CN103649117A - Fc变体及其生成方法 - Google Patents

Abstract

本文中描述了Fc变体及用于有效生成抗体和其它多聚体蛋白质复合物（在本文中统称为异多聚体蛋白质）的方法。异多聚体蛋白质可能能够特异性结合超过一个靶物。靶物可以是例如单一分子上的或位于不同分子上的不同表位。该方法组合了异多聚体蛋白质的有效高基因表达水平、适宜的装配、及容易的纯化。本发明还提供了使用这些异多聚体蛋白质的方法，及包含这些抗体的组合物、试剂盒和制品。

Description

Fc变体及其生成方法

对相关申请的交叉引用 

本申请要求2011年2月4日提交的、题为“Fc变体及其生成方法”的美国临时专利申请流水号61/439,750的优先权。 

发明领域

本发明涉及Fc变体、其生成方法、及包含Fc变体的抗体和Fc融合物。 

发明背景 

IgG型的单克隆抗体含有两个相同的抗原结合臂和一个恒定域(Fc)。在它们的结合臂中具有不同特异性的抗体通常不天然存在，因此不得不借助化学工程（例如化学交联、等）、重组DNA和/或细胞融合技术来创建。 

双特异性抗体能同时结合两种不同抗原。这种特性能够开发对于常规单克隆抗体不可能的治疗策略。已经开发的一大组想象出来的双特异性抗体形式反映对这些分子的强烈兴趣。参加Berg J,Lotscher E,Steimer KS,et al.,“Bispecific antibodies that mediate killing of cells infected with human immunodeficiency virus of any strain,”Proc Natl Acad Sci USA(1991)88(11):4723-4727及Fischer N and Leger O.,“Biospecific Antibodies:Molecules That Enable Novel Therapeutic Strategies,”Pathobiology(2007)74:3-14。 

另一类多特异性分子是重组融合蛋白。由免疫调节性蛋白质的胞外域和免疫球蛋白(Ig)的恒定(Fc)域组成的重组融合蛋白代表一类发展中的人治疗剂。免疫粘附素组合具有期望特异性的蛋白质序列的结合区与抗体的效应域。免疫粘附素具有两项对于它们作为治疗剂的潜力有重大意义的重要特性：靶特异性，和药动学稳定性（体内半衰期与抗体的相当）。免疫粘附素可作为拮抗剂用于抑制或阻断有害相互作用，或者可作为激动剂用于模拟或增强生理应答。参见Chamow SM,Zhang DZ,Tan XY,et al.,“A humanized,bispecific immunoadhesin-antibody that retargets CD3+effectors to kill HIV-1-infected cells,”J Hematother1995;4(5):439-446。 

其它地方已经讨论了其它多特异性分子。例子包括但不限于：Fisher et al.,Pathobiology(2007)74:3-14（各种双特异性形式的综述）；2003年12月9日公告授予Feige等人的美国专利No.6,660,843（肽体(peptibody)）；2002年1月10日公布的美国专利公开文本No.2002-004587（多特异性抗体）；2009年11月3日公告授予Wu等人的美国专利No.7612181（双重可变域形式）；美国专利No.6,534,628；Nord K et al.,Prot Eng(1995)8:601-608；Nord K et al.,Nat Biotech(1997)15:772-777；及

et al.,Biotechnol Appl Biochem.(2008)Jun;50(Pt2):97-112（Affibodies）；Martens et al.,Clin Cancer Res(2006),12:6144-6152及Jin et al.,Cancer Res(2008)68(11):4360-4368（单臂抗体）；Bostrom et al.,Science(2009)323:1610-1614（双重作用Fab，aka混合效价抗体）。本领域技术人员知道其它形式。 

临床级材料的制造对于一般的抗体，尤其对于上文所述多特异性分子仍然是挑战。如上所述，有多种路径生成具有混合结合臂（即彼此不同的结合臂）的分子。这些方法均具有其缺点。 

化学交联费力，因为可能仍需要自同二聚体和其它不想要的副产物纯化有关种类。另外，化学修饰步骤会改变蛋白质的完整性，如此导致较差的稳定性。如此，这种方法常常无效且会导致抗体活性损失。 

细胞融合技术（即杂合杂交瘤）表达两种重链和两种轻链，它们随机装配导致产生10种抗体组合。期望的异多聚体抗体只是如此生成的抗体中的一小部分。期望异多聚体蛋白质的纯化显著降低生产产量并提高制造成本。 

重组DNA技术已经用于生成不包含Fc域的各种异多聚体形式，例如单链Fv、双抗体、等。这种类型的抗体分子的主要缺点是缺乏Fc域和因此抗体触发效应器功能（例如补体活化、Fc受体结合等）的能力。如此，想要包含功能性Fc域的双特异性抗体。 

重组DNA技术还已经用于生成“节入穴”双特异性抗体。参见美国专利申请20030078385（Arathoon等人-Genentech）。这种策略的一项约束是两种亲本抗体的轻链必须相同以防止错配和形成不想要的和/或无活性的分子（由于在同一细胞中表达）。 

另外，退火和纯化期间的限制性事件是氧化还原效率。氧化的异二聚体通常只占这个步骤后蛋白质的70-80%（BioAnalyzer和MS-TOF）。剩余20-30%的抗体是二聚体且缺乏共价连接（SEC-LLS）。这可以消除但显著影响总体 产量。如此，仍然需要改进抗体生成，尤其是异二聚体的总体产量。本文中描述了可改进抗体、异二聚体诸如此类的总体产量的Fc变体以及用于生成它们的方法。本发明的这些和其它方面和优点根据对本文中提供的发明的描述会是明显的。 

发明概述 

使用当前技术生成异多聚体蛋白质（例如多特异性抗体）具有一些缺点，包括生成产物混合物、产量降低和效应器功能降低/消除等等。如此，期望高效且高水平生成异多聚体蛋白质。 

通过各种手段生成抗体分子一般得到较好理解。例如，美国专利6331415（Cabilly等人）记载了一种用于重组生成免疫球蛋白的方法，其中同时自单一载体或自两个分开的载体（在单一细胞中）表达重和轻链。Wibbenmeyer等人（1999,Biochim Biophys Acta1430(2):191-202）及Lee和Kwak（2003,J.Biotechnology101:189-198）记载了自使用在分开的大肠杆菌培养物中表达的质粒分开生成的重和轻链生成单克隆抗体。与抗体生成有关的各种其它技术记载于例如Harlow,et al.,ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1988)及WO2006028936。这些均仍存在缺点，诸如低产量、使用化学品、等。 

本文中公开了在为改进异多聚体蛋白质生成中的总体产量提供基础的氨基酸残基处包含至少两处突变的Fc变体。 

本发明提供一种简单且有效的生产工艺/方法，其容许经济地生成包含变体Fc多肽的异多聚体蛋白质（例如多特异性抗体）。 

在第一个实施方案中，提供了变体异多聚体蛋白质，其包含野生型Fc多肽的Fc变体。在各种实施方案中，Fc变体在所述野生型Fc多肽的Fc区中包含至少一处、两处、三处、四处、五处、六处、七处、八处、九处或十处氨基酸修饰，导致与野生型Fc多肽相比展现降低的错配（例如节/节配对）、降低的头-尾形成或升高的总体产量的变体蛋白质。在一些实施方案中，优选的是Fc变体包含两处、三处或四处能够破坏同二聚体形成的氨基酸修饰，如本文中描述的。在一些实施方案中，Fc变体包含至少一条重链上残基241和243处用与野生型Fc多肽中存在的氨基酸不同的氨基酸进行的替代。在一些实施方案中，至少一条重链上的突变选自F241R/F243S和F241R/F243S。在一些实 施方案中，Fc变体进一步包含节-入-穴修饰(knob-into-hole modification)。 

在第二个实施方案中，提供了一种分离的核酸，其编码本文中描述的变体异多聚体蛋白质或经过修饰的IgG抗体。 

在第三个实施方案中，提供了一种表达载体，其编码本文中描述的变体异多聚体蛋白质或经过修饰的IgG抗体。 

在第四个实施方案中，提供了一种宿主细胞，其包含本文中描述的核酸分子或包含该核酸分子的表达载体。在一些实施方案中，宿主细胞为CHO细胞。在一些实施方案中，宿主细胞为大肠杆菌细胞。 

在一个实施方案中，生成本文所述变体异多聚体蛋白质或经过修饰的IgG抗体的方法包括： 

(a)培养宿主细胞；并 

(b)自细胞培养物回收变体异多聚体蛋白质或经过修饰的IgG抗体。 

在一些实施方案中，所述回收包含裂解细胞。 

在一些实施方案中，制备异多聚体蛋白质（包括包含具有第一异二聚化域的含第一Fc多肽和具有第二异二聚化域的第二含Fc多肽的异多聚体蛋白质）的方法，其中第二异二聚化域与第一异二聚化域相互作用，且其中第一和第二含Fc多肽通过至少一个链间二硫键连接，该方法包括下述步骤： 

(a)提供纯化的具有第一异二聚化域的第一含Fc多肽； 

(b)提供纯化的具有第二异二聚化域的第二含Fc多肽； 

(c)组合第一和第二含Fc多肽； 

(d)将第一含铰链多肽与第二含铰链多肽重折叠；并 

(e)回收所述异多聚体蛋白质复合物。 

在一些实施方案中，第一和第二含Fc多肽进一步包含便于含Fc多肽相对于彼此正确取向的突变。在一些实施方案中，突变包含至少一条重链上残基241和243处用与野生型Fc多肽中存在的氨基酸不同的氨基酸进行的替代。 

在一个实施方案中，提供了通过本文所述方法生成的异多聚体蛋白质。 

要理解，本发明的方法可包括其它步骤，它们一般是对于启动和/或完成本文所述发明的方法涵盖的过程而言明显的例行步骤。例如，在一个实施方案中，本发明方法的步骤(a)之前有这样的步骤，其中将编码Fc变体多肽的核酸导入第一宿主细胞，并将编码第二含铰链多肽的核酸导入第二宿主细胞。在一个实施方案中，本发明方法进一步包含纯化对至少两种不同靶物具有结 合特异性的异多聚体蛋白质的步骤。在一个实施方案中，在纯化异多聚体蛋白质的步骤之前不超过约10%、15%、20%或30%的分离的多肽以单体和/或重-轻链二聚体存在。在一个实施方案中，单体可以少于约30%的不想要的多肽污染物，该污染物需要在纯化异多聚体蛋白质之前除去。 

在一个实施方案中，第一和/或第二含Fc多肽是抗体重链。在又一个实施方案中，抗体重链与抗体轻链配对以提供重-轻链对。在一些实施方案中，重-轻链对共价连接。在另一个实施方案中，重-轻链对定义靶物结合臂。在一些实施方案中，靶物结合臂是相同的。在一些实施方案中，靶物结合臂各识别两种不同靶物。 

在另一个实施方案中，第一和/或第二含Fc多肽包含可变重链域。在另一个实施方案中，第一和/或第二含Fc多肽包含受体结合域。在一些实施方案中，第一和/或第二含Fc多肽是基本上相同的（即异二聚化域可以是不同的，而异二聚化域以外的区域是相同的）。在一些实施方案中，第一和/或第二含Fc多肽是不同的。 

在一些实施方案中，异多聚体蛋白质选自下组：抗体，双特异性抗体，多特异性抗体，单臂抗体，单特异性单价抗体，多特异性单价抗体，双特异性聚体(maxibody)，免疫粘附素，肽体(peptibody)，双特异性肽体，单价肽体，亲合体(affibody)和受体融合蛋白。 

在一些实施方案中，所述异多聚体蛋白质包含具有至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、或任何整数直至所有在正常情况下能够形成重链间二硫化物连接的半胱氨酸残基的铰链区。在一些实施方案中，将别的半胱氨酸引入铰链区中。 

本发明的异多聚体蛋白质也可以是抗体片段，诸如例如Fc或Fc融合多肽，只要它包含免疫球蛋白的Fc区。Fc融合多肽一般包含融合至异源多肽序列（诸如抗原结合域）的Fc多肽（或其片段），诸如融合至免疫球蛋白Fc多肽的受体胞外域(ECD)（例如融合至IgG2Fc的Flt受体ECD）。例如，在一个实施方案中，Fc融合多肽包含VEGF结合域，其可以是VEGF受体，其包括flt、flk、等。本发明的异多聚体蛋白质一般包含重链恒定域和轻链恒定域。在一个实施方案中，本发明的异多聚体蛋白质包含修饰（例如但不限于插入一个或多个氨基酸，例如为了形成二聚化序列诸如亮氨酸拉链），用于形成重链间二聚化或多聚化。在这些实施方案的一些中，异多聚体蛋白质包含二聚化 域（诸如亮氨酸拉链序列），例如融合至重链片段的C端。在这些实施方案的一些中，异多聚体蛋白质包含二聚化域，其包含突变以提供“节入穴”二聚化域（如下文进一步定义的）。 

在本发明的方法和异多聚体蛋白质的一些实施方案中，含Fc多肽包含至少一项特征，其促进含Fc多肽相对于彼此正确取向，同时改进第一和第二含Fc多肽的总体产量。此类特征改进通过本文中描述的发明的方法可获得的异多聚体蛋白质群体的产量和/或纯度和/或同质性。在一个实施方案中，第一含Fc多肽和第二含Fc多肽的Fc多肽在界面处相遇/相互作用。在其中第一和第二含Fc多肽的Fc多肽在界面处相遇的一些实施方案中，第二Fc多肽的界面包含的隆起可放置在第一Fc多肽的界面中的空腔中。在一个实施方案中，第一Fc多肽已经自模板/初始多肽改变以编码空腔，或者第二Fc多肽已经自模板/初始多肽改变以编码隆起，或二者兼之。在一个实施方案中，第一Fc多肽已经自模板/初始多肽改变以编码空腔且第二Fc多肽已经自模板/初始多肽改变以编码隆起，或二者兼之。在一个实施方案中，第二Fc多肽的界面包含的隆起可放置在第一Fc多肽的界面中的，其中空腔或隆起或二者已经分别引入第一和第二Fc多肽的界面中。在其中第一和第二Fc多肽在界面处相遇的一些实施方案中，第一Fc多肽的界面包含的隆起可放置在第二Fc多肽的界面中的空腔中。在一个实施方案中，第二Fc多肽已经自模板/初始多肽改变以编码空腔，或者第一Fc多肽已经自模板/初始多肽改变以编码隆起，或二者兼之。在一个实施方案中，第二Fc多肽已经自模板/初始多肽改变以编码空腔且第一Fc多肽已经自模板/初始多肽改变以编码隆起，或二者兼之。在一个实施方案中，第一Fc多肽的界面包含的隆起可放置在第二Fc多肽的界面中的空腔中，其中隆起或空腔或二者已经分别引入第一和第二Fc多肽的界面中。 

在一个实施方案中，隆起和空腔各自包含天然存在氨基酸残基。在一个实施方案中，包含隆起的Fc多肽如下生成，即将来自模板/初始多肽的界面的初始残基用具有比初始残基更大的侧链体积的输入残基替换。在一个实施方案中，包含隆起的Fc多肽通过如下方法生成，其包括其中将编码来自所述多肽的界面的初始残基的核酸用编码具有比初始更大的侧链体积的输入残基的核酸替换的步骤。在一个实施方案中，初始残基为苏氨酸。在一个实施方案中，输入残基为精氨酸(R)。在一个实施方案中，输入残基为苯丙氨酸(F)。在一个实施方案中，输入残基为酪氨酸(Y)。在一个实施方案中，输入残基 为色氨酸(W)。在一个实施方案中，输入残基为R、F、Y或W。在一个实施方案中，通过替换模板/初始多肽中的两个或更多个残基来生成隆起。在一个实施方案中，包含隆起的Fc多肽包含将第366位苏氨酸用色氨酸替换，氨基酸编号方式依照Kabat et al.(pp.688-696in Sequences of proteins of immunological interest,5th ed.,Vol.1(1991;NIH,Bethesda,MD))的EU编号方案。 

在一些实施方案中，包含空腔的Fc多肽如下生成，即将模板/初始多肽的界面中的初始残基用具有比初始残基更小的侧链体积的输入残基替换。例如，包含空腔的Fc多肽可以通过如下方法生成，其包括其中将编码来自所述多肽的界面的初始残基的核酸用编码具有比初始更小的侧链体积的输入残基的核酸替换的步骤。在一个实施方案中，初始残基为苏氨酸。在一个实施方案中，初始残基为亮氨酸。在一个实施方案中，初始残基为酪氨酸。在一个实施方案中，输入残基不是半胱氨酸(C)。在一个实施方案中，输入残基为丙氨酸(A)。在一个实施方案中，输入残基为丝氨酸(S)。在一个实施方案中，输入残基为苏氨酸(T)。在一个实施方案中，输入残基为缬氨酸(V)。可以通过替换模板/初始多肽的一个或多个初始残基来生成空腔。例如，在一个实施方案中，包含空腔的Fc多肽包含替换两个或更多个选自下组的初始氨基酸：苏氨酸，亮氨酸和酪氨酸。在一个实施方案中，包含空腔的Fc多肽包含两个或更多个选自下组的输入残基：丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸和缬氨酸。在一些实施方案中，包含空腔的Fc多肽包含替换两个或更多个选自下组的初始氨基酸：苏氨酸，亮氨酸和酪氨酸，且其中所述初始氨基酸用选自下组的输入残基替换：丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸和缬氨酸。在一个实施方案中，包含空腔的Fc多肽包含将第366位苏氨酸用丝氨酸替换，氨基酸编号方式依照Kabat等人，见上文的EU编号方案。在一个实施方案中，包含空腔的Fc多肽包含将第368位亮氨酸用丙氨酸替换，氨基酸编号方式依照Kabat等人，见上文的EU编号方案。在一个实施方案中，包含空腔的Fc多肽包含将第407位酪氨酸用缬氨酸替换，氨基酸编号方式依照Kabat等人，见上文的EU编号方案。在一个实施方案中，包含空腔的Fc多肽包含两个或更多个选自下组的氨基酸替换：T366S，L368A和Y407V，氨基酸编号方式依照Kabat等人，见上文的EU编号方案。在这些抗体片段的一些实施方案中，包含隆起的Fc多肽包含将第366位苏氨酸用色氨酸替换，氨基酸编号方式依照Kabat等人，见上文的 EU编号方案。 

在一个实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽的界面已经突变以包含至少一条重链上残基241和243处用与野生型Fc多肽中存在的氨基酸不同的氨基酸进行的替代。在一些实施方案中，至少Fc多肽（例如一条重链）上的突变选自F241R/F243S和F241R/F243S。在一些实施方案中，Fc变体进一步包含节-入-穴修饰。 

在各种实施方案中，第一和第二重链多肽的Fc多肽可以相同或不同，前提是它们能够二聚化以形成Fc区（如本文中定义的）。第一Fc多肽一般连续连接至单一多肽中的一个或多个免疫球蛋白重链域，例如具有铰链、恒定和/或可变域序列。在一个实施方案中，第一Fc多肽包含铰链序列的至少一部分（包括整个）、C_H2域的至少一部分（包括整个）和/或C_H3域的至少一部分（包括整个）。在一个实施方案中，第一Fc多肽包含免疫球蛋白的铰链序列和C_H2和C_H3域。在一个实施方案中，第二Fc多肽包含铰链序列的至少一部分（包括整个）、C_H2域的至少一部分（包括整个）和/或C_H3域的至少一部分（包括整个）。在一个实施方案中，第二Fc多肽包含免疫球蛋白的铰链序列和C_H2和C_H3域。在一个实施方案中，本发明的抗体包含第一和第二Fc多肽，它们各自包含至少一个抗体恒定域的至少一部分。在一个实施方案中，抗体恒定域是C_H2和/或C_H3域。在本发明抗体包含恒定域的任何实施方案中，抗体恒定域可以来自任何免疫球蛋白类别，例如IgG。免疫球蛋白来源可以是任何合适物种来源（例如IgG可以是人IgG₁）或合成形式。 

在一个实施方案中，分别在本发明抗体的第一和第二靶物分子结合臂中的第一轻链多肽和第二轻链多肽包含不同/独特抗原结合决定簇（例如不同/独特可变域序列）。在一个实施方案中，分别在本发明抗体的第一和第二靶物分子结合臂中的第一轻链多肽和第二轻链多肽包含相同（即共同）抗原结合决定簇（例如相同可变域序列）。 

本发明的方法能够以高同质性生成异多聚体分子。因而，本发明提供了方法，其中至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%的多肽在包含第一重和轻链多肽对和第二重和轻链多肽对的复合物中。在一个实施方案中，本发明提供了方法，其中介于约60和99%、70和98%、75和97%、80和96%、85和96%、或90和95%之间的多肽在包含第一重和轻链多肽对和第二重和轻链多肽对的复 合物中。 

在一个实施方案中，本发明的抗体选自下组：IgG，IgE，IgA，IgM和IgD。在一些实施方案中，本发明的抗体的铰链区优选为选自下组的免疫球蛋白的：IgG，IgA和IgD。例如，在一些实施方案中，抗体或抗体铰链区是IgG的，其在一些实施方案中是IgG1或IgG2（例如IgG2a或IgG2b）。在一些实施方案中，本发明的抗体选自下组：IgG，IgA和IgD。在一个实施方案中，抗体是人、人源化、嵌合或非人（例如鼠）起源的。 

本发明的异多聚体蛋白质一般能够结合（优选特异性地）抗原。此类抗原包括例如肿瘤抗原、细胞存活调节因子、细胞增殖调节因子、与（例如知道或怀疑在功能上有助于）组织发育或分化的相关的分子、细胞表面分子、淋巴因子、细胞因子、涉及细胞周期调节的分子、涉及脉管发生(vasculogenesis)的分子和与（例如知道或怀疑在功能上有助于）血管发生(angiogenesis)相关的分子。本发明的异多聚体蛋白质能够结合的抗原可以是上述范畴之一的子集的成员，其中所述范畴的其它子集包含具有不同特征（就感兴趣抗原而言）的其它分子/抗原。也可以认为感兴趣抗原属于两个或更多个范畴。在一个实施方案中，本发明提供了结合（优选特异性地）并非细胞表面分子的肿瘤抗原的异多聚体蛋白质。在一个实施方案中，肿瘤抗原是细胞表面分子，诸如受体多肽。在另一个例子中，在一些实施方案中，本发明的异多聚体蛋白质结合（优选特异性地）并非簇分化因子的肿瘤抗原。在另一个例子中，本发明的异多聚体蛋白质能够结合（优选特异性地）促分化因子，其在一些实施方案中不是例如CD3或CD4。在一些实施方案中，本发明的异多聚体蛋白质是抗VEGF抗体。在一些实施方案中，本发明的异多聚体蛋白质是选自下组的双特异性抗体：IL-lα/IL-lβ，IL-12/IL-18；IL-13/IL-9；IL-13/IL-4；IL-13/IL-5；IL-5/IL-4；IL-13/IL-lβ；IL-13/IL-25；IL-13/TARC；IL-13/MDC；IL-13/MEF；IL-13/TGF-β；IL-13/LHR激动剂；IL-12/TWEAK，IL-13/CL25；IL-13/SPRR2a；IL-13/SPRR2b；IL-13/ADAM8，IL-13/PED2，IL17A/IL17F，CD3/CD19，CD138/CD20；CD138/CD40；CD19/CD20；CD20/CD3；CD38/CD138；CD38/CD20；CD38/CD40；CD40/CD20；CD-8/IL-6；CD20/BR3，TNFα/TGF-β，TNFα/IL-lβ；TNFα/IL-2，TNFα/IL-3，TNFα/IL-4，TNFα/IL-5，TNFα/IL6，TNFα/IL8，TNFα/IL-9，TNFα/IL-10，TNFα/IL-11，TNFα/IL-12，TNFα/IL-13，TNFα/IL-14，TNFα/IL-15，TNFα/IL-16， TNFα/IL-17，TNFα/IL-18，TNFα/IL-19，TNFα/IL-20，TNFα/IL-23，TNFα/IFNα，TNFα/CD4，TNFα/VEGF，TNFα/MIF，TNFα/ICAM-1，TNFα/PGE4，TNFα/PEG2，TNFα/RANK配体，TNFα/Te38；TNFα/BAFF；TNFα/CD22；TNFα/CTLA-4；TNFα/GP130；TNFα/IL-12p40；VEGF/HER2，VEGF-A/HER2，VEGF-A/PDGF，HER1/HER2，VEGF-A/VEGF-C，VEGF-C/VEGF-D，HER2/DR5,VEGF/IL-8，VEGF/MET，VEGFR/MET受体，VEGFR/EGFR，HER2/CD64，HER2/CD3，HER2/CD16，HER2/HER3；EGFR/HER2，EGFR/HER3，EGFR/HER4，IL-13/CD40L，IL4/CD40L，TNFR1/IL-1R，TNFR1/IL-6R，TNFR1/IL-18R，EpCAM/CD3，MAPG/CD28，EGFR/CD64，CSPGs/RGM A；CTLA-4/BTNO2；IGF1/IGF2；IGF1/2/Erb2B；MAG/RGM A；NgR/RGM A；NogoA/RGM A；OMGp/RGM A；PDL-I/CTLA-4；和RGMA/RGM B，IL1β/IL18，NRP1/VEGFA，VEGFA/NRP2，cMET/EGFR，ALK1/BMP9，VEGFA/α5β1，HER1/HER3-BU，和CMV。在一些实施方案中，本发明的异多聚体蛋白质结合至少两种选自下组的靶物分子：α5β1，ALK1，BMP9，IL-lα，IL-lβ，TARC，MDC，MEF，TGF-β，LHR激动剂，TWEAK，CL25，SPRR2a，SPRR2b，ADAM8，PED2，CD3，CD4，CD16，CD19，CD20，CD22，CD28，CD40，CD38，CD64，CD138，CD-8，BR3，TNFα，TGF-β，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，IL-16，IL-17，IL-17A，IL-17F，IL-18，IL-19，IL-20，IL-23，IL-25，IFNα，MIF，ICAM-1，PGE4，PEG2，RANK配体，Te38，BAFF，CTLA-4，GP130，IL-12p40，VEGF，VEGF-A，PDGF，HER1，HER2，HER3，HER3-BU，HER4，VEGF-C，VEGF-D，DR5，cMET，MET，MET受体，VEGFR，EGFR，CD40L，TNFR1，IL-1R，IL-6R，IL-18R，EpCAM，MAPG，CSPGs，BTNO2，IGF1，IGF2，IGF1/2，Erb2B，MAG，NgR，NogoA，NRP1，NRP2，OMGp，PDL-I，RGM A和RGM B。在一些实施方案中，本发明的异多聚体蛋白质结合CD3和至少一种选自BLR1、BR3、CD19、CD20、CD22、CD72、CD79A、CD79B、CD180(RP105)、CR2、FcRH1、FcRH2、FcRH5、FCER2、FCRL4、HLA-DOB、和NAG14的别的靶物分子。 

本发明的方法中的第一和第二宿主细胞可以以任何允许表达和分离感兴趣多肽的设置来培养。例如，在一个实施方案中，本发明的方法中的第一宿主细胞和第二宿主细胞作为分开的细胞培养物来培养。在另一个实施方案 中，本发明的方法中的第一宿主细胞和第二宿主细胞作为包含这两种宿主细胞的混合培养物来培养。 

异多聚体蛋白质可以进行修饰以增强和/或添加别的期望特征。此类特征包括生物学功能诸如免疫效应器功能、期望的体内半衰期/清除、生物利用度、生物分布或其它药动学特征。此类修饰是本领域公知的且也可以凭经验确定，而且可以包括通过可以基于或不基于肽的模块进行的修饰。例如，抗体可以是糖基化的或无糖基化的，一般至少部分取决于宿主细胞的性质。优选地，本发明的抗体是无糖基化的。通过本发明的方法生成的无糖基化抗体可以随后糖基化，例如通过使用本发明公知的体外糖基化方法。如上文和本文所述，本发明的异多聚体蛋白质可以在原核细胞中生成，诸如例如大肠杆菌。大肠杆菌生成的异多聚体蛋白质一般是无糖基化且缺乏在正常情况下与在哺乳动物宿主细胞（例如CHO）生成的异多聚体蛋白质中找到的糖基化概况相关的生物学功能。 

本发明还提供了免疫缀合物，其包含与异源模块缀合的本发明异多聚体蛋白质。任何异源模块会是合适的，只要它与抗体的缀合没有实质性降低期望的抗体功能和/或特征。例如，在一些实施方案中，免疫缀合物包含的异源模块是细胞毒剂。在一些实施方案中，所述细胞毒剂选自下组：放射性同位素，化疗剂和毒素。在一些实施方案中，所述毒素选自下组：加利车霉素(calichemicin)，美登素(maytansine)和单端孢菌素(trichothene)。在一些实施方案中，免疫缀合物包含的异源模块是可检测标志物。在一些实施方案中，所述可检测标志物选自下组：放射性同位素，配体-受体对的成员，酶-底物对的成员和荧光共振能量转移对的成员。 

在一个实施方案中，本发明提供了组合物，其包含本发明异多聚体蛋白质和载体，载体在一些实施方案中是药学可接受的。 

在另一个实施方案中，本发明提供了组合物，其包含本文所述免疫缀合物和载体，载体在一些实施方案中是药学可接受的。 

在一个实施方案中，本发明提供了组合物，其包含一群本发明多特异性异多聚体蛋白质。正如对本领域技术人员会是明显的，一般此类组合物不会是完全（即100%）均质。然而，如本文中描述的，本发明的方法能够生成基本上同质的一群多特异性异多聚体蛋白质。例如，本发明提供了包含异多聚体蛋白质的组合物，其中至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%的所述异多聚体蛋白质是本文所述发明的多特异性抗体（例如双特异性抗体、等）。 

在另一个实施方案中，本发明提供了制品，其包括容器和其中装的组合物，其中该组合物包含本发明的异多聚体蛋白质（例如抗体）。在另一个实施方案中，本发明提供了制品，其包括容器和其中装的组合物，其中该组合物包含本文所述免疫缀合物。在一些实施方案中，这些制品进一步包含使用所述组合物的用法说明书。 

