MX2013008920A

MX2013008920A - Variantes de fc y metodos para su produccion.

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Publication number: MX2013008920A
Application number: MX2013008920A
Authority: MX
Inventors: Justin Scheer; J Michael Elliott
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2011-02-04
Filing date: 2012-02-03
Publication date: 2013-10-01
Also published as: HK1196020A1; RU2018108836A; RU2018108836A3; EP2670776B1; MX355255B; JP2017006128A; CN103649117A; RU2013140685A; KR20140043722A; WO2012106587A1; JP2014506790A; KR101913448B1; AR085138A1; BR112013019499B1; JP6161540B2; CA2825064C; CA2825064A1; EP2670776A1; BR112013019499A2; AR127516A2

Abstract

En la presente se describen variantes de Fc y métodos para la producción eficiente de anticuerpos y otros complejos de proteínas multiméricas (a los que en la presente se hace referencia de manera colectiva como proteínas heteromultiméricas). Las proteínas heteromultiméricas pueden ser capaces de unirse específicamente a más de una diana. Las dianas pueden ser, por ejemplo, distintos epítopos en una única molécula o ubicadas en distintas moléculas. Los métodos combinan nivel de expresión génica elevado y eficiente, ensamblaje apropiado y facilidad de purificación de las proteínas heteromultiméricas. La invención también proporciona el uso de estas proteínas heteromultiméricas y composiciones, kits y artículos de manufactura que comprenden estos anticuerpos.

Description

VARIANTES DE Fe Y MÉTODOS PARA SU PRODUCCIÓN REFERENCIA A OTRAS SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud reivindica la prioridad de la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos que lleva el número de serie 61/439.750, denominada "Fe Variante And Methods For Their Production", que se depositó el 4 de febrero de 2011.

CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere a variantes de Fe, métodos para su generación y anticuerpos y fusiones de Fe que comprenden variantes de Fe.

ANTECEDENTES Los anticuerpos monoclonales del tipo IgG contienen dos brazos de unión con el antígeno idénticos y un dominio constante (Fe). Los anticuerpos con una especificidad diferente en sus brazos de unión usualmente no se presentan en la naturaleza, por lo tanto, hay que elaborarlos con la ayuda de ingeniería química (por ejemplo, reticulación química, etc.), ADN recombinante o tecnología de fusión celular.

Los anticuerpos biespecíficos pueden unir simultáneamente dos antígenos diferentes. Esta propiedad permite el desarrollo de estrategias terapéuticas que no son posibles con anticuerpos monoclonales de tipo convencional. El panel grande de formatos de anticuerpos biespecíficos imaginativos que se ha desarrollado refleja el fuerte interés por estas moléculas que existe. Consultar Berg J, Lotscher E, Steimer KS, y colaboradores, "Bispecific antibodies that medíate killing of cells infected with human immunodeficieney virus of any strain," Proc Nati Acad Sci USA (1991) 88(11 ): 4723—4727, al igual que Fischer N. y Leger O., "Biospecific Antibodies: Molecules That Enable Novel Therapeutic Strategies," Pathobiology (2007) 74:3—14.

Otra clase de moléculas multiespecíficas es la de las proteínas de fusión recombinantes. Las proteínas de fusión recombinantes que consisten del dominio extracelular de proteínas inmunoreguladoras y el dominio constante (Fe) de inmunoglobulina (Ig) representan una clase creciente de sustancias terapéuticas para seres humanos. Las inmunoadhesinas combinan la región de unión de una secuencia de proteínas, con una especificidad deseada, con el dominio efector de un anticuerpo. Las inmunoadhesinas tiene dos propiedades importantes que son significativas en cuanto a su potencial como agentes terapéuticos: la especificidad diana y la estabilidad farmacocinética (semivida in vivo que se compara a la de los anticuerpos). Las inmunoadhesinas se pueden usar como antagonistas para inhibir o bloquear las interacciones perjudiciales o como agonista para imitar o mejorar las respuestas fisiológicas. Consultar Chamow S. M., Zhang D. Z., Tan X. Y. y colaboradores, "A humanized, bispecific ¡mmunoadhesin— antibody that retargets CD3+ effectors to kill HIV— 1— infected cells," J Hematother 1995; 4(5): 439—446.

En otros trabajos se han analizado distintas moléculas multiespecíficas. Entre los ejemplos, se incluyen los siguientes sin carácter restrictivo: Fisher y colaboradores, Pathobiology (2007) 74:3— 14 (repaso de varios formatos biespecíficos); patente estadounidense número 6.660.843, concedida el 9 de diciembre de 2003 a Feige y colaboradores, (enlaces peptídicos); publicación de patente estadounidense número 2002— 004587 publicada el 10 de enero de 2002 (anticuerpos multiespecíficos); patente estadounidense número 7.612.181 concedida el 3 de noviembre de 2009 a Wu y colaboradores (formato de dominio variable doble); patente estadounidense número 6.534.628, Nord K. y colaboradores, Prot Eng (1995) 8:601—608, Nord K. y colaboradores, Nat Biotech (1997) 15:772—777 y Grónwall y colaboradores, Biotechnol Appl Biochem. (2008) junio; 50 (Pt 2):97— 112 (Affibodies); Martens y colaboradores, Clin Cáncer Res (2006), 12: 6144—6152 y Jin y colaboradores, Cáncer Res (2008) 68(11 ):4360— 4368 (anticuerpos de un brazo); Bostrom y colaboradores, Science (2009) 323:1610— 1614 (Fab de doble acción, también conocidos como anticuerpos de valencia mixta). Los especialistas en la técnica conocen otros formatos.

La fabricación de material de grado clínico sigue presentando un desafío para los anticuerpos, en general, y especialmente para las moléculas multiespecíficas que se describieron más arriba. Tal como se indicó previamente, hay muchas vías para la producción de moléculas con brazos de unión mixtos, es decir, brazos de unión que no son idénticos entre sí. Cada uno de estos métodos tiene sus desventajas. La reticulación química requiere mano de obra intensiva dado que las especies involucradas tal vez aún necesiten purificarse de los homodímeros y otros subproductos indeseables. Además, los pasos de modificación química pueden alterar la integridad de las proteínas, lo cual lleva a una deficiente estabilidad. De esta manera, este método a menudo resulta ineficiente y puede derivar en la pérdida de la actividad de los anticuerpos.

La tecnología de fusión celular (por ejemplo, los hibridomas híbridos) expresan dos cadenas pesadas y dos cadenas livianas que se ensamblan de manera aleatoria, lo cual lleva a que se generen diez combinaciones de anticuerpos. Los anticuerpos heteromultiméricos convenientes son sólo una pequeña fracción de los anticuerpos que se producen de esta manera. La purificación de las proteínas heteromultiméricas deseadas reduce drásticamente los rendimientos de producción y aumenta los costos de elaboración.

Las técnicas de ADN recombinante se usan para generar varios formados heteromultiméricos, por ejemplo Fv de cadena simple, anticuerpos biespecíficos, etc., que no comprenden un dominio Fe. Una de las principales desventajas para este tipo de moléculas de anticuerpos es la carencia del dominio Fe y, con ello, la capacidad del anticuerpo de disparar una función efectora (por ejemplo, activación del complemento, unión del receptor Fe, etc.). De esta manera, resulta conveniente un anticuerpo biespecífico que comprende un dominio Fe funcional. Las técnicas de ADN recombinante también se usaron para generar anticuerpos biespecíficos del tipo de "botón en ojal". Consultar la solicitud de patente estadounidense número 20030078385 (Arathoon y colaboradores— Genentech). Una restricción de esta estrategia es que las cadenas livianas de los dos anticuerpos padre deben ser idénticas para evitar el apareamiento erróneo y que se formen moléculas indeseables o inactivas debido a que se expresan en la misma célula.

Del mismo modo, el evento limitante durante el recocido y la purificación es la eficiencia redox. Típicamente, el heterodímero oxidado sólo compone hasta el 70— 80% de la proteína después de este paso (bioanalizador y MS— TOF). El 20— 30% restante del anticuerpo es dimérico y carece de una unión covalente (SEC— LLC). Esto se puede eliminar, pero impacta significativamente sobre los rendimientos generales. De este modo, sigue existiendo la necesidad de mejorar el rendimiento general de la producción de anticuerpos, especialmente los heterodímeros. En la presente se describen variantes de Fe que pueden mejorar el rendimiento general de los anticuerpos, heterodímeros y demás similares, al igual que los métodos para su generación. Estos y otros aspectos y ventajas de la invención podrán apreciarse a partir de la descripción de la invención que se consigna en la presente.

BREVE RESEÑA DE LA INVENCIÓN La producción de proteínas heteromultiméricas, por ejemplo anticuerpos multiespecíficos, con el empleo de las técnicas actuales presenta desventajas, entre las que se incluyen la producción de una mezcla de productos, menor rendimiento y una disminución/eliminación de la función efectora, entre otras. De este modo, es deseable producir proteínas heteromultiméricas de manera eficaz y con elevados niveles.

La producción de moléculas de anticuerpos, por diversos medios, generalmente es bien entendida. La patente estadounidense número 6331415 (Cabily y colaboradores), por ejemplo, describe un método para la producción recombinante de ¡nmunoglobulina donde las cadenas pesadas y livianas se expresan de manera simultánea a partir de un único vector o de dos vectores separados en una única célula. Wibbenmeyer y colaboradores, (1999, Biochim Biophys Acta 1430(2): 191 —202), por su parte Lee y Kwak (2003, J. Biotechnology 101 :189—198) describen la producción de anticuerpos monoclonales a partir de cadenas pesadas y livianas producidas en forma separada, usando plásmidos que se expresan en cultivos separados de E. coli. Diversas otras técnicas pertinentes a la producción de anticuerpos se describen, por ejemplo, en Harlow, y colaboradores, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., (1988) y en la patente WO2006028936. Pero, de todas maneras, cada una de éstas tiene desventajas, tales como bajo rendimiento, uso de sustancias químicas, etc.

En la presente se revelan variantes de Fe que comprenden, al menos, dos mutaciones en los residuos de aminoácidos que proporcionan la base para mejorar los rendimientos generales en la producción de proteínas heteromultiméricas.

La presente invención proporciona un proceso/método de producción fácil y eficiente que permite producir de manera económica proteínas heteromultiméricas, por ejemplo, anticuerpos específicos, que comprende una variante de polipéptido de Fe.

En una primera forma de realización, se brinda una proteína heteromultimérica variante que comprende una variante de Fe de un polipéptido de Fe de tipo silvestre. En varias formas de realización, la variante de Fe comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez modificaciones de aminoácidos en la región de Fe de dicho polipéptido de Fe de tipo silvestre, lo cual da como resultado una variante de proteína que exhibe un menor apareamiento erróneo (por ejemplo, apareamiento botón/botón), menor formación de cabeza a cola o mayor rendimiento general respecto del polipéptido de Fe de tipo silvestre. En algunas formas de realización, es preferible que la variante de Fe comprenda dos, tres o cuatro modificaciones de aminoácidos capaces de perturbar la formación de homodímero, tal como se describe en la presente. En algunas formas de realización, la variante de Fe comprende una sustitución en los residuos 241 y 243 en una cadena pesada, como mínimo, con un aminoácido que es diferente del que se encuentra presente en un polipéptido de Fe de tipo silvestre. En algunas formas de realización, las mutaciones en una cadena pesada, como mínimo, se seleccionan de F241 R/F243S y F241 R/F243S. En algunas formas de realización, la variante de Fe comprende, asimismo, una o más modificaciones de botón en el ojal.

En una segunda forma de realización, se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica la proteína heteromultimérica variante o el anticuerpo IgG modificado según se describe en la presente.

En una tercera forma de realización, se proporciona un vector de expresión que codifica la proteína heteromultimérica variante o el anticuerpo de IgG modificado según se describe en la presente.

En una cuarta forma de realización, se proporciona una célula hospedante que comprende una molécula de ácido nucleico o un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico según se describe en la presente. En algunas formas de realización, la célula hospedante es una célula CHO. En algunas formas de realización, la célula hospedante es una célula de E. coli.

En una forma de realización, un método para producir la variante de proteína heteromultimérica o el anticuerpo de IgG modificado que se describe en la presente comprende: cultivar una célula hospedante; y recuperar la variante de proteína heteromultimérica o el anticuerpo de IgG modificado del cultivo celular.

En algunas formas de realización, la recuperación comprende la lisis de las células.

En algunas formas de realización, el método para elaborar una proteína heteromultimérica que comprende un primer polipéptido que contiene Fe que tiene un primer dominio de heterodimerización y un segundo polipéptido que contiene Fe que tiene un segundo dominio de heterodimerización, donde el segundo dominio de heterodimerización interactúa con el primer dominio de heterodimerización, y donde los polipéptidos que contienen Fe primero y segundo están unidos por, al menos, una unión disulfuro intercadena, el método comprende los pasos de: proporcionar un primer polipéptido que contiene Fe purificado que tiene un primer dominio de heterodimerización; proporcionar un segundo polipéptido que contiene Fe purificado que tiene un segundo dominio de heterodimerización; combinar los polipéptidos que contienen Fe primero y segundo; replegar el primer polipéptido que contiene bisagra con el segundo polipéptido que contiene bisagra; y recuperar el complejo de proteínas heteromultiméricas.

En algunas formas de realización, los polipéptidos que contienen Fe primero y segundo también comprenden mutaciones que facilitan la correcta orientación de los polipéptidos que contienen Fe uno respecto del otro. En algunas formas de realización, las mutaciones comprenden sustituciones en los residuos 241 y 243 en una cadena pesada, como mínimo, con un aminoácido que es diferente del que se encuentra presente en un polipéptido de Fe de tipo silvestre.

En una forma de realización, se proporcionan las proteínas heteromultiméricas producidas por los métodos que se describen en la presente.

Cabe comprender que los métodos de la invención pueden incluir otros pasos que, en general, son pasos de rutina evidentes para iniciar o completar el proceso comprendido por los métodos de la invención, de la manera que se describe en la presente. Por ejemplo, en una forma de realización, el paso (a) de un método de la invención está precedido por un paso donde un ácido nucleico que codifica una variante de polipéptido de Fe se introduce en primera célula hospedante, y un ácido nucleico que codifica un segundo polipéptido que contiene bisagra se introduce en una segunda célula hospedante. En una forma de realización, los métodos de la invención también comprenden un paso de purificar proteínas heteromultiméricas que tienen especificidad de enlace con, al menos, dos dianas distintas. En una forma de realización, no más de alrededor del 10%, 15%, 20% ó 30% de polipéptidos aislados están presentes como monómeros o dímeros de cadena pesada— liviana antes del paso de purificar las proteínas multiméricas. En una forma de realización, los monómeros pueden ser menos de alrededor del 30% de los contaminantes de polipéptidos no deseados, que es preciso eliminar antes de purificar las proteínas heteromultiméricas.

En una forma de realización, el primer o el segundo polipéptido que contiene Fe es una cadena pesada de anticuerpos. En otra forma de realización, la cadena pesada de anticuerpos se aparea con una cadena liviana de anticuerpos para proporcionar un par de cadena pesada— liviana. En algunas formas de realización, el par de cadena pesada— liviana está unido de manera covalente. En otra forma de realización, el par de cadena pesada— liviana define un brazo de unión a la diana. En algunas formas de realización, los brazos de unión a la diana son idénticos. En algunas formas de realización, cada uno de los brazos de unión con la diana reconoce dos dianas distintas.

En otra forma de realización, el primer o el segundo polipéptido que contiene Fe comprende un dominio variable de cadena pesada. En otra forma de realización, el primer o el segundo polipéptido que contiene Fe comprende un dominio de unión al receptor. En algunas formas de realización, el primero o el segundo polipéptido que contiene Fe son sustancialmente idénticos (es decir, el dominio de heterodimerización puede no ser idéntico a las regiones fuera del dominio de heterodimerización que es idéntico). En algunas formas de realización, los polipéptidos que contienen Fe primero y segundo no son idénticos.

En algunas formas de realización, la proteína heteromultimérica se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo de un brazo, anticuerpo monovalente monoespecífico, un anticuerpo monovalente multiespecífico, un maxi— anticuerpo biespecífico, una inmunoadhesina, un enlace peptídico, un enlace peptídico ?¡específico, un enlace peptídico monovalente, una molécula que sintetiza las funciones de los anticuerpos (affibody) y una proteína de fusión con el receptor. En algunas formas de realización, dichas proteínas heteromultiméricas comprenden una región de bisagra que tiene al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, o cualquier número entero de hasta todos, los residuos cisteína que son normalmente capaces de formar una unión disulfuro intercadena pesada. En algunas formas de realización, se han introducido cisteínas adicionales en la región de bisagra.

Una proteína heteromultimérica de la invención también puede ser un fragmento de anticuerpo, tal como, por ejemplo, un Fe o un polipéptido de fusión Fe, en la medida en que comprenda la región Fe de una inmunoglobulina. En términos generales, un polipéptido de fusión Fe comprende un polipéptido de Fe (o fragmento de éste) que se fusiona con una secuencia de polipéptidos heterólogos (tal como un dominio de enlace con el antígeno), tal como un dominio extracelular del receptor (ECD, por sus siglas en inglés) fusionado a un polipéptido de Fe de inmunoglobulina (por ejemplo, ECD del receptor Flt fusionado con un Fe de la lgG2). Por ejemplo, en una forma de realización, un polipéptido de fusión Fe comprende un dominio de unión a VEGF, que puede ser un receptor VEGF, que incluye flt, flk, etc. En general, una proteína heteromultimérica de la invención comprende un dominio constante de cadena pesada y un dominio constante de cadena liviana. En una forma de realización, una proteína heteromultimérica de la invención comprende una modificación (por ejemplo, pero sin carácter restrictivo, la inserción de uno o más aminoácidos, por ejemplo para formar una secuencia de dimerización, tal como un cierre leucina) para formar dimerización o multimerización de inter— cadena pesada. En algunas de estas formas de realización, la proteína heteromultimérica comprende un dominio de dimerización (tal como una secuencia de cierre leucina), por ejemplo fusionado al extremo C terminal del fragmento de cadena pesada. En algunas de estas formas de realización, la proteína heteromultimérica comprende un dominio de dimerización que comprende mutaciones a fin de proporcionar un dominio de dimerización de "botón en el ojal" (tal como se define más adelante).

En algunas formas de realización de los métodos y proteínas heteromultiméricas de la invención, los polipéptidos que contienen Fe comprenden al menos una característica que promueve la orientación adecuada de los polipéptidos que contienen Fe uno respecto del otro, a la vez que mejoran el rendimiento general, de los polipéptidos que contienen Fe primero y segundo. Dicha o dichas características mejoran el rendimiento o la pureza o la homogeneidad de las poblaciones de proteínas heteromultiméricas que se pueden obtener por métodos de la invención, tal como se describe en la presente. En una forma de realización, los polipéptidos de Fe de un primer polipéptido que contiene Fe y un segundo polipéptido que contiene Fe se encuentran/interactúan en una interfaz. En algunas formas de realización, donde los polipéptidos de Fe de los polipéptidos que contienen Fe primero y segundo se encuentran en una interfaz, la interfaz del segundo polipéptido de Fe comprende una protuberancia que se puede ubicar en una cavidad de la interfaz del primer polipéptido de Fe. En una forma de realización, el primer polipéptido de Fe se alteró respecto de la plantilla/polipéptido original para codificar la cavidad o el segundo polipéptido de Fe se ha alterado a partir de una plantilla/polipéptido original para codificar una protuberancia, o ambas. En una forma de realización, el primer polipéptido de Fe se alteró respecto de la plantilla/polipéptido original para codificar la cavidad y el segundo polipéptido de Fe se ha alterado a partir de una plantilla/polipéptido original para codificar una protuberancia, o ambas. En una forma de realización, la interfaz del segundo polipéptido de Fe comprende una protuberancia que se puede ubicar en una cavidad en la interfaz del primer polipéptido de Fe donde la cavidad o protuberancia, o ambas, fueron introducidas en la interfaz de los polipéptidos de Fe primero y segundo, respectivamente. En algunas formas de realización, donde los polipéptidos de Fe primero y segundo se encuentran en una interfaz, la interfaz del primer polipéptido de Fe comprende una protuberancia que se puede ubicar en una cavidad de la interfaz del segundo polipéptido de Fe. En una forma de realización, el segundo polipéptido de Fe se alteró respecto de la plantilla/polipéptido original para codificar la cavidad o el primer polipéptido de Fe se ha alterado a partir de una plantilla/polipéptido original para codificar una protuberancia, o ambas. En una forma de realización, el segundo polipéptido de Fe se alteró respecto de la plantilla/polipéptido original para codificar la cavidad y el primer polipéptido de Fe se ha alterado a partir de una plantilla/polipéptido original para codificar una protuberancia, o ambas. En una forma de realización, la interfaz del primer polipéptido de Fe comprende una protuberancia que se puede ubicar en una cavidad en la interfaz del segundo polipéptido de Fe dónde la protuberancia o la cavidad, o ambas, fueron introducidas en la interfaz de los polipéptidos de Fe primero y segundo, respectivamente.

En una forma de realización, cada una de la protuberancia y la cavidad comprende un residuo de aminoácidos naturales. En una forma de realización, el polipéptido de Fe que comprende la protuberancia se genera mediante el reemplazo de un residuo original a partir de la interfaz de una plantilla/polipéptido original con un residuo importado que tiene un volumen de cadena lateral mayor que el residuo original. En una forma de realización, el polipéptido de Fe que comprende la protuberancia se genera a través de un método que comprende un paso donde el ácido nucleico que codifica un residuo original de la interfaz de dicho polipéptido se reemplaza con ácido nucleico que codifica un residuo importado que tiene un volumen de cadena lateral mayor que el original. En una forma de realización, el residuo original es treonina. En una forma de realización, el residuo importado es arginina (R). En una forma de realización, el residuo importado es fenilalanina (F). En una forma de realización, el residuo importado es tirosina (Y). En una forma de realización, el residuo importado es triptófano (W). En una forma de realización, el residuo importado es R, F, Y o W. En una forma de realización, se genera una protuberancia mediante el reemplazo de dos o más residuos en una plantilla/polipéptido original. En una forma de realización, el polipéptido de Fe que comprende una protuberancia comprende el reemplazo de treonina en la posición 366 con triptófano, la numeración de aminoácidos se realiza según el esquema de numeración de la Unión Europea de Kabat y colaboradores, (páginas 688— 696 en Sequences of proteins of immunological interest, 5° edición, volumen 1 (1991 ; NIH, Bethesda, MD)).

En algunas formas de realización, el polipéptido de Fe que comprende la cavidad se genera mediante el reemplazo de un residuo original a partir de la interfaz de una plantilla/polipéptido original con un residuo importado que tiene un volumen de cadena lateral menor que el residuo original. Por ejemplo, el polipéptido de Fe que comprende la cavidad se puede generar a través de un método que comprende un paso donde el ácido nucleico codifica un residuo original de la interfaz de dicho polipéptido se reemplaza con ácido nucleico que codifica un residuo importado que tiene un volumen de cadena lateral menor que el original. En una forma de realización, el residuo original es treonina. En una forma de realización, el residuo original es leucina. En una forma de realización, el residuo original es tirosina. En una forma de realización, el residuo importado no es cisteína (C). En una forma de realización, el residuo importado es alanina (A). En una forma de realización, el residuo importado es serina (S). En una forma de realización, el residuo importado es treonina (T). En una forma de realización, el residuo importado es valina (V). Se puede generar una cavidad si se reemplazan uno o más residuos originales de una plantilla/polipéptido original. Por ejemplo, en una forma de realización, el polipéptido de Fe que comprende una cavidad comprende el reemplazo de dos o más aminoácidos originales que se seleccionan del grupo que consiste de treonina, leucina y tirosina. En una forma de realización, el polipéptido de Fe que comprende una cavidad comprende dos o más residuos importados que se seleccionan del grupo que consiste de alanina, serina, treonina y valina. En algunas formas de realización, el polipéptido de Fe que comprende una cavidad comprende el reemplazo de dos o más aminoácidos originales que se seleccionan del grupo que consiste de treonina, leucina y tirosina, y donde dichos aminoácidos originales se reemplazan con residuos importados que se seleccionan del grupo que consiste de alanina, serina, treonina y valina. En una forma de realización, el polipéptido de Fe que comprende una cavidad comprende el reemplazo de treonina en la posición 366 con serina, la numeración de aminoácidos se realiza según el esquema de numeración de la Unión Europea de Kabat y colaboradores, que se citó más arriba. En una forma de realización, el polipéptido de Fe que comprende una cavidad comprende el reemplazo de leucina en la posición 368 con alanina, la numeración de aminoácidos se realiza según el esquema de numeración de la Unión Europea de Kabat y colaboradores, que se citó más arriba. En una forma de realización, el polipéptido de Fe que comprende una cavidad comprende el reemplazo de tirosina en la posición 407 con valina, la numeración de aminoácidos se realiza según el esquema de numeración de la Unión Europea de Kabat y colaboradores, que se citó más arriba. En una forma de realización, el polipéptido de Fe que comprende una cavidad comprende dos o más reemplazos de aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste de T366S, L368A y Y407V, la numeración de aminoácidos se realiza según el esquema de numeración de la Unión Europea de Kabat y colaboradores, que se citó más arriba. En algunas formas de realización de estos fragmentos de anticuerpos, el polipéptido de Fe que comprende la protuberancia comprende el reemplazo de treonina en la posición 366 con triptófano, la numeración de aminoácidos se realiza según el esquema de numeración de la Unión Europea de Kabat y colaboradores, que se citó más arriba.

En una forma de realización, la interfaz del primer polipéptido de Fe o el segundo polipéptido de Fe se mutó de modo de incluir las sustituciones en los residuos 241 y 243 en, al menos, una cadena pesada con un aminoácido que es distinto de los que se encuentran presentes en un polipéptido de Fe de tipo silvestre. En algunas formas de realización, las mutaciones en al menos un polipéptido de Fe, por ejemplo una cadena pesada, se seleccionan de F241 R F243S y F241 R/F243S. En algunas formas de realización, la variante de Fe comprende, asimismo, una o más modificaciones de botón en el ojal.

En varias formas de realización, el polipéptido de Fe de los polipéptidos de cadena pesada primero y segundo pueden o no ser idénticos, siempre que sean capaces de dimerizarse para formar una región de Fe (tal como se define en la presente). En general, un primer polipéptido de Fe está unido de manera continua a uno o más dominios de una cadena pesada de inmunoglobulina en un único polipéptido, por ejemplo con bisagra, secuencias de dominio constante o variable. En una forma de realización, el primer polipéptido de Fe comprende al menos un fragmento (que incluye toda) de una secuencia de bisagra, al menos un fragmento (que incluye todo) del dominio CH2 o al menos un fragmento (que incluye todo) de un dominio CH3. En una forma de realización, el primer polipéptido de Fe comprende la secuencia de bisagra y los dominios CH2 y CH3 de una inmunoglobulina. En una forma de realización, el segundo polipéptido de Fe comprende al menos un fragmento (que incluye toda) de una secuencia de bisagra, al menos un fragmento (que incluye todo) del dominio CH2 o al menos un fragmento (que incluye todo) de un dominio CH3. En una forma de realización, el segundo polipéptido de Fe comprende la secuencia de bisagra y los dominios CH2 y CH3 de una inmunoglobulina. En una forma de realización, un anticuerpo de la invención comprende los polipéptidos Fe primero y segundo, cada uno de los cuales comprende al menos un fragmento de al menos un dominio constante de un anticuerpo. En una forma de realización, el dominio constante del anticuerpo es un dominio CH2 O CH3. En cualquiera de las formas de realización de un anticuerpo de la invención que comprende un dominio constante, el dominio constante del anticuerpo puede ser de cualquier clase de inmunoglobulina, por ejemplo de una igG. La fuente de inmunoglobulina puede ser de cualquier especie de origen adecuada (por ejemplo, una IgG puede ser IgGi humana) o de forma sintética.

En una forma de realización, un primer polipéptido de cadena liviana y un segundo polipéptido de cadena liviana en un brazo de unión a la molécula diana primero y segundo, respectivamente, de un anticuerpo de la invención comprende distintos/diferentes determinantes de unión con el antígeno (por ejemplo, distintas/diferentes secuencias del dominio variable). En una forma de realización, un primer polipéptido de cadena liviana y un segundo polipéptido de cadena liviana en un brazo de unión de la molécula diana primero y segundo, respectivamente, de un anticuerpo de la invención comprende el mismo (es decir, uno común) determinante de unión con el antígeno (por ejemplo, la misma secuencia del dominio variable).

Los métodos de la invención son capaces de generar las moléculas heteromultiméricas en una elevada homogeneidad. En tal sentido, la invención proporciona métodos donde al menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de los polipéptidos están en un complejo que comprende un primer par de polipéptidos de cadena pesada y de cadena liviana y un segundo par de polipéptidos de cadena pesada y de cadena liviana. En una forma de realización, la invención proporciona métodos donde entre alrededor de 60 y 99%, 70 y 98%, 75 y 97%, 80 y 96%, 85 y 96%, ó 90 y 95% de polipéptidos están en un complejo que comprende un primer par de polipéptidos de cadena pesada y de cadena liviana y un segundo par de polipéptidos de cadena pesada y de cadena liviana.

En una forma de realización, un anticuerpo de la invención se selecciona del grupo que consiste de IgG, IgE, IgA, IgM e IgD. En algunas formas de realización, la región de bisagra de un anticuerpo de la invención es, con preferencia, de una inmunoglobulina que se selecciona del grupo que consta de IgG, IgA e IgD. Por ejemplo, en algunas formas de realización, un anticuerpo o región de bisagra de un anticuerpo es de IgG, que en algunas formas de realización es lgG1 o lgG2 (por ejemplo, lgG2a o lgG2b). En algunas formas de realización, un anticuerpo de la invención se selecciona del grupo que consiste de IgG, IgA e IgD. En una forma de realización, el anticuerpo es de origen humano, humanizado, quimérico o no— humano (por ejemplo, murino).

En general, las proteínas heteromultiméricas de la invención son capaces de unirse, con preferencia de manera específica, a los antígenos. Dichos antígenos incluyen, por ejemplo, antígenos de tumores, factores reguladores de la sobrevida celular, factores reguladores de la proliferación celular, moléculas asociadas con (por ejemplo, que se sabe o se sospecha que contribuyen funcionalmente a) el desarrollo o la diferenciación tisular, moléculas de la superficie celular, linfoquinas, citoquinas, moléculas que participan de la regulación del ciclo celular, moléculas que participan en la vasculogénesis y moléculas asociadas con (por ejemplo, que se sabe o se sospecha que contribuyen funcionalmente a) la angiogénesis. Un antígeno al cual una proteína heteromultimérica de la invención es capaz de unirse puede ser un miembro de un subconjunto de una de las categorías mencionadas previamente, donde el o los otros subconjuntos de dicha categoría comprenden otras moléculas/antígenos que tienen una característica distinta (con respecto al antígeno de interés). También puede considerarse que un antígeno de interés pertenece a dos o más categorías. En una forma de realización, la invención proporciona una proteína heteromultimérica que se une, con preferencia específicamente, a un antígeno de tumor que no es una molécula de la superficie celular. En una forma de realización, un antígeno de tumor es una molécula de la superficie celular, tal como un polipéptido de receptor. En otro ejemplo, en algunas formas de realización, una proteína heteromultimérica de la invención se une, con preferencia específicamente, a un antígeno de tumor que no es un factor de diferenciación en racimo. En otro ejemplo, una proteína heteromultimérica de la invención es capaz de unirse, con preferencia específicamente, a un factor de diferenciación en racimo, que en algunas formas de realización no es, por ejemplo, CD3 ni CD4. En algunas formas de realización, una proteína heteromultimérica de la invención es un anticuerpo anti— VEGF. En algunas formas de realización, una proteína heteromultimérica de la invención es un anticuerpo biespecífico que se selecciona del grupo que consiste de IL— lalfa/IL— Ibeta, IL— 12/IL— 18; IL— 13/IL— 9; IL— 13/IL— 4; IL— 13/IL— 5; IL— 5/IL— 4; IL— 13/1 L— Ibeta; IL— 13/IL— 25; IL— 13/TARC; IL— 13/MDC; IL— 13/MEF; IL— 13 TGF— ß; IL— 13/agonista LHR; IL— 12/TWEAK, IL— 13/CL25; IL— 13/SPRR2a; IL— 13/SPRR2b; IL— 13/ADAM8, IL— 13/PED2, IL17A/IL17F, CD3/CD19, CD138/CD20; CD138/CD40; CD19/CD20; CD20/CD3; CD38/CD138; CD38/CD20; CD38/CD40; CD40/CD20; CD— 8/IL— 6; CD20/BR3, TNF— alfa/TGF— beta, TNF— alfa/IL— Ibeta; TNF— alfa/IL— 2, TNF alfa/IL— 3, TNF— alfa/IL— 4, TNF— alfa/IL— 5, TNF— alfa/IL6, TNF— alfa/IL8, TNF— alfa/IL— 9, TNF— alfa/IL— 10, TNF— alfa/IL— 11 , TNF— alfa/IL— 12, TNF— alfa/IL— 13, TNF— alfa/IL— 14, TNF— alfa/IL— 15, TNF— alfa/IL— 16, TNF— alfa/IL— 17, TNF— alfa/IL— 18, TNF— alfa/IL— 19, TNF— alfa/IL— 20, TNF— alfa/IL— 23, TNF— alfa/IFN— alfa, TNF— alfa/CD4, TNF— alfa/VEGF, TNF— alfa/MIF, TNF— alfa/ICAM— 1, TNF— alfa/PGE4, TNF— alfa/PEG2, TNF— alfa/ligando RANK, TNF— alfa/Te38; TNF— alfa/BAFF; TNF— alfa/CD22; TNF— alfa/CTLA— 4; TNF— alfa/GP130; TNFa/IL— 12p40; VEGF/HER2, VEGF— A/HER2, VEGF— A/PDGF, HER1/HER2, VEGF— A VEGF— C, VEGF— CA/EGF— D, HER2/DR5.VEGF/IL— 8, VEGF/MET, VEGFR/MET receptor, VEGFR/EGFR, HER2/CD64, HER2/CD3, HER2/CD16, HER2/HER3; EGFR/HER2, EGFR/HER3, EGFR/HER4, IL— 13/CD40L, IL4/CD40L, TNFR1/IL— 1R, TNFR1/IL— 6R, TNFR1/IL— 18R, EpCAM/CD3, MAPG/CD28, EGFR/CD64, CSPGs/RGM A; CTLA-^/BTN02; IGF1/IGF2; IGF1/2/Erb2B; MAG/RGM A; NgR/RGM A; NogoA/RGM A; OMGp/RGM A; PDL— l/CTLA— 4; y RGM A/RGM B, ??_1ß/??_18, NRP1/VEGFA, VEGFA/NRP2, cMET/EGFR, ALK1/BMP9, VEGFA/adß? , HER1/HER3— BU y CMV. En algunas formas de realización, una proteína heteromultimérica de la invención se une a, al menos, dos moléculas diana que se seleccionan del grupo que consiste de: a5ß1 , ALK1 , BMP9, IL— lalfa, IL— Ibeta, TARC, MDC, MEF, TGF— ß, agonista LHR, TWEAK, CL25, SPRR2a, SPRR2b, ADAM8, PED2, CD3, CD4, CD16, CD19, CD20, CD22, CD28, CD40, CD38, CD64, CD138, CD— 8, BR3, TNF— alfa, TGF— beta, IL— 2, IL— 3, IL— 4, IL— 5, IL— 6, IL— 8, IL— 9, IL— 10, IL— 11 , IL— 12, IL— 13, IL— 14, IL— 15, IL— 16, IL— 17, IL— 17A, IL— 17F, IL— 18, IL— 19, IL— 20, IL— 23, IL— 25, IFN— alfa, MIF, ICA — 1 , PGE4, PEG2, ligando RANK , Te38, BAFF, CTLA— 4, GP130, IL— 12p40, VEGF, VEGF— A, PDGF, HER1 , HER2, HER3, HER3— BU, HER4, VEGF— C, VEGF— D, DR5, cMET, MET, MET receptor, VEGFR, EGFR, CD40L, TNFR1 , IL— 1R, IL— 6R, IL— 18R, EpCAM, MAPG, CSPGs, BTN02, IGF1 , IGF2, IGF1/2, Erb2B, MAG, NgR, NogoA, NRP1 , NRP2, OMGp, PDL— I, RGM A y RGM B. En algunas formas de realización, una proteína heteromultimérica de la presente invención se una a CD3, y al menos una molécula diana adicional de BLR1 , BR3, CD19, CD20, CD22, CD72, CD79A, CD79B, CD180 (RP105), CR2, FcRH1 , FcRH2, FcRH5, FCER2, FCRL4, HLA— DOB y NAG14.

Las células hospedantes primera y segunda en los métodos de la invención pueden cultivarse en cualquier entorno que permita expresar y aislar los polipéptidos de interés. Por ejemplo, en una forma de realización, la primera célula hospedante y la segunda célula hospedante en un método de la invención se crían como cultivos celulares separados. En otra forma de realización, la primera célula hospedante y la segunda célula hospedante en un método de la invención se crían como un cultivo mixto que comprende ambas células hospedantes.

Las proteínas heteromultiméricas pueden modificarse para mejorar o agregar características deseadas adicionales. Dichas características incluyen funciones biológicas, tales como funciones de un efector inmune, una semivida in v/Vo/depuración convenientes, biodisponibilidad, biodistribución u otras características farmacocinéticas. Dichas modificaciones son bien conocidas en la técnica y también pueden determinarse de manera empírica, y pueden incluir modificaciones en fracciones que pueden o no tener base peptídica. Por ejemplo, los anticuerpos pueden glicosilarse o aglicosilarse, que en general depende, al menos en parte, de la naturaleza de la célula hospedante. Con preferencia, los anticuerpos de la invención son aglicosilados. Con posterioridad, un anticuerpo aglicosilado producido por un método de la invención puede glicosilarse, por ejemplo, mediante el uso de métodos de glicosilacion in vitro que son bien conocidos en la técnica. Tal como se describió previamente y en la presente, las proteínas heteromultiméricas de la invención pueden producirse en una célula procariota, tal como por ejemplo, E. coli. Las proteínas heteromultiméricas producidas a partir de E. coli son, en general, aglicosiladas y carecen de las funciones biológicas que normalmente se asocian con perfiles de glicosilacion que se encuentran en proteínas heteromultiméricas producidas a partir de la célula hospedante (por ejemplo, CHO).

