ES2112838T5 - Peptidos receptores de celulas t como agentes terapeuticos para enfermedades autoinmunitarias y malignas. - Google Patents

Abstract

SE PRESENTAN PEPTIDOS Y COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE CONTIENEN PEPTIDOS INMUNOGENICOS DE UN RECEPTOR DE CELULAS T MARCADOR (TCR) CARACTERISTICOS DE UNA ENFERMEDAD RELACIONADA CON EL SISTEMA INMUNE, CAPACES DE PREVENIR, SUPRIMIR O TRATAR LA ENFERMEDAD. EN UN ASPECTO PREFERENTE DE LA INVENCION, LA SECUENCIA AMINOACIDA DEL PEPTIDO CORRESPONDE A AL MENOS PARTE DE UNA REGION DETERMINADORA COMPLEMENTARIA (CDR) O A UNA REGION HIPERVARIABLE DEL TCR. TAMBIEN SE PRESENTAN ANTICUERPOS Y/O CELULAS T INMUNOLOGICAMENTE REACTIVAS AL PEPTIDO DEL TCR CAPACES DE PREVENIR, SUPRIMIR O TRATAR UNA ENFERMEDAD RELACIONADA CON EL SISTEMA INMUNE MEDIANTE UNA TRANSFERENCIA PASIVA.

Description

Péptidos receptores de células T como agentes terapéuticos para enfermedades autoinmunitarias y malignas.

Referencia cruzada a solicitud de patente relacionada

Esta es una solicitud de continuación en parte de la patente de EE.UU. Ser. No. 07/467.577, presentada el 19 de Enero de 1990, que es una solicitud de continuación en parte de la patente de EE.UU. Ser. No. 07/382.804, presentada el 19 de Julio de 1989.

Fundamento de la invención Campo de la invención

La invención, en el campo de la inmunología y la inmunoterapia, está dirigida a péptidos y a sus composiciones farmacéuticas que son capaces de prevenir, suprimir o tratar enfermedades relacionadas con el sistema inmunitario tales como enfermedades autoinmunitarias y enfermedades malignas.

Descripción de la técnica anterior

Las enfermedades autoinmunitarias se caracterizan por un ataque indeseado e injustificado por el sistema inmunitario sobre los tejidos del hospedante. Aun cuando el mecanismo del progreso de estas enfermedades no está bien entendido, al menos algunos de los detalles con respecto a la presentación de antígenos en este (y otros) contextos están siendo esclarecidos. Se piensa en la actualidad que los antígenos, incluyendo los autoantígenos, son procesados por células que presentan antígeno (APC) y los fragmentos que resultan se asocian luego con una de las proteínas de la superficie de las células, codificada por el complejo principal de histocompatibilidad (MHC). Como resultado de ello, se dice que el reconocimiento de un antígeno peptídico está "restringido" de MHC. Cuando el complejo de MHC/fragmento de antígeno se une a un receptor complementario en células T (TCR) situado sobre la superficie de un linfocito T, ello conduce a la activación y proliferación del clon de subpoblación de células T que llevan tal TCR particular. Una vez activadas, las células T poseen la capacidad de regular otras células del sistema inmunitario que exhiben el antígeno procesado y de destruir células o tejidos que transportan epítopos del antígeno reconocido.

Una revisión del papel de los TCRs en enfermedades autoinmunitarias llevada a cabo por Acha-Orbea, H., et al. (Ann. Rev. Immunol. 7:371-405 (1989)) ha discutido la enorme variación de TCRs disponible en el sistema inmunitario de un individuo y la generación de esta diversidad mediante la organización génica de la línea germinal y el reordenamiento del DNA que codifica las cadenas \alpha y \beta del TCR. Las cadenas \alpha están codificadas por diversas combinaciones de segmentos génicos de las regiones variable (V), de unión (J) y constante (C). Las cadenas \beta del TCR están codificadas adicionalmente por una diversidad de segmentos génicos de la región (D), y, por tanto, comprenden una secuencia VDJC reordenada, Debido a la exclusión alélica, un clon de células T expresa solamente un tipo de heterodímero de \alpha-\beta del TCR.

Un número creciente de enfermedades humanas han sido clasificadas como de naturaleza autoinmunitaria (véase, Theofilopoulos, A., en: D.P. Stites, et al., compiladores., Basic and Clinical Immunology, Lange Medical Publications, Los Altos, CA, 1988) varios ejemplos de las cuales son la artritis reumatoide (RA), la miastenia grave (MG), la esclerosis múltiple (MS), el lupus eritematoso sistémico (SLE), la tiroiditis autoinmunitaria (tiroiditis de Hashimoto), la enfermedad de Graves, la enfermedad inflamatoria del intestino, la uveorretinitis autoinmunitaria, la polimiositis y ciertos tipos de diabetes. Han sido desarrollados modelos en animales para muchas de estas enfermedades autoinmunitarias humanas. Entre los modelos mejor estudiados se encuentra la encefalomielitis alérgica experimental (EAE, denominada también encefalomielitis autoinmunitaria experimental), un modelo para la MS.

Debido a que se conoce ahora que estas y otras enfermedades autoinmunitarias implican la acción de células T cooperadoras estimuladas por la unión de sus TCR a un complejo MHC/autoantígeno (o no autoantígeno), han sido propuestas estrategias de prevención y/o tratamiento que se basan en la disrupción de interacciones entre el complejo MHC/antígeno y el TCR. Wraith, D.C., et al. (Cell 57: 709-715(1989)), han propuesto enfoques basados en este principio, que incluyen la vacunación con células T totales (como inicialmente ha sido descrito por el laboratorio de I.R, Cohen, discutido más adelante), el bloqueo pasivo utilizando anticuerpos que se unen al TCR, el bloqueo pasivo utilizando anticuerpos que se unen a la parte de MHC del complejo, la administración de anticuerpos reactivos con el alelo marcador de las células T cooperadoras, CD4, y el uso de péptidos que simulan el antígeno de interés y compiten por la unión al MHC o la molécula de TCR.

La proteína básica de la mielina, MBP, es el autoantígeno principal implicado en la EAE y es el candidato principal como encefalitógeno involucrado en la MS.

El grupo de Heber-Katz (Heber-Katz, E., et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 540:576-577 (1988); Owhashi, M., et al., J. Exp. Med. 168:2153-2164 (Dic. 1988) ha analizado la especificidad clara de reconocimiento de epítopos de MBP por células T de rata. Cuando células T de ratas inmunizadas con MBP fueron hibridadas con una línea de linfoma T del ratón y clonadas, el esquema de especificidad clara y el análisis de transferencia Southern del reordenamiento génico de la V_{\beta} de TCR indicaron una respuesta policlonal, aun cuando el 75% de los clones reaccionaron con el determinante encefalitógeno 68-88. Un anticuerpo monoclonal (mAB), designado 10.18, dirigido a un hibridoma encefalitógeno de células T probó ser un antiidiotipo o un anticlonotipo que reaccionaba solamente con clones de células T específicos para el epítopo 68-88 de MBP. El mAB pudo bloquear o invertir la EAE cuando se inyectó junto con el péptido encefalitógeno de la MBP o 5 días después. El mAB 10.18 soluble bloqueó los clones de células T específicos, e inmovilizó el mAb 10.18 que estimulaba su proliferación. Después de la inducción de EAE con MBP, la proporción de células de unión de mAb 10.18 aumentó partiendo de frecuencias inicialmente muy bajas. Los autores llegaron a la conclusión de que las células T 10.18^{+} probablemente representan el repertorio patógeno dominante de las células T de EAE en ratas Lewis. Sin embargo, no se sabía si el mAb 10.18 reconocía una región V o un determinante idiotípico.

La células T que expresan el heterodímero \alpha\beta de TCR pueden inducir anticuerpos específicos de la familia génica V e idiotípicos que pueden regular la función de las células T (Owhashi, M., et al., supra; Gascoigne, N.R.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 84:2936 (1987); Kappler, J.W., et al., Nature 332;35 (1988); Kappler, J.W., et al., Cell 49:263(1987); MacDonald, H.R., et al., Nature 332:40 (1988)). Por ejemplo, los anticuerpos que reconocen la secuencia V_{\beta}8 de TCR han sido eficaces en la prevención y el tratamiento de la autoinmunidad en el ratón y en la rata (Owhashi, M., et al., supra; Acha Orbea, H., et al., Cell 54: 263-273 (1988); Urban, J., et al., Cell 54:577-592 (1988))). La obtención de tales anticuerpos selectivos para productos génicos de la región V ha sido dependiente de la disponibilidad de clones de células T que expresen TCR codificados por la familia génica V relevante, y requiere un procedimiento laborioso de rastreo usando células totales para establecer la especificidad.

Si bien los tratamientos terapéuticos con anticuerpos en los que los anticuerpos están dirigidos a moléculas de MHC y moléculas CD4 han tenido éxito, en general, en diversos modelos en animales de autoinmunidad, estos enfoques pueden ser demasiado inespecíficos y en potencia excesivamente supresores, ya que el 70% de las células T llevan el alelo marcador CD4, y dado que todas las respuestas que ocurren por intermedio de células T y la mayor parte de las respuestas de anticuerpos requieren la presentación de antígeno asociada al MHC.

El laboratorio de I.R. Cohen ha desarrollado un enfoque para el tratamiento inmunoespecífico de la autoinmunidad que utiliza linfocitos T totales vivos o atenuados como vacunas para tratar o prevenir la EAE, la tiroiditis autoinmunitaria experimental (EAT) y la artritis experimental. Este enfoque ha sido revisado por Cohen, I.R., Immunol. Rev. 94:5-21 (1986), que discute varios modelos en animales de enfermedades autoinmunitarias en los que se ha usado vacunación con linfocitos T específicos de la enfermedad para generar efectos profilácticos o terapéuticos. La especificidad clara de la vacunación vino dictada por la especificidad clara del reconocimiento de células T, implicando posible al TCR. Por ejemplo, se encontró que dos líneas diferentes de células T anti-MBP, cada una de ellas reactiva con un epítopo diferente de MBP, vacunaban contra la EAE específicamente inducida por el epítopo particular, lo que indica alguna forma de inmunidad antiidiotípica. Sin embargo, cuando se llevaron a cabo intentos para aislar clones de células T específicos de MBP o específicos de tiroglobulina (en un modelo de tiroiditis) a partir de las líneas de células no clonales, solamente se obtuvieron clones que producían la enfermedad, pero no producían resistencia. Esto conduce al descubrimiento de que la agregación o rigidificación apropiadas de las membranas celulares, o bien mediante presión hidrostática o por reticulación química, proporcionaba células que podían inducir protección más consistentemente. De modo similar, dosis bajas (sub-encefalitógenas) de células específicas de MBP podían inducir también resistencia a la EAE letal. El estado protector fue denominado "contra-autoinmunidad" (counter-autoimmunity). Este estado implica clones de células T que pueden proliferar específicamente en respuesta a las células T vacunantes, pueden suprimir in vitro clones efectores (no específicamente, presumiblemente mediante la liberación de una linfoquina supresora), y pueden transferir de modo adoptivo contra-autoinmunidad in vivo. Tal contra-autoinmunidad va acompañada de respuestas de hipersensibilidad retardada (DH) suprimida para el epítopo específico y prevención o remisión de la enfermedad clínica.

Una dificultad importante con los enfoques anteriores es que requieren el uso de preparaciones biológicas complejas que no comprenden agentes terapéuticos bien definidos. Tales preparaciones soportan la producción de complejos y requisitos de mantenimiento (por ejemplo, la necesidad de esterilidad y de grandes cantidades de medio para producir gran número de células T "de vacuna"), y carecen de reproducibilidad de lote a lote. Las preparaciones de "vacunas" de células T, para ser útiles en el hombre, deben ser tanto autólogas como individualmente específicas, es decir, hechas únicamente a medida de cada uno de los pacientes. Además, la presencia de antígenos adicionales sobre la superficie de tales células T puede dar como resultado una respuesta inmunitaria mas amplia, posiblemente perjudicial, no limitada a los clones deseados de las células T (Offner, H. et al., J. Neuroimmunol. 21:13-22 (1989).

El documento EP-A-0340109 propone el uso de anticuerpos, oligopéptidos o anticuerpos antiidiotípicos relacionados con las regiones variables de un receptor de células T asociado con una enfermedad autoinmunitaria para inhibir la función del receptor de células T.

El documento WO90/11294 propone el uso de células T, receptores de células T o fragmentos de los mismos, como vacunas contra patologías que ocurren con mediación de células T.

Existe, por consiguiente, una gran necesidad, de agentes y de composiciones farmacéuticas que posean las propiedades de especificidad de la respuesta autoinmunitaria considerada diana, capacidad de predicción en su selección, conveniencia y reproducibilidad de preparación, y suficiente definición para permitir una regulación precisa de la dosificación.

Sumario de la invención

Esta invención fue realizada en respuesta a una necesidad clara de agentes terapéuticos y composiciones capaces de prevenir, suprimir o tratar enfermedades relacionadas con el sistema inmunitario, de un modo específico de clones, sin ocasionar supresión generalizada de la inmunidad, como es el caso con la mayor parte de los enfoques inmunoterapéuticos e inmunofarmacológicos actuales. La invención fue desarrollada partiendo del conocimiento de que líneas o clones de células T específicos de autoantígenos, que en realidad median en la enfermedad autoinmunitaria, podían ser convertidos en agentes terapéuticos mediante protocolos de atenuación complejos e inyectados directamente en animales para prevenir o tratar la enfermedad.

Los intentos del inventor para conseguir tal inmunoterapia celular dio resultados menores que óptimos. Cuando se emplean los métodos de atenuación descritos en la técnica anterior, el inventor consiguió niveles variables, impredecibles, de protección, y la inmunidad resultante no estuvo limitada de modo clónico, presumiblemente debido a que las "vacunas" de células totales introducen una diversidad de antígenos.

Con el intento de simplificar y normalizar este enfoque general y conseguir una inmunidad altamente específica en la que solamente estuvieran afectados aquellos clones de células T que reconocieran el antígeno asociado a la enfermedad, el inventor ideó la presente invención. Se reconoció por primera vez por el presente inventor que puede ser sintetizado un péptido inmunógeno que imita una parte de un "alelo marcador" inmunológico asociado con la enfermedad, tal como el TCR de células T implicadas en el proceso de la enfermedad. Inesperadamente, la inmunización de un sujeto con el péptido dirige la respuesta inmunitaria del hospedante contra el "alelo marcador" evitando o suprimiendo con ello el desarrollo de la enfermedad o tratando la enfermedad en curso.

Un sello característico de la invención es un método para seleccionar el péptido a usar para prevenir, suprimir o tratar una enfermedad relacionada con el sistema inmunitario, basado en la identificación de la secuencia de aminoácidos de un TCR marcador asociado con la enfermedad, predecir que segmento de la secuencia de TCR está basado inmunógenicamente en varios algoritmos conocidos, y determinar que sitio o sitios en la estructura del TCR son una diana apropiada para una respuesta inmunitaria lo que dará por resultado protección contra la enfermedad.

Una realización de la invención es un péptido que tiene aproximadamente 15-30 aminoácidos que comprende una secuencia de aminoácidos de un receptor de células T marcador característico de una enfermedad relacionada con el sistema inmunitario, siendo capaz dicho péptido de inducir protección contra dicha enfermedad y comprendiendo al menos parte de la región segunda de determinación de la complementariedad de dicho receptor de células T, o un derivado funcional de dicho péptido, con tal que el péptido no posea la secuencia

Asp-Met-Gly-His-Gly-Leu-Arg-Leu-Ile-His-Tyr-Ser-Tyr-Asp-Val-Asn-Ser-Thr-Glu-Lys,

La invención comprende también el péptido conjugado a un soporte, tal como una secuencia de aminoácidos heteróloga adicional, con objeto de mejorar la inmunogenicidad del péptido.

La invención está dirigida también a una composición farmacéutica que comprende el péptido o su derivado funcional, en mezcla con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Por tanto, la invención proporciona péptidos químicamente definidos y tratamientos terapéuticos que pueden ser aplicados específicamente a enfermedades designadas, relacionadas con el sistema, para interrumpir las respuestas inmunológicas específicas responsables de la inducción o promoción del proceso de la enfermedad.

Las enfermedades para las que la invención es particularmente útil incluyen enfermedades autoinmunitarias tales como la artritis reumatoide, la artritis coadyuvante, la miastenia grave, la encefalomielitis, la esclerosis múltiple, la tiroiditis, la diabetes, la enfermedad intestinal inflamatoria, y el Lupus eritematoso sistémico. La invención está dirigida también a enfermedades malignas, tal como leucemias y linfomas de células T en las que el TCR sirve de marcador de tumores.

Una realización de la invención es un método para seleccionar un péptido que posee una secuencia de aminoácidos de un receptor de células T, en el que dicho receptor de células T es un receptor de células T marcador, característico de un enfermedad relacionada con el sistema inmunitario, siendo dicho péptido capaz de inducir protección contra dicha enfermedad, que comprende las etapas de:

(a)

separar células T de un sujeto susceptible a la enfermedad;

(b)

expandir las células T de la etapa (a) en un cultivo en presencia de una preparación de un autoantígeno;

(c)

identificar el receptor de células T expresado por las células T expandidas de la etapa (b); y

(d)

seleccionar el péptido desde la secuencia de aminoácidos que comprende al menos parte de la región segunda de determinación de la complementariedad de dicho receptor de células T.

\newpage

El TCR puede identificarse mediante el uso de anticuerpos específicos del TCR o determinando la secuencia de aminoácidos del TCR.

La invención proporciona además un método para preparar un péptido que posee la secuencia de aminoácidos de un TCR, en el que dicho receptor de células T es un receptor de células T marcador, característico de una enfermedad relacionada con el sistema inmunitario, siendo dicho péptido capaz de inducir protección contra dicha enfermedad, que comprende las etapas de:

(a)

seleccionar un péptido como se ha descrito anteriormente; y

(b)

sintetizar el péptido o un derivado funcional del mismo.

Otras realizaciones de la invención están dirigidas a anticuerpos policlonales, monoclonales o quiméricos específicos para el péptido de TCR, que son capaces de proteger a un sujeto de una enfermedad relacionada con el sistema inmunitario, y a métodos para preparar tales anticuerpos. También están comprendidos por la invención los anticuerpos conjugados a agentes citotóxicos, incluyendo proteínas ribosómicas de inhibición tales como la cadena A de la ricina.

La invención incluye también el uso de los anticuerpos anteriores en la fabricación de un medicamento para prevenir, suprimir o tratar una enfermedad autoinmunitaria.

Descripción breve de los dibujos

Figura 1. Inhibición específica del péptido de la reactividad de anticuerpos. Antisueros procedentes de 4 ratas inmunizadas o bien con el péptido V\beta8(39-59) de TCR solo o una combinación del péptido de TCR y el autoantígeno GP-S49S derivado de MBP, fueron reunidos y diluidos 40-360 veces. Los antisueros fueron ensayados para determinar la reactividad en medio ELISA directo con 25 ng de péptido unido a pocillos de microplacas. Esta cantidad de péptido es equivalente a 10 pM de V\beta8(39-59) de TCR (peso molecular = 2390 daltons) o 15 pM de GP-549S (peso molecular = 1630 daltons). Se añadieron concentraciones variables de péptidos inhibidores en una gama de 0,005 - 50 \mug/pocillo. Las medidas de la absorbancia fueron determinadas en pocillos triplicados, y se calculó la reactividad como el * de pocillos testigo sin inhibir.

Figura 2. Los anticuerpos para el péptido V\beta8(39-59) de TCR tiñen las células T encefalitógenas V\beta8+. Timocitos normales (A y C) o células de la línea T específicas de GP-S49S (B y D) fueron incubadas con anticuerpos de conejo para V_{\beta}8(39-59) de TCR, seguido de un anticuerpo que facilita IgG anti-conejo de ratón y anticuerpo de IgG anti-ratón de cabra marcado con fluoresceína. Se llevó a cabo un análisis de tinción por citometría de flujo usando un citofluorógrafo Coulter Epics C. A y C representan trazados de puntos de 10.000 células que muestran el tamaño de las células frente a la intensidad de la fluorescencia; B y D representan los histogramas correspondientes. La intensidad de la fluorescencia de células de línea T teñidas con el anticuerpo anti-V_{\beta}8 (39-59) de TCR (>90% teñidas) está aumentada en comparación con el 5% de timocitos normales que se tiñeroncon este anticuerpo. Ambos, timocitos y células de línea T incubados con IgG de conejo normal como testigo para la IgG anti-V_{\beta}8 (39-59) de TCR mostraron niveles de fondo de tinción (línea de puntos en la caja D).

Figura 3. Prevención supresión y tratamiento de EAE con 50 \mug de péptido V_{\beta}8-39-59 de TCR/CFA. Se inyectaron ratas s.c. con el péptido de TCR 40 días antes, al mismo tiempo, o al comienzo de la enfermedad 12 días después de la inducción de EAE con 50 \mug de GP-MBP/CFA.

Figura 4. Supresión de la EAE con 50 \mug de péptido V_{\beta}8-39-59 de TCR administrado i.d. en la oreja al mismo tiempo o en los días 7 u 11 después de la inducción de la EAE con 50 \mug de GP-MBP/CFA.

Figura 5. Tratamiento de la EAE con 10 ó 50 \mug de péptido V_{\beta}8-39-59 de TCR administrado i.d. en la oreja a la iniciación de los signos clínicos (día 12) después de la inducción de la EAE con 50 \mug de GP-MBP/CFA.

Figura 6. Especificidad de péptido de líneas de células T específicas de MPB humana a partir de pacientes con MS y pacientes normales.

Figura 7. Porcentaje de respuesta de proliferación total de líneas de células T dirigida a cada péptido en comparación con el porcentaje de clones totales que responden a cada uno de los péptidos.

Figura 8. Respuestas celulares a los péptidos V_{\beta}8- y V_{\beta}14 de TCR procedentes de ratas inmunizadas con péptido de TCR y curadas de EAE. Se da la DTH en mm/100 y la proliferación en CPM/1000, ambas habiendo restado el ruido de fondo.

Figura 9. Tratamiento de EAE recidivante con péptido el V_{\beta}17 de TCR.

Descripción de las realizaciones preferidas

Las composiciones, métodos y productos de esta invención son aplicables a usos humano y veterinarios.

Los péptidos de la presente invención comprenden secuencias de aproximadamente 13-30 aminoácidos que son inmunógenos, es decir, son capaces de inducir una respuesta inmunitaria cuando se inyectan en un sujeto.

Por "derivado funcional" se entiende un "fragmento", "variante", "análogo" o "derivado químico" del péptido, cuyos términos y expresiones se definen más adelante.

Ha de entenderse que la secuencia de aminoácidos que comprende el péptido de esta invención puede ser usada sola o unida a, o contenida dentro de la secuencia de, un péptido mayor. El péptido mayor puede incluir secuencias de péptidos no afines, tales como una proteína soporte usada para mejorar la inmunogenicidad del oligopéptido de TCR. Tales soportes son bien conocidos en la técnica e incluyen proteínas heterólogas, tales como, por ejemplo, hemocianina de lapa de "ojo de llave" (keyhole), albúmina de suero bovino, toxoide tetánico y semejantes. También se encuentra incluido dentro del alcance de esta invención el péptido conjugado a un anticuerpo, y el péptido conjugado a una toxina. Las toxinas de esta invención incluyen la proteína ribosómica inhibidora, tal como, por ejemplo, la cadena A de la ricina o toxina de Pseudomonas.

Tal como se emplea en esta memoria, "TCR marcador" alude a un TCR que es característico de una enfermedad especificada relacionada con el sistema inmunitario, tal como una enfermedad autoinmunitaria o una enfermedad maligna (es decir, un cáncer).

La expresión "enfermedad relacionada con el sistema inmunitario" tal como se usa en esta memoria, alude a una enfermedad en la que el sistema inmunitario está implicado en la patogénesis de la enfermedad, o en la que la estimulación apropiada del sistema inmunitario puede dar como resultado protección contra la enfermedad. Un ejemplo preferido de una enfermedad relacionada con el sistema inmunitario a la que va dirigida esta invención es una enfermedad autoinmunitaria. Ejemplos no limitativos de las enfermedades autoinmunitarias contempladas por esta invención son la artritis reumatoide (RA), la miastenia grave (MG), la esclerosis múltiple (MS), el lupus eritematoso sistémico (SLE). la tiroiditis autoinmunitaria (tiroiditis de Hashimoto), la enfermedad de Graves, la enfermedad intestinal inflamatoria, la uveorretinitis autoinmunitaria, la polimiositis y ciertos tipos de diabetes.

Por tanto, un TCR marcador para la MS es un TCR que es capaz de unir el complejo entre auto MHC y el fragmento de MBP (o el fragmento de MBP solo), comprendiendo el MBP la característica autoantigénica principal de esta enfermedad. En otras enfermedades autoinmunitarias, otros TCRs sirven de marcadores, dado que son específicos para el complejo entre moléculas del MHC y los autoantígenos implicados en estas enfermedades. Por ejemplo, en la miastenia grave (MG), se cree que el autoantígeno es el receptor nicotínico de la acetilcolina (AChR). Por consiguiente un TCR identificable que se una al AChR en el contexto de auto MHC (o directamente) y sea expresado por células T reactivas con el AChR, que median en la enfermedad, es un "TCR marcador" para la MG. Los expertos pueden reconocer que la determinación de un TCR marcador y de péptidos inmunógenos puede conseguirse con el ejercicio de una habilidad rutinaria, usando métodos de rastreo bien conocidos en la técnica, cuando las enseñanzas de la presente invención son completamente apreciadas.

