JP6161540B2 - Ｆｃ変異体及びそれらの生産方法 - Google Patents

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本出願は、２０１１年２月４日に出願された「Ｆｃ変異体及びそれらの生産方法」と題された米国仮特許出願番号第６１／４３９，７５０号に対する優先権を主張する。

本発明は、Ｆｃ変異体、それらの生産方法、及びＦｃ変異体を含む抗体とＦｃ融合体に関する。

ＩｇＧタイプのモノクローナル抗体は、２つの同一の抗原結合アーム及び定常ドメイン（Ｆｃ）を含む。それらの結合アームの中で異なった特異性を有する抗体は、通常、自然界では発生せず、従って、化学工学の助け（例えば、化学的架橋など）、組換えＤＮＡ及び／又は細胞融合技術で作られなければならない。

二重特異性抗体は、同時に２つの異なる抗原に結合することができる。この特性は、従来のモノクローナル抗体では不可能である治療戦略の開発を可能にする。開発された想像上の二重特異性抗体フォーマットの大型パネルは、これらの分子の強い関心を反映している。Ｂｅｒｇ Ｊ，Ｌｏｔｓｃｈｅｒ Ｅ，Ｓｔｅｉｍｅｒ ＫＳ，ｅｔ ａｌ．，“Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｍｅｄｉａｔｅ ｋｉｌｌｉｎｇ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｏｆ ａｎｙ ｓｔｒａｉｎ，” Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９１）８８（１１）：４７２３−４７２７及びＦｉｓｃｈｅｒ Ｎ ａｎｄ Ｌｅｇｅｒ Ｏ．，“Ｂｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ Ｔｈａｔ Ｅｎａｂｌｅ Ｎｏｖｅｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，” Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ （２００７）７４：３−１４を参照。

多重特異的分子の別のクラスは、組換え融合タンパク質である。免疫調節タンパク質の細胞外ドメイン及び免疫グロブリン（Ｉｇ）の定常（Ｆｃ）ドメインからなる組換え融合タンパク質は、急成長しているクラスのヒトの治療法を表す。イムノアドヘシンは、タンパク質配列の結合領域と抗体のエフェクタードメインとを、所望の特異性で、組み合わせる。イムノアドヘシンは、治療薬としての可能性に対して意義のある２つの重要な特性、標的特異性、及び薬物動態学的安定性（抗体のそれに匹敵するインビボでの半減期）を有する。イムノアドヘシンは有害な相互作用を阻害するか、又はブロックするアンタゴニストとして、又は生理学的反応を模倣したり、強化するためにアゴニストとして使用することができる。Ｃｈａｍｏｗ ＳＭ，Ｚｈａｎｇ ＤＺ，Ｔａｎ ＸＹ，ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ，ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ−ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈａｔ ｒｅｔａｒｇｅｔｓ ＣＤ３＋ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ｔｏ ｋｉｌｌ ＨＩＶ−１−ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｃｅｌｌｓ，” Ｊ Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ １９９５；４（５）：４３９−４４６を参照。

他の多特異的分子は他の場所で議論されてきた。例としては、限定されないが、Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００７）７４：３−１４（様々な二重特異性抗体の総説）；Ｆｅｉｇｅらに２００３年１２月９日に発行された米国特許第６，６６０，８４３号（ペプチボディ）；米国特許出願公開第２００２−００４５８７号、２００２年１月１０日に公開（多重特特異性抗体）；Ｗｕらに２００９年１１月３日に発行された、米国特許第７６１２１８１号（二重可変ドメインフォーマット）；米国特許第６，５３４，６２８号，Ｎｏｒｄ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ（１９９５）８：６０１−６０８，Ｎｏｒｄ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ（１９９７）１５：７７２−７７７、及びＧｒｏｅｎｗａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００８）Ｊｕｎ；５０（Ｐｔ ２）：９７−１１２（（アフィボディ）（Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ）；Ｍａｒｔｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ （２００６），１２：６１４４−６１５２及びＪｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ （２００８）６８（１１）：４３６０−４３６８（ワンアームド抗体）（ｏｎｅ ａｒｍｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）；Ｂｏｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００９）３２３：１６１０−１６１４（二重作用Ｆａｂ、別名混合原子価抗体）を含む。他のフォーマットは、当業者に知られている。

臨床グレードの材料の製造は、一般的に抗体において、特に上記多重特異性分子において挑戦的である。上で述べたように、混合結合アーム、即ち互いに同一ではない結合アームを有する分子の製造には多くの道筋がある。これらの各方法は、その欠点を有している。

化学的架橋は、関連する種を更にホモ二量及び他の望ましくない副産物から精製する必要があるかもしれないので大きな労力を要する。更に、化学修飾の工程は、タンパク質の完全性を変えることができ、よって安定性の劣化につながる。従って、この方法は多くの場合、非効率的であり、抗体活性の損失につながり得る。

細胞融合技術（例えば、ハイブリッドハイブリドーマ）で、ランダムに会合する２本の重鎖と２本の軽鎖を発現し、１０の抗体の組み合わせの生成へと導く。所望のヘテロ多量体抗体は、このように産生された抗体のほんの一部である。所望のヘテロ多量体タンパク質の精製は、劇的に生産収率を減らし、製造コストを増大させる。

組換えＤＮＡ技術は、様々なヘテロ多量体フォーマット、例えばＦｃドメインを含んでいない単鎖、ダイアボディなどを生成するために使用されてきた。このタイプの抗体分子の主な欠点は、Ｆｃドメインの欠如、従って、エフェクター機能をトリガする抗体の能力（例えば、活性化、Ｆｃ受容体の結合等の補完）の欠如である。従って、機能性Ｆｃドメインを含む二重特異性抗体が望まれている。

組換えＤＮＡ技術はまた「ノブ・イントゥー・ホール（ｋｎｏｂ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅ）」二重特異性抗体を生成するために使用されている。米国特許出願公開第２００３００７８３８５号（Ａｒａｔｈｏｏｎ ｅｔ ａｌ．−Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を参照。この戦略の１つの制約は、２つの親抗体の軽鎖は、同じ細胞で発現されているため、望まれない及び／又は不活性な分子の誤対合及び形成を防ぐために同一でなければならないということである。

加えて、アニーリング及び精製の最中の制限事象は酸化還元効率である。酸化されたヘテロダイマーは、この工程の後で典型的には、７０〜８０％のタンパク質を作りあげるだけである（ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ 及びＭＳ−ＴＯＦ）。残りの２０〜３０％の抗体は二量体であり、共有結合を欠いている（ＳＥＣ−ＬＬＳ）。これは除去することは可能だが、全収率に大きく影響を与える。従って、抗体生産、特にヘテロダイマーの生産における全収率を改善する必要が残っている。本明細書に記載されるのは、抗体、ヘテロダイマーなどの全収率を改善し得るＦｃ変異体、並びにそれらの生産法である。本発明のこれら及び他の態様及び利点は、本明細書で提供される本発明の説明から明らかになるであろう。

最新技術を用いたヘテロ多量体タンパク質、例えば、多重特異性抗体の産生は、とりわけ、生成物の混合物の生産、収量の減少、及びエフェクター機能の減少／除去を含む、欠点を有する。従って、ヘテロ多量体タンパク質を効率的かつ高レベルでを生産することが望まれる。

抗体分子の産生は、様々な手段によって、一般的によく理解されている。米国特許第６３３１４１５号（Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．）は、例えば、免疫グロブリンの組換え産生の方法を記述しており、そこでは、単一細胞において、重鎖と軽鎖が一本鎖ベクターから、又は２つの別個のベクターから同時に発現される。Ｗｉｂｂｅｎｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９９，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １４３０（２）： １９１−２０２）及びＬｅｅ ａｎｄ Ｋｗａｋ（２００３，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０１：１８９−１９８）は、大腸菌の別個の培養で発現させたプラスミドを使用して、別々に発現させた重鎖と軽鎖からモノクローナル抗体の産生を説明している。抗体の産生に関連する様々な他の技術が、例えば、Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ ａｌ．，ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８８）及び国際公開第２００６０２８９３６号に記載されている。しかし、これらの各々は、低収量や化学物質の使用などの欠点を持っている。

本明細書に開示されるのは、ヘテロ多量体タンパク質の生産における全収率を改善するための基礎を与えるアミノ酸残基における少なくとも２カ所の変異を含むＦｃ変異体である。

本発明は、変異体Ｆｃポリペプチドを含む、ヘテロ多量体タンパク質、例えば多重特異性抗体の経済的な生産を可能にする簡単で効率的な生産工程／方法を提供する。

第一の実施態様において、野生型ＦｃポリペプチドのＦｃ変異体を含む変異体ヘテロ多量体タンパク質が与えられる。様々な実施態様において、Ｆｃ変異体は、前記野生型ＦｃポリペプチドのＦｃ領域において、少なくとも一、二、三、四、五、六、七、八、九又は十のアミノ酸修飾を含み、野生型Ｆｃポリペプチドと比較した場合に、誤対合（例えばノブ／ノブ対合）の減少、頭尾形成の減少、又は全収率の増加を示す変異体タンパク質を生じる。幾つかの実施態様において、Ｆｃ変異体は、本明細書に記載されるようにホモダイマーの形成を破壊することができる二、三、又は四のアミノ酸修飾を含む。幾つかの実施態様において、Ｆｃ変異体は、少なくとも一つの重鎖の残基２４１及び２４３で、野生型Ｆｃポリペプチドに存在するものと異なるアミノ酸との置換を含む。幾つかの実施態様において、少なくとも一つの重鎖の変異は、Ｆ２４１Ｒ／Ｆ２４３Ｓ及びＦ２４１Ｓ／Ｆ２４３Ｒから選択される。幾つかの実施態様において、Ｆｃ変異体は、ノブ・イントゥー・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）修飾（複数）を更に含む。

第二の実施態様において、本明細書に記載される変異体ヘテロ多量体タンパク質又は修飾型ＩｇＧ抗体をコードする単離された核酸が提供される。

第三の実施態様において、本明細書に記載される変異体ヘテロ多量体タンパク質又は修飾型ＩｇＧ抗体をコードする発現ベクターが提供される。

第四の実施態様において、本明細書に記載される核酸分子を含む核酸分子又は発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。幾つかの実施態様において、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。幾つかの実施態様において、宿主細胞は、大腸菌細胞である。

一実施態様において、本明細書に記載される変異体ヘテロ多量体タンパク質又は修飾型ＩｇＧ抗体を生産する方法は、
（ａ）宿主細胞を培養し；及び
（ｂ）細胞培養物から変異体ヘテロ多量体タンパク質又は修飾型ＩｇＧ抗体を回収することを包含する。
幾つかの実施態様において、回収は細胞を溶解することを含む。

幾つかの実施態様において、第一のヘテロ二量体化ドメインを有する第一のＦｃ含有ポリペプチド、及び第二のヘテロ二量体化ドメインを有する第二のＦｃ含有ポリペプチドを含むヘテロ多量体タンパク質を含むヘテロ多量体タンパク質を調製する方法であって、ここで第二のヘテロ二量体化ドメインが第一のヘテロ二量体化ドメインと相互作用し、第一及び第二のＦｃ含有ポリペプチドが少なくとも一の鎖間ジスルフィド結合により連結されており、該方法は、
（ａ）第一のヘテロ二量体化ドメインを有する精製された第一のＦｃ含有ポリペプチドを提供し；
（ｂ）第二のヘテロ二量体化ドメインを有する精製された第二のＦｃ含有ポリペプチドを提供し；
（ｃ）第一及び第二のＦｃ含有ポリペプチドを結合し、
（ｄ）第一のヒンジ含有ポリペプチドを第二のヒンジ含有ポリペプチドとともにリフォールディングし、
（ｅ）ヘテロ多量体タンパク質複合体を回収する、工程を含む。
幾つかの実施態様において、第一及び第二のＦｃ含有ポリペプチドは、Ｆｃ含有ポリペプチドのお互いに対する適切な配向を容易にする変異を更に含む。幾つかの実施態様において、変異体は、少なくとも一つの重鎖の残基２４１及び２４３で、野生型Ｆｃポリペプチドに存在するものと異なるアミノ酸との置換を含む。

一実施態様において、本明細書に記載の方法により産生されたヘテロ多量体タンパク質が提供される。

本発明の方法は、一般的に、本明細書に記載の本発明の方法に包含されたプロセスを開始及び／又は完了するための明白なルーチン的工程である他の工程を含むことができることを理解すべきである。例えば、一実施態様において、本発明の方法の工程（ａ）は、Ｆｃ変異体ポリペプチドをコードする核酸が第一の宿主細胞に導入され、第二のヒンジ含有ポリペプチドをコードする核酸が第二の宿主細胞に導入される工程で始まる。一実施態様において、本発明の方法は、少なくとも２つの異なる標的への結合特異性を有するヘテロ多量体タンパク質を精製する工程を含む。一実施態様において、ヘテロ多量体タンパク質を精製する工程の前に、わずか約１０％、１５％、２０％又は３０％の単離されたポリペプチドがモノマー又は重鎖−軽鎖のダイマーとして存在する。一実施態様において、モノマーは、ヘテロ多量体タンパク質の精製前に除去する必要性がある望まれないポリペプチド混入物が約３０％未満であり得る。

一実施態様において、第一及び／又は第二のＦｃ含有ポリペプチドは、抗体の重鎖である。更なる実施態様において、抗体の重鎖は抗体軽鎖と対になり、重鎖−軽鎖対を提供する。幾つかの実施態様において、重鎖−軽鎖の対は共有結合で連結される。他の実施態様において、重鎖−軽鎖の対は標的結合アームを定める。幾つかの実施態様において、標的結合アームは同一である。幾つかの実施態様において、標的結合アームの各々は２つの異なる標的を認識する。

その他の実施態様において、第一及び／又は第二のＦｃ含有ポリペプチドは、可変重鎖ドメインを含む。その他の実施態様において、第一及び／又は第二のＦｃ含有ポリペプチドは、レセプター結合ドメインを含む。幾つかの実施態様において、第一及び／又は第二のＦｃ含有ポリペプチドは実質的に同一である（すなわち、ヘテロ二量体化ドメインは、同一であるヘテロ二量体化ドメインの外部領域と同一ではない可能性がある）。幾つかの実施態様において、第一及び／又は第二のＦｃ含有ポリペプチドは同一ではない。

幾つかの実施態様において、ヘテロ多量体タンパク質は、抗体、二重特異性抗体、多選択性抗体、ワンアームド抗体、単一特異性一価抗体、多選択性一価抗体、二重特異性マキシボディ（ｍａｘｉｂｏｄｙ）、イムノアドヘシン、ペプチボディ、二重特異性ペプチボディ、一価ペプチボディ、アフィボディ及びレセプター融合タンパク質からなる群から選択される。

幾つかの実施態様において、前記ヘテロ多量体タンパク質は、通常は重鎖間のジスルフィド結合を形成することが可能である、少なくとも一、少なくとも二、少なくとも三、少なくとも四、又は全ての任意の整数のシステイン残基を有するヒンジ領域を含む。幾つかの実施態様において、付加的なシステインが、ヒンジ領域に導入されている。

本発明のヘテロ多量体タンパク質はまた、免疫グロブリンのＦｃ領域を含むかぎり、例えば、Ｆｃ又はＦｃ融合ポリペプチドなどの抗体断片であってもよい。Ｆｃ融合ポリペプチドは、一般的に、異種ポリペプチド配列（例えば、抗原結合ドメインなど）に融合されたＦｃポリペプチド（又はその断片）、例えば、免疫グロブリンＦｃポリペプチドに融合されたレセプター細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（例えば、ＩｇＧ２のＦｃへ融合したＦＬＴレセプターＥＣＤ）などで構成されている。例えば、一実施態様において、Ｆｃ融合ポリペプチドは、ｆｌｔ，ｆｌｋなどを含むＶＥＧＦ結合ドメイン（ＶＥＧＦレセプターであり得る）を含む。本発明のヘテロ多量体タンパク質は一般的に重鎖定常ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む。一実施態様において、本発明のヘテロ多量体タンパク質は、重鎖間二量体化又は多量体化の形成のために、修飾（例えば、限定されないが、例えば、ロイシンジッパーなど２量体化配列を形成するための一以上のアミノ酸の挿入）を含む。これらの実施態様の幾つかにおいて、ヘテロ多量体タンパク質は、例えば重鎖断片のＣ末端に融合した二量化化ドメイン（例えば、ロイシンジッパー配列など）を含む。これらの実施態様の幾つかにおいて、ヘテロ多量体タンパク質は「ノブ・イントゥー・ホール（ｋｎｏｂ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅ）」２量体化ドメインを（以下で更に定義されるように）提供するための変異を含む二量体化ドメインを含む。

本発明の方法及びヘテロ多量体タンパク質の幾つかの実施態様において、Ｆｃ含有ポリペプチドは、第一及び第二のＦｃ含有ポリペプチドについて全収率を改善する一方、Ｆｃ含有ポリペプチドの互いに対する適切な配向を促進する少なくとも一の特徴を含む。

このような特性（ｓ）は、本明細書に記載の本発明の方法によって得られるヘテロ多量体タンパク質集団の収率及び／又は純度及び／又は均質性を向上させる。一実施態様において、第一のＦｃ含有ポリペプチド及び第二のＦｃ含有ポリペプチドのＦｃポリペプチドが界面で接触／相互作用する。第一及び第二のＦｃ含有ポリペプチドのＦｃポリペプチドが界面で接触する幾つかの実施態様において、第二のＦｃポリペプチドの界面は、第一のＦｃポリペプチドの界面における空洞内に配置可能である突起を有している。一実施態様において、第一のＦｃポリペプチドは、空洞をエンコードするテンプレート／元のポリペプチドから変更されているか、又は第二のＦｃポリペプチドは、突起をエンコードするテンプレート／元のポリペプチドから変更されているか、又はその両方である。一実施態様において、第一のＦｃポリペプチドは、空洞をエンコードするテンプレート／元のポリペプチドから変更されており、かつ第二のＦｃポリペプチドは、突起をエンコードするテンプレート／元のポリペプチドから変更されているか、又はその両方である。一実施態様において、第二のＦｃ融合ポリペプチドの界面は、第一のＦｃポリペプチドの界面にある空洞内に配置可能である突起を含み、ここで空洞又は突起又はその両方がそれぞれ、第一及び第二のＦｃポリペプチドの界面中に導入されている。第一及び第二のＦｃポリペプチドが界面で接触する幾つかの実施態様において、第一のＦｃポリペプチドの界面は、第二のＦｃポリペプチドの界面における空洞内に配置可能である突起を含む。一実施態様において、第二のＦｃポリペプチドは、空洞をエンコードするテンプレート／元のポリペプチドから変更されているか、又は第一のＦｃポリペプチドは、突起をエンコードするテンプレート／元のポリペプチドから変更されているか、又はその両方である。一実施態様において、第二のＦｃポリペプチドは、空洞をエンコードするテンプレート／元のポリペプチドから変更されており、かつ第一のＦｃポリペプチドは、突起をエンコードするテンプレート／元のポリペプチドから変更されているか、又はその両方である。一実施態様において、第一のＦｃ融合ポリペプチドの界面は、第二のＦｃポリペプチドの界面にある空洞に配置可能である突起を含み、ここで突起又は空洞又はその両方がそれぞれ、第一及び第二のＦｃポリペプチドの界面中に導入されている。

一実施態様において、突起及び空洞がそれぞれ、天然に存在するアミノ酸残基を含む。一実施態様において、突起を含んでなるＦｃポリペプチドは、テンプレート／元のポリペプチドの界面からの元の残基を、元の残基より大きい側鎖容積を有する移入残基と置換することによって生成される。一実施態様において、突起を含んでなるＦｃポリペプチドは、前記ポリペプチドの界面からの元の残基をコード化する核酸が、元の残基より大きい側鎖容積を有する移入残基をコード化する核酸と置換される工程を含む方法により生成される。一実施態様において、元の残基はスレオニンである。一実施態様において、移入残基はアルギニン（Ｒ）である。一実施態様において、移入残基はフェニルアラニン（Ｆ）である。一実施態様において、移入残基はチロシン（Ｙ）である。一実施態様において、移入残基はトリプトファン（Ｗ）である。一実施態様において、移入残基はＲ，Ｆ，Ｙ又はＷである。一実施態様において、突起はテンプレート／元のポリペプチド中の二以上の残基を置換することにより生成される。一実施態様において、突起を含むＦｃポリペプチドは、位置３６６のスレオニンのトリプロファンによる置換を含む（アミノ酸の番号付けはＫａｂａｔらによるＥＵ番号付け方式による（頁６８８−６９６、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ ｅｄ．， Ｖｏｌ．１（１９９１；ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ））。

幾つかの実施態様において、空洞を含んでなるＦｃポリペプチドは、テンプレート／元のポリペプチドの界面にある元の残基を、元の残基より小さい側鎖容積を有する移入残基と置換することによって生成される。例えば、空洞を含んでなるＦｃポリペプチドは、前記ポリペプチドの界面からの元の残基をコード化する核酸が、元の残基より小さい側鎖容積を有するインポート残基をコード化する核酸と置換される工程を含む方法により生成される。一実施態様において、元の残基はスレオニンである。一実施態様において、元の残基はロイシンである。一実施態様において、元の残基はチロシンである。一実施態様において、移入残基はシステイン（Ｃ）ではない。一実施態様において、移入残基はアラニン（Ａ）である。一実施態様において、移入残基はセリン（Ｓ）である。一実施態様において、移入残基はスレオニン（Ｔ）である。一実施態様において、移入残基はバリン（Ｖ）である。空洞は、テンプレート／元のポリペプチドの一以上の元の残基を置換することによって生成することができる。例えば、一実施態様において、空洞を含むＦｃポリペプチドは、スレオニン、ロイシン及びチロシンからなる群から選択される二以上の元のアミノ酸の置換を含む。一実施態様において、空洞を含むＦｃポリペプチドは、アラニン、セリン、スレオニン及びバリンからなる群から選択される二以上の移入残基を含む。幾つかの実施態様において、空洞を含むＦｃポリペプチドは、スレオニン、ロイシン及びチロシンからなる群から選択される二以上の元のアミノ酸の置換を含み、ここで、前記元のアミノ酸が、アラニン、セリン、スレオニン及びバリンからなる群から選択される移入残基で置換されている。一実施態様において、空洞を含むＦｃポリペプチドは、位置３６６のスレオニンのセリンによる置換を含む（アミノ酸の番号付けは上掲のＫａｂａｔらによるＥＵ番号付け方式による）。一実施態様において、空洞を含むＦｃポリペプチドは、位置３６８のスロイシンのアラニンによる置換を含む（アミノ酸の番号付けは上掲のＫａｂａｔらによるＥＵ番号付け方式による）。一実施態様において、空洞を含むＦｃポリペプチドは、位置４０７のチロシンのバリンによる置換を含む（アミノ酸の番号付けは上掲のＫａｂａｔらによるＥＵ番号付け方式による）。一実施態様において、空洞を含むＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖからなる群から選択される二以上のアミノ酸置換を含む（アミノ酸の番号付けは上掲のＫａｂａｔらによるＥＵ番号付け方式による）。これらの抗体断片の一実施態様において、突起を含むＦｃポリペプチドは、位置３６６のスレオニンのトリプトファンによる置換を含む（アミノ酸の番号付けは上掲のＫａｂａｔらによるＥＵ番号付け方式による）。

一実施態様において、第一のＦｃポリペプチド及び／又は第二のＦｃポリペプチドの界面が、少なくとも一つの重鎖の残基２４１及び２４３で、野生型Ｆｃポリペプチドに存在するものと異なるアミノ酸との置換を含むように変異されている。幾つかの実施態様において、少なくともＦｃポリペプチド、例えば一つの重鎖における変異は、Ｆ２４１Ｒ／Ｆ２４３Ｓ及びＦ２４１Ｓ／Ｆ２４３Ｒから選択される。幾つかの実施態様において、Ｆｃ変異体は、ノブ・イントゥー・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）修飾（複数）を更に含む。

様々な実施態様において、第一の重鎖ポリペプチド及び第二の重鎖ポリペプチドのＦｃポリペプチドは、それらがＦｃ領域を形成するために二量体化することができるという条件であれば、同一であってもなくても良い。第一のポリペプチドは一般に、一本鎖の免疫グロブリン重鎖の一以上のドメインに対して、例えば、ヒンジ配列、定常ドメイン配列及び／又は可変ドメイン配列により、連続して連結されている。一実施態様において、第一のＦｃポリペプチドは、ヒンジ配列の（全てを含む）少なくとも一部、Ｃ_Ｈ２ドメインの（全てを含む）少なくとも一部、及び／又はＣ_Ｈ３ドメインの（全てを含む）少なくとも一部を含む。一実施態様において、第一のＦｃポリペプチドは、ヒンジ配列、及び免疫グロブリンのＣ_Ｈ２ドメイン及びＣ_Ｈ３ドメインを含む。一実施態様において、第二のＦｃポリペプチドは、ヒンジ配列の（全てを含む）少なくとも一部、Ｃ_Ｈ２ドメインの（全てを含む）少なくとも一部、及び／又はＣ_Ｈ３ドメインの（全てを含む）少なくとも一部を含む。一実施態様において、第二のＦｃポリペプチドは、ヒンジ配列、及び免疫グロブリンのＣ_Ｈ２ドメイン及びＣ_Ｈ３ドメインを含む。一実施態様において、本発明の抗体は、第一のＦｃポリペプチド及び第二のＦｃポリペプチドを含み、その各々は少なくとも一の抗体の定常ドメインの少なくとも一部分を含む。一実施態様において、抗体定常ドメインはＣ_Ｈ２及び／又はＣ_Ｈ３ドメインである。定常ドメインを含む本発明の抗体の何れかの実施態様において、抗体定常ドメインは、任意の免疫グロブリンクラス、例えばＩｇＧ、由来であり得る。免疫グロブリンの起源は任意の適切な元の種であり得るか（例えば、ＩｇＧはヒトＩｇＧ_１であり得る）、合成型であり得る。

一実施態様において、本発明の抗体の、第一及び第二の標的分子結合アームにおける、第一の軽鎖ポリペプチド及び第二の軽鎖ポリペプチドは、それぞれ、別々の／異なる抗原結合決定因子（例えば、別々の／異なる可変ドメイン配列）を含む。一実施態様において、本発明の抗体の、第一及び第二の標的分子結合アームにおける、第一の軽鎖ポリペプチド及び第二の軽鎖ポリペプチドは、それぞれ、同一の（即ち共通の）抗原結合決定因子、例えば、同一の可変ドメイン配列を含む。

本発明の方法は、高い均質性でヘテロ多量体分子を生成することができる。よって、本発明は、少なくとも約４０％，４５％，５０％，５５％，６０％，６５％，７０％，７５％，８０％，８５％，９０％，９５％，９６％，９７％，９８％，９９％のポリペプチドが、第一の重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの対、及び、第二の重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの対を含んでなる複合体で存在する。一実施態様において、本発明は、約６０％から９９％の間、７０％から９８％の間、７５％から９７％の間、８０％から９６％の間、８５％から９６％の間、又は９０％から９５％の間のポリペプチドが、第一の重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの対、及び、第二の重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの対を含んでなる複合体で存在する方法を提供する。

一実施態様において、本発明の抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＤからなる群から選択される。幾つかの実施態様において、本発明の抗体のヒンジ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤからなる群から選択される免疫グロブリンであることが好ましい。例えば、幾つかの実施態様において、抗体又は抗体のヒンジ領域はＩｇＧであって、それは幾つかの実施態様において、ＩｇＧ１又はＩｇＧ２（例えばＩｇＧ２ａ又はＩｇＧ２ｂ）である。幾つかの実施態様において、本発明の抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤからなる群から選択される。一実施態様において、抗体は、ヒト、ヒト化、キメラ又は非ヒト（例えば、マウス）の起源である。

本発明のヘテロ多量体タンパク質は、一般的に抗原に、好ましくは特異的に結合することが可能である。このような抗原は、例えば、腫瘍抗原、細胞生存調節因子、細胞増殖調節因子、組織発達又は分化に関連する（例えば、既知の、又は機能的に寄与することが疑われる）分子、細胞表面分子、リンホカイン、サイトカイン、細胞周期の調節に関与する分子、血管形成に関与する分子、及び分子血管新生に関連する（例えば、既知の、又は機能的に寄与することが疑われる）分子を含む。本発明のヘテロ多量体タンパク質が結合することができる抗原は、上記のカテゴリの一のサブセットのメンバーであり得、ここで、前記カテゴリの他のサブセット（複数）は、（目的の抗原に関して）異なる特徴を有する他の分子／抗原を含む。目的の抗原はまた、２つ以上のカテゴリに属しているとみなすことができる。一実施態様において、本発明は、細胞表面分子ではない腫瘍抗原に、好ましくは特異的に結合するヘテロ多量体タンパク質を提供する。一実施態様において、腫瘍抗原は、レセプターポリペプチドなどの細胞表面分子である。その他の実施態様で、幾つかの実施態様において、本発明のヘテロ多量体タンパク質は、クラスター分化因子ではない腫瘍抗原に、好ましくは特異的に結合する。その他の実施態様において、本発明のヘテロ多量体タンパク質は、幾つかの実施態様において例えばＣＤ３又はＣＤ４ではないクラスター分化因子に、好ましくは特異的に結合することができる。幾つかの実施態様において、本発明のヘテロ多量体タンパク質は、抗ＶＥＧＦ抗体である。幾つかの実施態様において、本発明のヘテロ多量体タンパク質は、ＩＬ−ｌアルファ／ＩＬ−ｌベータ，ＩＬ−１２／ＩＬ−１８；ＩＬ−１３／ＩＬ−９；ＩＬ−１３／ＩＬ−４；ＩＬ−１３／ＩＬ−５；ＩＬ−５／ＩＬ−４；ＩＬ−１３／ＩＬ−ｌベータ；ＩＬ−１３／ＩＬ−２５；ＩＬ−１３／ＴＡＲＣ；ＩＬ−１３／ＭＤＣ；ＩＬ−１３／ＭＥＦ；ＩＬ−１３／ＴＧＦ−β；ＩＬ−１３／ＬＨＲアゴニスト；ＩＬ−１２／ＴＷＥＡＫ，ＩＬ−１３／ＣＬ２５；ＩＬ−１３／ＳＰＲＲ２ａ；ＩＬ−１３／ＳＰＲＲ２ｂ；ＩＬ−１３／ＡＤＡＭ８，ＩＬ−１３／ＰＥＤ２，ＩＬ１７Ａ／ＩＬ１７Ｆ，ＣＤ３／ＣＤ１９，ＣＤ１３８／ＣＤ２０；ＣＤ１３８／ＣＤ４０；ＣＤ１９／ＣＤ２０；ＣＤ２０／ＣＤ３；ＣＤ３８／ＣＤ１３８；ＣＤ３８／ＣＤ２０；ＣＤ３８／ＣＤ４０；ＣＤ４０／ＣＤ２０；ＣＤ−８／ＩＬ−６；ＣＤ２０／ＢＲ３，ＴＮＦアルファ／ＴＧＦ−ベータ，ＴＮＦアルファ／ＩＬ−ｌベータ；ＴＮＦアルファ／ＩＬ−２，ＴＮＦアルファ／ＩＬ−３，ＴＮＦアルファ／ＩＬ−４，ＴＮＦアルファ／ＩＬ−５，ＴＮＦアルファ／ＩＬ６，ＴＮＦアルファ／ＩＬ８，ＴＮＦアルファ／ＩＬ−９，ＴＮＦアルファ／ＩＬ−１０，ＴＮＦアルファ／ＩＬ−１１，ＴＮＦアルファ／ＩＬ−１２，ＴＮＦアルファ／ＩＬ−１３，ＴＮＦアルファ／ＩＬ−１４，ＴＮＦアルファ／ＩＬ−１５，ＴＮＦアルファ／ＩＬ−１６，ＴＮＦアルファ／ＩＬ−１７，ＴＮＦアルファ／ＩＬ−１８，ＴＮＦアルファ／ＩＬ−１９，ＴＮＦアルファ／ＩＬ−２０，ＴＮＦアルファ／ＩＬ−２３，ＴＮＦアルファ／ＩＦＮアルファ，ＴＮＦアルファ／ＣＤ４，ＴＮＦアルファ／ＶＥＧＦ，ＴＮＦアルファ／ＭＩＦ，ＴＮＦアルファ／ＩＣＡＭ−１，ＴＮＦアルファ／ＰＧＥ４，ＴＮＦアルファ／ＰＥＧ２，ＴＮＦアルファ／ＲＡＮＫリガンド、ＴＮＦアルファ／Ｔｅ３８；ＴＮＦアルファ／ＢＡＦＦ；ＴＮＦアルファ／ＣＤ２２；ＴＮＦアルファ／ＣＴＬＡ−４；ＴＮＦアルファ／ＧＰ１３０；ＴＮＦα／ＩＬ−１２ｐ４０；ＶＥＧＦ／ＨＥＲ２，ＶＥＧＦ−Ａ／ＨＥＲ２，ＶＥＧＦ−Ａ／ＰＤＧＦ，ＨＥＲ１／ＨＥＲ２，ＶＥＧＦ−Ａ／ＶＥＧＦ−Ｃ，ＶＥＧＦ−Ｃ／ＶＥＧＦ−Ｄ，ＨＥＲ２／ＤＲ５，ＶＥＧＦ／ＩＬ−８，ＶＥＧＦ／ＭＥＴ，ＶＥＧＦＲ／ＭＥＴ受容体，ＶＥＧＦＲ／ＥＧＦＲ，ＨＥＲ２／ＣＤ６４，ＨＥＲ２／ＣＤ３，ＨＥＲ２／ＣＤ１６，ＨＥＲ２／ＨＥＲ３；ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２，ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３，ＥＧＦＲ／ＨＥＲ４，ＩＬ−１３／ＣＤ４０Ｌ，ＩＬ４／ＣＤ４０Ｌ，ＴＮＦＲ１／ＩＬ−１Ｒ，ＴＮＦＲ１／ＩＬ−６Ｒ，ＴＮＦＲ１／ＩＬ−１８Ｒ，ＥｐＣＡＭ／ＣＤ３，ＭＡＰＧ／ＣＤ２８，ＥＧＦＲ／ＣＤ６４，ＣＳＰＧｓ／ＲＧＭ Ａ；ＣＴＬＡ−４／ＢＴＮＯ２；ＩＧＦ１／ＩＧＦ２；ＩＧＦ１／２／Ｅｒｂ２Ｂ；ＭＡＧ／ＲＧＭ Ａ；ＮｇＲ／ＲＧＭ Ａ；ＮｏｇｏＡ／ＲＧＭ Ａ；ＯＭＧｐ／ＲＧＭ Ａ；ＰＤＬ−Ｉ／ＣＴＬＡ−４；及びＲＧＭ Ａ／ＲＧＭ Ｂ，ＩＬ１β／ＩＬ１８，ＮＲＰ１／ＶＥＧＦＡ，ＶＥＧＦＡ／ＮＲＰ２，ｃＭＥＴ／ＥＧＦＲ，ＡＬＫ１／ＢＭＰ９，ＶＥＧＦＡ／α５β１，ＨＥＲ１／ＨＥＲ３−ＢＵ、及びＣＭＶから選択される二重特異性抗体である。幾つかの実施態様において、本発明のヘテロ多量体タンパク質は、α５β１，ＡＬＫ１，ＢＭＰ９，ＩＬ−ｌアルファ，ＩＬ−ｌベータ，ＴＡＲＣ，ＭＤＣ，ＭＥＦ，ＴＧＦ−β，ＬＨＲアゴニスト，ＴＷＥＡＫ，ＣＬ２５，ＳＰＲＲ２ａ，ＳＰＲＲ２ｂ，ＡＤＡＭ８，ＰＥＤ２，ＣＤ３，ＣＤ４，ＣＤ１６，ＣＤ１９，ＣＤ２０，ＣＤ２２，ＣＤ２８，ＣＤ４０，ＣＤ３８，ＣＤ６４，ＣＤ１３８，ＣＤ−８，ＢＲ３，ＴＮＦアルファ，ＴＧＦ−ベータ，ＩＬ−２，ＩＬ−３，ＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−６，ＩＬ−８，ＩＬ−９，ＩＬ−１０，ＩＬ−１１，ＩＬ−１２，ＩＬ−１３，ＩＬ−１４，ＩＬ−１５，ＩＬ−１６，ＩＬ−１７，ＩＬ−１７Ａ，ＩＬ−１７Ｆ，ＩＬ−１８，ＩＬ−１９，ＩＬ−２０，ＩＬ−２３，ＩＬ−２５，ＩＦＮアルファ，ＭＩＦ，ＩＣＡＭ−１，ＰＧＥ４，ＰＥＧ２，ＲＡＮＫリガンド，Ｔｅ３８，ＢＡＦＦ，ＣＴＬＡ−４，ＧＰ１３０，ＩＬ−１２ｐ４０，ＶＥＧＦ，ＶＥＧＦ−Ａ，ＰＤＧＦ，ＨＥＲ１，ＨＥＲ２，ＨＥＲ３，ＨＥＲ３−ＢＵ，ＨＥＲ４，ＶＥＧＦ−Ｃ，ＶＥＧＦ−Ｄ，ＤＲ５，ｃＭＥＴ，ＭＥＴ，ＭＥＴレセプター，ＶＥＧＦＲ，ＥＧＦＲ，ＣＤ４０Ｌ，ＴＮＦＲ１，ＩＬ−１Ｒ，ＩＬ−６Ｒ，ＩＬ−１８Ｒ，ＥｐＣＡＭ，ＭＡＰＧ，ＣＳＰＧｓ，ＢＴＮＯ２，ＩＧＦ１，ＩＧＦ２，ＩＧＦ１／２，Ｅｒｂ２Ｂ，ＭＡＧ，ＮｇＲ，ＮｏｇｏＡ，ＮＲＰ１，ＮＲＰ２，ＯＭＧｐ，ＰＤＬ−Ｉ，ＲＧＭ Ａ及びＲＧＭ Ｂからなる群から選択される少なくとも２つの標的分子に結合する。幾つかの実施態様では、本発明のヘテロ多量体タンパク質はＣＤ３及びＢＬＲ１，ＢＲ３，ＣＤ１９，ＣＤ２０，ＣＤ２２，ＣＤ７２，ＣＤ７９Ａ，ＣＤ７９Ｂ，ＣＤ１８０（ＲＰ１０５），ＣＲ２，ＦｃＲＨ１，ＦｃＲＨ２，ＦｃＲＨ５，ＦＣＥＲ２，ＦＣＲＬ４，ＨＬＡ−ＤＯＢ，及びＮＡＧ１４から選択される少なくとも１つの更なる標的分子に結合する。

