KR102190220B1

KR102190220B1 - 타겟 특이적 세포막 단백질 제거용 조성물

Info

Publication number: KR102190220B1
Application number: KR1020140063899A
Authority: KR
Inventors: 정광호; 이승현; 조미영; 고영준; 린포웨이; 이크리스티나; 황재웅
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2013-05-29
Filing date: 2014-05-27
Publication date: 2020-12-14
Also published as: KR20140140503A; JP2015027988A; JP6502619B2

Abstract

드라이버 세포막 단백질에 결합하는 제1 결합 도메인, 및 표적 세포막 단백질에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중 결합 분자를 포함하는 표적 세포막 단백질 제거용 조성물, 상기 표적 세포막 단백질 제거용 조성물을 유효성분으로 포함하는 항암 조성물, 및 상기 표적 세포막 단백질 제거용 조성물을 이용한 세포막 단백질 제거 방법이 제공된다.

Description

타겟 특이적 세포막 단백질 제거용 조성물{Composition for Target-Specific Membrane Protein Depletion}

세포막 단백질(Membrane Protein)은 세포막에 존재하는 단백질을 의미하며, 각각 특이적인 기능을 보유하고 있다. 이들 세포막 단백질의 정확한 기능에 대한 연구는 주로 siRNA를 이용한 단백질 발현 저해에 의해 이루어지고 있다. 그러나, 이러한 siRNA를 이용한 단백질 발현 저해 방법은 세포막 상에서의 정확한 기능을 규명하는데 있어서는 한계가 있다.

세포막 단백질의 기능을 판별하는데 보다 유리한 방법은 이들 막단백들이 정상적으로 발현되어 정상적으로 세포막에 자리를 잡은 후에 이들을 제거하는 것이다. 예를 들어 세포막 단백질 가운데 암세포와 관여된 것으로 잘 알려진 58종의 수용체 티로신 카이네이즈(Receptor Tyrosine Kinase; RTK) 들은 어느 정도 공통되는 구조를 보유하고 있다. 이들 RTK 단백질은 리간드의 결합 여부에 따라 동종이합체(homodimer) 또는 이종이합체(heterodimer)를 형성하고, 신호전달에 관여하는 다양한 세포막 또는 세포내 단백질과의 상호 작용을 통해 세포 증식, 분화, 이동, 생존, 부착, 대사 등의 다양한 활성에 관여한다. 즉, 세포막 단백질의 기능은 세포막 단백질이 정상적으로 발현하고 또한 정상적으로 세포막으로 위치화하여 세포 외부 신호를 세포 내부로 전달할 수 있어야 정상적으로 발휘된다.

세포막 단백질들은 세포막에 존재하면서 세포 내 위치에 따라 각각의 특이적인 기능을 보유하고 있어 이들의 정확한 기능에 대한 연구는 주로 siRNA를 이용한 단백질 발현 저해에 의해 이루어지고 있으나 세포막 상에서의 정확한 기능을 규명하는데 있어서는 한계가 있다. 세포막 단백질의 기능을 판별하는데 더 바람직한 방법은 이들 막단백들이 정상적으로 발현되어 정상적으로 세포막에 자리를 잡은 후에 이들을 제거할 수 있는 기술의 개발이 바람직하다. 특히 세포막(plasma membrane) 상에서 특정 세포막 단백질을 제거할 수 있을 경우 이는 siRNA 기술과 같이 범용화된 막단백질 제거(membrane protein depletion) 방법을 제공할 수 있을 것이다.

따라서, RTK 단백질을 비롯한 다양한 세포막 단백질의 정확한 기능 분석 및 효과적인 억제를 위하여 정상적으로 발현 및 세포막에 위치화한 세포막 단백질을 제거하는 기술의 개발이 요구된다.

본 발명의 일 예는 드라이버 세포막 단백질에 결합하는 제1 결합 도메인, 및 표적 세포막 단백질에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중 결합 분자를 포함하는 표적 세포막 단백질 제거용 조성물을 제공한다.

다른 예는 표적 세포막 단백질 제거용 조성물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및/또는 치료용 조성물을 제공한다.

또 다른 예는 상기 표적 세포막 단백질 제거용 조성물을 생체로부터 분리된 세포에 처리하는 단계를 포함하는 표적 세포막 단백질 제거 방법을 제공한다.

본 발명의 일 예는 드라이버(driver) 세포막 단백질에 결합하는 제1 결합 도메인, 및 표적 세포막 단백질에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중 결합 분자를 포함하는 표적 세포막 단백질 제거용 조성물을 제공한다.

상기 드라이버 세포막 단백질에 결합하는 제1 결합 도메인과 표적 세포막 단백질에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중 결합 분자는, 세포막에 위치하는 제1 결합 도메인을 통하여 드라이버 세포막 단백질과, 제2 결합 도메인을 통하여 세포막 단백질에 동시에 결합하며, 이 때, 드라이버 세포막 단백질은 제1 결합 도메인의 결합에 의하여 세포 내로 이동하게 되고, 이에 따라서 상기 이중 결합 분자와 여기에 결합된 표적 세포막 단백질이 함께 세포 내로 이동하여, 세포내에서 분해가 이루어진다 (도 1 및 도 2 참조).

도 1은 본 발명에 따른 세포막 단백질 제거 기술의 원리를 모식적으로 보여준다. 구체적으로, 표적이 되는 세포막 단백질이 세포막 표면에 존재하는 경우, 이 표적을 인지함과 동시에 세포막 상의 드라이버와 동시에 결합하여, 제거하고자 하는 세포막 단백질 표적을 함께 세포내 이동(endocytosis)시키고 분해시킬 수 있는 이중 결합 분자(trigger)를 세포 외부로부터 처리하여 세포막 단백질을 제거하는 모습을 보여준다.

도 2는 본 발명에 따른 표적 특이적 세포막 단백질 제거 기술의 원리를 모식적으로 보여준다. 세포막 상에는 여러 가지 종류의 세포막 단백질이 존재하지만, trigger의 특이성에 의해 다른 세포막 단백질에는 결합하지 않고 표적하고자 하는 특정한 세포막 단백질에만 결합하고, 이 단백질의 internalization &　degradation을 유발할 수 있다.

상기 드라이버(driver) 세포막 단백질은 위 설명한 바와 같이 이중 결합 분자를 통하여 표적 세포막 단백질을 세포 내로 이동시키는 역할을 함을 표현하고자 본 명세서에서 명명한 것이다.

상기 드라이버 세포막 단백질은 세포막에 위치하는 단백질로서, 각종 리간드, 항체, 또는 항체 이외의 단백질(또는 펩타이드)의 결합에 의하여 세포내재화(internalization)가 유발되는 모든 단백질일 수 있다. 상기 표적 세포막 단백질은 세포막에 위치하는 단백질로서, 이중결합분자를 통하여 상기 드라이버 세포막 단백질과 결합되면 세포내재화 되는 모든 단백질일 수 있다.상기 드라이버 세포막 단백질과 표적 세포막 단백질은 각각 독립적으로 모든 수용체, 채널 단백질, 세포막효소 (membrane enzymes), 지질단백질 (lipoprotein), 인테그린(integrin), 세포 표면의 다양한 마커들 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 드라이버 세포막 단백질 및 표적 세포막 단백질은 각각 독립적으로, 각종 리간드, 항체, 또는 항체 이외의 단백질(또는 펩타이드)의 결합에 의하여 세포내재화(internalization)가 유발되는 수용체 타이로신 카이네이즈류 (예컨대, c-Met 단백질, c-Met 단백질 변이체 (mutants), EGFR, HER2, HER3, VEGFR, IGF1R, ephrin receptors, FGFR, 등), 인테그린류, NMDA 수용체, G-단백질 연결 수용체 (G-protein-coupled receptors; GPCR), 트렌스페린 수용체, 저밀도지질단백질 (Low-Density Lipoprotein; LDL) 수용체, 표면 분화 항원류(cluster of differentiation; cluster of designation; CD)(예컨대, CD11a, CD20, CD3, CD33, CD44, CD59, CD73, CD152 (CTLA4) 등), NTRK2 (neurotrophic tyrosine kinase) 등), 세포 표면에 존재하는 주변막 단백질(peripheral membrane proteins), 테트라스파닌(tetraspanins; 예컨대, CD9, CD81, CD 151, CD63, CD37, CD53, NET1, NET2, NET4, NET5, NET6, TM4SF6, Tspan2, Tspan3, TM4B, 등), 항체 결합에 의하여 세포내재화 될 수 있는 항체-약물 접합체 (antibody drug conjugates; ADC)에 대한 세포막 표적 단백질 (2013 Nature Reviews Drug Discovery 12:330 참조) (예컨대, CD22, CD 79b, CD22, GPNMB, CD19, CD56, CD138, PSMA, EGFR, CD74, TACSTD2, CEA, Folate receptor 1, CD37, Mucin16, ETB, STEAP1, CD70, SLC44A4, Nectin4, AGS-16, Guanylyl cyclase C, Mucin1, EGFRvIII, Mesothelin, 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

상기 드라이버 세포막 단백질은, 세포외도메인(extracellular domain)에 리간드 또는 항체가 결합되면 효율적으로 세포 안으로 이동되는 성질을 보유하는 모든 세포막 단백질들 중에서 선택된 것일 수 있다. 상기 드라이버 세포막 단백질 중 일부는 자체적으로는 세포내 이동이 일어나지 않으나, 돌연변이를 통하여 단백질에 리간드 또는 항체를 처리할 경우에 인위적으로 세포 내 이동이 유발될 수 있는 세포막 단백질로 변형된 것일 수도 있다.

상기 드라이버 세포막 단백질은 상기 표적 세포막 단백질과 동일한 세포의 세포막에 위치하거나, 상기 표적 세포막 단백질과 동일한 세포의 세포막에 위치하도록 도입된 것일 수 있다. 상기 드라이버 세포막 단백질에 상기 제1 결합 도메인이 결합하면 세포 내로 이동한 후 분해되는 것일 수 있다. 일 예에서 상기 드라이버 세포막 단백질은 다음으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다:

1) 리간드, 항체, 항체 이외의 단백질, 또는 펩타이드의 결합에 의하여 세포내재화(internalization)가 유발되는 모든 수용체 티로신 카이네이즈류 (Receptor Tyrosine Kinase; RTK) (예컨대, c-Met 단백질, c-Met 단백질 변이체 (mutants), 상피세포 성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor; EGFR; ErbB1), HER2(Human Epidermal growth factor Receptor 2 protein; ErbB2), HER3(Human Epidermal growth factor Receptor 3 protein; ErbB3), 혈소판유래 성장인자 수용체 (platelet-derived growth factor receptors; PDGFR), 혈관내피세포 성장인자 수용체 (vascular endothelial growth factors; VEGFR), 인슐린-유사 성장인자 1 수용체 (Insulin-like Growth Factor 1 Receptor; IGF1R), 에프린 수용체(ephrin receptors), 섬유아세포성장인자 수용체 (fibroblast growth factor receptor; FGFR) 등);

2) 리간드, 항체, 항체 이외의 단백질, 또는 펩타이드의 결합에 의하여 세포내재화가 유발되는 모든 수용체류 (예컨대, 트랜스페린 수용체(transferrin receptors), 저밀도지질단백질 (Low-Density Lipoprotein; LDL) 수용체, 표면 분화 항원류(cluster of differentiation; cluster of designation; CD)(예컨대, CD11a, CD20, CD3, CD33, CD44, CD59, CD73, CD152 (CTLA4) 등), NTRK2 (neurotrophic tyrosine kinase) 등);

3) 테트라스파닌 (tetraspanins; 예컨대, CD9, CD81, CD 151, CD63, CD37, CD53, NET1, NET2, NET4, NET5, NET6, TM4SF6, Tspan2, Tspan3, TM4B, 등); 및

4) 항체 결합에 의하여 세포내재화 될 수 있는 항체-약물 접합체 (antibody drug conjugates; ADC)에 대한 세포막 표적 단백질 (Ref: 2013 Nature Reviews Drug Discovery 12:330) (예컨대, CD22, CD 79b, CD22, GPNMB, CD19, CD56, CD138, PSMA, EGFR, CD74, TACSTD2, CEA, Folate receptor 1, CD37, Mucin16, ETB, STEAP1, CD70, SLC44A4, Nectin4, AGS-16, Guanylyl cyclase C, M ucin1, EGFRvIII, Mesothelin,등).

일 구체예에서, 상기 드라이버 세포막 단백질은 c-Met 단백질일 수 있고, 여기에 결합하는 이중 결합 분자의 제1 결합 도메인은 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 (서열번호 79)의 143번째 위치에서 147번째 위치에 걸친 서열번호 73의 아미노산 서열 (EEPSQ)에 결합하는 것일 수 있다.

상기 표적 세포막 단백질은 단백질의 종류 및 성질, 또는 기능에 상관없이 세포막에 존재하는 모든 종류의 세포막 단백질들로부터 선택된 것일 수 있고, 자체적인 성질로는 세포막에서 세포 내로 이동되지 않는 세포막 단백질까지 모두 포함될 수 있다.

일 예에서, 상기 표적 세포막 단백질은 수용체 티로신 카이네이즈와 같이 종양유발 (oncogenesis) 등의 비정상적 세포 상태와 관련된 세포 신호를 매개하는 수용체, 채널 등의 세포막 단백질일 수 있다. 이와 같은 표적 세포막 단백질은 비정상적 세포 상태와 관련된 질병, 예컨대 암의 치료 표적이 되는 것일 수 있다.

예컨대, 상기 표적 세포막 단백질은 세포막에 존재하는 G-단백질 연결 수용체 (G-protein-coupled receptors; GPCR), 수용체 티로신 카이네이즈 (receptor tyrosine kinases) 등의 모든 종류의 내재화 단백질(integral proteins)과 세포 표면에 존재하는 주변막 단백질(peripheral membrane proteins)을 모두 포함하는 것으로, 마이크로필라멘트(microfilaments)와 결합된 구조단백질(structural proteins), 세포부착분자(cell adhesion molecules), 세포막 효소(membrane enzymes), 세포막 수용체(membrane receptors), 캐리어 단백질(carrier proteins), 채널 단백질(channel proteins)과 운반 단백질(transport proteins), 또한 세포의 표면 쪽으로 위치하는 지질 고정 단백질(lipid-anchored proteins) 등 모든 종류의 세포막 단백질들로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있다. 상기 내재화 단백질은 앞서 드라이버 세포막 단백질과 관련하여 설명된 리간드 또는 항체 결합에 의하여 세포내재화(internalization)가 유발되는 모든 수용체 티로신 카이네이즈류 (Receptor Tyrosine Kinase; RTK), G-단백질 연결 수용체류 (G-protein-coupled receptors; GPCR), 항체 결합에 의하여 세포내재화가 유발되는 모든 수용체류 (트랜스페린 수용체(transferrin receptors), 저밀도지질단백질 (Low-Density Lipoprotein; LDL) 수용체, 표면 분화 항원류(cluster of differentiation; cluster of designation; CD) 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 일 예에서, 상기 표적 세포막 단백질은, 이 중에서 특히 세포의 기능에 중요한, 상피세포 성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor; EGFR), 혈관내피 성장인자 수용체(vascular endothelial growth factor receptor; VEGFR), HER2 단백질(Human Epidermal growth factor Receptor 2 protein), HER3 단백질(Human Epidermal growth factor Receptor 3 protein), 혈소판유래 성장인자 수용체 (platelet-derived growth factor receptors; PDGFR) 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

상기 "c-Met 단백질"은 간세포 성장 인자와 결합하는 수용체 티로신 카이네이즈를 의미한다. 상기 c-Met 단백질은 모든 종에서 유래하는 것일 수 있으며, 예컨대, 인간 c-Met (예컨대, NP_000236), 원숭이 c-Met (예컨대, Macaca mulatta, NP_001162100) 등과 같은 영장류 유래의 것, 또는 마우스 c-Met (예컨대, NP_032617.2), 래트 c-Met (예컨대, NP_113705.1) 등과 같은 설치류 유래의 것 등일 수 있다. 상기 단백질은 예를 들면, GenBank Aceession Number NM_000245에 제공된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드, 또는 GenBank Aceession Number NP_000236에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 그의 세포외 도메인을 포함한다. 수용체 티로신 키나제 c-Met은 예를 들면, 암발생, 암전이, 암세포 이동, 암세포 침투, 신생혈관 생성 과정 등의 여러 가지 기작에 관여한다.