También indicadas como enfermedades relacionadas con el sistema inmunitario tal como se usa en la presente invención se encuentran las malignidades en las que la célula tumoral transporta un marcador tumoral, tal como un antígeno tumoral, capaz de ser reconocido y respondido por el sistema inmunitario. El TCR puede servir de marcador tumoral en la leucemia de células T o células de linfoma de células T.

En un sujeto afectado con una enfermedad relacionada con el sistema inmunitario o susceptible a ella, la introducción del péptido portador de la secuencia de aminoácidos de una parte del TCR marcador da como resultado la generación de una respuesta inmunitaria dirigida al TCR y protección contra la enfermedad relacionada con el sistema inmunitario.

Mediante el término "protección" contra la enfermedad tal como se emplea en esta memoria, se entiende "prevención", "supresión" o "tratamiento" de la enfermedad. "Prevención" implica la administración de la composición protectora antes de la inducción de la enfermedad. Así pues, por ejemplo, en el modelo de animal, EAE, la administración con éxito de una composición protectora antes de la inyección del encefalitógeno que induce la enfermedad, da como resultado la "prevención" de la enfermedad.

"Supresión" implica la administración de la composición después de acontecimiento inductivo pero antes de la aparición clínica de la enfermedad. De nuevo, usando el ejemplo de EAE, la administración con éxito de una composición protectora después de la inyección del encefalitógeno, pero antes de la aparición de síntomas neurológicos, comprende la "supresión" de la enfermedad.

"Tratamiento" implica la administración de la composición protectora después de la aparición de la enfermedad. En el ejemplo de la EAE, la administración con éxito de una composición protectora después de la inyección del encefalitógeno y después de haberse desarrollados signos clínicos, comprende el "tratamiento" de la enfermedad.

Ha de entenderse que en medicina humana, no siempre es posible distinguir entre "prevención" y "supresión" dado que el acontecimiento o acontecimientos inductivos últimos pueden ser desconocidos, estar latentes, o no tener el paciente la certeza hasta mucho después de la ocurrencia del acontecimiento o acontecimientos. Por consiguiente, es común usar el término "profilaxis" como distinto al de "tratamiento" para incluir tanto "prevención" como "supresión" como se han definido en esta memoria. El término "protección" tal como se emplea en esta memoria, se entiende que incluye "profilaxis".

Para la realización de la invención dirigida a enfermedades autoinmunitarias, la respuesta inmunitaria del sujeto está dirigida a los TCRs particulares que marcan aquellas células T que intervienen en el proceso autoinmunitario, y los péptidos conforme a la invención son capaces, por tanto, de interferir con la unión del complejo MHC/antígeno (o el antígeno solo) necesarios para iniciar o propagar la respuesta autoinmunitaria.

En general, la secuencia peptídica representa una parte del propio TCR y debe ser inmunógena, según se define más adelante, correspondiendo a una parte al menos de la región segunda de determinación de la complementariedad (CDR2) del heterodímero \alpha\beta de TCR. Asimismo incluidos dentro del alcance de esta invención están péptidos que corresponden a una parte al menos de la región segunda de determinación de la complementariedad de las cadenas \gamma de TCR y \delta de TCR o sus homólogas en el heterodímero \gamma\delta (véanse Strominger, J.L., Cell 57:895-898 (1989); y Clevers, H. et al., Ann Rev. Immunol. 6:629-662 (1988)).

Las CDRs del TCR son definidas por analogía con la estructura de la molécula de inmunoglobulina en la que las CDRs comprendían las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de las cadenas pesadas o ligeras que establecían contacto con el antígeno y que constituían partes cruciales del sitio de unión del antígeno. Se opina que las tres CDRs del TCR participan en la unión al antígeno y el MHC (Davis, M.M. et al., Nature 334:395-402 (1988); Claverie, J.M., et al., Immun. Today 10:10-14 (1989)). Dirigiendo la respuesta inmunitaria del sujeto o los anticuerpos protectores de esta invención contra la región segunda de determinación de la complementariedad del "TCR, marcador" aumenta la posibilidad de interrumpir los acontecimientos necesarios de unión o reconocimiento entre la célula T asociada con la autoinmunidad y el autoantígeno y/o el MHC.

Un "fragmento" del péptido de la presente invención alude a cualquier subconjunto de la molécula, es decir, un péptido más corto.

Una "variante" del péptido alude a una molécula substancialmente similar o bien al péptido entero o bien a un fragmento del mismo. Péptidos variantes pueden ser preparados convenientemente mediante síntesis química directa del péptido variante, usando métodos bien conocidos en la técnica.

Alternativamente, variantes de la secuencia de aminoácidos del péptido pueden ser preparadas mediante mutaciones en el DNA que codifica el péptido sintetizado. Tales variantes incluyen por ejemplo, deleciones de restos, o inserciones o substituciones de restos dentro de la secuencia de aminoácidos. Cualquier combinación de deleción, inserción y substitución puede llevarse a cabo también para llegar a la construcción final, con tal que la construcción final posea la actividad deseada. Evidentemente, las mutaciones que puedan hacerse en el DNA que codifica el péptido variante no deben alterar el marco de lectura y preferiblemente no han de crear regiones complementarias que pudieran producir estructuras secundarias de mRNA (véase la Publicación de la patente europea No. EP 75.444)

Al nivel genético, estas variantes son preparadas ordinariamente mediante mutagénesis de nucleótidos dirigida al sitio, en el DNA que codifica la moléculas del péptido, produciendo con ello DNA que codifica la variante, y expresando después de esto el DNA en cultivos celulares recombinantes. Las variantes ponen de manifiesto típicamente la misma actividad biológica cualitativa que el péptido no variante.

La preparación de un péptido variante conforme esto se consigue preferiblemente mediante mutagénesis, específica del sitio, del DNA que codifica una versión variante o no variante preparadas con anterioridad, de la proteína o péptido de TCR. La mutagénesis específica del sitio permite la producción de variantes de péptidos mediante el uso de secuencias específicas de oligonucleótidos que codifican la secuencia de DNA de la mutación deseada, así como también un número suficiente de nucleótidos adyacentes, para proporcionar una secuencia cebadora de tamaño y complejidad secuencial suficientes para formar un dúplex estable sobre ambos lados de la unión de la deleción que está siendo atravesada. La técnica de mutagénesis específica del sitio es bien conocida en la técnica, como ha sido puesta de ejemplo por Adelman et al., DNA 2:183 (1983). Los vectores típicos útiles en la mutagénesis dirigida al sitio, incluyen vectores tales como el fago M13, por ejemplo, según ha sido descrito por Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, Walton, A., compilador, Elsevier, Amsterdam (1981). Estos fagos pueden adquirirse en el comercio con facilidad y su uso es generalmente bien conocido por los expertos en la técnica. Alternativamente, vectores plasmídicos que contienen un origen de replicación de un fago de una sola cadena (Veira et al., Meth. Enzimol. 153:3 (1987), pueden ser empleados para obtener DNA de cadena simple.

En general, la mutagénesis dirigida al sitio, conforme con lo que aquí se indica, se lleva a cabo obteniendo en primer lugar un vector de cadena simple que incluye dentro de su secuencia una secuencia de DNA que codifica el péptido relevante. Se prepara, en general sintéticamente, un cebador de oligonucleótido que lleva la secuencia mutada deseada, por ejemplo, mediante el método de Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 75:5765 (1978). Este cebador es sometido después a hibridación de extremos complementarios con el vector de cadena simple que contiene la secuencia proteínica, y sometido a enzimas de polimerización del DNA, tales como fragmento de Klenow de polimerasa I de E. coli, para completar la síntesis de la cadena que lleva la mutación. Por tanto, la secuencia mutada y la segunda cadena llevan la mutación deseada. Este vector heterodúplex se usa luego para transformar células apropiadas y se seleccionan los clones que incluyen los vectores recombinantes que llevan el ordenamiento de secuencia mutada. La región proteínica mutada puede ser separada y colocada en un vector apropiado para la producción de proteína, en general un vector de expresión del tipo que puede ser empleado para la transformación de un hospedante apropiado.

Un ejemplo de una inserción terminal incluye la fusión de una secuencia señal, tanto si es heteróloga como si es homóloga respecto a la célula hospedante, en el extremo N terminal de la molécula del péptido, facilitando la secreción de la molécula del péptido maduro desde los hospedantes recombinantes.

Otro grupo de variantes son aquellos en los que al menos un resto de aminoácido de la molécula del péptido y, preferiblemente, solo uno, ha sido separado e insertado un resto diferente en su lugar. Tales substituciones son llevadas a cabo preferiblemente conforme a la siguiente lista cuando se desea modular finamente las características de la molécula de un péptido.

Resto	Substituciones	Resto	Substituciones
original	ejemplares	original	ejemplares
Ala	gly; ser	Leu	ile; val
Arg	lys	Lys	arg; gln; glu
Asn	gln; his	Met	leu; tyr; ile
Asp	glu	Phe	met: leu; tyr
Cys	ser	Ser	thr
Gln	asn	Thr	ser
Glu	asp	Trp	tyr
Gly	ala; pro	Tyr	trp; phe
His	asn; gln	Val	ile; leu
Ile	leu; val

Se llevan a cabo cambios sustanciales en las propiedades funcionales o inmunológicas seleccionando substituciones que son menos conservadores que las que figuran en la lista anterior, es decir, seleccionando restos que difieren más significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura de la cadena principal del péptido en la zona de la substitución, por ejemplo, como una configuración laminar o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el conjunto de la cadena lateral. Las substituciones que son esperadas en general para aquellas en las que (a) la glicina y/o la prolina está sustituida por otro aminoácido o está suprimida o insertada; (b) un resto hidrófilo, por ejemplo, serilo o treonilo, sustituye a un resto hidrófobo (o está sustituido por él), por ejemplo, leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo o alanilo; (c) un resto de cisteína sustituye a cualquier otro resto (o está sustituido por el); (d) un resto que tiene un cadena lateral electropositiva, por ejemplo, lisilo, arginilo o histidilo, sustituye a un resto que tiene una carga electronegativa (o es sustituido por él), por ejemplo, glutamilo o aspartilo; o (e) un resto que tiene una cadena lateral voluminosa, por ejemplo, fenilalanina, sustituye a uno que no tiene tal cadena lateral (o es sustituido por él), por ejemplo, glicina.

La mayor parte de las deleciones e inserciones y sustituciones en particular, no es de esperar que produzcan cambios radicales en las características de la molécula del péptido. No obstante, cuando es difícil predecir el efecto exacto de la sustitución, deleción o inserción antes de llevarla a cabo, los expertos en la técnica podrán apreciar que el efecto puede ser evaluado mediante análisis de rastreo rutinarios. Por ejemplo, se efectúa típicamente una variante mediante mutagénesis dirigida al sitio del ácido nucleico que codifica la molécula del péptido, expresión del ácido nucleico variante en cultivos celulares recombinantes, y, opcionalmente, purificación a partir del cultivo celular, por ejemplo, mediante adsorción de inmunoafinidad sobre una columna de anticuerpo anti-péptido (para absorber la variante uniéndola a al menos un epítopo).

La actividad del lisado de células o de la variante del péptido purificada se somete luego a rastreo en un ensayo de rastreo adecuado para la característica deseada. Por ejemplo, un cambio del carácter inmunológico de la molécula del péptido, tal como unión a un anticuerpo dado, es medido mediante un inmunoensayo de tipo competitivo. Los cambios en el reconocimiento de células T del péptido variante es medido mediante un ensayo DH in vivo o un ensayo de proliferación de células T in vitro. Las modificaciones de propiedades del péptido tales como estabilidad redox o estabilidad térmica, hidrofobicidad, susceptibilidad a la degradación proteolítica o la tendencia a agregarse con soportes o a multímeros, son ensayadas por métodos bien conocidos por los expertos en la técnica.

Un "análogo" de un péptido alude a una molécula no natural sustancialmente similar o bien a la molécula entera o a un fragmento de la misma.

Un "derivado químico" de un péptido de esta invención contiene restos químicos adicionales que no forman normalmente parte del péptido. Modificaciones covalentes de los péptidos están incluidas dentro del alcance de esta invención. Tales modificaciones pueden ser introducidas en la molécula haciendo reaccionar restos de aminoácidos diana del péptido con un agente orgánico de derivatización que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o restos terminales.

Los restos cisteinilo se hacen reaccionar lo más comúnmente con \alpha-haloacetatos (y las aminas correspondientes), tales como ácido cloroacético o cloroacetamida, obteniéndose derivados carboximetílicos o carboxiamidometílicos. Los restos cisteinilo también son derivatizados por reacción con bromotrifluoroacetona, ácido \alpha-bromo-\beta-(5-imidozolil)propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-piridilo, disulfuro de metil-, 2-piridilo, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol, o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.

Los restos histidilo son derivatizados por reacción con procarbonato de dietilo a pH 5,5-7,0 debido a que este agente es relativamente específico para la cadena lateral del histidilo. El bromuro de para-bromofenacilo también es útil; la reacción se lleva a cabo preferiblemente en cacodilato de sodio 0,1 M a pH 6,0.

Los restos lisinilo y amino terminales se hacen reaccionar con anhídrido succínico u otros anhídridos de ácidos carboxílicos. La derivatización con estos agentes tiene el efecto de invertir la carga de los restos lisinilo. Otros reactivos adecuados para derivatizar restos que contienen amino en posición \alpha incluyen imidoésteres tales como picolinimidato de metilo; fosfato de piridoxal; piridoxal; cloroborohidruro; ácido trinitrobencenosulfónico; O-metilisourea; 2,4-pentanodiona y reacción con glioxilato catalizada con transaminasa.

Los restos arginilo son modificados por reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre los que se encuentran el fenilglioxal, la 2,3-butanodiona, la 1,2-ciclohexanodiona y la ninhidrina. La derivatización de restos de arginina requiere que la reacción sea llevada a cabo en condiciones alcalinas, debido al alto pk_{a} del grupo funcional de guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina así como también el grupo amino en posición épsilon de la arginina.

La modificación específica de los restos tirosilo per se ha sido estudiada extensamente, con interés particular en la introducción de marcadores espectrales en restos tirosilo por reacción con compuestos de diazonio aromáticos o tetranitrometano. Lo más comúnmente, se usan el N-acetilimidizol y el tetranitrometano para formar especies de O-acetiltirosilo y 3-nitroderivados, respectivamente. Los restos tirosilo son yodados usando ^{125}I o ^{135}I para preparar proteínas marcadas para usar en radioinmunoensayos, siendo adecuado el método de la cloramina T.

Los grupos laterales carboxilo (aspartilo o glutamilo) son modificados selectivamente por reacción con carbodiimidas (R'-N-C-N-R') tales como la 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-(4-etil)carbodiimida o la 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)carbodiimida. Además, los restos aspartilo y glutamilo se convierten en restos asparaginilo y glutaminilo por reacción con iones amonio.

Los restos glutaminilo y asparaginilo son desamidados frecuentemente para dar los restos glutamilo y aspartilo correspondientes. Alternativamente, estos restos son desamidados bajo condiciones ácidas suaves. Cualquiera de las dos formas de estos restos cae dentro del alcance de esta invención.

La derivatización con agentes bifuncionales es útil para reticular el péptido a una matriz de soporte insoluble en agua o a otros soportes macromoleculares. Los agentes de reticulación comúnmente usados incluyen, por ejemplo, el 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, el glutaraldehído, ésteres de la N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con el ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales incluyendo ésteres disuccinimidílicos tales como el 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato), y maleimidas bifuncionales tales como el bis-N-maleimido-1,8-octano. Los agentes de derivatización tales como el metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato proporcionan intermedios fotoactivables que son capaces de formar reticulaciones en presencia de la luz. Alternativamente, se emplean matrices insolubles en agua reactivas tales como hidratos de carbono activados con bromuro de cianógeno y los sustratos reactivos descritos en las patentes de EE.UU. Nos. 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; y 4.330.440, para la inmovilización de proteínas.

Otras modificaciones incluyen la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de los restos serilo o treonilo, la metilación de los grupos amino en posición \alpha de las cadenas laterales de la lisina, arginina e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties, W.H. Freeman and Co., San Francisco, páginas 79.86 (1983)), la acetilación del grupo amino terminal, y, en algunos casos, la amidación de los grupos carboxilo del C terminal.

Tales restos derivatizados pueden mejorar la solubilidad, absorción, semivida biológica y semejantes del péptido. Los restos pueden, alternativamente, eliminar o atenuar cualquier efecto secundario indeseable del péptido y semejante. Restos capaces de intervenir en tales efectos están descritos, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, Mack Publishing Co., Easton, PA (1980)

Enfermedad maligna

También son susceptibles a métodos de la invención linfomas y leucemias. Los linfomas y muchas leucemias son tumores formados por linfocitos que sufren una proliferación incontrolada (es decir, son malignos). Puesto que varias clases de leucemias y linfomas están compuestas de células T que derivan de un precursor único de células T malignas, todas las células tumorales llevan el mismo TCR, que sirve por tanto de "marcador tumoral" que puede ser la diana de las composiciones protectoras de esta invención. De modo semejante, las inmunoglobulinas superficiales pueden servir de marcadores tumorales para leucemias o linfomas de células B.

Una realización de la invención está dirigida a la mejora de una respuesta antitumoral, haciendo como diana el TCR de aquellas células T que reaccionan frente al "marcador tumoral" en vez del propio marcador tumoral. Por tanto, puede usarse una respuesta inmunitaria dirigida hacia el TCR en una célula T específica del tumor, para regular la respuesta antitumoral en beneficio del hospedante.

En efecto, podrá apreciarse que cualquier enfermedad que implique una célula que tenga una molécula superficial que diferencie tal célula de otras células del mismo tipo histológico y de células de un tipo histológico diferente, contiene un "marcador" característico y será susceptible de tratamiento mediante composiciones que inducen una respuesta inmunitaria para el "marcador", alterando con ello la actividad de la célula que lleva el "marcador".

Según la presente invención, la propia molécula del marcador puede ser relativamente no inmunógena; ello requiere, como mínimo, un epítopo antigénico característico. Este epítopo por sí mismo puede ser intrínsecamente inmunógeno, o puede hacerse inmunógeno mediante tratamientos bien conocidos en la técnica, tales como conjugación con una molécula portadora inmunógena. Así, un epítopo de una proteína de marcador, o bien como péptido libre o en forma que la hace inmunógena, es capaz de atraer una respuesta de anticuerpos, una respuesta inmunitaria por intermedio de células, o ambas, según se ha concebido en la invención. Por consiguiente, una composición que incorpora no la proteína total del marcador, sino, una región peptídica específica que sea inmunógena o antigénica, comprenderá una preparación útil para tratar una enfermedad relacionada con el sistema inmunitario caracterizada por este
marcador.

Identificación de células T que llevan TCR marcador

La presente invención utiliza un péptido sintético que representa al menos parte de la región segunda de determinación de la complementariedad del TCR que tiene importancia biológica en la unión ligando/MHC, y que es característica de una familia génica V del TCR. Por consiguiente, la invención proporciona un enfoque mucho más simple para obtener anticuerpos o células T específicos de la región V del TCR. Usando otras secuencias procedentes de la misma cadena \beta para inducir un espectro de anticuerpos o células T específicos de la región V del TCR, los expertos en la materia serán capaces de elaborar los mapas de epítopos del TCR expuestos, y establecer la importancia de estas regiones en la unión ligando/MHC, con el ejercicio de la experiencia rutinaria.

TCRs marcadores asociados con una enfermedad dada son identificados usando técnicas conocidas. Un enfoque genético usando pacientes que se sabe padecen MG o MS ha sido descrito por Oksenberg, J.R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:988-992 (1989). Secuencias de la cadena \beta de TCR apropiada han sido obtenidas mediante análisis genómico usando polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción encontrados en familias que poseen un predominio de la enfermedad autoinmunitaria particular, según ha sido descrito por Seboun, E., et al., Cell 87:1095-1100 (1989); Burns, F.R., et al., J. Exo. Med. 169:27-39 (1989)).

Por tanto podrá apreciarse que, para los fines de la presente invención, la determinación del TCR marcador asociado con una enfermedad autoinmunitaria y la identificación de péptidos que comprenden una secuencia inmunógena no requieren que el autoantígeno sea caracterizado. Es suficiente que (a) la enfermedad autoinmunitaria implique una respuesta inmunitaria por intermedio de células T, como parte necesaria del proceso patógeno, y (b) la enfermedad tenga una diana específica de órganos, tejidos o células. En efecto, como se sabe en la técnica (véase, por ejemplo, Theofilopoulos, A., supra), la enfermedad autoinmunitaria puede no implicar un autoantígeno en absoluto en la etapa inductiva, sino que, puede representar una respuesta a un antígeno exógeno, tal como un antígeno bacteriano o viral, que tenga reacción cruzada con autoantígenos, o de como resultado una respuesta inmunopatológica dirigida al antígeno exógeno presente en el hospedante.

Células T que reconocen un autoantígeno o un antígeno asociado con una enfermedad autoinmunitaria (tales como ciertos antígenos virales o bacterianos) son clonadas, y pueden fusionarse con una célula de inmortalización, tal como línea de células T de largo plazo, una línea de linfoma de células T o un hibridoma de células T y se desarrollan en cultivos. Las células cultivadas sirven como origen de cDNA que codifica el TCR apropiado. Tal cDNA es clonado y expresado por métodos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Maniatis, T., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1982)).

Además de los enfoques anteriores, podrá apreciarse que puede obtenerse ventaja de modelos en animales para identificar los loci de la región variable del TCR que están asociados con la enfermedad autoinmunitaria. Los animales que son susceptibles a cualquiera de varias enfermedades autoinmunitarias, ejemplos no limitativos de los cuales incluyen la EAE, la MG experimental, la tiroiditis autoinmunitaria experimental, la artritis coadyuvante, la artritis inducida por colágeno, y semejantes, tienen un locus variable del TCR particular asociado con la enfermedad que puede ser identificado in vitro.

Mediante la expresión "susceptible a una enfermedad" se entiende un estado en el que el animal posee un gen o genes que se sabe están asociados con la enfermedad, aumentando con ello el riesgo de que el individuo con el tal gen o tales genes pueda desarrollar tal enfermedad en comparación con la población general. Los genes que se sabe están asociados con enfermedades autoinmunitarias, por ejemplo, incluyen genes de MHC (en especial clase II), genes V de inmunoglobulina, genes V de TCR, y semejantes. El término "susceptible" está destinado también a incluir aquellos individuos que tienen realmente la enfermedad. Aun cuando una correlación completa entre una enfermedad autoinmunitaria y el uso de un TCR particular ni se espera ni es necesaria para poner en práctica con éxito la presente invención, altas correlaciones de aproximadamente 60-70% han sido encontradas para la presencia o expresión de un gen de una región variable particular y susceptibilidad a la enfermedad autoinmunitaria en animales.

En una realización alternativa de esta invención, células T aisladas procedentes de seres humanos que son susceptibles a una enfermedad autoinmunitaria, y en particular individuos susceptibles que padecen la enfermedad autoinmunitaria, son expandidas por cultivo. Técnicas para la expansión de células T han sido descritas por Zamvil et al., Nature 317:355-358 (1985), y Nature 324:258-260 (1986).

En una realización que emplea este método, linfocitos de sangre periférica del paciente son separados y estimulados con el autoantígeno o un péptido específico que deriva de él o que está relacionado con él, capaz de estimulación comparable a la del autoantígeno. El autoantígeno (o péptido relacionado) se añade a los cultivos de linfocitos durante varios días. En una realización, las células son estimuladas con autoantígeno durante 5-6 días. En otras realizaciones, las células son estimuladas durante períodos de tiempo más largos. El tiempo necesario para la estimulación es función de la proporción de células reactivas en la muestra de sangre, el estado de activación de estas células, y la potencia de la preparación de estimulación, y es determinable con facilidad por los expertos en la técnica. Después de realizar el cultivo bajo condiciones selectivas, aproximadamente 5 x 10^{5} células viables son aisladas y reestimuladas con aproximadamente 3 x 10^{7} células autológas que presentan antígeno (irradiadas para prevenir su proliferación, tal como con aproximadamente 2500-4500 rad) y aproximadamente 20 \mug/ml del autoantígeno (o péptido relacionado). Aproximadamente 7 días más tarde, se recogen las células viables y se someten a clonación mediante dilución limitativa en presencia de aproximadamente 10^{3} - 10^{6} células que presentan antígeno, por ejemplo, aproximadamente 5 x 10^{5} células que presentan antígeno, e IL-2 humana o combinaciones crudas o puras de factores de crecimiento de linfocitos (tales como, por ejemplo, IL-4). Las células de tal línea de células T son expandidas y cultivadas en matraces de cultivo de tejidos durante aproximadamente una a dos semanas. Tales líneas pueden ser reestimuladas de modo múltiple con células que presentan antígeno, preparaciones de autoantígenos, e IL-2. La reestimulación puede ser llevada a cabo típicamente una vez por semana. Si se desea, tales células T pueden ser clonadas mediante cualquiera de muchos métodos conocidos en la técnica, tal como, por ejemplo, dilución limitante o retirando células desde colonias que crecen en agar blando, en general aproximadamente 2 días después de la reestimulación.

En otra realización, linfocitos procedentes de un órgano o un fluido corporal son cultivados en primer lugar en presencia de IL-2. En estas condiciones, tendrá lugar selección de células ya activadas y sólo crecen tales células. Seguidamente, tales células T son estimuladas con células que presentan antígeno y una preparación autoantígena. Usando este enfoque, células T específicas de MBP procedentes de médula espinal de ratas con EAE, pueden ser expandidas selectivamente in vitro.