在还有另一个实施方案中，本发明提供了多核苷酸，其编码本发明的异多聚体蛋白质。在还有另一个实施方案中，本发明提供了多核苷酸，其编码本文所述免疫缀合物。在一些实施方案中，核酸（即多核苷酸）是分离的。 

在一个实施方案中，本发明提供了重组载体，其用于表达本发明的分子（例如抗体）。在另一个实施方案中，本发明提供了重组载体，其用于表达本发明的免疫缀合物。 

本发明的方法中可以使用多种宿主细胞任一。此类细胞是本领域已知的（本文中描述了其中一些），或者可以关于使用本领域已知的例行技术在本发明的方法中使用的合适性凭经验确定。在一个实施方案中，宿主细胞是原核的。在一些实施方案中，宿主细胞是革兰氏阴性细菌细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌。在一些实施方案中，大肠杆菌是脂蛋白缺陷(Δlpp)菌株的。在一些实施方案中，大肠杆菌宿主细胞的基因型缺乏degP和prc基因且包含突变型spr基因。在一个实施方案中，宿主细胞是哺乳动物，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。 

在一个实施方案中，本发明提供了宿主细胞，其包含本发明的多核苷酸或重组载体。在一个实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是原核细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是革兰氏阴性细菌细胞，其在一些实施方案中是大肠杆菌。在本发明的方法中，本发明的宿主细胞可以进一步包含编码如下分子的多核苷酸或重组载体，该分子在宿主细胞中的表达提高异多聚体蛋白质的产量。例如，此类分子可以是伴侣蛋白。在一个实施方案中，所述分子是选自下组的原核多肽：DsbA，DsbC，DsbG和FkpA。在一些实施方案中，所述多核苷酸或重组载体编码DsbA和DsbC二者。在一些实施方案中，大肠杆菌宿主细胞是内源蛋白酶活性缺陷的菌株的。在一些实施方案中，大肠杆菌宿主细胞 的基因型为缺乏degP和prc基因且包含突变型spr基因的大肠杆菌菌株的。在一些实施方案中，大肠杆菌宿主细胞的基因型为Δlpp。 

本发明的异多聚体蛋白质在多种设置中找到多种用途。在一个例子中，本发明的异多聚体蛋白质是治疗性抗体。在另一个例子中，本发明的异多聚体蛋白质是激动性抗体。在另一个例子中，本发明的异多聚体蛋白质是拮抗性抗体。本发明的异多聚体蛋白质也可以是诊断性抗体。在还有另一个例子中，本发明的异多聚体蛋白质是阻断性抗体。在另一个例子中，本发明的异多聚体蛋白质是中和性抗体。 

在一个实施方案中，本发明提供了在受试者中治疗或延迟疾病的方法，所述方法包括将本发明的异多聚体蛋白质施用于所述受试者。在一个实施方案中，疾病是癌症。在另一个实施方案中，疾病与血管发生失调相关。在另一个实施方案中，疾病是免疫病症，诸如类风湿性关节炎、免疫性血小板减少性紫癜、系统性红斑狼疮、等。 

在一个实施方案中，本发明提供了本发明的异多聚体蛋白质（例如抗体）在制备用于治疗性和/或预防性处理疾病（诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性病症、免疫（诸如自身免疫）病症和/或血管发生相关病症）的药物中的用途。 

在一个实施方案中，本发明提供了本发明的核酸在制备用于治疗性和/或预防性处理疾病（诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性病症、免疫（诸如自身免疫）病症和/或血管发生相关病症）的药物中的用途。 

在一个实施方案中，本发明提供了本发明的表达载体在制备用于治疗性和/或预防性处理疾病（诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性病症、免疫（诸如自身免疫）病症和/或血管发生相关病症）的药物中的用途。 

在一个实施方案中，本发明提供了本发明的宿主细胞在制备用于治疗性和/或预防性处理疾病（诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性病症、免疫（诸如自身免疫）病症和/或血管发生相关病症）的药物中的用途。 

在一个实施方案中，本发明提供了本发明的制品在制备用于治疗性和/或预防性处理疾病（诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性病症、免疫（诸如自身免疫）病症和/或血管发生相关病症）的药物中的用途。 

在一个实施方案中，本发明提供了本发明的试剂盒在制备用于治疗性和/或预防性处理疾病（诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性病症、免疫（诸如自身免疫）病症和/或血管发生相关病症）的药物中的用途。 

根据下面的详细描述，本发明的其它目的、特征和优点会变得明显。然而，应当理解，详细描述和具体实施例虽然指出本发明的优选实施方案，但是仅仅作为例示给出，因为根据此详细描述，本发明的范围和精神内的各种改变和修饰对本领域技术人员会变得明显。 

附图简述 

图1A图示完全氧化的半抗体。未显示“节”或“穴”或其它异二聚化域。此图中描绘的半抗体是IgG1同种型。本领域技术人员会领会，其它免疫球蛋白同种型可作为具有对应链间键和链内键的半抗体来设想。在完整抗体中，铰链半胱氨酸会形成链间二硫键。 

图1B图示全长双特异性抗体。没有描绘铰链区中的重链间二硫键。 

图2A和B图示分别编码节和穴半抗体的质粒。 

图3图示使用分开改造和表达的半抗体生成异多聚体蛋白质，例如双特异性抗体。生成的BsAb通常具有两条不同的重链，各自与其关联轻链配对。在这种方法中，每种半抗体的每条轻链不必相同。 

图4A是使用分开改造和表达的半抗体生成双特异性抗体的流程图。在这种方法中，使用氧化还原化学。 

图4B显示考马斯染色的凝胶。在还原性和非还原性条件下通过SDS-PAGE分析两种半抗体。在非还原性条件下每种半抗体的主要级分是75kD轻链-重链对。在还原性条件（例如用DTT处理）下，每条链作为分开的条带可见。 

图4C显示有和无1mM N-乙基马来酰亚胺（NEM）处理下半抗体的ESI-TOF质谱术结果。在用NEM处理时没有观察到半抗体的质量变化，指示所有半胱氨酸被完全氧化。氧化型铰链半胱氨酸在所描绘的氨基酸序列中作为环状二硫化物呈现。半抗体的预期质量为72,548道尔顿，这是通过质谱术观察到的，指示没有共价加合物。 

图4D显示抗EGFR/抗c-met双特异性抗体生成的羧甲基（CM）层析图、SDS-PAGE凝胶的照片和去卷积质量。CM层析生成单峰，其随后通过SDS-PAGE来分析。凝胶上的主要条带是全长（即完整）双特异性抗体。在75kD范围处还能看到次要条带。随后通过质谱术分析主要条带，并指示唯一可检测到的完整抗体产物符合抗EGFR/抗c-met双特异性抗体的理论MW。 

图5是使用分开改造和表达的半抗体大规模生成双特异性抗体的流程图。 

图6是节-入-穴Fc异二聚体的图示。在mini-Z域肽存在下使异二聚体结晶（未显示）。使mini-Z肽结合至C_H2-C_H3界面，并推测帮助稳定Fc的C_H2区。节和穴结构与两个C_H3域接触，而且与无糖基化野生型IgG₁Fc没有显著差异。 

图7是Fc晶体结构分析提示的头-尾配对的图示。该配对可能是氧化还原无效的部分原因。Fc的头-尾配对引起一部分抗体逃脱铰链二硫化物配对。虽然是二聚体，但是它们真正身份的不确定性要求清除它们。这影响退火过程的总体产量/效率，而且仍然是平台改进的靶。 

图8A-D显示不同Fc变体的二聚体含量。Fc的凝胶过滤分析显示不同的二聚化含量。节突变体展现与节和穴二者的野生型形式相比减少的非共价同二聚化。 

图9显示节-节Fc之间的接触区域。小图A显示疏水性接触。节-节Fc同二聚体作为卡通画着色，其中链A为浅色阴影，链B为深色阴影。链A的CH2域中的疏水性残基Y349、L368、K370、F405和Y407与链B的CH3域中的残基F241、F243、V262、和V264联合。P395和P396创建两个CH2域之间的疏水性口袋。小图B显示亲水性接触。节-节Fc同二聚体作为卡通画着色，其中链A为浅色阴影，链B为深色阴影。链A的CH2域中的残基T350、K370、和D399与链B的CH3域中的残基S239、V240、R301、和K334联合。N389、Y391和K392形成两个CH2域之间的相互作用。 

图10是柱形图，显示二硫化物形成，产生正确节-入-穴异二聚体的比率。当将半抗体初始混合在一起时，在时间零看到低水平的同二聚体。随着还原型谷胱甘肽开始还原铰链二硫化物，同二聚体开始消失。随着时间过程前行，谷胱甘肽开始氧化过程，而且看到完整IgG形成的增多。 

图11是来自使用固定化配体进行的实验的一系列表面等离振子共振（SPR）谱曲线。使分析物在配体上通过，并监测同二聚化。在6.25nM、12.5nM、25nM、50nM、100nM和200nM测试分析物浓度。配体是：（A）节野生型，（B）穴野生型，（C）节F241R/F243S，（D）节F241S/F243R，和（E）穴F241S/F243R。y轴显示响应单位，而x周是时间（秒）。 

缩写 

ADCC=抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 

API=抗病原体免疫粘附素 

BPI=杀菌/通透性提高蛋白 

C1q=补体因子1q 

CD=分化簇 

CDC=补体依赖性细胞毒性 

CH1或C_H1=重链第一恒定域 

CH2或C_H2=重链第二恒定域 

CH3或C_H3=重链第三恒定域 

CH4或C_H4=重链第四恒定域 

CL或C_L=轻链恒定域 

CTLA=细胞毒性T淋巴细胞相关分子 

Fc=可结晶片段 

FcγR=IgG的Fc部分的受体伽马 

HIV=人免疫缺陷病毒 

ICAM=细胞间粘附分子 

BsAb=双特异性抗体 

BsDb=双特异性双抗体 

dsFv=二硫化物稳定化Fv 

Fc=抗体的恒定片段 

Fd=抗体的V_H+C_H1 

FcR=Fc受体 

Fv=抗体的可变片段 

IgG=免疫球蛋白G 

mAb=单克隆抗体 

PBL=外周血淋巴细胞 

scDb=单链双抗体 

scFv=单链Fv 

(scFv)₂=scFv-scFv串联物 

Tandab=串联双抗体 

VH或V_H=抗体的重链可变域 

VL或V_L=抗体的可变域轻链 

发明详述 

现在会通过提述来详细描述本发明，只使用下面的定义和实施例。通过述及明确收录本文中述及的所有专利和出版物，包括此类专利和出版物内公开的所有序列。 

除非本文中另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员常规理解相同的含义。Singleton,et al.,DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY,2D ED.,John Wiley and Sons,New York(1994)及Hale&Marham,THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY,Harper Perennial,NY(1991)给技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般词典。虽然与本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料均可用于实施或测试本发明，但是描述了优选方法和材料。数值范围包括限定范围的数值。除非另有说明，核酸从左到右以5'至3'方向书写；氨基酸序列从左到右以氨基至羧基方向书写。对于本领域的定义和术语，特别地，实施者可见Sambrook et al.,1989及Ausubel FM et al.,1993。要理解，本发明不限于描述的特定方法、方案、和试剂，因为这些可以变化。 

数值范围包括限定范围的数值。 

除非另有说明，核酸从左到右以5'至3'方向书写；氨基酸序列从左到右以氨基至羧基方向书写。 

本文中提供的标题不是对本发明的各个方面或实施方案的限制，这可以通过述及完整说明书而得到。因而，紧接着的下文定义的术语更加完整地通过述及完整说明书来定义。 

I.定义

“异多聚体”、“异多聚体复合物”、或“异多聚体蛋白质”指至少包含第一含Fc多肽和第二含Fc多肽的分子，其中第二含Fc多肽在氨基酸序列方面与第一含Fc多肽相差至少一个氨基酸残基。异多聚体可包含由第一和第二含Fc多肽形成的“异二聚体”，或者可形成更高等级的三级结构，其中存在除第一和第二含Fc多肽外的多肽。异多聚体的多肽可通过非肽、共价键（例如二硫键）和/或非共价相互作用（例如氢键、离子键、范德华力、和/或疏水 性相互作用）彼此相互作用。 

如本文中使用的，“异多聚化域”指对生物学分子的改变或添加，从而促进异多聚体形成及阻碍同多聚体形成。任何较之同二聚体对形成异二聚体具有强偏好的异二聚化域在本发明的范围内。例示性例子包括但不限于例如美国专利申请20030078385（Arathoon等人–Genentech；描述节入穴）；WO2007147901（

等人–Novo Nordisk；描述离子相互作用）；WO2009089004（Kannan等人–Amgen；描述静电转向效应(electrostatic steering effect)）；美国临时专利申请61/243,105（Christensen等人-Genentech；描述卷曲螺旋）。还可参见例如Pack,P.&Plueckthun,A.,Biochemistry31,1579-1584(1992)，其描述亮氨酸拉链或Pack et al.,Bio/Technology11,1271-1277(1993)，其描述螺旋-转角-螺旋基序。短语“异多聚化域”和“异二聚化域”在本文中可互换使用。 

术语“抗体”在本文中以最广义使用，指任何包含两条重链和两条轻链的免疫球蛋白(Ig)分子，及其任何片段、突变体、变体或衍生物，只要它们展现期望的生物学活性（例如表位结合活性）。抗体的例子包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体（例如双特异性抗体）和抗体片段，如本文中描述的。抗体可以是人的、人源化的和/或亲和力成熟的。 

作为述及的框架，如本文中使用的，抗体会指免疫球蛋白G（IgG）的结构。然而，本领域技术人员会理解/认识到任何免疫球蛋白类别的抗体均可用于本文所述创造性方法。为清楚起见，IgG分子含有一对相同的重链（HC）和一对相同的轻链（LC）。每条LC具有一个可变域（V_L）和一个恒定域（C_L），而每条HC具有一个可变（V_H）和三个恒定域（C_H1、C_H2、和C_H3）。C_H1和C_H2域通过铰链区连接。这种结构是本领域公知的。见图1B。 

如本文中使用的，“半抗体”指联合的一条免疫球蛋白重链和一条免疫球蛋白轻链。图1A中描绘了一种例示性半抗体。本领域技术人员会容易地领会半抗体也可具有由单个可变域组成的抗原结合域。 

术语“大抗体(maxibody)”指包含融合的scFv和Fc多肽的融合蛋白。见WO2009089004的图8a。双特异性大抗体见WO2009089004的图2。 

人IgG Fc区的术语“C_H2结构域”通常依照EU编号系统自IgG的大约残基231延伸至大约340。CH2结构域的独特之处在于它没有与另一结构域紧密配对。而是，有两个N-连接的分支的碳水化合物链介于完整天然IgG分子的两 个CH2结构域之间。推测该碳水化合物可能提供结构域-结构域配对的替代且有助于稳定CH2结构域。Burton,Molec.Immunol.22:161-206（1985）。 

术语“C_H3结构域”包含Fc区中C_H2结构域C-端的一段残基（即依照EU编号系统自IgG的大约氨基酸残基341至大约氨基酸残基447）。 

如本文中使用的，术语“Fc区”一般指包含免疫球蛋白重链C端多肽序列的二聚体复合物，其中C端多肽序列是通过木瓜蛋白酶消化完整抗体可获得的。Fc区可包含天然或变异Fc序列。虽然免疫球蛋白重链的Fc序列的边界可以变化，但是人IgG重链Fc序列通常定义为自Fc序列大约位置Cys226处的氨基酸残基或自大约位置Pro230至羧基端的区段。除非本文另有规定，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号依照EU编号系统，也称作EU索引，如记载于Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991。免疫球蛋白的Fc序列一般包含两个恒定域，即C_H2域和C_H3域，且任选包含C_H4域。“Fc多肽”在本文中表示构成Fc区的多肽之一，例如单体Fc。Fc多肽可以自任何合适的免疫球蛋白获得，诸如IgG₁、IgG₂、IgG₃、或IgG₄亚型，IgA，IgE，IgD或IgM。Fc区包含两条H链的、通过二硫化物保持在一起的羧基端部分。抗体的效应器功能由Fc区中的序列决定；这个区也是在某些类型的细胞上找到的Fc受体（FcR）识别的部分。在一些实施方案中，Fc多肽包含部分或整个野生型铰链序列（一般在它的N端）。在一些实施方案中，Fc多肽不包含功能性或野生型铰链序列。 

“功能性Fc区”拥有天然序列Fc区的“效应器功能”。例示性的“效应器功能”包括C1q结合；CDC；Fc受体结合；ADCC；吞噬作用；细胞表面受体（例如B细胞受体；BCR）下调等。此类效应器功能一般要求Fc区与结合结构域（例如抗体可变域）联合，而且可以使用多种测定法来评估，例如本文定义中所公开的。 

“天然序列Fc区”包含与在自然界中找到的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG₁Fc区（非A和A同种异型）；天然序列人IgG₂Fc区；天然序列人IgG₃Fc区；和天然序列人IgG₄Fc区；及其天然存在变体。 

“变异Fc区”包含由于至少一处氨基酸修饰（优选一处或多处氨基酸替代）而与天然序列Fc区有所不同的氨基酸序列。优选的是，变异Fc区具有与 天然序列Fc区或与亲本多肽的Fc区相比至少一处氨基酸替代，例如在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中具有约1处至约10处氨基酸替代，优选约1处至约5处氨基酸替代。变异Fc区在本文中将优选与天然序列Fc区和/或亲本多肽的Fc区拥有至少约80%的同源性，且最优选至少约90%的同源性，更优选至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%的同源性。 

如本文中使用的，“Fc成分”指Fc区的铰链区、C_H2结构域或C_H3结构域。 

在某些实施方案中，含Fc多肽包含IgG Fc区，优选自野生型人IgG Fc区衍生的。“野生型”人IgG Fc表示氨基酸序列天然存在于人群内。当然，正如Fc序列在个体间可略微变化，可以对野生型序列进行一处或多处改变且仍然保留在本发明的范围内。例如，Fc区可含有与本发明无关的别的改变，诸如糖基化位点中的突变或包括非天然氨基酸。在与节(knob)、穴(hole)或节/穴联合使用时，“野生型”意指只引入节、穴或节/穴突变但在其它方面包含人群内天然存在序列的蛋白质序列。 

术语“可变区”或“可变域”指抗体重或轻链中牵涉抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链可变域（分别为VH和VL）一般具有类似的结构，其中每个域包含4个保守的框架区（FR）和3个高变区（HVR）。（见例如Kindt等Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman和Co.,第91页（2007））。单个VH或VL域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，可以分别使用来自结合抗原的抗体的VH或VL域筛选互补VL或VH域的文库来分离结合特定抗原的抗体。见例如，Portolano等,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等,Nature352:624-628(1991)。 

如本文中使用的，术语“Fab”指抗体的抗原结合片段。如上所述，可使用木瓜蛋白酶消化完整抗体。木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段（即“Fab”片段）和一个残余的“Fc”片段（即Fc区，见上文）。Fab片段由完整L链及H链的可变域（V_H）和重链第一恒定域（C_H1）组成。 

如本文中使用的，短语“抗原结合臂”、“靶物分子结合臂”、“靶物结合臂”及其变化形式指本发明的异多聚体蛋白质中有能力特异性结合感兴趣靶物的组成部分。一般且优选地，抗原结合臂是免疫球蛋白多肽序列，例如免疫球蛋白轻和重链CDR和/或可变域序列的复合物。 

“靶物”或“靶物分子”指异多聚体蛋白质的结合臂识别的模块。例如，如果异多聚体蛋白质是抗体，那么靶物可以是单一分子上的或不同分子上的表 位，或病原体或肿瘤细胞，这取决于上下文。类似地，如果异多聚体蛋白质是受体-Fc融合蛋白，那么靶物会是受体的关联结合配偶。本领域技术人员会领会，靶物由靶物结合臂的结合特异性决定，而且不同靶物结合臂可识别不同靶物。靶物优选以高于1uM Kd（依照Scatchard分析）的亲和力结合本发明的异多聚体蛋白质。靶物分子的例子包括但不限于血清可溶性蛋白质和/或其受体，诸如细胞因子和/或细胞因子受体、粘附素、生长因子和/或其受体、激素、病毒颗粒（例如RSV F蛋白、CMV、StaphA、流感、丙型肝炎病毒）、微生物（例如细菌细胞蛋白质、真菌细胞）、粘附素、CD蛋白和其受体。 

“完整”或“全长”抗体的一个例子是包含抗原结合臂以及C_L和至少重链恒定域C_H1、C_H2、和C_H3的抗体。恒定域可以是天然序列恒定域（例如人天然序列恒定域）或其氨基酸序列变体。 

如本文中使用的，术语“偶联”指彼此连接第一和第二含Fc多肽，例如形成共价键必需的步骤。此类步骤包括还原、退火和/或氧化第一和第二含Fc多肽的铰链区中的半胱氨酸残基以形成链间二硫键。偶联可以通过化学交联或使用氧化还原系统来实现。参见例如Humphreys et al.,J.Immunol.Methods(1998)217:1-10及Zhu et al.,Cancer Lett.,(1994)86:127-134。 

术语“多特异性抗体”以最广义使用，具备涵盖具有多表位特异性的抗体。此类多特异性抗体包括但不限于包含重链可变域（V_H）和轻链可变域（V_L）的抗体，其中V_HV_L单元具有多表位特异性，具有两个或更多个V_L和V_H域的抗体，其中每个V_HV_L单元结合不同表位，具有两个或更多个单一可变域的抗体，其中每个单一可变域结合不同表位，全长抗体，抗体片段诸如Fab、Fv、dsFv、scFv、双抗体、双特异性双抗体和三抗体，共价或非共价连接的抗体片段。“多表位特异性”指特异性结合相同或不同靶物上的两种或更多种不同表位的能力。“单特异性”指只结合一种表位的能力。依照一个实施方案，多特异性抗体是以5μM至0.001pM、3μM至0.001pM、1μM至0.001pM、0.5μM至0.001pM、或0.1μM至0.001pM的亲和力结合每种表位的IgG抗体。图1B中提供了双特异性的一种例示性图示。 

“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2、和Fv片段；双抗体（Db）；串联双抗体（taDb），线性抗体（例如美国专利No.5,641,870；Zapata et al.,Protein Eng.8(10):1057-1062(1995)）；单臂抗体，单可变域抗体，微型抗体（minibodies），单链抗体分子；和自抗体片段形成的多特异性抗体（例如包括但不限于Db-Fc、taDb-Fc、taDb-C_H3和(scFV)4-Fc）。 

表述“单域抗体”（sdAb）或“单可变域（SVD）抗体”一般指其中单一可变域（V_H或V_L）能赋予抗原结合的抗体。换言之，单一可变域不需要与另一可变域相互作用来识别靶抗原。单域抗体由每个抗原结合臂上的单一单体可变抗体域（V_H或V_L）组成。单域抗体的例子包括那些自驼类（美洲驼和骆驼）和软骨鱼（例如铰口鲨）衍生的和那些通过重组方法自人和小鼠抗体衍生的（Ward et al.,Nature(1989)341:544-546;Dooley and Flajnik,Dev Comp Immunol(2006)30:43-56;Muyldermans et al.,Trend Biochem Sci(2001)26:230-235;Holt et al.,Trends Biotechnol(2003):21:484-490;WO2005/035572;WO03/035694;Davies and Riechmann,Febs Lett(1994)339:285-290;WO00/29004;WO02/051870）。单可变域抗体可以存在于具有其它可变区或可变域的抗原结合臂（例如同或异多聚体）中，在这种情况中它不是单域抗体。 

如本文所述，术语“节-入-穴”或“KnH”技术指通过在两条多肽相互作用的界面处将隆起（节）引入一条多肽并将空腔（穴）引入另一条多肽中，在体外或在体内将两条多肽配对在一起的技术。例如，已经在抗体的Fc:Fc结合界面、C_L:C_H1界面或V_H/V_L界面中引入KnH（例如US2007/0178552,WO96/027011,WO98/050431and Zhu et al.(1997)Protein Science6:781-788）。这在制造多特异性抗体期间驱动两条不同重链配对在一起中尤其有用。例如，在它们的Fc区中具有KnH的多特异性抗体可进一步包含连接至每个Fc区的单一可变域，或进一步包含与相似或不同轻链可变域配对的不同重链可变域。KnH技术还可用于将两个不同受体胞外域配对在一起或包含不同靶物识别序列的任何其它多肽序列（例如包括亲和抗体（affibody）、肽体（peptibody）和其它Fc融合物）。 

“Fv”由紧密、非共价联合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠结果散发出六个高变环（H和L链各3个环），其贡献出供抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单一可变域（或只包含对抗原特异性的三个CDR的半个Fv）也具有识别和结合抗原的能力，尽管常常处于比完整结合位点要低的亲和 力。 

“单链Fv”，也缩写成“sFv”或“scFv”，指包含连接成单一多肽链的V_H和V_L抗体结构域的抗体片段。优选地，sFv多肽进一步包含V_H和V_L域之间的多肽接头，其使得sFv能够形成抗原结合所期望的结构。关于sFv的综述，参见Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994);Malmborg et al.,J.Immunol.Methods183:7-13,1995。 

术语“双抗体”指通过在V_H和V_L域之间用短接头（约5-10个残基）构建sFv片段（见前一段）制备的小型抗体片段，短接头使得实现V域的链间而非链内配对，导致二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双抗体是两个“交叉”sFv片段的异二聚体，其中两种抗体的V_H和V_L域存在于不同多肽链上。双抗体更完整地描述于例如EP404,097；WO93/11161；及Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)。 

术语“单臂抗体”指包含下述的抗体：（1）通过肽键连接至包含C_H2域、C_H3域或C_H2-C_H3域的多肽的可变域和（2）第二C_H2、C_H3或C_H2-C_H3域，其中可变域没有通过肽键连接至包含第二C_H2、C_H3或C_H2-C_H3域的多肽。在一个实施方案中，单臂抗体包含3条多肽：（1）包含可变域（例如V_H）、C_H1、C_H2和C_H3的第一多肽，（2）包含可变域（例如V_L）和C_L域的第二多肽，和（3）包含C_H2和C_H3域的第三多肽。在另一个实施方案中，单臂抗体具有部分铰链区，其含有两个半胱氨酸残基，它们形成连接恒定重链的二硫键。在一个实施方案中，单臂抗体的可变域形成抗原结合区。在另一个实施方案中，单臂抗体的可变域是单一可变域，其中每个单一可变域是一个抗原结合区。在一个实施方案中，单臂抗体是单可变域抗体。 

本发明的抗体可以是“嵌合”抗体，其中重和/或轻链的一部分与自特定物种衍生的或属于特定抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而链的剩余部分与自另一物种衍生的或属于另一抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，前提是它们展现期望的生物学活性（美国专利No.4,816,567；及Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984)）。本文中感兴趣的嵌合抗体包括灵长类化（primatized）抗体，其包含自非人灵长类（例如旧世界猴、猿、等）衍生的可变域抗原结合序列和人恒定区序列。 

非人（例如啮齿类）抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人抗体的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白（受体抗体）中的高变区残基用具有期望抗体特异性、亲和力和能力的非人物种（供体抗体）诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区（FR）残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。通常，人源化抗体包含至少一个、通常两个基本上整个如下可变区，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还包含至少部分免疫球蛋白恒定区（Fc），通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones et al.,Nature321:522-525（1986）；Riechmann et al.,Nature332:323-329（1988）；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596（1992）。 

“肽体”指随机生成肽与Fc域的融合物。参见2003年12月9日公告授予Feige等人的美国专利No.6,660,843（通过述及完整收录）。它们包括连接至N端、C端、氨基酸侧链、或超过一个这些位点的一个或多个肽。肽体技术使之能够设计掺有靶向一种或多种配体或受体、肿瘤归巢肽、膜运输肽、等等的肽的治疗剂。肽体技术已经证明可用于设计多种此类分子，包括线性的和二硫化物约束的肽、“串联肽多聚体”（即单链Fc域上超过一个肽）。参见例如美国专利No.6,660,843；2003年10月16日公布的美国专利申请No.2003/0195156（对应于2002年11月21日公布的WO02/092620）；2003年9月18日公布的美国专利申请No.2003/0176352（对应于2003年4月17日公布的WO03/031589）；1999年10月22日公布的美国流水号09/422,838（对应于2000年5月4日公布的WO00/24770）；2003年12月11日公布的美国专利申请No.2003/0229023；2003年7月17日公布的WO03/057134；2003年12月25日公布的美国专利申请No.2003/0236193（对应于2004年4月8日提交的PCT/US04/010989）；2003年9月18日提交的美国流水号10/666,480（对应于2004年4月1日公布的WO04/026329），通过述及将每一篇完整收入本文。 

“亲和抗体(affibody)”指使用通过肽键连接至Fc区的蛋白质，其中该蛋白质用作支架来提供靶分子的结合表面。该蛋白质常常是天然发生蛋白质，诸如葡萄球菌蛋白A或IgG结合B域、或自其衍生的Z蛋白（参见Nilsson et al (1987),Prot Eng1,107-133及美国专利No.5,143,844）或其片段或衍生物。例如，可以自对靶分子具有改变的结合亲和力的Z蛋白变体创建亲和抗体，其中通过随机诱变突变Z蛋白的一个区段以创建能够结合靶分子的变体文库。亲和抗体的例子包括美国专利No.6,534,628,Nord K et al,Prot Eng8:601-608(1995)及Nord K et al,Nat Biotech15:772-777(1997).Biotechnol Appl Biochem.2008Jun;50(Pt2):97-112。 

在用于本文时，术语“免疫粘附素”指将异源蛋白质（“粘附素”）的结合特异性与免疫球蛋白恒定域的效应器功能联合起来的分子。在结构上，免疫粘附素包括氨基酸序列不同于抗体的抗原识别和结合位点（即与抗体的恒定区相比是“异源的”）、具有期望结合特异性的氨基酸序列与免疫球蛋白恒定域序列（例如IgG的CH2和/或CH3序列）的融合物。例示性的粘附素序列包括包含受体或配体中与目的蛋白质结合的那部分的连续氨基酸序列。粘附素序列还可以是与目的蛋白质结合但不是受体或配体序列的序列（例如肽体（肽体y）中的粘附素序列）。此类多肽序列可通过多种方法来选择或鉴定，包括噬菌体展示技术和高通量分拣方法。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定域序列可以自任何免疫球蛋白获得，诸如IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4亚型、IgA（包括IgA1和IgA2）、IgE、IgD、或IgM。 