상기 "상피세포성장인자 수용체(Epidermal growth factor receptor; EGFR)", HER2(human epidermal growth factor receptor 2 protein), 및 HER3(human Epidermal growth factor receptor 3 protein)는 각각 EGFR (HER1), HER2, HER3 및 HER4으로 구성되어 있는 HER 패밀리의 수용체 티로신 키나아제(RTKs)의 일원이다. EGFR, HER2, 또는 HER3의 세포외 도메인에 대한 리간드의 결합은 다른 ErbB 수용체와의 리셉터 호모- 또는 헤테로-이량체화를 유도하며, 이는 특이적인 티로신 잔기의 세포내 자가인산화를 유발한다. EGFR 자가인산화는 세포 증식, 혈관신생 및 전이에 영향을 미치는 MAPK 및 PI3K/Akt 활성화를 포함한 다운스트림 신호전달 네트워크를 이끈다. EGFR, HER2, 및/또는 HER3의 과발현, 유전자 증폭, 돌연변이, 또는 재배열은 여러 종류의 인간 악성 종양에서 빈번히 관찰되며, 암 치료의 불량한 예후 및 나쁜 임상적 결과와 관련 있다. 이러한 이유로, 이들 EGFR, HER2, 및/또는 HER3는 항암 요법에 있어서 중요한 표적이 된다.

상기 EGFR, HER2, 또는 HER3는 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등의 포유류로부터 유래된 것일 수 있다. 예컨대, 상기 EGFR은 GenBank Accession Nos. JQ739160, JQ739161, JQ739162, JQ739163, JQ739164, JQ739165, JQ739166, JQ739167, NM_005228.3, NM_201284.1, NM_201282.1, 또는 NM_201283.1 등에 제공된 뉴클레오타이드 서열(mRNA)에 의하여 암호화된 폴리펩타이드일 수 있다. 예컨대, 상기 HER2는 GenBank Accession No. X03363.1 등에 제공되는 뉴클레오타이드 서열 (mRNA)에 의하여 암호화된 폴리펩타이드일 수 있다. 예컨대, 상기 HER3는 GenBank Accession No. NM_001982 등에 제공되는 뉴클레오타이드 서열 (mRNA)에 의하여 암호화된 폴리펩타이드일 수 있다.

상기 "혈관내피세포 성장 인자 수용체(Vascular Endothelial Cell Growth Factor Receptor: VEGFR)"는 혈관내피세포 성장 인자 정상세포에서도 존재하며, 특히 암세포에서 분비되는 혈관내피세포 성장인자(VEGF)와 결합하여 혈관신생을 일으키며, 암세포에 필요한 양분을 공급한다. VEGFR의 과발현은 다양한 질병의 원인이되며, 특히 암의 발생뿐 아니라, 침습, 전이 등의 나쁜 예후에도 관여한다. 이러한 이유로, VEGF는 항암 요법에 있어서 중요한 표적이 된다. 상기 VEGFR은 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등의 포유류로부터 유래된 것일 수 있다. 예컨대, 상기 VEGFR은 GenBank Accession Number AF063657.2 등에 제공된 뉴클레오타이드 서열(mRNA)에 의해 암호화된 폴리펩타이드일 수 있다.

상기 "혈소판유래 성장인자 수용체 (platelet-derived growth factor receptors; PDGFR)"는 표면 수용체 티로신 카이네이즈 중 하나로, 세포증식, 세포분화, 세포성장 등의 조절 및 암을 일으키는 많은 질병과 관련 있다. 상기 PDGFR은 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등의 포유류로부터 유래된 것일 수 있다. 예컨대, 상기 PDGFR은 GenBank Accession Nos. NM_006206.4(PDGFR-A), NM_002609.3(PDGFR-B), NM_016205.2(PDGFR-C) 등에 제공된 뉴클레오타이드 서열(mRNA)에 의해 암호화된 폴리펩타이드일 수 있다.

상기 "인슐린-유사 성장인자 1 수용체 (Insulin-like Growth Factor 1 Receptor; IGF1R)"는 수용체 티로신 카이네이즈 중 하나로, 인슐린-유사 성장인자 1(IGF-1)에 의하여 활성화되는 막통과 수용체이다. 상기 IGF1R은 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등의 포유류로부터 유래된 것일 수 있다. 예컨대, 상기 IGF1R은 GenBank Accession No. NM_000875.3 등에 제공된 뉴클레오타이드 서열(mRNA)에 의해 암호화된 폴리펩타이드일 수 있다.

상기 "에프린 수용체(ephrin receptors)"는 표면 수용체 티로신 카이네이즈 중 하나로, axon guidance, formation of tissue boundaries, cell migration, segmentation 등의 배발생 과정을 조절한다. 상기 에프린 수용체는 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등의 포유류로부터 유래된 것일 수 있다. 예컨대, 상기 에프린 수용체는 GenBank Accession Nos. NM_004440.3, NM_004438.3, NM_004431.3, NM_004442.6, NM_017449.3, NM_004093.3, NM_004441.4, NM_182472.2, NM_005232.4, NM_005233.5, NM_173641.2, NM_001099439.1, NM_001080448.2, NM_001080448.2, NM_004443.3, NM_182689.1, NM_004428.2, NM_004439.5, NM_001962.2, NM_004429.4, NM_182644.2, NM_004952.4, NM_173655.2, NM_182690.2, NM_020526.3, NM_001406.3, NM_005227.2, NM_182685.1 등에 제공된 뉴클레오타이드 서열(mRNA)에 의해 암호화된 폴리펩타이드일 수 있다.

상기 "트랜스페린 수용체 (transferrin receptors)"는 트랜스페린의 캐리어 단백질로, 수용체-매개 엔도사이토시스를 통하여 철의 세포내 이동에 관여하며, 세포내 철 농도를 조절한다. 상기 트랜스페린 수용체는 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등의 포유류로부터 유래된 것일 수 있다. 예컨대, 상기 트랜스페린 수용체는 GenBank Accession Nos. NM_001128148.1, NM_003234.2, NM_001206855.1, NM_003227.3, BC001188.1, M11507.1 등에 제공된 뉴클레오타이드 서열(mRNA)에 의해 암호화된 폴리펩타이드일 수 있다.

상기 "저밀도지질단백질 (Low-Density Lipoprotein; LDL) 수용체"는 트랜스페린의 캐리어 단백질로, 수용체-매개 엔도사이토시스를 통하여 철의 세포내 이동에 관여하며, 세포내 철 농도를 조절한다. 상기 LDL 수용체는 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등의 포유류로부터 유래된 것일 수 있다. 예컨대, 상기 트랜스페린 수용체는 GenBank Accession Nos. NM_000527.4, NM_001195802.1, NM_001195799.1, NM_001195803.1, NM_001195800.1, NM_001195798.1 등에 제공된 뉴클레오타이드 서열(mRNA)에 의해 암호화된 폴리펩타이드일 수 있다.

상기 "표면 분화 항원류(cluster of differentiation; cluster of designation; CD)"는 수용체 또는 리간드로서 다양하게 작용하는 단백질로서, 인간의 경우 약 350 가지가 알려져 있고, 세포 신호화(cell signaling), 세포 부착 등의 다양한 세포 과정에 관여한다. 상기 표면 분화 항원류는 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등의 포유류로부터 유래된 것일 수 있다. 예컨대, 상기 표면 분화 항원류는 모든 CD 계열일 수 있으며, 특히 암 전이와 관련된 CD44, CD147, 또는 이의 variant들일 수 있고, 보다 구체적으로 GenBank Accession Nos. (NM_000610.3, NM_001728.3, X55150.1) 등에 제공된 뉴클레오타이드 서열(mRNA)에 의해 암호화된 폴리펩타이드일 수 있다.

상기 " G-단백질 연결 수용체 (G-protein-coupled receptors; GPCR)"는 막통과 수용체 단백질로, 신호 도입 경로 (signal transduction pathway) 및 세포 반응을 활성화하며, 다양한 질병에 관여한다. GPCR은 거대한 단백질군으로 서열 상동성 및 기능적 유사성을 기초로 6개의 클래스로 분류될 수 있다: 클래스 A 또는 클래스 1 (Rhodopsin-like receptors); 클래스 B 또는 클래스 2 (Secretin receptor family); 클래스 C 또는 클래스 3 (Metabotropic glutamate/pheromone); 클래스 D 또는 클래스 4 (Fungal mating pheromone receptors); 클래스 E 또는 클래스 5 (Cyclic AMP receptors); 및 클래스 F 또는 클래스 6 (Frizzled/Smoothened). 상기 GPCR은 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등의 포유류로부터 유래된 것일 수 있다. 예컨대, GPCR은 암 전이에 관련되는 케모카인 수용체(chemokine receptors; Rhodopsin-like receptor subfamily), 예컨대, CXC 케모카인 수용체, CC 케모카인 수용체, CX3C 케모카인 수용체, 등일 수 있으며, 보다 구체적으로 GenBank Accession Nos. NM_001123041.2, NM_005508.4 NM_005201.3, NM_016602.2 등에 제공된 뉴클레오타이드 서열(mRNA)에 의해 암호화된 폴리펩타이드일 수 있다.

테트라스파닌 (tetraspanins; 예컨대, CD9, CD81, CD 151, CD63, CD37, CD53, NET1, NET2, NET4, NET5, NET6, TM4SF6, Tspan2, Tspan3, TM4B, etc.)는 포유류에서 33종이 발견된 막통과단백질(transmembrane proteins)로서, 거의 모든 세포 및 조직 유형에서 원형질막 상에서 또는 다양한 세포내 소기관 및 과립 내에서 다양하게 발견된다. 다른 많은 세포 표면 단백질과는 달리, 테트라스파닌은 뚜렷한 수용체 기능을 나타내지는 않는다. 테트라스파닌은 엔도좀 시스템 및 라이소좀-관련 소기관에서 발견된다. 이들은 혈소판 내의 dense granule 및 알파-과립(alpha-granules), 멜라닌세포(melanocytes) 내의 멜라노좀 (melanosomes), T-세포 내의 세포독성 과립 (cytotoxic granules), 내피세포 내의 바이벨-팔라드 소체 (Weibel-Palade bodies), 및 수지상세포 내의 Major Histocompatibility Complex II (MHCII) 등을 포함한다. 또한, 많은 세포 유형에서, late endosomes/MVBs (multivesicular bodies)가 세포 표면과 융합되도록 유발되고, 암의 진행 및 전이와 기능적으로 관련이 있는 엑소좀 (exosome)을 분비할 수 있다. 이는 테트라스파닌이 막 제거 (membrane depletion)를 위한 드라이버 또는 표적으로서 사용 가능함을 제안한다. CD9는 GenBank Accession Nos. NM_001769 또는 NM_007657의 뉴클레오타이드 서열 (mRNA)에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. CD81는 GenBank Accession Nos. NM_004356 또는 NM_133655의 뉴클레오타이드 서열 (mRNA)에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. CD151은 GenBank Accession Nos. NM_001039490 또는 NM_001111049의 뉴클레오타이드 서열 (mRNA)에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. CD63은 GenBank Accession Nos. NM_001040034 또는 NM_001042580의 뉴클레오타이드 서열 (mRNA)에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. CD37은 GenBank Accession Nos. NM_001040031 또는 NM_007645 의 뉴클레오타이드 서열 (mRNA)에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. CD53은 GenBank Accession Nos. NM_000560 또는 NM_007651 의 뉴클레오타이드 서열 (mRNA)에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. NET1는 GenBank Accession Nos. NM_001047160 또는 NM_001047159 의 뉴클레오타이드 서열 (mRNA)에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. NET2는 GenBank Accession Nos. NM_012338 또는 NM_173007의 뉴클레오타이드 서열 (mRNA)에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. NET6는 GenBank Accession Nos. NM_014399 또는 NM_025359 의 뉴클레오타이드 서열 (mRNA)에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. TM4SF6는 GenBank Accession Nos. NM_001278743, NM_001278742, NM_001278741, NM_001278740, NM_003270, 또는 NM_019656 의 뉴클레오타이드 서열 (mRNA)에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. Tspan2는 GenBank Accession Nos. NM_005725, NM_001243132, 또는 NM_027533 의 뉴클레오타이드 서열 (mRNA)에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. Tspan3은 GenBank Accession Nos. NM_001168412, NM_198902, NM_005724, 또는 NM_019793 의 뉴클레오타이드 서열 (mRNA)에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. TM4B (TSPAN16)는 GenBank Accession Nos. NM_001282510, NM_001282509 또는 NM_012466 의 뉴클레오타이드 서열 (mRNA)에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

상기 표적 세포막 단백질 제거용 조성물은 비정상적 세포 상태와 관련된 세포 신호를 매개하거나 암 등의 질병에 관련된 표적 세포막 단백질과 단순 결합하여 활성을 억제하는 것에 그치지 않고, 이들 표적 세포막 단백질을 세포내로 이동시키고 분해시키는 보다 근본적인 제거 작용을 한다.

상기 표적 세포막 단백질 제거용 조성물에 의한 표적 세포막 단백질 제거를 위하여, 상기 드라이버 세포막 단백질과 표적 세포막 단백질은 동일한 세포 (예컨대 동일한 세포의 세포막)에 위치하는 것일 수 있다. 또한, 상기 표적 세포막 단백질 제거용 조성물에 의하여 제거되는 표적 세포막 단백질의 위치는 세포막의 유연성과 표적 세포막 단백질의 세포막 발현 수준(예컨대, 비정상적 세포 상태에서의 발현 수준)을 고려할 때 드라이버 세포막 단백질과의 거리에 있어서 특별한 제한이 없다.

상기 표적 세포막 단백질 제거용 조성물에 포함된 상기 제1 결합 도메인과 제2 결합 도메인은 드라이버 세포막 단백질 또는 표적 세포막 단백질에 결합하는 항체, 항체 단편(antibody fragments, 예컨대 항원결합단편), 또는 항체 모조체 (antibody mimics 또는 antibody mimetics) 등으로부터 독립적으로 선택되는 것일 수 있다. 상기 제1 결합 도메인과 제2 결합 도메인은 예컨대, 항체 (예컨대, full immunoglobulin form), scFv 항체, 파아지 항체(phage antibody), 도메인 항체(domain antibody), DARPins(Designed Ankyrin Repeat Proteins), 피브로넥틴 도메인(Fibronectin Domains), 크링글 도메인(Kringle Domains), 나노바디(nanobody), 펩티바디(peptibody), 펩타이드(peptide), 앱타이드(aptide) 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

예컨대, 상기 제1 결합 도메인은 드라이버 세포막 단백질에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, 상기 제2 결합 도메인은 표적 세포막 단백질에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. 이 경우, 상기 이중 결합 분자는 상기 드라이버 세포막 단백질과의 결합 부위와 상기 표적 세포막 단백질과의 결합 부위를 포함하는, 드라이버 세포막 단백질 및 표적 세포막 단백질에 대한 이중 특이 (이중 결합) 항체일 수 있다.