La invención también proporciona inmunocongujados que comprenden una proteína heteromultimérica de la invención conjugada con una fracción heteróloga. Cualquier fracción heteróloga puede resultar adecuada en la medida en que su conjugación en el anticuerpo no reduzca sustancialmente una función o característica deseada del anticuerpo. Por ejemplo, en algunas formas de realización, un inmunoconjugado comprende una fracción heteróloga que es un agente citotóxico. En algunas formas de realización, dicho agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste de isótopo radioactivo, un agente quimioterapéutico y una toxina. En algunas formas de realización, dicha toxina se selecciona del grupo que consiste de caliquemicina, maitansina y tricoteno. En algunas formas de realización, un inmunoconjugado comprende una fracción heteróloga que es un marcador detectable. En algunas formas de realización, dicho marcador detectable se selecciona del grupo que consiste de un isótopo radioactivo, un miembro de un par ligando— receptor, un miembro un par enzima— sustrato y un miembro de un par de transferencia de energía por resonancia en la fluorescencia.

En una forma de realización, la invención proporciona composiciones que comprenden una proteína heteromultimérica de la invención y un portador, que en algunas formas de realización es farmacéuticamente aceptable.

En otra forma de realización, la invención proporciona composiciones que comprenden un inmunoconjugado según se describe en la presente y un portador, que en algunas formas de realización es farmacéuticamente aceptable.

En una forma de realización, la invención proporciona una composición que comprende una población de proteínas heteromultiméricas multiespecificas de la invención. Tal como resultará evidente para el especialista en la técnica, en general, dicha composición no será completamente homogénea (es decir, 100%). Sin embargo, tal como se describe en la presente, los métodos de la invención pueden producir una población sustancialmente homogénea de proteínas heteromultiméricas multiespecificas. Por ejemplo, la invención proporciona una composición que comprende proteínas heteromultiméricas, donde al menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de dichas proteínas heteromultiméricas son un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico, etc.) de la invención, tal como se describe en la presente.

En otra forma de realización, la invención proporciona artículos de manufactura que comprenden un recipiente y una composición contenida en él, donde la composición comprende una proteína heteromultimérica (por ejemplo, un anticuerpo) de la invención. En otra forma de realización, la invención proporciona artículos de manufactura que comprenden un recipiente y una composición contenida en él, donde la composición comprende un inmunoconjugado, tal como se describe en la presente. En algunas formas de realización, estos artículos de manufactura también comprenden instrucciones para usar dicha composición.

Aún en otra forma de realización, la invención proporciona polinucleótidos que codifican una proteína heteromultimérica de la invención. También en otra forma de realización, la invención proporciona polinucleótidos que codifican un inmunoconjugado, tal como se describe en la presente. En algunas formas de realización, los ácidos nucleicos (por ejemplo, los polinucleótidos) están aislados. En una forma de realización, la invención proporciona vectores recombinantes para expresar una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) de la invención. En otra forma de realización, la invención proporciona vectores recombinantes para expresar un inmunoconjugado de la invención.

Cualquiera de un número de células hospedantes se pueden usar en los métodos de la invención. Dichas células son conocidas en la técnica (algunas de las cuales se describen en la presente), o bien se pueden determinar de manera empírica con respecto a la adecuación para su empleo en los métodos de la invención que usan técnicas de rutina que son conocidas en la técnica. En una forma de realización, una célula hospedante es procariota. En algunas formas de realización, una célula hospedante es una célula bacteriana Gram— negativa. En una forma de realización, una célula hospedante es E coli. En algunas formas de realización, la E. co//' es de una cepa deficiente en lipoproteína (????). En algunas formas de realización, el genotipo de una célula hospedante de E. coli carece de los genes degP y prc y alberga un gen spr mutante. En una forma de realización, una célula hospedante es de mamífero, por ejemplo, una célula de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés).

En una forma de realización, la invención proporciona células hospedantes que comprenden un polinucleótido o vector recombinante de la invención. En una forma de realización, una célula hospedante es una célula de mamífero, por ejemplo, una célula de ovario de hámster chino (CHO). En una forma de realización, una célula hospedante es una célula procariota. En algunas formas de realización, una célula hospedante es una célula bacteriana Gram— negativa que, en algunas formas de realización, es E. coli. Las células hospedantes de la invención también pueden comprender un polinucleótido o vector recombinante que codifica una molécula, cuya expresión en una célula hospedante mejora el rendimiento de una proteína heteromultimérica en un método de la invención. Por ejemplo, dicha molécula puede ser una proteína chaperona. En una forma de realización, dicha molécula es un polipéptido procariota que se selecciona del grupo que consta de DsbA, DsbC, DsbG y FkpA. En algunas formas de realización, dicho polinucleótido y vector recombinante codifica tanto DsbA como DsbC. En algunas formas de realización, una célula hospedante de E. coli es de una cepa deficiente en actividades de proteasa endógena. En algunas formas de realización, el genotipo de una célula hospedante de E. coli es el de una cepa de E. coli que carece de los genes degP y prc y alberga un gen spr mutante. En algunas formas de realización, el genotipo de una célula hospedante de E. coli es ????.

Las proteínas heteromultiméricas de la invención encuentran una variedad de usos en una variedad de entornos. En un ejemplo, una proteína heteromultimérica de la invención es un anticuerpo terapéutico. En otro ejemplo, una proteína heteromultimérica de la invención es un anticuerpo agonista. En otro ejemplo, una proteína heteromultimérica de la invención es un anticuerpo antagonista. Una proteína heteromultimérica de la invención también puede ser un anticuerpo de diagnóstico. Aún en otro ejemplo, una proteína heteromultimérica de la invención es un anticuerpo de bloqueo. En otro ejemplo, una proteína heteromultimérica de la invención es un anticuerpo neutralizante.

En una forma de realización, la invención proporciona métodos para tratar o retrasar una enfermedad en un sujeto, dichos métodos comprenden administrarle a dicho sujeto una proteína heteromultimérica de la invención. En una forma de realización, la enfermedad es cáncer. En otra forma de realización, la invención se asocia con la disregulación de la angiogénesis. En otra forma de realización, la enfermedad es un trastorno inmune, tal como artritis reumatoide, púrpura trombocitopénica inmune, lupus eritemaso sistémico, etc.

En una forma de realización, la invención proporciona el uso de una proteína heteromultimérica (por ejemplo, un anticuerpo) de la invención en la elaboración de un medicamento para el tratamiento terapéutico o profiláctico de una enfermedad, tal como un cáncer, un tumor, un trastorno de proliferación celular, un trastorno inmune (tal como auto inmune) o un trastorno relacionado con la angiogénesis.

En una forma de realización, la invención proporciona el uso de un ácido nucleico de la invención en la elaboración de un medicamento para el tratamiento terapéutico o profiláctico de una enfermedad, tal como un cáncer, un tumor, un trastorno de proliferación celular, un trastorno inmune (tal como auto inmune) o un trastorno relacionado con la angiogénesis.

En una forma de realización, la invención proporciona el uso de un vector de expresión de la invención en la elaboración de un medicamento para el tratamiento terapéutico o profiláctico de una enfermedad, tal como un cáncer, un tumor, un trastorno de proliferación celular, un trastorno inmune (tal como auto inmune) o un trastorno relacionado con la angiogénesis.

En una forma de realización, la invención proporciona el uso de una célula hospedante de la invención en la elaboración de un medicamento para el tratamiento terapéutico o profiláctico de una enfermedad, tal como un cáncer, un tumor, un trastorno de proliferación celular, un trastorno inmune (tal como auto inmune) o un trastorno relacionado con la angiogénesis.

En una forma de realización, la invención proporciona el uso de un artículo de manufactura de la invención en la elaboración de un medicamento para el tratamiento terapéutico o profiláctico de una enfermedad, tal como un cáncer, un tumor, un trastorno de proliferación celular, un trastorno inmune (tal como auto inmune) o un trastorno relacionado con la angiogénesis.

En una forma de realización, la invención proporciona el uso de un kit de la invención en la elaboración de un medicamento para el tratamiento terapéutico o profiláctico de una enfermedad, tal como un cáncer, un tumor, un trastorno de proliferación celular, un trastorno inmune (tal como auto inmune) o un trastorno relacionado con la angiogénesis.

A partir de la descripción detallada que se brinda a continuación, se comprenderán más acabadamente otros objetos, características y ventajas de la presente invención. Sin embargo, es preciso comprender que la descripción detallada y los ejemplos específicos, si bien indican las formas de realización preferidas de la invención, sólo se incluyen con fines ilustrativos, ya que los especialistas en la técnica advertirán que se pueden introducir cambios y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1A ilustra un semi— anticuerpo totalmente oxidado. No se muestran el "botón" ni el "ojal" ni otros dominios de heterodimerización. El semi— anticuerpo que se presenta en esta Figura es un isotipo lgG1. El especialista en la técnica apreciará que los otros isotipos de inmunoglobulina pueden visualizarse como semi— anticuerpos con las correspondientes uniones inter e intra— cadena. En un Ab intacto, las cisteínas de bisagra formarán enlaces disulfuro inter— cadena.

La Figura 1 B ilustra un anticuerpo biespecífico de longitud completa. No se presentan las uniones disulfuro inter— cadena pesada en la región de bisagra. Las Figuras 2A y B ilustran plásmidos que codifican los semi— anticuerpos de botón y ojal, respectivamente.

La Figura 3 ilustra la producción de proteínas heteromultiméricas, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, usando semi— anticuerpos diseñados y expresados de manera separada. El BsAb producido, típicamente, tiene dos cadenas pesadas diferentes, cada una apareada con su cadena liviana del cognado. En este método cada cadena liviana no es necesariamente la misma para cada semi— anticuerpo.

La Figura 4A es un diagrama de flujo para la producción de anticuerpos biespecíficos que usan semi— anticuerpos diseñados y expresados de manera separada. En este método se usa la química redox.

La Figura 4B muestra un gel teñido con Coomassie. Los dos semi— anticuerpos se analizaron bajo condiciones reductoras y no reductoras mediante electroforesis sobre gel de poliacrilamida— SDS. La fracción predominante es el par de cadena liviana y cadena pesada de 75 kD para cada semi— anticuerpo bajo condiciones no reductoras. En condiciones reductoras (por ejemplo, tratamiento con DTT), cada cadena es visible como una banda separada.

La figura 4C muestra los resultados de la espectrometría de masas ESI— TOF de un semi— anticuerpo con y sin tratamiento de 1 mM N— etilmaleimida (NEM). No se observan cambios en la masa del semi— anticuerpo cuando se realiza el tratamiento con NEM, lo cual indica que todas las cisternas están totalmente oxidadas. Las cistenías de bisagra oxidadas se representan como un disulfuro cíclico en la secuencia de aminoácidos que se presenta. La masa esperada para el semi— anticuerpo es 72.548 Daltons, lo cual es lo que se observa mediante la espectrometría de masas e indica que no hay aductos covalentes.

La Figura 4D muestra el cromatograma de carboximetilo (CM), una foto de una electroforesis sobre gel de poliacrilamida— SDS y la masa simplificada para la producción de un anticuerpo biespecífico anti— EGFR/anti— c— met. La cromatografía de CM produce un único pico que posteriormente se analiza mediante SDS— PAGE. La banda principal en el gel es el anticuerpo biespecifico de longitud completa (es decir, intacto). También se puede observar una banda menor en el rango de 75 kD. Posteriormente, la banda principal se analizó mediante espectrometría de masas y se indicó que el único producto de anticuerpo intacto detectable coincidía con el MW teórico de un anticuerpo biespecífico anti— EGFR anti— c— met.

La Figura 5 es un diagrama de flujo para la producción a gran escala de anticuerpos biespecíficos que usan semi— anticuerpos diseñados y expresados de manera separada.

La Figura 6 es una representación gráfica de heterodímero Fe del tipo de botón en ojales. El heterodímero se cristalizó en la presencia de un péptido del dominio mini— Z (que no se muestra). El péptido mini— Z se unió a la interfaz CH2— CH3 y se presume que ayuda a estabilizar las regiones CH2 del Fe. La estructura de botón y ojal hace contacto con los dos dominios CH3 y no es significativamente diferente de los Fe de lgG1 de tipo silvestre aglicosilados.

La Figura 7 es una representación gráfica del apareamiento de cabeza a cola sugerido por el análisis de estructuras en cristal. Los apareamientos pueden ser parcialmente responsables por la ineficiencia redox. El apareamiento de cabeza a cola del Fe causa que una porción de los anticuerpos escape del apareamiento disulfuro de bisagra. S bien son diméricos, la incertidumbre de su verdadera identidad requiere que sean eliminados. Esto produce impacto sobre los rendimientos/eficiencia generales del proceso de recocción y sigue siendo un objetivo para la mejora de la plataforma.

Las Figuras 8A— D muestran el contenido dimérico de diferentes variantes de Fe. El análisis de filtración en gel de Fe muestra diferentes grados de dimerización.

Los mutantes de botón demuestran una menor homodimerización no covalente cuando se los compara con versiones del tipo silvestre tanto del botón como del ojal.

La Figura 9A-B muestran las regiones de contacto entre los Fe de botón— botón. El panel A muestra los contactos hidrófobos. Los homodímeros Fe botón— botón se presentan como caricaturas con la cadena A sombreada en claro y la cadena B sombreada en oscuro. Los residuos hidrófobos Y349, L368, K370, F405 e Y407 en el dominio CH de la cadena A se asocian con los residuos F241 , F243, V262 y V264 en el dominio CH3 de la cadena B. P395 y P396 crean un bolsillo hidrófobo entre los dos dominios CH2. El panel B muestra los contactos hidrófilos que se presentan en este panel. Los homodímeros Fe botón— botón se presentan como caricaturas con la cadena A sombreada en claro y la cadena B sombreada en oscuro. Los residuos T350, K370 y D399 en el dominio CH2 de la cadena A se asocian con los residuos S239, V240, R301 y K334 en el dominio CH3 de la cadena B. N389, Y391 y K392 forman interacciones entre los dos dominios CH2. La Figura 10 es un gráfico de barras que muestra la tasa de formación de disulfuro para proporcionar el heterodímero de botón en ojal correcto. Cuando los semi— anticuerpos se mezclan inicialmente, se observa un bajo nivel de homodímeros en la hora cero. A medida que el glutation reducido empieza a reducir los disulfuros de bisagra, los homodímeros empiezan a desaparecer. A medida que avanza el tiempo, el glutation empieza el proceso de oxidación y se observa un aumento en la formación de IgG intacta.

La Figura 11A--E es una serie de curvas de espectros de resonancia de plasmón de superficie (SPR, por sus siglas en inglés) proveniente de los experimentos usando un ligando inmovilizado. El analito se pasó sobre el ligando y se controló la homodimerización. Las concentraciones de analito se sometieron a prueba a 6.25nM, 12.5nM, 25nM, 50nM, 100n y 200nM. Los ligandos fueron: (A) el botón de tipo silvestre, (B) el orificio de tipo silvestre, (C) el botón F241 R/F243S, (D) el botón F241 S/F243R y (E) el ojal F241 S/F243R. El eje de las Y muestra las unidades de respuesta y el eje de las X es el tiempo (en segundos).

ABREVIATURAS ADCC = Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo API = Inmunoadhesinas anti patógenos BPI = Proteína bactericida/que aumenta la permeabilidad C1 q = Factor de complemento 1q CD = Racimo de diferenciación CDC = Citotoxicidad dependiente del complemento CH1 ó CH1 = Primer dominio constante de la cadena pesada CH2 ó CH2 = Segundo dominio constante de la cadena pesada CH3 ó CH3 = Tercer dominio constante de la cadena pesada CH4 ó CH4 = Cuarto dominio constante de la cadena pesada CL ó CL = Dominio constante de la cadena liviana CTLA = Molécula citotóxica asociada al linfocito T Fe = Fragmento cristalizable Fc(R = Receptor gamma para la porción Fe de la IgG HIV = Virus de inmunodeficiencia humana ICAM = Molécula de adhesión intercelular BsAb = Anticuerpo biespecífico BsDb = Anticuerpo biespecífico dsFv = Fv estabilizado por disulfuro Fe = Fragmento constante de un anticuerpo Fd = VH+CH1 de un anticuerpo FcR = Receptor Fe Fv = Fragmento variable de un anticuerpo IgG = Inmunoglobulina G mAb = Anticuerpo monoclonal PBL = Linfocito de sangre periférica scDb = Anticuerpo biespecífico de cadena simple scFv = Fv de cadena simple (scFv)2 = Tándem scFv— scFv Tandab = Anticuerpo biespecífico en tándem VH ó VH= Dominio variable de la cadena pesada de un anticuerpo VL ó VL = Dominio variable de la cadena liviana de un anticuerpo DESCRIPCIÓN DETALLADA A continuación se describirá la invención en detalle sólo a modo de referencia utilizando las siguientes definiciones y ejemplos. Todas las patentes y publicaciones, incluso todas las secuencias que se revelan dentro de las patentes y publicaciones a las que se hace referencia en la presente quedan expresamente incorporadas por referencia.

Salvo que se definan de manera diferente en la presente, todos los términos técnicos y científicos que se utilizan en la presente tienen el mismo significado que aplican ordinariamente los especialistas en la técnica dentro de la cual se encuadra la presente invención. Singleton, y colaboradores, DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., John Wiley and Sons, New York (1994), y Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991 ) le aportan al especialista en la técnica un diccionario general de muchos de los términos que se emplean en la presente invención. Si bien para la puesta en práctica o para el testeo de la presente invención se pueden utilizar otros métodos y materiales similares o equivalentes a los que se describen en la presente, a continuación se describen los métodos y los materiales que resultan preferidos. Los rangos numéricos incluyen los números que definen el rango. Salvo que se indique de otra manera, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en orientación 5' a 3'; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en orientación amino a carboxi, respectivamente. A los profesionales se les aconseja particularmente remitirse a Sambrook y colaboradores, 1989, como así también a Ausubel FM y colaboradores, 1993, para consultar definiciones y términos de la técnica. Cabe comprender que la presente invención no se encuentra limitada a los protocolos, metodología y reactivos que se describen aquí.

Los rangos numéricos incluyen los números que definen el rango.

Salvo que se indique de otra manera, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en orientación 5' a 3'; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en orientación amino a carboxi, respectivamente. Los encabezados que se consignan en la presente no son limitaciones de los diversos aspectos o formas de realización de la invención, que pueden considerarse como una referencia para la memoria en su totalidad. En tal sentido, los términos que se definen inmediatamente a continuación se definen en un sentido más amplio por referencia a la memoria en su totalidad.

Definiciones Un "heteromultímero", "complejo héteromultimérico" o "proteína heteromultimérica" se refiere a una molécula que comprende al menos un primer polipéptido que contiene Fe y un segundo polipéptido que contiene Fe, donde el segundo polipéptido que contiene Fe difiere en la secuencia de aminoácidos del primer polipéptido que contiene Fe en un residuo de aminoácido, por lo menos. El heteromultímero puede comprender un "heterodímero" formado por los polipéptidos que contienen Fe primero y segundo o pueden formar estructuras terciarias de un orden superior donde se encuentran presentes los polipéptidos además de los polipéptidos que contienen Fe primero y segundo. Los polipéptidos del heteromultímero pueden interactuar entre sí a través de una unión peptídica covalente (por ejemplo, unión disulfuro) o una interacción no covalente (por ejemplo, uniones hidrógeno, uniones iónicas, fuerzas de van der Waals o interacciones hidrófobas).

Tal como se lo emplea en la presente, "dominio de heteromultimerización" se refiere a alteraciones o agregados a una molécula biológica, de modo de promover la formación de heteromultímero y ocultar la formación de homomultímero. Todo dominio de heterodimerización que tenga una fuerte preferencia por la formación de heterodímeros sobre los homodímeros se encuadra dentro del alcance de la invención. Los ejemplos ilustrativos incluyen, sin carácter restrictivo, por ejemplo la solicitud de patente estadounidense número 20030078385 (Arathoon y colaboradores, - Genentech, que describe la estructura de botón en ojales); la patente WO 2007147901 (Kjaergaard y colaboradores, - Novo Nordisk, que describe interacciones iónicas); la patente WO 2009089004 (concedida a Kannan y colaboradores, - Amgen, que describe los efectos de la dirección electrostática); la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos número 61/243.105 (Christensen y colaboradores, — Genentech; que describe las estructuras de doble alfa hélice). Además, consultar por ejemplo, Pack, P. y Plueckthun, A., Biochemistry 31 , 1579— 1584 (1992) que describen el cierre de leucina o Pack y colaboradores, Bio/Technology 11 , 1271— 1277 (1993) que describen el motivo hélice— giro— hélice. Las frases "domino de heteromultimerización" y "dominio de heterodimerización" se utilizan en la presente de manera intercambiable.

El término "anticuerpo" se emplea en la presente en el sentido más amplio y se refiere a cualquier molécula de inmunoglobulina (Ig) que comprende dos cadenas pesadas y dos cadenas livianas, y todo fragmento, mutante, variante o derivación de éstas, en la medida en que exhiban la actividad biológica que se busca (por ejemplo, actividad de unión con el epítopo). Los ejemplos de anticuerpos incluyen anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpos, tal como se describe en la presente. Un anticuerpo puede ser humano, humanizado o madurado por afinidad.

Como marco de referencia y tal como se lo emplea en la presente, un anticuerpo hace referencia a una estructura de una inmunoglobulina G (IgG). Sin embargo, el especialista en la técnica entiende/reconoce que un anticuerpo de cualquier clase de inmunoglobulina puede utilizarse en el método inventivo que se describe en la presente. Para mayor claridad, una molécula de IgG contiene un par de cadenas pesadas (HC, por sus siglas en inglés) idénticas y un par de cadenas livianas (LC, por sus siglas en inglés) idénticas. Cada LC tiene un dominio variable (VL) y un dominio constante (CL), mientras que cada HC tiene un dominio variable (VH) y tres dominios constantes (CH1 , CH2 y CH3). Los dominios CH1 y CH2 están conectados por una región de bisagra. La estructura es bien conocida en la técnica. Se hace referencia a la Figura 1 B.

Tal como se lo emplea e la presente, por "semi— anticuerpo" se entiende una cadena pesada de inmunoglobulina asociada con una cadena liviana de inmunoglobulina. En la Figura 1A se presenta un ejemplo de semi— anticuerpo. El especialista en la técnica podrá apreciar fácilmente que un semi— anticuerpo también puede tener un dominio de unión con el antígeno que consiste de un único dominio variable.

El término "maxi— anticuerpo" se refiere a una proteína de fusión que comprende un scFc fusionado a un polipéptido de Fe. Se hace referencia a la Figura 8A de la patente WO 2009089004. Se hace referencia a la Figura 2 de la patente WO 2009089004 respecto de un maxi— anticuerpo biespecífico.

El término "dominio CH2" de una región Fe de la IgG humana usualmente se extiende desde el residuo 231 , aproximadamente, hasta el residuo 340, aproximadamente, de la IgG según el sistema de numeración de la Unión Europea. El dominio CH2 es exclusivo porque no está estrechamente apareado con otro dominio. En cambio, dos cadenas de carbohidratos ramificadas unidas por N se interponen entre los dos dominios CH2 de una molécula de IgG natural intacta. Se ha especulado que el carbohidrato puede proporcionar un sustituto para el apareamiento dominio— dominio y ayuda a estabilizar el dominio CH2. Burton, Molec. Immunol. 22:161—206 (1985).

El término "dominio CH3" comprende el tramo de residuos del extremo C terminal hasta un dominio CH2 en una región Fe (es decir, desde aproximadamente el residuo de aminoácido 342 hasta aproximadamente el residuo de aminoácido 447 de una IgG según el sistema de numeración de la Unión Europea).

El término "región Fe", tal como se lo emplea en la presente, en general se refiere a un complejo de dímeros que comprende las secuencias de polipéptidos del extremo C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina, donde una secuencia de polipéptido del extremo C terminal es aquella que se puede obtener mediante la digestión de papaína de un anticuerpo intacto. La región Fe puede comprender secuencias de Fe naturales o variantes. Si bien las fronteras de la secuencia Fe de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, la secuencia Fe de la cadena pesada de la IgG humana, en general, se define para que se extienda desde un residuo de aminoácido en una posición aproximada Cys226, o desde una posición aproximada Pro230, hasta el extremo terminal carboxilo de la secuencia Fe. Salvo que se especifique lo contrario en la presente, la numeración de los residuos de aminoácidos en la región Fe o en la región constante se adecúa al sistema de numeración de la unión Europea, que también se llama índice UE, tal como lo describen Kabat y colaboradores, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. En general, la secuencia Fe de una inmunoglobulina comprende dos dominios constantes, un dominio CH2 y un dominio CH3 y, de manera opcional, comprende un dominio CH4. Por "polipéptido de Fe" en la presente se entiende uno de los polipéptidos que forman una región Fe, por ejemplo, un Fe monomérico. Un polipéptido de Fe puede obtenerse a partir de cualquier inmunoglobulina adecuada, tal como los subtipos IgGi, lgG2, lgG3 ó lgG4, IgA, IgE, IgD ó IgM. La región Fe comprende las porciones del extremo carboxi terminal de ambas cadenas H que se mantienen unidas mediante disulfuros. Las funciones efectoras de los anticuerpos se determinan por las secuencias en la región Fe; esta región también es la parte reconocida por los receptores Fe (FcR) que se encuentra en ciertos tipos de células. En algunas formas de realización, un polipéptido de Fe comprende parte o toda una secuencia de bisagra de tipo silvestre (en general, en su extremo N terminal). En algunas formas de realización, un polipéptido de Fe no comprende una secuencia de bisagra de tipo funcional o silvestre.

Una "región Fe funcional" posee una "función efectora" de una región Fe de la secuencia nativa. Las "funciones efectoras" de ejemplo incluyen la unión a C1q; CDC; la unión al receptor Fe; ADCC, fagocitosis; regulación descendente de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, el receptor de células B; BCR), etc. Dichas funciones efectoras generalmente requieren que la región Fe se combine con un dominio de unión (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo) y se puede evaluar usando varios ensayos como los que se revelan, por ejemplo, en las definiciones de la presente.

Una "región Fe de la secuencia nativa" comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fe que se encuentra en la naturaleza. Las regiones Fe humanas de la secuencia nativa incluyen una región Fe de la IgGi de la secuencia nativa (alotipos no A y A); región Fe de la lgG2 humana de la secuencia nativa; región Fe de la lgG3 humana de la secuencia nativa; y región Fe de la lgG4 de la secuencia nativa, al igual que sus variantes naturales.

Una "región Fe variante" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la región Fe de la secuencia nativa en virtud de, al menos, una modificación de aminoácidos, con preferencia una o más sustituciones de aminoácidos. Con preferencia, la región Fe variante tiene al menos una sustitución de aminoácidos en comparación con una región Fe de la secuencia nativa o la región Fe de un polipéptido padre, por ejemplo, de entre una y diez sustituciones de aminoácidos, aproximadamente; y, con preferencia, de entre una y cinco sustituciones de aminoácidos, aproximadamente, en una región Fe de la secuencia nativa o en la región Fe del polipéptido padre. La región Fe vanante de la presente habrá de poseer, preferentemente, al menos alrededor del 80% de homología con una región Fe de la secuencia nativa o con una región Fe de un polipéptido padre, y con la mayor de las preferencias al menos alrededor del 90% de homología con ella; con mayor preferencia al menos alrededor del 95%, al menos alrededor del 96%, al menos alrededor del 97%, al menos alrededor del 98%, o al menos alrededor del 99% de homología con ella.

Tal como se lo emplea en la presente, el término "componente de Fe" se refiere a una región de bisagra, un dominio CH2 o un domino CH3 de una región Fe.

En ciertas formas de realización, el polipéptido que contiene Fe comprende una región Fe de la IgG, con preferencia derivada de una región Fe de la IgG humana de tipo silvestre. Por Fe de la IgG humana "de tipo silvestre" se entiende una secuencia de aminoácidos que se produce naturalmente dentro de la población humana. Por supuesto, así como la secuencia Fe puede variar ligeramente entre los individuos, se pueden hacer una o más alteraciones a una secuencia de tipo silvestre y aún así permanecer dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, la región Fe puede contener otras alteraciones que no se relacionan con la presente invención, tal como una mutación en un sitio de glcosilación o inclusión de un aminoácido no natural. Cuando se usa en conjunto con botón, ojal o botón/ojal, "tipo silvestre" se refiere a la secuencia de proteínas que tiene introducidas sólo las mutaciones botón, ojal o botón/ojal, pero que comprende la secuencia que se produce naturalmente dentro de la población humana.

El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o cadena liviana de anticuerpo que está involucrada en la unión del anticuerpo con el antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y de la cadena liviana (VH y NA., respectivamente, por sus siglas en inglés) de un anticuerpo nativo generalmente tienen estructuras similares, donde cada dominio comprende cuatro regiones de marco conservadas (FRs) y tres regiones hipervariables (HVRs). (Ver, por ejemplo, Kindt y colaboradores, Kuby Immunology, sexta edición, W. H. Freeman and Co., página 91 (2007)) Un único dominio VH O VL puede ser suficiente para conferir especificidad de unión con el antígeno. Sumado a ello, los anticuerpos que se unen a un antígeno en particular pueden aislarse usando un dominio VH ó VL desde un anticuerpo que se une al antígeno para cribar una biblioteca de dominios VL ó VH complementarios, respectivamente. Ver, por ejemplo, Portolano y colaboradores, J. Immunol. 150:880—887 (1993); Clarkson y colaboradores, Nature 352:624—628 (1991 ). El término "Fab" tal como se usa en la presente se refiere a un fragmento de unión con el antígeno de un anticuerpo. Tal como se indica previamente, se puede usar papaína para digerir un anticuerpo intacto. La digestión con papaína de anticuerpos produce dos fragmentos de unión con el antígeno idénticos, es decir fragmentos "Fab" y un fragmento "Fe" residual (es decir, la región Fe indicada previamente). El fragmento Fab consiste de una cadena L entera junto con el dominio de la región variable de la cadena H (VH), y el primer dominio constante de una cadena pesada (CH1 ).

Las frases "brazo de unión con el antígeno", "brazo de unión con la molécula diana", "brazo de unión con la diana" y sus variantes, tal como se las emplea en la presente, se refieren a una parte componente de una proteína heteromultimérica de la invención que tiene la capacidad de unirse específicamente a una diana de interés. En términos generales y con preferencia, el brazo de unión con el antígeno es un complejo de secuencias de polipéptidos de inmunoglobulina, por ejemplo CDR o secuencias del dominio variable de una cadena liviana y cadena pesada de inmunoglobulina.

Una "diana" ó "molécula diana" se refiere a una fracción reconocida por un brazo de unión de la proteína heteromultimérica. Por ejemplo, si la proteína heteromultimérica es un anticuerpo, luego la diana puede ser epítopos en una única molécula o en diferentes moléculas, o un patógeno o célula tumoral, según el contexto. Del mismo modo, si la proteína heteromultimérica es una proteína de fusión del receptor Fe, la diana sería el socio que se une al cognado para el receptor. El especialista en la técnica habrá de apreciar que la diana se determina por la especificidad de unión del brazo que se une a la diana y que diferentes brazos de unión a la diana pueden reconocer dianas diferentes. Con preferencia, una diana se une a una proteína heteromultimérica de la presente invención con una afinidad mayor que 1 uM Kd (según el análisis de Scarchard). Los ejemplos de moléculas diana incluyen, sin carácter restrictivo, proteínas solubles en suero o sus receptores, tales como citoquinas o receptores de citoquina, adhesinas, factores de crecimiento o sus receptores, hormonas, partículas virales (por ejemplo, proteína RSV, CMV, StaphA, influenza, virus de la hepatitis C), microorganismos (por ejemplo, proteínas de células bacterianas, células fúngicas), adhesinas, proteínas CD y sus receptores.

Un ejemplo de un anticuerpo "intacto" o "de longitud completa" es el que comprende un brazo de unión con el antígeno, al igual que un CL y, al menos, dominios constantes de la cadena pesada CH1 , CH2 y CH3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de la secuencia nativa (por ejemplo, dominios constantes de la secuencia nativa humana) o variantes de la secuencia de aminoácidos de ellos.

El término "acoplamiento" tal como se emplea en la presente se refiere a los pasos necesarios para vincular los polipéptidos que contienen Fe primero y segundo entre sí, por ejemplo la formación de una unión covalente. Dichos pasos comprenden la reducción, recocción u oxidación de residuos cisteína en la región de bisagra de los polipéptidos que contienen Fe primero y segundo para formar una unión disulfuro entre las cadenas. El acoplamiento puede conseguirse mediante reticulación química o el uso de un sistema redox. Ver, por ejemplo, Humphreys y colaboradores, J. Immunol. Methods (1998) 217:1— 10, y Zhu y colaboradores, Cáncer Lett., (1994) 86: 127—134.

El término "anticuerpo multiespecífico" se emplea en el sentido más amplio y, específicamente, cubre un anticuerpo que tiene especificidad poliepitópica. Tales anticuerpos multiespecíficos incluyen, sin carácter restrictivo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada (VH) y un dominio variable de la cadena liviana (VL), donde la unidad VHVL tiene especificidad poliepitópica, anticuerpos que tienen dos o más dominios V|_ y VH donde cada unidad VHVL se une a un epítopo diferente, anticuerpos que tienen dos o más dominios variables simples donde cada dominio variable simple se une a un epítopo diferente, anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpos, tales como Fab, Fv, dsFv, scFv, diacuerpos, diacuerpos biespecíficos y triacuerpos, fragmentos de anticuerpos que se han unido de manera covalente o no covalente. "Especificidad poliepitópica" se refiere a la capacidad de unirse específicamente a dos o más epítopos diferentes en la misma diana o en dianas diferentes. Por "monoespecífico" se hace referencia a la capacidad de unirse sólo a un epítopo. Según una forma de realización de la invención, anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo de IgG que se une a cada epítopo con una afinidad de 5 µ? a 0.001 pM, 3 µ? a 0,001 pM, 1 µ? a 0,001 pM, 0,5 µ? a 0,001 p ó 0,1 µ? a 0,001 pM. Un dibujo ilustrativo de una biespecífico se consigna en la Figura 1B.

Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, con preferencia de unión con el antígeno o una región variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos (Db); diacuerpos en tándem (taDb), anticuerpos lineales (por ejemplo, la patente estadounidense número 5.641.870, concedida a Zapata y colaboradores: Protein Eng. 8(10):1057— 1062 (1995)); anticuerpos de un brazo, anticuerpos del dominio variable simple, minicuerpos, moléculas de anticuerpos de cadena simple, y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, incluyendo sin carácter restrictivo, Db— Fe, taDb— Fe, taDb— CH3 y (scFV)4— Fe). La expresión "anticuerpos de dominio simple" (sdAbs) o "anticuerpos de dominio variable simple (SVD)", en general, se refiere a anticuerpos donde un domino variable simple (VH Ó VL) puede conferir unión con el antígeno. En otras palabras, el dominio variable simple no necesita ¡nteractuar con otro dominio variable a fin de reconocer el antígeno diana. Los anticuerpos de dominio simple consiste de un dominio de anticuerpo variable monomérico simple (VH Ó VL) en cada brazo de unión con el antígeno. Los ejemplos de anticuerpos de domino simple incluyen los que derivan de camélidos (llamas y camellos) y peces cartilaginosos (por ejemplo, tiburón nodriza) y los que derivan de métodos recombinantes de anticuerpos humanos y ratones (Ward y colaboradores, Nature (1989) 341 :544— 546; Dooley y Flajnik, Dev Comp Immunol (2006) 30:43— 56; Muyldermans y colaboradores, Trend Biochem Sci (2001 ) 26:230—235; Holt y colaboradores, Trends Biotechnol (2003):21 :484— 490; la patente WO 2005/035572; la patente WO 03/035694; Davies y Riechmann, Febs Lett (1994) 339:285—290; la patente WO00/29004; y la patente WO 02/051870). Un anticuerpo de dominio variable simple puede encontrarse presente en un brazo de unión con el antígeno (por ejemplo, homo— ó hetera— multímero) con otras regiones variables o dominios variables, en cuyo caso no es un anticuerpo de dominio simple.

El término tecnología "botón en el ojal" o "KnH" (por sus siglas en inglés), tal como se lo menciona en la presente, se refiere a la tecnología que dirige el apareamiento de dos polipéptidos juntos in vitro o in vivo mediante la introducción de una protuberancia (botón) en un polipéptido y una cavidad (ojal) en el otro polipéptido en una interfaz en la cual interactúan. Por ejemplo, se han introducido KnH en las interfaces de unión Fc:Fc, interfaces CL:CH1 o ¡nterfaces VH/VL de los anticuerpos (por ejemplo, las patentes US2007/0178552, WO 96/027011 , WO 98/05043, y Zhu y colaboradores, (1997) Protein Science 6:781—788). Esto resulta especialmente útil para dirigir el apareamiento de dos cadenas pesadas diferentes durante la elaboración de anticuerpos multiespecíficos. Por ejemplo, los anticuerpos multiespecíficos que tienen KnH en sus regiones Fe también pueden comprender dominios variables simples unidos a cada región Fe, o también pueden comprender diferentes dominios variables de la cadena pesada que se aparea con dominios variables de la cadena liviana similares o diferentes. También se puede usar la tecnología KnH para aparear dos dominios extracelulares receptores diferentes o cualesquiera otras secuencias de polipéptidos que comprenden diferentes secuencias de reconocimiento diana diferentes (por ejemplo, incluso moléculas que sintetizan las funciones de los anticuerpos (affibodies), enlaces peptídicos y otras fusiones Fe).

"Fv" consiste de un dímero de un dominio de la región variable de la cadena pesada y uno de la cadena liviana en asociación estrecha y no— covalente. A partir del plegamiento de estos dos dominios emanan seis bucles hipervariables (3 bucles de cada cadena H y L) que contribuyen a los residuos de aminoácidos para la unión con el antígeno y confieren especificidad de unión con el antígeno al anticuerpo. Si embargo, aún un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende sólo tres CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, si bien a menudo con una menor afinidad que todo el sitio de enlace.

"Fv de cadena simple" que también se abrevia como "sFv" o "scFv" son fragmentos de anticuerpos que comprenden los dominios de anticuerpos VH y VL conectados en una única cadena de polipéptidos. Con preferencia, el polipéptido sFv también comprende un ligador polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite que el sFv forme la estructura conveniente para el enlace con el antígeno. Para consultar una revisión de sFv, ver Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, volumen I 1 13, Rosenburg and Moore eds., Springer— Verlag, New York, páginas 269— 315 (1994); Malmborg y colaboradores, J. Immunol. Methods 183:7—13, 1995.

El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos elaborados mediante la construcción de fragmentos sFv (ver el párrafo precedente) con ligadores cortos (alrededor de 5 a 10 residuos) entre los dominios VH y VL, de modo tal que se logre el apareamiento inter— cadena y no intra— cadena de los dominios V, lo cual da como resultado un fragmento bivalente, es decir el fragmento que tiene dos sitios de unión con el antígeno. Los diacuerpos biespecíficos son heterodímeros de dos fragmentos sFv "cruzados" donde los dominios VH y VL de los dos anticuerpos se encuentran presentes en diferentes cadenas de polipéptidos. Los anticuerpos biespecíficos se describen más ampliamente en, por ejemplo, las patentes EP 404,097; WO 93/11 161 ; y Hollinger y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444— 6448 (1993).

