DE69031919T3

DE69031919T3 - T-zell-rezeptor-peptide als heilmittel für autoimmune und bösartige krankheiten

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Publication number: DE69031919T3
Application number: DE69031919T
Authority: DE
Original assignee: Connetics Corp
Current assignee: Immune Response Corp
Priority date: 1989-07-19
Filing date: 1990-07-19
Publication date: 2005-01-27
Anticipated expiration: 2010-07-20
Also published as: JP3072330B2; DE69031919D1; NO920252L; EP0552142A4; CA2064077C; AU652540B2; NZ234586A; WO1991001133A1; IL95125A0; CA2064077A1; KR100216097B1; DE69031919T2; NO920252D0; AU6048590A; ES2112838T3; JPH05504939A; DK0552142T3; EP0552142A1; ATE161850T1; EP0552142B2

Description

Hintergrund zu der Erfindung
Feld der Erfindung
Die Erfindung auf dem Gebiet der Immunologie und Immuntherapie bezieht sich auf Peptide und ihre pharmazeutischen Zusammensetzungen, die in der Lage sind, immunbezogene Krankheiten, wie Autoimmunkrankheiten und bösartige Krankheiten zu verhindern, zu unterdrücken oder zu behandeln.
Beschreibung des mikrobiologischen Hintergrundes
Autoimmunkrankheiten sind durch eine unerwünschte und unzulässige Attacke auf das Gewebes des Wirts seitens des Immunsystems gekennzeichnet. Obwohl der Mechanismus für das Fortschreiten dieser Krankheiten noch nicht besonders gut verstanden wird, sind zumindest einige Einzelheiten hinsichtlich der Antigenpräsentation in diesem (und anderem) Kontext aufgeklärt. Es wird heute angenommen, dass Antigene einschließlich der Autoantigene durch Antigen präsentierende Zellen (APC) prozessiert werden und dass die daraus hervorgehenden Fragmente dann mit einem der Zelloberflächenproteine assoziieren, die durch den Haupt-Histokompatibilitäts-Komplex (major histocompatibility complex, MHC) codiert werden. Folglich wird die Erkennung eines Antigenpeptids als "MHC beschränkt" bezeichnet. Wenn der MHC/Antigenfragment-Komplex an einen komplementären T-Zell-Rezeptor (TCR) an der Oberfläche eines T-Lymphozyten bindet, führt dies zur Aktivierung und Proliferation des Klons oder der Subpopulation von T-Zellen, die diesen speziellen TCR tragen. Die T-Zellen haben, einmal aktiviert, die Fähigkeit, andere Zellen des Immunsystems zu regulieren, die das prozessierte Antigen präsentieren und Zellen oder Gewebe zu zerstören, die Epitope des erkannten Antigens tragen.
Ein Überblick von Acha-Orbea, H., et al. (Ann. Rev. Immunol. 7:371–405 (1989)) über die Rolle von TCR bei Autoimmunkrankheiten diskutiert die überwältige Vielfalt von TCR, die in dem Immunsystem eines Individuums verfügbar sind und die Erzeugung dieser Vielfalt durch die Organisation der Keimliniengene und dem DNA-Rearrangement, das für die TCR-α- und -β-Ketten codiert. Die α-Ketten werden durch unterschiedliche Kombinationen von Gensegmenten für die variable (V-)Region, die Junction (J-)Region und die konstante (C-)Region codiert. Die TCR-β-Ketten werden zusätzlich durch ein Gensegment für die Diversity (-D)Region codiert und enthalten demzufolge eine neu arrangierte VDJC-Sequenz. Zufolge des allelen Ausschlusses exprimiert ein Klon von T-Zellen nur einen Typ eines TCR-α-β-Heterodimers.
Eine zunehmende Zahl von menschlichen Erkrankungen wird von ihrer Natur her als autoimmune Krankheiten klas sifiziert (Theofilopoulos, A., In: D.P. Stites„ et al., eds., in Basic and Clinical Immunology, Lange Medical Publications, Los Altos, CA, 1988), wobei rheumatoide Arthritis (RA), Myasthenia Gravis (MG), multiple Sklerose (MS), erythematoser systemischer Lupus (SLE), Autoimmunthyroiditis (Hashimoto's Thyroiditis), Graves' Krankheit, entzündliche Darmerkrankung, autoimmune Uveoretinitis, Polymyositis und bestimmte Arten von Diabetes verschiedene Beispiele hiervon sind. Für eine Anzahl dieser menschlichen Autoimmunerkrankungen wurden Tiermodelle entwickelt. Experimentelle allergische Encephalomyelitis (EAE, auch experimentelle Autoimmunencephalomyelitis genannt), ein Modell für MS, gehört zu den am besten untersuchten Modellen.
Da es jetzt bekannt ist, dass bei diesen und anderen Autoimmunkrankheiten die Wirkung von T-Helfer-Zellen beteiligt ist, die durch das Binden ihres TCR an einen MHC/Autoantigenkomplex (oder einen Nicht-Autoantigenkomplex) stimuliert sind, wurden Präventions- und/oder Behandlungsstrategien vorgeschlagen, die auf der Unterbrechung der Wechselwirkungen zwischen dem MHC/Antigenkomplex und dem TCR basieren. Wraith, D.C., et al. in Cell. 57:709–715) (1989)) schlug Lösungen vor, die auf diesem Prinzip basieren, einschließlich der Impfung mit vollständigen T-Zellen (wie ursprünglich durch I.R. Cohen's Labor vorgeschlagen und weiter unten besprochen), der passiven Blockierung unter Verwendung von Antikörpern, die an den TCR binden, der passiven Blockierung unter Verwendung von Antikörpern, die an den MHC-Teil des Komplexes binden, der Verabreichung von Antikörpern, die mit dem CD4-Marker von T-Helfer-Zellen reaktionsfähig sind, und der Verwendung von Peptiden, die das interessierende Antigen nachahmen und um die Bindung an die MHC- oder TCR-Moleküle konkurrieren.
Das Myelinbasisprotein, MBP, stellt das hauptsächliche Autoantigen dar, das an der EAE beteiligt ist, und es ist der führende Kandidat als Encephalitogen, das an MS beteiligt ist.
Die Gruppe um Heber-Katz (Heber-Katz, E., et al., in Ann. N.Y. Acad. Sci. 540:576–577 (1988); Owhashi, M., et al., in J. Exp. Med. 168:2153–2164 (Dez. 1988)) hat die Feinspezifität bei der Erkennung von MBP-Epitopen durch die T-Zellen von Ratten analysiert. Wenn die mit MBP immunisierten T-Zellen von Ratten mit einer T-Lymphomlinie von Mäusen hybridisiert und geklont werden, zeigt das Muster der Feinspezifität und die Sothernblotanalyse des TCR-Vβ-Gen-Arrangements eine polyklonale Antwort, obwohl 75% des Klons mit der 68–88 Encephalitogendeterminante reagiert hat. Ein mit 10.18 bezeichneter monoklonaler Antikörper (mAb), der gegen ein Encephalitogen des T-Zellhybridoms gerichtet ist, erwies sich als ein Anti-Idiotyp oder ein Anti-Klonotyp, der nur mit T-Zellen reagierte, die für das MBP 68–88 Epitop spezifisch ist. Der mAb konnte EAE blockieren oder rückgängig machen, wenn er zusammen mit dem encephalitogenen MBP-Peptid injiziert wurde, oder 5 Tage später. Löslicher 10.18 mAb blockierte die spezifischen T-Zell-Klone und immobilisierter 10.18 mAb stimulierte ihre Proliferation. Auf die Induzierung von EAE mittels MBP hin erhöhte sich der Anteil von Zellen, die den 10.18 mAb binden, ausgehend von einer anfangs sehr niedrigen Frequenz. Die Autoren schlossen daraus, dass die 10.18+ T-Zellen wahrscheinlich das dominante pathogene T-Zellrepertoire von EAE in Lewis-Ratten darstellten. Jedoch war es nicht bekannt, ob der 10.18 mAb eine V-Domäne oder eine idiotypische Determinante erkannte.
T-Zellen, die den TCR-αβ-Heterodimer exprimieren, können idiotypische Antikörper und V-Gen-familienspezifische Antikörper exprimieren, die die T-Zellfunktion regulieren (Owhashi, M., et al., a.a.O.; Gascoigne, N.R.J., J.W., et al., in Proc. Natl. Acad. Sci., USA 84:2936 (1987); Kappler, j.W., et al., in Nature 332:35 (1988); Kappler, J.W., et al., in Cell 49:263 (1987); MacDonald, H.R., et al., in Nature 332:40 (1988). Beispielsweise sind Antikörper, die die TCR Vβ8-Sequenz erkennen, bei der Prävention und Behandlung von Autoimmunitäten in Mäusen und Ratten wirksam (Owhashi, M., et al., supra; Acha-Orbea, H., et al., in Cell 54:263–273 (1988); Urban, J., et al., in Cell 54:577–592 (1988)). Die Gewinnung solcher Antikörper, die für die Genprodukte in der V-Region selektiv sind, ist von der Verfügbarkeit von T-Zellklonen abhängig, die den TCR exprimieren, der durch die relevante V-Genfamilie codiert wird, und sie erfordert mühsame Screeningverfahren unter Verwendung von vollständigen Zellen, um die gewünschte Spezifität zu erreichen.
Obwohl Antikörpertherapien, bei denen Antikörper gegen die MHC-Moleküle und die CD4-Moleküle gerichtet sind, bei verschiedenen Tiermodellen mit Autoimmunität erfolgreich sind, sind diese Lösungen nicht besonders selektiv und möglicherweise übermäßig suppressiv, da 70% der T-Zellen den CD4-Marker tragen und da alle T-Zell-vermittelten Antworten und die meisten Antikörperantworten eine MHC-assoziierte Antigenpräsentation erfordern.
Das Labor von I.R. Cohen hat eine Lösung für die immunspezifische Behandlung von Autoimmunitäten entwickelt, bei der lebende oder abgeschwächte vollständige T-Lymphozyten als Impfstoff verwendet werden, um EAEn – experimentelle autoimmune Thyroiditis (EAT) – und experimentelle Arthritis zu verhindern oder zu behandeln. Diese Lösung ist dem Aufsatz von I.R. Cohen in Immunol. Rev. 94:5–21 (1986) beschrieben, der verschiedene Tiermodelle von Autoimmunkrankheiten diskutiert, wobei eine Impfung mit krankheitsspezifischen T-Lymphozyten verwendet wurde, um prophylaktische und therapeutische Effekte zu erzielen. Die Feinspezifität der Impfung wurde durch die Feinspezifität der T-Zell-Erkennung diktiert, die möglicherweise den TCR mit einschließt. Beispielsweise wurden zwei unterschiedliche Anti-MBP-T-Zell-Linien gefunden, von denen jede mit einem anderen Epitop des MBP reagieren kann, um gegen EAE zu impfen, das durch die speziellen Epitope induziert wurde, was eine Form der antiidiotypischen Immunität anzeigt. Als jedoch Versuche unternommen wurden, die Klone mit MBP-spezifischen T-Zellen oder Thyroglobulin-spezifischen T-Zellen (in einem Thyroiditismodell) von den nichtklonalen Zell-Linien zu isolieren, wurden nur Klone gewonnen, die die Krankheit, jedoch keine Widerstandsfähigkeit hervorrufen. Dies führte zu der Erkenntnis, dass eine geeignete Aggregation oder Rigidifikation der Zellmembranen, entweder durch den hydrostatischen Druck oder chemische Querbindung hervorgerufen, Zellen hervorbrachte, die konsistenter den Schutz induzieren konnten. In ähnlicher Weise konnten auch niedrige (subencephalitogene) Dosen von MBP-spezifischen Zellen eine Resistenz gegen lethale EAE induzieren. Der Schutzzustand wurde als "Gegen-Autoimmunität" bezeichnet. Bei diesem Zustand sind T-Zellklone beteiligt, die spezifisch als Antwort auf die eingeimpften T-Zellen proliferieren können, Effektorklone in vitro (nichtspezifisch, vermutlich zufolge der Freisetzung eines suppressiven Lymphokins) unterdrücken können und die, wie angenommen, in vivo die Gegenautoimmunität übertragen können. Solche Gegen-Autoimmunität ist von einer unterdrückten verzögerten Überempfindlichkeitsantwort (DH) auf die spezifischen Epitope und einer Verhinderung oder Abnahme der klinischen Erkrankung begleitet.
Eine Hauptschwierigkeit bei den vorstehenden Lösungen besteht darin, dass sie die Verwendung komplexer biologischer Präparationen erfordern, die keine wohl definierten therapeutischen Wirkstoffe enthalten. Solche Präparationen leiden darunter, dass sie eine komplexe Produktion und Pflege (beispielsweise der Notwendigkeit für Sterilität und großer Mengen an Medium zur Produktion einer großen Anzahl von "Impf"-T-Zellen) erfordern und ihnen die Reproduzierbarkeit von Batch zu Batch fehlt. Die T-Zell-Impfpräparationen, die für Menschen verwendbar sind, müssen sowohl autolog als auch individuell spezifisch sein, d.h. für jeden Patienten exakt zugeschnitten. Darüber hinaus kann das Vorhandensein von zusätzlichen Antigenen auf der Oberfläche von solchen T-Zellen zu einer breiteren, möglicherweise schädlichen Immunreaktion führen, die nicht auf die gewünschten T-Zellklone beschränkt ist (Offner, H. et al., in J. Neuroimmunol. 21:13–22 (1989)).
In der EP-A-0 340 109 ist die Verwendung von Antikörpern, Oligopeptiden oder antiidiotypischen Antikörpern beschrieben, die auf die variablen Regionen von T-Zell-Rezeptoren bezogen sind, die mit Autoimmunkrankheiten assoziiert sind, um die Funktion der T-Zell-Rezeptoren zu inhibieren.
In der WO90/11294 ist die Verwendung von T-Zellen, T-Zell-Rezeptoren oder deren Fragmenten als Impfstoff gegen T-Zell-vermittelte Pathologien vorgeschlagen.
Es gibt deswegen einen großen Bedarf für Wirkstoffe und pharmazeutische Zusammensetzungen, die die Eigenschaft der Spezifität für die Autoimmunreaktion, auf die gezielt wird, die Vorhersagbarkeit ihrer Selektion, die Einfachheit und Reproduzierbarkeit der Zubereitung und der aus reichenden Definition aufweisen, um eine genaue Steuerung der Dosierung zu ermöglichen.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung wurde als Antwort auf einen klaren Bedarf nach therapeutischen Wirkstoffen und Zusammensetzungen geschaffen, die in der Lage sind, immunbezogene Krankheiten in einer klonspezifischen Weise zu verhindern, zu unterdrücken oder zu behandeln, ohne dass eine allgemeine Unterdrückung des Immunverhaltens verursacht wird, wie dies im Falle der meisten heute gebräuchlichen immuntherapeutischen und immunpharmakologischen Lösungsansätze der Fall ist. Die Erfindung wurde aus der Kenntnis heraus entwickelt, dass Linien oder Klone von T-Zellen, die für Autoantigene, die in der Tat Autoimmunkrankheiten vermitteln, durch komplexe Abschwächungsprotokolle in Therapeutika umgewandelt und unmittelbar in Tiere injiziert werden können, um die Krankheit zu verhindern oder zu behandeln.
Die Versuche des Erfinders, eine derartige zelluläre Immuntherapie zu schaffen, führte zu suboptimalen Ergebnissen. Bei der Verwendung von Abschwächungsverfahren, wie sie aus dem Stand der Technik bekannt sind, erhielt der Erfinder variable unvorhersehbare Schutzwerte und die sich ergebende Immunität war nicht auf den Klon beschränkt, vermutlich weil Vollzellenimpfstoffe eine Varietät von Antigenen eingeführt haben.
Bei einem Versuch, diese allgemeine Lösung zu vereinfachen und zu standardisieren und eine sehr spezifische Immunität zu erhalten, bei der nur jene Klone von T-Zellen, die das Krankheits-assoziierte Antigen erkannten, bevorzugt wurden, schuf der Erfinder die vorliegende Erfindung. Der Erfinder hat erstmalig erkannt, dass ein immunogenes Peptid synthetisiert werden kann, das einen Teil des Krankheits-assoziierten immunologischen "Markers" nachahmt, beispielsweise den TCR von T-Zellen, die an dem Krankheitsprozess beteiligt sind. Unerwarteterweise richtet die Immunisierung eines Individuums mit dem Peptid die Immunantwort des Wirtes gegen den "Marker" und verhindert dadurch bzw. unterdrückt die Entwicklung der Krankheit oder behandelt den Verlauf der Krankheit.
Ein Merkmal der Erfindung ist ein Verfahren zum Auswählen, welches Peptid zu verwenden ist, um eine immunbezogene Krankheit zu verhindern, zu unterdrücken oder zu behandeln, und zwar basierend auf einer Identifikation der Aminosäuresequenz des TCR-Markers, der mit der Krankheit assoziiert ist, vorherzusagen, welches Segment der TCR-Sequenz auf verschiedenen bekannten Algorithmen immunogen basiert, und zu bestimmen, welche Stelle oder Stellen in der TCR-Struktur ein geeignetes Ziel für eine Immunantwort sind, die zu einem Schutz gegen die Krankheit führen.
Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung ist ein Peptid mit 15–30 Aminosäuren, die eine Aminosäuresequenz eines T-Zell-Rezeptor-Markers haben, die für eine immunbezogene Krankheit charakteristisch ist, wobei das Peptid in der Lage ist, einen Schutz gegen die Krankheit zu induzieren, und wenigstens einen Teil des zweiten Komplementaritätsbestimmenden Abschnitts des T-Zellrezeptors aufweist; oder es handelt sich um ein funktionales Derivat des Peptids, vorausgesetzt, dass das Peptid nicht die Sequenz
Asp-Met-Gly-His-Gly-Leu-Arg-Leu-Ile-His-Tyr-Ser-Tyr-Asp-Val-Asn-Ser-Thr-Glu-Lys aufweist.
Die Erfindung schließt auch das Peptid ein, das mit einem Träger konjugiert ist, beispielsweise eine zusätzliche heterologe Aminosäuresequenz, um die Immunogenität des Peptids zu verbessern.
Die Erfindung ist auch auf eine pharmazeutische Zusammensetzung gerichtet, die das Peptid oder ein funktionales Derivat in Vermischung mit einem pharmazeutisch verträglichen Exzipienten aufweist.
Somit liefert die Erfindung chemisch definierte Peptide und Therapeutika, die bei bestimmten immunbezogenen Krankheiten speziell angewendet werden können, um die spezifische immunologische Antwort zu unterbrechen, die für das Induzieren oder das Verbreiten des Krankheitsprozesses verantwortlich ist.
Zu den Krankheiten, bei denen die Erfindung insbesondere einzusetzen ist, gehören Autoimmunkrankheiten, wie rheumatoide Arthritis, adjuvante Arthritis, Myasthenia Gravis, Enzephalomyelitis, multiple Sklerose, Thyroiditis, Diabetes, entzündliche Darmerkrankung und systemischer erythematoser Lupus. Die Erfindung ist auch gegen bösartige Erkrankungen gerichtet, wie T-Zell-Leukämie und Lymphom, wobei der TCR als Tumormarker dient.
Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung ist ein Verfahren zum Auswählen eines Peptids mit einer Aminosäuresequenz eines T-Zell-Rezeptors, wobei der T-Zell-Rezeptor eine T-Zell-Rezeptor-Marker ist, der für eine immunbezogene Krankheit charakteristisch und das Peptid in der Lage ist, einen Schutz gegen die Krankheit zu induzieren, wobei zu dem Verfahren die Schritte gehören, dass:

(a) die T-Zellen von einem Individuum, das eine Disposition für die Krankheit aufweist, entnommen werden;
(b) die Anzahl der T-Zellen nach Schritt (a) in einer Kultur in Anwesenheit einer autoantigenen Präparation expandiert werden;
(c) der T-Zell-Rezeptor, der durch die expandierten T-Zellen nach Schritt (b) exprimiert wird, identifiziert wird; und
(d) das Peptid aus der Aminosäuresequenz ausgewählt wird, das wenigstens einen Teil des zweiten Komplementaritäts-bestimmenden Abschnitts des T-ZellRezeptors aufweist.

Der TCR kann durch seine Verwendung von TCR-spezifischen Antikörpern oder durch Bestimmung der TCR-Aminosäuresequenz identifiziert werden.
Die Erfindung schafft ferner ein Verfahren zum Herstellen eines Peptids mit einer Aminosäuresequenz eines TCR, wobei der T-Zell-Rezeptor ein T-Zell-Rezeptor-Marker ist, der für eine immunbezogene Krankheit charakteristisch ist, das Peptid in der Lage ist, einen Schutz gegen die Krankheit zu induzieren und zu dem Verfahren die Schritte gehören, dass:

(a) wie oben beschrieben, ein Peptid ausgewählt wird; und
(b) das Peptid oder ein funktionales Derivat hiervon synthetisiert wird.

Weitere Ausführungsbeispiele der Erfindung sind auf polyklonale, monoklonale oder chimere Antikörper gerichtet, die für das TCR-Peptid spezifisch sind, das in der Lage ist, ein Individuum gegen eine immunbezogene Krank heit zu schützen sowie Verfahren zum Herstellen solcher Antikörper. Die Erfindung umfasst auch Antikörper, die an zytotoxische Wirkstoffe gebunden sind einschließlich ribosomaler Inhibierungsproteine, wie beispielsweise die Ricin-A-Kette.
Zu der Erfindung gehört auch die Verwendung der obigen Antikörper bei der Herstellung eines Medikaments, um eine Autoimmunkrankheit zu verhindern, zu unterdrücken oder zu behandeln.
Kurze Beschreibung der Figuren
1. Peptid-spezifische Inhibierung einer Antikörperreaktionsfähigkeit. Antiseren von 4 Ratten, die entweder mit dem TCR Vβ8 (39–59) Peptid allein oder in Kombination des TCR-Peptids und des GP-S49S MBP-abgeleiteten Autoantigens kombiniert sind, werden zusammengegossen und 40-360-fach verdünnt. Die Antiseren werden auf ihre Reaktionsfähigkeit in ELISA mit 25 ng Peptid, das an Mikroplattentüpfel gebunden ist, indirekt getestet. Die Menge an Peptid ist 10 pM TCR Vβ8 (39–59) (MW = 2390 Dalton) oder 15 pM GP-549S (MW = 1630 Dalton) äquivalent. In einem Bereich zwischen 0,005 – 50μg/Tüpfel werden variierende Konzentrationen des Inhibitorpeptids zugegeben. Die Absorptionsmessungen wurden in Triplikattüpfeln bestimmt und die Reaktionsfähigkeit als Vielfaches der nichtinhibierten Kontrolltüpfel berechnet.
2. Antikörper gegen das Peptid TCR Vβ8(39–59) färben Vβ+ encephalitogene T-Zellen. Normale Thymozyten (A und C) oder GP-S49S-spezifische T-Zell-Linien (B und D) werden mit Karnickelantikörpern gegen TCR Vβ8 (39–59) inkubiert, gefolgt von einem Maus-Anti-Karnickel-IgG- begünstigenden Antikörper und einem Fluoreszin-markierten Ziege-Anti-Maus-IgG-Antikörper. Zytrometrische Strömungsanalyse der Verfärbung wird unter Verwendung eines Coulter Epics- C-Zytofluorograph durchgeführt. A und C entsprechen Dot-Plots von 10 000 Zellen unter Veranschaulichung der Zellgröße über der Fluoreszenzintensität; B und D repräsentieren die entsprechenden Histogramme. Die Fluoreszenzintensität der T-Linienzellen, die mit Anti-TCR Vβ8(39–59) Antikörper gefärbt sind (mehr als 90% gefärbt), ist, verglichen mit den 5% normalen Thymozyten erhöht, die mit diesem Antikörper gefärbt sind. Sowohl die Thymozyten als auch die T-Linienzellen, die mit normalem Karnickel-IgG inkubiert sind, als Kontrolle für das Anti-TCR Vβ8(39–59) IgG zeigten den Hintergrundwert der Färbung (gestrichelte Linie in Kasten D).
3. Prävention, Unterdrückung und Behandlung von EAE mit 50μg TCR Vβ8-39–59 Peptid/CFA. Ratten wurden s.c. mit dem TCR-Peptid 40 Tage zuvor gleichzeitig oder 12 Tage nach dem Einsetzen der Krankheit nach der Induzierung von EAE mit 50μg GP-MBP/CFA geimpft.
4. Die Unterdrückung von EAE mit 50μg TCR Vβ8-39–59 Peptid, das gleichzeitig oder 7 oder 11 Tage nach der Induzierung von EAE mit 50μg GP-MBP/CFA i.d. in das Ohr verabreicht wurde.
5. Behandlung von EAE mit 10 oder 50μg TCR Vβ8-39-59, das beim Einsetzen der klinischen Anzeichen (Tag 12) nach der Induzierung von EAE mit 50μg GP-MBP/CFA in dem Ohr i.d. verabreicht wurde.
6. Die Peptidspezifität von MBP-spezifischen menschlichen T-Zell-Linien aus MS-Patienten und Gesunden.
7. Verhältnis der Gesamtproliferationsantwort von T-Zell-Linien, die gegen jedes Peptid gerichtet sind, verglichen mit dem Anteil aller Klone, die auf jedes Peptid reagieren.
8. Zellantworten gegen die TCR Vβ8- und Vβ14-Peptide bei aus EAE-genesenen Ratten und TCR-Peptid-immunisierten Ratten. DTH ist in mm/100 und die Proliferation in CPM/1000 angegeben, wobei jeweils die Hintergrundaktivität abgezogen ist.
9. Behandlung von wiederaufflackernder EAE mit TCR Vβ17-Peptid.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsbeispiele
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, Verfahren und Produkte sind sowohl bei Menschen als auch beim Tier anwendbar.
Die erfindungsgemäßen Peptide enthalten Sequenzen von etwa 13–30 Aminosäuren und sind immunogen, d.h. in der Lage, eine Immunantwort zu induzieren, wenn sie in ein Individuum injiziert werden.
Unter "funktionalem Derivat" ist ein "Fragment", eine "Variante", ein "Analogon" oder ein "chemisches Derivat" des Peptids zu verstehen, dessen Terme nachstehend definiert sind.
Es ist verständlich, dass die Aminosäuresequenz, die das erfindungsgemäße Peptid enthält, alleine verwendet werden kann oder an ein längeres Peptid gebunden oder innerhalb der Sequenz eines längeren Peptids enthalten.
Das längere Peptid kann Sequenzen eines nicht verwandten Peptids aufweisen, beispielsweise ein Carrier-Protein, das dazu verwendet wird, die Immunogenität des TCR-Oligopeptids zu verbessern. Solche Carrier sind dem Fachmann bekannt und es gehören hierzu heterologe Proteine, so z.B. Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH), Rinderserumalbumin, Tetanustoxoid u.dgl. In den Umfang der Erfindung fällt auch das Peptid, das an einen Antikörper gebunden ist, ebenso wie ein Peptid, das an ein Toxin gebunden ist. Zu den erfindungsgemäßen Toxinen gehören das ribisomale Inhibitorprotein, beispielsweise die Ricin-A-Kette oder das Pseudomonas-Toxin.
In dem hier gebrauchten Sinne bezeichnet der Ausdruck "Marker TCR" einen TCR, der für eine besondere immunbezogene Krankheit charakteristisch ist, beispielsweise eine Autoimmunkrankheit oder eine bösartige Erkrankung (d.h. Krebs).
Der Ausdruck "immunbezogene Krankheit" bezeichnet in dem hier verwendeten Sinne eine Krankheit, bei der das Immunsystem an der Pathogenese der Krankheit beteiligt ist oder bei der eine geeignete Stimulierung des Immunsystems zu einem Schutz gegen diese Krankheit führen kann. Ein bevorzugtes Beispiel für eine immunbezogene Krankheit, auf die die Erfindung zielt, ist eine Autoimmunkrankheit. In nicht beschränkender Weise werden als Beispiele für Autoimmunkrankheiten bei dieser Erfindung angesehen rheumatoide Arthritis (RA), Myasthenia Gravis (MG), multiple Sklerose (MS), systemischer erythematoser Lupus (SLE), autoimmune Thyroiditis (Hashimoto's-Thyroiditis), Graves' Krankheit, entzündliche Darmerkrankung, Autoimmunuveoretinitis, Polymyositis und bestimmte Arten von Diabetes.
Demzufolge ist ein Marker-TCR für MS ein TCR, der in der Lage ist, den Komplex zwischen dem eigenen MHC und dem MBP-Fragment (oder dem MBP-Fragment alleine) zu binden, wobei der MBP die autoantigene Hauptcharakteristik dieser Krankheit aufweist. Bei anderen Autoimmunerkrankungen dienen andere TCR als Marker, da sie für den Komplex zwischen den MHC-Molekülen und den Autoantigenen spezifisch sind, die bei diesen Krankheiten beteiligt sind. Bei Myasthenia Gravis (MG) wird zum Beispiel angenommen, das Autoantigen ist der Nikotinacetylcholin-Rezeptor (AChR). Deshalb wird ein identifizierbarer TCR, der AChR im Zusammenhang mit Selbst-MHC (oder direkt) bindet und durch AChR reaktive T-Zellen exprimiert wird, die die Krankheit vermitteln, als "Marker-TCR" für MG bezeichnet. Der Fachmann sieht, dass die Bestimmung eines Marker-TCR und des immunogenen Peptids durch routinierte Übung unter Verwendung von Screening-Verfahren, wie sie hinlänglich bekannt sind, erfolgt, wenn die Lehren der vorliegenden Erfindung vollständig verstanden sind.