Tal como se usa en la presente invención, el término "autoantígeno" no está destinado a ser limitante de una macromolécula definida o conocida. Por ejemplo, en el caso de diabetes de tipo I, el antígeno particular asociado con células de la isleta pancreática (o células beta) que es el desencadenante o antígeno diana de la respuesta autoinmunitaria por intermedio de células T, es desconocido. Para la presente invención, el autoantígeno usado para estimular células in vitro, según se ha descrito anteriormente, puede comprender células totales de la isleta pancreática, preparaciones crudas de membrana derivadas de tales células, componentes de membrana purificados parcialmente, o, cuando está identificado, el autoantígeno diabetógeno. Lo mismo es cierto para otras enfermedades autoinmunitarias para las que un autoantígeno únicos no ha sido identificado todavía, incluyendo la tiroiditis de Hashimoto, la artritis en la que el autoantígeno no es colágeno, la enfermedad de Sjogren, la polimiositis, la arterioesclerosis, y semejantes. Los expertos en la técnica podrán apreciar que en tanto el resto inmunógeno a que responden las células T se encuentre presente en la preparación estimuladora, los métodos de la invención pueden ser llevados a cabo según se ha descrito.

La presencia de células T reactivas específicas de autoantígenos en la población de células T clonadas, expandidas, puede determinarse con facilidad ensayando la aptitud de las células para ser activadas en presencia del autoantígeno. Muchos ensayos se encuentran disponibles, y son bien conocidos en la técnica, para medir acontecimientos precoces o tardíos en el proceso de activación de células T. Ejemplos de tales métodos incluyen, aun cuando no se limitan a ellos, la proliferación de células T (que puede medirse por la absorción de timidina radiomarcada), la secreción de interleuquina-2, la movilización del calcio intracelular, la translocación de enzimas particulares de membranas implicadas en el metabolismo del inositol-fosfato, y cambios en la expresión de moléculas de la superficie de las células (que puede determinarse mediante citometría de flujo).

El TCR expresado por un clon de células T que responde a un antoantígeno particular puede ser identificado usando anticuerpos específicos de TCR, o bien policlonales, o bien monoclonales o quiméricos (véase más adelante) que son específicos para un segmento variable del TCR, para detectar expresión superficial, empleando técnicas de microscopía de fluorescencia, citometría de flujo, inmunocitoquímica, u otros métodos conocidas en la técnica. Tales anticuerpos han sido descritos para varias regiones V de las cadenas \alpha \beta del TCR (véanse, por ejemplo, Owhashi, M., et al., supra; Gascoigne, N.R.J., et al., supra; Kappler, J.W., et al., 1987, 1988 (supra); y MacDonald, H.R., supra).

Alternativamente, el DNA o mRNA del clon de células T puede ser sondado directamente, o después de amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (Synha et al., Science 239:1026 (1988); Saiki et al., Nature 324:163 (1986), por hibridación específica con sondas de ácido nucleico para las diversas familias génicas del TCR, usando métodos de hibridación bien conocidos en la técnica. La secuencia del TCR o una parte de la misma, pueden obtenerse directamente después partiendo del DNA o mRNA reordenado, amplificado.

La expresión de un TCR particular puede identificarse también determinando la secuencia de ácido nucleico que codifica al menos parte del TCR, por ejemplo, después de clonar el gen V del TCR, o determinando la secuencia de aminoácidos de al menos parte de una proteína de TCR. Será evidente que cualquiera de los enfoques antes citados, o enfoques adicionales conocidos por los expertos en la técnica, darán por resultado la identificación del TCR expresado en una célula T, o un clon o una línea de células T. Esta información es necesaria para la selección de una secuencia de aminoácidos que comprenda el péptido o preparaciones farmacéuticas de esta invención.

Donde no ha sido identificado autoantígeno especifico, la oligoclonalidad de células T en la región anatómica asociada con la enfermedad puede usarse como base para el enriquecimiento de células T reactivas. Por ejemplo, células asociadas únicamente con las artritis reumatoide se encuentran en el líquido sinovial de la articulación; células asociadas únicamente con la MS se encuentran en el líquido cerebroespinal (CSF); y células T asociadas con la enfermedad se infiltran en el tejido tiroideo en la tiroiditis de Hashimoto y en la enfermedad de Graves. En estos casos, se aíslan células T desde la posición anatómica de interés, y las células son expandidas en cultivo como se ha descrito anteriormente. (Véanse también, Londei, M. et al., Science 228:85-89 (1985); Londei, M. et al. Acta Endocrinol. 115 (suplemento 281):86-89 (1987); Stamenkovic, I. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:1179-1183 (1988); Lipoldova, M. et al. J. Autoimmun. 2:1-13 (1989); Oksenberg, J.R., et al., supra). Se aísla el DNA o mRNA de tales células, se prepara el cDNA, y se establecen las diferencias de las secuencias de cDNA que codifican los loci variables del TCR, por comparación de sujetos aquejados con sujetos sin aquejar. Como una alternativa para expandir las células por cultivo, DNA celular o, preferiblemente, cDNA obtenido a partir de mRNA, pueden obtenerse directamente de células T aisladas del sujeto, y expandirse el ácido nucleico mediante la reacción en cadena de la polimerasa, PCR, como anteriormente.

Los antígenos asociados con varias enfermedades autoinmunitarias de modelos humanos y de animales, son conocidos en la actualidad. El colágeno de tipo II y la proteína de choque térmico de 65 kD del Mycobacterium tuberculosis son antígenos asociados con la artritis reumatoide; el AChR está asociado con la MG y con la miastenia grave alérgica experimental (EAMG) que pueden inducirse en ratones. Se sabe que la tiroglobulina es el antígeno asociado con la tiroiditis alérgica experimental (EAT) en el ratón. Una enfermedad similar, la tiroiditis de Hashimoto, implica una respuesta inmunitaria a un antígeno sobre las células foliculares de tiroides. En la enfermedad de Graves, la respuesta inmunitaria está dirigida al receptor de tirotropina sobre células de tiroides. Se sabe que la proteína básica de la mielina (MBP) y proteína proteolípida (PLP) están asociadas con la encefalomielitis alérgica experimental (EAE) en el ratón y la rata. La EAE es un modelo reconocido para la esclerosis múltiple en el hombre.

Por consiguiente, los expertos en la técnica podrán apreciar que la presente invención está dirigida, en un aspecto, a la identificación de péptidos útiles para la prevención o tratamiento terapéutico de enfermedades del hombre y de animales incluyendo las citadas anteriormente, pero no limitándose a ellas.

Selección de péptidos antigénicos

Una realización importante de esta invención comprende el método combinado de identificar un TCR asociado con una enfermedad autoinmunitaria, determinar que secuencia oligopeptídica incluyendo al menos parte de la región segunda de determinación de la complementariedad del TCR es tanto inmunógena como importante para la acción de las células T en el proceso de la enfermedad, sintetizar tal péptido, y usarlo como agente terapéutico.

Regiones de secuencias de importancia del TCR son identificadas para realizar la síntesis, sobre la base de sus propiedades antigénicas o inmunógenas predichas. Mediante el término "inmunógeno" se entiende la capacidad de un péptido para inducir una respuesta inmunitaria, o bien por intermedio de células T, o bien por un anticuerpo, o ambas. Mediante el término "antigénico" se entiende la capacidad de un péptido para ser reconocido, en forma libre, por anticuerpos y en el contexto de moléculas MHC en el caso de células T específicas de antígenos. Las regiones de una proteína o un péptido que son, presumiblemente, inmunógenos o antigénicos para células T, se identifican, por ejemplo, usando los enfoques y algoritmos descritos por Margalit, H. et al., (J. Immunol. 138:2213-2229 (1987) y Rothbard, J.B. et al., EMBO J. 7:93-100 (1988)). El enfoque de Margalit et al., se basa en el análisis de sitios antigénicos inmunodominantes de células T cooperadoras que conducen al desarrollo de un algoritmo basado en un modelo helicoidal anfipático, en el que se postula que los sitios antigénicos son hélices con una cara predominantemente polar y otra cara predominantemente apolar. El enfoque de Rothbard et al., reconoce motivos similares a epítopos reconocidos preferentemente por clones de células T cooperadoras o células T citotóxicas, que pueden predecir con exactitud zonas dentro de las secuencias proteínicas que son capaces de ser reconocidas por moléculas MHC de clase I y II, suponiéndose tal reconocimiento como necesario para la inmunogenicidad y antigenicidad de células T. Las regiones del TCR que tienen importancia inmunorreguladora para los fines de esta invención, incluyen al menos una parte de la región segunda de determinación de la complementariedad.

El uso del enfoque anterior para seleccionar secuencias peptídicas para usar en el tratamiento de la EAE en ratas ejemplifica el éxito de este enfoque. Por ejemplo, se predijo mediante los algoritmos anteriores, que un péptido que comprende 16 aminoácidos que corresponde a la CDR1 del TCR marcador para la EAE en ratas Lewis, V\beta8 (25-41), no era inmunógeno para células T. En efecto, este péptido no induce inmunidad de células T y no protege de la EAE a las ratas Lewis. Se predijo que un péptido que corresponde a la CDR1 de una cadena \beta diferente de TCR, que no está asociada con la EAE, V\beta14(25-41), era inmunógeno para las células T, y sin duda se encontró que inducía inmunidad de células T en ratas Lewis, pero, como era de esperar, no protegía de la EAE. De modo semejante, se predijo que el péptido de la CDR2, V\beta14(39-59), correspondiente a un TCR no asociado con la EAE, era inmunógeno, e inducía inmunidad, pero, de nuevo, no comunicaba protección contra la EAE. Conforme a la invención, se predijo que el péptido asociado con la CDR2 del TCR de importancia, V\beta8(39-59), era tanto inmunógeno como protector en la EAE y, sin duda, se puso de manifiesto que era así (véanse Ejemplos, más adelante).

El tamaño del péptido seleccionado para usar en esta invención viene determinado en gran medida por el requisito de inmunogenicidad, si bien manteniendo la estructura mínima del epítopo de tal modo que una célula T o un anticuerpo específico para el péptido pueda reconocer y reaccionar con el TCR sobre una célula T intacta. Por ejemplo, los péptidos de esta invención, con objeto de que sean suficientemente inmunógenos y posean una alta probabilidad de incluir el epítopo relevante del TCR que pueda conducir a modulación de la actividad de las células T, tienen del orden de aproximadamente 15-30 aminoácidos, aun cuando se contemplan también fragmentos de péptidos de diferente longitud. El uso con éxito de un péptido de TCR de 21 aminoácidos presente sobre la cadena \beta del TCR, asociado con la EAE en ratas, para tratar la EAE conforme a los métodos de esta invención, está ampliamente demostrado en los Ejemplos que siguen.

La inmunogenicidad de péptidos útiles en la presente invención puede ser rastreada por métodos bien conocidos, tales como el uso de una respuesta de DH en un animal. En una respuesta tal, se "sensibiliza" un animal mediante inyección de una dosis apropiada de un antígeno, típicamente por vía subcutánea (SC), con frecuencia con un adyuvante, tal como el adyuvante de Freund completo (CFA). En general, aproximadamente 5-15 días más tarde, la respuesta es "provocada" por enfrentamiento del animal, típicamente por vía intradérmica (ID), con una dosis apropiada del antígeno, típicamente en solución salina u otro tampón. La respuesta se aprecia 24-48 horas más tarde. Ejemplos no limitativos de métodos de ensayo que miden DH incluyen el tamaño del eritema (enrojecimiento) y endurecimiento (tumefacción) en el lugar de la inyección del antígeno, tumefacción de la oreja, tumefacción de la planta de la pata, tumefacción de la cola, acumulación de yododesoxiuridina marcada con ^{125}I, inyectada sistémicamente, en el sitio del enfrentamiento, acumulación de proteína sérica radiomarcada (tal como albúmina) inyectada por vía intravenosa (IV) en el sitio del enfrentamiento y acumulación de células inflamatorias marcadas, tales como linfocitos o neutrófilos, inyectadas por vía IV, en el sitio del enfrentamiento. Por ejemplo, una respuesta de tumefacción de la oreja por enfrentamiento por vía ID apropiado en el pabellón de la oreja de aproximadamente 0,15-0,25 mm, y de preferencia, aproximadamente 0,20 mm (en una rata Lewis) representa una respuesta de DH positiva. Los expertos en la técnica comprenderán que variaciones en el tamaño y dosis del péptido, vía de sensibilización o provocación de DH, soportes usados, adyuvantes usados, etc. pueden afectar al tiempo y extensión de la respuesta de DH.

Para que un péptido se considere inmunógeno, como se pretende aquí, una dosis de aproximadamente 10-200 \mug por animal, y de preferencia, aproximadamente 25-100 \mug del péptido por animal, ha de ser capaz de sensibilizar a un animal para una respuesta de DH. Además, en un animal sensibilizado, una dosis de aproximadamente 1-100 \mug, y de preferencia, aproximadamente 5-50 \mug, del péptido es capaz de provocar una respuesta de DH por enfrentamiento por vía ID.

Síntesis de péptidos y ensayo

Los péptidos deseados, con secuencias determinadas según se ha descrito anteriormente, se preparan usando técnicas estándar de síntesis que incluyen conjugación secuencial de aminoácidos en solución y en fase sólida, y producción recombinante en hospedantes procarióticos o eucarióticos. La verificación de que el péptido preparado es inmunógeno, puede determinarse con facilidad usando una reacción de DH en un animal (por ejemplo, ratón o rata), según se ha descrito anteriormente. El péptido se administra por vía subcutánea, y el animal es enfrentado aproximadamente 9-14 días después por vía ID en el pabellón de la oreja. La respuesta de tumefacción de la oreja, medida 24 ó 48 horas después del enfrentamiento, sirve como una medida simple y fidedigna de la presencia de inmunidad al péptido con intermedio de células T.

La verificación de la aptitud del péptido inmunógeno para modular realmente la autoinmunidad, puede ser obtenida usando un modelo apropiado en un animal, teniendo en cuenta las diferencias entre especies de los péptidos relacionados con el TCR. Por ejemplo, aun cuando se prefiere usar una secuencia que representa la CDR2 de un TCR marcador humano para tratar seres humanos, la región correspondiente del TCR marcador para el modelo de enfermedad en animal se usa en la enfermedad del animal.

Sistemas de modelos en animales que pueden ser usados para rastrear la eficacia de los péptidos para proteger contra o tratar la enfermedad, están disponibles, según se ha discutido anteriormente. Como es lógico, los péptidos idénticos pueden no ser eficaces en el hombre ya que pueden no corresponder a un sitio apropiado del TCR humano asociado con la enfermedad, o pueden no ser suficientemente inmunógenos en el hombre. Ha de entenderse pueden requerirse modificaciones de la secuencia del péptido delineado en un modelo particular de animal al objeto de tratar sujetos pertenecientes a otras especies, incluyendo el hombre. Por tanto, la verificación de que, por ejemplo, una secuencia peptídica particular asociada a la CDR2, es eficaz para proteger contra una enfermedad particular puede ser obtenida en estos modelos, lo que lleva a predicciones de que la secuencia humana correspondiente pudiera ser un candidato preferido como tratamiento terapéutico eficaz por el péptido para el hombre. La determinación de la secuencia del TCR correspondiente en el hombre (o en especies animales no humanas diferentes), usando los enfoques anteriormente descritos, permite así modificar el péptido para usar en el hombre (u otras especies).

La exposición que sigue es una lista no exclusiva de modelos de enfermedades en animales de enfermedades autoinmunitarias humanas con las que un péptido del TCR puede ser evaluado por su aptitud para modificar la enfermedad, y para inducir anticuerpos y células T capaces, por transferencia, de modificar la enfermedad. El lupus eritematoso sistémico(SLE) se ensaya en ratones susceptibles según ha sido descrito por Knight et al., J. Exp. Med. 147:1653 (1978) y Reinertsen et al., N. Eng. J. Med. 299:515 (1978). La MG se ensaya en ratones hembra SJL/J induciendo la enfermedad con proteína de AChR soluble procedente de otras especies, según ha sido descrito por Lindstrom, J., et al., en Adv. Immunol. 42:233-284 (1988). La artritis es inducida en una raza de ratones susceptible mediante inyección de colágeno de Tipo II, según ha sido descrito por Stuart, J.M., et al., Ann. Rev. Immunol. 2:199-218 (1984). La artritis adyuvante es inducida en ratas susceptibles mediante inyección de proteína termosensible Micobacteriana, según ha sido descrito por Van Eden, W., et al., Nature 331:171-173 (1988). La tiroiditis es inducida en el ratón por administración de tiroglobulina, según ha sido descrito por Maron, R., et al., J. Exp. Med. 152:1115-1120 (1980). La diabetes melitus dependiente de insulina (IDDM) ocurre de modo natural o puede ser inducida en ciertas razas de ratones, como ha sido descrito por Kanasawa et al., Diabetologia 27:113 (1984). Puede hacerse que otras razas de ratón manifiesten esta enfermedad por transferencia de linfocitos desde esta raza.

La EAE en el ratón y la rata sirve de modelo de la MS en el hombre. En este modelo, la enfermedad de desmielinación es inducida por administración de proteína básica de mielina (MBP) o proteína proteolípida (PLP), o virus de Theiler, según ha sido descrito por Paterson, P.Y., Textbook of Immunopathology (Mischer et al., compiladores), Grune and Stratton, Nueva York, páginas 179-213 (1986); McFarlin, D.E., et al., Science 179:478-480 (1973); y Satoh, J., et al., J. Immunol. 138:179-184 (1987).

Para medir el beneficio preventivo, supresor o terapéutico de las composiciones de esta invención en el hombre, se usan ciertas medidas clínicas de resultado. En la MS, por ejemplo, los parámetros cuantitativos incluyen: (a) incapacidad clínica, (b) grado de exacerbación en estudio, y (c) carga de placa cerebral por imágenes mediante resonancia magnética (MRI) (que es un parámetro reciente importante usado para evaluar pacientes con MS). Estas medidas implican examen a la ciega por separado o examen no a la ciega mediante el médico que atiende a la enfermedad. Medidas neuropsicológicas de deterioro cognitivo se usan como un determinante independiente de incapacidad. La incapacidad clínica se mide típicamente mediante la Escala de McAlpine, la Calificación de Kurtzke, o una modificación de la Calificación de Kurtzke denominada la Calificación Expandida del Estado de Incapacidad (EDSS). Una mejora de 1/2 unidad en la EDSS (Intervalo de 1-9) se considera significativa. Una medida clínica, la capacidad de los pacientes para pasear, es clasificada mediante el Ambulation Index (Indice de paseo), en el que una mejora de 1 o más unidades se considera significativa. Estas medidas clínicas son bien conocidas en la técnica y han sido descritas con detalle por McAlpine, D., et al., en Multiple Sclerosis, Livingston Press, Edimburgo (1955); Binken, P.J. et al., Handbook of Clinical Neurology, Volumen 9, Amsterdam-North Holland Publishers, Amsterdam (1970); y Field, E.J. et al., Multiple Sclerosis: A Critical Review, M.M.T.P Press, Ltd., Lancaster, Inglaterra, (1977)

La medida de la mejora de RA, por ejemplo, se basa en un cierto número de puntos finales clínicos primarios, que incluyen la resolución o reducción de la tumefacción, la reducción en la duración de la rigidez matutina, la velocidad de sedimentación de los eritrocitos disminuida y/o la proteína C reactiva disminuida, la resolución de condiciones asociadas con procesos reumatoides tales como nódulos reumatoides, y la reducción en los recuentos de linfocitos. Los puntos finales secundarios incluyen la disminución de la fatiga y la mejora del estado general determinado por el paciente y el médico. Los resultados clínicos están divididos en los siguiente: (a) Respuesta completa - superior a un 90% de disminución de la tumefacción de las articulaciones, sensibilidad, y rigidez matutina; (b) Respuesta acusada - 50-90% de disminución de la tumefacción de las articulaciones, sensibilidad y rigidez matutina; (c) Respuesta moderada - 30-50% de disminución de la tumefacción de las articulaciones, sensibilidad y rigidez matutina,; y (d) Sin respuesta - \leq 30% de disminución de la tumefacción de las articulaciones, sensibilidad, y rigidez matutina.

Medidas similares que permiten evaluar los efectos preventivos, supresores o de tratamiento, de los péptidos, anticuerpos, células T y otras composiciones de la presente invención en enfermedades adicionales en relación con el sistema inmunitario, son conocidas de los expertos en la técnica.

Inmunidad pasiva

Además del uso de un péptido del TCR para la inmunización activa, realizaciones adicionales de la presente invención implican anticuerpos específicos para el péptido del TCR, para la transferencia pasiva de inmunidad anti-TCR. La inmunidad pasiva con intermedio de anticuerpos, puede implicar cualquiera de varios mecanismos efectores tales como, por ejemplo, la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos, o la citotoxicidad dependiente de complemento. Alternativamente, se usa el anticuerpo para suministrar un agente tóxico de un modo específico, tal como la cadena A de la ricina, por ejemplo.

Para la vacunación pasiva, se inyecta al animal sujeto el péptido apropiado, según se describe más adelante. y se cosechan los linfocitos de sangre periférica o linfocitos procedentes de otro órgano, tales como un nódulo linfático de drenaje. Pueden ser recuperadas células B desde la población celular inicial tomada del animal inmunizado con el péptido del TCR, e inmortalizadas por fusión con asociados de fusión de la línea celular usando técnicas estándar para obtener hibridomas para producir anticuerpos monoclonales específicos del péptido del TCR. Los hibridomas que producen anticuerpos apropiados son rastreados mediante inmunoensayos convencionales, tales como ensayos ELISA directos, para determinar la reactividad con el antígeno del péptido del TCR o con las células T relevantes.

Anticuerpos monoclonales (mAbs) para antígenos específicos, tales como los péptidos del TCR de esta invención, pueden ser obtenidos mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature 256:495-497 (1975), y la patente de EE.UU. No. 4.376.110. Tales anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina, incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD, y cualquiera de sus subclases. Alternativamente, pueden prepararse anticuerpos a partir de antisueros policlonales tomados de animales inmunizados con el péptido del TCR, sometidos a diversos esquemas de purificación conocidos en la técnica, y usarse directamente para la transferencia pasiva de inmunidad anti-TCR.

Los anticuerpos monoclonales que tienen origen en roedores son "humanizados" enlazando una molécula de cDNA que codifica la región V del mAb, con DNA que codifica la región constante humana, usando cualquiera de varios enfoques, descritos por Cabilly et al., Patente de EE.UU. No. 4.816.567 (28/3/89) y la Publicación de la patente europea, EP125023 (14/11/84); Taniguchi et al., Publicación de la patente europea EP171496 (19/2/86); Morrison et al., Publicación de la patente europea EP173494 (5/3/86); Neuberger et al., Publicación PCT WO8601533 (13/3/86); Kudo et al., Publicación de la patente europea. EP184187 (11/6/86); Robinson et al., Publicación PCT WO 8702671 (7/5/87); Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3273-3277 (1984); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984); Boulianne et al., Nature 312:643-646 (1984); Morrison, Science, 229:1202- 1207 (1985); Neuberger et al., Nature 314:268-270 (1985); Takeda et al., Nature 314:452-454 (1985); Tan et al., J. Immunol. 135:3564-3567 (1985); Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Sahagan et al., J. Immunol. 137:1066-1074 (1986); Sun et al., Hybridoma 5 (Supp. 1): S17-S19 (1986); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218 (1987); Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443 (1987); Liu et al., J. Immunol. 139:3521-3526 (1987); Better, M., et al., Science 240:1041-1043 (20 de Mayo de 1988); y Horwitz, A.H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8676-8682 (1988)).

El método preferido de producción de anticuerpos quiméricos combina cinco elementos: (1) aislamiento de RNA mensajero (mRNA) a partir de una línea de hibridoma de células B del ratón que produce el anticuerpo monoclonal, clonación y producción de cDNA desde la misma; (2) Preparación de una genoteca de cDNA de longitud total a partir de mRNA purificado, desde la que los segmentos génicos de la región (V) variable apropiados de los genes de las cadenas ligera (L) y pesada (H) pueden ser (i) identificados con sondas apropiadas, (ii) secuenciados, y (iii) hechos compatibles con un segmento génico de la región (C) constante; (3) Preparación de módulos de segmento génico de la región C mediante preparación de cDNA y clonación; (4) Construcción de secuencias completas de codificación de las cadenas H o L por ligamiento de los segmentos génicos de la región V de inmunoglobulina específicos, clonados, descritos en (2), anterior, a módulos de segmentos génicos de la región C humana, clonados, descritos en (3); y (5) Expresión y producción de cadenas quiméricas L y H en hospedantes seleccionados, incluyendo células procarióticas y eucarióticas.