El término "anticuerpo de un brazo" o "anticuerpos de un brazo" se refiere a un anticuerpo que comprende (1 ) un domino variable unido mediante una unión peptídica a un polipéptido que comprende un dominio CH2, un dominio CH3 o un dominio CH2— CH3 y (2) un segundo dominio CH2, CH3 Ó CH2— CH3, donde un dominio variable no está unido mediante una unión peptídica a un polipéptido que comprende el segundo dominio CH2, Ch3 O CH2— CH3. En una forma de realización, el anticuerpo de un brazo comprende 3 polipéptidos: (1 ) un primer polipéptido que comprende un dominio variable (por ejemplo, VH), CH1 , CH2 y CH3; (2) un segundo polipéptido que comprende un dominio variable (por ejemplo, V|_) y un dominio O.; y (3) un tercer polipéptido que comprende un dominio CH2 y CH3. En otra forma de realización, el anticuerpo de un brazo tiene una región de bisagra parcial que contiene los dos residuos cisteína que forman uniones disulfuro que unen las cadenas pesadas constantes. En una forma de realización, los dominios variables del anticuerpo de un brazo forman una región de unión con el antígeno. En otra forma de realización, los dominios variables del anticuerpo de un brazo son dominios variables simples, donde cada dominio variable simple es una región de unión con el antígeno. En una forma de realización, el anticuerpo de un brazo es un anticuerpo de domino variable simple.

Los anticuerpos de la invención pueden ser anticuerpos "quiméricos" donde una porción de la cadena pesada o de la cadena liviana es idéntica u homologa a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie en particular o que pertenecen a una clase o subclase en particular de anticuerpo, mientras que el resto de la cadena es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, al igual que fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica buscada (patente estadounidense número 4.816.567; y Morrison y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81 :6851— 6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés en la presente incluyen anticuerpos primatizados que comprenden secuencias de unión con el antigeno de domino variable derivados de un primate no humano (por ejemplo, catarrino, simio, etc.), y secuencias de la región constante humanas.

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, roedores) son anticuerpos quiméricos que contienen secuencias mínimas derivadas del anticuerpo no humano. En la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en los cuales los residuos de una región hipervariable del receptor están reemplazados por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad de anticuerpo, afinidad y capacidad que se buscan. En algunas instancias, los residuos de la región de marco (FR) de la inmunoglobulina humana son reemplazados por los correspondientes residuos no humanos. Del mismo modo, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para retinar en mayor grado el desempeño del anticuerpo. En términos generales, el anticuerpo humanizado habrá de comprender sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, donde todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de la ¡nmunoglobulina no humana y todos o sustancialmente todos los RF son aquellos de una secuencia de ¡nmunoglobulina humana. De manera optativa, el anticuerpo humanizado también comprende al menos una porción de una región constante de ¡nmunoglobulina (Fe), típicamente la de una ¡nmunoglobulina humana. Para consultar mayores detalles, ver Jones y colaboradores, Nature 321 :522— 525 (1986); Riechmann y colaboradores, Nature 332:323—329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593—596 (1992).

"Enlace peptídico" o "enlaces peptídicos" se refiere a una fusión de péptidos generados de manera aleatoria con un dominio Fe. Ver la patente estadounidense número 6.660.843, emitida el 9 de diciembre de 2003 a Feige y colaboradores (que se incorpora íntegramente a la presente por referencia). Incluyen uno o más péptidos enlazados al extremo terminal N, al extremo terminal C, a las cadenas laterales de aminoácidos o a más de uno de estos sitios. La tecnología de los enlaces peptídicos permite el diseño de agentes terapéuticos que incorporan péptidos orientados a uno o más ligandos o receptores, péptidos de recirculación de tumores, péptidos transportadores de membranas, y demás similares. La tecnología de los enlaces peptídicos demostró ser útil en el diseño de una cantidad de dichas moléculas, incluso los péptidos lineales y restringidos por disulfuro, "multímeros peptídicos en tándem" (es decir, más de un péptido en una única cadena de un dominio Fe). Ver, por ejemplo, Patente estadounidense número 6.660.843; solicitud de patente estadounidense número 2003/0195156, publicada el 16 de octubre de 2003 (que corresponde a la patente WO 02/092620, publicada el 21 de noviembre de 2002); solicitud de patente estadounidense número 2003/0176352, publicada el 18 de septiembre de 2003 (que corresponde a la patente WO 03/031589, publicada el 17 de abril de 2003); solicitud estadounidense que lleva el número de serie 09/422.838, depositada el 22 de octubre de 1999 (que corresponde a la patente WO 00/24770, publicada el 4 de mayo de 2000); solicitud de patente estadounidense número 2003/0229023, publicada el 11 de diciembre de 2003; WO 03/057134, publicada el 17 de julio de 2003; solicitud de patente estadounidense número 2003/0236193, publicada el 25 de diciembre de 2003 (que corresponde a la PCT/US04/010989, depositada el 8 de abril de 2004); solicitud estadounidense que lleva el número de serie 10/666.480, depositada el 18 de septiembre de 2003 (que corresponde a la patente WO 04/026329, publicada el 1 de abril de 2004), cada una de las cuales se incorpora íntegramente a la presente por referencia.

"Moléculas que sintetizan las funciones de los anticuerpos (affibodies)" o "molécula que sintetiza las funciones de los anticuerpos" (affibody) se refiere al uso de una proteína unida por un enlace peptídico a una región Fe, donde la proteina se usa como un andamio para proporcionar una superficie de unión para una molécula diana. A menudo, la proteína es una proteína natural, tal como una proteína del estafilococo A o domino B de unión con la IgG, o la proteína Z que deriva de ellos (ver Nilsson y colaboradores,(1987), Prot Eng 1 , 107— 133, y la patente estadounidense número 5.143.844) o un fragmento o derivado de ellos. Por ejemplo, los affibodies pueden crearse a partir de variantes de proteínas Z que tienen afinidad de unión alterada hacia las moléculas diana, donde un segmento de la proteína Z se ha mutado mediante mutagénesis aleatoria para crear una biblioteca de variantes capaces de unirse a una molécula diana. Los ejemplos de affibodies incluyen la patente estadounidense número 6.534.628, Nord K y colaboradores, Prot Eng 8:601— 608 (1995), como así también Nord K y colaboradores, Nat Biotech 15:772—777 (1997). Biotechnol Appl Biochem. 2008 Jun;50(Pt 2):97— 112.

Tal como se lo emplea en la presente, el término "inmunoadhesina" designa moléculas que combinan la especificidad de unión de una proteína heteróloga (una "adhesina") con funciones efectoras de dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de aminoácidos con una especificidad de unión deseada, dicha secuencia de aminoácidos es diferente del sitio de reconocimiento y unión del antígeno de un anticuerpo (es decir, es "heteróloga" en comparación con una región constante de un anticuerpo) y una secuencia del dominio constante de una inmunoglobulina (por ejemplo, secuencia CH2 y CH3 de una IgG). Los ejemplos de secuencias de adhesina incluyen secuencias de aminoácidos contiguos que comprenden una porción de un receptor o un ligando que se une a una proteína de interés. Las secuencias de adhesina también pueden ser secuencias que se unen a una proteína de interés, pero no son secuencias receptoras ni ligandos (por ejemplo, secuencias de adhesinas en enlaces peptídicos). Dichas secuencias de polipéptidos pueden seleccionarse o identificarse a través de varios métodos, incluso las técnicas de exhibición en fago y métodos de clasificación de alto rendimiento. La secuencia de dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina puede obtenerse a partir de cualquier inmunoglobulina, tal como los subtipos lgG1 , lgG2, lgG3 o lgG4, IgA (incluso lgA1 e lgA2), IgE, IgD ó IgM. "Complejo" o "que forma complejo", tal como se emplea en la presente, se refiere a la asociación de dos o más moléculas que interactúan entre sí a través de uniones o fuerzas (por ejemplo, fuerzas de van der Waals, hidrófobas o hidrófilas) que no son uniones peptídicas. En una forma de realización, el complejo es heteromultimérico. Cabe comprender que el término "complejo de proteínas" o "complejo de polipéptidos", tal como se lo emplea en la presente, incluye complejos que tienen entidad no proteica conjugada a una proteína en el complejo proteico (por ejemplo, incluyendo sin carácter restrictivo, moléculas químicas, tales como toxinas o un agente de detección).

Una proteína heteromultimérica de la presente invención "que une un antígeno de interés" es la que une la diana con suficiente afinidad, de modo que la proteína heteromultimérica es útil como agente de diagnóstico o terapéutico en la orientación hacia una proteína o una célula o tejido que expresa la diana, y no tiene una reacción cruzada significativa con otras proteínas. En dichas formas de realización el grado de unión de la proteína heteromultimérica a una proteína "no diana" será de menos del 10%, aproximadamente, de la unión del anticuerpo a su proteína diana en particular, según se determina mediante un ensayo de separador de células activado por fluorescencia (FACS, por su sigla en inglés), radioinmunoprecipitación (RIA) o ELISA. Con respecto a la unión de una proteína heteromultimérica a una molécula diana, el término "unión específica" o "que específicamente se une a" o que es "específico para" un polipéptido particular o un epítopo en una diana de polipéptido particular significa que es mensurablemente diferente de una interacción no específica (por ejemplo, una interacción no específica puede ser unión a albúmina de suero bovino o caseína). La unión específica se puede medir, por ejemplo, al determinar la unión de una molécula comparada con la unión de una molécula de control. Por ejemplo, la unión específica se puede determinar mediante la competencia con una molécula de control que es similar a la diana, por ejemplo, un exceso de diana no marcada. En este caso, la unión específica se indica si la unión de la diana marcada a una sonda es inhibida de manera competitiva por el exceso de diana no marcada. El término "unión específica" o "que específicamente se una a" o "es específico para" un polipéptido en particular o un epítopo en una diana polipeptídica en particular tal como se emplea en la presente, puede exhibirse, por ejemplo, a través de una molécula que tiene una Kd para la diana de, al menos, alrededor de 200 nM, como alternativa de, al menos, alrededor de 150 nM, como alternativa de, al menos, alrededor de 100 nM, como alternativa de, al menos, alrededor de 60 nM, como alternativa de, al menos, alrededor de 50 nM, como alternativa de, al menos, alrededor de 40 nM, como alternativa de, al menos, alrededor de 30 nM, como alternativa de, al menos, alrededor de 20 nM, como alternativa de, al menos, alrededor de 10 nM, como alternativa de, al menos, alrededor de 8 nM, como alternativa de, al menos, alrededor de 6 nM, como alternativa de, al menos, alrededor de 4 nM, como alternativa de, al menos, alrededor de 2 nM, como alternativa de, al menos, alrededor de 1 nM, o mayor. En una forma de realización, el término "unión específica" se refiere a la unión donde una proteína heteromultimérica se une a un polipéptido particular o un epítopo en un polipéptido en particular sin unirse sustancialmente a ningún otro polipéptido o epítopo de polipéptido.

"Afinidad de unión", en general, se refiere a la fortaleza de la suma total de interacciones no covalentes entre un sitio de enlace simple de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su socio de unión (por ejemplo, un antígeno). Salvo que se indique lo contrario, tal como se lo emplea en la presente, "afinidad de unión" se refiere a afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1 :1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X para su socio Y puede representarse generalmente mediante la constante de disociación (Kd). Por ejemplo, la Kd puede ser de alrededor de 200 nM, 150 nM, 100 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 8 nM, 6 nM, 4 nM, 2 nM, 1 nM o más fuerte. La afinidad se puede medir a través de métodos comunes conocidos en la técnica, incluso los que se describen en la presente. Los anticuerpos de baja afinidad, por lo general, se unen al antígeno lentamente y tienden a disociarse fácilmente, mientras que los anticuerpos de alta afinidad, por lo general, se unen al antígeno a mayor velocidad y tienden a permanecer unidos durante un período más prolongado. Una variedad de métodos para medir la afinidad de unión son conocidos en la técnica, y se puede utilizar cualquiera a los fines de la presente invención.

En una forma de realización, la "Kd" o "valor de Kd" según la presente invención se mide usando ensayos de resonancia de plasmones superficiales con el empleo de un aparato BIAcoreTM— 2000 o un BIAcore™— 3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a una temperatura de 25°C con diana inmovilizada (por ejemplo, antígeno), chips CM5 a 10 unidades de respuesta (RU, por sus siglas en inglés), aproximadamente. Brevemente, los chips bisensores carboximetilados (CM5, de BIAcore, Inc.), se activan con clorhidrato de N— etil— N'— (3— dimetilaminopropil)— carbodiimida (EDC) y N— hidroxisuccinimida (NHS) según las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con 10 mM de acetato de sodio, a pH 4,8, en 5 pg/ml (~0.2µ?) antes de la inyección en un caudal de 5 µ?/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de proteína acoplada. Después de la inyección de antígeno, se inyecta etanolamina (1 M) para bloquear los grupos no reaccionados. Para las mediciones cinéticas, se inyectan diluciones dobles en serie de Fab (por ejemplo, 0,78 nM a 500 nM) en PBS con 0,05% de Tween 20 (PBST) a una temperatura 25°C en un caudal de aproximadamente 25 µ?/min. Las tasas de asociación (kon) y las tasas de disociación (koff) se calculan usando un modelo de unión uno a uno de Langmuir (software de evaluación BIAcore, versión 3.2), mediante la adecuación simultánea del sensograma de asociación y disociación. La constante de disociación en equilibrio (Kd, por sus siglas en inglés) se calcula como la proporción koff kon- Ver, por ejemplo, Chen y colaboradores, J. Mol. Biol. 293:865—881 (1999). Si en la tasa de la constante de afinidad excede de 106 M— 1 S— mediante el ensayo de resonancia de plasmones superficiales indicado previamente, la tasa de la constante de afinidad puede determinarse usando una técnica de templado fluorescente que mida el aumento o la disminución en la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación 295 nm; emisión = 340 nm; paso de banda 16 nm), a una temperatura de 25°C de un anticuerpo anti— antígeno (forma Fab) de 20 nM en PBS, a pH 7,2, en la presencia de crecientes concentraciones de antígeno medido en un espectrómetro, tal como un espectrómetro equipado con detención de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM serie 8000 (ThermoSpectronic) con cubeta agitada.

"Biológicamente activo", "actividad biológica" y "características biológicas" con respecto a una proteína heteromultimérica de la presente invención, tal como un anticuerpo, fragmento o derivado de ésta significa que tiene la capacidad de unirse a una molécula biológica, salvo que se especifique lo contrario.

"Aislado", cuando se usa para describir los diversos polipéptidos heteromultiméricos significa un heteromultímero que ha sido separado y recuperado de una célula o un cultivo celular a partir del cual se expresa. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interfieren con los usos diagnósticos o terapéuticos del heteromultímero, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no— proteináceos. En ciertas formas de realización, el heteromultímero se purificará (1 ) en un grado mayor que el 95% en peso de la proteína según se determina a través del método de Lowry, y con la máxima preferencia en un grado mayor que el 99% en peso; (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos internos mediante el uso de un secuenciador de taza giratoria ; o (3) hasta la homogeneidad mediante SDS— PAGE [electroforesis en gel de poliacrilamida] en condiciones reductoras o no— reductores con el empleo de azul de Coomassie o, con preferencia, tinción de plata. Sin embargo, lo frecuente es que el polipéptido aislado se elabore mediante un paso de purificación, como mínimo.

En general, los heteromultímeros de la presente invención se purifican hasta obtener una homogeneidad sustancial. Las frases "sustancialmente homogéneo", "forma sustancialmente homogénea" y "homogeneidad sustancial" se utilizan para indicar que el producto está sustancialmente desprovisto de subproductos originados a partir de combinaciones de polipéptidos no deseables (por ejemplo, homomultímeros).

Expresado en términos de pureza, homogeneidad sustancial significa que la cantidad de subproductos no excede el 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 4%, 3%, 2% ó 1% en peso o es menos del 1 % en peso. En una forma de realización, el subproducto está por debajo del 5%.

"Molécula biológica" hace referencia a un ácido nucleico, una proteína, un carbohidrato, un lípido y sus combinaciones. En una forma de realización, la molécula biológica existe en la naturaleza.

Por "unido" o "uniones", tal como se emplea en la presente, significa una ligadura de unión a péptido directo entre una primera y una segunda secuencia de aminoácidos o una ligadura que implica una tercera secuencia de aminoácidos que está unido mediante péptido a— y entre— las secuencias de aminoácidos primera y segunda. Por ejemplo, un péptido ligador unido al extremo C terminal de una secuencia de aminoácidos y al extremo N terminal de la otra secuencia de aminoácidos.

Por "ligador", tal como se lo emplea en la presente, se indica una secuencia de aminoácidos de dos o más aminoácidos de longitud. El ligador puede consistir de aminoácidos polares o no polares neutros. Un ligador puede tener, por ejemplo, una longitud de entre 2 y 100 aminoácidos, tal como una longitud de entre 2 y 50 aminoácidos, por ejemplo una longitud de 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 aminoácidos. Un ligador pede ser "clivable", por ejemplo mediante clivado automático, clivado enzimático o químico. Los sitios de clivado en secuencias de aminoácidos, enzimas y sustancias químicas que se clivan en tales sitios son bien conocidos en la técnica y también se describen en la presente.

Tal como se lo emplea en la presente, enlace significa un ligador de aminoácidos que une otras dos secuencias de aminoácidos. Un enlace que se describe en la presente puede ligar los extremos N terminales de un dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina con el extremo C terminal de un dominio constante de la cadena liviana de inmunoglobulina. En formas de realización en particular, un enlace tiene una longitud de entre 15 y 50 aminoácidos, por ejemplo, una longitud de entre 20 y 26 aminoácidos (por ejemplo, una longitud de 20, 21, 22, 23, 24, 25 ó 26 aminoácidos). Un enlace puede ser "clivable", por ejemplo mediante clivado automático o clivado enzimático o químico usando los métodos y reactivos que son de uso habitual en la técnica.

El clivado enzimático de un "ligador" o de un "enlace" puede implicar el uso de una endopeptidasa, tal como por ejemplo Lys— C, Asp— N, Arg— C, V8, Glu— C, quimiotripsina, tripsina, pepsina, papaína, trombina, Generasa, Factor Xa, TEV (proteasa de cisteína del virus del tabaco), enteroquinasa, HRV C3 (proteasa C3 del rinovirus humano), quininogenasa, al igual que convertasas de proproteínas similares a subtilinsina (por ejemplo, Furin (PC1 ), PC2, ó PC3) o convertasa dibásica de N— arginina. El olivado químico puede involucrar el uso de, por ejemplo, hidroxilamina, N— clorosuccinimida, N— bromosuccinimida o bromuro de cianógeno.

Un "sitio de olivado de endopeptidasa Lys— C" tal como se lo emplea en la presente es un residuo lisina en una secuencia de aminoácidos que se puede clivar en el lado C terminal mediante endopeptidasa Lys— C. La endopeptidasa Lys— C se diva en el lado C terminal de un residuo lisina.

Por "agente caotrópico" se entiende una sustancia hidrosoluble que perturba la estructura tridimensional de una proteína (por ejemplo, un anticuerpo) al interferir con las interacciones intramoleculares estabilizantes (por ejemplo, uniones de hidrógeno, fuerzas de van der Waals o efectos hidrófobos). Los agentes caotropicos de ejemplo incluyen, sin carácter restrictivo, urea, clorhidrato de guanidina, perclorato de litio, histidina y arginina.

Por un "detergente suave" se entiende una sustancia hidrosoluble que perturba la estructura tridimensional de una proteína (por ejemplo, un anticuerpo) mediante la interferencia con interacciones intramoleculares estabilizantes (por ejemplo, uniones de hidrógeno, fuerzas de van der Waals o efectos hidrófobos), pero que no perturba de manera permanente la estructura de proteínas de modo de provocar una pérdida de actividad biológica (es decir, no desnaturaliza la proteína). Los ejemplos de detergentes suaves incluyen, sin carácter restrictivo, Tween (por ejemplo, Tween— 20), Tritón (por ejemplo, Tritón X— 100), NP— 40 (fenoxilpolietoxiletanol de nonilo), Nonidet P— 40 (fenoxilpolietoxiletanol de octilo), al igual que sulfato de sodio y dodecilo (SDS).

Por "funciones efectoras" del anticuerpo se hace referencia a aquellas actividades biológicas que se pueden atribuir a la región Fe (una región Fe de la secuencia nativa o una región Fe variante de la secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo, y que varía con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras del anticuerpo incluyen: Unión C1q y citotoxicidad dependiente del complemento; unión al receptor Fe; citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo (ADCC); fagocitosis, regulación descendente de receptores de la superficie celular.

Citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo o "ADCC" se refiere a una forma de toxicidad en la cual la Ig secretada unida a receptores Fe (RcRs) se presenta en ciertas células citotóxicas (por ejemplo, células asesinas naturales (NK, por sus siglas en inglés), neutrófilos y macrófagos) permiten que estas células efectoras se unan específicamente a una célula diana que porta el antígeno y, posteriormente, matan la célula diana con agentes cítotóxicos. Los brazos de anticuerpos son células citotóxicas y son absolutamente esenciales para tal asesinato. Las células primarias para mediar la ADCC, células NK, expresan solamente FCYRIII, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FCYRII y FCYRIII. La expresión de FcT sobre células hematopoyéticas se sintetizan en la tabla 3 de la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457— 92 (1991 ). Para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés, se puede llevar a cabo un ensayo ADCC in vitro, tal como el que se describe en la patente estadounidense número 5.500.362 o número 5.821.337. Las células efectoras de utilidad para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) y células asesinas naturales (NK). Como alternativa o de manera adicional, la actividad ADCC de la molécula de interés puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal, tal como el que se revela en Clynes y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:652—656 (1998). "Receptor Fe" o "FcR" describe un receptor que se une a la región Fe de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano. Sumado a ello, un FcR preferido es uno que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRIl y FcyRIII, incluso variantes alélicas y formas alternativamente empalmadas de estos receptores. Los receptores FcyRIl incluyen FcyRI IA (un "receptor activador") y FcyRI IB (un "receptor inhibidor"), que tiene secuencias de aminoácidos similares que difieren primariamente en sus dominios citoplásmicos. El receptor activador FcyRIIA contiene un motivo de activación basado en tirosina de inmunoreceptor (ITAM, por sus siglas en inglés) en su dominio citoplásmico. El receptor inhibidor FcyRIIB contiene un motivo de inhibición basado en tirosina de inmunoreceptor (ITIM, por sus siglas en inglés) en su dominio citoplásmico (consultar la revisión de M. Daéron, Annu. Rev. Immunol. 15:203—234 (1997)). Los FcRs se revisan en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457— 492 (1991); Capel y colaboradores, Immunomethods 4:25— 34 (1994) ; al igual que de Haas y colaboradores, J. Lab. Clin. Med. 126:330— 41 (1995) . Otros FcRs, incluidos los que se habrán de identificar en el futuro, quedan comprendidos en el término "FcR". El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgGs de la madre al feto (Guyer y colaboradores, J. Immunol. 117:587 (1976), y Kim y colaboradores, J. Immunol. 24:249 (1994)).

Las "células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno ó más FcRs y realizan funciones efectoras. Con preferencia, las células expresan al menos FCYRIII y realizan función efectora de ADCC. Los ejemplos de leucocitos humanos que median la ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células asesinas naturales (NK), monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos, siendo las PBMC y las NK las que se prefieren. Las células efectoras pueden aislarse de una fuente natural, por ejemplo de la sangre.

"Citotoxicidad dependiente de complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de una célula diana en la presencia de un complemento. La activación de la vía de complemento clásica se inicia con la unión del primer componente del sistema de complementos (C1q) a anticuerpos (de la subclase apropiada) que están unidos a su antígeno cognado. Para evaluar la activación de complemento, se puede realizar un ensayo de CDC, por ejemplo de la manera que describen Gazzano— Santero y colaboradores, J. Immunol. Methods 202:163 (1996).

El término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o derivado para tratar una enfermedad o trastorno en un sujeto. En el caso de un tumor (por ejemplo, un tumor cancerígeno), la cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o fragmento de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo multiespecífico o fragmento de anticuerpo) puede reducir la cantidad de células cancerígenas; reducir el tamaño del tumor primario; inhibir (es decir, retardar en alguna medida y, con preferencia, detener) la infiltración de células cancerígenas en órganos periféricos; inhibir (es decir, retardar en alguna medida y, con preferencia, detener) la metástasis del tumor; inhibir, en alguna medida, el crecimiento del tumor o aliviar en alguna medida uno o más de los síntomas asociados con el trastorno. En la medida en que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo pueda prevenir el crecimiento o el exterminio de las células cancerígenas existentes, puede ser citostático o citotóxico. Para el tratamiento contra el cáncer, la eficacia in vivo puede medirse, por ejemplo, mediante la evaluación de la duración de la sobrevida, el tiempo hasta la progresión de la enfermedad (TTP, por sus siglas en inglés), las tasas de respuesta (RR, por sus siglas en inglés), la duración de la respuesta o la calidad de vida.

Por "reducir o inhibir" se entiende la capacidad de causar una disminución general, con preferencia del 20% o mayor, con mayor preferencia 50% o mayor, y con la mayor de las preferencias del 75%, 85%, 90%, 95%, o mayor. Reducir o inhibir puede referirse a los síntomas del trastorno que se está tratando, la presencia o el tamaño de la metástasis, el tamaño del tumor primario, o el tamaño o número de los vasos sanguíneos en trastornos angiogénicos.

Los términos "cáncer" y "cancerígeno" hacen referencia o describen la condición fisiológica en mamíferos que, típicamente, se caracteriza por el crecimiento/proliferación celular no regulado. En esta definición se incluyen los cánceres benignos y malignos. Entre los ejemplos de cáncer se incluyen, sin limitación, carcinoma, linfoma, sarcoma, blastema y leucemia. Los ejemplos más concretos de este tipo de cáncer incluyen cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma escamoso de pulmón, cáncer de peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago incluyendo el cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, glioma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma de endometrio o de útero, carcinoma de la glándula salival, cáncer de riñon (por ejemplo, carcinoma de células renales), cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma de pene, melanoma y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello. Por "cáncer en etapa temprana" se entiende un tipo de cáncer que no es invasivo o metastásico, o bien se clasifica como estadio 0, I o II del cáncer. El término "precanceroso" se refiere a una condición o un crecimiento que, típicamente, precede o se convierte en un cáncer. Por "no metastásico" se entiende un cáncer que es benigno o que permanece en el sitio primario y no ha penetrado en el sistema linfático, en el sistema de vasos sanguíneos o tejidos que no sean el sitio primario. Por lo general, un tipo de cáncer no metastático es cualquier tipo de cáncer que se encuentra un estadio 0, I ó II del cáncer y, en ocasiones, un cáncer en estadio III.

Un "trastorno alérgico o inflamatorio" en este documento hace referencia a una enfermedad o un trastorno que resulta de una hiper— activación del sistema inmune de un individuo. Los ejemplos de trastornos alérgicos o inflamatorios incluyen, pero no se limitan a, el asma, la psoriasis, la artritis reumatoide, la dermatitis atópica, la esclerosis múltiple, el lupus eritematoso sistémico, el eccema, el trasplante de órganos, la degeneración macular relacionada con la edad, la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa, la esofagitis eosinofílica y las enfermedades autoinmunes asociadas con la inflamación.

Una "enfermedad auto inmune" en este documento es una enfermedad o un trastorno derivado de— y dirigido contra— los propios tejidos de un individuo o uno de sus co— segregados o manifestación, o bien que son una afección derivada de dicha de enfermedad. Los ejemplos de enfermedades o trastornos autoinmunes incluyen, pero no se limitan a: artritis (artritis reumatoide, tales como la artritis aguda, artritis reumatoide crónica, artritis gotosa, artritis gotosa aguda, artritis inflamatoria crónica, artritis degenerativa, artritis infecciosa, artritis de Lyme, artritis proliferativa, artritis psoriásica, artrosis vertebral, y artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis crónica progrediente, artritis deformante, poliartritis crónica primaria, artritis reactiva y espondilitis anquilosante), enfermedades de la piel inflamatorias hiperproliferativas, psoriasis, tales como psoriasis en placas, psoriasis en gota, psoriasis pustulosa y psoriasis de las uñas, dermatitis incluida la dermatitis por contacto, dermatitis por contacto crónica, dermatitis alérgica, dermatitis por contacto alérgica, dermatitis herpetiforme y la dermatitis atópica, síndrome de hiper IgM ligado al cromosoma X, urticaria, tales como urticaria crónica alérgica y urticaria idiopática crónica, incluyendo la urticaria crónica auto inmune, polimiositis/dermatomiositis, dermatomiositis juvenil, necrolisis epidérmica tóxica, esclerodermia (incluyendo la esclerodermia sistémica), esclerosis tales como la esclerosis sistémica, la esclerosis múltiple (EM), como la EM espino— óptica, EM progresiva primaria (EMPP) , y la EM remitente— recidivante (EMRR), esclerosis sistémica progresiva, aterosclerosis, arteriesclerosis, esclerosis diseminada y esclerosis atáxica, enfermedad inflamatoria intestinal (Ell) (por ejemplo, enfermedad de Crohn, enfermedades gastrointestinales mediadas por enfermedades autoinmunes, colitis, tales como la colitis ulcerativa, colitis ulcerosa, colitis microscópica, colitis colágena, colitis poliposa, enterocolitis necrotizante y colitis transmural, y la enfermedad auto inmune inflamatoria del intestino), pioderma gangrenoso, eritema nudoso, colangitis esclerosante primaria, episcleritis), síndrome de dificultad respiratoria, incluyendo el síndrome de dificultad respiratoria aguda o del adulto (SDRA), meningitis, inflamación de la totalidad o parte de la coroiditis úvea, iritis, enfermedad hematológica auto inmune, espondilitis reumatoide, pérdida repentina de la audición, enfermedades mediadas por IgE, tales como la anafilaxia y la rinitis alérgica y atópica, encefalitis tales como encefalitis de Rasmussen y encefalitis límbica o del tronco cerebral, uveítis, tales como la uveítis anterior, uveítis anterior aguda, uveítis granulomatosa, uveítis no granulomatosa, uveítis facoantigénica, uveítis posterior o uveítis auto inmune, glomerulonefritis (GN) con y sin síndrome nefrótico, como glomerulonefritis crónica o aguda, como GN primaria, GN mediada inmunológicamente, GN membranosa (nefropatía membranosa), GN membranosa idiopática o nefropatía membranosa idiopática, GN proliferativa membrano o membranosa (GNMP), incluidas los de tipo I y tipo II, y GN rápidamente progresiva, afecciones alérgicas, reacciones alérgicas, eczema incluyendo eczema alérgico o atópico, asma, tal como asma bronquial, asma bronquial y asma auto— inmune, las afecciones que implican la infiltración de células T y respuestas inflamatorias crónicas, enfermedad pulmonar inflamatoria, miocarditis auto inmune, deficiencia de adhesión de los leucocitos, lupus eritematoso sistémico (LES) o lupus eritematoso sistémico como el LES cutáneo, lupus eritematoso cutáneo subagudo, síndrome de lupus neonatal (NLE), lupus eritematoso diseminado, lupus (incluyendo nefritis, cerebritis, pediátrica, no renal, extra— renal, discoide, alopecia), de inicio juvenil (tipo I), incluyendo la diabetes mellitus, diabetes mellitus pediátrica diabetes insulino— dependiente (DMID), diabetes mellitus del adulto (diabetes de tipo II), diabetes auto inmune, diabetes insípida idiopática, respuestas inmunes asociadas con hipersensibilidad aguda y retrasada mediada por citocinas y los linfocitos T, tuberculosis, sarcoidosis, granulomatosis incluyendo granulomatosis linfomatoide, granulomatosis de Wegener, agranulocitosis, vasculitis, incluyendo vasculitis (incluyendo vasculitis de vasos grandes (incluyendo polimialgia reumática y arteritis de células gigantes (Takayasu)), vasculitis de vasos medianos (incluyendo la enfermedad de Kawasaki y la poliarteritis nodosa), poliarteritis microscópica, vasculitis del SNC, vasculitis necrotizante, cutánea o por hipersensibilidad, vasculitis necrotizante sistémica y vasculitis asociada a ANCA, como la vasculitis o el síndrome de Churg— Strauss (CSS, por su siglas en inglés)), arteritis temporal, anemia aplásica, anemia aplásica auto inmune, anemia positiva de Coombs, anemia de Diamond Blackfan, anemia hemolítica o anemia hemolítica inmune incluyendo anemia hemolítica auto inmune (AHA), la anemia perniciosa, enfermedad de Addison, anemia o aplasia pura de glóbulos rojos (AEP), deficiencia de factor VIII, hemofilia A, neutropenia auto inmune, pancitopenia, leucopenia , enfermedades que implican diapedesis de leucocitos, trastornos del sistema nervioso central inflamatorias, síndrome de múltiples lesiones de órganos tales como los secundarios a septicemia, traumatismo o hemorragia, enfermedades mediadas por complejo antígeno— anticuerpo, enfermedad de la membrana basal anti— glomerular, síndrome de anticuerpos anti— fosfolípidos, neuritis alérgica, enfermedad de Bechet o de Behcet, síndrome de Castleman, síndrome de Goodpasture, síndrome de Raynaud, síndrome de Sjógren, síndrome de Stevens— Johnson, penfigoide tal como penfigoide ampolloso y penfigoide de la piel, pénfigo (incluyendo pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, penfigoide el pénfigo mucosa— membrana y pénfigo eritematoso), poliendocrinopatías autoinmunes, enfermedad o síndrome de Reiter, nefritis compleja inmune, nefritis mediada por anticuerpos, neuromielitis óptica, polineuropatías, neuropatía crónica como polineuropatías IgM o neuropatía mediada por IgM, trombocitopenia (desarrollada por los pacientes con infarto de miocardio, por ejemplo), Incluyendo púrpura trombocitopénica trombótica (TTP, por sus siglas en inglés) y trombocitopenia auto inmune o inmuno— mediada, como la púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), incluyendo la PTI crónica o aguda, enfermedad auto inmune del testículo y ovario incluyendo la orquitis auto inmune y ooforitis, hipotiroidismo primario, hipoparatiroidismo, enfermedades autoinmunes endocrinas como la tiroiditis, tal el caso de la tiroiditis auto inmune, la enfermedad de Hashimoto, tiroiditis crónica (tiroiditis de Hashimoto), o la tiroiditis subaguda, enfermedad tiroidea auto inmune, hipotiroidismo idiopatico, enfermedad de Graves, síndromes poliglandulares como síndromes poliglandulares autoinmunes (o síndromes de endocrinopatía poliglandular), síndromes paraneoplásicos, incluyendo síndromes paraneoplásicos neurológicos como el síndrome miasténico de Lambert— Eaton o el síndrome de Eaton— Lambert, síndrome de hombre rígido o de persona rígida, encefalomielitis, tales como encefalomielitis alérgica o encefalomielitis alérgica y encefalomielitis alérgica experimental (EAE), miastenia grave tal como miastenia gravis relacionada con timoma, degeneración cerebelosa, neuromiotonía, síndrome opsoclono u opsoclono— mioclono (OMS, por sus siglas en inglés) y neuropatía sensorial, neuropatía motora multifocal, síndrome de Sheehan, hepatitis auto inmune, hepatitis crónica, hepatitis lupoide, hepatitis de células gigantes, hepatitis crónica activa o hepatitis auto inmune crónica activa, neumonitis intersticial linfoide, bronquiolitis obliterante (no trasplante) frente a neumonía intersticial no específica, síndrome de Guillain— Barré, enfermedad de Berger (nefropatía por IgA), nefropatía por IgA idiopática, dermatosis lineal por IgA, cirrosis biliar primaria, pneumonocirrosis, síndrome de enteropatía auto inmune, enfermedad celíaca, celiaquía, esprúe celíaco (enteropatía por gluten), esprúe refractario, esprúe idiopático, crioglobulinemia, esclerosis amilotrófica lateral (ALS; enfermedad de Lou Gehrig), enfermedad arterial coronaria, enfermedad auto inmune del oído, tal como la enfermedad auto inmune del oído interno (EAOI ), pérdida de la audición auto inmune, síndrome opsoclono— mioclono (OMS, por sus siglas en inglés), policondritis tal como policondritis refractaria o en recaída, proteinosis alveolar pulmonar, amiloidosis, escleritis, una linfocitosis son cancerosa, una linfocitosis primaria, que incluye linfocitosis monoclonales de células B (por ejemplo, gammapatía monoclonal benigna y garnmopatía monoclonal de significación no determinada, la GMSI), neuropatía periférica, síndrome paraneoplásico, canalopatías como la epilepsia, migraña, arritmia, trastornos musculares, sordera, ceguera, parálisis periódica, y canalopatías del SNC, autismo, miopatía inflamatoria, la glomerulosclerosis focal y segmentaria (GEFS), oftalmopatía endocrina, uveorretinitis, trastorno de coriorretinitis, trastorno hepatológico auto inmune, fibromialgia, insuficiencia endocrina múltiple, síndrome de Schmidt, adrenalitis, atrofia gástrica, demencia presenil, enfermedades desmielinizantes, tales como enfermedades autoinmunes desmielinizantes, nefropatía diabética, síndrome de Dressier, alopecia areata, síndrome CREST (calcinosis, fenómeno de Raynaud, dismotilidad esofágica, esclerodactilia y telangiectasias), infertilidad masculina y femenina auto inmune, enfermedad mixta del tejido conectivo, mal de Chagas, fiebre reumática, aborto recurrente, pulmón de granjero, eritema multiforme, síndrome de post— cardiotomía, síndrome de Cushing, pulmón de pajarero, angiítis granulomatosa alérgica, angiítis linfocítica benigna, síndrome de Alport, alveolitis como alveolitis alérgica y alveolitis fibrosante, enfermedad pulmonar intersticial, reacción a la transfusión, lepra, malaria, leishmaniasis, kypanosomiasis, esquistosomiasis, la ascariasis, la aspergilosis, el síndrome de Sampter, el síndrome de Caplan, el dengue, la endocarditis, la fibrosis endomiocárdica, fibrosis pulmonar intersticial difusa, fibrosis pulmonar intersticial, la fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis quística, la endoftalmitis, eritema elevatum et diutinum, eritroblastosis fetal, fascitis eosinofílica, síndrome de Shulman, síndrome de Felty, flariasis, ciclitis como ciclitis crónica, heterocrónicos ciclitis, iridociclitis, o ciclitis Fuch, púrpura de Henoch— Schonlein, el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), la infección por virus ECHO, la miocardiopatía, enfermedad de Alzheimer, la infección por parvovirus, la infección por virus de la rubéola, síndromes pos— vacunación, la infección de rubéola congénita, virus de Epstein— Barr, la parotiditis, síndrome de Evan, falla gonadal auto inmune, la corea de Sydenham, la nefritis post estreptocócica, ubiterans tromboangitis, tirotoxicosis, tabes dorsal, coroiditis, polimialgia de células gigantes, oftalmopatía endocrina, la neumonitis por hipersensibilidad crónica, queratoconjuntivitis seca, queratoconjuntivitis epidémica, el síndrome nefrótico idiopático, la nefropatía de cambios mínimos, lesión benigna familiar y por isquemia— reperfusión, la autoinmunidad de retina, inflamación de las articulaciones, la bronquitis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, silicosis , aftas, estomatitis aftosa, trastornos arterioscleróticos, espermatogenese, hemolisis auto inmune, la enfermedad de Boeck, crioglobulinemia, la contractura de Dupuytren, endoftalmia facoanafiláctica, enteritis alérgica, eritema nudoso leproso, parálisis facial idiopática, síndrome de fatiga crónica, fiebre reumática, enfermedad de Hamman— Rich, pérdida de la audición sensoneural, hemoglobinuria paroxismática, hipogonadismo, ileítis regional, leucopenia, mononucleosis infecciosa, mielitis transversal, primaria mixedema idiopático, nefrosis, la oftalmía simpática, orquitis granulomatosa, pancreatitis, polirradiculitis aguda, pioderma gangrenosa, tiroiditis de des Quervain, espénica adquirida, infertilidad debida a los anticuerpos contra los espermatozoides, timoma no maligna, el vitíligo, SCID y enfermedades asociadas al virus de Epstein— Barr, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), enfermedades parasitarias, como la Leishmania, síndrome de shock tóxico, intoxicaciones alimentarias, las afecciones que implican la infiltración de células T, deficiencia por adhesión de leucocitos, las respuestas inmunes asociadas con hipersensibilidad aguda y retardada mediada por citoquinas y linfocitos T, las enfermedades que implican diapédesis de leucocitos, el síndrome de lesión de órganos múltiples, enfermedades mediadas por el complejo antígeno— anticuerpo, enfermedad de la membrana basal antiglomerular, la neuritis alérgica, poliendocrinopatías autoinmunes, ooforitis, mixedema primaria, la gastritis atrófica auto inmunitaria, oftalmía simpática, enfermedades reumáticas, enfermedad mixta del tejido conectivo, síndrome nefrótico, insulitis, insuficiencia poliendocrina, neuropatía periférica, síndrome de tipo auto inmune poliglandular I, hipoparatiroidismo idiopático de aparición en el adulto (AOIH, por sus siglas en inglés), alopecia total, la miocardiopatía dilatada, epidermolisis ampollosa adquirida (EBA, por sus siglas en inglés), la hemocromatosis, la miocarditis, síndrome nefrótico, colangitis esclerosante primaria, la sinusitis purulenta o no purulenta, sinusitis aguda o crónica, sinusitis etmoidal, frontal, maxilar o esfenoidal, un trastorno relacionado con eosinófilos, como la eosinofilia, infiltración pulmonar, eosinofilia, síndrome de eosinofilia— mialgia, síndrome de Loffler, neumonía eosinófila crónica, eosinofilia pulmonar tropical, aspergilosis bronconeumónica, aspergiloma o granulomas que contienen eosinófilos, anafilaxis, espondiloartritis seronegativas, enfermedades autoinmunes poliendocrinas, colangitis esclerosante, la esclerótica, epiesclerótica, la candidiasis mucocutánea crónica, el síndrome de Bruton, hipogammaglobulinemia transitoria de la infancia, síndrome de Wiskott— Aldrich, ataxia telangiectasia, los trastornos autoinmunes asociados con enfermedades del colágeno, el reumatismo, enfermedades neurológicas, trastorno de isquemia reperfusión, reducción de la respuesta de la presión arterial, la disfunción vascular, angiectasis, daño tisular, isquemia cardiovascular, hiperalgesia, isquemia cerebral, la enfermedad que acompaña la vascularización, las enfermedades alérgicas de hipersensibilidad, glomerulonefritis, lesión por reperfusión, lesión por reperfusión de los tejidos del miocardio o de otra índole, dermatosis con componentes inflamatorios agudos, meningitis purulenta aguda u otros desórdenes del sistema central nervioso inflamatorias, ocular y trastornos inflamatorios orbitales, síndromes asociados a la transfusión de granulocitos, toxicidad inducida por citoquinas, la inflamación grave y aguda, inflamación crónico intratable, pielitis, pneumonocirrosis, la retinopatía diabética, trastornos de arterias grandes, la hiperplasia endarterial, úlcera péptica, valvulitis, y la endometriosis.