本発明の方法における第一の宿主細胞及び第二の宿主細胞は、目的のポリペプチドの発現及び単離を可能にする任意の設定で培養することができる。例えば、一実施態様において、本発明の方法における第一の宿主細胞及び第二の宿主細胞は、別個の細胞培養として増殖される。その他の実施態様において、本発明の方法における第一の宿主細胞及び第二の宿主細胞は、両方の宿主細胞を含む混合培養として増殖される。

ヘテロ多量体タンパク質は、更なる所望の特性を増強及び／又は追加するように修飾することができる。このような特性は、免疫エフェクター機能、望まれるインビボ半減期／クリアランス、生物学的利用能、生体内分布又は他の薬物動態特性などの生物学的機能が含まれている。そのような修飾は、当技術分野で周知であり、また経験的に決定することができ、かつ、ペプチドベースであってもなくてもよい部分による修飾を含み得る。例えば、抗体は、グリコシル化又は非グリコシル化されることがあり、一般的には宿主細胞の性質に少なくとも部分的に依存する。好ましくは、本発明の抗体は、グリコシル化されている。本発明の方法により製造されたグリコシル化抗体は、その後、例えば当技術分野で周知のインビトロでのグリコシル化の方法を使用して、グリコシル化することができる。上記及び本明細書に記載したように、本発明のヘテロ多量体タンパク質は、例えば、大腸菌などの原核細胞で産生することができる。大腸菌で生産されるヘテロ多量体タンパク質は一般に非グリコシル化されており、かつ、哺乳動物宿主細胞（例えば、ＣＨＯ）が生成したヘテロ多量体タンパク質に見出されるグリコシル化プロファイルに関連付けられている生物学的機能を通常欠いている。

また、本発明は、異種部分とコンジュゲートした本発明のヘテロ多量体タンパク質を含む免疫複合体を提供する。抗体に対するそのコンジュゲーションが抗体の所望の機能及び／又は特性を実質的に減少させない任意の異種部分が適している可能性がある。例えば、幾つかの実施態様において、免疫複合体が細胞傷害性薬物である異種部分を含む。幾つかの実施態様において、前記細胞傷害性薬物は、放射性同位元素、化学療法剤及び毒素からなる群から選択される。幾つかの実施態様において、前記毒素はカリチアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅｍｉｃｉｎ）、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）及びトリコテセン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｎｅ）からなる群から選択される。幾つかの実施態様において、免疫複合体が検出可能なマーカーである異種部分を含む。幾つかの実施態様において、前記検出可能なマーカーは、放射性同位体、リガンド−レセプターの対のメンバー、酵素−基質の対のメンバー及び蛍光共鳴エネルギー移動の対のメンバーからなる群から選択される。

一実施態様において、本発明は、本発明のヘテロ多量体タンパク質、及び幾つかの実施態様において薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。

その他の実施態様において、本発明は、本発明に記載の免疫複合体及び幾つかの実施態様において薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。

一実施態様において、本発明は、本発明の多重特異性ヘテロ多量体タンパク質の集団を含む組成物を提供する。当業者に明らかなように、一般的にそのような組成物は、完全に（すなわち、１００％）均一ではないであろう。しかし、本明細書に記載のように、本発明の方法は、多選択性ヘテロ多量体タンパク質の実質的に均一な集団を産生することができる。例えば、本発明は、ヘテロ多量体タンパク質を含む組成物を提供し、ここで少なくとも４０％，４５％，５０％，５５％，６０％，６５％，７０％，８０％，８５％，９０％，９５％，９６％，９７％，９８％，９９％の前記ヘテロ多量体タンパク質が、本明細書に記載の発明による多選択性抗体（例えば、二重特異性抗体など）である。

その他の実施態様において、本発明は、容器及びそれに含まれる組成物を含む製造品を提供し、ここでその組成物は、本発明のヘテロ多量体タンパク質（例えば、抗体）を含む。その他の実施態様において、本発明は、容器及びそれに含まれる組成物を含む製造品を提供し、ここでその組成物は、本明細書に記載される免疫複合体を含む。幾つかの実施態様において、これらの製造品は前記組成物を使用するための説明書を更に含んでいる。

更に別の実施態様において、本発明は、本発明のヘテロ多量体タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。更に別の実施態様において、本発明は、本明細書に記載される免疫複合体をコードするポリヌクレオチドを提供する。幾つかの実施態様において、核酸（即ち、ポリヌクレオチド）が単離される。

一実施態様において、本発明は、本発明の分子（例えば、抗体）を発現するための組換えベクターを提供する。その他の実施態様において、本発明は、本発明の免疫複合体を発現するための組換えベクターを提供する。

多くの宿主細胞のいずれも本発明の方法に使用することができる。このような細胞は、当該分野で公知であるか（その一部は本明細書に記載される）、又は当該分野で公知の通常の技術を用いて本発明の方法における使用のための適性に関して経験的に決定することができる。一実施態様において、宿主細胞は、原核生物である。幾つかの実施態様において、宿主細胞は、グラム陰性細菌の細胞である。一実施態様において、宿主細胞は、大腸菌である。幾つかの実施態様において、大腸菌は、リポ蛋白の欠損株（Δｌｐｐ）である。幾つかの実施態様において、大腸菌宿主細胞の遺伝子型はｄｅｇＰ及びｐｒｃ遺伝子を欠いており、変異型のｓｐｒ遺伝子を有する。一実施態様において、宿主細胞は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞である。

一実施態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチド又は組換えベクターを含む宿主細胞を提供する。一実施態様において、宿主細胞は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞である。一実施態様において、宿主細胞は、原核生物である。幾つかの実施態様において、宿主細胞は、いくつかの実施態様では大腸菌であるグラム陰性細菌の細胞である。本発明の宿主細胞は、分子をコードするポリヌクレオチド又は組換えベクターを含むことができ、宿主細胞内でのその発現は、本発明の方法においてヘテロ多量体タンパク質の収率を向上させる。例えば、そのような分子は、シャペロンタンパク質であってよい。一実施態様において、前記分子は、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＣを、ＤｓｂＧ及びＦｋｐＡからなる群から選択される原核生物ポリペプチドである。幾つかの実施態様において、前記ポリヌクレオチド又は組換えベクターは、ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣを両方をコード化する。幾つかの実施態様において、大腸菌宿主細胞は、内因性のプロテアーゼ活性の欠損株である。幾つかの実施態様において、大腸菌宿主細胞の遺伝子型は、ｄｅｇＰ及びｐｒｃ遺伝子を欠いており、変異型のｓｐｒ遺伝子を有する大腸菌株のものである。幾つかの実施態様において、大腸菌宿主細胞の遺伝子型はΔｌｐｐである。

本発明のヘテロ多量体タンパク質は、様々な設定で、様々な用途を見いだす。一例において、本発明のヘテロ多量体タンパク質は、治療用抗体である。その他の例において、本発明のヘテロ多量体タンパク質は、アゴニスト抗体である。その他の例において、本発明のヘテロ多量体タンパク質は、拮抗性抗体である。本発明のヘテロ多量体タンパク質はまた、診断抗体でもあり得る。更にその他の例において、本発明のヘテロ多量体タンパク質は、遮断抗体である。その他の例において、本発明のヘテロ多量体タンパク質は、中和抗体である。

一実施態様において、本発明は、被験体における疾患を治療又は遅延させる方法を提供し、該方法は本発明のヘテロ多量体タンパク質を該被検体に投与することを含む。一実施態様において、疾患は癌である。その他の実施態様において、その疾患は、血管新生の調節不全に関連している。その他の実施態様において、疾患は、関節リウマチ、免疫性血小板減少性紫斑病、全身性エリテマトーデスなどの免疫疾患である。

一実施態様において、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性障害、免疫（自己免疫など）障害及び／又は血管新生関連疾患などの疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の調製における、本発明のヘテロ多量体タンパク質（例えば、抗体）の使用を提供する。

一実施態様において、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性障害、免疫（自己免疫など）障害及び／又は血管新生関連疾患などの疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の調製における、本発明の核酸の使用を提供する。

一実施態様において、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性障害、免疫（自己免疫など）障害及び／又は血管新生関連疾患などの疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の調製における、本発明の発現ベクターの使用を提供する。

一実施態様において、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性障害、免疫（自己免疫など）障害及び／又は血管新生関連疾患などの疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の調製における、本発明の宿主細胞の使用を提供する。

一態様において、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性障害、免疫（自己免疫など）障害及び／又は血管新生関連疾患などの疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の調製における、本発明の製造品の使用を提供する。

一実施態様において、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性障害、免疫（自己免疫など）障害及び／又は血管新生関連疾患などの疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の調製における、本発明のキット使用を提供する。

本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、詳細な説明及び具体的な実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、本発明の範囲と趣旨における様々な変更及び修正が、当業者に対して、この詳細な説明から明らかになるであろうゆえ、単に例として与えられることを理解されるべきである。

図１Ａは、完全に酸化された半抗体（ｈａｌｆ−ａｎｔｉｂｏｄｙ）を示している。「ノブ（ｋｎｏｂ）」又は「ホール（ｈｏｌｅ）」又は他のヘテロ二量体化ドメインは示されていない。この図に示されている半抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプである。当業者は、他の免疫グロブリンのアイソタイプは、対応する鎖間結合及び鎖内結合を有する半抗体として想定することができることを理解するであろう。インタクトな抗体（Ａｂ）において、ヒンジのシステインは、鎖間ジスルフィド結合を形成することになる。

図１Ｂは全長二重特異性抗体を示している。ヒンジ領域にある重鎖間ジスルフィド結合は示されていない。

図２Ａ＆Ｂは、ノブ（ｋｎｏｂ）半抗体及びホール（ｈｏｌｅ）半抗体をコードするプラスミドを示している。

図３は、別々に操作されて発現された半抗体を用いる、ヘテロ多量体タンパク質、例えば、二重特異性抗体の産生を示している。産生されたＢｓＡｂは、各々が同族の軽鎖と対をなしている２つの異なる重鎖を有する。この方法では、各軽鎖は、各半抗体に対して同じである必要はない。

図４Ａは、別々に操作されて発現された半抗体を用いる、二重特異性抗体の産生についてのフロー図である。この方法では、酸化還元化学が用いられる。

図４Ｂは、クマシー染色したゲルを示す。この２つの半抗体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、還元条件および非還元条件下で分析した。主たる画分は、非還元条件下での各半抗体の７５ｋＤの軽鎖と重鎖の対である。還元条件下（例えば、ＤＴＴによる処置）では、各鎖は別々のバンドとして見える。

図４Ｃは、１ｍＭのＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）処置のある場合と無い場合での半抗体のＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析の結果を示す。ＮＥＭによる処置により半抗体の質量には変化が観察されず、このことは全てのシステインが完全に参加されていることを示している。酸化されたヒンジシステインは、表示アミノ酸配列において環状ジスルフィドとして表されている。半抗体の予想質量は７２５４８ダルトンであり、これは質量分析により観察されているものであって、全く共有結合付加物がないことを示している。

図４Ｄは、カルボキシメチル（ＣＭ）のクロマトグラム、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真、及び抗ＥＧＦＲ／抗−ｃ−ｍｅｔ二重特異性抗体の産生についてデコンボリューションされた質量を示す。ＣＭのクロマトグラフィーはその後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析された単一のピークを生成する。ゲル上の主要なバンドは、全長（すなわち、インタクトな）二重特異性抗体である。マイナーなバンドも７５ｋＤの範囲で見ることができる。主要バンドはその後、質量分析により分析され、検出可能なインタクトな抗体製品のみが抗ＥＧＦＲ／抗ｃ−ｍｅｔ二重特異性抗体の理論的な分子量（ＭＷ）と一致したことが示された。

図５は、別々に操作されて発現された半抗体を用いる、二重特異性抗体の大規模生産についてのフロー図である。

図６は、ノブ・イントゥー・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）のＦｃヘテロダイマーの図解である。ヘテロダイマーはミニＺドメインペプチドの存在で結晶化された（非表示）。ミニＺドメインペプチドはＣ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３界面に結合し、恐らくＦｃのＣ_Ｈ２領域を安定化することに役だっている。ノブとホールの構造が、２つのＣ_Ｈ３ドメインによる接触を作成し、グリコシル化されていない（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）野生型ＩｇＧ_１のＦｃとは有意には異ならない。

図７は、Ｆｃの結晶構造解析により示唆された頭尾対形成の図解である。対形成は、酸化還元の非効率性に部分的に原因があり得る。Ｆｃの頭尾対形成は、抗体の一部にヒンジのジスルフィド対形成を回避させる。ダイマーではあるが、それらの真の同一性の不確かさは、それらの除去を必要とする。このことは、アニーリング工程の全収率／効率に影響し、依然としてプラットフォーム改良のための標的となっている。

図８Ａ−Ｄは、異なるＦｃ変異体の二量体含量を示す。Ｆｃのゲル濾過解析は異なる程度の二量体化を示している。ノブ（Ｋｎｏｂ）変異体は、ノブ（ｋｎｏｂ）及びホール（ｈｏｌｅ）の両方の野生型バージョンと比較すると、非共有性ホモ二量体化の減少を示している。

図９は、ノブ（Ｋｎｏｂ）Ｆｃ−ノブ（Ｋｎｏｂ）Ｆｃの間の接触領域を示す。パネルＡは、疎水性接触を示す。ノブ（Ｋｎｏｂ）−ノブ（Ｋｎｏｂ）Ｆｃホモダイマーが、薄い陰影のＡ鎖と濃い陰影のＢ鎖で漫画として描出されている。 Ａ鎖のＣＨ２ドメインの疎水性残基Ｙ３４９，Ｌ３６８，Ｋ３７０，Ｆ４０５及びＹ４０７はＢ鎖のＣＨ３ドメインの残基Ｆ２４１，Ｆ２４３，Ｖ２６２，及びＶ２６４と会合する。Ｐ３９５とＰ３９６は２つのＣＨ２ドメイン間に疎水性ポケットを作り出す。パネルＢはこのパネル内で示される疎水性接触を示す。ノブ（Ｋｎｏｂ）−ノブ（Ｋｎｏｂ）Ｆｃホモダイマーが、薄い陰影のＡ鎖と濃い陰影のＢ鎖で漫画として描出されている。Ａ鎖のＣＨ２ドメインの残基Ｔ３５０，Ｋ３７０，及びＤ３９９はＢ鎖のＣＨ３ドメインの残基Ｓ２３９，Ｖ２４０，Ｒ３０１，及びＫ３３４と会合する。Ｎ３８９，Ｙ３９１及びＫ３９２は２つのドメイン間で相互作用を形成する。

図１０は、正しいノブ・イントゥー・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）ヘテロダイマーを産生するジスルフィド形成の割合を示す棒グラフである。半抗体が最初に一緒に混合されると、時刻ゼロで低レベルのホモダイマーが見られる。還元されたグルタチオンがヒンジのジルスフィドを還元し始めるので、ホモダイマーが消失し始める。時間が経過するにつれて、グルタチオンは酸化プロセスを開始し、インタクトなＩｇＧの形成の増加が見られる。

図１１は、固定化リガンドを用いた実験からの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）スペクトルの一連の曲線である。分析物はリガンド上を通過させ、ホモ二量体化をモニタリングした。分析物の濃度は６．２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ及びと２００ｎＭにて試験された。リガンドは：（Ａ）ノブ（ｋｎｏｂ）野生型、（Ｂ）ホール（ｈｏｌｅ）野生型、（Ｃ）ノブ（ｋｎｏｂ）Ｆ２４１Ｒ／Ｆ２４３Ｓ、（Ｄ）ノブ（ｋｎｏｂ）Ｆ２４１Ｓ／Ｆ２４３Ｒ、及び（Ｅ）ホール（ｈｏｌｅ）Ｆ２４１Ｓ／Ｆ２４３Ｒであった。ｙ軸は応答単位を、ｘ軸は時間（秒）を示す。

略語
ＡＤＣＣ＝抗体依存性細胞傷害
ＡＰＩ＝抗病原体イムノアドヘシン
ＢＰＩ＝殺菌性／透過性増加タンパク質
Ｃ１ｑ＝補体因子１ｑ
ＣＤ＝分化のクラスター
ＣＤＣ＝補体依存性細胞傷害
ＣＨ１又はＣ_Ｈ１＝重鎖第一定常ドメイン
ＣＨ２又はＣ_Ｈ２＝重鎖第二定常ドメイン
ＣＨ３又はＣ_Ｈ３＝重鎖第三定常ドメイン
ＣＨ４又はＣ_Ｈ４＝重鎖第四定常ドメイン
ＣＬ又はＣ_Ｌ＝軽鎖定常ドメイン
ＣＬＴＡ＝細胞傷害性Ｔリンパ球関連分子
Ｆｃ＝結晶化可能断片
ＦｃγＲ＝ＩｇＧのＦｃタンパク質のレセプターガンマ
ＨＩＶ＝ヒト免疫不全ウイルス
ＩＣＡＭ＝細胞間接着分子
ＢｓＡｂ＝二重特異性抗体
ＢｓＤｂ＝二重特異性ダイアボディー
ｄｓＦｖ＝ジスルフィド安定化Ｆｖ
Ｆｃ＝抗体の定常ドメイン
Ｆｄ＝抗体のＶ_Ｈ＋Ｃ_Ｈ１
ＦｃＲ＝Ｆｃレセプター
Ｆｖ＝抗体の可変ドメイン
ＩｇＧ＝免疫グロブリンＧ
ｍＡｂ＝モノクローナル抗体
ＰＢＬ＝末梢血リンパ球
ｓｃＤＢ＝単鎖ダイアボディ
ｓｃＦｖ＝単鎖Ｆｖ
（ｓｃＦｖ）_２＝ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖタンデム型
Ｔａｎｄａｂ＝タンデムダイアボディ
ＶＨ又はＶ_Ｈ＝抗体の重鎖の可変ドメイン
ＶＬ又はＶ_Ｌ＝抗体の軽鎖の可変ドメイン

詳細な説明
本発明は、以下の定義及び実施例を使用する参照によってのみ詳細に説明される。本明細書で言及されるような特許及び刊行物は、そのような特許及び刊行物に開示すべての配列を含み、参照により明示的に援用される。

本明細書において別に規定されない限り、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるように、使用されるすべての技術用語および科学用語は、本明細書と同じ意味を持つ。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，２Ｄ ＥＤ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）及びＨａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ，ＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ（１９９１）は、本発明において使用される数多くの用語多くの一般的な辞書を使う技能を提供する。本明細書に記載したものと類似又は同等の任意の方法及び材料を本発明の実行又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料が記載される。数値の範囲は、範囲を定める数値が含まれる。特に断らない限り、核酸は５’から３’の向きで左から右に書かれ、アミノ酸配列は、アミノ基からカルボキシの向きで左から右に書かれている。実行者は、定義と技術の用語について、特にＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９、及びＡｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ．，１９９３に向いている。本発明は、特定の方法論、プロトコール、及び記載された試薬に対し、これらが変更し得るため、限定されるものでないことが理解されるべきである。

数値の範囲は、範囲を定める数値が含まれる。

特に断らない限り、核酸は５’から３’の向きで左から右に書かれ、アミノ酸配列は、アミノ基からカルボキシの向きで左から右に書かれている。

本明細書で提供される見出しは、本明細書を全体として参照することにより有することができる本発明の種々の態様又は実施態様を制限するものではない。従って、すぐ下に定義された用語は、本明細書を全体として参照することにより、より完全に定義される。

Ｉ．定義
「ヘテロ多量体」、「ヘテロ多量体複合体」、又は「ヘテロ多量体タンパク質」とは、少なくとも第一のＦｃ含有ポリペプチド及び第二のＦｃ含有ポリペプチドを指し、ここで第二のＦｃ含有ポリペプチドがアミノ酸配列において、第一のＦｃ含有ポリペプチドと少なくとも一つのアミノ酸残基だけ異なる。ヘテロ多量体は、第一及び第二のＦｃ含有ポリペプチドで形成される「ヘテロダイマー」を含むことができ、又は第一及び第二のＦｃ含有ポリペプチドに加えてポリペプチドが存在している高次立体構造を形成することができる。ヘテロ多量体のポリペプチドは、非ペプチド性、共有結合（例えば、ジスルフィド結合）及び／又は非共有結合性相互作用（例えば、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、及び／又は疎水性相互作用）により相互作用し得る。

本明細書に記載されるように、「ヘテロ多量体化ドメイン」は生体分子に対して、ヘテロ多量体形成を促進し、ホモ多量体の形成を阻害するなどの改変や追加を指す。ホモダイマーよりもヘテロダイマーの形成について強い優先度を持つ任意のヘテロ二量体化ドメインが、本発明の範囲内にある。実例となる例として、限定されないが、例えば、米国特許出願公開第２００３００７８３８５号（Ａｒａｔｈｏｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ；ノブ・イントゥー・ホールを記載）；国際公開第２００７１４７９０１号（Ｋｊａｅｒｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ：イオン性相互作用を記述）；国際公開第２００９０８９００４号（Ｋａｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．Ａｍｇｅｎ：静電的ステアリング効果（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｓｔｅｅｒｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ）を記載）；米国仮特許出願第６１／２４３，１０５号（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．−Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ；コイルドコイルを記述）を含む。また、例えば、ロイシンジッパーを記述するＰａｃｋ，Ｐ．＆Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１，１５７９−１５８４（１９９２）、又はヘリックス・ターン・ヘリックスモチーフを記述するＰａｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１，１２７１−１２７７（１９９３）を参照。語句「ヘテロ多量体化ドメイン」及び「ヘテロ多二量体化ドメイン」は、本明細書にて互換的に用いられる。

本明細書における用語「抗体」は、最も広義の意味で使用され、２本の重鎖と２本の軽鎖、及び所望の生物学的活性（例えば、エピトープ結合活性）を示す限り、それらの任意の断片、突然変異体、変異体又は誘導体を含む、任意の免疫グロブリン（Ｉｇ）分子を指す。抗体の例には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体および抗体断片が含まれる。抗体は、ヒト、ヒト化、及び／又は親和性成熟であり得る。

参照の骨組みとして、本明細書で使用される場合、抗体は免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の構造を参照することにする。しかし、任意の免疫グロブリンクラスの抗体は、本明細書に記載の本発明の方法で利用することができることを当業者は理解する／認識するであろう。明確にするために、ＩｇＧ分子は一対の同一の重鎖（ＨＣｓ）、及び一対の同一の軽鎖（ＬＣｓ）を含む。各ＬＣは一可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）と一定常ドメイン（Ｃ_Ｌ）を有し、一方各ＨＣは一可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）と三つの定常ドメイン（Ｃ_Ｈ１，Ｃ_Ｈ２，及びＣ_Ｈ３）を有する。Ｃ_Ｈ１ドメイン及びＣ_Ｈ２ドメインはヒンジ領域により連結されている。この構造は、当該技術分野において周知である。図１Ｂを参照する。

本明細書において用いられる場合、「半抗体」は、一免疫グロブリン軽鎖に結合する一免疫グロブリン重鎖を指す。典型的な半抗体が、図１Ａに示されている。半抗体はまた、単一の可変ドメインを含む抗原結合ドメインを有し得ることを、当業者は容易に理解するであろう。

用語「マキシボディ」は、Ｆｃポリペプチドに融合したｓｃＦｖを含む融合タンパク質を指す。国際公開第２００９０８９００４号の図８ａに参照が行われる。二重特異性マキシボディについて、国際公開第２００９０８９００４号の図２に参照が行われる。

ヒトＩｇＧのＦｃ領域の用語「Ｃ_Ｈ２ドメイン」は、ＥＵ番号付けに従い、通常ＩｇＧの約２３１残基から約３４０残基に伸展する。Ｃ_Ｈ２ドメインは、それが他のドメインと密接に対をなしていない点でユニークである。むしろ、２つのＮ−結合型分枝糖鎖がインタクトな天然ＩｇＧ分子の２つのＣ_Ｈ２ドメインの間に挿入されている。糖は、ドメイン−ドメインの対合の代替を提供し、ＣＨ２ドメインの安定化を助長し得ることが推測されている。Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１６１−２０６（１９８５）．

用語「Ｃ_Ｈ３ドメイン」は、Ｆｃ領域のＣ末端からＣ_Ｈ２ドメインへの残基（即ち、ＥＵ番号付けシステムによって、ＩｇＧのアミノ酸残基３４１あたりからアミノ酸残基４４７あたりへ）の伸展を含む。

本明細書で使用される用語「Ｆｃ領域」は、一般に、免疫グロブリン重鎖のＣ末端ポリペプチドを含む二量体複合体を指し、ここで、Ｃ末端ポリペプチド配列は、インタクトな抗体のパパイン消化により得ることができるものである。Ｆｃ領域は、天然型又は変異体Ｆｃ配列を含んでもよい。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は様々であり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、Ｆｃ配列の位置Ｃｙｓ２２６のアミノ酸残基から、又はＰｒｏ２３０から、そのカルボキシル末端への伸展と定義される。本明細書に明記されていない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。免疫グロブリンのＦｃ配列は、一般に、２つの定常ドメイン、Ｃ_Ｈ２ドメイン及びＣ_Ｈ３ドメインを含み、任意でＣ_Ｈ４ドメインを含む。本明細書の「Ｆｃポリペプチド」により、Ｆｃ領域、例えば単量体Ｆｃを構成するポリペプチドの一つを意味する。Ｆｃポリペプチドは、任意の適切な免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭから得られ得る。Ｆｃ領域は、ジスルフィドにより一緒に保持される、両方のＨ鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域における配列によって決定され、この領域はまた、特定の種類の細胞に見出されるＦｃレセプター（ＦｃＲ）によって認識される部分である。幾つかの実施態様において、Ｆｃポリペプチドは、野生型ヒンジ配列の一部又は全部を（一般に、そのＮ末端で）含む。幾つかの実施態様において、Ｆｃポリペプチドは、機能性又は野生型ヒンジ配列を含まない。

「機能性Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を保有する。例示的な「エフェクター機能」には、Ｃ１ｑ結合；ＣＤＣ；Ｆｃレセプター結合；ＡＤＣＣ；貪食作用；細胞表面レセプター（例えば、Ｂ細胞レセプター；ＢＣＲ）のダウンレギュレーションなどが含まれる。そのようなエフェクター機能は、結合ドメイン（例えば抗体可変ドメイン）と組み合わせるためにＦｃ領域を一般に必要とするので、例えば本明細書における定義に開示するような、様々なアッセイを用いて該エフェクター機能を評価することができる。

「天然配列Ｆｃ領域」は、天然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。天然配列ヒトＦｃ領域には、天然配列ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域（非ＡおよびＡアロタイプ）；天然配列ヒトＩＧ２ Ｆｃ領域；天然配列ヒトＩＧ３ Ｆｃ領域；および天然配列ヒトＩＧ４ Ｆｃ領域；ならびにこれらの天然に生じる変異体が含まれる。

「変異体Ｆｃ領域」は、少なくとも１のアミノ酸修飾、好ましくは１以上のアミノ酸置換によって天然配列Ｆｃ領域のものとは異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、変異体Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域と又は親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して少なくとも１のアミノ酸置換、例えば、天然配列Ｆｃ領域に又は親ポリペプチドのＦｃ領域に約１から約１０のアミノ酸置換、および好ましくは約１から約５のアミノ酸置換を有する。本明細書での変異体Ｆｃ領域は、好ましくは、天然配列Ｆｃ領域との及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域との少なくとも約８０％の相同性、ならびに最も好ましくはそれらとの少なくとも約９０％の相同性、より好ましくはそれらとの少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の相同性を有する。

本明細書で用いる「Ｆｃ複合体」は、Ｆｃ領域のヒンジ領域、Ｃ_Ｈ２ドメイン又はＣ_Ｈ３ドメインを指す。

所定の実施態様において、Ｆｃ含有ポリペプチドは、好ましくは野生型ヒトＩｇＧのＦｃ領域に由来のＩｇＧのＦｃ領域を含む。「野生型」ヒトＩｇＧのＦｃによって、ヒトの集団内で自然に発生するアミノ酸の配列を意味する。もちろん、Ｆｃ配列が個体間で若干差があり得るのと同様に、一以上の改変が野生型配列に作られる場合があり、それでもなお本発明の範囲内で維持される。例えば、Ｆｃ領域は、本発明に関連していない更なる改変、例えば、グリコシル化部位における変異、又は非天然アミノ酸の包含などを含めることができる。ノブ、ホール又はノブ／ホールと併せて使用されるとき、「野生型」は、ノブ、ホール又はノブ／ホールの導入された変異のみを有するタンパク質配列を指すことを意味し、そうでなければヒトの集団内で天然に生じる配列を含むことを意味する。

用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン（それぞれＶ_ＨおよびＶ_Ｌ）は、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む各ドメインを持ち、一般的に似たような構造を有する。（例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，頁９１（２００７）を参照）。単一のＶ_Ｈ又はＶ_Ｌドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。更に、特定の抗原に結合する抗体は、相補的なＶ_Ｌ又はＶ_Ｈドメインのそれぞれのライブラリーをスクリーニングするために、抗原に結合する抗体由来のＶ_Ｈ又はＶ_Ｌドメインを用いて単離することができる。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０−８８７（１９９３）；Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１）を参照。

本明細書で使用する用語「Ｆａｂ」は、抗体の抗原結合断片を指す。上述したように、パパインはインタクトな抗体を消化するために用いることができる。抗体のパパイン消化は、２つの同一な抗原結合断片、即ち、「Ｆａｂ」断片、及び残りの「Ｆｃ」断片（即ち、上掲のＦｃ領域）を生成する。Ｆａｂ断片は、Ｈ鎖の可変領域ドメイン（Ｖ_Ｈ）と一緒のＬ鎖の全体、及び一方の重鎖の第一の定常ドメイン（Ｃ_Ｈ１）からなる。

語句「抗原結合アーム」、「標的分子結合アーム」、「標的結合アーム」及びそれらの変形は、本明細書にて使用される場合、目的の標的に特異的に結合する能力を有する本発明のヘテロ多量体化タンパク質の構成部分を指す。一般的にかつ好ましくは、抗原結合アームは免疫グロブリンポリペプチド配列、例えば、ＣＤＲ及び／又は免疫グロブリン軽鎖及び重鎖の可変ドメイン配列の複合体である。

「標的」又は「標的分子」は、ヘテロ多量体タンパク質の結合アームによって認識される部分をいう。例えば、ヘテロ多量体タンパク質が抗体である場合、標的は、文脈に応じて、単一分子上又は異なる分子上、又は病原体又は腫瘍細胞上のエピトープであり得る。同様に、ヘテロ多量体タンパク質が、レセプター−Ｆｃ融合タンパク質である場合、標的はレセプターに対して同族の結合パートナーとなるであろう。当業者は、標的は標的結合アームとの結合特異性によって決定され、異なる標的結合アームは異なる標的を認識することができることを理解するであろう。標的は、好ましくは１ｕＭのＫｄ（スキャッチャード分析による）よりも高い親和性を有する本発明のヘテロ多量体タンパク質に結合する。標的分子の例は、限定されないが、血清可溶性タンパク質及び／又はそれらのレセプター、例えば、サイトカイン及び／又はサイトカインレセプター等、アドヘシン、成長因子及び／又はそれらのレセプター、ホルモン、ウイルス粒子（例えば、ＲＳＶ Ｆタンパク質、ＣＭＶ、ＳｔａｐｈＡ、インフルエンザ、Ｃ型肝炎ウイルス）、微生物（例えば、細菌細胞タンパク質、真菌細胞）、アドヘシン、ＣＤタンパク質及びそれらのレセプターを含む。

「インタクト」又は「全長」抗体の一例は、抗原結合アーム並びにＣ_Ｌ及び少なくとも重鎖定常ドメイン、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、及びＣ_Ｈ３を含む。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列変異体であり得る。

本明細書にて使用される用語「カップリング」は、第一のＦｃ含有ポリペプチド及び第二のＦｃ含有ポリペプチドをお互いに連結させること、例えば共有結合の形成に必要な工程を指す。このような工程は、鎖間ジスルフィド結合を形成するために、第一及び第二のＦｃ含有ポリペプチドのシステイン残基の還元、アニーリング及び／又は酸化を含む。カップリングは、化学的架橋，又は酸化還元系を用いることによって達成することができる。例えば、Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９８）２１７：１−１０ 及びＺｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．，（１９９４）８６：１２７−１３４を参照。

用語「多特異性抗体」は最も広い意味で使用され、具体的にはポリエピトープ特異性を有する抗体を網羅する。このような多重特異性抗体は、限定されないが、重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）および軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含む抗体を含み、Ｖ_ＨＶ_Ｌユニットはポリエピトープ特異性、２以上のＶ_Ｌドメイン及びＶ_Ｈドメインを有し、各Ｖ_ＨＶ_Ｌユニットは異なるエピトープに結合する抗体、２以上の単一可変ドメインを有し、各単一可変ドメインが異なるエピトープに結合する抗体、全長抗体、抗体断片、例えばＦａｂ、Ｆｖを、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ及びトリアボディなど、共有結合又は非共有結合で連結している抗体断片を含む。「ポリエピトープ特異性」とは、同一または異なる標的（複数）上の２つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する能力を指す。「単一特異性」は唯一つのエピトープに結合する能力を指す。一実施態様によれば、多重特異性抗体は、各エピトープに、５μＭから０．００１ｐＭ、３μＭから０．００１ｐＭ、１μＭから０．００１ｐＭ，、０．５μＭから０．００１ｐＭ、又は０．１μＭから０．００１ｐＭの親和性で結合するＩｇＧ抗体である。二重特異性抗体の説明図が図１Ｂに与えられる。

「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部、好ましくはインタクトな抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）（Ｄｂ）；タンデムダイアボディ（ｔａＤｂ）；直鎖状抗体（米国特許第５６４１８７０号、実施例２；Ｚａｐａｔａ等，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５））；一アーム抗体、単一可変ドメイン抗体、ミニボディ；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体（例えば、Ｄｂ−Ｆｃ、ｔａＤｂ−Ｆｃ、ｔａＤｂ−ＣＨ３および（ｓｃＦＶ）４−Ｆｃが含まれるがこれらに限定されない）を含む。

「単一ドメイン抗体」（ｓｄＡｂ）または「単一可変ドメイン（ＳＶＤ）抗体」という表現は、単一可変ドメイン（Ｖ_Ｈ又はＶ_Ｌ）が抗原結合を付与することができる抗体を一般に指す。言い換えると、単一可変ドメインは、標的抗原を認識するために別の可変ドメインと相互作用する必要がない。単一ドメイン抗体は、各抗原結合アーム上の単一の単量体可変抗体ドメイン（Ｖ_Ｈ又はＶ_Ｌ）からなる。単一ドメイン抗体の例には、ラクダ科（ラマおよびラクダ）および軟骨魚（例えばテンジクザメ）に由来するものならびにヒトおよびマウス抗体からの組換え法から得られるものが含まれる（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１：５４４−５４６；Ｄｏｏｌｅｙ ａｎｄ Ｆｌａｊｎｉｋ，Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００６）３０：４３−５６；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ（２００１） ２６：２３０−２３５；Ｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００３）：２１：４８４−４９０；国際公開第２００５／０３５５７２号；国際公開第０３／０３５６９４号；Ｄａｖｉｅｓ ａｎｄ Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔ（１９９４） ３３９：２８５−２９０；国際公開第００／２９００４号；国際公開第０２／０５１８７０号）。単一可変ドメイン抗体は、他の可変領域又は可変ドメインを持つ抗原結合アーム（例えば、ホモ又はヘテロ多量体）中に存在することができる、その場合には、それは単一ドメイン抗体ではない。

本明細書において言及する「ノブ・イントゥー・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）」または「ＫｎＨ」技術という用語は、インビトロまたはインビボで２つのポリペプチドの相互的な対合を導く技術であって、それらが相互作用する界面において一方のポリペプチドに突起（ノブ）をおよび他方のポリペプチドに空洞（ホール）を導入することによる技術を指す。例えば、ＫｎＨは、抗体のＦｃ：Ｆｃ結合界面、Ｃ_Ｌ：Ｃ_Ｈ１界面またはＶ_Ｈ／Ｖ_Ｌ界面において導入されている（例えば、米国特許出願公開第２００７／０１７８５５２号、国際公開第９６／０２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号及びＺｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６：７８１−７８８）。これは、多重特異性抗体の製造中に２つの異なる重鎖の相互的な対合を駆動するのに特に有用である。例えば、Ｆｃ領域にＫｎＨを有する多重特異性抗体は、各Ｆｃ領域に連結された単一可変ドメインをさらに含むことができ、または類似したもしくは異なる軽鎖可変領域と対合する異なる重鎖可変ドメインをさらに含むことができる。ＫｎＨ技術を用いて、２つの異なるレセプター細胞外ドメインを互いに対合させること、又は（例えばアフィボディ、ペプチボディおよび他のＦｃ融合体を含む）異なる標的認識配列を含む任意の他のポリペプチド配列を対合させることもできる。

「Ｆｖ」は１本の重鎖と１本の軽鎖の可変領域の二量体からなる。これら２つのドメインの折り畳みから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に対する抗原結合特異性を付与する６つの高頻度可変ループ（Ｈ及びＬ鎖から、それぞれ３つのループ）が生じる。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含んでなるＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりは低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を持つ。

「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」とも略称される「単鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖内に結合したＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーをさらに含み、それはｓＦＶが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，頁２６９−３１５（１９９４）；Ｍａｌｍｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８３：７−１３，１９９５を参照のこと。