일 예에서, 상기 이중 특이 항체는,

드라이버 세포막 단백질에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및

상기 드라이버 세포막 단백질에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 C 말단 또는 N 말단에 연결된 표적 세포막 단백질에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편

을 포함하는 것일 수 있다.

이 경우 상기 이중 특이 항체는 상하 비대칭 형태의 이중 특이 항체일 수 있다. 상기 상하 비대칭 이중 특이 항체는 이중 특이 항체의 N-말단과 C-말단이 구조적으로 상이한 것 (예컨대, N-말단은 완전한 항체 형태 (예컨대, full immunoglobulin form)이고, C-말단은 항체 단편 형태 (예컨대, scFv)인 것, 또는 Fc 부위를 기준으로, N-말단 부분과 C-말단 부분이 서로 다르고, 각각 독립적으로 scFv, (scFv)2, Fab, Fab', F(ab')2, 및 DARPins 등의 항체 모조체로 이루어진 군에서 선택된 것), 및/또는 기능적으로 상이한 것 (예컨대, C-말단과 N-말단이 서로 다른 단백질을 특이적으로 인식 및/또는 결합함)일 수 있다.

다른 예에서, 상기 이중 특이 항체는,

단일 가닥 형태의 드라이버 세포막 단백질에 대한 항체 (scFvFc) 또는 이의 항원 결합 단편(scFv), 및 단일 가닥 형태의 표적 세포막 단백질에 대한 항체(scFvFc) 또는 이의 항원 결합 단편(scFv)을 포함하고,

상기 단일 가닥 형태의 드라이버 세포막 단백질에 대한 항체 또는 항원 결합 단편과 표적 세포막 단백질에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 접합하여 좌우 비대칭 형태를 형성하는 것일 수 있다. 이 경우 상기 이중 특이 항체는 좌우 비대칭 형태의 이중 특이 항체일 수 있다. 좌우 비대칭 형태의 이중 특이 항체는 서로 다른 단백질을 특이적으로 인식 및/또는 결합하는 2 개의 단일 사슬 항체를 포함하는 것일 수 있다.

상기 표적 세포막 단백질 제거용 조성물 또는 상기 이중 특이 항체에 있어서, 드라이버 세포막 단백질에 대한 항체는 드라이버 세포막 단백질의 세포 내 이동 및 분해를 매개하는 역할을 발휘하는 것이 중요하므로, 이러한 역할을 보다 잘 발휘하기 위하여, 드라이버 세포막 단백질에 대한 항체는 완전한 항체 형태 (예컨대, full immunoglobulin form)를 갖는 것일 수 있다. 또한, 표적 세포막 단백질에 대한 항체는 표적 세포막 단백질에 대한 특이적 인식 및 결합이 중요하므로, 드라이버 세포막 단백질에 대한 항체는 완전한 형태뿐 아니라 항원 결합 단편 형태인 것도 좋다. 따라서, 상기 이중 특이 항체는 드라이버 세포막 단백질에 대한 완전한 항체 및 상기 항체의 C 말단에 연결된 드라이버 세포막 단백질에 대한 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 것일 수 있다.

또한, 드라이버 세포막 단백질과 표적 세포막 단백질과의 거리를 고려할 때, 드라이버 세포막 단백질과의 결합 부위와 표적 세포막 단백질과의 결합 부위가 유연성 있는 연결부위를 통하여 연결되어 있는 구조가 유리할 수 있다.

상기 이중 특이 항체에서 드라이버 세포막 단백질에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 표적 세포막 단백질에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 펩타이드 링커를 통하거나 통하지 않고 연결될 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 1 내지 100개, 2 내지 50개, 또는 5 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있으며, 그 포함된 아미노산 종류는 제한이 없다. 예컨대, 상기 펩타이드 링커는, Gly, Asn 및 Ser로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 잔기를 포함할 수 있으며, Thr 및/또는 Ala과 같은 중성 아미노산들도 포함할 수 있다. 펩타이드 링커에 적합한 아미노산 서열은 당 업계에 공지된 것일 수 있다. 한편, 상기 펩타이드 링커는 상기 이중 특이 항체의 기능에 영향을 미치지 않는 한도 내에서, 그 길이를 다양하게 결정할 수 있다.

구체예에서, 상기 표적 세포막 단백질에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항 EGFR 항체, 항 HER2 항체, 항 HER3 항체, 항 VEGFR 항체, 항 PDGFR 항체, 항 IGF-1R 항체로 이루어진 군에서 선택된 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. 상기 항 EGFR 항체는 시툭시맙(Cetuximab; Erbitux), 패니투무맙(Panitumumab), 마투주맙(Matuzumab), 네시투무맙(Necitumumab), 니모투주맙(Nimotuzumab), 잘루투무맙(Zalutumumab), MM-151(EGFR의 중복되지 않는 에피토프에 결합하도록 설계된 3개의 완전한 인간 모노클로날 항체의 혼합물로 이루어진 올리고클로날 치료제 ), 서열번호 109 또는 113의 중쇄가변부위 및 서열번호 110 또는 114의 경쇄가변부위를 갖는 항체 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 상기 항 HER2 항체는 트라스투주맙(Trastuzumab; Herceptin), 퍼투주맙(Pertuzumab) 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 상기 항 HER3 항체는 RG-7597 (인간화 IgG1 단클론항체) 등일 수 있다. 상기 항 VEGFR2 (KDR) 항체는 라무시루맙(Ramucirumab) 등에서 선택된 것일 수 있다. 상기 항 PDGFR 항체는 올라라투맙 (Olaratumab, IMC-3G3) 등일 수 있다. 상기 항 IGF-1R 항체는 식수투무맙(Cixutumumab; IMC-A12) 등일 수 있다.

상기 이중 특이 항체에는 상기 표적 세포막 단백질에 대한 항체가 완전한 항체 형태로 포함되거나 항원 결합 단편으로 포함될 수 있다.

상기 드라이버 세포막 단백질에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항 c-Met 항체, 또는 세포막 단백질을 효율적으로 세포 내로 내재화(internalize)시키는 단백질에 대한 항체로 이루어진 군에서 선택된 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. 상기 드라이버 세포막 단백질에 대한 항체는 완전한 항체 형태로 포함되거나 항원 결합 단편으로 포함될 수 있다.

상기 "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩타이드의 일부를 의미한다. 예를 들어, scFv, (scFv)₂, Fab, Fab' 또는 F(ab')₂일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

상기 항원 결합 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(C_H1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다.

Fab'는 중쇄 C_H1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')₂ 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다.

Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 1 내지 100개, 2 내지 50개, 또는 5 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있으며, 그 포함된 아미노산 종류는 제한이 없다. 예컨대, 상기 펩타이드 링커는, Gly, Asn 및 Ser로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 잔기를 포함할 수 있으며, Thr 및/또는 Ala과 같은 중성 아미노산들도 포함할 수 있다. 펩타이드 링커에 적합한 아미노산 서열은 당 업계에 공지된 것일 수 있다. 한편, 상기 펩타이드 링커는 상기 항원결합단편의 기능에 영향을 미치지 않는 한도 내에서, 그 길이를 다양하게 결정할 수 있다.

상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')₂단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

구체예에서, 상기 이중 특이 항체는 항 c-Met항체, 및 상기 항 c-Met 항체의 C 말단에 연결된 표적 세포막 단백질에 대한 항체 (예컨대, 항 EGFR 항체, 항 HER2 항체, 항 HER3 항체, 항 VEGFR 항체, 또는 항 PDGFR 항체 등)의 scFv, (scFv)₂, Fab, Fab' 또는 F(ab')₂, 예컨대 scFv를 포함하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 항 EGFR 항체의 scFv, (scFv)₂, Fab, Fab' 또는 F(ab')₂는 서열번호 109 또는 서열번호 113의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변부위와 서열번호 110 또는 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변부위를 포함하는 것일 수 있다. 따라서, 한 구체예에서, 상기 이중 특이 항체는 항 c-Met항체, 및 상기 항 c-Met 항체의 C 말단에 연결된, 서열번호 109 또는 서열번호 113의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변부위와 서열번호 110 또는 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변부위를 포함하는 항 EGFR 항체의 scFv, (scFv)₂, Fab, Fab' 또는 F(ab')₂를 포함하는 것일 수 있다.

상기 항 c-Met 항체는 c-Met에 작용하여 세포내이동(internalization) 및 분해(degradation)를 유도하는 모든 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있으며, c-Met의 특정 부위, 예컨대 SEMA 도메인 내의 특정 부위를 에피토프로 인식하는 것일 수 있다.

HGF(Hepatocyte growth factor)의 수용체인 c-Met은 세포외 부위, 막투과 부위, 세포내 부위의 세 부분으로 구분되며, 세포외 부위의 경우, 이황화 결합에 의해 α-소단위체와 β-소단위체가 연결된 형태로 HGF 결합 도메인인 SEMA 도메인, PSI 도메인(plexin-semaphorins-integrin homology domain) 및 IPT 도메인(immunoglobulin-like fold shared by plexins and transcriptional factors domain)으로 이루어진다. c-Met 단백질의 SEMA 도메인은 서열번호 79의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, c-Met의 세포외 부위에 존재하는 도메인으로서, HGF가 결합하는 부위에 해당한다. SEMA 도메인 중에서 특정 부위, 예컨대, 106번째부터 124번째까지에 해당하는 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖는 영역은 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 에피토프 중 2번과 3번 프로펠러 도메인 사이의 루프(loop) 부위에 해당하며, 본 발명에서 제안되는 항 c-Met 항체의 에피토프로 작용할 수 있다.

용어, "에피토프(epitope)"는 항원 결정 부위(antigenic determinant)로서, 항체에 의해 인지되는 항원의 일부분을 의미하는 것으로 해석된다. 일 구체예에 따르면, 상기 에피토프는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인(서열번호 79) 내의 연속하는 5개 이상의 아미노산을 포함하는 부위, 예컨대, c-Met 단백질의 SEMA 도메인(서열번호 79) 내의 106번째부터 124번째까지에 해당하는 서열번호 71 내에 위치하는 연속하는 5개 내지 19개의 아미노산을 포함하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 에피토프는 서열번호 71의 아미노산 서열 중 서열번호 73(EEPSQ)을 포함하여 연속하는 5 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있다. 상기 서열번호 73의 아미노산 서열은 c-Met 단백질의 SEMA 도메인(서열번호 79)의 143번째 위치에서 147번째 위치까지의 아미노산 서열이다. 예컨대, 상기 에피토프는 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다.

상기 서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 에피토프는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 2번과 3번 프로펠러 구조의 도메인 사이의 루프 부위 중 가장 바깥으로 위치한 부위에 해당하며, 상기 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 에피토프는 일 구체예에 따른 항체 또는 항원 결합 단편이 가장 특이적으로 결합하는 부위이다.

따라서, 항 c-Met 항체는 서열번호 서열번호 71의 아미노산 서열 중 서열번호 73(EEPSQ)을 포함하는 연속하는 5 내지 19개의 아미노산을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 것일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 71, 서열번호 72, 또는 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 항 c-Met 항체는,

서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, 서열번호 5의 아미노산 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열, 또는 서열번호 2의 아미노산 서열 내의 3번째부터 10번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 8 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열, 서열번호 85의 아미노산 서열, 또는 서열번호 85의 아미노산 서열 내의 1번째부터 6번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 6 내지 13개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및

서열번호 7의 아미노산 서열의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2, 및 서열번호 9의 아미노산 서열, 서열번호 86의 아미노산 서열, 또는 서열번호 89의 아미노산 서열 내의 1번째부터 9번째까지의 아미노산을 포함하는 9 내지 17개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역

을 포함하고,

상기 서열번호 4 내지 서열번호 9는 각각 하기 일반식 Ⅰ 내지 일반식 Ⅵ으로 표시되는 아미노산 서열인 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다:

일반식 Ⅰ

Xaa₁-Xaa₂-Tyr-Tyr-Met-Ser (서열번호 4),

일반식 Ⅱ

Arg-Asn-Xaa₃-Xaa₄-Asn-Gly-Xaa₅-Thr (서열번호 5),

일반식 Ⅲ

Asp-Asn-Trp-Leu-Xaa₆-Tyr (서열번호 6),

일반식 Ⅳ

Lys-Ser-Ser-Xaa₇-Ser-Leu-Leu-Ala-Xaa₈-Gly-Asn-Xaa₉-Xaa₁₀-Asn-Tyr-Leu-Ala (서열번호 7)

일반식 Ⅴ

Trp-Xaa₁₁-Ser-Xaa₁₂-Arg-Val-Xaa₁₃(서열번호 8)

일반식 Ⅵ

Xaa₁₄-Gln-Ser-Tyr-Ser-Xaa₁₅-Pro-Xaa₁₆-Thr (서열번호 9)

상기 일반식 Ⅰ에서, Xaa₁은 존재하지 않거나 Pro 또는 Ser이고, Xaa₂는 Glu 또는 Asp이며,

상기 일반식 Ⅱ에서, Xaa₃은 Asn 또는 Lys이며, Xaa₄는 Ala 또는 Val이고, Xaa₅는 Asn 또는 Thr이며,

상기 일반식 Ⅲ에서, Xaa₆은 Ser 또는 Thr이고,

상기 일반식 Ⅳ에서, Xaa₇은 His, Arg, Gln 또는 Lys이고, Xaa₈은 Ser 또는 Trp이고, Xaa₉은 His 또는 Gln이며, Xaa₁₀는 Lys 또는 Asn이고,

상기 일반식 Ⅴ에서, Xaa₁₁은 Ala 또는 Gly이며, Xaa₁₂은 Thr 또는 Lys이고, Xaa₁₃는 Ser 또는 Pro이며,

상기 일반식 Ⅵ에서, Xaa₁₄은 Gly, Ala 또는 Gln이고, Xaa₁₅는 Arg, His, Ser, Ala, Gly 또는 Lys이며, Xaa₁₆는 Leu, Tyr, Phe 또는 Met이다.

일 구체예에서, 상기 CDR-H1은 서열번호 1, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 CDR-H2는 서열번호 2, 서열번호 25, 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 CDR-H3는 서열번호 3, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 85로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 CDR-L1은 서열번호 10, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 CDR-L2는 서열번호 11, 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 CDR-L3은 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 37, 서열번호 86, 및 서열번호 89로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 1, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 2, 서열번호 25, 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 3, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 85으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H3)를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 10, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 11, 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 37, 서열번호 86, 및 서열번호 89로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L3)를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것일 수 있다.

원하는 항원을 피면역 동물에게 면역시켜 생산하는 동물 유래 항체는 일반적으로 치료 목적으로 인간에 투여 시 면역거부반응이 일어날 수 있으며, 이러한 면역거부반응을 억제하고자 키메릭 항체(chimeric antibody)가 개발되었다. 키메릭 항체는 유전공학적 방법을 이용하여 항-아이소타입(anti-isotype) 반응의 원인이 되는 동물 유래 항체의 불변 영역을 인간 항체의 불변 영역으로 치환한 것이다. 키메릭 항체는 동물 유래 항체에 비하여 항-아이소타입 반응에 있어서 상당 부분 개선되었으나, 여전히 동물 유래 아미노산들이 가변 영역에 존재하고 있어 잠재적인 항-이디오타입(anti-idiotypic) 반응에 대한 부작용을 내포하고 있다. 이러한 부작용을 개선하고자 개발된 것이 인간화 항체(humanized antibody)이다. 이는 키메릭 항체의 가변 영역 중 항원의 결합에 중요한 역할을 하는 CDR(complementaritiy determining regions) 부위를 인간 항체 골격(framework)에 이식하여 제작된다.