Muchos sistemas de vectores se encuentran disponibles para la expresión de genes de las cadenas H y L clonados en células de mamífero (véase Glover, D,M,. compilador, DNA Cloning. Vol. II, páginas 143-238, IRL Press, 1985<9. Diferentes enfoques pueden ser seguidos para obtener anticuerpos H_{2}L_{2} completos. Es posible coexpresar cadenas H y L en las mismas células para conseguir asociación intracelular y ligamiento de las cadenas H y L en anticuerpos H_{2}L_{2} tetrámeros completos. La coexpresión puede tener lugar usando o bien el mismo o diferentes plásmidos en el mismo hospedante. Los genes de ambas cadenas H y L pueden ser colocados en el mismo plásmido, que después es transfectado en células, seleccionando para ello directamente células que expresen ambas cadenas. Alternativamente, pueden transfectarse primeramente células con un plásmido que codifica una cadena, por ejemplo la cadena L, seguido de transfección de la línea celular resultante con un plásmido de la cadena H que contiene un segundo alelo marcador seleccionable. Las líneas celulares que producen moléculas H_{2}L_{2} por cualquiera de ambas rutas pueden ser transfectadas con plásmidos que codifican copias adicionales de las cadenas H, L, o H más L, en conjunción con alelos marcadores seleccionables adicionales, para generar líneas celulares con propiedades mejoradas, tales como mayor producción de moléculas de anticuerpos H_{2}L_{2} acopladas, o estabilidad mejorada de las líneas celulares transfectadas.

Los anticuerpos quiméricos de esta invención poseen tanto la especificidad de reconocimiento de TCR del mAb de ratón como las propiedades biológicas de anticuerpos humanos, que incluyen resistencia a aclaramiento en el hombre y mucho menor inmunogenicidad (lo que permite múltiples tratamientos).

Los anticuerpos anti-péptido de TCR (policlonales, monoclonales y quiméricos) de esta invención pueden ser usados terapéuticamente como inmunoconjugados (véase, para realizar una revisión: Dillman, R.O., Ann Int. Med. 111:592-603 (1989)). Ellos pueden ser acoplados a proteínas citotóxicas, incluyendo proteínas ribosómicas inhibidoras tales como la cadena A de la ricina, toxina de Pseudomonas, y toxina diftérica, así como también otras proteínas tales como el factor de la necrosis tumoral. Toxinas conjugadas a anticuerpos u otros ligandos, son conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Olsnes, S. et al., Immunol Today 10:291-295 (1989)). Un ejemplo adicional de un anticuerpo conjugado tal es XomaZyme^{R}-CD5 Plus, que es un mAb anti-CD5 conjugado a la cadena A de la ricina. Esta preparación es eficaz para la profilaxis y uso terapéutico en la enfermedad injerto-frente a-hospedante, y de la artritis reumatoide refractaria humana. Este anticuerpo conjugado a toxina particular es específico para la mayoría de los linfocitos T y un subconjunto de linfocitos B. Las células que tienen el alelo marcador CD5 decaen rápidamente en respuesta al tratamiento. Dado que el anticuerpo para un péptido del TCR reaccionará con una proporción mucho más pequeña de linfocitos totales, mayores dosis de un anticuerpo anti-TCR conjugado a la cadena A de la ricina serán toleradas por los pacientes, o al revés, serán eficaces dosis más bajas. Las dosis eficaces de un anticuerpo monoclonal conjugado con la cadena A de la ricina para un péptido de TCR se encuentran en el intervalo de aproximadamente 0,005 a 0,5 mg/kg/día, estando las dosis preferidas en el intervalo de aproximadamente 0,05 a 0,2
mg/kg/día.

Los anticuerpos anti-péptido de TCR, de esta invención, pueden ser conjugados a tipos adicionales de restos terapéuticos incluyendo, pero no limitándose a ellos, radionucleidos y fármacos citotóxicos, para tratar individuos con autoinmunidad o con una enfermedad maligna o linfoproliferativa. Ejemplos no limitativos de radionucleidos que pueden ser copulados a anticuerpos y proporcionados in vivo a sitios de antígenos, incluyen ^{212}Bi, ^{131}I, ^{186}Re, y ^{90}Y. Tales radionucleidos ejercen su efecto citotóxico irradiando localmente las células, lo que conduce a diversas lesiones intracelulares, como es bien sabido en la técnica de la radioterapia.

Fármacos citotóxicos que pueden ser conjugados a anticuerpos y usados seguidamente para tratamiento terapéutico in vivo incluyen, aun cuando no se limita a ellos, daunorrubicina, doxorrubicina, metotrexato, y mitomicina C. Los fármacos citotóxicos interfieren con procesos celulares críticos incluyendo DNA, RNA y síntesis de proteínas. Para una exposición más completa de estas clases de fármacos que se conocen en la técnica, y sus mecanismos de acción, véase Goodman, A.G., et al., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 7ª Ed., Macmillan Publishing Co., (1985).

El tratamiento de un individuo usando los anticuerpos, fragmentos o derivados de esta invención, comprende administrar por vía parenteral una dosis única o múltiple del anticuerpo, fragmento o derivado del mismo. La dosis eficaz es función del anticuerpo individual, la presencia y naturaleza de un agente terapéutico conjugado y el sujeto y su estado clínico, y puede variar desde aproximadamente 10 ng/kg de peso hasta aproximadamente 100 mg/kg de peso. La vía de administración puede incluir las vías IV, SC, intramuscular, intrapulmonar, intraperitoneal (IP), intranasal, intratecal, intradérmica, transdérmica u otras vías conocidas.

Formulación de péptidos

El uso terapéutico preclínico y clínico de la presente invención para el tratamiento de enfermedades o de trastornos, será mejor realizado por los expertos en la materia,empleando principios aceptados de diagnosis y tratamiento. Tales principios son conocidos en la técnica, y están establecidos, por ejemplo, por Braunwald, E. et al., compiladores., en Harrison's Principles of Internal Medicine, 11ª Ed. McGraw-Hill, editor, Nueva York, N.Y. (1987).

Los péptidos y composiciones de la presente invención, o sus derivados funcionales, son bien adecuados para la preparación de composiciones farmacéuticas. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser administradas a cualquier animal que pueda experimentar los efectos beneficiosos de las composiciones de la invención. Principalmente entre tales animales está el hombre, aun cuando la invención no está destinada a quedar limitada
a él.

Las composiciones farmacéuticas de las presente invención pueden ser administradas por cualesquiera medios que consigan su finalidad pretendida. Por ejemplo, la administración puede ser efectuada por las vías parenteral, subcutánea, intravenosa, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica, o bucal. Alternativa, o simultáneamente, la administración puede ser efectuada por vía oral. Los péptidos y composiciones farmacéuticas pueden ser administrados por vía parenteral, mediante inyección de bolo o mediante perfusión gradual a lo largo del tiempo.

La dosis administrada dependerá de la edad, sexo, salud y peso del receptor, tipo de tratamiento coincidente, si hay alguno, frecuencia de tratamiento, y la naturaleza del efecto deseado. Los intervalos de dosis para la administración de las composiciones de la presente invención son lo suficientemente amplios para producir el efecto deseado, por el que, por ejemplo, se consigue una respuesta inmunitaria al péptido, medida mediante DH o la producción de anticuerpos, y la enfermedad relacionada con el sistema inmunitario es significativamente prevenida, suprimida o tratada. Las dosis no deben ser tan grandes que causen efectos secundarios adversos, tales como reacciones cruzadas indeseadas, inmunosupresión generalizada, reacciones anafilácticas y semejantes.

Las dosis preferida para el hombre varían entre aproximadamente 0,001-25 mg/kg de peso.

Además de los péptidos de la invención que por sí mismos son farmacológicamente activos, las composiciones farmacéuticas pueden contener excipientes farmacéuticamente aceptables que comprenden excipientes y materiales auxiliares que facilitan el tratamiento de los compuestos activos para dar preparados que pueden ser usados farmacéuticamente. Las composiciones preferidas comprenden la inclusión de un coadyuvante, tal como alumbre u otros coadyuvantes conocidos en la técnica (Véanse, por ejemplo, Warren, H.S, et al., Ann. Rev. Immunol. 4:369-388 (1986); Chedid, L., Feder. Proc. 45:2531-2560 (1986)).

Para mejorar la liberación o la bioactividad, los péptidos pueden ser incorporados en liposomas usando métodos y compuestos conocidos en la técnica.

Las preparaciones que pueden ser administradas por vía oral en forma de comprimidos y cápsulas, las preparaciones que pueden ser administradas por vía rectal, tales como supositorios, y las preparaciones en forma de soluciones para inyección o introducción oral, contienen desde aproximadamente 0,001 a aproximadamente 99 por ciento, de preferencia desde aproximadamente 0,01 a aproximadamente 95 por ciento, de compuesto o compuestos activos, junto con el excipiente.

Son excipientes adecuados, en particular, cargas tales como sacáridos, por ejemplo, lactosa o sacarosa, manitol o sorbitol, preparaciones de celulosa y/o fosfatos de calcio, por ejemplo fosfato tricálcico o hidrogenofosfato de calcio, así como aglutinantes, tales como pasta de almidón, usando, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, y/o polivinilpirrolidona.

Otras preparaciones farmacéuticas que pueden ser usadas por vía oral incluyen cápsulas "push-fit" (cápsulas duras) de gelatina, así como también cápsulas blandas, herméticamente cerradas, hechas con gelatina y un plastificante tal como glicerina o sorbitol. Las cápsulas "push-fit" pueden contener los compuestos activos en forma de gránulos que pueden mezclarse con cargas tales como lactosa, aglutinantes tales como almidones, y/o lubricantes tales como talco o estearato de magnesio, y, opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los compuestos activos son, preferiblemente, disueltos o suspendidos en líquidos adecuados, tales como aceites grasos o parafina líquida. Además, pueden añadirse estabilizantes.

Las preparaciones farmacéuticas posibles que pueden ser usadas por vía rectal incluyen, por ejemplo, supositorios que consisten en una combinación de uno o más de los compuestos activos con una base de supositorios. Son bases de supositorios adecuadas, por ejemplo, triglicéridos naturales o sintéticos, o hidrocarburos parafínicos. Además, también es posible usar cápsulas rectales de gelatina que consisten en una combinación de los compuestos activos con una base. Los materiales de base posibles incluyen, por ejemplo, triglicéridos líquidos, polietilenglicoles, o hidrocarburos parafínicos.

Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los péptidos en forma soluble en agua, por ejemplo sales solubles en agua. Además, pueden administrarse suspensiones de los péptidos en forma de suspensiones inyectables oleosas apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos, por ejemplo, aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, por ejemplo, oleato de etilo o triglicéridos. Las suspensiones inyectables acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, e incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, sorbitol, y/o dextrano. Opcionalmente, la suspensión puede contener también estabilizantes.

Los péptidos se formulan usando vehículos parenterales, convencionales, farmacéuticamente aceptables, para administrar mediante inyección. Estos vehículos son atóxicos y terapéuticos, y muchas formulaciones se indican en Remington's Pharmaceutical Sciences, (supra). Ejemplos no limitativos de excipientes son agua, solución salina, solución deRinger, solución de dextrosa y solución salina equilibrada de Hank. Las formulaciones según la invención pueden contener también cantidades menores de aditivos tales como sustanciasque mantienen la isotonicidad, el pH fisiológico y la estabilidad.

Los péptidos de la invención se formulan preferiblemente en forma purificada sustancialmente libre de agregados y otros materiales proteínicos, preferiblemente en concentraciones de aproximadamente 1,0 ng/ml a 100 mg/ml.

Las dosis eficaces de los péptidos de esta invención para usar en la prevención, supresión o tratamiento de una enfermedad relacionada con el sistema inmunitario, están en el intervalo de aproximadamente 1 ng a 100 mg/kg de peso. El intervalo de dosis preferido está entre aproximadamente 10 ng y 10 mg/kg. Un intervalo de dosis más preferidos está entre aproximadamente 100 ng y 1 mg/kg.

La inmunogenicidad del péptido puede ser mejorada incluyéndolo en un péptido o una cadena más largos o conjugándolo con soportes "inmunológicos" tales como KLH, albúmina de suero, toxoide tetánico, y semejantes, usando técnicas estándar de ligamiento. Una diversidad de tales métodos son conocidos en la técnica, por ejemplo, el uso de agentes de condensación tales como la diciclohexilcarbodiimida o el uso de agentes de enlace tales como los que pueden adquirirse en el comercio procedentes de Pierce Chemical Co., Rockford, IL.

Las dosis de anticuerpos específicos de péptidos de TCR varían en función del origen de la especie, isotipo, afinidad, naturaleza (policlonal, monoclonal, quimérico) y otras características de los anticuerpos que son conocidas por los expertos. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal para un péptido de TCR será administrado a una dosis entre 0,01-50 mg/kg.

Los ejemplos que siguen están destinados a ser ilustrativos de la invención, pero no a limitarla.

Ejemplo I Composiciones de péptidos útiles para tratar la EAE, como modelo de la MS Introducción

La EAE es un modelo en rata bien reconocido de la enfermedad autoinmunitaria humana, esclerosis múltiple (MS). Por consiguiente, la utilidad de la presente invención fue demostrada al poner de manifiesto que la administración del péptido que representa el péptido apropiado de la CDR2 del TCR que, en la rata, es un TCR alelo marcador para la EAE, previene la EAE en estos animales. En este modelo, la enfermedad es inducida inyectando a la rata sujeto una forma encefalitógena de proteína básica de mielina, tal como, por ejemplo, proteína básica de cobaya (guinea pig basic protein) (GPBP) o un péptido sintético que corresponde a los restos 72-89 de la GPBP (GPBP(72-89)). La inyección de cualquiera de estos dos péptidos en adyuvante de Freund completo (CFA) induce clones encefalitógenos de células T que utilizan preferentemente los homólogos de rata de los genes V\alpha2 y V\beta8 del TCR del ratón (Chou, Y.K., et al., J. Neurosci. Res. 22:181-187 (1989); Burns, F.R. et al., J. Exp. Med. 169:27-39 (1989)).

Los inventores han indicado la secuencia completa de nucleótidos y de aminoácidos deducida para los genes de las cadenas \alpha y \beta del TCR de rata reordenados (con homología secuencial con las familias V\alpha2 y V\beta8 del ratón, respectivamente) usados en respuesta al epítopo encefalitógeno principal de la proteína básica, GPBP(72-89) (Burns, F.R., et al., supra). Dentro de la región V\beta8 del TCR, fue identificada y sintetizada una secuencia de 21 aminoácidos que incluía la región segunda de determinación de la complementariedad (CDR2) y se predijo que era inmunógeno paracélulas T (basado en los algoritmos de Margalit et al., y Rothbard et al., (supra).

Este péptido tiene la secuencia : Asp-Met-Gly-His-Gly-Leu-Arg-Leu-Ile-His- Tyr-Ser-Tyr-Asp-Val-Asn-Ser-Thr-Glu-Lys-Gly y se denomina "V\beta8(39-59) de TCR,"

Se sintetizó un péptido testigo partiendo de la región correspondiente de una secuencia V\beta de TCR diferente que era homóloga con la familia V\beta14 del ratón (Williams et al., supra).

Inmunidad específica a péptido de TCR

Cuatro ratas fueron inmunizadas mediante inyección por vía subcutánea (SC) de 400 \mug de péptido de TCR en CFA (100 \mug de Mycobacterium/rata) y las respuestas inmunitarias específicas del péptido fueron medidas al cabo de 30 días.

Para medir anticuerpos específico para el péptido V\beta8(39-59) de TCR, se ensayó suero procedente de las ratas inmunizadas mediante el ensayo ELISA directo. El péptido de TCR fue depositado por revestimiento sobre microplacas de plástico (25 ng de péptido de TCR/pocillo). Se añadieron diluciones del suero y las placas se sometieron a incubación durante 2 horas. La reacción fue desarrollada por adición de anticuerpos conjugados a peroxidasa, específicos de las cadenas H y L de Ig. Se añadió un sustrato cromógeno para la peroxidasa y el producto de reacción coloreado se midió por la absorbancia a 405 nm (A_{405}) usando un lector de placas colorimétrico.

Una dilución 1:200 de suero inmune dio una absorbancia de 0,63 \pm 0,12 unidades. Sueros testigo procedentes de ratas inmunizadas con el péptido testigo (derivado de la correspondiente región CDR2 de una cadena de TCR sin relacionar, V\beta14) dio una reacción de solamente 0,02 \pm 0,01 unidades. Así pues, se obtuvo una respuesta específica del anticuerpo para el péptido de TCR.

Además, las ratas mostraron un respuesta de células T específica in vivo, medida como una reacción de hipersensibilidad retardada (DH) al enfrentamiento intradérmico (ID) con el péptido V\beta8(39-59) de TCR, pero no con el péptido V\beta14.

TABLA 1 La inmunización con el péptido V_{\beta}8 de TCR evita la inducción de EAE

	Inducción de EAE^{1}
Protocolo de inmunización^{2}	Incidencia	Día de iniciación	Duración	Gravedad^{3}
Péptido V_{\beta}8 de TCR	0/10	- - -	- - -	- - -
Péptido V\beta14 de TCR	4/4	14\pm2	6\pm2	3,1\pm0,3
Solución salina	14/14	14\pm2	6\pm1	3,0\pm0,5

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  \begin{minipage}[t]{150mm} ^{1}  Se indujo EAE mediante
enfrentamiento SC con 50  \mu g de GPBP + 400  \mu g de
 Mycobacteria  en adyuvante de Freund completo (CFA) 30 días
después de inmunización con el péptido de TCR (o de solución
salina).\end{minipage} \cr}

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  \begin{minipage}[t]{150mm} ^{2}  Se inyectaron ratas por vía
SC o bien con: (1) 100  \mu g del péptido de TCR
[DMGHGLRLIHYSDVNSTEKG (código de una sola letra)] que representa los
restos 39-59 del clon de cDNA de rata
V _{\beta} 510, homólogo con la familia V _{\beta} 8 del ratón
(Burns  et al., J. Exp. Med .  169 :27-39
(1989)); (2) 100  \mu g del péptido de TCR [APGGTLQQLFYSFNVGQSELF]
que representa los restos 39-59 del clon de cDNA de
rata CRTB188 homólogo con la familia V _{\beta} 14 del ratón
(Williams, C.B.  et al., J. Immunol .
 142 :1037-1035 (1989)): o bien  (3) solución
salina. Los péptidos o la solución salina se mezclaron con CFA que 
contenía 100  \mu g de  Mycobacteria  antes de la
inyección.\end{minipage} \cr}

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  \begin{minipage}[t]{150mm} ^{3}  Los valores representan la
media de la gravedad máxima de EAE. 0, no hay señales; 0,5, letargo,
pérdida de peso; 1, rabo fláccido; 2, debilidad en las patas
traseras; 3, parálisis de los cuartos traseros, incontinencia; 4,
moribundos.\end{minipage} \cr}

La inmunidad específica hacia el péptido del TCR protege contra la EAE clínica

Además de mostrar inmunidad específica hacia el péptido del TCR, se encontró que las ratas inmunizadas con el péptido estaban protegidas contra la EAE clínica.

La inmunización de ratas Lewis con el péptido TCR V\beta8(39-59), pero no con el péptido TCR V\beta14 o solución salina, prevenía completamente la inducción de la EAE (Tabla 1). Las ratas inmunizadas con el péptido V\beta(39-59) desarrollaron tanto anticuerpos específicos para el péptido V\beta8(39-59) como una respuesta de hipersensibilidad retardada (DH) de tumefacción de la oreja de 0,17 mm a 50 \mug del péptido V\beta8(39-59) del TCR. El péptido testigo, V\beta14 indujo también inmunidad específica contra él mismo, pero no comunicó protección contra la EAE.

La inmunidad específica hacia el péptido de TCR genera células T específicas

Además de demostrar la producción de anticuerpos, DH y protección contra la EAE, el péptido de TCR indujo células T específicas del antígeno, demostrable, (es decir, específicas del péptido de TCR).

Se inmunizaron ratas por vía SC con 400 \mug del péptido V\beta8(39-59) de TCR en CFA (conteniendo 1 mg de M. tuberculosis) y se enfrentaron por vía SC o bien con 50 \mug de GPBP en CFA al mismo tiempo o con 100 \mug de GPBP 30 días más tarde. Veinte días después del enfrentamiento simultáneo, los nódulos linfáticos (LN) de drenaje fueron separados y preparadas suspensiones de linfocitos.

Una fracción de las células fue ensayada para determinar la respuesta proliferativa a antígenos o mitógenos in vitro (5 x 10^{5} células/pocillo).

El resto de las células fueron reestimuladas en cultivo en masa (en placas petri de 6 cm de diámetro) con el péptido de TCR apropiado (50 \mug/ml) durante 3 días, seguido de transferencia a medio rico en IL-2 durante un período adicional de 4 días. Estas células fueron ensayadas seguidamente para determinar las respuestas proliferativas a antígenos y/o mitógenos por reestimulación en presencia de células accesorias tímicas irradiadas ((2 x 10^{4} células/pocillo). En algunos casos, la estimulación mediante péptido de TCR fue llevada a cabo en presencia de 2 \mug/pocillo de anticuerpos monoclonales. Los resultados se indican en la Tabla 2 (los valores subrayados muestran respuestas estadísticamente significantes).

Las células de nódulos linfáticos (LN) aislados de las ratas protegidas respondían al péptido V\beta8(39-59) de TCR así como a la GPBP y PPD (derivado purificado de proteína de M. tuberculosis). Esto fue evidencia además para la presencia simultánea de reactividad de células T específica de TCR así como específica de autoantígeno.

Líneas de células T fueron seleccionadas de los LN de las ratas protegidas que respondían específicamente al V\beta8(39-59) pero no al péptido V\beta14 (Tabla 2). Las células T especificas del V\beta8(39-59) de TCR eran fuertemente positivas mediante inmunofluorescencia para el alelo marcador CD4 y débilmente positivas para el alelo marcador CD8. La respuesta proliferativa al péptido V\beta8(39-59) estaba restringida solamente por moléculas MHC de clase I.

Una línea de células T específica de GPBP fue seleccionada también a partir de ratas protegidas inmunizadas con el péptido V\beta(39-59) de TCR y con GPBP. Esta línea tenía una respuesta no característicamente baja al péptido 72-89 encefalitógeno en comparación con su respuesta al GPBP. Una vez seleccionadas y activadas, las células de la línea de células T específica del GPBP procedentes de ratas protegidas con péptido de TCR eran encefalitógenas (la administración de 10^{7} células ocasionó parálisis de las patas traseras en 3 ratas), lo que indica que la inmunización con el péptido V\beta8(39-59) de TCR no dio por resultado la deleción de precursores de células T encefalitógenas.

La mezcla de las células T específicas del V\beta8(39-59) de TCR y células T específicas de la BP no perjudican la respuesta a la GPBP, incluso en la presencia del péptido de TCR (Tabla 2). Sin embargo la presencia de células T específicas del péptido V\beta8(39-59), causó una respuesta aumentada a la totalidad de los péptidos de la GPBP excepto la secuencia 72-89 encefalitógena. Las células T específicas del péptido de TCR, por consiguiente, alteraron el esquema de reconocimiento del péptido de células T reactivas con la GPBP, lo que proporciona evidencia de la existencia de interacciones célula-célula.

TABLA 2 Especificidad de líneas de células T derivadas de ratas protegidas de EAE por el péptido V_{\beta}8 de TCR

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Interacciones directas entre células T específicas del péptido de TCR y específicas de BP

Células T procedentes de los LN de las ratas inmunizadas fueron ensayadas para determinar su grado de respuesta in vitro a células T V_{\beta}8^{+} o V_{\beta}8^{-} atenuadas. Las células T estimuladoras fueron irradiadas (2500R), y 2 x 10^{4} células fueron cultivadas (en ausencia de células accesorias adicionales) con 2 x 10^{5} células T específicas de TCR aisladas, durante 3 días, tratadas finalmente durante 18 horas con ^{3}H-timidina, y la absorción del isótopo fue medida mediante espectroscopía de centelleo líquido.

En ausencia de una línea de células T estimuladoras, las respuestas "de fondo" (ruido de fondo) eran del orden de 7000 cpm (Tabla 3). Cuando la línea estimuladora era específica para el epítopo S72-89 de GPBP, y por consiguiente expresaba el péptido V_{\beta}8 de TCR, la respuesta fue 31.000 cpm. Sin embargo, cuando la línea estimuladora era específica del péptido 55-74 de GPBP, y por consiguiente no expresaba el péptido V_{\beta}8 de TCR, no hubo respuesta significativa por encima de la de fondo (8000 cpm). Así pues, solamente las células V_{\beta}8^{+} pudieron ser reconocidas por células T específicas para el péptido de TCR, lo que indica la presencia de reconocimiento directo del péptido V_{\beta}8 sobre la célula T diana por una célula T reguladora específica de V_{\beta}8. Los resultados indican el reconocimiento directo de la secuencia del TCR sobre la superficie de la célula T estimuladora. Sin embargo, las células T específicas del péptido de TCR, no eran citotóxicas para las células diana reactivas con la BP.

Transferencia pasiva de protección frente a la EAE por células T específicas del péptido de TCR

La capacidad protectora de células T específicas del péptido V_{\beta}8(39-59) fue establecida por transferencia adoptiva. Ratas inyectadas con 10^{7} células T específicas de V_{\beta}8(39-59) no desarrollaron EAE (Tabla 4). La protección transferida apareció que ocurría por intermedio de células T; anticuerpos específicos de V_{\beta}8(39-59) no fueron detectables en el suero de ratas protegidas. Los resultados de DT (Tabla 4) indicaron que las células T transferidas adoptivamente podían prevenir la inducción de EAE sin comprometer el reconocimiento de células T de otros antígenos.