El término "agente citotóxico" como se usa aquí se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de una célula o que causa la destrucción de una célula. Con el término se pretende incluir isótopos radiactivos (por ejemplo, At211 , 1131 , 1125, Y90, Re186, Re188, Sm153, BÍ212, Ra223, P32, y los isótopos radiactivos de Lu), agentes quimioterapéuticos, por ejemplo, el metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucil, agentes intercalantes daunorrubicina o de otro tipo, las enzimas y los fragmentos de los mismos tales como enzimas, antibióticos, nucleolíticos y toxinas tales como toxinas de moléculas pequeñas o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fungico, vegetal o de origen animal, incluyendo fragmentos o variantes de las mismas, y los diversos agentes antitumorales, contra el cáncer y quimioterapéuticos que se describe aquí. En la presente se describen otros agentes citotóxicos. Un agente tumoricida causa la destrucción de las células tumorales.

Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida; Cytoxan® sulfonatos de alquilo, tales como busulfán, improsulfan y piposulfan; aziridinas como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietiilentiofosforamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona), delta— 9— tetrahidrocanabinol (dronabinol, Marinol ®), beta— lapachona; lapachol, colchicinas, ácido betulínico, camptotecina (incluidos el sintético análogo de topotecano (Hycamtin ®), CPT— 11 (irinotecano, CAMPTOSAR ®), acetilcamptotecina, escopolectina y 9— aminocamptotecina); briostatina; calistatina; CC— 065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina), podofilotoxina, ácido podofilínico; tenipósido; criptopficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW— 2189 y CB1— TM1 ); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictiina; espongistatina, mostazas nitrogenadas, tales como clorambucil, clornafazina y colofosfamida, estramustina, ¡fosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, y ranimnustina; antibióticos tales como los antibióticos enediina (por ejemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gamma 1 (ver, por ejemplo, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl. 33: 183—186 (1994)); dinemicina, incluyendo dinemicina A; espermicina, así como cromóforo de neocarzinostatina y cromóforos relacionados de antibiótico de enedina y cromoproteína), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinis, dactinomicina, daunorrubicina , detorubicina, 6— diazo— 5— oxo— L norleucina, doxorrubicina ADRIAMYCIN® (incluyendo morfolino— doxorubicina, cianomorfolino doxorrubicina, 2— pirrolino doxorrubicina y deoxidoxorubicina), epirubicina esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas como la mitomicina C, el ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabolitos como el metotrexato y 5— fluorouracilo (5— FU), análogos de ácido fólico, tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de la purina como la fludarabina, 6— mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6 azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos como calusterona, propionato de dromostanolona epitiostanol, mepitiostano testolactona; anti— adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano, regenerador de ácido fólico, como el ácido frolínico; aceglatona; glucósido aldofosfamida ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilona, etoglucid; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidainina maitansinoides como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona 2— etilhidrazida; procarbazina; complejo polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazonico; triaziquona; 2,2',2"— triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T— 2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosida ("Ara— C"); tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel TAXOL® (Bristol— Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ), ABRAXANETM sin contenido de cromóforo, formulación en nanopartículas con ingeniería de albúmina de paclitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, IL), y doxetacel TAXOTERE® (Rhóne— Poulenc Rorer, Antony, Francia); cloranbucil; gemcitabina (GEMZAR®); 6— tioguanina; mercaptopurina, metotrexato, análogos de platino, como cisplatino y carboplatino, vinblastina (Velban ®), platino, etopósido (VP— 16), ifosfamida, mitoxantrona, vincristina (Oncovin ®), oxaliplatino; leucovovina; vinorelbina (Navelbine ®); Novantrone; edatrexato; daunomicina, aminopterina, ibandronato, inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometlilornitina (DMFO), los retinoides como el ácido retinoico, la capecitabina (Xeloda ®), sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores, como CHOP, una abreviatura de una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisolona y FOLFOX, una abreviatura de un régimen de tratamiento con oxaliplatino (ELOXATINTM) combinado con 5— FU y leucovovina.

También se incluyen en esta definición los agentes anti— hormonales que actúan para regular, reducir, bloquear o inhibir los efectos de las hormonas que pueden promover el crecimiento del cáncer, y a menudo se presentan en forma de sistémica o el tratamiento de todo el cuerpo. Pueden ser hormonas propiamente dichas. Los ejemplos incluyen anti— estrogenos y los moduladores selectivos de receptores de estrógeno (SERM), como, por ejemplo, el tamoxifeno (incluso tamoxifeno Nolvadex® ), raloxifeno EVISTA ®, droloxifeno, 4— hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno FARESTON®; anti— progesteronas, los reguladores descendentes de los reguladores de estrógeno (ERD), agentes que funcionan para suprimir o cerrar los ovarios, por ejemplo, hormona luteinizante, la hormona liberadora (LHRH), como Lupron® y acetato de leurpolida ELIGARD ®, acetato de goserelina, buserelina acetato y tripterelina; otros anti— andrógenos como la flutamida, bicalutamida y la nilutamida, e inhibidores de la aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrogenos en las glándulas suprarrenales, como, por ejemplo, 4 (5)— imidazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE ®, exemestano Aromasil ®, formestania, Fadrozol, vorozol RIVISOR ®, letrozol Femara ®, anastrozol y Arimidex ®. Además, la definición de este tipo de agentes quimioterapéuticos incluye los bifosfonatos como el clodronato (por ejemplo, BONEFOS ® u OSTAC®), etidronato DIDROCAL ® , NE— 58095, ácido zoledrónico / zoledronato Zometa ®, alendronato FOSAMAX ®, pamidronato Aredia ®, tiludronato Skelid ®, o risedronato Actonel ®, así como troxacitabina (un análogo de citosina nucleósida 1 ,3— dioxolano); oligonucleótidos antisentido, particularmente aquellos que inhiben la expresión de genes en las vías de señalización implicadas en la proliferación celular aberrante, tal como, por ejemplo, la PKC— alfa , Raf, H— Ras, y el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF— R), las vacunas, como vacunas THERATOPE ® y vacunas de terapia génica, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN ® , la vacuna LEUVECTIN ® y vacuna VAXID ®; inhibidor de la topoisomerasa 1 LURTOTECAN ®; rmRH ABARÉLIX ®; lapatinib ditosilato (un ErbB— 2 e inhibidor de moléculas pequeñas de la quinasa tirosina doble EGFR que también se conoce como GW572016), y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores.

Un "agente inhibidor del crecimiento" cuando se utiliza aquí se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula ya sea in vitro o in vivo. Así, el agente inhibidor del crecimiento puede ser uno que reduce significativamente el porcentaje de células en fase S. Los ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento celular incluyen agentes que bloquean la progresión del ciclo (en un lugar distinto de la fase S), tales como agentes que inducen el arresto de G1 y el arresto de la fase M. Los bloqueadores clásicos de la fase M incluyen la vincas (por ejemplo, vincristina y vinblastina), taxanos, inhibidores de la topoisomerasa II tales como la doxorubicina, eplrubicina, daunorubicina, etopósido y bleomicina. Los agentes que arrestan G1 también se extienden al arresto de la fase S, por ejemplo, los agentes alquilantes de ADN como el tamoxifeno, la prednisona, la dacarbazina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato, 5— fluorouracilo y ara— C. Se puede consultar más información en The Molecular Basis of Cáncer, Mendelsohn and Israel, eds., capítulo 1 , que se titula "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" por Murakami y colaboradores, (WB Saunders: Filadelfia, 1995), especialmente la página 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son medicamentos contra el cáncer, ambos derivados del tejo. Docetaxel (Taxotere ®, de Rhóne— Poulenc Rorer), derivado del tejo europeo, es un análogo semisintético de paclitaxel (Taxol ®, de Bristol— Myers Squibb). Paclitaxel y docetaxel promueven el ensamblaje de los microtúbulos de dímeros de tubulina y estabilizan los microtúbulos impidiendo la despolimerización, lo que resulta en la inhibición de la mitosis de las células.

El "tratamiento anti cancerígeno", como se usa aquí se refiere a un tratamiento que reduce o inhibe el cáncer en un sujeto. Los ejemplos de la terapia anti— cáncer incluyen la radioterapia citotóxica, así como la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor del crecimiento, una vacuna contra el cáncer, un inhibidor de la angiogénesis, un profármaco, una citoquina, una citoquina antagonista, un corticosteroide, un agente inmunosupresor, un anti— eméticos, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, o un analgésico para el sujeto.

El término "profármaco" como se usa en esta solicitud se refiere a una forma precursora o derivado de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica para las células tumorales en comparación con el fármaco original y es capaz de ser enzimáticamente activado o convertido en la forma padre más activa. Ver, por ejemplo, Wilman, "Prodrugs in Cáncer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, páginas 375— 382, 615th Meeting Belfast (1986), como así también Stella y colaboradores, "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt y colaboradores, (ed.), páginas 247— 267, Humana Press (1985). Entre los profármacos se incluyen, sin limitación, profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptidos, profármacos modificados por aminoácidos D, profármacos glicosilados, profármacos que contienen betalactama, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida y profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, profármacos de 5— fluorocitosina y otros de 5— fluorouridina que se pueden convertir en un fármaco libre citotóxico más activo. Los ejemplos de fármacos citotoxicos que se pueden derivar en una forma de profármaco para su empleo en esta invención incluyen, sin carácter restrictivo, aquellos agentes quimioterapéuticos descriptos previamente.

El término "citocina" es un término genérico para las proteínas liberadas por una población de células que actúan sobre otra célula como mediadores intercelulares. Los ejemplos de tales citoquinas son linfoquinas, monoquinas y tradicionales hormonas polipeptídicas. Entre las citoquinas se encuentran la hormona de crecimiento tales como la hormona del crecimiento humano (HGH), hormona del crecimiento humano N— metionilo, y la hormona del crecimiento bovina, hormona paratiroidea, tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormonas glicoproteicas tales como la hormona folículo— estimulante (FSH), hormona estimulante del tiroides (TSH) y la hormona luteinizante (LH), el factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), la prolactina, lactógeno placentario, factor de necrosis tumoral alfa y beta, sustancia inhibidora de Müller; péptido asociado a gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento del endotelio vascular; integrina; trombopoyetina (TPO), factores de crecimiento nerviosos tales como NGF— alfa; factor de crecimiento de plaquetas; factores de crecimiento transformantes (TGF), tales como TGF— alfa y TGF— beta; factor de crecimiento similar a la insulina I y II; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductivos; interferones tales como interferón— alfa, beta y gamma; factores estimulantes de colonias (CSF), tales como los macrófagos— CSF (M— LCR); granulocitos y macrófagos— CSF (GM— CSF), y granulocitos CSF— (G— CSF); interleucinas (ILS), tales como IL— 1 , IL— 1 alfa, IL— 1 beta, IL— 2, IL— 3, IL— 4, IL— 5, IL— 6, IL— 7, IL— 8, IL— 9, IL— 10, IL— 11 , IL— 12; IL— 18 un factor de necrosis tumoral, tales como TNF— alfa o TNF— beta, y otros factores polipeptídicos, incluyendo LIF y ligando kit (KL). Tal como se usa aquí, el término citoquina incluye proteínas provenientes de fuentes naturales o de cultivo de células recombinantes y equivalentes biológicamente activas de las citoquinas secuencia nativa.

Por "antagonista de citoquinas" se entiende una molécula que bloquea parcialmente o totalmente, inhibe o neutraliza una actividad biológica de por lo menos una citoquina. Por ejemplo, los antagonistas de la citoquina pueden inhibir la actividad de citocinas por la inhibición de la expresión de citoquinas y/o secreción, o por unión a una citoquina o un receptor de citoquinas. Loa antagonistas de la citoquina incluyen los anticuerpos, péptidos de secuencias sintéticas o nativas, inmunoadhesinas y pequeñas moléculas antagonistas que se unen a una citoquina o a un receptor de citoquina. El antagonista de citoquinas es opcionalmente conjugado con — o fusionado a— un agente citotóxico. Los ejemplos de antagonistas de TNF son etanercept (ENBREL®), infliximab (REMICADE®) y adalimumab (HUMIRATM).

El término "agente inmunosupresor" como se usa aquí se refiere a sustancias que actúan para suprimir o enmascarar el sistema inmune del sujeto a tratar Esto incluye sustancias que suprimen la producción de citoquinas, regulan a la baja o suprimen la libre expresión de antígenos o enmascaran los antígenos MHC. Los ejemplos de agentes inmunosupresores incluyen pirimidinas 2— amino— 6— aril— 5— sustituidos (véase la patente de EE. UU. número 4.665.077); mofetil micofenolato como CELLCEPT ®; azatioprina (Imuran ®, Azasan ® / 6— mercaptopurina; bromocriptina; danazol; dapsona; glutaraldehído (que enmascara los antígenos MHC, como se describe en la Patente de EE. UU. número 4.120.649); anticuerpos anti— idiotípicos para antígenos MHC y fragmentos MHC; ciclosporina A; esteroides tales como corticosteroides y glucocorticosteroides, por ejemplo, prednisona, prednisolona, tales como Pediapred ® (prednisolona sodio fosfato) u OraPred ® (solución oral de prednisolona sodio fosfato), metilprednisolona y dexametasona, metotrexato (por vía oral o subcutánea) (Rheumatrex ®, TREXALLTM); hidroxicloroquina/cloroquina, la sulfasalazina, la leflunomida, citoquina o antagonistas del receptor de la citoquina, incluyendo los anticuerpos anti— interferón — ?,— beta, o — a— , anticuerpos anti— factor de necrosis tumoral alfa (infliximab o adalimumab), inmunoadhesina anti— TNF (ENBREL ®, etanercept), anticuerpos anti— factor de necrosis tumoral beta, anticuerpos anti— interleucina— 2 y anticuerpos anti— receptor— IL— 2; anticuerpos anti— LFA— 1 , incluyendo anticuerpos anti— CD11a anticuerpos anti— CD18, anticuerpos anti— L3T4; anti— globulina de linfocitos heterólogos; anticuerpos policlonales o anticuerpos pan— T, o anticuerpos monoclonales anti— CD3 o anti— CD4/CD4a; péptido soluble que contiene un dominio de unión LFA— 3 (patente WO 90/08187); estreptoquinasa; TGF ß— ; estreptodornasa; ARN o ADN del hospedante; FK506; RS— 61443; desoxiespergualina; rapamicina; T receptor de la célula (Cohén y colaboradores, Patente de EE. UU. número 5.114.721.); fragmentos del receptor de células T (Offner y otros, Science, 251 : 430— 432 (1991 ); WO 90/11294; laneway, Nature 341 :482 (1989) y patente WO 91/01133), anticuerpos contra el receptor de células T (PE 340.109), como T10B9, ciclofosfamida (Cytoxan®), dapsona, penicilamina (Cuprimine ®), el intercambio de plasma, o inmunoglobulina intravenosa (IglV). Estos pueden ser usados solos o. en combinación unos con otros, en particular las combinaciones de esteroides y otro agente inmunosupresor o dichas combinaciones seguidas por una dosis de mantenimiento con un agente no esteroide para reducir la necesidad de esteroides.

Un "analgésico" se refiere a un fármaco que actúa para inhibir o suprimir el dolor en un sujeto. Los ejemplos de analgésicos incluyen fármacos anti— inflamatorios no esteroides (AINE) como el ibuprofeno (Motrin ®), naproxeno (Naprosyn ®), ácido acetilsalicílico, indometacina, sulindac, y tolmetina, incluyendo sus sales y derivados, así como varios otros medicamentos utilizados para reducir los dolores punzantes que pueden presentarse, incluso anticonvulsivos (gabapentina, fenitoína, carbamazepina) o antidepresivos tricíclicos. Los ejemplos específicos incluyen acetaminofeno, aspirina, amitriptilina (Elavil ®), carbamazepina (Tegretol ®), feniltoína (Dilantin ®), gabapentina (Neurontín ®), (E)— N— vanillil— 8— metil— 6— noneamida (capsaicina ®), o un bloqueador de los nervios.

Los "corticosteroides" se refieren a cualquiera de varias sustancias sintéticas o naturales, con la estructura química general de los esteroides que imitan o potencian los efectos de los corticosteroides naturales Los ejemplos de los corticosteroides sintéticos incluyen prednisona, prednisolona (incluyendo metilprednisolona), dexametasona triamcinolona y betametasona.

Una "vacuna contra el cáncer", como se usa aquí, es una composición que estimula una respuesta inmune en un sujeto contra un cáncer. Las vacunas contra el cáncer suelen ser una fuente de células o material asociado con el cáncer (antígeno) que puede ser autólogo (del mismo individuo) o alogénlco (de otros individuos) respecto del sujeto, junto con otros componentes (por ejemplo, adyuvantes) para estimular aún más y aumentar la respuesta inmune frente al antígeno. Las vacunas contra el cáncer pueden resultar en la estimulación del sistema inmune del sujeto para producir anticuerpos a uno o varios antígenos específicos, y/o para producir células T asesinas para atacar las células cancerosas que tienen estos antígenos.

El término "radioterapia citotóxica" como se usa aquí se refiere a la terapia de radiación que inhibe o previene la función de las células y/o destrucción de las células causas. La terapia de radiación puede incluir, por ejemplo, irradiación externa o terapia con un agente radioactivo marcado, tal como un anticuerpo. El término incluye el uso de isótopos radioactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm 53, Bi212, Ra223, P32 y los isótopos radiactivos de Lu).

"Sujeto" significa un vertebrado, tal como un mamífero, que puede ser un humano. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, los animales de granja (como vacas), animales deportivos, mascotas (tales como gatos, perros y caballos), primates, ratones y ratas.

Excepto cuando se indique lo contrario por el contexto, los términos "primer" polipéptido y "segundo" polipéptido, y las variaciones de los mismos, son meramente identificadores genéricos, y no deben tomarse como una identificación específica o un polipéptido particular o componente de anticuerpos de la invención.

Los reactivos disponibles en el mercado a que se hace referencia en los ejemplos se usan de acuerdo con las instrucciones del fabricante, a menos que se indique lo contrario. La fuente de esas células identificadas en los siguientes ejemplos y en toda la memoria, por números de acceso ATCC es la American Type Culture Collection, de Manassas, VA. A menos que se indique lo contrario, la presente invención utiliza procedimientos estándar de tecnología de ADN recombinante, tales como los que se describen anteriormente y en los libros de texto que se citan a continuación: Sambrook y colaboradores, ya citados; Ausubel y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates and Wiley Interscience, NY, 1989); Innis y colaboradores, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Inc., NY, 1990); Harlow y colaboradores, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1988); Gait, Oligonucleotide Synthesis (IRL Press, Oxford, 1984); Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan y colaboradores, Current Protocols in Immunology, 1991.

A lo largo de esta memoria y las reivindicaciones, la palabra "comprende", o variaciones como "comprende" o "que comprende", se entenderá que implican la inclusión de un número entero establecido o grupo de números enteros, pero no la exclusión de cualquier otro entero o grupo de números enteros.

Construcción de proteínas heteromultiméricas Típicamente, las proteínas heteromultiméricas que se describen en la presente habrán de comprender una significativa porción de una región Fe del anticuerpo. Dominios de heteromultimerización Las proteínas heteromultiméricas comprenden un dominio de heteromultimerización. Para generar una población sustancialmente homogénea de moléculas heterodiméricas, el dominio de heterod imerización debe tener una fuerte preferencia por la formación de heterodímeros sobre los homodímeros. Si bien las proteínas heteromultiméricas que se ejemplifican en la presente usan la tecnología de botón en ojal para facilitar la heteromultimerización, los especialistas en la técnica podrán apreciar otros dominios que resultan de utilidad en la presente invención.

Botones en ojales El uso de botones en ojales como método para producir anticuerpos multiespecíficos es bien conocido en la técnica. Ver la patente estadounidense número 5.731.168 concedida el 24 de marzo de 1998 y cedida a Genentech, la publicación de PCT número WO2009089004 publicada el 16 de julio 2009 y cedida a Amgen, y la publicación de patente estadounidense número 20090182127 publicada el 6 de julio de 2009 y cedida a Novo Nordisk A/S. Ver, también, Marvin y Zhu, Acta Pharmacologica Sincia (2005) 26(6):649— 658 y Kontermann (2005) Acta Pharacol. Sin., 26:1— 9. Se consigna una breve explicación.

Una "protuberancia" se refiere al menos a una cadena lateral de aminoácidos que se proyecta desde la interfaz de un primer polipéptido y, por lo tanto, se puede ubicar en una cavidad compensatoria en la interfaz adyacente (es decir, la interfaz de un segundo polipéptido), de modo de estabilizar el heteromultímero y, de esa manera, favorecer la formación de heteromultímero sobre la de homomultímero, por ejemplo. La protuberancia puede existir en la interfaz original o puede introducirse de manera sintética (por ejemplo, alterando el ácido nucleico que codifica la interfaz). Normalmente, el ácido nucleico que codifica la interfaz del primer polipéptido se altera para codificar la protuberancia. Para lograr esto, el ácido nucleico que codifica al menos un residuo de aminoácido "original" en la interfaz del primer polipéptido se sustituye con ácido nucleico que codifica al menos un residuo de aminoácido "importado" que tiene un volumen de cadena lateral más grande que el residuo de amino ácido original. Se apreciará que no puede haber más de un residuo original y el importado correspondiente. El límite superior para el número de residuos originales que se sustituyen es el número total de residuos en la interfaz del primer polipéptido. Los volúmenes de cadena lateral de los diferentes residuos de aminoácidos se muestran en la tabla siguiente.

TABLA 2 Propiedades de residuos de aminoácidos a Peso molecular de aminoácidos menos el del agua. Valores obtenidos de Handbook of Chemistrv and Phvsics. 43rd ed. Cleveland, Chemical Rubber Publishing Co., 1961. b Valores de A. A. Zamyatnin, Prog. Biophys. Mol. Biol. 24:107—123, 1972. c Valores de C. Chothia, J. Mol. Biol. 105:1—14, 1975. El área de superficie accesible se define en las Figuras 6 a 20 de esta referencia.

Los residuos importado preferidos para la formación de una protuberancia son generalmente residuos de aminoácidos de origen natural y se seleccionan preferiblemente de arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y) y triptófano (W). Los más preferidos son el triptófano y tirosina. En una forma de realización, el residuo original para la formación de la protuberancia tiene un volumen de cadena lateral pequeño, tales como alanina, asparagina, ácido aspártico, glicina, serina, treonina o valina.

Una "cavidad" se refiere a— al menos— una cadena lateral de aminoácidos que está rebajada desde la interfaz de un segundo polipéptido y, por lo tanto, se adapta a una protuberancia correspondiente en la interfaz adyacente de uri primer polipéptido. La cavidad puede existir en la interfaz original o puede introducirse de manera sintética (por ejemplo, alterando el ácido nucleico que codifica la interfaz). Normalmente, el ácido nucleico que codifica la interfaz del segundo polipéptido se altera para codificar la cavidad. Para lograr esto, el ácido nucleico que codifica al menos un residuo de aminoácido "original" en la interfaz del segundo polipéptido se sustituye con un ADN que codifica al menos una residuo de aminoácido "importado" que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño que el residuo de amino ácido original. Se apreciará que no puede haber más de un residuo original y el importado correspondiente. El límite superior para el número de residuos originales que se sustituyen es el número total de residuos en la interfaz del segundo polipéptido. Los volúmenes de cadena lateral de los residuos de aminoácidos diferentes se muestran en la Tabla 2. Los residuos importado preferidos para la formación de una cavidad son generalmente residuos de aminoácidos de origen natural y se seleccionan preferiblemente de alanina (A), serian (S), treonina (T) y valina (V). Los más preferidos son serina, alanina o treonina. En una forma de realización, el residuo original para la formación de la cavidad tiene un volumen de cadena lateral grande, tal como tirosina, arginina, fenilalanina o triptófano.

Un residuo de aminoácido "original" es el que se sustituye por un residuo "importado" que puede tener un volumen de cadena lateral más pequeño o más grande que el residuo original. El residuo de aminoácidos importado puede ser un residuo de aminoácidos de origen natural o no natural, pero preferiblemente es la primera opción. Los residuos de aminoácidos "de origen natural" son aquellos residuos codificados por el código genético y que se enumeran en la Tabla 2 anterior. Por residuo de aminoácido "no natural" se entiende un residuo que no está codificado por el código genético, pero que es capaz de unirse de manera covalente al residuo aminoácido adyacente en la cadena polipeptídica. Los ejemplos residuos de aminoácidos de origen no natural son norleucina, ornitina, norvalina, homoserina y otros análogos de residuos de aminoácidos, tales como los que se describen en Ellman y colaboradores, Meth. Enzym. 202:301— 336 (1991 ), por ejemplo. Para generar dichos residuos de aminoácidos no naturales se pueden usar los procedimientos de Noren y colaboradores, Science, 244: 182 (1989) y los de Ellman y colaboradores, ya citados. Brevemente, esto implica activar químicamente un supresor tRNA con un residuo de aminoácidos no natural seguido de la transcripción in vitro y la traslación del RNA. El método de la presente invención implica reemplazar al menos un residuo de aminoácido original, pero se pueden reemplazar más un residuo original. Normalmente, no más de los residuos totales en la ¡nterfaz del primer o del segundo polipéptido comprenderán residuos de aminoácidos originales que se pueden reemplazar. Típicamente, los residuos originales para reemplazo se "entierran" Por "enterrado" se entiende que el residuo es esencialmente inaccesible al solvente. En general, el residuo importado no es cisteína para evitar la posible oxidación o el apareamiento erróneo de los enlaces disulfuro.

La protuberancia es "posicionable" en la cavidad, lo cual significa que la localización espacial de la protuberancia y la cavidad en la interfaz de un polipéptido, primero y segundo, respectivamente, y los tamaños de la protuberancia y la cavidad son tales que la protuberancia se puede localizar en la cavidad sin perturbar de manera significativa la asociación normal de los polipéptidos primero y segundo en la interfaz. Dado que protuberancias tales como Tyr, Phe y Trp normalmente no se extienden perpendicularmente desde el eje de la interfaz y tienen conformaciones preferidas, la alineación de una protuberancia con una cavidad correspondiente se basa en el modelado del par protuberancia/cavidad basado en una estructura tridimensional tal como la obtenida por cristalografía de rayos X o resonancia magnética nuclear (RMN). Esto puede lograrse utilizando técnicas ampliamente aceptadas en la técnica. Por "ácido nucleico original o plantilla" se entiende el ácido nucleico que codifica un polipéptido de interés que puede ser "alterado" (es decir, genéticamente o mutado) para codificar una protuberancia o cavidad. El ácido nucleico original o de partida puede ser un ácido nucleico de origen natural o puede comprender un ácido nucleico que ha sido sometido a modificaciones antes (por ejemplo, un fragmento de anticuerpo humanizado). Por "alteración" del ácido nucleico se entiende que el ácido nucleico original está mutado mediante la inserción, supresión o sustitución de al menos un codón que codifica un residuo de aminoácido de interés. Normalmente, un codón que codifica un residuo original es reemplazado por un codón que codifica un residuo importado. Las técnicas para modificar genéticamente un ADN de esta manera se han revisado en Mutagénesis: a Practical Approach, M. J. McPherson, Ed., (IRL Press, Oxford, Reino Unido. (1991 ), e incluyen mutagénesis dirigida al sitio, la mutagénesis de cassette y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), mutagénesis, por ejemplo. Al mutar un ácido nucleico original/plantilla, un polipéptido original / plantilla codificado por el ácido nucleico original/plantilla es correspondientemente alterado.

La protuberancia o cavidad puede ser "introducida" en la interfaz de un polipéptido primero o segundo por medios sintéticos, por ejemplo por técnicas recombinantes, la síntesis de péptidos in vitro, la técnicas para la introducción de residuos de aminoácidos de origen no natural que se describieron anteriormente, por acoplamiento enzimático o químico de péptidos o alguna combinación de estas técnicas. En consecuencia, la protuberancia o cavidad que se "introdujo" es "no natural" o "no nativa", lo que significa que no existe en la naturaleza o en el polipéptido original (por ejemplo un anticuerpo monoclonal humanizado).

Generalmente, el residuo importado de aminoácidos para formar la protuberancia tiene un número relativamente pequeño de "rotómeros" (por ejemplo, aproximadamente 3— 6). Un "rotómero" es una conformación energéticamente favorable de una cadena lateral de aminoácidos. El número de rotómeros de los residuos de aminoácidos diferentes son analizados en Ponders y Richards, J. Mol. Biol. 193: 775—791 (1987).

Otras mutaciones Los polipéptidos que se describen en la presente pueden tener mutaciones que confieren menor apareamiento erróneo, reducida formación de cabeza a cola o mayor rendimiento general, en comparación con el polipéptido de Fe de tipo silvestre o polipéptido de Fe de botón en el ojal. La variante de Fe comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez sustituciones en los residuos seleccionados de S239, V240, F241 , F243, V264, R301 , K334, Y349, T350, L368, K370, N389, Y391 , K392, P395, P396, D399, F405, Y407 en al menos en una cadena pesada con un aminoácido que es diferente del que se encuentra presente en un polipéptido de Fe de tipo silvestre. Puede ser conveniente alterar la función efectora y se contempla que algunas de las mutaciones puedan mejorar o reducir la función efectora. Se prefiere que las mutaciones no alteren significativamente otras características funcionales del anticuerpo, por ejemplo, la función efectora.

Vectores, células hospedantes y métodos recombinantes Para la producción recombinante de una proteína heteromultimérica (por ejemplo, un anticuerpo) de la invención, el ácido nucleico que lo codifica se aisla y se inserta en un vector replicable para una posterior clonación (amplificación del ADN) o para expresión. El ADN que codifica el anticuerpo se aisla fácil y rápidamente y se secuencia con el empleo de procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante el empleo de sondas de oligonucleótidos que son capaces de enlazarse específicamente a los genes que codifican las cadenas liviana y pesada del anticuerpo). Se encuentran disponibles muchos vectores. La elección del vector depende en parte de la célula hospedante que se vaya a usar. En términos generales, las células hospedantes preferidas son de origen procariota o eucariota (en general, de mamífero, pero también se incluyen las de hongos (por ejemplo, levadura), insectos, plantas y células nucleadas de otros organismos multicelulares). Cabe apreciar que las regiones constantes de cualquier isotipo pueden usarse para este fin, incluso las regiones constantes IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, y que dichas regiones constantes pueden obtenerse a partir de cualquier especie humana o animal.

Cómo generar proteínas heteromultiméricas usando células hospedantes procariotas Construcción de vectores Las secuencias polinucleotidas que codifican componentes polipéptidos de las proteínas heteromultiméricas (por ejemplo, un anticuerpo) de la invención pueden obtenerse usando técnicas recombinantes estándar. Las secuencias de polinucleótidos deseadas pueden aislarse y secuenciarse a partir de, por ejemplo, células que producen anticuerpos, tales como células de hibridoma. Como alternativa, los polinucleótidos pueden sintetizarse usando sintetizador de nucleótidos o técnicas de PCR. Una vez obtenidas, las secuencias que codifican los polipéptidos se insertan en un vector recombinante capaz de replicar y expresar polinucleótidos heterólogos en hospedantes procariotas. Muchos vectores que se encuentran disponibles y son conocidos en la técnica pueden usarse a los fines de la presente invención. La selección de un vector apropiado dependerá fundamentalmente del tamaño de los ácidos nucleicos que se habrán de insertar en el vector y en la célula hospedante en particular que se habrá de transformar con el vector. Cada vector contiene varios componentes, dependiendo de su función (amplificación o expresión de un polinucleótido heterólogo, o ambas) y su compatibilidad con la célula hospedante en particular donde reside. En términos generales, los componentes del vector incluyen, sin carácter restrictivo: un origen de replicación, un gen marcador de selección, un promotor, un sitio de unión a ribosoma (RBS, por sus siglas en inglés), una secuencia de señales, un inserto de ácido nucleico heterólogo y una secuencia de terminación de la transcripción.

En general, los vectores de plásmido que contienen replicón y secuencias de control que son derivadas de especies compatibles con células hospedantes se usan en conexión con estos hospedantes. De manera ordinaria, el vector lleva un sitio de replicación, al igual que secuencias marcadoras que pueden ser capaces de proporcionar selección fenotípica en células transformadas. Por ejemplo, E. coli se transforma típicamente usando pBR322, un plásmido que deriva de especies de E. coli. pBR322 contiene genes que codifican ampicilina (Amp) y resistencia a tetraciclina (Tet) y, de esta manera, proporciona un medio sencillo para identificar células transformadas. pBR322, sus derivados u otros plásmldos microbianos o bacteriófagos también pueden contener, o ser modificados para que contengan, promotores que pueden ser utilizados por el organismo microbiano para la expresión de proteínas endógenas. Los ejemplos de derivados de pBR322 que se utilizan para la expresión de anticuerpos particulares se describen en detalle en Cárter y colaboradores, patente estadounidense número 5.648.237.

Además, los vectores de fagos que contienen secuencias de replicón y control que sean compatibles con el microorganismo hospedante se pueden utilizar como vectores de transformación en conexión con estos hospedantes. Por ejemplo, se puede utilizar el bacteriófago ????.??.— 11 en la elaboración de un vector recombinante que puede ser utilizado para transformar células hospedantes sensibles tales como E. coli LE392.

El vector de expresión de la invención puede comprender dos o más pares de promotores de cistrón, que codifica cada uno de los componentes polipeptídicos. Un promotor es una secuencia no traducida reguladora que se sitúa aguas arriba (5 ') respecto de un cistrón que modula su expresión. Los promotores procariotas normalmente se dividen en dos clases, inducible y constitutiva. Un promotor inducible es un promotor que inicia un mayor nivel de transcripción del cistrón bajo su control en respuesta a cambios en la condición de cultivo, por ejemplo, la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura.

Una gran cantidad de promotores, reconocidos por una variedad de células hospedantes potenciales, son bien conocidos. El promotor seleccionado puede ser unido operativamente a ADN cistrón que codifica, por ejemplo, la cadena liviana o pesada, eliminando el promotor del ADN fuente mediante digestión con enzimas de restricción y la inserción de la secuencia del promotor aislado en el vector de la invención. Tanto la secuencia del promotor nativo como muchos promotores heterólogos pueden ser utilizados para la amplificación directa y/o la expresión de los genes diana. En algunas formas de realización, los promotores heterólogos son utilizados, ya que generalmente permiten una mayor transcripción y más elevados rendimientos del gen diana expresado en comparación con el promotor polipéptido diana nativo.