인간화 항체를 제작하기 위한 CDR 이식(grafting) 기술에 있어서 가장 중요한 것은 동물 유래 항체의 CDR 부위를 가장 잘 받아들일 수 있는 최적화된 인간 항체를 선정하는 것이며, 이를 위하여 항체 데이터베이스의 활용, 결정구조(crystal structure)의 분석, 분자모델링 기술 등이 활용된다. 그러나, 최적화된 인간 항체 골격에 동물 유래 항체의 CDR 부위를 이식할지라도 동물 유래 항체의 골격에 위치하면서 항원 결합에 영향을 미치는 아미노산이 존재하는 경우가 있기 때문에, 항원 결합력이 보존되지 못하는 경우가 상당수 존재하므로, 항원 결합력을 복원하기 위한 추가적인 항체 공학 기술의 적용은 필수적이라고 할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 항체는 마우스 유래 항체, 마우스-인간 키메릭 항체 또는 인간화 항체일 수 있다.

완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.

용어, "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 V_H 및 3개의 불변 영역 도메인 C_H1, C_H2 및 C_H3과 힌지(hinge)를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 V_L 및 불변 영역 도메인 C_L을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.

용어, "CDR(complementarity determining region)"은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다(CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다. 한편, 본 명세서에 있어서, 용어, "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 인식"은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.

일 구체예에 따르면, 항 c-Met 항체 또는 항원 결합 단편에서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 17, 서열번호 74, 서열번호 87, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93 또는 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 75, 서열번호 88, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99 또는 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 항 c-Met 항체는 수탁번호 KCLRF-BP-00220인 하이브리도마 세포에서 생산되는, c-Met 단백질의 세포외 부위(extracellular region)에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체일 수 있다 (대한민국 공개특허 제2011-0047698호 참조; 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 포함됨).

상기의 항 c-Met 항체는 대한민국 공개특허 제2011-0047698호에 정의된 항체를 모두 포함할 수 있다.

상기 항 c-Met 항체의 앞서 정의된 CDR 부위 또는 경쇄 가변 부위와 중쇄 가변 부위를 제외한 경쇄 불변 부위와 중쇄 불변 부위는 모든 서브타입의 면역글로불린의 경쇄 불변 부위와 중쇄 불변 부위일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 항 c-Met 항체는 서열번호 62의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임) 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 20번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임) 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 갖는 경쇄로 이루어진 항체; 서열번호 64의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임) 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 갖는 경쇄로 이루어진 항체; 또는 서열번호 66의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임) 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 갖는 경쇄로 이루어진 항체인 것일 수 있다.

다른 구체예에 따르면, 상기 항 c-Met 항체는 서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 70의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임) 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 갖는 경쇄로 이루어진 항체; 서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 70의 아미노산 서열 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 갖는 경쇄로 이루어진 항체; 또는 서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 70 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열의 아미노산 서열을 갖는 경쇄로 이루어진 항체인 것일 수 있다.

다른 구체예에 따르면, 상기 항 c-Met 항체는 서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 갖는 경쇄로 이루어진 항체; 서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 갖는 경쇄로 이루어진 항체; 또는 서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 갖는 경쇄로 이루어진 항체인 것일 수 있다.

한 구체예에서, 상기 상기 항 c-Met 항체는 서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 갖는 경쇄로 이루어진 항체 또는 서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 갖는 경쇄로 이루어진 항체일 수 있다.

한편, 상기 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 경쇄이며, 서열번호 68의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 상기 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에서 36번 (kabat numbering에 따름, 서열번호 68 내의 62번째 아미노산 위치) 히스티딘 (histidine)이 티로신 (tyrosine)으로 치환된 형태의 폴리펩티드이다. 상기 치환으로 인하여, 일 구체예에 따른 항체의 생산량이 증가될 수 있다. 또한 상기 서열번호 108의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 상기 서열번호 68의 아미노산 서열 중 1번째부터 20번째까지의 시그널 펩타이드를 제외한 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에서 kabat numbering에 의한 27e 위치(kabat numbering에 따름, 서열번호 108 내 32번째 위치; CDR-L1 내부)의 세린(Ser)이 트립토판(Trp)으로 치환된 것으로, 상기 치환으로 인하여, 일 구체예에 따른 항체의 활성(예컨대, cMet에 대한 결합친화도, c-Met 분해 활성 및 Akt 인산화 억제 활성 등)이 보다 증진될 수 있다.

다른 예는 상기한 표적 세포막 단백질 제거용 조성물 또는 여기에 포함된 이중 결합 분자 (또는 이중 특이 항체)를 세포에 처리하는 단계를 포함하는 표적 세포막 단백질 제거 방법을 제공한다. 또 다른 예는 상기한 표적 세포막 단백질 제거용 조성물 또는 여기에 포함된 이중 결합 분자 (또는 이중 특이 항체)의 표적 세포막 단백질 제거를 위한 용도를 제공한다.

상기 세포는 포유류, 예컨대, 인간, 원숭이 등의 영장류, 또는 래트, 마우스 등의 설치류로부터 유래한 모든 세포로서, 살아있는 세포일 수 있다. 상기 세포는, 예컨대 암세포일 수 있으며, 드라이버 세포막 단백질, 예컨대 c-Met 단백질이 발현하는 세포일 수 있다. 상기 세포는 생체에 존재하는 것이거나, 생체로부터 분리된 것일 수 있다.

한편, 대표적으로 EGFR을 포함한 RTK들과 암세포에서 함께 발현되는 c-Met은 다른 RTK와 crosstalk이 존재하면서 이들에 대한 항암제 내성과 연관되어 있다. 따라서 c-Met과 함께 EGFR 또는 HER2와 같은 RTK를 저해할 수 있다면 기존 항암제의 내성 및 문제점을 극복한 새로운 기능을 갖는 항암제 개발이 가능하게 된다.

이에, 본 발명의 다른 측면은 상기한 표적 세포막 단백질 제거용 조성물 또는 여기에 포함된 이중 결합 분자 (또는 이중 특이 항체)을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및/또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또 다른 예는 상기한 표적 세포막 단백질 제거용 조성물 또는 여기에 포함된 이중 결합 분자 (또는 이중 특이 항체)의 약학적 유효량을 암의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 및/또는 치료 방법이 제공한다. 또 다른 예는 상기한 표적 세포막 단백질 제거용 조성물 또는 여기에 포함된 이중 결합 분자 (또는 이중 특이 항체)의 암의 예방 및/또는 치료를 위한 용도가 제공된다.

상기 암은, 이에 제한되지 않지만, 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간세포암, 위암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 암은 원발성 암 또는 전이성 암일 수 있다. 특히, 상기 암은 기존의 항암제, 예컨대 상기 표적 세포막 단백질에 대한 길항제에 대하여 내성이 생긴 암일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 상기한 표적 세포막 단백질 제거용 조성물 또는 여기에 포함된 이중 결합 분자 (또는 이중 특이 항체)의 약학적 유효량과, 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 및/또는 부형제 등과 함께 제공될 수 있다.

상기 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는, 항체의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 약학적 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 희석제, 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

상기 약학적 조성물의 적절한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 상기 조성물의 바람직한 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다. 용어 "약학적 유효량"은 암을 예방 또는 치료하는 데 효과를 나타내는 양을 의미한다.

상기 약학적 조성물은 당해 당업자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

또한, 상기 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.

한편, 상기 약학적 조성물은 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하므로, 면역 리포좀으로 제형화될 수 있다. 항체를 포함하는 리포좀은 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 면역 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 폴리에틸렌글리콜-유도체화된 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 지질 조성물로서 역상 증발법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fab' 단편은 디설파이드-교체 반응을 통해 리포좀에 접합될 수 있다. 독소루비신과 같은 화학치료제가 추가로 리포좀 내에 포함될 수 있다.

상기 약학적 조성물의 투여 대상 또는 상기 예방 및/또는 치료 방법의 투여 대상 환자는 포유류, 예컨대 인간, 원숭이 등의 영장류, 또는 래트, 마우스 등의 설치류 등일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 기존의 항암제, 예컨대 상기 표적 세포막 단백질에 대한 길항제에 대하여 내성이 생긴 암환자일 수 있다.

앞서 설명한 바와 같이,　본 발명에 따른 표적 세포막 단백질 제거 기술에 있어서,　특정 세포막 단백질의 제거가 가능하기 위해서는 세포막 단백질의 엔도사이토시스 및 분해(degradation)를 유발하는 Driver가 세포막 상에 함께 존재하는 것이 필요하고, 이중 결합 분자(Trigger)를 통해서 Driver와 표적을 연결시킴과 동시에 표적이 driver와 함께 세포 내로 엔도사이토시스되고 분해되어야 한다. Driver는 세포막 단백질로 표적 세포막 단백질과 동일한 세포막에 존재하면서 엔도사이토시스 및 세포내 분해가 가능한 분자이며, 이중 결합 분자(Trigger)는 표적 세포막 단백질과 Driver에 동시에 높은 친화도로 결합 가능한 분자로 Driver의 엔도사이토시스 및 분해를 유발함과 동시에 표적을 잡아 끌어 Driver와 함께 분해되도록 만든다.

도 3에서는 일 실시예로에 사용된 Driver와 Trigger (이중결합 항체)를 도식적으로 나타내고 있다. 항암 표적으로 잘 알려진 세포막 단백질인 EGFR은 세포의 표면에 존재하며 EGFR에 대한 항체를 처리하더라도 활성이 억제될 뿐이며 살아있는 세포막에서 제거되지는 않는다. 일 실시예에서 사용된 Driver는 특정한 에피토프를 포함하는 c-Met 세포막 단백질이며, 이중 결합 항체는 특정 에피토프에 높은 친화도로 결합되는 이중항체로 c-Met이 세포내로 이동 되더라도 부작용(agonism)을 유발하지 않고 효과적으로 c-Met을 분해시킬 수 있는 특성을 가졌다.

발명의 targeted membrane protein depletion 기술은 실제 임상 샘플에 대하여 다음과 같은 효과를 기대할 수 있다:

1. 세포생물학 분야의 세포막 단백질 기능 연구를 위한 새로운 Tool 제공으로 세포막 단백질의 기능 연구와 연관된 획기적인 method 제공하며 siRNA 기술과 같이 상품화 가능

2. 이중항체 pipeline 확장: c-Met과 함께 병용투여 등으로 시너지 효능이 기대되는 2차 타겟들에 대한 이중항체를 제조, 기본적으로 이들 항암타겟을 제거할 수 있는 기능을 이용하여 새로운 신규 항암 치료제 pipeline 확장 가능

3. EGFR, HER2 등의 항암 관련 major target 들에 대한 효능 제고: Homodimer와 heterodimer 모두 분해하여 암생성 기능저해 효과

4. c-Met 관련 내성 극복 및 c-Met 치료 효능 제고된 항암제 제조

도 1은 일 실시예에 따른 세포막에서 타겟 특이적 특정 세포막 단백질 제거 원리를 보여주는 모식적도이다.
도 2는 일 실시예에 따른 세포막에서의 타겟 특이적 특정 세포막 단백질 제거 원리를 보여주는 모식도이다.
도 3은 일 실시예에 따른 세포막 단백질 제거 시스템(이중특이항체: BsAb)의 구성 요소를 보여주는 모식도이다.
도 4는 MKN45 위암세포주에서의 항 c-Met/EGFR 이중 특이 항체에 의한 c-Met 분해율을 보여주는 그래프이다 (Y축: 대조군(media)에 대한 상대적 c-Met 양; X축: L3-1Y IgG2: 항 c-Met 항체, ME-01, ME-03: c-Met/EGFR 이중 특이 항체, MH2-01: c-Met/HER2 이중 특이 항체).
도 5는 MKN45 위암세포주에서의 항 c-Met/EGFR 이중 특이 항체에 의한 EGFR 분해를 보여주는 형광 이미지이다 (노란색: 항-c-Met/EGFR 이중특이항체; 붉은색: 항-c-Met 항체; 녹색: 항-EGFR 항체).
도 6은 MKN45 위암세포주에서의 항 c-Met/EGFR 이중 특이 항체에 의한 EGFR의 세포내 이동 및 분해를 항 EGFR 항체(ICR62) 단독 또는 융합되지 않은 항 c-Met 항체와 항 EGFR 항체(ICR62)를 함께 투여한 경우와 비교하여 보여주는 형광이미지이다(노란색: 항-c-Met/EGFR 이중특이항체; 붉은색: 항-c-Met 항체; 녹색: 항-EGFR 항체).
도 7은 MKN45 위암세포주에서의 항 c-Met/EGFR 이중 특이 항체에 의한 EGFR의 세포내 이동 및 분해를 항 c-Met 항체 단독 또는 융합되지 않은 항 c-Met 항체와 항 EGFR 항체(ICR62 또는 Erbitux)를 함께 투여한 경우와 비교하여 보여주는 형광이미지이다(노란색: 항-c-Met/EGFR 이중특이항체; 붉은색: 항-c-Met 항체; 녹색: 항-EGFR 항체).
　　도 8은 EBC-1 폐암암세포주에서 항 c-Met/EGFR 이중 특이 항체에 의한 EGFR의 세포내 이동 및 분해를 항 c-Met 항체 또는 항 EGFR 항체 단독 또는 융합되지 않은 항 c-Met 항체와 항 EGFR 항체(ICR62 또는 Erbitux)를 함께 투여한 경우와 비교하여 보여주는 형광이미지이다(노란색: 항-c-Met/EGFR 이중특이항체; 붉은색: 항-c-Met 항체; 녹색: 항-EGFR 항체).
도 9는 　　MKN45 위암 세포주 (상단) 및 EBC-1 폐암 세포주(하단)에서의 항 c-Met/EGFR 이중 특이 항체에 의한 EGFR의 총량 및 활성을 웨스턴블라팅으로 시험한 결과이다.
도 10은 c-Met 발현 낮은 A431 암세포주에서의 항 c-Met/EGFR 이중 특이 항체에 의한 EGFR의 총량 및 활성을 웨스턴블라팅으로 시험한 결과이다.
도 11은 HCC827 폐암 세포주 및 HCC827 Erlotinib 내성 세포주 세포주 (HCC827 ER)에서의 c-Met 발현량 증가에 따른 EGFR 분해를 웨스턴 블라팅으로 확인한 결과이다.
도 12는 MKN45 위암 세포주에서 항 c-Met/Her2 이중 특이 항체에 의한 HER2 특이적 분해를 웨스턴 블라팅으로 확인한 결과이다.
도 13은 c-Met 발현이 낮은 A549 암세포주에서 c-Met 과발현시킨 후의 항 c-Met/EGFR 이중 특이 항체에 의한 EGFR 분해 유도 효과를 보여주는 형광 이미지이다.
도 14는 c-Met 발현이 낮은 HeLa 세포주에서 c-Met 과발현시킨 후의 항 c-Met/EGFR 이중 특이 항체에 의한 EGFR 분해 유도 효과를 보여주는 형광 이미지이다.
도 15는 huAbF46 항체의 에피토프 맵핑(mapping)을 위한 ELISA 결과이다.
도 16은 SEMA 도메인 상의 huAbF46 항체의 에피토프 위치를 확인한 그림이다.