Als immunbezogene Krankheiten sollen auch maligne Erkrankungen angesehen werden, bei denen die Tumorzelle einen Tumormarker trägt, beispielsweise ein Tumorantigen, das in der Lage ist, durch das Immunsystem erkannt zu werden und auf das das Immunsystem reagieren kann. Der TCR kann als Tumormarker bei T-Zell-Leukämie oder T-Zell-Lymphom-Zellen dienen.
Bei einem Individuum, das von einer immunbezogenen Krankheit befallen oder dafür disponiert ist, führt das Zuführen des Peptids, das die Aminosäuresequenz eines Teils des Marker-TCR trägt, zum Hervorrufen einer Immunantwort gegen den TCR und einen Schutz gegen die immunbezogene Krankheit.
Unter dem Begriff "Schutz" gegenüber der Krankheit, wie er hier verwendet wird, soll die Prävention, die Unterdrückung oder die Behandlung der Krankheit verstanden sein. Zur "Prävention" gehört die Verabreichung einer schützenden Zusammensetzung bevor die Krankheit induziert wird. So führt z.B. bei dem Tiermodell EAE eine erfolgreiche Verabreichung einer schützenden Zusammensetzung vor der Injektion des Encephalitogens, das die Krankheit induziert, zu einem "Schutz" gegen die Krankheit.
Bei der "Unterdrückung" wird die Zusammensetzung nach dem induzierenden Ereignis verabreicht, jedoch bevor die Krankheit klinisch in Erscheinung tritt. Wiederum beim EAE-Beispiel bedeutet die erfolgreiche Verabreichung einer schützenden Zusammensetzung nach der Injektion des Encephalitogens, jedoch vor dem Auftreten neurologischer Symptome die "Unterdrückung" der Krankheit.
"Behandlung" meint die Verabreichung der schützenden Zusammensetzung nach dem Auftreten der Krankheit. Bei dem EAE-Beispiel bedeutet die erfolgreiche Verabreichung einer schützenden Zusammensetzung nach der Injektion des Encephalitogens und nach dem Entwickeln klinischer Anzeichen die "Behandlung" der Krankheit.
Es ist klar, dass in der Humanmedizin es nicht immer möglich ist, zwischen "Prävention" und "Unterdrückung" zu unterscheiden, da das schließlich zur Induktion führende Ereignis oder die Ereignisse unbekannt oder latent sein können oder sich der Patient dessen nicht sicher ist, bis das Ereignis oder die Ereignisse aufgetreten sind. Deswegen ist es üblich, den Ausdruck "Prophylaxe" zur Unterscheidung von "Behandlung" zu verwenden, wobei Prophylaxe beides, die "Prävention" und die "Unterdrückung" einschließt, wie sie hier definiert wurden. Der Ausdruck "Schutz" soll in dem hier verwendeten Sinne die "Prophy laxe" einschließen.
Bei dem erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiel, das gegen eine autoimmune Krankheit gerichtet ist, richtet sich die Immunantwort des Individuums gegen die speziellen TCR, die jene T-Zellen markieren, die den Autoimmunprozess vermitteln sowie die erfindungsgemäßen Peptide, die somit in der Lage sind, das Binden des MHC/Antigen-Komplexes (oder des Antigens alleine) zu stören, der zur Initialisierung oder Ausbreitung der Autoimmunantwort erforderlich ist.
Im Allgemeinen repräsentiert die Peptidsequenz einen Teil des TCR selbst und muss immunogen sein, wie dies unten definiert ist, entsprechend wenigstens einem Teil der zweiten Komplementaritäts-bestimmende Region (CDR2) des TCR αβ Heterodimers. Im Bereich dieser Erfindung sollen auch Peptide liegen entsprechend wenigstens einem Teil der zweiten Komplementaritäts-bestimmende Region der TCR-γ- und TCR-δ-Ketten oder ihre Homologe in dem γδ-Heterodimer (siehe Strominger, J.L., in Cell 57:895–898 (1989); und Clevers, H, et al., in Ann. Rev. Immunol. 6:629–662 (1988)).
Die CDR des TCR sind durch Analogie zu der Struktur des Immunglobulinmoleküls definiert, wobei die CDR die Aminosäuresequenzen die variablen Regionen der schweren oder der leichten Kette enthalten, die mit dem Antigen in Berührung gekommen sind und die entscheidenden Teile der Antigenbindungsstelle darstellen. Es wird angenommen, dass alle drei TCR-CDR an der Bindung an ein Antigen oder MHC beteiligt sind (Davis, M.M., et al., Nature 334:395–402 (1988); Claverie, J.M., et al., in Immun. Tody 10:10–14 (1989)). Indem die Immunantwort des Individuums oder die erfindungsgemäßen Antikörper gegen den zweiten Komplemen taritäts-bestimmenden Abschnitt des "Marker-TCR" gerichtet werden, wird die Wahrscheinlichkeit einer Unterbrechung der erforderlichen Bindungs- oder Erkennungsereignisse zwischen den autoimmunassoziierten T-Zellen und dem Autoantigen und/oder MHC erhöht.
Ein "Fragment" des erfindungsgemäßen Peptids bedeutet jeden Unterabschnitt des Moleküls, der wiederum ein kürzeres Peptid ist.
Eine "Variante" des Peptids bezeichnet ein Molekül, das im Wesentlichen entweder dem gesamten Peptid oder dessen Fragment ähnlich ist. Peptidvarianten können unmittelbar durch chemische Synthese der Peptidvariante bequem hergestellt werden, wobei aus dem Stand der Technik wohlbekannte Verfahren verwendet werden.
Alternativ können Aminosäuresequenzvarianten des Peptids durch Mutationen in der DNA hergestellt werden, die für das zu synthetisierende Peptid codieren. Solche Varianten enthalten beispielsweise Auslassungen von Substitionen innerhalb der Aminosäuresequenz, Einfügungen oder Ersetzungen. Jede Kombination von Auslassung, Einfügung oder Substitution kann zu dem endgültigen Construct führen, vorausgesetzt, dass das endgültige Ergebnis die gewünschte Aktivität besitzt. Die Mutationen, die in der DNA, die für die Peptidvariante codiert, müssen offensichtlich nicht den Leserahmen verändern und erzeugen vorzugsweise komplementäre Bereiche, die eine Sekundär-mRNA-Struktur hervorrufen könnte (sie EP-A-0 075 444).
Auf dem genetischen Niveau werden diese Varianten für gewöhnlich durch stellenbezogene Mutagenese der Nukleotide in der DNA erzeugt, die für das Peptidmolekül codiert, wodurch eine DNA produziert wird, die für die Variante codiert, wobei anschließend die DNA in einer rekombinanten Zellkultur exprimiert wird. Die Varianten zeigen üblicherweise qualitativ dieselbe biologische Aktivität wie das nicht veränderte Peptid.
Die Herstellung der Peptidvariante, wie hier beschrieben, wird bevorzugt durch eine stellenspezifische Mutagenese der DNA erreicht, die für eine vorher zubereitete Variante oder eine nicht variierte Version des TCR-Proteins oder Peptids codiert. Eine stellenspezifische Mutagenese gestattet die Produktion von Peptidvarianten unter Verwendung spezifischer Oligonukleotidsequenzen, die für die DNA-Sequenz der gewünschten Mutation codieren ebenso wie eine ausreichende Anzahl benachbarter Nukleotide, um eine Primersequenz ausreichender Größe und eine Sequenzkomplexität bereitzustellen, um einen stabilen Duplex zu beiden Seiten der Auslassungsverknüpfung zu bilden, die zu überbrücken ist. Die Technik der stellenspezifischen Mutagenese ist aus dem Stand der Technik hinreichend bekannt, beispielsweise aus Adelman et al., DNA 2:183 (1983). Zu den typischen Vektoren, die für die stellenbezogene Mutagenese brauchbar sind, gehören Vektoren, wie beispielsweise der M13-Phage, wie dies von Messing et al., in Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, Walton, A., ed., Elsevier, Amsterdam (1981) berichtet wurde. Dieser Phage ist auf dem Markt leicht zu bekommen und seine Verwendung ist für den Fachmann hinlänglich bekannt. Alternativ können Plasmidvektoren, die einen einsträngigen Phagen im Replikationsanfang enthalten (Veira et al., Meth. Enzymol. 153:3 (1987)) verwendet werden, um eine einsträngige DNA zu bekommen.
Im Allgemeinen wird die stellengerichtete Mutagenese ausgeführt, indem zunächst ein einsträngiger Vektor erhal ten wird, der innerhalb seiner Sequenz eine DNA-Sequenz enthält, die für das relevante Peptid codiert. Dann wird ein Oligonukleotid-Primer, der die gewünschte mutierte Sequenz trägt, für gewöhnlich synthetisch hergestellt, beispielsweise mittels des Verfahrens nach Crea et al., in Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 75:5765 (1978). Dieser Primer wird dann an den einsträngigen, die Proteinsequenz enthaltenden Vektor gebunden und DNA-polymerisierenden Enzymen ausgesetzt, beispielsweise dem I Klenow-Polymerasefragment aus E. coli, um die Synthese des die Mutation tragenden Strangs zu vervollständigen. Auf diese Weise wird eine mutierte Sequenz erhalten und der zweite Strang trägt die gewünschte Mutation. Dieser Heteroduplexvektor wird dann dazu verwendet, geeignete Zellen zu transformieren und die Klone, die die rekombinanten Vektoren enthalten, die das mutierte Sequenz-Arrangement tragen, werden selektiert. Die mutierte Proteinregion wird dann herausgelöst und in einem geeigneten Vektor zur Proteinproduktion plaziert, im Allgemeinen einem Exprimierungsvektor in einer Art, wie er zur Transformation eines geeigneten Wirts verwendet werden kann.
Zu einem Beispiel für eine terminale Einfügung gehört eine Fusion einer Signalsequenz, die entweder zu den Wirtszellen heterolog oder homolog ist, an den N-Terminus des Peptidmoleküls, um die Sezernierung des reifen Peptidmoleküls aus dem rekombinanten Wirt zu erleichtern.
Eine andere Variante von Gruppen sind jene, bei denen wenigstens ein Aminosäurerest in dem Peptidmolekül, vorzugsweise nur einer, entfernt wurde und ein anderer Baustein an seine Stelle gesetzt wurde. Solche Ersetzungen werden vorzugsweise entsprechend der nachstehenden Auflistung durchgeführt, wenn es erwünscht wird, die Eigenschaften des Peptidmoleküls zu modulieren.
Wesentliche Änderungen hinsichtlich der funktionalen oder immunologischen Eigenschaften werden erreicht, indem Substitutionen ausgewählt werden, die weniger konservativ sind als jene in der obigen Liste, d.h. indem Bausteine gewählt werden, die sich deutlicher in ihrer Auswirkung unterscheiden hinsichtlich (a) der Aufrechterhaltung der Struktur des Peptidrückrats im Bereich der Substitution, beispielsweise als blattförmige oder schraubenförmige Konformation, (b) der Ladung oder der hydrophoben Eigenschaf des Moleküls an der Zielstelle oder (c) dem Volumen der Seitenkette. Die Substitutionen, von denen im Allgemeinen erwartet wird, dass sie dies erbringen, beinhalten, dass (a) Glyzin und/oder Prolin durch eine andere Aminosäure ersetzt, entfernt oder eingeführt wird; (b) dass ein hydrophiler Baustein, beispielsweise Seryl oder Threonyl für oder durch einen hydrophoben Baustein ersetzt wird, beispielsweise Leuzyl, Isoleuzyl, Phenylalanyl, Valyl oder Alanyl; (c) dass ein Zysteinbaustein für oder durch einen anderen Baustein ersetzt wird; (d) dass ein Baustein mit einer elektropositiven Seitenkette, beispielsweise Lysyl, Arginyl oder Histidyl durch einen Baustein ersetzt wird, der eine elektronegative Ladung aufweist, beispielsweise Glutamyl oder Aspartyl; oder (e) dass ein Baustein mit einer voluminösen Seitenkette, beispielsweise Phenylalanin für (oder durch) einen Baustein ersetzt wird, der keine derartige Seitenkette hat, beispielsweise Glyzin.
Die meisten Auslassungen, Einfügungen und insbesondere Ersetzungen rufen erwartungsgemäß keine radikalen Änderungen in den Eigenschaften der Peptidmoleküle hervor. Wenn es jedoch schwierig ist, genau die Wirkung der Substitution, Auslassung oder Einfügung vor der Ausführung vorherzusagen, weiß der Fachmann ohne weiteres, dass er die Wirkung durch Routine-Screening-Tests evaluieren kann. Beispielsweise wird eine Variante üblicherweise durch eine stellenspezifische Mutagenese der das Molekül codierenden Peptidnukleinsäure beim Expremieren der Nukleinsäurevariante in rekombinanten Zellkulturen und optional der gereinigten Gewinnung aus der Zellkultur, beispielsweise durch Immunoaffinitätsadsorption an einer Antipeptid-Antikörpersäule erzeugt (um die Variante durch Bindung an wenigstens ein Epitop zu absorbieren).
Die Aktivität des Zell-Lysats oder der gereinigten Peptidvariante wird sodann in einem Screening-Test gescreent, der für die gewünschte Eigenschaft geeignet ist. Beispielsweise wird eine Änderung der immunologischen Eigenschaft des Peptidmoleküls, beispielsweise das Binden an einen vorgegebenen Antikörper, durch Immunotests mit konkurrierendem Charakter gemessen. Änderungen bei der T-Zell-Erkennung der Peptidvariante wird durch einen HD-Test in vivo oder einen T-Zell-Proliferationstest in vitro gemessen. Modifikationen solcher Peptideigenschaften, wie Redox oder thermische Stabilität, Hydrophobigkeit, Empfindlichkeit gegenüber proteolytischem Abbau oder die Neigung, mit Trägern oder in Multimere zu aggregieren, werden mittels Verfahren untersucht, die für den normalen Fachmann bekannt sind.
Ein "Analogon" eines Peptids bezeichnet ein nicht natürliches Molekül, das entweder dem gesamten Molekül oder einem Fragment im Wesentlichen ähnlich ist.
Ein "chemisches Derivat" eines erfindungsgemäßen Peptids enthält zusätzliche chemische Mengen, die normalerweise nicht Bestandteil des Peptids sind. Covalente Modifikationen des Peptids liegen innerhalb des Bereichs dieser Erfindung. Solche Modifikationen können in das Molekül eingefügt werden, indem man den Aminosäurerest des Peptids, auf den gezielt wird, mit einem organischen derivierenden Wirkstoff reagieren lässt, der in der Lage ist, mit den ausgewählten Seitenketten oder terminalen Bausteinen zu reagieren.
Für gewöhnlich lässt man Zysteinbausteine mit α-Haloacetaten (und entsprechenden Aminen), beispielsweise Chloroaceticsäure oder Chloroacetamin) reagieren, um Carboxymethyl- oder Carboxyamidomethylderivate zu bekommen. Zysteinreste werden durch Reaktion mit Bromotrifluoroazeton, α-Bromo-β-(5-Imidozoyl)Propionsäure, Chloroacetylphosphat, N-Alkylmaleimid, 3-Nitro-2-Pyridyldisulfid, Methyl 2-Pyridyldisulfid, p-Chloromercuribenzoat, 2-Chloromercuri-4-Nitrophenol oder Chloro-7-Nitrobeno-2-Oxa-1,3-Diazol deriviert.
Histidylbausteine werden durch Reaktion mit Diehtylprokarbonat bei einem pH-Wert von 5,5–7,0 deriviert, da dieser Wirkstoff für die Histidylseitenkette verhältnismäßig spezifisch ist. Parabromophenacylbromid ist ebenfalls brauchbar; diese Reaktion wird vorzugsweise in 0,1 M Natriumcacodylat bei einem pH-Wert von 6,0 ausgeführt.
Lysinyl- und Amino-terminale Bausteine lässt man mit Succin oder anderen Karboxylsäureanhydriden reagieren. Die Derivatbildung mit diesen Wirkstoffen führt zu einer Umkehrung der Ladung der Lysinylbausteine. Andere geeignete Wirkstoffe zur Derivatbildung bei dem α-Amino enthaltenden Baustein sind Imidoester, wie Methylpicolinimidate; Pyridoxalphosphate; Pyridoxal; Chloroborohydrid; Trinitrobenzensulfonsäure; O-Methylissurea; 2,4 Pentanedion; und die Transaminase-katalysierte Reaktion mit Glyoxylat.
Die Arginylbausteine werden durch Reaktion mit einem oder mehreren konventionellen Wirkstoffen modifiziert, zu denen Phenylglyoxal, 2,3-Butanedion, 1,2-Cyclohexanedion und Ninhydrin gehören. Die Derivatbildung bei Argininbausteinen erfordert, dass die Reaktion wegen des hohen pK_a der Guanidinfunktionsgruppe unter alkalischen Bedingungen ausgeführt wird. Ferner können diese Wirkstoffe mit in Gruppen von Lysin ebenso wie mit der Argininepsilon-Aminogruppe reagieren.
Die spezifische Modifikation der Tyrosylbausteine per se wurde ausführlich untersucht, wobei besonderes Interesse dem Einfügen von spektralen Labeln in die Tyrosylbausteine galt, indem man sie mit aromatischen Diazonverbindungen oder Tetranitromethan reagieren ließ. Für gewöhnlich werden N-Acetylimidizol und Tetranitromethan verwendet, um O-Acetyltyrosylspezien bzw. 3-Nitroderivate zu bilden. Tyrosylbausteine werden unter Verwendung von ¹²⁵I oder ¹³¹I iodiert, um markierte Proteine zur Verwendung in Radioimmuntests zu bekommen, wobei die Chloramin-T-Methode geeignet ist.
Die Carboxylseitengruppe (Aspartyl oder Glutamyl) werden durch Reaktion mit Carbodiimiden (R'-N-C-N-R'), beispielsweise Cyclohexyl-3-(2-Morpholinyl-(4-Ethyl) Carbodiimid oder 1-Ethyl-3-(4 Azon 4,4-Dimethylpentyl) Carbodiimid modifiziert. Ferner werden Aspartyl- und Glutamylreste in Asparaginyl- und Glutaminylreste durch Reaktion mit Ammoniumionen konvertiert.
Glutaminyl- und Asparaginylbausteine werden häufig zu den entsprechenden Glutamyl- und Aspartylbausteinen deamidiert. Alternativ werden diese Rest in den Bereich der Erfindung.
Die Derivatbildung mit bifunktionalen Wirkstoffen ist zum Cross-Linken mit einer wasserunlöslichen Trägermatrix oder anderen makromolekularen Trägern zweckmäßig. Zu den gebräuchlichen Cross-Linkwirkstoffen gehören z.B. 1,1-Bis(Diazoacetyl)-2-Phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysucciinimidester, beispielsweise Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionale Imidoester einschließlich Disuccinimidylester wie 3,3'-Dithiobis(Succinimidylproprionat) und bifunktionale Maleimide wie Bis-N-Maleimido-1,8-Octan. Derivat bildende Wirkstoffe, wie Methyl-3-[(p-Azidophanyl) Dithio] Propioimidat führen zu fotoaktivierbaren Zwischenstufen, die in der Lage sind, unter Licht Cross-Links zu bilden. Alternativ werden reaktionsfähige wasserunlösliche Matrizen, wie Cyanogenbromid-aktivierte Karbohydrate und die reaktionsfähigen Substrate, wie sie in den US-Patenten 3 969 287, 3 691 016, 4 195 128, 4 247 642, 4 229 537 und 4 330 440 beschrieben sind, verwendet, um das Protein zu immobilisieren.
Zu anderen Modifikationen gehören die Hydroxylierung von Prolin und Lysin, Phosphorilierung von Hydroxylgruppen von Seryl und Theonylresten, Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidinseitenketten (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecule Proper ties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79–86 (1983)), die Acethylierung des N-terminalen Amins und in einigen Fällen die Amidierung der C-terminalen Carboxylgruppen.
Solche derivierten Teile können die Löslichkeit, Absorption, biologische Halbwertszeit u.dgl. des Peptids verbessern. Diese Teile können alternativ unerwünschte Nebeneffekte des Peptids u.dgl. eliminieren oder abschwächen. Teile, die in der Lage sind, solche Wirkungen zu vermitteln, sind beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Ausgabe, Mack Publishing Co., Easton, PA (1980) veröffentlicht.
Bösartige Krankheit
Auf die erfindungsgemäßen Verfahren sprechen auch Lymphome und Leukämien an. Lymphome und viele Leukämien sind Tumore, die aus Lymphozyten bestehen, die unkontrollierte proliferieren (beispielsweise bösartig sind). Da verschiedene Klassen von Leukämie und Lymphom aus T-Zellen bestehen, die sich von einem einzigen malignen T-Zell-Vorläufer ableiten, tragen all diese Tumorzellen denselben TCR, der somit als "Tumor-Marker" dient, auf den die schützende Zusammensetzung gemäß der Erfindung ausgerichtet werden kann. In ähnlicher Weise können Oberflächenimmunoglobuline als Tumor-Marker für B-Zell-Leukämien oder Lymphome dienen.
Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung ist auf die Verbesserung der Antitumorantwort ausgerichtet, indem auf den TCR jener T-Zellen gezielt wird, die gegen den "Tumor-Marker" reagieren, anstatt auf den Tumor-Marker selbst. Somit kann eine Immunantwort, die auf den TCR auf einer tumorspezifischen T-Zelle gerichtet ist, dazu verwendet werden, die Antitumorantwort zum Vorteil des Wirtes zu regulieren.
In der Tat ist es verständlich, dass jede Krankheit, bei der eine Zelle mit einem Oberflächenmolekül beteiligt ist, das die Zelle von anderen Zellen desselben histologischen Typs und von allen Zellen mit einem anderen histologischen Typ unterscheidet, einen charakteristischen "Marker" enthält und für die Behandlung durch Zusammensetzungen empfindlich ist, die eine Immunantwort auf den "Marker" induzieren und dadurch die Aktivität der den "Marker" tragenden Zelle verändert.
Erfindungsgemäß kann das Marker-Molekül selbst verhältnismäßig nicht-immunogen sein, es muss nur mindestens ein charakteristisches Antigenepitop tragen. Dieses Epitop kann selbst inhärent immunogen sein oder es kann durch bekannte Behandlungsverfahren immunogen gemacht werden, beispielsweise durch Konjugierung mit einem immunogenen Trägermolekül. Somit ist ein Epitop eines Marker-Proteins, gleichgültig, ob es sich um ein freies Peptid handelt oder in einer Form, die es immunogen macht, in der Lage, eine Antikörperantwort, eine zellvermittelte Immunantwort oder beides hervorzurufen, wie dies erfindungsgemäß gemeint ist. Eine Zusammensetzung, der nicht das gesamte Marker-Protein inkorporiert ist, sondern besser eine spezifische Peptidregion, die immunogen oder antigen ist, stellt somit eine Präparation dar, die zur Behandlung einer immunbezogenen Krankheit, die durch diesen Marker charakterisiert wird.
Identifikation von Marker-TCR-tragenden T-Zellen
Die vorliegende Erfindung verwendet ein synthetisches Peptid, das wenigstens einen Teil des zweiten Komplementaritäts-bestimmenden Abschnitts des TCR darstellt, der bei der Liganden/MHC-Bindung biologische Bedeutung hat, und das für eine TCR V-Genfamilie charakteristisch ist. Die Erfindung schafft somit eine viel einfachere Lösung, um TCR V-Region-spezifische Antikörper oder T-Zellen zu erhalten. Indem andere Sequenzen aus derselben β-Kette verwendet werden, um ein Spektrum von TCR- V-Region-spezifischen Antikörpern oder T-Zellen zu induzieren, ist der Fachmann in der Lage, freiliegende Epitope des TCR zu kartieren und die Bedeutung dieser Regionen bei der Liganden/MHB-Bindung mit den normalen Routinen herauszufinden.
Marker-TCR, die mit einer gegebenen Krankheit assoziiert sind, werden unter Verwendung bekannter Techniken identifiziert. Eine genetische Lösung unter Verwendung von Patienten, die bekanntermaßen MG oder MS haben, ist von Oksenberg, J.R., et al., in Proc. Natl. Acad. Sci USA 86:988–992 (1989) beschrieben worden. Sequenzen der geeigneten TCR-β-Kette wurden durch genomische Analyse unter Verwendung von Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus erhalten, der in Familien gefunden wurde, die eine Disposition für die spezielle Autoimmunkrankheit haben, wie dies von Seboun, E., et al., in Cell 87:1095–1100 (1989) und Burns, F.R., et al., in J. Exp. Med. 169:27–39 (1989)) beschrieben wurde.
Es ist somit ersichtlich, dass für die Zwecke der vorliegenden Erfindung die Bestimmung des Marker-TCR, der mit der Autoimmunkrankheit assoziiert ist, und die Identifikation der Peptide, die eine immunogene Sequenz enthalten, nicht erforderlich ist, dass das Autoantigen charakterisiert wird. Es reicht aus, wenn (a) an der Autoimmunkrankheit T-Zell-vermittelte Immunantworten als wesentli cher Teil des pathogenen Prozesses beteiligt sind und (b) wenn die Krankheit ein Organ-Gewebe- oder zellspezifisches Ziel hat. Wie dies in der Mikrobiologie bekannt ist (siehe beispielsweise Theofilopoulos, A., a.a.O.), braucht an der Autoimmunkrankheit auf der induzierenden Stufe kein Autoantigen beteiligt zu sein, sondern es kann sich um eine Antwort auf ein exogenes Antigen handeln, beispielsweise ein bakterielles oder ein virales Antigen, das mit dem Eigenantigen cross-reaktiv ist oder das zu einer immunopathogenen Antwort führt, die gegen das exogene Antigen gerichtet ist, das sich in dem Wirt befindet.
T-Zellen, die ein Autoantigen oder ein Antigen erkennen, das mit einer Autoimmunkrankheit assoziiert ist (beispielsweise bestimmte virale oder bakterielle Antigene), werden geklont und mit einer immortalisierenden Zelle verschmolzen, beispielsweise einer Longterm-T-Zell-Linie, einer T-Zell-Lymphom-Linie oder einem T-Zell-Hybridom und sodann lässt man sie in Kultur wachsen. Die in Kultur gewachsenen Zellen dienen als Quelle für die cDNA, die für den geeigneten TCR codiert. Diese cDNA wird geklont und durch bekannte Verfahren exprimiert (siehe beispielsweise Maniatis, T., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1982)).
Zusätzlich zu den vorstehend erwähnten Lösungen wird klar, dass aus Tiermodellen Nutzen gezogen werden kann, um die Loci für die variable Region des TCR zu identifizieren, die mit der Autoimmunkrankheit assoziiert sind. Tiere, die für eine Anzahl von Autoimmunkrankheiten empfänglich sind, zu denen als nicht beschränkende Beispiele EAE-experimentelle MG, experimentelle Autoimmunthyroiditis, adjuvante Arthritis, Collagen-induzierte Arthritis u.dgl. gehören, haben einen variablen TCR-Locus, der mit der Krankheit assoziiert ist und in vitro identifiziert werden kann.
Unter dem Begriff "Diposition für eine Krankheit" soll ein Zustand verstanden werden, in dem das Tier ein Gen oder Gene besitzt, die bekanntermaßen mit der Krankheit assoziiert sind, wodurch das Risiko, dass das Individuum mit diesem Gen oder Genen die Krankheit entwickelt, erhöht ist, verglichen mit der Gesamtpopulation. Gene, die bekanntermaßen mit Autoimmunkrankheiten assoziiert sind, schließen die MHC-Gene (insbesondere Klasse II), Immunoglobulin V-Gene, TCR-V-Gene u.dgl. ein. Der Ausdruck "disponiert" soll außerdem jene Individuen mit umfassen, die tatsächlich erkrankt sind. Obwohl eine vollständige Korrelation zwischen einer Autoimmunkrankheit und der Verwendung eines speziellen TCR weder erwartet noch notwendig ist, um die Erfindung erfolgreich anwenden zu können, wurden hohe Korrelationen von etwa 60–70% für das Vorhandensein oder das Exprimieren eines speziellen Gens für eine variable Region und einer Disposition für die Autoimmunkrankheit bei Tieren herausgefunden.
Bei einem alternativen Ausführungsbeispiel der Erfindung wurden T-Zellen, die aus Menschen isoliert wurden, die für eine Autoimmunkrankheit disponiert sind und insbesondere disponierte Individuen, die an der Autoimmunkrankheit erkrankt sind, in Kultur expandiert. Techniken zur T-Zell-Expandierung sind bei Zamvil et al., Nature 317:358 (1985) und Nature 324:258–260 (1986) beschrieben.
Bei einem Ausführungsbeispiel, das dieses Verfahren verwendet, werden periphere Blutlymphozyten von Patienten entnommen und mit dem Autoantigen oder einem spezifischen Peptid stimuliert, das von diesem abgeleitet oder mit diesem verwandt ist und das zu einer Stimulation fähig ist, die der des Autoantigens vergleichbar ist. Das Auto antigen (oder das verwandte Peptid) wird für mehrere Tage den Lymphozytenkulturen zugegeben. Bei einem Ausführungsbeispiel werden die Zellen mit dem Autoantigen 5–6 Tage stimuliert. Bei anderen Ausführungsbeispielen werden die Zellen für eine längere Zeitspanne stimuliert. Die Zeit, die zur Stimulation erforderlich ist, ist eine Funktion des Anteils der reaktionsfähigen Zellen in der Blutprobe, im Aktivierungszustand dieser Zellen und der Potenz der Stimulierungszubereitung, wobei die Zeit durch den Fachmann leicht zu bestimmen ist. Nach der Kultivierung unter diesen selektiven Bedingungen werden 5 × 10⁵ lebensfähige Zellen isoliert und mit etwa 3 × 10⁷ autologen Antigen präsentierenden Zellen (die, um ihre Ausbreitung zu verhindern, mit etwa 2500–4500 rad bestrahlt sind) und etwa 20μg/ml des Autoantigens (oder des verwandten Peptids) erneut stimuliert. Etwa 7 Tage später werden lebensfähige Zellen gesammelt und durch limitierende Verdünnung in Anwesenheit von etwa 10³ – 10⁶ Antigen präsentierenden Zellen, beispielsweise etwa 5 × 10⁵ Antigen präsentierenden Zellen und menschlichen IL-2 oder rohem oder gereinigten Kombinationen von Lymphozytenwachstumsfaktoren (beispielsweise IL-4) geklont. Die Zellen dieser T-Zell-Linien werden in Gewebekulturflaschen etwa ein bis zwei Wochen expandiert und wachsen gelassen. Solche Linien können mit den Antigen präsentierenden Zellen, autoantigenen Zubereitungen und IL-2 mehrfach restimuliert werden. Die Restimulation kann typischerweise einmal pro Woche ausgeführt werden. Falls gewünscht, können diese T-Zellen durch eine Vielzahl von Verfahren geklont werden, beispielsweise Begrenzen der Verdünnung oder Heraussortieren von Zellen aus Kolonien, die auf weichem Agar wachsen, im Allgemeinen etwa 2 Tage nach der Restimulierung.
