在一個實施例中，Kd藉由放射性標記之抗原結合分析(RIA)量測，該分析利用相關抗體之Fab型式及其抗原，如藉由以下分析所述進行。Fab對抗原之溶液結合親和力藉由在一系列滴定未標記抗原存在下使Fab與最低濃度之(125I)-標記抗原平衡，接著用抗-Fab抗體塗佈之盤捕捉結合抗原來量測(參見例如Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999))。為確定分析條件，將MICROTITER®多孔盤(Thermo Scientific)用50mM碳酸鈉(pH 9.6)中之5μg/ml捕捉抗-Fab抗體(Cappel Labs)塗佈隔夜，且隨後在室溫(約23℃)下用PBS中之2%(w/v)牛血清白蛋白阻斷2至5小時。在無吸附劑盤(Nunc #269620)中，將100pM或26pM[125I]抗原與相關Fab之連續稀釋液混合(例如與抗-VEGF抗體Fab-12之評估一致，Presta等人，Cancer Res.57：4593-4599(1997))。接著將相關Fab培育隔夜；然而，培育可持續較長時間段(例如約65小時)以保證達到平衡。此後，將混合物轉移至捕捉盤中以在室溫下培育(例如一小時)。隨後移除溶液且用含0.1%聚山梨醇酯20(TWEEN-20®)之PBS洗滌盤八次。當盤乾燥時，添加150微升/孔之閃爍體(MICROSCINT-20TM；Packard)，且在TOPCOUNTTM γ計數器(Packard)上對盤計數10分鐘。選擇提供小於或等於最大結合20%之各Fab的濃度用於競爭性結合分析。
根據另一個實施例，Kd使用表面電漿共振分析，使用BIACORE®-2000、BAICORE®-T200或BIACORE®-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)，在25℃下，利用固定抗原CM5晶片，在約10反應單位(RU)下量測。簡言之，根據供應商說明書，以N-乙基-N'-(3-二甲胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物感測器晶片(CM5,BIACORE,Inc.)。抗原用10mM乙 酸鈉pH 4.8及/或HBS-P(0.01M Hepes pH7.4、0.15M NaCl、0.005%界面活性劑P20)稀釋至5μg/ml(約0.2μM)，隨後在5微升/分鐘及/或30微升/分鐘之流動速率下注射以獲得大約10個反應單位(RU)之偶合蛋白。在抗原注射後，注射1M乙醇胺以阻斷未反應之基團。關於動力學量測，在25℃下，以約25μl/min之流動速率注射於含0.05%聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)界面活性劑之PBS(PBST)中之Fab兩倍連續稀釋液(0.78nM至500nM)。使用簡單的一比一朗格繆爾結合模型(one-to-one Langmuir binding model)(BIACORE®評估軟體3.2版)，藉由同時擬合結合及解離感測圖譜來計算締合速率(kon)及解離速率(koff)。平衡解離常數(Kd)係依比率koff/kon計算。參見例如Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999)。若藉由以上表面電漿共振分析測定之締合速率超過106M-1s-1，則締合速率可使用螢光淬滅技術量測，該技術在如光譜儀(諸如具有攪拌式光析槽之止流裝備型分光光度計(Aviv Instruments)或8000-系列SLM-AMINCOTM分光光度計(ThermoSpectronic))中所量測之濃度增加之抗原存在下，量測在25℃下PBS中之20nM抗-抗原抗體(Fab形式)(pH 7.2)之螢光發射強度(激發=295nm；發射=340nm，16nm帶通)之增加或減少。
2.抗體片段
在某些實施例中，本文所提供之抗體為抗體片段。抗體片段包括(但不限於)Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv及scFv片段以及下文描述之其他片段。關於某些抗體片段之綜述，參見Hudson等人Nat.Med.9：129-134(2003)。關於scFv片段之評述，參見例如Pluckthün,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編輯，(Springer-Verlag,New York)，第269-315頁(1994)；亦參見WO 93/16185；以及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。關於包含救助受體結合抗原決定基殘基及具有延長之活體內半衰期之Fab 及F(ab')2片段的論述，參見美國專利第5,869,046號。
雙功能抗體為可為二價或雙特異性之具有兩個抗原結合位點之抗體片段。參見例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)；及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。三功能抗體及四功能抗體亦描述於Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)。
單域抗體為包含抗體之重鏈可變域全部或一部分或輕鏈可變域全部或一部分的抗體片段。在某些實施例中，單域抗體為人類單域抗體(Domantis,Inc.,Waltham,MA；參見例如美國專利第6,248,516 B1號)。
抗體片段可藉由各種技術製得，包括(但不限於)蛋白分解消化完整抗體以及藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌或噬菌體)產生，如本文所描述。
3.嵌合及人類化抗體
在某些實施例中，本文所提供之抗體為嵌合抗體。某些嵌合抗體描述於例如美國專利第4,816,567號；及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851-6855(1984))中。在一個實例中，嵌合抗體包含非人類可變區(例如來源於小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人類靈長類動物(諸如猴)之可變區)及人類恆定區。在另一實例中，嵌合抗體為「類別轉換」抗體，其中類別或子類別已自親本抗體之類別或子類別改變。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
在某些實施例中，嵌合抗體為人類化抗體。通常，對非人類抗體進行人類化以降低對人類之免疫原性，同時保留親本非人類抗體之特異性及親和力。一般而言，人類化抗體包含一或多個可變域，其中HVR，例如CDR(或其部分)來源於非人類抗體，且FR(或其部分)來源於人類抗體序列。人類化抗體視情況亦包含人類恆定區之至少一部 分。在一些實施例中，人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如HVR殘基所來源之抗體)之相應殘基取代以例如恢復或提高抗體特異性或親和力。
人類化抗體及其製造方法綜述於例如Almagro及Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008)，且進一步描述於例如Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；Queen等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)；美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Kashmiri等人，Methods 36：25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28：489-498(1991)(描述「表面重修」)；Dall'Acqua等人，Methods 36：43-60(2005)(描述「FR改組」)；及Osbourn等人，Methods 36：61-68(2005)及Klimka等人，Br.J.Cancer,83：252-260(2000)(描述FR改組之「引導選擇」方法)。
可用於人類化之人類構架區包括(但不限於)：使用「最佳擬合」方法選擇之構架區(參見例如Sims等人J.Immunol.151：2296(1993))；來源於具有特定子群輕鏈或重鏈可變區之人類抗體的共同序列之構架區(參見例如Carter等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：4285(1992)；及Presta等人J.Immunol.,151：2623(1993))；人類成熟(體細胞突變)構架區或人類生殖系構架區(參見例如Almagro及Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008))；及來源於篩選FR文庫之構架區(參見例如Baca等人，J.Biol.Chem.272：10678-10684(1997)及Rosok等人，J.Biol.Chem.271：22611-22618(1996))。
4.人類抗體
在某些實施例中，本文所提供之抗體為人類抗體。可使用此項技術中已知之各種技術來產生人類抗體。人類抗體一般描述於van Dijk及van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5：368-74(2001)及 Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20：450-459(2008)。
人類抗體可藉由將免疫原投與已經修飾以回應於抗原攻擊而產生完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體的轉殖基因動物來製備。此類動物通常含有人類免疫球蛋白基因座的全部或一部分，其置換內源性免疫球蛋白基因座，或存在於染色體外或隨機整合至動物染色體中。在此類轉殖基因小鼠中，內源性免疫球蛋白基因座一般已不活化。關於自轉殖基因動物獲得人類抗體之方法的綜述，參見Lonberg,Nat.Biotech.23：1117-1125(2005)。亦參見例如美國專利第6,075,181號及第6,150,584號，描述XENOMOUSETM技術；美國專利第5,770,429號，描述HUMAB®技術；及美國專利第7,041,870號，描述K-M MOUSE®技術及美國專利申請公開案第US 2007/0061900號，描述VELOCIMOUSE®技術)。藉由此類動物產生之來自完整抗體之人類可變區可例如藉由與不同人類恆定區組合而經進一步修飾。
人類抗體亦可藉由基於融合瘤之方法製備。已描述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類雜骨髓瘤細胞株(參見例如Kozbor J.Immunol.,133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63頁(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；及Boerner等人，J.Immunol.,147：86(1991))。經由人類B細胞融合瘤技術產生之人類抗體亦描述於Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103：3557-3562(2006)中。其他方法包括例如描述於美國專利第7,189,826號(描述單株人類IgM抗體自融合瘤細胞株之產生)及Ni,Xiandai Mianyixue,26(4)：265-268(2006)(描述人類-人類融合瘤)中之方法。人類融合瘤技術(三源雜交瘤技術)亦描述於Vollmers及Brandlein,Histology and Histopathology,20(3)：927-937(2005)以及Vollmers及Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3)：185-91(2005)。
人類抗體亦可藉由分離選自人類衍生噬菌體呈現庫之Fv純系可變域序列產生。此類可變域序列接著可與所需人類恆定域組合。下文描述用於自抗體文庫選擇人類抗體之技術。
5.文庫衍生之抗體
本發明之抗體可藉由針對具有所需活性之抗體篩選組合文庫來分離。舉例而言，此項技術中已知多種方法用於產生噬菌體呈現文庫及針對具有所需結合特徵之抗體篩選此類文庫。此類方法綜述於例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178：1-37(O'Brien等人編輯，Human Press,Totowa,NJ,2001)且進一步描述於例如McCafferty等人，Nature 348：552-554；Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Marks及Bradbury,Methods in Molecular Biology 248：161-175(Lo編輯，Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；及Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004)。
在某些噬菌體呈現方法中，VH及VL基因之譜系分別藉由聚合酶鏈式反應(PCR)選殖且在噬菌體文庫中無規重組，接著可篩選抗原結合噬菌體，如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.,12：433-455(1994)中所述。噬菌體通常以單鏈Fv(scFv)片段或Fab片段形式呈現抗體片段。來自經免疫來源之文庫提供抗免疫原之高親和力抗體而無需構築融合瘤。或者，可選殖原始譜系(例如自人類)以提供抗各種非自體抗原以及自體抗原之抗體之單一來源而無需任何免疫接種，如Griffiths等人，EMBO J,12：725-734(1993)所述。最終，亦可以合成方式藉由自幹細胞選殖未經重排之V基因區段，且使用含有隨機序列之PCR引子以編碼高度可變CDR3區及實現活體外重排來製備原始文庫，如藉由 Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.,227：381-388(1992)描述。描述人類抗體噬菌體文庫之專利公開案包括例如：美國專利第5,750,373號及美國專利公開案第2005/0079574號、第2005/0119455號、第2005/0266000號、第2007/0117126號、第2007/0160598號、第2007/0237764號、第2007/0292936號及第2009/0002360號。
自人類抗體文庫分離之抗體或抗體片段在本文中視為人類抗體或人類抗體片段。
6.多特異性抗體
在某些實施例中，本文所提供之抗體為多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體為對至少兩個不同位點具有結合特異性之單株抗體。在某些實施例中，結合特異性中之一者係針對CLL-1且另一者係針對任何其他抗原。在某些實施例中，結合特異性中之一者係針對CLL-1且另一者係針對CD3。參見例如美國專利第5,821,337號。在某些實施例中，雙特異性抗體可結合於CLL-1之兩個不同抗原決定基。雙特異性抗體亦可用於使細胞毒性劑定位於表現CLL-1之細胞。雙特異性抗體可製備為全長抗體或抗體片段。在一些實施例中，多特異性抗體為對至少兩個不同位點具有結合特異性之單株抗體。
在一些實施例中，多特異性抗體為對至少兩個不同抗原結合位點具有結合特異性之單株抗體(諸如雙特異性抗體)。在一些實施例中，多特異性抗體之第一抗原結合域及第二抗原結合域可結合同一個分子內之兩個抗原決定基(分子內結合)。舉例而言，多特異性抗體之第一抗原結合域及第二抗原結合域可結合於同一CLL-1分子上之兩個不同抗原決定基。在某些實施例中，多特異性抗體結合之兩個不同抗原決定基為正常不同時藉由一種單特異性抗體(諸如習知抗體)或一種免疫球蛋白單一可變域結合的抗原決定基。在一些實施例中，多特異性抗體之第一抗原結合域及第二抗原結合域可結合位於兩個不同分子 內之抗原決定基(分子間結合)。舉例而言，多特異性抗體之第一抗原結合域可結合於一種CLL-1分子上之一種抗原決定基，而多特異性抗體之第二抗原結合域可結合於不同CLL-1分子上之另一抗原決定基，由此使兩個分子交聯。
在一些實施例中，多特異性抗體(諸如雙特異性抗體)之抗原結合域包含兩個VH/VL單元，其中第一VH/VL單元結合於第一抗原決定基且第二VH/VL單元結合於第二抗原決定基，其中各VH/VL單元包含重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)。此類多特異性抗體包括(但不限於)全長抗體、具有兩個或兩個以上VL及VH域之抗體及抗體片段(諸如Fab、Fv、dsFv、scFv、雙功能抗體、雙特異性雙功能抗體及三功能抗體、已共價或非共價連接之抗體片段)。進一步包含重鏈可變區至少一部分及/或輕鏈可變區至少一部分之VH/VL單元亦可稱為「臂」或「半聚體」或「半抗體」。在一些實施例中，半聚體包含足以允許與第二半聚體形成二硫鍵之重鏈可變區部分。在一些實施例中，半聚體包含杵突變或臼突變，例如以允許與包含互補臼突變或杵突變之第二半聚體或半抗體雜二聚。杵突變及臼突變在下文中進一步論述。
在某些實施例中，本文提供之多特異性抗體可為雙特異性抗體。如本文所用，術語「雙特異性抗體」係指包含能夠結合於一個分子上之兩個不同抗原決定基或能夠結合於兩個不同分子上之抗原決定基的抗原結合域的多特異性抗體。雙特異性抗體亦可在本文中稱為具有「雙重特異性」或「雙重特異性的」。示例性雙特異性抗體可結合CLL-1與任何其他抗原。在某些實施例中，結合特異性之一係針對CLL-1且另一係針對CD3。參見例如美國專利第5,821,337號。在某些實施例中，雙特異性抗體可結合於同一CLL-1分子之兩個不同抗原決定基。在某些實施例中，雙特異性抗體可結合於兩個不同CLL-1分子上之兩個不同抗原決定基。雙特異性抗體亦可用於將細胞毒性劑定位 至表現CLL-1之細胞。雙特異性抗體可製備為全長抗體或抗體片段。
用於製備多特異性抗體之技術包括(但不限於)具有不同特異性之兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之重組共表現(參見Milstein及Cuello,Nature 305：537(1983)，WO 93/08829及Traunecker等人，EMBO J.10：3655(1991))及「杵臼」工程改造(參見例如美國專利第5,731,168號、WO2009/089004、US2009/0182127、US2011/0287009，Marvin及Zhu,Acta Pharmacol.Sin.(2005)26(6)：649-658，及Kontermann(2005)Acta Pharmacol.Sin.,26：1-9)。如本文所用，術語「杵臼」或「KnH」技術係指活體外或活體內，藉由在相互作用界面處將突起(杵)引入一種多肽及空腔(臼)引入另一多肽中來指導兩個多肽配對在一起之技術。舉例而言，KnH已引入抗體之Fc：Fc結合界面、CL：CH1界面或VH/VL界面(參見例如US 2011/0287009、US2007/0178552、WO 96/027011、WO 98/050431以及Zhu等人，1997,Protein Science 6：781-788)。在一些實施例中，在製造多特異性抗體期間KnH驅動兩個不同重鏈配對在一起。舉例而言，在Fc區中具有KnH之多特異性抗體可進一步包含連接於各Fc區之單一可變域，或進一步包含與類似或不同輕鏈可變域配對之不同重鏈可變域。KnH技術亦可用於將兩個不同受體細胞外域配對在一起或配對包含不同標靶識別序列之任何其他多肽序列(例如包括親和抗體、肽體及其他Fc融合物)。
如本文所用，術語「杵突變」係指在多肽與另一多肽相互作用之界面處將突起(杵)引入多肽之突變。在一些實施例中，另一多肽具有臼突變。
如本文所用，術語「臼突變」係指在多肽與另一多肽相互作用之界面處將空腔(臼)引入多肽之突變。在一些實施例中，另一多肽具有杵突變。
以下提供簡單非限制性論述。
「突起」係指自第一多肽之界面伸出且因此可定位於相鄰界面(亦即第二多肽之界面)中之補償空腔以便穩定化雜多聚體且藉此促進例如雜多聚體形成而非均多聚體形成的至少一個胺基酸側鏈。突起可存在於原始界面或可以合成方式(例如藉由改變編碼界面之核酸)引入。在一些實施例中，編碼第一多肽之界面的核酸經改變以編碼突起。為實現此，編碼第一多肽之界面中之至少一個「原始」胺基酸殘基的核酸經編碼至少一個側鏈體積大於原始胺基酸殘基之「輸入」胺基酸殘基的核酸置換。應瞭解可存在一個以上原始及對應輸入殘基。各種胺基殘基之側鏈體積展示於例如US2011/0287009之表1。引入「突起」之突變可稱為「杵突變」。
在一些實施例中，用於形成突起之輸入殘基為選自精胺酸(R)、苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)及色胺酸(W)的天然存在之胺基酸殘基。在一些實施例中，輸入殘基為色胺酸或酪胺酸。在一些實施例中，用於形成突起之原始殘基具有小側鏈體積，諸如丙胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺酸。
「空腔」係指自第二多肽之界面凹陷且因此容納第一多肽之相鄰界面上之對應突起的至少一個胺基酸側鏈。空腔可存在於原始界面或可以合成方式(例如藉由改變編碼界面之核酸)引入。在一些實施例中，編碼第二多肽之界面的核酸經改變以編碼空腔。為實現此，編碼第二多肽之界面中之至少一個「原始」胺基酸殘基的核酸經編碼至少一個側鏈體積小於原始胺基酸殘基之「輸入」胺基酸殘基之DNA置換。應瞭解可存在一個以上原始及對應輸入殘基。在一些實施例中，用於形成空腔之輸入殘基為選自丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)及纈胺酸(V)的天然存在之胺基酸殘基。在一些實施例中，輸入殘基為絲胺酸、丙胺酸或蘇胺酸。在一些實施例中，用於形成空腔之原始殘基具有大側鏈體積，諸如酪胺酸、精胺酸、苯丙胺酸或色胺酸。引入 「空腔」之突變可稱為「臼突變」。
突起「可定位」於空腔中，此意謂分別第一多肽及第二多肽之界面上的突起及空腔之空間位置及突起及空腔之尺寸使得突起可位於空腔中，且不顯著擾動第一及第二多肽在該界面之正常締合。因為諸如Tyr、Phe及Trp之突起通常不自界面軸線垂直延長且具有較佳構形，所以突起與對應空腔之比對在一些情況下可依賴於基於三維結構，諸如藉由X射線結晶學或核磁共振(NMR)獲得之三維結構將突起/空腔對模型化。此可使用此項技術中公認之技術實現。
在一些實施例中，IgG1恆定區中之杵突變為T366W(EU編號)。在一些實施例中，IgG1恆定區中之臼突變包含一或多個選自T366S、L368A及Y407V(EU編號)之突變。在一些實施例中，IgG1恆定區中之臼突變包含T366S、L368A及Y407V(EU編號)。