이하 하기의 실시예를 본 발명을 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것일 뿐이며, 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

참고예 1: 항 c- Met 항체의 제작

1.1. c- Met 에 대한 마우스 항체 ' AbF46' 의 생산

1.1.1. 마우스의 면역화

하이브리도마 세포주의 개발에 필요한 면역화 된 마우스를 얻기 위하여, 5마리의 마우스에 한 마리당 100 ㎍의 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질(R&D Systems)과 동량의 완전 프로인드 어주번트(Freund's adjuvant)를 혼합하여 4-6 주된 BALB/c 마우스(Japan SLC, Inc.)의 복강 내에 주사하였다. 2주 후에 상기와 동일한 방법으로 상기 항원으로 사용된 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질을 앞서 주사한 양의 절반인 50 ㎍을 동량의 불완전 프로인드 어주번트(incomplete Freund's adjuvant)과 혼합하여 마우스의 복강 내에 주사하였다. 일주일 후 마지막 부스팅(boosting)이 수행되고 3일 후에 상기 마우스의 꼬리에서 채혈하여 혈청을 얻은 뒤 1/1000로 PBS에 희석하여 ELISA로 c-Met을 인지하는 항체의 역가가 증가됨을 확인하였다. 상기의 결과로 항체의 양이 충분하게 얻어지는 마우스를 선별하여 하기의 세포융합과정을 수행하였다.

1.1.2. 세포 융합 및 하이브리도마의 제조

세포융합 실험 3일 전에 50 ㎍의 PBS에 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질 혼합물을 BALB/c 마우스(Japan SLC, Inc.)의 복강 내에 주사하고, 면역화 된 마우스를 마취한 후 몸통의 좌측에 위치한 비장(spleen)을 적출하였다. 적출한 비장을 메쉬로 갈아서 세포를 분리하고, 배양 배지(DMEM, GIBCO, Invitrogen)와 혼합하여 비장세포 현탁액을 만들었다. 상기 현탁액을 원심분리하여 세포층을 회수하였다. 상기 얻어진 비장세포 1 x 10⁸개와 골수종세포(Sp2/0) 1 x 10⁸개를 혼합한 다음, 원심분리하여 세포를 침전시켰다. 상기 원심분리된 침전물을 천천히 분산시키고, 배양 배지(DMEM)에 들어있는 45% 폴리에틸렌글리콜(PEG)(1 ㎖)을 처리하고, 37 ℃에서 1분 동안 유지시킨 후, 배양 배지(DMEM) 1 ㎖을 첨가하였다. 이후 배양배지(DMEM) 10 ㎖을 1분 동안 첨가하고, 37℃의 물에서 5분 동안 방치한 후 50 ㎖로 맞추어 다시 원심분리하였다. 세포 침전물을 분리 배지(HAT 배지)에 1~2×10⁵/㎖ 정도로 재현탁시키고, 96-웰(well) 플레이트에 0.1 ㎖씩 분주한 후 37℃ 이산화탄소 배양기에서 배양하여 하이브리도마 세포군을 제작하였다.

1.1.3. c- Met 단백질에 대한 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 선별

상기 참고예 1.1.2에서 제조된 하이브리도마 세포군 중에서 c-Met 단백질에만 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포를 선별하기 위하여 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질과 인간의 Fc 단백질을 항원으로 이용한 ELISA 분석 방법을 통하여 스크리닝하였다.

마이크로타이터 플레이트에 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질을 한 웰당 각각 50 ㎕ (2 ug/㎖)씩 가하여 플레이트 표면에 부착시키고, 반응하지 않은 항원은 세척하여 제거하였다. c-Met이 아닌 Fc에 결합되는 항체를 선별하여 제외시키기 위하여 인간의 Fc 단백질을 위와 동일한 방법으로 플레이트 표면에 부착시켰다.

상기 참고예 1.1.2에서 얻어진 하이브리도마 세포의 배양액을 상기 준비된 각각 웰에 50 ㎕씩을 가하여 1 시간 동안 반응시킨 후 인산 완충용액-트윈 20(TBST) 용액으로 충분히 세척하여 반응하지 않은 배양액을 제거하였다. 여기에 염소 항-마우스 IgG-호스래디쉬 퍼옥시다제(goat anti-mouse IgG-HRP)를 가하여 1 시간 동안 실온에서 반응시킨 다음, TBST 용액으로 충분히 세척하였다. 이어서 퍼옥시다제의 기질용액(OPD)을 가하여 반응시키고, 그 반응 정도는 ELISA Reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하여 확인하였다.

위와 같은 반응 정도 확인에 의하여, 인간의 Fc에는 결합되지 않고, 인간의 c-Met 단백질에만 특이적으로 높은 결합력을 갖는 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주들을 반복하여 선별하였다. 반복 선별을 통해 얻은 하이브리도마 세포주를 제한 희석(limiting dilution)하여 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주 1개의 클론을 최종적으로 얻었다. 최종 선별된 단일클론 항체 생산 하이브리도마를 2009년 10월 6일자로 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 대한민국 서울 종로구 연건동에 소재하는 한국 세포주연구재단에 기탁하여 수탁번호 KCLRF-BP-00220를 부여받았다 (한국 공개특허 제2011-0047698 참조).

1.1.4. 단일클론 항체의 생산 및 정제

상기 참고예 1.1.3에서 얻은 하이브리도마 세포를 무혈청 배지에서 배양하고 배양액으로부터 단일클론 항체를 생산 정제하였다.

먼저 10%(v/v) FBS가 포함된 배양 배지(DMEM) 배지 50 ㎖에서 배양된 상기 하이브리도마 세포를 원심분리하여 세포 침전물을 20 ㎖ PBS로 2회 이상 세척하여 FBS가 제거된 상태에서, 상기 세포 침전물을 배양 배지(DMEM) 배지 50 ㎖에 재현탁시킨 후, 3일 동안 37℃ 이산화탄소 배양기에서 배양하였다.

이후, 원심분리하여, 항체를 생산하는 세포를 제거하고 항체들이 분비된 배양액을 분리하여, 4℃에 보관하거나 바로 모아서 항체의 분리 정제에 사용하였다. 친화성 칼럼(Protein G agarose column; Pharmacia, USA)을 장착한 AKTA 정제 기기(GE Healthcare)를 이용하여 상기 준비된 배양액 50 ㎖ 내지 300 ㎖로부터 항체를 순수 정제한 후, 단백질 응집용 필터(Amicon)를 사용하여 PBS로 상층액을 치환하여 정제된 항체를 보관하고, 이후의 실시예에 사용하였다.

1.2. c- Met 에 대한 키메릭 항체 chAbF46 의 제작

일반적으로 마우스 항체는 치료 목적으로 인간에게 주입되었을 때 면역거부반응(immunogenicity)을 보일 가능성이 높으므로, 이를 해결하기 위하여, 상기 실시예 1에서 제작된 마우스 항체 AbF46으로부터, 항원 결합에 관련된 변이 영역(variable region)을 제외한 불변 영역(constant region)을 인간 IgG1 항체의 서열로 치환하는 키메릭 항체 chAbF46을 제작하였다.

중쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열은 'EcoRI-signal sequence-VH-NheI-CH-TGA-XhoI'(서열번호 38)로, 경쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열은 'EcoRI-signal sequence-VL- BsiWI-CL-TGA-XhoI'(서열번호 39)로 구성되도록 각각 디자인하여 유전자를 합성하였다. 이후, Invitrogen 사의 OptiCHO^TM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVEC^TM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편(서열번호 38)을, pcDNA^TM3.3-TOPOTA Cloning Kit(Cat no. 8300-01)에 상기 경쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편(서열번호 39)을 각각 EcoRI(NEB, R0101S)과 XhoI(NEB, R0146S) 제한 효소를 사용하여 클로닝함으로써, 키메릭 항체의 발현을 위한 중쇄를 포함하는 벡터 및 경쇄를 포함하는 벡터를 각각 구축하였다.

상기 구축된 벡터는 각각 Qiagen Maxiprep kit (Cat no. 12662)을 이용하여 증폭되었으며, 임시발현은 Freestyle^TM MAX 293 Expression System (invitrogen)을 이용하여 진행 되었다. 사용된 세포주는 293 F cell 이며, FreeStyle™ 293 Expression Medium를 배지로 사용하여 부유배양방식으로 배양되었다. 임시발현 하루 전 세포를 5x10⁵cells/ml의 농도로 준비한 후, 24시간이 지난 뒤 cell수가 1x10⁶cells/ml이 되었을 때 임시발현을 진행하였다. Freestyle^TM MAX reagent (invitrogen)을 사용한 liposomal reagent법으로 형질도입(transfection)을 진행 하였으며, 15ml tube에 중쇄 DNA: 경쇄 DNA=1:1 의 비율로 DNA를 준비하여 OptiPro™ SFM (invtrogen) 2ml과 mix하고(A), 또 다른 15ml tube에 Freestyle^TM MAX reagent 100㎕와 OptiPro™ SFM 2ml을 mix(B)한 후, (A)와 (B)을 mix하여 15분간 incubation 한 후, 하루 전에 준비한 세포에 혼합액을 천천히 섞어주었다. 형질도입 완료 후, 37℃, 80% humidity, 8% CO₂ _,130 rpm incubator에서 5일간 배양하였다.

이후, 10%(v/v) FBS가 첨가된 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 5시간 동안 배양한 다음, FBS가 첨가되지 않은 DMEM 배지로 48시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다.

상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액을 각각 100 ml 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출시켰다. 얻어진 용출물을 PBS 버퍼로 교환하여 최종적으로 키메릭 항체 AbF46(이하, chAbF46로 명명함)을 정제하였다.

1.3. 키메릭 항체 chAbF46 으로부터 인간화 항체 huAbF46 의 제작

1.3.1. 중쇄의 인간화( Heavy chain humanization )

H1-heavy 및 H3-heavy 2종의 디자인을 위하여, 우선 Ig Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 통하여 상기 참고예 1.2에서 정제된 마우스 항체 AbF46의 VH 유전자와 가장 상동성이 높은 인간의 생식선(germline) 유전자를 분석하였다. 그 결과, VH3-71이 아미노산 레벨에서 83%의 상동성을 가짐을 확인하였으며, 마우스 항체 AbF46의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3를 Kabat numbering으로 정의하고, 마우스 항체 AbF46의 CDR 부분이 VH3-71의 골격(framework)에 도입되도록 디자인하였다. 이때, 30번(S→T), 48번(V→L), 73번(D→N), 78번(T→L) 아미노산은 원래 마우스 AbF46 항체의 아미노산 서열로 back-mutation 하였다. 이후, H1은 추가로 83번(R→K)과 84번(A→T) 아미노산에 돌연변이를 주어 최종적으로 H1-heavy(서열번호 40)와 H3-heavy(서열번호 41)를 구축하였다.

H4-heavy의 디자인을 위하여 인간항체의 골격(framework) 서열을 찾아 본 결과, AbF46 항체의 마우스 골격 서열과 서열이 매우 유사함과 동시에, 기존의 가장 안정하다고 알려진 VH3 subtype을 사용하여 Kabat numbering으로 정의된 마우스 항체 AbF46의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3를 도입하였다. 이를 통하여 H4-heavy (서열번호 42)를 구축하였다.

1.3.2. 경쇄의 인간화( Light chain humanization )

H1-light(서열번호 43) 및 H2-light(서열번호 44) 2종의 디자인을 위하여, Ig Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 통하여, 마우스 항체 AbF46의 VL 유전자와 가장 상동성이 높은 인간 생식선 유전자를 분석하였다. 그 결과, VK4-1이 아미노산 레벨에서 75%의 상동성을 가짐을 확인하였으며, 마우스 항체 AbF46의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3를 Kabat numbering으로 정의하고, 마우스 항체 AbF46의 CDR부분이 VK4-1의 골격에 도입되도록 디자인하였다. 이때, H1-light는 36번(Y→H), 46번(L→M), 49번(Y→I) 3개의 아미노산을 back-mutation 하였으며, H2-light는 49번 아미노산(Y→I) 1개만을 back-mutation 하여 구축하였다.

H3-light(서열번호 45)의 디자인을 위하여, Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 통하여 마우스 항체 AbF46의 VL 유전자와 가장 상동성이 높은 인간 생식선 유전자를 분석한 결과 중, 상기 VK4-1 이외에 VK2-40을 선정하였다. 마우스 항체 AbF46 VL과 VK2-40은 아미노산 레벨에서 61%의 상동성을 가짐을 확인하였으며, 마우스 항체 AbF46의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3를 Kabat numbering으로 정의하고, 마우스 항체 AbF46의 CDR부분이 VK4-1의 골격에 도입되도록 디자인하였다. 이때, H3-light는 36번(Y→H), 46번(L→M), 49번(Y→I) 3개의 아미노산을 back-mutation 하여 구축하였다.

H4-light(서열번호 46)의 디자인을 위하여, 인간항체의 골격(framework) 서열을 찾아 본 결과, 기존의 가장 안정하다고 알려진 Vk1 subtype을 사용하여 Kabat numbering으로 정의된 마우스 항체 AbF46의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3를 도입하였다. 이때, H4-light는 36번(Y→H), 46번(L→M), 49번(Y→I) 3개의 아미노산을 추가로 back-mutation 하여 구축하였다.

이후, Invitrogen 사의 OptiCHO^TM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVEC^TM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편(H1-heavy; 서열번호 47, H3-heavy; 서열번호 48, H4-heavy; 서열번호 49)을 pcDNA^TM3.3-TOPOTA Cloning Kit 에 상기 경쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편(H1-light; 서열번호 50, H2-light; 서열번호 51, H3-light; 서열번호 52, H4-light; 서열번호 53)을 각각 EcoRI(NEB, R0101S)과 XhoI(NEB, R0146S) 제한 효소를 사용하여, 클로닝함으로써, 인간화 항체의 발현을 위한 벡터를 구축하였다.

상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액 각 100 ml을 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출하였다. 이를 PBS buffer로 교환하여 최종적으로 인간화 항체 AbF46(이하, huAbF46로 명명함)을 정제하였다. 한편, 이후 실시예에서 사용한 인간화 항체 huAbF46의 중쇄, 경쇄 조합은 H4-heavy (서열번호 42) 및 H4-light(서열번호 46)이다.

1.4. huAbF46 항체의 scFv 라이브러리 제작

huAbF46 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 이용하여 huAbF46 항체의 scFv를 제작하기 위한 유전자를 디자인하였다. 각각의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 'VH-링커-VL'의 형태가 되도록 하고, 상기 링커는 'GLGGLGGGGSGGGGSGGSSGVGS'(서열번호 54)의 아미노산 서열을 가지도록 디자인하였다. 이렇게 디자인된 huAbF46 항체의 scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 55)를 바이오니아에 의뢰하여 합성하였으며, 이를 발현시키기 위한 벡터를 서열번호 56에 나타내었다.

이후, 상기 벡터로부터 발현된 결과물을 분석하여, c-Met에 특이적인 결합력을 보임을 확인하였다.

1.5. 친화도 성숙( affinity maturation )을 위한 라이브러리 유전자의 제작

1.5.1. 표적 CDR 의 선정 및 프라이머 제작

huAbF46 항체의 친화도 성숙(affinity maturation)을 위하여 6개의 상보성 결정 부위(complementary determining region, CDR)를 상기 제작된 마우스 항체 AbF46으로부터 'Kabat numbering'에 의하여 정의하였으며, 각각의 CDR은 하기 표 1과 같다.