TABLA 3 Respuesta de la línea de células T específicas del péptido V_{\beta}8 de TCR a células T V_{\beta}8^{+} o V_{\beta}8^{-} atenuadas

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2

TABLA 4 Células T específicas del péptido V_{\beta}8 de TCR protegen contra la EAE

3

Especificidad de líneas de células T que derivan de ratas protegidas

La aptitud de células T específicas del V_{\beta}(39-59) para (a) alterar los esquemas de respuestas de líneas de células T específicas de GPBP in vitro, (b) proteger ratas nativas de la EAE, y (c) reducir reacciones de DH in vivo, indicaron que el esquema de respuesta a epítopos de BP podía ser alterado en ratas protegidas mediante células T específicas del péptido de TCR. Como muestra la Tabla 5, células LN procedentes de los animales protegidos contra la EAE respondieron bien al péptido del TCR de la GPBP en comparación con células LN procedentes del grupo testigo. Por el contrario, las células LN procedentes del grupo protegido manifestaron una respuesta significativa al péptido 87-89 de BP, mientras que las células LN procedentes del grupo testigo no respondieron a este péptido. La selección de una línea de células T específica del V_{\beta}8(39-59) de TCR procedente de los LN de ratas protegidas adoptivamente (Tabla 5) indicó que las células T específicas del péptido de TCR habían emigrado a los LN y persistían en los LN que drenaban el sitio de la inyección de GPBP.

Discusión

Estos resultados demuestran por primera vez el uso de un péptido sintético procedente de la región CDR2 del TCR para inducir células T reguladoras específicas de V_{\beta}8 que previenen la inducción de EAE. La modelación por ordenador de interacciones ternarias entre cadenas de TCR, péptidos antigénicos y moléculas de restricción MHC, es concordante con la implicación de la CDR en la unión péptido/MHC cuando el TCR está plegado en una configuración enérgicamente favorable (Davis et al., y Claverie et al., supra). Los efectos reguladores de células T específicas para CDR2 apoyan la noción de que esta región posee importancia biológica. Aun cuando los inventores no pretenden quedar ligados a una teoría en particular, parece improbable que las células T respondientes interaccionen directamente con la molécula de V_{\beta}8 de TCR de la superficie de la célula T diana. Sin duda, puede pensarse que el péptido de TCR endógeno podría ser "procesado" y expresado preferentemente sobre la superficie de las células T en asociación con moléculas de la clase I (Long, E.O., Immunol. Today 10:232-234 (1989)). Si una forma natural del péptido de TCR se asocia con la molécula MHC sobre la superficie de las células T, la interacción de las células T específicas de TCR podría interferir con la activación de células T normales por un epítopo de BP.

TABLA 5 Especificidad antigénica de líneas de células T derivadas de los nódulos linfáticos de ratas protegidas contra la EAE por la transferencia de células T específicas del péptido V_{\beta}8 de TCR

4

La vacunación con células T atenuadas indica que es inducida inmunidad protectora frente a estructuras objetivo en la que participan diferentes clones de células T diferentes para el mismo epítopo inductor de enfermedad, pero no implican directamente al TCR. La inmunogenicidad y actividad inmunorreguladora demostrada en esta invención de una región definida de la cadena V_{\beta}8 del TCR expresada por células T encefalitógenas, es una etapa importante hacia adelante en la comprensión de la regulación antiidiotípica, y proporciona una explicación clara de los efectos protectores del enfoque de inmunización con péptidos. El enfoque de la presente invención, usando un péptido sintético para inducir anticuerpos específicos de péptidos de TCR, tiene valor para producir una diversidad de anticuerpos altamente específicos para evaluar secuencias importantes en la función del TCR. Las propiedades reguladoras potenciales de anticuerpos inducidos respecto al péptido V_{\beta}8(39-59) están ilustradas en el Ejemplo II.

La vacunación con péptido del TCR tiene aplicación en condiciones autoinmunitarias o condiciones malignas humanas que se caracterizan por el uso de genes V del TCR.

Ejemplo II Los anticuerpos contra un péptido sintético de la región V del TCR suprimen la EAE

Este Ejemplo proporciona una evaluación de los efectos de inmunización con el péptido V_{\beta}8(39-59) de TCR sobre la EAE inducida con el péptido de la proteína básica de cobaya (GPBP) encefalitógeno, S87-99, y sobre respuestas de anticuerpo a los péptidos de la GPBP S49S o S87-99. Se describen respuestas de anticuerpos contra el péptido V_{\beta}8(39-59) de TCR y se evalúa la aptitud de estos anticuerpos para reaccionar con células T V_{\beta}8^{+} y suprimir signos clínicos de la EAE.

Los resultados demuestran que el péptido V_{\beta}8(39-59) de TCR puede inducir tanto protección contra la EAE como títulos elevados de anticuerpo específico para cualquiera de los epítopos de la GPBP que son encefalitógenos en ratas Lewis. Además, se muestran anticuerpos anti-V_{\beta}8(39-59) de TCR para suprimir la EAE con independencia de células T reguladoras. Así pues, ambos mecanismos reguladores humoral y celular son generados después de inmunizar las ratas Lewis con el péptido V_{\beta}8(39-59) del TCR.

A. Materiales y métodos 1. Síntesis y purificación de péptidos

Todos los péptidos usados en este estudio fueron sintetizados mediante una modificación menor (Hashimn G,A., et al., J. Neurosci. Res. 16:467 (1986)) del método en fase sólida (Merrifield, R.B., J. Amer. Chem. Soc. 85:2149 (1963)) empleando éster de Boc-aminoácido-resina (Peninsula Laboratories, San Carlos, CA). Los péptidos (Tabla 6) fueron sintetizados con derivados t-Boc de L-aminoácidos, comenzando con el éster de t-Boc-L-glicina-O-resina (0,65 mmoles/g; 0,78 mmoles). Las reacciones de acoplamiento y desbloqueo fueron verificadas rutinariamente mediante el ensayo de Kaiser (Kaiser, E., et al., Anal. Biochem. 34:595 (1970)) para grupos amino libres. Las etapas de desbloqueo único y reacción de acoplamiento doble ocasional fueron suficientes para la síntesis de todos los péptidos usados en este estudio. El péptido Gp-S49S define la región 69-84 de la GPBP y posee un resto de glicina en el extremo C-terminal. Los números de restos de los péptidos de GPBP usados en este estudio se corresponden con los indicados para la proteína básica de mielina bovina (Eylar, E.H., et al., J. Biol. Chem. 246:5770 (1971)).

Los péptidos que contenían triptófano fueron tratados primeramente con piperidina al 10% durante 30 minutos para separar los grupos de bloqueo formilo y luego, a semejanza de otros péptidos, fueron separados desde la resina, juntamente con otra desprotección de la cadena lateral, por tratamiento con HF a 0ºC en presencia de anisol. Después de separar el HF, la mezcla de resina-péptido se lavó 4 veces con éter y se secó. El péptido se extrajo con agua, se liofilizó y se filtró a través de una columna de Sephadex G10 (2,5 x 100 cm) que se equilibró con ácido acético al 5% y se eluyó con el mismo. Los péptidos insolubles en ácido fueron extraídos de la mezcla de resina-péptido con carbonato amónico 0,03 M, filtrados sobre una columna de Sephadex G10 que se equilibró con bicarbonato amónico 0,03 M y se eluyó con el mismo, y se liofilizó. Se consiguió una purificación adicional del péptido usando HPLC con una columna Bondapak C18 equilibrada con ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1% en agua y se eluyó con un gradiente lineal de acetonitrilo hasta el 40% que contenía TFA al 0,1% a lo largo de un período de 60 minutos. La pureza de los péptidos fue documentada mediante HPLC y por análisis de la composición de aminoácidos.

2. Péptidos de ensayo y testigos

El péptido V_{\beta}8(39-59) de TCR fue sintetizado conforme a la secuencia identificada por Burns, F.R., et al. (j. Exp. Med. 169:27 (1989)). Como testigos de especificidad de la familia génica V_{\beta} de TCR y para la región hipervariable de la CDR2, se sintetizaron péptidos adicionales, incluyendo el V_{\beta}14(39-59) deTCR, que comprende la correspondiente CDR2 de la familia génica V_{\beta}14 (Williams, C.B., et al., J. Immunol. 142:1027(1989)), y V_{\beta}8(25-41) de TCR, correspondiente a una secuencia en la región CDR1 adyacente al péptido V_{\beta}8(39-59) de TCR (Burns, F.R., et al., referencia citada). Otros péptidos testigo incluían una serie que define regiones específicas de la GPBP. Los péptidos Gp-S49S y Gp-S87-99 definen respectivamente, las secuencias encefalitógenas mayor y menor para ratas Lewis. Los péptidos Gp-S67 (restos 69-81) y Gp-S53 (restos 75-84) definen respectivamente epítopos de células T y de células B dentro del epítopo encefalitógeno mayor incluido en el péptido Gp-S49S (restos 69-84). El péptido Gp-S55-74 define un determinante de células T no encefalitógeno en ratas Lewis (Offner, H., et al., J. Exp. Med. 170: 355 (1989)), y el Gp-NAc-1-16 incluye la secuencia encefalitógena para la raza PL/J del ratón (Zamvil, S.S., et al., Nature 324:258 (1986)).

3. Acoplamiento de péptidos a KLH

Se disolvió hemocianina de lapa "ojo de llave" (keyhole limpet hemocyanin) (KLH) (Calbiochem Corp., La Jolla, CA) en solución salina tamponada con fosfato (PBS), se dializó frente a PBS a 4ºC durante la noche y se liofilizó. Se disolvió un peso conocido de KLH (8 mg o 1-2 \mumoles) junto con el péptido a acoplar (10 \mumoles), en 1 ml de agua desionizada. Después de ajustar el pH a 4,5 con HCl 0,01 N, se añadieron 375 mg de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) en 0,5 ml de agua, y la mezcla de reacción se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente. La mezcla se colocó después en bolsas de diálisis, se dializó frente a PBS, 3 cambios, a 4ºC, y se liofilizó. La cantidad de péptido acoplado a KLH se calculó a partir del aumento de masa de la parte no dializable de la KLH.

TABLA 6 Secuencia de aminoácidos de péptidos que derivan del TCR y péptidos afines procedentes de proteína básica de mielina

5

4. Preparación de anticuerpos anti-péptidos

Ratas Lewis macho de 200-250 g de peso fueron inmunizadas con una dosis única de 100 \mug del péptido libre. El péptido fue emulsionado en adyuvante de Freund completo (CFA) e inyectado por vía SC. Cada rata recibió 100 \mul de la emulsión que contenía 100 \mug de péptido y 100 \mug de M. butyricum. Asimismo, ratas Lewis fueron inmunizadas con 100 \mug de un péptido particular y enfrentadas con otro péptido o bien simultáneamente o bien con una dosis posterior. Las ratas inmunizadas fueron sangradas previamente desde la vena caudal antes y a intervalos después de inmunizar.

Conejos blancos de Nueva Zelanda, de 2,7-3,2 kg de peso fueron sangrados previamente e inmunizados con 0,5 ml de emulsión de CFA que contenía 4 mg de péptido y 2 mg de M. butyricum. La emulsión se inyectó por vía SC en varios sitios en la zona dorsal del cuello y la cola. Los conejos fueron inmunizados o bien con el péptido libre o bien con péptido conjugado a KLH. Los conejos inmunizados recibieron los días 7, 14 y 21 1 mg de péptido emulsionado en adyuvante de Freund incompleto e inyectados por vía SC en el costado. Todos los conejos fueron sangrados a través de la vena de la oreja después de que fueron colocados en jaulas de contención y tranquilizados con acepromazina. Para evitar la hipovolemia, la cantidad de sangre separada fue reemplazada con solución salina estéril. Se prepararon sueros procedentes de ratas o conejos individuales a partir de sangre coagulada, mediante centrifugación. Todos los sueros fueron privados de complemento durante 30 minutos a 56ºC y congelados en pequeñas partes alícuotas a las que se había añadido azida de sodio.

5. Preparación de inmunoglobulina

Se preparó IgG a partir de suero mediante los métodos publicados (Steinbuch, M., et al., Arch. Biochem. Biophys. 134:279 (1969)) y se purificó mediante cromatografía de intercambio iónico con DEAE-sephadex. El suero se diluyó con un volumen de solución amortiguadora de acetato 0,06 M y se ajustó el pH a 4,8 a temperatura ambiente. Se añadió gota a gota ácido caprílico, 6,8 g/100 ml de suero, con agitación vigorosa durante 30 minutos. La mezcla se centrifugó después, el sobrenadante se ajustó a pH 5,7, se dializó frente a agua desionizada y se liofilizó.

6. Análisis de anticuerpos

La reactividad de los anticuerpos se determinó mediante una adaptación para péptidos (Hashim, G,A., et al., J. Neurosci. Res. 24:222 (1989)) del ensayo inmunoenzimático directo (ELISA) y mediante la inhibición ELISA según ha sido descrito por Cleveland, W.L., et al. (Methods in Enzymol. 121:95 (1986)). Se usó inmunoglobulina marcada con peroxidasa anti-rata de conejo o anti-conejo de cabra,(cadenas H y L purificadas por afinidad, Cooper Biomedical, Malvern, PA), junto con O-fenilenodiamina para sustrato enzimático, y se midió la densidad óptica a 450-460 nm en un lector colorimétrico de placas (Model Vmax, Molecular Devices, Mento, CA).

7. Inducción de EAE

Se indujo EAE en ratas Lewis macho (225-250 g) según ha sido descrito (Hashim, G.A., et al., J. Neurosci. Res. 24:222 (1989)). Cada una de las ratas recibió una inyección SC única de una emulsión de CFA que contenía 100 \mug de péptido y 100 \mug de M. butyricum. Las ratas inmunizadas fueron inspeccionadas diariamente para apreciar signos clínicos de la EAE y fueron rematadas entre los días 25 y 30 después del enfrentamiento. En este momento, se recogieron los sueros procedentes de ratas individuales, y se procesaron los tejidos cerebrales y de la médula espinal para histología.

8. Prevención y supresión de EAE en ratas Lewis

Ratas Lewis macho fueron inmunizadas con 100 \mug del péptido V_{\beta}8(39-59) de TCR emulsionado en CFA e inyectado por vía SC. Las ratas inmunizadas fueron sangradas desde la cola para la determinación de anticuerpos y fueron enfrentadas con 100 \mug de un péptido encefalitógeno (Gp-S49S o Gp-S87-99). Grupos de ratas fueron enfrentadas o bien el mismo día o bien el día 40-41 después de que fueran inmunizadas, basado en el curso de tiempo observado de producción de anticuerpos anti-V_{\beta}8(39-59) de TCR.

Para estudiar la supresión de la EAE por anticuerpos anti-V_{\beta}8(39-59), ratas Lewis fueron enfrentadas con el péptido encefalitógeno Gp-S49S e inyectadas por vía intraperitoneal o bien con solución salina (testigo) o bien con IgG de rata Lewis o conejo anti-V_{\beta}8(39-59) administrada cada dos días durante 14 días. Cada rata recibió un total de o bien 49 o bien 70 mg de IgG de rata o conejo, respectivamente, y se remató el día 24 después del enfrentamiento. Cuando se inyectó en solución salina estéril a lo largo de un período de 14 días, la IgG de conejo permaneció en niveles altos en la circulación de las ratas receptoras en los días 12 y 24 después de transferir y no interfirió con el desarrollo de anticuerpos anti-Gp-S49S.

9. Tinción de anticuerpos de células T V_{\beta}8^{+} y V_{\beta}8^{-}

IgG de rata o conejo (10 \mug) procedente de animales normales o inmunizados con V_{\beta}8(39-59) de TCR fue incubada a varias concentraciones durante 30 minutos con 10^{6} timocitos normales de rata (que se sabe son en u mayor parte V_{\beta}8^{-}) o una línea de células T reactivas con Gp-S49S, específica de GPBP (que se sabe es V_{\beta}^{+}). Después de varios lavados, las células fueron incubadas con 10 \mug de IgG de ratón anti-rata o anti-conejo durante un período adicional de 30 minutos como etapa de amplificación. Después de lavar adicionalmente, las células fueron teñidas con IgG anti-ratón de cabra fluoresceinada (específica de las cadenas H + L), lavadas, fijadas en formalina al 2%, y sometidas a evaluación para determinar la intensidad de fluorescencia a 488 nm usando un Citofluorógrafo Coulter Epics C. Las células fueron cerradas electrónicamente en base a esquemas de dispersión de ángulo avanzado frente a ángulo recto para incluir las poblaciones principales de linfocitos, que fueron evaluadas luego mediante fluorescencia FITC.

B. Resultados 1. Prevención de EAE mediante inmunización con el péptido V_{\beta}8(39-59) de TCR

Para evaluar los efectos profilácticos de inmunidad anti-V_{\beta}8(39-59) de TCR sobre la EAE inducida por diversos epítopos encefalitógenos, ratas Lewis fueron primeramente inmunizadas con el péptido V_{\beta}8(39-59) de TCR y 44 días más tarde, se indujo EAE o bien con Gp-S49S o con Gp-S87-99. Como indica la Tabla 7, la inmunización con el péptido V_{\beta}8(39-59) de TCR redujo grandemente la gravedad de la EAE inducida por Gp-S49S, y previno completamente la EAE inducida por el S87-89. Aun cuando las calificaciones histológicas en ambos grupos protegidos eran reducidas, la inflamación en el CNS estaba en general menos afectada por inmunización con el péptido V_{\beta}8(39-59) de TCR de lo que eran los parámetros clínicos.

2. Supresión de la EAE con el péptido V_{\beta}8(39-59) de TCR

Para evaluar la supresión de la EAE, el péptido V_{\beta}8(39-59) de TCR fue administrado simultáneamente con la dosis encefalitógena de GPBP o Gp-S49S. Como muestra la Tabla 7, el péptido V_{\beta}8(39-59) de TCR previno la EAE inducida por GPBP en la mayoría de las ratas, y redujo marcadamente la gravedad clínica en los animales restantes. Un resultado similar se obtuvo en la EAE inducida por Gp-S49S. Por el contrario, el péptido testigo V_{\beta}14(39-59) de TCR no tenía efectos supresores sobre la EAE (Tabla 7). De nuevo, los signos histológicos de EAE estaban relativamente menos afectados por la inmunización con V_{\beta}8(39-59) de TCR que los signos clínicos

TABLA 7 Prevención y supresión de EAE por inmunización con el péptido V_{\beta}8(39-59) de TCR

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3. Respuestas de anticuerpos contra el péptido V\beta8(39-59) de TCR

Anticuerpos específicos de V\beta de TCR producidos contra clones de células T intactos (Owhashi, M., et al., J. Exp. Med. 168:2153 (1988); Gascoigne, N.R.J., et al., Proc. Natl. Acad. Scis. USA 84:2936 (1987); Happler, J.W., et al., Nature 332:35 (1988); Kappler, J.W., et al., Cell 49:263 (1987); MacDonald, H.R.., et al., Nature 332:40 (1988)) han probado ser eficaces en la prevención y tratamiento de la EAE tanto en ratas Lewis (Owhashi, M., et al., J. Exp. Med. 168:2153 (1988)) como en ratones PL/J (Acha-Orbea, H., et al., Cell 54:263 (1988); Urban, J., et al., Cell 54:577 (1988)). Resultó, por tanto, muy importante determinar si podían producirse anticuerpos contra el péptido sintético V_{\beta}8(39-59) de TCR, y si es así, si ellos tenían utilidad clínica.

Tales anticuerpos podían, sin duda ser producidos, y se encontró que eran clínicamente eficaces. Anticuerpos contra el péptido V_{\beta}8(39-59) de TCR fueron detectados en los sueros de ratas Lewis tan pronto como 7 días después de una inyección única de 100 \mug del péptido libre en CFA (Tabla 8). Aun cuando se observó un alto grado de variabilidad en la respuesta de anticuerpos, los títulos de anticuerpos aumentaron gradualmente con el tiempo. Ninguna de las ratas inmunizadas con el péptido de TCR desarrollo signo alguno de EAE, y todas permanecieron sanas durante todo el período de observación de 41 días.

Los conejos inmunizados o bien con el péptido V_{\beta}8(39-59) de TCR libre o conjugado a KLH produjeron títulos mucho más altos de anticuerpos que los que produjeron las ratas (Tabla 8). Los títulos de anticuerpos permanecieron altos durante más de 6 meses, mostrando una reactividad detectable a diluciones de hasta 1/320.000.

TABLA 8 Respuesta de anticuerpos contra el péptido V_{\beta}8(39-59) de TCR en ratas Lewis y conejos

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4. Respuestas de anticuerpos contra el péptido encefalitógeno S49S

La inmunización de ratas Lewis con la GPBP o el péptido GP-S49S (restos 69-84) induce anticuerpos que reconocen varios epítopos diferentes, uno de los cuales comprende los restos 82-84 (Asp-Glu-Asn) y es puesto en evidencia por la unión del anticuerpo a Gp-S53 (restos 75-84) (Day, E.D., et al., J. Neurosci. Res. 18:214 (1987); Hashim, G.A., et al., J. Neurosci. Res. 17:375 (1987)). Estas respuestas de anticuerpos dependen de la cooperación de células T, que pueden ser proporcionada por células T encefalitógenas específicas para el péptido GP-S49S. Aun cuando la inmunización con el péptido V_{\beta}8(39-59) de TCR previene y suprime la EAE por mediación de células T específicas de Gp-S49S del fenotipo cooperador, es importante determinar el efecto de tal inmunización sobre la formación de anticuerpos anti-S49S.

La respuesta de anticuerpos a Gp-S49S fue detectada tan pronto como 7 días después de la inmunización con el Gp-S49S en CFA (Tabla 9). La toma periódica de sangre de las ratas inmunizadas mostró un aumento acusado de los títulos de anticuerpos para ambos, Gp-S49S y Gp-S53, durante los 48 días siguientes, apareciendo la respuesta anti-Gp-S53 solamente después del desarrollo y recuperación final de la EAE.

Después de preinmunización y protección contra la EAE con el péptido V_{\beta}8(39-59) de TCR, las respuestas de anticuerpos del día 26 a Gp-S49S y Gp-S53 se elevaron dos a cuatro veces con respecto a la de las ratas no tratadas con el péptido de TCR (Tabla 9). Similarmente, las respuestas anti-S87-99 aumentaron >4 veces en ratas preinmunizadas y protegidas con el péptido V_{\beta}8(39-59) de TCR (Tabla 9). Así, una respuesta inmunitaria dirigida contra células T V_{\beta}8^{+} mejoró realmente las respuestas de anticuerpos a varios epítopos de GPBP de células B distintos.

TABLA 9 Respuesta de anticuerpos contra péptidos encefalitógenos en ratas inmunizadas con el péptido V_{\beta}8(39-59) de TCR durante el curso de la EAE

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5. Especificidad de anticuerpos anti-péptido

Para evaluar la especificidad de diversos antisueros, se determinó la unión a un panel de péptidos sintéticos de TCR y GPBP. Los resultados (Tabla 10), muestran que el antisuero anti-Gp-S49 que reconocía al GP-S49S y su fragmento C terminal, Gp-S53, no reaccionaba con el fragmento N terminal del Gp-S49 (es decir, Gp-S67), con cualesquiera otras regiones de la GPBP, ni con cualquiera de los péptidos de la región V del TCR. De modo semejante, los antisueros de rata o conejo para el péptido V_{\beta}8(39-59) de TCR, reconocían solamente el inmunógeno, y no otras secuencias del TCR (incluyendo los 3 restos de solapamiento - AspMetGly - presentes en el péptido V_{\beta}8(25-41) o péptido de GPBP. Los antisueros procedentes de ratas inmunizadas simultáneamente con el péptido V_{\beta}8(39-59) de TCR más Gp-S49S o Gp-S87-89 demostraron la misma especificidad para cada uno de los inmunógenos como antisueros procedentes de ratas inmunizadas únicamente (Tabla 5). La especificidad de reactividad de anticuerpos para el V_{\beta}8(39-59) de TCR y para el Gp-S49S fue confirmada por inhibición de la unión en ELISA, dependiente de la dosis, específica del péptido (Figura 1).

6. Anticuerpos para V_{\beta}8(39-59) de TCR reconocen células T V_{\beta}8^{+}

Para interpretar los efectos reguladores potenciales de anticuerpos para el V_{\beta}8(39-59) de TCR, era crucial establecer si los anticuerpos específicos del péptido iteraccionaban directamente con células T V_{\beta}8^{+} o no. Para evaluar tal reactividad, células T encefalitógenas V_{\beta}8^{+} o timocitos normales que son predominantemente V_{\beta}8^{-} fueron incubadas con anticuerpo de IgG de rata o conejo anti-V_{\beta}8 (39-59) de TCR, seguido por anticuerpo que provoca anti-rata o anti-conejo, de ratón, y anticuerpo de IgG de cabra anti-ratón marcado con fluoresceína. Como puede apreciarse en la Figura 2, la IgG de conejo incorporada al péptido V_{\beta}8(39-59) de TCR conjugado a KLH causó una intensidad de fluorescencia aumentada en la población total de células T encefalitógenas V_{\beta}8^{+} (>90% positivas frente a un antisuero testigo), en oposición a aproximadamente 5% de la población normal de timocitos. IgG de rata e IgG de conejo inducida contra el péptido de TCR sin conjugar tiñó también selectivamente las células T V_{\beta}8^{+}, aun cuando con menos intensidad. Estos resultados indican que el anticuerpo para el péptido V_{\beta}8(39-59) de TCR puede unirse específicamente a células T V_{\beta}8^{+}. Ninguno de los antisueros era citotóxico para células T V_{\beta}8^{+} en presencia de complemento, medido por liberación de cromo o exclusión de colorante, lo que sugiere que la unión del anticuerpo alteró la función de las células T sin matar las células.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 10 Reactividad de anticuerpos contra los péptidos v_{\beta}8(39-59) de TCR y GPBP con un panel de péptidos sintéticos de proteína básica de mielina y de la cadena \beta del TCR

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7. Supresión de la EAE con anticuerpo anti-V_{\beta}8(39-59) de TCR

Ratas Lewis inmunizadas con péptido V_{\beta}8(39-59) de TCR no solamente estaban protegidas contra la EAE, sino que desarrollaron anticuerpos en circulación específicos para el péptido inmunizante. Para evaluar el papel de estos anticuerpos en la regulación de la EAE, ratas Lewis fueron enfrentadas con Gp-S49S en CFA y fueron tratadas luego con IgG (rata o conejo) específica del V_{\beta}8(39-59) de TCR. Las ratas que recibieron IgG de rata Lewis un día sí y otro no durante 12 días desarrollaron signos clínicos suaves de EAE con histología reducida en el cerebro, pero lesiones más extensas en la médula espinal, en comparación con los testigos (Tabla 11). Las ratas que habían recibido IgG de conejo desarrollaron signos clínicos mínimos con poco cambio de las calificaciones histológicas (Tabla 6). Así pues, la administración pasiva de anticuerpos anti-V_{\beta}8(39-59) de TCR durante un período de 12 días suprimió los signos clínicos de la EAE pero no los signos histológicos.