Bei einem anderen Ausführungsbeispiel werden Lymphozyten aus einem Organ oder Körperflüssigkeit zunächst in Anwesenheit von IL-2 kultiviert. Unter diesen Bedingungen tritt eine Selektion nach Zellen auf, die bereits aktiviert sind und nur solche Zellen werden wachsen. Anschließend werden diese T-Zellen mit den Antigen-präsentierenden Zellen und einer autoantigenen Zubereitung stimuliert. Unter Verwendung dieser Lösung können MBP-spezifische T-Zellen aus dem Rückenmark von Ratten, die an EAE erkrankt sind, selektiv in vitro expandiert werden.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung soll der Begriff "Autoantigene" nicht im Sinne einer Beschränkung auf ein definiertes oder bekanntes Makromolekül verstanden werden. Beispielsweise im Falle des Diabetes vom Typ I ist das spezielle Antigen, das mit der Pankreas-Inselzelle (oder β-Zelle) assoziiert ist und das als Auslöser oder Zielantigen für die T-Zell-vermittelte Autoimmunantwort dient, unbekannt. Im Sinne der Erfindung kann das Autoantigen, das dazu verwendet wird, in vitro die Zellen, wie oben beschrieben, zu stimulieren, von den vollen Pankreas-Inselzellen, rohen Membranpräparationen, die von diesen Zellen abgeleitet sind, teilweise gereinigten Membrankomponenten oder, falls identifiziert, dem diabetogenen Autoantigen gebildet sein. Dasselbe gilt für andere Autoimmunerkrankungen, bei denen das typische Autoantigen noch nicht identifiziert wurde, einschließlich Hashimoto's Thyroiditis, Arthritis, bei der das Autoantigen nicht Collagen ist, Sjogrens-Erkrankung, Polymyositis, Arteriosklerose u.dgl. Für den Fachmann ist klar, dass, solange wie der immunogene Teil, auf den die T-Zellen reagieren, in der stimulierenden Zubereitung enthalten ist, die erfindungsgemäßen Verfahren, wie beschrieben, ausgeführt werden können.
Das Vorhandensein der Autoantigen-spezifischen reaktionsfähigen T-Zellen in der geklonten, erweiterten T- Zell-Population kann leicht bestimmt werden, indem die Fähigkeiten der Zellen getestet wird, in Anwesenheit des Autoantigens aktiviert zu werden. Viele Tests sind verfügbar und bekannt, um frühe oder späte Ereignisse in dem T-Zell-Aktivierungsprozess zu messen. Zu den Beispielen für solche Verfahren gehören im nicht ausschließenden Sinne die T-Zell-Proliferation (die durch die Aufnahme von radiomarkiertem Thymidin gemessen werden kann), die Sezernierung von Interleukin-2, die intrazelluläre Calciummobilisierung, die Translokation von speziellen Membranenzymen, die an dem Inositolphosphatmetabolismus beteiligt sind, und Änderungen beim Exprimieren von Zelloberflächenmolekülen (die durch Strömungszytometrie bestimmt werden können).
Der TCR, der durch einen T-Zell-Klon, der auf ein spezielles Autoantigen reagiert, exprimiert wird, kann unter Verwendung von TCR-spezifischen Antikörpern identifiziert werden, die entweder polyklonal, monoklonal oder chimerisch sind (siehe unten) und die für ein variables TCR-Segment spezifisch sind, um die Exprimierung an der Oberfläche zu erkennen, indem Techniken wie Fluoreszenzmikroskopie, Strömungszytometrie, Immunozytochemistrie oder andere bekannte Techniken eingesetzt werden. Derartige Antikörper wurden für eine Vielzahl von TCR α-β-Ketten-V-Regionen beschrieben (siehe beispielsweise Owhashi, M., et al., a.a.O., Gascoigne, N.R.J., et al., a.a.O, Kappler, J.W., et al., 1987, 1988 (a.a.O.) oder MacDonald, H.R., a.a.O.).
Alternativ kann die DNA oder die mRNA von T-Zell-Klonen direkt untersucht werden oder nach Identifizierung durch die Polymerasekettenreaktion (Synha et al., Science 239:1026 (1988), Saiki et al., Nature 324:163 (1986), indem sie mit Nukleinsäuresonden für die unterschiedlichen TCR-Genfamilien unter Verwendung von bekannten Hybridisierungsverfahren spezifisch hybridisiert wird. Die TCR-Sequenz oder ein Teil davon kann sodann unmittelbar aus der amplifizierten, rearrangten DNA oder mRNA erhalten werden.
Das Exprimieren eines speziellen TCR kann außerdem identifiziert werden, indem die Nukleotidsäuresequenz, die für wenigstens einen Teil des TCR codiert, beispielsweise nach dem Klonen des TCR-V-Gens bestimmt wird, oder indem die Aminosäuresequenz wenigstens eines Teil des TCR-Proteins bestimmt wird. Es ist klar, dass die oben erwähnten Lösungen oder weitere Lösungen, die dem Fachmann bekannt sind, dazu führen, den TCR zu identifizieren, der auf einer T-Zelle oder einem Klon oder einer Linie von Z-Zellen exprimiert wird. Diese Information wird zur Selektion einer Aminosäuresequenz benötigt, die das erfindungsgemäße Peptid oder eine pharmazeutische Zubereitung enthält.
Wenn kein spezifisches Autoantigen identifiziert wurde, kann die Oligoklonität der T-Zellen in der anatomischen Region, die mit der Krankheit assoziiert ist, als Basis zum Anreichern der reaktionsfähigen T-Zellen verwendet werden. Beispielsweise Zellen, die typisch mit rheumatoider Arthritis assoziiert sind, fanden sich in dem Synovialfluid des Gelenks; Zellen, die typischerweise MS-assoziiert sind, wurden in der cerebrospinalen Flüssigkeit (CSF) aufgefunden; und Krankheits-assoziierte T-Zell-Infiltrate des Thyroidgewebes bei Hashimoto's Thyroiditis und bei der Graves' Krankheit. In diesen Fällen werden die Zellen aus dem relevanten anatomischen Bereich isoliert und, wie oben beschrieben, werden die Zellen in Kultur expandiert (siehe auch Londei, M. et al., in Science 228:85–89 (1985), Londei, M. et al., in Acta Endocrinol. 115 (suppl. 281):86–89 (1987), Stamenkovic, I. et al., in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:1179–1183 (1988), Lipoldova, M. et al., in J. Autoimmun. 2:1–13 (1989), Oksenberg, J.R., et al., a.a.O.). Die DNA oder mRNA dieser Zellen wird isoliert, die cDNA erzeugt und die Differenzen in den Sequenzen der cDNA, die für die variablen TCR-Loci codiert, durch Vergleich von erkrankten mit nicht erkrankten Individuen bestimmt. Als Alternative zum Expandieren der Zellen in Kultur kann zelluläre DNA oder vorzugsweise cDNA, die aus mRNA hergestellt ist, unmittelbar aus T-Zellen, die aus dem Individuum isoliert wurden, erhalten und die Nukleoitidsäure durch PCR-Reaktion, wie oben beschrieben, vermehrt werden.
Die Antigene, die mit einer Vielzahl von menschlichen Autoimmunkrankheiten oder Tiermodellen von Autoimmunkrankheiten assoziiert sind, sind gegenwärtig bekannt. Das Typ II-Collagen und das Wärmeschockprotein 65 kD von Mycobacterium Tuberculosis sind Antigene, die mit rheumatoider Arthritis assoziiert sind; AChR ist assoziiert mit MG und mit experimenteller allergener Myasthenia Gravis (EAMG), die in Mäusen induziert werden kann. Thyroglobulin ist bekanntermaßen das Antigen, das mit experimenteller allergener Thyroiditis (EAT) bei Mäusen assoziiert ist. Bei einer ähnlichen Erkrankung, Hashimoto's Thyroiditis, ist eine Immunreaktion auf ein Antigen auf follicularen Thyroidzellen beteiligt. Bei Graves' Erkrankung ist die Immunantwort auf den Thyrotropin-Rezeptor von Thyroidzellen gerichtet. Das Myelinbasisprotein (MBP) und das Proteolipidprotein (PLP) sind bekanntermaßen mit experimenteller allergener Encephalomyelitis (EAE) bei Mäusen und Ratten assoziiert. EAE ist ein anerkanntes Modell für multiple Sklerose bei Menschen.
Für den Fachmann ist es deshalb klar, dass die vor liegende Erfindung auf einen Aspekt bei der Identifikation von Peptiden zielt, die für die Prävention oder Therapie von menschlichen und tierischen Erkrankungen brauchbar sind, die die oben erwähnten einschließen, jedoch nicht auf diese beschränkt sind.
Auswahl der antigenen Peptide
Zu einem wichtigen Ausführungsbeispiel dieser Erfindung gehört eine kombinierte Methode zur Identifikation eines TCR, der mit einer Autoimmunkrankheit assoziiert ist, der Bestimmung, welche Oligopeptidsequenz einschließlich eines Teils des zweiten Komplementaritäts-bestimmenden Abschnitts des TCRs sowohl immunogen und für die T-Zell-Aktion in dem Erkrankungsprozess wichtig ist, der Synthetisierung dieses Peptids und der Verwendung desselben als therapeutischem Wirkstoff.
Regionen der relevanten TCR-Sequenzen werden zur Synthese auf der Basis ihrer vorhergesagten antigenen oder immunogenen Eigenschaften identifiziert. Unter dem Begriff "immunogen" soll hier die Fähigkeit des Peptids verstanden werden, eine Immunantwort zu induzieren, und zwar entweder eine zellvermittelte, eine Antikörper- oder beide. Der Begriff "antigen" soll die Fähigkeit eines Peptids bezeichnen, in freier Form durch Antikörper erkannt zu werden und in Verbindung mit MHC-Molekülen im Falle von antigenspezifischen T-Zellen. Regionen eines Proteins oder Peptids, die wahrscheinlich immunogen oder antigen für T-Zellen sind, werden beispielsweise unter Verwendung von Lösungen und Algorithmen identifiziert, wie sie von Margalit, H. et al. (J. Immunol. 138:2213–2229 (1987) und Rothbard, J.B. et al. (EMBO J. 7:93–100 (1988)) beschrieben. Die Margalit- et al.-Lösung basiert auf der Analyse der antigenen Stellen von immunodominanten T-Helfer-Zel len, was zur Entwicklung eines Algorithmus führt, der auf einem amphipathischen Helix-Model basiert, bei dem die antigenen Stellen vermutlich Schrauben sind mit einem überwiegend polaren und einem überwiegend apolaren Stirnende. Die Lösungen von Rothbard et al. erkennen Motive, die ähnlich den Epitopen sind, die bevorzugt von T-Helfer- oder T-zytotoxischen-Zellklonen erkannt werden, was die genauen Bereiche innerhalb der Proteinsequenz genau vorhersagen kann, die in der Lage sind, durch die MHC-Klasse I- und Klasse II-Moleküle erkannt zu werden, wobei diese Erkennung vermutlich für die T-Zell-Immunogenität und Antigenität notwendig ist.
Die Bereiche des TCR, die für die Zwecke der Erfindung hinsichtlich ihrer immunoregulatorischen Eigenschaft von Bedeutung sind, erfassen wenigstens einen Teil des zweiten Komplementaritäts-bestimmenden Abschnitts.
Die Verwendung der oben genannten Lösung zur Auswahl der Peptidsequenzen zur Verwendung bei der Behandlung von EAE bei Ratten zeigt beispielhaft den Erfolg dieser Lösung. Beispielsweise wurde durch den obigen Algorithmus vorhergesagt, dass ein Peptid mit 16 Aminosäuren entsprechend der CDR1 des Marker-TCR für EAE bei Lewis-Ratten das Vβ8 (25–41) – für die T-Zellen nicht immunogen ist. In der Tat induziert diese Peptide keine T-Zell-Immunität und schützen die Lewis-Ratten nicht gegen EAE. Das Peptid Vβ14 (25–41), das dem CDR1 einer anderen TCR-β-Kette entspricht, die nicht mit EAE assoziiert ist, war vorhergesagterweise für T-Zellen immunogen, und es stellte sich in der Tat heraus, dass es bei Lewis-Ratten eine T-Zell-Immunität hervorrufen konnte, jedoch, wie erwartet, nicht gegen EAE schützen konnte. In ähnlicher Weise wurde vorhergesagt, dass das CDR2-Peptid Vβ14 (39–59), das einem nicht mit EAE assoziierten TCR entspricht, immunogen ist, und die Immunität induzieren, jedoch wiederum nicht gegen EAE schützen konnte. Erfindungsgemäß wurde vorhergesagt, dass das CDR2 verwandte Peptid Vβ8(39–59) des relevanten TCR sowohl für EAE immunogen als auch schützend ist und in der Tat, erwies sich dies als richtig (siehe die untenstehenden Beispiele).
Die Größe des Peptids, die zur Verwendung in dieser Erfindung ausgewählt wird, wird weitgehend durch das Erfordernis der Immunogenität bestimmt, während die minimale Epitop-Struktur aufrecht erhalten bleibt, so dass eine T-Zelle oder ein Antikörper, der für das Peptid spezifisch ist, den TCR auf einer intakten T-Zelle erkennen und mit ihm reagieren kann. Beispielsweise bewegt sich die Größe der erfindungsgemäßen Peptide im Bereich von etwa 15–30 Aminosäuren, damit sie ausreichend immunogen sind und eine hohe Wahrscheinlichkeit aufweisen, die relevanten Epitope des TCR zu tragen, die zu einer Modulation der T-Zell-Aktivität führen kann, obwohl Peptid-Fragmente mit anderer Länge in Betracht gezogen werden. Die erfolgreiche Verwendung eines 21 Aminosäure-langen TCR-Peptids, das auf der TCR-β-Kette präsent ist, die mit EAE in Ratten assoziiert ist, um EAE in erfindungsgemäßen Verfahren zu behandeln, ist ausführlich in den nachfolgenden Beispielen demonstriert.
Die Immunogenität von Peptiden, die für die Erfindung brauchbar sind, kann nach wohlbekannten Verfahren gescreent werden, beispielsweise die Verwendung einer DH-Antwort in einem Tier. Für eine solche Antwort wird ein Tier durch Injektion einer geeigneten Dosis eines Antigens, typischerweise subkutan (s.c.), häufig mit einem Adjuvant, beispielsweise einem vollständigen Freund'schen Adjuvant (CFA), "sensibilisiert". 5–15 Tage später wird die Antwort "provoziert", indem das Tier typischerweise intradermal (i.d.) mit einer geeigneten Dosis des Antigens, typischerweise in physiologischer Salzlösung oder einem anderen Puffer, abgefragt wird. Die Antwort wird 24-48 Stunden später geprüft. Nicht beschränkende Beispiele für Testmethoden zum Messen des DH erfassen die Größe des Erythems (Rötung) und die Verhärtung (Schwellung) an der Stelle der Injektion des Antigens, die Schwellung des Ohrs, die Schwellung der Fußballen, die Schwellung des Schwanzes, die Akkumulation von systemisch injizierten ¹²⁵I-markierten Iododeoxyuridin an der Impfstelle, die Akkumulation von intravenös (i.v.) injiziertem Proteinserum, beispielsweise Albumin, an der Belastungsstelle und die Akkumulation von i.v. injizierten markierten und eine Entzündung hervorrufenden Zellen, wie Lymphozyten oder Neutrophilen an der Impfstelle. Nach einer i.d. Abfrage in der Ohrmuschel von ca. 0,15–0,25 mm, vorzugsweise etwa 0,2 mm (bei einer Lewis-Ratte) zeigt z.B. eine Antwort in Gestalt einer Ohrschwellung eine positive DH-Antwort an. Der Fachmann sieht, dass Veränderungen in der Peptidgröße, der Dosierung, dem Weg der Sensibilisierung oder der Abfrage von DH, dem verwendeten Carriers, des verwendeten Adjuvants etc. dem zeitlichen Verlauf und dem Ausmaß der DH-Antwort beeinflussen.
Bei einem Peptid, das angenommenermaßen immunogen ist, wie dies hier beabsichtigt ist, sollte eine Dosis von etwa 10–200μg pro Tier und vorzugsweise etwa 25–100μg Peptid pro Tier in der Lage sein, ein Tier für eine DH-Antwort zu sensibilisieren. Ferner ist bei einem sensibilisierten Tier eine Dosis von etwa 1–100μg, vorzugsweise etwa 5–50μg des Peptids in der Lage, bei der i.d. Abfrage eine DH-Antwort auszulösen.
Synthese von Peptiden und Versuch
Die gewünschten Peptide mit den Sequenzen, die, wie oben beschrieben, bestimmt sind, werden unter Verwendung von Standardsynthesetechniken präpariert einschließlich sequentieller Aminosäurekonjugation in der Lösung oder in der festen Phase und der Rekombinatenproduktion in prokariontischen oder eukariontischen Wirten. Die Verifikation, dass das zubereitete Peptid immunogen ist, kann leicht unter Verwendung einer DH-Reaktion in einem Tier (beispielsweise Maus oder Ratte), wie oben beschrieben, erfolgen. Das Peptid wird subkutan verabreicht und das Tier etwa 9–14 Tage später i.d. in der Ohrmuschel abgefragt. Nach dem Abrufen wird die Antwort in Gestalt der Ohrschwellung 24 oder 48 Stunden später gemessen und dient als einfaches und verlässliches Maß für das Vorliegen einer T-Zell-vermittelten Immunität gegen das Peptid.
Die Verifikation der Fähigkeit des immunogenen Peptids, um tatsächlich die Autoimmunität zu modulieren, kann dadurch erhalten werden, dass ein geeignetes Tiermodell verwendet wird, wobei die Speziesunterschiede in den TCR-verwandten Peptiden berücksichtigt werden. Obwohl z.B. es bevorzugt wird, eine Sequenz zu verwenden, die dem CDR2 eines menschlichen TCR-Markers bei der Behandlung von Menschen entspricht, wird bei der tierischen Erkrankung die entsprechende Region des TCR-Markers für die Tiermodellkrankheit verwendet.
Tiermodellsysteme, die zum Screenen der Wirksamkeit der Peptide beim Schutz gegen oder der Behandlung der Krankheit verwendet werden können, sind, wie oben diskutiert, verfügbar. Natürlich können die identischen Peptide bei Menschen nicht wirksam sein, da sie nicht mit einer geeigneten Stelle auf dem Krankheit assoziierten menschlichen TCR korrespondieren oder sie können bei Menschen nicht ausreichend immunogen wirken. Es ist klar, dass Modifikationen der Peptidsequenz, die für ein spezielles Tiermodell abgeleitet ist, erforderlich sind, um andere Individuen, die zu anderen Spezien gehören, einschließlich den Menschen zu behandeln. Die Verifikation, dass z.B. eine spezielle CDR2 assoziierte Peptidsequenz beim Schutz gegen eine spezielle Krankheit wirksam ist, kann somit mit Hilfe dieser Modelle erhalten werden, die zu Vorhersagen führen, dass die entsprechende Humansequenz ein bevorzugter Kandidat als wirksames therapeutisches Peptid für Menschen darstellt. Die Bestimmung der entsprechenden TCR-Sequenz bei Menschen (oder anderen nichtmenschlichen Spezien) unter Verwendung der oben beschriebenen Lösungsansätze gestattet somit die Modifikation des Peptids zur Verwendung beim Menschen (oder anderen Spezies).
Nachstehend ist eine nicht abschließende Liste von Tierkrankheitsmodellen für menschliche Autoimmunkrankheiten angegeben, bei denen ein TCR-Peptid hinsichtlich seiner Fähigkeit eingeschätzt werden kann, die Krankheit zu modifizieren und Antikörper sowie T-Zellen zu induzieren, die in der Lage sind, bei der Übertragung die Krankheit zu modifizieren. Systemischer erythematoser Lupus (SLE) wird in dafür empfindlichen Mäusen getestet, wie dies von Knight et al., in J. Exp. Med. 147:1653 (1978) und Reinertsen et al., in N. Eng.J. Med. 229:515 (1978) beschrieben ist. MG wird in SJL/J-Mäuseweibchen getestet, indem die Krankheit mit einem löslichen AChR-Protein von anderen Spezies induziert wird, wie dies von Lindstrom, J., et al., in Adv. Immunol. 42:233–284 (1988) beschrieben ist. Arthritis wird in einem dafür empfindlichen Mäusestamm durch Injektion des Typ II-Collagens induziert, wie dies von Stuart, J.M., et al., in Ann. Rev. Immunol. 2:199–218 (1984) beschrieben ist. Adjuvante Arthritis wird durch Injektion des mikrobakteriellen Wärmeschockproteins in dafür empfindlichen Ratten induziert, wie dies Van Eden, W., et al., in Nature 331:171–173 (1988) beschrieben hat. Thyroiditis wird durch Verabreichung von Thyroglubolin in Mäusen induziert, was Maron, R., et al., in J. Exp. Med. 152:1115–1120 (1980) beschrieben hat. Insulinabhängiger Diabetes mellitus (IDDM) tritt natürlich auf oder kann in bestimmten Mäusestämmen, wie in jenen, die durch Kanasawa et al., in Diabetologia 27:113 (1984) beschrieben sind, induziert werden. Andere Mäusestämme können veranlasst werden, diese Krankheit zu zeigen, indem Lymphozyten von diesem Stamm übertragen werden.
EAE in Mäusen und Ratten dient als Modell für MS bei Menschen. In diesem Modell wird die demyelinierende Krankheit durch Verabreichung des Myelinbasisproteins (MBP) oder des Proteolipidproteins (PLP) oder den Theilers Virus induziert, wie dies durch Paterson, P.Y. in Textbook of Immunopatholpgy (Mischer et al., eds.), Grunde und Stratton Stratton, New York, pp. 179–213 (1986), McFarlin, D.E., et al., in Science 179:478–480 (1973) und Satoh, J., et al., in J.. Immunol. 138:179–184 (1987) beschrieben ist.
Zum Messen der präventiven, suppressiven und therapeutischen Wirkung der erfindungsgemäßen Zusammenstellung beim Menschen werden bestimmte klinische Messergebnisse verwendet. Beispielsweise gehören bei MS zu den quantitativen Parametern: (a) die klinische Störung, (b) die Untersuchung der Geschwindigkeit, mit der die Verschlimmerung eintritt und (c) die Plaquebelastung des Gehirns mittels Kernspinresonanzdarstellung (MRI) (wobei die Belastung ein wesentlicher neuer Parameter ist, der zur Bewertung von MS-Patienten verwendet wird). Zu diesen Messungen gehören auch getrennte Blind- und Nichtblinduntersuchungen durch den behandelnden Arzt. Neurophysiologische Messungen der kognitiven Störung werden als eine unabhängige Bestimmungsgröße für die Beeinträchtigung verwendet. Die klinische Beeinträchtigung wird üblicherweise nach der McAlpine-Skala, dem Kurtzke-Punktesystem oder einer Modifikation des Kurtzke-Punktesystems, dem Expanded Disability Status Score (EDSS), bewertet. Eine Verbesserung von einer halben Einheit in dem EDSS (Bereich von 1–9) wird als signifikant angesehen. Ein klinischer Wert, nämlich die Fähigkeit des Patienten zu gehen, wird durch den Ambulationindex bewertet, wobei eine Verbesserung um eine oder mehr Einheiten als signifikant angesehen wird. Diese klinischen Messwerte sind in der Medizin hinreichend bekannt und im Einzelnen von Mc Alpine, D., et al., in Multiple Sclerosis, Livingston Press, Edinburgh (1955), Binken, P.J. et al., in Handbook of Clinical Neurology, Volume 9, Amsterdam-North Holland Publishers, Amsterdam (1970) und Field, E.J. et al., in Multiple Sclerosis: A. Critical Review, M.M.T. P Press, Ltd., Lancaster, England, (1977) beschrieben.
Das Maß der Verbesserung bei RA z.B. basiert auf einer Anzahl von primären klinischen Eckwerten einschließlich der Auflösung und Verminderung von Schwellungen, der Verminderung der Dauer der morgendlichen Steifheit, der Abnahme der Erythrozytensedimentationsrate und/oder des C-reaktionsfähigen Proteins, der Auflösung von rheumatoid-assoziierten Zuständen, wie rheumatoiden Knoten und einer Verminderung der Lymphozytenzahl. Zu den sekundären Eckwerten gehört eine Verminderung der Müdigkeit und eine Verbesserung der Gesamtkondition, wie sie durch den Patienten und den Arzt festgestellt wird. Die klinischen Ergebnisse werden wie folgt aufgeteilt: (a) vollständige Antwort – die Abnahme der Gelenkschwellung, die Schwächung und die morgendliche Steifheit haben um mehr als 90% abgenommen; (b) bemerkenswerte Antwort – die Schwellung der Gelenke, die Schwachheit und die morgendliche Steifheit haben um 50–90% abgenommen; (c) mäßige Reaktion – die Gelenkschwellung, die Schwachheit und die morgendliche Steifheit haben um 30–50% abgenommen und (d) keine Reaktion – die Gelenkschwellung, die Schwachheit und die morgendliche Steifheit haben um weniger als 30% abgenommen.
Ähnliche Messungen, die eine Evaluierung der präventiven, suppressiven und Behandlungswirkungen der Peptide, Antikörper und T-Zellen und anderer Zusammensetzungen gemäß der Erfindung bei weiteren immunbezogenen Krankheiten gestatten, sind dem Fachmann bekannt.
Passive Immunität
Zusätzlich zu der Verwendung eines TCR-Peptids zur aktiven Immunisierung gehören zu weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsbeispielen Antikörper, die für das TCR-Peptid spezifisch sind, um eine Anti-TCR-Immunität passiv zu übertragen. Passive Antikörper vermittelte Immunität involviert einen der Vielzahl der Effektormechanismen, so z.B. antikörperabhängig zelluläre Cytotoxizität oder komplementabhängige Cytotoxizität. Alternativ kann der ver wendete Antikörper einen toxischen Wirkstoff in einer spezifischen Weise, beispielsweise eine Ricin-A-Kette übermitteln.
Zur passiven Schutzimpfung wird einem betroffenen Tier ein geeignetes Peptid, wie unten beschrieben, injiziert und die peripheren Blutlymphozyten oder Lymphozyten aus anderen Organen, beispielsweise aus einem Lymphknoten, werden geerntet. Die B-Zellen können aus der ursprünglichen Zellpopulation herausgesucht werden, die aus dem TCR-Peptid-immunisierten Tier entnommen wurden und durch Fusion mit T-Zell-Linienfusionspartnern immortalisiert werden, wobei Standardtechniken zum Herstellen der Hybri dome zur Produktion von monoklonalen Antikörpern verwendet werden, die für das TCR-Peptid spezifisch sind. Hybridome, die geeignete Antikörper produzieren, werden durch gebräuchliche Immunoessays, beispielsweise dem direkten ELISA-Essay, hinsichtlich ihrer Reaktionsfähigkeit mit dem TCR-Peptid-Antigen oder mit den relevanten T-Zellen gescreent.
Monoklonale Antikörper (mAb) gegen spezielle Antigene, beispielsweise TCR-Peptide gemäß der Erfindung, können durch für den Fachmann bekannte Verfahren gewonnen werden. Sie z.B. Kohler und Milstein in Nature 256:495–497 (1975) und das US-Patent 4 376 110. Diese Antikörper können zu einer der Immunglobulinklassen einschließlich der Klasse der IgG, der IgM, der IgE, der IgA, der IgD und beliebigen Unterklassen gehören. Alternativ können die Antikörper aus polyklonalen Antiseren hergestellt werden, die aus Tieren entnommen werden, die mit dem TCR-Peptid immunisiert und die verschiedenen bekannten Reinigungsschemata unterzogen sind und direkt zur passiven Übertragung der Anti-TCR-Immunität verwendet werden.