Los promotores adecuados para su uso con hospedantes procariotas incluyen el promotor PhoA, los sistemas promotores ß— galactamasa y lactosa, un sistema promotor triptófano (trp) y promotores híbridos como el TAC o el promotor trc. Sin embargo, otros promotores que son funcionales en bacterias (tales como otros promotores bacterianos conocidos o fagos) son adecuados también. Sus secuencias de nucleótidos han sido publicadas, lo que permite que el experto en la materia los ligue funcionalmente a cistrones que codifican los genes de la proteína heteromultimérica, por ejemplo, las cadenas liviana y pesada diana (Siebenlist y colaboradores, (1980) Cell 20: 269), utilizando enlazadores o adaptadores para suministrar cualquier sitio de restricción requerido.

En una forma de realización de la invención, cada cistrón dentro del vector recombinante comprende un componente de secuencia señal de secreción que dirige la translocación de los polipéptidos expresados a través de una membrana.

En general, la secuencia de señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN del polipéptido diana que se inserta en el vector. La secuencia señal seleccionada con el propósito de esta invención debe ser una que es reconocida y procesada (es decir, escindida por una peptidasa de señal) por la célula hospedante. Para las células hospedante procariotas que no reconocen y procesan las secuencias nativas señal en los polipéptidos heterólogos, la secuencia señal es sustituida por una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo que consiste de la fosfatasa alcalina, la penicilinasa, IPP, líderes de enterotoxina II estable al calor (St II), LamB, PhoE, PelB, OmpA y MBP. En una forma de realización de la invención, las secuencias de señales utilizadas en ambos cistrones del sistema de expresión son secuencias STII señal o variantes de las mismas.

En otra forma de realización, la producción de las inmunoglobulinas de acuerdo con la invención se puede realizar en el citoplasma de la célula hospedante y, por lo tanto, no requiere la presencia de secuencias señal de secreción dentro de cada cistrón. A este respecto, las cadenas de inmunoglobulina ligera y pesada se expresan, pliegan y ensamblan para formar inmunoglobulinas funcionales dentro del citoplasma. Ciertas cepas hospedantes (por ejemplo las cepas de E. coli trxBT ) proporcionan condiciones de citoplasma que son favorables para la formación de enlaces disulfuro, permitiendo con ello plegamiento y ensamblaje correctos de las subunidades de proteína expresada. Ver Proba y Pluckthun Gene, 159:203 (1995).

Las células hospedantes procariotas adecuadas para la expresión de proteínas heteromultiméricas (por ejemplo, anticuerpos) de la invención incluyen arqueobacterias y eubacterias, tales como los organismos Gram— negativos o Gram— positivas. Los ejemplos de bacterias útiles incluyen Escherichia (por ejemplo, E. coli), bacilos (por ejemplo, B. subtilis), enterobacterias, especies de Pseudomonas (por ejemplo, P. aeruginosa), Salmonella typhimurium, marcescans Serratia, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla o Paracoccus. En una forma de realización, se usan células gram— negativas. En una forma de realización, las células de E. coli se utilizan como hospedantes para la invención. Los ejemplos de cepas E. coli incluyen la cepa W31 110 (Bachmann, Cellular and Molecular Bioloqy. vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), páginas 1 190— 1219; ATCC, número de depósito 27.325) y sus derivados, incluso la cepa 33D3 que tienen el genotipo W3110 AfhuA (AtonA) ptr3 lac Iq lacL8 AompTA(nmpc— fepE) degP41 kanR (patente estadounidense número 5.639.635). Otras cepas y sus derivados, tales como E. coli 294 (ATCC 31.446), E. coli B, E. coli ? 1776 (ATCC 31.537) y E. coli RV308 (ATCC 31608) son también adecuados. En una forma de realización, E. coli Alpp encuentra uso en particular. Estos ejemplos son ilustrativos y no limitativos Los métodos para construir los derivados de cualquiera de las bacterias mencionadas que tienen genotipos definidos son conocidos en la técnica y se describen en, por ejemplo, Bass y colaboradores, Proteins. 8:309— 314 (1990). En general, es necesario seleccionar las bacterias apropiadas, teniendo en consideración replicabilidad del replicón en las células de una bacteria. Por ejemplo, las especies E. coli, Serratia o Salmonella pueden utilizarse adecuadamente como el anfitrión cuando plásmidos bien conocidos tales como pBR322, pBR325, pACYC177, o pKN410 se utilizan para suministrar el replicón. Típicamente, la célula hospedante debe secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticas, y los inhibidores de la proteasa deseablemente adicionales pueden ser incorporados en el cultivo celular, ii. Producción de polipéptidos Las células hospedantes se transforman con los vectores de expresión descriptos previamente y se someten a cultivo en medio nutriente convencional modificado según corresponda para inducir los promotores, seleccionar los transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias convenientes.

Transformación significa introducir ADN en el hospedante procariota, de modo que el ADN sea replicable, ya sea como elemento extracromosómico o por integrante cromosómico. Según la célula hospedante utilizada, la transformación se lleva a cabo usando técnicas estándar que son apropiadas para dichas células. El tratamiento con calcio empleando cloruro de calcio se utiliza generalmente para las células bacterianas que contienen sustanciales barreras de pared celular. Otro método para la transformación emplea polietileno glicol / DMSO. Otra técnica utilizada es la electroporación.

Las células procariotas utilizadas para producir los polipéptidos de la invención se cultivan en medios conocidos en la técnica y que son adecuados para el cultivo de las células hospedante seleccionadas. Los ejemplos de medios adecuados incluyen caldo Luria (LB, por sus siglas en inglés), además de suplementos de nutrientes necesarios. En algunas formas de realización, los medios también contienen un agente de selección, elegidos en base a la construcción del vector de expresión, para permitir selectivamente el crecimiento de las células procariotas que contienen el vector de expresión. Por ejemplo, se añade ampicilina a los medios para el crecimiento de células que expresan gen resistente a la ampicilina. Cualquier otro suplemento necesario, además de carbono, nitrógeno, y fuentes de fosfato inorgánico también se pueden incluir en las concentraciones apropiadas, ya sea introducidos solos o como una mezcla con otro suplemento o medio tal como una fuente de nitrógeno complejo. Opcionalmente, el medio de cultivo puede contener uno o más agentes reductores seleccionados del grupo que consta de glutatión, cisteína, cistamina, tioglicolato, ditioeritritol y ditiotreitol.

Las células hospedantes procariotas se cultivan a temperaturas adecuadas. Para el crecimiento de E. coli, por ejemplo, los intervalos de temperatura que se prefieren van de entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 39°C, con mayor preferencia de entre aproximadamente 25°C y aproximadamente 37°C, incluso más preferiblemente la temperatura es de aproximadamente 30°C. El pH del medio puede ser cualquier pH que varía desde aproximadamente 5 a aproximadamente 9, dependiendo principalmente en el organismo hospedante. Para E. coli, el pH es preferiblemente de aproximadamente 6,8 a aproximadamente 7,4, y más preferiblemente aproximadamente 7.

Si un promotor inducible se utiliza en el vector de expresión de la invención, la expresión de proteínas es inducida bajo condiciones adecuadas para la activación del promotor. En una forma de realización de la invención, los promotores phoA se utilizan para controlar la transcripción de los polipéptidos. En consecuencia, las células hospedantes transformadas se cultivan en un medio limitador de fosfato para la inducción. Con preferencia, el medio limitador del fosfato es el medio C.R.A.P. (consultar, por ejemplo, Simmons y colaboradores, J. Immunol. Methods (2002), 263:133— 147). Una variedad de otros inductores pueden ser utilizados, de acuerdo con la construcción de vector empleado, como es conocido en la técnica. En una forma de realización, las células hospedantes que contienen Fe primera y segunda se cultivan por separado y los polipéptidos expresados de la presente invención se secretan en— y se recuperar a partir del— periplasma de las células hospedantes por separado. En una segunda forma realización, las células hospedantes que contienen Fe primera y segunda se cultivan por separado y antes del aislamiento de los polipéptidos que contienen Fe, los dos cultivos de células hospedantes se mezclan y se peletean las células. En una tercera forma realización, las células hospedantes que contienen Fe primera y segunda se cultivan por separado, se centrifugan y se resuspenden por separado y luego se mezclan juntas antes del aislamiento de los polipéptidos que contienen Fe. En una cuarta forma realización, las células hospedantes que contienen Fe primera y segunda se cultivan juntas en el mismo recipiente de cultivo. La recuperación de proteínas implica típicamente interrumpir la membrana celular del microorganismo, generalmente por medios tales como choque osmótico sonicación, o lisis. Una vez que las células se rompen, los restos de células o células enteras pueden ser eliminados por centrifugación o filtración. Las proteínas se pueden purificar adicionalmente, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad de la resina.

Como alternativa, las proteínas pueden ser transportadas en los medios de cultivo y aislarse allí mismo. Las células pueden ser retiradas del cultivo y el sobrenadante del cultivo filtrarse y concentrarse para obtener una purificación adicional de las proteínas producidas. Los polipéptidos expresados pueden ser aún más aislado e identificado mediante métodos comúnmente conocidos, tales como la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) y ensayo de transferencia Western. Los polipéptidos aislados se utilizan para producir las proteínas heteromultiméricas en En una forma de realización de la invención, la producción de proteínas heteromultiméricas (por ejemplo, anticuerpos) se lleva a cabo en grandes cantidades a través de un proceso de fermentación. Se pueden emplear distintas procedimientos de fermentación alimentados por lote y a gran escala para la producción de proteínas recombínantes. Las fermentaciones a gran escala tienen por lo menos 1000 litros de capacidad, preferiblemente aproximadamente de 1.000 a 100.000 litros de capacidad. Estos fermentadores utilizan impulsores de agitadores para distribuir oxígeno y nutrientes, especialmente la glucosa (el preferido de carbono / energía de la fuente). La fermentación a pequeña escala se refiere generalmente a la fermentación en un fermentador que no tiene más de aproximadamente 100 litros de capacidad volumétrica, y puede variar desde aproximadamente 1 litro a aproximadamente 100 litros.

En un proceso de fermentación, la inducción de la expresión de la proteína se inicia típicamente después de que las células han sido cultivadas en condiciones adecuadas para una densidad deseada, por ejemplo, una OD550 de aproximadamente 180— 220, etapa en la cual las células están en la fase estacionaria temprana. Una variedad de inductores pueden ser utilizados, de acuerdo con la construcción de vector empleado, como es conocido en la técnica y se ha descripto previamente. Las células pueden ser cultivadas durante períodos más cortos antes de la inducción. Las células son generalmente inducidas durante aproximadamente 12— 50 horas, aunque pueden utilizarse tiempos de inducción más largos o más cortos.

Para mejorar el rendimiento de la producción y la calidad de los polipéptidos de la invención, las diversas condiciones de fermentación pueden ser modificadas. Por ejemplo, para mejorar el ensamblaje y el plegamiento adecuados de las proteínas heteromultiméricas secretadas (por ejemplo, los anticuerpos), otros vectores de proteínas chaperonas que sobreexpresan proteínas, tales como OSD (DsbA, CEDD, DSBC, y DsbD o DsbG) o FkpA (una peptidilprolil cis trans— isomerasa con actividad chaperona) puede utilizarse para co— transformar las células hospedante procariotas. Las proteínas chaperonas han demostrado facilitar el plegado correcto y la solubilidad de las proteínas heterólogas producidas en células hospedantes bacterianas. Chen y colaboradores, (1999) J Bio Chem 274:19601—19605; Georgiou y colaboradores, la patente estadounidense número 6.083.715; Georgiou y colaboradores, la patente estadounidense número 6.027.888; Bothmann y Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100—17105; Ramm y Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106—17113; Arie y colaboradores, (2001 ) Mol. Microbio!. 39:199—210.

Para minimizar la proteólisis de proteínas heterólogas expresadas (especialmente aquellas que son sensibles proteolíticamente), ciertas cepas hospedantes deficientes para las enzimas proteolíticas pueden ser utilizadas para la presente invención. Por ejemplo, las cepas de células hospedantes puede ser modificadas para efectuar la mutación genética en los genes que codifican proteasas bacterianas conocidas tales como la proteasa III, OmpT, degP, Tsp, proteasa I, proteasa Mi, proteasa VI y combinaciones de los mismos. Algunas cepas de E. coli deficientes en proteasa están disponibles y se describen en, por ejemplo, Joly y colaboradores, (1998), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:2773—2777; Georgiou y colaboradores, la patente estadounidense número 5.264.365; Georgiou y colaboradores, la patente estadounidense número 5.508.192; Hará y colaboradores, Microbial Drug Resistance, 2:63— 72 (1996).

En una forma de realización, las cepas de E. coli deficientes en enzimas proteolíticas y transformadas con plásmidos que sobreexpresan una o más proteínas chaperonas se utilizan como células hospedantes en el sistema de expresión de la invención. En una segunda forma realización, la cepa de E. coli es deficiente en una lipoproteína de la membrana externa (????).

Purificación de proteínas heteromultiméricas En una forma de realización, la proteína heteromultimérica producida aquí se purifica para obtener preparaciones que son sustancialmente homogéneas para realizar otros ensayos y darle usos adicionales. Se pueden emplear métodos de purificación de proteínas estándar conocidos en la técnica. Los procedimientos siguientes son ejemplos de procedimientos de purificación adecuados: fraccionamiento en columnas de inmunoafinidad o intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC en fase inversa, cromatografía sobre sílice o sobre una resina de intercambio catiónico tales como DEAE, cromatoenfoque, SDS— PAGE, la precipitación con sulfato amónico, y filtración en gel utilizando, por ejemplo, Sephadex G— 75.

En una forma de realización, la proteína A inmovilizada sobre una fase sólida se utiliza para la purificación de inmunoafinidad de, por ejemplo, productos de anticuerpos completos de longitud de la invención. La proteína A es una proteína de la pared celular de Staphylococcus aureus de 41 kD que se une con una afinidad alta a la región Fe de los anticuerpos. Lindmark y colaboradores, (1983) J. Immunol. Meth. 62:1— 13. La fase sólida a la que la proteína A se inmoviliza es preferiblemente una columna que comprende una superficie de vidrio o sílice, más preferiblemente una columna de vidrio de poro controlado o una columna de ácido silícico. En algunas aplicaciones, la columna se ha recubierto con un reactivo, tal como glicerol, en un intento por evitar la adherencia no específica de los contaminantes.

Como primer paso de purificación, la preparación derivada del cultivo de células como se describe anteriormente se aplica sobre la fase sólida inmovilizada de la Proteína A para permitir la unión específica del anticuerpo de interés a la proteína A. La fase sólida se lava luego para eliminar contaminantes no específicamente unidos a la fase sólida. La proteína heteromultimérica (por ejemplo, anticuerpo) se recupera de la fase sólida por elusión.

Cómo generar proteínas heteromultiméricas usando células hospedantes eucariotas En general, los componentes de vector incluyen, sin limitación, uno o más de los siguientes grupos: una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento mejorador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción.

Componente de la secuencia señal Un vector que se usa en una célula hospedante eucariota también puede contener una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de clivado específico en el extremo N terminal de la proteína madura o del polipéptido de interés. La secuencia señal heteróloga seleccionada preferiblemente es una que es reconocida y procesada (es decir, escindida por una peptidasa de señal) por la célula hospedante. En la expresión de células de mamífero, las secuencias de señales de mamíferos, así como líderes secretores virales, por ejemplo, ell herpes simplex gD señal, están disponibles. El ADN de la región precursora tal se ligó en el marco de lectura al ADN que codifica la proteína heteromultimérica deseada (por ejemplo, anticuerpos).

Origen de replicación Por lo general, un orgen del componente de replicación no es necesario para los vectores de expresión de mamíferos. Por ejemplo, el origen de SV40 típicamente puede ser utilizado, pero sólo debido a que contiene el promotor temprano.

Componente del gen de selección Los vectores de expresión y de clonación pueden contener un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Los genes marcadores de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a los antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, metotrexato o tetraciclina; (b) complementan las deficiencias auxotróficas de la célula; cuando corresponda o (c) suministran nutrientes críticos que no están disponibles a partir del complejo o medio definido. Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula hospedante. Aquellas células que están transformadas con éxito con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia a los fármacos y, por tanto, sobreviven al régimen de selección. Los ejemplos de dicha selección dominante utilizan los fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

Otro ejemplo de marcadores seleccionabas adecuados para células de mamíferos son los que permiten la identificación de células competentes para absorber el ácido nucleico de anticuerpos, tales como DHFR, la timidina quinasa, metalotioneína I y II, los genes de metalotioneína preferentemente de primates, la adenosina deaminasa, ornitina descarboxilasa, etc.

Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección DHFR se identificaron por primera vez mediante el cultivo de todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (MTX), un antagonista competitivo de DHFR. Una célula hospedante apropiada cuando se emplea la DHFR de tipo silvestre es la línea celular de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad DHFR (por ejemplo, ATCC CRL— 9096).

Como alternativa, las células hospedantes (particularmente hospedantes de tipo silvestre que contienen DHFR endógeno) transformadas o co— transformadas con secuencias de ADN que codifican un anticuerpo, proteína DHFR de tipo silvestre, y otro marcador seleccionare tal como aminoglicósido 3'— fosfotransferasa (APH) se pueden seleccionar por crecimiento celular en medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable, tal como un antibiótico aminoglicosídico, por ejemplo, kanamicina, neomicina, o G418. Consultar, por ejemplo, la patente estadounidense que lleva el número 4.965.199.

Componente del promotor Los vectores de expresión y de clonación suelen contener un promotor que es reconocido por el organismo hospedante y está unido operativamente a los polipéptidos que contienen Fe deseados (por ejemplo, anticuerpo) de ácido nucleico. Las secuencias promotoras son conocidas por los eucariotas. Virtualmente todos los genes eucariotas tienen una región rica en AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases aguas arriba del sitio donde se inicia la transcripción. Otra secuencia encontró 70 a 80 bases aguas arriba desde el inicio de la transcripción de muchos genes es una región CNCAAT donde N puede ser cualquier nucleótido. El extremo 3 'de muchos genes eucariotas es una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola poli A para el extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias están convenientemente insertadas en vectores de expresión eucarióticos.

La trascripción de los polipéptidos que contienen Fe (por ejemplo anticuerpos) deseados a partir de los vectores en células hospedantes de mamífero se controla, por ejemplo, por los promotores obtenidos a partir de los genomas de virus tales como, por ejemplo, virus del polioma, el virus de la viruela aviar, adenovirus (tales como adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, hepatitis B y el virus simio 40 (SV40), a partir de promotores heterólogos de mamífero, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, o de calor— choque promotores, a condición de tales promotores son compatibles con los sistemas de células hospedante.

Los promotores temprano y tardío del virus SV40 se obtienen como un fragmento de restricción de SV40 que también contiene el origen de replicación viral SV40. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción Hindlll de E. Un sistema para expresar ADN en hospedantes mamíferos utilizando el virus del papiloma bovino como un vector se describe en la Patente de EE. UU. número 4.419.446. Una modificación de este sistema se describe en la Patente de EE. UU. número 4.601.978. Ver, asimismo, Reyes y colaboradores, Nature 297:598—601 (1982) sobre la expresión de cDNA de ß— interferón humano en células de ratón bajo el control de un promotor de la timidina quinasa proveniente del virus del herpes simple. Como alternativa, la repetición terminal larga del virus del Sarcoma de Rous se puede utilizar como el promotor.

Componente del elemento mejorador La transcripción de ADN que codifica los polipéptidos contienen Fe deseados (por ejemplo, anticuerpos) mediante eucariotas superiores pueden aumentarse si se inserta una secuencia mejoradora en el vector. Se conocen varias secuencias mejoradoras para los genes de mamífero (por ejemplo, globina, elastasa, albúmina, alfa— fetoproteína e insulina), también se puede usar un mejorador a partir de un virus de célula eucariota. Los ejemplos incluyen el mejorador SV40 en el lado tardío del origen de replicación (bp 100 a 270), un mejorador del promotor temprano del citomegalovirus, el mejorador polioma en el lado tardío del origen de replicación y los mejoradores de adenovirus. Ver, del mismo modo, Yaniv, Nature 297:17— 8 (1982) para consultar una descripción de los elementos para mejorar la activación de los promotores eucariotas. El mejorador pueden dividirse en el vector en la posición 5' ó 3' respecto de la secuencia codificadora de polipéptidos del anticuerpo, siempre que se logre el mejoramiento, pero en general se encuentra en el sitio 5' del promotor.

Componente de terminación de la transcripción Los vectores de expresión que se usan en células hospedantes eucariotas típicamente habrán de contener secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el mRNA. Dichas secuencias están normalmente disponibles de las regiones no traducidas 5', y ocasionalmente 3', de ADN o cADN eucariotas o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos que se transcriben como fragmentos poliadenilados en la parte no traducida del mRNA que codifica un anticuerpo. Un componente de terminación de la transcripción que es útil es la región de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovino. Ver la patente W094/1 1026 y el vector de expresión que se revela en la presente.

Selección y transformación de células hospedantes Las células hospedantes para clonar o expresar el ADN en los vectores de la presente incluyen células eucariotas superiores que se describen en la presente, incluso las células hospedantes de vertebrados. La propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo tisular) se ha convertido en un procedimiento de rutina. Los ejemplos de líneas celulares hospedantes de mamífero que resultan de utilidad son la línea CV1 de riñon de mono transformada por SV40 (COS— 7, ATCC CRL 1651 ); línea de riñon embrionario de ser humano (células 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión, [Graham y colaboradores, J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñon de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/— DHFR (CHO, Urlaub y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243—251 (1980)); células de riñon de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñon de mono verde africano (VERO— 76, ATCC CRL— 1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñon canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de ratas Buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas Is (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51 ); células TRI (Mather y colaboradores, Annals N. Y. Acad. Sci. 383:44—68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma celular (Hep G2).

Las células hospedantes se transforman con los vectores de expresión o de clonación descriptos previamente para la producción de los polipéptidos que contienen Fe (por ejemplo, anticuerpos) deseados y se someten a cultivo en medio nutriente convencional modificado según corresponda para inducir los promotores, seleccionar los transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias convenientes.

Cultivo de células hospedantes Las células hospedantes utilizadas para producir el o los polipéptidos que contienen Fe que se desean (por ejemplo, anticuerpos) de la presente invención pueden someterse a cultivo en una variedad de medios. Los medios que se comercializan en el mercado, tales como F10 de Ham (Sigma); medio esencial mínimo [Minimal Essential Médium (MEM)], (Sigma); RPMI— 1640 (Sigma); y medio de Eagle modificado por Dulbecco [Dulbecco's Modified Eagle's Médium (DMEM)], Sigma), resultan adecuados para cultivar las células hospedantes. Del mismo modo, cualquiera de los medios que se describen en Ham y colaboradores, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes y colaboradores, Anal. Biochem.102:255 (1980), patentes estadounidenses números 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; ó 5.122.469; WO 90/03430; WO 87/00195; ó referencia de patente estadounidense número 30.985 pueden usarse como medio de cultivo para las células hospedantes. Cualquiera de estos medios puede suplementarse según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), soluciones amortiguadoras (tal como HEPES), nucleótidos (tal como adenosina y timidina), antibióticos (tal como el fármaco Gentamicina™), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentes en concentraciones finales dentro del rango micromolar), y glucosa o una fuente de energía equivalente. También se puede incluir cualquier otro suplemento que resulte necesario en las concentraciones apropiadas que conocen los expertos en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y demás similares, son aquellas que se utilizaron previamente con la célula hospedante seleccionada para la expresión, y serán fácilmente determinadas por el experto en el arte.

Purificación de proteínas heteromultiméricas Cuando se utilizan técnicas recombinantes, los polipéptidos que contienen Fe pueden ser producidos intracelularmente, o directamente secretados en el medio. Si el polipéptido que contiene Fe se produce de manera intracelular, como un primer paso, los restos de partículas, ya sean células hospedantes o fragmentos Usados, se eliminan, por ejemplo, mediante centrifugación o ultra filtración. Cuando el polipéptido que contiene Fe es secretado en el medio, los sobrenadantes procedentes de tales sistemas de expresión son generalmente primero concentrados utilizando un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultra filtración Pellicon Amicon o Millipore. Un inhibidor de la proteasa, tal como PMSF, puede incluirse en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteólisis y se pueden incluir antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes adventicios.

La composición heteromultimérica preparada a partir de las células puede ser purificada utilizando, por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad la técnica de purificación que se prefiere. La idoneidad de la proteína A como un ligando de afinidad depende de la especie y el ¡sotipo de cualquier dominio Fe de inmunoglobulina que está presente en el anticuerpo. La proteína A puede utilizarse para purificar los anticuerpos que se basan en las cadenas pesadas ?1 , ?2 ó ?4 humanas (Lindmark y colaboradores, J. Immunol. Meth,, 62:1— 13 (1983)). Se recomienda la proteína G para todos los isotipos de ratón y para la ?3 humana (Guss y colaboradores, EMBO J. 5:15671575 (1986)). La matriz a la cual está unido el ligando de afinidad muy a menudo es agarosa, pero también pueden utilizarse otras matrices. Las matrices mecánicamente estables, tales como vidrio de tamaño de poro controlado o poli(estirenodivinil)benceno permiten caudales más veloces y tiempos de procesamiento más breves de los que se pueden lograr con agarosa. Si el anticuerpo comprende un dominio CH 3, la resina Bakerbond ABX™(J. T. Baker, Phillipsburg, N. J.) resulta de utilidad para la purificación. Otras técnicas para la purificación de proteínas tales como fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC en fase inversa, cromatografía sobre sílice, cromatografía en heparina Sepharose ™, cromatografía sobre resina de intercambio de aniones o cationes (por ejemplo, una columna de ácido poliaspártico), cromatoenfoque, SDS— PAGE, y precipitación con sulfato de amonio también están disponibles en función del anticuerpo que se habrá de recuperar.

Después de cualquier paso de purificación preliminar, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y los contaminantes puede ser sometida a cromatografía de interacción hidrofóbica de bajo pH utilizando una solución amortiguadora de elusión a un pH de entre aproximadamente 2,5— 4,5, realizada preferiblemente a bajas concentraciones de sal (por ejemplo, desde aproximadamente 0— 0,25 M de sal). La producción de las proteínas heteromultiméricas puede — de manera alternativa o adicional— (a cualquiera de los métodos particulares anteriores) comprender una solución de diálisis que comprende una mezcla de los polipéptidos.

Producción de anticuerpos con baculovirus El baculovirus recombinante puede ser generado por la co— transfección de un plásmido que codifica un anticuerpo o fragmento de anticuerpo y el ADN del virus BaculoGoldT (Pharmingen) en una célula de insecto tal como una célula de Spodoptera frugiperda (por ejemplo, células Sf9; ATCC CRL 1711 ) o una célula Drosophila melanogaster S2 utilizando, por ejemplo, lipofectina (disponible comercialmente a través de GIBCO— BRL). En un ejemplo particular, una secuencia de anticuerpo se fusiona aguas arriba de una etiqueta de epítopo contenida dentro de un vector de expresión de baculovirus. Estas etiquetas de epítopos incluyen etiquetas poli— His. Una variedad de plásmidos se pueden emplear, incluyendo plásmidos derivados de plásmidos disponibles comercialmente, tales como pVL1393 (Novagen) o pAcGP67B (Pharmingen). En pocas palabras, la secuencia que codifica un anticuerpo o un fragmento del mismo puede ser amplificado por PCR con cebadores complementarios a las regiones 5 'y 3'. El cebador 5 'puede incorporar flanqueo (seleccionados) sitios de enzimas de restricción. El producto puede ser, luego, digerido con las enzimas de restricción seleccionadas y subclonadas en el vector de expresión.

Después de la transfección con el vector de expresión, las células hospedantes (por ejemplo, células Sf9) se incuban durante — 5 días a 28 ° C y el virus libérado se cosecha y se utiliza para amplificaciones adicionales. La infección viral y la expresión de la proteína pueden realizarse como describen, por ejemplo, O'Reilley y colaboradores, (Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual. Oxford: Oxford University Press (1994)).

El anticuerpo etiquetado poli— His luego puede purificarse, por ejemplo mediante cromatografía de afinidad de Ni2+— quelado, de la siguiente manera. Se elaboran los extractos a partir de células Sf9 infectadas con virus, según describen Rupert y colaboradores, (Nature 362:175—179 (1993)). Brevemente, las células Sf9 se lavan, resuspenden en solución amortiguadora de sonicación (25 ml_ de HEPES a pH 7,9; 12,5 mM de MgC12; 0,1 mM de EDTA; 10% de glicerol; 1% de NP— 40; 0,4 M de KCI), y se sonican dos veces durante 20 segundos en hielo. Los sonicados se limpian por centrifugación, y el sobrenadante se diluye 50 veces en solución amortiguadora de carga (50 mM de fosfato; 300 mM de NaCI; 10% de glicerol a pH 7.8) y se filtran a través de un filtro de 0,45 pm. Una columna de Ni2+— NTA agarosa (que suministra Qiagen) se elabora con un volumen de lecho de 5 mi, se lava con 25 mi de agua y se equilibra con 25 mi de solución amortiguadora de carga. El extracto de células filtradas se carga en la columna en un caudal de 0,5 mi por minuto. La columna se lava a la línea de base A280 con solución amortiguada de carga, momento en el cual se inicia la recogida de la fracción. A continuación, la columna se lava con una solución amortiguadora de lavado secundario (50 mM de fosfato; 300 mM de NaCI, 10% de glicerol a pH 6), que eluye la proteína unida de manera no específica. Después de alcanzar nuevamente la línea de base de A280, la columna se desarrolla con un gradiente de 0 a 500 mM de imidazol en la solución de amortiguadora de lavado secundario. Fracciones de un mi se recogen y analizan por SDS— PAGE y se tiñen con plata o Western blot con conjugado de Ni2 +— NTA con fosfatasa alcalina (Qiagen). Las fracciones que contienen el anticuerpo eluido etiquetado His10 se reúnen y se dializan frente a solución amortiguadora de carga.

Como alternativa, la purificación del anticuerpo se puede realizar utilizando técnicas conocidas de cromatografía, incluyendo por ejemplo, la proteína A o proteína G cromatografía en columna. En una forma de realización, el anticuerpo de interés puede ser recuperado de la fase sólida de la columna por elusión en una solución que contiene un agente caotrópico o un detergente suave. Los ejemplos de agentes caotrópicos y detergentes suaves incluyen, pero no se limitan a, guanidina— HCI, urea, perclorato de litio, arginina, histidina, SDS (dodecilsulfato de sodio), Tween, Tritón, y NP— 40, todos los cuales están disponibles comercialmente.

Formación/ensamblaje de proteína heteromultímérica La formación de la proteína heteromultímérica completa implica el montaje de los polípéptidos que contienen Fe primero y segundo mediante la formación de puentes disulfuro que en la presente invención se refieren como replegamiento. El replegamiento incluye la asociación del a primer polipéptído que contiene Fe con el segundo polipéptído que contiene Fe y la formación de los enlaces dísulfuro entre cadenas. El replegado, también denominado renaturalízación, en la presente invención se lleva a cabo in vítro.

Las células hospedantes pueden ser cultivadas utilizando los métodos que se describen anteriormente, ya sea como cultivos separados o como un único cultivo. En un método, las células hospedantes primera y segunda se cultivan en el mismo recipiente de cultivo (a veces referido aquí como co— cultivadas o un cultivo mixto). En otro método, las células hospedante primero y segundo se cultivan en recipientes de cultivo separados. En un método, los cultivos separados son procesados por separado y luego mezclados/combinados antes de la ruptura de la membrana celular. En otro método, los cultivos separados se mezclan, y luego son procesados antes de la ruptura de la membrana celular. En un método, los cultivos separados se mezclan sin más transformación antes de la ruptura de la membrana celular. En un método, el cultivo único que comprende las células hospedantes primera y segunda se procesan antes de la ruptura de la membrana celular. En otro método, las células co— cultivadas no se procesan antes de la ruptura de la membrana celular. El procesamiento de las células comprende centrifugación y resuspensión en una solución amortiguadora apropiada (por ejemplo, solución amortiguadora de extracción).

Las soluciones amortiguadoras de extracción son conocidas en la técnica y el experto en la técnica será capaz de determinar qué solución amortiguadora corresponde usar sin experimentación indebida.

Las membranas de la célula hospedante se rompen usando métodos conocidos en la técnica. Tales métodos incluyen permeabilización de la membrana celular y la desintegración de la membrana celular. La permeabilización de la membrana celular se refiere a que la membrana presente "fugas", por ejemplo, mediante la introducción de agujeros, sin destruir la integridad general de la membrana de tal manera que la célula permanezca viable. En otras palabras, la permeabilización proporciona movimiento macromolecular través de la membrana celular y preserva la estructura celular de manera suficiente como para permitir la viabilidad celular continua. En contraste, la desintegración de la membrana lleva a que los contenidos celulares se liberen en el medio extracelular y se produzca la muerte celular.

Los métodos para romper las membranas celulares incluyen, pero no se limitan a la lisis enzimática. sonicación, choque osmótico, paso a través de un microfluidizador, adición de EDTA, utilización de diversos detergentes, disolventes (tales como tolueno, dimetilsulfóxido, etc.), agentes tensioactivos (tales como Tritón X— 100, Tween 20, etc.), soluciones amortiguadoras hipotónicas, el uso de técnicas de congelación / descongelación, electroporación, y el paso a través de un homogeneizador de bolas de acero inoxidable.

Una vez que los polipéptidos que contienen Fe son liberados de la célula (ya sea por permeabilización o desintegración) los dominios heteromultimerización impulsarán la asociación de las proteínas heteromultiméricas. La formación de disulfuro inter— cadena de los polipéptidos que contienen Fe pueden proceder con o sin la adición de agentes reductores. La proteína heteromultimérica unida a disulfuro resultante es purificada a continuación. Opcionalmente, se pueden formular para investigación, con fines de diagnóstico, terapéutico o de otro tipo.

Moléculas diana Los ejemplos de moléculas que pueden ser dirigidas por una proteína heteromultimérica de esta invención incluyen, pero no se limitan a, proteínas solubles en suero y sus receptores y otras proteínas unidas a la membrana (por ejemplo, adhesinas).

En otra forma realización, la proteína heteromultimérica de la invención es capaz de unirse a una, dos o más citoquinas, proteínas relacionadas citoquinas, y receptores de citoquinas seleccionados del grupo formado por BMPI, BMP2, BMP3B (GDFIO), BMP4, BMP6, BMP8, CSFI (M— CSF), CSF2 (GM— CSF), CSF3 (G— CSF), EPO, FGFI (aFGF), FGF2 (bFGF), FGF3 (int— 2), FGF4 (HST), FGF5, FGF6 (HST— 2), FGF7 (KGF), FGF9, FGF10, FGF11 , FGF12, FGF12B, FGF14, FGF16, FGF17, FGF19, FGF20, FGF21 , FGF23, IGF1, IGF2, IFNAI, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNBI, IFNG, IFNWI, FELI, FELI (EPSELON), FELI (ZETA), ILIA, ILIB, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, ILII, IL12A, IL12B, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL17B, IL18, IL19, IL20, IL22, IL23, IL24, IL25, IL26, IL27, IL28A, IL28B, IL29, IL30, PDGFA, PDGFB, TGFA, TGFB1 , TGFB2, TGFB3, LTA (TNF— b), LTB, TNF (TNF— a ), TNFSF4 (ligando OX40), TNFSF5 (ligando CD40), TNFSF6 (FasL), TNFSF7 (ligando CD27), T FSF8 (ligando CD30), TNFSF9 (ligando 4— 1 BB), TNFSFIO (TRAIL), TNFSF1 I (TRANCE), TNFSF12 (AP03L), TNFSF13 (Abril), TNFSF13B, TNFSF14 (HVEM— L), TNFSF15 (VEGI), TNFSF18, HGF (VEGFD), VEGF, VEGFB, VEGFC, ILIR1 , IL1 R2, IL1 RL1, LL1 RL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3RA, IL4R, IL5RA, IL6R, IL7R, IL8RA, IL8RB, IL9R, ILIORA, ILIORB, IL1 IRA, IL12RB1 , IL12RB2, IL13RA1, IL13RA2, IL15RA, IL17R, IL18R1 , IL20RA, IL21 R, IL22R, IL1 HY1 , ILIRAP, IL1 RAPL1 , IL1 RAPL2, ILIRN, IL6ST, IL18BP, IL18RAP, IL22RA2, AIFI, HGF, LEP (leptina), PTN y THPO. En otra forma de realización, una molécula diana es una quimioquina, un receptor quimioquina o una proteína relacionada con quimioquina que se selecciona del grupo formado por CCLI (I— 309), CCL2 (MCP— 1 / CAF), CCL3 (MIP— la), CCL4 (MIP— Ib), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP— 3), CCL8 (mcp— 2), CCLH (eotaxina), CCL13 (MCP— 4), CCL15 (MIP— Id), CCL16 (HCC— 4), CCL17 (TARC), CCL18 (PARC), CCL19 (MDP— 3b), CCL20 (MIP— 3a), CCL21 (SLC / exodus— 2), CCL22 (MDC / STC— I), CCL23 (MPIF— I), CCL24 (MPIF— 2 / eotaxina— 2), CCL25 (TECK), CCL26 (eotaxina— 3), CCL27 (CTACK / ILC), CCL28, CXCLI (GROI), CXCL2 (GRO2), CXCL3 (GR03), CXCL5 (ENA— 78), CXCL6 (GCP— 2), CXCL9 (MIG), CXCLIO (IP 10), CXCLII (I— TAC), CXCL12 (SDFI), CXCL13, CXCL14, CXCL16, PF4 (CXCL4), PPBP (CXCL7), CX3CL1 (SCYDI), SCYEI, XCLI (linfotactina), XCL2 (SC — Ib), BLRI (MDR15), CCBP2 (D6 / JAB61 ), CCRI (CKRI / HM145), CCR2 (mcp— IRB / RA), CCR3 (CKR3 / CMKBR3), CCR4, CCR5 (CMKBR5 / ChemR13), CCR6 (CMKBR6 / CKR— L3 / STRL22 / DRY6), CCR7 (CKR7 / EBII), CCR8 (CMKBR8 / TERI / CKR— Ll), CCR9 (GPR— 9— 6), CCRLI (VSHKI), CCRL2 (L— CCR), XCRI (GPR5 / CCXCRI), CMKLRI, CMKORI (RDCI), CX3CR1 (V28), CXCR4, GPR2 (CCRIO), GPR31 , GPR81 (FKSG80), CXCR3 (GPR9/CKR— L2), CXCR6 (TYMSTR /STRL33 / Bonzo), HM74, IL8RA (IL8Ra), IL8RB (IL8Rb), LTB4R (GPR16), TCPIO, CKLFSF2, CKLFSF3, CKLFSF4, CKLFSF5, CKLFSF6, CKLFSF7, CKLFSF8, BDNF, C5R1 , CSF3, GRCCIO (CIO), EPO, FY (DARC), GDF5, HDFIA, DL8, PRL, RGS3, RGS13, SDF2, SLIT2, TLR2, TLR4, TREMI, TREM2 y VHL.