C. Discusión

Los resultados presentados en esta memoria constituyen la primera demostración de la aptitud de un péptido sintético de la región V del TCR para inducir anticuerpos específicos que pueden suprimir la inducción de la EAE. Estos anticuerpos específicos del péptido V_{\beta}8(39-59) de TCR son capaces de unión a células T que llevan el TCR intacto, entero, y de alterar con ello la función de estas células sin lisarlas. Acoplados con los resultados presentados en el Ejemplo I, estos resultados indican que ambas respuestas inmunitarias, la de anticuerpos y la respuesta por intermedio de células, pueden proporcionar acciones reguladoras del sistema inmunitario independientes sobre linfocitos T encefalitógenos que utilizan genes comunes de la región V en respuesta a epítopos de MBP. Ambos mecanismos reguladores tienen efectos preventivos y supresores potentes sobre la inducción de los signos clínicos de una enfermedad autoinmunitaria.

TABLA 11 Supresión de la EAE en ratas Lewis mediante anticuerpos anti-V_{\beta}8(39-59) de TCR transferidos pasivamente

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El péptido V_{\beta}8(39-59) de TCR, que se había predicho que era un buen inmunógeno de células T, basándose en los algoritmos de Margalit et al. y Rothbard et al. (supra), mostró ser un inmunógeno de células B potente, en especial en concejos. Los anticuerpos eran altamente específicos para el péptido inmunizante (tanto por reacción directa como por ensayos de inhibición), teñían solamente las células T V_{\beta}8^{+}, y suprimían la EAE que cursa por intermedio de células T V_{\beta}8^{+}.

En conclusión, el péptido sintético V_{\beta}8(39-59) de TCR inducía tanto la inmunidad de células T como la producción de anticuerpos en ratas Lewis. Ambos, las células T y los anticuerpos, solos o conjuntamente, son capaces de regular la respuesta inmunitaria a un enfrentamiento con un encefalitógeno. La aptitud de este péptido de TCR para activar células T reguladoras y anticuerpos protectores, demuestra la utilidad de este enfoque para el control de enfermedades autoinmunitarias humanas.

Ejemplo III EAE clínica en ratas tratadas con péptidos V_{\beta}8(39-59) de TCR antes o después de la iniciación de la enfermedad

Se ensayó la aptitud del péptido V_{\beta}8(39-59) de TCR administrado o bien por vía SC (en adyuvante) o por vía ID (en solución salina) para interrumpir el proceso de la enfermedad cuando se administra en diversos tiempos después de inducir la EAE con GPBP (Tabla 12). En el Experimento 1, el péptido de TCR fue administrado o bien el día 10 (línea 2) o cuando la primera rata de un grupo mostró signos clínicos de la EAE (líneas 3 y 4) en el momento de la iniciación. En ambos casos, con ambas vías de inyección del péptido, hubo un disminución significativa de la duración de la enfermedad, aun cuando no en la gravedad o el tiempo de iniciación. La eficacia del péptido administrado por vía ID en solución salina tiene una importancia particular para el tratamiento terapéutico humano, puesto que se prefiere a la inyección por vía SC en adyuvante.

TABLA 12 EAE clínica en ratas tratadas con péptidos v_{\beta}8(39-59) de TCR antes o después de la iniciación de la enfermedad

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En el Experimento 2, se varió el momento de la administración ID del péptido de TCR, así como la dosis. Como indica la Tabla 12, 50 \mug del péptido administrados los días 0 (día de inducción de la EAE), 7 ó 14, dieron por resultado una disminución significativa de la duración de la enfermedad. Se observó también un retraso en la iniciación de la enfermedad. Además, disminuyó el porcentaje de animales que mostraban signos de la enfermedad. Una dosis mayor del péptido (200 \mug) mostró que era menos eficaz que la dosis inferior, debido posiblemente a una sobrecarga a corto plazo del péptido que podía haber encerrado la respuesta inmunitaria generada contra el TCR. El tratamiento con un péptido de tamaño semejante, correspondiente a un TCR irrelevante no tuvo efecto sobre la iniciación, gravedad ni incidencia de la EAE, pero pudo haber reducido algo la duración (última línea de la Tabla 12).

Ejemplo IV Respuestas de células T de células de LN y lineas de células T seleccionadas con péptidos de TCR procedentes de ratas que reciben tratamiento terapéutico con péptido de TCR

Se examinaron las respuestas proliferativas y la especificidad de células T en los LN de drenaje (poplíteos) de ratas tratadas con péptido V_{\beta}8(39-59) de TCR para la EAE, el día 13 después de la inducción de la enfermedad (Tabla 13). El día 0, ratas Lewis recibieron un régimen de inducción de la EAE de GPBP + CFA, SC, en las plantas de las patas traseras. El día 13 se dividieron en tres grupos y recibieron o bien solución salina (columna 1), 100 \mug de péptido V_{\beta}8(39-59) de TCR (+ CFA), SC, en la planta de las patas traseras (columna 2) o bien 50 \mug de V_{\beta}8(39-59) de TCR en solución salina por vía ID, en el pabellón de la oreja. El día 20, aproximadamente 7 días después de la iniciación de la EAE, los LNs poplíteos fueron separados y se ensayo directamente la actividad proliferativa de células Y en respuesta a los antígenos o mitógenos indicados.

Las células de LN procedentes de ratas testigo respondían del mejor modo a Con A, PPD, GPBP y GPBP (72-89), y GPBP (45-89) (que incluye la secuencia 72-89 y otro péptido inmunógeno pero no encefalitógeno). Por contraste, células LN procedentes de ratas a las que se había administrado el péptido de TCR por vía SC en CFA, no mostraron respuestas proliferativas significativas a GPBP o a cualquiera de los fragmentos de BP. Las células LN procedentes de ratas tratadas por vía ID con el péptido de TCR respondían de modo semejante al de las células testigo, con la excepción de una respuesta reducida a GPBP(72-89). Además, el último grupo mostró una respuesta aumentada a GPBP(90-170), que no se sabe que sea encefalitógena. Esto indica que había ocurrido conmutación de epítopos.

TABLA 13 Respuestas proliferativas de células LN de ratas lewis después de inducción de EAE y tratamiento con péptidos de TCR

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Una parte alícuota de cada uno de los 3 grupos anteriores de células LN fue estimulada por cultivo o bien con GPBP o con el péptido de TCR durante 3 días, y las células fueron expandidas en IL-2 durante 5 días más. Las respuestas proliferativas a los diversos antígenos y mitógenos de estas células T fueron examinadas, como anteriormente. Los resultados se muestran en la Tabla 14.

Las células T testigo (Tabla 14, columna 1) respondieron bien a GPBP, GPBP(72-89), P1 y BP de rata (lo que indica reconocimiento homólogo en el CNS). La última línea de la Tabla indica que cuando se inyectaron células T de este grupo en ratas nativas, ellas fueron encefalitógenas.

Las células T procedentes del grupo de animales tratados con el péptido de TCR en CFA, SC, y seleccionadas por cultivo con GPBP (columna 2) respondieron mal a GPBP, GPBP(72-89) y BP de rata. La respuesta a P1 de GPBP se debió aparentemente al segundo epítopo (no encefalitógeno), ya que la respuesta al epítopo de GPBP(72-89) era débil. La respuesta potente al péptido de TCR indicó que una exposición de 7 días (sin selección posterior con este péptido) era suficiente para inmunidad anti-péptido de TCR. Es de gran importancia la observación de que estas células eran incapaces de transferir EAE, lo que indica que los clones encefalitógenos pudieran no seleccionarse durante el cultivo en presencia del antígeno de GPBP.

Las células procedentes de los animales inmunizados con TCR anteriores, cuando se seleccionaron in vitro con el péptido de TCR en vez de con GPBP (columna 3), apareció que respondían solamente al péptido de TCR (y, como es lógico, el mitógeno de células T, Con A).

Finalmente, las células de ratas tratadas con el péptido de TCR por vía ID y seleccionadas en cultivo con GPBP (columna 4) se comportaron de un modo esencialmente semejante al de las células testigo. Es decir, reconocían en epítopo encefalitógeno de GPBP(72-89) y eran capaces de transferir la EAE. Esto indica que los precursores de células T encefalitógenos todavía se encontraban presentes en las ratas tratadas de este modo y podían seleccionarse por cultivo. Esto sugiere la posibilidad de que la duración reducida de la EAE apreciada en las ratas tratadas con el péptido de TCR por vía IC (véase el Ejemplo III y la Tabla 12) no implica regulación de las células LN de drenaje. Sin embargo, es importante notar que las LNs que drenan el sitio de la inyección ID (es decir, el LN cervical cuando la inyección ID se efectúa en el pabellón de la oreja) pueden poner de manifiesto diferentes propiedades
reguladoras.

TABLA 14 Respuestas proliferativas de células T seleccionadas por péptidos, procedentes de ratas lewis después de inducción de EAE y tratamiento in vivo con péptidos de TCR

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Ejemplo V Tratamiento de enfermedad autoinmunitaria con un anticuerpo conjugado a toxina, para un péptido de TCR

En el presente ejemplo, se produce un mAb inmunizando ratones con el péptido V_{\beta}8(39-59) y llevando a cabo los métodos de preparación de un hibridoma, como se ha descrito anteriormente. El mAb se conjuga después con la cadena A de la ricina, obteniendo una inmunotoxina. El anticuerpo conjugado a toxina se inyecta al mismo tiempo en ratas junto con una dosis encefalitógena de GPBP (profilaxis), y en otras ratas después de la iniciación de la EAE (tratamiento terapéutico).

El tratamiento profiláctico con el anticuerpo antipéptido de TCR conjugado a la cadena A de la ricina (1-4 inyecciones a dosis de 0,05 a 0,2 mg/kg) dio por resultado una incidencia y una gravedad de la EAE significativamente reducidas. El tratamiento terapéutico con dosis similares del conjugado dio por resultado un acortamiento significativo de la duración y una disminución de la gravedad de la enfermedad.

Ejemplo VI Tratamiento de la artritis con péptidos de TCR

El presente ejemplo describe como se trata la artritis reumatoide humana mediante la composición y los métodos de la invención. Se modela mediante dos modelos en animales: (1) artritis inducida en ratones susceptibles mediante inyección de colágeno de Tipo II (Stuart, J.M., et al., Ann. Rev. Immunol. 2:199-218 (1984), y (2) artritis inducida en ratas susceptible mediante inyección de proteína termosensible (heat shock protein) (HSP) Micobacteriana (Van Eden, W., et al., Nature 331:171-173 (1988)). Células T artritógenas que responden al colágeno o HSP y capaces de trasferir la enfermedad, son seleccionadas in vitro en presencia de colágeno o HSP usando los métodos anteriormente descritos. Se identifica el TCR asociado con células T que median en la enfermedad y se determina la presunta secuencia de aminoácidos mediante secuenciación de los ácidos nucleicos, como anteriormente. Usando los algoritmos de Margalit et al., y Rothbard et al. (supra), se sintetiza una parte inmunógena del TCR que comprende al menos parte de la región segunda de determinación de la complementariedad, y se emplea para inmunizar ratones (para artritis de colágeno) o ratas (para artritis coadyuvante).

Los animales tratados con el péptido de TCR en asociación con la inducción de la enfermedad están significantemente protegidos del desarrollo de la artritis, medida por la tumefacción de las articulaciones y por la reactividad de células T al artritógeno. Los animales tratados con el péptido de TCR después de la iniciación de la enfermedad, muestran un acortamiento significativo de la duración y una disminución de la gravedad de los síntomas de la artritis.

La inmunización pasiva con anticuerpos inducidos contra el péptido de TCR asociado con la artritis, pone de manifiesto también efectos profilácticos y terapéuticos similares sobre la inducción de la artritis. Un tratamiento con éxito se consigue mediante anticuerpos policlonales, mAbs, anticuerpos quiméricos y anticuerpos conjugados a inmunotoxina.

Ejemplo VII Tratamiento de la tiroiditis con péptidos de TCR

Se trata la tiroiditis humana, incluyendo la tiroiditis de Hashimoto y la enfermedad de Graves, mediante la composición y los métodos de la invención según se describe en el presente ejemplo. Aun cuando es incierta la naturaleza precisa del autoantígeno diana, la reactividad inmunitaria a la tiroglobulina y al receptor de tirotrofina, respectivamente, está asociada con estas enfermedades. La tiroiditis es modelada en ratones mediante la administración de tiroglobulina (Maron, R., et al., J. Exp. Med. 152:1115-1120 (1980)). Células T que responden a la tiroglobulina y a antígenos de células foliculares del tiroides, y capaces de transferir la enfermedad, son seleccionadas in vitro en presencia de o bien tiroglobulina, células del tiroides o preparaciones de membrana de celulas del tiroides, usando los métodos anteriormente descritos. Se identifica el TCR asociado con células T que median en la enfermedad, y se determina la presunta secuencia de aminoácidos mediante secuenciación de los ácidos nucleicos, como anteriormente. Usando los algoritmos de Margalit et al., y de Rothbard et al., (supra), se sintetiza una parte inmunógena del TCR que comprende al menos parte de la región segunda de determinación de la complementariedad, y se usa para inmunizar ratones.

Los animales tratados con el péptido de TCR en asociación con la inducción de la enfermedad, están significativamente protegidos del desarrollo de la tiroiditis y de la reactividad de células T a los antígenos tiroideos. Los animales tratados con el péptido de TCR después de la iniciación de la enfermedad muestran un acortamiento significativo de la duración y una disminución de la gravedad de los síntomas de la tiroiditis.

La inmunización pasiva con anticuerpos inducidos contra el péptido de TCR asociado con la tiroiditis muestra también efectos profilácticos y terapéuticos similares sobre la inducción de la enfermedad. Se consigue un tratamiento con éxito mediante anticuerpos policlonales, mAbs, anticuerpos quiméricos y anticuerpos conjugados a inmunotoxinas.

Ejemplo VIII Tratamiento de la diabetes con péptidos de TCR

La diabetes mellitus insulino-dependiente (IDDM), o diabetes de tipo I, es una enfermedad autoinmunitaria caracterizada por reactividad inmunitaria dirigida a células del islote pancreático (o beta), que resulta en la destrucción de células y el cese de la producción de insulina. Los antígenos diana para esta ataque inmunitario no han sido caracterizados con certeza. El presente ejemplo describe como se trata la IDDM mediante las composiciones y métodos de esta invención.

La enfermedad es modelada en animales en los que ocurre de modo natural, o puede ser inducida en ciertas razas de ratones (Kanasawa et al., Diabetologia 27:113 (1984). Puede hacerse que otras razas de ratones exhiban esta enfermedad mediante transferencia de linfocitos a partir de las razas susceptibles.

Células T que responden a antígenos de células del islote pancreático y que son capaces de transferir la enfermedad, son seleccionadas in vitro, en presencia o bien de células del islote pancreático o bien de preparaciones de membranas de células del islote, usando los métodos anteriormente descritos. Se identifica el TCR asociado con las células T que median en la enfermedad, y se determina la presunta secuencia de aminoácidos mediante secuenciación de ácidos nucléicos, como anteriormente. Usando los algoritmos de Margalit et al., y de Rothbard et al., (supra), se sintetiza una parte inmunógena del TCR que comprende al menos parte de la región segunda de determinación de la complementariedad, y se usa para inmunizar ratones.

Los animales tratados con el péptido de TCR en asociación con la inducción de la enfermedad están significativamente protegidos del desarrollo de la diabetes y de la reactividad de células T para los antígenos de las células del islote pancreático. Los animales tratados con el péptido de TCR después de la iniciación de la enfermedad muestran un acortamiento significativo de la duración y una disminución de la gravedad de los síntomas de la
diabetes.

La inmunización pasiva con anticuerpos inducidos contra el péptido de TCR asociado con la diabetes pone de manifiesto también efectos profilácticos y terapéuticos similares sobre la inducción de la enfermedad. Un tratamiento con éxito se consigue mediante anticuerpos policlonales, mAbs, anticuerpos quiméricos y anticuerpos conjugados a inmunotoxinas.

Ejemplo IX Tratamiento de la encefalomielitis autoinmunitaria experimental con péptido de la región V del receptor de células T

La inmunización de ratas y ratones con proteína básica de mielina (MBP) induce células T encefalitógenas que expresan un repertorio limitado de genes de la región V del receptor del células T. Los ejemplos anteriores demuestran que un péptido sintético procedente de la secuencia V_{\beta}8 de la que participan la mayor parte de los clones de células T encefalitógenos de rata, induce protección contra la EAE estimulando células T reguladoras y anticuerpos específicos. En el presente ejemplo, se demuestra que el mismo péptido de TCR, que corresponde a los restos 39-59 de la secuencia V_{\beta}8 e incluye la región segunda de determinación de la complementariedad, es altamente eficaz como tratamiento terapéutico de la EAE.

El péptido V_{\beta}8-39-59 de TCR, cuando se administra por vía subcutánea en adyuvante de Freund completo, a ratas con EAE moderada, detuvo la progresión de la enfermedad y acortó significativamente el curso de la enfermedad. Cuando el péptido de TCR se administró por vía i.d en la oreja, los efectos fueron retardados durante 1 día, pero de nuevo llevaron a una resolución más rápida de signos clínicos. Las líneas de células T seleccionadas con MBP procedentes de las ratas tratadas respondían mal a la MBP, pero retenían la reactividad respecto al péptido de TCR y fallaban en la transferencia a receptores normales. El efecto clínico rápido del péptido de TCR sugirió el desencadenamiento de una red reguladora preexistente evocada en respuesta al desarrollo de la EAE. En apoyo de este concepto, se presenta evidencia directa en el presente ejemplo de reconocimiento de células T del péptido de TCR en ratas sin tratar que padecen EAE.

A. Materiales y métodos

Animales: Se obtuvieron ratas Lewis hembra, 6-8 semanas de edad, de Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, IN). Las ratas fueron alojadas y mantenidas en la Instalación de Recursos Animales VAMN de Portland, de conformidad con las pautas Federales e Institucionales.

Antígenos: GP- o Rt-MBP fue extraída y purificada según el método de Eylar (Eylar, E.H., et al., J. Biol. Chem. 246:5770 (1971)). Fragmentos procedentes del desdoblamiento enzimático de GP-MBP incluyendo los restos 1-37, 43-89 y 90-169, un péptido sintético de GP-MBP correspondiente a los restos 72-89, y los péptidos sintéticos correspondientes a los restos 39-59 de V_{\beta}8 de TCR y V_{\beta}14 de TCR, fueron sintetizados y purificados según ha sido descrito anteriormente (Vandenbark, A.A., et al., Nature 341:541 (1989); Eylar, E.H., et al., J. Biol. Chem. 246:5779 (1971)). Estos péptidos tenían una pureza >90% mediante análisis por cromatografía líquida de alta presión.

Protocolos clínicos: Se indujo EAE en todos los experimentos mediante una inyección subcutánea (s.c) única en la planta de una pata trasera, de 50 \mug de GP-MBP en adyuvante de Freund completo conteniendo 100 \mug de M. tuberculosis H37RA (DIFCO, Detroit, MI) muertos por calor. En el protocolo de prevención, se inyectaron ratas por vía s.c en la planta de una pata trasera 40 días antes de la inducción de EAE con 100 \mug de V_{\beta}8-39-59 de TCR o V_{\beta}14-39-59 de TCR en CFA conteniendo 100 \mug de M. tuberculosis. En los protocolos de supresión, los péptidos de TCR fueron inyectados al mismo tiempo (100 \mug s.c. en CFA, o 50 \mug i.d. en 0,1 ml de solución salina en la oreja), 7 días (i.d.), u 11 días (i.d.) después de enfrentamiento con GP-MBP. En los protocolos de tratamiento, los péptidos de TCR fueron administrados o bien por vía s.c. en CFA o por vía i.d. en la oreja el primer día en que se apreciaron signos clínicos de EAE (habitualmente el día 12 después del enfrentamiento con GP-MBP). Los animales fueron calificados diariamente según los signos clínicos de la EAE, usando una escala de calificación de 0-4, en la que 0 = no hay signos; 1 = cola flácida; 2 = debilidad de las patas traseras, ataxia; 3 = parálisis de los cuartos traseros; 4 = parálisis de los cuartos frontal y traseros, estado moribundo. Los grupos que recibieron tratamiento fueron comparados con grupos testigo para establecer diferencias en la gravedad de la enfermedad y en la duración máxima de signos clínicos, mediante el ensayo de la t de Student sin emparejar. Las reacciones de hipersensibilidad de tipo retardado fueron medidas mediante el ensayo de la tumefacción de la oreja (Offner, H., et al., J. Exper. Med. 170:355 (1989) 24 y 48 horas después de inyección i.d. de 50 \mug de antígeno. Se seleccionaron líneas de células T específicas de la GP-MBP a partir de ratas tratadas con péptido de TCR y ratas sin tratar según se ha descrito anteriormente (Vandenbark, A.A., et al., J. immunol. 135:223 (1985)). Diez millones de células de la línea activada con GP-MBP fueron transferidas por vía i.p. a ratas nativas para ensayar la actividad encefalitógena y se estableció la calificación según se ha descrito antes para la EAE inducida activamente.

Proliferación de linfocitos: La activación de células T fue medida mediante la absorción de ^{3}H-timidina. 500.000 células de nódulos linfáticos o 20.000 células de la línea en presencia de 1 millón de células accesorias tímicas irradiadas fueron incubadas con medio de cultivo y antígenos en pocillos de microtitulación durante 18 horas antes de la adición de 0,5 \muBq de timidina marcada. Los cultivos celulares fueron cosechados sobre filtros de fibra de vidrio y sometidos a recuento mediante técnicas de centelleo líquido. Se calcularon las CPM medias a partir de cultivos por triplicado. Las desviaciones típicas (SD) procedentes de cultivos replicados variaron <10% respecto al valor medio.

B. Resultados

Para evaluar el efecto regulador de los péptidos de TCR sobre la EAE, el péptido V_{\beta}8-39-59, un péptido testigo, el V_{\beta}14-39-59, o solución salina, se inyectaron antes de, al mismo tiempo que, o después de la inyección de la emulsión encefalitógena, GP-MBP/CFA. Las calificaciones clínicas medias, diarias, de los protocolos más eficaces de prevención, supresión y tratamiento, están presentados en las Figuras 3-5, y todos los grupos ensayados están resumidos en la Tabla 15.

Efectos clínicos de TCR/CFA. La inyección del péptido V_{\beta}8-39-59 en CFA 40 días antes del enfrentamiento con GP-MBP indujo protección completa contra la EAE clínica (Figura 3). Además, la inyección simultánea del péptido en CFA con la emulsión encefalitógena suprimió la EAE, reduciendo la incidencia (8/13 en el grupo tratado frente a 26/26 en los testigos), la gravedad (calificación de 1,3 frente a 3,4), y la duración (2,0 frente a 6,6 días) de enfermedad clínica (Figura 3, Tabla 15). Las ratas inyectadas 40 días antes de la inducción de la EAE o al mismo tiempo que la inducción, con el péptido V_{\beta}14-39-59 en CFA, o con CFA solo, desarrollaron EAE que no pudo distinguirse de los testigos (Tabla 15).

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 15 Prevención, supresión y tratamiento de la EAE con el péptido V_{\beta}8-39-59 de TCR

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Para evaluar sus efectos terapéuticos, el péptido V_{\beta}8-39-59 de TCR en CFA se inyectó s.c. en ratas el primer día o a la iniciación de signos clínicos. Las ratas en el momento de este tratamiento exhibían debilidad de las patas traseras, ataxia e incontinencia (un grado medio de 1,8). Como se muestra en la Figura 3, el tratamiento con el péptido de TCR/CFA previno la progresión posterior de signos clínicos y acortó la duración de la EAE desde 6,6 días (testigos) a 3,5 días. El tratamiento con V_{\beta}14-39-59 de TCR/CFA o CFA solo no tuvo efecto sobre la EAE clínica (Tabla 15).

Efectos clínicos del péptido de TCR administrado por vía i.d. Para evitar el empleo de CFA, se llevó a cabo una evaluación de los efectos sobre la EAE de administrar una solución salina del péptido de TCR, por vía intradérmica, en la oreja. Como se muestra en la Figura 4, la administración i.d. de 50 \mug del péptido de TCR al mismo tiempo que el enfrentamiento encefalitógeno (día 0), o en los días 7 u 11 después del enfrentamiento, tuvo en todos los casos efectos supresores similares sobre la EAE, reduciendo la gravedad clínica máxima desde 3,4 a 1,7-1,8, y acortando la duración de la EAE desde 6,6 días a 3-4 días (Tabla 17).