如本文中使用的，“复合物”或“复合的”指经由不是肽键的键和/或力（例如范德华、疏水、亲水力）彼此相互作用的两个或更多个分子的联合。在一个实施方案中，复合物是异多聚体。应当理解，如本文中使用的，术语“蛋白质复合物”或“多肽复合物”包括如下的复合物，其具有缀合至蛋白质复合物中蛋白质的非蛋白质实体（例如包括但不限于化学分子，诸如毒素或检测剂）。 

结合感兴趣抗原的本发明异多聚体蛋白质指以足够亲和力结合靶物使得异多聚体蛋白质可作为诊断剂和/或治疗剂用于靶向蛋白质或表达靶物的细胞或组织，且与其它蛋白质没有显著交叉相互作用的异多聚体蛋白质。在此类实施方案中，异多聚体蛋白质结合“非靶”蛋白质的程度会小于抗体对其特定靶蛋白的结合的约10%，如通过荧光激活细胞分选（FACS）分析或放射免疫沉淀（RIA）或ELISA测定的。关于异多聚体蛋白质对靶分子的结合，术语“特异性结合（特定多肽或特定多肽靶上的表位）”或“特异性结合至（特定多肽或特定多肽靶上的表位）”或“对（特定多肽或特定多肽靶上的 表位）特异性的”表示结合可测量地不同于非特异性相互作用（例如，非特异性结合可以是结合牛血清清蛋白或酪蛋白）。特异性结合可以例如通过测定分子的结合，与对照分子的结合比较来测量。例如，特异性结合可以通过与类似靶物的对照分子（例如过量的未标记靶物）竞争来测定。在这种情况中，如果经标记靶物对探针的结合受到过量未标记靶物竞争性抑制，那么指示特异性结合。如本文中使用的，术语“特异性结合（特定多肽或特定多肽靶物上的表位）”或“特异性结合至（特定多肽或特定多肽靶物上的表位）”或“对（特定多肽或特定多肽靶物上的表位）特异性的”可以例如由对靶物具有至少约200nM、或者至少约150nM、或者至少约100nM、或者至少约60nM、或者至少约50nM、或者至少约40nM、或者至少约30nM、或者至少约20nM、或者至少约10nM、或者至少约8nM、或者至少约6nM、或者至少约4nM、或者至少约2nM、或者至少约1nM、或更大的Kd的分子展现。在一个实施方案中，术语“特异性结合”指如下的结合，其中异多聚体蛋白质结合特定多肽或特定多肽上的表位且没有实质性结合任何其它多肽或多肽表位。 

“结合亲和力”通常指分子（例如抗体）的单一结合位点与其结合配偶体（例如抗原）之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于本文时，“结合亲和力”指反映结合对的成员（例如抗体与抗原）之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用解离常数（Kd）来表述。例如，Kd可以是约200nM、150nM、100nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、8nM、6nM、4nM、2nM、1nM、或更强。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的那些。低亲和力抗体通常缓慢的结合抗原且趋于容易解离，而高亲和力抗体通常更快速的结合抗原且趋于保持更长时间的结合。本领域知道测量结合亲和力的多种方法，其中任一种都可用于本发明的目的。 

在一个实施方案中，依照本发明的“Kd”或“Kd值”是通过表面等离振子共振测定法使用BIAcore^TM-2000或BIAcore^TM-3000（BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ）于25℃使用固定化靶物（例如抗原）CM5芯片在约10个响应单位（RU）测量的。简而言之，依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N’-（3-二甲基氨基丙基）-碳化二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片（CM5,BIAcore Inc.）。用10mM乙酸钠pH4.8将抗原 稀释至5μg/ml（约0.2μM），然后以5μl/分钟的流速注入至获得约10个响应单位（RU）的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，于25℃以约25μl/分钟的流速注入在含0.05%Tween-20的PBS（PBST）中两倍连续稀释的Fab（例如0.78nM至500nM）。使用简单一对一朗格缪尔（Langmuir）结合模型（

Evaluation Software version3.2）通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率（k_on）和解离速率（k_off）。平衡解离常数（Kd）以比率k_off/k_on计算。参见例如Chen et al.,J Mol Biol293:865-881（1999）。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过10⁶M^-1s^-1，那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计（a stop-flow equipped spectrophometer）（Aviv Instruments）或8000系列SLM-Aminco分光光度计（ThermoSpectronic）中用搅拌比色杯的测量，在存在浓度渐增的抗原的条件下，测量PBS,pH7.2中的20nM抗抗原抗体（Fab形式）于25℃的荧光发射强度（激发=295nm；发射=340nm，16nm带通）的升高或降低。 

关于本发明异多聚体蛋白质（诸如抗体、片段、或其衍生物）的“有生物学活性的”和“生物学活性”和“生物学特征”指具有结合生物学分子的能力，除非另有说明。 

在用于描述各种异多聚体多肽时，“分离的”表示已经与/自表达它的细胞或细胞培养物分开和/或回收的异多聚体。其天然环境的污染性成分指将会干扰异多聚体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在某些实施方案中，将异多聚体纯化至（1）根据Lowry法的测定，蛋白质重量超过95%且最优选重量超过99%，（2）足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或（3）根据使用考马斯蓝或优选银染色的还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE，达到同质。然而，分离的多肽通常通过至少一个纯化步骤来制备。 

本发明的异多聚体一般纯化至基本上均质。短语“基本上均质的”、“基本上均质的形式”和“基本上均质”用于指示产物基本上没有源自不想要的多肽组合（例如同多聚体）的副产物。 

在纯度方面的表述，基本上均质表示副产物的量不超过10%、9%、8%、7%、6%、4%、3%、2%或1%（以重量计）或少于1%（以重量计）。在一个 实施方案中，副产物低于5%。 

“生物学分子”指核酸、蛋白质、碳水化合物、脂质、及其组合。在一个实施方案中，生物学分子在自然界中存在。 

如本文中使用的，“连接”表示第一和第二氨基酸序列之间的直接肽键连接或涉及第三氨基酸序列（即与第一和第二氨基酸序列成键且在第一和第二氨基酸序列之间的肽）的连接。例如，与一条氨基酸序列的C末端且与另一条氨基酸序列的N末端成键的接头肽。 

如本文中使用的，“接头”表示长度为两个或更多个氨基酸的氨基酸序列。接头可以由中性极性或非极性氨基酸组成。接头的长度可以是例如2-100个氨基酸，诸如长度为2-50氨基酸，例如长度为3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、或50个氨基酸。接头可以是“可切割的”，例如通过自切割、或酶促或化学切割。氨基酸序列中的切割位点和切割此类位点的酶和化学品是本领域公知的，而且本文中也有描述。 

如本文中使用的，“栓系(tether)”表示连接两个其它氨基酸序列的氨基酸接头。如本文中描述的，栓系可连接免疫球蛋白重链可变域的N端与免疫球蛋白轻链恒定域的C端。在特定实施方案中，栓系的长度为约15-50个氨基酸，例如长度为20-26个氨基酸（例如长度为20、21、22、23、24、25、或26个氨基酸）。栓系可以是“可切割的”，例如通过自切割、或酶促或化学切割，使用本领域的标准方法和试剂。 

对“接头”或“栓系”的酶促切割可涉及使用内肽酶，诸如例如Lys-C、Asp-N、Arg-C、V8、Glu-C、糜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝血酶、Genenase、因子Xa、TEV（烟草蚀纹病毒半胱氨酸蛋白酶）、肠激酶、HRV C3（人鼻病毒C3蛋白酶）、激肽原酶、以及枯草杆菌蛋白酶样蛋白质原转化酶（例如弗林蛋白酶（PC1）、PC2、或PC3）或N-精氨酸二元（dibasic）转化酶。化学切割可涉及使用例如羟胺、N-氯琥珀酰亚胺、N-溴琥珀酰亚胺、或溴化氰。 

如本文中使用的，“Lys-C内肽酶切割位点”指能在C端侧被Lys-C内肽酶切割的氨基酸序列中的赖氨酸残基。Lys-C内肽酶在赖氨酸残基的C端侧切割。 

“离液剂”表示通过干扰稳定化分子内相互作用（例如氢键、范德华力、或疏水效应）破坏蛋白质（例如抗体）三维结构的水溶性物质。例示性离液 剂包括但不限于脲、胍-HCl、高氯酸锂、组氨酸、和精氨酸。 

“温和去污剂”表示通过干扰稳定化分子内相互作用（例如氢键、范德华力、或疏水效应）破坏蛋白质（例如抗体）三维结构，但不会永久破坏蛋白质结构从而引起生物学活性丧失（即不使蛋白质变性）的水溶性物质。例示性温和去污剂包括但不限于Tween（例如Tween-20）、Triton（例如Triton X-100）、NP-40（壬基苯氧基聚乙氧基乙醇）、Nonidet P-40（辛基苯氧基聚乙氧基乙醇）、和十二烷基硫酸钠（SDS）。 

抗体“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区（天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区）且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）；吞噬作用；细胞表面受体（例如B细胞受体）下调；和B细胞活化。 

“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指其中结合至某些细胞毒性细胞（例如天然杀伤（NK）细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞）上存在的Fc受体（FcR）的分泌型Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒剂杀死靶细胞的细胞毒性形式。该抗体“武装”（臂）细胞毒性细胞，而且是此类杀伤作用绝对要求的。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92（1991）第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估感兴趣分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利No.5,500,362或5,821,337中所记载的。可用于此类测定法的有用的效应细胞包括外周血单个核细胞（PBMC）和天然杀伤（NK）细胞。或者/另外，可在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:652-656（1998）中所披露的。 

“Fc受体”或“FcR”描述结合抗体Fc区的受体。优选的FcR是人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR（γ受体），包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA（“活化受体”）和FcγRIIB（“抑制受体”），它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在其胞质结构域中。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序（ITAM）。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序（ITIM）（参见综述M.

Annu.Rev. Immunol.15:203-234（1997））。FcR的综述参见Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492（1991）；Capel等,Immunomethods4:25-34（1994）；de Haas等,J.Lab.Clin.Med.126:330-41（1995）。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR，包括那些未来将会鉴定的。该术语还包括新生儿受体，FcRn，它负责将母体IgG转移给胎儿（Guyer等,J.Immunol.117:587（1976）及Kim等,J.Immunol.24:249（1994））。 

“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应器功能的白细胞。优选的是，该细胞至少表达FcγRIII并行使ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞（PBMC）、天然杀伤（NK）细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞，优选PBMC和NK细胞。效应细胞可以从其天然来源例如血液分离。 

“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指存在补体时对靶细胞的溶解。经典补体途径的激活是由补体系统第一组分（C1q）结合其关联抗原所结合的抗体（适宜亚类的）起始的。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods202:163（1996）中所记载的。 

术语“治疗有效量”指抗体、抗体片段或衍生物在受试者中治疗疾病或病症的量。在肿瘤（例如癌性肿瘤）的情况中，治疗有效量的抗体或抗体片段（例如多特异性抗体或抗体片段）可减少癌细胞的数目；缩小原发性肿瘤的尺寸；抑制（即一定程度的减缓，优选阻止）癌细胞浸润入周围器官；抑制（即一定程度的减缓，优选阻止）肿瘤转移；一定程度的抑制肿瘤生长；和/或一定程度的减轻一种或多种与病症有关的症状。根据抗体或抗体片段可阻止现有癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的程度，它可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。对于癌症疗法，体内功效可以通过例如评估存活持续时间、距疾病进展的时间（TTP）、响应率（RR）、响应持续时间、和/或生活质量来测量。 

“降低或抑制”指引起优选20%或更多、更优选50%或更多、且最优选75%、85%、90%、95%、或更多的总体降低的能力。降低或抑制可以指所治疗的病症的症状、转移的存在或大小、原发性肿瘤的大小、或血管发生性病症中血管的大小或数目。 

术语“癌（症）”和“癌（性）的”指向或描述哺乳动物中典型的以不受调节的细胞生长/增殖为特征的生理疾患。此定义中包括良性和恶性癌症。癌症 的例子包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、和白血病。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌、肺癌包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、肺的鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌（gastric or stomach cancer）包括胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌（例如肾细胞癌）、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肛门癌、阴茎癌、黑素瘤、及各种类型的头和颈癌。“早期癌症”指非侵入性的或转移性的，或者归为0期、I期、或II期癌症的癌症。术语“癌前”指典型地在癌之前或发展成癌的疾患或生长。“非转移的”指良性的或保留在原发部位且尚未渗透入淋巴或血管系统或渗透至原发部位以外的组织的癌症。一般而言，非转移性癌症指作为0期、I期、或II期癌症和偶尔的III期癌症的任何癌症。 

“变应性或炎性病症”在本文中指源自个体免疫系统过度激活的疾病或病症。例示性的变应性或炎性病症包括但不限于哮喘、银屑病、类风湿性关节炎、特应性皮炎、多发性硬化、全身性狼疮、全身性红斑狼疮、湿疹、器官移植、年龄相关黄斑变性、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、嗜曙红细胞性食管炎、与炎症有关的自身免疫病。 

“自身免疫病”在本文中指因个体自身组织引起的和针对个体自身组织的疾病或病症或其共分离（co-segregate）或表现或者由此产生的疾患。自身免疫性疾病或病症的例子包括但不限于关节炎（类风湿性关节炎诸如急性关节炎、慢性类风湿性关节炎、痛风性关节炎、急性痛风性关节炎、慢性炎性关节炎、退行性关节炎、感染性关节炎、莱姆（Lyme）关节炎、增生性关节炎、银屑病性关节炎、脊椎关节炎和幼发型类风湿性关节炎，骨关节炎，慢性进行性关节炎（arthritis chronica progrediente），变形性关节炎，慢性原发性多关节炎，反应性关节炎，和强直性脊柱炎），炎性过度增殖性皮肤病，银屑病诸如斑块状银屑病、滴状银屑病、脓疱性银屑病和指甲银屑病，皮炎包括接触性皮炎、慢性接触性皮炎、变应性皮炎、变应性接触性皮炎、疱疹样皮炎和特应性皮炎，x连锁的高IgM综合征，荨麻疹诸如慢性变应性荨麻疹和慢性特发性荨麻疹包括慢性自身免疫性荨麻疹，多肌炎/皮肌炎，青少年型皮肌炎，中毒性表皮坏死松解症，硬皮病（包括系统性硬皮病），硬化诸如系统性硬化、多发性硬化（MS）诸如脊髓-眼（spino-optical）MS、原发性进行性MS（PPMS）和复发性消退性（relapsing remitting）MS（RRMS）、 进行性系统性硬化、动脉粥样硬化、动脉硬化、播散性硬化（sclerosis disseminata）和共济失调性（ataxic）硬化，炎性肠病（IBD）（例如克罗恩氏（Crohn）病，自身免疫介导的胃肠病，结肠炎诸如溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,colitis ulcerosa）、微观（microscopic）结肠炎、胶原性结肠炎、息肉状结肠炎、坏死性小肠结肠炎和透壁性结肠炎，和自身免疫性炎性肠病），坏疽性脓皮症，结节性红斑，原发性硬化性胆管炎，巩膜外层炎），呼吸窘迫综合征包括成人型或急性呼吸窘迫综合征（ARDS），脑膜炎，整个或部分葡萄膜的炎症，虹膜炎，脉络膜炎，自身免疫性血液学病症，类风湿性脊椎炎，突发性听觉丧失，IgE介导的疾病诸如过敏反应和变应性和特应性鼻炎，脑炎诸如拉斯默森氏（Rasmussen）脑炎和边缘系和/或脑干脑炎，葡萄膜炎诸如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽肿性葡萄膜炎、非肉芽肿性葡萄膜炎、晶状体抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎或自身免疫性葡萄膜炎，具有和没有肾病综合征的肾小球肾炎（GN）诸如慢性或急性肾小球肾炎诸如原发性GN、免疫介导的GN、膜性GN（膜性肾病）、特发性膜性GN或特发性膜性肾病、膜性或膜性增殖性GN（MPGN）包括I型和II型、和急进性GN，变应性疾患，变应性反应，湿疹包括变应性或特应性湿疹，哮喘诸如支气管哮喘（asthma bronchiale,bronchial asthma）和自身免疫性哮喘，涉及T细胞浸润和慢性炎性应答的疾患，慢性肺部炎性疾病，自身免疫性心肌炎，白细胞粘附缺陷，系统性红斑狼疮（SLE）（systemic lupus erythematosus,systemic lupus erythematodes）诸如皮肤SLE、亚急性皮肤红斑狼疮、新生儿狼疮综合征（NLE）、播散性红斑狼疮、狼疮（包括狼疮肾炎、狼疮脑炎、儿科狼疮、非肾狼疮、肾外狼疮、盘状狼疮、狼疮脱发），幼发型（I型）糖尿病包括儿科胰岛素依赖性糖尿病（IDDM）、成人期发作的糖尿病（II型糖尿病）、自身免疫性糖尿病、特发性尿崩症，与细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏感性有关的免疫应答，结核病，结节病，肉芽肿病包括淋巴瘤样肉芽肿病、韦格纳氏（Wegener）肉芽肿病，粒细胞缺乏，血管炎病包括血管炎（包括大血管血管炎（包括风湿性多肌痛和巨细胞（高安氏（Takayasu））动脉炎），中血管血管炎（包括川崎氏（Kawasaki）病和结节性多动脉炎），微观（microscopic）多动脉炎，CNS血管炎，坏死性、皮肤性或超敏感性血管炎，系统性坏死性血管炎，和ANCA相关血管炎诸如丘-施二氏（Churg-Strauss）血管炎或综合征（CSS）），颞动脉炎，再生障碍性贫血， 自身免疫性再生障碍性贫血，库姆斯（Coombs）阳性贫血，戴-布二氏（Diamond Blackfan）贫血，溶血性贫血或免疫性溶血性贫血包括自身免疫性溶血性贫血（AIHA），恶性贫血（pernicious anemia,anemia perniciosa），阿狄森氏（Addison）病，单纯红细胞性贫血或再生障碍（PRCA），因子VIII缺乏，血友病A，自身免疫性嗜中性粒细胞减少症，全血细胞减少症，白细胞减少症，涉及白细胞渗出的疾病，CNS炎性病症，多器官损伤综合征诸如那些败血症、外伤或出血继发的，抗原-抗体复合物介导的疾病，抗肾小球基底膜病，抗磷脂抗体综合征，变应性神经炎，贝切特氏（Bechet或Behcet）病，卡斯尔曼氏（Castleman）综合征，古德帕斯丘氏（Goodpasture）综合征，雷诺氏（Reynaud）综合征，斯耶格伦氏（Sjogren）综合征，史-约二氏（Stevens-Johnson）综合征，类天疱疮诸如大疱性类天疱疮和皮肤类天疱疮，天疱疮（包括寻常型天疱疮、落叶型天疱疮、粘膜类天疱疮型天疱疮和红斑性天疱疮），自身免疫性多内分泌病，莱特氏（Reiter）病或综合征，免疫复合物肾炎，抗体介导的肾炎，视神经脊髓炎，多神经病，慢性神经病诸如IgM多神经病或IgM介导的神经病，血小板减少症（例如心肌梗死患者发生的）包括血栓性血小板减少性紫癜（TTP）和自身免疫或免疫介导的血小板减少症诸如特发性血小板减少性紫癜（ITP）包括慢性或急性ITP，睾丸和卵巢的自身免疫病包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎，原发性甲状腺功能减退症，甲状旁腺功能减退，自身免疫性内分泌病包括甲状腺炎诸如自身免疫性甲状腺炎、桥本氏（Hashimoto）病、慢性甲状腺炎（桥本氏（Hashimoto）甲状腺炎）或亚急性甲状腺炎，自身免疫性甲状腺病，特发性甲状腺功能减退症，格雷夫斯氏（Graves）病，多腺性综合征诸如自身免疫性多腺体综合征（或多腺性内分泌病综合征），瘤外综合征包括神经学瘤外综合征诸如兰伯特-伊顿（Lambert-Eaton）肌无力综合征或伊顿-兰伯特（Lambert-Eaton）综合征，僵体或僵人综合征，脑脊髓炎诸如变应性脑脊髓炎（变应性encephalomyelitis,encephalomyelitis变应性a）和实验性变应性脑脊髓炎（EAE），重症肌无力诸如胸腺瘤相关重症肌无力，小脑变性，神经性肌强直，视性眼阵挛或视性眼阵挛肌阵挛综合征（OMS），和感觉神经病，多灶性运动神经病，席汉氏（Sheehan）综合征，自身免疫性肝炎、慢性肝炎、类狼疮肝炎、巨细胞性肝炎、慢性活动性肝炎或自身免疫性慢性活动性肝炎，淋巴样间质性肺炎，梗阻性细支气管炎（非移植）对NSIP，格-巴二氏（Guillain-Barré）综合征， 贝格尔氏（Berger）病（IgA肾病），特发性IgA肾病，线性IgA皮肤病，原发性胆汁性肝硬化，肺硬变，自身免疫性肠病综合征，乳糜泻，腹部疾病，口炎性腹泻（麸质肠病），顽固性口炎性腹泻，特发性口炎性腹泻，冷球蛋白血症、肌萎缩侧索硬化（ALS）（卢格里克氏（Lou Gehrig）病），冠状动脉病，自身免疫性耳病诸如自身免疫性内耳病（AIED），自身免疫性听觉丧失，视性眼阵挛肌阵挛综合征（OMS），多软骨炎诸如顽固性或复发性多软骨炎，肺泡蛋白沉着症，淀粉样变，巩膜炎，非癌性淋巴细胞增多，原发性淋巴细胞增多包括单克隆B细胞淋巴细胞增多（例如良性单克隆丙种球蛋白病和性质未确定的单克隆丙种球蛋白病（MGUS）），周围神经病，瘤外综合征，通道病诸如癫痫、偏头痛、心率失常、肌肉病症、失聪、失明、周期性瘫痪和CNS的通道病，孤独症，炎性肌病，局灶性节段性肾小球硬化（FSGS），内分泌性眼病，葡萄膜视网膜炎，脉络膜视网膜炎，自身免疫性肝脏病学病症，纤维肌痛，多发性内分泌衰竭，施密特氏（Schmidt）综合征，肾上腺炎，胃萎缩，早老性痴呆，脱髓鞘病诸如自身免疫性脱髓鞘病，糖尿病肾病，德雷斯勒氏（Dressler）综合征，斑秃，CREST综合征（钙质沉着症、雷诺氏（Raynaud）现象、食道运动功能障碍、指端硬化和毛细管扩张），男性和女性自身免疫性不孕不育，混合性结缔组织病，恰加斯氏（Chagas）病，风湿热，习惯性流产，农民肺，多形红斑，心脏切开术后综合征，柯兴氏（Cushing）综合征，养鸟者肺，变应性肉芽肿性血管炎，良性淋巴细胞性血管炎，阿尔波特氏（Alport）综合征，肺泡炎诸如变应性肺泡炎和纤维化肺泡炎，间质性肺病，输血反应，麻风，疟疾，利什曼病，锥虫病（kypanosomiasis），血吸虫病，蛔虫病，曲霉病，Sampter氏综合征，卡普兰氏（Caplan）综合征，登革，心内膜炎，心内膜心肌纤维化，弥漫性肺间质纤维化，间质性肺纤维化，特发性肺纤维化，囊性纤维化，眼内炎，持久隆起性红斑（erythema elevatum et diutinum），胎儿成红细胞增多症，嗜曙红细胞性筋膜炎（faciitis）、舒尔曼氏（Shulman）综合征，费尔提氏（Felty）综合征，flariasis，睫状体炎诸如慢性睫状体炎、异时性睫状体炎、虹膜睫状体炎或Fuch氏睫状体炎，亨诺-许兰二氏（Henoch-Schonlein）紫癜，人免疫缺陷病毒（HIV）感染，艾柯病毒感染，心肌病，阿尔茨海默氏（Alzheimer）病，细小病毒感染，风疹病毒感染，种痘后综合征，先天性风疹感染，爱泼斯坦-巴尔（Epstein-Barr）病毒感染、腮腺炎，埃文斯（Evans）综合征，自身免疫性性腺衰竭，西登 哈姆氏（Sydenham）舞蹈病，链球菌后肾炎，闭塞性血栓血管炎（thromboangitis ubiterans），甲状腺毒症，脊髓痨，脉络膜炎，巨细胞性多肌痛，内分泌性眼病，慢性超敏感性肺炎，干燥性角膜结膜炎，流行性角膜结膜炎，特发性肾炎综合征，微小病变肾病，良性家族性和缺血-再灌注损伤，视网膜自身免疫，关节炎症，支气管炎，慢性阻塞性气道疾病，硅沉着病，口疮，口疮性口炎，动脉硬化性病症，无精子发生（aspermiogenese），自身免疫性溶血，伯克氏（Boeck）病，冷球蛋白血症，杜普伊特伦氏（Dupuytren）挛缩，晶体过敏性眼内炎（endophthalmia phacoanaphylactica），变应性小肠炎（enteritis变应性a），麻风节结性红斑，特发性面瘫，慢性疲乏综合征，风湿热（febris rheumatica），哈-里二氏（Hamman-Rich）病，感觉神经性听觉丧失，阵发性血红蛋白尿（haemoglobinuria paroxysmatica），性腺功能减退，局限性回肠炎（ileitis区alis），白细胞减少症，传染性单核细胞增多症，横贯性（traverse）脊髓炎，原发性特发性粘液水肿，肾病，交感性眼炎（ophthalmia symphatica），肉芽肿性睾丸炎（orchitis granulomatosa），胰腺炎，急性多神经根炎，坏疽性脓皮症，奎尔万氏（Quervain）甲状腺炎，获得性脾萎缩，由于抗精虫抗体的不育症，非恶性胸腺瘤，白癜风，SCID和爱泼斯坦-巴尔（Epstein-Barr）病毒相关疾病，获得性免疫缺陷综合征（AIDS），寄生虫病诸如利什曼虫，中毒性休克综合征，食物中毒，涉及T细胞浸润的疾患，白细胞粘附缺陷，与细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏感性有关的免疫应答，涉及白细胞渗出的疾病，多器官损伤综合征，抗原-抗体复合物介导的疾病，抗肾小球基底膜病，变应性神经炎，自身免疫性多内分泌病，卵巢炎，原发性粘液水肿，自身免疫性萎缩性胃炎，交感性眼炎，风湿病，混合性结缔组织病，肾病综合征，胰岛炎，多内分泌衰竭，周围神经病，自身免疫性多腺性综合征I型，成人期发作的特发性甲状旁腺功能减退（AOIH），全秃，扩张型心肌病，获得性大疱性表皮松解（epidermolisis bullosa acquisita,EBA），血色素沉着，心肌炎，肾病综合征，原发性硬化性胆管炎，化脓性或非化脓性鼻窦炎，急性或慢性鼻窦炎，筛窦炎，额窦炎，上颌窦炎或蝶窦炎，嗜曙红细胞相关病症诸如嗜曙红细胞增多症、肺嗜曙红细胞增多性浸润、嗜曙红细胞增多-肌痛综合征、吕弗勒氏（Loffler）综合征、慢性嗜曙红细胞性肺炎、热带肺嗜曙红细胞增多、支气管肺曲霉病、曲霉肿、或含有嗜曙红细胞的肉芽肿，过敏反应，血清阴性脊椎关节炎病，多内分泌自身免疫病，硬化性胆 管炎，巩膜、巩膜外层、慢性粘膜皮肤假丝酵母病，布鲁顿氏（Bruton）综合征，婴儿期一过性低丙种球蛋白血症，威斯科特-奥尔德里齐（Wiskott-Aldrich）综合征，共济失调性毛细管扩张，与以下各项有关的自身免疫性病症：胶原病、风湿病、神经病学疾病、缺血再灌注紊乱、血压应答降低（reduction in blood pressure response）、血管功能障碍、毛细管扩张（antgiectasis）、组织损伤、心血管缺血、痛觉过敏、脑缺血和伴随血管化的疾病，变应性超敏感性病症，肾小球肾炎病，再灌注损伤，心肌或其它组织的再灌注损伤，具有急性炎性成分的皮肤病，急性化脓性脑膜炎或其它中枢神经系统炎性病症，眼和眼窝的炎性病症，粒细胞输血相关综合征，细胞因子诱发的中毒，急性重度炎症，慢性顽固性炎症，肾盂炎，肺硬变，糖尿病性视网膜病，糖尿病性大动脉病症，动脉内增生，消化性溃疡，心瓣炎，和子宫内膜异位症。 

术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或防止细胞的功能和/或引起对细胞的破坏的物质。该术语意图包括：放射性同位素，例如At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、Ra²²³、P³²、和Lu的放射性同位素；化疗剂，例如甲氨蝶呤（methotrexate）、阿霉素（adriamycin）、长春花生物碱类（vinca alkaloids）（长春新碱（vincristine）、长春碱（vinblastine）、依托泊苷（etoposide））、多柔比星（doxorubicin）、美法仑（melphalan）、丝裂霉素（mitomycin）C、苯丁酸氮芥（chlorambucil）、柔红霉素（daunorubicin）或其它嵌入剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；和毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素，包括其片段和/或变体；及本文中披露的各种抗肿瘤药、抗癌药、和化疗剂。本文中记载了其它细胞毒剂。杀肿瘤药引起肿瘤细胞的破坏。 

“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类（alkylating agents），诸如塞替派（thiotepa）和

环磷酰胺（cyclophosphamide）；磺酸烷基酯类（alkyl sulfonates），诸如白消安（busulfan）、英丙舒凡（improsulfan）和哌泊舒凡（piposulfan）；氮丙啶类（aziridines），诸如苯佐替派（benzodepa）、卡波醌（carboquone）、美妥替派（meturedepa）和乌瑞替派（uredepa）；乙撑亚胺类（ethylenimines）和甲基蜜胺类（methylamelamines），包括六甲蜜胺（altretamine）、三乙撑蜜胺（triethylenemelamine）、三乙撑磷酰胺（triethylenephosphoramide）、三乙撑 硫代磷酰胺（triethylenethiophosphoramide）和三羟甲蜜胺（trimethylolomelamine）；番荔枝内酯类（acetogenins）（尤其是布拉他辛（bullatacin）和布拉他辛酮（bullatacinone））；δ-9-四氢大麻酚（tetrahydrocannabinol）（屈大麻酚（dronabinol），