CDR	아미노산 서열
CDR-H1	DYYMS(서열번호 1)
CDR-H2	FIRNKANGYTTEYSASVKG(서열번호 2)
CDR-H3	DNWFAY(서열번호 3)
CDR-L1	KSSQSLLASGNQNNYLA(서열번호 10)
CDR-L2	WASTRVS(서열번호 11)
CDR-L3	QQSYSAPLT(서열번호 12)

항체 CDR의 무작위 서열 도입을 위하여 다음과 같이 프라이머를 제작하였다. 기존의 무작위 서열 도입 방식은 돌연변이를 주고자 하는 부위에 동일한 비율의 염기 (25% A, 25% G, 25% C, 25% T)가 도입되도록 N 코돈을 이용하였으나, 본 실시예에서는 huAbF46 항체의 CDR에 무작위 염기를 도입하기 위하여, 각 CDR의 아미노산을 코딩하는 3개의 야생형(wild-type) 뉴클레오타이드 중 첫번째와 두번째 뉴클레오타이드의 85%는 그대로 보존하고, 나머지 3개의 염기를 각각 5%씩 도입하는 방식을 취하였다. 또한, 세 번째 뉴클레오타이드는 동일하게(33% G, 33% C, 33% T)가 도입되도록 프라이머를 디자인하였다.

1.5.2. huAbF46 항체의 라이브러리 제작 및 c- Met 에 대한 결합력 확인

CDR의 무작위 서열 도입을 통한 항체 라이브러리 유전자의 구축은 상기 참고예 1.5.1과 같은 방법으로 제작된 프라이머를 이용하여 수행하였다. 주형으로 huAbF46 항체의 scFv를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 이용하여, 도 1에 나타낸 방법과 같이 2개의 PCR 절편을 제작하고, 이를 중복 확장 중합효소연쇄반응(overlap extension PCR) 방법을 통하여, 원하는 CDR만 각각 돌연변이된 huAbF46 항체의 scFv 라이브러리 유전자를 확보하여 제작된 6개의 CDR을 각각 표적으로 하는 라이브러리들을 구축하였다.

이렇게 제작된 라이브러리는 야생형과 각 라이브러리의 c-Met에 대한 결합력을 확인하였으며,　각각의 라이브러리는 야생형에 비하여 c-Met에 대한 결합력이 대부분 낮아지는 경향을 보였으나, 일부 c-Met에 대한 결합력이 유지되는 돌연변이들을 확인하였다.

1.6. 제작된 라이브러리로부터 친화도가 개선된 항체의 선별

상기 구축된 라이브러리로부터 c-Met에 대한 라이브러리의 결합력을 향상시킨 후, 각각의 개별 클론으로부터 scFv의 유전자 서열을 분석하였다. 확보된 유전자 서열은 각각 하기 표 2와 같으며, 이를 IgG 형태로 변환하였다. 하기 클론 중에서, L3-1, L3-2, L3-3, L3-5으로부터 생산된 4종의 항체를 선별하여 후속 실험을 수행하였다.

클론 이름	도출된 라이브러리	CDR 서열
H11-4	CDR-H1	PEYYMS(서열번호 22)
YC151	CDR-H1	PDYYMS(서열번호 23)
YC193	CDR-H1	SDYYMS(서열번호 24)
YC244	CDR-H2	RNNANGNT(서열번호 25)
YC321	CDR-H2	RNKVNGYT(서열번호 26)
YC354	CDR-H3	DNWLSY(서열번호 27)
YC374	CDR-H3	DNWLTY(서열번호 28)
L1-1	CDR-L1	KSSHSLLASGNQNNYLA(서열번호 29)
L1-3	CDR-L1	KSSRSLLSSGNHKNYLA(서열번호 30)
L1-4	CDR-L1	KSSKSLLASGNQNNYLA(서열번호 31)
L1-12	CDR-L1	KSSRSLLASGNQNNYLA(서열번호 32)
L1-22	CDR-L1	KSSHSLLASGNQNNYLA(서열번호 33)
L2-9	CDR-L2	WASKRVS(서열번호 34)
L2-12	CDR-L2	WGSTRVS(서열번호 35)
L2-16	CDR-L2	WGSTRVP(서열번호 36)
L3-1	CDR-L3	QQSYSRPYT(서열번호 13)
L3-2	CDR-L3	GQSYSRPLT(서열번호 14)
L3-3	CDR-L3	AQSYSHPFS(서열번호 15)
L3-5	CDR-L3	QQSYSRPFT(서열번호 16)
L3-32	CDR-L3	QQSYSKPFT(서열번호 37)

1.7. 선별된 항체의 IgG 로의 변환

선별된 4종의 항체의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 'EcoRI-signal sequence-VH-NheI-CH-XhoI'(서열번호 38)로 구성되며, 중쇄의 경우 친화도 성숙 후에 항체의 아미노산이 변경되지 않았으므로, huAbF46 항체의 중쇄를 그대로 사용하였다. 다만, 힌지 영역(hinge region)은 인간 IgG1의 힌지가 아닌 U6-HC7 힌지(서열번호 57) 로 치환하였다. 경쇄는 'EcoRI-signal sequence-VL-BsiWI-CL-XhoI'로 구성되도록 각각 디자인하여 유전자를 합성하였으며, 친화도 성숙 후에 선별된 상기 4종 항체의 경쇄 가변영역을 포함하여 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 58 내지 서열번호 61)를 바이오니아에 의뢰하여 합성하였다. 이후, Invitrogen 사의 OptiCHO^TM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVEC^TM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편(서열번호 38)을, pcDNA^TM3.3-TOPOTA Cloning Kit(Cat no. 8300-01)에 상기 경쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편(L3-1 유래 CDR-L3를 포함하는 DNA 절편: 서열번호 58, L3-2 유래 CDR-L3를 포함하는 DNA 절편: 서열번호 59, L3-3 유래 CDR-L3를 포함하는 DNA 절편: 서열번호 60, L3-5 유래 CDR-L3를 포함하는 DNA 절편: 서열번호 61)을 각각 EcoRI(NEB, R0101S)과 XhoI(NEB, R0146S) 제한 효소를 사용하여 클로닝함으로써, 친화력 성숙된 항체의 발현을 위한 벡터를 구축하였다.

상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액 각 100 ml을 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출하였다. 이를 PBS buffer로 교환하여 최종적으로 친화력 성숙된 4종의 항체(이하, huAbF46-H4-A1(L3-1 유래), huAbF46-H4-A2 (L3-2 유래), huAbF46-H4-A3 (L3-3 유래), 및 huAbF46-H4-A5(L3-5 유래)로 명명함)를 정제하였다.

1.8. 불변영역 및/또는 힌지영역이 치환된 huAbF46 - H4 -A1의 제조

상기 참고예 1.7에서 선별된 4종의 항체 중에서, c-Met과의 결합친화도가 가장 높고, Akt 인산화 및 c-Met 분화 정도가 가장 낮은 것으로 측정된 huAbF46-H4-A1을 대상으로, 힌지영역 또는 불변영역 및 힌지영역이 치환된 항체를 제작하였다.

huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변영역, U6-HC7 힌지 및 인간의 IgG1 불변영역으로 이루어진 중쇄 및 huAbF46-H4-A1의 경쇄 가변영역 및 인간의 카파(kappa) 불변영역으로 이루어진 경쇄로 이루어진 항체를 huAbF46-H4-A1(U6-HC7)으로; huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변영역, 인간의 IgG2 힌지 및 인간의 IgG1 불변영역으로 이루어진 중쇄 및 huAbF46-H4-A1의 경쇄 가변영역 및 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 경쇄로 이루어진 항체를 huAbF46-H4-A1(IgG2 hinge)로; huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변영역, 인간의 IgG2 힌지 및 인간의 IgG2 불변영역으로 이루어진 중쇄 및 huAbF46-H4-A1의 경쇄 가변영역 및 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 경쇄로 이루어진 항체를 huAbF46-H4-A1(IgG2 Fc)로 각각 명명하였다. 또한, 한편, 상기 3종의 항체는 생산량 증대를 위하여 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 경쇄의 36번 히스티딘 (histidine)을 모두 티로신 (tyrosine)으로 치환하였다.

상기 3종 항체를 제작하기 위해, huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변영역, U6-HC7힌지 및 인간의 IgG1 불변영역으로 이루어진 폴리펩티드(서열번호 62)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 63), huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변영역, 인간의 IgG2 힌지 및 인간의 IgG1 불변영역으로 이루어진 폴리펩티드(서열번호 64)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 65), huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변영역, 인간의 IgG2 힌지 및 인간의 IgG2 불변영역으로 이루어진 폴리펩티드(서열번호 66)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 67), 36번 히스티틴이 티로신으로 치환된 huAbF46-H4-A1의 경쇄 가변영역 및 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 폴리펩티드(서열번호 68)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 69)를 바이오니아에 의뢰하여 합성하였다. 이후, Invitrogen 사의 OptiCHO^TM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVEC^TM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 염기서열을 갖는 DNA 절편을, pcDNA^TM3.3-TOPOTA Cloning Kit(Cat no. 8300-01)에 상기 경쇄에 해당하는 염기서열을 갖는 DNA 절편을 삽입하여, 상기 항체의 발현을 위한 벡터를 구축하였다.

상기 구축된 벡터는 각각 Qiagen Maxiprep kit (Cat no. 12662)을 이용하여 증폭되었으며, 임시발현은 Freestyle^TM MAX 293 Expression System (invitrogen)을 이용하여 진행 되었다. 사용된 세포주는 293 F cell 이며, FreeStyle™ 293 Expression Medium를 배지로 사용하여 부유배양방식으로 배양되었다. 임시발현 하루 전 세포를 5x10⁵cells/ml의 농도로 준비한 후, 24시간이 지난 뒤 cell수가 1x10⁶cells/ml이 되었을 때 임시발현을 진행하였다. Freestyle^TM MAX reagent (invitrogen)을 사용한 liposomal reagent법으로 형질도입(transfection)을 진행 하였으며, 15ml tube에 중쇄 DNA: 경쇄 DNA=1:1 의 비율로 DNA를 준비하여 OptiPro™ SFM (invtrogen) 2ml과 mix하고(A), 또 다른 15ml tube에 Freestyle^TM MAX reagent 100㎕와 OptiPro™ SFM 2ml을 mix(B)한 후, (A)와 (B)을 mix하여 15분간 incubation 한 후, 하루 전에 준비한 세포에 혼합액을 천천히 섞어주었다. 형질도입 완료 후, 37 ℃, 80% humidity, 8% CO₂ _,130 rpm incubator에서 5일간 배양하였다.

상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액 각 100 ml을 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출하였다. 이를 PBS buffer로 교환하여 최종적으로 3종의 항체(huAbF46-H4-A1(U6-HC7), huAbF46-H4-A1(IgG2 hinge), huAbF46-H4-A1(IgG2 Fc))를 정제하였다. 이 중에서 본 발명에 따른 항 c-Met 항체를 대표하여 huAbF46-H4-A1(U6-HC7)와 huAbF46-H4-A1(IgG2 Fc)을 선택하여 하기의 실시예에 사용하였으며, 편의상 상기 항체를 각각 항 c-Met 항체 L3-1Y(huAbF46-H4-A1(U6-HC7)) 및 항 c-Met 항체 L3-1Y IgG2 (uAbF46-H4-A1(IgG2 Fc))로 명명하였다.

1.9. huAbF46 항체의 에피토프 맵핑(mapping)을 위한 펩티드 제작

(1) 에피토프 맵핑

1) huAbF46 항체의 에피토프 맵핑을 위한 펩타이드 제작

c-Met의 SEMA 도메인을 포함하는 543개의 아미노산 서열 및 구조는 PDB (Protein Database) ID: 1UZY 에 나타나 있으며, 이들 아미노산 서열을 기초로 CLIPS (Chemically Linked Peptides on Scaffolds) 기술을 이용하여 구조적 에피토프(conformational eptitope)와 불연속적 에피토프(discontinuous epitope)를 만들 수 있는 6063개의 다른 서열들이 디자인되고 합성 되었다 (Timmerman et al., 2007 Functional reconstruction and synthetic mimicry of a conformational epitope using CLIPS^TM technology. J. Mol. Recognit. 20: 283-00). Peptide array 제작 과정을 자세히 설명하면, CLIPS 기술은 기존의 전형적인 방법인 약 15개의 아미노산 길이를 갖는 선형 펩티드 이외에 CLIPS(Chemically Linked Peptides on Scaffolds)라 불리는 'PepScan'사 고유의 구조를 갖는 펩티드를 제작하는 방법으로, huAbF46 항체를 대상으로 선형 펩티드 및 CLIPS 펩티드 모두에 대하여 결합력을 측정하였다. CLIPS 펩티드 중 T2 CLIPS 펩티드는 2개의 시스테인이 루프(loop)를 형성하여 인위적으로 펩티드에 구조를 부여하며, T3 CLIPS 펩티드는 3개의 시스테인이 루프를 형성하여 펩티드에 구조를 부여한다. 또한, T2T3 또는 T2T2와 같은 결합형 펩티드를 제작할 수도 있다.

에피토프 멥핑을 위해 총 6063개의 펩티드를 제작하였으며(Peptide array의 제작은 PepScan에 의뢰함), 1 내지 529번 펩티드는 전형적인 선형 펩티드로서, 일부 영역이 오버래핑(overlapping) 되도록 15개의 아미노산 길이로 제작되었다. 530 내지 1058번 펩티드는 T2 CLIPS 펩티드에 1 내지 529번 펩티드들을 도입하여 제작하였다. 1059 내지 2014번 펩티드는 T3 CLIPS 펩티드에 15개의 아미노산을 가지는 펩티드 2개를 연결하여 총 956개를 제작하였다. 2015 내지 6063번 펩티드는 8 내지 35개의 아미노산 잔기를 가지는 펩티드 그룹간의 결합을 통하여 선형 및 비연속적인 구조를 가지는 에피토프를 찾기 위한 펩티드로서 총 4048개가 제작되었다.

예를 들어, T2 CLIPS 펩티드를 포함하는 펩티드 어레이는 다음과 같은 방법으로 제작한다. 0.5 mM의 T2 CLIPS 펩티드가 포함된 1,3-비스 (브로모메틸) 벤젠 용액을 암모늄 비카르보네이트 (20 mM, pH 7.9)/아세톤니트릴 (1:1(v/v)에 용해시키고, 상기 결과물 용액을 펩티드 어레이에 첨가하였다. 상기 CLIPS 주형은 펩티드 어레이(3 ul의 웰을 갖는 455개의 웰 플레이트)의 고체-상 결합된 펩티드 내에 존재하는 2개의 시스테인 곁사슬에 결합된다. 상기 용액이 완전하게 덮히도록 30분 내지 60분 동안 상기 용액 내에서 펩티드 어레이를 천천히 흔들어 주었다. 마지막으로, 상기 펩티드 어레이를 과량의 물로 충분히 세척하고, PBS (pH 7.2) 내에 1% SDS/0.1% 베타-머캅토에탄올이 포함된 파쇄-완충액에서 30분 동안 70℃의 온도 조건으로 초음파 분쇄한 다음, 45분 동안 물에서 추가적으로 초음파 분쇄를 하였다. T3 CLIPS 펩티드는 상기 방법과 동일하나, 3개의 시스테인 곁사슬에 결합되도록 한다.

상기 펩티드를 사용하여 ELISA를 통해 에피토프 맵핑을 수행한 결과, huAbF46의 핵심 에피토프는 c-Met 단백질의 168번째 아미노산에서 171번째 아미노산으로 이루어진 펩티드인 EEPSQ(서열번호 73)임을 확인할 수 있었다.