用語「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）」は、鎖間ではなく鎖内でＶドメインを対形成させ、結果として二価の断片、すなわち２つの抗原−結合部位を有する断片が得られるように、Ｖ_ＨとＶ_Ｌドメインとの間に、短いリンカー（約５−１０残基）を持つｓＦｖ断片（前の段落を参照）を構築することにより調製される小型の抗体断片を意味する。二重特異性ダイアボディは２つの「交差」ｓＦｖ断片のヘテロダイマーであり、そこでは２つの抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在する。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開９３／１１１６１号；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）により十分に記載されている。

用語「ワンアームド抗体」は、（１）Ｃ_Ｈ２ドメイン、Ｃ_Ｈ３ドメイン又はＣ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３ドメインを含むポリペプチドに結合したペプチドによって連結された可変ドメインと（２）第二Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３又はＣ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３ドメインとを含む抗体であって、該可変ドメインが、該第二Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３又はＣ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３ドメインを含むポリペプチドに結合したペプチドによって連結されていない抗体を指す。一実施態様において、ワンアームド抗体は、（１）可変ドメイン（例えばＶ_Ｈ）、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３を含む第一ポリペプチドと（２）可変ドメイン（例えばＶ_Ｌ）およびＣ_Ｌドメインを含む第二ポリペプチドと（３）Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３ドメインを含む第三ポリペプチドの３つのペプチドとを含む。別の実施態様では、ワンアームド抗体は、定常重鎖を連結するジスルフィド結合を形成する２つのシステイン残基を含有する部分的ヒンジ領域を有する。一実施態様では、ワンアームド抗体の可変ドメインは抗原結合領域を形成する。別の実施態様では、ワンアームド抗体の可変ドメインは単一可変ドメインであり、各単一可変ドメインが抗原結合領域である一実施態様において、ワンアームド抗体は単一の可変ドメイン抗体である。

本発明の抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の種に由来する又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一又は相同であるが、その（それらの）鎖の残部は別の種に由来する又は別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体、ならびにそのような抗体の断片（但し、それらが所望の生物学的活性を示すことを条件とする）であり得る（米国特許第４８１６５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５（１９８４））。本明細書における対象のキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば旧世界ザル、類人猿など）及びヒト定常領域配列に由来する可変ドメイン抗原結合配列を含む霊長類化抗体が含まれる。

非ヒト（例えば齧歯類）抗体の「ヒト化」形とは、非ヒト抗体から得られた最小配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域からの残基が、所望の抗体特異性、親和性、及び性能を有するマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類などのヒト以外の種（ドナー抗体）の超可変領域からの残基によって置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例においては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は、対応する非−ヒト残基によって置き換えられている。更に、ヒト化抗体はレシピエント抗体又はドナー抗体において見いだされない残基を含むことが可能である。これらの修飾は、抗体の性能をさらに改良するために作成される。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には２つの可変ドメインの全てを実質的に含み、超可変ループの全て又は実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、任意で、免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンのそれを含むであろう。更なる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）を参照。

「ペプチボディ」又は「ペプチボディ（複数）」はにランダムに生成されたペプチドのＦｃドメインとの融合体を指す。Ｆｅｉｇｅ ｅｔ ａｌ．に対して２００３年１２月９日に発行された米国特許第６，６６０，８４３号を参照（参照によりその全体が援用される）。それらは、Ｎ末端、Ｃ末端、アミノ酸側鎖に対して、又はこれらの部位の一以上に対して結合した一以上のペプチドを含む。ペプチボディ技術は、リガンド及び受容体、腫瘍帰巣ペプチド、膜輸送ペプチドなどのペプチドを組み込んだ治療薬の設計を可能にする。ペプチボディ技術は、ジスルフィドによって拘束された線状ペプチド、「直列ペプチド多量体」（すなわち、Ｆｃドメインの単鎖上の１つより多くのペプチド）を含めて、多数のそのような分子の設計において有用であることが証明された。例えば、米国特許第６，６６０，８４３号；２００３年１０月１６日に公開された米国特許出願公開第２００３／０１９５１５６号（２００２年１１月２１日に公開された国際公開第０２／０９２６２０号に対応する）；２００３年９月１８日に公開された米国特許出願公開第２００３／０１７６３５２号（２００３年４月１７日に公開された国際公開第０３／０３１５８９号に対応する）；１９９９年１０月２２日に出願された米国特許出願第０９／４２２，８３８号（２０００年５月４日に公開された国際公開第００／２４７７０号に対応する）；２００３年１２月１１日に公開された米国特許出願公開第２００３／０２２９０２３号；２００３年７月１７日に公開された国際公開第０３／０５７１３４号；２００３年１２月２５日に公開された米国特許出願公開第２００３／０２３６１９３号（２００４年４月８日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ０４／０１０９８９号に対応する）；２００３年９月１８日に出願された米国特許出願第１０／６６６，４８０号（２００４年４月１日に公開された国際公開第０４／０２６３２９号に対応する）を参照のこと。これらの各々は出典明記によりその全体が本明細書に組み込まれる。

「アフィボディ」は、標的分子のための結合表面を生じさせるためにタンパク質を足場として使用する、ペプチド結合によりＦｃ領域に連結されたタンパク質の使用を指す。前記タンパク質は、多くの場合、天然に生じるタンパク質、例えばブドウ球菌プロテインＡもしくはＩｇＧ結合Ｂドメイン、またはそれらに由来するＺタンパク質（Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ（１９８７），Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ １，１０７−１３３、および米国特許第５，１４３，８４４号を参照）またはそれらの断片もしくは誘導体である。例えば、標的分子を結合できる変異体のライブラリを生じさせるようにランダム突然変異誘発によってＺタンパク質のセグメントを突然変異させたものである、標的分子への結合親和性が改変されたＺタンパク質変異体から、アフィボディを作ることができる。アフィボディの例には、米国特許第６５３４６２８号、Ｎｏｒｄ Ｋ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ８：６０１−６０８（１９９５）およびＮｏｒｄ Ｋ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ １５：７７２−７７７（１９９７）．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００８ Ｊｕｎ；５０（Ｐｔ ２）：９７−１１２が含まれる。

本明細書において用いる場合、用語「イムノアドヘシン」は、異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能を兼備する分子を示す。構造的には、イムノアドヘシンは、アミノ酸配列が抗体の抗原認識および結合部位以外である（すなわち、抗体の定常領域と比較して「異種」である）、所望の結合特異性を有するアミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列（例えばＩｇＧのＣ_Ｈ２及び／又はＣ_Ｈ３配列）との融合体を含む。例示的なアドヘシン配列には、対象のタンパク質に結合するレセプターまたはリガンドの一部分を含む隣接アミノ酸配列が含まれる。アドヘシン配列は、対象のタンパク質を結合するがレセプター又はリガンド配列ではない配列（例えばペプチボディ中のアドヘシン配列）でもあり得る。そのようなポリペプチド配列を、ファージディスプレイ技術及びハイスループット選別法をはじめとする様々な方法によって、選択または同定することができる。前記イムノアドヘシンにおける免疫グロブリンの定常ドメイン配列は、任意の免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はＩｇＭから得ることができる。

本明細書で用いられる「複合体」または「複合体化した」は、ペプチド結合でない結合及び／又は力（例えば、ファンデルワールス、疎水性、親水性力）によって互いに相互作用する２つ以上の分子の会合を指す。一実施態様では、複合体はヘテロ多量体である。本明細書で用いられる「タンパク質複合体」又は「ポリペプチド複合体」という用語が、タンパク質複合体中のタンパク質にコンジュゲートした非タンパク質エンティティー（例えば、限定するものではないが、化学分子、例えば毒素又は検出剤を含む）を有する複合体を含むことは理解されるはずである。

本明細書で用いられる「ヘテロ多量体」とは、対象の抗原に結合し、ヘテロ多量体タンパク質が、タンパク質又は標的を発現する細胞又は組織を標的とする診断及び／又は治療剤として有用であるように、十分な親和性で標的に結合し、他のタンパク質とは有意に交差反応しないものである。そのような実施態様では、「非標的」タンパク質に対するヘテロ多量体タンパク質の結合範囲は、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析又は放射性免疫沈降法（ＲＩＡ）又はＥＬＩＳＡにより決定した場合、その特定の標的タンパク質に対する抗体の結合の約１０％未満である。標的分子へのヘテロ多量体タンパク質の結合に関して、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド標的上のエピトープに対する「特異的結合」又は「に特異的に結合する」又は「に特異的な」といった用語は、非特異的な相互作用とは測定可能な差異を有する結合を意味する（例えば、非特異的な相互作用はウシ血清アルブミンまたはカゼインへの結合であってよい）。特異的結合は、例えば、コントロール分子の結合と比較して分子の結合を決定することにより測定することができる。例えば、特異的結合は、標的、例えば標識していない過剰な量の標的に類似したコントロール分子との競合により決定することができるこの場合、プローブに対する標識した標的の結合が、標識していない過剰な量の標的により競合的に阻害された場合、特異的結合が示される。ここで用いる特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド標的上のエピトープに対する「特異的結合」又は「に特異的に結合する」又は「に特異的である」といった用語は、例えば、少なくともおよそ２００ｎＭ、あるいは少なくともおよそ１５０ｎＭ、あるいは少なくともおよそ１００ｎＭ、あるいは少なくともおよそ６０ｎＭ、あるいは少なくともおよそ５０ｎＭ、あるいは少なくともおよそ４０ｎＭ、あるいは少なくともおよそ３０ｎＭ、あるいは少なくともおよそ２０ｎＭ、あるいは少なくともおよそ１０ｎＭ、あるいは少なくともおよそ８ｎＭ、あるいは少なくともおよそ６ｎＭ、あるいは少なくともおよそ４ｎＭ、あるいは少なくともおよそ２ｎＭ、あるいは少なくともおよそ１ｎＭ又はそれ以上の対標的Ｋｄを有する分子によって提示されうる。一実施態様では、用語「特異的な結合」は、ヘテロ多量体タンパク質が他のいかなるポリペプチド又はポリペプチドエピトープに実質的に結合しないで特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープに結合する結合を指す。

一般的に「結合親和性」は、分子（例えば抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）との間の非共有結合的な相互作用の総合的な強度を意味する。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映している本質的な結合親和性を指す。そのパートナーＹに対する分子Ｘの親和性は、一般的に解離定数（Ｋｄ）で表すことができる。例えば、Ｋｄは、２００ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、８ｎＭ、６ｎＭ、４ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ又はそれ以上の強さでありうる。親和性は、本明細書に記載したものを含む、当技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。低親和性抗体は抗原にゆっくり結合して素早く解離する傾向があるのに対し、高親和性抗体は抗原により密接により長く結合したままとなる。結合親和性の様々な測定方法が当分野で公知であり、それらの何れかを本発明のために用いることができる。

一実施態様では、本発明の「Ｋｄ」又は「Ｋｄ値」は、およそ１０反応単位（ＲＵ）の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃のＢＩＡｃｏｒｅ^ＴＭ−２０００又はＢＩＡｃｏｒｅ^ＴＭ−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）にて表面プラズモン共鳴アッセイを行って測定される。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｃ．）を、提供者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化した。抗原を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（〜０．２μＭ）に希釈し、結合したタンパク質の反応単位（ＲＵ）がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入する。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。動力学的な測定のために、Ｆａｂの２倍の段階希釈（例えば、０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を、２５℃で、およそ２５μｌ／分の流速で、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに注入した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル（ｓｉｍｐｌｅ ｏｎｅ−ｔｏ−ｏｎｅ Ｌａｎｇｍｕｉｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌ）（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン３．２）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数（Ｋｄ）をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出した。例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照。上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる結合速度が１０^６Ｍ−^１Ｓ−^１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計（ｓｔｏｐ−ｆｌｏｗ ｅｑｕｉｐｐｅｄ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒ）（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズのＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）、２５℃で、２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ）における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。

抗体、断片又はこれらの誘導体といった本発明のヘテロ多量体タンパク質に関して「生物学的に活性な」及び「生物学的活性」及び「生物学的特徴」は、特段の記載がない限り、生物学的分子に結合する能力を有することを意味する。

「単離された」とは、様々なヘテロ多量体ポリペプチドを記述するために使用するときは、発現された細胞又は細胞培養物から分離され及び／又は回収されたヘテロ多量体を意味する。その自然環境の混入成分は、ヘテロ多量体の診断または治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質様または非タンパク質様溶質が含まれる。所定の実施態様において、ヘテロ多量体は、（１）ローリー法により判定してタンパク質９５重量％超、および最も好ましくは９９重量％超まで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、Ｎ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、または（３）クーマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を用いる還元もしくは非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均一になるまで精製される。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製されるであろう。

本発明のヘテロ多量体は、実質的に均一になるまで一般には精製される。「実質的に均一な」、「実質的に均一な形態」および「実質的均一」という句は、その産物に、望ましくないポリペプチドの組み合わせ（例えばホモ多量体）起源の副産物が実質的にないことを示すために用いられる。

純度に関して表現される、実質的に均一とは、副産物の量が、１０重量％、９重量％、８重量％、７重量％、６重量％、４重量％、３重量％、２重量％もしくは１重量％を超えない、または１重量％未満であることを意味する。一実施態様では、副産物は５％未満である。

「生物学的分子」は、核酸、タンパク質、糖質、脂質およびこれらの組合せを指す。一実施態様では、生物学的分子は天然に存在する。

本明細書で用いられる「連結された」または「連結する」とは、第一アミノ酸配列と第二アミノ酸配列の間の直接的なペプチド結合による結合、または第一および第二アミノ酸配列に結合した、該配列間のペプチドである、第三アミノ酸配列を伴う結合のいずれかを意味する。例えば、あるアミノ酸配列のＣ末端におよび他のアミノ酸配列のＮ末端に結合したリンカーペプチド。

本明細書で用いられる「リンカー」とは、２以上のアミノ酸長のアミノ酸配列を意味する。リンカーは、天然極性または非極性アミノ酸から成り得る。リンカーは、例えば、２から１００アミノ酸長、例えば２アミノ酸長と５０アミノ酸長の間、例えば、３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０アミノ酸長であり得る。リンカーは、例えば自己切断または酵素的もしくは化学的切断により、「切断可能」であり得る。アミノ酸配列内の切断部位ならびにそのような部で切断する酵素および化学物質は、当該技術分野において周知であり、本明細書にも記載する。

本明細書で用いられる「テザー」とは、２つの別のアミノ酸配列を連結するアミノ酸リンカーを意味する。本明細書に記載するテザーは、免疫グロブリン重鎖可変ドメインのＮ末端と免疫グロブリン軽鎖定常領域のＣ末端を連結することができる。特定の実施態様において、テザーは、約１５アミノ酸長と５０アミノ酸長の間、例えば、２０アミノ酸長と２６アミノ酸長の間（例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６アミノ酸長）である。テザーは、例えば、当該技術分野において標準的な方法および試薬を用いる自己切断または酵素的もしくは化学的切断により、「切断可能」であり得る。

「リンカー」または「テザー」の酵素的切断は、例えばＬｙｓ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｎ、Ａｒｇ−Ｃ、Ｖ８、Ｇｌｕ−Ｃ、キモトリプシン、トリプシン、ペプシン、パパイン、トロンビン、ゲネナーゼ、第Ｘａ因子、ＴＥＶ（タバコエッチウイルスシステインプロテアーゼ）、エンテロキナーゼ、ＨＲＶ Ｃ３（ヒトライノウイルスＣ３プロテアーゼ）、キニノゲナーゼ、ならびにスブチリシン様プロプロテイン転換酵素（例えば、フリン（ＰＣ１）、ＰＣ２もしくはＰＣ３）またはＮ−アルギニン二塩基性転換酵素などの、エンドペプチダーゼの使用を必要とし得る。化学的切断は、例えば、ヒドロキシルアミン、Ｎ−クロロスクシンイミド、Ｎ−ブロモスクシンイミド、または臭化シアンの使用を必要とし得る。

本明細書で用いられる「Ｌｙｓ−Ｃエンドペプチダーゼ切断部位」は、Ｌｙｓ−ＣエンドペプチダーゼによってＣ末端側で切断され得るアミノ酸配列内のリシン残基である。Ｌｙｓ−Ｃエンドペプチダーゼは、リシン残基のＣ末端側で切断する。

「カオトロピック剤」とは、分子内相互作用（例えば水素結合、ファンデルワールス力または疎水性作用）の安定化を妨害することによりタンパク質（例えば抗体）の三次元構造を破壊する水溶性物質を意味する。例示的なカオトロピック剤には、限定するものではないが、尿素、グアニジン−ＨＣｌ、過塩素酸リチウム、ヒスチジンおよびアルギニンが含まれる。

「中性（ｍｉｌｄ）界面活性剤」とは、分子内相互作用（例えば水素結合、ファンデルワールス力または疎水性作用）の安定化を妨害することによりタンパク質（例えば抗体）の三次元構造を破壊するが、生物学的活性を喪失させるようにタンパク質構造を永久破壊しない（すなわち、タンパク質を変性しない）、水溶性物質を意味する。例示的な中性界面活性剤には、限定するものではないが、Ｔｗｅｅｎ（例えばＴｗｅｅｎ−２０）、Ｔｒｉｔｏｎ（例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、ＮＰ−４０（ノニルフェノキシポリエトキシエタノール）、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が含まれる。

抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に帰する生物学的活性を意味し、抗体のアイソタイプにより変わる。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害；Ｆｃレセプター結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）；貪食作用；細胞表面レセプター（例えば、Ｂ細胞レセプター）のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が含まれる。

「抗体依存性細胞媒介性細胞障害」又は「ＡＤＣＣ」とは、ある種の細胞障害細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球及びマクロファージ）上に存在するＦｃレセプター（ＦｃＲｓ）と結合した分泌Ｉｇにより、これらの細胞障害エフェクター細胞が抗原−担持標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒により標的細胞を死滅させることを可能にする細胞障害性の形態を意味する。抗体は細胞障害細胞を「備えて」おり、これはこのような死滅には絶対に必要なものである。ＡＤＣＣを媒介する初代細胞、ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する造血細胞におけるＦｃＲの発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）の４６４ページの表３に要約されている。対象の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５５００３６２号又は同第５８２１３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイを実施することができる。このようなアッセイにおいて有用なエフェクター細胞には、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）が含まれる。代わりとして、もしくは付加的に、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ等，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９９８）において開示されているような動物モデルにおいて、インビボで評価することが可能である。

「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記載するものである。好適なＦｃＲは天然配列ヒトＦｃＲである。さらに、好適なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマレセプター）と結合するもので、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含み、これらのレセプターの対立遺伝子変異体、選択的にスプライシングされた形態のものも含まれる。ＦｃγＲＩＩレセプターには、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性型レセプター」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害型レセプター」）が含まれ、主としてその細胞質ドメインは異なるが、類似のアミノ酸配列を有するものである。活性型レセプターＦｃγＲＩＩＡは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター活性化モチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ；ＩＴＡＭ）を含んでいる。阻害型レセプターＦｃγＲＩＩＢは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター阻害性モチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ；ＩＴＩＭ）を含んでいる（Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４（１９９７）を参照）。ＦｃＲｓに関しては、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌ等，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２５−３４（１９９４）；及びｄｅ Ｈａａｓ等，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１（１９９５）に概説されている。将来的に同定されるものも含む他のＦｃＲｓはここでの「ＦｃＲ」という言葉によって包含される。また、該用語には、母性ＩｇＧの胎児への移送を担い（Ｇｕｙｅｒ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））、免疫グロブリンのホメオスタシスを調節する新生児性レセプターＦｃＲｎも含まれる。

「ヒトエフェクター細胞」は、一又は複数のＦｃＲを発現する白血球であり、エフェクター機能を果たす。好ましくは、細胞は少なくともＦＣγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を果たす。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞及び好中球を含み；ＰＢＭＣ類及びＮＫ細胞が好まれる。エフェクター細胞は、天然源、例えば血液から単離することができる。

「補体依存性細胞障害」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解することを意味する。古典的補体経路の活性化は、その同族抗原に結合する（適切なサブクラスの）抗体に対する補体系（Ｃ１ｑ）の第一の成分の結合によって開始される。補体活性を評価するために、ＣＤＣアッセイが、例えばＧａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）に記載されるように実施することができる。

「治療的有効量」なる用語は、対象の疾患又は疾病を治療するための抗体、抗体断片または誘導体の量を指す。腫瘍（例えば癌性腫瘍）の場合は、治療的有効量の抗体ないし抗体断片（例えば多選択性抗体ないし抗体断片）は、癌細胞の数を減少させる、腫瘍の大きさを小さくする、癌細胞の周辺器官への浸潤を阻害する（すなわち、ある程度に遅く、好ましくは止める）、腫瘍の転移を阻害する（すなわち、ある程度遅く、好ましくは止める）、腫瘍の成長をある程度阻害する、及び／又は疾患に関連する一又は複数の症状をある程度和らげうる。抗体ないし抗体断片が、成長を妨げ及び／又は現存の癌細胞を死滅させる範囲において、それは細胞分裂停止性及び／又は細胞障害性である。癌治療に対しては、インビボにおける効力は、例えば生存期間、病状の進行時間（ＴＴＰ）、応答速度（ＲＲ）、応答期間、及び／又は生活の質の測定により測定される。

「低減する又は阻害する」とは、概して好ましくは２０％以上、より好ましくは５０％以上、最も好ましくは７５％、８５％、９０％、９５％又はそれ以上の減少を引き起こす能力を指す。低減する又は阻害するとは、治療する疾患の症状、転移の存在又は大きさ、原発腫瘍のサイズ、又は血管形成性疾患の血管の大きさ又は数を指しうる。

用語「癌」及び「癌性」は、無秩序な細胞成長／細胞増殖を典型的に特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を言う。良性及び悪性の癌は、この定義に含まれる。癌の例には、これらに限定するものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病が含まれる。このような癌のより具体的な例には、扁平細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞性癌、胃腸癌を含む胃（ｇａｓｔｒｉｃ及びｓｔｏｍａｃｈ）癌、膵癌、神経膠芽腫、膠腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝腫瘍、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌（例えば、腎臓細胞癌腫）、肝癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、肛門部の癌腫、陰茎癌腫、メラノーマ、及び様々な種類の頭頸部癌が含まれる。「初期段階の癌」は、浸潤性でも転移性でもなく、又はステージ０、Ｉ又はＩＩの癌として分類される癌を意味する。「前癌性」なる用語は、典型的に癌に進行する又は癌に発達する症状ないし成長を指す。「非転移性」とは、良性である癌、又は原発部位に止まり、リンパ管や血管系ないしは原発部位以外の組織に浸透しない癌を意味する。一般的に、非転移性癌は、ステージ０、Ｉ又はＩＩの癌、場合によってステージＩＩＩの癌のいずれかの癌である。

本明細書において「アレルギー性又は炎症性の疾患」は、個体の免疫系の過剰活性化から生じる疾患又は疾病である。例示的なアレルギー性又は炎症性の疾患には、喘息、乾癬、関節リウマチ、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、全身狼瘡、エリテマトーデス、湿疹、臓器移植、年齢性黄斑変性、クローン病、潰瘍性大腸炎、好酸性食道炎および炎症に関連する自己免疫性疾患が含まれるが、これに限定されない。

本明細書中の「自己免疫疾患」は、個体の自己組織又は同時分離又はその徴候又は結果として生じるその症状に対する及びそれらから生じる疾患又は症状である。自己免疫疾患又は症状の例として、限定するものではないが、関節炎（関節リウマチ（例えば急性の関節炎、慢性の関節リウマチ、痛風性関節炎、急性の痛風性関節炎、慢性炎症性関節炎、変形性関節症、感染性関節炎、ライム関節炎、増殖性関節炎、乾癬の関節炎、椎骨関節炎及び若年性発症関節リウマチ、骨関節炎、関節炎慢性化、関節炎変形、関節炎慢性原発、反応性関節炎、及び強直性脊椎炎）、炎症性過剰増殖性皮膚病、乾癬、例えばプラーク乾癬、滴状乾癬、膿疱性乾癬及び爪乾癬）、皮膚炎、例として接触皮膚炎、慢性接触皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、ヘルペス状の皮膚炎、貨幣状皮膚炎、脂漏性皮膚炎、非特異的皮膚炎、一次刺激物接触皮膚炎及び過敏性皮膚炎、Ｘ連鎖性過剰ＩｇＭ症候群、蕁麻疹、例えば慢性アレルギー性蕁麻疹及び慢性特発性蕁麻疹、例として慢性自己免疫蕁麻疹、多発性筋炎／皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、中毒性上皮性表皮壊死症、強皮症（全身強皮症を含む）、硬化症、例えば全身性硬化症、多発性硬化症（ＭＳ）、例えば脊椎−眼（ｓｐｉｎｏ−ｏｐｔｉｃａｌ）ＭＳ）、一次進行性ＭＳ（ＰＰＭＳ）及び再発性寛解ＭＳ（ＲＲＭＳ）、進行性全身性硬化症、アテローム性動脈硬化、動脈硬化症、硬化症汎発、失調性硬化症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（例えばクローン病、自己免疫性胃腸疾患、大腸炎、例えば潰瘍性大腸炎、大腸性潰瘍、微細な大腸炎、膠原性大腸炎、大腸ポリープ、壊死性全腸炎及び経壁の大腸炎、及び自己免疫炎症性腸疾患）、膿皮症壊疽、結節性紅斑、原発性硬化性胆管炎、上強膜炎、呼吸窮迫症候群、例として成人性又は急性の呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、髄膜炎、葡萄膜の全部又は一部の炎症、虹彩炎、脈絡膜炎、自己免疫血液疾患、リウマチ様脊椎炎、リウマチ様関節滑膜炎、突発性聴力障害、ＩｇＥ媒介性疾患、例えばアナフィラキシー及びアレルギー性鼻炎及びアトピー性鼻炎、脳炎、例えばラスマッセンの脳炎及び辺縁及び／又は脳幹脳炎、ブドウ膜炎、例として、前部ブドウ膜炎、急性前ブドウ膜炎、肉芽腫ブドウ膜炎、非顆粒性ブドウ膜炎、水晶体抗原性ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎又は自己免疫ブドウ膜炎、ネフローゼ症候群を有する又は有さない糸球体腎炎（ＧＮ）、例として、慢性又は急性の糸球体腎炎、例として原発性ＧＮ、免疫性ＧＮ、膜性ＧＮ（膜性ネフロパシ）、特発性膜性ＧＮ又は特発性膜性ネフロパシ、膜又は膜性増殖性ＧＮ（ＭＰＧＮ）（タイプＩ及びタイプＩＩを含む）、急速進行性ＧＮ、アレルギー性症状、アレルギー性反応、湿疹、例としてアレルギー性又はアトピー性湿疹、喘息、例えば喘息気管支炎、気管支喘息及び自己免疫喘息、Ｔ細胞の浸潤を伴う症状及び慢性炎症反応、慢性肺炎症性疾患、自己免疫心筋炎、白血球粘着力欠損、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）又は全身性ループスエリテマトーデス、例えば皮膚ＳＬＥ、亜急性の皮膚ＳＬＥ、新生児期ループス症候群（ＮＬＥ）、紅班性狼瘡汎発、ループス（例としてループス腎炎、ループス脳炎、小児ループス、非腎性ループス、腎外ループス、円板状ループス、脱毛症ループス）、若年性開始型（Ｉ型）真正糖尿病、例として小児インシュリン依存性真正糖尿病（ＩＤＤＭ）、成人発症型真正糖尿病（ＩＩ型糖尿病）、自己免疫性糖尿病、特発性の尿崩症、サイトカイン及びＴリンパ球によって媒介される急性及び遅発性過敏症と関係する免疫応答、結核、サルコイドーシス、肉芽腫症、例としてリンパ腫肉芽腫症、ヴェゲナーの肉芽腫症、無顆粒球症、脈管炎、例として血管炎、大血管性血管炎（例えば大脈管脈管炎（リウマチ性多発性筋痛及び巨細胞（高安）動脈炎を含む）、中脈管脈管炎（川崎病及び結節性多発動脈炎を含む）、微小多発動脈炎、ＣＮＳ脈管炎、壊死性血管炎、皮膚性血管炎又は過敏性血管炎、全身性壊死性血管炎、及びＡＮＣＡ関連の脈管炎、例としてチャーグ−ストラウス脈管炎又は症候群（ＣＳＳ））、側頭動脈炎、無形成性貧血、自己免疫無形成性貧血、クームズ陽性貧血症、ダイアモンドブラックファン貧血症、溶血性貧血又は免疫溶血性貧血、例として自己免疫溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、悪性貧血（貧血症悪性熱）、アジソン病、純粋な赤血球貧血症又は形成不全（ＰＲＣＡ）、第ＶＩＩＩ因子欠損症、血友病Ａ、自己免疫好中球減少症、汎血球減少症、白血球減少症、白血球血管外遊出を伴う疾患、ＣＮＳ炎症性疾患、多器官損傷症候群、例えば敗血症、外傷又は出血の二次症状、抗原−抗体複合体関連疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット又はベーチェット病、カールスマン症候群、グッドパスチャー症候群、レイノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンスジョンソン症候群、類天疱瘡、例えば水疱性類天ぽうそう及び類天疱瘡皮膚、天疱瘡（尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、ペンフィグス粘液膜類天疱瘡及び天疱瘡エリテマトーデスを含む）、自己免疫多腺性内分泌障害、ライター病又は症候群、免疫複合体腎炎、抗体媒介性腎炎、視神経脊髄炎、多発性神経炎、慢性神経障害、例えばＩｇＭ多発性神経炎又はＩｇＭ媒介性神経障害、血小板減少（例えば心筋梗塞患者によるもの）、例えば血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、及び自己免疫性又は免疫媒介性血小板減少、例えば慢性及び急性のＩＴＰを含む特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、自己免疫性精巣炎及び卵巣炎を含む精巣及び卵巣の自己免疫性疾患、一次甲状腺機能低下症、副甲状腺機能低下症、自己免疫内分泌性疾患、例えば甲状腺炎、例えば自己免疫性甲状腺炎、橋本病、慢性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）又は亜急性の甲状腺炎、自己免疫甲状腺性疾患、特発性甲状腺機能低下症、グレーブ病、自己免疫多腺性症候群、例として多腺性症候群（又は、多腺性内分泌障害症候群）、腫瘍随伴症候群、例として神経系新生物関連症候群、例えばランバート−イートン筋無力症症候群又はイートン―ランバート症候群、スティッフマン又はスティッフマン症候群、脳脊髄炎、例として、アレルギー性脳脊髄炎又は脳脊髄炎性アレルギー及び実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、重症筋無力症、例えば胸腺腫関連の重症筋無力症、小脳性退化、神経ミオトニ、眼球クローヌス又は眼球クローヌス筋硬直症候群（ＯＭＳ）及び感覚系神経障害、多病巣性運動神経障害、シーハン症候群、自己免疫肝炎、慢性肝炎、類狼瘡肝炎、巨細胞肝炎、慢性活動性肝炎又は自己免疫慢性活動性肝炎、リンパ系間隙間質性肺炎（ＬＩＰ）、閉塞性細気管支炎（非移植）対ＮＳＩＰ、ギラン‐バレー症候群、ベルガー病（ＩｇＡネフロパシ）、特発性ＩｇＡネフロパシ、線状ＩｇＡ皮膚病、原発性胆管萎縮症、肺線維症、自己免疫腸疾患症候群、セリアック病、コエリアック病、脂肪便症（グルテン腸疾患）、抵抗性スプルー、特発性スプルー、クリオグロブリン血症、アミロトロフィック側索硬化症（ＡＬＳ；筋萎縮性側索硬化症（Ｌｏｕ Ｇｅｈｒｉｇ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ））、冠状動脈疾患、自己免疫性耳疾患、例として、自己免疫内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫聴力障害、眼球クローヌス筋硬直徴候（ＯＭＳ）、多発性軟骨炎、例として、抵抗性又は再発性多発性軟骨炎、肺胞状蛋白症、アミロイドーシス、強膜炎、非癌性リンパ球増多症、一次リンパ球増多症、これにはモノクローナルＢ細胞リンパ球増多症（例えば良性モノクローナル免疫グロブリン症及び未同定の有意なモノクローナル免疫グロブリン血症（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｇａｍｍｏｐａｔｈｙ ｏｆ ｕｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ）、ＭＧＵＳ）が含まれる、末梢性神経障害、腫瘍随伴症候群、チャネル病、例として、癲癇、片頭痛、不整脈、筋疾患、難聴、盲目、周期性麻痺及びＣＮＳのチャネル病、自閉症、炎症性ミオパシ、局所性分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、内分泌性眼障害、ブドウ膜網膜炎、脈絡網膜炎、自己免疫性肝臓病、線維症、多内分泌性不全、シュミット症候群、副腎炎、胃萎縮、初老期痴呆、脱髄性疾患、例として自己免疫脱髄性病、糖尿病性ネフロパシ、ドレスラー症候群、円形脱毛症、ＣＲＥＳＴ症候群（石灰沈着、レイノー現象、食道運動障害、強指症及び毛細管拡張症）、雌雄自己免疫性不妊性、混合性結合組織病、シャーガス病、リウマチ熱、再発性中絶、農夫肺、多形性紅斑、心切開術後症候群、クッシング症候群、愛鳥家肺、アレルギー性肉芽腫性脈管炎、良性リンパ球血管炎、アルポート症候群、肺胞炎、例えばアレルギー性肺胞炎及び繊維化肺胞炎、間隙肺疾患、輸血反応、ハンセン病、マラリア、リーシュマニア症、キパノソミアシス（ｋｙｐａｎｏｓｏｍｉａｓｉｓ）、住血吸虫症、蛔虫症、アスペルギルス症、サンプター症候群、カプラン症候群、デング熱、心内膜炎、心内膜心筋線維形成、広汎性間質性肺線維形成、間質性肺線維形成、特発性の肺線維形成、嚢胞性線維症、眼内炎、持久性隆起性紅斑、胎児赤芽球症、好酸性筋膜炎（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ ｆａｃｉｉｔｉｓ）、シャルマン症候群、フェルティー症候群、フィラリア（ｆｌａｒｉａｓｉｓ）、毛様体炎、例えば慢性毛様体炎、ヘテロ慢性毛様体炎、虹彩毛様体炎、又はＦｕｃｈの毛様体炎）、ヘーノホ−シェーンライン紫斑病、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染、エコーウィルス感染、心筋症、アルツハイマー病、パルボウィルス感染、風疹ウィルス感染、種痘後症候群、先天性風疹感染、エプスタインバーウイルス感染、耳下腺炎、エヴァンの症候群、自己免疫性腺機能不全、シドナム舞踏病、連鎖球菌感染後腎炎、閉塞性血栓性血管炎（ｔｈｒｏｍｂｏａｎｇｉｔｉｓ ｕｂｉｔｅｒａｎｓ）、甲状腺中毒症、脊髄癆、脈絡膜炎、巨細胞多発性筋痛、内分泌性眼障害、慢性過敏性肺炎、乾性角結膜炎、流行性角結膜炎、特発性腎臓症候群、微小変化ネフロパシ、良性家族性及び乏血−再灌流障害、網膜自己免疫、関節炎症、気管支炎、慢性閉塞性気道疾患、珪肺症、アフタ、アフタ性口内炎、動脈硬化症疾患、アスペルミオジェネース（ａｓｐｅｒｍｉｏｇｅｎｅｓｅ）、自己免疫性溶血、ベック病、クリオグロブリン血症、デュピュイトラン拘縮、水晶体過敏性眼内炎、腸炎アレルギー、結節性紅斑、ｌｅｐｒｏｓｕｍ、特発性顔麻痺、慢性疲労症候群、リウマチ性熱、ハンマンリッチ病、感覚器性（ｓｅｎｓｏｎｅｕｒａｌ）聴力障害、血色素尿症発作（ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎｕｒｉａ ｐａｒｏｘｙｓｍａｔｉｃａ）、性機能低下、回腸炎領域、白血球減少症、単核細胞増加症感染、横移動脊髄炎、一次特発性の粘液水腫、ネフローゼ、眼炎ｓｙｍｐｈａｔｉｃａ、精巣炎肉芽腫症、膵炎、多発性神経根炎急性、膿皮症壊疽、Ｑｕｅｒｖａｉｎ甲状腺炎、後天性脾臓萎縮、抗精子抗体による不妊性、非悪性胸腺腫、白斑、ＳＣＩＤ及びエプスタインバーウイルス関連疾患、後天性免疫不全症候群（エイズ）、寄生虫病、例えばＬｅｓｉｈｍａｎｉａ、毒性ショック症候群、食中毒、Ｔ細胞の浸潤を伴う症状、白血球−粘着力欠損、サイトカイン及びＴリンパ球に媒介される急性及び遅発性過敏症関連免疫応答、白血球血管外遊出を伴う疾患、多器官損傷症候群、抗原−抗体複合体媒介性疾患、抗糸球体基底膜疾患、アレルギー性神経炎、自己免疫多腺性内分泌障害、卵巣炎、原発性粘液水腫、自己免疫萎縮性胃炎、交感性眼炎、リウマチ性疾患、混合性結合組織病、ネフローゼ症候群、膵島炎、多内分泌性不全、末梢性神経障害、自己免疫多腺性症候群Ｉ型、成人発症型特発性副甲状腺機能低下症（ＡＯＩＨ）、完全脱毛症、拡張型心筋症、後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）、ヘモクロマトーシス、心筋炎、ネフローゼ症候群、原発性硬化性胆管炎、化膿性又は非化膿性副鼻腔炎、急性又は慢性副鼻腔炎、篩骨、正面、上顎骨又は蝶形骨副鼻腔炎、好酸球性関連疾患、例えば好酸球増加症、肺浸潤好酸球増加症、好酸球増加症−筋肉痛症候群、レフラー症候群、慢性好酸性肺炎、熱帯肺好酸球増加症、気管支肺炎アスペルギルス症、アスペルギローム又は好酸球性を含有する肉芽腫、アナフィラキシー、血清陰性脊椎関節炎疹、多内分泌性自己免疫性疾患、硬化性胆管炎、強膜、上強膜、慢性皮膚粘膜カンジ
ダ症、ブラットン症候群、乳児期の一過性低ガンマグロブリン血症、ウィスコット‐アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症候群、膠原病と関係する自己免疫疾患、リウマチ、神経病学的疾患、虚血性再灌流障害、血圧応答の減退、血管機能不全、ａｎｔｇｉｅｃｔａｓｉｓ、組織損傷、心血管乏血、痛覚過敏、脳虚血、及び脈管化を伴う疾患、アレルギー性過敏症疾患、糸球体腎炎、再灌流障害、心筋又は他の組織の再灌流損傷、急性炎症性成分を有する皮膚病、急性化膿性髄膜炎又は他の中枢神経系炎症性疾患、眼性及び眼窩の炎症性疾患、顆粒球輸血関連症候群、サイトカイン誘発性毒性、急性重症炎症、慢性難治性炎症、腎盂炎、肺線維症、糖尿病性網膜症、糖尿病性大動脈疾患、動脈内過形成、消化性潰瘍、弁膜炎、及び子宮内膜症などがある。