Monoklonale Antikörper mit Nagetierursprung werden "humanisiert", indem ein cDNA-Molekül, das für die V-Region des mAb codiert, an eine DNA gekoppelt wird, die für die konstante humane Region codiert, wobei eine der vielen Lösungen verwendet werden kann, wie sie von Cabilly et al., in dem US-Patent 4 816 567 (3/28/89) und der europäischen Patent-Veröffentlichung EP-125 023 /11/14/84), Taniguchi et al., in der europäischen Patent-Veröffentlichung EP-171 496 (2/19/86), Morrison et al., in der europäischen Patent-Veröffentlichung EP 173 494 (3/5/86), Neuberger et al., in der PCT-Veröffentlichung WO 86 01 533 (3/13/86), Kudo et al., in der europäischen Patentveröffentlichung EP-184 187 (6/11/86), Robinson et al., der PCT-Veröffentlichung WO 87 02 671 (5/7/87), Cabilly et al., in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3273–3277 (1984), MOrrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851–6855 (1984), Boulianne et al., Nature 312:643–646 (1984), Morrison, Science, 229:1202–1207 (1985), Neuberger et al., Nature 314:268–270 (1985), Takeda et al., Nature 314:452-454 (1985), Tan et al., J. Immunol. 135:3564–3567 (1985), Jones et al., Nature 321:522–525 (1986), Oi et al., Bio-Techniques 4:214 (1986), Sahagan et al., J. Immunol. 137:1066–1074 (1986), Sun et al., Hybridoma 5 (Supp. 1):S17–S19 (1986), Sun et al., proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214–218 (1987), Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439–3443 (1987), Liu et al., J. Immunol. 139:3521–3526 (1987), Better, M., et al., Science 240:1041–1043 (20. May 1988) und Horwitz, A. H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8676–8682 (1988)) beschrieben sind.
Das bevorzugte Verfahren zur Herstellung chimerer Antikörper kombiniert fünf Elemente: (1) Isolation der Messenger RNA (mRNA) aus einer B-Zell-Hybridomlinie von Mäusen, die den monoklonalen Antikörper produziert, Klonen und Produzieren der cDNA hieraus; (2) Herstellung einer cDNA-Bibliothek für die volle Länge aus der gereinigten mRNA, aus der die geeigneten Gensegmente für die variable (V-)Region in den Genen für die leichte (L) und die schwere (H)-Kette (i) durch geeignete Sonden identifizieret werden können, (ii) sequenziert werden können und (iii) mit einem Gensegment für die konstante C-Region kompatibel gemacht werden können, (3) Herstellung der Gensegmentmodule der C-Region durch Herstellung einer cDNA und Klonen; (4) Konstruktion der kompletten H- oder L-Ketten-Codierungssequenzen durch Verbinden der geklonten Gensegmente, die für die Immunoglobulin-V-Region spezifisch ist, wie in (2) oben beschrieben, an geklonte Gensegmentmodule der menschlichen C-Region, wie unter (3) beschrieben; und (5) Expremieren und Produzieren von chimeren L- und H-Ketten in ausgewählten Wirten, zu denen prokariontische und eukariontische Zellen gehören.
Zum Exprimieren der geklonten Gene für die H- und L-Ketten von Säugetierzellen sind viele Vektorsysteme verfügbar (siehe Glover, D.M. ed., DNA Cloning, Vol. II, pp 143–238, IRL Press, 1985). Andere Lösungen können nachgearbeitet werden, um komplette H₂L₂-Antikörper zu erhalten. Es ist möglich, in derselben Zelle H- und L-Ketten zu koexprimieren, um eine intrazelluläre Assoziation und Kopplung der H- und L-Ketten zu vollständigen tetramären H₂L₂-Antikörpern zu erreichen. Das koexprimieren kann unter Verwendung entweder derselben oder unterschiedlicher Plasmide in demselben Wirt erfolgen. Gene sowohl für die H- als auch für die L-Ketten können in demselben Plasmid plaziert werden, das dann in die Zellen transfiziert wird, wodurch unmittelbar nach Zellen selektiert wird, die beide Ketten exprimieren können. Alternativ können Zellen zunächst mit einem Plasmid, das für eine Kette codiert, beispielsweise die L-Kette, transfiziert werden und anschließend kann die resultierende Zell-Linie mit einem H-Ketten-Plasmid transfiziert werden, das einen zweiten auswählbaren Marker enthält. Zell-Linien, die die H₂L₂-Moleküle über eine der Routen reproduzieren, können mit Plasmiden transfiziert werden, die für zusätzliche Kopien der H-, L- oder H- plus L-Ketten codieren, in Verbindung mit zusätzlichen auswählbaren Markern, um Zell-Linien mit verbesserten Eigenschaften zu generieren, beispielsweise einer größeren Produktion von assemblierten H₂L₂-Antikörpermolekülen oder einer verbesserten Stabilität der transfizierten Zell-Linien.
Die chimeren Antikörper gemäß der Erfindung tragen sowohl die TCR-Erkennungsspezifität des Mäuse-mAb als auch die biologischen Eigenschaften der menschlichen Antikörper, zu denen die Widerstandsfähigkeit gegen Beseitigung im Menschen und eine weit geringere Immunogenizität gehören (was die Behandlungen gestattet).
Die Anti-TCR-Peptidantikörper (polyklonal, monoklonal und chimerisch) gemäß der Erfindung können therapeutisch als Immunokonjugate verwendet werden (siehe Überblick von: Dillman, R.O., in Ann. Int. Med. 111:592–603 (1989)). Sie können an zytotoxische Proteine angekoppelt werden, zu denen inhibierende Ribosom-Proteine wie Ricin-A, Pseudomonas Toxin und Diphteria Toxin sowie andere Proteine als Tumornekrosefaktor gehören. Mit Antikörpern oder anderen Liganden konjugierte Toxine sind bekannt (siehe z.B. Olsnes, S. et al., Immunol. Today 10:291–295 (1989)). Ein zusätzliches Beispiel für solch einen konjugierten Antikörper ist der XomaZyme^R–CD5 Plus, der ein Anti-CD5 mAb ist, der mit einer Ricin-A-Kette konjugiert ist. Diese Zubereitung ist bei der Prophylaxe und Therapie von Graftversus-Host-Krankheit oder der refraktorischen rheumatoiden Arthritis beim Menschen wirksam. Dieser spezielle, toxinkonjugierte Antikörper ist für die meisten T-Lymphozyten und einen Subset von B-Lymphozyten spezifisch. Zellen, die den CD5-Marker tragen, fallen in Abhängigkeit von der Behandlung sehr schnell ab. Da der Antikörper gegen ein TCR-Peptid mit einem viel kleineren Anteil sämtlicher Lmphozyten reagiert, wird von den Patienten eine höhere Dosis des Anti-TCR-Antikörpers, der mit Ricin-A konjugiert ist, toleriert oder umgekehrt, es ist bereits eine geringere Dosis wirksam. Effektive Dosen des mit Ricin-A konjugierten monoklonalen Antikörpers gegen das TCR-Peptid, liegen im Bereich von etwa 0,005 bis 0,5 mg/kg/Tag, wobei die bevorzugte Dosis im Bereich zwischen etwa 0,05 bis 0,2 mg/kg/Tag liegt.
Der erfindungsgemäße Anti-TCR-Peptid-Antikörper kann mit weiteren Typen therapeutischer Komponenten konjugiert werden, zu denen als nichtbeschränkende Aufzählung Radionuklide und zytotoxische Medikamente gehören, um Individuen mit Autoimmunkrankheiten oder bösartigen Krankheiten oder lymphoproliferativen Krankheiten zu behandeln. Nichtbeschränkende Beispiele für Radionuklide, die an die Antikörper gekoppelt werden und in vivo an die Antigenstellen befördert werden können, sind ²¹²Bi, ¹³¹I, ¹⁸⁶Re und ⁹⁰Y. Diese Radionukleide erbringen ihre zytotoxische Wirkung, indem die Zellen lokal bestrahlt werden, was zu verschiedenen intrazellulären Beschädigungen führt, wie dies auf dem Gebiet der Radiotherapie hinlänglich bekannt ist.
Zytotoxische Medikamente, die mit den Antikörpern konjugiert werden und anschließend zur in vivo-Therapie verwendet werden können, sind ohne Anspruch auf Vollständigkeit Daunorubicin, Doxorubicin, Methotrexat und Mitomycin C. Zytotoxische Medikamente stören kritische zelluläre Prozesse einschließlich der DNA, RNA und Proteinsynthese. Hinsichtlich einer vollständigeren Darstellung dieser Klassen von Medikamenten, die in der Medizin bekannt sind und ihrer Mechanismen siehe Goodman, A.G., et al., in Goodman and Gilman's The Pharmocological Basis of Therapeutics, 7. Ed., MacMillan Publishing Co., (1985).
Die Behandlung eines Individuums unter Verwendung der erfindungsgemäßen Antikörper, Fragmente oder Derivate sieht die parenterale Verabreichung einer einzigen oder mehrerer Dosen des Antikörpers, der Fragmente oder der Derivate hiervon vor. Die effektive Dosis ist eine Funktion des individuellen Antikörpers, des Vorhandenseins und der Natur eines damit konjugierten therapeutischen Wirkstoffes, des Individuums und seines klinischen Zustands und kann zwischen etwa 10 mg/kg Körpergewicht bis etwa 100 mg/kg Körpergewicht variieren. Die Verabreichung kann i.v., SC, intramuskulär, intrapulmonar, intraperitoneal (i.p.), intranasal, intrathecal, intradermal, transdermal oder auf andere Wege erfolgen.
Formulierung der Peptide
Die präklinische und klinische therapeutische Verwendung der Erfindung bei der Behandlung von Krankheiten oder Störungen wird am besten durch den Fachmann durchgeführt, wobei die akzeptierten Prinzipien der Diagnose und Behandlungen eingesetzt werden. Diese Prinzipien sind bekannt und beispielsweise von Braunwald, E. et al., eds., in Harrison's Principles of Internal Medicine, 11. Ed., McGraw Hill, Verleger, New Nork, N.Y. (1987) dargelegt.
Die erfindungsgemäßen Peptide und Zusammensetzungen bzw. ihre funktionalen Derivate sind zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen gut geeignet. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können jedem Tier verabreicht werden, das in den Genuss der vorteilhaften Wirkungen der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen kommen soll. Diese Tiere sind in erster Linie die Menschen, obwohl die Erfindung nicht hierauf beschränkt sein soll.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammenstellungen können durch jedes Mittel, mit dem der beabsichtigte Zweck erreicht wird, verabreicht werden. Beispielsweise kann die Darreichung parenteral, subkutan, intravenös, intradermal, intramuskulär, intraperitoneal, transdermal oder über Schleimhautwege erfolgen. Alternativ oder konkurrierend kann die Verabreichung über orale Wege erfol gen. Die Peptide und pharmazeutischen Zusammensetzungen können parenteral durch Bolusinjektion oder zeitlich gestreckte, allmähliche Perfusion verabreicht werden.
Die verabreichte Dosierung hängt von dem Alter, dem Geschlecht, der Gesundheit und dem Gewicht des Empfängers, der Art der konkurrierenden Behandlung und, falls geschehen, der Häufigkeit der Behandlung sowie der Natur der gewünschten Wirkung ab.
Die Dosierungsbereiche bei der Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sind groß genug, um den gewünschten Effekt hervorzurufen, durch den beispielsweise eine Immunantwort auf das Peptid, gemessen als DH- oder Antikörperproduktion erreicht wird, und um die immunbezogene Krankheit deutlich zu verhindern, zu unterdrücken oder zu behandeln. Die Dosis sollte nicht so groß sein, dass ungünstige Nebeneffekte, wie unerwünschte Crossreaktionen oder eine allgemeine Immunosuppression oder anaphylaktische Reaktionen u.dgl. auftreten.
Bevorzugte Dosen bei Menschen rangieren etwa zwischen 0,001 – 25 mg/kg Körpergewicht.
Zusätzlich zu den erfindungsgemäßen Peptiden, die selbst bereits pharmakologisch wirksam sind, können pharmazeutische Zusammensetzungen geeignete pharmazeutisch verträgliche Carrier enthalten, zu denen Exzipienten und Hilfsstoffe gehören, die das Prozessieren der aktiven Verbindungen in Zubereitungen, die pharmazeutisch verwendet werden können, erleichtern. Zu den bevorzugten Zusammensetzungen gehören der Einschluss eines Adjuvants, beispielsweise Alums, oder anderer bekannter Adjuvantien (siehe z.B. Warren, H.S. et al., Ann. Rev. Immunol. 4:369-388 (1986), Chedid, L., Feder. Proc. 45:2531–2560 (1986)).
Um das Abliefern oder die Bioaktivität zu verbessern, können die Peptide unter Verwendung von bekannten Verfahren und Verbindungen in Liposomen inkorporiert sein.
Zubereitungen, die oral in Form von Tabletten oder Kapseln verabreicht werden können, Zubereitungen, die rektal, beispielsweise als Suppositoren verabreicht werden können und Zubereitungen in Form von Lösungen zum Injizieren oder zur oralen Zufuhr enthalten zwischen etwa 0,001 bis etwa 99 Prozent, vorzugsweise von etwa 0,01 bis etwa 95 Prozent der aktiven Verbindung(en) zusammen mit dem Exzipienten.
Geeignete Exzipienten sind insbesondere Füller, wie Saccharide, beispielsweise Lactose oder Sucrose, Mannitol oder Sorbitol, Zellulosezubereitungen und/oder Kalziumphosphate, z.B. Trikalziumphosphat oder Kalziumhydrogenphosphat, ebenso wie Binder, wie Stärke, Paste, z.B. Maisstärke, Weizenstärke, Reisstärke, Kartoffelstärke, Gelatine, Tragacanth, Methylzellulose, Hydroxypropylmethylzellulose, Natriumcarboxymethylzellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon.
Andere pharmazeutische Zubereitungen, die oral verwendet werden können, sind "Push-Fit"-Kapseln aus Gelatine sowie weiche verschlossene Kapseln aus Gelatine und einem Plastifizierer, wie Glyzerol oder Sorbitol. Die "Push-Fit"-Kapseln können die aktiven Zusammensetzungen in Form von Granulat, das mit Füllern wie Lactose, Bindern wie Stärke und/oder Schmiermittel gemischt sind, wie Talkum oder Magnesiumstearat und, optional, Stabilisierern gemischt sein können, enthalten. In Weichkapseln sind die aktiven Verbindungen vorzugsweise in geeigneten Flüssigkeiten, wie fettigen Ölen oder flüssigem Paraffin, gelöst oder suspendiert. Zusätzlich können Stabilisierer hin zugegeben sein.
Zu den möglichen pharmazeutischen Zubereitungen, die rektal verwendet werden können, gehören z.B. Suppositorien, die aus einer Kombination aus einer oder mehreren der aktiven Verbindungen mit einer Suppositorienbasis bestehen. Geeignete Suppositoriengrundstoffe sind beispielsweise natürliche oder synthetische Triglyceride oder Paraffinhydrokarbone. Zusätzlich ist es ferner möglich, Gelatine-Rektalkapseln zu verwenden, die aus einer Kombination der aktiven Wirkstoffe mit einem Grundstoff bestehen. Zu den möglichen Grundstoffmaterialien gehören z.B. flüssige Triglyceride, Polyethylenglykole oder Paraffinhydrokarbone.
Geeignete Formulierungen zur parenteralen Verabreichung sind wässrige Lösungen der Peptide in wasserlöslicher Form, beispielsweise wasserlöslichen Salzen. Zusätzlich können Suspensionen der Peptide als geeignete ölige Suspensionsinjektionen verabreicht werden. Geeignete lipophile Lösungsmittel oder Vehikel sind fettige Öle, beispielsweise Sesamöl oder synthetische Fettsäurester, beispielsweise Ethyloleat oder Triglyceride. Wässrige Injektionssuspensionen können Substanzen enthalten, die die Viskosität der Suspension erhöhen und sind beispielsweise Natriumkarboxylmethylzellulose, Sorbitol und/oder Dextran. Optional können die Suspensionen auch noch Stabilisierer enthalten.
Die Peptide werden unter Verwendung konventioneller pharmazeutisch verträglicher parenteraler Vehikel zur Verabreichung mittels Injektion formuliert. Diese Vehikel sind nicht toxisch und therapeutisch und eine Reihe von Formulierungen ist in Remington's Pharmaceutical Sciences, (a.a.O.) geoffenbart. Nichtbeschränkende Beispiele für Exzipienten sind Wasser, physiologische Kochsalzlösung, Ringer's-Lösung, Dextroselösung und Hank's balancierte Salzlösung. Erfindungsgemäße Formulierungen können außerdem geringe Anteile von Additiven, wie Substanzen enthalten, die die Isotonizität, den physiologischen pH-Wert und die Stabilität aufrechterhalten.
Die erfindungsgemäßen Peptide liegen vorzugsweise in gereinigter Form vor, die im Wesentlichen frei von Aggregaten oder anderem Proteinmaterial ist, vorzugsweise bei einer Konzentration von etwa 1,0 ng/ml bis zu 100 mg/ml.
Wirksame Dosen des erfindungsgemäßen Peptids zur Verwendung bei der Prävention, der Unterdrückung oder der Behandlung von immunbezogenen Krankheiten liegen in dem Bereich von etwa 1 ng bis 100 mg/kg/ Körpergewicht. Ein bevorzugter Dosierungsbereich liegt zwischen 10 ng und 10 mg/kg. Ein speziell bevorzugter Dosisbereich liegt zwischen 100 ng und 1 mg/kg.
Die Immunogenizität des Peptids kann erhöht werden, indem es in einem längeren Peptid oder einer Kette enthalten ist oder indem es mit einem "immunologischen" Carrier, beispielsweise KLH, Albuminserum, Tetanustoxid u.dgl. unter Verwendung von Standardverbindungstechniken konjugiert wird. Eine Vielzahl dieser Verfahren ist aus dem Stand der Technik bekannt, beispielsweise die Verwendung von kondensierenden Wirkstoffen, wie Dicyclohexylcarbodiimid oder der Verwendung von Linkern, wie jene, die von Pierce Chemical Co., Rockford, IL. gewerblich zu beziehen sind.
Die Dosen für die TCR-Peptidspezifischen Antikörper variieren als Funktion des Speziesursprungs für den Anti körper, im Isotyp, der Affinität, seiner Natur (polyklonal, monoklonal, chimerisch) und anderer Eigenschaften, wie dies dem Fachmann bekannt ist. Beispielsweise wird ein monoklonaler Antikörper gegen ein TCR-Peptid mit einer Dosis zwischen 0,01 – 50 mg/kg verabreicht.
Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung ohne sie zu beschränken.
Beispiel 1
Zusammensetzungen von Peptiden, die zur Behandlung von EAE, als Modell von MS, verwendbar sind
Einführung
EAE stellt ein anerkanntes Rattenmodell für die menschliche Autoimmunkrankheit Multiple Sklerose dar. Demgemäß wurde die Brauchbarkeit der vorliegenden Erfindung nachgewiesen, indem gezeigt wurde, dass die Verabreichung des Peptids, das das geeignete CDR2-Peptid des TCR repräsentiert, der bei Ratten ein TCR-Marker für EAE darstellt, in diesen Tieren EAE verhindert. Bei diesem Modell wird die Krankheit durch Injizieren einer encephalitogenen Form des Myelinbasisproteins, beispielsweise des Basisproteins vom Guineaschwein (GPBP) oder eines synthetischen Peptids, das mit den Bausteinen 72–89 von GPBP (GPBP(72–89)) korrespondiert, in der jeweilige Ratte induziert. Die Injektion eines dieser Peptide in einem vollständigen Freund'schen Adjuvant (CFA) induziert encephalitogene T-Zell-Klone, die vorzugsweise die Rattenhomologe der Mäuse TCR Vag und Vβ8 Gene verwenden (Chou, Y.K., et al., J. Neurosci. Res. 22:181–187 (1989), Burns, F.R., et al., J.Exp. Med. 169:27–39 (1989)).
Die Erfinder berichteten über die vollständige Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz für die rearrangten TCR α- und β-Kettengene (mit der Sequenzhomologie zu den Mäuse-Vα2 bzw. Vβ8-Familien), die in Abhängigkeit von dem encephalitogenen Hauptepitop des Basisproteins, GPBP(72–89) (Burns, F.R., et al., a.a.O.) verwendet wurden. Innerhalb der TCR Vβ8-Region wurde eine 21-Aminosäure-lange Sequenz identifiziert und synthetisiert, die den zweiten Komplementaritäts-bestimmenden Abschnitt (CDR2) enthält, und es wurde vorhergesagt, dass diese für T-Zellen immunogen ist (basierend auf dem Algorithmus von Margalit et al. und Rothbard et al. (a.a.O.).
Das Peptid hat die Sequenz: Asp-Met-Gly-His-Gly-Leu-Arg-Leu-Ile-His-Tyr-Ser-Tyr-Asp-Val-Asn-Ser-Thr-Glu-Lys-Gly und endet mit "TCR Vβ8(39–59)".
Aus der entsprechenden Region einer anderen TCR Vβ-Sequenz wurde ein Kontrollpeptid synthetisiert, das zu der Vβl4-Familie von Mäusen (William et al., a.a.O.) homolog war.
Spezifische Immunität gegen das TCR-Peptid
Durch subkutane (s.c.) Injektion von 400 μg TCR-Peptid in CFA (100μg Mycobacterium/Ratte) wurden vier Ratten immunisiert und 30 Tage danach wurden die Peptidspezifischen Immunantworten gemessen.
Um die Antikörper, die für das TCR Vβ8(39–59) Peptid spezifisch sind, wurde Serum aus den immunisierten Ratten durch Direkt-ELISA getestet. Das TCR-Peptid wurde auf Kunststoffmikroplatten aufgeschichtet (25 ng TCR-Peptid/Tüpfel). Es wurden Serumverdünnungen zugegeben und die Platten 2 Stunden lang inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Peroxidase-konjugierten Antikörpern, die für Ig-, H- und L-Ketten spezifisch sind, entwickelt. Ein chromogenes Substrat für Peroxidase wurde zugegeben und es wurde die Absorption der farbigen Reaktionsprodukte bei 405 nm (A₄₀₅) unter Verwendung eine colorimetrischen Platereaders gemessen.
Eine 1:200 Verdünnung des Immunserums führt zu einer Absorption von 0,63 ± 0,12 Einheiten. Kontrollseren aus Ratten, die mit dem Kontrollpeptid immunisiert waren (aus der entsprechenden CDR2-Region einer nichtverwandten TCR-Kette Vβ14 abgeleitet), führte zu einer Reaktion von nur 0,02 ± 0,01 Einheiten. Somit wurde eine spezifische Antikörperreaktion auf das TCR-Peptid erhalten.
Zusätzlich zeigten die Ratten eine spezifische T-Zell-Antwort in vivo, gemessen als verzögerte Hypersensitivitätsreaktion (DH) gegen die intradermale Abfrage (i.d.) mit dem Vβ8(39–59) TCR-Peptid, jedoch keine mit dem Vβ14-Peptid.
TCR-Peptid-spezifische Immunität schützt gegen klinische EAE
Zusätzlich dazu, dass die Peptid-immunisierten Ratten eine spezifische Immunität gegen das TCR-Peptid zeigten, wurde herausgefunden, dass die Peptid-immunisierten Ratten gegen klinische EAE geschützt sind.
Die Immunisierung von Lewis-Ratten mit dem TCR Vβ8(39–59) Peptid verhindert vollständig die Induzierung von EAE (Tabelle 1), jedoch nicht bei dem TCR Vβ14-Peptid oder physiologischer Kochsalzlösung. Die mit Vβ8(39–59) immunisierten Ratten entwickelten sowohl Antikörper, die spezifisch gegen das Vβ8(39–59)-Peptid sind, als auch eine verzögerte Hypersensitivitätsreaktion (DH) von 0,17 mm Ohrschwellung gegen 50μg TCR Vβ8(39–59) Peptid. Das Vβ14-Kontrollpeptid induzierte ebenfalls eine Immunität, die gegen sich selber spezifisch war, konnte jedoch keinen Schutz gegen EAE hervorbringen.
TCR-Peptid-spezifische Immunität erzeugt spezifische T-Zellen
Zusätzlich zur Demonstration der Antikörperproduktion, der DH-Antwort und dem Schutz gegen EAE führt das TCR-Peptid zu nachweisbaren antigenspezifischen T-Zellen (d.h. TCR-Peptid-spezifischen) T-Zellen.
Ratten wurden s.c. mit 400μg TCR Vβ8(39–59)-Peptid in CFA (das 1 mg M. Tuberculosis enthält) immunisiert und wurden entweder gleichzeitig mit 50μg GPBP in CFA oder 30 Tage später mit 100μg GPBP s.c. abgefragt. Zwanzig Tage nach dem gleichzeitigen Abfragen wurden wegführende Lymphknoten (LN) entnommen und Lymphozytensuspensionen zuberei tet.
Eine Fraktion der Zellen wurde hinsichtlich der Proliferationsantwort auf Antigene oder Mitogene in vitro (5 × 10⁵ Zellen/Tüpfel) getestet.
Der Rest der Zellen wurde in einer Schüttkultur (Petrischale mit 6 cm Durchmesser) mit dem geeigneten TCR-Peptid (50μg/ml) 3 Tage lang erneut stimuliert, worauf sie in ein IL-2-reiches Medium weitere 4 Tage lang übertragen wurden. Diese Zellen wurden anschließend hinsichtlich der Proliferationsantworten auf Antigene oder Mitogene durch Restimulation in Anwesenheit von bestrahlten Thymusanhangdrüsenzellen (2 × 10⁴ Zellen/Tüpfel) restimuliert. In einigen Fällen wurde die Stimulation durch das TCR-Peptid in Anwesenheit von 2μg/Tüpfel monoklonaler Antikörper ausgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt (unterstrichene Werte zeigen statistisch signifikante Antworten).
Lymphknotenzellen (LN), die aus den geschützten Ratten isoliert wurden, reagierten auf das TCR Vβ8(39–59)-Peptid ebenso wie auf das GPBP und das PPD (gereinigtes Proteinderivat aus M. Tuberculosis). Dies war ein weiterer Beweis für die konkurrierende Anwesenheit einer TCR-spezifischen T-Zell-Reaktionsfähigkeit als auch für eine antigenspezifische T-Zell-Reaktionsfähigkeit.
Die T-Zell-Linien wurden aus den LN der geschützten Ratten, die spezifisch auf das Vβ8(39–59)-Peptid, jedoch nicht auf das Vβ14-Peptid reagiert haben, ausgewählt (Tabelle 2). Die TCR Vβ8(39–59) spezifischen T-Zellen erwiesen sich als stark positiv bei der Immunofluoreszenzsuche nach den CD4-Markern und schwach positiv nach den CD8-Markern. Die proliferative Antwort auf das Vβ8(39–59)- Peptid war nur auf die MHC-Moleküle der Klasse I beschränkt.
Eine GPBP-spezifische T-Zell-Linie wurde außerdem aus den geschützten Ratten selektiert, die sowohl mit dem TCR Vβ8(39–59)-Peptid und GPBP immunisiert waren. Diese Linie zeigte eine uncharakteristisch geringe Antwort auf das encephalitogene 72-89-Peptid, verglichen mit dem Antwortverhalten auf GPBP. Einmal selektiert und aktiviert waren Zellen der GPBP-spezifischen T-Zell-Linien von Ratten, die gegen das TCR-Peptid geschützt waren, encephalitogen (Verabreichung von 10⁷ Zellen verursachen bei 3 Ratten eine Paralyse der Hinterbeine), was anzeigt, dass die Immunisierung mit dem TCR Vβ8(39–59)-Peptid nicht in der Beseitigung der Vorläufer der encephalitogenen T-Zellen führte.
Das Mischen der TCR Vβ8(39–59)-spezifischen T-Zellen mit den BP-spezifischen T-Zellen störte nicht die Antwort auf das GPBP, selbst wenn das TCR-Peptid anwesend war (Tabelle 2). Die Anwesenheit der TCR Vβ8(39–59)-spezifischen T-Zellen verursachte jedoch eine gesteigerte Antwort auf alle Peptide des GPBP mit Ausnahme der encephalitogenen 72–89-Sequenz. Die TCR-Peptid-spezifischen T-Zellen änderten deshalb das Peptiderkennungsmuster der mit GPBP reaktionsfähigen T-Zellen, was den Beweis für die Existenz von Zelle-Zelle-Interaktionen liefert.
Unmittelbare Interaktionen zwischen TCR-Peptid-spezifischen T-Zellen und BP-spezifischen T-Zellen
T-Zellen aus den LN von immunisierten Ratten wurden in vitro auf ihr Antwortverhalten auf abgeschwächte Vβ8⁺- oder Vβ8^–-T-Zellen untersucht. Die als Stimulator dienenden T-Zellen wurden bestrahlt (2500R) und 2 × 10⁴-Zellen wurden (beim Fehlen von zusätzlichen Anhangzellen) 3 Tage lang mit 2 × 10⁵-isolierten TCR-spezifischen T-Zellen kultiviert, mit ³H-Thymidin 18 Stunden lang gepulst und es wurde die Isotopenaufnahme durch Flüssigkeitsscintillationsspektroskopie gemessen.
Beim Fehlen einer stimulierenden T-Zell-Linie liegen die "Hintergrund"-Antworten in der Größenordnung von 7000 cpm (Tabelle 3). Wenn die stimulierende Linie für das GPBP 572–89 Epitop-spezifisch ist und folglich den Vβ8-TCR exprimiert, beträgt die Antwort 31 000 cpm. Wenn jedoch die Stimulatorlinie für das GPBP 55–74-Peptid spezifisch ist und nicht den Vβ8-TCR exprimiert, war keine signifikante Antwort über dem Hintergrund zu beobachten (8000 cpm). Somit konnte nur die Vβ8⁺-Zelle durch die T-Zellen erkannt werden, die für das TCR-Peptid spezifisch sind, was anzeigt, dass die direkte Erkennung des Vβ8-Peptids auf den Ziel-T-Zellen durch eine regulatorische Vβ8-spezifische T-Zelle auftritt. Diese Ergebnisse zeigen die direkte Erkennung der TCR-Sequenz an der Oberfläche der Stimulator-T-Zelle an. Die TCR-Peptid-spezifischen T-Zellen jedoch sind für die BP-reaktiven Zielzellen nicht zytotoxisch.