在一些實施例中，IgG4恆定區中之杵突變為T366W(EU編號)。在一些實施例中，IgG4恆定區中之臼突變包含一或多個選自T366S、L368A及Y407V(EU編號)之突變。在一些實施例中，IgG4恆定區中之臼突變包含T366S、L368A及Y407V(EU編號)。
亦可藉由以下來製備多特異性抗體：工程改造靜電轉向作用以製備抗體Fc-雜二聚體分子(WO 2009/089004A1)；使兩個或兩個以上抗體或片段交聯(參見例如美國專利第4,676,980號，及Brennan等人，Science,229：81(1985))；使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體(參見例如Kostelny等人，J.Immunol.,148(5)：1547-1553(1992))；使用「雙功能抗體」技術製造雙特異性抗體片段(參見例如Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448(1993))；以及使用單鏈Fv(sFv)二聚體(參見例如Gruber等人，J.Immunol.,152：5368(1994))；以及製備三特異性抗體，如例如Tutt等人J.Immunol.147：60(1991)中描述。
本文中亦包括具有三個或三個以上功能抗原結合位點之工程改 造抗體，包括「章魚抗體」或「雙重可變域免疫球蛋白」(DVD)(參見例如US 2006/0025576A1，及Wu等人Nature Biotechnology(2007)))。本文之抗體或片段亦包括包含結合於CLL-1以及另一不同抗原之抗原結合位點的「雙作用FAb」或「DAF」(參見例如US 2008/0069820)。
7.抗體變異體
在某些實施例中，涵蓋本文所提供之抗體之胺基酸序列變異體。舉例而言，可能需要提高抗體之結合親和力及/或其他生物特性。抗體之胺基酸序列變異體可藉由將適當修飾引入編碼該抗體之核苷酸序列中或藉由肽合成來製備。此類修飾包括例如發生於抗體胺基酸序列內的殘基缺失及/或插入及/或取代。可進行缺失、插入及取代之任何組合以獲得最終構築體，其限制條件為最終構築體具有所需特徵，例如抗原結合。
a.取代、插入及缺失變異體
在某些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代之抗體變異體。用於取代突變誘發之相關位點包括HVR及FR。保守取代展示於表1中標題「較佳取代」下。更多實質性變化提供於表1中標題「示例性取代」下，且如下文參考胺基酸側鏈類別進一步描述。胺基酸取代可引入相關抗體中且針對所需活性篩選產物，例如保留/提高抗原結合、降低免疫原性或改善ADCC或CDC的產物。
胺基酸可根據共有側鏈特性進行分組：(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代將需要將此等類別中之一者之成員換成另一類別。
一種類型之取代變異體涉及取代親本抗體(例如人類化抗體或人類抗體)之一或多個高變區殘基。一般而言，選擇用於進一步研究之所得變異體相對於親本抗體將在某些生物特性方面具有修改(例如改善)(例如親和力提高、免疫原性降低)及/或將實質上保留親本抗體之某些生物特性。一種示例性取代變異體為親和力成熟抗體，其可例如使用基於噬菌體呈現之親和力成熟技術(諸如本文所描述之技術)便利地產生。簡言之，使一或多個HVR殘基突變且在噬菌體上呈現變異抗體且針對特定生物活性(例如結合親和力)進行篩選。
改變(例如取代)可在HVR中進行以例如提高抗體親和力。可在HVR「熱點」(亦即由在體細胞成熟過程期間經歷高頻率突變之密碼 子所編碼之殘基(參見例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207：179-196(2008)))及/或SDR(a-CDR)中用測試結合親和力之所得變異VH或VL進行此類改變。藉由構築二級文庫及自二級文庫再選擇來達成親和力成熟已描述於Hoogenboom等人之Methods in Molecular Biology 178：1-37(O'Brien等人編，Human Press,Totowa,NJ,(2001))。在親和力成熟之一些實施例中，藉由多種方法(例如易錯PCR、鏈改組或寡核苷酸引導之突變誘發)中之任一者將多樣性引入選擇用於成熟之可變基因中。隨後產生二級文庫。隨後篩選該文庫以鑑別具有所需親和力之任何抗體變異體。引入多樣性之另一方法涉及HVR引導途徑，其中將若干HVR殘基(例如一次4-6個殘基)隨機分組。參與抗原結合之HVR殘基可例如使用丙胺酸掃描突變誘發或模型化來特定鑑別。常常尤其以CDR-H3及CDR-L3為目標。
在某些實施例中，取代、插入或缺失可發生在一或多個HVR內，只要此等改變不實質上降低抗體結合抗原之能力即可。舉例而言，可在HVR中進行不實質上降低結合親和力之保守改變(例如，如本文所提供之保守取代)。此類改變可在HVR「熱點」或SDR外。在上文提供之變異VH及VL序列之某些實施例中，各HVR未改變，或含有不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。
一種適用於鑑別可靶向用於突變誘發之抗體之殘基或區的方法稱為「丙胺酸掃描突變誘發」，如由Cunningham及Wells(1989)Science,244：1081-1085所描述。在此方法中，鑑別標靶殘基之殘基或群(例如帶電殘基，諸如arg、asp、his、lys及glu)且經中性或帶負電胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)置換以確定抗體與抗原之相互作用是否受影響。可在對初始取代顯示功能敏感性之胺基酸位置處引入其他取代。或者或另外，抗原-抗體複合物之晶體結構用於鑑別抗體與抗原之間的接觸點。此類接觸殘基及鄰近殘基可作為取代候選物之目標或 排除在取代候選物之外。可篩選變異體以判定其是否含有所需特性。
胺基酸序列插入包括在一個殘基至含有一百個或一百個以上殘基之多肽長度範圍內的胺基及/或羧基端融合物，以及具有單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他插入變異體包括抗體之N端或C端與酶(例如對於ADEPT而言)或延長抗體之血清半衰期之多肽的融合物。
b)糖基化變異體
在某些實施例中，對本文所提供之抗體進行改變以增加或降低抗體糖基化之程度。在抗體上添加糖基化位點或使抗體缺失糖基化位點可藉由改變胺基酸序列以便產生或移除一或多個糖基化位點來便利地實現。
在抗體包含Fc區之情況下，可改變附接於其上之碳水化合物。由哺乳動物細胞產生之天然抗體通常包含分支鏈雙觸角寡醣，其一般藉由N鍵附接於Fc區之CH2域的Asn297。參見例如Wright等人TIBTECH 15：26-32(1997)。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及附接於雙觸寡醣結構之「主幹」中之GlcNAc的海藻糖。在一些實施例中，可對本發明抗體中之寡醣進行修飾以便形成具有某些改良特性之抗體變異體。
在一個實施例中，提供具有缺乏附接(直接或間接)於Fc區之海藻糖之碳水化合物結構的抗體變異體。舉例而言，此類抗體中海藻糖之量可為1%至80%，1%至65%，5%至65%或20%至40%。海藻糖之量藉由計算相對於如藉由MALDI-TOF質譜分析量測之附接於Asn 297之所有醣結構(例如複合、雜交及高甘露糖結構)的總和，糖鏈內Asn297處之海藻糖之平均量來確定，如例如WO 2008/077546中所描述。Asn297係指位於Fc區中約位置297之天冬醯胺殘基(Fc區殘基之Eu編 號)；然而，歸因於抗體中微小序列變化，Asn297亦可位於位置294與300之間位置297之上游或下游約±3個胺基酸處。此類海藻糖基化變異體可具有改善之ADCC功能。參見例如美國專利公開案第US 2003/0157108號(Presta,L.)；第US 2004/0093621號(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。關於「去海藻糖基化」或「缺乏海藻糖」抗體變異體之公開案之實例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87：614(2004)。能夠產生去海藻糖基化抗體之細胞株之實例包括缺乏蛋白質海藻糖基化之Lec13 CHO細胞(Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美國專利申請案第US 2003/0157108 A1號，Presta,L；以及WO 2004/056312 A1,Adams等人，尤其實例11)，及基因剔除細胞株，諸如α-1,6-海藻糖基轉移酶基因、FUT8、基因剔除CHO細胞(參見例如Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87：614(2004)；Kanda,Y.等人，Biotechnol.Bioeng.,94(4)：680-688(2006)；以及WO2003/085107)。
進一步提供具有平分寡醣之抗體變異體，例如其中附接於抗體之Fc區的雙觸角寡醣藉由GlcNAc平分。此類抗體變異體可具有減少之海藻糖基化及/或改善之ADCC功能。此類抗體變異體之實例描述於例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美國專利第6,602,684號(Umana等人)；以及US 2005/0123546(Umana等人)。亦提供寡醣中之至少一個半乳糖殘基與Fc區附接之抗體變異體。此類抗體變異體可具 有改善之CDC功能。此類抗體變異體描述於例如WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；及WO 1999/22764(Raju,S.)中。
c. Fc區變異體
在某些實施例中，可將一或多個胺基酸修飾引入本文所提供之抗體之Fc區中，從而產生Fc區變異體。Fc區變異體可包含人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)，其在一或多個胺基酸位置處包含胺基酸修飾(例如取代)。
在某些實施例中，本發明涵蓋具有一些而非所有效應功能之抗體變異體，此使得該抗體成為對於其中活體內抗體半衰期至關重要，而某些效應功能(諸如補體及ADCC)為不必要或有害的應用而言合乎需要之候選物。可進行活體外及/或活體內細胞毒性分析以確認CDC及/或ADCC活性之降低/消除。舉例而言，可進行Fc受體(FcR)結合分析以確保抗體不具有FcγR結合能力(從而可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。用於介導ADCC之初級細胞NK細胞僅表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。FcR在造血細胞上之表現概述於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)之第464頁之表3中。評估相關分子之ADCC活性之活體外分析的非限制性實例描述於以下中：美國專利第5,500,362號(參見例如Hellstrom,I.等人Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 83：7059-7063(1986))及Hellstrom,I等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 82：1499-1502(1985)；第5,821,337號(參見Bruggemann,M.等人，J.Exp.Med.166：1351-1361(1987))。或者，可採用非放射性分析方法(參見例如流動式細胞量測術之ACTITM非放射性細胞毒性分析(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；及CytoTox 96®非放射性細胞毒性分析(Promega,Madison,WI))。適用於此類分析之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及天然殺手(NK) 細胞。或者或另外，可評估相關分子之活體內ADCC活性，例如在動物模型(諸如Clynes等人Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)中所揭示)中。亦可進行C1q結合分析以確認抗體無法結合C1q且因此缺乏CDC活性。參見例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為評估補體活化，可進行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)；Cragg,M.S.等人，Blood 101：1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.及M.J.Glennie,Blood 103：2738-2743(2004))。亦可使用此項技術中已知之方法測定FcRn結合及活體內清除率/半衰期(參見例如Petkova,S.B.等人，Int'l.Immunol.18(12)：1759-1769(2006))。
在一些實施例中，可將一或多個胺基酸修飾引入本文提供之抗體之Fc部分中以增加IgG與新生Fc受體之結合。在某些實施例中，抗體包含根據EU編號之以下三個突變：M252Y、S254T及T256E(「YTE突變」)(美國專利第8,697,650號；亦參見Dall'Acqua等人，Journal of Biological Chemistry 281(33)：23514-23524(2006))。在某些實施例中，YTE突變不影響抗體結合於其同源抗原之能力。在某些實施例中，與天然(亦即非YTE突變)抗體相比，YTE突變增加抗體之血清半衰期。在一些實施例中，與天然(亦即非YTE突變)抗體相比，YTE突變增加抗體之血清半衰期3倍。在一些實施例中，與天然(亦即非YTE突變)抗體相比，YTE突變增加抗體之血清半衰期2倍。在一些實施例中，與天然(亦即非YTE突變)抗體相比，YTE突變增加抗體之血清半衰期4倍。在一些實施例中，與天然(亦即非YTE突變)抗體相比，YTE突變增加抗體之血清半衰期至少5倍。在一些實施例中，與天然(亦即非YTE突變)抗體相比，YTE突變增加抗體之血清半衰期至少10倍。參見例如美國專利第8,697,650號；亦參見Dall'Acqua等人，Journal of Biological Chemistry 281(33)：23514-23524(2006)。
在某些實施例中，YTE突變體提供一種調節抗體之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)活性的方式。在某些實施例中，YTEO突變體提供一種調節人類化IgG抗體針對人類抗原之ADCC活性的方式。參見例如美國專利第8,697,650號；亦參見Dall'Acqua等人，Journal of Biological Chemistry 281(33)：23514-23524(2006)。
在某些實施例中，YTE突變體允許同時調節血清半衰期、組織分佈及抗體活性(例如IgG抗體之ADCC活性)。參見例如美國專利第8,697,650號；亦參見Dall'Acqua等人，Journal of Biological Chemistry 281(33)：23514-23524(2006)。
具有減少之效應功能的抗體包括根據EU編號Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者經取代的抗體(美國專利第6,737,056號)。此類Fc突變體包括在根據EU編號胺基酸位置265、269、270、297及327Fc中之兩者或兩者以上經取代的突變體，包括根據EU編號殘基265及297取代為丙胺酸(亦即根據EU編號D265A及N297A)的所謂「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。在某些實施例中，Fc突變體包含以下兩個胺基酸取代：D265A及N297A。在某些實施例中，Fc突變體由以下兩個胺基酸取代組成：D265A及N297A。
在某些實施例中，野生型人類Fc區之位置329(EU編號)(P329)的脯胺酸經甘胺酸或精胺酸或大至足以破壞Fc/Fc(受體界面，在Fc之P329與FcgRIII之色胺酸殘基W87及W110之間形成(Sondermann等人：Nature 406,267-273(2000年7月20日))內之脯胺酸夾心的胺基酸殘基取代。在另一個實施例中，Fc變異體中之至少一個其他胺基酸取代為S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S，且在另一個實施例中，該至少一個其他胺基酸取代為人類IgG1 Fc區之L234A及L235A或人類IgG4 Fc區之S228P及L235E，均係根據EU編 號(美國專利第8,969,526號，其以全文引用的方式併入本文中)。
在某些實施例中，多肽包含野生型人類IgG Fc區之Fc變異體，其中該多肽之人類IgG Fc區P329經甘胺酸取代且其中Fc變異體包含人類IgG1 Fc區之L234A及L235A或人類IgG4 Fc區之S228P及L235E的至少兩個其他胺基酸取代，且其中殘基係根據EU編號進行編號(美國專利第8,969,526號，其以全文引用的方式併入本文中)。在某些實施例中，包含P329G、L234A及L235A(EU編號)取代之多肽顯示對人類FcγRIIIA及FcγRIIA之親和力減少，從而下調ADCC至藉由包含野生型人類IgG Fc區之多肽誘發的ADCC之至少20%，及/或下調ADCP(美國專利第8,969,526號，其以全文引用的方式併入本文中)。
在一特定實施例中，包含野生型人類Fc多肽之Fc變異體的多肽包含三重突變：根據EU編號位置Pro329之胺基酸取代、L234A及L235A突變(P329/LALA)(美國專利第8,969,526號，其以全文引用的方式併入本文中)。在特定實施例中，多肽包含以下胺基酸取代：P329G、L234A及L235A，根據EU編號。
描述具有提高或降低之與FcR之結合的某些抗體變異體(參見例如美國專利第6,737,056號；WO 2004/056312，及Shields等人，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001))。
在某些實施例中，抗體變異體包含具有一或多個提高ADCC之胺基酸取代，例如Fc區之位置298、333及/或334(EU編號)之取代的Fc區。
在一些實施例中，在Fc區中進行改變，引起C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)改變(亦即提高或降低)，例如如美國專利第6,194,551號、WO 99/51642及Idusogie等人J.Immunol.164：4178-4184(2000)中描述。
半衰期延長且與負責將母體IgG轉移至胎兒之新生兒Fc受體 (FcRn)(Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等人，J.Immunol.24：249(1994))之結合改良的抗體描述於US 2005/0014934A1(Hinton等人)中。彼等抗體包含其中具有一或多個取代之Fc區，其中Fc區與FcRn之結合得以改善。此類Fc變異體包括在Fc區殘基中之一或多者具有取代之Fc變異體：根據EU編號，238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如Fc區殘基434之取代(美國專利第7,371,826號)。關於Fc區變異體之其他實例，亦參見Duncan及Winter,Nature 322：738-40(1988)；美國專利第5,648,260號；美國專利第5,624,821號；及WO 94/29351。
d.半胱胺酸工程改造之抗體變異體
在某些實施例中，可能需要產生半胱胺酸工程改造之抗體，例如「THIOMABTM抗體」，其中抗體之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在特定實施例中，經取代之殘基存在於抗體之可接近位點。藉由用半胱胺酸取代彼等殘基，反應性硫醇基從而定位於抗體之可接近位點且可用於使抗體與其他部分(諸如藥物部分或連接子-藥物部分)結合以產生如本文中進一步描述之免疫結合物。在某些實施例中，以下殘基中之任一或多者可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205(Kabat編號)；重鏈之A140(EU編號)；重鏈之L174(EU編號)；重鏈之Y373(EU編號)；輕鏈之K149(Kabat編號)；重鏈之A118(EU編號)；以及重鏈Fc區之S400(EU編號)。在特定實施例中，本文所述之抗體包含HC-A140C(EU編號)半胱胺酸取代。在特定實施例中，本文所述之抗體包含LC-K149C(Kabat編號)半胱胺酸取代。在特定實施例中，本文所述之抗體包含HC-A118C(EU編號)半胱胺酸取代。可如例如美國專利第7,521,541號中所述產生半胱胺酸工程改造之抗體。
在某些實施例中，抗體包含以下重鏈半胱胺酸取代之一：
在某些實施例中，抗體包含以下輕鏈半胱胺酸取代之一：
e.抗體衍生物
在某些實施例中，可將本文中所提供之抗體進一步修飾以含有此項技術中已知且可易於獲得之其他非蛋白質部分。適合於抗體衍生化之部分包括(但不限於)水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧雜環戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及聚葡萄糖或聚(n-乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如丙三醇)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛因其於水中之穩定性而可具有製造優勢。聚合物可具有任何分子量，且可為分支或未分支的。與抗體附接之聚合物的數目可變化，且若連接一個以上聚合物，則聚合物可相同或不同分子。一般而言，用於衍生作用之聚合物之數目及/或類型可基於包括(但不限於)待改善抗體之特殊特性或功能，抗體衍生物是否將用於指定病症下之療法等考慮因素來確定。
在另一實施例中，提供抗體與可藉由暴露於放射線選擇性地加熱之非蛋白質部分之結合物。在一個實施例中，非蛋白質部分為碳奈米管(Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：11600-11605(2005))。放射線可具有任何波長，且包括(但不限於)不損害普通細胞但將非蛋白質部分加熱至靠近殺死抗體-非蛋白質部分之細胞之溫度的波長。
B.重組方法及組合物