本明細書で用いられる「細胞障害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ^２１１、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８、Ｓｍ^１５３、Ｂｉ^２１２、Ｒａ^２２３、Ｐ^３２及びＬｕの放射性同位体）、化学治療薬、例としてメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロランブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤、酵素及びその断片、例えば核溶解性酵素、抗生物質、及び毒素、例えばその断片及び／又は変異体を含む小分子毒素又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素、そしてここに開示する種々の抗腫瘍剤、抗癌剤および化学療法剤を含むように意図されている。他の細胞障害性薬が本明細書に記載されている。殺腫瘍剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。

「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学物質である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標））のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、及びウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）のようなアジリジン類；アルトレートアミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド（ｔｒｉｅｔｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、トリエチレンチオホスホルアミド（ｔｒｉｅｔｈｉｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）及びトリメチローロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；デルタ−９−テトラヒドロカナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標）；βラパチョーネ；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトセシン（合成アナログトポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標）、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン（ｓｃｏｐｏｌｅｃｔｉｎ）及び９−アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナログを含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）；テニポシド；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；ドゥオカルマイシン（合成アナログ、ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エロイテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンギスタチン；クロランブシル、クロロナファジン（ｃｈｌｏｒｎａｐｈａｚｉｎｅ）、チョロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、トロフォスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン（ｃｈｌｏｒｏｚｏｔｏｃｉｎ）、フォテムスチン（ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａｓ）；抗生物質、例えばエネジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンωＩ１（例えばＡｇｎｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔｌ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ．３３：１８３−１８６（１９９４）参照）；ダイネマイシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）Ａを含むダイネマイシン；エスペラマイシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパクエネジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン類（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎｓ）、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣのようなマイトマイシン、マイコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、オリボマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎｓ）、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）；代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸アナログ、例えばデノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、メトトレキセート、プテロプテリン（ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）、トリメトレキセート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）；プリンアナログ、例えばフルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシチジン（ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）、６−アザウリジン（ａｚａｕｒｉｄｉｎｅ）、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、フロキシウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）；アンドロゲン類、例えばカルステロン（ｃａｌｕｓｔｅｒｏｎｅ）、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン（ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ）；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニッシャー（ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）、例えばフロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン（ａｍｓａｃｒｉｎｅ）；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン（ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）；ジアジコン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；エルフォルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ）；エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）；エトグルシド（ｅｔｏｇｌｕｃｉｄ）；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｍｉｎｅ）；メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）類、例えばメイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）及びアンサミトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎｅ）；ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）；ミトキサントロン；モピダモール（ｍｏｐｉｄａｍｏｌ）；ニトラクリン（ｎｉｔｒａｃｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；ラゾキサン（ｒａｚｏｘａｎｅ）；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム（ｓｐｉｒｏｇｅｒｍａｎｉｕｍ）；テニュアゾン酸（ｔｅｎｕａｚｏｎｉｃ ａｃｉｄ）；トリアジコン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類（特にＴ−２毒素、ベラクリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎｅ）Ａ及びアングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ））；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカーバジン；マンノムスチン（ｍａｎｎｏｍｕｓｔｉｎｅ）；ミトブロニトール；ミトラクトール（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）；ピポブロマン（ｐｉｐｏｂｒｏｍａｎ）；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド類、例えばＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）、ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭパクリタキセルのクレモフォー無添加アルブミン操作ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）、及びＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドキセタキセル（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；プラチナアナログ、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））；プラチナ；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトキサントロン；ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；オキサリプラチン；ロイコボビン（ｌｅｕｃｏｖｏｖｉｎ）；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロナート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸のようなレチノイド；カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標）；上述したもののいずれかの薬学的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体：並びに上記のうち２以上の組み合わせ、例えば、シクロフォスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニソロン併用療法の略称であるＣＨＯＰ、及び５−ＦＵ及びロイコボビン（ｌｅｕｃｏｖｏｖｉｎ）とオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮＴＭ）を組み合わせた治療法の略称であるＦＯＬＦＯＸが含まれる。

また、癌の成長を促進しうるホルモンの影響を調節、低減、阻止（ブロック）又は阻害するように作用し、たびたび全身性、又は全身治療の形態にある抗ホルモン剤もこの定義に含まれる。これらはホルモン類自体でもよい。例として、抗卵胞ホルモン類及び、選択的なエストロゲンレセプターモジュレータ類（ＳＥＲＭ）、例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェン）、ＥＶＩＳＴＡ（登録商標）ラロキシフェン、ドロロキシフェン（ｄｒｏｌｏｘｉｆｅｎｅ）、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン（ｔｒｉｏｘｉｆｅｎｅ）、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン及びＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）トレミフェン、抗プロゲステロン類、エストロゲンレセプター下方制御因子（ＥＲＤ）、卵巣を抑制するか又は一時停止させるように機能する薬剤、例えば、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト、例えば、ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）及びＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標）酢酸ロイプロリド、ゴセレリンアセテート、ブセレリンアセテート及びトリプトレリン（ｔｒｉｐｔｅｒｅｌｉｎ）、他の抗アンドロゲン類、例えばフルタミド、ニルタミド及びビカルタミド、及び、副腎のエストロゲン産生を制御する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害薬、例として、例えば４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）メゲストロールアセテート、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）エキセメスタン、ホルメスタン、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）レトロゾール及びＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）アナストロゾールなどがある。加えて、化学療法剤のこのような定義には、ビスホスホネート、例えばクロドロン酸（例えば、ＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）又はＯＳＴＡＣ（登録商標））、ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標）エチドロン酸、ＮＥ−５８０９５、ＺＯＭＥＴＡ（登録商標）ゾレドロン酸／ゾレドロネート、ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標）アレンドロネート、ＡＲＥＤＩＡ（登録商標）パミドロン酸、ＳＫＥＬＩＤ（登録商標）チルドロン酸又はＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標）、リセドロン酸、並びにトロキサチタビン（ｔｒｏｘａｃｉｔａｂｉｎｅ）（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常な細胞増殖に関係するシグナル伝達経路の遺伝子の発現を阻害するもの、例として、例えばＰＫＣ−α、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ及び上皮性成長因子レセプター（ＥＧＦ−Ｒ）、ワクチン、例えばＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチン及び遺伝子治療ワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン及びＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン、ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１インヒビター、ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ、ラパチニブジトシラート（ＥｒｂＢ−２及びＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼ小分子インヒビター、ＧＷ５７２０１６とも称される）、及び、上記の何れかの薬学的に受容可能な塩類、酸又は誘導体が含まれる。

本明細書で用いられる際の「増殖阻害剤」は、細胞の増殖をインビトロ又はインビボの何れかで阻害する化合物又は組成物を意味する。よって、増殖阻害剤は、Ｓ期でＨｉｐ発現細胞の割合を有意に減少させるものである。増殖阻害剤の例は、細胞周期の進行を（Ｓ期以外の位置で）阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス（例えばビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキサン類、及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。またＧ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、及びアラ−Ｃである。更なる情報は、Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ及びＩｓｒａｅｌ，編，Ｃｈａｐｔｅｒ１，表題「Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｏｎｃｏｇｅｎｅ，ａｎｄ ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｄｒｕｇｓ」，Ｍｕｒａｋａｍｉ等，（ＷＢ Ｓａｕｎｄｅｒｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９５）、特に１３頁に見出すことができる。タキサン類（パクリタキセル及びドセタキセル）は、共にイチイに由来する抗癌剤である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、ローン・プーラン ローラー）は、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、ブリストル−マイヤー スクウィブ）の半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリン二量体から微小管の集合を促進し、細胞の有糸分裂を阻害する結果となる脱重合を防ぐことによって微小管を安定化にする。

本明細書で用いる「抗癌療法」は、被検体の癌を低減するか又は阻害する処置を指す。抗癌療法の例には、細胞障害性放射線療法、並びに細胞障害性剤、化学療法剤、増殖阻害性剤、癌ワクチン、脈管形成インヒビター、プロドラッグ、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、副腎皮質ステロイド、免疫抑制因子、制吐剤、抗体ないし抗体断片又は鎮痛剤の治療上の有効量の被検体への投与が含まれる。

この出願で用いられる用語「プロドラッグ」なる用語は、親薬剤と比較して腫瘍細胞に対する細胞障害性が低く、酵素的に活性化又はより活性な親形態に変換されうる薬学的に活性な物質の前駆体又は誘導体の形態を指す。例として、Ｗｉｌｍａｎ，”Ｐｒｏｄｒｕｇｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，１４，頁３７５−３８２，６１５ｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｂｅｌｆａｓｔ（１９８６）およびＳｔｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，”Ｐｒｏｄｒｕｇｓ： Ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，” Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄ．），頁２４７−２６７，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（１９８５）を参照のこと。プロドラッグには、限定するものではないが、ホスファート含有プロドラッグ、チオホスファート含有プロドラッグ、スルファート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、任意に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ、又は任意に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、より活性のある細胞毒のない薬剤に転換可能な５−フルオロシトシン及び他の５−フルオロウリジンプロドラッグを含む。限定はしないが、本発明で使用されるプロドラッグ形態に誘導体化可能な細胞障害性剤の例には、前記の化学療法剤が含まれる。

「サイトカイン」なる用語は、一つの細胞集団から放出され、他の細胞に細胞間メディエータとして作用するタンパク質の一般用語である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインに含まれるのは、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インシュリン；プロインシュリン；レラキシン；プロレラキシン；糖タンパク質ホルモン、例えば濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体化ホルモン（ＬＨ）；上皮性増殖因子（ＥＧＦ）；肝臓成長因子；線維芽成長因子（ＦＧＦ）；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子−α及び−β；ミューラー阻害因子；マウス生殖腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−β等の神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−β等のトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦｓ）；インシュリン様成長因子−Ｉ及びＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘発因子；インターフェロン−α、−β、及び−γ等のインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）、例えばマクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；及び顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬｓ）、例えばＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８；腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ−α及びＴＮＦ−β；及びＬＩＦ及びキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子である。本明細書で用いられる際、用語サイトカインには、天然供給源から、又は組換え細胞培養からのタンパク質、及び天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物が含まれる。

「サイトカインアンタゴニスト」とは、少なくとも一のサイトカインの生物学的活性を一部又は完全に遮断、阻害、又は中和する分子を意味する。例えば、サイトカインアンタゴニストは、サイトカイン発現および／または分泌を阻害することによって、または、サイトカイン又はサイトカインレセプターに結合することによってサイトカイン活性を阻害してよい。サイトカインアンタゴニストには、抗体、合成又は天然の配列ペプチド、イムノアドヘシン、及びサイトカイン又はサイトカインレセプターに結合する小分子アンタゴニストが含まれる。サイトカインアンタゴニストは場合によって、細胞障害性剤とコンジュゲートされるか又は融合される。例示的なＴＮＦアンタゴニストは、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標））、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））およびアダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ^ＴＭ）である。

本明細書中で用いる「免疫抑制剤」なる用語は、治療される被検体の免疫系を抑制するか又は隠すために作用する物質を指す。これには、サイトカイン産生を抑制する物質、自己抗原発現を下方制御は又は抑制する物質、又は、ＭＨＣ抗原をマスキングする物質が含まれる。免疫抑制剤の例には、２−アミノ−６−アリル−５−置換ピリミジン（米国特許第４６６５０７７号を参照）；ミコフェノール酸モフェチル、例えばＣＥＬＬＣＥＰＴ（登録商標）；アザチオプリン（ＩＭＵＲＡＮ（登録商標）、ＡＺＡＳＡＮ（登録商標）／６‐メルカプトプリン；ブロモクリプチン；ダナゾール；ダプソン；グルタールアルデヒド（米国特許第４１２０６４９号に記載のように、ＭＨＣ抗原をマスキングするもの）；ＭＨＣ抗原およびＭＨＣ断片のための抗イディオタイプ抗体；サイクロスポリンＡ；副腎皮質ステロイドおよび糖質コルチコイドといったステロイド、例えばプレドニゾン、プレドニソロン、例えばＰＥＤＩＡＰＲＥＤ（登録商標）（プレドニソロンリン酸ナトリウム）又はＯＲＡＰＲＥＤ（登録商標）（プレドニソロンリン酸ナトリウム経口溶液）、メチルプレドニゾロンおよびデキサメサゾン；メトトレキセート（経口又は皮下）（ＲＨＥＵＭＡＴＲＥＸ（登録商標）、ＴＲＥＸＡＬＬＴＭ）；ヒドロキシクロロキン／クロロキン；スルファサラジン；レフルノミド；サイトカイン又はサイトカインレセプターアンタゴニスト、例として抗インターフェロン−γ、−β、又は−α抗体、抗腫瘍壊死因子−α抗体（インフリキシマブ又はアダリムマブ）、抗ＴＮＦαイムノアドヘシン（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）、エタネルセプト）、抗腫瘍壊死因子−β抗体、抗インターロイキン２抗体、及び抗ＩＬ−２レセプター抗体；抗ＣＤ１１ａおよび抗ＣＤ１８抗体を含む抗ＬＦＡ−１抗体；抗Ｌ３Ｔ４抗体；異種性抗リンパ球グロブリン；ポリクローナル又はパンＴ抗体、又はモノクローナル抗ＣＤ３又は抗ＣＤ４／ＣＤ４ａ抗体；ＬＦＡ−３結合ドメインを含む可溶性ペプチド（１９９０年７月２６日公開の国際公開１９９０／０８１８７）；ストレプトキナーゼ；ＴＧＦ−β；ストレプトドルナーゼ；宿主のＲＮＡ又はＤＮＡ；ＦＫ５０６；ＲＳ−６１４４３；デオキシスペルグアリン；ラパマイシン；Ｔ細胞レセプター（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５１１４７２１号）；Ｔ細胞レセプター断片（Ｏｆｆｎｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：４３０−４３２（１９９１）；国際公開１９９０／１１２９４；Ｉａｎｅｗａｙ，Ｎａｔｕｒｅ，３４１：４８２（１９８９）；及び国際公開１９９１／０１１３３）；Ｔ１０Ｂ９といったＴ細胞レセプター抗体（欧州特許第３４０１０９号）；シクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標））；ダプソン；ペニシラミン（ＣＵＰＲＩＭＩＮＥ（登録商標））；血漿交換；または、静脈免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）が含まれる。これらは単独で用いられても、互いに、特にステロイド及び他の免疫抑制剤との組合せ、又はこの組合せの後にステロイドの必要性を低減するために維持用量の非ステロイド剤を組み合わせて用いられてもよい。

「鎮痛剤」は、被検体の痛みを阻害するかまたは抑制するために作用する薬剤を指す。例示的な鎮痛剤には、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、例えばイブプロフェン（ＭＯＴＲＩＮ（登録商標））、ナプロキセン（ＮＡＰＲＯＳＹＮ（登録商標））、アセチルサリチル酸、インドメタシン、スリンダクおよびトルメチン、これらの塩類及び誘導体、並びに、生じうる鋭い痛みを低減するために用いられる様々な他の医薬、例えば抗痙攣剤（ガバペンチン、ｐｈｅｎｙｌｏｉｎ、カルバマゼピン）又は三環系抗鬱薬が含まれる。具体例には、アセトアミノフェン、アスピリン、アミトリプチリン（ＥＬＡＶＩＬ（登録商標））、カルバマゼピン（ＴＥＧＲＥＴＯＬ（登録商標））、ｐｈｅｎｙｌｔｏｉｎ（ＤＩＬＡＮＴＩＮ（登録商標））、ガバペンチン（ＮＥＵＲＯＮＴＩＮ（登録商標））、（Ｅ）−Ｎ−バニリル−８−メチル−６−ノネアミド（ＣＡＰＳＡＩＣＩＮ（登録商標））又は神経遮断薬が含まれる。

「副腎皮質ステロイド」は、天然に生じる副腎皮質ステロイドの効果を模倣するかあるいは増大するステロイドの一般的な化学構造を有するいくつかの合成又は天然に生じる物質の何れか一つを指す。合成副腎皮質ステロイドの例として、プレドニゾン、プレドニゾロン（メチルプレドニゾロンを含む）、デキサメサゾン、トリアムシノロン及びベタメサゾンが含まれる。

本明細書で用いる「癌ワクチン」は、癌に対して被検体において免疫応答を刺激する組成物である。癌ワクチンは典型的に、抗原に対して免疫応答を更に刺激してブーストする他の構成成分（例えばアジュバント）とともに、被検体に対して自己由来性（自己から）又は同種異系性（他から）である癌関連の物質又は細胞（抗原）の供与源からなる。癌ワクチンにより望ましくは、被検体の免疫系が刺激され、１又はいくつかの特異的抗原に対して抗体が産生され、および／またはそれらの抗原を有する癌細胞を攻撃するためにキラーＴ細胞が産生される。

本明細書で用いる「細胞障害性放射線療法」は、細胞の機能を阻害又は予防し、および／または細胞の破壊を引き起こす放射線療法を指す。放射線療法には、例えば、外的光線照射又は抗体などの放射性標識した薬剤による療法が含まれうる。この用語は、放射性同位体（例えばＡｔ^２１１、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８、Ｓｍ^１５３、Ｂｉ^２１２、Ｒａ^２２３、Ｐ^３２およびＬｕの放射性同位体）の使用を含むことを目的とする。

「被検体」は、脊椎動物、例として哺乳動物、例えばヒトである。哺乳動物には、家畜（例えばウシ）、スポーツ用動物、愛玩動物（例えばネコ、イヌおよびウマ）、霊長類、マウスおよびラットが含まれるが、これらに限定されない。

文脈により特に指示がある場合を除き、用語「第一の」ポリペプチド及び「第二の」ポリペプチド、及びその変形は単に汎用的な識別子であり、本発明の抗体の特異的又は特定のポリペプチド又は成分を識別していると取られるべきではない。

実施例において示す市販の試薬は、特に明記しない限り製造業者の指示に従って使用した。以下の実施例及び明細書全体にわたってＡＴＣＣ受託番号によって識別される細胞の供与源は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡである。特に明記しない限り、本発明は、本明細書中、及び以下のテキスト：上掲のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）；Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．：Ｎ．Ｙ．，１９９０）；Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８８）；Ｇａｉｔ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ：Ｏｘｆｏｒｄ，１９８４）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，１９８７；Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９１に記載されるものなど、組換えＤＮＡ技術の標準的な手順を用いる。

本明細書及び特許請求の範囲全体を通して、「含む」なる語彙、又は「含む」ないし「含んでいる」の変形型は、定めた完全体又は完全体の群を包含するもので、任意の他の完全体又は完全体の群を除外するものではない。

ＩＩ．ヘテロ多量体タンパク質の構築
一般的に、本明細書に記載されるヘテロ多量体タンパク質は、抗体のＦｃ領域の大部分を含む。

ヘテロ多量体化ドメイン
ヘテロ多量体タンパク質は、ヘテロ多量体化ドメインを含む。ヘテロ二量体分子の実質的に均一な集団を生成するため、ヘテロ二量体化ドメインは、ホモ二量体よりもヘテロ二量体を形成について強い優先度を持っている必要がある。本明細書に例示されるヘテロ多量体タンパク質は、ヘテロ二量体化を容易にするためノブ・イントゥー・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）技術を用いるが、当業者は、本発明において有用な他のヘテロ二量体化ドメインを認識するであろう。

ノブ・イントゥー・ホール
多重特異性抗体を産生する方法としてのノブ・イントゥー・ホールの使用は当技術分野でよく知られている。Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈに割り当てられ、１９９８年３月２４日に付与された米国特許第５７３１１６８号、Ａｍｇｅｎに割り当てられ、２００９年７月１６日に付与されたＰＣＴ公開国際公開第２００９０８９００４号、及びＮｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓに割り当てられ、２００９年７月１６日に公開された米国特許出願公開第２００９０１８２１２７号を参照。また、Ｍａｒｖｉｎ ａｎｄ Ｚｈｕ，Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｃｉａ（２００５）２６（６）：６４９−６５８及びＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ（２００５） Ａｃｔａ Ｐｈａｒａｃｏｌ．Ｓｉｎ．，２６：１−９を参照。簡潔な議論がここに提供される。

「突起」とは、ヘテロ多量体を安定させ、それによって、例えばホモ多量体形成よりもヘテロ多量体形成を支持するように、第一のポリペプチドの界面から突き出し、従って隣接界面（即ち、第二のポリペプチドの界面）の代償空洞内に配置可能である少なくとも一つのアミノ酸側鎖を指す。突起は、元の界面に存在し得るか又は（例えば界面をコードする核酸を変更することで）合成的に導入することができる。通常は、第１のポリペプチドの界面をコードする核酸は、突起をコード化するために変更される。これを達成するために、第一のポリペプチドの界面において少なくとも一の「元の」アミノ酸残基をコードする核酸が、元のアミノ酸残基より大きい側鎖体積を有する少なくとも一つの「移入」アミノ酸残基をコードする核酸に置換される。複数の元の残基及びそれに対応する移入残基が存在し得ることが理解されるであろう。置換される元の残基の数の上限は、第一のポリペプチドの界面における残基の総数である。種々のアミノ酸残基の側鎖の体積を以下の表に示す。

突起の形成に好適な輸入残基は、一般に、天然に生じるアミノ酸残基であり、好ましくはアルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）及びトリプトファン（Ｗ）から選択される。最も好ましいのは、トリプトファンとチロシンである。一実施態様において、突起の形成のための元の残基は、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、セリン、トレオニン又はバリンなど小さな側鎖の体積を有する。

「空洞（ｃａｖｉｔｙ）」は、第二のポリペプチドの界面から窪み、従って、第一のポリペプチドの隣接界面上の対応する突起を収容する少なくとも一つのアミノ酸側鎖を指す。空洞は、元の界面に存在し得るか又は（例えば界面をコードする核酸を変更することで）合成的に導入することができる。通常は、第二のポリペプチドの界面をコードする核酸が、空洞をコード化するために変更される。これを達成するために、第二のポリペプチドの界面において少なくとも一の「元の」アミノ酸残基をコードする核酸が、元のアミノ酸残基より小さい側鎖体積を有する少なくとも一つの「移入」アミノ酸残基をコードするＤＮＡに置換される。複数の元の残基及びそれに対応する移入残基が存在し得ることが理解されるであろう。置換される元の残基の数の上限は、第二のポリペプチドの界面における残基の総数である。種々のアミノ酸残基の側鎖の体積を上の表２に示す。空洞の形成に好適な輸入残基は、一般に、天然に生じるアミノ酸残基であり、好ましくはアラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）及びバリン（Ｖ）から選択される。最も好ましいのは、セリン、アラニン又はスレオニンである。一実施態様において、空洞の形成のための元の残基は、チロシン、アルギニン、フェニルアラニン又はトリプトファンなど大きな側鎖の体積を有する。

「元の」のアミノ酸残基は、元の残基より小さいか又は大きい側鎖の体積を持つことができる「移入」残基で置換されているものである。移入アミノ酸残基は、天然に生じるアミノ基残基か又は非天然型アミノ酸残基であり得るが、好ましくは前者である。「天然に生じる」アミノ基残基は、遺伝子コードによりコード化され、上記の表２に記載されているものである。「非天然型」アミノ酸残基とは、遺伝コードによってコード化されていないが、ポリペプチド鎖中で隣接するアミノ酸残基に共有結合することができる残基を意味する。非天然型アミノ酸残基の例としては、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン、及び他のアミノ酸残基アナログ、例えば、Ｅｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２０２：３０１−３３６（１９９１）に記載されるものなどである。非天然型アミノ酸残基を生成するために、Ｎｏｒｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１８２（１９８９）及び上掲のＥｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，の手順を使用することができる。簡潔には、これは非天然型アミノ酸残基でサプレッサーｔＲＮＡを化学的に活性化し、続くインビトロでのＲＮＡの転写及び翻訳を含む。本発明の方法は、少なくとも一つの元のアミノ酸残基の置換を含むが、複数の元の残基を置換することができる。通常、第一又は第二のポリペプチドの界面における全残基だけが、置換される元のアミノ酸残基を含む。典型的には、置換される元の残基は「埋没」されている。「埋没」とは、残基が溶剤に本質的に接近不能であることを意味する。一般的に、移入残基は、酸化の可能性又はジスルフィド結合の誤対合を防止するために、システインではない。

突起は、空洞内に「配置することが可能」であり、このことは、第一ポリペプチド及び第二ポリペプチドのそれぞれの界面上の突起と空洞の空間的位置、及びその突起と空洞の大きさが、界面での第一ポリペプチド及び第二ポリペプチドの正常な会合を著しくを乱すことなく、その突起が空洞中に配置され得るようなものであることを意味している。Ｔｙｒ、Ｐｈｅ及びＴｒｐなどの突起は通常、界面の軸から垂直に延びておらず、好適なコンフォメーションをとっていないので、対応する空洞と突起の位置合わせは、Ｘ線結晶構造解析又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）により得られたものなど三次元構造に基づく突起／空洞の対のモデリングに依存している。このことは、当該技術分野において広く受け入れられている技術を用いて達成することができる。

「元の又は鋳型核酸」とは、突起又は空洞をコードするため、「改変」されうる（すなわち、遺伝子操作され又は変異され得る）目的のポリペプチドをコードする核酸を意味する。元の又は出発核酸は、天然に存在する核酸であってもよいし、又は事前の改変が施されている核酸（ヒト化抗体断片など）を含んでもよい。核酸を「改変する」とは、目的のアミノ基残基をコード化する少なくとも一のコドンの挿入、欠失、又は置換により元の核酸が変異されることを意味する。通常は、元の残基をコードするコドンは、移入残基をコード化するコドンに置換される。この方法により遺伝子的にＤＮＡを修飾するための技法がＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍ．Ｊ． ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｅｄ．，（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ．（１９９１）に概説されており、例えば、部位特異的変異誘発、カセット変異導入、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）変異を含む。元の／鋳型核酸を変異させることにより、元の／鋳型核酸によってコードされた元の／鋳型ポリペプチドが、従ってそれに応じて改変される。

突起又は空洞は、合成手段によって、例えば、インビトロペプチド合成、ペプチドの酵素的又は化学的カップリング又はこれらの技術のある組合わせによる、先に説明した非天然型アミノ基残基を導入するための技術によって、第一又は第二ポリペプチドの界面に「導入」することができる。従って、「導入」されている突起又は空洞は、「非天然型」又は「非天然」であり、このことは、それが自然の中で、または元のポリペプチドにおいて存在しないことを意味する（例えば、ヒト化モノクローナル抗体）。

一般的に、突起を形成するための移入アミノ酸残基は、比較的少数の「回転異性体」を持っている（例えば、約３から６）。「回転異性体」はエネルギー的に好都合なアミノ酸側鎖のコンフォメーションである。様々なアミノ基残基の回転異性体の数は、Ｐｏｎｄｅｒｓ ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９３：７７５−７９１（１９８７）に総説されている。

他の変異
本明細書に記載されるＦｃポリペプチドは、野生型Ｆｃポリペプチド又はノブ・イントゥー・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）Ｆｃポリペプチドと比較した場合に、誤対合の減少、頭尾形成の減少、又は全収率の増大を与える変異を有し得る。Ｆｃ変異体は、少なくとも一つの重鎖上で、Ｓ２３９，Ｖ２４０，Ｆ２４１，Ｆ２４３，Ｖ２６４，Ｒ３０１，Ｋ３３４，Ｙ３４９，Ｔ３５０，Ｌ３６８，Ｋ３７０，Ｎ３８９，Ｙ３９１，Ｋ３９２，Ｐ３９５，Ｐ３９６，Ｄ３９９，Ｆ４０５，Ｙ４０７から選択される残基での、野生型Ｆｃポリペプチドに存在するものと異なるアミノ酸との、少なくとも一、二、三、四、五、六、七、八、九又は１０の置換を含む。エフェクター機能を変えることが望まれる場合があり、変異の幾つかはエフェクター機能を亢進又は減少させ得ることが熟慮されている。変異は、抗体の別の機能的特徴、例えばエフェクター機能を有意には変えないのが望まれる。

ＩＩＩ．ベクター、宿主細胞及び組換え法
本発明のヘテロ多量体タンパク質（例えば抗体）の組換え生産のために、それをコードする核酸が単離され、更なるクローニング（ＤＮＡの増幅）用又は発現用に、複製可能なベクターへ挿入される。抗体をコードする核酸は容易に単離され、従来の手順を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定することができる。多くのベクターが利用可能である。ベクタ−の選択は、使用される宿主細胞に一部は依存する。一般には、好ましい宿主細胞は、原核生物または真核生物（一般には、哺乳動物であるが、菌類（例えば、酵母）、昆虫、植物、その他の多細胞生物からの有核細胞も含む）起源のどちらかのものである。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを含む、任意のアイソタイプの定常領域が、この目的用に使用することができ、そのような定常領域は任意のヒト又は動物種から得ることができると理解されるであろう。

ａ．原核生物の宿主細胞を使用してヘテロ多量体タンパク質を生成する
ｉ．ベクターの構築
本発明のヘテロ多量体タンパク質（例えば抗体）のポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチド配列を標準的な組換え技術を使用して得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列が、例えばハイブリドーマ細胞などの抗体産生細胞から単離され、配列決定され得る。あるいは、ポリヌクレオチドをヌクレオチド合成装置又はＰＣＲ技術を使用して合成することができる。一たび得られると、ポリペプチドをコードする配列を、原核生物の宿主において異種ポリヌクレオチドを複製し発現することができる組換えベクターに挿入される。入手可能で当該技術分野で公知のベクターが本発明の目的用に使用することができる。適切なベクターの選別はベクターに挿入される核酸の大きさ及びそのベクターで形質転換される特定の宿主細胞に主に依存するであろう。各ベクターは、その機能（異種ポリヌクレオチドの増幅又は発現、或いは両方）、及びそれが属する特定の宿主細胞との適合性に依存して、様々な成分を含有する。ベクターの成分は、限定されないが、一般的に、複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種核酸挿入及び転写終結配列を含む。

一般に、宿主細胞と適合した種に由来するレプリコン及び制御配列を含むプラスミドベクターが、これらのホストに関連して使用される。ベクターは通常、複製部位、並びに形質転換細胞の表現型選択を提供することができるマーキング配列を運ぶ。例えば、大腸菌は典型的には、大腸菌種から由来したプラスミドであるｐＢＲ３２２を使用して形質転換される。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン（Ａｍｐ）及びテトラサイクリン（Ｔｅｔリ）耐性をコードする遺伝子を含有し、従って形質転換された細胞を同定するための簡便な手段を提供する。ｐＢＲ３２２、その誘導体、又は他の微生物プラスミド又はバクテリオファージもまた含んでいてもよく、又は内因性タンパク質の発現用に微生物生物体によって使用することができるプロモーターを含むように改変され得る。特定の抗体の発現のために使用されるｐＢＲ３２２の誘導体の例は、Ｃａｒｔｅｒらの米国特許第５６４８２３７号に詳細に記載されている。

更に、宿主微生物と適合したレプリコン及び制御配列を含むファージベクターは、これらの宿主に関連した形質転換ベクターとして使用することができる。例えば、λＧＥＭ．ＴＭ．−１１などのバクテリオファージを、大腸菌ＬＥ３９２などの感受性宿主細胞を形質転換するために使用することができる組換えベクターの作成に利用することができる。

本発明の発現ベクターは、ポリペプチド成分の各々をコードする、二つ以上のプロモーター−シストロン対を含んでもよい。プロモーターは、その発現を調節するシストロンに対する上流（５’）に位置する非翻訳調節配列である。原核生物のプロモーターは、典型的には、誘導性と構成性の２つのクラスに分類される。誘導性プロモーターは、培養条件の変化、例えば、栄養素の有無または温度の変化に応じて、その制御下でシストロンの転写レベルの上昇を開始するプロモーターである。

様々な潜在的宿主細胞によって認識される多数のプロモーターがよく知られている。選択されたプロモーターは、例えば、制限酵素消化を介して供給源のＤＮＡからプロモーターを除去し、そして、本発明のベクターに単離されたプロモーター配列を挿入することにより、軽鎖又は重鎖をコードするシストロンＤＮＡに結合させることができる。天然のプロモーター配列及び数多くの異種プロモーターの両方を、標的遺伝子の直接増幅及び／又は発現に用いることができる。幾つかの実施態様において、異種プロモーターが一般に天然の標的ポリペプチドプロモーターに比べて標的遺伝子のより高い転写収率および高い発現収率を可能にするようため、異種プロモーターが利用されている。

原核生物宿主での使用に適したプロモーターには、ＰｈｏＡプロモーター、βガラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系及び例えばｔａｃ又はｔｒｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが挙げられる。しかしながら、（他の既知の細菌又はファージプロモーターなど）細菌内で機能している他のプロモーターも同様に適している。それらのヌクレオチド配列は公開されており、それによって当業者が、任意の必要な制限部位を供給するリンカー又はアダプターを使用して、例えば、ターゲットの軽鎖および重鎖などのヘテロ多量体タンパク質の遺伝子をコードするシストロンにそれらを操作可能に連結できる（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８０）Ｃｅｌｌ ２０：２６９）。

本発明の一実施態様において、組換えベクター内の各シストロンは、発現されたポリペプチドの膜を横断する移行を導く分泌シグナル配列成分を含む。一般に、シグナル配列はベクターの成分であってもよいし、又はベクターに挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部であってもよい。本発明の目的のために選択されたシグナル配列は、宿主細胞によって認識されてプロセスされる（即ちシグナルペプチダーゼにより切断される）ものでなければならない。認識し、異種ポリペプチドを原産とするシグナル配列を認識せずプロセスしない原核宿主細胞について、そのシグナル配列は、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ及びＭＢＰからなる群から、例えば、選択された原核生物のシグナル配列で置換される。本発明の一実施態様において、発現系の両方のシストロンで使用されるシグナル配列は、ＳＴＩＩシグナル配列またはその変異体である。

別の実施態様において、本発明による免疫グロブリンの産生は、宿主細胞の細胞質中で生じ得るので、従って各シストロン内における分泌シグナル配列の存在を必要としない。その点において、免疫グロブリンの軽鎖および重鎖が発現され折り畳まれ、細胞質内の機能的な免疫グロブリンを形成するように会合される。特定の宿主株（例えば、大腸菌ｔｒｘＢ⁻株）が、ジスルフィド結合の形成のために好ましい細胞質の条件を提供し、それにより発現されるタンパク質サブユニットの適切な折り畳みと会合を可能にしている。Ｐｒｏｂａ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ Ｇｅｎｅ，１５９：２０３（１９９５）を参照。

本発明のヘテロ多量タンパク質（例えば、抗体）を発現するのに適した原核生物宿主細胞は、古細菌及び真正細菌、例えばグラム陰性またはグラム陽性生物などが含まれる。有用な細菌の例としては、大腸菌類（例えば、大腸菌）、桿菌（例えば、枯草菌）、腸内細菌、シュードモナス種（例えば、緑膿菌）、ネズミチフス菌、霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、クレブシエラ、プロテウス、赤痢菌、根粒菌、ビトレオシラ、又はパラコッカスを含む。一実施態様において、グラム陰性細胞が用いられる。一実施態様において、大腸菌細胞が、本発明のための宿主として使用される。大腸菌株の例としては、Ｗ３１１０株（Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２巻（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７），頁１１９０−１２１９；ＡＴＣＣ寄託番号２７，３２５）、及び遺伝子型Ｗ３１１０ ΔｆｈｕＡ（ΔｔｏｎＡ） ｐｔｒ３ ｌａｃ Ｉｑ ｌａｃＬ８ ΔｏｍｐＴΔ（ｎｍｐｃ−ｆｅｐＥ） ｄｅｇＰ４１ ｋａｎ^Ｒ（米国特許第５，６３９，６３５号）を有する菌株３３Ｄ３を含む、その誘導体が含まれる。他の菌株及びその誘導体、例えば大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）、大腸菌Ｂ、大腸菌λ１７７６（ＡＴＣＣ３１５３７）及び大腸菌ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ３１６０８）なども適している。一実施態様において、大腸菌Δｌｐｐは特定の用途を見いだしている。これらの実施例は、限定ではなく例示である。定められた遺伝子型を有する上記細菌の任意の誘導体を構築するための方法は当該技術分野で公知であり、例えば、Ｂａｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，８：３０９−３１４（１９９０）に記載されている。細菌の細胞内のレプリコンの複製能を考慮して適切な細菌を選択することが一般的に必要である。良く知られたプラスミド、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、又はｐＫＮ４１０がレプリコンを供給するために使用されるとき、例えば、大腸菌、セラチア、またはサルモネラ属を、宿主として適切に用いることが可能である。典型的には、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する必要があり、更なるプロテアーゼ阻害剤を、望ましくは、細胞培養物に組み込むことができる。

ＩＩ．ポリペプチド産生
宿主細胞が上述の発現ベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切に修飾された従来の栄養培地で培養される。

形質転換は、ＤＮＡが、染色体外要素として、或いは染色体組込み体により、の何れかによって、複製可能であるように、原核生物の宿主にＤＮＡを導入することを意味する。使用する宿主細胞に応じて、形質転換は、そのような細胞に適した標準的な技術を用いて行われる。塩化カルシウムを採用したカルシウム処理は、一般に、実質的な細胞壁障壁を含有する細菌細胞のために使用される。形質転換のための別の方法は、ポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いる。更に使用される別の手法は、エレクトロポレーションである。