Passive Übertragung des EAE-Schutzes durch TCR-Peptidspezifische T-Zellen
Die Schutzfähigkeit von Vβ8(39–59) Peptid-spezifischen T-Zellen wurde durch adoptive Übertragung hergestellt. Ratten, denen nur 10⁷ Vβ8(39–59)-spezifische T-Zellen injiziert waren, entwickelten kein EAE (Tabelle 4). Der übertragene Schutz schien T-Zell-vermittelt zu sein; Vβ8(39–59)-spezifische Antikörper wurden in dem Serum der geschützten Ratten nicht gefunden. Die DT-Ergebnisse (Tabelle 4) haben angezeigt, dass die adoptiv übertragenen T-Zellen die Induzierung von EAE verhindern konnten, ohne dass die T-Zell-Erkennung von anderen Antigenen beeinträchtigt wurde.
Spezifität von T-Zell-Linien, die von geschützten Ratten abgeleitet sind
Die Fähigkeit von Vβ8(39–59)-spezifischen T-Zellen, (a) die Antwortmuster von GPBP-spezifischen T-Zell-Linien in vitro zu ändern, (b) naive Ratten gegen EAE zu schützen und (c) in vivo die DH-Reaktionen zu vermindern, hat angezeigt, dass das Antwortmuster auf die BP-Epitope bei Ratten geändert sein könnte, die durch die TCR-Peptispezifischen T-Zellen geschützt sind. Wie in Tabelle 5 gezeigt, haben LN-Zellen aus EAE-geschützten Tieren gut auf das TCR-Peptid von GPBP reagiert, verglichen mit den LN-Zellen einer Kontrollgruppe. Im Gegensatz dazu zeigten LN-Zellen aus der geschützten Gruppe eine signifikante Antwort auf das 87–99 Peptid von BP, während die LN-Zellen der Kontrollgruppe auf dieses Peptid nicht reagiert haben. Die Selektion einer TCR Vβ8(39–59)-spezifischen T-Zell-Linie aus den LN von adoptiv geschützten Ratten (Tabelle 5) hat angezeigt, dass die TCR-Peptid-spezifischen T-Zellen in die LN, die die Stelle der GPBP-Injektion drainiert, gewandert sind und sich dort eingenistet haben.
Diskussion
Die Ergebnisse demonstrieren zum ersten Mal die Verwendung eines synthetischen Peptids aus der CDR2-Region des TCR, um Vβ8-spezifische Regulator-T-Zellen zu induzieren, die die Auslösung von EAE verhindern. Computer-Modelle der ternären Wechselwirkung unter den TCR-Ketten, antigenen Peptiden und den MHC-Restriktionsmolekülen ist mit der CDR-Beteiligung an der Peptid/MHC-Bindung konsistent, wenn der TCR in eine energetisch günstige Konformation gefaltet ist (Davis et al. and Claverie et al., a.a.O.). Die regulatorischen Wirkungen der T-Zellen, die für den CDR2 spezifisch sind, stützen die Annahme, dass diese Region eine biologische Bedeutung aufweist. Obwohl die Erfinder nicht an eine spezielle Theorie gebunden sein wollen, scheint es unwahrscheinlich, dass die Antwort der T-Zelle direkt mit dem funktionalen TCR Vβ8-Molekül auf der Oberfläche der Ziel-T-Zelle wechselwirkt. In der Tat ist es überzeugend, dass das endogene TCR-Peptid vorzugsweise auf der T-Zell-Oberfläche prozessiert und exprimiert wird zusammen mit Klasse I-Molekülen (Long, E.O., Immunol. Today 10:232–234 (1989)). Wenn die natürliche Form des TCR-Peptids mit dem MHC-Molekül an der Oberfläche der T-Zelle assoziiert ist, kann die Wechselwirkung der TCR-spezifischen T-Zelle die normale Aktivierung der T-Zelle durch ein BP-Epitop stören.
Die Impfung mit abgeschwächten T-Zellen zeigt an, dass die schützende Immunität gegen Zielstrukturen induziert wird, die sich unterschiedliche T-Zell-Klone teilen, die für dasselbe krankheitsinduzierende Epitop spezifisch sind, jedoch den TCR direkt nicht implizieren. Die hier demonstrierte Immunogenizität und immunregulatorische Aktivität einer definierten Region der TCR Vβ8-Kette, die durch die encephalitogenen T-Zellen exprimiert wird, stellt einen wichtigen Schritt nach vorne zum Verständnis der antiidiotypischen Regulierung dar und schafft eine klare Erklärung für die Schutzwirkungen der Peptidimmunisierungslösung. Die erfindungsgemäße Lösung, bei der ein synthetisches Peptid verwendet wird, um die TCR-Peptidspezifischen Antikörper zu induzieren, ist bei der Produktion einer Vielfalt von hochspezifischen Antikörpern zum Bestimmen von Sequenzen von Wert, die für die TCR-Funktion Bedeutung haben. Die möglichen regulatorischen Eigenschaften der Antikörper, die gegen das Vβ8(39–59)-Peptid gezüchtet sind, sind in Beispiel II erläutert.
Die TCR-Peptid-Impfung findet ihre Anwendung bei humanen Autoimmun- oder bösartigen Zuständen, die durch die gewöhnliche TCR V-Genverwendung gekennzeichnet sind.
Beispiel II
Antikörper gegen ein synthetisches TCR V-Regions-Peptid unterdrücken EAE
Dieses Beispiel liefert eine Evaluation der Wirkungen der Immunisierung mit dem TCR Vβ8(39–59)-Peptid gegen EAE, die durch das encephalitogene Guineaschweinbasisproteinpeptid (GPBP), S87–99, induziert wurde, sowie auf die Antikörperantworten auf die GPBP-Peptide S49S oder S87–99.
Die Antikörperantworten gegen das TCR Vβ8(39–59)-Peptid sind beschrieben und die Fähigkeit dieser Antikörper, mit den Vβ8⁺-T-Zellen zu reagieren und die klinischen Anzeichen von EAE zu unterdrücken sind bewertet.
Die Ergebnisse zeigen, dass das TCR Vβ8(39–59)-Peptid sowohl den Schutz gegen EAE als auch erhöhte Titer von Antikörpern, die für eines der GPBP-Epitope spezifisch sind, induzieren kann, die bei Lewis-Ratten encephalitogen sind. Ferner wurde gezeigt, dass anti-TCR Vβ8(39–59) Antikörper EAE unterdrücken, unabhängig von regulatorischen T-Zellen. Somit sind nach der Immunisierung der Lewis-Ratten mit dem TCR Vβ8(39–59)-Peptid sowohl humorale als auch zelluläre regulatorische Mechanismen erzeugt worden.
A. Materialien und Verfahren
1. Peptidsynthese und Reinigung
Alle in dieser Studie verwendeten Peptide wurden durch eine minore Modifikation (Hashim, G.A., et al., J. Neurosci. Res. 16:467 (1986) des Festphasenverfahrens (Merrifield R.B., J. Amer. Chem. Soc. 85:2149 (1963)) unter Verwendung von Boc-Aminosäure-Harz-Ester (Peninsula Laboratories, San Carlos, CA) hergestellt worden. Die Peptide (Tabelle 6) wurden mit t-Boc-L-Aminosäurederivaten synthetisiert, wobei von dem t-BocL-Glycin-O-Harz-Ester (0,65 mMol/g: 0,78 mMol) ausgegangen wurde. Die Kopplungs- und Deblockierungsreaktionen wurden routinemäßig mit Hilfe des Kaiser'schen Tests auf freie Aminogruppen überwacht (Kaiser, E., et al., in Anal. Biochem. 34:595 (1970)). Einzelne Deblockierungs- und gelegentliche doppelte Doppelreaktionsschritte reichten zur Synthese aller in dieser Studie verwendeten Peptide aus. Das Peptid Gp-S49S definiert die Region 69–84 von GPBP und trägt ein C-terminales Glyzin. Die Bausteinnummern der GPBP-Peptide, die in dieser Studie verwendet wurden, entsprechen denen, die für das bovine Myelinbasisprotein berichtet werden (Eylar, E.H., et al., J. Biol. Chem. 246:5770 (1971)).
Tryptophan enthaltende Peptide werden zunächst 30 Minuten lang mit 10% Piperidin behandelt, um die formylblockierenden Gruppen zu entfernen und sodann werden alle anderen Peptide von dem Harz gespalten zusammen mit anderen Seitenkettendeprotection, indem sie 0°C in Anwesenheit von Anisol mit HF behandelt werden. Nach dem Entfernen des HF wird die Harz-Peptid-Mischung 4 mal mit Äther gewaschen und getrocknet. Das Peptid wird mit Wasser extrahiert, lyophilisiert und durch eine Sephadex G10-Säule (2,5 × 100 cm) gefiltert, die mit 5%-iger Essigsäure equilibriert und eluiert wurde. Die säureunlöslichen Peptide werden aus der Harz-Peptid-Mischung mit 0,03 M Ammoniumkarbonat extrahiert, auf einer Sephadex G10-Säule gefiltert, die mit 0,03 M Ammoniumbikarbonat equilibriert und eluiert wurde, und sodann werden sie lyophilisiert. Die weitere Reinigung des Peptids wurde unter Verwendung von HPLC mit einer Bondapak C18-Säule erreicht, die mit 0,1% Trifluor-Essigsäure (TFA) in Wasser equilibriert wurde und mit einem linearen Gradienten bis zu 40% Acetonitril enthaltenden 0,1%-igen TFA über eine Zeitspanne von 60 Minuten eluiert wurde. Die Reinheit der Peptide wurde durch HPLC sowie durch Aminosäurekompositionsanalyse dokumentiert.
2. Test- und Kontrollpeptide
Das TCR Vβ8(39–59)-Peptid wurde entsprechend der Sequenz, wie sie durch Burns, F.R., et al., in J. Exp. Med. 169:27 (1989)) angegeben wurde, synthetisiert. Als Kontrollen für die TCR Vβ-Genfamilienspezifität und für die CDR2 hypervariable Region wurden weitere Peptide synthetisiert einschließlich dem TCR Vβ14(39–59), das die entsprechenden CDR2 der Vβ14-Genfamilie (Williams C.B., et al., in J. Immunol. 142:1027 (1989)) sowie dem TCR Vβ8(25-41), der einer Sequenz in der CDR1-Region neben dem Peptid TCR Vβ8(39–59) entspricht (Burns, F.R., et al., a.a.O.). Zu anderen Kontrollpeptiden gehört eine Serie, die spezielle Regionen von GPBP definiert. Die Peptide Gp-S49S und Gp-S87–99 definieren jeweils die große und die kleine encephalitogene Sequenz bei Lewis-Ratten. Die Peptide Gp-S67 (Bausteine 69–81) und Gp-S53 (Bausteine 75–84) definieren jeweils T-Zell- und B-Zell-Epitope innerhalb des hauptencephalitogenen Epitops, das in dem Peptid GpS49S (Reste 69–84) enthalten ist. Das Peptid Gp-S55–74 definiert eine nichtencephalitogene T-Zell-Determinante bei Lewis-Ratten (Offner, H., et al., in J. Exp. Med. 170:355 (1989)) und Gp-Nac-1-16 umfasst die encephalitogene Sequenz für den PL/J-Mäusestamm (Zamvil, S.S., et al., Nature 324:258 (1986)).
3. Peptidkopplung an KLH
Das Keyhole-Limpithemocyanin (KLH) (Calbiochem Corp., La Jolla, CA) wurde in Phosphat gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PBS) gegen PBS bei 4°C über Nacht dialysiert und lyophilisiert. Eine bekannte Menge von KLH (8 mg oder 1–2 μMol) zusammen mit dem Peptid, das zu kuppeln ist (10 μMol), wurde in 1 ml deionisiertem Wasser gelöst. Nachdem der pH-Wert mittels 0,01 N HCl auf 4,5 eingestellt war, wurden 375 mg von 1-Ethyl-3 (3-Dimethylaminopropyl)-Karbodiimid (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) in 0,5 ml Wasser hinzugegeben und die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde lang gerührt. Die Mischung wurde dann in Dialysesäcke gegeben und gegen 3 Wechsel von PBS bei 4°C dialysiert und lyophilisiert. Die Menge an Peptid, das an KLH gebunden war, wurde aufgrund der Massenzunahme in dem nichtdialysierbaren Teil der KLH berechnet.
4. Herstellung von Antipeptid-Antikörpern
Lewis-Rattenweibchen mit einem Gewicht zwischen 200-250g wurden mit einer einzigen Dosis von 100 μg des freien Peptids immunisiert. Das Peptid wurde in vollem Freund'schen Adjuvans (CFA) emulgiert und s.c. injiziert. Jede Ratte erhielt 100 μl der Emulsion, die 100 μg Peptid und 100 μg M. Butyricum enthielt. In ähnlicher Weise wurden Lewis-Ratten mit 100 μg eines speziellen Peptids immunisiert und entweder gleichzeitig oder zu einem späteren Zeitpunkt mit einem anderen Peptid abgefragt. Immunisierten Ratten wurden aus der Schwanzvene vor und in Intervallen nach der Immunisierung Blut entnommen.
Weißen Neuseeland-Karnickeln mit einem Gewicht von 6-7 lbs. wurde Blut entnommen und sie wurden mit 0,5 ml CFA Emulsion immunisiert, die 4mg Peptid und 2mg M. Butyricum enthielt. Die Emulsion wurde s.c. an mehreren Stellen in dem dorsalen Bereich des Nackens und des Schwanzes injiziert. Die Karnickel wurden entweder mit dem freien Peptid oder mit Peptid, das mit KLH konjugiert war, immunisiert. Die immunisierten Karnickel wurden an den Tagen 7, 14 und 21 mit 1mg Peptid, das in unvollständigem Freund'schen Adjuvant emulgiert war und s.c. an der Flanke injiziert wurde, geboosted. Allen Karnickeln wurde über die Ohrvene Blut entnommen, nachdem sie in Zwangskäfige überführt waren und mit Acepromozin beruhigt waren. Um Hypovolemie zu verhindern, wurde die Blutmenge, die entnommen wurde, durch sterile Kochsalzlösung ersetzt. Die Seren von einzelnen Ratten oder Karnickeln wurde durch Zentrifugieren aus geklumptem Blut hergestellt. Alle Seren wurden 30 Minuten lang bei 56°C dekomplementiert und in kleinen Aliquoten eingefroren, denen Natriumazid zugegeben war.
5. Herstellung von Immunoglobulin
Aus dem Serum wurde nach veröffentlichten Verfahren (Steinbuch, M., et al., in Arch. Biochem. Biophys. 134:279 (1969)) IgG hergestellt und durch Ionenaustausch-Chromatographie mit DEAE-Sephadex gereinigt. Das Serum wurde mit einer Volumeneinheit von 0,06 M Acetatpuffer verdünnt und der pH-Wert bei Raumtemperatur auf 4,8 eingestellt. In einer Menge von 6,8g/100 ml Serum wurde Caprylsäure unter heftigem Rühren über 30 Minuten tröpfchenweise zugegeben. Die Mischung wurde sodann zentrifugiert und der Überstand wurde auf einen pH-Wert von 5,7 eingestellt, gegen deionisiertes Wasser dialysiert und lyophilisiert.
6. Antikörpertests
Die Antikörperreaktionsfähigkeit wurde durch eine Adaption für Peptide des Direkt-Enzym-gekoppelten Immunosorptionsversuchs (ELISA) bestimmt (Hashim, G.A., et al., in J. Neurosci. Res. 24:222 (1989)) und durch den Inhibierungs-ELISA, wie er von Cleveland, W.L., et al., (Methods in Enzymol. 121:95 (1986)) beschrieben ist. Peroxidasemarkiertes Karnickel-Anti-Ratten-Immunoglobulin oder Ziegen-Anti-Karnickel-Immunoglobulin (affinitätsgereinigte H- und L-Ketten, Cooper Biomedical, Malvern, PA) wurde zusammen mit O-Phenylendiamin als Enzymsubstrat verwendet und die optische Dichte wurde bei 450–650 nm in einem kolorimetrischen Platereader (Model Vmax, Molecular Devices, Mento, CA) gemessen.
7. EAE-Induktion
EAE wurde, wie von Hashim, G.A., et al., in J. Neu rosci. Res. 24:222 (1989) beschrieben in Lewis-Ratten-Weibchen (225–250g) induziert. Jede Ratte erhielt eine einzige s.c. Injektion einer CFA-Emulsion, die 100 μg Peptid und 100 μg M. Butyricum enthielt. Die immunisierten Ratten wurden täglich auf klinische Anzeichen von EAE inspiziert und zwischen 25 und 30 Tagen nach der Abfrage getötet. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Seren von individuellen Ratten gesammelt und das Rückenmarksgewebe wurde zum Zweck der histologischen Untersuchung verarbeitet.
8. Prävention und Unterdrückung von EAE in Lewis-Ratten
Weibliche Lewis-Ratten wurden mit 100 μg TRC Vβ8(39-59)Peptid immunisiert, das in CFA emulgiert war und s.c. injiziert wurde. Den immunisierten Ratten wurde am Schwanz Blut zur Antikörperbestimmung entnommen und sie wurden mit 100 μg eines encephalitogenen Peptids (Gp-S49S oder Gp-587–99) abgefragt. Gruppen von Ratten wurden entweder am selben Tag oder am Tag 40–41 nach der Immunisierung, basierend auf dem beobachteten zeitlichen Verlauf der Anti-TCR Vβ8(39–59) Antikörperproduktion, abgefragt.
Um die EAE-Unterdrückung durch Anti-TCR Vβ8(39–59) Antikörper zu studieren, wurden die Lewis-Ratten mit dem encephalitogenen Peptid Gp-S49S abgefragt und es wurde ihnen entweder physiologische Kochsalzlösung intraperitoneal (Kontrolle) oder entweder Lewis-Ratten-IgG oder Karnickel-Anti-TCR Vβ8(39–59)-IgG injiziert, das 14 Tage fand jeden zweiten Tag verabreicht wurde. Jede Ratte erhielt eine Gesamtmenge von entweder 49 oder 70 mg Ratten- bzw. Karnickel-IgG und sie wurde am 24. Tag nach der Abfrage getötet. Wenn über eine Zeitspanne von 14 Tagen sterile Kochsalzlösung injiziert wurde, blieb das Karnickel-IgG im Kreislauf der aufnehmenden Ratten, an den Tagen 12 und 24 nach der Übertragung auf hohen Werten und sie erzeugte keine Wechselwirkung mit der Entwicklung der Anti-Gp-S49S-Antikörper.
9. Antikörperfärbung von Vβ8⁺ und Vβ8^–-T-Zellen
Ratten- oder Karnickel-IgG (10 μg) von normalen oder TCR Vβ8(39–59) immunisierten Tieren wurde bei unterschiedlichen Konzentrationen 30 Minuten lang mit 10⁶ Thymozyten (bekanntlich überwiegend Vβ8^–) von normalen Ratten oder einer Gp-S49S-reaktionsfähigen, GPBP-spezifischen T-Zell-Linie (bekanntermaßen Vβ8⁺) inkubiert wurden. Nach mehrmaligem Waschen wurden die Zellen mit 10 μg Maus-Anti-Ratten-IgG oder Anti-Karnickel-IgG für weitere 30 Minuten als Amplifizierungsschritt inkubiert. Nach dem weiteren Waschen wurden die Zellen mit fluoresziniertem Ziegen-Anti-Maus-IgG (H- + L-kettenspezifisch) gefärbt, gewaschen, in 2% Formalin fixiert und hinsichtlich der Fluoreszenzintensität bei 488 nm unter Verwendung eines Coulter Epics C-Cytofluorograph evaluiert. Die Zellen wurden elektronisch basierend auf dem Winkelverhältnis des Musters der Vorwärtsstreuung zu der rechtwinkeligen Streuung aussortiert, um die Hauptlymphozytenpopulationen einzuschließen, die sodann hinsichtlich der FITC-Fluoreszenz evaluiert wurden.
A. Ergebnisse
1. Prävention von EAE durch TCR Vβ8(39–59) Peptid-Immunisierung
Um die prophylaktischen Wirkungen der Anti-TCR Vβ8(39–59)-Immunität gegenüber EAE zu evaluieren, die durch unterschiedliche encephalitogene Epitope induziert war, wurden die Lewis-Ratten zunächst mit dem TCR Vβ8(39-59)-Peptid 44 Tage später immunisiert und EAE wurde entweder mit Gp-S49S oder Gp-S87–99 induziert. Wie in Tabelle 7 gezeigt, vermindert die Immunisierung mit dem TCR Vβ8(39-59)-Peptid die Schwere der Gp-S49S induzierten EAE deutlich und verhindert vollständig die durch S87–99-induzierte EAE. Obwohl die histologischen Scores bei beiden geschützten Gruppen vermindert war, war die Entzündung in dem CNS zufolge der TCR Vβ8(39–59)-Peptidimmunisierung weniger beeinflusst als dies die klinischen Parameter waren.
2. Unterdrückung von EAE mit dem TCR Vβ8 (39–59)-Peptid
Um die Unterdrückung von EAE zu evaluieren, wurde das TCR Vβ8(39–59)-Peptid gleichzeitig mit der encephalitogenen Dosis von GPBP oder Gp-S49S verabreicht. Wie in Tabelle 7 gezeigt, verhinderte das TCR Vβ8(39–59)-Peptid die GPBP-induzierte EAE bei den meisten Ratten und verminderte markant die klinische Schwere bei den übrigen Tieren. Ein ähnliches Ergebnis wurde bei Tieren mit Gp-S49S-induzierter EAE erhalten. Im Gegensatz dazu hat das TCR Vβ14(39-59)-Kontrollpeptid keine unterdrückenden Wirkungen auf die EAE (Tabelle 7). Wiederum waren durch die TCR Vβ8(39–59) Immunisierung die histologischen Zeichen der EAE verhältnismäßig weniger beeinflusst als die klinischen Anzeichen.
3. Antikörperantworten gegen das TCR Vβ8(39–59)-Peptid
Die TCR Vβ8-spezifischen Antikörper, die gegen intak te T-Zell-Klone gezüchtet waren (Owhashi, M., et al., J. Exp. Med. 168:2153 (1988), Gascoigne, N.R.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 84:2936 (1987), Kappler, J.W., et al., Nature 332:35 (1988), Kappler, J.W., et al., Cell 49:263 (1987), MacDonald, H.R., et al., Nature 332:40 (1988) haben sich bei der Prävention und Behandlung von EAE sowohl in Lewis-Ratten (Oshashi, M., et al., J. Exp. Med. 168:2153 (1988)) als auch in PL/J-Mäusen (Acha-Orbea, H., et al., Cell 54:263 (1988), Urban, J., et al., Cell 54:577 (1988)) als wirksam erwiesen.
Es war somit sehr wichtig, festzustellen, ob Antikörper gegen das synthetische TCR Vβ8(39–59)-Peptid gezüchtet werden können und wenn, ob sie eine klinische Verwendbarkeit haben.
Derartige Antikörper konnten in der Tat gezüchtet werden und sie zeigten sich als klinisch wirksam. Antikörper gegen TCR Vβ8(39–59) wurden in den Seren von Lewis-Ratten bereits 7 Tage nach einer einzigen Injektion von 100 μg des freien Peptids in CFA (Tabelle 8) entdeckt. Obwohl ein hohes Variabilitätsmaß bei der Antikörperreaktion beobachtet wurde, stiegen die Antikörpertiter allmählich mit der Zeit. Keine der TCR-Peptid-immunisierten Ratten entwickelte irgendwelche Zeichen von EAE und alle blieben über die 41-tägige Beobachtungsperiode gesund.
Karnickel, die entweder mit dem freien Peptid oder dem KLH-konjugierten TCR Vβ8(39–59)-Peptid immunisiert waren, erzeugten sehr viel höhere Titer an Antikörpern als Ratten (Tabelle 8). Die Antikörpertiter blieben 6 Monate lang hoch und zeigten eine erkennbare Reaktionsfähigkeit bei Verdünnungen bis zu 1/320 000.
4. Antikörperantworten gegen das encephalitogene Peptid S49S
Die Immunisierung von Lewis-Ratten mit GPBP Peptid oder GP-S49S-Peptid (Reste 69–84) induzierte Antikörper, die mehrere unterschiedliche Epitope erkennen, von denen eines in den Bausteinen 82–84 (Asp-Glu-Asn) enthalten ist und durch Antikörperbindung an Gp-S53 (Bausteine 75–84) nachgewiesen wurde (Day E.D., et al., J. Neurosci, Res. 18:214 (1987), Hashim, G.A., et al., J. Neurosci. Res. 17:375 (1987)). Diese Antikörperantworten hängen von der Hilfe durch T-Zellen ab, die durch encephalitogene T-Zellen, die für das GP-S49S-Peptid spezifisch sind, geschaffen werden kann. Obwohl die Immunisierung mit dem TCR Vβ8(39–59-Peptid EAE, die durch Gp-S49S-spezifische T-Zellen des Helfer-Phenotyps vermittelt wird, verhindert oder unterdrückt, ist es wichtig, die Wirkung dieser Immunisierung auf die Anti-S49S-Antikörperformation zu bestimmen.
Die Antikörperantwort auf Gp-S49S wurde bereits 7 Tage nach der Immunisierung mit dem Gp-S49S in CFA (Tabelle 9) entdeckt. Periodische Blutentnahme aus den immunisierten Ratten zeigte eine markante Zunahme bei den Antikörpertitern sowohl gegen Gp-S49S als auch gegen Gp-S53 während der nächsten 48 Tage, wobei die Anti-GpS53-Antwort nur nach der Entwicklung und dem schließlichen Genesen von der EAE auftrat.
Nach der Vorimmunisierung und dem Schutz gegen EAE mittels TCR Vβ8(39–59) waren die 26 Tage Antworten gegen Gp-S49S und GpS53 zwei- oder vierfach erhöht, verglichen mit der bei Ratten, die nicht mit dem TCR-Peptid (Tabelle 9) behandelt waren. In ähnlicher Weise waren die Anti-S87-99-Antworten mehr als viermal größer als in Ratten, die präimmunisiert und mit dem TCR Vβ8(39–59)-Peptid geschützt war (Tabelle 9). Somit verstärkt eine Immunantwort, die gegen Vβ8⁺-T-Zellen gerichtet ist, tatsächlich die Antikörperantworten gegen mehrere bestimmte B-Zell-Epitope von GPBP.
5. Spezifität der Antipeptid-Antikörper
Um die Spezifität verschiedener Antiseren zu evaluieren, wurde die Bindung an eine Gruppe von synthetischen TCR- und GPBP-Peptiden ermittelt. Die Ergebnisse (Tabelle 10) zeigen, dass das Anti-Gp-S49-Antiserum, das das GPS49S- und sein C-terminales Fragment Gp-S53 erkannte, nicht mit dem N-terminalen Fragment von Gp-S49 (d.h. Gp-S67) reagiert, nicht mit einer anderen Region und auch nicht mit den Peptiden der TCR-V-Region. In ähnlicher Weise erkannten die Ratten oder Karnickel-Antiseren gegen das TCR Vβ8(39–59)-Peptid nur das Immunogen und nicht andere TCR-Sequenzen (einschließlich der 3 überlappenden Reste – AspMetGly – die auf dem TCR Vβ8(25–41) präsentiert werden) oder die GPBP-Peptide. Antiseren von Ratten, die gleichzeitig mit dem TCR Vβ8(39–59)-Peptid plus Gp-S49S oder Gp-S87–99 immunisiert wurden, demonstrierten dieselbe Spezifität für jedes der Immunogene als Antiseren aus einer einzig immunisierten Ratte (Tabelle 5). Die Spezifität der Antikörperreaktionsfähigkeit mit TCR Vβ8(39–59) und mit Gp-S49S wurde für die Peptid-spezifische, dosenabhängige Inhibierung der Bindung in ELISA bestätigt (1).
6. Antikörper gegen TCR Vβ8(39–59) erkennen Vβ8⁺T-Zellen
Um die potentiellen regulatorischen Wirkungen der Antikörper auf TCR Vβ8(39–59) zu interpretieren, war es entscheidend festzustellen, ob die Peptid-spezifischen Antikörper mit den Vβ8⁺-T-Zellen direkt interagieren oder nicht. Um eine solche Reaktionsfähigkeit zu bewerten, wurden Vβ8⁺ encephalitogene T-Zellen oder normale Thymozyten, die überwiegend Vβ8^– sind mit Ratten oder Karnickel- Anti-TCR Vβ8(39–59)-IgG-Antikörpern inkubiert, gefolgt von Mäuse-Anti-Ratten- oder Anti-Karnickel-facilisierenden Antikörpern und fluoreszinmarkierten Ziegen-Anti-Maus-IgG-Antikörper. Wie in 2 gezeigt, verursachte das Karnickel-IgG, das gegen das KLH konjugierte, TCR Vβ8(39–59)-Peptid gezüchtet war, eine erhöhte Fluoreszenzintensität bei der gesamten Vβ8+-encephalitogenen T-Zell-Population (>90% positiv gegenüber einem Kontrollantiserum), im Gegensatz zu näherungsweise 5% der normalen Thymozytenpopulation. Ratten-IgG und Karnickel-IgG, das gegen nichtkonjugiertes TCR-Peptid gezüchtet war, färbte außerdem selektiv die Vβ8⁺-T-Zellen, jedoch mit einer geringeren Intensität. Diese Ergebnisse zeigen an, dass der Antikörper gegen TCR Vβ8(39–59)-Peptid spezifisch an Vβ8⁺-T-Zellen binden kann. Keines der Antiseren war für Vβ8⁺-T-Zellen in Anwesenheit von Komplement zytotoxisch, wie dies sowohl durch Chromfreisetzung oder Farbausschluss gemessen wurde, was nahelegte, dass die Antikörperbindung die T-Zell-Funktion ändert, ohne die Zellen zu töten.