En otra forma de realización, las proteínas heteromultiméricas de la invención tienen la capacidad de unirse a una o más dianas que se seleccionan del grupo formado por ABCFI; ACVRI; ACVRIB; ACVR2; ACVR2B; ACVRLI; AD0RA2A; Aggrecan; AGR2; AlCDA; AIFI; AIGI; AKAPI; AKAP2; AMH; AMHR2; ANGPTI; ANGPT2; ANGPTL3; ANGPTL4; ANPEP; APC; APOCI; AR; AZGPI (zinc— a— glicoproteína); B7.1 ; B7.2; BAD; BAFF (BLys); BAGI; BAII; BCL2; BCL6; BDNF; BLNK; BLRI (MDR15); BMPI; BMP2; BMP3B (GDFIO); BMP4; BMP6; BMP8; BMPRIA; BMPRIB; BMPR2; BPAGI (plectina); BRCAI; C19orflO (IL27w); C3; C4A; C5; C5R1 ; CANTI; CASP1 ; CASP4; CAVI; CCBP2 (D6 / JAB61 ); CCLI (1—309); CCLII (eotaxina); CCL13 (MCP— 4); CCL15 (MIP— Id); CCL16 (HCC— 4); CCL17 (TARC); CCL18 (PARC); CCL19 (MIP— 3b); CCL2 (MCP —1 ); MCAF; CCL20 (MIP— 3a); CCL21 ( TP— 2); SLC; exodus— 2; CCL22 (MDC / STC— I); CCL23 (MPIF— 1 ); CCL24 (MPIF— 2 / eotaxina— 2); CCL25 (TECK); CCL26 (eotaxina— 3); CCL27 (CTACK / ILC); CCL28; CCL3 (MTP— la); CCL4 (MDP— Ib); CCL5 (RANTES); CCL7 (MCP— 3); CCL8 (mcp— 2); CCNAI; CCNA2; CCNDI; CCNEI; CCNE2; CCRI (CKRI / HM145); CCR2 (mcp— IRB / RA);CCR3 (CKR3 / CMKBR3); CCR4; CCR5 (CMKBR5 / ChemR13); CCR6 (CMKBR6 / CKR— L3 / STRL22 / DRY6); CCR7 (CKR7 / EBII); CCR8 (CMKBR8 / TERI / CKR— Ll); CCR9 (GPR— 9— 6); CCRLI (VSHKI); CCRL2 (L— CCR); CD164; CD19; CDIC; CD20; CD200; CD22; CD24; CD28; CD3; CD37; CD38; CD3E; CD3G; CD3Z; CD4; CD40; CD40L; CD44; CD45RB; CD52; CD69; CD72; CD74; CD79A; CD79B; CD8; CD80; CD81 ; CD83; CD86; CDHI (E— caderina); CDH10; CDH12; CDH13; CDH18; CDH19; CDH20; CDH5; CDH7; CDH8; CDH9; CDK2; CDK3; CDK4; CDK5; CDK6; CDK7; CDK9; CDKNIA (p21Wapl/Cipl); CDKNIB (p27K¡pl); CDKNIC; CDKN2A (P16INK4a); CDKN2B; CDKN2C; CDKN3; CEBPB; CERI; CHGA; CHGB; Chitinasa; CHST10; CKLFSF2; CKLFSF3; CKLFSF4; CKLFSF5; CKLFSF6; CKLFSF7; CKLFSF8; CLDN3;CLDN7 (claudina— 7); CLN3; CLU (clusterina); CMKLRI; CMKORI (RDCI); CNRI; COL18A1 ; COLIAI; COL4A3; COL6A1 ; CR2; CRP; CSFI (M— CSF); CSF2 (GM— CSF); CSF3 (GCSF);CTLA4; CTNNBI (b— catenina); CTSB (catepsina B); CX3CL1 (SCYDI); CX3CR1 (V28); CXCLI (GROI); CXCL10 (IP— 10); CXCLII (I— TAC / IP— 9); CXCL12 (SDFI); CXCL13; CXCL14;CXCL16; CXCL2 (GRO2); CXCL3 (GRO3); CXCL5 (ENA— 78 / LIX); CXCL6 (GCP— 2); CXCL9 (MIG); CXCR3 (GPR9/CKR— L2); CXCR4; CXCR6 (TYMSTR /STRL33 / Bonzo); CYB5; CYCI; CYSLTRI; DAB2IP; DES; DKFZp451 J0118; DNCLI; DPP4; E2F1 ; ECGFI; EDGI; EFNAI; EFNA3; EFNB2; EGF; EGFR; ELAC2; ENG; ENO1 ; ENO2; ENO3; EPHB4; EPO; ERBB2 (Her— 2); EREG; ERK8; ESRI; ESR2; F3 (TF); FADD; FasL; FASN; FCERIA; FCER2; FCGR3A; FGF; FGFI (aFGF); FGF10; FGF11 ; FGF12; FGF12B; FGF13; FGF14; FGF16; FGF17; FGF18; FGF19; FGF2 (bFGF); FGF20; FGF21 ; FGF22; FGF23; FGF3 (int— 2); FGF4 (HST); FGF5; FGF6 (HST— 2); FGF7 (KGF); FGF8; FGF9; FGFR3; FIGF (VEGFD); FELI (EPSILON); FILI (ZETA); FLJ12584; FLJ25530; FLRTI (fibronectina); FLTI; FOS; FOSLI (FRA— I); FY (DARC); GABRP (GABAa); GAGEBI; GAGECI; GALNAC4S— 6ST; GATA3; GDF5; GFI1 ; GGT1 ; GM— CSF; GNASI; GNRHI; GPR2 (CCRIO); GPR31 ; GPR44; GPR81 (FKSG80); GRCCIO (CIO); GRP; GSN (Gelsolina); GSTPI; HAVCR2; HDAC4; HDAC5; HDAC7A; HDAC9; HGF; HIFIA; HDPI; histamina y receptores de histamina; HLA— A; HLA— DRA; HM74; HMOXI ; HUMCYT2A; ICEBERG; ICOSL; ID2; IFN— a; IFNAI; IFNA2; IFNA4; IFNA5; IFNA6; IFNA7; IFNB1 ; IFN— gamma; DFNWI; IGBPI; IGFI; IGFIR; IGF2; IGFBP2; IGFBP3; IGFBP6; IL— I; IL10; IL10RA; IL10RB; IL11 ; IL11 RA; IL— 12; IL12A; IL12B; IL12RB1 ; IL12RB2; IL13; IL13RA1 ; IL13RA2; IL14; IL15; IL15RA; IL16; IL17; IL17B; IL17C; IL17R; IL18; IL18BP; IL18R1 ; IL18RAP; IL19; IL1A; IL1 B; ILIF10; IL1 F5; IL1 F6; IL1 F7; IL1 F8; IL1 F9; IL1 HYI; IL1 RI; IL1 R2; IL1 RAP; IL1 RAPL1 ; IL1 RAPL2; IL1 RL1 ; IL1 RL2, ILIRN; IL2; IL20; IL20RA; IL21 R; IL22; IL22R; IL22RA2; IL23; IL24; IL25; IL26; IL27; IL28A; IL28B; IL29; IL2RA; IL2RB; IL2RG; IL3; IL30; IL3RA; IL4; IL4R; IL5; IL5RA; IL6; IL6R; IL6ST (glicoproteína 130); EL7; EL7R; EL8; IL8RA; DL8RB; IL8RB; DL9; DL9R; DLK; INHA; INHBA;INSL3; INSL4; IRAKI; ERAK2; ITGAI; ITGA2; ITGA3; ITGA6 (a6 integrina); ITGAV; ITGB3; ITGB4 (b 4 integrina); JAGI; JAKI; JAK3; JUN; K6HF; KAN; KDR; KITLG; KLF5 (GC Box BP); KLF6; KLKIO; KLK12; KLK13; KLK14; KLK15; KLK3; KLK4; KLK5; KLK6; KLK9; KRT1 ; KRT19 (Keratina 19); KRT2A; KHTHB6 (keratina tipo H específica del cabello); LAMAS; LEP (leptina); Lingo— p75; Lingo— Troy; LPS; LTA (TNF— b); LTB; LTB4R (GPR16); LTB4R2; LTBR; MACMARCKS; MAG or Omgp ; MAP2K7 (c— Jun); MDK; MIBI; midquina; MEF; MIP— 2; MKI67; (Ki— 67); MMP2; MMP9; MS4A1 ; MSMB; MT3 (metalotionectina— III); MTSSI; MUCI (mucina); MYC; MYD88; NCK2; neurocano; NFKBI; NFKB2; NGFB (NGF); NGFR; NgR— Lingo; NgR— Nogo66 (Nogo); NgR— p75; NgR— Troy; NMEI (NM23A); N0X5; NPPB; NROBI; NR0B2; NRIDI; NR1 D2; NR1H2; NR1 H3; NR1 H4; NR1 I2; NR1 I3; NR2C1 ; NR2C2; NR2E1 ; NR2E3; NR2F1 ; NR2F2; NR2F6; NR3C1 ; NR3C2; NR4A1 ; NR4A2; NR4A3; NR5A1 ; NR5A2; NR6A1 ; NRPI; NRP2; NT5E; NTN4; ODZI; OPRDI; P2RX7; PAP; PARTI; PATE; PAWR; PCA3; PCNA; PDGFA; PDGFB; PECAMI; PF4 (CXCL4); PGF; PGR; fosfacano; PIAS2; PIK3CG; PLAU (uPA); PLG; PLXDCI; PPBP (CXCL7); PPID; PRI; PRKCQ; PRKDI; PRL; PROC; PROK2; PSAP; PSCA; PTAFR; PTEN; PTGS2 (COX— 2); PTN; RAC2 (p21 Rac2); RARB; RGSI; RGS13; RGS3; RNFIIO (ZNF144); ROB02; S100A2; SCGB1 D2 (lipofilina B); SCGB2A1 (mamaglobina 2); SCGB2A2 (mamaglobina 1 ); SCYEI (citoquina que activa monocitos endoteliales); SDF2; SERPINAI; SERPINA3; SERP1 NB5 (maspina); SERPINEI (PAI— I); SERPDMF1 ; SHBG; SLA2; SLC2A2; SLC33A1 ; SLC43A1 ; SLIT2; SPPI; SPRRIB (Sprl); ST6GAL1 ; STABI; STAT6; STEAP; STEAP2; TB4R2; TBX21 ; TCPIO; TDGFI; TEK; TGFA; TGFBI; TGFBIII; TGFB2; TGFB3; TGFBI; TGFBRI; TGFBR2; TGFBR3; THIL; THBSI (trombospondina—1 ); THBS2; THBS4; THPO; TIE (Tie— 1); TMP3; tissue factor; TLRIO; TLR2; TLR3; TLR4; TLR5; TLR6; TLR7; TLR8; TLR9; TNF; TNF— a; TNFAEP2 (B94); TNFAIP3; TNFRSFIIA; TNFRSFIA; TNFRSFIB; TNFRSF21 ; TNFRSF5; TNFRSF6 (Fas); TNFRSF7; TNFRSF8; TNFRSF9; TNFSFIO (TRAIL); TNFSFI 1 (TRANCE); TNFSF12 (AP03L); TNFSF13 (April); TNFSF13B; TNFSF14 (HVEM— L); TNFSF15 (VEGI); TNFSF18; TNFSF4 (ligando OX40); TNFSF5 (ligando CD40); TNFSF6 (FasL); TNFSF7 (ligando CD27); TNFSF8 (ligando CD30); TNFSF9 (ligando 4— 1 BB ); TOLLIP; receptores similares a Toll; TOP2A (topoisomerasa Ea); TP53; TPMI; TPM2; TRADD; TRAFI; TRAF2; TRAF3; TRAF4; TRAF5; TRAF6; TREMI; TREM2; TRPC6; TSLP; TWEAK; VEGF; VEGFB; VEGFC; versicano; VHL C5; VLA— 4; XCLI (linfotactina); XCL2 (SCM— Ib); XCRI(GPR5 / CCXCRI); YYI y ZFPM2.

Las moléculas diana que se prefieren para los anticuerpos encuadrados dentro de la presente invención incluyen las proteínas CD, tales como CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD20, CD34; CD64, CD200; miembros de la familia del receptor ErbB, tal como el receptor EGF; el receptor HER2, HER3 ó HER4; moléculas de adhesión celular, tales como LFA— 1 , Mac1 , p150.95, VLA— 4, ICAM— 1 , VCAM, integrina alfa4/beta7 e integrina alfa/beta3, que incluye sus subunidades alfa o beta (por ejemplo, anticuerpos anti— CD11a, anti— CD18 o anti— CD11 b); factores de crecimiento, tales como VEGF— A, VEGF— C; factor tisular (TF); interferón alfa (?IFN— alfa); TNF— alfa, una interleucina, tal como IL— 1 beta, IL— 3, IL— 4, IL— 5, IL— 8, IL— 9, IL— 13, IL17A/F, IL— 18, IL— 13Ralfa1 , IL13R— alfa2, IL— 4R, IL— 5R, IL— 9R, IgE; antígenos del grupo sanguíneo; receptor flk2/flt3; receptor de obesidad (OB); receptor mpl; CTLA— 4; RANKL, RANK, proteína RSV F, proteína C, etc.

En una forma de realización, las proteínas heteromultiméricas de la presente invención se unen a la proteína relacionada con el receptor de la lipoproteína de baja densidad (LRP)— 1 ó LRP— 8 o bien receptor de transferrina y, al menos, una diana que se selecciona del grupo que consiste de 1 ) beta— secretasa (BACE1 ó BACE2), 2) alfa— secretasa, 3) gamma— secretasa, 4) tau— secretasa, 5) proteína precursora amiloide (APP), 6) receptor de muerte 6 (DR6), 7) péptido beta amiloide, 8) alfa— sinucleina, 9) Parkina, 10) Huntingtina, 11 ) p75 NTR y 12) caspasa— 6.

En una forma de realización, una proteína heteromultimérica de la presente invención se une a, al menos, dos moléculas diana que se seleccionan del grupo que consiste de: IL— lalfa y IL— Ibeta, IL— 12 y IL— 18; IL— 13 y IL— 9; IL— 13 y IL— 4; IL— 13 y IL— 5; IL— 5 y IL— 4; IL— 13 y IL— Ibeta; IL— 13 y IL— 25; IL— 13 y TARC; IL— 13 y MDC; IL— 13 y MEF; IL— 13 y TGF— ß; IL— 13 y agonista LHR ; IL— 12 y TWEAK, IL— 13 y CL25; IL— 13 y SPRR2a; IL— 3 y SPRR2b; IL— 13 y ADAM8, IL— 13 y PED2, IL17A y IL17F, CD3 y CD19, CD138 y CD20; CD138 y CD40; CD19 y CD20; CD20 y CD3; CD38 y CD138; CD38 y CD20; CD38 y CD40; CD40 y CD20; CD— 8 y IL— 6; CD20 y BR3, TNF— alfa y TGF— beta, TNF— alfa y IL— Ibeta; TNF— alfa y IL— 2, TNF alfa y IL— 3, TNF— alfa y IL— 4, TNF— alfa y IL— 5, TNF— alfa y IL6, TNF— alfa y IL8, TNF— alfa y IL— 9, TNF— alfa y IL— 10, TNF— alfa y IL— 11 , TNF— alfa y IL— 12, TNF— alfa y IL— 13, TNF— alfa y IL— 14, TNF— alfa y IL— 15, TNF— alfa y IL— 16, TNF— alfa y IL— 17, TNF— alfa y IL— 18, TNF— alfa y IL— 19, TNF— alfa y IL— 20, TNF— alfa y IL— 23, TNF— alfa y IFN— alfa, TNF— alfa y CD4, TNF— alfa y VEGF, TNF— alfa y MIF, TNF— alfa y ICAM— 1 , TNF— alfa y PGE4, TNF— alfa y PEG2, TNF— alfa y ligando RANK; TNF— alfa y Te38; TNF— alfa y BAFF; TNF— alfa y CD22; TNF— alfa y CTLA— 4; TNF— alfa y GP130; TNFa y IL— 12p40; VEGF y HER2, VEGF— A y HER2, VEGF— A y PDGF, HER1 y HER2, VEGF— A y VEGF— C, VEGF— C y VEGF— D, HER2 y DR5.VEGF y IL— 8, VEGF y MET, VEGFR y receptor MET, VEGFR y EGFR, HER2 y CD64, HER2 y CD3, HER2 y CD16, HER2 y HER3; EGFR(HERI ) y HER2, EGFR y HER3, EGFR y HER4, IL— 13 y CD40L, IL4 y CD40L, TNFR1 y IL— 1 R, TNFR1 y IL— 6R y TNFR1 y IL— 18R, EpCAM y CD3, MAPG y CD28, EGFR y CD64, CSPGs y RGM A; CTLA— 4 y BTN02; IGF1 y IGF2; IGF1/2 y Erb2B; MAG y RGM A; NgR y RGM A; NogoA y RGM A; OMGp y RGM A; PDL— I y CTLA— 4; y RGM A y RGM B.

Los antígenos solubles o fragmentos de los mismos, opcionalmente conjugados con otras moléculas, se pueden utilizar como inmunógenos para generar anticuerpos. Para las moléculas transmembrana, tales como receptores, los fragmentos de estos (por ejemplo, el dominio extracelular de un receptor) se pueden utilizar como inmunógeno. Como alternativa, las células que expresan la molécula de transmembrana se pueden utilizar como inmunógeno. Dichas células se pueden derivar de una fuente natural (por ejemplo, líneas celulares de cáncer) o pueden ser células que han sido transformadas por técnicas recombinantes para expresar la molécula de transmembrana. Otros antígenos y las formas de los mismos útiles para la preparación de anticuerpos serán evidentes para aquellos especialistas en la técnica.

Ensayos de actividad Las proteínas heteromultiméricas de la presente invención se pueden caracterizar por sus propiedades físicas / químicas y funciones biológicas mediante varios ensayos conocidos en la técnica.

Las proteínas heteromultiméricas puede ser caracterizadas además por una serie de ensayos que incluyen, pero no se limitan a, secuenciación del extremo N terminal, análisis de aminoácidos, cromatografía líquida a alta presión de exclusión por tamaño (HPLC), espectrometría de masas, cromatografía de intercambio iónico y digestión con papaína.

En ciertas formas de realización de la invención, las inmunoglobulinas producidas aquí son analizadas para determinar su actividad biológica. En algunas formas de realización, las inmunoglobulinas de la presente invención se testearon para determinar su actividad de unión al antígeno. Los ensayos de unión al antígeno que se conocen en la técnica y pueden ser utilizados aquí incluyen, sin limitación, cualquier ensayo de unión competitiva o directa utilizando técnicas tales como transferencia Western, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo inmunoabsorbente unido por enzimas), inmunoensayos "sandwich", ensayos de inmunoprecipitación , inmunoensayos fluorescentes e inmunoensayos con proteína A. Un ensayo de unión al antígeno ilustrativo se proporciona a continuación en la sección de Ejemplos.

En una forma de realización, la presente invención contempla un anticuerpo alterado que posee algunas pero no todas las funciones efectoras, que lo hacen un candidato deseado para muchas aplicaciones en las que la semivida media in vivo es importante, si bien ciertas funciones efectoras (tales como complemento y ADCC) son innecesarias o perjudiciales. En ciertas formas de realización, las actividades de Fe de la proteína heteromultimérica producida se miden para garantizar que sólo se mantengan las propiedades deseadas. Los ensayos de citotoxicidad in vitro o in vivo puede llevarse a cabo para confirmar la reducción / agotamiento de CDC y / o actividades de ADCC. Por ejemplo, los ensayos de unión a los receptores Fe (FCR) pueden llevarse a cabo para asegurar que la proteína heteromultimérica carece de unión al FcyR (por lo tanto es probable que carezca de actividad ADCC), pero conserva la capacidad de unión a FcRn. Las células primarias para la mediación de las células NK y ADCC, expresan Fc(RIII solamente, mientras que los monocitos expresan Fc(RI, Fc(RII y Fc(RIII. La expresión de FcR sobre células hematopoyéticas se sintetiza en la tabla 3 de la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457— 92 (1991 ). Un ejemplo de un ensayo in vitro para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés se describe en la patente estadounidense número 5.500.362 ó 5.821.337. Las células efectoras de utilidad para dichos ensayos Incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células asesinas naturales (NK). Como alternativa o de manera adicional, la actividad ADCC de la molécula de interés puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal, tal como el que se revela en Clynes y colaboradores, PNAS (USA) 95:652—656 (1998). Los ensayos de unión a C1 q también pueden llevarse a cabo para confirmar que el anticuerpo es incapaz de unirse a C1q y por lo tanto carece de actividad de CDC. Para evaluar la activación de complemento, se puede realizar un ensayo de CDC, por ejemplo de la manera que describen Gazzano— Santoro y colaboradores, J. Immunol. Methods 202:163 (1996). La unión a FcRn y las determinaciones in vivo de la depuración/semivida también se pueden realizar utilizando métodos conocidos en la técnica.

Proteínas conjugadas La invención también proporciona proteínas conjugadas tales como anticuerpos conjugados o inmunoconjugados (por ejemplo, "anticuerpos conjugados con fármaco" o "ADC"), que comprenden cualquiera de las proteínas heteromultiméricas aquí que se describen (por ejemplo, un anticuerpo hecho de acuerdo con los métodos que se describen en este documento), donde una de las regiones constantes de la cadena liviana o la cadena pesada está conjugada a una molécula química, tales como un agente colorante o citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, un fármaco, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de bacterias, hongos, plantas o de origen animal, o fragmentos de los mismos), o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado). En particular, como se describe aquí, la utilización de dominios de heteromultimerización permite la construcción de anticuerpos que contienen dos cadenas pesadas diferentes (HC1 y HC2), así como dos cadenas livianas diferentes (LC1 y LC2). Un constructo inmunoconjugado que utiliza los métodos que se describen aquí puede contener el agente citotóxico conjugado a una región constante de una sola de las cadenas pesadas (HC1 o HC2) o sólo una de las cadenas livianas (LC1 o LC2). Además, debido a que el inmunoconjugado puede tener el agente citotóxico unido a sólo una cadena pesada o liviana, la cantidad del agente citotóxico que se administra a un sujeto se reduce con relación a la administración de un anticuerpo que tiene el agente citotóxico unido a ambas cadenas pesadas o livianas. Al reducir la cantidad de agente citotóxico que se administra a un sujeto limita los efectos secundarios adversos asociados con el agente citotóxico.

El uso de los conjugados anticuerpo— fármaco para la administración local de agentes citotóxicos o citostáticos, es decir, medicamentos que matan o inhiben las células tumorales en el tratamiento del cáncer (Syrigos y Epenetos, Anticancer Research 19:605—614 (1999); Niculescu— Duvaz y Springer, Adv. Drg. Del. Rev. 26:151—172 (1997); la patente estadounidense número 4.975.278) permite la administración selectiva de la fracción de drogas a los tumores, y la acumulación intracelular en el mismo, donde la administración sistémica de estos agentes de fármacos no conjugados pueden dar lugar a niveles inaceptables de toxicidad para las células normales, así como para las células tumorales que se pretende eliminar (Baldwin y colaboradores, Lancet (Mar. 15, 1986):603— 605 (1986); Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review," en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera y colaboradores, (ed.s), páginas 475— 506). Con ello, se busca la eficacia máxima con una toxicidad mínima. Tanto los anticuerpos policlonales y anticuerpos monoclonales han sido reportados como útiles en estas estrategias (Rowland y colaboradores, Cáncer Immunol. Immunother. 21 :183— 187 (1986)). Los fármacos utilizados en estos métodos incluyen daunomicina, doxorubicina, metotrexato y vindesina (Rowland y colaboradores, (1986) ya citados). Las toxinas utilizadas en los conjugados anticuerpo— toxina incluyen toxinas bacterianas tales como toxina de la difteria, toxinas de plantas tales como ricina, toxinas de moléculas pequeñas tales como geldanamicina (Mandler y colaboradores, Jour. of the Nat. Cáncer Inst. 92(19):1573— 1581 (2000); Mandler y colaboradores, Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025—1028 (2000); Mandler y colaboradores, Bioconjugate Chem. 13:786— 791 (2002)), maitansinoides (EP 1391213; Liu y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:8618—8623 (1996)) y caliqueamicina (Lode y colaboradores, Cáncer Res. 58:2928 (1998); Hinman y colaboradores, Cáncer Res. 53:3336— 3342 (1993)). Las toxinas pueden producir sus efectos citotóxicos y citostáticos por los mecanismos que incluyen la unión a tubulina, unión al ADN, o la inhibición de la topoisomerasa. Algunos fármacos citotóxicos tienden a ser inactivos o menos activos cuando se conjugan a anticuerpos o ligandos receptores de proteínas.

Los agentes quimioterapéuticos que resultan de utilidad para generar inmunoconjugados se describen en la presente (por ejemplo, en los párrafos que anteceden). Las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden ser utilizadas incluyen cadena de difteria A, fragmentos activos no vinculantes de la toxina diftérica, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfa— sarcina, las proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantína, proteínas Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP— S), inhibidor de la momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Consultar, por ejemplo, la patente WO 93/21232 publicada el 28 de octubre de 1993. Se encuentra a disposición una variedad de radionucleidos para la producción de anticuerpos radioconjugados. Entre los ejemplos se incluyen 212Bi, 131l, 131ln, 90Y y 186Re. Los conjugados del anticuerpo y agente citotoxico se elaboran usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales, tales como N— succinimidil— 3— (2— piridilditiol) propíonato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tal como clorhidrato de dimetil adipimidato), esteres activos (tal como suberato de disuccinimidilo), aldehidos (tal como glutaraldehído), compuestos bis— azido (tal como bis (p— azidobenzoilo) hexanediamina), derivados de bis— diazonio (tal como bis— (p— diazoniobenzoilo)— etilenediamina), diisocianatos (tal como 2,6— diisocianato de tolueno) y compuestos de flúor bi— activos (tal como 1 ,5— difluoro— 2,4— dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede elaborar una inmunotoxina de ricino, según se describe en Vitetta y colaboradores, Science 238:1098 (1987). El ácido 1— isotiocianatobencil— 3— metildietileno triaminepentaacético marcado con carbono (MX— DTPA) es un ejemplo de agente quelante para la conjugación de radionucleotidos con el anticuerpo. Ver, por ejemplo, la patente W094/11026.

También quedan contemplados dentro de la presente, los conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de moléculas pequeñas, tales como una caliqueamicina, maitansinoidas, dolastatinas, aurostatinas, un tricoteceno y CC1065 y los derivados de estas toxinas que tienen actividad de toxina.

Maitansina y maitansinoides En algunas formas de realización, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo (de longitud completa o fragmentos) de la invención conjugados en una o más moléculas maitansinoides.

Los maitansinoides son inhibidores mitotóticos que actúan mediante la inhibición de la polimerización de tubulina. La maitansina se aisló primeramente a partir del arbusto procedente del Este de África Maytenus serrata (la patente estadounidense número 3.896.111 ). Posteriormente, se descubrió que ciertos microbios también producen maitansinoides, tal como maitansinol y ésteres de C— 3 maitansinol (la patente estadounidense número 4.151.042). El maitansinol sintético, al igual que sus derivados y análogos se revelan, por ejemplo, en las patentes estadounidenses que llevan los siguientes números: 4.137.230; 4.248.870; 4.256.746; 4.260.608; 4.265.814; 4.294.757; 4.307.016; 4.308.268; 4.308.269; 4.309.428; 4.313.946; 4.315.929; 4.317.821 ; 4.322.348; 4.331 .598; 4.361.650; 4.364.866; 4.424.219; 4.450.254; 4.362.663; y 4.371.533.

Las fracciones de fármaco maitansinoides son fracciones de fármacos atractivos en los conjugados de fármacos de anticuerpos dado que son: (i) relativamente accesibles para elaborar por medio de fermentación o modificación química, derivación de productos de la fermentación; (ii) tratables para derivación con grupos funcionales adecuados para la conjugación a través de ligadores no disulfuro con anticuerpos; (iii) estables en plasma y (iv) eficaces contra una variedad de líneas celulares de pulmón.

Los inmunoconjugados que contienen maitansinoides, los métodos para su elaboración y su empleo con fines terapéuticos se revelan, por ejemplo, en las patentes estadounidenses que llevan los números 5.208.020 y 5.416.064 y la patente europea EP 0 425 235 B1 , cuyas revelaciones quedan expresamente incorporadas a la presente por referencia. Liu y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:8618— 8623 (1996) describieron inmunoconjugados que comprenden un maitansinoide denominado DM1 que se une al anticuerpo monoclonal C242 dirigido contra el cáncer colorrectal en seres humanos. Se halló que el conjugado era altamente citotóxico hacia las células del cáncer de colon cultivadas, y demostró actividad antitumoral y en un ensayo de crecimiento tumoral in vivo. Chari y colaboradores, Cáncer Research 52:127— 131 (1992) describen inmunoconjugados donde un maitansinoide se conjugó a través de un ligador disulfuro con el anticuerpo murino A7 que se une a un antígeno en líneas celulares de cáncer de colon humano o bien a otro anticuerpo monoclonal murino TA.1 que se une al oncogén HER— 2/neu. La citotoxicidad del conjugado maitansinoide TA.1 se sometió a ensayos in vitro en la línea de células de cáncer de mama humano SK— BR— 3, que expresa 3 x 105 HER— 2 antígenos de superficie por célula. El conjugado de fármaco logró un grado de citotoxicidad similar al fármaco maitansinoide libre, que puede aumentar si se aumenta el número de moléculas maitansinoides por molécula de anticuerpo. El conjugador maitansinoide A7 demostró baja citotoxicidad sistémica en ratones.

Los conjugados anticuerpo— maitansinoide se elaboran uniendo de manera química un anticuerpo a una molécula maitansinoide sin reducir de modo significativo la actividad biológica del anticuerpo ni de la molécula maitansinoide. Ver, por ejemplo, la patente estadounidense número 5.208.020, cuyas revelaciones se incorporan íntegramente a la presente por referencia. Un promedio de 3 ó 4 moléculas maitansinoides conjugadas por molécula de anticuerpo conjugado demostraron eficacia para mejorar la citotoxicidad de células diana sin afectar de manera negativa la función ni la solubilidad del anticuerpo, si bien aún puede esperarse que una molécula de toxina/anticuerpo mejore la citotoxicidad con el uso del anticuerpo desnudo. Los maitansinoides son bien conocidos en la técnica y se pueden sintetizar a través de técnicas conocidas o bien pueden aislarse de fuentes naturales. Los maitansinoides adecuados se revelan, por ejemplo en la patente estadounidense número 5.208.020 y en las otras patentes y publicaciones que son patentes a las cuales se hace referencia en la presente. Los maitansinoides preferidos son maitansinol y análogos de maitansinol modificados en el anillo aromático o en otras posiciones de la molécula maitansinol, tal como varios ésteres de maitansinol.

Existen muchos grupos ligadores que se conocen en la técnica para elaborar conjugados anticuerpo— maitansinoide, incluso por ejemplo los que se revelan en la patente estadounidense número 5.208.020 o en la patente EP 0 425 235 B1 , Chari y colaboradores, Cáncer Research 52:127— 131 (1992), y la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos número 2005/0169933, cuyas revelaciones quedan expresamente incorporadas a la presente por referencia. Los conjugados anticuerpo— maitansinoide que comprenden el componente ligador SMCC pueden elaborarse de la manera que se revela en la publicación de la solicitud de patente estadounidense número 2005/0169933. Los grupos de unión incluyen grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos lábiles en medio ácido, grupos fotolábiles, grupos peptidasa lábiles o grupos lábiles esterasa, como se describe en las patentes anteriormente identificadas, siendo los preferidos los disulfuro y grupos tioéter. En la presente se describen y ejemplifican otros grupos de unión. Los conjugados de anticuerpo y maitansinoide pueden elaborarse con el empleo de una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales, tales como propionato de N— succinimidil— 3— (2— piridilditio) (SPDP), succinimidil— A— (N— maleimidometil) ciclohexano— 1— carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tal como clorhidrato de dimetil adipimidato), ésteres activos (tal como suberato de disuccinimidilo), aldehidos (tal como glutaraldehído), compuestos bis— azido (tal como bis (p— azidobenzoilo) hexanediamina), derivados de bis— diazonio (tal como bis— (p— diazoniobenzoil)— etilenediamina), diisocianatos (tal como 2,6— diisocianato de tolueno), y compuestos de flúor bi— activos (tal como 1 ,5— difluoro— 2,4— dinitrobenceno). Los agentes de acoplamiento particularmente preferidos incluyen propionato de N— succinimidil— 3— (2— piridilditio) (SPDP) (Carlsson y colaboradores, Biochem. J. 173:723—737 (1978)) y N— succinimidil— 4— (2— pirid¡ltio)pentanoato (SPP) para proporcionar ligador disulfuro.

El ligador puede unirse a la molécula maitansinoide en varias posiciones, según el tipo de unión. Por ejemplo, un enlace éster se pueden formar por reacción con un grupo hidroxilo utilizando técnicas convencionales de acoplamiento. La reacción puede producirse en la posición C— 3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C— 14 modificada con hidroximetilo, la posición C— 15 modificada con un grupo hidroxilo, y la posición C— 20 que tiene un grupo hidroxilo. En una forma de realización preferida, la relación está formada en la posición C— 3 de maitansinol o un análogo maitansinol. ii. Auristatinas y dolastatinas En algunas formas de realización, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo de la invención conjugado con dolastatinas o dolostatina análogos peptídicos y derivados, los auristatinas (patentes estadounidenses números 5.635.483 y 5.780.588). Se ha demostrado que las dolastatinas y auristatinas interfieren con la dinámica de microtúbulos, la hidrólisis de GTP y la división nuclear y celular (Woyke y colaboradores, Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580— 3584 (2001 )) y tienen actividad anticancerígena (la patente estadounidense número 5.663.149) y antifúngica (Pettit y colaboradores, Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961— 2965 (1998)). La fracción de fármaco dolastatina o auristatina puede unirse al anticuerpo a través del extremo N— (amino) terminal o el extremo C— (carboxi) terminal de la fracción de fármaco peptídico (WO 02/088172).

Las formas de realización de ejemplo de auristatina incluyen las fracciones de fármacos monometilauristatina unidas en el extremo N terminal DE y DF, que se revelan en "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", publicación de solicitud estadounidense número 2005/0238649, cuyas revelaciones se incorporan íntegramente a la presente por referencia.

Las fracciones de fármacos basados en péptidos pueden elaborarse al formar una unión peptídica entre dos o más aminoácidos o fragmentos peptídicos. Dichas uniones de péptidos pueden elaborarse, por ejemplo, según el método de síntesis en fase líquida (ver, E. Schróder y K. Lübke, "The Peptides," volumen 1 , páginas 76— 136, 1965, Academic Press) que es bien conocido en el campo de la química de péptidos. Las fracciones de fármaco auristatina/dolastatina pueden elaborarse según los métodos de: las patentes estadounidenses números 5.635.483 y 5.780.588; Pettit y colaboradores, J. Nat. Prod. 44:482—485 (1981); Pettit y colaboradores, Anti— Cáncer Drug Design 13:47— 66 (1998); Poncet, Curr. Pharm. Des. 5:139—162 (1999); al igual que Pettit, Fortschr. Chem. Org. Naturst. 70:1— 79 (1997). Ver, asimismo, Doronina, Nat. Biotechnol. 21(7):778— 784 (2003); y "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands," publicación de la solicitud de patente estadounidense número 2005/0238649, que se incorpora íntegramente a la presente por referencia (donde se revelan, por ejemplo, ligadores y métodos para elaborar compuestos de monometilvalina, tal como MMAE y conjugados de MMAF con los ligadores). iii. Caliqueamicina En otras formas de realización, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo de la invención conjugado en una o más moléculas de caliqueamicina. La familia de antibióticos de caliqueamicina es capaz de producir rupturas de ADN bicatenario en concentraciones por debajo de las picomolares. Para la elaboración de conjugados de la familia de caliqueamicina, consultar las patentes estadounidenses números 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701 , 5.770.710, 5.773.001 y 5.877.296 (todas ellas concedidas a American Cyanamid Company). Los análogos estructurales de la caliqueamicina que se pueden emplear, incluyen, sin carácter restrictivo, ?-?', 02', 03', N— acetil— ?-?', PSAG y ?? (Hinman y colaboradores, Cáncer Research 53:3336— 3342 (1993), Lode y colaboradores, Cáncer Research 58:2925— 2928 (1998) y las mencionadas patentes estadounidenses que fueron concedidas a American Cyanamid). Otro fármaco anti— tumoral donde el anticuerpo puede conjugarse es QFA, que es un antifolato. Tanto la caliqueamicina como la QFA tienen sitios de acción intracelulares y no cruzan fácilmente la membrana plasmática. Por lo tanto, la absorción celular de estos agentes a través de la internalización mediada por antibióticos mejora en gran medida sus efectos citotóxicos.

Otros agentes citotóxicos Otros agentes antitumorales que se pueden conjugar con los anticuerpos de la invención o que se pueden elaborar según los métodos que se describen en la presente incluyen BCNU, estreptozoicina, vincristina y 5— fluorouracil, la familia de agentes a los que colectivamente se conoce como complejo LL— E33288, el cual se describe en las patentes estadounidenses números 5.053.394 y 5.770.710, al igual que las esperamicinas (la patente estadounidense número 5.877.296).

Las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden ser utilizados incluyen cadena A de la difteria, fragmentos activos no vinculantes de la toxina diftérica, cadena A de la exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfa— sarcina, las proteínas de Aleurites fordii , proteínas de diantina, las proteínas Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP— S), inhibidor de la momordica charantia, curcina, cretina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, y los tricotecenos (ver, por ejemplo, la patente WO 93/21232, que se publicó el 28 de octubre de 1993) La presente invención también contempla un inmunoconjugado formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolítica (por ejemplo, una ribonucleasa o una endonucleasa de ADN, tal como desoxiribonucleasa, DNasa). Para la destrucción selectiva de un tumor, el anticuerpo puede comprender un átomo altamente radiactivo. Se encuentra a disposición una variedad de isótopos radiactivos para la producción de anticuerpos radioconjugados. Los ejemplos incluyen At211, I131. I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 y los isótopos radiactivos de Lu. Cuando se usa el conjugado para detección, puede comprender un átomo radiactivo para estudios escintigráficos, por ejemplo tc99m o I123, ó una etiqueta de rotación para generación de imágenes por resonancia magnética nuclear (NMR) (que también se conoce como generación de imágenes por resonancia magnética, MRI), tal como yodo 123, yodo 131 , indio 111 , flúor 19, carbono 13, nitrógeno 15, oxígeno 17, gadolinio, manganeso o hierro.