本発明のポリペプチドを生成するために用いられる原核細胞は、当該技術分野で知られており、選択された宿主細胞の培養に適した培地中で増殖される。適切な媒体の例としては、ルリア培地（ＬＢ）と必要な栄養素補給が含まれている。幾つかの実施態様において、培地は、発現ベクターを含む原核細胞の増殖を選択的に可能にする発現ベクターの構築に基づいて選択された選択剤を含有する。例えば、アンピシリンが、アンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の増殖のための培地に添加される。

炭素、窒素、及び無機リン酸塩の供給源以外の任意の必要な栄養補助剤も、単独で又は他の栄養補助剤もしくは複合窒素供給源などの培地との混合物として導入され、適切な濃度で含まれてよい。任意で選択培地は、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコール酸、ジチオエリスリトール及びジチオスレイトールとからなる群から選択される一以上の還元剤を含んでもよい。

原核生物宿主細胞は適当な温度で培養される。大腸菌の増殖において、例えば、好ましい温度は、約２０℃から約３９℃、より好ましくは約２５℃から約３７℃の範囲であり、更により好ましくは約３０℃である。培地のｐＨは、宿主生物に主に依存して、約５から約９の範囲の任意のｐＨであり得る。大腸菌については、ｐＨは好ましくは約６．８から約７．４、より好ましくは約７．０である。

誘導性プロモーターが、本発明の発現ベクターに使用される場合には、タンパク質の発現は、プロモーターの活性化に適した条件下で誘導される。本発明の一実施態様において、ＰｈｏＡプロモーターが、ポリペプチドの転写の制御のために使用される。従って、形質転換された宿主細胞は、誘導のためにリン酸塩制限培地で培養される。好ましくは、リン酸塩制限培地はＣ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地である（例えば、Ｓｉｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００２），２６３：１３３−１４７を参照）。当技術分野で知られているように、採用されたベクターコンストラクトに従って、他の様々な誘導因子を使用することができる。

一実施態様において、第一及び第二のＦｃ含有宿主細胞が別々に培養され、発現された本発明のポリペプチドが、宿主細胞のペリプラズムに分泌され別々に回収される。第二の実施態様において、第一及び第二のＦｃ含有宿主細胞が別々に培養され、そしてＦｃ含有ポリペプチドの分離の前に、２つの宿主細胞培養物を一緒に混合し、細胞がペレット状にされる。第三の実施態様において、第一及び第二のＦｃ含有宿主細胞が別々に培養され、遠心分離し、別々に再懸濁し、その後、Ｆｃ含有ポリペプチドの分離の前に一緒に混合する。第四の実施態様において、第一及び第二のＦｃ含有宿主細胞は同じ培養容器中で一緒に培養される。タンパク質の回収は、一般的に浸透圧ショック、超音波処理や溶解などの手段によって、典型的には微生物の細胞膜を破壊することが含まれる。一度細胞が破壊されると、細胞の破片又は全細胞を、遠心分離又は濾過によって除去することができる。タンパク質は、、例えば、アフィニティー樹脂クロマトグラフィーによって更に精製することができる。あるいは、タンパク質は、培地に移され、そこで単離することができる。細胞は培養物から除去することができ、培養上清を、産生されるタンパク質の更なる精製のために、濾過し、濃縮した。発現されたポリペプチドは更に、単離し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びウエスタンブロットアッセイ等の一般に知られている方法を用いて同定することができる。単離されたポリペプチドは、ヘテロ多量体タンパク質を生産するために使用される。

本発明の一実施態様において、ヘテロ多量体タンパク質（例えば、抗体）の産生は、発酵プロセスにより大量に行われる。様々な大規模流加発酵手順が、組換えタンパク質の生産のために利用可能である。大規模発酵は、少なくとも１０００リットルの容量、好ましくは約１，０００から１００，０００リットルの容量を有する。これらの発酵槽は、酸素及び栄養素、特にグルコース（好ましい炭素／エネルギー源）を分配するために攪拌羽根車を使用している。小規模発酵は一般的に容積がわずか約１００リットルしかない、約１リットルから約１００リットルの範囲であり得る発酵槽での発酵を指す。

発酵プロセスにおいて、タンパク質発現の誘導は、典型的には、細胞が適した条件下で所望の濃度、例えば、細胞が初期の静止期にある段階である、ＯＤ５５０が約１８０〜２２０まで増殖した後に開始される。当技術分野で知られ、上述されるように、採用されたベクターコンストラクトに従って、様々な誘導因子を使用することができる細胞は、誘導に先だって短い期間増殖させることができる。細胞は通常約１２〜５０時間誘導されるが、それより長いか又は短い誘導時間である場合がある。

本発明のポリペプチドの生産収率や品質を向上させるために、様々な発酵条件を変更することができる。例えば、分泌されたヘテロ多量体タンパク質（例えば、抗体）の適切な会合とフォールディングを改善するために、シャペロンタンパク質、例えばＤｓｂタンパク質（ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ及び又はＤｓｂＧ）又はＦｋｐＡ（シャペロン活性を有するペプチジルシス、トランス−イソメラーゼ）を過剰発現する追加ベクターを、宿主の原核細胞を共形質転換することに用いることができる。シャペロンタンパク質は、細菌宿主細胞中で産生される異種タンパク質の溶解性及び適切なフォールディングを促進することが実証されている。Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ ２７４：１９６０１−１９６０５；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｌ., 米国特許第６，０８３，７１５号；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，０２７，８８８号；Ｂｏｔｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１００−１７１０５；Ｒａｍｍ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１０６−１７１１３；Ａｒｉｅ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９：１９９−２１０．

発現された異種タンパク質（特にタンパク質分解感受性であるもの）のタンパク質分解を最小限にするために、タンパク質分解酵素が欠損した特定の宿主株を本発明に用いることができる。例えば、宿主細胞株は、例えば、プロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーゼＭｉ、プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩなどの公知の細菌プロテアーゼ及びそれらの組合せをコードする遺伝子の遺伝的変異をもたらすように修飾することができる。幾つかの大腸菌プロテアーゼ欠損株が利用可能であり、例えば、Ｊｏｌｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：２７７３−２７７７；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，２６４，３６５号；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，５０８，１９２号；Ｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，２：６３−７２（１９９６）に記載されている。

一実施態様において、タンパク質分解酵素が欠損し、一以上のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドで形質転換された大腸菌株が、本発明の発現系において宿主細胞として使用される。第二の実施態様において、大腸菌株は外膜のリポタンパク質を欠損している（Δｌｐｐ）。

ＩＩＩ．ヘテロ多量体タンパク質の精製
一実施態様において、本明細書において生産されるヘテロ多量体タンパク質が更に精製され、更なるアッセイ及び用途のために実質的に均一である調製物を得る。当技術分野で公知の標準的なタンパク質精製方法を用いることができる。以下の手順は適切な精製手順の例である：免疫親和性又はイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上或いはＤＥＡＥなどの陽イオン交換樹脂上でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、セファデックスＧ−７５を例えば使用するゲル濾過。

一実施態様において、固相に固定されたプロテインＡが、例えば、本発明の完全長抗体製品のの免疫親和性精製において使用される。プロテインＡは黄色ブドウ球菌由来の４１ｋＤの細胞壁タンパク質であり、抗体のＦｃ領域に高い親和性で結合する。Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９８３） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３．プロテインＡが固定化された固相は、好ましくはガラス又はシリカ表面を含むカラムであり、より好ましくは制御された細孔ガラスカラム又はケイ酸カラムを含む。幾つかの用途では、カラムは、汚染物質の非特異的な付着を防止する試みにおいて、グリセロールなどの試薬でコーティングされている。

精製の第一工程として、上述したように、細胞培養物に由来する調製物がプロテインＡ固定化固相にアプライされ、目的の抗体のプロテインＡに対する特異的結合を可能にする。固相は、その後、非特異的に固相に結合した汚染物質を除去するために洗浄される。ヘテロ多量体タンパク質（例えば、抗体）は溶出により固相から回収される。

ｂ．真核生物の宿主細胞を使用してヘテロ多量体タンパク質を生成する
ベクター成分は、限定されないが、一般的に以下の一つ以上を含む：シグナル配列、複製起点、一つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列。

ｉ．シグナル配列成分
真核生物の宿主細胞において使用するためのベクターはまた、目的の成熟タンパク質又はポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する、シグナル配列或いは他のポリペプチドを含んでいてもよい。好ましく選択された異種性シグナル配列は、宿主細胞によって認識されてプロセスされる（即ちシグナルペプチダーゼにより切断される）ものである。哺乳動物の細胞発現においては、哺乳動物のシグナル配列、並びにウイルスの分泌性リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤのシグナルを利用可能である。そうした前駆体領域のＤＮＡは、所望のヘテロ多量タンパク質（例えば、抗体）をコードするＤＮＡにリーディング・フレーム中で連結されている。

ＩＩ．複製起点
一般的に、複製起点の成分は哺乳動物の発現ベクターにおいて必要ではない。例えば、ＳＶ４０起点が典型的には使用され得るが、ただそれが初期プロモーターを含有するためだからである。

ＩＩＩ．選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、選択可能なマーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含んでいてもよい。典型的な選択遺伝子は、（ａ）例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、又はテトラサイクリンなどの抗生物質或いは他の毒素に対する耐性を付与し、（ｂ）該当する場合に栄養要求性欠乏症を補完し、又は（ｃ）複合培地から得られない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。

選択方式の一例は、宿主細胞の増殖を阻止する薬物を利用する。異種性遺伝子で首尾よく形質転換された細胞は、薬剤耐性を付与するタンパク質を生産し、よって選択レジメンを生き残る。このような優性選択の例としては、薬物のネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。

哺乳動物の細胞に適した選択マーカーの他の例は、例えば、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉと−ＩＩ、好ましくは、霊長類のメタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなど抗体核酸を取り込む能力のある細胞の同定を可能にするものである。

例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞は、メトトレキサート（Ｍｔｘ）、ＤＨＦＲの競合的拮抗薬を含有する培地中で形質転換体の全てを培養することにより同定される。野生型ＤＨＦＲを用いたときの適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性が欠損しているチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−９０９６）である。

あるいは、抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲ蛋白質、および３’−ホスアミノグリコシドなどの別の選択可能なマーカー（ＡＰＨ）で形質転換又は同時形質転換される宿主細胞（特に内因性ＤＨＦＲを含有する野生型ホスト）は、アミノグリコシド系抗生物質、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、又はＧ４１８などの選択可能なマーカーの選択剤を含有する培地中の細胞増殖により選択することができる。例えば、米国特許第４，９６５，１９９号を参照。

ｉｖ．プロモーター成分
発現ベクター及びクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、操作可能に所望のＦｃ含有ポリペプチド（例えば、抗体）を核酸に連結されているプロモーターを含んでいる。プロモーター配列は、真核生物で知られている。実質的にすべての真核生物の遺伝子は、転写が開始される部位からおよそ２５から３０塩基上流に位置するＡＴに富んだ領域を有する。多くの遺伝子の転写の開始点から７０から８０塩基上流に見いだされる別の配列はＣＮＣＡＡＴ領域であり、ここで、Ｎは任意のヌクレオチドである。大部分の真核生物遺伝子の３’末端で、コード配列の３’末端にポリＡ尾部を追加するためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列である。これらの配列の全ては、適切に真核生物の発現ベクターに挿入される。

哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの所望のＦｃ含有ポリペプチド（例えば、抗体）の転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルスは、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られるプロモーターにより、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、または熱ショックプロモーターから、そうしたプロモーターが宿主細胞系と適合するという条件で、制御される。

ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーター及び後期プロモーターは、複製のＳＶ４０ウイルス起源をも含有するＳＶ４０制限酵素断片として都合良く得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限酵素断片として好都合に得られる。ベクターとしてウシパピローマウイルスを用いて哺乳動物宿主でＤＮＡを発現させるためのシステムは、米国特許第４４１９４４６号に開示されている。このシステムの改変は、米国特許第４６０１９７８号に記載されている。単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの制御下で、マウス細胞におけるヒトβインターフェロンのｃＤＮＡの発現に関しては、Ｒｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２９７：５９８−６０１（１９８２）を参照。あるいは、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復をプロモーターとして使用することができる。

ｖ．エンハンサーエレメント成分
所望のＦｃ含有ポリペプチド（例えば、抗体）をコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することによって高めることができる。多くのエンハンサー配列が現在哺乳動物遺伝子（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、及びインスリン遺伝子）から知られている。また、真核細胞ウイルスからのエンハンサーを使用する場合がある。例としては、複製起点の後期側（ｂｐ１００−２７０）にＳＶ４０エンハンサーを、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサーを、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサーを、及びアデノウイルスエンハンサーを含む。真核生物プロモーターの活性化を増強するための要素の説明については、Ｙａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ ２９７：１７−１８（１９８２）も参照。エンハンサーは、増強が達成されることを条件として、抗体ポリペプチドをコードする配列に対して５’又は３’の位置で、しかし一般的にはプロモーターから５’位に位置しているベクター中にスプライシングされ得る。

ｖｉ．転写終結成分
真核生物宿主細胞中で用いられる発現ベクターは、典型的には、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含むであろう。そのような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ或いはｃＤＮＡの非翻訳領域の５’から、場合によっては３’から一般的に利用可能である。これらの領域は、抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分において、ポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンのポリアデニル化領域である。国際公開第９４／１１０２６号及びそこに開示される発現ベクターを参照。

ｖｉｉ．宿主細胞の選択及び形質転換
本明細書におけるベクター中でのＤＮＡのクローニング又は発現用に適した宿主細胞は、脊椎動物宿主細胞を含む本明細書に記載の高等真核細胞が含まれる。培養液（組織培養）中での脊椎動物細胞の増殖は日常的な手順となっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）によって形質転換されたサル腎臓Ｖ１株；ヒト胚腎臓株（懸濁培養液中での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞又は２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））；マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株（ＨｅｐＧ２）である。

宿主細胞が上述の例えば所望のＦｃ含有ポリペプチド（抗体）産生のための発現ベクター又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切に修飾された従来の栄養培地で培養される。

ｖｉｉｉ宿主細胞を培養する
本発明の所望のＦｃ含有ポリペプチド（例えば、抗体）を生成するために使用される宿主細胞は種々の培地において培養され得る。市販で入手可能な培地が、例えばＨａｍ’ｓ Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、基礎培地（（ＭＥＭ），（Ｓｉｇｍａ），ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ），Ｓｉｇｍａ）などが本宿主細胞の培養用に適している。更に、Ｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９），Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，９２７，７６２号；同第４，５６０，６５５号；又は同第５，１２２，４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国特許Ｒｅ．３０，９８５号に記載される任意の培地が本宿主細胞用の培養培地として使用され得る。任意のこれらの培地は、ホルモン及び／又は他の増殖因子（例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子など）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩）、緩衝液（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えばアデノシン及びチミジン）、抗生物質（ゲンタマイシン^ＴＭ薬）、微量元素（通常マイクロモル範囲の最終濃度で存在すると定義される無機化合物）、及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な栄養補助剤もまた、当業者に知られている適当な濃度で含まれていてもよい。培養条件、例えば、温度、ｐＨ等は、発現のために選択された宿主細胞で以前に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。

ｉｘ．ヘテロ多量体タンパク質の精製
組換え技術を使用するとき、Ｆｃ含有ポリペプチドは細胞内に産生され、又は直接培地に分泌することができる。Ｆｃ含有ポリペプチドが、第一工程として、細胞内に産生されると、宿主細胞又は溶解された断片の何れかの粒状破片は、例えば遠心分離または限外濾過によって除去される。Ｆｃ含有ポリペプチドが培地に分泌される場合、その発現系からの上清は、一般にまず最初に、例えば、アミコン又はミリポアペリコン限外濾過ユニットなど、市販のタンパク質濃度フィルターを使用して濃縮される。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤は、タンパク質分解を阻害するために以上の工程の何れかに含まれ、そして抗生物質が、外来性の汚染物の増殖を防止するために含まれ得る。

細胞から調製されたヘテロ多量体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及び親和性クロマトグラフィーを用いて精製することができ、とりわけ親和性クロマトグラフィーが好ましい精製技術である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡが、ヒトγ１、γ２又はγ４重鎖に基づいた抗体の精製に用いることができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。プロテインＧがマウスの全アイソタイプ及びヒトγ３について推奨される（Ｇｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））。親和性リガンドが付着したマトリックスは、ほとんどの場合アガロースであるが、他のマトリックスは利用可能である。制御された細孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）などの機械的に安定したマトリックス、又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンは、アガロースで達成することができるよりもより速い流速とより短い処理時間を可能にする。抗体が、Ｃ_Ｈ３ドメインを含有する場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ^ＴＭ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）が精製のために有用である。タンパク質精製のための他の技術、例えば、イオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）上でのヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ^ＴＭクロマトグラフィー上でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿もまた回収する抗体に依存して利用できる。

任意の予備的精製工程に続いて、目的の抗体と夾雑物を含む混合物は、ｐＨが約２．５から４．５の間での溶出バッファーを使用して、低いｐＨの疎水性相互作用クロマトグラフィーに供され、好ましくは低塩濃度（例えば約０−０．２５Ｍの塩）で実施され得る。ヘテロ多量体タンパク質の産生は、（前述の特定の方法の何れかに対して）別法で又は付加的に、ポリペプチドの混合物を含む溶液を透析することを含む。

ｘ．バキュロウイルスを使用する抗体産生
組換えバキュロウイルスは、抗体又は抗体断片をコードするプラスミドとＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＴＭウイルスＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）は、例えば、リポフェクチン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬから市販される）を使用して、ヨトウガ細胞（例えば、Ｓｆ９細胞；ＡＴＣＣ ＣＲＬ１７１１）などの昆虫細胞、又はキイロショウジョウバエＳ２細胞に同時導入することにより生成することができる。特定の実施例において、抗体配列が、バキュロウイルス発現ベクター内に含まれるエピトープタグの上流に融合される。このようなエピトープタグは、ポリＨｉｓタグを含める。ｐＶＬ１３９３（Ｎｏｖａｇｅｎ）又はｐＡｃＧＰ６７Ｂ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）などの市販のプラスミド由来のプラスミドを含む、様々なプラスミドを用いることができる。簡潔には、抗体又はその断片をコードする配列は、その５’および３’領域に相補的なプライマーを用いてＰＣＲにより増幅することができる。５’プライマーは、隣接する（選択された）制限酵素部位を組み込むことができる。生成物は、次いで選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされ得る。

発現ベクターによるトランスフェクションの後、宿主細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）は、２８℃で４−５日間インキュベートされ、放出されるウイルスは回収され、更なる増幅するために使用される。ウイルス感染及びタンパク質の発現は、例えば、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｏｘｆｏｒｄ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９４））により説明したように実行され得る。

次いで、発現されたポリＨｉｓタグ付き抗体を、例えば、ＮＩ２＋−キレート親和性クロマトグラフィーにより以下のとおり精製する。Ｒｕｐｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３６２：１７５−１７９（１９９３））により説明されるように、抽出物を組換えウイルスに感染したＳｆ９細胞から調製することができる。簡潔には、Ｓｆ９細胞が洗浄され、超音波処理バッファ−（２５ｍＬ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．９；１２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；０．１ｍＭ ＥＤＴＡ；１０％グリセロールｌ；０．１％ ＮＰ−４０；０．４Ｍ ＫＣｌ）に再懸濁され、氷上で２０秒間２回超音波処理される。超音波処理物を遠心分離によって除去し、上清を添加液（５０ｍＭ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；３００ｍＭ ＮａＣｌ；１０％グリセロールｐＨ７．８）で５０倍に希釈し、０．４５μｍのフィルターを介して濾過する。Ｎｉ２＋−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎから市販）が、５ｍＬのベッドボリュームで調製され、２５ｍＬの水で洗浄し、２５ｍＬの添加液で平衡化される。濾過された細胞抽出物が毎分０．５ｍｌでカラムにロードされる。カラムを添加液によりベースラインＡ２８０まで洗浄し、その時点で分別捕集を開始する。次に、カラムを２次洗浄バッファー（５０ｍＭのリン酸、３００ｍＭの塩化ナトリウム、１０％グリセロールでｐＨ６．０）で洗浄し、非特異的に結合したタンパク質を溶出する。Ａ２８０ベースラインに再び到達後、カラムは、二次洗浄バッファーで０から５００ｍＭのイミダゾール勾配で展開される。１ｍＬの分画が収集され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、銀染色又はアルカリホスファターゼコンジュゲートしたＮｉ２＋−ＮＴＡを用いたウェスタンブロットにより分析される（Ｑｉａｇｅｎ）。溶出したＨｉｓ１０タグ付き抗体を含む画分がプールされ、添加液に対して透析される。

あるいは、抗体の精製は、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含めた公知のクロマトグラフィー技術を用いて行うことができる。一実施態様において、目的の抗体は、カオトロピック剤又は中性洗剤を含有する溶液中への溶出により、カラムの固相から回収することができる。典型的なカオトロピック剤及び中性洗剤としては、限定されないが、グアニジン塩酸、尿素、リチウム過塩素酸塩（ｐｅｒｃｌｏｒａｔｅ）、アルギニン、ヒスチジン、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、Ｔｗｅｅｎ、トリトン、及びＮＰ−４０を含み、それらの全ては市販に入手可能である。

ＩＶ．ヘテロ多量体タンパク質の形成／構築
完全なヘテロ多量体タンパク質の形成は、本発明において再フォールディングと呼ばれている、ジスルフィド結合の形成により第一のＦｃ含有ポリペプチド及び第二のＦｃ含有ポリペプチドの再構築が含まれる。再フォールディングは、第一のＦｃ含有ポリペプチドの第二のＦｃ含有ポリペプチドとの会合、及び鎖間ジスルフィド結合の形成を含む。再フォールディングはまた、再生とも呼ばれ、本発明においてはインビトロで行われる。

宿主細胞は、別々の培養として、又は、単一培養のいずれかとして、上記の方法を用いて培養することができる。一つの方法において、第一宿主細胞と第二宿主細胞は、同じ培養容器で増殖される（時には共培養又は混合培養とも称される）。別の方法において、第一及び第二の宿主細胞は、別々の培養容器で増殖される。一つの方法において、別々の培養液は別々に処理され、次いで細胞膜の破壊に先だって、混合され／組み合わされる。一つの方法において、別々の培養液は混合され、次いで細胞膜の破壊に先だって処理される。一つの方法において、別々の培養液は、細胞膜の破壊に先だって更に処理されること無く、混合される。一つの方法において、第一宿主細胞及び第二宿主細胞を含む単一培養液が、細胞膜の破壊に先だって処理される。その他の方法において、共培養された細胞は細胞膜の破壊に先だって処理されない。細胞の処理は、遠心分離及び適切な緩衝液中（例えば、抽出緩衝液）での再懸濁を含む。

抽出緩衝液は当技術分野で知られており、当業者は、過度の実験によらず使用する緩衝液を決定することができるであろう。

宿主細胞膜は、当技術分野で公知の方法を用いて破砕する。そのような方法は、細胞膜の透過処理及び細胞膜の分解を含む。細胞膜の透過処理は、例えば、細胞が生きたままでいるように膜全体の完全性を破壊することなく、穴を導入することによって、膜を「漏れやすい」状態にすることを指す。言い換えれば、透過処理は、細胞膜を通過する高分子の移動を与え、細胞の生存を存続させるのを可能にするために十分な細胞構造を維持する。これとは対照的に、細胞膜の崩壊は、細胞内容物を細胞外環境に放出し、細胞死に至る。

細胞膜を破壊するための方法としては、限定されないが、酵素的溶解、超音波処理、浸透圧ショック、マイクロフルイダイザーの通過、ＥＤＴＡの添加、種々の界面活性剤、溶媒（例えば、トルエン、ジメチルスルホキシド等）、界面活性剤（例えば、トリトンＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ ２０等）、低張バッファーの使用、凍結／解凍技術、エレクトロポレーションの使用、ステンレス鋼のボールホモジナイザーの通過を含む。

Ｆｃ含有ポリペプチドが（透過処理又は崩壊のどちらかによって）細胞から放出された後、ヘテロ多量体化ドメインは、ヘテロ多量体タンパク質の会合を促進するであろう。会合したＦｃ含有ポリペプチドの鎖間ジスルフィド形成が、還元剤を添加若しくは添加せずに進行する場合がある。得られたジスルフィド結合化ヘテロ多量体タンパク質は、その後精製される。任意で、それを、研究、診断、治療又は他の目的のために処方することができる。

Ｖ．標的分子
本発明のヘテロ多量タンパク質により標的とすることができる分子の例としては、限定されないが、水溶性の血清タンパク質及びそれらの受容体及び他の膜結合タンパク質（例えば、アドヘシン）を含む。

他の実施態様では、本発明のヘテロ多量体タンパク質は、ＢＭＰｌ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３Ｂ（ＧＤＦｌＯ）、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ８、ＣＳＦｌ （Ｍ−ＣＳＦ）、ＣＳＦ２（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＣＳＦ３（Ｇ−ＣＳＦ）、ＥＰＯ、ＦＧＦｌ （ａＦＧＦ）、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ３（ｉｎｔ−２）、ＦＧＦ４（ＨＳＴ）、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６（ＨＳＴ−２）、ＦＧＦ７（ＫＧＦ）、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１２Ｂ、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２３、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＩＦＮＡｌ、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＢｌ、ＩＦＮＧ、ＩＦＮＷｌ、ＦＥＬｌ、ＦＥＬｌ（ＥＰＳＥＬＯＮ）、ＦＥＬｌ（ＺＥＴＡ）、ＩＬｌＡ、ＩＬｌＢ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬＩｌ、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１７Ｂ、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２４、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８Ａ、ＩＬ２８Ｂ、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３、ＬＴＡ（ＴＮＦ−ｂ）、ＬＴＢ、ＴＮＦ（ＴＮＦ−ａ）、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０リガンド）、ＴＮＦＳＦ９（４−１ＢＢリガンド）、ＴＮＦＳＦｌ０（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦＳＦ１ｌ（ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰＯ３Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１３（Ａｐｒｉｌ）、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ−Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）、ＴＮＦＳＦ１８、ＨＧＦ（ＶＥＧＦＤ）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＩＬｌＲ１、ＩＬ１Ｒ２、ＩＬ１ＲＬ１、ＬＬ１ＲＬ２、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ８ＲＡ、ＩＬ８ＲＢ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬｌ０ＲＡ、ＩＬｌ０ＲＢ、ＩＬ１ｌＲＡ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１２ＲＢ２、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ１７Ｒ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２２Ｒ、ＩＬ１ＨＹ１、ＩＬｌＲＡＰ、ＩＬ１ＲＡＰＬ１、ＩＬ１ＲＡＰＬ２、ＩＬｌＲＮ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ１８ＢＰ、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＩＬ２２ＲＡ２、ＡＩＦｌ、ＨＧＦ、ＬＥＰ（レプチン）、ＰＴＮ、およびＴＨＰＯからなる群から選択される１、２またはそれ以上のサイトカイン、サイトカイン関連タンパク質およびサイトカインレセプターを結合することができる。

他の実施態様では、標的分子は、ＣＣＬｌ（Ｉ−３０９）、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１／ＭＣＡＦ）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−Ｉａ）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ−Ｉｂ）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ７（ＭＣＰ−３）、ＣＣＬ８（ｍｃｐ−２）、ＣＣＬＨ（ｅｏｔａｘｉｎ）、ＣＣＬ１３（ＭＣＰ−４）、ＣＣＬ１５（ＭＩＰ−Ｉｄ）、ＣＣＬ１６（ＨＣＣ−４）、ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）、ＣＣＬ１８（ＰＡＲＣ）、ＣＣＬ１９（ＭＤＰ−３ｂ）、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ−３ａ）、ＣＣＬ２１（ＳＬＣ／ｅｘｏｄｕｓ−２）、ＣＣＬ２２（ＭＤＣ／ＳＴＣ−Ｉ）、ＣＣＬ２３（ＭＰＩＦ−Ｉ）、ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ−２／エオタキシン−２）、ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）、ＣＣＬ２６（エオタキシン−３）、ＣＣＬ２７（ＣＴＡＣＫ／ＩＬＣ）、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬｌ（ＧＲＯｌ）、ＣＸＣＬ２（ＧＲＯ２）、ＣＸＣＬ３（ＧＲ０３）、ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ−７８）、ＣＸＣＬ６（ＧＣＰ−２）、ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＬ１Ｏ（ＩＰ １０）、ＣＸＣＬ１１（Ｉ−ＴＡＣ）、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦｌ）、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１６、ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）、ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）、ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤｌ）、ＳＣＹＥｌ、ＸＣＬｌ（リンホタクチン）、ＸＣＬ２（ＳＣＭ−Ｉｂ）、ＢＬＲｌ（ＭＤＲ１５）、ＣＣＢＰ２（Ｄ６／ＪＡＢ６１）、ＣＣＲｌ（ＣＫＲｌ／ＨＭ１４５）、ＣＣＲ２（ｍｃｐ−ｌＲＢ／ＲＡ）、ＣＣＲ３（ＣＫＲ３／ＣＭＫＢＲ３）、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５（ＣＭＫＢＲ５／ＣｈｅｍＲ１３）、ＣＣＲ６（ＣＭＫＢＲ６／ＣＫＲ−Ｌ３／ＳＴＲＬ２２／ＤＲＹ６）、ＣＣＲ７（ＣＫＲ７／ＥＢＩｌ）、ＣＣＲ８（ＣＭＫＢＲ８／ＴＥＲｌ／ＣＫＲ−Ｌｌ）、ＣＣＲ９（ＧＰＲ−９−６）、ＣＣＲＬｌ（ＶＳＨＫｌ）、ＣＣＲＬ２（Ｌ−ＣＣＲ）、ＸＣＲｌ（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲｌ）、ＣＭＫＬＲｌ、ＣＭＫＯＲｌ（ＲＤＣｌ）、ＣＸ３ＣＲ１（Ｖ２８）、ＣＸＣＲ４、ＧＰＲ２（ＣＣＲｌＯ）、ＧＰＲ３１、ＧＰＲ８１（ＦＫＳＧ８０）、ＣＸＣＲ３（ＧＰＲ９／ＣＫＲ−Ｌ２）、ＣＸＣＲ６（ＴＹＭＳＴＲ／ＳＴＲＬ３３／ボンゾー）、ＨＭ７４、ＩＬ８ＲＡ（ＩＬ８Ｒａ）、ＩＬ８ＲＢ（ＩＬ８Ｒｂ）、ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）、ＴＣＰｌＯ、ＣＫＬＦＳＦ２、ＣＫＬＦＳＦ３、ＣＫＬＦＳＦ４、ＣＫＬＦＳＦ５、ＣＫＬＦＳＦ６、ＣＫＬＦＳＦ７、ＣＫＬＦＳＦ８、ＢＤＮＦ、Ｃ５Ｒ１、ＣＳＦ３、ＧＲＣＣｌＯ（ＣｌＯ）、ＥＰＯ、ＦＹ（ＤＡＲＣ）、ＧＤＦ５、ＨＤＦｌＡ、ＤＬ８、プロラクチン、ＲＧＳ３、ＲＧＳ１３、ＳＤＦ２、ＳＬＩＴ２、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＲＥＭｌ、ＴＲＥＭ２およびＶＨＬからなる群から選択される、ケモカイン、ケモカインレセプターまたはケモカイン関連タンパク質である。