Cuando el péptido de TCR fue inyectado el día en que se apreciaron por primera vez signos clínicos (calificación clínica media de 1,9), no se observó efecto clínico sobre la EAE durante el primer día; sin embargo, durante los días siguientes, la gravedad de la EAE se redujo marcadamente con respecto a la de los testigos (Fig. 5). La dosis de 50 \mug/rata de péptido de TCR causó una resolución más rápida de la EAE (3,1 días) que la dosis más baja de 10 \mug de péptido/rata (4,0 días) en comparación con 6,6 días para los testigos.

El efecto rápido del péptido V_{\beta}8-39-59 de TCR en la resolución de la EAE clínica sugirió que el tratamiento con el péptido podía haber desencadenado una respuesta de recuerdo al TCR, inducida inicialmente en respuesta a la EAE. Para documentar esta posibilidad in vivo, ratas que padecían o que se habían recuperado de la EAE inducida con GP-MBP/CFA (sin exposición previa al péptido de TCR) tenían una respuesta de DTH significativa con respecto al péptido V_{\beta}8 (p<0,01 en comparación con ratas nativas o ratas inmunizadas con CFA), pero no con respecto al péptido V_{\beta}14 (Tabla 16). La magnitud de la respuesta al péptido V_{\beta}8 en ratas que padecían EAE fue comprensiblemente menor que la respuesta en ratas inmunizadas previamente con un régimen protector de péptido de TCR en CFA (Tabla 16).

Respuestas de células T en ratas protegidas. Para evaluar los efectos del tratamiento terapéutico con péptido V_{\beta}8 de TCR sobre las respuestas de células T, fueron ensayadas células de nódulos linfáticos (LNC) que drenaban el sitio de inyección de la GP-MBP/CFA, para determinar la proliferación inducida por el antígeno, y expandidas luego a líneas de células T. Como muestra la Tabla 17, las LNC procedentes de ratas tratadas con V_{\beta}8-39-59 de TCR tenían un nivel elevado de proliferación de fondo (47.000 CPM), y respuestas similares a la GP-MBP y otros antígenos de ensayo. Las líneas de células T seleccionadas con la GP-MBP (MBP/1º) respondían débilmente a la selección de antígeno y no respondían en absoluto a MBP-Rt y S72-89 de GP. La máxima respuesta de esta línea fue al péptido V_{\beta}8-39-59 de TCR. Con el reconocimiento débil de la GP-MBP y fuerte respuesta al TCR, no fue sorprendente que la línea de células T fallara a transferir signos clínicos de EAE a rata nativas (Tabla 17). Un esquema similar de alta respuesta al TCR y baja reactividad a la GP-MBP y otros antígenos, se observó también en la línea de células T (V_{\beta}8/1º) seleccionada con V_{\beta}8-39-59 de TCR (Tabla 17).

Por el contrario, LNC procedentes de ratas recuperadas de EAE sin tratar respondieron del modo predecible a GP-MBP, Rt-MBP y GP-S72-89 (Tabla 17). Inesperadamente sin embargo, estas LNC respondieron también al péptido V_{\beta}8-39-59 de TCR y en un grado menor al péptido V_{\beta}14-39-59. Cuando se seleccionaron con GP-MBP, la línea de células T resultante respondió fuertemente a epítopos de MBP, y transfirió EAE clínica grave a receptores nativos a pesar del bajo nivel de actividad residual para el péptido V_{\beta}8 de TCR (Tabla 17). Por selección posterior con el péptido V_{\beta}8 de TCR, la respuesta específica a este péptido de TCR fue amplificada, aun cuando persistía un nivel bajo de respuesta a la GP-MBP y el S72-89. Selección adicional con el péptido V_{\beta}14 de TCR amplificó solamente las células T reactivas con V_{\beta}14. Por tanto, en ambas lineas seleccionadas de TCR, el esquema de respuestas verificó la presencia de células T reactivas con el TCR procedentes del LN de ratas restablecidas de la EAE. Como indica la Figura 8, se observaron DTH y respuestas proliferativas fuertes en animales previamente inmunizados con los respectivos péptidos de TCR/CFA. Las ratas previamente inmunizadas con los péptidos V_{\beta}8- del TCR pero no con el péptido V_{\beta}14 de TCR estaban protegidas en el enfrentamiento subsiguiente con laGP-MBP/CFA. Se observaron también respuestas significativas de DTH y proliferativa fuerte al péptido V_{\beta}8- de TCR, en ratas restablecidas de la EAE que nunca habían sido inmunizadas con el péptido sintético, lo que indica que había sido inducida una respuesta reguladora natural al péptido V_{\beta}8- de TCR, como consecuencia del proceso de la enfermedad de EAE.

Un modelo de MS adicional, bien conocido, es la EAE en el ratón que, en contraste con ratas, se caracteriza por una progresión clínica reincidente. Grupos de 6 ratones SJL/J fueron inyectados con el péptido 139-151 de apoproteína proteolípida (PLP) en CFA. El primer día de la iniciación de signos clínicos (día 14), los ratones recibieron 50 \mug de un péptido sintético que correspondía a los restos 1-17 de la secuencia V_{\beta}17 de TCR por administración i.v. i.d., o s.c. Como muestra la Figura 9, ambas inyecciones, la s.c y la i.d., del péptido de TCR redujeron la gravedad y acortaron la duración de la enfermedad en el episodio inicial y en la EAE reincidente.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 16 Respuestas de hipersensibilidad retardada a péptidos de TCR

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C. Discusión

Este ejemplo demuestra claramente la administración terapéutica del péptido V_{\beta}8-39-59 de TCR en la EAE, que es concordante con los ejemplos anteriores que demuestran la eficacia del péptido de TCR para prevenir y suprimir la EAE. El efecto clínico rápido, así como también las respuestas de DTH y de proliferación de linfocitos al péptido de TCR, indican que respuestas de células T al péptido V_{\beta}8 de TCR estaban presentes ya en ratas que padecían EAE, que nunca habían sido inmunizadas a este propósito con el péptido sintético.

La inmunización previa con el péptido V_{\beta}8 en CFA durante 40 días antes del enfrentamiento con la GP-MBP fue el protocolo más eficaz ensayado (Figura 3 y Tabla 15). Resulta evidente que este período de inmunización es óptimo para la inducción tanto de células T protectoras como de anticuerpos para el péptido V_{\beta}8 de TCR. La inyección del péptido V_{\beta}8 de TCR al mismo tiempo que el enfrentamiento con la GP-MBP fue menos protectora que la inmunización previa, pero este protocolo todavía suprimió completamente todos los signos clínicos de la EAE en más del 30% (6/19) de las ratas (Tabla 15). En el resto, el curso clínico de la EAE fue más corto y más benigno. La inyección del péptido V_{\beta}8 de TCR después del enfrentamiento con la GP-MBP pero antes de la iniciación de la EAE clínica, fue asimismo eficaz, previniendo completamente la iniciación de la EAE en 4/19 ratas, y reduciendo, en general, la gravedad y duración de la enfermedad en el resto (Tabla 15).

Un aspecto sorprendente del presente ejemplo es el efecto clínico casi inmediato del péptido V_{\beta}8 de TCR inyectado en animales enfermos. Todas las ratas que habían recibido tratamiento terapéutico con el péptido de TCR se restablecieron de la EAE con mayor rapidez que los testigos. Las inyectadas con péptido de TCR en CFA no progresaron clínicamente antes del restablecimiento. Las inyectadas con péptido de TCR por vía intradérmica progresaron el primer día, pero luego se recuperaron tan deprisa como las ratas inyectadas con TCR/CFA. Ambas dosis de péptido, la de 10 \mug y 50 \mug, aceleraron la recuperación, pero la dosis más alta resolvió la EAE un día más pronto que la dosis más baja.

El tratamiento terapéutico con el péptido de TCR mostró ser efectivo regulando en descenso las respuestas de células T a determinantes encefalitógenos de GP-MBP. Las células de los nódulos linfáticos procedentes de las ratas tratadas con el péptido de TCR, enfrentadas con la GP-MBP tenían niveles altos de proliferación de células, pero no tenían respuestas específicas a BP (Tabla 17). Sin embargo, las líneas de células T seleccionadas con la GP-MBP proliferaron en presencia de GP-MBP y el péptido V_{\beta}8 de TCR, pero no el péptido V_{\beta}14 de TCR, lo que indica la presencia de especificidades tanto efectoras como de células T reguladoras. El que esta mezcla de células no pudiera transferir la EAE puede ser atribuible al dominio aparente de células reactivas de V_{\beta}8 de TCR (netas 49.000 CPM) sobre las células reactivas con GP-MBP (netas 12.000 CPM) o células reactivas de S72-89 (netas 3.000 CPM). Por contraste, las LNC procedentes de ratas restablecidas de la EAE que habían sido enfrentadas inicialmente con la GP-MBP pero sin tratar con el péptido V_{\beta}8 de TCR reconocían la GP-MBP, la Rt-MBP y el S72-89, y en un grado menor los péptidos V_{\beta}8 y V_{\beta}14 de TCR (Tabla 17). Las líneas de células T seleccionadas con GP-MBP eran altamente encefalitógenas, debido lo más probablemente al dominio de células T reactivas con GP-MBP (netas 84.000 CPM) sobre las células T reactivas con V_{\beta}8 de TCR (netas 9.000 CPM). La persistencia de células T reactivas con el péptido V_{\beta}8 de TCR en las líneas seleccionadas con GP-MBP es algo inusual puesto que las líneas de células T seleccionadas con un antígeno típicamente pierden las respuestas a todos los otros antígenos. No se ha detectado reactividad cruzada entre la GP-MBP y el péptido V_{\beta}8 de TCR.

Las ratas Lewis no recaen espontáneamente cuando la EAE es inducida con MBP/CFA. Aun cuando este curso monofásico de la EAE no permite el ensayo del tratamiento terapéutico con el péptido V_{\beta}-39-59 de TCR sobre la recaída de la enfermedad, proporciona la oportunidad de determinar si los mecanismos fuertes de recuperación en esta raza incluyen respuestas inmunitarias al péptido V_{\beta}8 de TCR. Las células T de ratas de Lewis que responden a cualquiera de los dos determinantes encefalitógenos (secuencia 72-84 u 87-99) de MBP, utilizan preferentemente la combinación génica V_{\alpha}2/V_{\beta}8 en su TCR. La inyección de células T encefalitógenas vivas o atenuadas pueden inducir protección contra la EAE, así como también respuestas idiotípicas y "ergotípicas". La frecuencia aumentada de células T encefalitógenas inducidas durante la EAE puede tener el mismo efecto de perturbar la red reguladora, y puede pensarse que al menos una parte de esta red está dirigida de modo natural en la secuencia V_{\beta}8-39-59 de
TCR.

Los datos presentes apoyan este argumento. Ratas enfermas o restablecidas a las que se había administrado el péptido V_{\beta}8 de TCR tenían respuestas de DTH a este péptido pequeñas pero significativas, pero no DTH al péptido V_{\beta}14 correspondiente (Tabla 16). Además, las células de los nódulos linfáticos procedentes de ratas restablecidas respondían mejor al péptido de TCR V_{\beta}8, y las células T específicas para cualquiera de los dos péptidos pudieron ser enriquecidas mediante técnicas de selección in vitro (Tabla 17). En conjunto, tales descubrimientos proporcionan evidencia directa de la inducción natural de inmunidad a la secuencia V_{\beta}8-39-59 de TCR expresada mediante células T encefalitógenas. Sin embargo, este puede no ser el único determinante importante sobre el TCR, dado que otras secuencias dentro de las cadenas \alpha o \beta del TCR inducen también células T reguladoras y anticuerpos. Los efectos protectores, supresores y terapéuticos de la región V_{\beta}8-39-59 demuestran claramente su importancia como determinante para la regulación idiotípica de la EAE.

Además, los datos presentados para los ratones SJL/J, que experimentan un curso clínico bifásico de EAE, demuestranque la administración de un péptido V_{\beta}17 de TCR, al comienzo de los signos clínicos, reduce la gravedad y duración de los síntomas tanto durante el episodio inicial como en la recaída. Esto proporciona apoyo adicional de la importancia de los péptidos de la región V del TCR como herramientas para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias puestas de modelo por la EAE.

Ejemplo X Especificidad de clones de células T humanas reactivos con epitopes inmunodominantes de proteína básica de mielina Introducción

La proteína básica de mielina (MBP) es altamente antigénica, y causa encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE) en una diversidad de especies animales cuando se inyecta con adyuvantes (Alvord, E.C., Jr., en Experimental Allergic Encephalomyelitis: A useful model for multiple sclerosis, Alvord, E.C., Jr., et al. (compiladores), Alan R. Liss, Inc., Nueva York, páginas 523-537 (1984).

La propiedad encefalitógena de la MBP está incluida dentro de un número discreto de epítopos inmunodominantes (aproximadamente 10). Dentro de cada raza, uno o más de estos epítopos, en asociación con las moléculas MHC de Clase II disponibles, induce linfocitos efectores T CD4+ que vuelven al sistema nervioso central (CNS), ocasionando lesiones inflamatorias perivasculares y disfunción nerviosa (Zamvil, S.S., et al., J.Immunol. 139:1075 (1987); Offner, H., et al., J. Exp. Med. 170:355 (1989)).

El fondo genético, que incluye tanto genes MHC como no-MHC, influye el que epítopos de MBP sean encefalitógenos (Beraud, E., et al., J. Immunol. 136:511 (1986); Zamvil, S.S., et al., J. Exp. Med. 162:2107 (1985)), el curso clínico y la gravedad de la enfermedad (Fritz, R.B., et al., J. Immunol. 134:2328 (1985); Hinrich, D.J., et al., J. Exp. Med. 166:1906 (1987); Linthicum, D.S., et al., J. Exp. Med. 155:31 (1982); Dietsch, G.E., et al., J. Immunol. 142:1476 (1989); Mokhtarian, F., et al., Nature (Londres) 309:356 (1984)), desmielinación (Mokhtarian, F., et al., Nature (Londres) 309:356 (1984)), y mecanismos de resistencia (Bernard, C.C., Clin. Exp. Immunol. 29:100 (1977); Welch, A.M., et al., J. Immunol. 125:186 (1980); Varriale, S., et al., J. Immunol. 125:186 (1989); Whitham, R.H., et al., Cell. Immunol. 126:290 (1990)).

El espectro de signos clínicos e histológicos inducidos por células T específicas de MBP se asemeja en muchos modos a las enfermedades humanas esclerosis múltiple (MS) y encefalomielitis aguda diseminada (ADE) (Paterson, P.Y., Adv. Immunol. 5: 131 (1966); Waksman, B.H., et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 175:282 (1984)). Por consiguiente, el reconocimiento de células T humanas de la MBP ha sido de un considerable interés.

Hay varias líneas de evidencia que sugieren la implicación de células T, incluyendo las específicas para la MBP humana, en la patogénesis de la MS. Estudios genéticos realizados indican desequilibrio de ligamiento entre los genes de las regiones V y C de los receptores de células T dentro de familias con MS (Hauser, S.L., et al., Neurology 39:275 (1989); Beall, S.S., et al., J. Cell. Biochem. 11D:223 (1987)) o entre pacientes, en general (Oksenberg, J.R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:988 (1989)). Sin embargo, la implicación actual de células T reactivas con MBP en la patogénesis de la MS solamente puede ser demostrada si la regulación o separación selectiva de células T reactivas con MBP puede afectar al proceso de la enfermedad. Tal regulación selectiva no es posible en la EAE.

En el presente ejemplo, se usó un péptido sintético de TCR para inducir células T reguladoras y anticuerpos dirigidos contra el TCR sobre las células T perniciosas. Este enfoque previno la inducción de EAE. Además, como se ha demostrado en el ejemplo anterior, la administración del péptido de TCR a ratas clínicamente enfermas detuvo la progresión de la enfermedad y aceleró la recuperación. La aplicación de este enfoque para la regulación de células T potencialmente encefalitógenas en pacientes con MS, depende de si o no células T reactivas con MBP, utilizan preferentemente un número limitado de genes de la región V del TCR en respuesta a epítopos inmunodominantes de MBP humana.

A este fin, se seleccionaron líneas de células T procedentes de pacientes con MS y testigos, de un modo que permitía la aparición de células T que reconocen epítopos de MBP inmunodominantes. A partir de estas líneas, fueron aislados 109 clones de células T específicos de MBP y caracterizados por fenotipo, especificidad del epítopo, restricción de MHC, y expresión del gen V de TCR. Los datos demuestran, a nivel clonal, que las células T procedentes de pacientes con MS reconocen más y diferentes epítopos de MBP que las células T procedentes de donantes normales. Además, en un donante con MS con el haplotipo HLA-DR2/DQwl asociado a la enfermedad, 4 de 8 clones de células T ensayados expresaban el fenotipo V_{\beta}5.2, lo que indica el uso preferente del gen V de TCR en respuesta a la MBP.

A. Materiales y métodos

Sujetos humanos: Los pacientes con MS evaluados en esta estudio incluían 11 pacientes con MS clínicamente definida o basada en ensayos de laboratorio, que estaban siendo atendidos en la clínica de MS de la Oregon Health Sciences University. Habíaa 7 mujeres y 4 hombres (edad media 46 años, amplitud 34-67 años), que padecían MS desde 6-35 años. Los pacientes tenían un índice de ambulación medio (ambulation index)(AI) de 3,4 \pm 1,6 (amplitud 1-6) y una calificación media del estado de incapacidad de Kurtzke (disability status score) (KDSS) de 4,3 \pm 2,0 (amplitud 2-4) (Kurtzke, J.F., Neurology 15:654 (1965)).

Los individuos normales incluían 6 mujeres y 3 hombres empleados (edad media 36 años, amplitud 25-55 años) procedentes del Veterans Affairs Medical Center y de la Oregon Health Sciences University. Estos individuos normales habían sido seleccionados en base a respuestas positivas de proliferación de PBL a MBP humana según se ha descrito anteriormente (Vandenbark A.A., et al., J.Neurosci. Res. 23:21 (1989)).

Todos los individuos habían sido tipificados en el sistema HLA con anterioridad a la selección de líneas de células T, mediante un método serológico estándar utilizado por el Laboratorio de Trasplantes de la Universidad de Ciencias de la Salud de Oregón. La frecuencia de alelos de Clase II HLA (DR,DQ) mostró una distribución desigual para DR2 (7 de 11 pacientes-63%-eran DR2 positivos; 3 de 9 normales-33%-eran DR2 positivos), que, en general, representaba la incidencia esperada para estos dos grupos (Theofilopoulos, A.N., en Basic and Clinical Immunology, Stites, D.P., et al., (compiladores), Appleton and Lange Publishers, Los Altos, CA, páginas 151-154 (1987)).

Antígenos: MBP humana (Hu-MBP) se extrajo y purificó a partir de cerebro humano congelado, fragmentado, (Eylar, E.H.., et al., Arch. Biochem. Biophys. 132:34 (1969)). Péptidos de Hu-MBP, incluyendo P1 (restos 45-89), P2 (restos 1-38) y P4 (restos 90-170), fueron obtenidos mediante desdoblamiento péptico y purificados por cromatografía de intercambio iónico en Sephadex, y cromatografía líquida de alta presión (Chou, C.H.-J., et al., J. Neurochem. 28:115 (1977)). Una serie de péptidos sintéticos que correspondían a las secuencias 13-28, 39-54, 55-74, 72-84, 87-99, 90-109. 110-129, 130-149, y 149-170 de la Hu-MBP fueron sintetizados mediante el método en fase sólida de Merrifield y purificados por HPLC según métodos que han sido descritos con anterioridad (Hashim, G.A., et al., J.Neurosci. Res. 16:467 (1986)).

Líneas de células T: Se seleccionaron líneas de células T reactivas con MBP humana, a partir de la sangre de 11 pacientes con MS y 9 individuos normales que habían respondido aa la Hu-MBP en ensayos previos de rastreo (Vandenbark, A.A.., et al., J. Neurosci. Res. 23:21 (1989)). Células mononucleadas sanguíneas (MNC) fueron separadas mediante centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll y cultivadas con 50 \mug/ml de Hu-MBP en medio completo (RPMI 1640 con albúmina de suero humano al 10%, L-glutamina, piruvato de sodio y antibióticos) a una densidad de células de 5x10^{5} por pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo redondo, durante 5 días, a 37ºC, en una atmósfera con 5% de CO_{2}. Las células estimuladas fueron transferidas a medio rico en IL-2 (que contenía 50 u/ml de IL-2 recombinante, AMGEN Biologicals, Thousand Oaks, CA) para expandir las células T activadas. Cuando el crecimiento en IL-2 se hizo más lento, las células T fueron reestimuladas con 25 \mug/ml de Hu-MBP presentada mediante monocitos autólogos contenidos en MNC de sangre periférica irradiada (4.500 rad) en la proporción de 1:10 (T:MNC). Las líneas de células T fueron reestimuladas 4-5 veces hasta que el número de células fue suficiente para evaluar la especificidad de epítopos de MBP, restricción de MHC y fenotipo.

Clonación de células T: Se obtuvieron clones de células T por dilución limitante de líneas de células T específicas de MBP que habían sido reestimuladas dos veces con Hu-MBP. Al cabo de 4 días en medio enriquecido con IL-2, los linfoblastos T fueron diluidos a 1, 10 y 30 células/20 \mul de medio de cultivo que contenía Hu-MBP (50 \mug/ml), IL-2 (50 u/ml)y MNC irradiadas (1,5 x 10^{6}), y la mezcla de células se colocó en cada uno de los pocillos de una bandeja de microensayo Tarasaki de 60 pocillos (NUNc Inc., Naperville, IL) (Lamb, J.R., et al., J. Immunol. 128:233 (1982)). La recuperación de clones específicos de la MBP humana fue de la máxima eficacia cuando al menos 10 células de la línea reactiva con Hu-MBP fueron sembradas por pocillo, produciendo un grado de recuperación del 20%. Cuando solamente se sembró por pocillo una célula de la línea, el grado de recuperación fue 2%. Las células T reactivas con Hu-MBP fueron reclonadas por siembra a 1 célula/pocillo. Las bandejas de Tarasaki fueron incubadas a 37ºC y CO_{2} al 5% durante 7 días. Para reestimulación, las células procedentes de cada pocillo positivo fueron transferidas a un pocillo único de una placa de 86 pocillos de fondo redondo, al que se añadieron 200 \mul de medio completo con 25 \mug/ml de Hu-MBP y 2x10^{5} MNC irradiadas. Se añadieron a las células 50 \mug/ml de IL-2 el tercer día después de la estimulación y las células se mantuvieron en IL-2 durante otros cuatro días. Cuando el número de células alcanzó 2-4x10^{5}, los cultivos fueron transferidos a una placa de 24 pocillos en 1 ml, y reestimuladas con Hu-MBP en presencia de 3x10^{6} MNC autólogas irradiadas, y expandidas más tarde en 2 ml de medio rico en IL-2.

Ensayo de proliferación: Se evaluó la especificidad de la respuesta de las células incubando 2x10^{4} células T con 1x10^{5} MNC sanguíneas autólogas, irradiadas (4.500 rad) en cultivos de 0,2 ml triplicados en una placa de mitrotitulación de fondo redondo, de 96 pocillos, en ausencia de antígenos y en presencia de 2 \mug/ml de Con A, 50 \mug/ml de Hu-MBP, 50 \mug/ml de fragmentos de Hu-MBP (P1, P2 y P4), 50 \mug/ml de péptidos sintéticos de Hu-MBP, y antígeno de virus herpes símplex (HSV) (Whittaker M.A. Bioproducts, Walkersville, MD) diluido 1/200. Los cultivos de microtitulación fueron incubados durante 3 días a 37ºC en CO_{2} al 5%, y fueron impulsados con 0,5 uBq de ^{3}H-TdR durante las últimas 18 horas. Las células fueron cosechadas sobre filtros de fibras de vidrio y se sometió a recuento la ^{3}H-TdR incorporada usando un contador de centelleo-\beta. La proliferación fue expresada como CPM de cultivo estimulado \pm SD (restado el ruido de fondo). Los ruidos de fondo variaban desde 200 a 2.000 CPM. La restricción de MHC se evaluó incubando las células T más Hu-MBP, fragmentos de Hu-MBP o péptidos sintéticos de Hu-MBP en presencia de anticuerpos específicos para determinantes estructurales de moléculas procedentes de los locus HLA-DP, -DQ o -DR (los anticuerpos fueron adquiridos de Becton Dickinson Pharmaceuticals, Mountain Wiew, CA).

Determinación del fenotipo de células T: Se determinó el fenotipo de líneas de células T y clones usando anticuerpos monoclonales Leu 3a (anti-T cooperadoras CD4+) y Leu 2a (anti T CD8+ citotóxicas/supresor) (Becton Dickinson), según se ha descrito con anterioridad (Vanderbak, A.A., et al., J. Neuroimmunol. 8:103 (1985)). Se determinó el fenotipo de clones de células T para la expresión de productos génicos de la cadena V\beta del TCR usando anticuerpos monoclonales de ratón específicos para V\beta5.2/5.3 (5A), V\beta5.3 (5B), V\beta6.7, V\beta8.1 y V\beta12, de TCR humanos (DIVERSI-T^{m} a\beta TcR Screening Panel 1A, T Cell Sciences Inc., Cambridge, MA). Dos x 10^{5} células T fueron incubadas con 5 \mul decada uno de los anticuerpos durante 1 horas a 4ºC, seguido de 3 lavados con medio que contenía AB de suero humana al 5% e incubación posterior con IgG anti-ratón de cabra conjugada a FITC, durante 30 minutos. Después de 2 lavados y fijación en formaldehído al 2%, las células teñidas fueron evaluadas por inmunofluorescencia usando un citómetro de flujo FACScan.