）；β-拉帕醌（lapachone）；拉帕醇（lapachol）；秋水仙素类（colchicines）；白桦脂酸（betulinic acid）；喜树碱（camptothecin）（包括合成类似物托泊替康（topotecan）

CPT-11（伊立替康（irinotecan）， ）、乙酰喜树碱、东莨菪亭（scopoletin）和9-氨基喜树碱）；苔藓抑素（bryostatin）；callystatin；CC-1065（包括其阿多来新（adozelesin）、卡折来新（carzelesin）和比折来新（bizelesin）合成类似物）；鬼臼毒素（podophyllotoxin）；鬼臼酸（podophyllinic acid）；替尼泊苷（teniposide）；隐藻素类（cryptophycins）（特别是隐藻素1和隐藻素8）；多拉司他汀（dolastatin）；duoc臂ycin（包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1）；艾榴塞洛素（eleutherobin）；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素（spongistatin）；氮芥类（nitrogen mustards），诸如苯丁酸氮芥（chlorambucil）、萘氮芥（chlornaphazine）、胆磷酰胺（cholophosphamide）、雌莫司汀（estramustine）、异环磷酰胺（ifosfamide）、双氯乙基甲胺（mechlorethamine）、盐酸氧氮芥（mechlorethamine oxide hydrochloride）、美法仑（melphalan）、新氮芥（novembichin）、苯芥胆甾醇（phenesterine）、泼尼莫司汀（prednimustine）、曲磷胺（trofosfamide）、尿嘧啶氮芥（uracil mustard）；亚硝脲类（nitrosoureas），诸如卡莫司汀（c臂ustine）、氯脲菌素（chlorozotocin）、福莫司汀（fotemustine）、洛莫司汀（lomustine）、尼莫司汀（nimustine）和雷莫司汀（ranimustine）；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素（enediyne）（例如加利车霉素（calicheamicin），尤其是加利车霉素γ1（参见例如Agnew,Chem.Intl.Ed.Engl.33:183-186（1994））；蒽环类抗生素（dynemicin），包括dynemicin A；埃斯波霉素（esperamicin）；以及新制癌素（neocarzinostatin）发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团）、阿克拉霉素（aclacinomycin）、放线菌素（actinomycin）、氨茴霉素（anthramycin）、偶氮丝氨酸（azaserine）、博来霉素（bleomycin）、放线菌素C（cactinomycin）、carabicin、洋红霉素（c臂inomycin）、嗜癌霉素（carzinophilin）、色霉素（chromomycin）、放线菌素D（dactinomycin）、柔红霉素（daunorubicin）、地托比星（detorubicin）、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、 

多柔比星（doxorubicin）（包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星）、表柔比星（epirubicin）、依索比星（esorubicin）、伊达比星（idarubicin）、麻西罗霉素（marcellomycin）、丝裂霉素类（mitomycins）诸如丝裂霉素C、霉酚酸（mycophenolic acid）、诺拉霉素（nogalamycin）、橄榄霉素（olivomycin）、培洛霉素（peplomycin）、泊非霉素（potfiromycin）、嘌呤霉素（puromycin）、三铁阿霉素（quelamycin）、罗多比星（rodorubicin）、链黑菌素（streptonigrin）、链佐星（streptozocin）、杀结核菌素（tubercidin）、乌苯美司（ubenimex）、净司他丁（zinostatin）、佐柔比星（zorubicin）；抗代谢物类，诸如甲氨喋呤（methotrexate）和5-氟尿嘧啶（5-FU）；叶酸类似物，诸如二甲叶酸（denopterin）、甲氨喋呤（methotrexate）、蝶酰三谷氨酸（pteropterin）、三甲曲沙（trimetrexate）；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨（fludarabine）、6-巯基嘌呤（mercaptopurine）、硫咪嘌呤（thiamiprine）、硫鸟嘌呤（thioguanine）；嘧啶类似物，诸如安西他滨（ancitabine）、阿扎胞苷（azacitidine）、6-氮尿苷（azauridine）、卡莫氟（c臂ofur）、阿糖胞苷（cytarabine）、双脱氧尿苷（dideoxyuridine）、去氧氟尿苷（doxifluridine）、依诺他滨（enocitabine）、氟尿苷（floxuridine）；雄激素类，诸如卡鲁睾酮（calusterone）、丙酸屈他雄酮（dromostanolone propionate）、表硫雄醇（epitiostanol）、美雄烷（mepitiostane）、睾内酯（testolactone）；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特（aminoglutethimide）、米托坦（mitotane）、曲洛司坦（trilostane）；叶酸补充剂，诸如亚叶酸（folinic acid）；醋葡醛内酯（aceglatone）；醛磷酰胺糖苷（aldophosphamide glycoside）；氨基乙酰丙酸（aminolevulinic acid）；恩尿嘧啶（eniluracil）；安吖啶（amsacrine）；bestrabucil；比生群（bisantrene）；依达曲沙（edatraxate）；地磷酰胺（defosfamide）；地美可辛（demecolcine）；地吖醌（diaziquone）；elfornithine；依利醋铵（elliptiniumacetate）；依托格鲁（etoglucid）；epothilone；硝酸镓；羟脲（hydroxyurea）；香菇多糖（lentinan）；氯尼达明（lonidamine）；美登木素生物碱类（maytansinoids），诸如美登素（maytansine）和安丝菌素（ansamitocin）；米托胍腙（mitoguazone）；米托蒽醌（mitoxantrone）；莫哌达醇（mopidamol）；二胺硝吖啶（nitracrine）；喷司他丁（pentostatin）；蛋氨氮芥（phenamet）；吡柔比星（pirarubicin）；洛索蒽醌（losoxantrone）；2-乙基酰肼（ethylhydrazide）；丙卡巴肼（procarbazine）；

多糖复合物（JHS Natural Products,Eugene,OR）；雷佐生（razoxane）；根霉素（rhizoxin）；西佐喃（sizofiran）；螺旋锗（spirogermanium）；细交链孢菌酮酸（tenuazonic acid）；三亚胺醌（triaziquone）；2,2',2''-三氯三乙胺；单端孢菌素类（trichothecenes）（尤其是T-2毒素、疣孢菌素（verrucarin）A、杆孢菌素（roridin）A和蛇行菌素（anguidin））；乌拉坦（urethan）；长春地辛（vindesine）

达卡巴嗪（dacarbazine）；甘露莫司汀（mannomustine）；二溴甘露醇（mitobronitol）；二溴卫矛醇（mitolactol）；哌泊溴烷（pipobroman）；gacytosine；阿糖胞苷（arabinoside）（“Ara-C”）；塞替派（thiotepa）；类紫杉醇类（taxoids），例如

帕利他赛（paclitaxel）（Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,NJ）、ABRAXANE^TM不含克列莫佛（Cremophor）、清蛋白改造的纳米颗粒剂型帕利他赛（American Ph臂aceutical Partners,Schaumberg,IL）和

多西他赛（doxetaxel）（

-Poulenc Rorer,Antony,France）；苯丁酸氮芥（chlorambucil）；吉西他滨（gemcitabine） 

6-硫鸟嘌呤（thioguanine）；巯基嘌呤（mercaptopurine）；甲氨喋呤（methotrexate）；铂类似物，诸如顺铂（cisplatin）和卡铂（carboplatin）；长春碱（vinblastine）

铂（platinum）；依托泊苷（etoposide）（VP-16）；异环磷酰胺（ifosfamide）；米托蒽醌（mitoxantrone）；长春新碱（vincristine）奥沙利铂（oxaliplatin）；亚叶酸（leucovorin）；长春瑞滨（vinorelbine）

能灭瘤（novantrone）；依达曲沙（edatrexate）；道诺霉素（daunomycin）；氨基蝶呤（aminopterin）；伊本膦酸盐（ibandronate）；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸（DMFO）；类视黄酸类（retinoids），诸如视黄酸（retinoic acid）；卡培他滨（capecitabine） 

任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物；以及两种或更多上述物质的组合，诸如CHOP（环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙联合疗法的缩写）和FOLFOX（奥沙利铂（ELOXATIN^TM）联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写）。 

该定义还包括作用为调节、降低、阻断、或抑制可促进癌生长的激素效果的抗激素剂，且常常是系统或全身治疗的形式。它们自身可以是激素。实例包括抗雌激素类和选择性雌激素受体调节剂类(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)（包括

他莫昔芬）、

雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬 (keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和

托瑞米芬(toremifene)；抗孕酮类；雌激素受体下调剂类(ERD)；功能为抑制或关闭卵巢的药剂，例如促黄体生成激素释放激素(LHRH)激动剂，诸如

和 

醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)、醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、醋酸布舍瑞林（buserelin acetate）和曲普瑞林(triptorelin)；其它抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；及抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、

醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、伏罗唑(vorozole)、

来曲唑(letrozole)和阿那曲唑(anastrozole)。另外，化疗剂的这种定义包括二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)（例如 

或

）、依替膦酸钠(etidronate)、NE-58095、 

唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronic acid/zoledronate)、

阿伦膦酸盐(alendronate)、

帕米膦酸盐(pamidronate)、

替鲁膦酸盐(tiludronate)或

利塞膦酸盐(risedronate)；以及曲沙他滨(troxacitabine)（1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物）；反义寡核苷酸，特别是抑制牵涉粘着细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如

疫苗和基因疗法疫苗，例如

疫苗、

疫苗和 

疫苗；

拓扑异构酶1抑制剂；rmRH；lapatinib ditosylate（ErbB-2和EGFR双重酪氨酸激酶小分子抑制剂，也称为GW572016）；及任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物。 

“生长抑制剂”在用于本文时指在体外或在体内抑制细胞生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以是显著降低处于S期的细胞百分比的药剂。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进（处于S期以外的位置）的药剂，诸如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春药类(vincas)（例如长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine)）、紫杉烷类(taxanes)、和拓扑异构酶II抑制剂诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。阻滞G1的药剂也溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼 松(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可参见《The Molecular Basis of Cancer》，Mendelsohn和Israel编，第1章，题为“Cell cycle regulation,oncogenes,and antieioplastic drugs”，Murakaini等人，WB Saunders，Philadelphia，1995，尤其是第13页。紫杉烷类（紫杉醇(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel)）是衍生自紫杉树的抗癌药。衍生自欧洲紫杉的多西他赛(

Rhone-Poulenc Rorer)是紫杉醇(Bristol-Myers Squibb)的半合成类似物。紫杉醇和多西他赛促进由微管蛋白二聚体装配成微管并通过防止解聚使微管稳定，导致对细胞中有丝分裂的抑制。 

如本文中使用的，“抗癌疗法”指减轻或抑制受试者中的癌症的治疗。抗癌疗法的例子包括细胞毒性放疗以及对受试者施用治疗有效量的细胞毒剂、化疗剂、生长抑制剂、癌症疫苗、血管发生抑制剂、前体药物、细胞因子、细胞因子拮抗剂、皮质类固醇、免疫抑制剂、止吐剂、抗体或抗体片段、或止痛剂。 

术语“前体药物”在用于本申请时指与母药(parent drug)相比对肿瘤细胞的细胞毒性较小并能够酶促活化或转变为更具活性母药形式的前体或衍生物形式药用活性物质。参见例如Wilman,“Prodrugs in Cancer Chemotherapy”,Biochemical Society Transactions,14,pp.375-382,615th Meeting Belfast(1986)和Stella et al.,“Prodrugs:A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery”,Directed Drug Delivery,Borchardt et al.,ed.,pp.247-267,Humana Press(1985)。前体药物包括但不限于含磷酸盐/酯前体药物、含硫代磷酸盐/酯前体药物、含硫酸盐/酯前体药物、含肽前体药物、D-氨基酸修饰前体药物、糖基化前体药物、含β-内酰胺前体药物、含任选取代苯氧基乙酰胺的前体药物或含任选取代苯乙酰胺的前体药物、可转变为更具活性而无细胞毒性的药物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前体药物。可衍生为本发明使用的前体药物形式的细胞毒性药物的例子包括但不限于上文描述的那些化疗剂。 

术语“细胞因子”是由一种细胞群释放，作为细胞间介质作用于另一种细胞的蛋白质的通称。此类细胞因子的例子有淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子中包括生长激素，诸如人生长激素(HGH)、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松 驰素；松驰素原；糖蛋白激素类，诸如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)；表皮生长因子(EGF)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子(FGF)；促乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-α和-β；穆勒氏(Mullerian)抑制性物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，诸如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子(osteoinductive factor)；干扰素，诸如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，诸如巨噬细胞CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF)和粒细胞CSF(G-CSF)；白介素(IL)，诸如IL-1、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-18；肿瘤坏死因子，诸如TNF-α或TNF-β；及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。在用于本文时，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质及天然序列细胞因子的生物学活性等效物。 

“细胞因子拮抗剂”表示部分或完全阻断、抑制、或中和至少一种细胞因子的生物学活性的分子。例如，细胞因子拮抗剂可通过抑制细胞因子表达和/或分泌或通过结合细胞因子或细胞因子受体来抑制细胞因子活性。细胞因子拮抗剂包括结合细胞因子或细胞因子受体的抗体、合成或天然序列肽、免疫粘附素、和小分子拮抗剂。细胞因子拮抗剂任选缀合或融合至细胞毒剂。例示性TNF拮抗剂是依那西普（etanercept，

）、英夫利昔单抗（infliximab，

）、和阿达木单抗（adalimumab，HUMIRA^TM）。 

如本文中使用的，术语“免疫抑制剂”指起抑制或掩盖所治疗受试者的免疫系统作用的物质。这包括抑制细胞因子生成、下调或抑制自身抗原表达、或掩盖MHC抗原的物质。免疫抑制剂的例子包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶类(见美国专利No.4,665,077)；霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)诸如 

硫唑嘌呤(azathioprine)(

/6-巯基嘌呤；溴隐亭(bromocryptine)；达那唑(danazol)；氨苯砜(dapsone)；戊二醛（它掩盖MHC抗原，如美国专利No.4,120,649中所记载的）；MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体；环孢霉素A；类固醇类，诸如皮质类固醇和糖皮质类固醇，例如泼尼松(prednisone)、泼尼松龙(prednisolone)诸如（泼尼松龙磷酸钠）或（泼尼松龙磷酸钠口服液）、甲泼尼龙(methylprednisolone)、和地塞米松(dexamethasone)；甲氨蝶呤(methotrexate) （口服或皮下）(

TREXALL^TM)；羟氯喹(hydroxycloroquine)/氯喹(chloroquine)；柳氮磺吡啶(sulfasalazine)；来氟米特(leflunomide)；细胞因子或细胞因子受体拮抗剂，包括抗干扰素-γ、-β或-α抗体，抗肿瘤坏死因子-α抗体（英夫利昔单抗(infliximab)或阿达木单抗(adalimumab)），抗TNF-α免疫粘附素（

依那西普(etanercept)），抗肿瘤坏死因子-β抗体，抗白介素-2抗体和抗IL-2受体抗体；抗LFA-1抗体，包括抗CD11a和抗CD18抗体；抗L3T4抗体；异源抗淋巴细胞球蛋白；多克隆或泛(pan)T抗体，或单克隆抗CD3或抗CD4/CD4a抗体；包含LFA-3结合域的可溶性肽(WO90/08187)；链激酶；TGF-β；链道酶；来自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；脱氧精胍菌素(deoxyspergualin)；雷帕霉素(rapamycin)；T细胞受体(Cohen et al.,美国专利No.5,114,721)；T细胞受体片段(Offner et al.Science251:430-432(1991);WO90/11294;Ianeway,Nature341:482(1989);WO91/01133)；T细胞受体抗体(EP340,109)，诸如T10B9；环磷酰胺

氨苯砜；青霉胺

血浆交换；或静脉内免疫球蛋白(IVIG)。这些可以单独或彼此组合使用，特别是类固醇和另一种免疫抑制剂的组合或此类组合继以维持剂量的非类固醇剂以降低对类固醇的需要。 

“止痛剂”指起抑制或遏制受试者中的疼痛的作用的药物。例示性止痛剂包括非类固醇抗炎药（NSAID），包括布洛芬（ibuprofen，

）、萘普生（naproxen，

）、乙酰水杨酸、茚甲新（indomethacin）、舒林酸（sulindac）、和托美汀（tolmetin），包括它们的盐和衍生物，以及用于减轻可能发生的刺痛的各种其它药疗，包括抗惊厥剂（gabapentin、phenyloin、卡马西平（carbamazepine））或三环抗抑郁剂。具体例子包括醋胺酚、阿司匹林、阿米替林（amitriptyline，

）、卡马西平（carbamazepine，）、phenyltoin

gabapentin 

(E)-N-香草基-8-甲基-6-noneamid

或神经阻断剂。 

“皮质类固醇”指具有类固醇的一般化学结构、模拟或提升天然存在皮质类固醇的效果的数种合成或天然存在物质中的任一种。合成皮质类固醇的例子包括泼尼松、泼尼松龙（包括甲泼尼龙）、地塞米松、曲安西龙、和倍他米松。 

如本文中使用的，“癌症疫苗”指在受试者中刺激针对癌症的免疫应答的组合物。癌症疫苗通常由癌症相关材料或细胞（抗原）的来源（对受试者可以是自体的（来自自己）或同种异体的（来自他人））以及用于进一步刺激和强化针对抗原的免疫应答的其它成分（例如佐剂）组成。癌症疫苗可导致刺激受试者的免疫系统生成针对一种或数种特定抗原的抗体，和/或生成杀伤T细胞以攻击具有那些抗原的癌症细胞。 

如本文中使用的，“细胞毒性放疗”指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞破坏的放射疗法。放射疗法可包括例如外线束辐照或使用经过放射性标记的药剂（诸如抗体）的疗法。该术语意图包括使用放射性同位素（例如At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、Ra²²³、P³²、和Lu的放射性同位素）。 

“受试者”指脊椎动物，诸如哺乳动物，例如人。哺乳动物包括但不限于家畜（诸如牛）、运动用动物、宠物（诸如猫、犬和马）、灵长类、小鼠、和大鼠。 

除非上下文另外指明，术语“第一”多肽和“第二”多肽及其变化形式仅仅是一般标识符，不要理解为标示本发明抗体的特定或具体多肽或成分。 

除非另有说明，实施例中提到的商品化试剂依照制造商的用法说明书来使用。下面的实施例中及贯穿说明书以ATCC登录号标示的那些细胞的来源是美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection,Manassas,VA）。除非另有说明，本发明使用重组DNA技术的标准规程，诸如上文及下面的教科书中描述的那些：Sambrook et al.,supra;Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology(Green Publishing Associates and Wiley Interscience,NY,1989);Innis et al.,PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(Academic Press,Inc.,NY,1990);Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,1988);Gait,Oligonucleotide Synthesis(IRL Press,Oxford,1984);Freshney,Animal Cell Culture,1987;Coligan et al.,Current Protocols in Immunology,1991。 

贯穿本说明书和权利要求书，用词“包含”或其变化形式会理解为暗示包括所述整数或整数群但不排除任何其它整数或整数群。 

II.异多聚体蛋白质的构建

典型地，本文所述异多聚体蛋白质会包含抗体Fc区的显著部分。 

异多聚化域

异多聚体蛋白质包含异多聚化域。为了生成基本上同质的异二聚体分子群体，异二聚化域必须具有超过同二聚体形成异二聚体的强偏爱。虽然本文中例示的异多聚体蛋白质利用节入穴技术来便于异多聚化，但是本领域技术人员会领会可用于本发明的其它异多聚化域。 

节入穴

作为生成多特异性抗体的方法，节入穴的使用是本领域公知的。参见美国专利No.5,731,168（1998年3月24日公告，转让给Genentech）、PCT公开No.WO2009089004（2009年7月16日公布，转让给Amgen）、和美国专利公开No.20090182127（2009年7月16日公布，转让给Novo Nordisk A/S）。还可参见Marvin and Zhu,Acta Pharmacologica Sincia(2005)26(6):649-658及Kontermann(2005)Acta Pharacol.Sin.,26:1-9。本文提供了简要讨论。 

“隆起”指至少一个氨基酸侧链自第一多肽的界面凸出并因此可放置在邻近界面（即第二多肽的界面）的补偿空腔中，从而稳定异多聚体，并由此例如有利于异多聚体形成，超过同多聚体形成。隆起可存在于初始界面中或可通过合成而引入（例如通过改变编码界面的核酸）。在正确情况下，改变编码第一多肽的界面的核酸以编码隆起。为了实现这一点，将编码第一多肽的界面中的至少一个“初始”氨基酸残基的核酸用编码至少一个侧链体积比初始氨基酸残基要大的“输入”氨基酸残基的核酸替换。会领会可以有超过一个初始和对应输入残基。可替换的初始残基的数目的上限是第一多肽的界面中的残基的总数。下表显示了各种氨基酸残基的侧链体积。 

表2 

氨基酸残基的特性 

a氨基酸的分子量减去水的分子量。数值来自Handbook of Chemistry and  Physics,43rd ed.Cleveland,Chemical Rubber Publishing Co.,1961。 

b数值来自A.A.Zamyatnin,Prog.Biophys.Mol.Biol.24:107-123,1972。 

c数值来自C.Chothia,J.Mol.Biol.105:1-14,1975。该参考文献的图6-20定义了可及表面积。 

用于形成隆起的优选输入残基一般是天然发生氨基酸残基且优选选自精氨酸（R）、苯丙氨酸（F）、酪氨酸（Y）和色氨酸（W）。最优选色氨酸和酪氨酸。在一个实施方案中，用于形成隆起的初始残基具有较小侧链体积，诸如丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。 

“空腔”指至少一个氨基酸侧链自第二多肽的界面凹进并因此容纳第一多肽的邻近界面上的对应隆起。空腔可存在于初始界面中或可通过合成而引入（例如通过改变编码界面的核酸）。在正确情况下，改变编码第二多肽的界面的核酸以编码空腔。为了实现这一点，将编码第二多肽的界面中的至少一个“初始”氨基酸残基的核酸用编码至少一个侧链体积比初始氨基酸残基要小的“输入”氨基酸残基的DNA替换。会领会可以有超过一个初始和对应输入残基。可替换的初始残基的数目的上限是第二多肽的界面中的残基的总数。上文表2显示了各种氨基酸残基的侧链体积。用于形成空腔的优选输入 残基通常是天然发生氨基酸残基且优选选自丙氨酸（A）、丝氨酸（S）、苏氨酸（T）和缬氨酸（V）。最优选丝氨酸、丙氨酸或苏氨酸。在一个实施方案中，用于形成空腔的初始残基具有较大的侧链体积，诸如酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。 

“初始”氨基酸残基指被“输入”残基替换的氨基酸残基，其中“输入”残基的侧链体积可以比初始残基要小或大。输入氨基酸残基可以是天然发生或非天然发生氨基酸残基，但是优选前者。“天然发生”氨基酸残基指那些由遗传密码编码且上文表2中列出的残基。“非天然发生”氨基酸残基意指不是由遗传密码编码但能够共价结合多肽链中的邻近氨基酸残基的残基。非天然发生氨基酸残基的例子是例如正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸和其它氨基酸残基类似物诸如Ellman et al.,Meth.Enzym.202:301-336(1991)中描述的那些。为了生成此类非天然发生氨基酸残基，可使用Noren et al.Science244:182(1989)及Ellman et al.,supra的规程。简言之，这涉及用非天然发生氨基酸残基化学活化阻抑tRNA，接着体外转录和反义RNA。本发明的方法涉及替换至少一个初始氨基酸残基，但是可以替换超过一个初始残基。在正常情况下，不超过第一或第二多肽界面中的全部初始氨基酸残基被替换。通常，用于替换的初始残基是“埋藏的”。“埋藏的”意味着残基是溶剂基本不可及的。一般地，输入残基不是半胱氨酸以防止二硫键的可能氧化或错配。 

隆起“可放置”在空腔中，这意味着隆起和空腔分别在第一多肽和第二多肽的界面上的空间位置及隆起和空腔的大小使得隆起能定位在空腔中，而对第一和第二多肽在界面处的正常联合没有显著扰乱。因为隆起诸如Tyr、Phe和Trp通常不与界面的轴垂直延伸且具有优选构象，所以隆起与对应空腔的排列依赖于隆起/空腔对基于三维结构（诸如通过X射线晶体学或核磁共振（NMR）获得的）的建模。这可以使用本领域广泛接受的技术来实现。 

“初始或模板核酸”意指编码感兴趣多肽的核酸，其可以“改变”（即遗传工程改造或突变）以编码隆起或空腔。初始或起始核酸可以是天然发生核酸或可以包含已经进行过在先改变（例如人源化抗体片段）的核酸。“改变”核酸意味着通过插入、删除或替换至少一个编码感兴趣氨基酸残基的密码子突变初始核酸。在正确情况下，将编码初始残基的密码子用编码输入残基的密码子替换。Mutagenesis:a Practical Approach,M.J.McPherson,Ed.,(IRL Press,Oxford,UK.(1991)中综述了用于以这种方式遗传修饰DNA的技术，而且包括例如定点诱变、盒式诱变和聚合酶链式反应（PCR）诱变。通过突变初始/模板核酸，由初始/模板核酸编码的初始/模板多肽如此得到相应改变。 

可以通过合成手段例如通过重组技术、体外肽合成、先前所述那些用于引入非天然发生氨基酸残基的技术、通过酶促或化学偶联肽或这些技术的一些组合将隆起或空腔“引入”第一或第二多肽的界面。因而，“引入”的隆起或空腔是“非天然发生的”或“非天然的”，这意味着它在自然界中或在初始多肽（例如人源化单克隆抗体）中不存在。 

一般地，用于形成隆起的输入氨基酸残基具有相对较小数目的“旋转异构体”（例如约3-6）。“旋转异构体”指氨基酸侧链的能量有利构象。Ponders and Richards,J.Mol.Biol.193:775-791(1987)中综述了各种氨基酸残基的旋转异构体的数目。 

其它突变

本文所述Fc多肽可具有赋予与野生型Fc多肽或节-入-穴Fc多肽相比降低的错配、降低的头-尾形成或升高的总体产量的突变。Fc变体包含选自至少一条重链上S239、V240、F241、F243、V264、R301、K334、Y349、T350、L368、K370、N389、Y391、K392、P395、P396、D399、F405、Y407的残基处与野生型Fc多肽中存在的氨基酸不同的氨基酸的至少一、二、三、四、五、六、七、八、九或十处替代。可能想要改变效应器功能，而且涵盖一些突变可增强或减弱效应器功能。优选突变没有显著改变抗体的其它功能特征，例如效应器功能。 

III.载体、宿主细胞和重组方法

为了重组生产本发明的异多聚体蛋白（例如抗体），分离编码它的核酸，并将其插入可复制载体，用于进一步克隆（DNA扩增）或表达。可使用常规流程容易的分离编码抗体的DNA并测序（如使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异结合的寡核苷酸探针）。可利用许多载体。载体的选择部分取决于将要使用的宿主细胞。通常，优选的宿主细胞是原核或真核（通常是哺乳动物，但也包括真菌（例如酵母）、昆虫、植物、和来自其它多细胞生物体的有核细胞）起源的。会领会，可以将任何同种型的恒定区用于此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD、和IgE恒定区，而且此类恒定区可以自任何人或动物物种获得。 

a.使用原核宿主细胞生成异多聚体蛋白

i.载体构建

可使用标准重组技术来获得编码本发明异多聚体蛋白（例如抗体）的多肽构件的多核苷酸序列。可从例如抗体生成细胞诸如杂交瘤细胞分离期望的多核苷酸序列并测序。或者，可使用核苷酸合成仪或PCR技术合成多核苷酸。一旦得到，将编码多肽的序列插入能够在原核宿主中复制并表达异源多核苷酸的重组载体。为了本发明，可使用本领域可获得的且知道的许多载体。适宜载体的选择将主要取决于将要插入载体的核酸的大小和将要用载体转化的具体宿主细胞。根据其功能（扩增或表达异源多核苷酸，或二者兼之）及其与它在其中驻留的具体宿主细胞的相容性，每种载体含有多种构件。载体构件通常包括但不限于复制起点、选择标志基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸插入片段、和转录终止序列。 

一般而言，与宿主细胞一起使用的质粒载体包含衍生自与这些宿主相容物种的复制子和控制序列。载体通常携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标志序列。例如，通常用衍生自大肠杆菌物种的质粒pBR322转化大肠杆菌。pBR322包含编码氨苄青霉素(Amp)和四环素(Tet)抗性的基因，由此提供轻松鉴定转化细胞的手段。pBR322、其衍生物、或其它微生物质粒或噬菌体还可包含或经修饰而包含可被微生物生物体用于表达内源蛋白质的启动子。Carter等人，美国专利5,648,237中详细记载了用于表达特定抗体的pBR322衍生物的实例。 

另外，可将包含与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体用作这些宿主的转化载体。例如，可使用噬菌体诸如λGEM.TM.-11来构建可用于转化易感宿主细胞诸如大肠杆菌LE392的重组载体。 

本发明的表达载体可包含两种或多种启动子-顺反子对，它们编码每一种多肽构件。启动子是位于顺反子上游（5'）的非翻译调控序列，它调控顺反子的表达。原核启动子通常分成两类，诱导型的和组成性的。诱导型启动子指响应培养条件的变化（如营养物的存在与否或温度变化）而启动受其控制的顺反子的升高水平转录的启动子。 

众所周知受到多种潜在宿主细胞识别的大量启动子。通过限制酶消化切下源DNA中的启动子并将分离的启动子序列插入本发明的载体，由此可将选择的启动子与编码例如轻链或重链的顺反子DNA可操作连接。天然启动子序 列和许多异源启动子都可用于指导靶基因的扩增和/或表达。在有些实施方案中，使用异源启动子，因为与天然靶多肽启动子相比，它们通常容许所表达靶基因的更高转录和更高产量。 

适用于原核宿主的启动子包括PhoA启动子、β-半乳糖苷酶和乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、和杂合启动子诸如tac或trc启动子。然而，在细菌中有功能的其它启动子（诸如其它已知的细菌或噬菌体启动子）也是合适的。它们的核苷酸序列已经发表，由此熟练工作人员能够使用提供任何所需限制位点的接头或衔接头将它们与编码异多聚体蛋白的基因例如靶轻链和重链的顺反子可操作连接（Siebenlist et al.,Cell20:269(1980)）。 