他の実施態様では、本発明のヘテロ多量体タンパク質は、ＡＢＣＦｌ；ＡＣＶＲｌ；ＡＣＶＲｌＢ；ＡＣＶＲ２；ＡＣＶＲ２Ｂ；ＡＣＶＲＬｌ；ＡＤ０ＲＡ２Ａ；アグリカン；ＡＧＲ２；ＡＩＣＤＡ；ＡＩＦｌ；ＡＩＧｌ；ＡＫＡＰｌ；ＡＫＡＰ２；ＡＭＨ；ＡＭＨＲ２；ＡＮＧＰＴｌ；ＡＮＧＰＴ２；ＡＮＧＰＴＬ３；ＡＮＧＰＴＬ４；ＡＮＰＥＰ；ＡＰＣ；ＡＰＯＣｌ；ＡＲ；ＡＺＧＰｌ（亜鉛−ａ−糖タンパク質）；Ｂ７．１；Ｂ７．２；ＢＡＤ；ＢＡＦＦ（ＢＬｙｓ）；ＢＡＧｌ；ＢＡＩｌ；ＢＣＬ２；ＢＣＬ６；ＢＤＮＦ；ＢＬＮＫ；ＢＬＲｌ（ＭＤＲ１５）；ＢＭＰｌ；ＢＭＰ２；ＢＭＰ３Ｂ（ＧＤＦｌＯ）；ＢＭＰ４；ＢＭＰ６；ＢＭＰ８；ＢＭＰＲｌＡ；ＢＭＰＲｌＢ；ＢＭＰＲ２；ＢＰＡＧｌ（プレクチン）；ＢＲＣＡｌ；Ｃ１９ｏｒｆｌＯ（ＩＬ２７ｗ）；Ｃ３；Ｃ４Ａ；Ｃ５；Ｃ５Ｒ１；ＣＡＮＴｌ；ＣＡＳＰ１；ＣＡＳＰ４；ＣＡＶｌ；ＣＣＢＰ２（Ｄ６／ＪＡＢ６１）；ＣＣＬｌ（１−３０９）；ＣＣＬＩｌ（エオタキシン）；ＣＣＬ１３（ＭＣＰ−４）；ＣＣＬ１５（ＭＩＰ−Ｉｄ）；ＣＣＬ１６（ＨＣＣ−４）；ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）；ＣＣＬ１８（ＰＡＲＣ）；ＣＣＬ１９（ＭＩＰ−３ｂ）；ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）；ＭＣＡＦ；ＣＣＬ２０（ＭＩＰ−３ａ）；ＣＣＬ２１（ＭＴＰ−２）；ＳＬＣ；ｅｘｏｄｕｓ−２；ＣＣＬ２２（ＭＤＣ／ＳＴＣ−Ｉ）；ＣＣＬ２３（ＭＰＩＦ−１）；ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ−２／エオタキシン−２）；ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）；ＣＣＬ２６（エオタキシン−３）；ＣＣＬ２７（ＣＴＡＣＫ／ＩＬＣ）；ＣＣＬ２８；ＣＣＬ３（ＭＴＰ−Ｉａ）；ＣＣＬ４（ＭＤＰ−Ｉｂ）；ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）；ＣＣＬ７（ＭＣＰ−３）；ＣＣＬ８（ｍｃｐ−２）；ＣＣＮＡｌ；ＣＣＮＡ２；ＣＣＮＤｌ；ＣＣＮＥｌ；ＣＣＮＥ２；ＣＣＲｌ（ＣＫＲｌ／ＨＭ１４５）；ＣＣＲ２（ｍｃｐ−ｌＲＢ／ＲＡ）；ＣＣＲ３（ＣＫＲ３／ＣＭＫＢＲ３）；ＣＣＲ４；ＣＣＲ５（ＣＭＫＢＲ５／ＣｈｅｍＲ１３）；ＣＣＲ６（ＣＭＫＢＲ６／ＣＫＲ−Ｌ３／ＳＴＲＬ２２／ＤＲＹ６）；ＣＣＲ７（ＣＫＲ７／ＥＢＩｌ）；ＣＣＲ８（ＣＭＫＢＲ８／ＴＥＲｌ／ＣＫＲ−Ｌｌ）；ＣＣＲ９（ＧＰＲ−９−６）；ＣＣＲＬｌ（ＶＳＨＫｌ）；ＣＣＲＬ２（Ｌ−ＣＣＲ）；ＣＤ１６４；ＣＤ１９；ＣＤｌＣ；ＣＤ２０；ＣＤ２００；ＣＤ２２；ＣＤ２４；ＣＤ２８；ＣＤ３；ＣＤ３７；ＣＤ３８；ＣＤ３Ｅ；ＣＤ３Ｇ；ＣＤ３Ｚ；ＣＤ４；ＣＤ４０；ＣＤ４０Ｌ；ＣＤ４４；ＣＤ４５ＲＢ；ＣＤ５２；ＣＤ６９；ＣＤ７２；ＣＤ７４；ＣＤ７９Ａ；ＣＤ７９Ｂ；ＣＤ８；ＣＤ８０；ＣＤ８１；ＣＤ８３；ＣＤ８６；ＣＤＨｌ（Ｅカドヘリン）；ＣＤＨ１０；ＣＤＨ１２；ＣＤＨ１３；ＣＤＨ１８；ＣＤＨ１９；ＣＤＨ２０；ＣＤＨ５；ＣＤＨ７；ＣＤＨ８；ＣＤＨ９；ＣＤＫ２；ＣＤＫ３；ＣＤＫ４；ＣＤＫ５；ＣＤＫ６；ＣＤＫ７；ＣＤＫ９；ＣＤＫＮｌＡ（ｐ２１Ｗａｐｌ／Ｃｉｐｌ）；ＣＤＫＮｌＢ（ｐ２７Ｋｉｐｌ）；ＣＤＫＮｌＣ；ＣＤＫＮ２Ａ（Ｐ１６ＩＮＫ４ａ）；ＣＤＫＮ２Ｂ；ＣＤＫＮ２Ｃ；ＣＤＫＮ３；ＣＥＢＰＢ；ＣＥＲｌ；ＣＨＧＡ；ＣＨＧＢ；キチナーゼ；ＣＨＳＴ１０；ＣＫＬＦＳＦ２；ＣＫＬＦＳＦ３；ＣＫＬＦＳＦ４；ＣＫＬＦＳＦ５；ＣＫＬＦＳＦ６；ＣＫＬＦＳＦ７；ＣＫＬＦＳＦ８；ＣＬＤＮ３；ＣＬＤＮ７（クローディン−７）；ＣＬＮ３；ＣＬＵ（クラステリン）；ＣＭＫＬＲｌ；ＣＭＫＯＲｌ（ＲＤＣｌ）；ＣＮＲｌ；ＣＯＬ１８Ａ１；ＣＯＬｌＡｌ；ＣＯＬ４Ａ３；ＣＯＬ６Ａ１；ＣＲ２；ＣＲＰ；ＣＳＦｌ（Ｍ−ＣＳＦ）；ＣＳＦ２（ＧＭ−ＣＳＦ）；ＣＳＦ３（ＧＣＳＦ）；ＣＴＬＡ４；ＣＴＮＮＢｌ（ｂ−カテニン）；ＣＴＳＢ（カテプシンＢ）；ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤｌ）；ＣＸ３ＣＲ１（Ｖ２８）；ＣＸＣＬｌ（ＧＲＯｌ）；ＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０）；ＣＸＣＬＩｌ（Ｉ−ＴＡＣ／ＩＰ−９）；ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦｌ）；ＣＸＣＬ１３；ＣＸＣＬ１４；ＣＸＣＬ１６；ＣＸＣＬ２（ＧＲＯ２）；ＣＸＣＬ３（ＧＲＯ３）；ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ−７８／ＬＩＸ）；ＣＸＣＬ６（ＧＣＰ−２）；ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）；ＣＸＣＲ３（ＧＰＲ９／ＣＫＲ−Ｌ２）；ＣＸＣＲ４；ＣＸＣＲ６（ＴＹＭＳＴＲ／ＳＴＲＬ３３／Ｂｏｎｚｏ）；ＣＹＢ５；ＣＹＣｌ；ＣＹＳＬＴＲｌ；ＤＡＢ２ＩＰ；ＤＥＳ；ＤＫＦＺｐ４５１Ｊ０１１８；ＤＮＣＬｌ；ＤＰＰ４；Ｅ２Ｆ１；ＥＣＧＦｌ；ＥＤＧｌ；ＥＦＮＡｌ；ＥＦＮＡ３；ＥＦＮＢ２；ＥＧＦ；ＥＧＦＲ；ＥＬＡＣ２；ＥＮＧ；ＥＮＯ１；ＥＮＯ２；ＥＮＯ３；ＥＰＨＢ４；ＥＰＯ；ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ−２）；ＥＲＥＧ；ＥＲＫ８；ＥＳＲｌ；ＥＳＲ２；Ｆ３（ＴＦ）；ＦＡＤＤ；ＦａｓＬ；ＦＡＳＮ；ＦＣＥＲｌＡ；ＦＣＥＲ２；ＦＣＧＲ３Ａ；ＦＧＦ；ＦＧＦｌ（ａＦＧＦ）；ＦＧＦ１０；ＦＧＦ１１；ＦＧＦ１２；ＦＧＦ１２Ｂ；ＦＧＦ１３；ＦＧＦ１４；ＦＧＦ１６；ＦＧＦ１７；ＦＧＦ１８；ＦＧＦ１９；ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）；ＦＧＦ２０；ＦＧＦ２１；ＦＧＦ２２；ＦＧＦ２３；ＦＧＦ３（ｉｎｔ−２）；ＦＧＦ４（ＨＳＴ）；ＦＧＦ５；ＦＧＦ６（ＨＳＴ−２）；ＦＧＦ７（ＫＧＦ）；ＦＧＦ８；ＦＧＦ９；ＦＧＦＲ３；ＦＩＧＦ（ＶＥＧＦＤ）；ＦＥＬｌ（ＥＰＳＩＬＯＮ）；ＦＩＬｌ（ＺＥＴＡ）；ＦＬＪ１２５８４；ＦＬＪ２５５３０；ＦＬＲＴｌ（フィブロネクチン）；ＦＬＴｌ；ＦＯＳ；ＦＯＳＬｌ（ＦＲＡ−Ｉ）；ＦＹ（ＤＡＲＣ）；ＧＡＢＲＰ（ＧＡＢＡａ）；ＧＡＧＥＢｌ；ＧＡＧＥＣｌ；ＧＡＬＮＡＣ４Ｓ−６ＳＴ；ＧＡＴＡ３；ＧＤＦ５；ＧＦＩ１；ＧＧＴ１；ＧＭ−ＣＳＦ；ＧＮＡＳｌ；ＧＮＲＨｌ；ＧＰＲ２（ＣＣＲｌＯ）；ＧＰＲ３１；ＧＰＲ４４；ＧＰＲ８１（ＦＫＳＧ８０）；ＧＲＣＣｌＯ（ＣｌＯ）；ＧＲＰ；ＧＳＮ（ゲルソリン）；ＧＳＴＰｌ；ＨＡＶＣＲ２；ＨＤＡＣ４；ＨＤＡＣ５；ＨＤＡＣ７Ａ；ＨＤＡＣ９；ＨＧＦ；ＨＩＦｌＡ；ＨＤＰｌ；ヒスタミンおよびヒスタミンレセプター；ＨＬＡ−Ａ；ＨＬＡ−ＤＲＡ；ＨＭ７４；ＨＭＯＸｌ；ＨＵＭＣＹＴ２Ａ；ＩＣＥＢＥＲＧ；ＩＣＯＳＬ；ＩＤ２；ＩＦＮ−ａ；ＩＦＮＡ１；ＩＦＮＡ２；ＩＦＮＡ４；ＩＦＮＡ５；ＩＦＮＡ６；ＩＦＮＡ７；ＩＦＮＢ１；ＩＦＮガンマ；ＤＦＮＷｌ；ＩＧＢＰｌ；ＩＧＦｌ；ＩＧＦｌＲ；ＩＧＦ２；ＩＧＦＢＰ２；ＩＧＦＢＰ３；ＩＧＦＢＰ６；ＩＬ−Ｉ；ＩＬ１０；ＩＬ１０ＲＡ；ＩＬ１０ＲＢ；ＩＬ１１；ＩＬ１１ＲＡ；ＩＬ−１２；ＩＬ１２Ａ；ＩＬ１２Ｂ；ＩＬ１２ＲＢ１；ＩＬ１２ＲＢ２；ＩＬ１３；ＩＬ１３ＲＡ１；ＩＬ１３ＲＡ２；ＩＬ１４；ＩＬ１５；ＩＬ１５ＲＡ；ＩＬ１６；ＩＬ１７；ＩＬ１７Ｂ；ＩＬ１７Ｃ；ＩＬ１７Ｒ；ＩＬ１８；ＩＬ１８ＢＰ；ＩＬ１８Ｒ１；ＩＬ１８ＲＡＰ；ＩＬ１９；ＩＬ１Ａ；ＩＬ１Ｂ；ＩＬｌＦ１０；ＩＬ１Ｆ５；ＩＬ１Ｆ６；ＩＬ１Ｆ７；ＩＬ１Ｆ８；ＩＬ１Ｆ９；ＩＬ１ＨＹｌ；ＩＬ１Ｒｌ；ＩＬ１Ｒ２；ＩＬ１ＲＡＰ；ＩＬ１ＲＡＰＬ１；ＩＬ１ＲＡＰＬ２；ＩＬ１ＲＬ１；ＩＬ１ＲＬ２（ＩＬｌＲＮ）；ＩＬ２；ＩＬ２０；ＩＬ２０ＲＡ；ＩＬ２１Ｒ；ＩＬ２２；ＩＬ２２Ｒ；ＩＬ２２ＲＡ２；ＩＬ２３；ＩＬ２４；ＩＬ２５；ＩＬ２６；ＩＬ２７；ＩＬ２８Ａ；ＩＬ２８Ｂ；ＩＬ２９；ＩＬ２ＲＡ；ＩＬ２ＲＢ；ＩＬ２ＲＧ；ＩＬ３；ＩＬ３０；ＩＬ３ＲＡ；ＩＬ４；ＩＬ４Ｒ；ＩＬ５；ＩＬ５ＲＡ；ＩＬ６；ＩＬ６Ｒ；ＩＬ６ＳＴ（糖タンパク質１３０）；ＥＬ７；ＥＬ７Ｒ；ＥＬ８；ＩＬ８ＲＡ；ＤＬ８ＲＢ；ＩＬ８ＲＢ；ＤＬ９；ＤＬ９Ｒ；ＤＬＫ；ＩＮＨＡ；ＩＮＨＢＡ；ＩＮＳＬ３；ＩＮＳＬ４；ＩＲＡＫＩ；ＥＲＡＫ２；ＩＴＧＡｌ；ＩＴＧＡ２；ＩＴＧＡ３；ＩＴＧＡ６（ａ６インテグリン）；ＩＴＧＡＶ；ＩＴＧＢ３；ＩＴＧＢ４（ｂ４インテグリン）；ＪＡＧｌ；ＪＡＫｌ；ＪＡＫ３；ＪＵＮ；Ｋ６ＨＦ；ＫＡＩｌ；ＫＤＲ；ＫＩＴＬＧ；ＫＬＦ５（ＧＣボックスＢＰ）；ＫＬＦ６；ＫＬＫｌＯ；ＫＬＫ１２；ＫＬＫ１３；ＫＬＫ１４；ＫＬＫ１５；ＫＬＫ３；ＫＬＫ４；ＫＬＫ５；ＫＬＫ６；ＫＬＫ９；ＫＲＴ１；ＫＲＴ１９（ケラチン１９）；ＫＲＴ２Ａ；ＫＨＴＨＢ６（毛特異的タイプＨケラチン）；ＬＡＭＡＳ；ＬＥＰ（レプチン）；Ｌｉｎｇｏ−ｐ７５；Ｌｉｎｇｏ−Ｔｒｏｙ；ＬＰＳ；ＬＴＡ（ＴＮＦ−ｂ）；ＬＴＢ；ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）；ＬＴＢ４Ｒ２；ＬＴＢＲ；ＭＡＣＭＡＲＣＫＳ；ＭＡＧ又はＯｍｇｐ；ＭＡＰ２Ｋ７（ｃ−Ｊｕｎ）；ＭＤＫ；ＭＩＢｌ；ミッドカイン；ＭＥＦ；ＭＩＰ−２；ＭＫＩ６７；（Ｋｉ−６７）；ＭＭＰ２；ＭＭＰ９；ＭＳ４Ａ１；ＭＳＭＢ；ＭＴ３（メタロチオネクチン−ＩＩＩ）；ＭＴＳＳｌ；ＭＵＣｌ（ムチン）；ＭＹＣ；ＭＹＤ８８；ＮＣＫ２；ニューロカン；ＮＦＫＢｌ；ＮＦＫＢ２；ＮＧＦＢ（ＮＧＦ）；ＮＧＦＲ；ＮｇＲ−Ｌｉｎｇｏ；ＮｇＲ−Ｎｏｇｏ６６（Ｎｏｇｏ）；ＮｇＲ−ｐ７５；ＮｇＲ−トロイ；ＮＭＥｌ（ＮＭ２３Ａ）；Ｎ０Ｘ５；ＮＰＰＢ；ＮＲＯＢｌ；ＮＲ０Ｂ２；ＮＲｌＤｌ；ＮＲ１Ｄ２；ＮＲ１Ｈ２；ＮＲ１Ｈ３；ＮＲ１Ｈ４；ＮＲ１Ｉ２；ＮＲ１Ｉ３；ＮＲ２Ｃ１；ＮＲ２Ｃ２；ＮＲ２Ｅ１；ＮＲ２Ｅ３；ＮＲ２Ｆ１；ＮＲ２Ｆ２；ＮＲ２Ｆ６；ＮＲ３Ｃ１；ＮＲ３Ｃ２；ＮＲ４Ａ１；ＮＲ４Ａ２；ＮＲ４Ａ３；ＮＲ５Ａ１；ＮＲ５Ａ２；ＮＲ６Ａ１；ＮＲＰｌ；ＮＲＰ２；ＮＴ５Ｅ；ＮＴＮ４；ＯＤＺｌ；ＯＰＲＤｌ；Ｐ２ＲＸ７；ＰＡＰ；ＰＡＲＴｌ；ＰＡＴＥ；ＰＡＷＲ；ＰＣＡ３；ＰＣＮＡ；ＰＤＧＦＡ；ＰＤＧＦＢ；ＰＥＣＡＭｌ；ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）；ＰＧＦ；ＰＧＲ；ホスファカン；ＰＩＡＳ２；ＰＩＫ３ＣＧ；ＰＬＡＵ（ｕＰＡ）；ＰＬＧ；ＰＬＸＤＣｌ；ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）；ＰＰＩＤ；ＰＲｌ；ＰＲＫＣＱ；ＰＲＫＤｌ；ＰＲＬ；ＰＲＯＣ；ＰＲＯＫ２；ＰＳＡＰ；ＰＳＣＡ；ＰＴＡＦＲ；ＰＴＥＮ；ＰＴＧＳ２（ＣＯＸ−２）；ＰＴＮ；ＲＡＣ２（ｐ２１Ｒａｃ２）；ＲＡＲＢ；ＲＧＳｌ；ＲＧＳ１３；ＲＧＳ３；ＲＮＦＩｌＯ（ＺＮＦ１４４）；ＲＯＢＯ２；Ｓ１００Ａ２；ＳＣＧＢ１Ｄ２（リポフィリンＢ）；ＳＣＧＢ２Ａ１（マンマグロビン２）；ＳＣＧＢ２Ａ２（マンマグロビン１）；ＳＣＹＥｌ（内皮性単球活性化サイトカイン）；ＳＤＦ２；ＳＥＲＰＩＮＡｌ；ＳＥＲＰＩＮＡ３；ＳＥＲＰ１ＮＢ５（マスピン）；ＳＥＲＰＩＮＥｌ（ＰＡＩ−Ｉ）；ＳＥＲＰＤＭＦ１；ＳＨＢＧ；ＳＬＡ２；ＳＬＣ２Ａ２；ＳＬＣ３３Ａ１；ＳＬＣ４３Ａ１；ＳＬＩＴ２；ＳＰＰｌ；ＳＰＲＲｌＢ（Ｓｐｒｌ）；ＳＴ６ＧＡＬ１；ＳＴＡＢｌ；ＳＴＡＴ６；ＳＴＥＡＰ；ＳＴＥＡＰ２；ＴＢ４Ｒ２；ＴＢＸ２１；ＴＣＰｌＯ；ＴＤＧＦｌ；ＴＥＫ；ＴＧＦＡ；ＴＧＦＢｌ；ＴＧＦＢｌＩｌ；ＴＧＦＢ２；ＴＧＦＢ３；ＴＧＦＢＩ；ＴＧＦＢＲｌ；ＴＧＦＢＲ２；ＴＧＦＢＲ３；ＴＨｌＬ；ＴＨＢＳｌ（トロンボスポンジン−１）；ＴＨＢＳ２；ＴＨＢＳ４；ＴＨＰＯ；ＴＩＥ（Ｔｉｅ−１）；ＴＭＰ３；組織因子；ＴＬＲｌＯ；ＴＬＲ２；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＴＬＲ５；ＴＬＲ６；ＴＬＲ７；ＴＬＲ８；ＴＬＲ９；ＴＮＦ；ＴＮＦ−ａ；ＴＮＦＡＥＰ２（Ｂ９４）；ＴＮＦＡＩＰ３；ＴＮＦＲＳＦＩｌＡ；ＴＮＦＲＳＦｌＡ；ＴＮＦＲＳＦｌＢ；ＴＮＦＲＳＦ２１；ＴＮＦＲＳＦ５；ＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ）；ＴＮＦＲＳＦ７；ＴＮＦＲＳＦ８；ＴＮＦＲＳＦ９；ＴＮＦＳＦｌＯ（ＴＲＡＩＬ）；ＴＮＦＳＦｌ １（ＴＲＡＮＣＥ）；ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰＯ３Ｌ）；ＴＮＦＳＦ１３（Ａｐｒｉｌ）；ＴＮＦＳＦ１３Ｂ；ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ−Ｌ）；ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）；ＴＮＦＳＦ１８；ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド）；ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）；ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）；ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）；ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０リガンド）；ＴＮＦＳＦ９（４−１ＢＢリガンド）；ＴＯＬＬＩＰ；Ｔｏｌｌ様レセプター；ＴＯＰ２Ａ（トポイソメラーゼＥａ）；ＴＰ５３；ＴＰＭｌ；ＴＰＭ２；ＴＲＡＤＤ；ＴＲＡＦｌ；ＴＲＡＦ２；ＴＲＡＦ３；ＴＲＡＦ４；ＴＲＡＦ５；ＴＲＡＦ６；ＴＲＥＭｌ；ＴＲＥＭ２；ＴＲＰＣ６；ＴＳＬＰ；ＴＷＥＡＫ；ＶＥＧＦ；ＶＥＧＦＢ；ＶＥＧＦＣ；バーシカン；ＶＨＬ Ｃ５；ＶＬＡ−４；ＸＣＬｌ（リンホタクチン）；ＸＣＬ２（ＳＣＭ−Ｉｂ）；ＸＣＲｌ（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲｌ）；ＹＹｌ；およびＺＦＰＭ２からなる群から選択される一又は複数の標的を結
合することができる。

本発明に包含される抗体に対する好適な分子標的分子には、ＣＤタンパク質、例えばＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４；ＣＤ６４、ＥＧＦレセプター、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４レセプターのようなＥｒｂＢレセプターファミリのＣＤ２００メンバー；細胞接着分子、例えばＬＦＡ−１、Ｍａｃ１、ｐ１５０．９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ、α４／β７インテグリン、およびそのαまたはβサブユニットを含むαｖ／β３インテグリン（例えば抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８又は抗ＣＤ１１ｂ抗体）；増殖因子、例えばＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃ；組織因子（ＴＦ）；αインターフェロン（αＩＦＮ）；ＴＮＦα、インターロイキン、例としてＩＬ−１β、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ１７Ａ／Ｆ、ＩＬ−１８、ＩＬ−１３Ｒα１、ＩＬ１３Ｒα２、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−５Ｒ、ＩＬ−９Ｒ、ＩｇＥ；血液群抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３レセプター；肥満（ＯＢ）レセプター；ｍｐｌレセプター；ＣＴＬＡ−４；ＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＫ、ＲＳＶ Ｆタンパク質、プロテインＣなどが含まれる。

一実施態様において、本発明おヘテロ多量体タンパク質は低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質の（ＬＲＰ）−１又はＬＲＰ−８、又はトランスフェリンレセプター、及び、１）β−セクレターゼ（ＢＡＣＥ１またはＢＡＣＥ２）、２）α−セクレターゼ、３）γ−セクレターゼ、４）τ−セクレターゼ、５）アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、６）デスレセプター６（ＤＲ６）、７）アミロイドβペプチド、８）α−シヌクレイン、９）パーキン、１０）ハンチンチン、１１）ｐ７５ ＮＴＲ、および１２）カスパーゼ６からなる群から選択される少なくとも一の標的に結合する。

一実施態様では、本発明のヘテロ多量体複合体は、ＩＬ−ｌαおよびＩＬ−ｌβ、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８；ＩＬ−１３およびＩＬ−９；ＩＬ−１３およびＩＬ−４；ＩＬ−１３およびＩＬ−５；ＩＬ−５およびＩＬ−４；ＩＬ−１３およびＩＬ−１β；ＩＬ−１３およびＩＬ−２５；ＩＬ−１３およびＴＡＲＣ；ＩＬ−１３およびＭＤＣ；ＩＬ−１３およびＭＥＦ；ＩＬ−１３およびＴＧＦ−β；ＩＬ−１３およびＬＨＲアゴニスト；ＩＬ−１２およびＴＷＥＡＫ、ＩＬ−１３およびＣＬ２５；ＩＬ−１３およびＳＰＲＲ２ａ；ＩＬ−１３およびＳＰＲＲ２ｂ；ＩＬ−１３およびＡＤＡＭ８、ＩＬ−１３およびＰＥＤ２、ＩＬ１７ＡおよびＩＬ１７Ｆ、ＣＤ３およびＣＤ１９、ＣＤ１３８およびＣＤ２０；ＣＤ１３８およびＣＤ４０；ＣＤ１９およびＣＤ２０；ＣＤ２０およびＣＤ３；ＣＤ３８およびＣＤ１３８；ＣＤ３８およびＣＤ２０；ＣＤ３８およびＣＤ４０；ＣＤ４０およびＣＤ２０；ＣＤ−８およびＩＬ−６；ＣＤ２０およびＢＲ３、ＴＮＦαおよびＴＧＦ−β、ＴＮＦαおよびＩＬ−１β；ＴＮＦαおよびＩＬ−２、ＴＮＦαおよびＩＬ−３、ＴＮＦαおよびＩＬ−４、ＴＮＦαおよびＩＬ−５、ＴＮＦαおよびＩＬ６、ＴＮＦαおよびＩＬ８、ＴＮＦαおよびＩＬ−９、ＴＮＦαおよびＩＬ−１０、ＴＮＦαおよびＩＬ−１１、ＴＮＦαおよびＩＬ−１２、ＴＮＦαおよびＩＬ−１３、ＴＮＦαおよびＩＬ−１４、ＴＮＦαおよびＩＬ−１５、ＴＮＦαおよびＩＬ−１６、ＴＮＦαおよびＩＬ−１７、ＴＮＦαおよびＩＬ−１８、ＴＮＦαおよびＩＬ−１９、ＴＮＦαおよびＩＬ−２０、ＴＮＦαおよびＩＬ−２３、ＴＮＦαおよびＩＦＮα、ＴＮＦαおよびＣＤ４、ＴＮＦαおよびＶＥＧＦ、ＴＮＦαおよびＭＩＦ、ＴＮＦαおよびＩＣＡＭ−１、ＴＮＦαおよびＰＧＥ４、ＴＮＦαおよびＰＥＧ２、ＴＮＦαおよびＲＡＮＫリガンド、ＴＮＦαおよびＴｅ３８；ＴＮＦαおよびＢＡＦＦ；ＴＮＦαおよびＣＤ２２；ＴＮＦαおよびＣＴＬＡ−４；ＴＮＦαおよびＧＰ１３０；ＴＮＦαおよびＩＬ−１２ｐ４０；ＶＥＧＦおよびＨＥＲ２、ＶＥＧＦ−ＡおよびＨＥＲ２、ＶＥＧＦ−ＡおよびＰＤＧＦ、ＨＥＲ１およびＨＥＲ２、ＶＥＧＦ−ＡおよびＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄ、ＨＥＲ２およびＤＲ５、ＶＥＧＦおよびＩＬ−８、ＶＥＧＦおよびＭＥＴ、ＶＥＧＦＲおよびＭＥＴレセプター、ＶＥＧＦＲおよびＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＣＤ６４、ＨＥＲ２およびＣＤ３、ＨＥＲ２およびＣＤ１６、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３；ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）およびＨＥＲ２、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ４、ＩＬ−１３およびＣＤ４０Ｌ、ＩＬ４およびＣＤ４０Ｌ、ＴＮＦＲ１およびＩＬ−１Ｒ、ＴＮＦＲ１およびＩＬ−６ＲおよびＴＮＦＲ１およびＩＬ−１８Ｒ、ＥｐＣＡＭおよびＣＤ３、ＭＡＰＧおよびＣＤ２８、ＥＧＦＲおよびＣＤ６４、ＣＳＰＧｓおよびＲＧＭ Ａ；ＣＴＬＡ−４およびＢＴＮＯ２；ＩＧＦ１およびＩＧＦ２；ＩＧＦ１／２およびＥｒｂ２Ｂ；ＭＡＧおよびＲＧＭ Ａ；ＮｇＲおよびＲＧＭ Ａ；ＮｏｇｏＡおよびＲＧＭ Ａ；ＯＭＧｐおよびＲＧＭ Ａ；ＰＤＬ−ＩおよびＣＴＬＡ−４；そして、ＲＧＭ ＡおよびＲＧＭ Ｂからなる群から選択される少なくとも２の標的分子に結合する。

場合によって、他の分子にコンジュゲートした可溶性抗原ないしその断片は、抗原を生成するための免疫原として用いられうる。膜貫通分子、例えばレセプター、これらの断片（例えばレセプターの細胞外ドメイン）が免疫原として使われてよい。あるいは、膜貫通分子を発現する細胞が免疫原として使われてよい。このような細胞は、天然の供与源（例えば癌細胞株）から得られてもよいし、膜貫通分子を発現するように組換え技術によって形質移入された細胞であってもよい。抗体を調製するために有用な他の抗原およびその形態は、当業者には明らかであろう。

ＶＩ．活性のアッセイ
本発明のヘテロ多量体タンパク質は、当該分野で公知の種々のアッセイにより、それらの物理的／化学的性質及び生物学的機能について特徴づけることができる。

精製されたヘテロ多量体タンパク質は、限定されないが、Ｎ末端配列決定、アミノ酸分析、非変性サイズ排除高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析法、イオン交換クロマトグラフィー及びパパイン消化を含む、一連のアッセイによって更に特徴づけることができる。

本発明の所定の実施態様において、本明細書にて産生された生産免疫グロブリンは、その生物学的活性について分析される。幾つかの実施態様において、本発明の免疫グロブリンはその抗原結合活性について試験される。当技術分野で知られており、本明細書で使用することができる抗原結合アッセイとしては、限定されないが、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光イムノアッセイ、及びプロテインＡイムノアッセイなどの技術を使用する任意の直接的又競合的結合アッセイを含む。例示的な抗原結合アッセイは、実施例の項で以下に提供される。

一実施態様において、本発明は、インビボにおける抗体の半減期が重要であるが、ある種のエフェクター機能（例えば補体およびＡＤＣＣなど）が不要または有害である多くの用途のための望ましい候補とならしめる、全てではないが一部のエフェクター機能を有する改変抗体を意図している。所定の実施態様において、所望の特性だけが維持されていることを確実にするために、生成されたヘテロ多量体タンパク質のＦｃ活性が測定される。インビトロ及び／又はインビボでの細胞毒性アッセイを、ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認するために行うことができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイは、ヘテロ多量体タンパク質がＦｃγＲ結合を欠くが（それゆえ、おそらくＡＤＣＣ活性を欠くが）、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確認するために行うことができる。ＡＤＣＣ、ＮＫ細胞を媒介する初代細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲの発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）の４６４ページの表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロでのアッセイの一例が、米国特許第５，５００，３６２号又は米国特許第５，８２１，３３７号に記載されている。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、またはさらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６ （１９９８）に開示されるように、インビボで、例えば動物モデルにおいて評価することができるＣ１ｑ結合アッセイはまた、抗体が体Ｃ１ｑを結合することができないこと、したがって、ＣＤＣ活性を欠いていることを確認するために行うことができる。補体活性を評価するために、ＣＤＣアッセイが、例えばＧａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）に記載されるように実施することができる。ＦｃＲｎ結合、及びインビボでのクリアランス／半減期の測定はまた、当該分野で公知の方法を用いて行うことができる。

ＶＩＩ．コンジュゲートタンパク質
また、本発明は、本明細書中に記載のヘテロ多量体タンパク質（例えば本明細書において記述される方法に従って作製される抗体）の何れかを含む、コンジュゲート抗体又はイムノコンジュゲート（例えば「抗体−薬剤コンジュゲート」又は「ＡＤＣ）といったコンジュゲートされたタンパク質であって、このとき軽鎖または重鎖の定常領域のうちの一つが、色素又は細胞障害性剤、例えば化学療法剤、薬剤、増殖阻害性剤、毒素（例えば細菌、真菌、植物又は動物の起源の酵素的に活性な毒素ないしその断片）又は放射性同位体（すなわち放射性コンジュゲート）のような化学的分子にコンジュゲートしている、コンジュゲートされたタンパク質を提供する。特に、本明細書に記述されるように、ヘテロ多量体化ドメインの使用により２の異なる重鎖（ＨＣ１およびＨＣ２）並びに２の異なる軽鎖（ＬＣ１およびＬＣ２）を含有する抗体の構築が可能となる。本明細書に記述される方法を用いて構築されるイムノコンジュゲートは、重鎖のうちの一つ（ＨＣ１又はＨＣ２）又は軽鎖のうちの一つ（ＬＣ１又はＬＣ２）の定常領域にコンジュゲートした細胞障害性剤を含有してよい。また、イムノコンジュゲートがただ一つの重鎖または軽鎖に接着した細胞障害性剤を有しうるので、被検体に投与される細胞障害性剤の量は、重鎖と軽鎖の両方に接着した細胞障害性剤を有する抗体の投与と比較して低い。被検体に投与される細胞障害性剤の量を減らすことは、細胞障害性剤と関係する副作用を制限する。

細胞障害性又は細胞分裂停止性の薬剤、すなわち癌治療における腫瘍細胞を死滅させる又は阻害するための薬剤の局所的送達に抗体−薬剤コンジュゲートを用いることは（Ｓｙｒｉｇｏｓ及びＥｐｅｎｅｔｏｓ（１９９９）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９：６０５−６１４；Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ−Ｄｕｖａｚ ａｎｄ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９９７）Ａｄｖ．Ｄｒｇ Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．２６：１５１−１７２；米国特許第４９７５２７８号）、腫瘍への薬剤成分の標的送達及びそこでの細胞内集積を可能とし、これらの非コンジュゲート薬物剤の全身性投与により正常細胞並びに除去しようとする腫瘍細胞への毒性が容認できないレベルとなりうる（Ｂａｌｄｗｉｎ等，（１９８６）Ｌａｎｃｅｔｐｐ．（１９８６年３月１５日）：６０３−０５；Ｔｈｏｒｐｅ，（１９８５）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ，」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａ．Ｐｉｎｃｈｅｒａら．（ｅｄ．ｓ），頁４７５−５０６）。これによって、最小限の毒性で最大限の効果を求める。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体はこの方策に有用であるとして報告されている（Ｒｏｗｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２１：１８３−１８７（１９８６））。この方法に用いる薬物には、ダウノマイシン、ドキソルビジン、メトトレキサート及びビンデジンが含まれる（Ｒｏｗｌａｎｄ等，（１９８６）、上掲）。抗体−毒素コンジュゲートに用いる毒素には、ジフテリア毒素などの細菌性毒素、ゲルダナマイシン（Ｍａｎｄｌｅｒら（２０００）Ｊｏｕｒ． ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９２（１９）：１５７３−１５８１；Ｍａｎｄｌｅｒら（２０００）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １０：１０２５−１０２８；Ｍａｎｄｌｅｒら（２００２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１３：７８６−７９１）、メイタンシノイド（欧州特許第１３９１２１３号；Ｌｉｕ等，（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：８６１８−８６２３）、及びカリケアマイシン（Ｌｏｄｅ等，（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：２９２８；Ｈｉｎｍａｎ等，（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３３３６−３３４２）などのリシン、小分子毒素などの植物毒が含まれる。該毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合又はトポイソメラーゼ阻害を含む機能によりその細胞障害性及び細胞分裂停止性の効果に影響しうる。ある種の細胞障害性剤は、大きな抗体又はタンパク質レセプターリガンドにコンジュゲートした場合に、不活性又は活性が低減する傾向がある。

免疫複合体（イムノコンジュゲート）の生成に有用な化学治療薬を本明細書中（例えば、上記）に記載した。使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖（シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、アルファ−サルシン（ｓａｒｃｉｎ）、アレウライツ・フォルディイ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）プロテイン、ジアンシン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）プロテイン（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・キャランティア（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）インヒビター、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン、サパオナリア（ｓａｐａｏｎａｒｉａ）オフィシナリスインヒビター、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、マイトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）が含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日公開の国際公開第９３／２１２３２号を参照のこと。放射性コンジュゲート抗体の生成には、様々な放射性ヌクレオチドが利用可能である。例としては、^２１２Ｂｉ、^１３１Ｉ、^１３１Ｉｎ、^９０Ｙ及び^１８６Ｒｅが含まれる。抗体及び細胞障害性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン２，６−ジイソシアネート等）、及びビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン等）を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されているように調製することができる。カーボン−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号参照。

抗体のコンジュゲートと一又は複数の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、アウロスタチン、トリコセン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｎｅ）及びＣＣ１０６５、及び毒性活性を有するこれらの毒素の誘導体が、ここで考察される。

ｉ．メイタンシン及びメイタンシノイド
幾つかの実施態様では、イムノコンジュゲートは一又は複数のメイタンシノイド分子と結合している本発明の抗体（完全長又は断片）を含んでなる。

メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブＭａｙｔｅｎｕｓ ｓｅｒｒａｔａから単離されたものである（米国特許第３８９６１１１号）。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びＣ−３メイタンシノールエステルを生成することが発見された（米国特許第４１５１０４２号）。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第４１３７２３０号；同４２４８８７０号；同４２５６７４６号；同４２６０６０８号；同４２６５８１４号；同４２９４７５７号；同４３０７０１６号；同４３０８２６８号；同４３０８２６９号；同４３０９４２８号；同４３１３９４６号；同４３１５９２９号；同４３１７８２１号；同４３２２３４８号；同４３３１５９８号；同４３６１６５０号；同４３６４８６６号；同４４２４２１９号；同４４５０２５４号；同４３６２６６３号；及び同４３７１５３３号に開示されている。

メイタンシノイド薬剤成分は、（ｉ）発酵又は化学修飾、発酵産物の誘導体化によって調製するために相対的に利用可能である（ｉｉ）抗体に対する非ジスルフィドリンカーによる共役に好適な官能基による誘導体化に従う、（ｉｉｉ）血漿中で安定、そして（ｉｖ）様々な腫瘍細胞株に対して有効であるため、抗体薬剤コンジュゲートの魅力的な薬剤成分である。

メイタンシノイドを含有するイムノコンジュゲート、その作製方法及びそれらの治療用途は、例えば米国特許第５２０８０２０号、同５４１６０６４号、欧州特許第０４２５２３５ Ｂ１号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。Ｌｉｕ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：８６１８−８６２３（１９９６）には、ヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合するＤＭ１と命名されたメイタンシノイドを含有するイムノコンジュゲートが記載されている。前記コンジュゲートは培養された結腸癌細胞に対して高い細胞障害性を有することが見出されており、インビボ腫瘍成長アッセイにおいて抗腫瘍活性を示す。Ｃｈａｒｉ等，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５２：１２７−１３１（１９９２）には、メイタンシノイドが、ジスルフィド結合を介して、ヒト結腸癌株化細胞の抗原に結合するマウス抗体Ａ７、又はＨＥＲ−２／ｎｅｕオンコジーンに結合する他のマウスモノクローナル抗体ＴＡ．１に結合しているイムノコンジュゲートが記載されている。ＴＡ．１−メイタンシノイドコンジュゲートの細胞障害性はヒト乳癌株化細胞ＳＫ−ＢＲ−３におけるインビトロで試験され、細胞当たり３×１０^５ＨＥＲ−２表面抗原が発現した。薬剤コンジュゲートにより、遊離のメイタンシノイド剤に類似した細胞障害度が達成され、該細胞障害度は、抗体分子当たりのメイタンシノイド分子の数を増加させることにより増加する。Ａ７−メイタンシノイドコンジュゲートはマウスにおいては低い全身性細胞障害性を示した。

抗体−メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体又はメイタンシノイド分子のいずれの生物学的活性もほとんど低減することなく、メイタンシノイド分子に抗体を化学的に結合させることにより調製される。例えば、米国特許第５２０８０２０号（この開示内容は出典明記により特別に組み込まれる）を参照。１分子の毒素／抗体は、裸抗体の使用において細胞障害性を高めることが予期されているが、抗体分子当たり、平均３−４のメイタンシノイド分子が結合したものは、抗体の機能又は溶解性に悪影響を与えることなく、標的細胞に対する細胞障害性を向上させるといった効力を示す。メイタンシノイドは当該技術分野でよく知られており、公知の技術で合成することも、天然源から単離することもできる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第５２０８０２０号、及び他の特許、及び上述した特許ではない刊行物に開示されている。好ましいメイタンシノイドは、メイタンシノール、及び種々のメイタンシノールエステル等の、メイタンシノール分子の芳香環又は他の位置が修飾されたメイタンシノール類似体である。

例えば、米国特許第５２０８０２０号又は欧州特許第０４２５２３５ Ｂ１号、Ｃｈａｒｉ等，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５２：１２７−１３１（１９９２）、及び米国特許出願公開２００５／０１６９９３３号（これらの開示内容は出典明記により特別に組み込まれる）に開示されているもの等を含め、抗体−メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。リンカー成分ＳＭＣＣを含んでなる抗体−メイタンシノイドコンジュゲートは、米国特許出願公開２００５／０１６９９３３に開示されるように調製されうる。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれるが、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。更なる結合基を本願明細書中に記載し、例示する。

抗体とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ）、活性エステル類（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド類（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン−２，６−ジイソシアネート）、及び二活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して作製することができる。特に好ましいカップリング剤には、ジスルフィド結合を提供するＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルチオ）ペンタノアート（ＳＰＰ）及びＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）（Ｃａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７３：７２３−７３７（１９７８））が含まれる。

リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するＣ−３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ−１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ−２０位で生じる。好ましい実施形態において、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のＣ−３位で形成される。

ｉｉ．アウリスタチン類及びドラスタチン類
幾つかの実施態様では、イムノコンジュゲートは、ドラスタチン又はドロスタチンペプチジル類似体及び誘導体、アウリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）（米国特許第５６３５４８３号；同第５７８０５８８号）にコンジュゲートした本発明の抗体を含んでなる。ドラスタチン及びアウリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解及び核と細胞の分割を妨げ（Ｗｏｙｋｅ等（２００１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５（１２）：３５８０−３５８４）、抗癌活性（米国特許第５６６３１４９号）及び抗真菌性活性（Ｐｅｔｔｉｔ等（１９９８）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２：２９６１−２９６５）を有することが示されている。ドラスタチン又はアウリスタチン薬剤成分は、ペプチジル薬剤分子のＮ（アミノ）末端又はＣ（カルボキシル）末端により抗体に接着しうる（国際公開公報０２／０８８１７２）。

例示的なアウリスタチンの実施態様は、Ｎ末端連結モノメチルアウリスタチン薬剤成分ＤＥ及びＤＦを含み、”Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌｖａｌｉｎｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ Ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｔｏ Ｌｉｇａｎｄｓ”，米国出願公開２００５／０２３８６４９号に開示され、その開示内容は出典明記によってその全体が明示的に組み込まれる。