7. Unterdrückung von EAE mit Anti-TCR Vβ8(39–59) Antikörpern
Mit TCR Vβ8(39–59) immunisierte Lewis-Ratten waren nicht nur gegen EAE geschützt, sondern entwickelten zirkulierende Antikörper, die für das immunisierende Peptid spezifisch war. Um die Rolle dieser Antikörper beim Abregeln von EAE zu bewerten, wurden Lewis-Ratten mit Gp-S49S in CFA abgefragt, und dann mit TCR Vβ8(39–59)- spezifischem IgG (Ratten oder Karnickel) behandelt. Ratten, die 12 Tage lang jeden zweiten Tag Lewis-Ratten-IgG erhielten, entwickelten milde klinische Anzeichen von EAE mit einem verminderten histologischen Befund im Gehirn, jedoch stärkeren Beschädigungen des Rückenmarks, verglichen mit den Kontrolltieren (Tabelle 11). Ratten, die Karnickel-IgG bekamen, entwickelten minimale klinische Anzeichen bei geringer Änderung der histologischen Bewertung (Tabelle 6). Somit unterdrückte eine 12 Tage andauernde Verabreichung von Anti-TCR Vβ8(39–59)-Antikörpern klinische Anzeichen von EAE, nicht jedoch die histologischen Befunde.
C. Diskussion
Die hier dargelegten Ergebnisse bilden den ersten Nachweis für die Fähigkeit eines synthetischen Peptids der TCR V-Region, spezifische Antikörper zu induzieren, die die Induktion von EAE unterdrücken können. Diese TCR Vβ8(39–59)-Peptid-spezifischen Antikörper sind in der Lage, an T-Zellen zu binden, die den gesamten intakten TCR tragen und hierdurch die Funktion der Zellen, ohne sie zu lysieren, zu ändern. Wenn man die im Beispiel I aufgeführten Ergebnisse damit verbindet, zeigen diese Ergebnisse an, dass sowohl die Antikörper als auch die zellvermittelte Immunantwort unabhängige immunoregulatorische Wirkungen auf encephalitogene T-Lymphozyten hat, die die gewöhnlichen V-Regionsgene in Abhängigkeit von Epitopen of MBP verwenden. Beide regulatorischen Mechanismen haben wirksame präventive und suppressive Auswirkung auf die Induktion von klinischen Anzeigen der Autoimmunkrankheit.
Die TCR Vβ8(39–59)-Peptide, die basierend auf dem Algorithmus von Margalit et al. und Rothbard et al. (a.a.O.) vorhergesagtermaßen ein gutes T-Zell-Immunogen darstellen, erwiesen sich als ein potentes B-Zell-Immunogen, insbesondere bei Karnickeln. Die Antikörper waren für das immunisierende Peptid sehr spezifisch (sowohl bei der direkten Reaktion als auch bei Inhibierungstests) färbten nur die Vβ8⁺-T-Zellen und unterdrücken EAE, die durch Vβ8+-T-Zellen vermittelt war.
Zusammengefasst induzierte das synthetische Peptid TCR Vβ8(39–59) sowohl eine T-Zell-Immunität als auch eine Antikörperproduktion in Lewis-Ratten. Sowohl T-Zellen als auch Antikörper alleine oder gemeinsam sind in der Lage, die Immunantwort auf eine encephalitogene Abfrage zu regulieren. Die Fähigkeit dieser TCR-Peptide, die regulatorischen T-Zellen und die schützenden Antikörper zu aktivieren, zeigt die Brauchbarkeit dieser Lösung bei der Steuerung von menschlichen Autoimmunkrankheiten.
Beispiel III
Klinische EAE bei Ratten, die mit TCR Vβ8(39–59)-Peptiden vor oder nach dem Einsetzen der Krankheit behandelt wurden
Es wurde die Fähigkeit von TCR Vβ8(39–59) getestet, den Krankheitsprozess zu unterbrechen, wenn es zu unterschiedlichen Zeiten nach der Induzierung von EAE entweder s.c. (in einem Adjuvants) oder i.d. (in physiologischer Kochsalzlösung) verabreicht wurde. Bei dem Experiment 1 wurde das TCR-Peptid entweder am Tag 10 (Linie 2) verabreicht oder zum Zeitpunkt des Beginns, als die erste Ratte einer Gruppe klinische Anzeichen von EAE zeigte (Linien 3 und 4). In beiden Fällen zeigte sich bei beiden Induktionswegen für das Peptid eine signifikante Verminderung der Dauer der Krankheit, jedoch nicht hinsichtlich der Schwere oder des Zeitpunkts des Beginns. Die Wirksamkeit des Peptids, das in physiologischer Kochsalzlösung über den i.d.-Weg verabreicht wird, ist bei der Humantherapie von besonderer Bedeutung, da er gegenüber der s.c. Injektion in einem Adjuvant bevorzugt wird.
Beim Experiment 2 wurden die Zeit der i.d. Verabreichung des TCR-Peptids, ebenso wie die Dosis variiert. Wie in Tabelle 12 gezeigt, wurden entweder an den Tagen 0 (Tag der EAE-Induzierung) 7 oder 14 50 μg des Peptids verabreicht, was zu einer signifikanten Verminderung der Dauer der Krankheit führte. Eine Verzögerung beim Einsetzen der Krankheit wurde ebenfalls beobachtet. Außerdem verminderte sich der Anteil von Tieren, die die Anzeichen der Krankheit zeigten. Eine größere Dosis des Peptids (200 μg) schien weniger wirksam als die niedrigere Dosis, vermutlich zufolge einer kurzzeitigen Überladung mit dem Peptid, was die Immunantwort gestört haben könnte, die gegen den TCR erzeugt wurde. Die Behandlung mit einem ähnlich bemessenen Peptid, das einem irrelevanten TCR entsprach, hatte keinen Einfluss auf den Beginn, die Schwere oder das Auftreten von EAE, mag jedoch die Dauer etwas vermindert haben (letzte Linie von Tabelle 12).
Beispiel IV
T-Zell-Antworten von LN-Zellen und TCR-Peptid-selektierten T-Zell-Linien aus Ratten, die eine TCR-Peptid-Therapie bekommen hatten
Die Proliferationsantworten und die Spezifität von T-Zellen bei den drainierenden LN (popliteal) von Ratten, die mit TCR Vβ8(39–59)-Peptid gegen EAE am Tag 13, nachdem die Krankheit induziert wurde, wurde untersucht (Tabelle 13). Am Tag 0 erhielten die Lewis-Ratten eine EAE-induzierende Menge von GP–BP + CFA s.c. in ihre hinteren Fußballen. Am Tag 13 wurden sie in drei Gruppen aufgeteilt und bekamen entweder physiologische Kochsalzlösung (Spalte 1), s.c., 100 μg TCR Vβ8(39–59)-Peptid (+ CFA) in die hinteren Fußballen (Spalte 2) oder i.d. 50 μg TCR Vβ8(39- 59) in physiologischer Kochsalzlösung in die Ohrmuschel. Am tag 20, etwa 7 Tage nach dem Einsetzen von EAE, wurden popliteale LN entnommen und die Proliferationsaktivität von T-Zellen in Abhängigkeit von dem angezeigten Antigen oder Mitogen wurde unmittelbar getestet.
Die LN-Zellen von Kontrollratten reagierten am besten auf Con A, PPD, GPBP und GPBP (72–89) sowie GPBP (45–89) (das die 72–89-Sequenz sowie weitere Immunogene, jedoch nichtencephalitogene Peptide enthält). Im Gegensatz dazu zeigten die LN-Zellen von Ratten, die s.c. in CFA das TCR-Peptid erhalten haben, keine signifikante Profilerationsantwort auf GPBP oder eines der BP-Fragmente. Die LN-Zellen von Ratten, die i.d. mit dem TCR-Peptid behandelt waren, reagierten ähnlich mit der Einschränkung einer verminderten Antwort auf GPBP(72–89). Zusätzlich zeigte die letztere Gruppe eine verstärkte Antwort auf GPBP(90-170), das bekanntermaßen nicht encephalitogen ist. Dies zeigt an, dass ein Umschalten der Epitope stattgefunden hat. Ein Aliquot jeder der oben genannten 3 Gruppen von
LN-Zellen wurde in Kultur 3 Tage lang entweder mit GPBP oder dem TCR-Peptid stimuliert und man ließ die Zellen für weitere 5 Tage in IL-2 sich vermehren. Die Proliferationsantworten auf die unterschiedlichen Antigene und Mitogene dieser ausgewählten T-Zellen wurde, wie oben beschrieben, geprüft. Die Ergebnisse sind in Tabelle 14 gezeigt.
Die Kontroll-T-Zellen (Tabelle 14, Spalte 1) reagierten gut auf GPBP, GPBP(72–89), P1 und Ratten-BP (was eine homologe Erkennung in der CNS anzeigt). Die letzte Zeile der Tabelle zeigt, dass, wenn die T-Zellen dieser Gruppe in naive Ratten injiziert wurden, sie encephalitogen wurden.
Die T-Zellen von der Gruppe der Tiere, die mit dem TCR-Peptid in CFA s.c. behandelt waren und mit GPBP in Kultur selektiert waren (Spalte 2), reagierten schwach auf GPBP, GPBP(72–89) und Ratten-BP. Die Antwort auf GPBP P1 erfolgte offensichtlich zufolge des zweiten (nicht encephalitogenen) Epitops, da die Antwort auf das GPBP(72–89)-Epitop schwach war. Die kräftige Antwort auf das TCR-Peptid zeigt an, dass eine 7 Tage lang dauernde Exposition (ohne weitere Selektion mit diesem Peptid) für eine Anti-TCR-Peptid-Immunität ausreichend war. Von großer Bedeutung ist die Beobachtung, dass diese Zellen nicht in der Lage waren, EAE zu übertragen, was andeutet, dass die encephalitogenen Klone in Anwesenheit des GPBP-Antigens während der Kultur nicht selektiert werden konnten.
Die Zellen von den obigen TCR-immunisierten Tieren schienen, wenn sie in vitro mit dem TCR-Peptid anstelle mit dem GPBP selektiert waren (Spalte 3) nur auf das TCR-Peptid zu reagieren (und natürlich auf das T-Zell-Mitogen, Con A).
Schließlich verhielten sich Zellen von Ratten, die mit dem TCR-Peptid i.d. behandelt und in Kultur mit GPBP selektiert waren (Spalte 4) im Wesentlichen ähnlich wie die Kontrollzellen. D.h. sie erkannten das encephalitogene GPBP(72–89) Epitop und waren in der Lage EAE zu übertragen. Dies zeigt, dass die encephalitogenen T-Zell-Vorläufer noch in den auf diese Weise behandelten Ratten vorhanden waren und in Kultur selektiert werden konnten. Dies legt die Möglichkeit nahe, dass die verminderte Dauer von EAE, wie sie in Ratten, die mit TCR-Peptid i.d. behandelt waren (siehe Beispiel III und Tabelle 12), nicht die Regulierung der drainierenden LN-Zellen beteiligt. Jedoch ist es wichtig zu beachten, dass die LN, die die Stellen der i.d. Injektion drainieren, unterschiedliche regulatorische Eigenschaften zeigen können (d.h. der cervicale LN, wenn die Injektion in der Ohrmuschel i.d. erfolgt.
Beispiel V
Behandlung einer Autoimmunkrankheit mit einem Toxinkonjugierten Antikörper gegen ein TCR-Peptid
Bei diesem Beispiel wird ein mAb durch Immunisierung von Mäusen mittels des TCR Vβ8(39–59)-Peptids produziert, wobei die Verfahren zum Herstellen eines Hybridoms, wie oben beschrieben, angewendet werden. Der mAb wird sodann mit einer Ricin-A-Kette konjugiert, um ein Immunotoxin zu schaffen. Der Toxin-konjugierte Antikörper wird in Ratten gleichzeitig zusammen mit einer encephalitogenen Dosis von GPBP (Prophylaxe) und in andere Ratten nach dem Einsetzen von EAE (Therapie) injiziert.
Die prophylaktische Behandlung mit dem Anti-TCR-Peptid- Antikörper, der mit der Ricin-A-Kette konjugiert ist (1–4 Injektionen mit einer Dosis von 0,05 bis 0,2mg/kg) führt zu einem deutlich verminderten Einsetzen und Schwere von EAE. Die therapeutische Behandlung mit ähnlichen Dosen des Konjugats führte zu einer deutlichen Verkürzung der Dauer und einer Verminderung der Schwere der Krankheit.
Beispiel VI
Behandlung von Arthritis mit TCR-Peptiden
Dieses Beispiel beschreibt, wie humane rheumatoide Arthritis durch die erfindungsgemäße Zusammensetzung und Verfahren behandelt wird. Sie wird durch zwei Tiermodelle modelliert: (1) Durch Injektion des Typ II-Collagens wird Arthritis in disponierten Mäusen induziert (Stuart, J.M. et al., Ann. Rev. Immunol. 2:199–218 (1984) und (2) Arthritis wird durch Injektion des mycobakteriellen Hitze schockproteins (HSP) in disponierten Ratten induziert (Van Eden, W., et al., Nature 331:171–173 (1988)). In vitro werden die arthritogenen T-Zellen, die mit dem Collagen oder HSP reaktionsfähig und in der Lage sind, diese Krankheit zu übertragen, in Anwesenheit des Collagens oder HSP unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren selektiert. Der TCR, der mit den krankheitsvermittelten T-Zellen assoziiert ist, wird identifiziert und die vermutliche Aminosäuresequenz, wie oben, durch Nukleinsäuresequenzieren bestimmt. Unter Verwendung des Algorithmus nach Margalit et al. und Rothbard et al. (a.a.O.) wird ein immunogener Teil des TCR, der wenigstens einen Teil des zweiten Komplementaritäts-bestimmenden Abschnitts trägt, synthetisiert und dazu verwendet, Mäuse (gegen collagene Arthritis) und Ratten (gegen adjuvante Arthritis) zu immunisieren.
Die in Verbindung mit der Krankheitsinduktion mit dem TCR-Peptid behandelten Tiere sind deutlich gegen die Entwicklung von Arthritis geschützt, und zwar gemessen durch Gelenkschwellung und durch die T-Zell-Reaktionsfähigkeit gegenüber dem Arthritogen. Tiere, die mit dem TCR-Peptid nach dem Einsetzen der Krankheit behandelt wurden, zeigen eine deutliche Verkürzung der Dauer und eine Verminderung der Schwere der Symptome der Arthritis.
Passive Immunisierung mit Antikörpern, die gegen das TCR-Peptid induziert waren, das mit Arthritis assoziiert ist, zeigen ebenfalls ähnliche prophylaktische und therapeutische Wirkungen bei der Arthritisinduktion. Eine erfolgreiche Behandlung wird durch polyklonale Antikörper, mAb, chimere Antikörper und immunotoxin-konjugierte Antikörper erreicht.
Beispiel VII
Behandlung von Thyroiditis mit TCR-Peptiden
Humane Thyroiditis einschließlich Hashimoto's Thyroiditis und Graves' Krankheit wird durch die erfindungsgemäße Zusammensetzung und Verfahren, wie sie in diesem Beispiel beschrieben ist, behandelt. Obwohl die genaue Natur des Zielantigens ungewiss ist, ist die Immunreaktionsfähigkeit mit Thyroglobulin- bzw. dem Thyrotrophin-Rezeptor mit dieser Krankheit assoziiert. Thyroiditis wird in Mäusen durch die Verabreichung von Thyroglobulin modelliert (Maron, R., et al., J. Exp. Med. 152:1115–1120 (1980)). T-Zellen, die mit Thyroglobulin und Thyroid-Follicular-Zellantigenen reaktionsfähig und in der Lage sind, die Krankheit zu übertragen, werden in vitro in Anwesenheit von entweder Thyroglobulin, Thyroidzellen oder Thyroidzellmembran-Zubereitungen unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren selektiert. Der TCR, der mit den krankheitsvermittelnden T-Zellen assoziiert ist, wird identifiziert und die vermutliche Aminosäuresequenz wird durch Nukleinsäuresequenzieren, wie oben, bestimmt. Unter Verwendung der Algorithmen nach Margalit et al. und Rothbard et al. (a.a.O.) wird ein immunogener Teil des TCR, der wenigstens einen Teil des zweiten Komplementaritätsbestimmenden Abschnitts aufweist, synthetisiert und zum Immunisieren von Mäusen verwendet.
Tiere, die mit dem TCR-Peptid in Verbindung mit der Krankheitsinduktion behandelt wurden, sind deutlich gegen die Entwicklung von Thyroiditis und einer T-Zell-Reaktivität mit den Thyroidantigenen geschützt. Tiere, die nach dem Einsetzen der Krankheit mit dem TCR-Peptid behandelt wurden, zeigen eine deutliche Verkürzung der Dauer und eine Verminderung bei der Schwere der Symptome der Thyroiditis.
Die passive Immunisierung mit Antikörpern, die gegen das TCR-Peptid induziert und mit der Thyroiditis assoziiert sind, zeigen auch ähnliche prophylaktische und therapeutische Effekte gegen die Induktion der Krankheit. Die erfolgreiche Behandlung wird durch polyklonale Antikörper, mAb, chimere Antikörper und Immunotoxin-konjugierte Antikörper erreicht.
Beispiel VIII
Behandlung von Diabetes mit TCR-Peptiden
Insulinabhängiger Diabetes Mellitus (IDDM) oder Typ I-Diabetes stellt eine Autoimmunkrankheit dar, die durch eine Reaktionsfähigkeit gekennzeichnet ist, die gegen die Pankreas-Inselzellen (oder β-Zellen) gerichtet ist, was zu einer Zellzerstörung und einem Versiegen der Insulinproduktion führt. Die Zielantigene für diesen Immunangriff wurden noch nicht mit Sicherheit gekennzeichnet. Das vorliegende Beispiel beschreibt, wie IDDM durch die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren behandelt wird.
Die Krankheit wird in Tieren modelliert, in denen sie natürlich auftritt oder in bestimmten Mäusestämmen induziert werden kann (Kanasawa et al., Diabetologia 27:113 (1984). Andere Mäusestämme können dazu veranlasst werden, diese Krankheit zu zeigen, indem Lymphozyten von disponierten Stämmen übertragen werden.
T-Zellen, die mit den Antigenen der Pankreas-Inselzellen reagieren und in der Lage sind, die Krankheit zu übertragen, werden in vitro in Anwesenheit entweder der Inselzellen oder Inselzellmembranzubereitungen unter Verwendung der oben beschriebenen Methoden selektiert. Der TCR, der mit diesen die Krankheit vermittelnden T-Zellen assoziiert ist, wird identifiziert und die mutmaßliche Aminosäuresequenz wird durch Nukleinsäuresequenzierung bestimmt, wie oben angegeben. Unter Verwendung der Algorithmen nach Margalit et al. und Rothbard et al. (a.a.O.) wird ein immunogener Teil des TCR, der wenigstens einen Teil des zweiten Komplementaritäts-bestimmenden Abschnitts enthält, synthetisiert und zum Immunisieren der Mäuse verwendet.
Tiere, die mit dem TCR-Peptid in Verbindung mit der Krankheitsinduktion behandelt werden, sind deutlich gegenüber der Entwicklung von Diabetes und gegen die T-Zell-Reaktionsfähigkeit gegenüber den Inselzellenantigenen geschützt. Tiere, die mit dem TCR-Peptid nach dem Einsetzen der Krankheit behandelt wurden, zeigen eine deutliche Verkürzung der Dauer und eine Verminderung der Schwere der Symptome von Diabetes.
Die Passivimmunisierung mit Antikörpern, die gegen das TCR-Peptid induziert und mit dem Diabetes assoziiert sind, zeigen ähnliche prophylaktische und therapeutische Wirkungen gegen die Krankheitsinduktion. Eine erfolgreiche Behandlung durch polyklonale Antikörper, mAb, chimere Antikörper und Immunotoxin-konjugierte Antikörper wird erreicht.
Beispiel IX
Behandlung von experimenteller Autoimmunencephalomyelitis mit dem V-Region-Peptid des T-Zell-Rezeptors
Die Immunisierung von Ratten und Mäusen mit dem Myelinbasisprotein (MBP) induziert encephalitogene T-Zellen, die ein begrenztes Repertoire der T-Zellgene für die Rezeptor-V-Region exprimieren. Die vorausgehenden Beispiele demonstrieren, dass ein synthetisches Peptid aus der Vβ8-Sequenz von den meisten encephalitogenen T-Zell-Klonen der Ratten geteilt wird und dass dieses einen Schutz gegen EAE induziert, indem spezielle regulatorische T-Zellen und Antikörper stimuliert werden. Bei dem vorliegenden Beispiel wird gezeigt, dass dasselbe TCR-Peptid, das den Bausteinen 39–59 der Vβ8-Sequenz entspricht und den zweiten Komplementaritäts-bestimmenden Abschnitt enthält, als Therapie bei EAE sehr wirksam ist.
Wenn das TCR Vβ8-(39–59)-Peptid in vollständigem Freund'schen Adjuvants Ratten mit moderater EAE verabreicht wird, hemmt es den Fortschritt der Krankheit und verkürzt deutlich den Krankheitsverlauf. Wenn das TCR-Peptid i.d. in das Ohr gegeben wird, wurden die Wirkungen um 1 Tag verzögert, führten jedoch wiederum zu einer schnelleren Auflösung der klinischen Anzeichen. MBP-selektierte T-Zell-Linien aus den behandelten Ratten reagierten mäßig auf das MBP, behielten jedoch ihre Reaktionsfähigkeit gegenüber dem TCR-Peptid und war nicht auf normale Rezipienten übertragbar. Der schnelle klinische Effekt des TCR-Peptids legt es nahe, dass ein vorher existierende regulatorisches Netzwerk ausgelöst wird, das als Antwort auf die EAE-Entwicklung aufgeweckt wird. Als Stütze für dieses Konzept wird in diesem Beispiel für die T-Zell-Erkennung des TCR-Peptids bei unbehandelten Ratten, die an EAE erkranken, der direkte Beweis geliefert.
A. Materialien und Verfahren
Tiere: Lewis-Rattenweibchen, 6–8 Wochen alt, wurden von Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, IN) bezogen. Die Ratten wurden bei der Portland VAMC Animal Resource Faci lity entsprechend den Federal and Institutional guidelines untergebracht und gehalten.
Antigene: GP- oder Rt-MBP wurde entsprechend dem Verfahren nach Eylar, (Eylar, E.H., et al., J. Biol. Chem. 246:5770 (1971)) extrahiert und gereinigt. Enzymrestriktionsfragmente von GP-MBP, die die Bausteine 1–37, 43–89 und 90–169 enthalten, ein synthetisches Peptid von GP-MBP entsprechend den Bausteinen 72–89 und die synthetischen Peptide entsprechend den Bausteinen 39–59 von TCR Vβ8 und TCR Vβ14 wurden, wie vorstehend beschrieben, synthetisiert und gereinigt (Vandenbark, A. A., et al., Nature 341:541 (1989), Eylar, E. H., et al., J. Biol. Chem. 246:5770 (1971)). Diese Peptide waren zufolge Hochdruckflüssigkeitschromatographieanalyse zu mehr als 90% rein.
Klinische Protokolle: Bei allen Experimenten wurde EAE durch eine einzige subkutane (s.c.)-Injektion von 50 μg GP-MBP in vollständigen Freund'schen Adjuvant mit 100 μg wärmegetöteten M. Tuberculosis H37RA (DIFCO, Detroit, MI) in einen hinteren Fußballen induziert. Bei dem Präventionsprotokoll wurden Ratten 40 Tage vor der EAE-Induzierung 100 μg TCR Vβ8-(39–59) oder TCR Vβ14-(39–59) in CFA mit 100 μg M. Tuberculosis in einen hinteren Fußballen s.c. injiziert. Bei dem Suppressionsprotokollen wurden die TCR-Peptide gleichzeitig (100 μg s.c. in CFA oder 50 μg i.d. in 0,1 ml physiologischer Kochsalzlösung im Ohr), 7 Tage nach (i.d.) oder 11 Tage (i.d.) nach der Abfrage mit GP-MBP injiziert. Bei den Behandlungsprotokollen wurden die TCR-Peptide entweder s.c. in CFA oder i.d. in das Ohr am ersten Tage verabreicht, an dem klinische Anzeichen von EAE zu erkennen waren (üblicherweise 12 Tage nach der Abfrage mit GP-MBP). Die Tiere wurden täglich hinsichtlich der klinischen Anzeichen von EAE mit Punkten bewertet, wobei eine Bewertungsskala von 0–4 verwendet wurde, bei der 0 = keine Anzeichen, 1 = kraftloser Schwanz, 2 = Hinterbeinschwäche, Ataxie, 3 = Paralyse des hinteren Viertels, 4 = Paralyse des vorderen und hinteren Viertels, sterbend. Die behandelten Gruppen wurden mit Kontrollgruppen hinsichtlich der Unterschiede der maximalen Schwere der Krankheit und der Dauer der klinischen Anzeichen mittels des Student's ungepaarten t-Test verglichen. Hypsersensivitätsreaktionen des verzögerten Typs wurden mittels des Ohrschwellungstests 24 und 48 Stunden nach der i.d.-Injektion von 50 g Antigen gemessen (Offner, H., et al., J. Exper, Med. 170:355 (1989)). Aus den TCR-Peptid behandelten und unbehandelten Ratten wurden, wie oben beschrieben, GP-MBP-spezifische T-Zell-Linien selektiert (Vandenbark, A. A., et al., J. Immunol. 135:223 (1985)). Zehn Millionen GP-MBP-aktivierte, zu einer Linie gehörende Zellen wurden i.p. in naive Ratten übertragen, um die encephalitogene Aktivität zu testen und sie wurden nach Punkten hinsichtlich der aktiv induzierten EAE, wie oben beschrieben, bewertet.
Lymphozytenproliferation: Die Aktivierung von T-Zellen wurde durch ³H-Tdy-Aufnahme gemessen. 500 000 Lymphknotenzellen oder 20 000 Linienzellen wurden in Anwesenheit von 1 Million Zellen der Thymusanhangdrüse in Kulturmedium und Antigenen in Mikrotiter-Tüpfeln 18 Stunden inkubiert, ehe 0,5 μBq-markiertes Thymidin zugegeben wurde. Die Zellkulturen wurden auf Glasfaserfilter geerntet und mittels Flüssigkeitsscintillationstechniken gezählt. Der mittlere CPM wurde aus Dreifachkulturen berechnet. Die Standardabweichungen (DD) von Wiederholungskulturen variierten um <10% gegenüber dem Mittelwert.
B. Ergebnisse
Um die regulatorische Wirkung der TCR-Peptide bei EAE zu evaluieren, wurden das Vβ8-(39–39)-Peptid, ein Kontrollpeptid Vβ14-(39–59) oder physiologische Kochsalzlösung vor, gleichzeitig oder nach der Injektion der encephalitogenen Emulsion, GP-MBP/CFA injiziert. Die durchschnittlichen täglichen klinischen Bewertungspunkte der am meisten wirksamen Prävention, Suppression und Behandlungsprotokolle sind in den 3–5 wiedergegeben, während alle untersuchten Gruppen in Tabelle 15 zusammengefasst sind.
Klinische Wirkungen bei TCR/CFA: Die Injektion des Vβ8-(39–59)-Peptids in CFA 40 Tage vor der Abfrage mit GP-MBP induzierte einen vollständigen Schutz gegen klinische EAE (3). Die gleichzeitige Injektion des Peptids in CFA zusammen mit der encephalitogenen Emulsion unterdrückte ferner EAE, verminderte das Auftreten (8/13 in der behandelten Gruppe gegenüber 26/26 in der Kontrollgruppe), verminderte die Schwere (1,3 gegenüber 3,4 Punkten) und die Dauer (2,0 gegenüber 6,6 Tagen) der klinischen Erkrankung (3, Tabelle 15). Ratten, denen 40 Tage zuvor oder zusammen mit der EAE-Induktion durch Vβ14-(39–59)-Peptid in CFA oder mit CFA allein injiziert wurde, entwickelten EAE, die von den Kontrolltieren nicht unterscheidbar war (Tabelle 15).
Um seine therapeutischen Wirkungen zu bewerten, wurde das TCR Vβ8-(39–599-Peptid in CFA s.c. in Ratten am ersten Tag oder beim Beginn der klinischen Anzeichen injiziert. Zum Zeitpunkt dieser Behandlung zeigten die Ratten eine Hinterbeinschwäche, Ataxie und Inkontinenz (ein durchschnittlicher Wert von 1,8). Wie in 3 gezeigt, verhinderte die Behandlung mit dem TCR-Peptid/CFA die weitere Verstärkung der klinischen Anzeichen und verkürzte die Dauer der EAE von 6,6 Tagen (Kontrolltiere) auf 3,5 Tage. Die Behandlung mit TCR Vβ14-(39–59)/CFA oder CFA alleine hatte keine Auswirkung auf die klinische EAE (Tabelle 15).
Klinische Wirkungen des TCR-Peptids i.d. verabreicht
Um die Verwendung von CFA zu vermeiden, wurde eine Evaluation der Auswirkungen auf EAE beim Verabreichen einer physiologischen Kochsalzlösung des TCR-Peptides intradermal in dem Ohr durchgeführt. Wie in 4 gezeigt, hatte die i.d. Verabreichung von 50 g des TCR-Peptids gleichzeitig mit der encephalitogenen Abfrage (Tag 0) oder am Tag 7 oder am Tag 11 nach der Abfrage dieselben unterdrückenden Wirkungen auf die EAE, die Verminderung der maximalen klinischen Schwere von 3,5 auf 1,7–1,8 und die Verkürzung der Dauer von EAE von 6,6 Tagen auf 3–4 Tage zur Folge (Tabelle 17).