在本发明的一个实施方案中，重组载体内的每个顺反子都包含指导所表达多肽穿膜转运的分泌信号序列构件。一般而言，信号序列可以是载体的构件，或者它可以是插入载体的靶多肽DNA的一部分。为了本发明而选择的信号序列应当是受到宿主细胞识别并加工（即被信号肽酶切除）的信号序列。对于不识别并加工异源多肽的天然信号序列的原核宿主细胞，将信号序列用选自例如下组的原核信号序列替代：碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp、或热稳定的肠毒素II(STII)前导序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP。在本发明的一个实施方案中，表达系统的两个顺反子中都使用的信号序列是STII信号序列或其变体。 

在另一个实施方案中，依照本发明的免疫球蛋白的生成可在宿主细胞的细胞质中发生，因此不需要在每个顺反子内存在分泌信号序列。在那点上，免疫球蛋白轻链和重链在细胞质内表达、折叠和装配而形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株（如大肠杆菌trxB-菌株）提供有利于二硫键形成的细胞质条件，从而容许所表达蛋白质亚基的正确折叠和装配。参见Proba and Pluckthun,Gene159:203(1995)）。 

适于表达本发明异多聚体蛋白（例如抗体）的原核宿主细胞包括古细菌（Archaebacteria）和真细菌（Eubacteria），诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体。有用细菌的实例包括埃希氏菌属（Escherichia）（如大肠埃希氏菌E.coli）、芽孢杆菌属（Bacillus）（如枯草芽孢杆菌B.subtilis）、肠杆菌属（Enterobacteria）、假单胞菌属（Pseudomonas）（如铜绿假单胞菌P.aeruginosa）物种、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、粘质沙雷氏菌（Serratia marcescans）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、变形菌属（Proteus）、 志贺氏菌属（Shigella）、根瘤菌属（Rhizobium）、透明颤菌属（Vitreoscilla）、或副球菌属（Paracoccus）。在一个实施方案中，使用革兰氏阴性细胞。在一个实施方案中，使用大肠杆菌细胞作为本发明的宿主。大肠杆菌菌株的实例包括菌株W3110（Bachmann,Cellular and Molecular Biology，第2卷，Washington,D.C.，美国微生物学学会，1987，第1190-1219页；ATCC保藏号27,325）及其衍生物，包括具有基因型W3110ΔfhuA(ΔtonA)ptr3lac Iq lacL8ΔompTΔ(nmpc-fepE)degP41kan^R的菌株33D3（美国专利号5,639,635）。其它菌株及其衍生物，诸如大肠杆菌294（ATCC31,446）、大肠杆菌B、大肠杆菌λ1776（ATCC31,537）和大肠杆菌RV308（ATCC31,608）也是合适的。在一个实施方案中，发现大肠杆菌Δlpp特别有用。这些实例只是例示而非限制。本领域知道用于构建具有指定基因型的任何上述细菌衍生物的方法，参见例如Bass et al.,Proteins8:309-314(1990)。通常必需考虑复制子在细菌细胞中的可复制性来选择适宜的细菌。例如，在使用众所周知的质粒诸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410来提供复制子时，大肠杆菌、沙雷氏菌属、或沙门氏菌属物种可能适于用作宿主。通常，宿主细胞应当分泌最小量的蛋白水解酶，而且可能希望在细胞培养中掺入额外的蛋白酶抑制剂。 

ii.多肽生成

用上述表达载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当改动的常规营养培养基中进行培养。 

转化即将DNA导入原核宿主，使得DNA能够进行复制，或是作为染色体外元件或是通过染色体成分。根据所用宿主细胞，使用适于这些细胞的标准技术进行转化。采用氯化钙的钙处理通常用于具有坚固细胞壁屏障的细菌细胞。另一种转化方法采用聚乙二醇/DMSO。使用的还有一种技术是电穿孔。 

在本领域知道的且适于培养选定宿主细胞的培养基中培养用于生成本发明多肽的原核细胞。合适培养基的实例包括添加了必需营养补充物的LB培养基(Luria broth)。在有些实施方案中，培养基还含有根据表达载体的构建而选择的选择剂，以选择性容许包含表达载体的原核细胞生长。例如，向用于培养表达氨苄青霉素抗性基因的细胞的培养基中添加氨苄青霉素。 

除了碳、氮、和无机磷酸盐来源以外，还可含有适当浓度的任何必需补充物，或是单独加入或是作为与另一种补充物或培养基的混合物，诸如复合氮源。任选的是，培养基可含有一种或多种选自下组的还原剂：谷胱甘肽、 半胱氨酸、胱胺、巯基乙酸盐/酯、二硫赤藓糖醇和二硫苏糖醇。 

在合适的温度培养原核宿主细胞。例如，对于培养大肠杆菌，优选的温度范围是约20℃至约39℃，更优选约25℃至约37℃，甚至更优选约30℃。主要取决于宿主生物体，培养基的pH可以是范围为约5至约9的任何pH。对于大肠杆菌，pH优选约6.8至约7.4，更优选约7.0。 

如果本发明的表达载体中使用诱导型启动子，那么在适于激活启动子的条件下诱导蛋白质表达。在本发明的一个实施方案中，使用PhoA启动子来控制多肽的转录。因此，为了诱导，在磷酸盐限制培养基中培养经过转化的宿主细胞。优选的是，磷酸盐限制培养基是C.R.A.P培养基（参见例如Simmons et al.,J.Immunol.Methods263:133-147(2002)）。根据所采用的载体构建物，可采用多种其它诱导物，正如本领域所知道的。 

在一个实施方案中，分开培养第一和第二含Fc宿主细胞(the first and second Fc-containing host cell)，而且所表达的本发明多肽分开分泌到宿主细胞的周质中并从中回收。在第二个实施方案中，分开培养第一和第二含Fc宿主细胞，而且在分离含Fc多肽之前，将两种宿主细胞培养物混合到一起并使细胞形成团粒。在第三个实施方案中，分开培养第一和第二含Fc宿主细胞，分开离心和重悬浮，然后在分离含Fc多肽之前混合到一起。在第四个实施方案中，在同一个培养容器中一起培养第一和第二含Fc宿主细胞。蛋白质回收通常牵涉破坏微生物细胞膜，通常通过诸如渗压震扰(osmotic shock)、超声处理或裂解等手段。一旦细胞遭到破坏，可通过离心或过滤清除细胞碎片或整个细胞。可以通过例如亲和树脂层析进一步纯化蛋白质。或者，蛋白质可能转运到培养液中并从中分离。可从培养液清除细胞，并将培养物上清液过滤和浓缩，用于进一步纯化所生成蛋白质。可使用普遍知道的方法诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western印迹分析进一步分离和鉴定所表达蛋白质。分离的多肽会用于生成异多聚体蛋白。 

在本发明的一个实施方案中，通过发酵过程大量进行异多聚体蛋白（例如抗体）生产。多种大规模补料-分批发酵流程可用于生产重组蛋白。大规模发酵具有至少1000升的容量，优选约1,000至100,000升的容量。这些发酵罐使用搅拌器叶轮来分配氧和养分，尤其是葡萄糖（优选的碳源/能源）。小规模发酵通常指在体积容量不超过约100升的发酵罐中进行的发酵，范围可以是约1升至约100升。 

在发酵过程中，通常在将细胞在合适条件下培养至期望密度（如OD₅₅₀约180-220，在此阶段细胞处于早期稳定期）后启动蛋白质表达的诱导。根据所采用的载体构建物，可使用多种诱导物，正如本领域知道的和上文描述的。可在诱导前将细胞培养更短的时间。通常将细胞诱导约12-50小时，但是可使用更长或更短的诱导时间。 

为了提高本发明多肽的产量和质量，可修改多项发酵条件。例如，为了改善所分泌异多聚体蛋白（例如抗体）的正确装配和折叠，可使用过度表达伴侣蛋白诸如Dsb蛋白（DsbA、DsbB、DsbC、DsbD和/或DsbG）或FkpA（具有伴侣活性的一种肽基脯氨酰-顺式,反式-异构酶）的额外载体来共转化宿主原核细胞。已经证明伴侣蛋白促进在细菌宿主细胞中生成的异源蛋白质的正确折叠和溶解度。Chen et al.,J.Biol.Chem.274:19601-19605(1999);Georgiou等人，美国专利6,083,715;Georgiou等人，美国专利6,027,888;Bothmann and Pluckthun,J.Biol.Chem.275:17100-17105(2000);Ramm and Pluckthun,J.Biol.Chem.275:17106-17113(2000);Arie et al.,Mol.Microbiol.39:199-210(2001)）。 

为了将所表达异源蛋白质（尤其是对蛋白水解敏感的异源蛋白质）的蛋白水解降至最低，可将蛋白水解酶缺陷的某些宿主菌株用于本发明。例如，可修饰宿主细胞菌株，在编码已知细菌蛋白酶的基因中进行遗传突变，诸如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其组合。可以获得有些大肠杆菌蛋白酶缺陷菌株，参见例如Joly et al.,(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:2773-2777;Georgiou等人，美国专利5,264,365;Georgiou等人，美国专利5,508,192;Hara et al.,Microbial Drug Resistance2:63-72(1996)。 

在一个实施方案中，在本发明的表达系统中使用蛋白水解酶缺陷且经过过度表达一种或多种伴侣蛋白的质粒转化的大肠杆菌菌株作为宿主细胞。在第二个实施方案中，大肠杆菌菌株是外膜脂蛋白缺陷的（Δlpp）。 

iii.异多聚体蛋白纯化

在一个实施方案中，进一步纯化本文中生成的异多聚体蛋白以获得基本上同质的制品，用于进一步的测定和使用。可采用本领域知道的标准蛋白质纯化方法。下面的流程是合适纯化流程的例示：免疫亲和或离子交换柱上的分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土或阳离子交换树脂诸如DEAE上的层析、 层析聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、和使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤。 

在一个实施方案中，将固定在固相上的蛋白A用于例如本发明全长抗体产物的免疫亲和纯化。蛋白A是来自金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的41kD细胞壁蛋白质，它以高亲和力结合抗体Fc区。Lindmark et al.,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983)）。蛋白A固定其上的固相优选具有玻璃或石英表面的柱子，更优选可控孔径玻璃柱或硅酸柱。在有些应用中，柱子以诸如甘油等试剂包被，试图防止污染物的非特异粘附。 

作为纯化的第一步，将衍生自如上所述细胞培养物的制备物施加到蛋白A固定化固相上，使得目的抗体特异结合蛋白A。然后清洗固相以清除与固相非特异结合的污染物。通过洗脱从固相回收异多聚体蛋白（例如抗体）。 

b.使用真核宿主细胞生成异多聚体蛋白

载体构件通常包括但不限于如下一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标志基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列。 

i.信号序列构件 

在真核宿主细胞中使用的载体还可在目的成熟蛋白质或多肽的N端包含信号序列或具有特异切割位点的其它多肽。优选受到宿主细胞识别并加工（即被信号肽酶切除）的异源信号序列。在哺乳动物细胞表达中，可利用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导，例如单纯疱疹病毒gD信号。将这些前体区的DNA连接到编码期望异多聚体蛋白（例如抗体）的DNA的读码框中。 

ii.复制起点 

通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点构件。例如，通常可以使用SV40起点，但是只是因为它包含早期启动子。 

iii.选择基因构件 

表达和克隆载体可包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编码如下蛋白质：(a)赋予对抗生素或其它毒素的抗性，如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素；(b)补足相应的营养缺陷；或(c)提供不能从复合培养基获得的关键营养物。 

选择方案的一个实例利用药物来阻滞宿主细胞的生长。经异源基因成功转化的那些细胞生成赋予药物抗性的蛋白质，因而幸免于选择方案。此类显性选择的实例使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。 

适于哺乳动物细胞的选择标志的另一个实例是能够鉴定有能力摄取抗 体核酸的细胞的选择标志，诸如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白I和II优选灵长类金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。 

例如，首先通过将所有转化子在含有甲氨蝶呤（Mtx，DHFR的一种竞争性拮抗剂）的培养基中进行培养来鉴定经DHFR选择基因转化的细胞。在采用野生型DHFR时，适宜的宿主细胞是DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系（如ATCC CRL-9096）。 

或者，可通过在含有针对选择标志的选择剂诸如氨基糖苷抗生素如卡那霉素、新霉素或G418的培养基中培养细胞来选择经编码抗体、野生型DHFR蛋白、和另一种选择标志诸如氨基糖苷3'-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞（特别是包含内源DHFR的野生型宿主）。参见例如美国专利4,965,199。 

iv.启动子构件 

表达和克隆载体通常包含受到宿主生物体识别的启动子，且与期望含Fc多肽（例如抗体）核酸可操作连接。已知真核细胞的启动子序列。事实上，所有真核基因都具有富含AT区，它位于起始转录的位点上游约25至30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处发现的另一种序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3'端是AATAAA序列，它可能是向编码序列的3'端添加聚腺苷酸(polyA)尾的信号。所有这些序列合适的插入真核表达载体中。 

在哺乳动物宿主细胞中由载体转录期望含Fc多肽（例如抗体）受到例如从病毒（诸如例如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒（诸如2型腺病毒）、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒、和猿猴病毒40(SV40)）基因组获得的、来自异源哺乳动物启动子（如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子）的、或来自热休克启动子的启动子的控制，倘若这些启动子与宿主细胞系统相容的话。 

方便的以SV40限制性片段的形式获得SV40病毒的早期和晚期启动子，该片段还包含SV40病毒复制起点。方便的以HindIII E限制性片段的形式获得人巨细胞病毒的立即早期启动子。美国专利4,419,446中公开了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利4,601,978中记载了该系统的一种修改。关于在小鼠细胞中在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下表达人β-干扰素cDNA还可参见Reyes et al.,Nature297: 598-601(1982)。或者，可使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。 

v.增强子元件构件 

可以通过在载体中插入增强子序列来提高高等真核细胞对编码期望含Fc多肽（例如抗体）的DNA的转录。现在知道来自哺乳动物基因（例如球蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、α-胎蛋白和胰岛素基因）的许多增强子序列。还有，可以使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括SV40复制起点晚期侧的增强子（bp100-270）、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期侧的增强子、和腺病毒增强子。关于增强激活真核启动子的元件的描述还可参见Yaniv,Nature297:17-18(1982)。增强子可剪接到载体中，位于抗体多肽编码序列的5'或3'位置，只要实现增强，但是通常位于启动子的5'位点。 

vi.转录终止构件 

在真核宿主细胞中使用的表达载体通常还包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5'端和偶尔的3'端获得。这些区域包含在编码抗体的mRNA的非翻译区中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止构件是牛生长激素聚腺苷酸化区。参见WO94/11026及其中公开的表达载体。 

vii.宿主细胞的选择和转化 

适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞包括本文描述的高等真核细胞，包括脊椎动物宿主细胞。脊椎动物细胞在培养（组织培养）中的繁殖已经成为常规流程。有用哺乳动物宿主细胞系的实例有经SV40转化的猴肾CV1系（COS-7，ATCC CRL1651）、人胚肾系（293细胞或为悬浮培养而亚克隆的293细胞，Graham et al.,J.Gen.Virol.36:59(1977)）、幼仓鼠肾细胞（BHK，ATCC CCL10）、中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR（CHO，Urlaub et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980)）、小鼠塞托利(Sertoli)细胞（TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)）、猴肾细胞（CV1，ATCC CCL70）、非洲绿猴肾细胞（VERO-76，ATCC CRL1587）、人宫颈癌细胞（HELA，ATCC CCL2）、犬肾细胞（MDCK，ATCC CCL34）、牛鼠(buffalo rat)肝细胞（BRL3A，ATCC CRL1442）、人肺细胞（W138，ATCC CCL75）、人肝细胞（Hep G2，HB8065）、小鼠乳瘤（MMT060562，ATCC CCL51）、TRI细胞（Mather et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)）、MRC5细胞、FS4细胞和人肝细胞瘤(hepatoma)系（Hep G2）。 

为了生成期望含Fc多肽（例如抗体），用上文所述表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当改动的常规营养培养基中进行培养。 

viii.宿主细胞的培养 

可在多种培养基中培养用于生成本发明期望含Fc多肽（例如抗体）的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏F10（Sigma）、极限必需培养基（MEM，Sigma）、RPMI-1640（Sigma）、和Dulbecco氏修改Eagle氏培养基（DMEM，Sigma）适于培养宿主细胞。另外，可使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基：Ham et al.,Meth.Enz.58:44(1979);Barnes et al.,Anal.Biochem.102:255(1980);美国专利4,767,704;4,657,866;4,927,762;4,560,655;5,122,469;WO90/03430;WO87/00195;或美国专利复审30,985。任何这些培养基可根据需要补充激素和/或其它生长因子（诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子）、盐（诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐）、缓冲剂（诸如HEPES）、核苷酸（诸如腺苷和胸苷）、抗生素（诸如GENTAMYCIN^TM药物）、痕量元素（定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物）、和葡萄糖或等效能源。还可以适宜浓度含有本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。培养条件诸如温度、pH等即为表达而选择的宿主细胞先前所用的，这对于普通技术人员是显然的。 

ix.异多聚体蛋白的纯化 

在使用重组技术时，可在细胞内生成含Fc多肽，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内生成含Fc多肽，那么首先需要通过例如离心或超滤清除微粒碎片，或是宿主细胞或是裂解片段。如果含Fc多肽分泌到培养基中，那么通常首先使用商品化蛋白质浓缩滤器（例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元）浓缩来自这些表达系统的上清液。可在任何上述步骤中包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF以抑制蛋白水解，而且可包括抗生素以防止外来污染物的生长。 

可使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析（优选的纯化技术是亲和层析）来纯化从细胞制备的异多聚体组合物。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2、或γ4重链的抗体（Lindmark et al.,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983)）。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人γ3（Guss et al., EMBO J.5:1567-1575(1986)）。亲和配体所附着的基质最常用的是琼脂糖，但是可使用其它基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。若抗体包含C_H3结构域，则可使用Bakerbond ABX^TM树脂（J.T.Baker，Phillipsburg，NJ）进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术诸如离子交换柱上的分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的层析、肝素SEPHAROSE^TM上的层析、阴离子或阳离子交换树脂（诸如聚天冬氨酸柱）上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。 

在任何初步纯化步骤之后，可将含有目的抗体和污染物的混合物进行低pH疏水相互作用层析，使用pH约2.5-4.5的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度（如约0-0.25M盐）进行。除任何上述特定方法之外，异多聚体蛋白的生成可以包括透析含有多肽混合物的溶液作为替代或补充。 

x.使用杆状病毒的抗体生成 

可以通过使用例如脂转染试剂（lipofectin，可从GIBCO-BRL购买）将编码抗体或抗体片段的质粒和BaculoGold^TM病毒DNA（Pharmingen）共转染入昆虫细胞诸如草地夜蛾（Spodoptera frugiperda）细胞（例如Sf9细胞；ATCC CRL1711）或黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）S2细胞来生成重组杆状病毒。在一个特别的例子中，将抗体序列融合在杆状病毒表达载体内包含的表位标签的上游。此类表位标签包括多组氨酸标签。可采用多种质粒，包括自商品化质粒诸如pVL1393（Novagen）或pAcGP67B（Pharmingen）衍生的质粒。简言之，可使用与5’和3’区互补的引物通过PCR扩增编码抗体或其片段的序列。5’引物可掺入侧翼（选定的）限制酶位点。然后可以用选定的限制酶消化产物并亚克隆入表达载体。 

用表达载体转染后，将宿主细胞（例如Sf9细胞）于28℃温育4-5天，并收获释放的病毒，用于进一步扩增。病毒感染和蛋白质表达可以如例如O’Reilley et al.,Baculovirus expression vectors:A Laboratory Manual.Oxford:Oxford University Press(1994)所述实施。 

然后可纯化所表达的多组氨酸标记的抗体，例如通过如下的Ni²⁺-螯合亲和层析。可以如Rupert et al.,Nature,362:175-179(1993)所述从重组病毒感染的Sf9细胞制备提取物。简而言之，清洗Sf9细胞，重悬于超声处理缓冲液（25mL Hepes pH7.9,12.5mM MgCl₂,0.1mM EDTA,10%甘油,0.1%NP-40, 0.4M KCl），在冰上超声处理2次各20秒。通过离心使超声处理物澄清，将上清液在加样缓冲液（50mM磷酸盐,300mM NaCl,10%甘油,pH7.8）中稀释50倍并通过0.45μm滤器过滤。制备柱床体积5mL的Ni²⁺-NTA琼脂糖柱（可从Qiagen购买），用25mL水清洗并用25mL加样缓冲液平衡。将过滤后的细胞提取物以0.5mL/分钟加到柱上。用加样缓冲液清洗柱子至基线A₂₈₀，此时开始收集级分。接着，用第二清洗缓冲液（50mM磷酸盐,300mM NaCl,10%甘油,pH6.0）清洗柱子，洗脱非特异性结合的蛋白质。再次达到A₂₈₀基线后，用第二清洗缓冲液中的0至500mM咪唑梯度冲洗柱子。收集1mL级分，并通过SDS-PAGE和银染或者通过使用偶联有碱性磷酸酶的Ni²⁺-NTA(Qiagen)的Western印迹进行分析。合并含所洗脱的His₁₀标记的抗体的级分，并针对加样缓冲液进行透析。 

或者，可以使用已知的层析技术（包括例如蛋白A或蛋白G柱层析）来实施抗体的纯化。在一个实施方案中，可以通过洗脱入含有离液剂或温和去污剂的溶液自柱的固相回收感兴趣抗体。例示性离液剂和温和去污剂包括但不限于胍-HCl、脲、高氯酸锂、精氨酸、组氨酸、SDS（十二烷基硫酸钠）、Tween、Triton、和NP-40，它们都是商品化的。 

IV.异多聚体蛋白质形成/装配

完整异多聚体蛋白质的形成涉及通过二硫键形成（在本发明中称作重折叠）进行的第一和第二含Fc多肽(the first and second Fc-containing polypeptide)的重装配。重折叠包括第一含Fc多肽与第二含Fc多肽的联合和链间二硫键的形成。本发明中体外进行重折叠（也称作复性）。 

可以使用上文所述方法培养宿主细胞，或是作为分开的培养物或是作为单一培养物。在一种方法中，在同一培养容器中培养第一宿主细胞和第二宿主细胞（在本文中有时称作共培养或混合培养）。在另一种方法中，在分开的培养容器中培养第一和第二宿主细胞。在一种方法中，分开进行分开的培养，然后混合/组合，之后破坏细胞膜。在另一种方法中，混合分开的培养物，然后在破坏细胞膜之前加工。在一种方法中，混合分开的培养物，在破坏细胞膜之前没有进一步加工。在一种方法中，在破坏细胞膜之前加工包含第一和第二宿主细胞的单一培养物。在另一种方法中，在破坏细胞膜之前不加工共培养的细胞。加工细胞包括离心和在适宜缓冲液中重悬浮（例如提取缓冲液）。 

提取缓冲液是本领域已知的，而且技术人员会能够确定使用哪种缓冲液，无需过度实验。 

使用本领域已知方法破坏宿主细胞膜。此类方法包括细胞膜透化和细胞膜分解。透化细胞膜指使得膜“漏”，例如通过引入穴进行，这不破坏膜的整体完整性，使得细胞保持存活。换言之，透化提供穿过细胞膜的高分子运动且充分保持细胞结构以容许延续细胞存活。相反，细胞膜分解导致细胞内容物释放入细胞外环境和细胞死亡。 

用于破坏细胞膜的方法包括但不限于酶促裂解、超声处理、渗压震扰、通过微流化仪、添加EDTA、使用各种去污剂、溶剂（诸如甲苯、二甲亚砜、等）、表面活性剂（诸如Triton-X100、Tween20、等）、低渗缓冲液、使用冷冻/融化技术、电穿孔、和通过不锈钢球匀浆器。 

一旦含Fc多肽自细胞释放（通过透化或分解），异多聚化域会驱动异多聚体蛋白质的联合。相关含Fc多肽的链间二硫化物形成可以在添加或不添加还原剂的情况下行进。然后纯化所得二硫化物连接的异多聚体蛋白质。任选地，它可以为了研究、诊断、治疗或其它目的而配制。 

V.靶分子

可作为本发明异多聚体蛋白质的靶物的分子的例子包括但不限于可溶性血清蛋白质和它们的受体和其它膜结合蛋白质（例如粘附素）。 

在另一个实施方案中，本发明的异多聚体蛋白质能够结合一种、两种或更多种选自下组的细胞因子、细胞因子相关蛋白质、和细胞因子受体：BMPl，BMP2，BMP3B（GDFlO），BMP4，BMP6，BMP8，CSFl（M-CSF），CSF2（GM-CSF），CSF3（G-CSF），EPO，FGFl（aFGF），FGF2（bFGF），FGF3（int-2），FGF4（HST），FGF5，FGF6（HST-2），FGF7（KGF），FGF9，FGF10，FGF11，FGF12，FGF12B，FGF14，FGF16，FGF17，FGF19，FGF20，FGF21，FGF23，IGF1，IGF2，IFNAl，IFNA2，IFNA4，IFNA5，IFNA6，IFNA7，IFNBl，IFNG，IFNWl，FELl，FELl（EPSELON），FELl（ZETA），ILlA，ILlB，IL2，IL3，IL4，IL5，IL6，IL7，IL8，IL9，IL10，ILIl，IL12A，IL12B，IL13，IL14，IL15，IL16，IL17，IL17B，IL18，IL19，IL20，IL22，IL23，IL24，IL25，IL26，IL27，IL28A，IL28B，IL29，IL30，PDGFA，PDGFB，TGFA，TGFB1，TGFB2，TGFB3，LTA（TNF-b），LTB，TNF（TNF-a），TNFSF4（OX40配体），TNFSF5（CD40配体），TNFSF6（FasL），TNFSF7 （CD27配体），TNFSF8（CD30配体），TNFSF9（4-1BB配体），TNFSFl0（TRAIL），TNFSF1l（TRANCE），TNFSF12（APO3L），TNFSF13（April），TNFSF13B，TNFSF14（HVEM-L），TNFSF15（VEGI），TNFSF18，HGF（VEGFD），VEGF，VEGFB，VEGFC，ILlR1，IL1R2，IL1RL1，LL1RL2，IL2RA，IL2RB，IL2RG，IL3RA，IL4R，IL5RA，IL6R，IL7R，IL8RA，IL8RB，IL9R，ILl0RA，ILl0RB，IL1lRA，IL12RB1，IL12RB2，IL13RA1，IL13RA2，IL15RA，IL17R，IL18R1，IL20RA，IL21R，IL22R，IL1HY1，ILlRAP，IL1RAPL1，IL1RAPL2，ILlRN，IL6ST，IL18BP，IL18RAP，IL22RA2，AIFl，HGF，LEP（瘦蛋白），PTN，和THPO。 

在另一个实施方案中，靶物分子是选自下组的趋化因子、趋化因子受体、或趋化因子相关蛋白质：CCLl（I-309），CCL2（MCP-1/MCAF），CCL3（MIP-Ia），CCL4（MIP-Ib），CCL5（RANTES），CCL7（MCP-3），CCL8（mcp-2），CCLH（嗜酸细胞活化趋化因子），CCL13（MCP-4），CCL15（MIP-Id），CCL16（HCC-4），CCL17（TARC），CCL18（PARC），CCL19（MDP-3b），CCL20（MIP-3a），CCL21（SLC/exodus-2），CCL22（MDC/STC-I），CCL23（MPIF-I），CCL24（MPIF-2/嗜酸细胞活化趋化因子-2），CCL25（TECK），CCL26（嗜酸细胞活化趋化因子-3），CCL27（CTACK/ILC），CCL28，CXCLl（GROl），CXCL2（GRO2），CXCL3（GR03），CXCL5（ENA-78），CXCL6（GCP-2），CXCL9（MIG），CXCLlO（IP10），CXCLIl（I-TAC），CXCL12（SDFl），CXCL13，CXCL14，CXCL16，PF4（CXCL4），PPBP（CXCL7），CX3CL1（SCYDl），SCYEl，XCLl（淋巴细胞趋化因子），XCL2（SCM-Ib），BLRl（MDR15），CCBP2（D6/JAB61），CCRl（CKRl/HM145），CCR2（mcp-lRB/RA），CCR3（CKR3/CMKBR3），CCR4，CCR5（CMKBR5/ChemR13），CCR6（CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6），CCR7（CKR7/EBIl），CCR8（CMKBR8/TER1/CKR-L1），CCR9（GPR-9-6），CCRLl（VSHKl），CCRL2（L-CCR），XCRl（GPR5/CCXCRl），CMKLRl，CMKORl（RDCl），CX3CR1（V28），CXCR4，GPR2（CCRlO），GPR31，GPR81（FKSG80），CXCR3（GPR9/CKR-L2），CXCR6（TYMSTR/STRL33/Bonzo），HM74，IL8RA（IL8Ra），IL8RB（IL8Rb），LTB4R（GPR16），TCPlO，CKLFSF2，CKLFSF3，CKLFSF4，CKLFSF5，CKLFSF6，CKLFSF7，CKLFSF8，BDNF，C5R1，CSF3，GRCClO（ClO），EPO，FY（DARC），GDF5，HDFlA，DL8， PRL，RGS3，RGS13，SDF2，SLIT2，TLR2，TLR4，TREMl，TREM2，和VHL。 