典型的には、ペプチドベースの薬剤成分は、２以上のアミノ酸及び／又はペプチド断片間でペプチド結合を形成することによって調製されうる。このようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野において周知の液相合成方法に従って調製することができる（Ｅ．Ｓｃｈｒｏｄｅｒ ａｎｄ Ｋ．Ｌｕｂｋｅ，”Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，１巻，頁７６−１３６，１９６５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓを参照）。アウリスタチン／ドラスタチン薬剤成分は、米国特許第５６３５４８３号；同第５７８０５８８号；Ｐｅｔｔｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．４４：４８２−４８５（１９８１）；Ｐｅｔｔｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ １３：４７−６６（１９９８）；Ｐｏｎｃｅｔ，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．５：１３９−１６２（１９９９）；およびＰｅｔｔｉｔ，Ｆｏｒｔｓｃｈｒ．Ｃｈｅｍ．Ｏｒｇ．Ｎａｔｕｒｓｔ．７０：１−７９（１９９７）の方法に従って調製されうる。また、Ｄｏｒｏｎｉｎａ（２００３）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２１（７）：７７８−７８４；および”Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌｖａｌｉｎｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ Ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｔｏ Ｌｉｇａｎｄｓ” 米国出願公開２００５０２３８６４９も参照のこと。これらは出典明記によってその全体が本願明細書中に組み込まれる（例えば、リンカー及びモノメチルバリン化合物、例えばＭＭＡＥ及びリンカーにコンジュゲートしたＭＭＡＦの調整方法を開示している）。

ｉｉｉ．カリケアマイシン
他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、一又は複数のカリケアマイシン分子と結合した本発明の抗体を含んでなる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ−ピコモルの濃度で二重鎖ＤＮＡ破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第５７１２３７４号、同５７１４５８６号、同５７３９１１６号、同５７６７２８５号、同５７７０７０１号、同５７７０７１０号、同５７７３００１号、同５８７７２９６号（全て、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ_１ ^Ｉ、α_２ ^Ｉ、α_３ ^Ｉ、Ｎ−アセチル−γ_１ ^Ｉ、ＰＳＡＧ及びθ^Ｉ _１（Ｈｉｎｍａｎ等，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３：３３３６−３３４２（１９９３）、Ｌｏｄｅ等 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５８：２９２５−２９２８（１９９８）及び上述したＡｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄの米国特許）が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは双方共、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。

ｉｖ．他の細胞傷害性薬物
本発明の抗体またはここに記載の方法に従って作製された抗体と結合可能な他の抗腫瘍剤には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び５−フルオロウラシル、米国特許第５０５３３９４号、同５７７０７１０号に記載されており、集合的にＬＬ−Ｅ３３２８８複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎｅ）（米国特許第５８７７２９６号）が含まれる。

使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖（シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、アルファ−サルシン（ｓａｒｃｉｎ）、アレウライツ・フォルディイ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）プロテイン、ジアンシン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）プロテイン（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・キャランティア（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）インヒビター、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン、サパオナリア（ｓａｐａｏｎａｒｉａ）オフィシナリスインヒビター、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、マイトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）が含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日公開の国際公開第９３／２１２３２号を参照のこと。

本発明は、抗体と核酸分解活性を有する化合物（例えばリボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮアーゼ）との間に形成されるイムノコンジュゲートを更に熟考する。

腫瘍を選択的に破壊するため、抗体は高い放射性原子を含有してよい。様々な放射性同位体が放射性コンジュゲート抗体の生産のために入手可能である。例としては、Ａｔ^２１１，Ｉ^１３１，Ｉ^１２５，Ｙ^９０，Ｒｅ^１８６，Ｒｅ^１８８，Ｓｍ^１５３，Ｂｉ^２１２，Ｐ^３２，Ｐｂ^２１２ 及びＬｕの放射性同位体を含む。コンジュゲートが検出に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ^９９ｍ又はＩ^１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）映像（磁気共鳴映像、ｍｒｉとしても公知）用のスピン標識、例えばヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。

放射−又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素−１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばｔｃ^９９ｍ又はＩ^１２３、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８及びＩｎ^１１１は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム−９０はリジン残基を介して結合可能である。ＩＯＤＯＧＥＮ法（Ｆｒａｋｅｒ等（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．８０：４９−５７）は、ヨウ素−１２３の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ」（Ｃｈａｔａｌ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９８９）に記載されている。

抗体と細胞障害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ）、活性エステル類（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド類（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン−２，６−ジイソシアネート）、及び二活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されているように調製することができる。カーボン−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号参照。リンカーは細胞中の細胞障害剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る（Ｃｈａｒｉ等，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５２：１２７−１３１（１９９２）；米国特許第５２０８０２０号）。

本発明の化合物は、限定するものではないが、架橋剤：市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，Ｕ．Ｓ．Ａより）ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−（４−ビニルスルホン）安息香酸塩）にて調製したＡＤＣが特に考えられる。Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ａｎｄ Ｃａｔａｌｏｇ ２００３−２００４の４６７−４９８頁を参照。

ｖ．コンジュゲート抗体の調製
本発明のコンジュゲート抗体において、抗体を、場合によってリンカーを介して、一つ以上の薬剤部分（例えば薬剤部分）、例えば抗体につき約１〜約２０の部分にコンジュゲートする。コンジュゲート抗体はいくつかの手段、当業者に公知の有機化学反応、状態及び試薬を用いて調製されうる：（１）共有結合による二価のリンカー試薬と抗体の求核基との反応の後に対象の部分と反応；及び（２）共有結合による二価のリンカー試薬と部分の求核基との反応の後に抗体の求核基との反応、が含まれる。コンジュゲート抗体を調製するための更なる方法は本願明細書中に記載される。

リンカー試薬は、一つ以上のリンカー成分から成ってもよい。例示的なリンカー成分は、６−マレイミドカプロイル（「ＭＣ」）、マレイミドプロパノイル（「ＭＰ」）、バリン−シトルリン（「ｖａｌ−ｃｉｔ」）、アラニン−フェニルアラニン（「ａｌａ−ｐｈｅ」）、ｐ−アミノベンジルオキシカルボンイル（「ＰＡＢ」）、Ｎ−スクシンイミジル４（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（「ＳＰＰ」）、Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１カルボキシレート（「ＳＭＣＣ」）、及びＮ−スクシンイミジル（４−イオド−アセチル）アミノ安息香酸エステル（「ＳＩＡＢ」）を含む。更なるリンカー成分は当分野で公知であり、そのいくつかは本願明細書において記述される。また、”Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌｖａｌｉｎｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ Ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｔｏ Ｌｉｇａｎｄｓ”、米国出願公開２００５／０２３８６４９を参照。その内容は出典明記により本願明細書に組み込まれる。

幾つかの実施態様では、リンカーはアミノ酸残基を含みうる。例示的なアミノ酸リンカー成分には、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド又はペンタペプチドなどがある。例示的なジペプチドは、バリン−シトルリン（ｖｃ又はｖａｌ−ｃｉｔ）、アラニン−フェニルアラニン（ａｆ又はａｌａ−ｐｈｅ）を含む。例示的なトリペプチドは、グリシン−バリン−シトルリン（ｇｌｙ−ｖａｌ−ｃｉｔ）及びグリシン−グリシン−グリシン（ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ）を含む。アミノ酸リンカー成分を含んでなるアミノ酸残基は、天然に生じるもの、並びに微量のアミノ酸及び非天然に生じるアミノ酸類似体、例えばシトルリンを含む。アミノ酸リンカー成分は設定され、特に酵素、例えば腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、Ｃ及びＤ又はプラスミンプロテアーゼによる酵素的切断の選択性に最適化できる。

抗体上の求核基には、限定するものでなく、以下のものを含む：（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えばリシン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えばシステイン、及び（ｉｖ）抗体がグリコシル化される糖水酸基又はアミノ基。アミン、チオール及び水酸基は、求核であり、反応して、リンカー部分上の求電子性の群及びリンカー試薬により共有結合を形成することができる：（ｉ）活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸及び酸ハロゲン化物；（ｉｉ）アルキル及びベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル及びマレイミド群、が含まれる。特定の抗体は、還元しうる鎖間ジスルフィド、すなわちシステイン架橋を有する。抗体は、還元剤、例えばＤＴＴ（ジチオトレイトール）による処置によって、リンカー試薬を用いたコンジュゲート反応を行ってもよい。ゆえに、各々のシステイン架橋は、理論的には、２の反応性のチオール求核基を形成する。チオールにアミンを転換させる２−イミノチオラン（トラウトの試薬）を用いてリシンを反応させることによって抗体に付加的な求核基を導入することができる。反応性のチオール基は、１、２、３、４又はそれ以上のシステイン残基を導入する（例えば、一又は複数の非天然のシステインアミノ酸残基を含んでなる変異体抗体を調製する）ことによって抗体（又は、その断片）に導入されてもよい。

また、本発明のコンジュゲート抗体は、抗体を修飾して求電子性の部分を導入する（リンカー試薬又は薬剤又は抗体部分上の求核置換基と反応させることができる）ことによって生成してもよい。グリコシル化された抗体の糖質を、例えば過ヨウ素酸塩酸化剤を用いて酸化して、リンカー試薬又は薬剤又は他の部分のアミン基と反応するアルデヒド又はケトン基を形成させてもよい。生じたイミンシッフ塩基群が安定結合を形成するか、又は例えば安定アミン結合を形成させるホウ化水素試薬によって、還元してもよい。一実施態様では、ガラクトースオキシダーゼ又はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩の何れかによるグリコシル化抗体の炭水化物部分の反応により、薬剤又は他の部分（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）上の適当な基と反応することができるタンパク質のカルボニル（アルデヒド及びケトン）基が生じうる。他の実施態様では、Ｎ末端セリン又はスレオニン残基を含んでいるタンパク質はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩と反応して、第一のアミノ酸の代わりにアルデヒドを生成する（Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ ＆ Ｓｔｒｏｈ，（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．３：１３８−１４６；米国特許第５３６２８５２号）。このようなアルデヒドは、薬剤部分又はリンカー求核基と反応することができる。

同様に、部分（例えば薬剤部分）上の求核基には、限定するものではないが、以下のものを含む：反応して、リンカー部分及びリンカー試薬上の求電子性の基と共有結合することができるアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボン酸エステル及びアリールヒドラジド基：（ｉ）活性エステル（例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸及び酸ハロゲン化物）；（ｉｉ）アルキル及びベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；および（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル及びマレイミド基、が含まれる。

別法として、抗体及び細胞障害剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。ＤＮＡの長さは、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの２つの部分をコードする領域をそれぞれ含有する。他の実施態様において、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」（例えばストレプトアビジン）に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体−レセプターコンジュゲートを個体に投与し、続いて清澄剤を使用し、循環から非結合コンジュゲートを除去し、細胞障害剤（例えば放射性ヌクレオチド）にコンジュゲートする「リガンド」（例えばアビジン）を投与する。

ＶＩＩＩ．実用性
本明細書に記載されるＦｃ変異体ポリペプチドは、ヘテロ多量体タンパク質の生産において産業上の利用可能性を見いだしている。

本明細書中に記載のヘテロ多量体タンパク質は、例えば、インビトロ、エクスビボ及びインビボでの治療方法に用途を見出している。本発明は、これらの分子の１つまたは複数を使用することに基づく様々な方法を提供する。特定の病的状態において、ヘテロ多量体タンパク質、例えば、多重特異性を利用することが必要であるか及び／又は望ましい。本発明は、例えば、治療薬、予防薬及び診断薬として、様々な目的のために使用することができるヘテロ多量体タンパク質を提供する。例えば、本発明は、疾患を治療する方法を提供し、該方法は、治療を必要とする被検体に、本発明のヘテロ多量体タンパク質を投与することを含み、それによって疾患が治療される。本明細書に記載された本発明のヘテロ多量体タンパク質のいずれかは、本明細書に記載の治療（又は予防又は診断）の方法で使用することができる。

例えば、ヘテロ多量体タンパク質が多価である場合には、価値ある利点は、それらの抗原に対してそれらが提示する結合活性の増強である。抗原ベースに対する結合単位（すなわちＦａｂ）の本質的な高い親和性を有することに加え、正常なＩｇＧ抗体はまた、標的に対するそれらの二価結合の結果として、抗原との結合を増加させる結合活性効果を利用している。

同じ抗原分子上の２つの別々のエピトープに対するヘテロ多量体タンパク質は、（二価結合のため）強化された結合親和力の利点を与え得るだけでなく、親抗体の何れかに結合していない新規な特性を獲得し得る。従って、本発明のヘテロ多量体タンパク質は、例えば、レセプター−リガンド相互作用の遮断に用途を見出している。

本明細書に記載のヘテロ多量体タンパク質はまた、一つの分子で２つの標的のシグナル伝達経路を遮断することの用途における使用を見いだしている。

ＩＸ．治療的用途
本明細書に記載の抗体又は抗体断片などのヘテロ多量体タンパク質（例えば本明細書に記述される方法に従って作製される抗体及び／又はその断片）は、治療上の適用のために使われてよい。例えば、このようなヘテロ多量体タンパク質は、前癌性、非転移性、転移性および癌性の腫瘍（例えば初期癌）を含む腫瘍の治療のため、アレルギー性または炎症性の疾患の治療のため、または自己免疫性疾患の治療のため、または、癌（例えば乳癌、結腸直腸癌、肺癌、腎臓細胞カルチノーマ、膠腫又は卵巣癌）、アレルギー性または炎症性の疾患又は自己免疫性疾患を発症するリスクがある被検体の治療のために使われてよい。

癌なる用語は、前癌性の増殖、良性腫瘍及び悪性腫瘍を含むがこれに限らず、一まとまりの増殖性疾患を包含する。良性腫瘍は、起源の部位に限局化されたままであり、遠位部位に浸潤、侵入又は転移する能力を有していない。悪性腫瘍は、周辺の他の組織に侵入して、障害を与える。また、それらは、起源の部位から切り離れる能力を獲得し、通常はリンパ節が配置されるリンパ系や血流を介して身体の他の部位に拡がりうる（転移する）。原発性腫瘍は、それらが生じる組織の種類によって分類され、転移性腫瘍は、癌細胞が由来する組織の種類によって分類される。時間とともに、悪性腫瘍の細胞は、より異常になり、正常細胞のようではなくなる。癌細胞にみられるこの変化は、腫瘍グレードと呼ばれており、癌細胞は、十分に分化されている、中程度に分化されている、ほとんど分化されていない、又は、未分化であると表される。十分に分化した細胞はで全く正常な見かけであり、起源の正常細胞のようである。未分化な細胞は、細胞の起源を決定することがもはや不可能であるほど異常となっている細胞である。

腫瘍は固形腫瘍であるか、或いは非固形腫瘍又は軟組織腫瘍でありうる。軟組織腫瘍の例には、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、成人急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、成熟Ｂ細胞急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、前リンパ球性白血病、又はヘアリーセル白血病）、或いはリンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、又はホジキン病）が含まれる。固形腫瘍には、血液、骨髄、又はリンパ系以外の身体組織のあらゆる癌が含まれる。固形腫瘍は更に、上皮細胞を起源とするものと、非上皮細胞を起源とするものとに分けられる。上皮細胞固形腫瘍の例には、胃腸管、結腸、胸部、前立腺、肺、腎臓、肝臓、膵臓、卵巣、頭頸部、口腔、胃、十二指腸、小腸、大腸、肛門、胆嚢、下唇、鼻いん頭、皮膚、子宮、男性生殖器、泌尿器、膀胱、及び皮膚の腫瘍が含まれる。非上皮起源の固形腫瘍には、肉腫、脳腫瘍、及び骨腫瘍が含まれる。非上皮起源の固形腫瘍には、肉腫、脳腫瘍、及び骨腫瘍が含まれる。

上皮性癌は一般に、良性腫瘍から侵襲前段階（例えばインサイツでの癌腫）、基底膜を透過して、上皮下間質に侵入した悪性癌に発達する。

また、多選択性タンパク質複合体は治療上の適用にも用いることができ、ＨＥＲ２を結合する抗体は、特に、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、腎臓細胞癌腫、膠腫又は卵巣癌を治療するために用いることができる。

本発明の組成物が投与される候補にある他の患者は、血管結合組織の異常増殖、赤瘡、後天性免疫不全症候群、動脈閉塞、アトピー性角膜炎、細菌性潰瘍、ベーチェット疾患、血液が媒介する腫瘍、頸動脈閉塞性疾患、脈絡叢血管新生、慢性炎症、慢性網膜剥離、慢性ブドウ膜炎、慢性硝子体炎、コンタクトレンズ疲労、角膜移植片拒絶、角膜血管新生、角膜移植片血管新生、クローン病、イールズ病、流行性角結膜炎、真菌潰瘍、単純ヘルペス感染、帯状ヘルペス感染、過粘稠度症候群、カポシ肉腫、白血病、脂質変性、ライム病、周縁表皮剥離、モーレン潰瘍、ハンセン病以外のマイコバクテリア感染、近視、眼性新生血管疾患、視神経窩、オスラー−ウェーバー症候群（オスラー−ウェーバー−ランデュ）、骨関節炎、パジェット病、毛様体扁平部炎、類天疱瘡、ｐｈｙｌｅｃｔｅｎｕｌｏｓｉｓ、多発動脈炎、レーザー後合併症、原生動物の感染、弾性線維性偽性黄色腫、翼状片角膜炎乾燥、放射状角膜切開、網膜血管新生、未熟児の網膜症、水晶体後繊維増殖、類肉腫、強膜炎、鎌状赤血球貧血、シェーグレン症候群、固形腫瘍、シュタルガルト病、スティーブンジョンソン病、上辺縁角膜炎、梅毒、全身狼瘡、テリアン周縁変性、トキソプラズマ症、ユーイング肉腫の腫瘍、神経芽細胞腫の腫瘍、骨肉腫の腫瘍、網膜芽細胞腫の腫瘍、横紋筋肉腫の腫瘍、潰瘍性大腸炎、静脈閉塞、ビタミンＡ欠乏、ヴェゲナー肉芽腫、糖尿病と関係している望ましくない脈管形成、寄生虫病、異常な創傷治癒、手術、損傷又は外傷後の肥大（例えば急性の肺損傷／ＡＲＤＳ）、体毛成長の阻害、排卵および黄体形成の阻害、移植の阻害および子宮における胚発達の阻害を有するか、又は発症するリスクにある。

本明細書中に記載の方法に従って作製されるコイルドコイル含有抗体、テザー抗体又は抗体を用いて治療されうるアレルギー性ないし炎症性疾患または自己免疫性疾患の例には、限定するものではないが、関節炎（関節リウマチ（例えば急性の関節炎、慢性の関節リウマチ、痛風性関節炎、急性の痛風性関節炎、慢性炎症性関節炎、変形性関節症、感染性関節炎、ライム関節炎、増殖性関節炎、乾癬の関節炎、椎骨関節炎及び若年性発症関節リウマチ、骨関節炎、関節炎慢性化、関節炎変形、関節炎慢性原発、反応性関節炎、及び強直性脊椎炎）、炎症性過剰増殖性皮膚病、乾癬、例えばプラーク乾癬、滴状乾癬、膿疱性乾癬及び爪乾癬）、皮膚炎、例として接触皮膚炎、慢性接触皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、ヘルペス状の皮膚炎、貨幣状皮膚炎、脂漏性皮膚炎、非特異的皮膚炎、一次刺激物接触皮膚炎及び過敏性皮膚炎、Ｘ連鎖性過剰ＩｇＭ症候群、蕁麻疹、例えば慢性アレルギー性蕁麻疹及び慢性特発性蕁麻疹、例として慢性自己免疫蕁麻疹、多発性筋炎／皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、中毒性上皮性表皮壊死症、強皮症（全身強皮症を含む）、硬化症、例えば全身性硬化症、多発性硬化症（ＭＳ）、例えば脊椎−眼（ｓｐｉｎｏ−ｏｐｔｉｃａｌ）ＭＳ）、一次進行性ＭＳ（ＰＰＭＳ）及び再発性寛解ＭＳ（ＲＲＭＳ）、進行性全身性硬化症、アテローム性動脈硬化、動脈硬化症、硬化症汎発、失調性硬化症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（例えばクローン病、自己免疫性胃腸疾患、大腸炎、例えば潰瘍性大腸炎、大腸性潰瘍、微細な大腸炎、膠原性大腸炎、大腸ポリープ、壊死性全腸炎及び経壁の大腸炎、及び自己免疫炎症性腸疾患）、膿皮症壊疽、結節性紅斑、原発性硬化性胆管炎、上強膜炎、呼吸窮迫症候群、例として成人性又は急性の呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、髄膜炎、葡萄膜の全部又は一部の炎症、虹彩炎、脈絡膜炎、自己免疫血液疾患、リウマチ様脊椎炎、リウマチ様関節滑膜炎、突発性聴力障害、ＩｇＥ媒介性疾患、例えばアナフィラキシー及びアレルギー性鼻炎及びアトピー性鼻炎、脳炎、例えばラスマッセンの脳炎及び辺縁及び／又は脳幹脳炎、ブドウ膜炎、例として、前部ブドウ膜炎、急性前ブドウ膜炎、肉芽腫ブドウ膜炎、非顆粒性ブドウ膜炎、水晶体抗原性ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎又は自己免疫ブドウ膜炎、ネフローゼ症候群を有する又は有さない糸球体腎炎（ＧＮ）、例として、慢性又は急性の糸球体腎炎、例として原発性ＧＮ、免疫性ＧＮ、膜性ＧＮ（膜性ネフロパシ）、特発性膜性ＧＮ又は特発性膜性ネフロパシ、膜又は膜性増殖性ＧＮ（ＭＰＧＮ）（タイプＩ及びタイプＩＩを含む）、急速進行性ＧＮ、アレルギー性症状、アレルギー性反応、湿疹、例としてアレルギー性又はアトピー性湿疹、喘息、例えば喘息気管支炎、気管支喘息及び自己免疫喘息、Ｔ細胞の浸潤を伴う症状及び慢性炎症反応、慢性肺炎症性疾患、自己免疫心筋炎、白血球粘着力欠損、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）又は全身性ループスエリテマトーデス、例えば皮膚ＳＬＥ、亜急性の皮膚ＳＬＥ、新生児期ループス症候群（ＮＬＥ）、紅班性狼瘡汎発、ループス（例としてループス腎炎、ループス脳炎、小児ループス、非腎性ループス、腎外ループス、円板状ループス、脱毛症ループス）、若年性開始型（Ｉ型）真正糖尿病、例として小児インシュリン依存性真正糖尿病（ＩＤＤＭ）、成人発症型真正糖尿病（ＩＩ型糖尿病）、自己免疫性糖尿病、特発性の尿崩症、サイトカイン及びＴリンパ球によって媒介される急性及び遅発性過敏症と関係する免疫応答、結核、サルコイドーシス、肉芽腫症、例としてリンパ腫肉芽腫症、ヴェゲナーの肉芽腫症、無顆粒球症、脈管炎、例として血管炎、大血管性血管炎（例えば大脈管脈管炎（リウマチ性多発性筋痛及び巨細胞（高安）動脈炎を含む）、中脈管脈管炎（川崎病及び結節性多発動脈炎を含む）、微小多発動脈炎、ＣＮＳ脈管炎、壊死性血管炎、皮膚性血管炎又は過敏性血管炎、全身性壊死性血管炎、及びＡＮＣＡ関連の脈管炎、例としてチャーグ−ストラウス脈管炎又は症候群（ＣＳＳ））、側頭動脈炎、無形成性貧血、自己免疫無形成性貧血、クームズ陽性貧血症、ダイアモンドブラックファン貧血症、溶血性貧血又は免疫溶血性貧血、例として自己免疫溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、悪性貧血（貧血症悪性熱）、アジソン病、純粋な赤血球貧血症又は形成不全（ＰＲＣＡ）、第ＶＩＩＩ因子欠損症、血友病Ａ、自己免疫好中球減少症、汎血球減少症、白血球減少症、白血球血管外遊出を伴う疾患、ＣＮＳ炎症性疾患、多器官損傷症候群、例えば敗血症、外傷又は出血の二次症状、抗原−抗体複合体関連疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット又はベーチェット病、カールスマン症候群、グッドパスチャー症候群、レイノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンスジョンソン症候群、類天疱瘡、例えば水疱性類天ぽうそう及び類天疱瘡皮膚、天疱瘡（尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、ペンフィグス粘液膜類天疱瘡及び天疱瘡エリテマトーデスを含む）、自己免疫多腺性内分泌障害、ライター病又は症候群、免疫複合体腎炎、抗体媒介性腎炎、視神経脊髄炎、多発性神経炎、慢性神経障害、例えばＩｇＭ多発性神経炎又はＩｇＭ媒介性神経障害、血小板減少（例えば心筋梗塞患者によるもの）、例えば血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、及び自己免疫性又は免疫媒介性血小板減少、例えば慢性及び急性のＩＴＰを含む特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、自己免疫性精巣炎及び卵巣炎を含む精巣及び卵巣の自己免疫性疾患、一次甲状腺機能低下症、副甲状腺機能低下症、自己免疫内分泌性疾患、例えば甲状腺炎、例えば自己免疫性甲状腺炎、橋本病、慢性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）又は亜急性の甲状腺炎、自己免疫甲状腺性疾患、特発性甲状腺機能低下症、グレーブ病、自己免疫多腺性症候群、例として多腺性症候群（又は、多腺性内分泌障害症候群）、腫瘍随伴症候群、例として神経系新生物関連症候群、例えばランバート−イートン筋無力症症候群又はイートン―ランバート症候群、スティッフマン又はスティッフマン症候群、脳脊髄炎、例として、アレルギー性脳脊髄炎又は脳脊髄炎性アレルギー及び実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、重症筋無力症、例えば胸腺腫関連の重症筋無力症、小脳性退化、神経ミオトニ、眼球クローヌス又は眼球クローヌス筋硬直症候群（ＯＭＳ）及び感覚系神経障害、多病巣性運動神経障害、シーハン症候群、自己免疫肝炎、慢性肝炎、類狼瘡肝炎、巨細胞肝炎、慢性活動性肝炎又は自己免疫慢性活動性肝炎、リンパ系間隙間質性肺炎（ＬＩＰ）、閉塞性細気管支炎（非移植）対ＮＳＩＰ、ギラン‐バレー症候群、ベルガー病（ＩｇＡネフロパシ）、特発性ＩｇＡネフロパシ、線状ＩｇＡ皮膚病、原発性胆管萎縮症、肺線維症、自己免疫腸疾患症候群、セリアック病、コエリアック病、脂肪便症（グルテン腸疾患）、抵抗性スプルー、特発性スプルー、クリオグロブリン血症、アミロトロフィック側索硬化症（ＡＬＳ；筋萎縮性側索硬化症（Ｌｏｕ Ｇｅｈｒｉｇ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ））、冠状動脈疾患、自己免疫性耳疾患、例として、自己免疫内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫聴力障害、眼球クローヌス筋硬直徴候（ＯＭＳ）、多発性軟骨炎、例として、抵抗性又は再発性多発性軟骨炎、肺胞状蛋白症、アミロイドーシス、強膜炎、非癌性リンパ球増多症、一次リンパ球増多症、これにはモノクローナルＢ細胞リンパ球増多症（例えば良性モノクローナル免疫グロブリン症及び未同定の有意なモノクローナル免疫グロブリン血症（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｇａｍｍｏｐａｔｈｙ ｏｆ ｕｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ）、ＭＧＵＳ）が含まれる、末梢性神経障害、腫瘍随伴症候群、チャネル病、例として、癲癇、片頭痛、不整脈、筋疾患、難聴、盲目、周期性麻痺及びＣＮＳのチャネル病、自閉症、炎症性ミオパシ、局所性分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、内分泌性眼障害、ブドウ膜網膜炎、脈絡網膜炎、自己免疫性肝臓病、線維症、多内分泌性不全、シュミット症候群、副腎炎、胃萎縮、初老期痴呆、脱髄性疾患、例として自己免疫脱髄性病、糖尿病性ネフロパシ、ドレスラー症候群、円形脱毛症、ＣＲＥＳＴ症候群（石灰沈着、レイノー現象、食道運動障害、強指症及び毛細管拡張症）、雌雄自己免疫性不妊性、混合性結合組織病、シャーガス病、リウマチ熱、再発性中絶、農夫肺、多形性紅斑、心切開術後症候群、クッシング症候群、愛鳥家肺、アレルギー性肉芽腫性脈管炎、良性リンパ球血管炎、アルポート症候群、肺胞炎、例えばアレルギー性肺胞炎及び繊維化肺胞炎、間隙肺疾患、輸血反応、ハンセン病、マラリア、リーシュマニア症、キパノソミアシス（ｋｙｐａｎｏｓｏｍｉａｓｉｓ）、住血吸虫症、蛔虫症、アスペルギルス症、サンプター症候群、カプラン症候群、デング熱、心内膜炎、心内膜心筋線維形成、広汎性間質性肺線維形成、間質性肺線維形成、特発性の肺線維形成、嚢胞性線維症、眼内炎、持久性隆起性紅斑、胎児赤芽球症、好酸性筋膜炎（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ ｆａｃｉｉｔｉｓ）、シャルマン症候群、フェルティー症候群、フィラリア（ｆｌａｒｉａｓｉｓ）、毛様体炎、例えば慢性毛様体炎、ヘテロ慢性毛様体炎、虹彩毛様体炎、又はＦｕｃｈの毛様体炎）、ヘーノホ−シェーンライン紫斑病、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染、エコーウィルス感染、心筋症、アルツハイマー病、パルボウィルス感染、風疹ウィルス感染、種痘後症候群、先天性風疹感染、エプスタインバーウイルス感染、耳下腺炎、エヴァンの症候群、自己免疫性腺機能不全、シドナム舞踏病、連鎖球菌感染後腎炎、閉塞性血栓性血管炎（ｔｈｒｏｍｂｏａｎｇｉｔｉｓ ｕｂｉｔｅｒａｎｓ）、甲状腺中毒症、脊髄癆、脈絡膜炎、巨細胞多発性筋痛、内分泌性眼障害、慢性過敏性肺炎、乾性角結膜炎、流行性角結膜炎、特発性腎臓症候群、微小変化ネフロパシ、良性家族性及び乏血−再灌流障害、網膜自己免疫、関節炎症、気管支炎、慢性閉塞性気道疾患、珪肺症、アフタ、アフタ性口内炎、動脈硬化症疾患、アスペルミオジェネース（ａｓｐｅｒｍｉｏｇｅｎｅｓｅ）、自己免疫性溶血、ベック病、クリオグロブリン血症、デュピュイトラン拘縮、水晶体過敏性眼内炎、腸炎アレルギー、結節性紅斑、ｌｅｐｒｏｓｕｍ、特発性顔麻痺、慢性疲労症候群、リウマチ性熱、ハンマンリッチ病、感覚器性（ｓｅｎｓｏｎｅｕｒａｌ）聴力障害、血色素尿症発作（ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎｕｒｉａ ｐａｒｏｘｙｓｍａｔｉｃａ）、性機能低下、回腸炎領域、白血球減少症、単核細胞増加症感染、横移動脊髄炎、一次特発性の粘液水腫、ネフローゼ、眼炎ｓｙｍｐｈａｔｉｃａ、精巣炎肉芽腫症、膵炎、多発性神経根炎急性、膿皮症壊疽、Ｑｕｅｒｖａｉｎ甲状腺炎、後天性脾臓萎縮、抗精子抗体による不妊性、非悪性胸腺腫、白斑、ＳＣＩＤ及びエプスタインバーウイルス関連疾患、後天性免疫不全症候群（エイズ）、寄生虫病、例えばＬｅｓｉｈｍａｎｉａ、毒性ショック症候群、食中毒、Ｔ細胞の浸潤を伴う症状、白血球−粘着力欠損、サイトカイン及びＴリンパ球に媒介される急性及び遅発性過敏症関連免疫応答、白血球血管外遊出を伴う疾患、多器官損傷症候群、抗原−抗体複合体媒介性疾患、抗糸球体基底膜疾患、アレルギー性神経炎、自己免疫多腺性内分泌障害、卵巣炎、原発性粘液水腫、自己免疫萎縮性胃炎、交感性眼炎、リウマチ性疾患、混合性結合組織病、ネフローゼ症候群、膵島炎、多内分泌性不全、末梢性神経障害、自己免疫多腺性症候群Ｉ型、成人発症型特発性副甲状腺機能低下症（ＡＯＩＨ）、完全脱毛症、拡張型心筋症、後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）、ヘモクロマトーシス、心筋炎、ネフローゼ症候群、原発性硬化性胆管炎、化膿性又は非化膿性副鼻腔炎、急性又は慢性副鼻腔炎、篩骨、正面、上顎骨又は蝶形骨副鼻腔炎、好酸球性関連疾患、例えば好酸球増加症、肺浸潤好酸球増加症、好酸球増加症−筋肉痛症候群、レフラー症候群、慢性好酸性肺炎、熱帯肺好酸球増加症、気管支肺炎アスペルギルス症、アスペルギローム又は好酸球性を含有する肉芽腫、アナフィラキシー、血清陰性脊椎関節炎疹、多内分泌性自己免疫性疾患、硬化性胆管炎、強膜、上強膜、慢性皮膚粘膜カンジダ症、ブラットン症
候群、乳児期の一過性低ガンマグロブリン血症、ウィスコット‐アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症候群、膠原病と関係する自己免疫疾患、リウマチ、神経病学的疾患、虚血性再灌流障害、血圧応答の減退、血管機能不全、ａｎｔｇｉｅｃｔａｓｉｓ、組織損傷、心血管乏血、痛覚過敏、脳虚血、及び脈管化を伴う疾患、アレルギー性過敏症疾患、糸球体腎炎、再灌流障害、心筋又は他の組織の再灌流損傷、急性炎症性成分を有する皮膚病、急性化膿性髄膜炎又は他の中枢神経系炎症性疾患、眼性及び眼窩の炎症性疾患、顆粒球輸血関連症候群、サイトカイン誘発性毒性、急性重症炎症、慢性難治性炎症、腎盂炎、肺線維症、糖尿病性網膜症、糖尿病性大動脈疾患、動脈内過形成、消化性潰瘍、弁膜炎、及び子宮内膜症などがある。

治療的な使用に加えて、本発明の抗体は、本明細書中に記載の疾患および症状についての診断的方法といった診断方法を含む他の目的のために用いられうる。

Ｘ．用量、製剤および持続時間
本発明のタンパク質は、良好な医療行為に一致した形で処方され、投与量が決められ、投与される。この場合に考慮される因子には、治療されている特定の疾患、治療されている特定の哺乳動物、個々の被検体の臨床症状、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医師に知られている他のファクターが含まれる。投与されるタンパク質の「治療上有効量」は、このような考慮によって調整され、特定の疾患（例えば癌、アレルギーないし炎症性疾患または自己免疫性疾患）を予防するか、改善するかまたは治療するために必要な最小限量である。タンパク質は、必ずしもそうする必要はないが、場合によっては、疾患の予防又は治療のために現在使用されている一又は複数の薬剤と共に処方される。かかる他の薬剤の有効量は、製剤中に存在するタンパク質の量、疾患又は治療のタイプ、及び上で検討した他の因子に依存する。これらは、一般に、これまで使用されたものと同じ用量及び投与経路で、あるいはこれまで用いられた投薬量の約１から９９％で使用される。一般に、癌の寛解又は治療は、癌と関係する一又は複数の症状又は医学的な問題を少なくすることを伴う。治療上有効な量の薬剤によって、以下の何れか又はいくつかが達成される。癌細胞数の（少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％以上の）減少；腫瘍サイズ又は腫瘍負担の低減又は阻害；周辺臓器への癌細胞の浸潤の阻害（すなわちある程度の減少及び／又は停止）；腺腫の場合のホルモン分泌の低減；血管密度の低減；腫瘍転移の阻害；腫瘍増殖の低減又は阻害；及び／又は、癌関連の一又は複数の症状のある程度の軽減。幾つかの実施態様では、タンパク質を用いて、被検体の癌又は自己免疫性疾患の発症又は再発を防ぐ。

一実施態様では、本発明は、癌又は自己免疫性疾患に罹りやすいか又はそうと診断されたヒト被検体の生存期間を増すために用いられうる。生存期間は、薬剤の最初の投与から死亡の時と定める。また、生存期間は治療中の被検体の死亡のリスクを表す、コントロール群に対する治療群の危険率（ＨＲ）を層別化することによって測定することもできる。

更に他の実施態様では、本発明の治療法は、様々な抗癌療法にて治療される癌であると疑われるか診断された一群のヒト被検体において奏効率を有意に増加させる。奏効率は治療に反応した治療された患者の割合と定義される。一実施態様では、本発明のタンパク質と、手術、放射線療法又は一又は複数の化学療法剤を使用する本発明の併用治療法は、手術、放射線療法又は化学療法単独で治療された群と比較して治療被検体群において奏効率を有意に増大させ、該奏効率は０．００５未満のχ二乗ｐ値を有する。癌の治療における治療上の有効性の更なる測定は米国特許出願公開２００５０１８６２０８に記載される。

治療用製剤は、所望の純度を有する活性成分を、任意の生理的に許容される担体、賦形剤又は安定剤と混合することによって、当分野で公知の標準的な方法を用いて調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ），ｅｄ．Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆ａｍｐ；Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）。許容可能な担体には、生理食塩水、又はリン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸などのバッファ；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（およそ１０未満の残基）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン、アミノ酸、例として、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン；単糖、二糖および他の炭水化物、例としてグルコース、マンノース又はデキストリン；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖アルコール、例えばマンニトール又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；および／又は非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ^ＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ^ＴＭ又はＰＥＧが含まれる。

場合によって、しかし、好ましくは、製剤は、薬学的に許容可能な塩、好ましくは塩化ナトリウムを、好ましくは生理的濃度で含有する。場合によって、本発明の製剤は、薬学的に許容可能な防腐剤を含有してもよい。いくつかの実施態様では、保存の濃度は、０．１から２．０％、一般的にｖ／ｖの範囲である。好適な防腐剤には製薬の分野で知られているものが含まれる。ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、メチルパラベンおよびプロピルパラベンは、好適な防腐剤である。場合によって、本発明の製剤は、０．００５〜０．０２％の濃度で、薬学的に許容可能な界面活性剤を含んでもよい。