Wenn das TCR-Peptid an dem Tag injiziert wurde, an dem die klinischen Anzeichen zuerst bemerkt wurden (durchschnittlicher Score von 1,9), wurde während des ersten Tages keine klinische Auswirkung auf die EAE beobachtet; jedoch wurde die Schwere der EAE während der nachfolgenden Tage gegenüber den Kontrolltieren (5) deutlich vermindert. Eine Dosis von 50 μg/Ratte an TCR-Peptid verursachte eine schnellere Auflösung der EAE (3,1 Tag) als die niedrigere Peptiddosis von 10 μg/Ratte (4,0 Tage) verglichen mit 6,6 Tagen für die Kontrolltiere.
Die schnelle Wirkung des TCR Vβ-(39–59)-Peptids beim Auflösen der klinischen EAE legt es nahe, dass die Behandlung mit dem Peptid eine Erinnerungsantwort auf den TCR getriggert hat, die ursprünglich als Antwort auf die EAE induziert wurde. Um diese Möglichkeit in vivo zu dokumentieren, zeigten Ratten, die an EAE erkrankt oder von dieser genesen sind, die mittels GP-MBP/CFA induziert war (ohne vorherige Exposition gegenüber dem TCR-Peptid), eine deutliche DTH-Antwort auf das Vβ8-Peptid (p < 0,01 verglichen mit naiven oder CFA-immunisierten Ratten), jedoch keine Antwort auf das Vβ14-Peptid (Tabelle 16). Die Stärke der Antwort auf das Vβ8-Peptid bei Ratten, die an EAE litten, war unverständlicherweise geringer als die Antwort in Ratten, die zuvor mit einer schützenden Menge des TCR-Peptids in CFA immunisiert wurden (Tabelle 16).
T-Zellantworten in geschützten Ratten: Um die Wirkungen der TCR Vβ8-Peptid-Therapie auf T-Zell-Antworten zu evaluieren, wurden Lymphknotenzellen (LNC), die die Injektionsstelle für das GP-MBP/CFA drainieren, hinsichtlich der antigen induzierten Proliferation getestet und sodann zu T-Zell-Linien expandiert. Wie in Tabelle 17 gezeigt, ergaben LNC von mit TCR Vβ8-39–59 behandelten Ratten ein hohes Maß der Hintergrundproliferation (47 000 CPM) und ähnliche Antworten auf GP-MBP sowie weitere Testantigene. Mit GP-MBP (MBP/1.) selektierte T-Zell-Linien reagierten schwach auf das selektierende Antigen und überhaupt nicht auf Rt-MBP und GP-S72–89. Die stärkste Antwort dieser Linie erfolgte gegen das TCR Vβ8-(39–59)-Peptid. Bei der schwachen Erkennung von GP-MBP und der starken Antwort auf TCR war es nicht überraschend, dass die T-Zell-Linien keine klinischen Anzeichen von EAE auf naive Ratten (Ta belle 17) übertragen konnte. Ein ähnliches Muster der starken Antwort auf TCR und der schwachen Reaktionsfähigkeit mit GP-MBP sowie anderen Antigenen wurden außerdem in der T-Zell-Linie (Vβ8/1.) beobachtet, die mit TCR Vβ8-(39-59) selektiert wurde (Tabelle 17).
Im Gegensatz dazu reagierten die LNC von unbehandelten, von der EAE genesenen Ratten in vorhergesagter Weise auf GP-MBP, Rt-MBP und GP-S72–89 (Tabelle 17). Es war jedoch unerwartet, dass diese LNC auch auf das TCR Vβ8-(39–59)-Peptid reagierten und zu einem geringeren Grad auf das TCR Vβ14-(39–59)-Peptid. Bei einer Selektion mit GP-MBP reagierte die erhaltene T-Zell-Linie stark auf MBP-Epitope und übertrug schwere klinische EAE auf naive Rezipienten trotz einer niedrigen Restaktivität gegenüber dem TCR Vβ8-Peptid (Tabelle 17). Bei weiterer Selektion mit dem TCR Vβ8-Peptid wurde die spezifische Antwort auf dieses TCR-Peptid verstärkt, obwohl eine Antwort auf niedrigem Niveau gegenüber dem GP-MBP und dem 572–89 bestehen blieb. Eine weitere Selektion mit dem TCR Vβ14-Peptid amplifizierte nur die mit Vβ14 reaktiven T-Zellen. Somit verifizierten die Reaktionsmuster in beiden TCR-selektierten Linien die Anwesenheit von TCR-reaktiven T-Zellen aus den LN von Ratten, die von der EAE genesen waren.
Wie in 8 gezeigt, wurden starke DTH und Proliferationsantworten bei Tieren beobachtet, die zuvor mit dem entsprechenden TCR-Peptiden/CFA immunisiert waren. Mit TCR Vβ8, jedoch nicht mit Vβ14-Peptiden präimmunisierte Ratten waren gegenüber einer nachfolgenden Abfrage mit GP-MBP/CFA geschützt. Signifikante DTH und starke Proliferationsantworten auf das TCR Vβ8-Peptid wurden außerdem bei Ratten beobachtet, die von der EAE genesen waren und die nie zuvor mit dem synthetischen Peptid immunisiert waren, was anzeigt, dass eine natürliche regulatorische Antwort auf das TCR Vβ8-Peptid als Folge auf den EAE-Erkrankungsprozess induziert wurde.
Ein weiteres anerkanntes Modell für MS stellt die EAE in Mäusen dar, die, im Gegensatz zu der EAE in Ratten, durch einen rückfallenden klinischen Fortschritt gekennzeichnet ist. Gruppen von je sechs SJL/J-Mäusen wurde das 139–151-Peptid des Proteolipidapoproteins (PLP) in CFA injiziert. Am ersten Tag des Einsetzens von klinischen Anzeichen (Tag 14) bekamen die Mäuse 50 μg eines synthetischen Peptids entsprechend den Bausteinen 1–17 der TCR Vβ17-Sequenz i.v., i.d. oder s.c. verabreicht. Wie in 9 gezeigt, vermindert sowohl die s.c. als auch die i.d. Injektion des TCR-Peptids die Schwere der Erkrankung und verkürzt die Erkrankungsdauer während der ersten Periode und beim Rezidiv von EAE.
C. Diskussion
Dieses Beispiel demonstriert klar, dass die therapeutische Verabreichung des TCR Vβ8-(39–59)-Peptids bei EAE die EAE verhindern und unterdrücken kann, was mit den vorherigen Beispielen, die die Wirksamkeit des TCR-Peptids demonstriert haben, konsistent ist. Der schnelle klinische Effekt, ebenso wie die DTH- und die Lymphozytenproliferationsantworten auf das TCR-Peptid zeigen an, dass die T-Zell-Antworten auf das TCR Vβ8-Peptid in den an EAE leidenden Ratten bereits vorhanden war, die nie zuvor mit dem synthetischen Peptid zu diesem Zweck immunisiert waren.
Eine Präimmunisation mit dem Vβ8-Peptid in CFA 40 Tage vor der GP-MBP-Abfrage war das effektivste untersuchte Protokoll (3 und Tabelle 15). Es ist ersichtlich, dass diese Zeitspanne für die Immunisation optimal ist, um sowohl schützende T-Zellen als auch Antikörper gegen das TCR Vβ8-Peptid zu induzieren. Die Injektion des TCR Vβ8-Peptids gleichzeitig mit der GP-MBP-Abfrage war weniger schützend als die Präimmunisation, jedoch unterdrückte dieses Protokoll immer noch vollständig sämtliche klinischen Anzeigen von EAE bei mehr als 30% der Ratten (6/19) (Tabelle 15). Beim Rest war der klinische Verlauf der EAE kürzer und milder. Die Injektion des TCR Vβ8-Peptids nach der GP-MBP-Abfrage, jedoch vor dem Einsetzen der klinischen EAE war ebenfalls wirksam und unterdrückte den Beginn der EAE bei 4 von 19 Ratten und verminderte die Schwere der Erkrankung und die Dauer beim Rest (Tabelle 15).
Ein überraschender Aspekt dieses Beispiels ist der weitgehend sofortige klinische Effekt des TCR Vβ-Peptids, das in kranke Tiere injiziert wurde. Alle Ratten, die die TCR-Peptid-Therapie erhielten, genasen von der EAE schneller als die Kontrolltiere. Bei jenen Tieren, denen TCR-Peptid in CFA injiziert wurde, traten keine klinischen Verschlimmerungen vor der Heilung ein. Jenen Tieren, denen das TCR-Peptid intradermal verabreicht wurde, zeigten am ersten Tag eine Verschlechterung, genasen dann genauso schnell wie die Ratten, denen TCR/CFA injiziert wurde. Sowohl die 10 μg als auch die 50 μg Dosis des Peptids be schleunigten die Genesung, jedoch beseitigte die höhere Dosis die EAE einen Tag früher als die niedrige Dosis.
Die TCR-Peptid-Therapie schien beim Abregulieren der T-Zell-Antworten auf encephalitogene Determinanten von GP-MBP wirksam. Lymphknotenzellen von den mit GP-MBP abgefragten und mit dem TCR-Peptid behandelten Ratten zeigten eine höhere Rate der proliferierenden Zellen, jedoch keine spezifischen BP-Antworten (Tabelle 17). T-Zell-Linien, die mit GP-MBP selektiert wurden, proliferierten in Anwesenheit von GP-MBP und TCR Vβ8-Peptid, jedoch nicht in Anwesenheit von TCR Vβ14-Peptid, was anzeigt, dass sowohl Effektor als auch regulatorische T-Zell-Spezifitäten vorhanden sind. Dass diese Zellmischung die EAE nicht übertragen konnte, ist der anscheinenden Dominanz der TCR Vβ8-reaktionsfähigen Zellen (netto 49 000 CPM) gegenüber den GP-MBP-reaktiven Zellen (nettomäßig 12 000 CPM) oder den 572-89-reaktiven Zellen (netto 3 000 CPM) zuzurechnen. Im Gegensatz dazu haben die LNC von aus der EAE-genesenen Ratten, die ursprünglich mit GP-MBP abgefragt, jedoch nicht mit dem TCR Vβ8-Peptid behandelt wurden, GP-MBP, Rt-MBP und 572–389) erkannt sowie zu einem geringeren Grad auch die TCR Vβ8- und die TCR Vβ14-Peptide (Tabelle 17). Die T-Zell-Linien, die mit GP-MBP selektiert waren, waren stark encephalitogenen, höchst wahrscheinlich wegen der Dominanz der GP-MBP-reaktiven T-Zellen (netto 84 000 CPM) gegenüber den TCR Vβ-reaktiven T-Zellen (netto 9 000 CPM). Der Fortbestand von TCR Vβ-Peptid-reaktiven T-Zellen in Linien, die mit GP-MBP selektiert wurden, ist etwas ungewöhnlich insofern, als die T-Zell-Linien, die mit einem Antigen selektiert werden, üblicherweise die Antworten auf alle anderen Antigene verlieren. Es wurde keine Querreaktionsfähigkeit zwischen GP-MBP und dem TCR Vβ8-Peptid entdeckt.
Lewis-Ratten zeigten keinen spontanen Rückfall, wenn die EAE mit MBP/CFA induziert wird. Obwohl dieser Monophasenverlauf der EAE nicht als Test der Therapie mit TCR Vβ8-(39–59)-Peptids bei Rückfallerkrankung gestattet, schafft es die Möglichkeit festzustellen, ob die starken Heilungsmechanismen in diesem Stamm die Immunantworten auf das TCR Vβ8-Peptid beinhalten. Die T-Zellen von Lewis-Ratten, die auf die encephalitogene Determinante (Sequenz 72–84 oder Sequenz 87–99) von MBP reagieren, verwenden vorzugsweise die Vα2/Vβ8-Gen-Kombination in ihren TCR. Die Injektion von lebenden oder abgeschwächten encephalitogenen T-Zellen kann einen Schutz gegen die EAE hervorrufen, ebenso wie idiotypische und "ergotypische" Antworten. Die zunehmende Häufigkeit von encephalitogenen T-Zellen, die während der die EAE induziert wurden, haben dieselbe Wirkung und stören das regulatorische Netzwerk und es ist überzeugend, dass wenigstens ein Teil dieses Netzwerkes in natürlicher Weise auf die TCR Vβ8-(39–59)-Sequenz gerichtet ist.
Die vorliegenden Daten stützen diese Annahme. Wenn erkrankten oder genesenen Ratten das TCR Vβ-Peptid i.d. verabreicht wurde, zeigten sie geringe, jedoch deutliche DTH-Antworten auf dieses Peptid, jedoch keine DTH auf das entsprechende Vβ14-Peptid (Tabelle 16). Ferner reagierten Lymphknotenzellen von genesenen Ratten besser auf das Vβ8-TCR-Peptid und T-Zellen, die auf eines der Peptide spezifisch waren und konnten durch in vitro-Selektionstechniken (Tabelle 17) angereichert werden. Diese Erkenntnisse zusammengenommen liefern den unmittelbaren Beweis für die natürliche Induktion der Immunität gegen die TCR Vβ8-(39-59)-Sequenz, die durch die encephalitogenen T-Zellen exprimiert wird. Jedoch kann dies möglicherweise nicht die einzige wichtige Determinante auf dem TCR sein, da andere Sequenzen innerhalb der TCR α- oder β-Ketten auch regula torische T-Zellen und Antikörper induzieren. Der schützende, der unterdrückende und der therapeutische Effekt dieser TCR Vβ8-(39–59)-Region zeigt deutlich seine Bedeutung als eine Determinante für die idiotypische Regulierung der EAE.
Daten, die für SJL/J-Mäuse präsentiert wurden, die einen biphasischen klinischen Verlauf der EAE zeigten, demonstrieren ferner, dass die Verabreichung des TCR Vβ17-Peptids beim Einsetzen der klinischen Anzeigen die Schwere und die Dauer der Symptome sowohl während der ersten Phase als auch während des Rückfalls vermindern. Dies stellt eine zusätzliche Stütze für die Bedeutung der TCR V-Region-Peptids als Werkzeug bei der Behandlung von Autoimmunkrankheiten dar, die durch die EAE modelliert sind.
Beispiel X
Spezifität von menschlichen Z-Zell-Klonen, die mit immunodominanten Epitopen des Myelinbasisproteins reaktionsfähig sind
Einleitung
Myelinbasisprotein (MBP) ist stark antigen und verursacht experimentelle Autoimmunencephalomyelitis (EAE) bei verschiedenen Tierspezien, wenn es zusammen mit Adjavantien injiziert wird (Alvord, E.C., Jr., in Experimental Allergic Encephalomyelitis: A useful model for multiple sclerosis, Alvord, E.C., Jr. et al. (eds.), Alan R. Liss, Inc., New York, pp. 523–537 (1984)).
Die encephalitogene Eigenschaft von MBP wird von einer diskreten Anzahl von immunodominanten Epitopen (etwa 10) eingeschlossen. Innerhalb jedes Stammes induzieren eines oder mehrere dieser Epitope zusammen mit den verfügbaren Klasse II-MHC-Molekülen CD4+-T-Effektor-Lymphozyten, die sich auf das zentrale Nervensystem (CNS) ausrichten, wobei sie perivaskuläre entzündlich Läsionen und Dysfunktionen der Nerven hervorrufen (Zamvil, S.S., et al., J. Immumol. 139:1075 (1987), Offner, H., et al., J.. Exp. Med. 170:355 (1989)).
Der genetische Hintergrund, zu dem sowohl das MHC- als auch Nicht-MHC-Gene gehören, beeinflusst, welche MBP-Epitope encephalitogen sind (Beraud, E., et al., J. Immunol. 136:511 (1986), Zamvil, S.S. et al., J. Exp. Med. 162:2107 (1985)), beeinflusst den klinischen Verlauf und die Schwere der Erkrankung (Fritz, R.B., et al., J. Immunol. 134:2328 (1985), Hinrich, D.J., et al., J. Exp. Med. 166:1906 (1987), Linthicum, D.S., et al., J. Exp. Med. 155:31 (1982), Diethsch, G.E., et al., J. Immunol. 142:1476 (1989), Mokhtarian, F., et al., Nature (London) 309:356 (1984)) beeinflusst die Demyelination (Mokhtarian, F., et al., Nature (London) 309:356 (1984)) und die Widerstandsmechanismen (Bernard, C.C., Clin. Exp. Immunol. 29:100 (1977), Welch, A.M., et al., J. Immunol. 125:186 (1980) Varriale, S., et al., J. Immunol. 125:186 (1989), Whitman, R.H., et al., Cell. Immunol. 126:290) 1990)).
Das Spektrum der klinischen und der histologischen Befunde, die durch MBP-spezifische T-Zellen hervorgerufen wurden, ähneln in vieler Hinsicht den menschlichen Erkrankungen, wie multiple Sklerose (MS) und verbreiteter Encephalomyelitis (ADE) (Paterson, P.Y., Adv. Immunol. 5:131 (1966), Waksman, B.H., et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 175:282 (1984)). Dementsprechend ist die MBP-Erkennung durch menschliche T-Zellen von besonderem Interesse.
Es gibt unterschiedliche Beweisführungen, die es nahelegen, dass T-Zellen einschließlich solcher, die für menschliches MBP spezifisch sind, an der Pathogenese von MS beteiligt sind. Genetische Studien zeigen ein Verknüpfungsungleichgewicht zwischen den Genen für die V- und C-Regionen der T-Zell-Rezeptoren innerhalb der Familien mit MS (Hauser, S.L., et al., Neurology 39:275 (1989), Beall, S.S., et al., J. Cell. Biochem. 11D:223 (1987)) oder unter Patienten insgesamt (Oksenberg, J.R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:988 (1989)). Jedoch kann die tatsächliche Beteiligung von T-Zellen, die mit MBP reaktivfähig sind, an der Pathogenese von MS nur demonstriert werden, wenn die selektive Regulierung oder die Beseitigung der mit MBP-reaktiven T-Zellen den Krankheitsprozess beeinflussen kann. Eine solche selektive Regulation ist nun bei EAE möglich.
Bei diesem Beispiel wurde ein synthetisches TCR-Peptid verwendet, um regulatorische T-Zellen und Antikörper zu induzieren, die gegen den TCR auf den zerstörerischen- T-Zellen gerichtet sind. Diese Lösung verhindert die Induzierung von EAE. Wie bei dem vorherigen Beispiel demonstriert, stoppte die Verabreichung des TCR-Peptids an klinisch erkrankte Ratten den Krankheitsverlauf und beschleunigte die Heilung. Die Anwendung dieser Lösung zur Regulierung potenziell encephalitogener T-Zellen bei MS-Patienten hängt davon ab, ob MBP-reaktive T-Zellen vorzugsweise eine begrenzte Anzahl der Gene für die TCR- V-Region in Abhängigkeit von den immunodominanten Epitopen von menschlichem MBP verwenden.
Zu diesem Zweck wurden T-Zell-Linien von MS-Patienten und Kontrollpersonen in einer Weise gesammelt, die das Hervortreten von T-Zellen gestattete, die immunodominante MBP-Epitope erkennen. Aus diesen Linien wurden 109 T-Zell-Klone, die MBP-spezifisch sind, isoliert und hinsichtlich des Phenotyps, der Spezifität des Epitops, der MHC-Restriktion und dem Exprimieren des TCR-V-Gens charakterisiert. Diese Daten zeigen auf der Ebene des Klons, dass T-Zellen von MS-Patienten mehr und andere MBP-Epitope erkennen als dies die T-Zellen von normalen Spendern tun. Ferner haben bei einem MS-Spender mit dem Krankheits-assoziierten HLA-DR2/DQwl-Haplotyp 4 von 8 untersuchten T-Zell-Klonen den Vβ5.2-Phenotyp exprimiert, was die bevorzugte TCR V-Genverwendung in der Antwort auf MBP anzeigt.
A. Materialien und Verfahren
Menschliche Probanden: Zu den in dieser Studie bewerteten MS-Patienten gehörten 11 Patienten mit einer klinisch- oder labormäßig gestützten MS, die durch die Oregon Health Sciences University MS-Klinik betreut wurden. Unter ihnen waren 7 Frauen und 5 Männer (Durchschnittsalter 46, bei einem Bereich zwischen 34–67 Jahren), die an MS zwischen 6–35 Jahren litten. Die Patienten hatten einen durchschnittlichen Ambulation-Index (AI) von 3,4 ±1,6 (Bereich 1–6) und einen Kurtzke-Score für die Behinderung (KDSS) von 4,3 ±2,0 (Bereich 2–4) (Kurtzke, J.F., Neurology 15:654 (1965)).
Zu den normalen Personen gehörten 6 weibliche und 3 männliche Angestellte (Durchschnittsalter 36, Alter zwischen 25–55 Jahre) des Veterans Affairs Medical Center und der Oregon Health Science University. Diese normalen Personen wurden auf der Basis der positiven PBL-Proliferationsantwort auf menschliches MBP selektiert, wie dies oben beschrieben ist (Vandenbark, A.A., et al., J. Neurosci. Res. 23:21 (1989)).
Alle Personen waren HLA-Typen, wie sich aus T-Zell- Linienselektion mittels standardmäßiger sereologischer Verfahren erwies, die durch das Oregon Health Sciences University Transplantation Laboratory verwendet wurden. Die Häufigkeit der HLA-Klasse II-Allele (DR,DQ) zeigte eine ungleichmäßige Verteilung für DR2 (7 von 11 Patienten waren DR2 positiv, entsprechend 63%; 3 von 9 Normalen waren DR2 positiv, entsprechend 33%), was im Allgemeinen dem erwarteten Auftreten für diese zwei Gruppen entspricht (Theofilopoulos, A.N., in Basic and Clinical Immunology, Stites, D.P., et al., (eds.), Appleton and Lange Publishers, Los Altos, CA, pp. 151–154 (1987)).
Antigene: Menschliches (Hu-) MBP wurde aus schockgefrorenem menschlichen Gehirn extrahiert und gereinigt (Eylar, E.H., et al., Arch. Biochem. Biophys. 132:34 (1969)). Durch Spalten mittels Peptid und Reinigen mittels Sephadex, Ionenaustauschchromatographie sowie Hochdruckflüssigkeitschromatographie (Chou, C.H.-J., et al., J. Neurochem. 28:115 (1977)) wurden Peptide von Hu-MBP einschließlich P1 (Bausteine 45–89), P2 (Bausteine 1–38) und P4 (Bausteine 90–170) erhalten. Eine Serie von synthetischen Peptiden entsprechend den Hu-MBP-Sequenzen 13–28, 39–54, 55–74, 72–84, 87–99, 90–109, 110–129, 130–149 und 149–170 wurde mittels der Merrifield Fest-Phasen-Methode synthetisiert und mittels HPLC entsprechend dem oben beschriebenen Verfahren gereinigt (Hashim, G.A., et al., J. Neurosci. Res. 16:467 (1986)).
T-Zell-Linien: Menschliche T-Zellen, die mit MBP reaktionsfähig waren, wurden aus dem Blut von 11 MS-Patienten und 9 normalen Personen selektiert, die in vorherigen Screening-Tests Antworten auf Hu-MBP zeigten (Vandenbark, A.A., et al., J. Neurosci. Res. 23:21 (1989)). Mononukleare Blutzellen (MNC) wurden mittels Ficoll-Dichtegradienten-Zentrifugierung abgetrennt und in vollständi gem Medium (RPMI 1640 mit 10% menschlichem AB-Serum, L-Glutamin, Natriumpyruvat und Antibiotika) mit 50 μg/ml Hu-MBP bei einer Zelldichte von 5×10⁵ pro Tüpfel einer flachbödigen 96-Tüpfelplatte 5 Tage lang bei 37°C in einer 5%-igen CO₂ Atmosphäre kultiviert. Die stimulierten Zellen wurden in ein IL-2-reiches Medium übertragen (es enthielt 50 μg/ml rekombinantes IL-2, AMGEN Biologicals, Thousand Oaks, CA), um die aktiven Zellen zu expandieren. Sobald sich das Wachstum in dem IL-2 verlangsamte, wurden die T-Zellen mit 25 μg/ml Hu-MBP erneut stimuliert, das durch autologe Monozyten präsentiert wurde, die in bestrahlten peripheren Blut MNC (4 500 rad) in einem Verhältnis von 1:10 (T:MNC) erhalten waren. Die T-Zell-Linien wurden 4–5 Mal erneut stimuliert, bis die Zellanzahl ausreichte, um die MBP-Epitopspezifität, die MHC-Restriktion und den Phenotyp zu untersuchen.
Klonen der T-Zellen: Durch beschränkte Verdünnung von MBP-spezifischen T-Zell-Linien, die zwei Mal mit Hu-MBP restimuliert wurden, wurden T-Zell-Klone erhalten. Nach 4 Tagen in IL-2-angereichertem Medium wurden die T-Lymphoblasten auf 1, 10 bzw. 30 Zellen/20 μl Kulturmedium verdünnt, das Hu-MBP (50 μg/ml), IL-2 (50 μg/ml) und bestrahltes MNC (1,5 × 10⁶) enthält, wobei jede Zellmischung in einen Tüpfel einer 60 Tüpfel enthaltenden Tarasaki Microtest Schale verteilt wurde (NUNC Inc., Naperville, IL) (Lamb. J.R., et al., J. Immunol. 128:233 (1982)). Die Rückgewinnung von menschlichen MBP-spezifischem Klonen war besonders effizient, wenn wenigstens 10 Hu-MBP-reaktive Zellen einer Linie pro Tüpfel ausgesät wurde, was eine 20%-ige Rückgewinnungsrate hervorrief. Wenn nur eine Linienzelle pro Tüpfel ausgesät wurde, betrug die Wiedergewinnungsrate 2%. Hu-MBP-reaktive T-Zellen wurden durch Säen von einer Zelle/Tüpfel erneut geklont. Die Tarasaki-Schalen wurden bei 37°C und 5% CO₂ 7 Tage lang inkubiert. Zum Restimulieren wurden die Zellen aus jedem positiven Tüpfel in einen einzigen Tüpfel einer 96 Tüpfelplatte mit runden Böden übertragen, wobei 200 μl des kompletten Mediums mit 25 μg/ml Hu-MBP und 2×10⁵ bestrahlte MNC zugegeben wurden. Zu den Zellen wurden 50 μg/ml von IL-2 zu den Zellen am dritten Tag nach der Stimulation hinzugefügt und die Zellen wurden weitere vier Tage lang in IL-2 gehalten. Sobald die Zellenzahl 2–4×10⁵ erreicht hatte, wurden die Kulturen in eine 24 Tüpfelplatte in 1 ml überführt und mit Hu-MBP in Anwesenheit von 3×10⁶ autologen bestrahlten MNC restimuliert, worauf sie dann in 2ml IL-2-reichem Medium vermehrt wurden.
Proliferationsuntersuchung: Die Spezifität der Zellantwort wurde bewerten, indem 2×10⁴-T-Zellen mit 1×10⁵ bestrahlten (4 500 rad) autologem Blut-MNC in 0,2 ml Dreifachkulturen in einer 96 Mikrotiter Tüpfelplatte mit runden Böden inkubiert wurden, wobei Antigene gefehlt haben und 2 μg/ml Con A, 50 μg/ml Hu-MBP, 50 μg/ml Hu-MBP-MBP-Fragmente (P1, P2 und P4), 50 μg/ml synthetischer Peptide von Hu-MBP und 1/200 verdünntes Antigen von Herpes Simplex-Virus (HSV) (Whittaker M.A. Bioproducts, Walkersville, MD) anwesend war. Die Mikrotiterkulturen wurden 3 Tage lang bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert und mit 0,5 μBq ³H-TdR wenigstens 18 Stunden lang gepulst. Die Zellen wurden auf Glasfaserfilter geerntet und es wurde die ³H-TdR-Aufnahme unter Verwendung eines β-Scintillationszählers gezählt. Die Proliferation wurde als CPM der stimulierten Kulturen ±SD ausgedrückt (Hintergrund abgezogen). Das Hintergrundsignal bewegte sich zwischen 299 und 2 000 CPM. Die MHC-Restriktion wurde bewertet, indem die T-Zellen mit Hu-MBP, Hu-MBP-Fragmenten oder synthetischen Peptiden von Hu-MBP in Anwesenheit von Antikörpern inkubiert wurden, die für die Netzwerkdeterminanten von Molekülen aus dem HLA-DP, –DQ oder -DR-Locus spezifisch waren (die Antikörper wurden bei Becton Dickinson Pharmaceuticals, Mountain View, CA). gekauft.
Bestimmung des Phenotyps der T-Zellen: Die T-Zell-Linien und -Klone wurden hinsichtlich des Phenotyps unter Verwendung von Leu 3a (Anti-CD4+ T-Helfer) und Leu 2a (Anti-CD8+ T zytotoxisch/Suppressor) monoklonaler Antikörper (Becton Dickinson), wie oben beschrieben, untersucht (Vandenbark, A.A., et al., in J. Neuroimmunol. 8:103 (1985)). Die T-Zell-Klone wurden hinsichtlich dem Exprimieren der TCR Vβ-Ketten-Genprodukte phenotypisch untersucht, wobei monoklonale Mäuse-Antikörper verwendet wurden, die für TCR Vβ5.2/5.3 (5A), Vβ5.3 (5B), Vβ6.7, Vβ8.1 und Vβ12 spezifisch waren (DIVERSI-T^m aβ TcR-Screening Panel 1A, T Cell Sciences Inc., Cambridge, MA). 2×10⁵ T-Zellen wurden mit 5 μl jedes Antikörpers 1 Stunde lang bei 4°C inkubiert, anschließend 3 Mal mit Medium gewaschen, das 5% menschliches AB-Serum enthielt, und daraufhin mit FITC-konjugierten Ziegen-Anti-Maus IgG 30 min lang inkubiert. Nachdem 2 Mal gewaschen und mit 2% Formaldehyd fixiert wurde, wurden die gefärbten Zellen unter Verwendung eines FACScan-Strömungszytometers hinsichtlich der Immunofluoreszenz bewertet.