可使用例如如US 4,816,567中所描述之重組方法及組合物產生抗體。在一個實施例中，提供編碼本文所述之抗-CLL-1抗體之分離核酸。此類核酸可編碼構成抗體之VL之胺基酸序列及/或構成VH之胺基酸序列(例如抗體之輕鏈及/或重鏈)。在另一實施例中，提供包含此類核酸之一或多種載體(例如表現載體)。在又一實施例中，提供包含此類核酸之宿主細胞。在一個此類實施例中，宿主細胞包含(例如已經以下轉型)：(1)包含編碼構成抗體VL之胺基酸序列及構成抗體VH之胺基酸序列之核酸的載體；或(2)包含編碼構成抗體VL之胺基酸序列之核酸的第一載體及包含編碼構成抗體VH之胺基酸序列之核酸的第二載體。在一個實施例中，宿主細胞為真核細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴細胞(例如Y0、NS0、Sp20細胞)。在一個實施例中，提供一種製備抗-CLL-1抗體之方法，其中該方法包含在適合於表現抗體之條件下培養如上文所提供之包含編碼抗體之核酸的宿主細胞且視情況自宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收抗體。
為重組產生抗-CLL-1抗體，分離例如如上所述之編碼抗體之核酸且插入一或多種載體中以在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。此類核酸可易於使用習知程序(例如藉由使用能夠與編碼抗體之重鏈及輕鏈之基因特異性結合的寡核苷酸探針)分離及定序。
適於選殖或表現抗體編碼載體之宿主細胞包括本文所描述之原核或真核細胞。舉例而言，抗體可於細菌中產生，尤其當不需要糖基 化及Fc效應功能時。關於抗體片段及多肽在細菌中之表現，參見例如美國專利第5,648,237號、第5,789,199號及第5,840,523號(亦參見Charlton,Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo編輯，Humana Press,Totowa,NJ,2003)，第245-254頁，描述大腸桿菌中抗體片段之表現)。在表現之後，抗體可以可溶性溶離份自細菌細胞糊狀物分離且其可進一步經純化。
除原核生物外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物為抗體編碼載體之適合選殖或表現宿主，包括糖基化路徑已經「人類化」，從而使得所產生之抗體具有部分或完全人類糖基化型態的真菌及酵母菌株。參見Gerngross,Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)及Li等人，Nat.Biotech.24：210-215(2006)。
用於表現糖基化抗體之適合宿主細胞亦來源於多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別出眾多可與昆蟲細胞聯合使用，尤其用於轉染草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)細胞之桿狀病毒株。
植物細胞培養物亦可用作宿主。參見例如美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429號(描述在轉殖基因植物中產生抗體之PLANTIBODIESTM技術)。
脊椎動物細胞亦可用作宿主。舉例而言，適於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞株可為適用的。適用哺乳動物宿主細胞株之其他實例為經SV40(COS-7)轉型之猴腎CV1株；人類胚腎細胞株(如例如在Graham等人，J.Gen Virol.36：59(1977)中所述之293或293細胞)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠睾丸支持細胞(mouse sertoli cell)(如例如在Mather,Biol.Reprod.23：243-251(1980)中所述之TM4細胞)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK；布法羅大鼠肝細胞(buffalo rat liver cell)(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562)；如例如在Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982)中所述之TRI細胞；MRC 5細胞；及FS4細胞。其他適用之哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR- CHO細胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；及骨髓瘤細胞株，諸如Y0、NS0及Sp2/0。關於適於抗體產生之某些哺乳動物宿主細胞株的綜述，參見例如Yazaki及Wu,Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo編輯，Humana Press,Totowa,NJ)，第255-268頁(2003)。
C.分析
可藉由此項技術中已知之各種分析對本文所提供之抗-CLL-1抗體針對其物理/化學特性及/或生物活性進行鑑別、篩選或表徵。
在一個態樣中，例如藉由已知之方法，諸如ELISA、BIACore®、FACS或西方墨點法測試本發明抗體之抗原結合活性。
在另一態樣中，可使用競爭分析來鑑別與本文中描述之任一抗體競爭結合於CLL-1之抗體。在某些實施例中，此類競爭抗體結合於由本文所述之抗體所結合者相同之抗原決定基(例如線性或構形抗原決定基)。用於定位抗體結合之抗原決定基的詳細示例性方法提供於Morris(1996)「Epitope Mapping Protocols」,Methods in Molecular Biology第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)。
在一示例性競爭分析中，在如下溶液中培育固定CLL-1，該溶液包含結合於CLL-1之第一標記抗體(例如本文所述之任一抗體)及測試與第一抗體競爭結合於CLL-1之能力的第二未標記抗體。第二抗體可存在於融合瘤上清液中。作為對照，在包含第一標記抗體但無第二未標記抗體之溶液中培育固定CLL-1。在允許第一抗體結合於CLL-1之條件下培育之後，移除過量未結合抗體，且量測與固定CLL-1締合之 標記之量。若測試樣品中與固定CLL-1締合之標記之量相對於對照樣品中實質上降低，則表明第二抗體與第一抗體競爭結合於CLL-1。參見Harlow及Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual第14章(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
D.免疫結合物
本發明亦提供免疫結合物，其包含本文中結合於一或多種細胞毒性劑之抗-CLL-1抗體，該一或多種細胞毒性劑諸如為化學治療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(例如細菌、真菌、植物或動物來源之蛋白質毒素、酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(亦即放射性結合物)。
免疫結合物允許藥物部分靶向傳遞至腫瘤且在一些實施例中其中在胞內累積，其中全身性投與未結合藥物可對正常細胞造成不可接受之毒性水準(Polakis P.(2005)Current Opinion in Pharmacology 5：382-387)。
抗體-藥物結合物(ADC)為靶向型化學治療分子，其藉由將有效細胞毒性藥物靶向表現抗原之腫瘤細胞，將抗體與細胞毒性藥物之特性組合(Teicher,B.A.(2009)Current Cancer Drug Targets 9：982-1004)，藉此藉由最大化功效且最小化脫靶毒性而增強治療指數(Carter,P.J.及Senter P.D.(2008)The Cancer Jour.14(3)：154-169；Chari,R.V.(2008)Acc.Chem.Res.41：98-107)。
本發明之ADC化合物包括具有抗癌活性之化合物。在一些實施例中，ADC化合物包括結合，亦即共價附接於藥物部分之抗體。在一些實施例中，抗體經由連接子共價連接於藥物部分。本發明之抗體-藥物結合物(ADC)選擇性地傳遞有效劑量之藥物至腫瘤組織，從而可實現較大選擇性，亦即較低有效劑量，同時增加治療指數(「治療窗」)。
抗體-藥物結合物(ADC)之藥物部分(D)可包括具有細胞毒性或細 胞生長抑制作用之任何化合物、部分或基團。藥物部分可藉由包括(但不限於)微管蛋白結合、DNA結合或插入及抑制RNA聚合酶、蛋白質合成及/或拓撲異構酶來賦予其細胞毒性及細胞生長抑制作用。示例性藥物部分包括(但不限於)類美登素、海兔毒素、阿瑞他汀、卡奇黴素、吡咯并苯并二氮呯(PBD)、奈莫柔比星及其衍生物、PNU-159682、蒽環黴素、倍癌黴素、長春花生物鹼、紫杉烷、單端孢黴烯族毒素、CC1065、喜樹鹼(camptothecin)、依利奈法德(elinafide)及具有細胞毒活性之其立體異構體、電子等排體、類似物及衍生物。此類免疫結合物之非限制性實例進一步詳細論述於下文中。
1.示例性抗體-藥物結合物
抗體-藥物結合物(ADC)化合物之一示例性實施例包含靶向腫瘤細胞之抗體(Ab)、藥物部分(D)及附接Ab與D之連接子部分(L)。在一些實施例中，抗體經由一或多個胺基酸殘基，諸如離胺酸及/或半胱胺酸附接於連接子部分(L)。
一示例性ADC具有式I：Ab-(L-D)p I
其中p為1至約20。在一些實施例中，可結合於抗體之藥物部分的數目由游離半胱胺酸殘基之數目限制。在一些實施例中，游離半胱胺酸殘基藉由本文所描述之方法引入抗體胺基酸序列中。示例性式I之ADC包括(但不限於)具有1、2、3或4個工程改造半胱胺酸胺基酸的抗體(Lyon,R.等人(2012)Methods in Enzym.502：123-138)。在一些實施例中，一或多個游離半胱胺酸殘基不使用工程改造已存在於抗體中，在此情況下現有游離半胱胺酸殘基可用於將抗體結合於藥物。在一些實施例中，抗體在抗體結合前暴露於還原條件以產生一或多個游離半胱胺酸殘基。
a)示例性連接子
「連接子」(L)為可用於連接一或多個藥物部分(D)於抗體(Ab)以形成式I之抗體-藥物結合物(ADC)的雙官能或多官能部分。在一些實施例中，抗體-藥物結合物(ADC)可使用具有用於共價附接於藥物及抗體之反應性官能基之連接子製備。舉例而言，在一些實施例中，抗體(Ab)之半胱胺酸硫醇可與連接子或藥物-連接子中間物之反應性官能基形成一鍵以製備ADC。
在一個態樣中，連接子具有能夠與抗體上存在之游離半胱胺酸反應形成共價鍵的官能基。非限制性示例性此類反應性官能基包括順丁烯二醯亞胺、鹵乙醯胺、α-鹵乙醯基、活化酯(諸如丁二醯亞胺酯、4-硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯)、酸酐、酸氯化物、磺醯基氯、異氰酸酯及異硫氰酸酯。參見例如Klussman等人(2004),Bioconjugate Chemistry 15(4)：765-773第766頁之結合方法，及其中之實例。
在一些實施例中，連接子具有能夠使抗體上存在之親電子基團反應的官能基。示例性此類親電子基團包括(但不限於)醛及酮羰基。在一些實施例中，連接子之反應性官能基之雜原子可與抗體上之親電子基團反應且形成與抗體之共價鍵。非限制性示例性此類反應性官能基包括(但不限於)醯肼、肟、胺基、肼、硫半卡巴肼、肼羧酸酯及芳基醯肼。
連接子可包含一或多種連接子組分。示例性連接子組分包括6-順丁烯二醯亞胺基己醯基(「MC」)、順丁烯二醯亞胺基丙醯基(「MP」)、纈胺酸-瓜胺酸(「val-cit」或「vc」)、丙胺酸-苯丙胺酸(「ala-phe」)、對胺基苯甲氧基羰基(「PAB」)、4-(2-吡啶基硫基)戊酸N-丁二醯亞胺基酯(「SPP」)及環己烷-1-甲酸4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)酯(「MCC」)。各種連接子組分為此項技術中已知，其中一些在下文中描述。
連接子可為「可裂解連接子」，促進藥物之釋放。非限制性示例性可裂解連接子包括酸不穩定連接子(例如包含腙)、蛋白酶敏感性(例如肽酶敏感性)連接子、光不穩定連接子或含二硫鍵之連接子(Chari等人，Cancer Research 52：127-131(1992)；US 5208020)。
在某些實施例中，連接子具有下式II：-Aa-Ww-Yy- II
其中A為「延伸子單元」，且a為0至1之整數；W為「胺基酸單元」，且w為0至12之整數；Y為「間隔子單元」，且y為0、1或2；且Ab、D及p如上文針對式I所定義。此類連接子之示例性實施例描述於明確地以引用的方式併入本文中之美國專利第7,498,298號中。
在一些實施例中，連接子組分包含將抗體連接於另一連接子組分或藥物部分之「延伸子單元」。非限制性示例性延伸子單元展示如下(其中波形線指示共價連接於抗體、藥物或其他連接子組分之位點)：
在一些實施例中，連接子可為肽模擬連接子，諸如 WO2015/095227、WO2015/095124或WO2015/095223中描述之肽模擬連接子，該等文獻以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，連接子組分包含「胺基酸單元」。在一些此類實施例中，胺基酸單元允許連接子藉由蛋白酶裂解，藉此促進藥物在暴露於胞內蛋白酶，諸如溶酶體酶時自免疫結合物釋放(Doronina等人(2003)Nat.Biotechnol.21：778-784)。示例性胺基酸單元包括(但不限於)二肽、三肽、四肽及五肽。示例性二肽包括(但不限於)纈胺酸-瓜胺酸(vc或val-cit)、丙胺酸-苯丙胺酸(af或ala-phe)；苯丙胺酸-離胺酸(fk或phe-lys)；苯丙胺酸-高離胺酸(phe-高lys)；及N-甲基-纈胺酸-瓜胺酸(Me-val-cit)。示例性三肽包括(但不限於)甘胺酸-纈胺酸-瓜胺酸(gly-val-cit)及甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸(gly-gly-gly)。胺基酸單元可包含天然存在之胺基酸殘基及/或次要胺基酸及/或非天然存在之胺基酸類似物，諸如瓜胺酸。胺基酸單元可針對藉由特定酶，例如腫瘤相關蛋白酶、組織蛋白酶B、C及D或纖維蛋白溶酶蛋白酶之酶裂解進行設計且最佳化。
在一些實施例中，連接子組分包含將抗體直接或經由延伸子單元及/或胺基酸單元連接於藥物部分的「間隔子單元」。間隔子單元可為「自分解型」或「非自分解型」。「非自分解型」間隔子單元為在ADC裂解時部分或所有間隔子單元仍然結合於藥物部分之間隔子單元。非自分解型間隔子單元之實例包括(但不限於)甘胺酸間隔子單元及甘胺酸-甘胺酸間隔子單元。在一些實施例中，含有甘胺酸-甘胺酸間隔子單元之ADC藉由腫瘤細胞相關蛋白酶進行酶裂解，使得甘胺酸-甘胺酸-藥物部分自ADC之其餘部分釋放。在一些此類實施例中，甘胺酸-甘胺酸-藥物部分在腫瘤細胞中進行水解步驟，因此自藥物部分裂解甘胺酸-甘胺酸間隔子單元。
「自分解型」間隔子單元允許釋放藥物部分。在某些實施例 中，連接子之間隔子單元包含對胺基苯甲基單元。在一些此類實施例中，對胺基苯甲基醇經由醯胺鍵附接於胺基酸單元，且在苯甲醇與藥物之間製得胺基甲酸酯、甲基胺基甲酸酯或碳酸酯(Hamann等人(2005)Expert Opin.Ther.Patents(2005)15：1087-1103)。在一些實施例中，間隔子單元為對胺基苯甲氧基羰基(PAB)。在一些實施例中，包含自分解型連接子之ADC具有以下結構：
其中Q為-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-鹵素、-硝基或-氰基；m為在0至4範圍內之整數；且p在1至約20範圍內。在一些實施例中，p在1至10、1至7、1至5或1至4範圍內。
自分解型間隔基之其他實例包括(但不限於)電子上類似於PAB基團之芳族化合物，諸如2-胺基咪唑-5-甲醇衍生物(美國專利第7,375,078號；Hay等人(1999)Bioorg.Med.Chem.Lett.9：2237)及鄰或對胺基苯甲基乙醛。在一些實施例中，可使用在醯胺鍵水解時進行環化之間隔子，諸如經取代及未經取代之4-胺基丁醯胺(Rodrigues等人(1995)Chemistry Biology 2：223)、適當經取代之雙環[2.2.1]及雙環[2.2.2]環系統(Storm等人(1972)J.Amer.Chem.Soc.94：5815)及2-胺基苯基丙醯胺(Amsberry等人(1990)J.Org.Chem.55：5867)。藥物與甘胺酸殘基之α-碳的連接為適用於ADC之自分解型間隔子的另一實例(Kingsbury等人(1984)J.Med.Chem.27：1447)。
在一些實施例中，連接子L可為用於經由分支之多官能連接子部分共價連接一個以上藥物部分於抗體的樹突型連接子(Sun等人(2002)Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12：2213-2215；Sun等人(2003)Bioorganic & Medicinal Chemistry 11：1761-1768)。樹突狀連接 子可增加藥物與抗體之莫耳比，亦即負載，其與ADC效能有關。因此，在抗體僅僅載有一個反應性半胱胺酸硫醇基之情況下，可經由樹突狀連接子附接多個藥物部分。
下文展示在式I之ADC之情況下非限制性示例性連接子：
其他非限制性示例性ADC包括如下結構： 其中X為： Y為： 各R獨立地為H或C1-C6烷基；且n為1至12。
通常，肽型連接子可藉由在兩個或兩個以上胺基酸及/或肽片段之間形成肽鍵來製備。例如根據液相合成方法可製備此類肽鍵(例如E.Schröder及K.Lübke(1965)「The Peptides」，第1卷，第76-136頁，Academic Press)。
在一些實施例中，連接子經調節溶解性及/或反應性之基團取代。作為一非限制性實例，諸如磺酸根(-SO3 -)或銨之帶電取代基可增加連接子試劑之水溶性且促進連接子試劑與抗體及/或藥物部分之偶合反應，或促進Ab-L(抗體-連接子中間物)與D或D-L(藥物-連接子中間物)與Ab之偶合反應，視用於製備ADC之合成途徑而定。在一些實施例中，一部分連接子與抗體偶合且一部分連接子與藥物偶合，且接著Ab-(連接子部分)a與藥物-(連接子部分)b偶合以形成式I之ADC。在一些此類實施例中，抗體包含一個以上(連接子部分)a取代基，使得在式I之ADC中一個以上藥物與抗體偶合。
本發明之化合物明確涵蓋(但不限於)用以下連接子試劑製備之ADC：雙-順丁烯二醯亞胺基-三氧基乙二醇(BMPEO)、N-(β-順丁烯二 醯亞胺基丙基氧基)-N-羥基丁二醯亞胺酯(BMPS)、N-(ε-順丁烯二醯亞胺基己醯基氧基)丁二醯亞胺酯(EMCS)、N-[γ-順丁烯二醯亞胺基丁醯基氧基]丁二醯亞胺酯(GMBS)、1,6-己烷-雙-乙烯基碸(HBVS)、4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧基-(6-醯胺基己酸)丁二醯亞胺基酯(LC-SMCC)、間順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基丁二醯亞胺酯(MBS)、4-(4-N-順丁烯二醯亞胺基苯基)丁醯肼(MPBH)、3-(溴乙醯胺基)丙酸丁二醯亞胺酯(SBAP)、碘乙酸丁二醯亞胺酯(SIA)、(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸丁二醯亞胺酯(SIAB)、N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、N-丁二醯亞胺基-4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(SPP)、4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸丁二醯亞胺酯(SMCC)、4-(對順丁烯二醯亞胺基苯基)丁酸丁二醯亞胺酯(SMPB)、6-[(β-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基)己酸丁二醯亞胺酯](SMPH)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、磺酸基-EMCS、磺酸基-GMBS、磺酸基-KMUS、磺酸基-MBS、磺酸基-SIAB、磺酸基-SMCC及磺酸基-SMPB以及丁二醯亞胺基-(4-乙烯基碸)苯甲酸酯(SVSB)，且包括雙-順丁烯二醯亞胺基試劑：二硫基雙順丁烯二醯亞胺基乙烷(DTME)、1,4-雙順丁烯二醯亞胺基丁烷(BMB)、1,4-雙順丁烯二醯亞胺基-2,3-二羥基丁烷(BMDB)、雙順丁烯二醯亞胺基己烷(BMH)、雙順丁烯二醯亞胺基乙烷(BMOE)、BM(PEG)2(下文展示)及BM(PEG)3(下文展示)；醯亞胺酯之雙官能衍生物(諸如二亞胺代己二酸二甲酯HCl)、活性酯(諸如辛二酸二丁二醯亞胺酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。在一些實施例中，雙順丁烯二醯亞胺試劑允許抗體中半胱胺酸之硫醇基附接於含硫醇之藥物部分、連接子或連接子-藥物中間物。與硫醇基反應之其他官能基包括(但不限於)碘乙醯 胺、溴乙醯胺、乙烯基吡啶、二硫鍵、吡啶基二硫鍵、異氰酸酯及異硫氰酸酯。
某些適用之連接子試劑可自各種商業來源獲得，諸如Pierce Biotechnology,Inc.(Rockford,IL)、Molecular Biosciences Inc.(Boulder,CO)，或根據此項技術中描述之程序合成；例如Toki等人(2002)J.Org.Chem.67：1866-1872；Dubowchik等人(1997)Tetrahedron Letters,38：5257-60；Walker,M.A.(1995)J.Org.Chem.60：5352-5355；Frisch等人(1996)Bioconjugate Chem.7：180-186；US 6214345；WO 02/088172；US 2003130189；US2003096743；WO 03/026577；WO 03/043583；及WO 04/032828。
碳14標記之1-異硫氰基苯甲基-3-甲基二伸乙三胺五乙酸(MX-DTPA)為用於將放射性核苷酸結合於抗體之示例性螯合劑。參見例如WO94/11026。
b)示例性藥物部分
(1)美登素及類美登素
在一些實施例中，免疫結合物包含結合於一或多個類美登素分子之抗體。類美登素為美登素之衍生物，且為藉由抑制微管蛋白聚合而起作用之有絲分裂抑制劑。美登素首次係自東非灌木齒葉美登木(Maytenus serrata)分離而得(美國專利第3896111號)。隨後，發現某些微生物亦產生類美登素，諸如美登醇及C-3美登醇酯(美國專利第4,151,042號)。合成類美登素揭示於例如美國專利第4,137,230號；第4,248,870號；第4,256,746號；第4,260,608號；第4,265,814號；第 4,294,757號；第4,307,016號；第4,308,268號；第4,308,269號；第4,309,428號；第4,313,946號；第4,315,929號；第4,317,821號；第4,322,348號；第4,331,598號；第4,361,650號；第4,364,866號；第4,424,219號；第4,450,254號；第4,362,663號；及第4,371,533號。