Las marcas de radio o de otro tipo pueden incorporarse en el conjugado de maneras conocidas. Por ejemplo, el péptido puede biosintetizarse o puede sintetizarse a través de la síntesis química de aminoácidos con el empleo de precursores de aminoácidos que implican, por ejemplo, flúor 19 en lugar de hidrógeno. Las marcas tales como tc99m o I123, Re186, Re188 e ln111 pueden unirse a través de un residuo cisteína en el péptido. Se puede unir ytrio 90 a través de un residuo lisina. El método IODOGEN (Fraker y colaboradores, Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49— 57 (1978)) se puede usar para incorporar yodo 123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) describe otros métodos con grado de detalle.

Los conjugados de anticuerpo y agente citotóxico pueden elaborarse con el empleo de una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales, tales como N— succinimidil— 3— (2— piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil— — (N— maleimidometil) ciclohexano— 1— carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncional de imidoésteres (tal como clorhidrato de dimetil adipimidato), ésteres activos (tal como suberato de disuccinimidilo), aldehidos (tal como glutaraldehído), compuestos bis— azido (tal como bis (p— azidobenzoilo) hexanediamina), derivados de bis— diazonio (tal como bis— (p— diazoniobenzoil)— etilenediamina), diisocianatos (tal como 2,6— diisocianato de tolueno), y compuestos de flúor b¡— activos (tal como 1 ,5— difluoro— 2,4— dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede elaborar una inmunotoxina de ricino, según se describe en Vitetta y colaboradores, Science 238:1098 (1987). El ácido 1— ¡sotiocianatobencil— 3— metildietileno triaminepentaacético marcado con carbono (MX— DTPA) es un ejemplo de agente quelante pra la conjugación de radionucleótidos con el anticuerpo. Ver, por ejemplo, la patente WO94/11026. El ligador puede ser un "ligador clivable" que facilita la liberación de fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, se puede usar un ligador químicamente inestable en ácido, ligador sensible a la peptidasa, ligador fotolábil, ligador de dimetilo o ligador que contiene disulfuro (Chari y colaboradores, Cáncer Research 52:127—131 (1992); la patente estadounidense número 5.208.020).

Los compuestos de la invención contemplan expresamente, pero sin carácter restrictivo, ADC elaborado con reactivos de reticulación: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC— SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo— EMCS, sulfo— GMBS, sulfo— KMUS, sulfo— MBS, sulfo— SIAB, sulfo— SMCC y sulfo— SMPB, and SVSB (succinimidil— (4— vinilsulfona)benzoato) que se comercializan en el mercado (por ejemplo, los de Pierce B ¡oteen no logy, Inc., Rockford, IL, EE. UU.). Ver las páginas 467— 498, de 2003—2004 Applications Handbook and Catalog.

Preparación de anticuerpos conjugados En los anticuerpos conjugados de la invención, un anticuerpo está conjugado con una o más fracciones (por ejemplo, fracciones de fármaco), por ejemplo, aproximadamente 1 a aproximadamente 20 fracciones por anticuerpo, opcionalmente a través de un enlazador. Los anticuerpos conjugados se pueden preparar por diversas rutas, que emplean reacciones de química orgánica, condiciones y reactivos conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo: (1 ) reacción de un grupo nucleofilo de un anticuerpo con un reactivo enlazador bivalente a través de una unión covalente, seguido por reacción con una fracción de interés, y (2) reacción de un grupo nucleofilo de una fracción con un reactivo enlazador bivalente a través de una unión covalente, seguido de reacción con el grupo nucleófílo de un anticuerpo. En la presente se describen otros métodos para elaborar anticuerpos conjugados.

El reactivo ligador puede estar compuesto de uno o más componentes de ligador. Los ejemplos de componentes del ligador incluyen 6— maleimidocaproilo ("MC"), maleimidopropanoilo ("MP"), valina— citrulina ("val— cit"), alanina— fenilalanina ("ala— phe"), p— aminobenciloxicarbonilo ("PAB"), N— Succinimidil — (2— piridiltio) pentanoato ("SPP"), N— Succinimidil 4— (N— maleimidometil) ciclohexano— 1 carboxilato ("SMCC) y N— Succinimidil (4— yodo— acetil) aminobenzoato ("SIAB"). En la técnica se conocen otros componentes de ligadores y algunos se describen. Ver, del mismo modo, "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands," publicación de solicitud estadounidense número 2005/0238649, cuyos contenidos se incorporan íntegramente a la presente por referencia.

En algunas formas de realización, el ligador puede comprender residuos de aminoácidos. Los ejemplos de componentes de los ligadores de aminoácidos incluyen un dipéptido, un tripéptido, un tetrapéptido o un pentapéptido. Los ejemplos de dipéptidos incluyen: valina— citrulina (ve ó val— cit), alanina— fenilalanina (af o ala— phe). Los ejemplos de tripéptidos incluyen: glicina— alina— citrulina (gly— val— cit) y glicina— glicina— glicina (gly— gly— gly). Los residuos de aminoácidos que comprenden un componente aminoácido enlazador incluyen los que se producen de forma natural, así como aminoácidos menores y análogos de aminoácidos de origen no natural, tales como citrulina. Los componentes ligadores de aminoácido pueden ser diseñados y optimizados en su selectividad para la escisión enzimática por unos enzimas particulares, por ejemplo, una proteasa asociada al tumor, catepsina B, C y D, o una proteasa plasmina.

Los grupos nucleófilos en los anticuerpos incluyen, sin carácter restrictivo: (i) grupos amina en el extremo N terminal, (ii) grupos amina de la cadena lateral, por ejemplo, lisina; (iii) grupos tiol de la cadena lateral, por ejemplo cisteína; y (iv) hidróxilo de azúcar o grupos amino donde el anticuerpo es glicosilado. Los grupos amina, tiol e hidróxilo son nucleófilos y capaces de reaccionar para formar uniones covalentes con grupos electrófilos en fracciones ligadoras y reactivos ligadores, que incluyen: (i) ésteres activos, tales como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformatos y haluros de ácido; (ii) haluros de alquilo y bencilo, tales como haloacetamidas; (iii) aldehidos, cetonas, carboxilo y grupos maleimida. Ciertos anticuerpos tienen disulfuros intercadena reducibles, tales como puentes cisteína. Los anticuerpos pueden hacerse reactivos para la conjugación con sus reactivos ligadores mediante el tratamiento de un agente reductor, tal como DTT (ditiotreitol). De esta manera, cada puente cisteína formará, en teoría, dos nucleófilos de tiol reactivos. Los grupos nucleófilos adicionales pueden introducirse en anticuerpos a través de la reacción de lisinas con 2— iminotiolano (reactivo de Traut), lo cual da como resultado la conversión de una amina en un tiol. Los grupos tiol reactivos pueden introducirse en el anticuerpo (o fragmento de éste), mediante la introducción de uno, dos, tres, cuatro o más residuos cisteína (por ejemplo, preparación de anticuerpos mutantes que comprenden uno o más residuos de aminoácidos cisteína no nativos).

Los anticuerpos conjugados de la invención también pueden producirse mediante la modificación del anticuerpo para introducir las fracciones electrófilas, que pueden reaccionar con sustitutos nucleófilos en el reactivo ligador o fármaco u otra fracción. Los azucares de los anticuerpos glicosilados pueden oxidarse, por ejemplo, con reactivos oxidantes de periodato, para formar grupos aldehido o cetona que pueden reaccionar con un grupo amino de reactivos ligadores o fármacos u otras fracciones. Los grupos de base Schiff de imina resultantes pueden formar una unión estable, o bien pueden reducirse, por ejemplo mediante reactivos de borohidruro para formar uniones amina estables. En una forma de realización, la reacción de la parte carbohidrato de un anticuerpo glicosilado con oxidasa de galactosa o meta— periodato de sodio puede proporcionar grupos carbonilo (aldehido y cetona) en la proteína que puede reaccionar con grupos apropiados en el fármaco u otra fracción (Hermanson, Bioconjugate Techniques). En otra forma de realización, las proteínas que contienen residuos serina o treonina en el extremo N terminal pueden reaccionar con meta periodato de sodio, lo cual da como resultado la producción de un aldehido en lugar del primer aminoácido (Geoghegan y Stroh, Bioconjugate Chem. 3:138— 146 (1992); la patente estadounidense número 5.362.852). Dicho aldehido se puede hacer reaccionar con una fracción de fármaco o nucleófilo de ligador.

Del mismo modo, los grupos nucleófilos en una fracción (tal como una fracción de fármaco) incluyen, sin carácter restrictivo: grupos amina, tiol, hidroxilo, hidrazida, oxima, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina y arilhidrazina capaces de reaccionar para formar uniones covalentes con grupos electrófilos en fracciones ligadoras y reactivos ligadores, que incluyen: (i) ésteres activos, tales como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformatos y haluros de ácido; (ii) haluros de alquilo y bencilo, tales como haloacetamidas; y (¡ii) aldehidos, cetonas, carboxilo y grupos maleimida.

Como alternativa, una proteína de fusión que comprende el anticuerpo y agente citotóxico puede elaborarse, por ejemplo, mediante técnicas recombinantes o síntesis de péptidos. La longitud de ADN puede comprender regiones respectivas que codifican las dos porciones del conjugado ya adyacentes uno de otra o separadas por una región que codifica un péptido ligador que no destruye las propiedades deseadas del conjugado. Aún en otra forma de realización, el anticuerpo puede conjugarse en un "receptor" (tal como estreptavidina) para la utilización en pre direccionamiento de tumores, donde el conjugado anticuerpo— receptor se administra al individuo, seguido de la eliminación de un conjugado no unido de la circulación usando un agente de limpieza y luego la administración de un "ligando" (por ejemplo, avidina), que se conjuga en un agente citotóxicó (por ejemplo, radionucléotido).

Utilidad Los presentes polipéptidos variantes de Fe que se describen en este documento encuentran aplicación industrial en la producción de proteínas heteromultiméricas. Las proteínas heteromultiméricas que se describen en la presente encuentran uso, por ejemplo, en métodos terapéuticos in vitro, ex vivo e in vivo. La invención brinda varios métodos basados en el uso de una o más de estas moléculas. En ciertas afecciones patológicas, es necesario o deseable utilizar proteínas heteromultiméricas, por ejemplo, anticuerpos multiespecíficos. La invención brinda estas proteínas heteromultiméricas, que se pueden utilizar para una variedad de fines, por ejemplo terapéutico, profiláctico y de diagnóstico. Por ejemplo, la invención brinda métodos para tratar una enfermedad, dichos métodos comprenden administrarle a un sujeto que necesita tratamiento, una proteína heteromultimérica de la invención, a través de la cual se trata la enfermedad. Cualquiera de las proteínas heteromultiméricas de la invención que se describen en la presente pueden usarse en los métodos terapéuticos (o profilácticos o de diagnóstico) que se describe en la presente.

Por ejemplo, cuando la proteína heteromultimérica es multivalente, un beneficio valioso es la avidez mejorada que poseen por el antígeno. Además de tener alta afinidad intrínseca en una unidad de unión (es decir, un Fab) con la base de antígeno, los anticuerpos de IgG normales también explican el efecto de avidez para aumentar su asociación con antígenos, como resultado de su unión bivalente hacia las dianas.

Una proteína heteromultimérica dirigida contra dos epítopos separados en la misma molécula de antígeno puede no proporcionar únicamente el beneficio de una mejorada avidez de unión (debido a la unión bivalente), pero también pueden adquirir propiedades novedosas que se asocian con los anticuerpos padre. De esta manera, las proteínas heteromultiméricas de la invención encuentran uso en, por ejemplo, el bloqueo de las interacciones receptor— ligan do.

Las proteínas heteromultiméricas que se describen en la presente también encuentran uso en la aplicación de bloqueo simultáneo de las vías de señalización de dos dianas con una molécula.

Usos terapéuticos Las proteínas heteromultiméricas tales como anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que se describen aquí (por ejemplo, un anticuerpo y / o fragmento del mismo elaborado de acuerdo con los métodos que se describen en este documento) pueden ser utilizados para aplicaciones terapéuticas. Por ejemplo, dichas proteínas heteromultiméricas se pueden utilizar para el tratamiento de tumores, incluidos los pre— cancerosos, tumores no metastásicos, metastásicos y cancerosos (por ejemplo, cáncer en etapa temprana), para el tratamiento de trastornos alérgicos o inflamatorios, o para el tratamiento de una enfermedad auto inmune, o para el tratamiento de un sujeto en riesgo de desarrollar cáncer (por ejemplo, el cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, carcinoma de células renales, el glioma o cáncer de ovario), un trastorno alérgico o inflamatorio, o una enfermedad auto inmune.

El término cáncer engloba un conjunto de trastornos proliferativos, incluyendo pero no limitado a, pre— cancerosos, tumores benignos y tumores malignos. Los tumores benignos permanecen localizados en el lugar de origen y no tienen la capacidad de infiltración, invasión, o metástasis a sitios distantes. Los tumores malignos van a invadir y dañar los tejidos que los rodean. También pueden adquirir la capacidad de desprenderse de donde comenzaron y extenderse a otras partes del cuerpo (metástasis), por lo general a través del torrente sanguíneo o del sistema linfático, donde se encuentran los ganglios linfáticos. Los tumores primarios se clasifican por el tipo de tejido del que procedan, los tumores metastásicos se clasifican por el tipo de tejido de la cual las células cancerosas se derivan. Con el tiempo, las células de un tumor maligno se vuelven más anormales y se parecen cada vez menos a las células normales. Este cambio en la apariencia de las células cancerígenas se llama el grado del tumor y las células cancerosas se describen como bien diferenciados, moderadamente diferenciadas, mal diferenciadas o no diferenciadas. Las células bien diferenciadas tienen un aspecto bastante normal y se asemejan a las células normales a partir de las cuales se originaron. Las células no diferenciadas son células que han llegado a ser tan anormales que ya no es posible determinar el origen de las células.

El tumor puede ser un tumor sólido o un tumor no— sólido o un tumor de tejido blando. Los ejemplos de tumores de tejidos blandos, como leucemia (leucemia, por ejemplo, leucemia mielógena crónica, leucemia mielógena aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielógena aguda, leucemia linfoblástica aguda de células B maduras, leucemia linfocítica crónica, leucemia polinfocítica o la leucemia de células peludas), o el linfoma (por ejemplo, el linfoma no— Hodgkin, el linfoma cutáneo de células T, o la enfermedad de Hodgkin). Un tumor sólido incluye cualquier tipo de cáncer de los tejidos del cuerpo distintos de la sangre, la médula ósea o el sistema linfático. Los tumores sólidos pueden ser subdivididos en los de origen de células epiteliales y los de origen de células no— epiteliales. Los ejemplos de tumores sólidos de células epiteliales incluyen los tumores del tracto gastrointestinal, colon, mama, próstata, pulmón, riñon, hígado, páncreas, ovario, cabeza y cuello, la cavidad oral, estómago, duodeno, intestino delgado, intestino grueso, ano, vesícula biliar , labio, nasofaringe, piel, útero, el órgano genital masculino, órganos urinarios, la vejiga y la piel. Los tumores sólidos de origen no epitelial son los sarcomas, tumores cerebrales y tumores en los huesos. Los cánceres epiteliales, en general, se desarrollan a partir de un tumor benigno a una etapa pre— invasiva (por ejemplo, el carcinoma in situ), a un cáncer maligno, que ha penetrado en la membrana basal e invadido el estroma subepitelial.

Los complejos de proteínas multiespecíficas también puede ser utilizados en estas aplicaciones terapéuticas, y los anticuerpos que se unen a HER2, en particular, pueden ser utilizados para tratar el cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, carcinoma de células renales, el glioma o cáncer de ovario.

Otros sujetos que son candidatos a recibir las composiciones de esta invención tienen, o están en riesgo de desarrollar, la proliferación anormal de tejido fibrovascular, acné rosácea, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, oclusión de las arterias, la queratitis atópica, úlceras bacterianas, enfermedad Bechet, tumores transmitidos por sangre, enfermedad obstructiva carotídea, neovascularización coroidea, la inflamación crónica, desprendimiento de retina crónico, uveítis crónica, vitritis crónica, abuso de lentes de contacto, el rechazo del injerto corneal, neovascularización corneal, neovascularización del injerto de córnea, enfermedad de Crohn, enfermedad de Eales, queratoconjuntivitis epidémica, las úlceras micóticas, infecciones por herpes simple, infecciones por herpes zoster, síndromes de hiperviscosidad, sarcoma de Kaposi, leucemia, la degeneración de los lípidos, la enfermedad de Lyme, queratólisis marginal, úlcera de Mooren, las infecciones por micobacterias distintas de la lepra, la miopía, enfermedad ocular neovascular, foseta papilar, síndrome de Osler— Weber (síndrome de Osler— Weber— Rendu), la osteoartritis, enfermedad de Paget, pars planitis, penfigoide, filectenulosis, poliarteritis, complicaciones posteriores a la aplicación de láser, las infecciones por protozoos, pseudoxantoma elástico, pterigión queroconuntivitis seca, queratotomía radial, neovascularización de la retina, retinopatía prematura, fibroplasia retrolental, sarcoidosis, escleritis, anemia de células falciformes, síndrome de Sogren, tumores sólidos, enfermedad de Stargart, la enfermedad de Steven Johnson, queratitis límbica superior, la sífilis, lupus sistémico, degeneración marginal de Terrien, la toxoplasmosis, los tumores del sarcoma de Ewing, los tumores de neuroblastoma, tumor de osteosarcoma, tumores de retinoblastoma, tumores de rabdomiosarcoma, colitis ulcerosa, la oclusión de las venas, deficiencia de vitamina A, la sarcoidosis de Wegener, la angiogénesis no deseada asociada con la diabetes, las enfermedades parasitarias, cicatrización anormal, hipertrofia que sobreviene después de una cirugía, lesión o trauma (por ejemplo, la lesión pulmonar aguda / SDRA), la inhibición del crecimiento del pelo, la inhibición de la ovulación y la formación del cuerpo lúteo, la inhibición de la implantación y la inhibición del desarrollo del embrión en el útero.

Los ejemplos de trastornos alérgicos o inflamatorios o de enfermedades o trastornos autoinmunes que se pueden tratar usando un anticuerpo elaborado según los métodos que se describen en la presente incluyen, pero no se limitan a: artritis (artritis reumatoide, tales como la artritis aguda, artritis reumatoide crónica, artritis gotosa, artritis gotosa aguda, artritis inflamatoria crónica, artritis degenerativa, artritis infecciosa, artritis de Lyme, artritis proliferativa, artritis psoriásica, artrosis vertebral, y artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis crónica progrediente, artritis deformante, poliartritis crónica primaria, artritis reactiva espondilitis anquilosante), enfermedades de la piel inflamatorias hiperproliferativas, psoriasis, tales como psoriasis en placas, psoriasis en gota, psoriasis pustulosa y psoriasis de las uñas, dermatitis incluida la dermatitis por contacto, dermatitis por contacto crónica, dermatitis alérgica, dermatitis por contacto alérgica, dermatitis herpetiforme y la dermatitis atópica, síndrome de hiper IgM ligado al cromosoma X, urticaria, tales como urticaria crónica alérgica y urticaria idiopática crónica, incluyendo la urticaria crónica auto inmune, polimiositis/dermatomiositis, dermatomiositis juvenil, necrólisis epidérmica tóxica, esclerodermia (incluyendo la esclerodermia sistémica), esclerosis tales como la esclerosis sistémica, la esclerosis múltiple (EM), como la EM espino— óptica, EM progresiva primaria (EMPP) , y la EM remitente— recidivante (EMRR), esclerosis sistémica progresiva, aterosclerosis, arteriesclerosis, esclerosis diseminada y esclerosis atáxica, enfermedad inflamatoria intestinal (EM) (por ejemplo, enfermedad de Crohn, enfermedades gastrointestinales mediadas por enfermedades autoinmunes, colitis, tales como la colitis ulcerativa, colitis ulcerosa, colitis microscópica, colitis colágena, colitis poliposa, enterocolitis necrotizante y colitis transmural, y la enfermedad auto inmune inflamatoria del intestino), pioderma gangrenoso, eritema nudoso, colangitis esclerosante primaria, episcleritis), síndrome de dificultad respiratoria, incluyendo el síndrome de dificultad respiratoria aguda o del adulto (SDRA), meningitis, inflamación de la totalidad o parte de la coroiditis úvea, iritis, enfermedad hematológica auto inmune, espondilitis reumatoide, pérdida repentina de la audición, enfermedades mediadas por IgE, tales como la anafilaxia y la rinitis alérgica y atópica, encefalitis tales como encefalitis de Rasmussen y encefalitis límbica o del tronco cerebral, uveítis, tales como la uveítis anterior, uveítis anterior aguda, uveítis granulomatosa, uveítis no granulomatosa, uveítis facoantigénica, uveítis posterior o uveítis auto inmune, glomerulonefritis (GN) con y sin síndrome nefrótico, como glomerulonefritis crónica o aguda, como GN primaria, GN mediada inmunológicamente, GN membranosa (nefropatía membranosa), GN membranosa idiopática o nefropatía membranosa idiopática, GN proliferativa membrano o membranosa (GNMP), incluidas los de tipo I y tipo II, y GN rápidamente progresiva, afecciones alérgicas, reacciones alérgicas, eczema incluyendo eczema alérgico o atópico, asma, tal como asma bronquial, asma bronquial y asma auto— inmune, las afecciones que implican la infiltración de células T y respuestas inflamatorias crónicas, enfermedad pulmonar inflamatoria, miocarditis auto inmune, deficiencia de adhesión de los leucocitos, lupus eritematoso sistémico (LES) o lupus eritematoso sistémico como el LES cutáneo, lupus eritematoso cutáneo subagudo, síndrome de lupus neonatal (NLE), lupus eritematoso diseminado, lupus (incluyendo nefritis, cerebritis, pediátrica, no renal, extra— renal, discoide, alopecia), de inicio juvenil (tipo I), incluyendo la diabetes mellitus, diabetes mellitus pediátrica diabetes insulino— dependiente (DMID), diabetes mellitus del adulto (diabetes de tipo II), diabetes auto inmune, diabetes insípida idiopática, respuestas inmunes asociadas con hipersensibilidad aguda y retrasada mediada por citocinas y los linfocitos T, tuberculosis, sarcoidosis, granulomatosis incluyendo granulomatosis linfomatoide, granulomatosis de Wegener, agranulocitosis, vasculitis, incluyendo vasculitis (incluyendo vasculitis de vasos grandes (incluyendo polimialgia reumática y arteritis de células gigantes (Takayasu)), vasculitis de vasos medianos (incluyendo la enfermedad de Kawasaki y la poliarteritis nodosa), poliarteritis microscópica, vasculitis del SNC, vasculitis necrotizante, cutánea o por hipersensibilidad, vasculitis necrotizante sistémica y vasculitis asociada a ANCA, como la vasculitis o el síndrome de Churg— Strauss (CSS, por su siglas en inglés)), arteritis temporal, anemia aplásica, anemia aplástica auto inmune, anemia positiva de Coombs, anemia de Diamond Blackfan, anemia hemolítica o anemia hemolítíca inmune incluyendo anemia hemolítica auto inmune (AHA), la anemia perniciosa, enfermedad de Addison, anemia o aplasia pura de glóbulos rojos (AEP), deficiencia de factor VIII, hemofilia A, neutropenia auto inmune, pancitopenia, leucopenia , enfermedades que implican diapedesis de leucocitos, trastornos del sistema nervioso central inflamatorias, síndrome de múltiples lesiones de órganos tales como los secundarios a septicemia, traumatismo o hemorragia, enfermedades mediadas por complejo antígeno— anticuerpo, enfermedad de la membrana basal anti— glomerular, síndrome de anticuerpos anti— fosfolípidos, neuritis alérgica, enfermedad de Bechet o de Behcet, síndrome de Castleman, síndrome de Goodpasture, síndrome de Raynaud, síndrome de Sjógren, síndrome de Stevens— Johnson, penfigoide tal como penfigoide ampolloso y penfigoide de la piel, pénfigo (incluyendo pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, penfigoide el! pénfigo mucosa— membrana y pénfigo eritematoso), poliendocrinopatías autoinmunes, enfermedad o síndrome de Reiter, nefritis compleja inmune, nefritis mediada por anticuerpos, neuromielitis óptica, polineuropatías, neuropatía crónica como polineuropatías IgM o neuropatía mediada por IgM, trombocitopenia (desarrollada por los pacientes con infarto de miocardio, por ejemplo), incluyendo púrpura trombocitopénica trombótica (TTP, por sus siglas en inglés) y trombocitopenia autoinmune o inmuno— mediada, como la púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), incluyendo la PTI crónica o aguda, enfermedad autoinmune del testículo y ovario incluyendo la orquitis autoinmune y ooforitis, hipotiroidismo primario, hipoparatiroidismo, enfermedades autoinmunes endocrinas como la tiroiditis, tal el caso de la tiroiditis autoinmune, la enfermedad de Hashimoto, tiroiditis crónica (tiroiditis de Hashimoto), o la tiroiditis subaguda, enfermedad tiroidea autoinmune, hipotiroidismo idiopátlco, enfermedad de Graves, síndromes poliglandulares como síndromes poliglandulares autoinmunes (o síndromes de endocrinópatía poliglandular), síndromes paraneoplásicos, incluyendo síndromes paraneoplásicos neurológicos como el síndrome miasténico de Lambert— Eaton o el síndrome de Eaton— Lambert, síndrome de hombre rígido o de persona rígida, encefalomielitis, tales como encefalomielitis alérgica o encefalomielitis alérgica y encefalomielitis alérgica experimental (EAE), miastenia grave tal como miastenia gravis relacionada con timoma, degeneración cerebelosa, neuromiotonía, síndrome opsoclono u opsoclono— mioclono (OMS, por sus siglas en inglés) y neuropatía sensorial, neuropatía motora multifocal, síndrome de Sheehan, hepatitis autoinmune, hepatitis crónica, hepatitis lupoide, hepatitis de células gigantes, hepatitis crónica activa o hepatitis autoinmune crónica activa, neumonitis intersticial linfoide, bronquiolitis obliterante (no trasplante) frente a neumonía intersticial no específica, síndrome de Guíllain— Barré, enfermedad de Berger (nefropatía por IgA), nefropatía por IgA idiopática, dermatosis lineal por IgA, cirrosis biliar primaria, pneumonocirrosis, síndrome de enteropatía autoinmune, enfermedad celíaca, celiaquía, esprúe celíaco (enteropatía por gluten), esprúe refractario, esprúe idiopátíco, crioglobulinemia, esclerosis amilotrófica lateral (ALS; enfermedad de Lou Gehrig), enfermedad arterial coronaria, enfermedad autoinmune del oído, tal como la enfermedad autoinmune del oído interno (EAOI), pérdida de la audición autoinmune, síndrome opsoclono— mioclono (OMS, por sus siglas en inglés), policondritis tal como policondritis refractaria o en recaída, proteinosis alveolar pulmonar, amiloidosis, escleritis, una linfocitosis son cancerosa, una linfocitosis primaria, que incluye linfocitosis monoclonales de células B (por ejemplo, gammapatía monoclonal benigna y garnmppatía monoclonal de significación no determinada, la GMSI), neuropatía periférica, síndrome paraneoplásico, canalopatías como la epilepsia, migraña, arritmia, trastornos musculares, sordera, ceguera, parálisis periódica, y canalopatías del SNC, autismo, miopatía inflamatoria, la glomerulosclerosis focal y segmentaria (GEFS), oftalmopatía endocrina, uveorretinitis, trastorno de coriorretinitis, trastorno hepatológico autoinmune, fibromialgía, insuficiencia endocrina múltiple, síndrome de Schmidt, adrenalitis, latrofia gástrica, demencia presenil, enfermedades desmielinizantes, tales como enfermedades autoinmunes desmielinizantes, nefropatía diabética, síndrome de Dressler, alopecia areata, síndrome CREST (calcinosis, fenómeno de Raynaud, dismotilidad esofágica, esclerodactilia y telangiectasias), infertilidad masculina y femenina autoinmune, enfermedad mixta del tejido conectivo, mal de Chagas, fiebre reumática, aborto recurrente, pulmón de granjero, eritema multiforme, síndrome de post— cardiotomía, síndrome de Cushing, pulmón de pajarero, angiítis granulomatosa alérgica, angiítis linfocítica benigna, síndrome de Alport, alveolitis como alveolitis alérgica y alveolitis fibrosante, enfermedad pulmonar intersticial, reacción a la transfusión, lepra, malaria, leishmaniasis, kypanosomiasis, esquistosomiasis, la ascariasis, la aspergilosis, el síndrome de Sampter, el síndrome de Caplan, el dengue, la endocarditis, la fibrosis endomiocárdica, fibrosis pulmonar intersticial difusa, fibrosis pulmonar intersticial, la fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis quística, la endoftalmitis, eritema elevatum et diutinum, eritroblastosis fetal, fascitis eosinofílica, síndrome de Shulman, síndrome de Felty, flariasis, ciclitis como ciclitis crónica, heterocrónicos ciclitis, iridociclitis, o ciclitis Fuch, púrpura de Henoch— Schonlein, el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), la infección por virus ECHO, la miocardiopatía, enfermedad de Alzheimer, la infección por parvovirus, la infección por virus de la rubéola, síndromes pos— vacunación, la infección de rubéola congénita, virus de Epstein— Barr, la parotiditis, síndrome de Evan, falla gonadal autoinmune, la corea de Sydenham, la nefritis post estreptocócica, ubiterans tromboangitis, tirotoxicosis, tabes dorsal, coroiditis, polimialgia de células gigantes, oftalmopatía endocrina, la neumonitis por hipersensibilidad crónica, queratoconjuntivitis seca, queratoconjuntivitis epidémica, el síndrome nefrótlco idiopático, la nefropatía de cambios mínimos, lesión benigna familiar y por isquemia— reperfusión, la autoinmunidad de retina, inflamación de las articulaciones, la bronquitis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, silicosis , aftas, estomatitis aftosa, trastornos arterioscleróticos, espermatogenese, hemolisis autoinmune, la enfermedad de Boeck, crioglobulinemia, la contractura de Dupuytren, endoftalmia facoanafiláctica, enteritis alérgica, eritema nudoso leproso, parálisis facial idiopática, síndrome de fatiga crónica, fiebre reumática, enfermedad de Hamman— Rich, pérdida de la audición sensoneural, hemoglobinuria paroxismática, hipogonadismo, ileítis regional, leucopenia, mononucleosis infecciosa, mielitis transversal, primaria mixedema idiopático, nefrosis, la oftalmía symphatica, orquitis granulomatosa, pancreatitis, polirradiculitis aguda, pioderma gangrenosa, tiroiditis de des Quervain, espénica adquirida, infertilidad debida a los anticuerpos contra los espermatozoides, timoma no maligna, el vitíligo, SCID y enfermedades asociadas al virus de Epstein— Barr, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), enfermedades parasitarias, corrió la Leishmania, síndrome de shock tóxico, intoxicaciones alimentarias, las afecciones que implican la infiltración de células T, deficiencia por adhesión de leucocitos, las respuestas inmunes asociadas con hipersensibilidad aguda y retardada mediada por citoquinas y linfocitos T, las enfermedades que implican diapédesis de leucocitos, el síndrome de lesión de órganos múltiples, enfermedades mediadas por el complejo antígeno— anticuerpo, enfermedad de la membrana basal antiglomerular, la neuritis alérgica, poliendocrinopatías autoinmunes, ooforitis, mixedema primaria, la gastritis atrófica autoinmunitaria, oftalmía simpática, enfermedades reumáticas, enfermedad mixta del tejido conectivo, síndrome nefrótico, insulitis, insuficiencia poliendocrina, neuropatía periférica, síndrome de tipo autoinmune poliglandular I, hipoparatiroidismo idiopático de aparición en el adulto (AOIH, por sus siglas en inglés), alopecia total, la miocardiopatía dilatada, epidermolisis ampollosa adquirida (EBA, por sus siglas en inglés), la hemocromatosis, la miocarditis, síndrome nefrótico, colangitis esclerosante primaria, la sinusitis purulenta o no purulenta, sinusitis aguda o crónica, sinusitis etmoidal, frontal, maxilar o esfenoidal, un trastorno relacionado con eosinófilos, como la eosinofilia, infiltración pulmonar, eosinofilia, síndrome de eosinofilia— mialgia, síndrome de Loffler, neumonía eosinófila crónica, eosinofilia pulmonar tropical, aspergilosis bronconeumónica, aspergiloma o granulomas que contienen eosinófilos, anafilaxis, espondiloartritis seronegativas, enfermedades autoinmunes poliendocrinas, colangitis esclerosante, la esclerótica, epiesclerotica, la candidiasis mucocutánea crónica, el síndrome de Bruton, hipogammaglobulinemia transitoria de la infancia, síndrome de Wiskott— Aldrich, ataxia telangiectasia, los trastornos autoinmunes asociados con enfermedades del colágeno, el reumatismo, enfermedades neurologicas, trastorno de isquemia reperfusión, reducción de la respuesta de la presión arterial, la disfunción vascular, angiectasia, daño tisular, isquemia cardiovascular, hiperalgesia, isquemia cerebral, la enfermedad que acompaña la vascularización, las enfermedades alérgicas de hipersensibilidad, glomerulonefritis, lesión por reperfusión, lesión por reperfusión de los tejidos del miocardio o de otra índole, dermatosis con componentes inflamatorios agudos, meningitis purulenta aguda u otros desórdenes del sistema central nervioso inflamatorias, ocular y trastornos inflamatorios orbitales, síndromes asociados a la transfusión de granulocitos, toxicidad inducida por citoquinas, la inflamación grave y aguda, inflamación crónico intratable, pielitis, pneumonocirrosis, la retinopatía diabética, trastornos de arterias grandes, la hiperplasia endarterial, úlcera péptica, valvulitis, y la endometriosis.

Además de los usos terapéuticos, los anticuerpos de la presente invención pueden ser utilizados para otros fines, incluyendo los métodos de diagnóstico, tales como métodos de diagnóstico para las enfermedades y condiciones que se describen en este documento.

Dosis, formulaciones y duración Las proteínas de esta invención se formularán, dosificarán y administrarán en una forma que se ajuste a las buenas prácticas médicas. Los factores a considerar en este contexto incluyen el trastorno particular a tratar, el mamífero particular a tratar, la condición clínica del sujeto individual, la causa del trastorno, el sitio de suministro del agente, el método de administración, la programación de la administración y otros factores conocidos por los médicos. La "cantidad terapéuticamente eficaz" de las proteínas a ser administradas se rige por estas consideraciones, y es la cantidad mínima necesaria para prevenir, aliviar o tratar un trastorno en particular (por ejemplo, un cáncer, trastornos alérgicos o inflamatorios o un trastorno auto inmune). Las proteínas no necesitan ser, pero opcionalmente son, formuladas con uno o más agentes que actualmente se utilizan para prevenir o tratar la enfermedad. La cantidad efectiva de tales agentes depende de la cantidad de proteínas presentes en la formulación, del tipo de trastorno o tratamiento, y otros factores mencionados anteriormente. Estos se utilizan generalmente en las mismas dosis y con idénticas vías de administración a las que se utilizaron anteriormente o entre alrededor del 1 a 99% de las dosis empleadas hasta ahora. En general, el alivio o tratamiento de un cáncer consiste en la atenuación de uno o más síntomas o problemas médicos asociados con el cáncer. La cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco puede lograr una o una combinación de los siguientes: reducir (por lo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100 % o más) el número de células cancerosas; reducir o inhibir el tamaño del tumor o la carga tumoral; inhibir (es decir, disminuir en cierta medida y/o detener) la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos; reducir la secreción hormonal en el caso de adenomas; reducir la densidad de los vasos; inhibir la metástasis tumoral; disminuir o inhibir el crecimiento tumoral; y / o aliviar en cierta medida uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. En algunas formas de realización, las proteínas se utilizan para prevenir la aparición o reaparición de cáncer o un trastorno auto inmune en el sujeto.

En una forma de realización, la presente invención puede ser utilizada para aumentar la duración de la supervivencia de un sujeto humano susceptible de padecer o a quien se la diagnosticado un cáncer o trastorno auto inmune. La duración de supervivencia se define como el tiempo que media entre la primera administración del fármaco hasta la muerte. La duración de la supervivencia también se puede medir por el índice de riesgo estratificado (HR, por sus siglas en inglés) del grupo de tratamiento frente al grupo control, lo que representa el riesgo de muerte para un sujeto durante el tratamiento.

En otra forma realización, el tratamiento de la presente invención aumenta significativamente la tasa de respuesta en un grupo de sujetos humanos susceptibles de padecer o a quienes se les ha diagnosticado un cáncer que son tratados con diferentes terapias contra el cáncer. La tasa de respuesta se define como el porcentaje de sujetos tratados que respondieron al tratamiento. En una forma de realización, el tratamiento de la invención combinado con el uso de proteínas de esta invención y la cirugía, la terapia de radiación, o uno o más agentes quimioterapéuticos aumenta significativamente la tasa de respuesta en el grupo de sujetos tratados en comparación con el grupo tratado con cirugía, radioterapia o quimioterapia solamente, el aumento tiene un valor Chi— cuadrado p de menos de 0,005. Otras mediciones de la eficacia terapéutica en el tratamiento de los cánceres se describen en la publicación de la solicitud de patente estadounidense número 20050186208.

Las formulaciones terapéuticas se preparan utilizando métodos estándar conocidos en la técnica mediante la mezcla del ingrediente activo que tiene el grado deseado de pureza con opcionales portadores fisiológicamente aceptables, excipientes o estabilizantes (Remington's Pharmaceutical Sciences (20° edición), ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wiikins, Filadelfia, PA). Los vehículos aceptables, incluyen solución salina o soluciones amortiguadoras tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos), proteínas, tales como la albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona, aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparaginas, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa, o dextrinas, agentes quelantes tales como EDTA, alcoholes de azúcares tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio, tensioactivos no iónicos tales como Tween™, Pluronics™ o PEG.

Opcionalmente, pero preferiblemente, la formulación contiene una sal farmacéuticamente aceptable, preferiblemente cloruro de sodio, y preferiblemente concentraciones alrededor de las fisiológicas. Opcionalmente, las formulaciones de la invención puede contener un conservante farmacéuticamente aceptable. En algunas formas de realización, la concentración de conservante oscila entre 0,1 a 2,0%, típicamente v/v. Los conservantes adecuados incluyen los conocidos en las técnicas farmacéuticas. El alcohol bencílico, fenol, m— cresol, metilparábeno, propilparabeno y son conservantes preferidos. Opcionalmente, las formulaciones de la invención pueden incluir un tensioactivo farmacéuticamente aceptable a una concentración de 0,005 a 0,02%.

La formulación de la presente también puede contener más de un compuesto activo, según sea necesario, para la afección en particular que se está tratando, con preferencia aquella con actividades complementarias que no se afectan negativamente entre sí. Dichas moléculas están adecuadamente presentes combinadas en cantidades que son eficaces para los fines previstos.