B. Ergebnisse
Kennzeichnung der Hu-MBP-spezifischen T-Zell-Linien von MS-Patienten und Normalen. Aus dem Blut von 11 Patienten mit MS und 9 normalen Spendern mit den zuvor erläuterten Proliferationsantworten auf Hu-MBP wurden Hu-MBP-spezifische T-Zell-Linien selektiert. Jede Linie wurde aus 30–50 Millionen Blutzellen durch wiederholte Stimulation mit vollem Hu-MBP selektiert und mit IL-2 expandiert.
Aufgrund der vorherigen Erfahrung beim Selektieren von T-Zell-Linien von Nagetieren sollten diese Bedingungen die Expansion und die Fokussierung der repräsentativen T-Zell-Antworten auf die immunodominanten Hu-MBP-Epitope gestatten.
Die T-Zell-Linien von MS-Patienten und normalen Spendern antworteten gleich gut sowohl auf das Hu-MBP als auch auf das Con A bei vernachlässigbaren Antworten auf die HSV-Antigene (6). Die T-Zell-Linien wurden hinsichtlich ihrer Antwort auf hoch-gereinigte Enzymspaltprodukte untersucht, die die gesamte Sequenz von Hu-MBP einschließlich P1 (Bausteine 45–89), P2 (Bausteine 1–38) und P4 (Bausteine 90–170) überspannten. 8 von 11 MS-Linien reagierten auf alle drei Hu-MBP-Fragmente, 2 reagierten auf 2 von 3 Fragmenten und nur 1 Linie reagierte auf ein einziges Fragment. Im Gegensatz dazu haben 5 von 9 normalen Linien auf ein einziges Fragment, 3 Linien auf alle Fragmente und 1 Linie auf überhaupt kein Fragment reagiert. Die Rate derjenigen, die auf das 45–89-Fragment geantwortet hat, war in der MS-Gruppe deutlich größer als bei den Kontrollpersonen, im Durchschnitt waren die MS-T-Zell-Linien signifikant stärker reaktionsfähig sowohl gegenüber dem 45–89-Fragment (P1) als auch dem 1–38-Fragment (P2) von Hu-MBP (6). Jedoch gab es keine Unterschiede in der Häufigkeit und der Stärke der Antwort auf das 90–170-Fragment (P4). Alle menschlichen T-Zell-Linien wiesen eine gemischten Phenotyp von CD4+-T-Zellen und CD8+-T-Zellen auf. Jedoch enthielten die T-Zell-Linien von MS-Patienten eine verhältnismäßig höhere Rate von CD4+ Subpopulationen und eine niedrige Rate CD8+Subpopulationen auf, verglichen mit normalen Spendern (78 ±13% gegenüber 58 ±8% bei CD4+-Zellen; 15 ±6% gegenüber 30 ±12% bei CD8+-Zellen, Tabelle 18).
Selektion und Charakterisierung der Hu-MBP-spezifischen T-Zell-Klone: Obwohl der Gesamtbereich der immunodominaten T-Zell-Epitope auf dem Hu-MBP aus dem Reaktionsmuster der T-Zell-Linien gegen die Hu-MBP-Peptide geschlossen werden kann, muss der Beweis der T-Zell-Erkennung aus der Analyse der Klone abgeleitet werden. Zu diesem Zweck wurden insgesamt 109 menschliche MBP-spezifische T-Zell-Klone von 7 MS-T-Zell-Linien (50 Klone) und 6 normale T-Zell-Linien (59 Klone) hinsichtlich ihrer Antwort auf Hu-MBP und Hu-MBP-Fragmente sowie synthetische Peptide bewertet. Die T-Zell-Linien der Spender waren mit Ausnahme der HLA-DR2-Verteilung vergleichbar (86% der MS-Patienten gegenüber 33% der normalen Spender waren DR2-positiv; siehe Tabelle 19).
Sämtliche T-Zell-Klone reagierten auf Hu-MBP, jedoch nicht auf das Antigen von Herpes simplex-Virus (HSV) bei ähnlichen Antwortwerten in beiden Gruppen. Insgesamt konnten 48 T-Zell-Klone als für CD4- und CDB-Marker phenotypisch bestimmt werden (gleichmäßig zwischen den Gruppen verteilt). Von diesen waren 45 Klone CD4+ und 3 (von einem normalen Spender) CD8+ (Tabelle 18). Diese Dominanz der CD4+-Klone war aufgrund der vorherigen Erfahrungen bei Ratten und Mäusen zu erwarten, selektierte jedoch nicht den relativen Anteil dieser Untergruppen in den T-Zell-Linien, aus denen die Klone abgeleitet waren (Tabelle 18).
Klonabhängige Spezifitäten reflektieren das Muster der T-Zell-Linienantworten. Um die Gültigkeit der Klonanalyse abzusichern, ist es wichtig zu bewerten, wie gut die Kloneigenschaften der T-Zellen die Antworten der T-Zell-Linien repräsentieren. Bei den Linien, die zum Vergleich ausreichend Klone hervorbrachten, zeigte die Anzahl der Klone, die spezifisch auf ein bestimmtes Fragment von MBP reagierten, eine signifikante Korrelation mit der Direktantwort auf das Hu-MBP-Fragment der elterlichen T-Zell-Linie (gepaarter ξ²-Test, p < 0,05).
Repräsentative Vergleiche zwischen 3 MS-Patienten und 2 normalen Spendern sind in 7 gezeigt. Ausgehend von dem Muster der Antworten der T-Zell-Linien wurde erwartet, dass mehr Klone, die mit P1 und P2 reagieren, aus den MS-T-Zell-Linien selektierbar wären als aus den Kontroll-Linien, jedoch die Häufigkeit der mit P4 reagierenden Klone verhältnismäßig gleich wäre. Dies war in der Tat der Fall, wie in Tabelle 19 gezeigt. Unerwarteterweise haben jedoch 46 der insgesamt 109 MBP-reaktiven T-Zell-Klone nicht auf ein einziges Fragment von Hu-MBP reagiert, obwohl die Antwort auf Hu-MBP gewaltig war und zwischen 10 000 und 27 000 cpm rangierte bei nur 1 000 – 2 000 cpm-Hintergrundsignal. Dieses Ergebnis war in der normalen Gruppe wesentlich häufiger als in der MS-Gruppe, und zwar weitgehend aufgrund des einzigen normalen Spenders (Tabelle 19).
Verschobene klonale Spezifität innerhalb von P4. Obwohl die P4-Region des Hu-MBP die C-Terminal-Hälfte des Moleküls darstellt, haben näherungsweise 2/3 (41 von 63) der Klone, die mit den Hu-MBP-Peptiden reaktiv sind, auf dieses Fragment reagiert. Um die Epitopspezifitäten zu identifizieren, wurden 23 dieser Klone von 4 normalen Spendern und 4 MS-Patienten in einem Proliferations-Test untersucht, bei dem gegen eine Serie von synthetischen Peptiden getestet wurde, die unterschiedlichen Abschnitten der P4-Region entsprechen. Wie in Tabelle 20 gezeigt, war die klonale Verteilung bei den normalen Spendern in Richtung auf die 120–129- Sequenz verschoben und bei den MS-Spendern in Richtung auf die 130–149-Sequenz. In beiden Gruppen waren die Antworten auf die 149–171-Sequenz ähnlich und nur der MS-Klon reagierte auf die 87–99-Sequenz (Tabelle 20).
HLA–DR2 ist zur Restriktion von Hu-MBP-Mehrfachepito pe in der Lage Die Assoziation des HLA-DR2/pQwl Haplotyps mit MS legt es nahe, dass diese Klasse II-Moleküle, insbesondere DR2, eine kritische Rolle bei der Restriktion der CD+-T-Zell-Antworten auf die CNS-Autoantigene spielen könnte. Zu diesem Zweck wurden die Hu-MBP-Epitope, die durch 17 T-Zell-Klone von 3 HLA-DR2/DQwl-Spendern erkannt wurden, in Tabelle 21 zusammengefasst. Dieser Satz von T-Zell-Klonen erkannte insgesamt P2 (3 Klone), P1 (1 Klon), P4 (8 Klone) oder kein Peptid (5 Klone). Innerhalb von P4 erkannte 1 MS-Klon das 87–99 Epitop, 1 normaler Klon erkannte das 110–129 Epitop, 1 MS-Klon erkannte das 130-149 Epitop und 4 Klone (3 MA und 1 normaler) erkannten das 149–171 Epitop. Bei 7 von 7 P4-reaktiven Klonen, die untersucht wurden, wurden die Antworten mittels Anti-HLA-DR-Antikörpern inhibiert, was klar DR2 als Restriktionselement (Tabelle 21) impliziert. Da der DR-Locus überwiegend bei der Beschränkung der menschlichen T-Zell-Antworten auf MBP verwendet wird, ist es wahrscheinlich, dass die Mehrheit der 10 nicht getesteten Klone auf DR2 beschränkt ist. In jedem Falle ist es klar, dass DR2 eine große Varietät von Hu-MBP-Epitopen beim Menschen beschränken kann.
Verwendung des TCR Vβ-Gens durch die Hu-MBP-reaktiven T-Zell-Klone. Die bevorzugte Verwendung der TCR Vα- und Vβ-Gen-Familien durch encephalitogene MBP-spezifische T-Zellen aus Ratten und Mäusen führt zu einer erfolgreichen Impfung und erfolgreichen therapeutischen Strategien, die gegen gewöhnliche TCR-Sequenzen auf den zerstörerischen T-Zellen gerichtet sind. Es ist jedoch unbekannt, ob ein ähnlicher Mechanismus beim Menschen zu der beschränkten Verwendung der TCR V-Gene bei der Antwort auf MBP oder andere Antigene führt. Zu Beginn der Analyse der Verwendung des TCR V-Gens wurden 38 T-Zell-Klone (19 von jeder

Gruppe) hinsichtlich der Exprimierung von Vβ-Gen-Produkten unter Verwendung eines Panels von 5 monoklonalen Antikörpern für Vβ5.2, Vβ5.3, Vβ6.7, Vβ8.1 und Vβ12 (Tabelle 22) spezifisch sind, hinsichtlich des Phenotyps festgelegt. Die TCR V-Gen-Exprimierung konnte bei sechs Klonen von allen MS-Spendern positiv festgestellt werden: Zwei von diesen Klonen expremierten Vβ6.7, während die anderen 4 Klone Vβ5.2 exprimierten. Von den Vβ5.2+-Klonen stammt der eine von einem DR2,4 Spender und 3 von einem DR2 homozygoten Spender. Ein zusätzlicher Klon von dem DR2 homozygoten Spender exprimierte eine umarrangierte mRNA für Vβ5.2, was anzeigt, dass bei dieser Person 4/8 analysierte Klone dasselbe TCR Vβ-Gen bei der Antwort auf Hu-MBP verwendet, obwohl jeder eine bestimmte Epitopspezifität aufweist (Tabelle 22).
C. Diskussion
Dieses Beispiel demonstriert klar auf der Klonebene, dass MS-Patienten ein komplexeres und geändertes T-Zell-Erkennungsmuster für immunodominante Hu-MBP-Epitope haben, als dies für normal reagierende Hu-MBP Personen gilt. Diese Daten legen eine verstärkte Exposition gegenüber immunogenen Formen von Hu-MBP bei MS-Patienten dar, wodurch die Wahrscheinlichkeit erhöht wird, dass encephalitogene T-Zellen einmal induziert immerwährend fortbestehen. Die potenzielle Bedeutung der T-Zell-Erkennung von Hu-MBP unter paralytischen Bedingungen beim Menschen, beispielsweise MS muss im Licht der potenten encephalitogenen Funktion von MBP-reaktiven T-Zellen bei Tieren gesehen werden und der zunehmenden Häufigkeit von aktivierten MBP-reaktiven T-Zellen im Blut und der CSF von MS-Patienten (Allegretta, M., et al., Science 247:718 (1990), Link H., et al., Neurology 40(Suppl. 1):283 (1990)).
Die in dieser Studie evaluierten T-Zell-Klone wurden aus Hu-MBP-spezifischen T-Zell-Linien isoliert, die in vitro selektiert waren, um das Auftauchen von Spezifitäten zu ermöglichen, die gegen immunodominante Hu-MBP-Epitope gerichtet sind. Encephalitogene Determinanten zeigen eine Immunodominanz während der Selektion bei den T-Zell-Linien von Ratten und Mäusen mittels des vollen MBP (Bourdette, D., et al., Cell. Immunol. 112:351 (1988), Vandenbark, A.A., et al., J. Immunol. 135:229 (1985)), wobei es wahrscheinlich ist, dass die T-Zellen für immunodominante Hu-MBP-Determinanten unter günstigen Bedingungen auch encephalitogen sein können. In dieser Studie zeigten die immunodominanten Epitope, die von T-Zell-Linien- Antworten abgeleitet wurden, eine signifikante Korrelation mit den Spezifitäten, die durch Klonanalyse identifiziert wurden (7).
Diese Ergebnisse führen dazu, dass die Schlüsse gültig werden, die aus den Liniendaten hinsichtlich der Spezifität abgeleitet wurden und dokumentieren, dass die Klone, die in der Selektionsprozedur überlebten, für die T-Zell-Population, die auf Hu-MBP reagierte, innerhalb der Linien repräsentativ waren.
Jedoch war der Phenotyp der Klone einheitlich CD4+ (mit der Ausnahme von 3 Klonen von einem einzigen normalen Spender), obwohl sämtliche T-Zell-Linien im Wesentlichen gleiche Werte an CD8+-T-Zellen enthielten. Es ist nicht klar, ob diese CD8+-T-Zellen innerhalb der Linien Hu-MBP-spezifisch sind oder ob sie einfach nur durch die verhältnismäßig hohen Werte des den Kulturen zugegebenen IL-2 in die Linien eingeführt wurden. Jedoch war ersichtlich, dass die normalen T-Zell-Linien durchgehend einen höheren Anteil von CD8+-Zellen enthielten als die MS-Linien. Es ist interessant und möglicherweise für die Regulierung der T-Zell-Funktion von Bedeutung, dass einer der CD8+-Klone die MBP-induzierte Proliferation eines CD4+-Klons von demselben normalen Spender inhibieren konnte. Solche regulatorischen CD8+-T-Zellen könnten, wenn sie in erhöhter Anzahl in vivo vorhanden sind, zu dem Ausbleiben der klinischen Erkrankung bei normalen Personen mit Hu-MBP-reaktiven T-Zellen beitragen. Ein kritischer Wert dieser CD8+-T-Zellen in Verbindung mit erhöhten Werten der zugehörigen Suppressorzellen (ähnlich jenen, wie sie in Mäusen beobachtet wurden) (Whitham, R.H., et al., Cell. Immunol. 126:290 (1990) könnte zu der Unfähigkeit beitragen, Hu-MBP-spezifische T-Zell-Linien von nicht mehr als 60% der normalen Spender zu selektieren (Vandenbark, A.A., et al., J. Neurosci. Res. 23:21 (1989)).
Im Gegensatz dazu können T-Zell-Linien von mehr als 80% der MS-Patienten selektiert werden. Von diesen regulatorischen Zelltypen würde nicht erwartet werden, dass sie die Wirksamkeit der Rückgewinnung der MBP-spezifischen T-Zell-Klone beeinflussen, indem die Verdünnung unmittelbar aus dem Blut ohne vorhergehende Linienselektion beschränkt wird, wie dies von anderen berichtet wird (Hafler, D.A., et al. J. Immunol. 139:68 (1987), Richert, J.R., et al., J. Neuroimmunol. 23:55 (1989), Richert, J.R., et al., Ann. Neurol. 26:342 (1989)).
Die T-Zell-Antworten auf Hu-MBP bei MS-Patienten beinhaltet einen weiteren Bereich von Spezifitäten als die Antworten bei normalen Personen (6). Zusätzlich zu den gemeinsamen Epitopen zeigten die T-Zellen von MS-Patienten eine Antwort, die zu der N-terminalen Hälfte von MBP und wenigstens einem Epitop in der C-terminalen Hälfte des Moleküls verschoben ist. Der am besten konsistente Unterschied in der Antwort zwischen MS- und normalen Spendern bestand in dem P1 (Baustein 45–89). Frühere Studien haben gezeigt, dass bei MS in der cerebrospinalen Flüssigkeit (CSF) immunoreaktive Fragmente von Hu-MBP ähnlichem Material vorhanden sind, wobei die dominante antigene Form, die Baustein 45–89 überspannt (Whitaker, J.N., J. Immunol. 129:2729 (1982)). Die erkennbare Konzentration dieses Fragmentes stieg nach einer Verletzung des zentralen Nervensystems in der CSF an, was eine einfache Erklärung für das erhöhte Auftreten von P1-reaktiven T-Zellen bei MS-Patienten liefert. Die Verschiebung der MS-Antwort nach P2 und zu dem 130–149-Epitop innerhalb von P4 konnte auch durch die Freigabe von immunoreaktiven Fragmenten aus dem Hu-MBP während der Demyelination erklärt werden, obwohl MHC-Restriktionswirkungen noch nicht ausgegrenzt werden können. Aus Tierstudien ist es bekannt, dass Langzeitimmunisierung mit MBP ein erweitertes Repertoire von T-Zellen gegen weniger und weniger dominante Kombinationen von MHC- und MBP-Epitopen induziert (Offner, H. et al., J. Exp. Med. 170:355 (1989)). Diese zusätzlichen T-Zell-Spezifitäten können, abhängig von ihrer Fähigkeit, homologes MBP zu erkennen, encephalitogen sein, brauchen dies aber nicht. Die verstärkte Komplexität der Spezifitäten von T-Zellen von MS-Patienten, die auf Hu-MBP reagieren, ist mit der Exposition gegenüber den immunogenen Fragmenten von MBP konsistent, die während der Demyelination freigesetzt werden, und es ist überzeugend, dass die lang andauernde chronische Natur von MS die kontinuierliche Induktion oder Restimulation von encephalitogenen T-Zell-Spezifitäten beteiligt.
Näherungsweise 40% der Hu-MBP-reaktiven T-Zell-Klone, insbesondere der Klone von normalen T-Zell-Linien, reagierte auf keines der Hu-MBP-Fragmente. Eine solche Antwort könnte die Junction-Epitope beteiligen, die die Spaltstellen von Hu-MBP überspannen (beispielsweise die Bausteine 30–55 oder 80–100), durch Spaltung zerstörte konforme Epitope oder isoforme oder posttranslatorische Varianten von Hu-MBP, die während der Reinigung der Spaltfragmente verlorgengeangen sind. Obwohl die Funktion dieser Zellen bei Menschen unklar ist, treten ähnliche Zellen mit großer Häufigkeit (50%) bei Lewis-Ratten auf, die von der EAE genesen sind. Solche T-Zellen übertrugen verzögerte Hypersensitivitätsantworten auf MBP, jedoch nicht EAE oder einen Schutz gegen die EAE.
Sowohl bei MS als auch bei normalen T-Zell-Klonen waren die Antworten überwiegend durch HLA-DR beschränkt, obwohl keine strenge Klassenzugehörigkeit zwischen irgendeinem spezifischen Epitop und einem gegebenen DR-Allel aufgefunden werden konnte. HLA-DR2, das bei MS-Patienten überrepräsentiert ist, war in der Lage, Mehrfachepitope von Hu-MBP zu beschränken und einige Epitope (beispielsweise (149–171) konnten durch unterschiedliche HLA-DR-Allele beschränkt werden. Bei einer früheren T-Zell-Linien-Untersuchung (Chou, Y.K., et al., J. Neurosci. Res. 23:207 (1989)) wurde berichtet, dass HLA-DR Allele auf 26/33 Hu-MBP Epitop-spezifische T-Zell-Antworten beschränkt seien, während HLA-DQ 6/33 Antworten nur bei Patienten beschränkte und HLA-DP die Antwort auf P2 bei einem einzigen normalen Spender beschränkte.
Die vorliegenden Daten von T-Zell-Klonen bestätigen die überwältigende Restriktionsfunktion der HLA-DR-Moleküle bei der Hu-MBP-Erkennung ebenso wie die Fähigkeit eines undefinierten HLA-DP-Allel (von einem anderen normalen Spender, DR7,?/DQw2,3) innerhalb der 1–38-Region von Hu-MBP die Epitope zu beschränken, die durch drei individuelle Klone erkannt werden. Es wurden jedoch keine HLA-DQ beschränkten Klone aufgefunden.
Eine Hauptfrage bei der Verwendung von TCR Vβ-Peptiden zur Regulierung der T-Zell-Antworten bei Menschen ist, ob die MBP-spezifischen T-Zellen einen eingeschränkten Satz von V-Genen verwenden oder nicht. Die vorliegenden Daten, bei denen Antikörper verwendet wurden, die nur für ca. 1/10 des TCR Vβ-Repertoires spezifisch sind, identifizieren definitiv 6/38 Klone, die alle von MS-Patienten stammen. Bei einem HLA-DR2/DQwl homozygoten Spender mit chronisch fortschreitender MS exprimierten 4 von 8 T-Zell-Klone, die für unterschiedliche Hu-MBP-Epitope spezifisch sind, dasselbe Vβ5.2-Gen in den T-Zell-Rezeptor (alle Vβ5.2, phenotypisch positive Klone wurden durch PcR bestätigt), was zum ersten Mal eine Verschiebung der TCR V-Gen-Verwendung bei Menschen bei der Antwort auf Hu-MBP nahelegt. Die Verwendung derselben TCR V-Region bei der Antwort auf unterschiedliche Hu-MBP-Epitope ist ähnlich den MBP-Antworten bei Ratten und Mäusen und zeigt, dass die Wahl des TCR nicht durch das Epitop veranlasst wird.
Ein wichtiger praktischer Teil dieser Beobachtung besteht darin, dass Verschiebungen in dem TCR-Repertoire herausgefunden werden können, ohne die Epitopspezifitäten des MBP-reaktiven Klons zu bestimmen. Tabelle 23 zeigt die PcR-Daten, die demonstrieren, dass die MBP-spezifischen T-Zell-Klone von menschlichen MS-Patienten in ihren TCR Vβ-Gen-Gebrauch verschoben sind. Voll-mRNA wurde von individuellen T-Zell-Klonen extrahiert, die für menschliches MBP bei MS-Patienten und normalen Spendern spezifisch sind und die umarrangierte TCR Vβ-Nachricht wurde durch PcR verstärkt und durch spezifische Sonden identifiziert. Es wurde die bevorzugte Verwendung von Vβ5.2 bei den MS-Patienten MS-1 und MS-2 sowie die bevorzugte Verwendung von Vβ14 bei dem normalen Spender N-1 durch die MBP-spezifischen T-Zell-Klone demonstriert. Dies liefert eine zusätzliche Stütze für die Annahme, dass bei Menschen auch bevorzugt die V-Region-Gene auf Autoantigene wie MBP antworten.
Die Erfindung ist nunmehr vollständig beschrieben und es ist für den Fachmann klar, dass sie innerhalb eines weiten Bereiches äquivalenter Parameter, Konzentrationen und Bedingungen ausgeführt werden kann, ohne das Wesen und den Kern der Erfindung zu verlassen und ohne übermäßige Experimente durchführen zu müssen.
Obwohl diese Erfindung in Verbindung mit speziellen Ausführungsbeispielen beschrieben ist, ist klar, dass sie zu weiteren Modifikationen fähig ist. Diese Anmeldung soll jede Veränderung, Gebrauch oder Adaption abdecken, die im Wesentlichen den Prinzipien der Erfindung folgt und auch alle Abweichungen von dieser Offenbarung umschließen, wie sie in diesem technischen Bereich, auf den sich die Erfindung bezieht, bekannt werden oder zur geläufigen Praxis wird, wie sie auch auf die wesentlichen Merkmale angewendet werden können, die, wie sie hier geoffenbart und in den beigefügten Ansprüchen enthalten sind.

Claims

Peptid aus etwa 15–30 Aminosäuren, das eine Aminosäurensequenz eines T-Zell-Rezeptor-Markers enthält, der für eine immunbezogene Krankheit charakteristisch ist, wobei das Peptid in der Lage ist, einen Schutz gegen die Krankheit zu induzieren und wenigstens einen Teil des zweiten Komplementaritäts-bestimmenden Abschnitts des T-Zell-Rezeptors oder ein funktionales Derivat des Peptids enthält, vorausgesetzt, dass das Peptid nicht die Sequenz Asp-Met-Gly-His-Gly-Leu-Arg-Ile-His-Tyr-Ser-Tyr-Asp-Val-Asn-Ser-Thr-Glu-Lys aufweist.
Peptid nach Anspruch 1 mit einer Peptidsequenz, die einem menschlichen Z-Zell-Rezeptor-Marker entspricht.
Peptid nach Anspruch 1 oder 2, das mit einem Träger oder einem Antikörper konjugiert ist, der ein monoklonaler Antikörper sein kann.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 in einer Mischung mit einem pharmazeutisch verträglichen Exzipienten aufweist.
Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Krankheit eine Autoimmunkrankheit ist, wie rheumatoide Arthritis, adjuvante Arthritis, Myasthenia Gravis, Enzephalomyelitis, multiple Sklerose, Thyroiditis, Diabetes, entzündliche Darmerkrankung oder systemischer erythematoser Lupus.
Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Krankheit eine maligne Krankheit, beispielsweise ein T-Zell-Lymphom ist.
Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung eines Medikaments, um immunbezogene Krankheiten zu verhindern, zu unterdrücken oder zu behandeln, beispielsweise eine Autoimmunkrankheit.
Verfahren zum Auswählen eines Peptids, das eine Aminosäurensequenz eines T-Zell-Rezeptors aufweist, der ein T-Zell-Rezeptor-Marker ist, der für eine immunbezogene Krankheit kennzeichnend ist, wobei das Peptid in der Lage ist, einen Schutz gegen die Krankheit zu induzieren, und zu dem Verfahren die Schritte gehören: (a) dass die T-Zellen aus einem Lebewesen entnommen werden, die für die Krankheit empfindlich sind; (b) dass die T-Zellen aus Schritt (a) in einer Kultur in Anwesenheit einer Autoantigenzubereitung expandiert werden; (c) dass der T-Zell-Rezeptor, der von den expandierten T-Zellen nach Schritt (b) exprimiert wird, identifiziert wird; und (d) dass aus der Aminosäuresequenz dasjenige Peptid ausgewählt wird, das wenigstens ein Teil des zweiten Komplementaritäts-bestimmenden Abschnitts des T-Zell-Rezeptors aufweist, vorausgesetzt, dass das Peptid nicht die Sequenz Asp-Met-His-Gly-Leu-Arg-Leu-Ile-His-Tyr-Ser-Tyr-Asp-Val-Asn-Ser-Thr-Glu-Lys aufweist.
Verfahren nach Anspruch 8, bei dem es zu dem Identifizierungsschritt (c) gehört, dass die Nukleotidsequenz wenigstens eines Teils des Gens bestimmt wird, das für den zweiten Komplementaritäts-bestimmenden Abschnitt codiert.
Verfahren nach Anspruch 8, bei dem es zu dem Identifizierungsschritt (c) gehört, dass die Aminosäuresequenz wenigstens eines Teils des zweiten Komplementaritäts-bestimmenden Abschnitts des T-Zell-Rezeptors bestimmt wird.
Verfahren zum Zubereiten eines Peptids mit einer Aminosäuresequenz eines T-Zell-Rezeptors, der ein T-Zell-Rezeptor-Marker ist, der für eine immunbezogene Krankheit charakteristisch ist, wobei das Peptid in der Lage ist, einen Schutz gegen diese Krankheit zu induzieren, und zu dem Verfahren die Schritte gehören: (a) dass ein Peptid nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10 ausgewählt wird; und (b) dass das Peptid oder ein funktionales Derivat hiervon synthetisiert wird.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem die Synthese eine chemische Synthese oder die Exprimierung einer Nukleotidsequenz ist, die für das Peptid codiert.
Verfahren zum Zubereiten eines polyklonalen Antikörpers, der in der Lage ist, ein Lebewesen gegen eine immunbezogen Krankheit zu schützen, wobei es zu dem Verfahren gehört: (a) dass einem tierischen Lebewesen ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 verabreicht wird; und (b) dass der Antikörper aus einer Körperflüssigkeit des tierischen Lebewesens zubereitet wird.
Verfahren zum Zubereiten eines monoklonalen Antikörpers, der in der Lage ist, ein Lebewesen gegen eine immunbezogene Krankheit zu schützen, wobei es zu dem Verfahren gehört: (a) dass einem tierischen Lebewesen ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 verabreicht wird; (b) dass Milzzellen oder B-Zellen aus dem tierischen Lebewesen entnommen werden; (c) dass die Milzzellen oder die B-Zellen mit einem Fusionspartner der Zell-Linie fusioniert werden, was zur Herstellung einer Hybridomzelle führt, die den monoklonalen Antikörper sezerniert; und (d) dass der sezernierte monoklonale Antikörper aufbereitet wird.
Verfahren nach den Ansprüchen 13 oder 14, bei dem das tierische Lebewesen ein Lebewesen ist, das empfindlich für eine immunbezogene Krankheit ist.
Antikörper, der für ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 spezifisch ist, wobei der Antikörper vorzugsweise ein polyklonaler, ein monoklonaler oder eine Chimere ist.
Antikörper nach Anspruch 16, der mit einem zytotoxischen Wirkstoff konjugiert ist, beispielsweise einem ribosomalen inhibierenden Protein, beispielsweise einer Ricin-A-Kette.
Verwendung eines Antikörpers nach den Ansprüchen 16 oder 17 zur Herstellung eines Wirkstoffs zur Verhinderung, Unterdrückung oder Behandlung einer Autoimmunkrankheit.