類美登素藥物部分為抗體-藥物結合物中具有吸引力之藥物部分，因為其：(i)藉由醱酵或醱酵產物之化學改質或衍生，相對易於製備；(ii)易由適合於經由非二硫化物連接子結合於抗體的官能基衍生；(iii)在血漿中穩定；及(iv)有效針對多種腫瘤細胞株。
適用作類美登素藥物部分之某些類美登素為此項技術中已知，且可自天然來源根據已知方法分離，或使用基因工程改造技術產生(參見例如Yu等人(2002)PNAS 99：7968-7973)。類美登素亦可根據已知方法以合成方式製備。
示例性類美登素藥物部分包括(但不限於)具有經改質之芳環的類美登素，諸如：C-19-去氯(美國專利第4256746號)(例如藉由氫化鋰鋁還原安莎黴素P2製備)；C-20-羥基(或C-20-去甲基)+/-C-19-去氯(美國專利第4361650號及第4307016號)(例如藉由使用鏈黴菌或放線菌去甲基化或使用LAH去氯來製備)；及C-20-去甲氧基、C-20-醯氧基(-OCOR)、+/-去氯(美國專利第4,294,757號)(例如藉由使用醯基氯醯化來製備)及在芳環其他位置具有改質之類美登素。
示例性類美登素藥物部分亦包括具有諸如以下修飾之類美登素：C-9-SH(美國專利第4424219號)(例如藉由美登醇與H2S或P2S5反應製備)；C-14-烷氧基甲基(去甲氧基/CH2OR)(US 4331598)；C-14-羥基甲基或醯氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美國專利第4450254號)(例如由諾卡菌屬(Nocardia)製備)；C-15-羥基/醯氧基(US 4364866)(例如藉由鏈黴菌轉化美登醇製備)；C-15-甲氧基(美國專利第4313946號及第4315929號)(例如自滑桃樹屬(Trewia nudlflora)製備)；C-18-N-去甲 基(美國專利第4362663號及第4322348號)(例如藉由美登醇由鏈黴菌去甲基化製備)；及4,5-去氧基(US 4371533)(例如藉由三氯化鈦/LAH還原美登醇製備)。
類美登素化合物上之許多位置適用作連接位置。舉例而言，酯鍵可藉由使用習知偶合技術與羥基反應形成。在一些實施例中，反應可在具有羥基之C-3位置、經羥基甲基修飾之C-14位置、經羥基修飾之C-15位置及具有羥基之C-20位置發生。在一些實施例中，鍵在美登醇或美登醇類似物之C-3位置形成。
類美登素藥物部分包括具有以下結構之類美登素藥物部分：
其中波形線指示類美登素藥物部分之硫原子共價附接於ADC之連接子。各R可獨立地為H或C1-C6烷基。將醯胺基附接於硫原子之伸烷基鏈可為甲基、乙基或丙基，亦即m為1、2或3(US 633410；US 5208020；Chari等人(1992)Cancer Res.52：127-131；Liu等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci USA 93：8618-8623)。
本發明之ADC涵蓋類美登素藥物部分之所有立體異構體，亦即對掌性碳R及S組態之任何組合(US 7276497；US 6913748；US 6441163；US 633410(RE39151)；US 5208020；Widdison等人(2006)J.Med.Chem.49：4392-4408，以全文引用的方式併入本文中)。在一些實施例中，類美登素藥物部分具有以下立體化學：
類美登素藥物部分之示例性實施例包括(但不限於)DM1；DM3；及DM4，具有以下結構：
其中波形線指示藥物之硫原子共價連接於抗體-藥物結合物之連接子(L)。
其他示例性類美登素抗體-藥物結合物具有以下結構及縮寫(其中Ab為抗體且p為1至約20。在一些實施例中，p在1至10，p為1至7，p為1至5，或p為1至4)：
其中DM1經由BMPEO連接子連接於抗體之硫醇基的示例性抗體-藥物結合物具有以下結構及縮寫：
其中Ab為抗體；n為0、1或2；且p為1至約20。在一些實施例中，p在1至10，p為1至7，p為1至5，或p為1至4。
含有類美登素之免疫結合物、其製備方法及其治療用途例如揭示於美國專利第5,208,020號及第5,416,064號、US 2005/0276812 A1及歐洲專利EP 0 425 235 B1(揭示內容以引用的方式明確併入本文中)中。亦參見Liu等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623(1996)；及Chari等人Cancer Research 52：127-131(1992)。
在一些實施例中，抗體-類美登素結合物可藉由化學連接抗體於類美登素分子來製備，不顯著降低抗體或類美登素分子之生物活性。 參見例如美國專利第5,208,020號(揭示內容以引用的方式明確併入本文中)。在一些實施例中，每個抗體分子平均結合3-4個類美登素分子之ADC已展示增強標靶細胞之細胞毒性的功效，不負面影響抗體之功能或溶解性。在一些情況下，即使一個分子毒素/抗體亦預期與使用裸抗體相比，增強細胞毒性。
用於製備抗體-類美登素結合物之示例性連接基團包括例如本文中描述之連接基團及以下中揭示之連接基團：美國專利第5208020號；EP專利0 425 235 B1；Chari等人Cancer Research 52：127-131(1992)；US 2005/0276812 A1；及US 2005/016993 A1，揭示內容以引用的方式明確併入本文中。
(2)阿瑞他汀及海兔毒素
藥物部分包括海兔毒素、阿瑞他汀及其類似物及衍生物(US 5635483；US 5780588；US 5767237；US 6124431)。阿瑞他汀為海洋軟體動物化合物海兔毒素-10之衍生物。雖然不欲受任何特定理論束縛，但海兔毒素及阿瑞他汀已展示干擾微管動力學、GTP水解及核及細胞分裂(Woyke等人(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.45(12)：3580-3584)且具有抗癌(US 5663149)及抗真菌活性(Pettit等人(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42：2961-2965)。海兔毒素/阿瑞他汀藥物部分可經由肽藥物部分之N(胺基)端或C(羧基)端附接於抗體(WO 02/088172；Doronina等人(2003)Nature Biotechnology 21(7)：778-784；Francisco等人(2003)Blood 102(4)：1458-1465)。
示例性阿瑞他汀實施例包括N端連接之單甲基阿瑞他汀藥物部分DE及DF，揭示於US 7498298及US 7659241(揭示內容以全文引用之方式明確併入)中：
其中DE及DF之波形線指示共價連接於抗體或抗體-連接子組分之位點，且在各位置獨立地：R2係選自H及C1-C8烷基；R3係選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環)、C3-C8雜環及C1-C8烷基-(C3-C8雜環)；R4係選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環)、C3-C8雜環及C1-C8烷基-(C3-C8雜環)；R5係選自H及甲基；或R4及R5共同形成碳環且具有式-(CRaRb)n-，其中Ra及Rb獨立地選自H、C1-C8烷基及C3-C8碳環且n係選自2、3、4、5及6；R6係選自H及C1-C8烷基；R7係選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環)、C3-C8雜環及C1-C8烷基-(C3-C8雜環)；各R8獨立地選自H、OH、C1-C8烷基、C3-C8碳環及O-(C1-C8烷基)；R9係選自H及C1-C8烷基；R10係選自芳基或C3-C8雜環；Z為O、S、NH或NR12，其中R12為C1-C8烷基；R11係選自H、C1-C20烷基、芳基、C3-C8雜環、-(R13O)m-R14或-(R13O)m-CH(R15)2； m為在1-1000範圍內之整數；R13為C2-C8烷基；R14為H或C1-C8烷基；R15每次出現時獨立地為H、COOH、-(CH2)n-N(R16)2、-(CH2)n-SO3H或-(CH2)n-SO3-C1-C8烷基；R16每次出現時獨立地為H、C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH；R18係選自-C(R8)2-C(R8)2-芳基、-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8雜環)及-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8碳環)；且n為在0至6範圍內之整數。
在一個實施例中，R3、R4及R7獨立地為異丙基或第二丁基且R5為-H或甲基。在一示例性實施例中，R3及R4各為異丙基，R5為-H，且R7為第二丁基。
在另一實施例中，R2及R6各為甲基，且R9為-H。
在另一實施例中，每次出現時R8為-OCH3。
在一示例性實施例中，R3及R4各為異丙基，R2及R6各為甲基，R5為-H，R7為第二丁基，R8每次出現時為-OCH3，且R9為-H。
在一個實施例中，Z為-O-或-NH-。
在一個實施例中，R10為芳基。
在一示例性實施例中，R10為-苯基。
在一示例性實施例中，當Z為-O-時，R11為-H、甲基或第三丁基。
在一個實施例中，當Z為-NH時，R11為-CH(R15)2，其中R15為-(CH2)n-N(R16)2，且R16為-C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH。
在另一個實施例中，當Z為-NH時，R11為-CH(R15)2，其中R15為-(CH2)n-SO3H。
式DE之一示例性阿瑞他汀實施例為MMAE，其中波形線指示與 抗體-藥物結合物之連接子(L)的共價附接：
式DF之一示例性阿瑞他汀實施例為MMAF，其中波形線指示與抗體-藥物結合物之連接子(L)的共價附接：
其他示例性實施例包括在五肽阿瑞他汀藥物部分之C端具有苯丙胺酸羧基修飾之單甲基纈胺酸化合物(WO 2007/008848)及在五肽阿瑞他汀藥物部分之C端具有苯丙胺酸側鏈修飾之單甲基纈胺酸化合物(WO 2007/008603)。
包含MMAE或MMAF及各種連接子組分之式I之ADC的非限制性示例性實施例具有以下結構及縮寫(其中「Ab」為抗體；p為1至約8，「Val-Cit」為纈胺酸-瓜胺酸二肽；且「S」為硫原子：
Ab-MC-vc-PAB-MMAF
Ab-MC-vc-PAB-MMAE
Ab-MC-MMAE
Ab-MC-MMAF
包含MMAF及各種連接子組分之式I之ADC的非限制性示例性實施例進一步包括Ab-MC-PAB-MMAF及Ab-PAB-MMAF。包含藉由非蛋白分解可裂解之連接子附接於抗體之MMAF的免疫結合物已展示具有與包含藉由蛋白分解可裂解連接子附接於抗體之MMAF的免疫結合物相當之活性(Doronina等人(2006)Bioconjugate Chem.17：114-124)。在一些此類實施例中，咸信藥物釋放由抗體在細胞中降解來實現。
通常，基於肽之藥物部分可藉由在兩個或兩個以上胺基酸及/或肽片段之間形成肽鍵來製備。例如根據液相合成方法可製備此類肽鍵(參見例如E.Schröder及K.Lübke,「The Peptides」，第1卷，第76-136頁，1965,Academic Press)。在一些實施例中，阿瑞他汀/海兔毒素藥物部分可根據以下之方法製備：US 7498298；US 5635483；US 5780588；Pettit等人(1989)J.Am.Chem.Soc.111：5463-5465；Pettit等人(1998)Anti-Cancer Drug Design 13：243-277；Pettit,G.R.等人，Synthesis,1996,719-725；Pettit等人(1996)J.Chem.Soc.Perkin Trans.1 5：859-863；及Doronina(2003)Nat.Biotechnol.21(7)：778-784。
在一些實施例中，式DE(諸如MMAE)及DF(諸如MMAF)之阿瑞他汀/海兔毒素藥物部分及其藥物-連接子中間物及衍生物(諸如MC-MMAF、MC-MMAE、MC-vc-PAB-MMAF及MC-vc-PAB-MMAE)可使用US 7498298、Doronina等人(2006)Bioconjugate Chem.17：114-124及Doronina等人(2003)Nat.Biotech.21：778-784製備，且接著結合於相關抗體。
(3)卡奇黴素
在一些實施例中，免疫結合物包含結合於一或多個卡奇黴素分子之抗體。抗生素之卡奇黴素家族及其類似物能夠在低於皮莫耳濃度下產生雙鏈DNA斷裂(Hinman等人，(1993)Cancer Research 53：3336-3342；Lode等人，(1998)Cancer Research 58：2925-2928)。卡奇黴素具有胞內作用位點，但在某些情況下，不容易跨過質膜。因此，在一些實施例中，此等藥劑經由抗體介導之內化的細胞吸收可大大增強其細胞毒性作用。製備具有卡奇黴素藥物部分之抗體-藥物結合物之非限制性示例性方法描述於例如US 5712374、US 5714586、US 5739116及US 5767285中。
在一些實施例中，結合於抗體之卡奇黴素藥物部分為具有下式之化合物： ，其中X為Br或I；L為連接子；R為氫、C1-6烷基或-C(=O)C1-6烷基；且Ra為氫或C1-6烷基。
在一些實施例中，X為Br，Ra為氫且R為異丙基。
在其他實施例中，X為Br，Ra為氫且R為乙基。
在其他實施例中，X為I，Ra為氫且R為異丙基。
在其他實施例中，X為I，Ra為氫且R為乙基。
在一些實施例中，X為Br，Ra為氫且R為-C(=O)CH3。
在其他實施例中，X為I，Ra為氫且R為-C(=O)CH3。
在其他實施例中，X為I，Ra為乙基且R為-C(=O)CH3。
在其他實施例中，X為Br，Ra為乙基且R為-C(=O)CH3。
(4)吡咯并苯并二氮呯
在一些實施例中，ADC包含吡咯并苯并二氮呯(PBD)。在一些實施例中，PDB二聚體識別且結合於特定DNA序列。天然產物安麯黴素(一種PBD)於1965年首次報導(Leimgruber等人，(1965)J.Am.Chem.Soc.,87：5793-5795；Leimgruber等人，(1965)J.Am.Chem.Soc.,87：5791-5793)。此後，已報導許多PBD，天然存在之PBD與類似物(Thurston等人，(1994)Chem.Rev.1994,433-465，包括三環PBD骨架之二聚體(US 6884799；US 7049311；US 7067511；US 7265105；US 7511032；US 7528126；US 7557099)。不欲受任何特定理論束縛，咸信二聚體結構用B形式DNA之小溝賦予適當等螺旋性三維形狀，使得在結合位點緊密貼合(Kohn,Antibiotics III.Springer-Verlag,New York，第3-11頁(1975)；Hurley及Needham-VanDevanter,(1986)Acc.Chem.Res.,19：230-237)。載有C2芳基取代基之二聚PBD化合物已展示適用作細胞毒性劑(Hartley等人(2010)Cancer Res.70(17)：6849-6858；Antonow(2010)J.Med.Chem.53(7)：2927-2941；Howard等人(2009)Bioorganic and Med.Chem.Letters 19(22)：6463-6466)。
在一些實施例中，PBD化合物可藉由在N10位置經活體內可移除之氮保護基保護而用作前藥(WO 00/12507；WO 2005/023814)。
PBD二聚體已結合於抗體且所得ADC展示具有抗癌特性(US 2010/0203007)。PBD二聚體上非限制性示例性連接位點包括五員吡咯環(PBD單元之間的繫栓子)及N10-C11亞胺基(WO 2009/016516；US 2009/304710；US 2010/047257；US 2009/036431；US 2011/0256157；WO 2011/130598)。
ADC之非限制性示例性PBD二聚體組分具有式A：
及其鹽及溶劑合物，其中：波形線指示共價附接於連接子之位點；點線指示C1與C2或C2與C3之間視情況存在雙鍵；R2獨立地選自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R及COR，且視情況進一步選自鹵基或二鹵基，其中RD獨立地選自R、CO2R、COR、CHO、CO2H及鹵基；R6及R9獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；R7獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；Q獨立地選自O、S及NH；R11為H或R，或其中Q為O、SO3M，其中M為金屬陽離子；R及R'各獨立地選自視情況經取代之C1-8烷基、C1-12烷基、C3-8雜環基、C3-20雜環及C5-20芳基，且視情況關於基團NRR'，R及R'連同其附接之氮原子一起形成視情況經取代之4、5、6或7員雜環；R12、R16、R19及R17係如分別針對R2、R6、R9及R7所定義；R"為C3-12伸烷基，該鏈可雜有一或多個雜原子，例如O、S、N(H)、NMe及/或芳環，例如苯或吡啶，該等環視情況經取代；且X及X'獨立地選自O、S及N(H)。
在一些實施例中，R及R'各獨立地選自視情況經取代之C1-12烷基、C3-20雜環及C5-20芳基，且視情況關於基團NRR'，R及R'連同其附接之氮原子一起形成視情況經取代之4、5、6或7員雜環。
在一些實施例中，R9及R19為H。
在一些實施例中，R6及R16為H。
在一些實施例中，R7為R17均為OR7A，其中R7A為視情況經取代之C1-4烷基。在一些實施例中，R7A為Me。在一些實施例中，R7A為Ch2Ph，其中Ph為苯基。
在一些實施例中，X為O。
在一些實施例中，R11為H。
在一些實施例中，各單體單元中C2與C3之間存在雙鍵。
在一些實施例中，R2及R12獨立地選自H及R。在一些實施例中，R2及R12獨立地為R。在一些實施例中，R2及R12獨立地為視情況經取代之C5-20芳基或C5-7芳基或C8-10芳基。在一些實施例中，R2及R12獨立地為視情況經取代之苯基、噻吩基、萘基、吡啶基、喹啉基或異喹啉基。在一些實施例中，R2及R12獨立地選自=O、=CH2、=CH-RD及=C(RD)2。在一些實施例中，R2及R12各為=CH2。在一些實施例中，R2及R12各為H。在一些實施例中，R2及R12各為=O。在一些實施例中，R2及R12各為=CF2。在一些實施例中，R2及/或R12獨立地為=C(RD)2。在一些實施例中，R2及/或R12獨立地為=CH-RD。
在一些實施例中，當R2及/或R12為=CH-RD時，各基團可獨立地具有下文所示之任一組態：
在一些實施例中，=CH-RD呈組態(I)。
在一些實施例中，R"為C3伸烷基或C5伸烷基。
在一些實施例中，ADC之一示例性PBD二聚體組分具有式A(I)之 結構： 其中n為0或1。
在一些實施例中，ADC之一示例性PBD二聚體組分具有式A(II)之結構： 其中n為0或1。
在一些實施例中，ADC之一示例性PBD二聚體組分具有式A(III)之結構： 其中RE及RE"各獨立地選自H或RD，其中RD如上所定義；且其中n為0或1。
在一些實施例中，n為0。在一些實施例中，n為1。在一些實施例中，RE及/或RE"為H。在一些實施例中，RE及RE"為H。在一些實施例中，RE及/或RE"為RD，其中RD為視情況經取代之C1-12烷基。在一些實施例中，RE及/或RE"為RD，其中RD為甲基。
在一些實施例中，ADC之一示例性PBD二聚體組分具有式A(IV)之結構： 其中Ar1及Ar2各獨立地為視情況經取代之C5-20芳基；其中Ar1及Ar2可相同或不同；且其中n為0或1。
在一些實施例中，ADC之示例性PBD二聚體組分具有式A(V)之結構： 其中Ar1及Ar2各獨立地為視情況經取代之C5-20芳基；其中Ar1及Ar2可相同或不同；且其中n為0或1。
在一些實施例中，Ar1及Ar2各獨立地選自視情況經取代之苯基、呋喃基、噻吩基及吡啶基。在一些實施例中，Ar1及Ar2各獨立地為視情況經取代之苯基。在一些實施例中，Ar1及Ar2各獨立地為視情況經取代之噻吩-2-基或噻吩-3-基。在一些實施例中，Ar1及Ar2各獨立地為視情況經取代之喹啉基或異喹啉基。喹啉基或異喹啉基可經由任何可用環位置結合於PBD核心。舉例而言，喹啉基可為喹啉-2-基、喹啉-3-基、喹啉-4-基、喹啉-5-基、喹啉-6-基、喹啉-7-基及喹啉-8-基。在一些實施例中，喹啉基係選自喹啉-3-基及喹啉-6-基。異喹啉基可為異喹啉-1-基、異喹啉-3-基、異喹啉-4-基、異喹啉-5-基、異喹啉-6-基、異喹啉-7-基及異喹啉-8-基。在一些實施例中，異喹啉基係選自異喹啉-3-基及異喹啉-6-基。
ADC之其他非限制性示例性PBD二聚體組分具有式B：
及其鹽及溶劑合物，其中：波形線指示共價附接於連接子之位點；連接於OH之波形線指示S或R組態；RV1及RV2獨立地選自H、甲基、乙基及苯基(該苯基可視情況經氟取代，尤其在4位置中)及C5-6雜環基；其中RV1及RV2可相同或不同；且n為0或1。
在一些實施例中，RV1及RV2獨立地選自H、苯基及4-氟苯基。
在一些實施例中，連接子可附接在PBD二聚體藥物部分之各種位點之一，包括B環之N10亞胺、C環之C-2內/外位置或連接A環之繫栓單元(參見以下結構C(I)及C(II))。
ADC之非限制性示例性PBD二聚體組分包括式C(I)及C(II)：
式C(I)及C(II)呈其N10-C11亞胺形式展示。示例性PBD藥物部分亦包括甲醇胺以及經保護之甲醇胺形式，如下表中所示：
其中：X為CH2(n=1至5)、N或O；Z及Z'獨立地選自OR及NR2，其中R為含有1至5個碳原子之一級、二級或三級烷基鏈；R1、R'1、R2及R'2各獨立地選自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C5-20芳基(包括經取代之芳基)、C5-20雜芳基、-NH2、-NHMe、-OH及-SH，其中在一些實施例中，烷基、烯基及炔基鏈包含至多5個碳原子；R3及R'3獨立地選自H、OR、NHR及NR2，其中R為含有1至5個碳原子之一級、二級或三級烷基鏈；R4及R'4獨立地選自H、Me及OMe；R5係選自C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C5-20芳基(包括經鹵基、硝基、氰基、烷氧基、烷基、雜環基取代之芳基)及C5-20雜芳基，其中在一些實施例中，烷基、烯基及炔基鏈包含至多5個碳原子；R11為H、C1-C8烷基或保護基(諸如乙醯基、三氟乙醯基、第三丁氧羰基(BOC)、苯甲基氧基羰基(CBZ)、9-茀基亞甲基氧基羰基(Fmoc)或包含自分解型單元之部分，諸如纈胺酸-瓜胺酸-PAB)；R12為H、C1-C8烷基或保護基；其中R1、R'1、R2、R'2、R5或R12中之一者之氫或A環之間的-OCH2CH2(X)nCH2CH2O-間隔子之氫經連接於ADC之連接子之鍵置換。