在另一个实施方案中，本发明的异多聚体蛋白质能够结合一种或多种选自下组的靶物：ABCFl；ACVRl；ACVRlB；ACVR2；ACVR2B；ACVRLl；AD0RA2A；Aggrecan；AGR2；AICDA；AIFl；AIGl；AKAPl；AKAP2；AMH；AMHR2；ANGPTl；ANGPT2；ANGPTL3；ANGPTL4；ANPEP；APC；APOCl；AR；AZGPl（锌-a-糖蛋白）；B7.1；B7.2；BAD；BAFF（BLys）；BAGl；BAIl；BCL2；BCL6；BDNF；BLNK；BLRl（MDR15）；BMPl；BMP2；BMP3B（GDFlO）；BMP4；BMP6；BMP8；BMPRlA；BMPRlB；BMPR2；BPAGl（网蛋白）；BRCAl；C19orflO（IL27w）；C3；C4A；C5；C5R1；CANTl；CASP1；CASP4；CAVl；CCBP2（D6/JAB61）；CCLl（1-309）；CCLIl（嗜酸细胞活化趋化因子）；CCL13（MCP-4）；CCL15（MIP-Id）；CCL16（HCC-4）；CCL17（TARC）；CCL18（PARC）；CCL19（MIP-3b）；CCL2（MCP-1）；MCAF；CCL20（MIP-3a）；CCL21（MTP-2）；SLC；exodus-2；CCL22（MDC/STC-I）；CCL23（MPIF-1）；CCL24（MPIF-2/嗜酸细胞活化趋化因子-2）；CCL25（TECK）；CCL26（嗜酸细胞活化趋化因子-3）；CCL27（CTACK/ILC）；CCL28；CCL3（MTP-Ia）；CCL4（MDP-Ib）；CCL5（RANTES）；CCL7（MCP-3）；CCL8（mcp-2）；CCNAl；CCNA2；CCNDl；CCNEl；CCNE2；CCRl（CKRl/HM145）；CCR2（mcp-lRB/RA）；CCR3（CKR3/CMKBR3）；CCR4；CCR5（CMKBR5/ChemR13）；CCR6（CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6）；CCR7（CKR7/EBIl）；CCR8（CMKBR8/TERl/CKR-Ll）；CCR9（GPR-9-6）；CCRLl（VSHKl）；CCRL2（L-CCR）；CD164；CD19；CDlC；CD20；CD200；CD22；CD24；CD28；CD3；CD37；CD38；CD3E；CD3G；CD3Z；CD4；CD40；CD40L；CD44；CD45RB；CD52；CD69；CD72；CD74；CD79A；CD79B；CD8；CD80；CD81；CD83；CD86；CDHl（E-钙粘蛋白）；CDH10；CDH12；CDH13；CDH18；CDH19；CDH20；CDH5；CDH7；CDH8；CDH9；CDK2；CDK3；CDK4；CDK5；CDK6；CDK7；CDK9；CDKNlA（p21Wapl/Cipl）；CDKNlB（p27Kipl）；CDKNlC；CDKN2A（P16INK4a）；CDKN2B；CDKN2C；CDKN3；CEBPB；CERl；CHGA；CHGB；甲壳酶；CHST10；CKLFSF2；CKLFSF3；CKLFSF4；CKLFSF5；CKLFSF6；CKLFSF7；CKLFSF8；CLDN3；CLDN7（密蛋白-7）；CLN3；CLU（簇蛋白）；CMKLRl；CMKORl （RDCl）；CNRl；COL18A1；COLlAl；COL4A3；COL6A1；CR2；CRP；CSFl（M-CSF）；CSF2（GM-CSF）；CSF3（GCSF）；CTLA4；CTNNBl（b-联蛋白）；CTSB（组织蛋白酶B）；CX3CL1（SCYDl）；CX3CR1（V28）；CXCLl（GROl）；CXCL10（IP-10）；CXCLIl（I-TAC/IP-9）；CXCL12（SDFl）；CXCL13；CXCL14；CXCL16；CXCL2（GRO2）；CXCL3（GRO3）；CXCL5（ENA-78/LIX）；CXCL6（GCP-2）；CXCL9（MIG）；CXCR3（GPR9/CKR-L2）；CXCR4；CXCR6（TYMSTR/STRL33/Bonzo）；CYB5；CYCl；CYSLTRl；DAB2IP；DES；DKFZp451J0118；DNCLl；DPP4；E2F1；ECGFl；EDGl；EFNAl；EFNA3；EFNB2；EGF；EGFR；ELAC2；ENG；ENO1；ENO2；ENO3；EPHB4；EPO；ERBB2（Her-2）；EREG；ERK8；ESRl；ESR2；F3（TF）；FADD；FasL；FASN；FCERlA；FCER2；FCGR3A；FGF；FGFl（aFGF）；FGF10；FGF11；FGF12；FGF12B；FGF13；FGF14；FGF16；FGF17；FGF18；FGF19；FGF2（bFGF）；FGF20；FGF21；FGF22；FGF23；FGF3（int-2）；FGF4（HST）；FGF5；FGF6（HST-2）；FGF7（KGF）；FGF8；FGF9；FGFR3；FIGF（VEGFD）；FELl（EPSILON）；FILl（ZETA）；FLJ12584；FLJ25530；FLRTl（纤连蛋白）；FLTl；FOS；FOSLl（FRA-I）；FY（DARC）；GABRP（GABAa）；GAGEBl；GAGECl；GALNAC4S-6ST；GATA3；GDF5；GFI1；GGT1；GM-CSF；GNASl；GNRHl；GPR2（CCRlO）；GPR31；GPR44；GPR81（FKSG80）；GRCClO（ClO）；GRP；GSN（凝溶胶蛋白）；GSTPl；HAVCR2；HDAC4；HDAC5；HDAC7A；HDAC9；HGF；HIFlA；HDPl；组胺和组胺受体；HLA-A；HLA-DRA；HM74；HMOX1；HUMCYT2A；ICEBERG；ICOSL；ID2；IFN-a；IFNAl；IFNA2；IFNA4；IFNA5；IFNA6；IFNA7；IFNB1；IFNγ；DFNWl；IGBPl；IGFl；IGFlR；IGF2；IGFBP2；IGFBP3；IGFBP6；IL-I；IL10；IL10RA；IL10RB；IL11；IL11RA；IL-12；IL12A；IL12B；IL12RB1；IL12RB2；IL13；IL13RA1；IL13RA2；IL14；IL15；IL15RA；IL16；IL17；IL17B；IL17C；IL17R；IL18；IL18BP；IL18R1；IL18RAP；IL19；IL1A；IL1B；ILlF10；IL1F5；IL1F6；IL1F7；IL1F8；IL1F9；IL1HYl；IL1Rl；IL1R2；IL1RAP；IL1RAPL1；IL1RAPL2；IL1RL1；IL1RL2，ILlRN；IL2；IL20；IL20RA；IL21R；IL22；IL22R；IL22RA2；IL23；IL24；IL25；IL26；IL27；IL28A；IL28B；IL29；IL2RA；IL2RB；IL2RG；IL3；IL30；IL3RA；IL4；IL4R；IL5；IL5RA；IL6；IL6R；IL6ST （糖蛋白130）；EL7；EL7R；EL8；IL8RA；DL8RB；IL8RB；DL9；DL9R；DLK；INHA；INHBA；INSL3；INSL4；IRAKI；ERAK2；ITGAl；ITGA2；ITGA3；ITGA6（a6整联蛋白）；ITGAV；ITGB3；ITGB4（b4整联蛋白）；JAGl；JAKl；JAK3；JUN；K6HF；KAIl；KDR；KITLG；KLF5（GC框BP）；KLF6；KLKlO；KLK12；KLK13；KLK14；KLK15；KLK3；KLK4；KLK5；KLK6；KLK9；KRT1；KRT19（角蛋白19）；KRT2A；KHTHB6（毛发特异性H型角蛋白）；LAMAS；LEP（瘦蛋白）；Lingo-p75；Lingo-Troy；LPS；LTA（TNF-b）；LTB；LTB4R（GPR16）；LTB4R2；LTBR；MACMARCKS；MAG或Omgp；MAP2K7（c-Jun）；MDK；MIBl；中期因子；MEF；MIP-2；MKI67；（Ki-67）；MMP2；MMP9；MS4A1；MSMB；MT3（金属硫蛋白-III）；MTSSl；MUCl（粘蛋白）；MYC；MYD88；NCK2；神经聚糖；NFKBl；NFKB2；NGFB（NGF）；NGFR；NgR-Lingo；NgR-Nogo66（Nogo）；NgR-p75；NgR-Troy；NMEl（NM23A）；N0X5；NPPB；NROBl；NR0B2；NRlDl；NR1D2；NR1H2；NR1H3；NR1H4；NR1I2；NR1I3；NR2C1；NR2C2；NR2E1；NR2E3；NR2F1；NR2F2；NR2F6；NR3C1；NR3C2；NR4A1；NR4A2；NR4A3；NR5A1；NR5A2；NR6A1；NRPl；NRP2；NT5E；NTN4；ODZl；OPRDl；P2RX7；PAP；PARTl；PATE；PAWR；PCA3；PCNA；PDGFA；PDGFB；PECAMl；PF4（CXCL4）；PGF；PGR；phosphacan；PIAS2；PIK3CG；PLAU（uPA）；PLG；PLXDCl；PPBP（CXCL7）；PPID；PRl；PRKCQ；PRKDl；PRL；PROC；PROK2；PSAP；PSCA；PTAFR；PTEN；PTGS2（COX-2）；PTN；RAC2（p21Rac2）；RARB；RGSl；RGS13；RGS3；RNFIlO（ZNF144）；ROBO2；S100A2；SCGB1D2（亲脂素B）；SCGB2A1（mammaglobin2）；SCGB2A2（mammaglobin1）；SCYEl（内皮单核细胞活化细胞因子）；SDF2；SERPINAl；SERPINA3；SERP1NB5（maspin）；SERPINEl（PAI-I）；SERPDMF1；SHBG；SLA2；SLC2A2；SLC33A1；SLC43A1；SLIT2；SPPl；SPRRlB（Sprl）；ST6GAL1；STABl；STAT6；STEAP；STEAP2；TB4R2；TBX21；TCPlO；TDGFl；TEK；TGFA；TGFBl；TGFBlIl；TGFB2；TGFB3；TGFBI；TGFBRl；TGFBR2；TGFBR3；THlL；THBSl（血小板反应蛋白-1）；THBS2；THBS4；THPO；TIE（Tie-1）；TMP3；组织因子；TLRlO；TLR2；TLR3；TLR4；TLR5；TLR6；TLR7；TLR8；TLR9；TNF；TNF-a；TNFAEP2（B94）；TNFAIP3；TNFRSFIlA；TNFRSFlA；TNFRSFlB；TNFRSF21；TNFRSF5；TNFRSF6 （Fas）；TNFRSF7；TNFRSF8；TNFRSF9；TNFSFlO（TRAIL）；TNFSFl1（TRANCE）；TNFSF12（APO3L）；TNFSF13（April）；TNFSF13B；TNFSF14（HVEM-L）；TNFSF15（VEGI）；TNFSF18；TNFSF4（OX40配体）；TNFSF5（CD40配体）；TNFSF6（FasL）；TNFSF7（CD27配体）；TNFSF8（CD30配体）；TNFSF9（4-1BB配体）；TOLLIP；Toll样受体；TOP2A（拓扑异构酶Ea）；TP53；TPMl；TPM2；TRADD；TRAFl；TRAF2；TRAF3；TRAF4；TRAF5；TRAF6；TREMl；TREM2；TRPC6；TSLP；TWEAK；VEGF；VEGFB；VEGFC；多能聚糖；VHL C5；VLA-4；XCLl（淋巴细胞趋化因子）；XCL2（SCM-Ib）；XCRl（GPR5/CCXCRl）；YYl；和ZFPM2。 

本发明涵盖的抗体的优选分子靶分子包括CD蛋白诸如CD3，CD4，CD8，CD16，CD19，CD20，CD34；CD64，CD200；ErbB受体家族的成员诸如EGF受体，HER2，HER3或HER4受体；细胞粘附分子诸如LFA-1，Mac1，p150.95，VLA-4，ICAM-1，VCAM，α4/β7整联蛋白，和αv/β3整联蛋白，包括它们的α或β亚基（例如抗CD11a，抗CD18或抗CD11b抗体）；生长因子诸如VEGF-A，VEGF-C；组织因子（TF）；α干扰素（αIFN）；TNFα，白介素，诸如IL-1β，IL-3，IL-4，IL-5，IL-8，IL-9，IL-13，IL17A/F，IL-18，IL-13Rα1，IL13Rα2，IL-4R，IL-5R，IL-9R，IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖（OB）受体；mpl受体；CTLA-4；RANKL，RANK，RSV F蛋白，蛋白C等。 

在一个实施方案中，本发明的异多聚体蛋白质结合低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)-1或LRP-8或运铁蛋白受体，和至少一种选自下组的靶物：1)β-分泌酶（BACE1或BACE2），2)α-分泌酶，3)γ-分泌酶，4)τ-分泌酶，5)淀粉状蛋白前体蛋白(APP)，6)死亡受体6(DR6)，7)淀粉状蛋白β肽，8)α-突触核蛋白，9)帕金蛋白，10)亨廷顿蛋白，11)p75NTR，和12)胱天蛋白酶-6。 

在一个实施方案中，本发明的异多聚体蛋白质结合至少两种选自下组的靶分子：IL-lα和IL-lβ，IL-12和IL-18；IL-13和IL-9；IL-13和IL-4；IL-13和IL-5；IL-5和IL-4；IL-13和IL-lβ；IL-13和IL-25；IL-13和TARC；IL-13和MDC；IL-13和MEF；IL-13和TGF-β；IL-13和LHR激动剂；IL-12和TWEAK，IL-13和CL25；IL-13和SPRR2a；IL-13和SPRR2b；IL-13和ADAM8，IL-13和PED2，IL17A和IL17F，CD3和CD19，CD138和CD20；CD138和CD40；CD19和CD20；CD20和CD3；CD38和CD138；CD38和CD20；CD38和CD40；CD40和CD20；CD-8 和IL-6；CD20和BR3，TNFα和TGF-β，TNFα和IL-lβ；TNFα和IL-2，TNFα和IL-3，TNFα和IL-4，TNFα和IL-5，TNFα和IL6，TNFα和IL8，TNFα和IL-9，TNFα和IL-10，TNFα和IL-11，TNFα和IL-12，TNFα和IL-13，TNFα和IL-14，TNFα和IL-15，TNFα和IL-16，TNFα和IL-17，TNFα和IL-18，TNFα和IL-19，TNFα和IL-20，TNFα和IL-23，TNFα和IFNα，TNFα和CD4，TNFα和VEGF，TNFα和MIF，TNFα和ICAM-1，TNFα和PGE4，TNFα和PEG2，TNFα和RANK配体，TNFα和Te38；TNFα和BAFF；TNFα和CD22；TNFα和CTLA-4；TNFα和GP130；TNFα和IL-12p40；VEGF和HER2，VEGF-A和HER2，VEGF-A和PDGF，HER1和HER2，VEGF-A和VEGF-C，VEGF-C和VEGF-D，HER2和DR5,VEGF和IL-8，VEGF和MET，VEGFR和MET受体，VEGFR和EGFR，HER2和CD64，HER2和CD3，HER2和CD16，HER2和HER3；EGFR（HER1）和HER2，EGFR和HER3，EGFR和HER4，IL-13和CD40L，IL4和CD40L，TNFR1和IL-1R，TNFR1和IL-6R和TNFR1和IL-18R，EpCAM和CD3，MAPG和CD28，EGFR和CD64，CSPGs和RGM A；CTLA-4和BTNO2；IGF1和IGF2；IGF1/2和Erb2B；MAG和RGM A；NgR和RGM A；NogoA和RGM A；OMGp和RGM A；PDL-I和CTLA-4；和RGM A和RGM B。 

可溶性抗原或其片段（任选缀合至其它分子）可作为免疫原用于生成抗体。对于跨膜分子，诸如受体，它们的片段（例如受体的胞外域）可用作免疫原。或者，表达跨膜分子的细胞可用作免疫原。此类细胞可衍生自天然来源（例如癌细胞系），或者可以是通过重组技术经过转化而表达跨膜分子的细胞。其它抗原和它们可用于制备抗体的形式对本领域技术人员会是明显的。 

VI.活性测定法

本发明的异多聚体蛋白质可以通过本领域已知的各种测定法表征它们的物理/化学特性和生物学功能。 

纯化的异多聚体蛋白质可以通过一系列测定法进一步表征，包括但不限于N端测序、氨基酸分析、非变性大小排阻高压液体层析(HPLC)、质谱术、离子交换层析和木瓜蛋白酶消化。 

在某些本发明的实施方案中，对本文中生成的免疫球蛋白分析它们的生物学活性。在一些实施方案中，对本发明的免疫球蛋白测试它们的抗原结合活性。本领域已知的且可用于本文的抗原结合测定法包括但不限于任何使用 下述技术的直接或竞争性结合测定法，诸如Western印迹、放射免疫测定法、ELISA（酶联免疫吸附测定法）、“夹心式”免疫测定法、免疫沉淀测定法、荧光免疫测定法、和蛋白A免疫测定法。下文实施例部分中提供了一种例示性抗原结合测定法。 

在一个实施方案中，本发明涵盖改变的抗体，其拥有一些但非所有效应器功能，使之成为其中抗体体内半衰期重要但某些效应器功能（诸如补体和ADCC）不必要或有害的许多应用的期望候选物。在某些实施方案中，测量生成的异多聚体蛋白质的Fc活性以确保只维持期望特性。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消除。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定法以确认异多聚体蛋白质缺乏FcγR结合（因此有可能缺乏ADCC活性），但保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol9:457-92(1991)第464页上表3总结了造血细胞上的FcR表达。用于评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的一个例子记载于美国专利No.5,500,362或5,821,337。对此类测定法有用的效应器细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可以体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes et al.PNAS(USA)95:652-656(1998)中公开的。也可以进行C1q结合测定法以确认抗体不能结合C1q且因此缺乏CDC活性。为了评估补体活化，可以实施CDC测定法，例如Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods202:163(1996)中描述的。也可以使用本领域已知方法实施FcRn结合和体内清除/半衰期测定。 

VII.偶联的蛋白质

本发明还提供偶联的蛋白质诸如偶联的抗体或免疫偶联物（例如“抗体-药物偶联物”或“ADC”），其包含任何本文所述异多聚体蛋白质（例如依照本文所述方法生成的抗体），其中轻链或重链恒定区之一偶联有化学分子诸如染料或细胞毒剂诸如化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素（例如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素，或其片段）、或放射性同位素（即放射偶联物）。特别地，如本文所述，使用异多聚化域能够构建含有两条不同重链（HC1和HC2）以及两条不同轻链（LC1和LC2）的抗体。使用本文所述方法构建的免疫偶联物可含有偶联至仅一条重链（HC1或HC2）或仅一条轻链（LC1或LC2）的恒定区的细胞毒剂。还有，因为免疫偶联物可具有附着 至仅一条重或轻链的细胞毒剂，所以施用于受试者的细胞毒剂的量相对于施用具有附着至两条重或轻链的细胞毒剂的抗体降低。降低施用于受试者的细胞毒剂的量限制与细胞毒剂有关的不利副作用。 

抗体-药物偶联物在癌症治疗中用于局部投递细胞毒剂或细胞抑制剂（即杀死或抑制肿瘤细胞的药物）的使用（Syrigos and Epenetos,Anticancer Research19:605-614(1999);Niculescu-Duvaz and Springer,Adv.Drg.Del.Rev.26:151-172(1997);美国专利No.4,975,278）容许将药物模块靶向投递至肿瘤，并在那儿进行细胞内积累，而系统施用这些未经偶联的药物制剂可能在试图消除的肿瘤细胞以外导致不可接受的对正常细胞的毒性水平（Baldwin等,Lancet(1986年3月15日)第603-05页(1986);Thorpe,(1985)“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review”，在《Monoclonal Antibodies'84：Biological And Clinical Applications》中，A.Pinchera等人编，第475-506页）。由此寻求最大功效及最小毒性。多克隆抗体和单克隆抗体皆有报导可用于这些策略（Rowland等,Cancer Immunol.Immunother.21：183-187(1986)）。这些方法中所使用的药物包括道诺霉素(daunomycin)、多柔比星(doxorubicin)、甲氨蝶呤(methotrexate)和长春地辛(vindesine)（Rowland等,1986,见上文）。抗体-毒素偶联物中所使用的毒素包括细菌毒素诸如白喉毒素、植物毒素诸如蓖麻毒蛋白、小分子毒素诸如格尔德霉素(geldanamycin)（Mandler et al.,Jour.of the Nat.Cancer Inst.92(19):1573-1581(2000);Mandler et al.,Bioorganic&Med.Chem.Letters10:1025-1028(2000);Mandler et al.,Bioconjugate Chem.13:786-791(2002)）、美登木素生物碱类（EP1391213;Liu等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：8618-8623(1996)）、和加利车霉素（Lode等,Cancer Res.58：2928(1998);Hinman等,Cancer Res.53：3336-3342(1993)）。毒素可通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制在内的机制实现其细胞毒性和细胞抑制性效果。有些细胞毒药物在与大的抗体或蛋白质受体配体偶联时趋于失活或活性降低。 

本文（例如上文）描述了可用于生成免疫偶联物的化疗剂。可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链（来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)）、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆 (Phytolaca americana)毒蛋白（PAPI、PAPII和PAP-S）、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。参见例如1993年10月28日公布的WO93/21232。多种放射性核素可用于生成放射偶联抗体。例子包括²¹²Bi、¹³¹I、¹³¹In、⁹⁰Y和¹⁸⁶Re。抗体和细胞毒剂的偶联物可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯（诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯）、活性酯类（诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯）、醛类（诸如戊二醛）、双叠氮化合物（诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺）、双重氮衍生物（诸如双(对-重氮苯甲酰基)乙二胺）、二异氰酸酯（诸如甲苯2,6-二异氰酸酯）、和双活性氟化合物（诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯）的双功能衍生物。例如，可如Vitetta等,Science238：1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见例如WO94/11026。 

本文还涵盖抗体与一种或多种小分子毒素诸如加利车霉素(calicheamicin)、美登木素生物碱类(maytansinoids)、多拉司他汀类(dolostatins)、aurostatins、单端孢霉素(trichothecene)和CC1065及这些毒素具有毒素活性的衍生物的偶联物。 

i.美登素和美登木素生物碱类 

在有些实施方案中，免疫偶联物包含偶联有一个或多个美登木素生物碱分子的本发明抗体（全长或片段）。 

美登木素生物碱类是通过抑制微管蛋白多聚化来发挥作用的有丝分裂抑制剂。美登素最初从东非灌木齿叶美登木（Maytenus serrata）分离得到（美国专利3,896,111）。随后发现某些微生物也生成美登木素生物碱类，诸如美登醇和C-3美登醇酯（美国专利4,151,042）。例如下列美国专利公开了合成美登醇及其衍生物和类似物：4,137,230;4,248,870;4,256,746;4,260,608;4,265,814;4,294,757;4,307,016;4,308,268;4,308,269;4,309,428;4,313,946;4,315,929;4,317,821;4,322,348;4,331,598;4,361,650;4,364,866;4,424,219;4,450,254;4,362,663;及4,371,533。 

美登木素生物碱类药物模块在抗体药物偶联物中是有吸引力的药物模块，因为它们：(i)相对易于通过发酵或发酵产物的化学修饰、衍生化来制备；(ii)易于用适于通过非二硫化物接头的偶联的官能基衍生化；(iii)在血浆中稳定；且(iv)有效针对多种肿瘤细胞系。 

例如下列专利公开了包含美登木素生物碱类的免疫偶联物及其制备方法和治疗用途：美国专利5,208,020;5,416,064;及欧洲专利EP0425235B1，在此通过述及明确收录其公开内容。Liu et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:8618-8623(1996)记载了包含与针对人结肠直肠癌的单克隆抗体C242连接的称为DM1的美登木素生物碱的免疫偶联物。发现该偶联物具有针对培养的结肠癌细胞的高度细胞毒性，而且在体内肿瘤生长测定法中显示抗肿瘤活性。Chari et al.,Cancer Research52:127-131(1992)记载了其中美登木素生物碱经二硫化物接头与结合人结肠癌细胞系上抗原的鼠抗体A7或结合HER-2/neu癌基因的另一种鼠单克隆抗体TA.1偶联的免疫偶联物。在体外在人乳癌细胞系SK-BR-3上测试了TA.1-美登木素生物碱偶联物的细胞毒性，该细胞系每个细胞表达3x10⁵个HER-2表面抗原。药物偶联物达到了与游离美登木素生物碱药物相似的一定程度的细胞毒性，这可通过增加每个抗体分子偶联的美登木素生物碱分子数目来提高。A7-美登木素生物碱偶联物在小鼠中显示低系统性细胞毒性。 

抗体-美登木素生物碱偶联物通过将抗体与美登木素生物碱分子化学连接且不显著削弱抗体或美登木素生物碱分子的生物学活性来制备。参见例如美国专利No.5,208,020（在此通过述及明确收录其公开内容）。每个抗体分子偶联平均3-4个美登木素生物碱分子在增强针对靶细胞的细胞毒性中显示功效，且对抗体的功能或溶解度没有负面影响，尽管预计甚至一个分子的毒素/抗体也将较之裸抗体的使用增强细胞毒性。美登木素生物碱类在本领域是众所周知的，而且可通过已知技术合成或从天然来源分离。例如美国专利5,208,020和上文提及的其它专利及非专利发表物中公开了合适的美登木素生物碱类。优选的美登木素生物碱类是美登醇和美登醇分子的芳香环或其它位置经过修饰的美登醇类似物，诸如各种美登醇酯。 

本领域知道许多连接基团可用于制备抗体-美登木素生物碱偶联物，包括例如美国专利5,208,020或欧洲专利0425235B1;Chari et al.,Cancer Research52:127-131(1992);美国专利公开文本No.2005/0169933中所公开 的（在此通过述及明确收录其公开内容）。包含接头构件SMCC的抗体-美登木素生物碱类偶联物可以如美国专利申请公开文本No.2005/0169933中所披露的来制备。连接基团包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团、或酯酶不稳定基团，正如上文所述专利中所公开的，优选二硫化物和硫醚基团。本文中描述和例示了别的连接基团。 

可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和美登木素生物碱的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯（诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯）、活性酯类（诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯）、醛类（诸如戊二醛）、双叠氮化合物（诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺）、双重氮衍生物（诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺）、二异氰酸酯（诸如甲苯2,6-二异氰酸酯）、和双活性氟化合物（诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯）的双功能衍生物。特别优选的偶联剂包括N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)（Carlsson et al.,Biochem.J.173:723-737(1978)）和N-琥珀酰亚氨基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，由此提供二硫键连接。 

根据连接的类型，可将接头附着于美登木素生物碱分子的多个位置。例如，可使用常规偶联技术通过与羟基的反应来形成酯键。反应可发生在具有羟基的C-3位置、经羟甲基修饰的C-14位置、经羟基修饰的C-15位置、和具有羟基的C-20位置。在一个优选的实施方案中，在美登醇或美登醇类似物的C-3位置形成键连接。 

ii.Auristatin和多拉司他汀 

在有些实施方案中，免疫偶联物包含与多拉司他汀类(dolastatins)或多拉司他汀肽类似物及衍生物、auristatin类偶联的本发明抗体(美国专利No.5,635,483和5,780,588)。多拉司他汀类和auristatin类已经显示出干扰微管动力学、GTP水解、及核和细胞分裂(Woyke et al.,Antimicrob.Agents and Chemother.45(12):3580-3584(2001))且具有抗癌(美国专利No.5,663,149)和抗真菌活性(Pettit et al.,Antimicrob.Agents Chemother.42:2961-2965(1998))。多拉司他汀或auristatin药物模块可经由肽药物模块的N（氨基）末端或C（羧基）末端附着于抗体(WO02/088172)。 

例示性的auristatin实施方案包括N-末端连接的单甲基auristatin药物模块DE和DF，披露于“Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands”,美国申请公开文本No.2005/0238649，在此通过述及明确收录其完整公开内容。 

典型的是，基于肽的药物模块可通过在两个或多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备。此类肽键可依照例如肽化学领域众所周知的液相合成法来制备(参见E.and K.Lübke,The Peptides,volume1,pp.76-136,1965,Academic Press)。auristatin/多拉司他汀药物模块可依照以下文献中的方法来制备：美国专利No.5,635,483和No.5,780,588;Pettit et al.,J.Nat.Prod.44:482-485(1981);Pettit et al.,Anti-Cancer Drug Design13:47-66(1998);Poncet,Curr.Pharm.Des.5:139-162(1999);and Pettit,Fortschr.Chem.Org.Naturst.70:1-79(1997)。还可参见Doronina,Nat.Biotechnol.21(7):778-784(2003);及“Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands”,美国申请公开文本号No.2005/0238649，在此通过述及完整收录（披露了例如制备诸如MMAE和MMAF偶联至接头的单甲基缬氨酸化合物的接头和方法）。 

iii.加利车霉素 

在其它实施方案中，免疫偶联物包含偶联有一个或多个加利车霉素分子的本发明抗体。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度生成双链DNA断裂。关于加利车霉素家族偶联物的制备参见美国专利No.5,712,374;No.5,714,586;No.5,739,116;No.5,767,285;No.5,770,701;No.5,770,710;No.5,773,001;和No.5,877,296（都授予美国Cyanamid公司）。可用的加利车霉素结构类似物包括但不限于γ1^I、α2^I、α3^I、N-乙酰基-γ1^I、PSAG和θ^I1（Hinman et al.,Cancer Research53:3336-3342(1993);Lode et al.,Cancer Research58:2925-2928(1998);及上述授予美国Cyanamid公司的美国专利）。可与抗体偶联的另一种抗肿瘤药物是QFA，它是一种抗叶酸药物。加利车霉素和QFA都具有胞内作用位点，且不易穿过质膜。因此，这些试剂经由抗体介导的内在化的细胞摄取大大增强了它们的细胞毒效果。 

iv.其它细胞毒剂 

可依照本文所述方法生成或与本发明的抗体偶联的其它抗肿瘤剂包括BCNU、链佐星(streptozoicin)、长春新碱(vincristine)、5-氟尿嘧啶、美国专利No.5,053,394和No.5,770,710中记载的统称为LL-E33288复合物的试剂家族、及埃斯波霉素类(esperamicins)（美国专利No.5,877,296）。 

可用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链（来自铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa）、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)毒蛋白（PAPI、PAPII和PAP-S）、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)（参见例如1993年10月28日公布的WO93/21232）。 

本发明还设想了抗体和具有核酸降解活性的化合物（如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶，诸如脱氧核糖核酸酶；DNA酶）之间形成的免疫偶联物。 