2) huAbF46 항체의 에피토프 맵핑(mapping)을 위한 ELISA 분석

에피토프 맵핑을 위하여 총 529개의 선형 펩티드 및 CLIPS 펩티드를 사용하여 PEPSCAN-기반의 ELISA 분석을 수행하였다. 상기 펩티드들은 5% 블로킹 용액(4% 오브알부민(ovalbumin), 5% 말 혈청(horse serum) 및 1% Tween 80)을 이용하여 30분 동안 상온에서 반응시켰다. 이후, 1% Tween 80이 첨가된 PBS에서 4℃로 밤샘 반응시킨 1 내지 100 ug/ml 범위의 huAbF46 항체를 상기 펩티드들에 반응시킨 후, 세척하였다. 이후, rabbit-anti-sheep antibody(SIGMA)를 처리하고, PBS로 세척한 후, 퍼옥시다제가 부착된 swine-anti-rabbit antibody(SIGMA)를 처리하고, PBS로 세척하였다. 이후, 3% H₂O₂에 2 ul/ml의 퍼옥시다제 2,2'-azino-di-3-ethylbenzthiazoline sulfonate (ABTS)(SIGMA)를 처리하고, 1시간 후에 발색 반응을 측정하였다.

그 결과, 도 15에서 보는 바와 같이, 선형 펩티드 및 CLIPS 펩티드 모두에서 'EEPSQ' 서열(서열번호 73)을 포함하는 펩티드에서만 특이적인 ELISA 양성 반응을 보였으며, 이에 따라, 상기 huAbF46은 c-Met의 선형 에피토프 및 구조 에피토프(conformational epitope)를 모두 인지하는 항체임을 확인할 수 있었다.

또한 상기 'EEPSQ'(서열번호 73) 에피토프 가운데 일부 폐암 환자 또는 난소암 환자에서 발견되는 것으로 알려진 c-Met SEMA 부위의 대표적인 돌연변이인 E168D 변이가 형성된 폴리펩티드를 이용하여 상기와 동일한 방법으로 ELISA를 수행한 결과, 하기 표 3과 같은 결과를 얻었다.

Core peptide sequence	Synthesized peptide sequence	ELISA value (antibody binding of huAbF46)
EEPSQ(SEQ ID NO: 73)	FAPQIEEPSQCPDCVVSALGAKVL(SEQ ID NO: 119)	2063
	CSPQIEEPSQC(SEQ ID NO: 120)	1306
	CPQIEEPSQAC(SEQ ID NO: 121)	2157
	CQIEEPSQAPC(SEQ ID NO: 122)	2744
	CIEEPSQAPDC(SEQ ID NO: 123)	2239
	CEEPSQAPDAC(SEQ ID NO: 124)	2829
EDPSQ(SEQ ID NO: 125)	FSPQIEDPSQCPDCVVSALGAKVL(SEQ ID NO: 126)	172
	CSPQIEDPSQC(SEQ ID NO: 127)	121
	CPQIEDPSQAC(SEQ ID NO: 128)	138
	CQIEDPSQAPC(SEQ ID NO: 129)	172
	CIEDPSQAPDC(SEQ ID NO: 130)	128
	CEDPSQAPDAC(SEQ ID NO: 131)	132

상기 결과로부터 huAbF46 항체는 E168D 변이를 가진 c-Met SEMA에는 결합하지 못하며, 따라서, 상기 항체는 암 발병 정보를 제공하기 위한 진단 방법에 이용될 수 있음을 의미한다.

3) huAbF46 항체의 에피토프 맵핑 결과 분석

상기실험으로부터, huAbF46 항체는 c-Met 단백질의 168번째 아미노산에서 171번째 아미노산으로 이루어진 펩티드인 'EEPSQ' 서열을 포함하는 선형 펩티드 및 CLIPS 펩티드 모두에서 비특이적 반응없이 특이적인 결합 반응을 보였다. 이는 huAbF46 항체가 c-Met 단백질 중 선형 에피토프 및 구조적 에피토프(conformational epitope) 모두에 결합함을 의미하며, 이를 분자구조 측면에서 확인하면(PyMOL 1.4.1 (www.pymol.org), Cn3D 4.1 (NCBI)), 도 16에 나타낸 바와 같이, huAbF46 항체의 에피토프는 SEMA 도메인에 위치하며, HGF의 결합 부위에서도, 직접적인 결합 부위와 가까운 쪽의 루프(loop)에 해당하는 위치임을 확인할 수 있었다.

(2) Full Positional Scanning 결과 분석

EEPSQ 서열의 각 아미노산 부위를 원래의 아미노산이 아닌 다른 20종의 아미노산으로 치환하고, 이들 각각의 펩티드가 huAbF46 항체와의 결합력에 어떤 변화가 생기게 되는지를 7종의 펩티드 어레이를 통하여 상세 분석하였다.

분석 결과, EEPSQ의 아미노산 서열 중 어떠한 아미노산이 상기 항체의 결합에 중요한지 여부를 확인하였으며, 특히 앞 부분의 EEP 서열이 항체의 결합에 매우 중요한 요소임을 확인할 수 있었다.

1.10. SEMA 도메인의 돌연변이에 의한 huAbF46 항체의 결합력 분석

EEPSQ 서열의 각 아미노산 부위 또는 5개 아미노산 전체를 원래의 아미노산이 아닌 알라닌으로 치환하고, 이들 각각의 펩티드('AAAAA', 'AEPSQ', 'EAPSQ', 'EEASQ', 'EEPSQ', 'EEPSA', 서열번호 132 내지 서열번호 137)와 huAbF46 항체의 결합력을 Biacore(GE healthcare)를 사용하여 측정하였다. CM5 칩 상에 huAbF46 항체를 약 80~110 RU만큼 고정시킨 후, 항원인 상기 서열번호 132 내지 서열번호 137의 펩티드를 100 nM부터 0.39 nM까지의 농도 범위 내에서 서로 다른 9개의 농도로 30 ul/min의 속도로 주입하여, 하기 표 4와 같이 kon 값과 koff 값을 구하고, 이로부터 KD 값을 계산하였다. 그 결과, 아미노산이 치환된 펩티드에는 huAbF46 항체가 결합하지 못하였으며, 이러한 결과를 통해서 'EEPSQ' 서열이 huAbF46 항체의 필수적인 에피토프임을 확인할 수 있었다.

항체	항원	k_off(1/Ms)	k_on(1/s)	K_D(nM)
huAbF46	EEPSQ(서열번호 73)	4.30 x 10⁵	7.05 x 10^-4	1.64
huAbF46	AAAAA(서열번호 132)	결합하지 않음
huAbF46	AEPSQ(서열번호 133)	결합하지 않음
huAbF46	EAPSQ(서열번호 134)	결합하지 않음
huAbF46	EEASQ(서열번호 135)	결합하지 않음
huAbF46	EEPAQ(서열번호 136)	4.32 x 10⁵	6.16 x 10^-4	1.43
huAbF46	EEPSA(서열번호 137)	결합하지 않음

참고예 2: 항 EGFR scFv 의 제작

EGFR에 결합되는 항체의 서열은 항 EGFR 항체의 scFv 서열을 기초로 중쇄가변부위와 경쇄가변부위 사이에 (G₄S)₃ linker peptide를 넣어서 제작하였다. 구체적으로, 자동화 유전자 합성(㈜바이오니아에 의뢰)으로 인간화 항 EGFR 항체 중쇄가변부위 (서열번호 109) 코딩 DNA 서열(서열번호 110)과 경쇄가변부위(서열번호 111) 코딩 DNA 서열(서열번호 112)에 (GGGGS)₃ linker peptide 코딩 DNA 서열을 첨가하여 항 EGFR 항체의 scFv 코딩 DNA를 합성하였다.

한편, 중쇄가변부위(서열번호 109)의 51번 아미노산 F를 I로, 62번 아미노산 Q를 S로, 경쇄가변부위 (서열번호 111)의 46번 아미노산 R을 L로, 83번 아미노산 F를 E로 치환하여 사용한 것을 제외하고, 상기와 동일한 방법으로 1차 변형된 항 EGFR scFv를 제작하였다. 이와 같은 변형으로 항체의 열안정성이 증진시킬 수 있다. 또한, 상기 1차 변형에 중쇄 44번 및 경쇄 100번 아미노산 서열을 C로 치환하는 것을 더하여 2차 변형된 항 EGFR scFv를 제작하였다. 구체적으로, 중쇄가변부위(서열번호 109)의 51번 아미노산 F를 I로, 44번 아미노산 G를 C로, 62번 아미노산 Q를 S로, 경쇄가변부위 (서열번호 111)의 46번 아미노산 R을 L로, 83번 아미노산 F를 E로, 100번 G를 C로 치환하여 사용한 것을 제외하고, 상기와 동일한 방법으로 2차 변형된 항 EGFR scFv (중쇄가변부위: 서열번호 113; 경쇄가변부위: 서열번호 114)를 제작하였다. 이와 같은 변형으로 안정화 다이설파이드 결합이 도입되어 항체의 생체내 약동학적 특성(pharmacokinetics)을 개선시킬 수 있다. 상기 항체 내 아미노산 위치는 kabat numbering에 따랐다.

이와 같이 얻어진 항 EGFR scFv, 또는 1차 또는 2차 변형된 항 EGFR scFv를 하기의 이중 특이 항체 제작에 사용하였다.

참고예 3: 항 Her2 scFv 의 제작

Her2에 결합되는 scFv 항체 서열은 트라스투주맙 (허셉틴)의 서열을 기초로 중쇄가변부위와 경쇄가변부위 사이에 펩타이드 링커 (G₄S)₃를 넣어서 제작되었다. 구체적으로, 자동화 유전자 합성(㈜Bioneer)으로 항 Her2 항체 (허셉틴)의 중쇄가변부위 (서열번호 115) 코딩 DNA 서열(서열번호 116)과 경쇄가변부위(서열번호 117) 코딩 DNA 서열(서열번호 118)에 (GGGGS)₃ 링커 코딩 DNA 서열을 첨가하여 항 Her2 항체의 scFv 코딩 DNA를 합성하였다.

<항 Her2 항체 중쇄 가변부위 아미노산 서열> (서열번호 115)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS

<항 Her2 항체 중쇄 가변부위 코딩 DNA 서열> (서열번호 116)

gaagttcagctggtggagtctggcggtggcctggtgcagccagggggctcactccgtttgtcctgtgcagcttctggcttcaacattaaagacacctatatacactgggtgcgtcaggccccgggtaagggcctggaatgggttgcaaggatttatcctacgaatggttatactagatatgccgatagcgtcaagggccgtttcactataagcgcagacacatccaaaaacacagcctacctgcagatgaacagcctgcgtgctgaggacactgccgtctattattgttctagatggggaggggacggcttctatgctatggactactggggtcaaggaaccctggtcaccgtctcctcg

<항 Her2 항체 경쇄 가변부위 아미노산 서열> (서열번호 117)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKR

<항 Her2 항체 경쇄 가변부위 코딩 염기 서열> (서열번호 118)

gatatccagatgacccagtccccgagctccctgtccgcctctgtgggcgatagggtcaccatcacctgccgtgccagtcaggatgtgaatactgctgtagcctggtatcaacagaaaccaggaaaagctccgaaactactgatttactcggcatccttcctctactctggagtcccttctcgcttctctggttccagatctgggacggatttcactctgaccatcagcagtctgcagccggaagacttcgcaacttattactgtcagcaacattatactactcctcccacgttcggacagggtaccaaggtggagatcaaacga

이와 같이 얻어진 항 Her2 항체의 scFv(항 Her2 scFv)를 하기의 이중 특이 항체 제작에 사용하였다.

실시예 1: 이중특이항체의 제작

1.1. 항 c- Met /항 EGFR 이중 특이 항체의 제작

상기 참고예 1에서 제작된 항 cMet 항체 L3-1Y IgG2의 Fc의 c-말단에 상기 참고예 2에서 제작된 항 EGFR scFv 또는 1차 또는 2차 변형된 항 EGFR scFv를 융합하였다. 그 융합과정은 아래와 같다.

Invitrogen 사의 OptiCHO^TM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pcDNA^TM3.3-TOPOTA Cloning Kit(Cat no. 8300-01)에 EcoRI 및 XhoI 제한 부위를 이용하여 상기 참고예 1에서 제작된 항 cMet 항체 L3-1Y-IgG2의 중쇄에 해당하는 염기서열을 갖는 DNA 절편을 삽입하고, pOptiVEC^TM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 경쇄에 해당하는 DNA 절편을 삽입하였다. 이후, pcDNA^TM3.3 에 삽입된 L3-1Y-IgG2의 Fc의 c-말단에 상기 참고예 2에서 제작된 항 EGFR scFv를 (G4S)2로 이루어진 10개의 아미노산 길이를 가진 linker pepetide를 사용하여 융합함으로써 이중항체의 발현을 위한 벡터를 구축하였다.

상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액 각 100 ml을 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출하였다. 이를 PBS buffer로 교환하여 최종적으로 항 cMet/항 EGFR 이중 특이 항체를 정제하였다.

상기 제작된 항 c-Met 항체 L3-1Y-IgG2의 c-말단에 항 EGFR scFv가 융합된 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체를 ME-01로, L3-1Y-IgG2의 c-말단에 상기 1차 변형된 항 EGFR scFv가 융합된 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체를 ME-03로, L3-1Y-IgG2의 c-말단에 상기 2차 변형된 항 EGFR scFv가 융합된 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체를 ME-03S로 각각 명명하였다.

상기 제작된 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체의 두 가지 항원(cMet/EGFR)에 대한 각 친화도를 Biacore T100(GE)을 사용하여 확인하였다. 인간 Fab 결합제(GE Healthcare)를 CM5 칩(#BR-1005-30,GE)의 표면에 제조사 설명서에 따라서 고정화시켰다. 약 90~120 RU의 ME03S를 포획하고, 다양한 농도의 c-Met-Fc(#358-MT/CF, R&D Systems) 또는 EGFR-Fc(#344-ER, R&D Systems)을 상기 포획된 항체에 주입하였다. 여기에 10mM Glycine-HCl(pH 1.5) 용액을 주입하여 상기 표면을 재생시켰다(regenerated). 친화도를 측정하기 위하여, 상기 실험에서 얻어진 데이터를 BIAevaluation software(GE Healthcare,Biacore T100 evaluation software)를 사용하여 fitting하였다.

상기 얻어진 결과를 아래의 표 5에 나타내었다.

Antibody	Antigen	KD (nM)	Ka (1/Ms)	kd (1/s)
ME03S	c-Met	0.23	6.7x10⁵	1.6x10^-4
ME03S	EGFR	0.12	2.4x10⁵	2.7x10^-5

표 5에 나타낸 바와 같이, 상기 제조된 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체는 두 가지 항원에 모두 결합함을 확인할 수 있다.

1.2. 항 c- Met /항 Her2 이중 특이 항체의 제작

상기 참고예 1에서 제작된 항 cMet 항체 L3-1Y-IgG2 (uAbF46-H4-A1(IgG2 Fc))의 Fc의 c-말단에 상기 참고예 3에서 제작된 항 Her2 scFv를 융합하였다. 그 융합과정은 아래와 같다.

Invitrogen 사의 OptiCHO^TM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pcDNA^TM3.3-TOPOTA Cloning Kit(Cat no. 8300-01)에 EcoRI 및 XhoI 제한 부위를 이용하여 상기 참고예 1에서 제작된 항 cMet 항체 L3-1Y-IgG2의 중쇄에 해당하는 염기서열(서열번호 66)을 갖는 DNA 절편을 삽입하고, pOptiVEC^TM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 항 cMet 항체 L3-1Y-IgG2의 경쇄에 해당하는 염기서열(서열번호 68)을 갖는 DNA 절편을 삽입하였다. 이후, pcDNA^TM3.3 에 삽입된 L3-1Y-IgG2의 Fc의 c-말단에 상기 참고예 3에서 제작된 항 Her2 scFv 코딩 DNA를 (GGGGS)2로 이루어진 펩타이드 링커의 코딩 DNA 서열을 사용하여 융합함으로써 이중항체의 발현을 위한 벡터를 구축하였다.