ADC之示例性PBD二聚體部分包括(但不限於)(波形線指示共價附接於連接子之位點)： 包含PBD二聚體之ADC之非限制性示例性實施例具有以下結構： PBD二聚體-val-cit-PAB-Ab；
PBD二聚體-Phe-Lys-PAB-Ab，其中：n為0至12。在一些實施例中，n為2至10。在一些實施例中，n為4至8。在一些實施例中，n係選自4、5、6、7及8。
在一些實施例中，包含本文中描述之PBD二聚體之ADC可藉由包括吡啶離去基之連接子-藥物中間物經由硫原子與抗體之半胱胺酸硫醇結合以形成雙硫鍵來製備。此外，在一些實施例中，包含本文中描 述之PBD二聚體之ADC可藉由結合包括硫基吡啶基之連接子-藥物中間物來製備，其中吡啶環經一或多個硝基取代。在一些實施例中，吡啶環經-NO2單取代。在一些實施例中，-NO2單取代相對於二硫鍵為對位。在一些實施例中，PBD二聚體經由N10位置連接。舉例而言，包含PBD二聚體之非限制性示例性ADC可藉由單甲基乙基吡啶基二硫化物、N10連接之PBD連接子中間物(以下展示)結合於抗體來製備：
PBD二聚體-val-cit-PAB-Ab及PBD二聚體-Phe-Lys-PAB-Ab之連接子為蛋白酶可裂解的，而PBD二聚體-順丁烯二醯亞胺-縮醛之連接子對酸為不穩定的。
PBD二聚體及包含PBD二聚體之ADC可根據此項技術中已知之方法製備。參見例如WO 2009/016516；US 2009/304710；US 2010/047257；US 2009/036431；US 2011/0256157；WO 2011/130598；WO 2013/055987。
(5)蒽環黴素
在一些實施例中，ADC包含蒽環黴素。蒽環黴素為顯示細胞毒活性之抗生素化合物。雖然不欲受任何特定理論束縛，但研究已指示蒽環黴素可藉由許多不同機制用以殺死細胞，包括：1)藥物分子插入細胞DNA中，藉此抑制DNA依賴性核酸合成；2)藉由藥物產生自由基，接著自由基與細胞大分子反應，對細胞造成損害，及/或3)藥物分子與細胞膜相互作用(參見例如C.Peterson等人，「Transport And Storage Of Anthracycline In Experimental Systems And Human Leukemia」,Anthracycline Antibiotics In Cancer Therapy；N.R. Bachur,「Free Radical Damage」同上第97-102頁)。因為具有細胞毒性潛能，所以蒽環黴素已用於治療大量癌症，諸如白血病、乳癌、肺癌、卵巢腺癌及肉瘤(參見例如P.H-Wiernik,Anthracycline：Current Status And New Developments第11頁)。
非限制性示例性蒽環黴素包括小紅莓、表柔比星、艾達黴素、道諾黴素、奈莫柔比星及其衍生物。已製備及研究道諾黴素及小紅莓之免疫結合物及前藥(Kratz等人(2006)Current Med.Chem.13：477-523；Jeffrey等人(2006)Bioorganic & Med.Chem.Letters 16：358-362；Torgov等人(2005)Bioconj.Chem.16：717-721；Nagy等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：829-834；Dubowchik等人(2002)Bioorg.& Med.Chem.Letters 12：1529-1532；King等人(2002)J.Med.Chem.45：4336-4343；EP 0328147；US 6630579)。抗體-藥物結合物BR96-小紅莓與腫瘤相關抗原路易斯-Y(Lewis-Y)特異性反應且已在I及II階段研究中評估(Saleh等人(2000)J.Clin.Oncology 18：2282-2292；Ajani等人(2000)Cancer Jour.6：78-81；Tolcher等人(1999)J.Clin.Oncology 17：478-484)。
PNU-159682為奈莫柔比星之有效代謝物(或衍生物)(Quintieri等人(2005)Clinical Cancer Research 11(4)：1608-1617)。奈莫柔比星為在小紅莓之糖苷胺基上具有2-甲氧基嗎啉基之小紅莓半合成類似物，且已處於臨床評定下(Grandi等人(1990)Cancer Treat.Rev.17：133；Ripamonti等人(1992)Brit.J.Cancer 65：703)，包括針對肝細胞癌之階段II/III試驗(Sun等人(2003)Proceedings of the American Society for Clinical Oncology 22,Abs1448；Quintieri(2003)Proceedings of the American Association of Cancer Research，第44：1版，Abs 4649；Pacciarini等人(2006)Jour.Clin.Oncology 24：14116)。
包含奈莫柔比星或奈莫柔比星衍生物之一非限制性示例性ADC 展示於式Ia中：
其中R1為氫原子、羥基或甲氧基，且R2為C1-C5烷氧基，或其醫藥學上可接受之鹽；L1及Z一起為如本文所述之連接子(L)；T為如本文所述之抗體(Ab)；且m為1至約20。在一些實施例中，m為1至10、1至7、1至5或1至4。
在一些實施例中，R1及R2均為甲氧基(-OMe)。
包含奈莫柔比星或奈莫柔比星衍生物之另一非限制性示例性ADC展示於式Ib中：
其中R1為氫原子、羥基或甲氧基，且R2為C1-C5烷氧基，或其醫藥學上可接受之鹽；L2及Z一起為如本文所述之連接子(L)； T為如本文所述之抗體(Ab)；且m為1至約20。在一些實施例中，m為1至10、1至7、1至5或1至4。
在一些實施例中，R1及R2均為甲氧基(-OMe)。
在一些實施例中，含奈莫柔比星之ADC之奈莫柔比星組分為PNU-159682。在一些此類實施例中，ADC之藥物部分可具有以下結構之一： 其中波形線指示連接於連接子(L)。
包括PNU-159682之蒽環黴素可經由若干連接位點及多種連接子結合於抗體(US 2011/0076287；WO2009/099741；US 2010/0034837；WO 2010/009124)，包括本文中描述之連接子。
包含奈莫柔比星及連接子之示例性ADC包括(但不限於)： PNU-159682順丁烯二醯亞胺縮醛-Ab； PNU-159682-val-cit-PAB-Ab； PNU-159682-val-cit-PAB-間隔子-Ab； PNU-159682-val-cit-PAB-間隔子(R1R2)-Ab，其中：R1及R2獨立地選自H及C1-C6烷基；且
PNU-159682-順丁烯二醯亞胺-Ab。
PNU-159682順丁烯二醯亞胺縮醛-Ab之連接子對酸為不穩定的，而PNU-159682-val-cit-PAB-Ab,PNU-159682-val-cit-PAB-間隔子-Ab及PNU-159682-val-cit-PAB-間隔子(R1R2)-Ab為蛋白酶可裂解的。
(6)1-(氯甲基)-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚(CBI)二聚體藥物部分
在一些實施例中，ADC包含1-(氯甲基)-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚 (CBI)。DNA小溝烷基化劑之5-胺基-1-(氯甲基)-1,2-二氫-3H-苯并[e]吲哚(胺基CBI)類別為有效細胞毒素(Atwell等人(1999)J.Med.Chem.,42：3400)，且已在設計用於癌症療法之許多類別前藥中用作效應單元。此等包括抗體結合物(Jeffrey等人(2005)J.Med.Chem.,48：1344)、基於胺基甲酸硝基苯甲酯之用於基因療法的前藥(Hay等人(2003)J.Med.Chem.46：2456)及呈低氧活化之前藥形式之對應硝基-CBI衍生物(Tercel等人(2011)Angew.Chem.,Int.Ed.,50：2606-2609)。CBI及吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯(PBD)藥效團已藉由烷基鏈連接在一起(Tercel等人(2003)J.Med.Chem 46：2132-2151)。
在一些實施例中，ADC包含1-(氯甲基)-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚(CBI)二聚體(WO 2015/023355)。在一些此類實施例中，二聚體為其中二聚體之一半為CBI部分且二聚體之另一半為PBD部分的雜二聚體。
在一些實施例中，CBI二聚體包含下式： 其中：R1係選自H、P(O)3H2、C(O)NRaRb或鍵結於連接子(L)之鍵；R2係選自H、P(O)3H2、C(O)NRaRb或鍵結於連接子(L)之鍵；Ra及Rb獨立地選自H及視情況經一或多個F取代之C1-C6烷基，或Ra及Rb形成五或六員雜環基；T為選自C3-C12伸烷基、Y、(C1-C6伸烷基)-Y-(C1-C6伸烷基)、(C1-C6伸烷基)-Y-(C1-C6伸烷基)-Y-(C1-C6伸烷基)、(C2-C6伸烯基)-Y- (C2-C6伸烯基)及(C2-C6伸炔基)-Y-(C2-C6伸炔基)之繫栓基團；其中Y獨立地選自O、S、NR1、芳基及雜芳基；其中伸烷基、伸烯基、芳基及雜芳基獨立且視情況經F、OH、O(C1-C6烷基)、NH2、NHCH3、N(CH3)2、OP(O)3H2及C1-C6烷基取代，其中烷基視情況經一或多個F取代；或伸烷基、伸烯基、芳基及雜芳基獨立且視情況經鍵結於L之鍵取代；D'為選自以下各者之藥物部分：
其中波形線指示與T之附接位點；X1及X2獨立地選自O及NR3，其中R3係選自H及視情況經一或多個F取代之C1-C6烷基；R4為H、CO2R或鍵結於連接子(L)之鍵，其中R為C1-C6烷基或苯甲基；且R5為H或C1-C6烷基。
(7)毒傘毒素(Amatoxin)
在一些實施例中，免疫結合物包含結合於一或多個毒傘毒素分子之抗體。毒傘毒素為由8個胺基酸構成之環狀肽。其可自條蕈(Amanita phalloides)蘑菇中分離或以合成方式製備。毒傘毒素特異性抑制哺乳動物細胞之DNA依賴性RNA聚合酶II，且藉此亦抑制所影響細胞之轉錄及蛋白質生物合成。細胞中轉錄之抑制引起生長及增殖停止。參見例如Moldenhauer等人JNCI 104：1-13(2012)、WO2010115629、WO2012041504、WO2012119787、WO2014043403、WO2014135282及WO2012119787，其以全文引用的方式併入本文中。在一些實施例中，一或多個毒傘毒素分子為一或多個α-瓢菌素分子。
(8)其他藥物部分
藥物部分亦包括格爾德黴素(geldanamycin)(Mandler等人(2000)J.Nat.Cancer Inst.92(19)：1573-1581；Mandler等人(2000)Bioorganic & Med.Chem.Letters 10：1025-1028；Mandler等人(2002)Bioconjugate Chem.13：786-791)；及酶活性毒素及其片段，包括(但不限於)白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、篦麻毒素A鏈、相思子毒素A鏈、莫迪素A鏈、α-帚麴菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、康乃馨蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制劑、白樹素、有絲分裂素、侷限麴菌素、酚黴素、伊諾黴素(enomycin)及黴菌毒素(tricothecene)。參見例如WO 93/21232。
藥物部分亦包括具有溶核活性之化合物(例如核糖核酸酶或DNA核酸內切酶)。
在某些實施例中，免疫結合物可包含高度放射性原子。多種放 射性同位素可用於產生放射性結合之抗體。實例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素。在一些實施例中，當免疫結合物用於偵測時，其可包含用於閃爍攝影研究之放射性原子，例如TC99m或I123；或用於核磁共振(NMR)成像(亦稱磁共振成像，MRI)之自旋標記物，諸如鋯-89、碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。鋯-89可與各種金屬螯合劑錯合且結合於抗體，例如用於PET成像(WO 2011/056983)。
放射性或其他標記可以已知方式併入免疫結合物中。舉例而言，肽可使用包含例如一或多個氟-19原子代替一或多個氫之適合胺基酸前驅物生物合成或化學合成。在一些實施例中，諸如Tc99、I123、Re186、Re188及In111之標記可經由抗體中之半胱胺酸殘基附接。在一些實施例中，釔-90可經由抗體之離胺酸殘基附接。在一些實施例中，IODOGEN方法(Fraker等人(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80：49-57)可用於併入碘-123。「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal,CRC Press 1989)描述某些其他方法。
在某些實施例中，免疫結合物可包含結合於前藥活化酶之抗體。在一些此類實施例中，前藥活化酶將前藥(例如肽基化學治療劑，參見WO 81/01145)轉化為活性藥物，諸如抗癌藥物。在一些實施例中，此類免疫結合物適用於抗體依賴性酶介導之前藥療法(「ADEPT」)。可結合於抗體之酶包括(但不限於)鹼性磷酸酶，其適用於將含磷酸酯基之前藥轉變成游離藥物；芳基硫酸酯酶，其適用於將含硫酸酯基之前藥轉變成游離藥物；胞嘧啶去胺酶，其適用於將無毒5-氟胞嘧啶轉變成抗癌藥物5-氟尿嘧啶；蛋白酶，諸如沙雷菌屬蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧基肽酶及組織蛋白酶(諸如組織蛋白酶B及L)，其適用於將含肽前藥轉變成游離藥物；D-丙胺 醯基羧基肽酶，其適用於轉變含有D-胺基酸取代基之前藥；碳水化合物裂解酶，諸如β-半乳糖苷酶及神經胺酸苷酶，其適用於將糖基化前藥轉變成游離藥物；β-內醯胺酶，其適用於將經β-內醯胺衍生之藥物轉變成游離藥物；以及青黴素醯胺酶，諸如青黴素V醯胺酶及青黴素G醯胺酶，其適用於將分別在胺氮經苯氧基乙醯基或苯乙基衍生之藥物轉變成游離藥物。在一些實施例中，酶可藉由此項技術中熟知之重組DNA技術共價結合於抗體。參見例如Neuberger等人，Nature 312：604-608(1984)。
c)藥物負載
藥物負載由p表示，為式I之分子中每個抗體之藥物部分之平均數目。藥物負載可在每個抗體1至20個藥物部分(D)之範圍內。式I之ADC包括與1至20個之範圍的藥物部分結合之抗體的集合。在由結合反應製備ADC時，每個抗體之藥物部分之平均數目可藉由諸如質譜分析、ELISA分析及HPLC之習知方式表徵。亦可測定就p而言之ADC之定量分佈。在一些情況下，可藉由諸如逆相HPLC或電泳之方式來實現其中p為來自具有其他藥物負載之ADC之一定值的均質ADC之分離、純化及表徵。
對於一些抗體-藥物結合物，p可受抗體上之附著位點之數目限制。舉例而言，在附接為半胱胺酸硫醇之情況下，如在以上某些示例性實施例中，抗體可僅僅具有一個或若干個半胱胺酸硫醇基，或可僅僅具有一個或若干個可附接連接子之足夠反應性硫醇基。在某些實施例中，較高藥物負載(例如p>5)可造成某些抗體-藥物結合物之凝聚、不可溶性、毒性或細胞滲透性喪失。在某些實施例中，ADC之平均藥物負載在1至約8、約2至約6或約3至約5之範圍內。實際上，已展示對於某些ADC而言，每個抗體之藥物部分的最佳比率可小於8，且可為約2至約5(US 7498298)。
在某些實施例中，在結合反應期間使少於理論最大值之藥物部分結合於抗體。抗體可含有例如不與藥物-連接子中間產物或連接子試劑反應的離胺酸殘基，如下文所論述。一般而言，抗體不含許多可連接於藥物部分之游離及反應性半胱胺酸硫醇基；實際上抗體中之大部分半胱胺酸硫醇殘基以二硫橋鍵之形式存在。在某些實施例中，抗體可用諸如二硫蘇糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP)之還原劑在部分或完全還原條件下還原，產生反應性半胱胺酸硫醇基。在某些實施例中，抗體經受變性條件，展現反應性親核基團，諸如離胺酸或半胱胺酸。
ADC之負載(藥物/抗體比率)可用不同方式控制，且例如藉由如下來控制：(i)限制藥物-連接子中間物或連接子試劑相對於抗體之莫耳過量；(ii)限制結合反應時間或溫度；及(iii)針對半胱胺酸硫醇修飾之部分或限制性還原條件。
應瞭解在一個以上親核基團與藥物-連接子中間物或連接子試劑反應之情況下，所得產物為具有一或多個藥物部分附接於抗體之分佈的ADC化合物之混合物。每個抗體之藥物之平均數目可藉由雙重ELISA抗體分析自混合物計算，該分析對抗體具有特異性且對藥物具有特異性。個別ADC分子可在混合物中藉由質譜分析鑑別，且藉由HPLC，例如疏水相互作用層析法分離(參見例如McDonagh等人(2006)Prot.Engr.Design & Selection 19(7)：299-307；Hamblett等人(2004)Clin.Cancer Res.10：7063-7070；Hamblett,K.J.等人「Effect of drug loading on the pharmacology,pharmacokinetics,and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate,」文摘號624,American Association for Cancer Research,2004 Annual Meeting,2004年3月27-31日，Proceedings of the AACR，第45卷，2004年3月；Alley,S.C.等人「Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates,」文摘號627,American Association for Cancer Research,2004 Annual Meeting,2004年3月27-31日，Proceedings of the AACR，第45卷，2004年3月)。在某些實施例中，具有單一負載值之均質ADC可藉由電泳或層析法自結合物混合物分離。
表A之抗體藥物結合物51-58可藉由使藥物部分與連接子試劑偶合且根據WO 2013/055987、WO 2015/023355、WO 2010/009124、WO 2015/095227之程序，且與包括本文所述之半胱胺酸工程改造抗體的任一抗-CLL1抗體結合來製備。特定抗體-藥物結合物敍述於表B中。
其他示例性抗體藥物結合物包括： ；及/或
應注意為簡單起見，以上結構及ADC 51至58之彼等結構僅僅展示一個連接子-藥物基團附接於抗體。如上文所提及，一個以上連接子-藥物基團可附接於抗體。
DAR=藥物/抗體比率平均值
A118C(EU編號)=A121C(順序編號)=A114C(Kabat編號)
野生型(「WT」)、半胱胺酸工程改造突變抗體(「硫基」)、輕鏈(「LC」)、重鏈(「HC」)、6-順丁烯二醯亞胺基己醯基(「MC」)、順丁烯二醯亞胺基丙醯基(「MP」)、纈胺酸-瓜胺酸(「val-cit」或「vc」)、丙胺酸-苯丙胺酸(「ala-phe」)、對胺基苯甲基(「PAB」)及對胺基苯甲氧基羰基(「PABC」)
d)製備免疫結合物之某些方法
式I之ADC可藉由若干途徑，採用熟習此項技術者已知之有機化學反應、條件及試劑製備，包括以下：(1)抗體之親核基團與二價連接子試劑反應，經由共價鍵形成Ab-L，接著與藥物部分D反應；及(2)藥物部分之親核基團與二價連接子試劑反應，經由共價鍵形成D-L，接著與抗體之親核基團反應。經由後一途徑製備式I之ADC的示例性方法描述於以引用的方式明確併入本文中之US 7498298中。
抗體上之親核基團包括(但不限於)：(i)N端胺基；(ii)側鏈胺基，例如離胺酸；(iii)側鏈硫醇基，例如半胱胺酸；及(iv)在抗體發生糖基化下糖羥基或胺基。胺、硫醇及羥基為親核性的且能夠與連接子部分及連接子試劑上之親電基團反應形成共價鍵，該等親電基團包括：(i)活性酯，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵基甲酸酯及酸鹵化物；(ii)烷基及苯甲基鹵化物，諸如鹵乙醯胺；及(iii)醛、酮、羧基及順丁烯二醯亞胺基。某些抗體具有可還原之鏈間二硫鍵，亦即半胱胺酸橋鍵。藉由用諸如DTT(二硫蘇糖醇)或三羰基乙基膦(TCEP)之還原劑處 理，使得抗體完全或部分還原，可使抗體具有反應性，以與連接子試劑結合。理論上各半胱胺酸橋鍵將因此形成兩個反應性硫醇親核體。可經由例如使離胺酸殘基與2-亞胺基硫雜環戊烷(妥特氏試劑(Traut's reagent))反應，修飾離胺酸殘基，使胺轉化成硫醇，而將額外親核基團引入抗體中。亦可藉由引入一個、兩個、三個、四個或更多個半胱胺酸殘基(例如藉由製備包含一或多個非天然半胱胺酸胺基酸殘基之變異抗體)，而將反應性硫醇基引入抗體中。
本發明之抗體-藥物結合物亦可藉由抗體上之親電基團(諸如醛或酮羰基)與連接子試劑或藥物上之親核基團之間發生反應來產生。連接子試劑上之適用親核基團包括(但不限於)醯肼、肟、胺基、肼、硫半卡巴肼、肼羧酸酯及芳基醯肼。在一個實施例中，抗體經修飾以引入能夠與連接子試劑或藥物上之親核取代基反應之親電部分。在另一個實施例中，糖基化抗體之糖可例如用過碘酸鹽氧化試劑氧化，以形成醛基或酮基，其可與連接子試劑或藥物部分之胺基反應。所得亞胺希夫鹼(Schiff base)基團可形成穩定鍵，或可例如藉由硼氫化物試劑還原，以形成穩定之胺鍵。在一個實施例中，糖基化抗體之碳水化合物部分與半乳糖氧化酶或偏過碘酸鈉反應可在抗體中產生羰基(醛及酮)，其可與藥物(Hermanson,Bioconjugate Techniques)上之適當基團反應。在另一個實施例中，含有N端絲胺酸或蘇胺酸殘基之抗體可與偏過碘酸鈉反應，產生醛代替第一胺基酸(Geoghegan及Stroh,(1992)Bioconjugate Chem.3：138-146；US 5362852)。此類醛可與藥物部分或連接子親核試劑反應。
藥物部分上之示例性親核基團包括(但不限於)：能夠與連接子部分及連接子試劑上之親電基團反應形成共價鍵的胺、硫醇、羥基、醯肼、肟、肼、硫半卡巴肼、肼羧酸酯及芳基醯肼基團，該等親電基團包括：(i)活性酯，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵基甲酸酯及酸鹵化物； (ii)烷基及苯甲基鹵化物，諸如鹵乙醯胺；及(iii)醛、酮、羧基及順丁烯二醯亞胺基。