Los ingredientes activos también pueden entramparse en microcápsulas elaboradas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsula de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsula de poli— (metilmetacilato), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano— partículas y nano— cápsulas) o en microemulsiones. Dichas técnicas se revelan en Remington's Pharmaceutical Sciences, ya citado.

Pueden elaborarse preparaciones de liberación prolongada. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación prolongada incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen la proteína heteromultimérica, cuyas matrices tienen la forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsula. Los ejemplos de matrices de liberación prolongada incluyen: poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2— hidroxietilo— metacrilato), o poli(vinilalcohol)), poliláctidos (patente estadounidense número 3.773.919), copolímeros de ácido L— glutámico y etil— L— glutamato, etileno— acetato de vinilo no— degradable, copolímeros de ácido láctico— ácido glicólico degradables, tales como Lupron Depot™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico— ácido glicólico y acetato de leuprolida), y ácido poli— D— (— )— 3— hidroxibutírico. Si bien los polímeros, tales como etileno— acetato de vinilo y ácido láctico— ácido glicólico, permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos más breves. Cuando las proteínas heteromultiméricas encapsuladas permanecen en el organismo durante un período prolongado, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a humedad a una temperatura de 37°C, lo cual produce una pérdida de actividad biológica y posibles cambios de inmunogenicidad. Pueden concebirse estrategias racionales para la estabilización según el mecanismo involucrado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación del enlace S S ¡ntermolecular a través del intercambio tio— sulfuro, se puede lograr la estabilización si se modifican los residuos sulfidrilo, se liofilizan a partir de soluciones ácidas, se controla el contenido de humedad, se utilizan los aditivos apropiados y se desarrollan las composiciones de matriz polimérica específicas.

Las proteínas que se describen aquí (por ejemplo, una proteína heteromultimérica tal como un anticuerpo multiespecífico hecha de acuerdo con los métodos que se describen en este documento) se administran a un sujeto humano, de acuerdo con métodos conocidos, tales como la administración intravenosa como un bolo o por infusión continua durante un período de tiempo, por inyección intramuscular, intraperitoneal, intracerobrospinal, subcutánea, intra— articular, rutas intrasínovial, intratecal, oral, tópica, o la inhalación. La administración local puede ser particularmente deseable si los efectos secundarios o toxicidad se asocian con el antagonismo a la molécula diana reconocida por las proteínas. Una estrategia ex vivo también se puede utilizar para aplicaciones terapéuticas. Las estrategias ex vivo implican transfectar o transducir células obtenidas a partir del sujeto con un polinucleótido que codifica una proteína de la presente invención. Las células transfectadas o transducidas se devuelven al sujeto. Las células pueden ser cualquiera de una amplia gama de tipos que incluyen, sin limitación, las células hemopoyéticas (por ejemplo, células de médula ósea, macrófagos, monocitos, células dendríticas, células T o células B), fibroblastos, células epiteliales, células endoteliales, queratinocitos, o las células musculares.

En un ejemplo, el complejo de proteína (por ejemplo, una proteína heteromultimérica tal como un anticuerpo multiespecífico elaborado de acuerdo con los métodos que se describen en este documento) se administra localmente, por ejemplo, mediante inyecciones directas, cuando el trastorno o la ubicación del tumor así lo permite, y las inyecciones pueden repetirse periódicamente. El complejo de proteínas también puede administrarse de manera sistémica al sujeto o directamente a las células tumorales, por ejemplo, a un tumor o un lecho del tumor después de la extirpación quirúrgica del tumor, con el fin de prevenir o reducir la recidiva local o metástasis.

Artículos de manufactura Otra forma realización de la invención es un artículo de manufactura que contiene uno o más complejos de proteínas que se describen en este documento, y los materiales útiles para el tratamiento o diagnóstico de un trastorno (por ejemplo, una enfermedad auto inmune o cáncer). El artículo de manufactura comprende un envase y una etiqueta o prospecto dentro de— o asociado con— el contenedor. Los envases convenientes incluyen, por ejemplo, las botellas, los frascos, las jeringuillas, etc. Los envases se puede formar de una variedad de materiales tales como cristal o plástico. El envase contiene una composición que es eficaz para tratar la afección y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el envase puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es una proteína heteromultimérica (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo) de la invención. La etiqueta o el prospecto indica que la composición se utiliza para tratar la afección particular. La etiqueta o el prospecto comprenderá además instrucciones para administrar la composición de proteína heteromultimérica al sujeto. Los artículos de manufactura y los kits que comprenden terapias combinatorias que se describen aquí también se contemplan.

Por prospecto se refiere habitualmente a las instrucciones incluidas en los paquetes comerciales de productos terapéuticos que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, contraindicaciones o advertencias sobre el uso de estos productos terapéuticos. En ciertas formas de realización, el prospecto indica que la composición se utiliza para tratar el cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, carcinoma de células renales, el glioma o cáncer de ovario.

Además, el artículo de manufactura puede comprender además un segundo recipiente que comprende una solución amortiguadora farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI, por sus siglas en inglés), solución salina amortiguada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Además, puede incluir otros materiales considerados desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otras soluciones amortiguadoras, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

También se proporcionan kits que son útiles para diversos fines, por ejemplo, para la purificación o la inmunoprecipitación de un antígeno (por ejemplo, HER2 o EGFR) a partir de células. Para el aislamiento y purificación de un antígeno (por ejemplo, HER2 o EGFR) el kit puede contener una proteína heteromultimérica (por ejemplo, un anticuerpo EGFR/HER2) acoplado a perlas (por ejemplo, perlas de sefarosa). Se puede proporcionar kits que contienen la proteína heteromultimérica para la detección y cuantificación del antígeno in vitro, por ejemplo, en un ensayo ELISA o Western blot. Al igual que el artículo de manufactura, el kit comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto incluido o vinculado al envase. El recipiente contiene una composición que comprende al menos una proteína heteromultimérica (por ejemplo, anticuerpo multiespecífico o fragmento de anticuerpo) de la invención. Se pueden incluir otros envases que contienen, por ejemplo, diluyentes y tampones o anticuerpos de control. La etiqueta o el prospecto puede proporcionar una descripción de la composición, así como instrucciones para el uso in vitro o para diagnóstico.

La descripción anterior se considera que es suficiente para permitir que un experto en la técnica ponga en práctica la invención. Con los ejemplos siguientes sólo se pretende ilustrar la invención, y de ninguna manera limitar su alcance. De hecho, diversas modificaciones de la invención, además de las aquí mostradas y explicadas serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción anterior y se encuadran dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

En la descripción experimental que sigue, se utilizan las siguientes abreviaturas: eq (equivalentes), M (molar); mM (micromolar), N (Normal), mol (mol); mmol (milimoles), mol (micromoles); nmol (nanomoles); g (gramos); mg (miligramos); kg (kilogramos); g (microgramos), L (litros); mi (mililitros); I (microlitros): cm (centímetros); mm (milímetros); mieras (micrómetros); nm (nanómetros); °C. (Grados centígrados), h (hora); min (minutos); seg (segundos); mseg (milisegundos); ADCC (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos); BsAb (anticuerpo biespecífico); CL (dominio constante de cadena liviana); CH (dominio constante de cadena pesada); CMC (citotoxicidad mediada por complemento), Fab (fragmento de unión al antígeno), Fe (fragmento cristalizado); Fv (fragmento variable (VL + VH)); EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico); HC (cadena pesada); IGFR (receptor del factor de crecimiento similar a insulina); LC (cadena liviana); scFv (fragmento monocatenario variable (VL y VH unidos por un enlazador de aminoácidos), VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular); VEGFR2 (factor de crecimiento epidérmico vascular endotelial 2); VH (dominio pesado variable), VL (dominio variable liviano).

EJEMPLOS La presente invención se describe en mayor grado de detalle en los siguientes ejemplos que de ningún modo pretenden limitar el alcance de la invención tal como se la reivindica. Las figuras adjuntas están destinadas a ser consideradas como partes integrales de la memoria y descripción de la invención. Todas las referencias citadas en este documento se incorporan específicamente por referencia. Los siguientes ejemplos se ofrecen para ¡lustrar, pero no limitar la invención reivindicada.

Ejemplo 1 Construcción de vectores de expresión Este ejemplo ilustra el constructo de ácido nucleico que se emplea para transformar células hospedantes.

En general, las secuencias que codifican el ADN de cadena pesada y de cadena liviana fueron clonados en un plásmido de expresión que contenía elementos promotores separados para cada una de las secuencias y resistencia a los antibióticos para la selección de células bacterianas que contienen el plásmido de expresión. Los constructos del vector también codifican la señal de secreción enterotoxina II que es estable al calor (STII) (Picken y colaboradores, 1983, Infect. Immun. 42:269—275, y Lee y colaboradores, 1983, Infect. Immun. 42:264—268) para la exportación de los polipéptidos de anticuerpos en el espacio periplásmico de la célula bacteriana. La transcripción de cada cadena se controla mediante el promotor phoA (Kikuchi y colaboradores, 1981 , Nucleic Acids Res., 9:5671—5678) y el control translacional se suministra a través de las variantes de la secuencia de señal STII que se describieron previamente de fuerza translacional relativa medida, que contienen cambios de codón silenciosos en la región de iniciación de la traducción (TIR) (Simmons y Yansura, 1996, Nature Biotechnol. 14:629—634, y Simmons y colaboradores, 2002, J. Immunol Methods, 263:133— 147). En las Figuras 2A y 2B, respectivamente, se exhibe un dibujo esquemático de los plásmidos de botón y ojal.

Si bien la presente invención no depende de las secuencias de unión al anticuerpo específico, y es aplicable a cualquier combinación de semi— anticuerpos, los ejemplos que aquí se consignan se dirigen a anticuerpos heteromultiméricos orientados a c— met, EGFR, IL— 4 e IL— 13. Los ejemplos de anticuerpos anti c— met se consignan en la patente de Estados Unidos número 7.472.724 y en la patente de Estados Unidos número 7.498.420. Los ejemplos de anticuerpos anti— EGFR se consignan en la solicitud provisional de los Estados Unidos número 61/210.562 (depositada el 20 de marzo de 2009), publicación de la solicitud de patente estadounidense número 20080274114 (publicada el 6 de noviembre de 2008) y la patente estadounidense número 5.844.093 (concedida el 1 de diciembre de 1998). Los ejemplos de anticuerpos anti— IL— 13 se describen en la patente estadounidense número 7.501.121 (otorgada el 10 de marzo de 2009), la patente estadounidense número 7.615.213 (otorgada el 10 de noviembre 2009), la patente WO 2006/085938 (publicada el 17 de agosto de 2006), la publicación de la solicitud de patente número 20090214523 (publicada el 27 de agosto 2009), y la patente estadounidense número 7.674.459 (otorgada el 9 de marzo de 2010). Los ejemplos de anticuerpos anti— IL— 4 se describen en la publicación de la solicitud de patente estadounidense número 20080241160 (publicada el 2 de octubre 2008), y la patente estadounidense número 6.358.509 (concedida el 19 de marzo de 2002).

Cada semi— anticuerpo tiene un botón (protuberancia) o un ojal (cavidad) diseñado en la cadena pesada, tal como se describe en la patente estadounidense número 7.642.228. En pocas palabras, primero se generó un mutante del botón CH3. Luego, se creó una biblioteca de mutantes del ojal CR3 mediante la aleatorización de los residuos 366, 368 y 407 que están cerca del botón en el dominio socio CH3. En los siguientes ejemplos, la mutación del botón es T366W, y el ojal tiene mutaciones T366S, L368A y Y407V en una estructura principal lgG1. Las mutaciones equivalentes en otros isotipos de inmunoglobulina pueden ser determinadas fácilmente por el especialista en la técnica. Además, el especialista en la técnica apreciará rápida y fácilmente que se prefiere que se usen dos semi— anticuerpos para que el biespecífico sea el mismo isotipo. Los semi— anticuerpos de diferentes isotipos pueden usarse, pero pueden necesitar mayores mutaciones. En algunas instancias, cada semi— anticuerpo tiene otras mutaciones introducidas en los residuos F241 y F243 en los dominios CH2. Se introdujeron mutaciones de puntos usando técnicas conocidas en la técnica para cambiar la fenilalánina de tipo silvestre en una serina o arginina, de modo que la combinación fue F241 S/F243R ó F241 R/F243S.

Si bien el vector que se describe en este Ejemplo es para el semi— anticuerpo anti c— Met o anti— EGFR, el especialista en la técnica apreciará fácilmente que se puede codificar cualquier anticuerpo en el plásmido. El plásmido inicial para todos los constructos que se utilizan en la presente es el plásmido cistrón separado del factor anti— tejido que se describió previamente paTF50, con TIR relativos de 1 para pesada y 1 para liviana (Simmons y colaboradores, 2002, J. Immunol Methods, 263:133— 147, y la patente estadounidense número 6.979.556). Un aumento en las fortalezas TIR relativas se usó para aumentar los títulos de expresión de estos semi— anticuerpos.

Ejemplo 2 Producción de proteína heteromultimérica usando cultivos celulares separados El ejemplo a continuación muestra la producción de proteínas heteromultiméricas cuando las células que expresan los componentes monoméricos (por ejemplo, semi— anticuerpo) se crían en cultivos separados. En este método, las células se crían y se induce la expresión del semi— anticuerpo en cultivos separados. En este método, los componentes pueden purificarse primero y luego combinarse para formar la proteína heteromultimérica.

En este método, un ácido nucleico que codifica el primer polipéptido que contiene Fe (por ejemplo, un semi— anticuerpo (botón)) se introduce en una primera célula hospedante y un ácido nucleico que codifica un segundo polipéptido que contiene Fe (por ejemplo, un semi— anticuerpo (ojal)) se introduce en una segunda célula hospedante. Si bien este ejemplo ilustra la formación de BsAb, el especialista en la técnica apreciará fácilmente que los métodos que se describen se aplican a cualquier proteína heteromultimérica que comprende una región de bisagra, por ejemplo, affibodies, etc.

Producción independiente de semi— anticuerpos de botón y semi— anticuerpos de ojal en cultivos separados, purificación separada de los semi— anticuerpos, mezclado y reacción redox para formar BsAb intactos Se generaron semi— anticuerpos que contenían las mutaciones de botón o de ojal (con o sin las mutaciones F241 y F243) en cultivos separados mediante la expresión de las cadena pesada y liviana usando los constructos que se describen en el Ejemplo 1 en una célula hospedante bacteriana, por ejemplo, E. coli. Ver las Figuras 3 y 4A. En este método el semi— anticuerpo de botón era un anti— EGFR y el semi— anticuerpo de ojal era un anti c— Met. Los plásmidos de expresión del Ejemplo 1 se introdujeron en cepas hospedantes de E. coli 33D3 (Ridgway y colaboradores, (1999) 59 (1 1 ): 2718) ó 64B4 (W3110 AfhuA AphoA HvG+ Aprc spr43H1 AdegP AmanA lacP AompT) y se seleccionaron transformantes en placas LB que contenían carbenicilina. Luego, se usaron los transformantes para inocular un cultivo inicial LB que contenía carbenicilina, y éste se crió toda la noche con agitación a 30°C. El cultivo inicial se diluyó 100X en un medio limitador del fosfato C.R.A.P. (Simmons y colaboradores, 2002, J. Immunol Methods, 263:133-^147) que contenía carbenicilina y esto se crió durante 24 horas con agitación a una temperatura de 30°C. Los cultivos se centrifugaron, y los pelets de células se congelaron hasta que comenzó la purificación de los anticuerpos. Los pel ts se descongelaron y se resuspendieron en una solución amortiguadora de extracción que contenía 25 mM de base Tris ajustada a pH 7,5 con ácido clorhídrico, 125 mM de NaCI y 5 mM de EDTA (TEB o solución amortiguadora de extracción Tris) y una proporción entre volumen y peso de 100 mL de TEB cada 5 gramos de peíet de células, y se extrajo mediante la ruptura de las células usando microfluidos haciendo pasar la mezcla resuspendida a través de un aparato microfluidizador Microfluidics Corporation modelo 1 10F (Newton, MA) tres veces. El extracto de las células bacterianas se clarificó por centrifugación durante 20 minutos a 15,O00Xg y el sobrenadante se recogió y se filtró a través de un filtro de acetato de 0,22 micrones antes de la purificación.

Cada semi— anticuerpo se purificó de manera separada mediante captura de la proteína A seguida de cromatografía por intercambio de cationes. Los extractos celulares clarificados del semi— anticuerpo de botón se cargaron en una columna HiTrap MabSelect™ SuRe de 1 mi provista por GE Healthcare (Pistcataway, NJ) en un caudal de 2 mL/min. Después de cargarla, la columna se lavó con 10 volúmenes de columna (CV) de 40 mM de citrato de sodio, a pH 6; 125 mM de cloruro de sodio y 5 mM de EDTA, seguido de 5 volúmenes de columna de 20 mM de citrato de sodio a pH 6 para facilitar la captura por parte de la columna de intercambio de cationes. Los anticuerpos capturados por afinidad se eluyeron con 10 volúmenes de columna (CV, por sus siglas en inglés) de 0,2 mM de ácido acético (a pH 2— 3) y directamente capturados en una columna por intercambio de cationes fuerte HiTrap SP— HP de 1 mL provista por GE Healthcare. La columna se lavó con 10 CV de solución amortiguadora A que contenía 25 mM de ácido 2— (N— morfolino)etanosulfónico (MES) a pH 5.8. Los semi— anticuerpos se eluyeron con un gradiente lineal de 0 a 50% de solución amortiguadora B (25 mM de MES, a pH 5,8 y 1 M de cloruro de sodio (NaCI)). Ambas proteínas se eluyeron con 20 a 40% de B, y el pico eluyente determinado por absorbancia UV a 280 nm y mediante análisis SDS— PAGE no reductor de las fracciones recogidas, se mancomunaron por separado como el semi— anticuerpo de botón o de ojal. En general, ambas proteínas exhibieron un pico de elusión mayor y todas las fracciones que contenían especies de la cadena pesada y de la cadena liviana que se oxidaron entre sí se incluyeron en el banco. El análisis de los semi— anticuerpos purificados mediante SDS— PAGE reductor y no reductor se presenta en la Figura 4B. Los resultados indican que la mayoría de las proteínas expresadas y capturadas tienen un tamaño de 75 kD. Esto se confirmó mediante espectrometría de masas ESI— TOF que se muestra en la Figura 4C. La masa de los semi— anticuerpos resultaron ser las masas previstas, lo cual indica que no hubo aducios disulfuro en ninguna cisteína, incluidos los dos residuos cisteína en la región de bisagra. Para determinar si las cisteínas de las bisagras se redujeron exhibiendo un tiol libre reactivo, las proteínas se hicieron reaccionar a un pH neutro con 1 mM de N— etilmaleimida (NEM) durante una hora antes del análisis por espectrometría de masas. La masa de la proteína se mantuvo sin cambios lo que indica que las cisteínas de bisagra se oxidaron entre sí, probablemente en un disulfuro intracadena, por ejemplo, un disulfuro cíclico. Con el fin de ensamblar un anticuerpo biespecífico completamente intacto utilizando estos dos semi— anticuerpos (botón y ojal), era necesario para reducir los disulfuros intracadena primero en la región de bisagra para liberar los tioles cisteína libres para que posteriormente pudiesen oxidarse en la otra cadena pesada formar el anticuerpo biespecífico 150 kD.

Para lograr el recocido, la reducción y reoxidación de los dos semi— anticuerpos complementarios para formar las moléculas biespecíficas intactas se desarrolló el siguiente procedimiento. Después del aislamiento independiente, las proteínas purificadas se combinaron en una masa igual en el paso de mancomunación del procedimiento (que se muestra en la Figura 5), el pH del banco se ajustó a 8 mediante la adición de una décima parte del volumen de Tris [1 M] a pH 8, y las proteínas se redujeron con 2 mM de ditiotreitol (DTT) a temperatura ambiente. Después de la reducción durante 2 horas, las proteínas mancomunadas se intercambiaron con solución amortiguadora en 25 mM de Tris, a pH 8, y 125 mM de NaCI con 5 mi de columnas giratorias Zeba Desalt (Pierce, Rockford, IL), resultando en un volumen de aproximadamente 4 mi de una concentración de proteína de 1 mg / mi. Las proteínas fueron recocidas a continuación calentando la mezcla a 37°C durante 3 horas, seguido por enfriamiento a temperatura ambiente, aproximadamente a 24°C. Los anticuerpos recocidos se concentraron usando 10 kD MW de concentradores de corte hasta un volumen de 0,5 mi con una concentración de proteína de aproximadamente 10 mg/ml y se oxidó por el aire mientras se dializó en 50 mM de Tris a pH 8, y 150 mM de NaCI con 10 kD de membranas (SpectrumLabs, Rancho Domínguez, CA). Después de la oxidación durante la noche a temperatura ambiente, el material oxidado se hizo correr en una columna de filtración en gel de S— 200 (22 mi, S200 Tricorn de GE Healthcare) en una solución amortiguadora que contenía 25 mM de MES a pH 6 y 300 mM de NaCI. El anticuerpo intacto se mancomunó y se diluyó 10 veces en agua.

La proteína BsAb se purificó luego por cromatografía de intercambio catiónico débil utilizando una resina de carboximetilo (1 mi de HiTrap CM— FF, GE Healthcare), con una elusión por gradiente de pH de 4,5 a 9,2. El tampón A y la composición B consistieron de 20 mM de citrato de sodio, 30 mM de MES, 20 mM de HEPES, 20 mM de imidizol, 20 mM de Tris, 20 mM de CAPS y 25 mM de NaCI, donde se ajusta la solución amortiguadora A a pH 4,2 con HCI y la solución amortiguadora B se ajustó a pH 9,2 (ó 10,4) usando NaOH. El material purificado obtenido después de la cromatografía en CM se analizó por espectrometría de masas para determinar la composición exacta molecular (Figura 4D). El análisis por espectroscopia de masas indicó que el único producto de anticuerpo intacto detectable fue con una MW de 146,051.89, que coincide casi idénticamente con la especia heterodimérica de botón y ojal anti— EGFR/anti— c— met con un peso molecular teórico de 145,051.75. El rendimiento de este procedimiento, comenzando con aproximadamente 2 mg del botón y 2 mg del ojal era aproximadamente de 0,5 a 1 mg.

El mismo procedimiento se llevó a cabo para los semi— anticuerpos que contenían las mutaciones F241 y F243.

Ejemplo 3 Cristalización de Fe Durante el proceso de ensamblaje, ciertas pérdidas están asociadas con los enlaces disulfuro deformes, tal como se demuestra por los bajos rendimientos en el Ejemplo 2. Este ejemplo es un análisis de las diferentes formas estructurales del Fe de botón y ojal observado por cristalografía de rayos X. La estructura cristalina de Fe se obtuvo para diversas proteínas heteromultiméricas, donde sólo se describieron las mutaciones de botón y ojal.

Fe de botón y ojal para cristalografía: Un anticuerpo de un brazo del tipo botón en ojal que consiste de una cadena pesada de la IgGI (ojal), una cadena liviana, y un Fe de cadena pesada truncada (botón) se purificaron a partir de E. Coli usando métodos de purificación de anticuerpos de tipo convencional. Ver, por ejemplo, la patente WO2005/063816. El anticuerpo de un brazo purificado se digirió con una proporción 1/1000 pesó/peso con endopeptidasa— C de lisina durante 15 minutos a una temperatura de 37°C. El digesto se detuvo con 5µ? del inhibidor de proteasa N— alfa— tosil— L— lisinil— clorometilcetona. El anticuerpo de un brazo intacto y FAb se eliminaron del Fe de botón— ojal usando resina kappa seleccionada que no se unió al Fe libre. El Fe de botón/ojal se purificó en una columna S75 (GE Biosciences) antes de la cristalización. Los fragmentos Fe de botón y ojal resultantes tienen las siguientes secuencias (se consigna el número de residuo inicial que se basa en una cadena pesada de lgG1 de longitud completa): Cadena 1 (ojal) (SEQ ID NO: 1 ) 223 THTCPPCPAP ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLSCAVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLVSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK Cadena 2 (botón) (SEQ ID NO: 2) 221 DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK Las condiciones de cristalización requirieron el agregado de un dominio mini Z de la proteína A (referencia a Starovasnik más adelante) para estabilizar la proteína. La proteína se intercambió con solución amortiguadora en 0,15M de NaCI, 50 mM de Tris a pH 8 y se concentró en 15 mg/ml. Se agregó péptido mini Z de concentración equimolar y se incubó durante toda la noche. Las proteínas se cristalizaron con el método de gota colgante (ver, por ejemplo: Experimental and theoretical analysis of the rate of solvent equilibration in the hanging drop method of protein crystal growth. Journal of Crystal Growth, volumen 90, ediciones 1—3, 2 julio 1988, páginas 117— 129) a 18°C con depósito de solución amortiguadora que contenía 20% p/v de PEG2000— MME, 0,1 M de MES a pH 6,5; 10% v/v de isopropanol. Las hojas de proteína se formaron después de una semana. Los datos se recogieron como la línea de haz ALS 5.0.2.

La versión minimizada del dominio B de la proteína A ("mini Z") se elaboró de la manera que se describió previamente (Starovasnik M.A., Braisted A.C., Wells J.A. (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. USA Vol. 94, páginas 10080-10085).

El heterodímero Fe de botón en ojal se cristalizó en la presencia de un péptido del dominio mini— Z (de la manera que se describió previamente). Consultar la Figura 6. El péptido mini— Z se unió a la interfaz CH2— CH3 y se presume que ayuda a estabilizar las regiones CH2 del Fe. La estructura hace contacto con los dos dominios CH3 y no es significativamente diferente de los Fe de lgG1 de tipo silvestre aglicosilados.

Fe de botón— botón para cristalografía: El dímero de la proteína de botón— botón se produjo mediante la expresión de E. Coli, según se describió previamente, con la excepción de que las variantes se expresaron como cadenas Fe simples con las cisternas de bisagra retiradas por la mutación en serina a fin de impedir la dimerización covalente (ver, por ejemplo, la patente WO2006028936) y se omitió el paso de intercambio de cationes. El Fe de botón— botón se encontraba presente como un dímero no covalente y se aisló mediante la combinación de cromatografía de afinidad de la proteína A y la filtración en gel usando una columna S200 (GE Biosciences). La proteína purificada se usó para el tamizado del cristal. Para los tamizados del crecimiento del cristal, la proteína se intercambió con solución amortiguadora en PBS y se concentró a 10 mg/ml. La proteína se cristalizó en 20% w/v PEG2000— -éter de monometilo (MME, por sus siglas en inglés), 0,2 M de sulfato de amonio; 0,1 M de cacodilato de sodio a pH 6,5 con 2µ? de proteína en 2µ? de depósito mediante el método de gota colgante a 18°C. Después de transcurridos cinco días aparecieron hojas gruesas y se recogieron los datos en la línea de haz ALS 5.0.1. usando un crioprotector de 25% p/v PEG 2000— M ME.

La secuencia para la secuencia de botón era (SEQ ID NO: 3): 221 DKTHTSPPSP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CWVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSL CLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG El homodímero ojal/ojal se elaboró de la misma manera que las variantes de Fe botón/botón.

La secuencia para la secuencia de ojal era (SEQ ID NO: 4): 221 DKTHTSPPSP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CWVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK Sin embargo, los Fe homodiméricos formaron una conformación de cabeza a cola que podría presentar los Fabs biespecíficos a 180° uno respecto del otro, tal como se presenta en la Figura 7. Esta no sólo sería una conformación novedosa de un Fe, sino que también podría prevenir la oxidación de bisagra normal, ya que los pares disulfuro están en los extremos opuestos del Fe. Sin un Fe coincidente, las cisteínas de bisagra tienden a ciclizarse y, luego, son no reactivas salvo que se las vuelva a oxidar. De esta manera, estas estructuras sugieren conformaciones alternativas que pueden contribuir a la ineficiencia redox.

En la Tabla 1 se muestra la recopilación de datos y la refinación para homodímeros— botón/botón y ojal/ojal— y el heterodímero— botón/ojal. Según el análisis de estructura cristal, se pudo desarrollar la siguiente Tabla 3 de residuos de contacto: Tabla 3 Cadena A Cadena B S239 K370 V240 K370 F241 L368 F241 K370 F243 F405 F243 Y407 P244 V397 V264 Y349 R301 ' T350 K334 D399 Y349 D265 Cadena A Cadena B L368 V262 K392 N389 K392 Y391 P395 P396 Para mayor claridad, la cadena A y B tienen los dos conjuntos de contactos. La tabla anterior representa uno de los dos conjuntos. Así que una tabla completa tendría el doble de los contactos mencionados anteriormente. Por ejemplo S239 en contactos A K370 en B, y S239 en el B se pone en contacto con el K370 en A. Ejemplo 4 Estabilización de la orientación El paso limitante durante el recocido y la purificación es el paso redox. Típicamente, el heterodímero oxidado sólo compone hasta el 70— 80 % de la proteína después de este paso (bioanalizador y MS— TOF). El 20— 30% restante del anticuerpo es dimérico y carece de una unión covalente (SEC— LLC). Ésto se puede eliminar, pero impacta significativamente sobre los rendimientos generales. Por lo tanto, para probar si somos capaces de alterar las asociaciones de cabeza a cola, y así mejorar la recuperación de biespecíficos, hemos generado Fe de botón con mutaciones F241 S/F243R ó F241 R/F243S.

Los Fe de botón y ojal tienen aproximadamente la misma cantidad de homodímero según cromatografía de exclusión por tamaño. Las mutaciones en el Fe de botón redujeron la cantidad de homodímero presente cuando se compara con el tipo silvestre (es decir, sólo las mutaciones de botón) hasta en un 83,5% (ver Figura 8). Ver la Tabla 4 a continuación.

Tabla 4 Botón Botón F241 S/F243R F241 R/F243S Reducción en el 83.5% 64.5% contenido de homodímero El recocido del anticuerpo biespecífico de botón y ojal se mejora con los mutantes Fe en comparación con el botón de tipo silvestre. El porcentaje de anticuerpo intacto que se cuantificó por bioanalizador es 27,6% para el par en peso, 46,4% para el botón mutante F241S/F243R, y 45,5% para el botón mutante F241 R/F243S. Hacer cualquiera de las mutaciones F241 S/F243R ó F241 R/F243S rompe los centros hidrófobos de apareamiento de cabeza a cola. La incorporación de las mutaciones en la cadena de botón disminuyó la cantidad de homodímero respecto del botón de tipo silvestre y parece ser beneficioso para la mejora del rendimiento. Se cree que las mutaciones similares en un ojal de tipo silvestre solo o en el Fe de botón en ojal de tipo silvestre darían lugar a mejoras similares.

Curso de tiempo biespecífico de glutatión Las mutaciones F241 S/F243R aumentaron la tasa de formación de puentes disulfuro entre los anticuerpos biespecíficos correcta. Los semi— anticuerpos se mezclaron 1 :1 en 200 mM de succinato de arginina a pH 8,5 con 200 excesos molares de glutatión reducido a temperatura ambiente. Durante la reacción se tomaron muestras en los momentos siguientes: 0, 3 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas y 72 hrs. Tras la recogida, un volumen equivalente de 0,15 M de ácido acético se añadió para detener la reacción de ensamblaje. Las muestras fueron analizadas en un equipo Agilent BioAnalyzer 2100 con un kit de proteínas 230. Utilizando las mutaciones F241S/F243R en semi— anticuerpos de botón y/u ojal aumenta la velocidad de oxidación bajo estas condiciones en los marcos de tiempo de 12 a 48 (Figura 10). Esto demuestra la ventaja de estos mutantes para las tasas de ensamblajes crecientes y la eficiencia global del ensamblaje.

Asociaciones de botón y ojal mediante resonancia de plasmón superficial (SPR) Con el empleo del sistema BioRad ProteOn™, se inmovilizaron ligandos de botón de tipo silvestre, de ojal de tipo silvestre, de botón F241 R/F243S, de botón F241S/F243R y de ojal F241S/F243R en un sensor activado por NHS. El analito, botón F241S/F243R, se pasó por el sensor en 25 mM de Tris, 150 mM de NaCI, 0.05 % de Tween— 20 a pH 8. Las concentraciones de analito fueron de 200 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12.5 nM y 6.25 nM. El chip ProteOn™ se regeneró entre cada concentración de analito usando 10 mM de glicina a pH3. Los datos demostraron que las mutaciones F241/F243 no interfieren con la heterodimerización, tampoco hay homodimerización mensurable con o sin estos cambios en estas concentraciones (Figuras 11 A— E). La Kd para heterodímeros está en el rango nanomolar de un solo dígito en ambos casos.

Cabe comprender que los ejemplos y formas de realización que se describen en la presente sólo tienen fines ilustrativos y los especialistas en la técnica pueden sugerir varias modificaciones o cambios, los cuales quedarán incluidos dentro del espíritu y el ámbito de esta solicitud y el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes citadas en la presente se incorporan íntegramente a ésta por referencia a todos los fines.

TABLA 1 Recopilación y refinamiento de datos para botón/botón, botón/ojal/MiniZ y ojal/ojal Botón/Botón Botón/Botón/MiniZ Ojal/Ojal (T366W) T366W + T366S/L368A/Y407V T366S/L368A/Y407V + MiniZ Recopilación de datos ALS 5.0.1 ALS 5.0.2 CLS CMCF— ID Grupo de espacio ?3?21 P2i C2 Célula unitaria (A, °) a=b= 44.50, c= 205.6 a=79.24, 0=66.08, a=75.47, 0=44.48, c=102.9, ß=95.2 c=68.90, ß=106.9 VM (A3/Dalton) 2.3 2.3 2.5 Resolución (A) 50 — 2.5 (2.59 — 50— 2.7 (2.80— 2.70) 50 — 2.1 (2.18 — 2.50) 2.10) Rsym a b 0.090 (0.427) 0.109 (0.486) 0.090 (0.566) Cantidad de 54606 10730 24715 observaciones Reflexiones exclusivas 9058 30484 13006 Redundancia 5.8 (4.2) 3.5 (3.3) 1.9 (1.8) Completitud (%) b 96.2 (82.3) 99.5 (98.7) 99.4 (99.7) l/olb 15 (2.3) 11 (2.3) 13 (2.7) Wilson B (A2) 45 56 34 Refinación Resolución (A) 50— 2.5 50— 2.7 50— 2.1 Cantidad de reflexiones 8853 28356 12850 (F>0a(F)) Rc, R|ibre final 0.222, 0.287 0.229, 0.294 0.197, 0.256 Moléculas/unidad 0.5 2 0.5 asimétrica Residuos de proteínas 208 968 208 Moléculas de solvente 41 0 106 Átomos" 1717 (29) 7811 (0) 1763 (23) Factor B medio ( A, 2)° 44/43/44 28/18/33/18: 39/38/39 29A,B/D,E G,H/l,J:todos Uniones Rmsd (A) 0.009 0.016 0.009 Ángulos Rmsd (°) 1.1 1.6 1.1 Bs unido a Rmsd (A, 2) 2.8/2.8 4.0/4.5 4.5/4/3 Cantidad de grupos 4 12 2 TLS Ramachandran (%) 91.8/7.1/0/1.1 88.6/10.9/0.5/0 95.1/4.4/0.5/0 aRsym =?l I I I— l<l>l l/?l<l> I, donde I es la intensidad de una observación simple e <l> es la intensidad promedio para observaciones equivalentes de simetría. b Entre paréntesis, para la capa de resolución más alta. 0 R =?IFo— Fe l/?IFo I, donde Fo y Fe son las amplitudes de factor de estructura observada y calculada, respectivamente Rlibre se calcula como R para las reflexiones secuestradas de la refinación. d Entre paréntesis, el número de átomos asignados menos la ocupación de unidad e proteína/solvente/todos los átomos o A, B/D, E/G, H/l, J: todos.

Claims

REIVINDICACIONES Habiendo así especialmente descripto y determinado la naturaleza de la presente invención y la forma como la misma ha de ser llevada a la práctica, se declara reivindicar como de propiedad y derecho exclusivo:

1. Una proteína heteromultimérica variante o anticuerpo IgG modificado que comprende una variante Fe de un polipéptido Fe de tipo silvestre, dicha variante Fe comprende al menos una modificación de aminoácidos en la región Fe de dicho polipéptido de tipo silvestre, donde dicha proteína variante exhibe un menor apareamiento erróneo, menor formación de cabeza a cola o mayor rendimiento general respecto del polipéptido Fe de tipo silvestre.

2. Una proteína heteromultimérica variante o anticuerpo IgG modificado que comprende una variante Fe de un polipéptido de Fe de tipo silvestre, dicha variante Fe comprende al menos dos modificaciones de aminoácidos en la región Fe de dicho polipéptido de tipo silvestre, donde dicha proteína variante exhibe un menor apareamiento erróneo, menor formación de cabeza a cola o mayor rendimiento general respecto del polipéptido de Fe de tipo silvestre.

3. La proteína heteromultimérica variante o anticuerpo de IgG modificado de las reivindicaciones 1 ó 2 también comprenden una o más modificaciones dé botón en ojal.

4. Una proteína heteromultimérica variante o anticuerpo IgG modificado que comprende una variante Fe de un polipéptido de Fe de tipo silvestre, donde dicha variante Fe comprende sustituciones en los residuos 241 y 243 én al menos una cadena pesada con un aminoácido que es distinto del que se encuentra presente en un polipéptido de Fe de tipo silvestre, con lo cual se genera un menor apareamiento erróneo, menor formación de cabeza a cola o mayor rendimiento general respecto del polipéptido de Fe de tipo silvestre.

5. La proteína heteromultimérica variante o anticuerpo de IgG modificado de la reivindicación 4 que comprende mutaciones en, al menos, una cadena pesada que se selecciona de F241 R/F243S y F241R/F243S.

6. La proteína heteromultimérica variante o anticuerpo de IgG modificado de las reivindicaciones 4 ó 5 también comprenden una o más modificaciones de botón en ojal.

7. La proteína heteromultimérica variante o anticuerpo de IgG modificado según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la proteína o anticuerpo es un anticuerpo multiespecífico.

8. Un acido nucleico aislado que codifica la proteína heteromultimérica variante o el anticuerpo IgG modificado de cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

9. Un vector de expresión que codifica la proteína heteromultimérica variante o el anticuerpo de IgG modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

10. Una célula hospedante que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 8 o un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico.

11. La célula hospedante de la reivindicación 10 que produce la proteína heteromultimérica variante o el anticuerpo de IgG modificado de cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

12. La célula hospedante de la reivindicación 11 que es una célula CHO.

13. La célula hospedante de la reivindicación 11 que es una célula de E. coli.

14. Un método para producir la proteína heteromultimérica variante o el anticuerpo de IgG modificado de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende cultivar la célula de la reivindicación 10 y recuperar la proteína heteromultimérica variante o el anticuerpo IgG modificado del cultivo celular.

15. Una composición que comprende una proteína heteromultimérica variante o el anticuerpo de IgG modificado de cualquiera de las reivindicaciones precedentes y un excipiente.