为了选择性破坏肿瘤，抗体可包含高度放射性原子。多种放射性同位素可用于生成放射偶联抗体。实例包括At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、Pb²¹²和Lu的放射性同位素。在将偶联物用于检测时，可包含放射性原子用于闪烁照相研究，例如Tc^99m或I¹²³，或是包含自旋标记物用于核磁共振（NMR）成像（也称为磁共振成像，MRI），诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。 

可以已知方式将放射性或其它标记物掺入偶联物。例如，可生物合成肽，或是通过化学氨基酸合成法合成肽，其中使用涉及例如氟-19代替氢的合适氨基酸前体。可经肽中的半胱氨酸残基来附着标记物，诸如Tc^99m或I¹²³、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸和In¹¹¹。可以经赖氨酸残基来附着钇-90。IODOGEN法（Fraker et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.80:49-57(1978)）可用于掺入碘-123。《Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy》（Chatal,CRC Press,1989）详细记载了其它方法。 

可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和细胞毒剂的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯（诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯）、活性酯类（诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯）、醛类（诸如戊二醛）、双叠氮化合物（诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺）、双重氮衍生物（诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺）、二异硫氰酸酯（诸如甲苯2,6-二异氰酸酯）、和双活性氟化合物（诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯）的双功 能衍生物。例如，可如Vitetta et al.,Science238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见例如WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫化物接头（Chari et al.,Cancer Research52:127-131(1992);美国专利5,208,020）。 

本发明的化合物明确涵盖但不限于用下列交联剂制备的ADC：商品化（如购自Pierce Biotechnology Inc.,Rockford,IL,U.S.A.）的BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC和sulfo-SMPB、和SVSB（琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯）。见2003-2004年度应用手册和产品目录(Applications Handbook and Catalog)第467-498页。 

v.偶联的抗体的制备 

在本发明的偶联的抗体中，将抗体任选经接头与一个或多个例如药物模块等模块偶联，例如每个抗体偶联约1个至约20个模块。可采用本领域技术人员知道的有机化学反应、条件和试剂通过数种路径来制备通偶联的抗体，包括：(1)抗体的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应，随后与感兴趣模块反应；和(2)模块的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应，随后与抗体的亲核基团反应。本文中描述了用于制备偶联的抗体的别的方法。 

接头试剂可以由一种或多种接头构件构成。例示性的接头构件包括6-马来酰亚胺己酰基("MC")、马来酰亚胺丙酰基("MP")、缬氨酸-瓜氨酸("val-cit")、丙氨酸-苯丙氨酸("ala-phe")、对氨基苄氧羰基("PAB")、4-(2-吡啶基硫代)戊酸N-琥珀酰亚氨基酯("SPP")、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1羧酸N-琥珀酰亚氨基酯("SMCC')、和(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸N-琥珀酰亚氨基酯("SIAB")。本领域知道别的接头构件，本文也描述了一些。还可参见“Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands”,美国申请公开文本No.2005/0238649，在此通过述及完整收录其公开内容。 

在有些实施方案中，接头可包含氨基酸残基。例示性的氨基酸接头构件包括二肽、三肽、四肽或五肽。例示性的二肽包括：缬氨酸-瓜氨酸（vc或 val-cit）、丙氨酸-苯丙氨酸（af或ala-phe）。例示性三肽包括：甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸（gly-val-cit）和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸（gly-gly-gly）。构成氨基酸接头构件的氨基酸残基包括那些天然存在的氨基酸，以及次要的氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物，诸如瓜氨酸。氨基酸接头构件可以在它们的特定酶（例如肿瘤相关蛋白酶，组织蛋白酶B、C和D，或纤溶酶蛋白酶）的酶促切割的选择性方面进行设计和优化。 

抗体的亲核基团包括但不限于：(i)N末端氨基；(ii)侧链氨基，如赖氨酸；(iii)侧链巯基，如半胱氨酸；和(iv)糖基化抗体中糖的羟基或氨基。氨基、巯基、和羟基是亲核的，能够与接头模块上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烷基和苯甲基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基和马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫键，即半胱氨酸桥。可通过还原剂诸如DTT（二硫苏糖醇）处理使抗体具有与接头试剂偶联的反应活性。每个半胱氨酸桥理论上将形成两个反应性硫醇亲核体。可经由赖氨酸与2-亚氨基硫烷（Traut氏试剂）的反应，导致胺转变为硫醇，从而将额外亲核基团引入抗体。可以通过导入一个、两个、三个、四个、或更多个半胱氨酸残基（例如制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的突变型抗体）而将反应性硫醇基导入抗体（或其片段）。 

还可通过修饰抗体来生成本发明的偶联的抗体，即引入可与接头试剂或药物或其它模块上的亲核取代基反应的亲电子模块。可用例如高碘酸盐氧化剂氧化糖基化抗体的糖，从而形成可与接头试剂或药物或其它模块的胺基团反应的醛或酮基团。所得亚胺Schiff碱基可形成稳定的键，或者可用例如硼氢化物试剂还原而形成稳定的胺连接。在一个实施方案中，糖基化抗体的碳水化合物模块与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可在蛋白质中生成羰（醛和酮）基团，它可与药物或其它模块上的适宜基团反应（Hermanson，Bioconjugate Techniques）。在另一个实施方案中，包含N末端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋白质可与偏高碘酸钠反应，导致在第一个氨基酸处生成醛（Geoghegan and Stroh,Bioconjugate Chem.3:138-146(1992);美国专利No.5,362,852）。此类醛可与药物模块或接头亲核体反应。 

同样，诸如药物模块等模块上的亲核基团包括但不限于：胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯、和芳基酰肼基团，它们能够与 接头模块上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烷基和苯甲基卤化物，诸如卤代乙酰胺；和(iii)醛类、酮类、羧基、和马来酰亚胺基团。 

或者，可通过例如重组技术或肽合成来制备包含抗体和细胞毒剂的融合蛋白。DNA的长度可包含各自编码偶联物两个模块的区域，或是彼此毗邻或是由编码接头肽的区域分开，该接头肽不破坏偶联物的期望特性。 

在又一个实施方案中，可将抗体与“受体”（诸如链霉亲和素）偶联从而用于肿瘤预先靶向，其中对个体施用抗体-受体偶联物，接着使用清除剂由循环中清除未结合的偶联物，然后施用与细胞毒剂（如放射性核素）偶联的“配体”（如亲合素）。 

VIII.效用

本文所述Fc变体多肽在生成异多聚体蛋白质中找到产业实用性。 

本文所述异多聚体蛋白质可用于例如体外、离体和体内治疗方法。本发明提供了基于使用一种或多种这些分子的多种方法。在某些病理状况中，必须和/或期望利用异多聚体蛋白质，例如多特异性抗体。本发明提供了这些异多聚体蛋白质，其可用于多种目的，例如作为治疗剂、预防剂和诊断剂。例如，本发明提供了治疗疾病的方法，所述方法包括对需要治疗的受试者施用本发明的异多聚体蛋白质，由此疾病得到治疗。本文所述发明的任何异多聚体蛋白质可用于本文所述治疗（或预防或诊断）方法。 

例如，当异多聚体蛋白质是多价的，一项有价值的好处在于它们对它们的抗原的亲合力得到增强。除了具有结合单元（即Fab）对抗原的基础上的内在高亲和力，由于它们针对靶物的二价结合，正常IgG抗体还利用亲合效应来提高它们与抗原的联合。 

针对同一抗原分子上两个分开表位的异多聚体蛋白质不仅可提供结合亲合力得到增强（由于二价结合）的好处，而且还可获得与任一亲本抗体无关的新特性。如此，本发明的异多聚体蛋白质可用于例如阻断受体-配体相互作用。 

本文所述异多聚体蛋白质还可用于用一种分子同时阻断两种靶物的信号传导途径的应用。 

IX.治疗用途

本文所述异多聚体蛋白质诸如抗体和抗体片段（例如依照本文所述方法 生成的抗体和/或其片段）可用于治疗性应用。例如，此类异多聚体蛋白质可用于治疗肿瘤，包括癌前、非转移性、转移性、和癌性肿瘤（例如早期癌症），用于治疗变应性或炎性病症，或用于治疗自身免疫性疾病，或用于治疗有风险发生癌症（例如乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、肾细胞癌、神经胶质瘤、或卵巢癌）、变应性或炎性病症、或自身免疫性疾病的受试者。 

术语癌症涵盖增殖性病症的集合，包括但不限于癌前生长、良性肿瘤、和恶性肿瘤。良性肿瘤仍然局限于起源部位且没有能力渗透、侵入、或转移至远端部位。恶性肿瘤会侵入并损害它们周围的其它组织。它们还能获得脱离起源部位并传播至身体其它部分（转移）（通常经由血流或在淋巴结所处位置经由淋巴系统）的能力。原发性肿瘤以发生它们的组织类型来分类；转移性肿瘤以衍生癌细胞的组织类型来分类。随着时间消逝，恶性肿瘤的细胞变得越来越异常，而且表现出更不像正常细胞。癌细胞外观的这种变化称作肿瘤等级(tumor grade)，而且将癌细胞描述为完全分化的(well-differentiated)、中度分化的(moderately-differentiated)、不良分化的(poorly-differentiated)、或未分化的(undifferentiated)。完全分化的细胞相当正常，表现为和类似它们起源的正常细胞。未分化的细胞指已经变得如此异常以致于不再可能确定其起源的细胞。 

肿瘤可以是实体瘤或者是非实体瘤或软组织肿瘤。软组织肿瘤的例子包括白血病（例如慢性髓细胞性白血病(chronic myelogenous leukemia)、急性髓细胞性白血病(acute myelogenous leukemia)、成人急性成淋巴细胞性白血病(adult acute lymphoblastic leukemia)、急性髓细胞性白血病(acute myelogenous leukemia)、成熟B细胞急性成淋巴细胞性白血病(mature B-cell acute lymphoblastic leukemia)、慢性淋巴细胞性白血病(chronic lymphocytic leukemia)、多形核细胞性白血病(polymphocytic leukemia)、或毛细胞性白血病(hairy cell leukemia)）或淋巴瘤（例如非何杰金氏淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、或何杰金氏病(Hodgkin’s disease)）。实体瘤包括血液、骨髓、或淋巴系统以外的身体组织的任何癌症。实体瘤可进一步分成上皮细胞起源的那些和非上皮细胞起源的那些。上皮细胞实体瘤的例子包括胃肠道、结肠、乳腺、前列腺、肺、肾、肝、胰腺、卵巢、头和颈、口腔、胃、十二指肠、小肠、大肠、肛门、胆囊、唇(labium)、鼻咽、皮肤、子宫、男性生殖器官、泌尿器官、膀胱、和皮肤的肿瘤。非上皮起源的实体瘤包括肉瘤、脑瘤、和骨瘤。 

上皮癌症一般自良性肿瘤进展至侵入前阶段（例如原位癌），至恶性癌症，其渗透基底膜并侵入上皮下基质。 

多特异性蛋白质复合物也可用于这些治疗性应用，而且结合HER2的抗体特别可用于治疗乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、肾细胞癌、神经胶质瘤、或卵巢癌。 

作为接受本发明组合物的候选者的其他受试者具有或者有风险发生纤维血管组织异常增殖、酒渣鼻（红斑痤疮）、获得性免疫缺陷综合征、动脉阻塞、特应性角膜炎、细菌性溃疡、贝切特氏病(Bechets disease)、血液传播的肿瘤(blood borne tumor)、颈动脉阻塞性疾病、脉络膜新血管形成、慢性炎症、慢性视网膜剥离、慢性葡萄膜炎、慢性玻璃体炎、接触镜佩戴过度、角膜移植片排斥、角膜新血管形成、角膜移植片新血管形成、克罗恩氏病(Crohn's disease)、伊尔斯病(Eales disease)、流行性角膜结膜炎、真菌性溃疡、单纯疱疹感染、带状疱疹感染、高粘滞综合征、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、白血病、脂质变性、莱姆氏病(Lyme's disease)、边缘角质层分离(marginal keratolysis)、莫伦溃疡(Mooren ulcer)、除麻风以外的分枝杆菌感染、近视、眼新血管疾病、视窝(optic pits)、奥-韦二氏综合征(Osler-Weber syndrome)（奥斯勒-韦伯-朗迪(Osler-Weber-Rendu)病）、骨关节炎、佩吉特氏病(Pagets disease)、扁平部睫状体炎(pars planitis)、类天疱疮、phylectenulosis、多动脉炎、激光后并发症(post-laser complication)、原生动物感染、弹性假黄色瘤、翼状胬肉(pterygium)、干燥性角膜炎、放射状角膜切开术、视网膜新血管形成、早产儿视网膜病、晶状体后纤维组织增生、类肉瘤/结节病(sarcoid)、巩膜炎、镰状细胞贫血、斯耶格伦氏综合征(Sogrens syndrome)、实体瘤、斯塔加特病(Stargarts disease)、约-斯病(Steven's Johnson disease)、上缘角膜炎(superior limbic keratitis)、梅毒、全身性狼疮、特里昂氏边缘变性(Terrien's marginal degeneration)、弓形虫病、尤因肉瘤(Ewing sarcoma)的肿瘤、成神经细胞瘤的肿瘤、骨肉瘤的肿瘤、视网膜母细胞瘤的肿瘤、横纹肌肉瘤的肿瘤、溃疡性结肠炎、静脉阻塞、维生素A缺乏、韦格纳结节病(Wegener’s sarcoidosis)、与糖尿病有关的不良血管发生、寄生虫病、异常伤口愈合、外伤、损伤或手术后肥大(例如急性肺损伤/ARDS)、毛发生长抑制、排卵和黄体形成抑制、子宫中胚胎发育抑制和植入抑制。 

可以使用依照本文所述方法生成的抗体来治疗的变应性或炎性病症或 自身免疫性疾病或病症的例子包括但不限于关节炎(类风湿性关节炎诸如急性关节炎、慢性类风湿性关节炎、痛风性关节炎、急性痛风性关节炎、慢性炎性关节炎、退行性关节炎、感染性关节炎、莱姆(Lyme)关节炎、增生性关节炎、银屑病性关节炎、脊椎关节炎和幼发型类风湿性关节炎，骨关节炎，慢性进行性关节炎(arthritis chronica progrediente)，变形性关节炎，慢性原发性多关节炎，反应性关节炎，和强直性脊柱炎)，炎性过度增殖性皮肤病，银屑病诸如斑块状银屑病、滴状银屑病、脓疱性银屑病和指甲银屑病，皮炎包括接触性皮炎、慢性接触性皮炎、变应性皮炎、变应性接触性皮炎、疱疹样皮炎和特应性皮炎，x连锁的高IgM综合征，荨麻疹诸如慢性变应性荨麻疹和慢性特发性荨麻疹包括慢性自身免疫性荨麻疹，多肌炎/皮肌炎，青少年型皮肌炎，中毒性表皮坏死松解症，硬皮病(包括系统性硬皮病)，硬化诸如系统性硬化、多发性硬化(MS)诸如脊髓-眼(spino-optical)MS、原发性进行性MS(PPMS)和复发性消退性(relapsing remitting)MS(RRMS)、进行性系统性硬化、动脉粥样硬化、动脉硬化、播散性硬化(sclerosis disseminata)和共济失调性(ataxic)硬化，炎性肠病(IBD)(例如克罗恩氏(Crohn)病，自身免疫介导的胃肠病，结肠炎诸如溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,colitis ulcerosa)、微观(microscopic)结肠炎、胶原性结肠炎、息肉状结肠炎、坏死性小肠结肠炎和透壁性结肠炎，和自身免疫性炎性肠病)，坏疽性脓皮症，结节性红斑，原发性硬化性胆管炎，巩膜外层炎)，呼吸窘迫综合征包括成人型或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，脑膜炎，整个或部分葡萄膜的炎症，虹膜炎，脉络膜炎，自身免疫性血液学病症，类风湿性脊椎炎，突发性听觉丧失，IgE介导的疾病诸如过敏反应和变应性和特应性鼻炎，脑炎诸如拉斯默森氏(Rasmussen)脑炎和边缘系和/或脑干脑炎，葡萄膜炎诸如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽肿性葡萄膜炎、非肉芽肿性葡萄膜炎、晶状体抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎或自身免疫性葡萄膜炎，具有和没有肾病综合征的肾小球肾炎(GN)诸如慢性或急性肾小球肾炎诸如原发性GN、免疫介导的GN、膜性GN(膜性肾病)、特发性膜性GN或特发性膜性肾病、膜性或膜性增殖性GN(MPGN)包括I型和II型、和急进性GN，变应性疾患，变应性反应，湿疹包括变应性或特应性湿疹，哮喘诸如支气管哮喘(asthma bronchiale,bronchial asthma)和自身免疫性哮喘，涉及T细胞浸润和慢性炎性应答的疾患，慢性肺部炎性疾病，自身免疫性心肌炎，白细胞粘附缺陷，系统性红斑狼疮 (SLE)(systemic lupus erythematosus,systemic lupus erythematodes)诸如皮肤SLE、亚急性皮肤红斑狼疮、新生儿狼疮综合征(NLE)、播散性红斑狼疮、狼疮（包括狼疮肾炎、狼疮脑炎、儿科狼疮、非肾狼疮、肾外狼疮、盘状狼疮、狼疮脱发），幼发型（I型）糖尿病包括儿科胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、成人期发作的糖尿病（II型糖尿病）、自身免疫性糖尿病、特发性尿崩症，与细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏感性有关的免疫应答，结核病，结节病，肉芽肿病包括淋巴瘤样肉芽肿病、韦格纳氏(Wegener)肉芽肿病，粒细胞缺乏，血管炎病包括血管炎（包括大血管血管炎（包括风湿性多肌痛和巨细胞（高安氏(Takayasu)）动脉炎），中血管血管炎（包括川崎氏(Kawasaki)病和结节性多动脉炎），微观(microscopic)多动脉炎，CNS血管炎，坏死性、皮肤性或超敏感性血管炎，系统性坏死性血管炎，和ANCA相关血管炎诸如丘-施二氏(Churg-Strauss)血管炎或综合征(CSS)），颞动脉炎，再生障碍性贫血，自身免疫性再生障碍性贫血，库姆斯(Coombs)阳性贫血，戴-布二氏(Diamond Blackfan)贫血，溶血性贫血或免疫性溶血性贫血包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)，恶性贫血(pernicious anemia,anemia perniciosa)，阿狄森氏(Addison)病，单纯红细胞性贫血或再生障碍(PRCA)，因子VIII缺乏，血友病A，自身免疫性嗜中性粒细胞减少症，全血细胞减少症，白细胞减少症，涉及白细胞渗出的疾病，CNS炎性病症，多器官损伤综合征诸如那些败血症、外伤或出血继发的，抗原-抗体复合物介导的疾病，抗肾小球基底膜病，抗磷脂抗体综合征，变应性神经炎，贝切特氏(Bechet或Behcet)病，卡斯尔曼氏(Castleman)综合征，古德帕斯丘氏(Goodpasture)综合征，雷诺氏(Reynaud)综合征，斯耶格伦氏(Sjogren)综合征，史-约二氏(Stevens-Johnson)综合征，类天疱疮诸如大疱性类天疱疮和皮肤类天疱疮，天疱疮（包括寻常型天疱疮、落叶型天疱疮、粘膜类天疱疮型天疱疮和红斑性天疱疮），自身免疫性多内分泌病，莱特氏(Reiter)病或综合征，免疫复合物肾炎，抗体介导的肾炎，视神经脊髓炎，多神经病，慢性神经病诸如IgM多神经病或IgM介导的神经病，血小板减少症（例如心肌梗死患者发生的）包括血栓性血小板减少性紫癜(TTP)和自身免疫或免疫介导的血小板减少症诸如特发性血小板减少性紫癜(ITP)包括慢性或急性ITP，睾丸和卵巢的自身免疫病包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎，原发性甲状腺功能减退症，甲状旁腺功能减退，自身免疫性内分泌病包括甲状腺炎诸如自身免疫性甲状腺炎、桥本氏(Hashimoto)病、慢性甲 状腺炎（桥本氏(Hashimoto)甲状腺炎）或亚急性甲状腺炎，自身免疫性甲状腺病，特发性甲状腺功能减退症，格雷夫斯氏(Graves)病，多腺性综合征诸如自身免疫性多腺体综合征（或多腺性内分泌病综合征），瘤外综合征包括神经学瘤外综合征诸如兰伯特-伊顿(Lambert-Eaton)肌无力综合征或伊顿-兰伯特(Lambert-Eaton)综合征，僵体或僵人综合征，脑脊髓炎诸如变应性脑脊髓炎(allergic encephalomyelitis,encephalomyelitis allergica)和实验性变应性脑脊髓炎(EAE)，重症肌无力诸如胸腺瘤相关重症肌无力，小脑变性，神经性肌强直，视性眼阵挛或视性眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)，和感觉神经病，多灶性运动神经病，席汉氏(Sheehan)综合征，自身免疫性肝炎、慢性肝炎、类狼疮肝炎、巨细胞性肝炎、慢性活动性肝炎或自身免疫性慢性活动性肝炎，淋巴样间质性肺炎，梗阻性细支气管炎（非移植）对NSIP，格-巴二氏(Guillain-Barré)综合征，贝格尔氏(Berger)病（IgA肾病），特发性IgA肾病，线性IgA皮肤病，原发性胆汁性肝硬化，肺硬变，自身免疫性肠病综合征，乳糜泻，腹部疾病，口炎性腹泻（麸质肠病），顽固性口炎性腹泻，特发性口炎性腹泻，冷球蛋白血症、肌萎缩侧索硬化(ALS)（卢格里克氏(Lou Gehrig)病），冠状动脉病，自身免疫性耳病诸如自身免疫性内耳病(AIED)，自身免疫性听觉丧失，视性眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)，多软骨炎诸如顽固性或复发性多软骨炎，肺泡蛋白沉着症，淀粉样变，巩膜炎，非癌性淋巴细胞增多，原发性淋巴细胞增多包括单克隆B细胞淋巴细胞增多（例如良性单克隆丙种球蛋白病和性质未确定的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)），周围神经病，瘤外综合征，通道病诸如癫痫、偏头痛、心率失常、肌肉病症、失聪、失明、周期性瘫痪和CNS的通道病，孤独症，炎性肌病，局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)，内分泌性眼病，葡萄膜视网膜炎，脉络膜视网膜炎，自身免疫性肝脏病学病症，纤维肌痛，多发性内分泌衰竭，施密特氏(Schmidt)综合征，肾上腺炎，胃萎缩，早老性痴呆，脱髓鞘病诸如自身免疫性脱髓鞘病，糖尿病肾病，德雷斯勒氏(Dressler)综合征，斑秃，CREST综合征（钙质沉着症、雷诺氏(Raynaud)现象、食道运动功能障碍、指端硬化和毛细管扩张），男性和女性自身免疫性不孕不育，混合性结缔组织病，恰加斯氏(Chagas)病，风湿热，习惯性流产，农民肺，多形红斑，心脏切开术后综合征，柯兴氏(Cushing)综合征，养鸟者肺，变应性肉芽肿性血管炎，良性淋巴细胞性血管炎，阿尔波特氏(Alport)综合征，肺泡炎诸如变应性肺泡炎和纤维化肺泡炎，间质性肺 病，输血反应，麻风，疟疾，利什曼病，锥虫病(kypanosomiasis)，血吸虫病，蛔虫病，曲霉病，Sampter氏综合征，卡普兰氏(Caplan)综合征，登革，心内膜炎，心内膜心肌纤维化，弥漫性肺间质纤维化，间质性肺纤维化，特发性肺纤维化，囊性纤维化，眼内炎，持久隆起性红斑(erythema elevatum et diutinum)，胎儿成红细胞增多症，嗜曙红细胞性筋膜炎(faciitis)、舒尔曼氏(Shulman)综合征，费尔提氏(Felty)综合征，flariasis，睫状体炎诸如慢性睫状体炎、异时性睫状体炎、虹膜睫状体炎或Fuch氏睫状体炎，亨诺-许兰二氏(Henoch-Schonlein)紫癜，人免疫缺陷病毒(HIV)感染，艾柯病毒感染，心肌病，阿尔茨海默氏(Alzheimer)病，细小病毒感染，风疹病毒感染，种痘后综合征，先天性风疹感染，爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒感染、腮腺炎，埃文斯(Evans)综合征，自身免疫性性腺衰竭，西登哈姆氏(Sydenham)舞蹈病，链球菌后肾炎，闭塞性血栓血管炎(thromboangitis ubiterans)，甲状腺毒症，脊髓痨，脉络膜炎，巨细胞性多肌痛，内分泌性眼病，慢性超敏感性肺炎，干燥性角膜结膜炎，流行性角膜结膜炎，特发性肾炎综合征，微小病变肾病，良性家族性和缺血-再灌注损伤，视网膜自身免疫，关节炎症，支气管炎，慢性阻塞性气道疾病，硅沉着病，口疮，口疮性口炎，动脉硬化性病症，无精子发生(aspermiogenese)，自身免疫性溶血，伯克氏(Boeck)病，冷球蛋白血症，杜普伊特伦氏(Dupuytren)挛缩，晶体过敏性眼内炎(endophthalmia phacoanaphylactica)，变应性小肠炎(enteritis allergica)，麻风节结性红斑，特发性面瘫，慢性疲乏综合征，风湿热(febris rheumatica)，哈-里二氏(Hamman-Rich)病，感觉神经性听觉丧失，阵发性血红蛋白尿(haemoglobinuria paroxysmatica)，性腺功能减退，局限性回肠炎(ileitis区alis)，白细胞减少症，传染性单核细胞增多症，横贯性(traverse)脊髓炎，原发性特发性粘液水肿，肾病，交感性眼炎(ophthalmia symphatica)，肉芽肿性睾丸炎(orchitis granulomatosa)，胰腺炎，急性多神经根炎，坏疽性脓皮症，奎尔万氏(Quervain)甲状腺炎，获得性脾萎缩，由于抗精虫抗体的不育症，非恶性胸腺瘤，白癜风，SCID和爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒相关疾病，获得性免疫缺陷综合征(AIDS)，寄生虫病诸如利什曼虫，中毒性休克综合征，食物中毒，涉及T细胞浸润的疾患，白细胞粘附缺陷，与细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏感性有关的免疫应答，涉及白细胞渗出的疾病，多器官损伤综合征，抗原-抗体复合物介导的疾病，抗肾小球基底膜病，变应性神经炎， 自身免疫性多内分泌病，卵巢炎，原发性粘液水肿，自身免疫性萎缩性胃炎，交感性眼炎，风湿病，混合性结缔组织病，肾病综合征，胰岛炎，多内分泌衰竭，周围神经病，自身免疫性多腺性综合征I型，成人期发作的特发性甲状旁腺功能减退(AOIH)，全秃，扩张型心肌病，获得性大疱性表皮松解(epidermolisis bullosa acquisita,EBA)，血色素沉着，心肌炎，肾病综合征，原发性硬化性胆管炎，化脓性或非化脓性鼻窦炎，急性或慢性鼻窦炎，筛窦炎，额窦炎，上颌窦炎或蝶窦炎，嗜曙红细胞相关病症诸如嗜曙红细胞增多症、肺嗜曙红细胞增多性浸润、嗜曙红细胞增多-肌痛综合征、吕弗勒氏(Loffler)综合征、慢性嗜曙红细胞性肺炎、热带肺嗜曙红细胞增多、支气管肺曲霉病、曲霉肿、或含有嗜曙红细胞的肉芽肿，过敏反应，血清阴性脊椎关节炎病，多内分泌自身免疫病，硬化性胆管炎，巩膜、巩膜外层、慢性粘膜皮肤假丝酵母病，布鲁顿氏(Bruton)综合征，婴儿期一过性低丙种球蛋白血症，威斯科特-奥尔德里齐(Wiskott-Aldrich)综合征，共济失调性毛细管扩张，与以下各项有关的自身免疫性病症：胶原病、风湿病、神经病学疾病、缺血再灌注紊乱、血压应答降低(reduction in blood pressure response)、血管功能障碍、毛细管扩张(antgiectasis)、组织损伤、心血管缺血、痛觉过敏、脑缺血和伴随血管化的疾病，变应性超敏感性病症，肾小球肾炎病，再灌注损伤，心肌或其它组织的再灌注损伤，具有急性炎性成分的皮肤病，急性化脓性脑膜炎或其它中枢神经系统炎性病症，眼和眼窝的炎性病症，粒细胞输血相关综合征，细胞因子诱发的中毒，急性重度炎症，慢性顽固性炎症，肾盂炎，肺硬变，糖尿病性视网膜病，糖尿病性大动脉病症，动脉内增生，消化性溃疡，心瓣炎，和子宫内膜异位症。 

除了治疗性用途，本发明的抗体还可用于其它目的，包括诊断方法，诸如针对本文所述疾病和状况的诊断方法。 

X.剂量、配制剂、和持续时间

会以与优良医学实践一致的方式配制、剂量给药和施用本发明的蛋白质。在此内容中考虑的因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体哺乳动物、受试者个体的临床状况、病症的起因、投递药剂的部位、施药的方法、施药的日程安排、和医学从业人员知道的其它因素。要施用的蛋白质的“治疗有效量”会由此类考虑事项来决定，而且是预防、改善、或治疗特定病症（例如癌症、变应性或炎性病症、或自身免疫性病症）所必需的最小量。该蛋白 质不是必须的但任选可以与一种或多种当前用于预防或治疗该病症的药剂一起配制。此类其它药剂的有效量取决于配制剂中存在的蛋白质的量、病症或治疗的类型、及上文讨论的其它因素。这些一般以与以前所用相同的剂量和施用路径来使用，或者以以前所采用剂量的约1-99%施用。一般地，改善或治疗癌症涉及减轻一种或多种与癌症有关的症状或医学问题。治疗有效量的药物能实现下述一项或组合：减少（至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或更多）癌细胞的数目；缩小或抑制肿瘤尺寸或肿瘤负担；抑制（即一定程度的减缓，和/或阻止）癌细胞浸润入周围器官；在腺瘤的情况中降低激素分泌；降低血管密度；抑制肿瘤转移；降低或抑制肿瘤生长；和/或一定程度的减轻一种或多种与癌症有关的症状。在一些实施方案中，该蛋白质用于预防受试者中癌症或自身免疫性病症的发生或复发。 