可用於製備ADC之非限制性示例性交聯試劑在本文中描述於標題為「示例性連接子」之章節下。使用此類交聯試劑連接兩個部分，包括蛋白質部分及化學部分之方法為此項技術中已知。在一些實施例中，包含抗體及細胞毒性劑之融合蛋白可例如藉由重組技術或肽合成來製備。重組DNA分子可包含編碼結合物之抗體及細胞毒性部分的區域，該等區域彼此相鄰或由編碼不破壞結合物之所需特性之連接子肽的區域分離。
在又一實施例中，抗體可結合於「受體」(諸如抗生蛋白鏈菌素)，以用於腫瘤預先靶向中，其中抗體-受體結合物投與患者，接著使用清除劑將未結合之結合物自循環中移除且接著投與結合於細胞毒性劑(例如藥物或放射性核苷酸)之「配位體」(例如抗生素蛋白)。
E.用於診斷及偵測之方法及組合物
在某些實施例中，任一本文提供之抗-CLL-1抗體適用於偵測生物樣品中CLL-1之存在。如本文所用，術語「偵測」涵蓋定量或定性偵測。「生物樣品」包含例如細胞或組織(例如生檢材料，包括癌性或可能癌性淋巴組織，諸如淋巴細胞、淋巴母細胞、單核細胞、骨髓單核細胞及其混合物)。
在一個實施例中，提供一種用於診斷或偵測方法之抗-CLL-1抗體。在另一態樣中，提供一種偵測生物樣品中CLL-1之存在的方法。在某些實施例中，該方法包含使生物樣品與如本文所述之抗-CLL-1抗體在允許抗-CLL-1抗體結合於CLL-1之條件下接觸，且偵測抗-CLL-1抗體與生物樣品中CLL-1之間是否形成複合物。此類方法可為活體外或活體內方法。在一個實施例中，抗-CLL-1抗體用於選擇適於用抗-CLL-1抗體治療之個體，例如其中CLL-1為選擇患者之生物標記物。 在另一個實施例中，生物樣品為細胞或組織。
在另一個實施例中，抗-CLL-1抗體活體內用於例如藉由活體內成像來偵測個體之CLL-1陽性癌症，例如以診斷、預後癌症或將癌症分期，確定適當治療過程，或監測癌症對療法之反應。一種此項技術中已知用於活體內偵測之方法為免疫-正電子發射斷層攝影法(免疫-PET)，如例如van Dongen等人，The Oncologist 12：1379-1389(2007)及Verel等人，J.Nucl.Med.44：1271-1281(2003)中所述。在此類實施例中，提供一種用於偵測個體之CLL-1陽性癌症的方法，該方法包含向患有或懷疑患有CLL-1陽性癌症之個體投與經標記之抗-CLL-1抗體，且偵測該個體中經標記之抗-CLL-1抗體，其中該經標記之抗-CLL-1抗體之偵測指示該個體患有CLL-1陽性癌症。在某些此類實施例中，經標記之抗-CLL-1抗體包含與諸如68Ga、18F、64Cu、86Y、76Br、89Zr及124I之正電子發射體結合之抗-CLL-1抗體。在一特定實施例中，正電子發射體為89Zr。
在其他實施例中，診斷或偵測之方法包含使固定於基質之第一抗-CLL-1抗體與待測試CLL-1之存在的生物樣品接觸，將該基質暴露於第二抗-CLL-1抗體，且偵測該生物樣品中該第二抗-CLL-1是否結合於該第一抗-CLL-1抗體與CLL-1之間的複合物。基質可為任何支撐介質，例如玻璃、金屬、陶瓷、聚合物珠粒、載玻片、晶片及其他基質。在某些實施例中，生物樣品包含細胞或組織。在某些實施例中，第一或第二抗-CLL-1抗體為任一本文所述之抗體。
可根據任一以上實施例診斷或偵測的示例性病症包括CLL-1陽性癌症，諸如CLL-1陽性AML、CLL-1陽性CML、CLL-1陽性MDS、CLL-1陽性慢性骨髓單核細胞性白血病、CLL-1陽性APL、CLL-1陽性慢性骨髓增生病症、CLL-1陽性血小板性白血病、CLL-1陽性pre-B-ALL、CLL-1陽性preT-ALL、CLL-1-陽性多發性骨髓瘤、CLL-1陽性 肥大細胞疾病、CLL-1陽性肥大細胞白血病、CLL-1陽性肥大細胞肉瘤、CLL-1陽性骨髓肉瘤、CLL-1陽性淋巴性白血病及CLL-1陽性未分化之白血病。在一些實施例中，CLL-1陽性癌症為在本文實例B中描述之條件下抗-CLL-1免疫組織化學(IHC)或原位雜交(ISH)評分超過「0」之癌症，0對應於超過90%腫瘤細胞中染色非常弱或無染色。在另一個實施例中，CLL-1陽性癌症以如在本文實例B中描述之條件下所定義，1+、2+或3+水準表現CLL-1。在一些實施例中，CLL-1陽性癌症為根據偵測CLL-1 mRNA之逆轉錄酶PCR(RT-PCR)分析表現CLL-1的癌症。在一些實施例中，RT-PCR為定量RT-PCR。
在某些實施例中，提供經標記之抗-CLL-1抗體。標記包括(但不限於)直接偵測之標記或部分(諸如螢光、發色、電子緻密、化學發光及放射性標記)，以及例如經由酶促反應或分子相互作用間接偵測之部分(諸如酶或配位體)。示例性標記包括(但不限於)放射性同位素32P、14C、125I、3H及131I；螢光團，諸如稀土螯合物或螢光素及其衍生物；若丹明及其衍生物；丹醯基；傘酮；螢光素酶，例如螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶(美國專利第4,737,456號)；螢光素；2,3-二氫酞嗪二酮；辣根過氧化酶(HRP)；鹼性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖澱粉酶；溶菌酶；醣氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸去氫酶；雜環氧化酶，諸如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶，其與採用過氧化氫氧化染料前驅體之酶(諸如HRP、乳過氧化酶或微過氧化酶)偶合；生物素/抗生物素蛋白；自旋標記；噬菌體標記；穩定自由基及其類似標記。在另一個實施例中，標記為正電子發射體。正電子發射體包括(但不限於)68Ga、18F、64Cu、86Y、76Br、89Zr及124I。在一特定實施例中，正電子發射體為89Zr。
F.醫藥調配物
如本文所述之抗-CLL-1抗體或免疫結合物之醫藥調配物藉由將 具有所需純度之此類抗體或免疫結合物與一或多種視情況選用之醫藥學上可接受之載劑混合來製備(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.編輯(1980))，呈凍乾調配物或水溶液形式。醫藥學上可接受之載劑在所用劑量及濃度下一般對接受者而言無毒，且包括(但不限於)：緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苯甲基銨；氯化六羥季銨；氯化苯甲烴銨；苄索氯銨(benzethonium chloride)；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷酯，諸如對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖類，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子型界面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)。本文中之示例性醫藥學上可接受之載劑進一步包括間質藥物分散劑，諸如可溶性中性活性玻尿酸酶醣蛋白(sHASEGP)，例如人類可溶性PH-20玻尿酸酶醣蛋白，諸如rHuPH20(HYLENEX®，Baxter International,Inc.)。某些示例性sHASEGP及使用方法，包括rHuPH20，描述於美國專利公開案第2005/0260186號及第2006/0104968號中。在一個態樣中，sHASEGP與一或多種其他葡萄糖胺聚糖酶(諸如軟骨素酶)組合。
示例性凍乾抗體或免疫結合物調配物描述於美國專利第6,267,958號中。抗體或免疫結合物調配物水溶液包括美國專利第6,171,586號及WO2006/044908中描述之抗體或免疫結合物調配物水溶液，後者之調配物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝液。
本文中之調配物亦可含有一種以上為所治療之特定適應症所必需之活性成分，較佳為具有不會對彼此產生不利影響之補充性活性的活性成分。
活性成分可包覆於微膠囊中，例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合法所製備之微膠囊，例如分別為羥基甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊；包覆於膠態藥物傳遞系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中或巨乳液中。此類技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.編輯(1980)中。
可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適合實例包括含有抗體或免疫結合物之固體疏水性聚合物之半滲透基質，該等基質呈成形制品形式，例如薄膜或微膠囊。
用於活體內投與之調配物一般為無菌的。無菌性可容易藉由例如無菌過濾膜過濾來實現。
G.治療方法及組合物
本文提供之任一抗-CLL-1抗體或免疫結合物可用於例如治療方法之方法中。
在一個態樣中，本文提供之抗-CLL-1抗體或免疫結合物用於抑制CLL-1陽性細胞增殖之方法中，該方法包含在容許抗-CLL-1抗體或免疫結合物結合於細胞表面上之CLL-1之條件下將該細胞暴露於抗-CLL-1抗體或免疫結合物，藉此抑制細胞增殖。在某些實施例中，方法為活體外或活體內方法。在其他實施例中，細胞為淋巴細胞、淋巴母細胞、單核細胞或骨髓單核細胞。在其他實施例中，細胞為單核細胞/粒細胞譜系之單核細胞、粒細胞及/或祖細胞。在一些實施例中，細胞對FLT3內部串聯重複序列之存在呈陽性。在一些實施例中，細胞對MLL-AF9融合基因(例如MLL-AF9易位)之存在呈陽性。在一些實 施例中，細胞對染色體11q23易位之存在呈陽性。在一些實施例中，細胞對易位t(9；11)(p22；q23)之存在呈陽性。
活體外細胞增殖之抑制可使用可購自Promega(Madison,WI)之CellTiter-GloTM發光細胞活力分析來分析。該分析基於存在之ATP(其指示代謝活性細胞)之定量，確定培養物中活細胞之數目。參見Crouch等人(1993)J.Immunol.Meth.160：81-88；美國專利第6602677號。分析可以96或384孔格式進行，易於進行自動化高通量篩選(HTS)。參見Cree等人(1995)AntiCancer Drugs 6：398-404。分析程序涉及向培養細胞中直接添加單一試劑(CellTiter-Glo®試劑)。此導致細胞溶解及由螢光素酶反應產生之發光信號之產生。發光信號與存在之ATP之量成比例，ATP之量與培養物中存在之活細胞數目成正比。資料可藉由光度計或CCD相機成像裝置記錄。發光輸出表示為相對光單位(RLU)。
在另一個態樣中，提供一種抗-CLL-1抗體或免疫結合物，其適用作藥劑。在其他態樣中，提供一種抗-CLL-1抗體或免疫結合物，其用於治療方法中。在某些實施例中，提供一種抗-CLL-1抗體或免疫結合物，其用於治療CLL-1陽性癌症。在某些實施例中，本發明提供一種抗-CLL-1抗體或免疫結合物，其用於治療患有CLL-1陽性癌症之個體的方法中，該方法包含向該個體投與有效量之抗-CLL-1抗體或免疫結合物。在一個此類實施例中，該方法進一步包含向個體投與有效量之至少一種例如如下文所描述之其他治療劑。
在另一態樣中，本發明提供抗-CLL-1抗體或免疫結合物之用途，其用於製造或製備藥劑。在一個實施例中，該藥劑係用於治療CLL-1陽性癌症。在另一個實施例中，藥劑係用於治療CLL-1陽性癌症之方法中，該方法包含向患有CLL-1陽性癌症之個體投與有效量之藥劑。在一個此類實施例中，該方法進一步包含向個體投與有效量之 至少一種例如如下文所描述之其他治療劑。
在另一態樣中，本發明提供一種治療CLL-1陽性癌症之方法。在一個實施例中，該方法包含向患有此類CLL-1陽性癌症之個體投與有效量之抗-CLL-1抗體或免疫結合物。在一些實施例中，癌症為AML。在一個此類實施例中，該方法進一步包含向個體投與有效量之至少一種例如如下文所描述之其他治療劑。
根據任一以上實施例之CLL-1陽性癌症可為例如CLL-1陽性AML、CLL-1陽性CML、CLL-1陽性骨髓發育不良症候群(MDS)、CLL-1陽性慢性骨髓單核細胞性白血病(CML)、CLL-1陽性APL、CLL-1陽性慢性骨髓增生病症、CLL-1陽性血小板性白血病、CLL-1陽性pre-B-ALL、CLL-1陽性preT-ALL、CLL-1-陽性多發性骨髓瘤、CLL-1陽性肥大細胞疾病、CLL-1陽性肥大細胞白血病、CLL-1陽性肥大細胞肉瘤、CLL-1陽性骨髓肉瘤、CLL-1陽性淋巴性白血病及CLL-1陽性未分化之白血病。在一些實施例中，CLL-1陽性癌症為在本文實例B中描述之條件下抗-CLL-1免疫組織化學(IHC)或原位雜交(ISH)評分超過「0」之癌症，0對應於超過90%腫瘤細胞中染色非常弱或無染色。在另一個實施例中，CLL-1陽性癌症以如在本文實例B中描述之條件下所定義，1+、2+或3+水準表現CLL-1。在一些實施例中，CLL-1陽性癌症為根據偵測CLL-1mRNA之逆轉錄酶PCR(RT-PCR)分析表現CLL-1的癌症。在一些實施例中，RT-PCR為定量RT-PCR。
在一些實施例中，根據任一以上實施例之細胞增生性病症可為例如AML、CML及/或MDS。在一些實施例中，CLL-1陽性細胞增生性病症為CLL-1陽性AML、CLL-1陽性CML、CLL-1陽性MDS。在一些實施例中，AML為AML亞型1、AML亞型2、AML亞型3、AML亞型4、AML亞型5、AML亞型6及AML亞型7中之一或多者。在一些實施例中，AML為AML亞型3(急性前髓細胞性白血病，APML)。在一 些實施例中，AML為AML亞型1、AML亞型2、AML亞型4、AML亞型5、AML亞型6及AML亞型7中之一或多者，且不為AML亞型3。
在一些實施例中，細胞增生性病症(例如CLL-1陽性癌症及/或AML)對FLT3、核仁磷酸蛋白(NPM1)、CCAAT/強化子結合蛋白α(C/EBPα)(CEBPA)及/或c-KIT中突變的存在呈陽性。在一些實施例中，細胞增生性病症(例如CLL-1陽性癌症及/或AML)對FLT3內部串聯重複序列之存在呈陽性。在一些實施例中，細胞增生性病症(例如CLL-1陽性癌症及/或AML)對FLT3酪胺酸激酶域點突變之存在呈陽性。在一些實施例中，細胞增生性病症(例如CLL-1陽性癌症及/或AML)對異檸檬酸脫氫酶1及/或2(IDH1及/或IDH2)中突變之存在呈陽性。在一些實施例中，細胞增生性病症(例如CLL-1陽性癌症及/或AML)對DNA甲基轉移酶3A(DNMT3A)中突變之存在呈陽性。在一些實施例中，細胞增生性病症(例如CLL-1陽性癌症及/或AML)為對(a)NPM1及FLT3中突變、(b)野生型NPM1及突變FLT3及/或(c)野生型NPM1及FLT3之存在呈陽性的NK-AML。
在一些實施例中，細胞增生性病症(例如CLL-1陽性癌症及/或AML)為陽性細胞遺傳學異常，諸如以下中之一或多者：t(15；17)、t(8；21)、inv(16)、t(16；16)、t(9；11)(p22；q23)、t(6；9)(p23；q34)、inv(3)(q21 q26.2)、inv(3；3)(q21；q26.2)、t(1；22)(p13；q13)、t(8；21)(q22；q22)、inv(16)(p13；1q22)、t(16；16)(p13.1；q22)及/或t(15；17)(q22；q12)。在一些實施例中，細胞增生性病症(例如CLL-1陽性癌症及/或AML)對MLL-AF9融合基因(例如MLL-AF9易位)之存在呈陽性。在一些實施例中，細胞增生性病症(例如CLL-1陽性癌症及/或AML)對染色體11q23易位之存在呈陽性。在一些實施例中，細胞增生性病症(例如CLL-1陽性癌症)為對易位t(9；11)(p22；q23)之存在呈陽性的細胞增生性病症(例如CLL-1陽性癌症及/或AML)。
根據任一以上實施例之「個體」可為人類。
在另一態樣中，本發明提供包含本文提供之任一抗-CLL-1抗體或免疫結合物的醫藥調配物，其例如用於任一以上治療方法中。在一個實施例中，醫藥調配物包含本文提供之任一抗-CLL-1抗體或免疫結合物及醫藥學上可接受之載劑。在另一個實施例中，醫藥調配物包含本文提供之任一抗-CLL-1抗體或免疫結合物及至少一種例如如下所描述之其他治療劑。
本發明之抗體或免疫結合物可單獨或與其他藥劑組合用於療法中。舉例而言，本發明之抗體或免疫結合物可與至少一種其他治療劑共同投與。在一些實施例中，其他治療劑為蒽環黴素。在一些實施例中，蒽環黴素為道諾黴素或艾達黴素。在一些實施例中，其他治療劑為阿糖胞苷。在一些實施例中，其他治療劑為克拉屈濱。在一些實施例中，其他治療劑為氟達拉賓或拓朴替康。在一些實施例中，其他治療劑為5-氮雜胞苷或地西他濱。在一些實施例中，其他治療劑為ATRA(全反式視黃酸)。在一些實施例中，其他治療劑為三氧化二砷。在一些實施例中，其他治療劑為羥基脲。在一些實施例中，其他治療劑為依託泊苷。在一些實施例中，其他治療劑為米托蒽醌。在一些實施例中，其他治療劑為氯法拉濱。在一些實施例中，其他治療劑為羥基脲。在一些實施例中，其他治療劑為FLT3抑制劑，諸如喹雜替尼(quizartinib)。在一些實施例中，其他治療劑為IDH2抑制劑。在一些實施例中，其他治療劑為CHK1抑制劑。在一些實施例中，其他治療劑為Plk抑制劑，諸如維拉替尼(volasertib)。
在任一方法之一些實施例中，其他治療劑為BCL2抑制劑。在一些實施例中，BCL2抑制劑為維托克斯(venatoclax)。
在任一方法之一些實施例中，其他治療劑為表觀遺傳調節劑。在一些實施例中，表觀遺傳調節劑為組蛋白脫乙醯基酶抑制劑。在一 些實施例中，表觀遺傳調節劑為DNA甲基轉移酶I抑制劑。在一些實施例中，表觀遺傳調節劑為組蛋白甲基轉移酶抑制劑。在一些實施例中，表觀遺傳調節劑為BET抑制劑。在一些實施例中，BET抑制劑選擇性地靶向第一布羅莫結構域(BD1)。在一些實施例中，BET抑制劑選擇性地靶向第二布羅莫結構域(BD2)。在一些實施例中，BET抑制劑為GSK1210151A、GSK525762、OTX-01、TEN-010、CPI-203及CPI-0610中之一或多者。
在一些實施例中，該方法可進一步包含其他療法。其他療法可為放射療法、手術、化學療法、基因療法、DNA療法、病毒療法、RNA療法、免疫療法、骨髓移植、奈米療法、單株抗體療法或前述各者之組合。其他療法可呈輔助或新輔助療法形式。在一些實施例中，其他療法為投與小分子酶抑制劑或抗轉移性藥劑。在一些實施例中，其他療法為投與副作用限制性藥劑(例如意欲減少治療之副作用出現及/或嚴重程度的藥劑，諸如抗噁心劑等)。在一些實施例中，其他療法為放射療法。在一些實施例中，額外療法為手術。在一些實施例中，其他療法為放射療法與手術之組合。在一些實施例中，其他療法為γ照射。在一些實施例中，其他療法為幹細胞移植。在一些實施例中，其他療法可為分開投與上述治療劑中之一或多者。
在任一方法之一些實施例中，其他療法包含癌症免疫療法。在任一方法之一些實施例中，癌症免疫療法包含PD-1軸結合拮抗劑。在任一方法之一些實施例中，癌症免疫療法包含PD-1結合拮抗劑。在任一方法之一些實施例中，癌症免疫療法包含PD-L1結合拮抗劑。在任一方法之一些實施例中，癌症免疫療法包含PD-L2結合拮抗劑。在任一方法之一些實施例中，癌症免疫療法包含CTLA-4抑制。在任一方法之一些實施例中，癌症免疫療法包含免疫促效劑。
以上所指出之此類組合療法涵蓋組合投與(其中兩種或兩種以上 治療劑包括於同一或分開調配物中)及分開投與，在此情況下本發明之抗體或免疫結合物之投與可在其他治療劑及/或佐劑投與之前、與其同時及/或在其之後進行。本發明之抗體或免疫結合物亦可與放射療法組合使用。
本發明之抗體或免疫結合物(及任何其他治療劑)可藉由任何適合之方式，包括非經腸、肺內及鼻內且必要時針對局部治療，病灶內投與來投與。非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投藥。給藥可藉由任何適當途徑(例如藉由注射，諸如靜脈內或皮下注射)給藥，視投與之短期或長期性而定。本文中涵蓋各種給藥時程，包括(但不限於)單次投與或經各個時間點多次投與、快速投與及脈衝式輸注。
本發明之抗體或免疫結合物以符合良好醫學實務之方式調配、給藥及投與。在此情形下考慮之因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病狀、病症起因、藥劑傳遞部位、投與方法、投與時程及醫學從業者已知之其他因素。抗體或免疫結合物無需但視情況與一或多種當前用於預防或治療所述病症之藥劑一起調配。此類其他藥劑之有效量視存在於調配物中之抗體或免疫結合物之量、病症或治療之類型及如上文所述之其他因素而定。此等藥劑一般以與本文所描述相同之劑量且用如本文所描述之投與途徑使用，或以本文所描述之劑量之約1%至99%使用，或以憑經驗/臨床上確定為適當之任何劑量及任何途徑使用。
為預防或治療疾病，本發明之抗體或免疫結合物(當單獨或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)之適當劑量將視待治療之疾病類型、抗體或免疫結合物之類型、疾病之嚴重程度及過程、抗體或免疫結合物係出於預防性還是治療性目的投與、先前療法、患者臨床病史及對抗體或免疫結合物之反應及主治醫師之判斷而定。一次性或歷經 一系列治療向患者適當地投與抗體或免疫結合物。視疾病之類型及嚴重程度而定，約1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)抗體或免疫結合物可為投與患者之初始候選劑量，無論例如藉由一或多次分開投與還是藉由連續輸注。一種典型日劑量可在約1μg/kg至100mg/kg或100mg/kg以上之範圍內，視上文所提及之因素而定。對於經歷數日或更長時間重複投藥，視病狀而定，治療一般持續至疾病症狀出現所需抑制為止。抗體或免疫結合物之一種示例性劑量將在約0.05mg/kg至約10mg/kg之範圍內。因此，可向患者投與約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何組合)之一或多種劑量。此類劑量可間歇地投與，例如每週或每三週(例如以使得患者接受約二至約二十或例如約六劑抗體)。初始可投與較高起始劑量，隨後可投與一或多種較低劑量。然而，其他給藥方案可為適用的。此療法之進程容易藉由習知技術及分析來監測。
應瞭解任一以上調配物或治療方法可使用本發明之免疫結合物與抗-CLL-1抗體進行。
H.製品