B. Resultados

Caracterización de líneas de células T específicas de Hu-MBP procedentes de pacientes con MS y normales. Líneas de células T específicas de Hu-MBP fueron seleccionadas partiendo de la sangre de 11 pacientes con MS y 9 donantes normales, con respuestas de proliferación. demostradas con anterioridad, a Hu-MBP. Cada una de las líneas se seleccionó partiendo de 30-50 millones de células sanguíneas mediante estimulación repetida con Hu-MBP total y expansión con IL-2. Basándose en la experiencia previa en la selección de líneas de células T de roedor, estas condiciones podrían permitir la expansión y enfoque de respuestas de células T representativas hacia epítopos de Hu-MBP inmunodominantes.

Las líneas de células T procedentes de pacientes con MS y donantes normales respondían igualmente bien tanto a la Hu-MBP como al Con A, con respuestas despreciables a antígenos de HSV (Figura 6). Las líneas de células T fueron evaluadas para determinar la respuesta a fragmentos de desdoblamiento enzimático altamente purificados que abarcan la secuencia completa de la Hu-MBP, incluyendo P1 (restos 45-89), P2 (restos 1-38) y P4 (restos 90-170=. Ocho de las 11 líneas de MS respondían a los 3 fragmentos de Hu-MBP, dos respondían a 2 de los 3 fragmentos, y solamente 1 línea respondía a un solo fragmento. Por contraste, 5 de 9 líneas normales respondieron a un solo fragmento, 3 líneas respondieron a todos los fragmentos y 1 línea no respondió a fragmento alguno. La proporción de respondedores al fragmento 45-89 fue significativamente mayor en el grupo de la MS frente a los testigos, y por término medio, las líneas de células T de MS eran significativamente más reactivas a ambos fragmentos, el 45-89 (P1) y el 1-38 (P2) de la Hu-MBP (Figura 6). Sin embargo, no había diferencia en la frecuencia ni en la magnitud de la respuesta al fragmento 90-170 (P4). Todas las líneas de células T humanas tenían un fenotipo mixto de células T CD4+ y CD8+. Sin embargo, las líneas de células T procedentes de pacientes con MS tenían una proporción relativamente mayor de subpoblación CD4+ y una proporción relativamente inferior de subpoblación CD8+ en comparación con las de los donantes normales (78 \pm 13% frente a 58 \pm 8% para células CD4+; 15 \pm 6% frente a 30 \pm 12% para células CD8+, Tabla 18).

Selección y caracterización de clones de células T específicos de Hu-MBP. Aun cuando la gama general de epítopos inmunodominantes de células T sobre la Hu-MBP puede deducirse del esquema de reactividad de líneas de células T para péptidos de Hu-MBP, la prueba del reconocimiento de células T debe derivarse del análisis de clones. A este fin, un total de 109 clones de células T específicas de MBP humana procedentes de 7 líneas de células T de MS (50 clones) y 6 líneas de células T de normales (59 clones) fueron evaluadas para determinar la respuesta a Hu-MBP, fragmentos de Hu-MBP y péptidos sintéticos. Los donantes de las líneas de células T eran comparables, excepto por la distribución de HLA-DR2 (86% de los pacientes con MS frente a 33% de los normales, eran DR2-positivos; véase la Tabla 19).

La totalidad de los clones de células T respondían a la Hu-MBP, pero no al antígeno del virus del herpes simplex (HSV), con un nivel similar de respuesta en ambos grupos. En total, 48 clones de células T (distribuidos igualmente entre los dos grupos) fueron sometidos a determinación del fenotipo para los alelos marcadores CD4 y CD8. De ellos, 45 clones eran CD4+ y 3 (procedentes de un donante normal) eran CD8+ (Tabla 18). Esta predominancia de clones CD4+ era esperada según la experiencia previa obtenida en ratas y ratones, pero no reflejaba la proporción relativa de estos subconjuntos en las líneas de células T desde las que habían derivado los clones (Tabla 18).

Las especificidades clonales reflejan el esquema de respuestas de las líneas de células T. Con objeto de establecer la validez del análisis clonal, es importante evaluar cómo las especificidades clonales de las células T representan las respuestas de las líneas de células T. En las líneas que proporcionaron suficientes clones para la comparación, el número de clones que respondían específicamente a un fragmento claro de MBP mostró una correlación significativa con la respuesta dirigida por el fragmento de Hu-MBP de la línea de células T originaria (ensayo de Chi-cuadrado emparejado, p < 0,05).

TABLA 18 Distribución fenotípica de 7 líneas de células específicas de MBP y clones procedentes de pacientes con MS e individuos normales

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TABLA 19 Especificidades de péptidos de clones de células T procedentes de pacientes con MS e individuos normales

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18

En La Figura 7 se muestran comparaciones representativas entre 3 donantes con MS y 2 donantes normales. Basado en el esquema de respuestas de líneas de células T, era de esperar que pudieran seleccionarse más clones reactivos para P1 y para P2 partiendo de las líneas de células T de MS que de las líneas testigo, pero que la frecuencia de clones reactivos para P4 sería relativamente igual. Este fue el caso sin duda, que se indica en la Tabla 19. Inesperadamente, 46 de los 109 clones de células T reactivos con MBP no respondieron a ningún fragmento aislado de Hu-MBP, aun cuando la respuesta a Hu-MBP fue vigorosa, variando desde 10.000 a 27.000 cpm con solo un ruido de fondo de 1.000-2.000 cpm. Este descubrimiento fue más frecuente en el grupo normal que en el grupo con MS, en gran parte sobre la base de un único donante normal (Tabla 19).

Especificidades clonales sesgadas dentro de P4. Aun cuando la región P4 de la Hu-MBP representa la mitad C terminal de la molécula, aproximadamente 2/3 (41 de 63) de los clones reactivos a péptidos de Hu-MBP respondían a esta fragmento. Para identificar especificidades de epítopo, 23 de estos clones procedentes de 4 donantes normales y 4 donantes con MS fueron ensayados en un ensayo de proliferación frente a una serie de péptidos sintéticos correspondientes a diferentes porciones de la región P4. Como se muestra en la Tabla 20, la distribución clonal estaba sesgada en donantes normales hacia la secuencia 110-129, y en donantes con MS hacia la secuencia 130-149. Las respuestas a la secuencia 149-171 fueron similares en ambos grupos, y solamente un clon de MS respondió a la secuencia 87-99 (Tabla 20).

El HLA-DR2 es capaz de restringir epítopos múltiples de Hu-MBP. La asociación del haplotipo HLA-DR2/Dqwl con MS sugiere que estas moléculas de Clase II, en especial DR2, podrían jugar un papel crítico en la restricción de respuestas de células T CD4+ a autoantígenos del CNS. A este fin, los epítopos de Hu-MBP reconocidos por 17 clones de células T procedentes de 3 donantes HLA-DR2/Dqw1 están resumidos en la Tabla 21. En total, este conjunto de clones de células T reconocieron a P2 (3 clones), P1 (1 clon), P4 (8 clones), o ningún péptido (5 clones). Dentro de P4, 1 clon de MS reconoció el epítopo 87-99, 1 clon de uno normal reconoció el epítopo 110-129, 1 clon de MS reconoció el epítopo 130-149, y 4 clones (3 de MS y 1 normal) reconocieron el epítopo 149-171. Las respuestas en 7 de 7 clones reactivos con P4 ensayados, fueron inhibidas con anticuerpo anti-HLA-DR, lo que implica claramente a DR2 como el elemento de restricción (Tabla 21). Dado que el locus DR es usado predominantemente en la restricción de respuestas de células T humanas a MBP, es probable que la mayoría de los 10 clones sin ensayar estuvieran restringidos también por DR2. En cualquier caso, es claro que el DR2 puede restringir una amplia variedad de epítopos de Hu-MBP en el hombre.

Uso del gen de V\beta del TCR por clones de células T reactivos con Hu-MBP. El uso preferente de las familias génicas V_{\alpha} y V\beta del TCR por células T específicas de MBP, encefalitógenas, procedentes de ratas y ratones, ha llevado con éxito a estrategias de vacunación y de tratamiento terapéutico dirigidas contra secuencias comunes del TCR sobre las células T perniciosas. Se desconoce, sin embargo, si un mecanismo similar en el hombre conduce al uso restringido de genes V de TCR en respuesta a MBP u otros antígenos. Para comenzar el análisis del uso del gen V de TCR, 38 clones de células T (19 procedentes de cada grupo) fueron sometidos a determinación del fenotipo para expresión de productos génicos de V\beta, usando un panel de 5 anticuerpos monoclonales específicos para V\beta5.2, V\beta5.3, V\beta6.7, V\beta8.1 y V\beta12 (Tabla 22). La expresión geníca de V del TCR pudo ser identificada positivamente en seis de los clones, todos procedentes de donantes con MS: Dos de estos clones expresaron el V\beta6.7, mientras que los otros clones expresaron el V\beta5.2, De los clones V\beta5.2+, 1 procedía de un donante DR2,4, y 3 eran de un donante homozigótico DR2. Un clon adicional procedente del donante homozigótico DR2 expresó mRNA reordenado para V\beta5.2, lo que indica que en estos individuos, 4/8 clones analizados usan el mismo gen V\beta del TCR en respuesta a la MBP-Hu, aun cuando cada uno de ellos tiene una especificidad de epítopo diferente (Tabla 22).

TABLA 20 Especificidades de epítopos de clones de célula T reactivos con P4 procedentes de pacientes con MS e individuos normales

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TABLA 21 Especificidades de epítopos de MBP humana en donantes homozigóticos DR2/DQw1

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TABLA 22 Expresión de la cadena V_{\beta} del receptor de células T de clones de células T reactivos con MBP

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C. Discusión

El presente ejemplo demuestra claramente al nivel clonal que los pacientes con MS tienen un esquema más complejo y alterado de reconocimiento de células T, de epítopos de Hu-MBP inmunodominantes que los respondedores de Hu-MBP normales. Estos datos sugieren una exposición aumentada a formas inmunógenas de Hu-MBP en pacientes con MS, aumentando con ello la probabilidad de inducir o perpetuar células T encefalitógenas. La importancia potencial del reconocimiento de células T de Hu-MBP en condiciones paralíticas humanas tales como la MS, debe ser considerada a la luz de la función encefalitógena potente de células T reactivas con MBP, en animales, y la frecuencia aumentada de células T reactivas con MBP, activadas, en la sangre, y CSF de pacientes con MS (Allegretta, M., et al., Science 247:718 (1990); Link, H., et al., Neurology 40 (Supl. 1):283 (1990).

Los clones de células T evaluados en este estudio fueron aislados de líneas de células T específicas de Hu-MBP, seleccionadas in vitro para permitir la aparición de especificidades dirigidas en epítopos de Hu-MBP inmunodominantes. Los determinantes encefalitógenos exhiben inmunodominación durante la selección de líneas de células T de rata y ratón con MBP total (Bourdette, D., et al., Cell. Immunol. 112:351 (1988); Vandenbark, A.A.., J. Immunol. 135:229 (1985)), y es probable que las células T para determinantes de Hu-MBP inmunodominantes pudieran también ser encefalitógenas bajo condiciones permisivas. En este estudio, los epítopos inmunodominantes deducidos de respuestas de líneas de células T pusieron de manifiesto una correlación significativa con las especificidades identificadas por medio del análisis clonal (Figura 7).

Estos resultados validan conclusiones deducidas de los datos de las líneas respecto a la especificidad, y documentan el que los clones que sobrevivieron al procedimiento de selección eran representativos de la población de células T, dentro de las líneas, que respondían a la Hu-MBP.

Sin embargo, el fenotipo de los clones era uniformemente CD4+ (con excepción de 3 clones procedentes de un único donante normal), aun cuando las líneas de células T contenían todas niveles sustanciales de células T CD8+. No está claro su las células T CD8+ dentro de las líneas eran específicas de la Hu-MBP, o si simplemente eran transportadas en las líneas por los niveles relativamente altos de IL-2 añadidos a los cultivos. Fue evidente, sin embargo, que las líneas de células T de normales contenían consistentemente un mayor porcentaje de células CD8+ que las líneas de MS. Es interesante y potencialmente relevante para la regulación de la función de las células T, el que uno de los clones CD8+ podía inhibir la proliferación inducida por MBP de un clon CD4+ procedente del mismo donante normal. Tales células T CD8+ reguladoras, si se encuentran presentes en números aumentados in vivo, podrían justificar la ausencia de enfermedad clínica en individuos normales con células T reactivas con Hu-MBP. Un nivel crítico de estas células T CD8+ en asociación con niveles aumentados de células supresoras adherentes (similares a los observados en el ratón (Whitham, R.H., et al., Cell. Immunol. 126:290 (1990))) podría justificar la incapacidad de seleccionar líneas de células T específicas de Hu-MBP procedentes de más del 60% de donantes normales (Vandenbark, A.A., et al., J. Neurosci. Res. 23:21 (1989)).

Por el contrario, pueden seleccionarse líneas de células T desde más del 80% de pacientes con MS. Podría no esperarse que estos tipos de células reguladoras influyeran en la eficacia de recuperación de clones de células T específicas de MBP, limitando la dilución directamente desde la sangre, sin selección previa de línea, como ha sido indicado por otros (Hafler, D.A., et al., J. Immunol. 139:68 (1987); Richert, J.R., et al., J. Neuroimmunol. 23:55 (1989); Richert, J.R., et al., Ann. Neurol. 26:342 (1989)).

Las respuestas de células T a Hu-MBP en pacientes con MS, incluían una gama más amplia de especificidades que las respuestas en individuos normales (Figura 6). Además de epítopos comunes, las células T procedentes de pacientes con MS mostraban una respuesta sesgada a la mitad del extremo N-terminal de la MBP y hacia al menos un epítopo en la mitad C terminal de la molécula. La diferencia de respuesta más consistente entre pacientes con MS y pacientes normales fue para P1 (restos 45-89). Estudios previos han puesto de manifiesto que en la MS, se encuentran presentes en el fluido cerebroespinal (CSF) fragmentos inmunorreactivos de un material semejante a la Hu-MBP, con los restos 45-89 que abarcan la forma antigénica dominante (Whitaker, J.N., J. Immunol. 129:2729 (1982)). La concentración detectable de este fragmento aumenta en el CSF después de daño en el sistema nervioso central, proporcionando una explicación posible de la presencia aumentada de células T reactivas con P1 en pacientes con MS. Los sesgos de respuestas de MS a P2 y al epítopo 130-149 dentro de P4 podría también ser explicada por la liberación de fragmentos inmunorreactivos de Hu-MBP durante la desmielinación, aun cuando los efectos de restricción de MHC no pueden ser desestimados todavía. Partiendo de estudios en animales, está claro que la inmunización a largo plazo con MBP induce un repertorio en expansión de células T de menos en menos combinaciones dominantes de epítopos de MHC y MBP (Offner., H., et al., J. Exp. Med. 170:355 (1989)). Estas especificidades adicionales de células T pueden ser o no encefalitógenas, dependiendo de su aptitud para reconocer MBP homólogas. La complejidad aumentada de especificidades de células T que responden a Hu-MBP en pacientes con MS, es coincidente con la exposición aumentada a fragmentos inmunógenos de MBP liberados durante la desmielinación, y puede pensarse que la naturaleza crónica, de largo plazo, de la MS implica la inducción o reestimulación continua de especificidades de células T encefalitógenas.

Aproximadamente el 40% de los clones de células T reactivos con Hu-MBP, en especial los clones procedentes de líneas de células T normales, no respondían a fragmento alguno de Hu-MBP. Una respuesta tal podría implicar epítopos de unión que abarcan los sitios de desdoblamiento de la Hu-MBP (por ejemplo, los restos 30-55 u 80-100), epítopos de conformación destruidos por desdoblamiento, o isoformas o variantes posttranscripcionales de Hu-MBP perdidas durante la purificación de fragmentos de desdoblamiento. Aun cuando la función de estas células en el hombre no es clara, células similares se presentan con alta frecuencia (50%) en ratas Lewis restablecidas de la EAE. Tales células T transfieren a la MBP respuestas de hipersensibilidad retardada, pero no transfieren EAE ni protección contra la EAE.

Las respuestas tanto en clones de células T de MS como de células T normales, estaban predominantemente restringidas por HLA-DR, aun cuando no se encontró una asociación fuerte entre un epítopo específico y un alelo DR dado. El HLA-DR2 que está sobre-representado en pacientes con MS, era capaz de restringir epítopos múltiples de Hu-MBP y algunos epítopos (por ejemplo el 149-177) podía estar restringido por varios alelos HLA-DR. En un estudio anterior de líneas de células T (Chou, Y.K., et al., J. Neurosci. Res. 23.207 (1989)), se ha indicado que los alelos HLA-DR estaban restringidos a 26/33 respuestas de células T específicas de epítopos de Hu-MBP, mientras que el HLA-DQ restringía 6/33 respuestas solamente en pacientes, y el HLA-DP restringía a P2 una única respuesta de un donante normal.

Los datos presentes procedentes de clones de células T confirman la función de restricción abrumadora de las moléculas de HLA-DR sobre el reconocimiento de la Hu-MBP, así como la aptitud de un alelo HLA-DP indefinido (procedente de un donante normal distinto, DR7,?/DQw2,3) para restringir epítopos dentro de la región 1-38 de la Hu-MBP reconocidos por tres clones individuales. No obstante, no se encontraron clones restringidos por el HLA-DQ.

Una cuestión principal con respecto al uso de péptidos de V\beta del TCR para regular las respuestas de células T en el hombre, tanto si las células T específicas de MBP utilizan un conjunto limitado de genes V como si no. Los datos presentes, usando anticuerpos específicos para solo aproximadamente una décima parte del repertorio de V\beta del TCR, identificaron positivamente 6/38 clones, todos procedentes de donantes con MS, En un donante homozigótico HLA-DR2/DQwl con SM progresiva crónica, 4 de 8 clones de células T específicos para diferentes epítopos de Mu-MBP, expresaron el mismo gen V\beta5.2 en el receptor de células T (todos los clones fenotípicamente V\beta5.2 positivo fueron confirmados mediante PcR), lo que sugirió por primera vez un sesgo en el uso del gen V del TCR por el hombre en respuesta a la Hu-MBP. El uso del mismo gen de la región V del TCR en respuesta a diferentes epítopos de Hu-MBP es similar a las respuestas de MBP en la rata y el ratón, e indica que la elección del TCR no está conducida por epítopos.

Una implicación práctica importante de esta observación es que los sesgos en el repertorio de TCR pueden ser investigados sin definir las especificidades de epítopo de clones reactivos con MBP. La Tabla 23 presenta datos de PcR que demuestran que clones de células T específicos de MBP procedentes de pacientes humanos con MS están sesgados en su uso de genes V_{\beta} de TCR. Se extrajo mRNA de clones de células T individuales específicos para MBP humana procedentes de pacientes con MS y donantes normales, y el mensaje de V_{\beta} del TCR reordenado fue amplificado mediante PcR e identificado por sondas específicas. Se demostró el uso preferente de V_{\beta}5.2 en donantes con MS MS-1 y MS-2, y el uso preferente de V_{\beta}14 por el donante normal N-1, por clones de células T específicos de MBP. Esto proporciona un soporte adicional para la conclusión de que el ser humano responde también preferentemente con genes de la región V, a autoantígenos tales como la MBP.

TABLA 23 Uso de genes V\beta de TCR específicos de BP

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Conclusión; Clones de células T específicos de BP están desviados en su uso de genes V\beta de TCR, con V\beta5.2 expresado por 18/24 clones de MS.

Habiendo descrito totalmente ahora esta invención, podrá apreciarse por los expertos en la técnica que la misma puede ser llevada a cabo dentro de un amplio intervalo de parámetros, concentraciones y condiciones equivalentes sin apartarse del espíritu y alcance de la invención y sin experimentación indebida.

Si bien esta invención ha sido descrita en conexión con realizaciones específicas de la misma, ha de entenderse que es capaz de modificaciones posteriores. Esta solicitud de patente está destinada a cubrir cualesquiera variaciones, usos o adaptaciones de las invenciones que siguen, en general, los principios de la invención e incluyen desviaciones tales de la presente descripción como las que están incluidas dentro de la práctica conocida o que es habitual dentro de la técnica a la que pertenece la invención y como puede aplicarse a las características esenciales indicadas anteriormente en esta memoria, tal como figura seguidamente en el alcance de las reivindicaciones que se acompañan.

Claims (18)

1. Un péptido que posee aproximadamente 15-30 aminoácidos que comprende una secuencia de aminoácidos de un receptor de células T marcador, característico de una enfermedad relacionada con el sistema inmunitario, siendo dicho péptido capaz de inducir protección frente a dicha enfermedad y que comprende al menos parte de la región segunda de determinación de la complementariedad de dicho receptor de células T, o un derivado funcional de dicho péptido, con tal que el péptido no posea la secuencia:

Asp-Met-Gly-His-Gly-Leu-Arg-Leu-Ile-His-Tyr-Ser-Tyr-Asp-Val-Asn-Ser-Thr-Glu-Lys.

2. Un péptido según la reivindicación 1, que posee una secuencia peptídica que corresponde a un receptor de células T marcador humano.

3. Un péptido según la reivindicación 1 ó la reivindicación 2, conjugado a un soporte o un anticuerpo, que puede ser un anticuerpo monoclonal.

4. Una composición farmacéutica que comprende un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en mezcla con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

5. Un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha enfermedad es una enfermedad autoinmunitaria, tal como la artritis reumatoide, la artritis coadyuvante, la miastenia grave, la encefalomielitis, la esclerosis múltiple, la tiroiditis, la diabetes, la enfermedad intestinal inflamatoria o el lupus eritematoso sistémico.

6. Un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha enfermedad es una enfermedad maligna, tal como un linfoma de células T.

7. El uso de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la fabricación de un medicamento para prevenir, suprimir o tratar una enfermedad relacionada con el sistema inmunitario, tal como una enfermedad autoinmunitaria.

8. Un método para seleccionar un péptido que posee una secuencia de aminoácidos de un receptor de células T, en el que dicho receptor de células T es un receptor de células T marcador, característico de una enfermedad relacionada con el sistema inmunitario, siendo capaz dicho péptido de inducir protección frente a dicha enfermedad, que comprende las etapas de:

(a)

separar células T de un sujeto susceptible a dicha enfermedad;

(b)

expandir dichas células T de la etapa (a) por cultivo en presencia de una preparación autoantigénica;

(c)

identificar el receptor de células T expresado por dichas células T expandidas de la etapa (b); y

(d)

seleccionar dicho péptido a partir de la secuencia de aminoácidos que comprende al menos parte de la región segunda de determinación de la complementariedad de dicho receptor de células T, con tal que el péptido no posea la secuencia Asp-Met-Gly-His-Gly-Leu-Arg-Leu-Ile-His-Tyr- Ser-Tyr-Asp-Val-Asn-Ser-Thr-Glu-Lys.

9. Un método según la reivindicación 8, en el que dicha etapa de identificación (c) comprende determinar la secuencia de nucleótidos de al menos parte del gen que codifica la región segunda de determinación de la complementariedad.

10. Un método según la reivindicación 8, en el que dicha etapa de identificación (c) comprende determinar la secuencia de aminoácidos de al menos parte de la región segunda de determinación de la complementariedad de dicho receptor de células T.

11. Un método para preparar un péptido que posee una secuencia de aminoácidos de un receptor de células T, en el que dicho receptor de células T es un receptor de células T marcador característico de una enfermedad relacionada con el sistema inmunitario, siendo dicho péptido capaz de inducir protección frente a dicha enfermedad, que comprende las etapas de:

(a)

seleccionar un péptido conforme a un método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10; y

(b)

sintetizar dicho péptido o un derivado funcional del mismo.

12. Un método según la reivindicación 11, en el que dicha síntesis es mediante síntesis química o por expresión de un secuencia de nucleótidos que codifica dicho péptido.

13. Un método para preparar un anticuerpo policlonal capaz de proteger a un sujeto frente a una enfermedad relacionada con el sistema inmunitario, que comprende:

(a)

administrar a un animal un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; y

(b)

preparar dicho anticuerpo a partir de un fluido corporal de dicho animal.

14. Un método para preparar un anticuerpo monoclonal capaz de proteger a un sujeto frente a una enfermedad relacionada con el sistema inmunitario, que comprende:

(a)

administrar a un animal un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3;

(b)

separar células esplénicas o células B de dicho animal;

(c)

fusionar dichas células esplénicas o células B con una línea celular acompañante de la fusión, dando como resultado la producción de un hibridoma que secreta dicho anticuerpo monoclonal; y

(d)

preparar dicho anticuerpo monoclonal secretado.

15. Un método según las reivindicaciones 13 ó 14, en el que dicho animal es un sujeto susceptible a dicha enfermedad relacionada con el sistema inmunitario.

16. Un anticuerpo específico para un péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el anticuerpo es preferiblemente policlonal, monoclonal o quimérico.

17. Un anticuerpo según la reivindicación 16, conjugado a un agente citotóxico tal como una proteína ribosómica inhibidora, por ejemplo la cadena A de la ricina.

18. El uso de un anticuerpo según la reivindicación 16 ó 17, para la fabricación de un agente para prevenir, suprimir o tratar una enfermedad autoinmunitaria.