また、本明細書中の製剤は、治療される特定の徴候の必要に応じて、一よりも多い活性な化合物、好ましくは互いに悪影響を与えない相補的活性を有するものを含有してもよい。そのような分子は意図する目的に有効な量で適切に組み合わせる。

活性成分はまた、コロイド性薬物デリバリーシステム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロカプセル、ミクロエマルション、ナノ−粒子、およびナノカプセルなど）又はマクロエマルション中、例えば、それぞれ、コアセルベーション法又は界面重合法によって製造された、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタシラート）（ｐｏｌｙ−（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ）マイクロカプセルに取込むことができる。このような技術は、上掲のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓにおいて開示される。

徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性製剤の適切な例には、ヘテロ多量体タンパク質を含有する固形疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが含まれ、このマトリックスはフィルムやマイクロカプセル等の成形品の形である。徐放性マトリックスの例として、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）又はポリ（ビニルアルコール））、ポリアクチド（米国特許第３７７３９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタマートの共重合体、非−分解性エチレン−ビニルアセテート、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ^ＴＭ（乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリド（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ ａｃｅｔａｔｅ）から構成される注射用ミクロスフェア）のような分解性乳酸−グリコール酸共重合体、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸などのポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化されたヘテロ多量体タンパク質が身体内に長時間残ると、それらは３７℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ−Ｓ結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、及び特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。

ここに記載のタンパク質（例えばヘテロ多量体タンパク質またはここに記載の方法に従って作製された多選択性抗体）は、ボーラスとして又はある期間の連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液内、包膜内、経口、局所などの投与経路又は吸入経路などの既知の方法でヒト患者に投与される。広範囲な副作用又は毒性がタンパク質が認識する標的分子に対する拮抗作用と関係している場合、局所投与が特に望ましい。また、エクスビボ方策が医療適用のために用いられてもよい。エクスビボ方策は、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを被検体から得られる細胞に形質移入させるか又は形質導入させることを伴う。形質移入させるか又は形質導入させた細胞は、次いで被検体に戻される。細胞は、造血性細胞（例えば骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、Ｔ細胞又はＢ細胞）、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、ケラチン合成細胞又は筋細胞を含むが、これらに限定されるものではない様々な範囲のいずれかでありうる。

一例では、タンパク質（例えばヘテロ多量体タンパク質、またはここに記載の方法に従って作製された多選択性抗体）は、疾患又は腫瘍の位置が許す限り、例えば直接注射によって局所的に投与され、この注射は周期的に繰り返されうる。また、タンパク質複合体は、局所の再発又は転移を予防するかまたは低減するために、被検体に全身的に、又は腫瘍細胞、例えば腫瘍の外科的切除後の腫瘍又は腫瘍巣に直接、送達されてよい。

ＸＩ．製造品
本発明の他の実施態様は、本明細書中に記載の一又は複数のタンパク質複合体と疾患（例えば自己免疫性疾患または癌）の治療または診断に有用な材料を具備する製造品である。製造品は、容器と容器上ないしは容器に付随するラベルないしはパッケージ挿入物を具備する。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ等を含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な物質から形成されうる。容器は、ガラス又はプラスチックのような様々な材料から形成されてよい。容器は、症状の治療に有効である組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針により貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも一つの活性薬剤は本発明のヘテロ多量体タンパク質（例えば、抗体又は抗体断片）である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が特定の疾患の治療に用いられることを示す。ラベル又はパッケージ挿入物は更に、ヘテロ多量体タンパク質の組成物を被検体に投与するための指示を含む。また、本明細書中に記載の併用治療薬を含む製造品及びキットも考慮される。

パッケージ挿入物は、慣習的に治療用製品の市販パッケージに含まれる指示書を指し、効能、使用、用量、投与、禁忌及び／又はこのような治療用製品の使用に関する警告についての情報を含むものである。ある実施態様では、パッケージ挿入物は、組成物が、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、腎臓細胞癌腫、膠腫又は卵巣癌の治療のために用いられることを示す。

さらに、製造品は、製薬的に許容可能なバッファー、例えば注射用の静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第２の容器を具備してもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。

また、様々な目的、例えば抗原（例えばＨＥＲ２またはＥＧＦＲ）を細胞から精製する又は免疫沈降するために有用なキットが提供される。抗原（例えばＨＥＲ２またはＥＧＦＲ）の単離又は精製のために、キットは、ビーズ（例えばセファロースビーズ）に結合したヘテロ多量体タンパク質（例えばＥＧＦＲ／ＨＥＲ２抗体）を含みうる。例えば、ＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロットにおいて、抗原をインビトロで検出及び定量するためのヘテロ多量体タンパク質を具備するキットが提供されうる。製造品と同様に、キットは、容器と容器上ないしは容器に付随するラベルないしはパッケージ挿入物を具備する。容器は、本発明の少なくとも一のヘテロ多量体タンパク質（例えば、多選択性抗体又は抗体断片）を含む組成物を収容する。例えば希釈剤及びバッファ又はコントロール抗体を具備する他の容器が具備されてよい。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物の説明並びにインビトロでの使用又は診断上の使用についての指示を提供してよい。

前述の記載は当業者が本発明を実施するために十分であるとみなされる。以下の実施例は、事例のためだけであって、本発明の権利範囲が制限されるものでは決してない。事実、本明細書に示したもの及び記載内容に本発明の様々な変更が加わることは、前述の記載から当業者に明らかであり、添付の特許請求の範囲内のものである。

後の実験の開示において；以下の略語が適用される：当量（当量）；Ｍ（モル）；μＭ（マイクロモル）；Ｎ（正常）；ｍｏｌ（モル）；ｍｍｏｌ（ミリモル）；μｍｏｌ（マイクロモル）；ｎｍｏｌ（ナノモル）；ｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｋｇ（キログラム）；μｇ（マイクログラム）；Ｌ（リットル）；ｍｌ（ミリリットル）；μｌ（マイクロリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；μｍ（マイクロメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；℃（摂氏温度）；ｈ（時間）；ｍｉｎ（分）；ｓｅｃ（秒）；ｍｓｅｃ（ミリ秒）；ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害））；ＢｓＡｂ（二重特異性抗体）；ＣＬ（軽鎖の定常ドメイン）；ＣＨ（重鎖の定常ドメイン）；ＣＭＣ（補体媒介性細胞傷害）のＦａｂ（抗原結合断片）；Ｆｃ（結晶化断片）；ＦＶ（可変断片（ＶＬ＋ＶＨ））；ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）；ＨＣ（重鎖）；ＩＧＦＲ（インスリン様成長因子受容体）；ＬＣ（軽鎖）；ｓｃＦｖ（単鎖可変断片（アミノ酸リンカーによって繋がったＶＬおよびＶＨ）；ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）；ＶＥＧＦＲ２（血管内皮増殖因子受容体２）；ＶＨ（可変重鎖ドメイン）；ＶＬ（可変軽鎖ドメイン）。

本発明は以下の実施例に更に詳細に記載されるが、これらは特許請求される本発明の範囲を限定することを意図のものではない。添付図面は、本発明の明細書と説明の不可欠な部分と見なされることが意図される。全ての参考文献は、本明細書に記載されている全てにおいて、参照により援用される。以下の実施例は、説明するために提供されるが、請求項に記載の発明を限定するものではない。

実施例１：
発現ベクターの構築
この例では、宿主細胞を形質転換するために使用する核酸コンストラクトを示している。

一般的には、重鎖及び軽鎖の両方をコードするＤＮＡ配列が、配列の各々に対して別個のプロモーター要素、及び発現プラスミドを含む細菌細胞を選択するための抗生物質耐性を含む、発現プラスミドにクローニングされる。ベクターのコンストラクトは、細菌細胞のペリプラズム空間への抗体ポリペプチドの排出のため、熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）分泌シグナル（Ｐｉｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４２：２６９−２７５，及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４２：２６４−２６８）をコード化する。各鎖の転写はｐｈｏＡプロモーターによって制御され（Ｋｉｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９：５６７１−５６７８）、翻訳制御が、測定された相対的翻訳力について以前に説明されたＳＴＩＩシグナル配列の変異体によって与えられ、それは翻訳開始領域（ＴＩＲ）におけるサイレントコドンの変化を含む（Ｓｉｍｍｏｎｓ ａｎｄ Ｙａｎｓｕｒａ，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：６２９−６３４及びＳｉｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２６３：１３３−１４７）。ノブ及びホールのプラスミドの模式図を、図２Ａ及び２Ｂにそれぞれ示す。

本発明は、特定の抗体の結合配列に依存しておらず、任意の半抗体の組み合わせに適用可能であるが、本明細書の実施例では、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＩＬ−４及びＩＬ−１３を対象としたヘテロ多量体抗体に向けられている。抗ｃ−ｍｅｔ抗体の例は、米国特許第７，４７２，７２４号、及び米国特許７，４９８，４２０第号に与えられる。抗ＥＧＦＲ抗体の例は、米国仮出願第６１／２１０５６２号（２００９年３月２０日出願）、米国特許出願公開第２００８０２７４１１４号（２００８年１１月６日公開）及び米国特許５８４４０９３号（１９９８年１２月１日付与）に与えられる。抗ＩＬ−１３抗体の例は、米国特許第７５０１１２１号（２００９年３月１０日付与）、米国特許７６１５２１３号（２００９年１１月１０日付与）、国際公開第２００６／０８５９３８号（２００６年８月１７日公開）、米国特許出願公開第２００９０２１４５２３号（２００９年８月２７日公開）、及び米国特許７６７４４５９号（２０１０年３月９付与）に記載されている。抗ＩＬ−４抗体の例は、米国特許出願公開第２００８０２４１１６０号（２００８年１０月２日公開）、及び米国特許６３５８５０９号（２００２年３月１９日付与）に記載されている。

各半抗体は、米国特許第７６４２２２８号に記載されているように重鎖に操作された、ノブ（突起）又はホール（空洞）を有していた。簡単に説明すると、Ｃ_Ｈ３ノブ変異体が最初に生成された。Ｃ_Ｈ３ホール変異体のライブラリーが、その後、パートナーのＣ_Ｈ３ドメイン上のノブに近接している残基３６６、３６８及び４０７をランダム化することにより作成された。次の例では、ノブの変異はＴ３６６Ｗであり、ホールはＩｇＧ１のバックボーンにおいて変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを有する。他の免疫グロブリンアイソタイプにおける同等の突然変異は、当業者によって容易に決定される。更に、当業者は、二重特異性のために使用される２つの半抗体が同じアイソタイプであることが好ましいことが容易に分かるであろう。異なるアイソタイプの半抗体が使用され得るが、更なる変異が必要である場合がある。

幾つかの事例では、各半抗体はＣ_Ｈ２ドメインにおける残基Ｆ２４１とＦ２４３で導入される変異を更に有していた。組み合わせがＦ２４１Ｓ／Ｆ２４３Ｒ又はＦ２４１Ｒ／Ｆ２４３Ｓの何れかであるように、野生型のフェニルアラニンをセリンまたはアルギニンの何れかに変更するため、当技術分野で公知の技術を用いて点変異が導入された。

この実施例で説明されるベクターは、抗ｃ−Ｍｅｔ又は抗ＥＧＦＲ半抗体の何れかのためであるが、当業者は、任意の抗体をプラスミド中にコード化することができることを容易に理解するであろう。本明細書で使用される全てのコンストラクトについての開始プラスミドは、以前に記載された、抗組織因子分離シストロンプラスミドのｐａＴＦ５０であり、相対的ＴＩＲが重に対して１及び軽に対して１である（Ｓｉｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２６３：１３３−１４７、及び米国特許第６，９７９，５５６号）。相対的ＴＩＲ強度の増加が、これらの半抗体の発現力価を高めるために使用された。

実施例２：
別々の細胞培養を用いるヘテロ多量体タンパク質の生産
以下の例では、単量体成分（例えば半抗体）を発現する細胞を別々の培養において増殖させるヘテロ多量体タンパク質の産生を示す。この方法では、別々の培養において半抗体を発現するように細胞を増殖し、誘導する。この方法では、その成分を最初に精製し、その後ヘテロ多量体タンパク質を形成するために組み合わせ得る。

この方法において、第一のＦｃ含有ポリペプチド（例えば、半抗体（ノブ））をコードする核酸が第一の宿主細胞に導入され、そして第二のＦｃ含有ポリペプチド（例えば、半抗体（ホール））をコードする核酸が第二の宿主細胞に導入される。この例では、ＢｓＡｂの形成を示しているが、当業者は、記載されている方法は、ヒンジ領域を含む任意のヘテロ多量体タンパク質、例えば、アフィボディなどにも適用可能であることを容易に理解するであろう。

インタクトなＢｓＡｂを形成するための、半抗体の別々の培養、別々の精製、混合及び酸化還元による、ノブ半抗体及びホール半抗体の独立した産生。
ノブの変異又はホールの変異の何れかを含む半抗体（Ｆ２４１とＦ２４３変異を含む又は含まない）が、細菌宿主細胞、例えば大腸菌で、実施例１に記載のコンストラクトを用いて重鎖及び軽鎖を発現させることにより、別々の培養で産生された。図３及び４Ａを参照。この方法では、ノブ半抗体は抗ＥＧＦＲであり、ホール半抗体は抗ｃ−ｍｅｔであった。実施例１の発現プラスミドを大腸菌宿主株３３Ｄ３（Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９９）５９（１１）：２７１８）又は６４Ｂ４（Ｗ３１１０ ΔｆｈｕＡ ΔｐｈｏＡ ｉｌｖＧ＋ Δｐｒｃ ｓｐｒ４３Ｈ１ ΔｄｅｇＰ ΔｍａｎＡ ｌａｃＩｑ ΔｏｍｐＴ）に導入し、形質転換体をカルベニシリンを含むＬＢプレート上で選択した。形質転換体は、その後、カルベニシリンを含むＬＢ種培養液を播種するために使用され、これを３０℃で振とうしながら一晩増殖させた。種培養液はカルベニシリンを含むリン酸塩制限培地Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ．（Ｓｉｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２６３：１３３−１４７）へ１００倍に希釈され、３０℃で２４時間震とうして増殖させた。培養液を遠心分離し、細胞ペレットは、抗体精製が開始されるまで凍結した。ペレットを解凍し、塩酸でｐＨ７．５に調整した２５ｍＭのトリスベース、１２５ｍＭのＮａＣｌ及び５ｍＭのＥＤＴＡ（ＴＥＢまたはトリス抽出緩衝液）を含み、容積重量比が５グラムの細胞ペレットあたり１００ｍＬのＴＥＢである抽出緩衝液に再懸濁し、そしてマイクロフルイディクスコーポレーションモデル１１０Ｆマイクロフルイダイザー（Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）を通して再懸濁した混合物を３回通すことにより、マイクロ流体工学を用いて細胞を破壊することによって抽出した。細菌の細胞抽出液を１５，０００×ｇで２０分間遠心分離によって清澄化し、上清が収集され、精製前に０．２２ミクロンのアセテートフィルターを介してろ過した。

各半抗体はプロテインＡ捕捉により別々に精製され、陽イオン交換クロマトグラフィーが続いた。ノブ半抗体からの清澄化細胞抽出物は、１ｍＬのＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ^ＴＭ ＳｕＲｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｔｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））上に２ｍＬ／分でロードされた。ロードした後、陽イオン交換カラムによる捕捉を容易にするために、カラムは１０カラム体積（ＣＶ）の４０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．０、１２５ｍＭの塩化ナトリウム、及び５ｍＭのＥＤＴＡで洗浄し、続いて５カラム体積の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．０で洗浄した。半抗体捕捉親和性は０．２ｍＭの酢酸（ｐＨ２−３）の１０カラム容量（ＣＶ）で溶出し、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅからの１ｍＬのＨｉＴｒａｐ ＳＰ−ＨＰの強陽イオン交換カラム上で直接捕捉した。カラムは２５ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）ｐＨ５．８を含む１０ＣＶの緩衝液Ａで洗浄した。半抗体を０−５０％の緩衝液Ｂ（２５ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ５．８、１Ｍの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ））の直線勾配で溶出した。２０−４０％のＢ、及び２８０ｎｍのＵＶ吸光度と回収画分の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によって決められた溶出液のピークとの間に溶出されたタンパク質の両方が、ノブ又はホール抗体として別々にプールされた。両タンパク質は、一般的に主要な溶出ピークを示し、お互いに酸化された重鎖種と軽鎖種を含む全ての画分がプールに含まれていた。還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、精製された半抗体の分析が図４Ｂに示される。結果は、発現され捕捉されたタンパク質の大半は、大きさが７５ｋＤであることを示している。我々は、図４Ｃに示すように、ＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析によって、これを確認した。半抗体の質量は予測された質量であり、ヒンジ領域内の２つのシステイン残基を含む任意のシステインにはジスルフィド付加物がなかったことを示している。ヒンジシステインが還元され反応性の遊離チオールを示すかどうかを判断するため、タンパク質は、質量分析法による分析の１時間前に１ｍＭのＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）と中性ｐＨで反応させた。タンパク質の質量は変わらず、ヒンジシステインがお互いに酸化され、鎖内ジスルフィド、例えば、環状ジスルフィドのである可能性が高い。これらの二つの半抗体（ノブとホール）を使用して、完全にインタクトな二重特異性抗体を構築するため、最初に、ヒンジ領域における鎖内ジスルフィドを還元し、システイン遊離チオールを遊離させ、その後、それらが別の重鎖へと酸化され、１５０ｋＤの二重特異性抗体を形成するようにする必要があった。

インタクトな二重特異性分子を形成するため、２つの相補的な半抗体のアニーリング、還元及び再酸化を達成するために、以下の手順が開発された。独立に分離した後、精製したタンパク質は、手順のプール工程でに等しい質量で一緒に結合され（図５に示す）、プールのｐＨを、１Ｍトリス、ｐＨ８．０の１０分の１の体積を追加することにより８．０に調整し、タンパク質を２．０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）により室温で還元した。２時間還元した後、プールされたタンパク質は、５ｍＬのＺｅｂａ Ｄｅｓａｌｔスピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて、２５ｍＭトリス、ｐＨ８．０、及び１２５ｍＭのＮａＣｌ中にバッファー交換され、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度の約４ｍＬｓの体積が得られる。タンパク質は、その後、３時間３７°Ｃに混合物を加熱することによりアニールし、続いて約２４°Ｃの室温まで冷却した。アニールされた抗体は、１０ｋＤの分子量カットオフスピンコンセントレータを使用して、約１０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で０．５ｍＬの体積まで濃縮され、１０ｋＤの膜により５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０、及び１５０ｍＭのＮａＣｌへ透析しながら空気により酸化された（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂｓ，Ｒａｎｃｈｏ Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，ＣＡ）。一晩室温で酸化した後、酸化された物質を、２５ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６．０および３００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液中でＳ−２００ゲルろ過カラム（ＧＥヘルスケアからの２２ｍＬのＳ２００ Ｔｒｉｃｏｒｎ）に流した。インタクトな抗体をプールし、水で１０倍に希釈した。

ＢｓＡｂタンパク質を、その後、カルボキシメチル（ＣＭ）樹脂（１ｍＬののＨｉＴｒａｐ ＣＭ−ＦＦ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いる弱陽イオン交換クロマトグラフィーにより、４．５から９．２へのｐＨ勾配溶出で精製した。緩衝液ＡとＢの組成物は、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、３０ｍＭのＭＥＳ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２０ｍＭのイミダゾール、２０ｍＭのトリス、２０ｍＭのＣＡＰＳ、及び２５ｍＭのＮａＣｌからなり、Ａ緩衝液はＨＣｌでｐＨ４．２に調整され、Ｂ緩衝液はＮａＯＨを用いてｐＨ９．２（または１０．４）に調整される。ＣＭクロマトグラフィー後に得られた精製された物質は、正確な分子組成を決定するために質量分析法で分析した（図４Ｄ）。質量スペクトル分析は、検出可能なインタクトな抗体生成物のみ分子量が１４６，０５１．８９であることを示し、これは、理論分子量が１４５，０５１．７５であるヘテロ二量体ノブ−ホール種の抗ＥＧＦＲ／抗ｃ−ｍｅｔとほぼ同じように一致する。約２ｍｇのノブ及び約２ｍｇのホールで始まるこの手順の収率は、約０．５から１ｍｇであった。

同じ手順をＦ２４１とＦ２４３突然変異を含む半抗体について行った。
実施例３：
Ｆｃの結晶化
実施例２における低収率で実証されるように、会合プロセスの最中において、一定の損失は誤って形成されたジスルフィド結合と関連している。この例は、Ｘ線結晶学によって観測されたノブ及びホールのＦｃの異なる構造形態の分析である。Ｆｃの結晶構造は、上述されたノブとホールの変異だけを含む様々なヘテロ多量体タンパク質について得られた。

結晶学のためのノブ及びホールＦｃ：
ＩｇＧ重鎖（ホール）、一本の軽鎖、及び一本の切断された重鎖Ｆｃ（ノブ）からなるワンアームドノブ・イントゥー・ホール（ｏｎｅ−ａｒｍｅｄ ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）抗体を、標準的な抗体精製法を用いて大腸菌から精製した。例えば、国際公開第２００５／０６３８１６号を参照。精製されたワンアームド抗体は、３７℃で１５分間、リジンエンドペプチダーゼ−Ｃで、１／１０００の重量／重量比で消化された。消化は、プロテアーゼ阻害剤、Ｎ−α−トシル−Ｌ−リシニル−クロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）の５μＭで停止した。インタクトなワンアームド抗体とＦＡｂは、遊離のＦｃに結合しないカッパ選択樹脂を使用してノブ−ホールＦｃから除去された。次いで、結晶化に先だって、ノブ／ホールＦｃはＳ７５カラム（ＧＥ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で精製された。得られたノブ及びＦｃ断片は以下の配列を有している（完全長ＩｇＧ１重鎖に基づく開始残基番号が与えられる）：

鎖１（ホール）（配列番号１）
２２３ ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰ ＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬ ＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭ ＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶ ＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥ ＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶ ＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲ ＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶ ＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤ ＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫ ＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩ ＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱ ＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰ ＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱ ＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦ ＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥ ＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫ ＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧ ＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶ ＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶ ＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬ ＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳ ＬＳＰＧＫ

鎖２（ノブ）（配列番号２）
２２１ ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶ ＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴ ＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴ ＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤ ＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤ ＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫ ＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹ ＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨ ＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫ ＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡ ＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫ ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴ ＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫ ＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫ ＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥ ＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮ ＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳ ＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬ ＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧ ＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥ ＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳ ＬＳＬＳＰＧＫ

結晶化条件は、タンパク質を安定化するためにプロテインＡからのｍｉｎｉＺドメインの添加を必要とした（下記Ｓｔａｒｏｖａｓｎｉｋ参照）。タンパク質は０．１５ＭのＮａＣ１、５０ｍＭのトリスｐＨ８．０にバッファー交換され、１５ｍｇ／ｍｌに濃縮された。等モル濃度のミニ（Ｍｉｎｉ−）Ｚペプチドを添加し、一晩インキュベートした。タンパク質はハンギングドロップ法により、１８℃で２０％のｗ／ｖのＰＥＧ２０００−ＭＭＥ、０．１ＭのＭＥＳ ｐＨ６．５、１０％のｖ／ｖイソプロパノールを含有するバッファーリザーバーにより１８℃で結晶化した（例えば、タンパク質結晶成長のハンギングドロップ法における溶媒平衡率の実験と理論解析。Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｇｒｏｗｔｈ，９０巻、１−３号，２ ７月 １９８８，頁１１７−１２９）を参照）。タンパク質のブレードが一週間後に形成された。データはＡＬＳビームライン５．０．２において収集された。

プロテインＡの最小バージョン、Ｂドメイン（「ミニＺ」）は以前に記載されたように調製された（Ｓｔａｒｏｖａｓｎｉｋ Ｍ．Ａ．，Ｂｒａｉｓｔｅｄ Ａ．Ｃ．，Ｗｅｌｌｓ Ｊ．Ａ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４巻，頁１００８０−１００８５）。

ノブ・イントゥー・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）ＦｃヘテロダイマーはミニＺドメインペプチドの存在で結晶化された（上述のように）。図６を参照。ミニＺドメインペプチドはＣＨ２−ＣＨ３界面に結合し、恐らくＦｃのＣＨ２領域を安定化することに役だっている。構造は２つのＣＨ３ドメインによる接触を作り、グリコシル化されていない（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）野生型ＩｇＧ１のＦｃとは有意には相違しない。

結晶学のためのノブホールＦｃ：
ノブ−ノブタンパク質ダイマーが、Ｆｃ変異体が、共有結合性の二量体化を防止するために、ヒンジのシステインをセリンへの変異により除去した単一のＦｃ鎖として発現されること、及び陽イオン交換工程を省略することを除いて、上述のように大腸菌での発現により生成された。ノブ−ノブＦｃは非共有結合性のダイマーとして存在しており、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー及びＳ２００カラム（ＧＥ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたゲル濾過の組み合わせにより単離された。精製したタンパク質を、結晶のスクリーニングに用いた。結晶成長のスクリーニングにおいて、タンパク質はＰＢＳにバッファー交換し、１０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。タンパク質は、１８℃でハングングドロップ法により、２μｌのリザーバー中に２μｌのタンパク質を含有し、２０％ｗ／ｖのＰＥＧ２０００−モノメチルエーテル（ＭＭＥ）、０．２Ｍの硫安、０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム ｐＨ６．５で結晶化した。厚いブレードが５日後に現れ、データは、２５％ｗ／ｖのＰＥＧ２０００−ＭＭＥのクライオプロテクタントを用いて、ＡＬＳビームライン５．０．１で収集した。

ノブ配列の配列は（配列番号３）であった：
２２１ ＤＫＴＨＴＳＰＰＳＰ ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶ ＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴ ＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴ ＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤ ＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤ ＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫ ＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹ ＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨ ＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫ ＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡ ＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫ ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴ ＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫ ＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫ ＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥ ＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮ ＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳ ＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬ ＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧ ＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥ ＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳ ＬＳＬＳＰＧＫ

ホール／ホール ホモダイマーは上のノブ／ノブ Ｆｃ変異体と同じ方法で調製した。

ホール配列の配列は（配列番号４）であった：
２２１ ＤＫＴＨＴＳＰＰＳＰ ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶ ＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴ ＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴ ＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤ ＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤ ＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫ ＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹ ＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨ ＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫ ＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡ ＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫ ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴ ＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫ ＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫ ＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥ ＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮ ＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳ ＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬ ＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧ ＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥ ＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳ ＬＳＬＳＰＧＫ

しかし、ホモダイマーのＦｃは、図７に素描されるように、互いに１８０°の二重特異性Ｆａｂのどちらかが存在するであろう頭尾コンフォーメーションを形成した。これはＦｃの新規なコンフォーメーションであるだけでなく、ジスルフィド対がＦｃの反対側の端にあるため、通常のヒンジの酸化を防止するであろう。適合するＦｃ無しでは、ヒンジシステインは環化し、その後再酸化されない限り、非反応性である傾向がある。従って、これらの構造は、酸化還元の非効率の一因であり得る別のコンフォメーションを示唆している。

表１は、ホモダイマー−ノブ／ノブ−及びヘテロダイマー−ノブ／ホールについてのデータ収集と精密化を示す。結晶構造解析に基づいて、接触残基についての以下の表３を作成した。
明確にするために、鎖ＡとＢは、接触の両方の組を持っている。上記の表は、２組の１つを表している。そのため、完全な表は上記リストされた接触の２倍であろう。例えば、ＡのＳ２３９はＢのＫ３７０と接触し、ＢのＳ２３９はＡのＫ３７０と接触している。

実施例４：
配向の安定化
アニーリング及び精製の最中の制限的な工程は酸化還元工程である。酸化されたヘテロダイマーは、この工程の後で典型的には、７０〜８０％のタンパク質を作りあげるだけである（ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ及びＭＳ−ＴＯＦ）。残りの２０〜３０％の抗体は二量体であり、共有結合を欠いている（ＳＥＣ−ＬＬＳ）。これは除去することは可能だが、全収率に大きく影響を与える。従って、頭尾会合を破壊し、従って二重特異性の回復を改善することができるかどうかを試験するために、我々はＦ２４１Ｓ／Ｆ２４３Ｒ変異又はＦ２４１Ｒ／Ｆ２４３Ｓ変異を含むノブＦｃを作成した。

ノブとホールＦｃは、サイズ排除クロマトグラフィーによると、ほぼ同量のホモダイマーを有している。ノブＦｃへの変異は、野生型と比較したとき（すなわちノブ変異のみ）、存在するホモダイマーの量を８３．５％ほども減少させる（図８を参照）。以下の表４を参照。

ノブ及びホール二重特異性抗体のアニーリングは、野生型ノブと比較して、Ｆｃ変異体により向上される。バイオアナライザーｉで定量化され完全な抗体の割合は、野生型の対で２７．６％、Ｆ２４１Ｓ／Ｆ２４３Ｒ変異体ノブで４６．４％、Ｆ２４１Ｒ／Ｆ２４３Ｓ変異体ノブで４５．５％である。Ｆ２４１Ｓ／Ｆ２４３Ｒ又はＦ２４１Ｒ／Ｆ２４３Ｓ変異体のどちらかを作成すると、頭尾の対の疎水性中心を破壊する。ノブ鎖へ変異を組み入れると、野生型ノブに比較してホモダイマーの量を減少させ、収率向上のために有益であると思われる。野生型ホールのみにおいて、又は野生型ノブ・イントゥー・ホールＦｃにおいて類似の変異は同様の向上をもたらすと考えられている。

グルタチオン二重特異性の経時変化
Ｆ２４１Ｓ／Ｆ２４３Ｒ変異は、二重特異性抗体間での正確なジスルフィド形成の割合を増加させた。半抗体は、室温で、２００モル過剰の還元型グルタチオンを含む２００ｍＭのアルギニンコハク酸 ｐＨ８．５の中で、１：１に混合された。反応の最中に、サンプルは以下の時点で採取された：０、３時間、６時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、及び７２時間。収集時に、等量の０．１５Ｍの酢酸で、会合反応を停止させた。次いで、サンプルをプロテイン２３０キットによりアジレント・バイオアナライザ２１００で分析した。ノブ及び／又はホール半抗体のどちらかでのＦ２４１Ｓ／Ｆ２４３Ｒ変異を利用すると、、これらの条件下で１２から４８時間の時間枠内で酸化速度を増加させる（図１０）。これは、会合速度及び全体の会合効率を増加させることにおいてこれらの変異体の利点を実証している。

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を介したノブ及びホール会合
ＢｉｏＲａｄ ＰｒｏｔｅＯｎ^ＴＭシステムを使用して、ノブ野生型、ホール野生型、ノブＦ２４１Ｒ／Ｆ２４３Ｓ，ノブＦ２４１Ｓ／Ｆ２４３Ｒ，及びホールＦ２４１Ｓ／Ｆ２４３Ｒリガンドが、ＮＨＳ活性化センサー上で固定された。分析物のノブＦ２４１Ｓ／Ｆ２４３Ｒは、２５ｍＭのＴｒｉｓ １５０ｍＭのＮａＣｌ ０．０５％のＴｗｅｅｎ２０ ｐＨ８．０の中でセンサー上を通過させた。分析物の濃度は、２００ｎＭ，１００ｎＭ，５０ｎＭ，２５ｎＭ，１２．５ｎＭ，及び６．２５ｎＭであった。ＰｒｏｔｅＯｎＴＭチップは、１０ｍＭのグリシンｐＨ３を使用して、各分析物の濃度間で再生された。データは、Ｆ２４１／Ｆ２４３変異は、ＣＨ３ヘテロ二量体化を妨げず、又はこれらの濃度でこれらの変化の有る無しに関わらず、任意の測定可能なホモ二量体化が無いことを実証していた。ヘテロダイマーのＫｄは両方の場合において一桁のナノモルの範囲である。

本明細書に記載される実施例と実施態様は例示のみを目的としており、様々な変更又はそれを踏まえた変化が当業者に示唆され、そして、添付の特許請求の範囲及び本出願の精神および範囲内に含まれるべきであることが理解される。本明細書に引用される全ての刊行物、特許及び特許出願は、全ての目的においてその全体が参考としてここに援用される。

Claims (20)

1. 野生型ＦｃポリペプチドのＦｃ変異体を含む変異体ヘテロ多量体タンパク質又は修飾型ＩｇＧ抗体であって、前記Ｆｃ変異体が、少なくとも一の重鎖の残基２４１及び２４３（ＥＵ番号付け）で、野生型Ｆｃポリペプチドに存在するものと異なるアミノ酸との置換を含み、該置換はＦ２４１Ｒ／Ｆ２４３Ｓ及びＦ２４１Ｓ／Ｆ２４３Ｒから選択される、変異体ヘテロ多量体タンパク質又は修飾型ＩｇＧ抗体。
2. ノブ・イントゥー・ホール修飾を更に含む、請求項１に記載の変異体ヘテロ多量体タンパク質又は修飾型ＩｇＧ抗体。
3. ノブ修飾が、Ｆｃポリペプチドの界面からの元のアミノ酸残基を、元のアミノ酸残基よりも大きい側鎖を持つアミノ酸残基と置換することを含み、アミノ酸残基の置換が、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン及びアルギニンからなる群から選択される、請求項２に記載の変異体ヘテロ多量体タンパク質又は修飾型ＩｇＧ抗体。
4. ノブ修飾がＴ３６６Ｗ置換（ＥＵ番号付け）を含む、請求項２又は請求項３に記載の変異体ヘテロ多量体タンパク質又は修飾型ＩｇＧ抗体。
5. ホール修飾が、Ｆｃポリペプチドの界面からの元のアミノ酸残基を、元のアミノ酸残基よりも小さい側鎖を持つアミノ酸残基と置換することを含み、置換するアミノ酸残基が、セリン、スレオニン、バリン及びアラニンからなる群から選択される、請求項２から４の何れか一項に記載の変異体ヘテロ多量体タンパク質又は修飾型ＩｇＧ抗体。
6. ホール修飾が、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ（ＥＵ番号付け）からなる群から選択される二又はそれ以上のアミノ酸置換を含む、請求項５に記載の変異体ヘテロ多量体タンパク質又は修飾型ＩｇＧ抗体。
7. ヘテロ多量体タンパク質又はＩｇＧ抗体が第一及び第二のＦｃポリペプチドを含み、Ｆ２４１Ｒ／Ｆ２４３Ｓ又はＦ２４１Ｓ／Ｆ２４３Ｒ置換を含むＦｃポリペプチドがノブ修飾を更に含む、請求項２から６の何れか一項に記載の変異体ヘテロ多量体タンパク質又は修飾型ＩｇＧ抗体。
8. ヘテロ多量体タンパク質又はＩｇＧ抗体が第一及び第二のＦｃポリペプチドを含み、Ｆ２４１Ｒ／Ｆ２４３Ｓ又はＦ２４１Ｓ／Ｆ２４３Ｒ置換を含むＦｃポリペプチドが、ホール修飾を更に含む、請求項２から６の何れか一項に記載の変異体ヘテロ多量体タンパク質又は修飾型ＩｇＧ抗体。
9. 両方の重鎖がＦ２４１Ｒ／Ｆ２４３Ｓ又はＦ２４１Ｓ／Ｆ２４３Ｒ置換を含む、請求項１から８の何れか一項に記載の変異体ヘテロ多量体タンパク質又は修飾型ＩｇＧ抗体。
10. タンパク質又は抗体が多重特異性抗体である、請求項１から９の何れか一項に記載の変異体ヘテロ多量体タンパク質又は修飾型ＩｇＧ抗体。
11. 残基２４１及び２４３（ＥＵ番号付け）においてアミノ酸置換を有しないヘテロ多量体タンパク質又はＩｇＧ抗体と比較した場合に、誤対合が減少し、頭尾形成が減少し、又は全収率が増大する、請求項１から１０の何れか一項に記載の変異体ヘテロ多量体タンパク質又は修飾型ＩｇＧ抗体。
12. 請求項１から１１の何れか一項に記載の変異体ヘテロ多量体タンパク質又は修飾型ＩｇＧ抗体をコードする単離された核酸。
13. 請求項１２に記載の核酸を含む発現ベクター。
14. 請求項１２に記載の核酸又は請求項１３に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
15. ＣＨＯ細胞、又は大腸菌細胞である、請求項１４に記載の宿主細胞。
16. 変異体ヘテロ多量体タンパク質又は修飾型ＩｇＧ抗体を産生する方法であって、請求項１４又は１５に記載の宿主細胞を培養すること、及び請求項１４又は１５に記載の宿主細胞を培養した細胞培養液から変異体ヘテロ多量体タンパク質又は修飾型ＩｇＧ抗体を回収することを含む方法。
17. 請求項１から１１の何れか一項に記載の変異体ヘテロ多量体タンパク質又は修飾型ＩｇＧ抗体を含む組成物。
18. 第一のヘテロ二量体化ドメインを有する第一のＦｃ含有ポリペプチド、及び第二のヘテロ二量体化ドメインを有する第二のＦｃ含有ポリペプチドを含むヘテロ多量体タンパク質を調製する方法であって、該第一及び／又は第二のＦｃ含有ポリペプチドが残基２４１及び２４３（ＥＵ番号付け）で置換を含み、第一及び／又は第二Ｆｃ含有ポリペプチドがＦ２４１Ｒ／Ｆ２４３Ｓ又はＦ２４１Ｓ／Ｆ２４３Ｒ置換を含む、該方法が
    （ａ）第一のヘテロ二量体化ドメインを有する精製された第一のＦｃ含有ポリペプチドを提供する工程、
    （ｂ）第二のヘテロ二量体化ドメインを有する精製された第二のＦｃ含有ポリペプチドを提供する工程、
    （ｃ）第一及び第二のＦｃ含有ポリペプチドを結合する工程、
    （ｄ）第一のＦｃ含有ポリペプチドを第二のＦｃ含有ポリペプチドと再フォールディングし、ヘテロ多量体タンパク質を形成する工程、及び
    （ｅ）ヘテロ多量体タンパク質複合体を回収する工程
    を含む方法。
19. ヘテロ多量体タンパク質を精製する工程を更に含み、ヘテロ多量体タンパク質が少なくとも２つの別個の標的に結合特異性を有する、請求項１８に記載の方法。
20. 第一及び／又は第二のＦｃ含有ポリペプチドがノブ・イントゥー・ホール修飾を更に含む、請求項１８に記載の方法。