在一个实施方案中，本发明可用于延长怀疑或诊断有癌症或自身免疫性病症的人受试者的存活持续时间。存活持续时间定义为自第一次施用药物到死亡的时间。存活持续时间也可以通过治疗组对对照组的分层危害比(HR)来测量，它代表受试者在治疗期间的死亡风险。 

在还有另一个实施方案中，本发明的治疗显著提高用各种抗癌疗法治疗的怀疑或诊断有癌症的一组人受试者中的响应率。响应率定义为响应治疗的受治疗受试者的百分比。在一个实施方案中，与用单独的手术、放疗或化疗治疗的组相比，使用本发明的蛋白质和手术、放疗或一种或多种化疗剂的本发明组合治疗显著提高受治疗受试者组中的响应率，提高具有小于0.005的卡方p值。癌症治疗中的治疗功效的别的度量记载于美国专利申请公开文本No.20050186208。 

使用本领域已知的标准方法通过将具有期望纯度的活性成分与任选的生理学可接受载体、赋形剂或稳定剂混合来制备治疗用配制剂(Remington’s Pharmaceutical Sciences(第20版),A.Gennaro编,2000,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,PA)。可接受的载体包括盐水，或缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量（少于约10个残基）多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯 合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘露醇或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或PEG。 

任选但优选的是，配制剂含有药学可接受盐，优选氯化钠，且优选大约为生理浓度。任选的是，本发明的配制剂可含有药学可接受防腐剂。在一些实施方案中，防腐剂的浓度范围为0.1-2.0%，典型的是v/v。合适的防腐剂包括药学领域已知的那些。苯甲醇、酚、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、和对羟基苯甲酸丙酯是优选的防腐剂。任选的是，本发明的配制剂可包括药学可接受表面活性剂，其浓度为0.005-0.02%。 

本文中的配制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性化合物，优选活性互补且彼此没有不利影响的那些。合适的是，此类分子以对于预定目的有效的量组合。 

活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中（例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊）、在胶状药物传递系统中（例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊）、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于Remington’s Pharmaceutical Sciences,见上文。 

可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有异多聚体蛋白质的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质以定型产品的形式存在，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶（例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇)）、聚交酯（美国专利No.3,773,919）、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOT^TM（由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体）及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够持续释放分子100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当胶囊化异多聚体蛋白质在体内长时间保持时，它们可能由于暴露于37℃的潮湿环境而变性或聚集，导致生物学活性损失和免疫原性可能改变。可根据相关机制来设计稳定化理性策略。例如，如果发现聚集机制是经由硫醇-二硫化物互换而形成分子间S-S键，那么可通过修饰巯基残基、自酸性溶液冻干、控制湿度、采用适宜添加剂、和开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定。 

依照已知方法给人类受试者施用本文所述蛋白质（例如依照本文所述方 法生成的异多聚体蛋白质诸如多特异性抗体），诸如静脉内施用（像推注或通过一段时间里的连续输注），通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、表面、或吸入路径。如果广泛的副作用或毒性与受该蛋白质识别的靶物分子的拮抗作用相关的话，局部施用可能是特别期望的。回体(ex vivo)策略也可用于治疗性应用。回体策略涉及用编码本发明蛋白质的多核苷酸转染或转导自受试者获得的细胞。然后将经过转染或转导的细胞返回受试者。细胞可以是极其多种类型之任一，包括但不限于造血细胞（例如骨髓细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞、T细胞、或B细胞）、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、或肌肉细胞。 

在一个例子中，在病症或肿瘤位置允许时，局部施用蛋白质复合物（例如依照本文所述方法生成的异多聚体蛋白质诸如多特异性抗体），例如通过直接注射，而且可以周期性重复注射。也可以在手术切除肿瘤后系统地/全身地将蛋白质复合物投递至受试者或直接投递至肿瘤细胞，例如肿瘤或肿瘤床，用以预防或降低局部复发或转移。 

XI.制品

本发明的另一个实施方案是制品，其含有一种或多种本文所述蛋白质复合物，和材料可用于治疗或诊断病症（例如自身免疫性疾病或癌症）。制品包括容器和容器上或与容器相关的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、管形瓶、注射器、等。容器可以自多种材料（诸如玻璃或塑料）形成。容器装有有效治疗状况的组合物且可具有无菌存取口（例如容器可以是具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或管形瓶）。组合物中的至少一种活性剂是本发明的异多聚体蛋白质（例如抗体或抗体片段）。标签或包装插页指示组合物用于治疗特定状况。标签或包装插页会进一步包含将异多聚体蛋白质组合物施用于受试者的用法说明书。还涵盖包含本文所述组合疗法的制品和试剂盒。 

包装插页指治疗性产品的商业包装中通常包括的用法说明书，其含有关于有关此类治疗性产品的使用的适应证、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。在某些实施方案中，包装插页指示组合物用于治疗乳腺癌，结肠直肠癌、肺癌、肾细胞癌、神经胶质瘤、或卵巢癌。 

另外，制品可进一步包括第二容器，其包含药学可接受缓冲剂，诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格(Ringer)氏溶液和右旋糖溶液。 它可进一步包括从商业和用户立场考虑的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针、和注射器。 

还提供了可用于各种目的的试剂盒，例如用于自细胞纯化或免疫沉淀抗原（例如HER2或EGFR）。对于分离和纯化抗原（例如HER2或EGFR），试剂盒可装有偶联至珠（例如sepharose珠）的异多聚体蛋白质（例如EGFR/HER2抗体）。可以提供装有用于在体外检测和量化抗原（例如在ELISA或Western印迹中）的异多聚体蛋白质的试剂盒。如同制品，试剂盒包括容器和容器上或与容器相关的标签或包装插页。容器装有包含至少一种本发明的异多聚体蛋白质（例如多特异性抗体或抗体片段）的组合物。可以包括装有例如稀释剂和缓冲剂或对照抗体的别的容器。标签或包装插页可提供关于组合物的描述以及关于有意体外或诊断用途的用法说明书。 

认为前述书面描述足以使得本领域技术人员能够实施本发明。下面的实施例仅出于例示目的提供，而且并非意图以任何方式限制本发明的范围。确实，除了本文中显示和描述的那些，本发明的各种修饰根据前面的描述对于本领域技术人员会变得明显且落在所附权利要求的范围内。 

在下面的实验公开中，应用下面的缩写：eq（当量）；M（摩尔/升）；μM（微摩尔/升）；N（正常）；mol（摩尔）；mmol（毫摩尔）；μmol（微摩尔）；nmol（纳摩尔）；g（克）；mg（毫克）；kg（千克）；μg（微克）；L（升）；ml（毫升）；μl（微升）；cm（厘米）；mm（毫米）；μm（微米）；nm（纳米）；℃（摄氏度）；h（小时）；min（分）；sec（秒）；msec（毫秒）；ADCC（抗体依赖性细胞的细胞毒性）；BsAb（双特异性抗体）；C_L（轻链恒定域）；C_H（重链恒定域）；CMC（补体介导的细胞毒性）；Fab（抗原结合片段）；Fc（结晶片段）；Fv（可变片段（V_L+V_H））；EGFR（表皮生长因子受体）；HC（重链）；IGFR（胰岛素样生长因子受体）；LC（轻链）；scFv（单链可变片段（通过氨基酸接头栓系的V_L和V_H）；VEGF（血管内皮生长因子）；VEGFR2（血管内皮生长因子受体2）；V_H（可变重域）；V_L（可变轻域）。 

实施例

在下面的实施例中更为详细地描述本发明，它们并非意图以任何方式限制要求保护的发明范围。附图旨在作为本发明的说明书和描述的整体部分予 以考虑。通过述及将引用的所有参考文献具体收入本文以援引其中记载的所有内容。提供下面的实施例以例示而非限制要求保护的发明。 

实施例1：表达载体的构建

这个实施例例示用于转化宿主细胞的核酸构建物。 

一般地，将重和轻链DNA编码序列二者克隆入表达质粒，其含有分开的用于每种序列的启动子元件和用于选择含有表达质粒的细菌细胞的抗生素抗性。载体构建物还编码热稳定肠毒素II（STII）分泌信号（Picken et al.,1983,Infect.Immun.42:269-275及Lee et al.,1983,Infect.Immun.42:264-268），用于将抗体多肽输出入细菌细胞的周质空间。通过phoA启动子控制每条链的转录（Kikuchi et al.,1981,Nucleic Acids Res.,9:5671-5678），并通过先前所述在翻译起始区中含有沉默密码子变化（TIR）、具有实测相对翻译强度的STII信号序列变体提供翻译控制（Simmons and Yansura,1996,Nature Biotechnol.14:629-634及Simmons et al.,2002,J.Immunol Methods,263:133-147）。图2A和2B分别显示了节和穴质粒的示意图。 

虽然本发明不依赖于具体抗体结合序列且可用于任何半抗体组合，但是本文中的实施例是针对c-met、EGFR、IL-4和IL-13的异多聚体抗体。抗c-met抗体的例子见美国专利No.7,472,724和美国专利No.7,498,420。抗EGFR抗体的例子见美国临时申请61/210,562（2009年3月20日提交）、美国专利申请公开No.20080274114（2008年11月6日公布）和美国专利No.5,844,093（1998年12月1日授权）。抗IL-13抗体的例子记载于美国专利No.7,501,121（2009年3月10日授权）、美国专利No.7,615,213（2009年11月10日授权）、WO2006/085938（2006年8月17日公布）、美国专利申请公开No.20090214523（2009年8月27日公布）、和美国专利No.7,674,459（2010年3月9日授权）。抗IL-4抗体的例子记载于美国专利申请公开No.US20080241160（2008年10月2日公布）和美国专利No.6,358,509（2002年3月19日授权）。 

每种半抗体具有如美国专利No.7,642,228所述改造入重链的节（隆起）或穴（空腔）。简言之，首先生成C_H3节突变体。然后通过随机化配偶C_H3域上接近节的残基366、368和407创建C_H3穴突变体文库。在下面的实施例中，节突变为T366W，而穴具有IgG1主链中的突变T366S、L368A和Y407V。本领域技术人员能容易地确定其它免疫球蛋白同种型中的等同突变。进一步， 熟练技术人员会容易地领会，优选用于双特异性的两种半抗体是相同同种型的。可以使用不同同种型的半抗体，但是可能需要进一步突变。 

在一些情况中，每种半抗体具有在C_H2域中的残基F241和F243处引入的进一步突变。使用本领域已知技术引入点突变，将野生型苯丙氨酸变成丝氨酸或精氨酸，使得组合为F241S/F243R或F241R/F243S。 

虽然这个实施例中描述的载体用于抗c-Met或抗EGFR半抗体，但是本领域技术人员会容易地领会，可以在质粒中编码任何抗体。用于本文中使用的所有构建物的起始质粒是先前所述抗组织因子分开顺反子质粒paTF50，其具有对重链为1的相对TIR和对轻链为1的相对TIR（Simmons et al.,2002,J.Immunol Methods,263:133-147及美国专利No.6,979,556）。利用相对TIR强度的升高来提高这些半抗体的表达滴度。 

实施例2：使用分开的细胞培养物生成异多聚体蛋白质

下面的实施例显示在分开的培养物中培养表达单体成分（例如半抗体）的细胞时生成异多聚体蛋白质。在这种方法中，在分开的培养物中培养并诱导细胞以表达半抗体。在这种方法中，可以首先纯化各成分，然后组合以形成异多聚体蛋白质。 

在这种方法中，将编码第一含Fc多肽（例如半抗体（节））的核酸导入第一宿主细胞并将编码第二含Fc多肽（例如半抗体（穴））的核酸导入第二宿主细胞。虽然这个实施例例示BsAb的形成，但是本领域技术人员会容易地领会，所述方法可应用于包含铰链区的任何异多聚体蛋白质，例如亲和抗体等。 

在分开的培养物中独立生成节半抗体和穴半抗体，分开纯化半抗体，混合和氧化还原以形成完整BsAb。

通过在细菌宿主细胞（例如大肠杆菌）中使用实施例1所述构建物表达重和轻链，在分开的培养物中生成含有节或穴突变（有或无F241和F243突变）的半抗体。见图3和4A。在这种方法中，节半抗体为抗EGFR，而穴半抗体为抗c-met。将实施例1的表达质粒导入大肠杆菌宿主菌株33D3（Ridgway et al.(1999)59(11):2718）或64B4（W3110ΔfhuAΔphoA ilvG+Δprc spr43H1ΔdegPΔmanA lacI^qΔompT），并在含有羧苄青霉素的LB板上选择转化子。然后使用转化子接种含有羧苄青霉素的LB起始培养物，并在摇动中于30℃培养过夜。 将起始培养物100倍稀释入含有羧苄青霉素的磷酸盐限制培养基C.R.A.P.（Simmons et al.,2002,J.Immunol Methods,263:133-147），并在摇动中于30℃培养24小时。将培养物离心，并冷冻细胞团粒直至开始纯化抗体。融化团粒并在含有用盐酸调至pH7.5的25mM Tris-碱、125mM NaCl和5mM EDTA的提取缓冲液（TEB或Tris提取缓冲液）中重悬浮，体积对重量比为100mL TEB每5克细胞团粒，并通过使用微射流技术破碎细胞来提取，即使重悬浮混合物三次通过Microfluidics公司110F型微流化仪（Newton,MA）。然后通过以15,000Xg离心20分钟澄清细菌细胞提取物，收集上清液并过滤通过0.22微米乙酸盐滤器，之后纯化。 

通过蛋白A捕捉，接着是阳离子交换层析，分开纯化每种半抗体。以2mL/min将来自节半抗体的澄清细胞提取物加载到来自GE Healthcare（Pistcataway,NJ）的1mL HiTrap MabSelect^TMSuRe柱上。加载后，用10个柱体积（CV）的40mM柠檬酸钠pH6.0、125mM氯化钠、和5mM EDTA，接着用5个柱体积的20mM柠檬酸钠pH6.0清洗柱以便于阳离子交换柱的捕捉。用10个柱体积（CV）的0.2mM乙酸（pH2-3）洗脱亲和捕捉的半抗体，并直接在来自GE Healthcare的1mL HiTrap SP-HP强阳离子交换柱上捕捉。用10CV的含有25mM2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）pH5.8的缓冲液A清洗柱。用线性梯度0–50%缓冲液B（25mM MES pH5.8和1M氯化钠（NaCl））洗脱半抗体。两种蛋白质都在20-40%B之间洗脱，并作为节或穴半抗体，分开合并通过280nm处UV吸光度及通过收集级分的非还原性SDS-PAGE分析确定的洗脱峰。两种蛋白质一般都展现一个主洗脱峰，并在集合中包括含有氧化至彼此的重链和轻链种类的所有级分。图4B显示了通过还原性和非还原性SDS-PAGE对纯化的半抗体的分析。结果指示大多数表达的且捕捉的蛋白质大小为75kD。我们通过图4C所示ESI-TOF质谱术确认了这一点。半抗体的质量为预期质量，指示没有任何半胱氨酸（包括铰链区中的两个半胱氨酸残基）上的二硫化物加合物。为了确定铰链半胱氨酸是否被还原，展现反应性游离硫醇，将在中性pH中蛋白质与1mM N-乙基马来酰亚胺（NEM）反应1小时，之后通过质谱术来分析。蛋白质的质量无变化，指示铰链半胱氨酸被氧化至彼此，最有可能在链内二硫化物（例如环状二硫化物）中。为了使用这两种半抗体（节和穴）装配完全完整的、双特异性抗体，首先必须还原铰链区处的链内二硫化物以释放半胱氨酸游离硫醇，使得它们 随后能被氧化至另一条重链以形成150kD双特异性抗体。 

为了实现两种互补半抗体的退火、还原和再氧化以形成完整双特异性分子，开发了下面的规程。独立分离后，在该规程的合并步骤中以相等质量将经过纯化的蛋白质组合在一起（图5所示），通过添加十分之一体积的1M Tris pH8.0将合并液的pH调至8.0，并于室温用2.0mM二硫苏糖醇（DTT）还原蛋白质。还原2小时后，使用5mL Zeba脱盐旋转柱（Pierce,Rockford,IL）将合并的蛋白质缓冲交换入25mM Tris pH8.0和125mM NaCl，产生约4mL体积、1mg/mL蛋白质浓度。然后，通过将混合物加热至37℃达3小时，接着冷却至室温（约24℃），使蛋白质退火。使用10kD MW截留旋转浓缩器将经过退火的抗体浓缩至0.5mL体积，蛋白质浓度约10mg/mL，并由空气氧化，同时用10kD膜（SpectrumLabs,Rancho Dominguez,CA）透析入50mM Tris pH8.0和150mM NaCl。于室温氧化过夜后，在含有25mM MES pH6.0和300mM NaCl的缓冲液中在S-200凝胶过滤柱（22mL S200Tricorn，来自GE Healthcare）上运行经过氧化的材料。合并完整抗体，并在水中稀释10倍。 

然后使用羧甲基（CM）树脂（1mL HiTrap CM-FF，GE Healthcare）通过弱阳离子交换层析纯化BsAb蛋白质，其中使用从4.5到9.2的pH梯度洗脱。缓冲液A和B组合物由20mM柠檬酸钠、30mM MES、20mM HEPES、20mM咪唑、20mM Tris、20mM CAPS、和25mM NaCl组成，其中A缓冲液用HCl调至pH4.2而B缓冲液使用NaOH调至pH9.2（或10.4）。通过质谱术分析CM层析后获得的经过纯化的材料以测定精确的分子组成（图4D）。质谱分析指示唯一可检测到的完整抗体产物具有146,051.89的MW，其几乎等同地匹配理论MW为145,051.75的异二聚体节-穴种类抗EGFR/抗c-met。用约2mg节和2mg穴开始，这种规程的产量为约0.5-1mg。 

对含有F241和F243突变的半抗体实施相同的规程。 

实施例3：Fc的结晶

装配过程期间，某些损失与错误形成的二硫键相关，如实施例2中的低产量证明的。这个实施例是通过X射线晶体学观察节和穴Fc的不同结构形式的一项分析。对各种只有上文所述节和穴突变的异多聚体蛋白质获得Fc晶体结构。 

用于晶体学的节和穴Fc：

使用标准抗体纯化方法自大肠杆菌纯化由一条IgGl重链（穴）、一条轻链、和一条截短的重链Fc（节）组成的单臂节-入-穴抗体。参见例如WO2005/063816。于37℃将经过纯化的单臂抗体用赖氨酸内肽酶C以1/1000wt/wt比例消化15分钟。用5μM蛋白酶抑制剂N-α-甲苯磺酰基-L-赖氨酰-氯甲酮（TLCK）终止消化物。使用不结合游离Fc的卡帕选择树脂自节-穴Fc清除完整单臂抗体和FAb。然后在S75柱（GE Biosciences）上纯化节/穴Fc，之后结晶。所得节和穴Fc片段具有下面的序列（提供基于全长IgG1重链的起始残基编号）： 

链1（穴）（SEQ ID NO:1） 

223THTCPPCPAP  ELLGGPSVFL  FPPKPKDTLM  ISRTPEVTCVVVDVSHEDPE  VKFNWYVDGV  EVHNAKTKPR  EEQYNSTYRVVSVLTVLHQD  WLNGKEYKCK  VSNKALPAPI  EKTISKAKGQPREPQVYTLP  PSREEMTKNQ  VSLSCAVKGF  YPSDIAVEWESNGQPENNYK  TTPPVLDSDG  SFFLVSKLTV  DKSRWQQGNVFSCSVMHEAL  HNHYTQKSLS  LSPGK 

链2（节）（SEQ ID NO:2） 

221DKTHTCPPCP  APELLGGPSV  FLFPPKPKDT  LMISRTPEVTCVVVDVSHED  PEVKFNWYVD  GVEVHNAKTK  PREEQYNSTYRVVSVLTVLH  QDWLNGKEYK  CKVSNKALPA  PIEKTISKAKGQPREPQVYT  LPPSREEMTK  NQVSLWCLVK  GFYPSDIAVEWESNGQPENN  YKTTPPVLDS  DGSFFLYSKL  TVDKSRWQQGNVFSCSVMHE  ALHNHYTQKS  LSLSPGK 

结晶条件要求添加来自蛋白A的miniZ域（下文Starovasnik参考文献）来稳定蛋白质。将蛋白质缓冲交换入0.15M NaC1、50mM Tris pH8.0，并浓缩至15mg/mL。添加等摩尔浓度Mini-Z肽，并温育过夜。于18℃通过悬滴法使蛋白质结晶（参见例如Experimental and theoretical analysis of the rate of solvent equilibration in the hanging drop method of protein crystal growth.Journal of Crystal Growth,volume90,Issues1-3,2July1988,pages117-129），其中缓冲液储液含有20%w/v PEG2000-MME、0.1M MES pH6.5、10%v/v异丙醇。1周后形成蛋白质片。于ALS束线5.0.2收集数据。 

如先前所述制备蛋白A，B-域的最小化形式（“miniZ”）（Starovasnik M.A., Braisted A.C.,Wells J.A.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.94,pp.10080-10085）。 

在mini-Z域肽存在下使节-入-穴Fc异二聚体结晶（如上所述）。见图6。将mini-Z肽结合至CH2-CH3界面，并推测帮助稳定化Fc的CH2区。该结构与两个CH3域接触，而且与无糖基化野生型IgG1Fc没有显著差异。 

用于晶体学的节-节Fc：

如上所述通过大肠杆菌中的表达来生成节-节蛋白质二聚体，只是Fc变体作为单一Fc链表达，其中通过突变成丝氨酸消除铰链半胱氨酸以防止共价二聚化（参见例如WO2006028936），而且省略阳离子交换步骤。节-节Fc作为非共价二聚体存在，并通过蛋白A亲和层析和凝胶过滤（使用S200柱（GE Biosciences））的组合来分离。将经过纯化的蛋白质用于晶体筛选。对于晶体生长筛选，将蛋白质缓冲交换入PBS并浓缩至10mg/mL。蛋白质于18℃通过悬滴法在20%w/v PEG2000-单甲基醚（MME）、0.2M硫酸铵、0.1M二甲胂酸钠pH6.5中结晶，2μl蛋白质在2μl储液中。5天后出现厚片，并于ALS束线5.0.1收集数据，使用防冻剂25%w/v PEG2000-MME。 

节序列的序列为（SEQ ID NO:3）： 

221DKTHTSPPSP  APELLGGPSV  FLFPPKPKDT  LMISRTPEVTCVVVDVSHED  PEVKFNWYVD  GVEVHNAKTK  PREEQYNSTYRVVSVLTVLH  QDWLNGKEYK  CKVSNKALPA  PIEKTISKAKGQPREPQVYT  LPPSREEMTK  NQVSLWCLVK  GFYPSDIAVEWESNGQPENN  YKTTPPVLDS  DGSFFLYSKL  TVDKSRWQQGNVFSCSVMHE  ALHNHYTQKS  LSLSPGK 

以与上文节/节Fc变体相同的方式制备穴/穴同二聚体。 

穴序列的序列为（SEQ ID NO:4）： 

221DKTHTSPPSP  APELLGGPSV  FLFPPKPKDT  LMISRTPEVTCVVVDVSHED  PEVKFNWYVD  GVEVHNAKTK  PREEQYNSTYRVVSVLTVLH  QDWLNGKEYK  CKVSNKALPA  PIEKTISKAKGQPREPQVYT  LPPSREEMTK  NQVSLSCAVK  GFYPSDIAVEWESNGQPENN  YKTTPPVLDS  DGSFFLVSKL  TVDKSRWQQGNVFSCSVMHE  ALHNHYTQKS  LSLSPGK 

然而，同二聚体Fc形成头-尾构象，它会相对于彼此180°地呈现双特异性 Fab任一，如图7所描绘的。这不仅对于Fc会是一种新的构象，而且还会防止正常铰链氧化，因为二硫化物对在Fc的相反末端上。没有匹配的Fc，铰链半胱氨酸趋于环化，然后是无反应性的，除非被氧化还原。如此，这些结果提示可能有助于氧化还原无效的备选构象。 

表1显示同二聚体（节/节和穴/穴）和异二聚体（节/穴）的数据收集和提炼。基于晶体结构分析，得出下面的表3（接触残基）： 

表3 

链A	链B
		S239	K370
V240	K370
		F241	L368
F241	K370
		F243	F405
F243	Y407
		P244	V397
V264	Y349
		R301	T350
K334	D399
		Y349	D265
L368	V262
		K392	N389
K392	Y391
		P395	P396

清楚起见，链A和B具有这两套接触。上表呈现两套之一。所以，完整表会有两倍的上文所列接触。例如，A中的S239接触B中的K370，而B中的S239与A中的K370接触。 

实施例4：定向稳定化

退火和纯化期间的限制步骤是氧化还原步骤。这个步骤之后，氧化的异二聚体通常只占蛋白质的70-80%（BioAnalyzer和MS-TOF）。剩余20-30%的 抗体为二聚体且缺乏共价连接（SEC-LLS）。这可以清除但显著影响总体产量。因此，为了测试我们是否能破坏头-尾联合及如此改进双特异性回收，我们生成了具有F241S/F243R或F241R/F243S突变的节Fc。 

根据大小排阻层析，节和穴Fc具有近似相同量的同二聚体。与野生型（即只有节突变）相比，对节Fc的突变减少存在的同二聚体的量，减少多达83.5%（见图8）。见下文表4。 

表4 

	节F241S/F243R	节F241R/F243S
			同二聚体含量的减少	83.5%	64.5%

与野生型节相比，凭借Fc突变体，节和穴双特异性抗体的退火得到改进。通过Bioanalyzer量化的完整抗体百分比，对于野生型对为27.6%，对于F241S/F243R突变体节为46.4%，而对于F241R/F243S突变体节为45.5%。生成F241S/F243R或F241R/F243S突变破坏头-尾配对的疏水中心。在节链中掺入突变相对于野生型节减少同二聚体的量，而且看来有益于产量改进。相信单独野生型穴中的或野生型节-入-穴Fc中的类似突变会导致类似的改进。 

谷胱甘肽双特异性时间过程

F241S/F243R突变提高双特异性抗体之间正确二硫化物形成的比率。于室温将半抗体在200mM精氨酸琥珀酸酯pH8.5中1:1混合，其中还原性谷胱甘肽200倍过量。反应期间，在下面的时间点采集样品：0，3hr，6hr，12hr，24hr，36hr，48hr，和72hr。收集时，添加等体积的0.15M乙酸以终止装配反应。然后在Agilent BioAnalyzer2100上用蛋白质230试剂盒分析样品。在节和/或穴半抗体上利用F241S/F243R突变提高这些条件下12至48小时时帧中的氧化率（图10）。这证明这些突变体对于提高装配率和总体装配效率的优势。 经由表面等离振子共振（SPR）的节和穴联合

使用BioRad ProteOn^TM系统，在NHS活化的传感器上固定节野生型、穴野生型、节F241R/F243S、节F241S/F243R、和穴F241S/F243R配体。使分析物节F241S/F243R在25mM Tris150mM NaCl0.05%Tween-20pH8.0中在传感器上通过。分析物浓度为200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM、和6.25nM。在每个分析物浓度之间使用10mM甘氨酸pH3再生ProteOn^TM芯片。数据证明，在这些浓度，F241/F243突变不干扰CH3异二聚化，而且也都没有任何可测量同二聚化（有或无这些变化）（图11A-E）。两种情况中异二聚体 的Kd都在单数位纳摩尔范围中。 

能够理解的是，本文所述实施例和实施方案只用于例示目的，而且本领域技术人员根据它们会想到各种变更或变化，它们要包括在本申请的精神和界限和所附权利要求的范围内。通过述及将本文中引用的所有出版物、专利、和专利申请完整收入本文用于所有目的。 

Claims (15)

1.一种变体异多聚体蛋白质或经过修饰的IgG抗体，其包含野生型Fc多肽的Fc变体，所述Fc变体包含所述野生型Fc多肽的Fc区中的至少一处氨基酸修饰，其中与野生型Fc多肽相比，所述变体蛋白质展现降低的错配、降低的头-尾形成或升高的总体产量。

2.一种变体异多聚体蛋白质或经过修饰的IgG抗体，其包含野生型Fc多肽的Fc变体，所述Fc变体包含所述野生型Fc多肽的Fc区中的至少两处氨基酸修饰，其中与野生型Fc多肽相比，所述变体蛋白质展现降低的错配、降低的头-尾形成或升高的总体产量。

3.权利要求1或2的变体异多聚体蛋白质或经过修饰的IgG抗体，其进一步包含节-入-穴修饰。

4.一种变体异多聚体蛋白质或经过修饰的IgG抗体，其包含野生型Fc多肽的Fc变体，其中所述Fc变体包含至少一条重链上的残基241和243处用与野生型Fc多肽中存在的不同的氨基酸进行的替代，由此引起与包含野生型Fc多肽的IgG抗体相比降低的错配、降低的头-尾形成或升高的总体产量。

5.权利要求4的变体异多聚体蛋白质或经过修饰的IgG抗体，其包含至少一条重链上选自F241R/F243S和F241R/F243S的突变。

6.权利要求4或5的变体异多聚体蛋白质或经过修饰的IgG抗体，其进一步包含节-入-穴修饰。

7.前述权利要求任一项的变体异多聚体蛋白质或经过修饰的IgG抗体，其中该蛋白质或抗体是多特异性抗体。

8.一种分离的核酸，其编码前述权利要求任一项的变体异多聚体蛋白质或经过修饰的IgG抗体。

9.一种表达载体，其编码权利要求1-7任一项的变体异多聚体蛋白质或经过修饰的IgG抗体。

10.一种宿主细胞，其包含权利要求8的核酸分子或包含该核酸分子的表达载体。

11.权利要求10的宿主细胞，其生成前述权利要求任一项的变体异多聚体蛋白质或经过修饰的IgG抗体。

12.权利要求11的宿主细胞，其为CHO细胞。

13.权利要求11的宿主细胞，其为大肠杆菌细胞。

14.一种生成前述权利要求任一项的变体异多聚体蛋白质或经过修饰的IgG抗体的方法，其包括培养权利要求10的细胞并自细胞培养物回收变体异多聚体蛋白质或经过修饰的IgG抗体。

15.一种组合物，其包含前述权利要求任一项的变体异多聚体蛋白质或经过修饰的IgG抗体以及载体。

Images