在本發明之另一態樣中，提供含有適用於治療、預防及/或診斷上述病症之物質的製品。製品包含容器及附於或系連於容器之標籤或藥品說明書。適合容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可由多種材料(諸如玻璃或塑膠)形成。容器裝有單獨或與有效治療、預防及/或診斷病症之另一組合物組合之組合物，且可具有無菌接取口(例如容器可為具有可由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為本發明之抗體或免疫結合物。標籤或藥品說明書指示組合物用於治療所選病狀。此外，製品可包含(a)其中含有組合物之第一容器，其中該組合物包含本發明之抗體或免疫結合物；及(b)其中含有組合物之第二容器，其中該組合物 包含另一細胞毒性劑或其他治療劑。本發明之此實施例中之製品可進一步包含指示組合物可用於治療特定病狀之藥品說明書。或者或另外，製品可進一步包含第二(或第三)容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝劑，諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝生理食鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)或右旋糖溶液。其可進一步包括就商業及使用者觀點而言所需之其他物質，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
III.實例
以下為本發明之方法及組合物之實例。應瞭解，考慮到上文提供之一般描述，可實施各種其他實施例。
實例1
A.單株抗體之產生
使用以下程序，藉由將動物用在哺乳動物表現系統中表現的與N端Flag(DYKDDDDK)融合之重組hu及cyno CLL-1細胞外域(ECD，65-265 huCLL-1及65-265 cynoCLL-1之胺基酸)免疫接種，產生針對人類(hu)及食蟹獼猴(cyno)CLL-1之單株抗體。huCLL1 ECD蛋白質(胺基酸65-265)包含SNP，AAA(Lys,K)244->CAA(GLN,Q)，其具有29%之次要等位基因頻率(MAF)。
對陽性純系進行擴增且針對與huCLL-1及cynoCLL-1之結合，藉由ELISA及FACS再次篩選。藉由螢光活化細胞分選術(FACS)，使用表現重組hu及cyno LL-1之穩定細胞株且使用在急性骨髓白血病腫瘤細胞株上表現之腫瘤衍生CLL-1，鑑別五個純系：m3H10、m6E7、m20B1、m21C9及m28H12，其反應強烈。鼠類重鏈及輕鏈可變域之胺基酸序列之比對展示於圖1A及圖1B中。m3H10及m21C9共享相同重鏈及輕鏈CDR，僅僅m21C9重鏈及輕鏈可變區之胺基酸序列展示於圖1中。
B.物種交叉反應性及結合親和力
測試單株抗體以確定其是否與cynoCLL-1細胞外域(ECD)(其與huCLL-1蛋白質ECD 85.07%一致及87.35%類似)交叉反應。嵌合抗-CLL-1人類IgG藉由塗佈在CM5感測器晶片上之小鼠抗人類IgG捕捉。為量測動力學，注射於HBS-EP緩衝液中之人類或食蟹獼猴CLL-1之三倍連續稀釋液(4.1nM至1000nM)。使用簡單的一比一朗格繆爾結合模型(one-to-one Langmuir binding model)，計算締合速率(kon)及解離速率(koff)。平衡解離常數(KD)係依比率koff/kon計算。以下表2展示五種抗體(m3H10、m6E7、m20B1、m21C9及m28H12)之嵌合型式識別重組hu及cynoCLL-1，且提供關於與hu及cyno-CLL-1之相互作用的動力學之細節。藉由來自食蟹獼猴(毛里求斯來源)之血液的FACS分析，進一步證實與cyno CLL-1之交叉反應性(資料未展示)。
按照標準程序(Holmes等人，Science 256：1205-1210(1992))進行史卡查分析以確定包括h6E7及ch21C9之抗體之相對結合親和力。
使用間接Iodogen法對抗-CLL-1抗體進行[I125]標記。藉由使用NAP-5管柱(GE Healthcare)之凝膠過濾，自游離125I-Na純化[I125]標記之抗-CLL-1抗體；經純化之碘化抗-CLL-1抗體具有8-10μCi/μg之範圍的特定活性。將50μL體積含有固定濃度之[I125]標記抗體及遞減濃度之連續稀釋之未標記抗體的競爭分析混合物置於96孔盤中。將穩定表 現重組hu或cynoCLL-1之HEK293AD細胞或表現內源性CLL-1之HL-60腫瘤細胞在生長培養基中在37℃下在5% CO2中培養。使用Sigma細胞解離溶液將細胞自燒瓶分離且用結合緩衝液洗滌，該結合緩衝液由具有1%牛血清白蛋白(BSA)之達爾伯克氏改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM)、300mM人類IgG及0.1%疊氮化鈉組成。將經洗滌之細胞以0.2mL結合緩衝液中100,000個細胞之密度添加至96孔盤。各孔中[I125]標記抗體之最終濃度為約250pM。競爭分析中未標記抗體之最終濃度在1000nM，經十次2倍數稀釋步驟，至0nM僅僅緩衝液分析物之範圍內。競爭分析一式三份地進行。將競爭分析物在室溫下培育2小時。在培育2小時之後，將競爭分析物轉移至Millipore多篩濾盤(Billerica,MA)中且用結合緩衝液洗滌4次以將游離與結合之[I125]標記抗體分開。過濾器在Wallac Wizard 1470 γ計數器(PerkinElmer Life and Analytical Sciences Inc.；Wellesley,MA)上計數。使用NewLigand軟體(Genentech)評估結合資料，該軟體使用Munson及Robard之擬合算法確定抗體之結合親和力(Munson及Robard 1980)。
表3展示對藉由HEK293AD CLL-1穩定細胞表現之重組hu及cynoCLL-1以及HL-60細胞的親和力(0.45-1.2nM之kD範圍)。
C.單株抗體抗原決定基分組
亦使用基於細胞之競爭結合FACS分析測定抗原決定基分組。將HL-60細胞與50-100倍過量之未標記競爭抗體一起或無該等抗體下預先培育，接著用直接標記之偵測抗體染色，來自偵測抗體之信號減弱 指示未標記之競爭抗體結合於CLL-1上與偵測抗體相同或類似的區域-此應發生在相同抗體用作偵測劑與競爭劑時。當不存在不同未標記抗體阻斷偵測劑信號時，未標記抗體結合於CLL-1中之不同區域。
表4展示抗體對CLL-1之抗原決定基分組。ch6E7及ch21C9，而非ch20B1及ch28H12與R&D Systems-PE(純系687317)分為一組。R&D Systems亦阻斷eBioscience純系HB3，但ch6E7及ch21C9無法阻斷eBioscience純系HB3結合。ch20B1及ch28H12未能與任何其他抗體競爭，表明各抗體結合不同抗原決定基。所有抗體未能與BD Biosciences純系50C1競爭，亦表明其結合不同抗原決定基。
D.抗-CLL-1抗體之人類化
如下所述將單株抗體6E7及21C9人類化。殘基編號係根據Kabat 等人，Sequences of proteins of immunological interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)。
在6E7及21C9之人類化期間構築的變異體呈IgG形式評估。將來自鼠類6E7及21C9之VL及VH域與人類VLκI(VLKI)及人類VH亞群I(VHI)共同序列比對。來自鼠類抗體之高變區經工程改造至VLKI及VHI接受體構架中。具體言之，自mu6E7及mu21C9 VL域，位置24-34(L1)、50-56(L2)及89-97(L3)移植至VLKI，且自mu6E7及mu21C9 VH域，位置26-35(H1)、50-65(H2)及93-102(H3)移植至VHI。
此章節中抗體之結合親和力藉由BIAcoreTM T200格式測定。簡言之，根據供應商之說明書，BIAcoreTM研究級CM5晶片用1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)試劑活化。山羊抗人類Fc IgG與晶片偶合以實現各流動池中大約10,000個反應單位(RU)。未反應之偶合基團用1M乙醇胺阻斷。為量測動力學，捕捉抗體以實現大約300RU。在25℃下，以30μl/min之流速注射於HBS-P緩衝液(0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、0.005%界面活性劑P20)中之人類CLL-1之三倍連續稀釋液。締合速率(kon)與解離速率(koff)使用1：1朗格繆爾結合模型(BIAcoreTM T200評估軟體版本2.0)計算。平衡解離常數(Kd)係依比率koff/kon計算。
CDR移植人類化6E7抗體之結合親和力與嵌合6E7相比。製備CDR移植人類化6E7抗體之其他變異體以評估其他維尼爾位置對結合CLL-1之影響。對於6E7，最初四種其他輕鏈(L1：CDR移植+(L4、L48及K49)，L2：CDR移植+L4，L3：CDR移植+K49，及L4：CDR移植+K49)及五種其他重鏈(H1：CDR移植+(A67、L69、V71、K73)，H2：CDR移植+A67，H3：CDR移植+L69，H4：CDR移植+V71，及H5：CDR移植+K73)。輕鏈上之K49為關鍵小鼠維尼爾殘基，且基於突變分析，測得重鏈上之L69及V71為關鍵小鼠維尼爾殘基(資料未展示)。嵌合6E7以9.59E-10M之KD結合，而CDR移植+K49(LC)+(A67、L69、V71、K73(HC))、CDR移植+K49(LC)+(L69、V71(HC))分別以1.40E-9M及1.37E-9M之KD結合。
CDR移植人類化21C9抗體之結合親和力與嵌合21C9抗體相比。製備CDR移植人類化21C9抗體之其他變異體以評估其他維尼爾位置對結合CLL-1之影響。對於21C9，最初三個其他輕鏈(L1：CDR移植+(F36及S43)，L2：CDR移植+F36，L3：CDR移植+S43)及五個其他重鏈(H1：CDR移植+(A67、L69、V71、K73)，H2：CDR移植+A67， H3：CDR移植+L69，H4：CDR移植+V71，及H5：CDR移植+K73)。輕鏈上之F36為關鍵小鼠維尼爾殘基。嵌合21C9以8.615E-9M之KD結合，而CDR移植+(F36及S43(LC))+L69(HC)及CDR移植+F36(LC)+L69(HC)分別以1.053E-8M及9.785-9M之KD結合。測得重鏈上之L69為關鍵小鼠維尼爾殘基。
如上所述，測試人類化6E7.L4H1e及21C9.L2H3結合人類及食蟹獼猴CLL-1之能力，其中例外為在食蟹獼猴結合分析中cynoCLL-1置換huCLL-1。人類化抗體之結合特性展示於以下表5中。如藉由史卡查，使用HL-60、EOL-1、293AD/cynoCLL1及293AD/huCLL-1細胞所測定，人類化6E7.L4H1e之結合親和力分別為0.34、0.29、0.22及0.35Kd(nM)。如藉由史卡查，使用HL-60、EOL-1、293AD/cynoCLL1及293AD/huCLL-1細胞所測定，人類化21C9.L2H3之結合親和力分別為1.3、0.74、2.4及3.6Kd(nM)。
在熱壓力(40℃，pH 5.5，2週)及2,2'-偶氮二(2-甲脒基丙烷)鹽酸鹽(AAPH)分析下測試人類化抗體6E7.L4H1e及21C9.L2H3。隨後樣品經受熱壓力以模擬在產物存放期內之穩定性。樣品經緩衝液更換成20mM組胺酸乙酸鹽、240mM蔗糖pH 5.5且稀釋至1mg/mL之濃度。一毫升樣品在40℃下經受壓力2週，且第二個樣品儲存在-70℃下作為對照。隨後兩個樣品使用胰蛋白酶消化以產生肽，其可使用液相層析法(LC)-質譜分析(MS)進行分析。對於各肽，自LC獲得樣品滯留時間，以及在MS中獲得高解析度準確質量及肽離子片段化資訊(胺基酸序列資訊)。在+-10ppm之窗口，自資料集獲取相關肽(天然及經修飾之肽 離子)的萃取離子層析圖(XIC)，且峰積分以確定面積。針對各樣品，藉由將(經修飾之肽之面積)除以(經修飾之肽之面積加天然肽之面積)乘以100來計算修飾之相對百分比。
6E7.L4H1e及h21C9.L2H3在DR-H2中具有N54G55，其容易發生去胺基作用(對於6E7.L4H1e，t0=13.2%及t2wk 14.5%，且r0=11%及t2wk=11.9%)。測試兩種抗體之N54變異體以確定是否可減輕潛在去胺基作用而不影響與hu及cynoCLL-1之結合。參見表6。
對於人類化6E7.L4H1e CDR-H2 N54抗體變異體，A54具有可接受之結合特徵，最類似於N54。對於人類化21C9.L2H3 CDR-H2 N54抗體變異體，所有變異體均展示在解離速率上對huCLL-1之親和力降低(10-30倍)且在締合速率上對cynoCLL-1之親和力降低(60-500倍)。如藉由史卡查，使用293AD/cynoCLL1、293AD/huCLL-1、HL-60及EOL-1細胞所測定，人類化6E7.L4H1e之結合親和力分別為0.67、0.68、0.6及0.25Kd(nM)。如藉由史卡查，使用293AD/cynoCLL1、293AD/huCLL-1、HL-60及EOL-1細胞所測定，人類化6E7.L4H1eN54A之結合親和力分別為0.9、0.89、0.64及0.32Kd(nM)。人類化6E7及21C9抗體之重鏈及輕鏈可變域胺基酸序列的比對分別展示於圖2A-2B及圖3A-3B中。
E.抗原決定基定位
為確定CLL-1之結合抗原決定基，使用羥基自由基足跡分析(HRF)技術檢查(a)游離抗原CLL-1及(b)三種不同抗原-mAb複合物。在Brookhaven國家實驗室使用X28c光束線將樣品暴露於羥基自由基達0、10、15及20毫秒(ms)之時間間隔。經標記之樣品使用PNG酶F進行去糖基化。為優化實驗方案，首先在去糖基化樣品上進行先導實驗。使用MS之先導研究揭露，樣品含有大量聚合物污染，需要額外清理。為移除聚合物污染，使用含三氯乙酸之丙酮使樣品沈澱且進行LC-MS分析。沈澱步驟成功且MS中聚合物污染信號顯著減弱。經清理之樣品進行還原及烷基化，使用胰蛋白酶消化，接著液相層析連同高解析度質譜分析(LC-MS)。使用ProtMapMS分析MS資料，產生各肽之劑量反應曲線。游離抗原之結果針對各複合物形式比較。基於同源性之抗原模型使用Swiss-Model軟體產生且可定位三個複合物中之每一者的溶劑保護區。
使用胰蛋白酶定位獲得之整體序列覆蓋率為90.05%。缺少區域主要由長度比4個殘基短的胰蛋白酶肽構成，其本身可難以偵測，因為其在LC管柱上之滯留特性弱。HRF過程引入穩定的側鏈氧化修飾，產生特定質量位移，可由串聯質譜分析數據鑑別出。萃取所選離子層析圖(SIC)且針對肽離子之未氧化及所有氧化形式(具有特定m/z)積分。此等峰面積值用於以劑量反應(DR)曲線圖形式表徵反應動力學，其量測完整肽隨著羥基自由基暴露之喪失。相較於游離抗原，複合物中之溶劑保護區經歷逐漸氧化反應。氧化速率(稱為速率常數，RC)之差異用來突出抗原決定基之位置。
ProtMapMS用於處理MS資料，產生各肽之RC值。最終結果展示於表1中。肽位置及對應序列展示於列1及2中。第三列展示複合物1(6E7.L4H1eA54抗體及CLL-1抗原)之保護比率PR(=RC抗原/RC複合 物)。類似地，第四及第五列展示複合物2(經在根據Kabat編號K149包含半胱胺酸殘基之輕鏈(K149C)工程改造的21C9.L2H3抗體及CLL-1抗原)及複合物3(R&D Systems單株抗-CLL1抗體(純系687317)及CLL-1抗原)之對應保護比率。若既定肽對特定的PR值小於1，則歸因於在複合物形成期間引入的結構改變，對應區域之溶劑可接近性增加。接近1之PR值指示區域之溶劑可接近性保持不變，而PR>1表明對應區域顯示隨複合物形成而變，避免溶劑。大部分肽對各複合物之PR值接近1，指示對應區域之溶劑可接近性最低程度地改變。肽142-158一致地展示所有三種抗體之最高PR值，意指區域之保護顯著。除保護肽142-158之外，R&D Systems單株抗-CLL1抗體(純系687317，不同於6E7.L4H1eAG及21C9.L2H3)亦展示區域103-116之顯著保護，如藉由重疊肽103-116及105-116證明。
F.抗-CLL-1抗體之內化
ADC標靶之一種所希望屬性為能夠將抗體內化至細胞中之降解隔室。為確定抗-CLL-1抗體在結合時是否內化，將HL-60或HL-60細胞在37℃下與於RPMI培養基中0.3mg/ml hIgG一起預先培育2小時以減輕與FcR之非特異性結合，接著接種於經細胞培養物處理之4孔腔室載玻片(Nalge Nunc International)。將1μg/mL之最終濃度的直接結合於Dylight 488的抗體與hIgG阻斷細胞一起在冰上在黑暗中培育30分鐘。立即將細胞成像以展示膜染色(T0)，且在延時攝影下，利用Leica SP5共焦顯微鏡，在10小時時間段內在37℃下追蹤。代表性實例ch21C9在30分鐘內由HL-60細胞迅速內化(資料未展示)。使用活體外基於細胞之分析，量測抗體藥結合物殺死標靶細胞之能力來證實ch21C9定位於溶酶體。
G.產生抗-CLL-1抗體藥物結合物
對於更大規模之抗體產生，在CHO細胞中產生抗體。編碼VL及VH之載體轉染至CHO細胞中且藉由蛋白A親和層析，自細胞培養基純化IgG。
藉由抗體ch21C9、ch3H10、ch28H12、ch20B1、ch6E7、6E7.L4H1e、6E7.L4H1eA54、21C9.L2H3經由連接子結合於PBD及PNU衍生物，產生抗-CLL-1抗體-藥物結合物(ADC)。
在最初分離時，抗體中之工程改造半胱胺酸殘基以與細胞硫醇(例如麩胱甘肽)之混合二硫化物之形式存在，且因此不可進行結合。此等抗體之部分還原(例如用DTT)、純化及用去氫抗壞血酸(DHAA)再氧化產生具有可用於結合之游離半胱胺酸硫氫基之抗體，如先前例如在Junutula等人(2008)Nat.Biotechnol.26：925-932及US 2011/0301334中所描述。簡言之，抗體與藥物-連接子部分組合，允許藥物-連接子部分結合於抗體之游離半胱胺酸殘基。在若干小時之後，純化ADC。
H. HL-60及EOL-1人類急性骨髓白血病細胞株異種移植模型中抗- CLL-1抗體藥物結合物之功效
使用人類急性骨髓白血病異種移植模型HL-60(AML亞型M2)及EOL-1(AML亞型M4a)研究抗-CLL-1 ADC之功效。兩者由於其遺傳及分子畸變均引起不良預後。雌性C.B-17 SCID小鼠(Charles River Laboratories；Hollister,CA)各用五百萬HL-60或EOL-1細胞皮下接種於腰窩區域中。當異種移植腫瘤達到100-300mm3之平均腫瘤體積(稱為第0天)時，動物隨機化成7-10隻小鼠一組，且接受ADC之單一靜脈內注射。在投與ADC前大約4小時，腹膜內給與動物過量(30mg/kg)抗-gD對照抗體以阻斷腫瘤細胞上可能非特異性抗體結合位點。在整個研究中量測小鼠之腫瘤及體重1-2次。當體重減輕超過其開始重量20%時，迅速地處死小鼠。所有動物在腫瘤達到3000mm3前或展示即將發生潰瘍之徵象前處死。藉由在注射後1、7及14天PK抽血，證實抗體之存在。
如圖4中所示，ch21C9、ch28H12、ch20B1、ch6E7及ch3H10經由在根據EU編號重鏈胺基酸118之游離半胱胺酸(A118C)結合於PNU 藥物部分：
顯著減小EOL-1腫瘤體積，而ch20B1中度減小腫瘤體積且ch28H12幾乎無作用。使用HL-60，看到類似結果，如圖5中所示。
人類化抗體6E7.L4H1e及21C9.L2H3以各種劑量(10及20μg/m2)由不同半胱胺酸工程改造結合位點結合PBD衍生物(SG34)。抗體在根據EU編號之重鏈胺基酸118(A118C)或在根據Kabat編號之輕鏈胺基酸 149(K149C)包含工程改造游離半胱胺酸。抗體-藥物結合物之結構展示如下：
如圖6中所示，在HL-60異種移植模型中，包含6E7L4H1e或21C9.L2H3之輕鏈K149C半胱胺酸工程改造免疫結合物展示比包含6E7.L4H1e或21C9.L2H3之重鏈A118C半胱胺酸工程改造免疫結合物更大程度地減小腫瘤體積。
亦在6E7.L4H1e與經工程改造以移除潛在去胺基位點之變異體6E7.L4H1eA54之間比較減小腫瘤體積之能力以確定活性以及抗體之結合是否保留。如圖7中所示，在HL-60異種移植模型中6E7L4H1e與6E7顯著減小腫瘤體積。
實例2. 合成用於製備(表A)中示例之抗體藥物結合物之連接子-藥物(LD)中間物
ADC-51之連接子-藥物中間物：(11S,11aS)-11-羥基-7-甲氧基-8-((5-(((S)-7-甲氧基-2-亞甲基-5-側氧基-2,3,5,11a-四氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-8-基)氧基)戊基)氧基)-2-亞甲基-5-側氧基-2,3,11,11a-四氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸(R)-2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫基)丙酯(MS(ESI)：875[M+H]+)藉由WO2013/055987之程序製備。
在氬氣氛圍下在0℃(冰/丙酮)下將硫醯氯(2.35mL 1.0M於DCM中之溶液，2.35mmol)逐滴添加至經攪拌之5-硝基吡啶-2-硫醇(334mg，2.14mmol)於無水DCM(7.5mL)中之懸浮液中。反應混合物自黃色懸浮液變為黃色溶液且升溫至室溫，接著攪拌2小時，此後藉由真空蒸發來移除溶劑，得到黃色固體。在0℃下在氬氣氛圍下使固體再溶解於DCM(15mL)中且用(R)-2-巰基丙-1-醇(213mg，2.31mmol)於無水DCM(7.5mL)中之溶液逐滴處理。使反應混合物升溫至室溫且攪拌20小時，此時藉由LC/MS分析顯示在滯留時間1.41分鐘形成實質性產物(ES+)m/z 247([M+H]+，約100%相對強度)。藉由過濾移除沈澱且真空蒸發濾液，得到橙色固體，其經H2O(20mL)處理且用氫氧化銨溶液鹼化。將混合物用DCM(3×25mL)萃取且經合併之萃取物用H2O(20mL)、鹽水(20mL)洗滌，乾燥(MgSO4)，過濾且真空蒸發，得到粗產物。藉由急驟層析法(梯度溶離以1%增量增加：100% DCM至98：2 v/v DCM/MeOH)純化，得到呈油狀之(R)-2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫基)丙-1-醇(111mg，21%產率)。
將三光氣(48mg，0.16mmol)添加至攪拌之(R)-2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫基)丙-1-醇(111mg，0.45mmol)及吡啶(34μL，33.5mg，0.42mmol)於無水DCM(5mL)中之溶液中。將反應混合物在氬氣氛圍下攪拌45分鐘，此後藉由真空蒸發來移除溶劑，得到呈黃色膜狀之氯甲酸(R)-2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫基)丙酯。產物未經純化或分析即用於下一步驟。
在室溫下將氯甲酸(R)-2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫基)丙酯(約139mg，0.45mmol)於無水DCM(5mL)中之溶液逐滴添加至經攪拌之((戊-1,5-二基雙(氧基))雙(6-((2R)-2-(((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)甲基)-4-亞甲基環戊烷-1-羰基)-4-甲氧基-3,1-伸苯基))二胺基甲酸二-第三丁酯51a(藉由WO 2013/055987中實例1之程序製備)(430mg，約0.45mmol)及吡啶(40μL，39mg，0.49mmol)於無水DCM(12mL)中之溶液中。在氬氣氛圍下將反應混合攪拌2.5小時，此時藉由LC/MS分析顯示在滯留時間2.42分鐘形成實質性產物(ES+)m/z 1226([M+H]+，約20%相對強度)、1248([M+Na]+，約60%相對強度)。將混合物用DCM(20mL)稀釋且用SiO2處理，且藉由真空蒸發來移除溶劑。所得殘餘物藉由急驟層析法(梯度溶離以10%增量增加：80：20 v/v己烷/EtOAc至70：30 v/v己烷/EtOAc)進行純化，得到呈黃色泡沫狀之(2-((S)-2-(((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)甲基)-4-亞甲基吡咯啶-1-羰基)-5-((5-(4-((S)-2-(((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)甲基)-4-亞甲基吡咯啶-1-羰基)-2-甲氧基-5-((((R)-2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫基)丙氧基) 羰基)胺基)苯氧基)戊基)氧基)-4-甲氧基苯基)胺基甲酸第三丁酯51b(419mg，76%產率)。(MS(ESI)：1224[M+H]+)
將冰醋酸(24mL)添加至經攪拌的經TBS保護之51b(419mg，0.34mmol)於THF(8mL)及H2O(8mL)中之溶液中。將反應混合物攪拌16小時，此時藉由LC/MS分析顯示反應完成，其中在滯留時間1.82分鐘觀測到所需產物(ES+)m/z 997([M+H]+，約100%相對強度)、1019([M+Na]+，約45%相對強度)。將反應混合物逐滴添加至冷卻(0-5℃)飽和NaHCO3溶液(400mL)。使中性溶液升溫至室溫且用EtOAc(4×100mL)萃取，且將經合併之有機層用H2O(80mL)、鹽水(100mL)洗滌，乾燥(MgSO4)，過濾且真空蒸發，得到粗產物。藉由急驟層析法(梯度溶離以1%增量增加：100% DCM至98：2 v/v DCM/MeOH)純化，得到呈微黃色泡沫狀之(2-((S)-2-(羥基甲基)-4-亞甲基吡咯啶-1-羰基)-5-((5-(4-((S)-2-(羥基甲基)-4-亞甲基吡咯啶-1-羰基)-2-甲氧基-5-((((R)-2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫基)丙氧基)羰基)胺基)苯氧基)戊基)氧基)-4-甲氧基苯基)胺基甲酸第三丁酯51c(341mg，100%產率)。(MS(ESI)：995[M+H]+)
在氬氣氛圍下在-45℃(乾冰/CH3CN)下將無水DMSO(107μL， 188mg，1.50mmol)於無水DCM(7.5mL)中之溶液逐滴添加至經攪拌之乙二醯氯(410μL 2.0M於DCM中之溶液，0.82mmol)於無水DCM(7.5mL)中之溶液中。在-45℃下攪拌15分鐘之後，將反應混合物用51c(341mg，0.34mmol)於無水DCM(15mL)中之溶液逐滴處理。在-45℃下又攪拌1小時之後，將反應混合物用TEA(476μL，342mg，3.42mmol)於無水DCM(7.5mL)中之溶液逐滴處理。經1.5小時之時間使反應混合物升溫至室溫且用DCM(50mL)稀釋，接著用飽和NH4Cl(15mL)、飽和NaHCO3(15mL)、鹽水(15mL)洗滌，乾燥(MgSO4)，過濾且真空蒸發，得到粗產物。藉由急驟層析法(梯度溶離以0.4%增量增加：100% DCM至98.4：1.6 v/v DCM/MeOH)純化，得到呈微黃色泡沫狀之(11S,11aS)-11-羥基-8-((5-(((11S,11aS)-11-羥基-7-甲氧基-2-亞甲基-10-(((R)-2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫基)丙氧基)羰基)-5-側氧基-2,3,5,10,11,11a-六氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-8-基)氧基)戊基)氧基)-7-甲氧基-2-亞甲基-5-側氧基-2,3,11,11a-四氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸第三丁酯51d(227mg，67%產率)：LC/MS滯留時間1.69分鐘(ES+)m/z 993([M+H]+，約80%相對強度)、1015([M+Na]+，約20%相對強度)。
在0℃(丙/丙酮)下將95：5 v/v TFA/H2O溶液(4mL)添加至51d(216mg，0.22mmol)之粗樣品中。在0℃下攪拌30分鐘之後，反應如藉由LC/MS判斷，認為完成，所需產物峰在滯留時間1.60分鐘下(ES+)m/z 875([M+H]+，約100%相對強度)。保持反應混合物為冷的，且逐滴添加至冷卻之飽和NaHCO3水溶液(100mL)中。將混合物用DCM(3×30mL)萃取且經合併之有機層用鹽水(50mL)洗滌，乾燥(MgSO4)，過濾且真空蒸發，得到粗產物。藉由急驟層析法(梯度溶離以0.4%增量增加：100% CHCl3至98.4：1.6 v/v CHCl3/MeOH)純化，得到呈黃色泡沫狀之LD-51(127mg，66%產率)：LC/MS(操作15分 鐘)，滯留時間6.18分鐘(ES+)m/z 875([M+H]+，約100%相對強度)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 9.21(s,1H),8.30(d,1H,J=8.8Hz),7.69(d,1H,J=4.5Hz),7.62(d,1H,J=8.9Hz),7.49(s,1H),7.25(s,1H),6.79(s,1H),6.74(s,1H),5.58(dd,1H,J=4.4,9.8Hz),5.22-5.10(m,4H),4.43(d,1H,J=3.7Hz),4.33-4.25(m,4H),4.15-3.98(m,5H),3.95-3.80(m,7H),3.68-3.59(m,1H),3.20-3.07(m,2H),2.99-2.87(m,2H),2.76-2.68(m,2H),1.99-1.83(m,4H),1.72-1.57(m,2H),1.19(d,3H,J=6.6Hz)。
ADC-52之連接子-藥物中間物：(2,5-雙((E)-3-((S)-1-(氯甲基)-5-(膦醯氧基)-1,2-二氫-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-3-側氧基丙-1-烯-1-基)苯基)胺基甲酸2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫基)丙酯(MS(ESI)：1098[M+H]+)藉由WO 2015/023355LD-53之程序製備。二氫磷酸(S)-1-(氯甲基)-3-((E)-3-(4-((E)-3-((S)-1-(氯甲基)-5-(膦醯氧基)-1,2-二氫-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-3-側氧基丙-1-烯-1-基)-2-(2-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙氧基)苯基)丙烯醯基)-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯(MS(ESI)：994[M+H]+)藉由WO 2015/023355之程序製備。
ADC-54之連接子-藥物中間物：(11S,11aS)-11-羥基-7-甲氧基-8-((5-(((S)-7-甲氧基-2-亞甲基-5-側氧基-2,3,5,11a-四氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-8-基)氧基)戊基)氧基)-2-亞甲基-5-側氧基-2,3,11,11a-四氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸(R)-2-((3-硝基吡啶-2-基)二硫基)丙酯(MS(ESI)：876[M+H]+)藉由WO 2013/055987之程序製備。
ADC-55之連接子-藥物中間物：雙(甲基胺基甲酸)4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺基)-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苯甲酯(2-側氧基-2-((2S,4S)-2,5,12-三羥基-7-甲氧基- 4-(((1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氫-1H-哌喃并[4',3'：4,5]噁唑并[2,3-c][1,4]噁嗪-3-基)氧基)-6,11-二側氧基-1,2,3,4,6,11-六氫并四苯-2-基)乙基)乙-1,2-二基酯。
按照US 8389697之實例3，向PNU-159682(15.3mg，0.02038mmol)(如WO 1998/02446及US 8470984實例1中報導製備)於3ml甲醇及2ml H2O中之溶液中添加NaIO4(5.1mg，0.0238mmol)於1ml H2O中之溶液。將反應混合物在室溫下攪拌3小時，直至無法偵測到起始物質(TLC及HPLC分析)。溶劑減壓移除，且粗紅色固體(2S,4S)-2,5,12-三羥基-7-甲氧基-4-{[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氫-1H-哌喃并[4',3'：4,5][1,3]噁唑并[2,3-c][1,4]噁嗪-3-基]氧基}-6,11-二側氧基-1,2,3,4,6,11-六氫并四苯-2-甲酸55a(MS(ESI)：628[M+H]+)藉由WO 2010/009124之程序轉化成LD-55(MS(ESI)：1355[M+H]+)。
ADC-56之連接子-藥物中間物：(2S,4S)-2,5,12-三羥基-7-甲氧基-4-(((1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氫-1H-哌喃并[4',3'：4,5]噁唑并[2,3-c][1,4]噁嗪-3-基)氧基)-N-(2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫基)乙基)-6,11-二側氧基-1,2,3,4,6,11-六氫并四苯-2-甲醯胺(MS(ESI)：842[M+H]+)藉由WO 2013/055987之程序製備。
ADC-57之連接子-藥物中間物：(2S,4S)-2,5,12-三羥基-7-甲氧基-4-(((1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氫-1H-哌喃并[4',3'：4,5]噁唑并[2,3-c][1,4]噁嗪-3-基)氧基)-N-(2-((5-硝基吡啶-2-基) 二硫基)丙基)-6,11-二側氧基-1,2,3,4,6,11-六氫并四苯-2-甲醯胺(MS(ESI)：856[M+H]+)藉由US8389697之程序製備。
ADC-58之連接子-藥物中間物：(2S,4S)-2,5,12-三羥基-7-甲氧基-4-(((1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氫-1H-哌喃并[4',3'：4,5]噁唑并[2,3-c][1,4]噁嗪-3-基)氧基)-N-(2-甲基-2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫基)丙基)-6,11-二側氧基-1,2,3,4,6,11-六氫并四苯-2-甲醯胺(MS(ESI)：870[M+H]+)藉由US8389697之程序製備。
雖然出於清楚瞭解之目的，前述本發明已藉助於說明及實例詳細地描述，但描述及實例不應解釋為限制本發明之範疇。本文引用的所有專利及科學文獻之揭示內容以全文引用的方式明確併入本文中。
<110> 美商建南德克公司等人
<120> 抗-CLL-1抗體及免疫結合物
<130> P32314-WO
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<221> VARIANT
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<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
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<221> misc_feature
<222> (1)..(122)
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<211> 112
<212> PRT
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<223> /備註=“人工序列之描述：合成多肽”
<400> 73

Claims (52)

  1. 一種分離之單株抗-CLL-1抗體，其中該抗體結合包含SEQ ID NO：49之胺基酸的抗原決定基及/或結合重疊抗原決定基且不結合包含SEQ ID NO：50及/或SEQ ID NO：51之抗原決定基。
  2. 如請求項1之抗體，其中該抗原決定基藉由羥基自由基足跡分析法確定。
  3. 一種分離之結合於CLL-1之抗體，其中該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列之HVR-L3。
  4. 如請求項3之抗體，其中該抗體含有包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-H2。
  5. 如請求項3之抗體，其中該抗體含有包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列之HVR-H2。
  6. 如請求項5之抗體，其中該抗體含有包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列之HVR-H2。
  7. 如請求項5之抗體，其中該抗體含有包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列之HVR-H2。
  8. 如請求項5之抗體，其中該抗體含有包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列之HVR-H2。
  9. 如請求項1至8中任一項之抗體，其中該抗體包含：a)包含SEQ ID NO：33之序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：32之序列之輕鏈可變區； b)包含SEQ ID NO：34之序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：32之序列之輕鏈可變區；c)包含SEQ ID NO：46之序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：32之序列之輕鏈可變區；或d)包含SEQ ID NO：48之序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：32之序列之輕鏈可變區。
  10. 一種分離之結合於CLL-1之抗體，其中該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列之HVR-L3。
  11. 如請求項10之抗體，其中該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：38之序列之重鏈可變區及(b)包含SEQ ID NO：37之序列之輕鏈可變區。
  12. 如請求項1至8、10及11中任一項之抗體，其中該抗體具有以下特徵中之一或多者：a)結合於重組人類CLL-1；b)結合於重組食蟹獼猴CLL-1；c)結合於人類周邊血液單核細胞(PBMC)之表面上的內源性CLL-1；d)結合於食蟹獼猴PBMC之表面上的內源性CLL-1；e)結合於癌細胞表面上之內源性CLL-1；f)結合於AML癌細胞之表面上的內源性CLL-1；g)結合於HL-60細胞之表面上的內源性CLL-1；h)結合於EOL-1細胞之表面上的內源性CLL-1；i)結合於包含K244Q突變之CLL-1； j)結合包含SEQ ID NO：49之胺基酸的抗原決定基及/或結合重疊抗原決定基；k)不結合包含SEQ ID NO：50及/或SEQ ID NO：51之抗原決定基；l)與R&D純系687317抗體競爭結合人類CLL-1；m)以小於15nM、小於10nM、小於7nM、小於5nM或小於3nM之Kd結合於內源性人類CLL-1；n)以小於10nM、小於7nM、小於5nM或小於3nM之Kd結合於重組人類CLL-1；及/或o)以小於10nM、小於7nM、小於5nM或小於3nM、小於2nM或小於1nM之Kd結合於重組食蟹獼猴CLL-1。
  13. 如請求項1至8、10及11中任一項之抗體，其中該抗體包含一或多個工程改造游離半胱胺酸胺基酸殘基。
  14. 如請求項13之抗體，其中該一或多個工程改造游離半胱胺酸胺基酸殘基位於該輕鏈中。
  15. 如請求項13之抗體，其中該一或多個工程改造游離半胱胺酸胺基酸殘基位於該重鏈中。
  16. 如請求項1至8、10及11中任一項之抗體，其為單株抗體。
  17. 如請求項1至8、10及11中任一項之抗體，其為人類或嵌合抗體。
  18. 如請求項1至8、10及11中任一項之抗體，其為結合CLL-1之抗體片段。
  19. 如請求項1至8、10及11中任一項之抗體，其為IgG1、IgG2a或IgG2b抗體。
  20. 一種分離之核酸，其編碼如請求項1至19中任一項之抗體。
  21. 一種宿主細胞，其包含如請求項20之核酸。
  22. 一種產生抗體之方法，其包含培養如請求項21之宿主細胞，從 而產生該抗體。
  23. 一種免疫結合物，其包含如請求項1至19中任一項之抗體及細胞毒性劑。
  24. 一種免疫結合物，其具有式Ab-(L-D)p，其中：(a)Ab為如請求項1至19中任一項之抗體；(b)L為連接子；(c)D為細胞毒性劑且該細胞毒性劑為藥物；且(d)p在1-8範圍內。
  25. 如請求項23或24之免疫結合物，其中該細胞毒性劑係選自類美登素(maytansinoid)、卡奇黴素(calicheamicin)、吡咯并苯并二氮呯及奈莫柔比星(nemorubicin)衍生物。
  26. 如請求項24之免疫結合物，其中D為式A之吡咯并苯并二氮呯： 其中點線指示C1與C2或C2與C3之間視情況存在雙鍵；R2獨立地選自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R及COR，且視情況進一步選自鹵基或二鹵基，其中RD獨立地選自R、CO2R、COR、CHO、CO2H及鹵基；R6及R9獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；R7獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；Q獨立地選自O、S及NH； R11為H或R，或其中Q為O、SO3M，其中M為金屬陽離子；R及R'各獨立地選自視情況經取代之C1-8烷基、C3-8雜環基及C5-20芳基，且視情況關於基團NRR'，R及R'連同其附接之氮原子一起形成視情況經取代之4、5、6或7員雜環；R12、R16、R19及R17係如分別針對R2、R6、R9及R7所定義；R"為C3-12伸烷基，該鏈可雜有一或多個雜原子及/或視情況經取代之芳環；且X及X'獨立地選自O、S及N(H)。
  27. 如請求項26之免疫結合物，其中D具有結構： 其中n為0或1。
  28. 如請求項27之免疫結合物，其中D具有結構：
  29. 如請求項24之免疫結合物，其中D為奈莫柔比星衍生物。
  30. 如請求項29之免疫結合物，其中D具有結構：
  31. 如請求項24及26至30中任一項之免疫結合物，其中L可藉由蛋白 酶裂解。
  32. 如請求項24及26至30中任一項之免疫結合物，其中L對酸為不穩定的。
  33. 如請求項32之免疫結合物，其中L包含腙。
  34. 如請求項28之免疫結合物，其中該免疫結合物具有結構：
  35. 如請求項24、26至30及34中任一項之免疫結合物，其中p在2-5範圍內。
  36. 一種醫藥調配物，其包含如請求項23至35中任一項之免疫結合物及醫藥學上可接受之載劑。
  37. 如請求項36之醫藥調配物，其進一步包含其他治療劑。
  38. 一種如請求項24至35中任一項之免疫結合物或如請求項36或37之醫藥調配物的用途，其用於製造供治療患有CLL-1陽性癌症之個體的藥劑。
  39. 如請求項38之用途，其中該CLL-1陽性癌症為AML。
  40. 如請求項38或請求項39之用途，其進一步包含向該個體投與其他治療劑。
  41. 一種如請求項23至35中任一項之免疫結合物的用途，其用於製造供抑制CLL-1陽性細胞增殖之藥劑。
  42. 如請求項41之用途，其中該細胞為AML癌細胞。
  43. 一種活體外抑制CLL-1陽性細胞增殖之方法，該方法包含在容許該免疫結合物與該細胞表面上之CLL-1結合的條件下將該細胞暴 露於如請求項23至35中任一項之免疫結合物，藉此抑制該細胞增殖。
  44. 如請求項43之方法，其中該細胞為AML癌細胞。
  45. 如請求項1至8、10及11中任一項之抗體，其與標記結合。
  46. 如請求項45之抗體，其中該標記為正電子發射體。
  47. 如請求項46之抗體，其中該正電子發射體為89Zr。
  48. 一種偵測生物樣品中人類CLL-1之方法，其包含使該生物樣品與如請求項1至19中任一項之抗-CLL-1抗體在容許該抗-CLL-1抗體與天然存在之人類CLL-1結合之條件下接觸，且偵測該抗-CLL-1抗體與該生物樣品中天然存在之人類CLL-1之間是否形成複合物。
  49. 如請求項48之方法，其中該生物樣品為AML癌症樣品。
  50. 一種經標記之抗-CLL-1抗體的用途，其用於製造供偵測CLL-1陽性癌症之藥劑，其中該經標記之抗-CLL-1抗體包含如請求項1至19中任一項之抗-CLL-1抗體，其中該藥劑係用於投與患有或懷疑患有CLL-1陽性癌症之個體且其中該個體中該經標記之抗-CLL-1抗體的偵測指示該個體中之CLL-1陽性癌症。
  51. 如請求項50之用途，其中該經標記之抗-CLL-1抗體包含與正電子發射體結合之抗-CLL-1抗體。
  52. 如請求項51之用途，其中該正電子發射體為89Zr。
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