상기 구축된 벡터를 각각 Qiagen Maxiprep kit (Cat no. 12662)을 이용하여 증폭하였으며, 임시발현은 Freestyle^TM MAX 293 Expression System (invitrogen)을 이용하여 진행 되었다. 사용된 세포주는 293 F cell 이며, FreeStyle™ 293 Expression Medium를 배지로 사용하여 부유배양방식으로 배양되었다. 임시발현 하루 전 세포를 5x10⁵cells/ml의 농도로 준비한 후, 24시간이 지난 뒤 cell수가 1x10⁶cells/ml이 되었을 때 임시발현을 진행하였다. Freestyle^TM MAX reagent (invitrogen)을 사용한 liposomal reagent법으로 형질도입(transfection)을 진행 하였으며, 15ml tube에 중쇄 DNA: 경쇄 DNA=3:2 의 비율로 DNA를 준비하여 OptiPro™ SFM (invtrogen) 2ml과 mix하고(A), 또 다른 15ml tube에 Freestyle^TM MAX reagent 100㎕와 OptiPro™ SFM 2ml을 mix(B)한 후, (A)와 (B)을 mix하여 15분간 incubation 한 후, 하루 전에 준비한 세포에 혼합액을 천천히 섞어주었다. 형질도입 완료 후, 37 ℃, 80% humidity, 8% CO₂ _,130 rpm incubator에서 5일간 배양하였다.

상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액 각 100 ml을 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출하였다. 이를 PBS buffer로 교환하여 최종적으로 항 cMet/항 Her2 이중 특이 항체를 정제하였다.

상기 제작된 항 c-Met 항체 L3-1Y-IgG2의 c-말단에 항 Her2 scFv가 융합된 항 c-Met/항 Her2 이중 특이 항체를 MH2-01으로 명명하였다.

상기 제작된 항 c-Met/항 Her2 이중 특이 항체의 두 가지 항원(cMet/Her2)에 대한 각 친화도를 Biacore T100(GE)을 사용하여 확인하였다. 인간 Fab 결합제(GE Healthcare)를 CM5 칩(#BR-1005-30, GE)의 표면에 제조사 설명서에 따라서 고정화시켰다. 약 90~120 RU의 MH2-01를 포획하고, 다양한 농도의 c-Met-Fc(#358-MT/CF, R&D Systems) 또는 Her2-Fc(1129-ER, R&D Systems)을 상기 포획된 항체에 주입하였다. 여기에 10mM Glycine-HCl(pH 1.5) 용액을 주입하여 상기 표면을 재생시켰다(regenerated). 친화도를 측정하기 위하여, 상기 실험에서 얻어진 데이터를 BIAevaluation software(GE Healthcare, Biacore T100 evaluation software)를 사용하여 fitting하였다.

상기 얻어진 결과를 표 6에 나타내었다.

표 3에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 1에서 제작된 이중 특이 항체 MH2-01은 c-Met과 Her2에 모두 결합함이 확인되었다

실시예 2: 이중 특이 항체의 c- Met 분해

상기 실시예 1.1 및 1.2에서 제작된 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체 및 항 c-Met/항 Her2 이중 특이 항체 의 암세포의 증식 억제 효과를 위암 세포주인 MKN45에서 확인하였다.

모든 세포주는 RPMI1640 배지 (#11875-093, Gibco)에 10%(v/v) FBS와 1%(v/v) Penicilin-Streptomycin을 첨가하여 5% CO₂ 및 37 ℃ 조건에서 배양하였다.

상기 실시예 1.1 및 1.2에서 제작된 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체의 c-Met 단백질의 분해 정도를 확인하기 위하여, 상대적인 총 c-Met량을 측정하였다. 상대적인 총 c-Met량은 항체가 c-Met에 결합하여 내재화를 일으켜 c-Met의 분해(degradation)가 일어나는 것을 이용하여, 총 c-Met양의 증감을 파악하여 항체의 효능을 검사하는 것이다.

우선, MKN45 위암 세포(일본 암연구 세포주 은행, Japanese Cancer Research Bank, JCRB, Tokyo, Japan) 2 x 10⁵ cells/ml와 상기 실시예 1에서 제작된 항체 5 ug(microgram)/ml를 96-웰 플레이트에 동시에 뿌려준 후, 24시간 동안　배양하였다. 이후, 항체가 처리된 세포를 용해(lysis)시키고 Human total HGF R/c-MET ELISA KIT (R&D systems, DYC358)를 이용하여　총 c-Met　양의 변화를 측정한 후 분석하였다.

상기 얻어진 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이 c-Met이 과발현되는 세포인 MKN45 위암 세포주에 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체 ME-01 및 ME-03를 처리함으로써 c-Met의 86.8% 및 88.4%가 분해됨을 관찰하였다. 또한 항 c-Met/항 Her 이중 특이 항체 MH2-01을 처리함으로써 c-Met의 약 80%가 분해됨을 관찰하였다. 이는 상기 이중 특이 항체 중 항 c-Met 도메인인 항 c-Met 항체 L3-1Y 및 L3-1Y IgG2를 단독 처리한 경우의 c-Met 분해 활성과 비교하여 현저하게 증진된 것이다. 이러한 결과는 항 c-Met 항체가 항 EGFR 항체 (scFv) 또는 항 Her2 항체 (scFv)와의 융합에 의하여 상승된 c-Met 분해 활성을 가짐을 보여준다.

실시예 3:　항 c- Met /항 EGFR 이중 특이 항체에 의한 EGFR 의 세포내 이동 및 분해

MKN45 세포주(일본 암연구 세포주 은행, Japanese Cancer Research Bank, JCRB, Tokyo, Japan)를 2X10⁴ cell/well의 양으로 준비하고, 여기에 L3-1Y-IgG2(참고예 1), 항 EGFR 단일항체(하기 참조), 및 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체 ME-03(실시예 1.1)을　각각 단독 처리 또는 병용 처리의 방법으로 각 웰당 5 ug/ml의 농도가 되도록 첨가하여 4시간 동안 37℃에서 처리하였다. 병용투여의 경우에도 각 항체를 5 ug/ml의 농도로 첨가하였다. 대조군(control)으로, 항체 처리 없이 PBS만을 처리한 군을 준비하였다. 여기에 4%(v/v) formaldehyde를 15분 동안 처리하여 세포를　　　플레이트에 고정시키고,　PBS로 3번 세척하였다. 그 후, 블라킹 버퍼(0.5% triton x-100 and 5% donkey serum)를 상온에서 1시간 동안 처리한 후, c-Met (FAB3582A, R&D systems) 및 EGFR (#5616, Cell signaling)에 대한 1차 항체를 1:100으로 희석하여 100 ul (microliter)의 양으로 15시간 동안 4℃에서 처리하였다. PBS로 3번 세척한 후, 2차 항체 (A21433, Invitrogen)를 1:2000으로 희석하여 100 ul의 양으로 1시간 동안 상온에서 처리하고, 다시 PBS로 3번 세척하여 DAPI가 포함된 mounting medium (H-1200, Vector lab)으로 plate를 준비하였다. 상기 준비된 세포를 Confocal 현미경 (Zeiss, LSM710)으로 세포를 관찰하였다.

상기 항 EGFR 단일항체(anti-EGFR ab)는 EGFR를 인식하는 scFv-Fc 항체로, 상기 참고예 2에 기재된 서열번호 109의 중쇄가변부위와 서열번호 111의 경쇄가변부위를 IgG2 Fc의 N 말단에 융합시켜 제작하였다.

상기 얻어진 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에서 보는 바와 같이, 세포막 상에 c-Met이 과발현된 상태에서 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체를 처리할 처리할 경우(오른쪽), 타겟 세포막 단백질인 EGFR이 세포내로 이동 및 분해됨을 관찰할 수 있다. 반면 c-Met에 대한 단일항체를 처리하는 경우에는 EGFR의 세포 내 이동이 관찰되지 않았다. 또한, EGFR에 대한 단일항체(anti-EGFR ab) 처리에도 아무 변화 없었다. 이는 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체에 의하여 세포막에 위치하는 EGFR이 세포 내로 이동하여 분해됨을 확인시켜주는 결과이다.

한편, 이중특이항체의 효능을 각 항체를 병용 투여하는 경우와 비교하기 위하여, 상기 제조된 항 EGFR 단일항체(anti-EGFR ab), L3-1Y-IgG2(참고예 1), 및 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체 ME-03(실시예 1.1)을　각각 단독 처리 또는 병용 처리의 방법으로 각 웰당 5 ug/ml의 농도가 되도록(병용투여의 경우 각 항체의 농도가 각각 5 ug/ml이 되도록 첨가) 처리하고, 상기 도 5의 결과를 얻은 방법과 동일한 방법으로 실험을 수행하였다.

상기 얻어진 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에서 보여지는 바와 같이, c-Met 항체와 EGFR 항체를 융합 이중 특이 항체 형태가 아닌 단순 복합처방 하는 경우에는 EGFR의 세포내 이동 및 분해가 유발되지 못하는 반면, 항 cMet/항 EGFR 이중 특이 항체(ME-03)를 처리한 경우에는 EGFR의 세포내 이동 및 분해가 유발됨을 확인할 수 있다. 이는 EGFR의 세포내 이동 및 분해가 유발되는 이유는 Driver로 작용하는 c-Met과 항 cMet/EGFR 이중 특이 항체(ME-03)를 이용한 세포막 단백질 제거 시스템이 가동되었기 때문이라고 설명될 수 있다. 반면에 각각의 단일항체를 병용 처리하는 경우에는 EGFR의 세포내 위치에는 아무 변화 없으며, c-Met 단일항체(L3-1Y-IgG2) 처리시에는 c-Met 만 세포 내로 이동/분해됨을 관찰할 수 있다.

MKN45 위암 세포주에서의 다양한 항 c-Met 항체, 항 EGFR 항체, 및 이들의 병용 처리와, 항 c-Met/EGFR 이중 특이 항체 처리시의 세포막 단백질(EGFR 및 c-Met)의 세포 내 위치 변화를 관찰하였다.

구체적으로, 상기 제조된 항 EGFR 단일항체(anti-EGFR ab), L3-1Y-IgG2(참고예 1), Erbitux(#ET509081213, Merck) 및 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체 ME-03S(실시예 1.1)을　각각 단독 처리 또는 병용 처리의 방법으로 각 웰당 5 ug/ml의 농도가 되도록(병용투여의 경우 각 항체의 농도가 각각 5 ug/ml이 되도록 첨가) 처리하고, 상기 도 5의 결과를 얻은 방법과 동일한 방법으로 실험을 수행하였다.

상기 얻어진 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에서 보여지는 바와 같이 EGFR의 세포 내 이동은 EGFR을 인지하는 항암치료제인 Erbitux 및 EGFR을 인지하는 scFv-Fc 항체인 anti-EGFR ab의 처리에 의해서는 유발되지 못하고, 항 cMet/EGFR 이중 특이 항체(ME-03S)를 처리한 경우에만 유발됨을 확인할 수 있다.

항 cMet/EGFR 이중 특이 항체의 EGFR의 세포내 이동 및 분해 활성을 다른 암세포 종류인 EBC-1 폐암 세포주 (JCRB, Japanese Collection of Research Bioresources)를 이용하여 시험하였다

구체적으로, 상기 제조된 항 EGFR 단일항체(anti-EGFR ab), L3-1Y-IgG2(참고예 1), Herceptin(Roche), 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체 ME-03S(실시예 1.1), 및 항 c-Met/항 Her2 이중 특이 항체 MH2-01(실시예 1.2)를 각각 단독 처리 또는 병용 처리의 방법으로 각 웰당 5 ug/ml의 농도가 되도록(병용투여의 경우 각 항체의 농도가 각각 5 ug/ml이 되도록 첨가) 처리하고, 상기 도 5의 결과를 얻은 방법과 동일한 방법으로 실험을 수행하였다.

상기 얻어진 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에서 보여지는 바와 같이, 폐암 세포주에서도 위암 세포주에서와 유사하게 EGFR의 세포 내 이동이 항 cMet/EGFR 이중 특이 항체(ME-03S)를 처리한 경우에만 유발됨을 확인할 수 있다. 또한, MH2-01의 경우, 같은 이중항체이지만 EGFR에 대한 영향은 전혀 없고, 타겟인 HER2만 internalization/degradation됨을 확인할 수 있으며, 이는 항 cMet/EGFR 이중 특이 항체(ME-03S)의 EGFR 특이적인 제거를 입증하는 결과라고 할 수 있다.

또한, 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체가 특이적으로 EGFR의 세포 이동 및 분해를 유도함을 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체 (ME-03) 처리시의 EGFR 총량 및 EGFR 활성 변화를 측정하여 확인하였다. 즉, MKN45 위암 세포주 및 EBC-1 폐암 세포주에 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체 (ME-03) 처리 24시간 후의 EGFR 총량 및 EGFR 활성 변화 (phospho-EGFR로 측정)를 웨스턴 블라팅으로 확인하였다.

구체적으로, MKN45 세포(일본 암연구 세포주 은행, Japanese Cancer Research Bank, JCRB, Tokyo, Japan) 및 EBC-1 세포(JCRB, Japanese Collection of Research Bioresources)를 96 well에 triplicates로 키우고 (5000 ~ 10,000 cell per well), 상기 세포가 들어있는 각 웰에 geftinib(#S1025, Selleckchem) 1uM, erbitux(#ET509081213, Merck) 5 ug/ml, L3-1Y-IgG2(참고예 1) 5 ug/ml, 및 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체 ME-03(실시예 1.1) 5 ug/ml를 각각 처리하고 24시간 배양하였다. EGF는 cell lysate를 만들기 30분 전에 100 ng/ml의 농도로 처리하였다.

상기 얻어진 웨스턴 블라팅 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9에서 보여지는 바와 같이, MKN45 위암 세포주 및 EBC-1 폐암 세포주 모두에서, EGFR 억제제인 Gefitinib 또는 항 EGFR 항체인 Erbitux를 단독 처리하는 경우에는 EGFR 활성은 저해되지만 EGFR 총량에는 변화가 없는 반면, 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체(ME-03)를 처리하는 경우에는 EGFR 활성 저해는 물론이고 EGFR 총량도 현저하게 감소하여 항체 처리 24시간 후에 EGFR이 모두 분해됨을 확인할 수 있다. 　

실시예 4:　c- Met 저발현 세포에서의 항 c- Met /항 EGFR 이중 특이 항체에 의한 EGFR 제거 시험

Driver 역할을 하는 c-Met의 발현이 낮은 세포에서도 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체가 세포막 단백질인 EGFR를 제거할 수 있는지 확인하기 위하여, c-Met 발현 수준이 낮은 A431세포(American Type Culture Collection, ATCC CRL-1555) 에 상기 실시예 1.1에서 제조된 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체(ME-03)를 처리하고 이에 의한 EGFR 제거 여부를 웨스턴 블라팅으로 확인하였다. A431세포는 EGFR 기능 연구에 많이 사용되는 세포로서, Driver 역할을 하는 c-Met의 발현이 있기는 하지만 EGFR의 발현량에 비해 매우 적고 EGFR의 발현량이 월등하게 많은 세포이다.

구체적으로, MKN45 세포 및 EBC-1 세포를 96 well에 triplicates로 키우고 (2 x 10⁵ cells/ml), 여기에 erbitux(#ET509081213, Merck) 5 ug/ml, L3-1Y-IgG2(참고예 1; 도 10에는 L3-1Y로 표시됨) 5 ug/ml, 및 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체 ME-03(실시예 1.1) 5 ug/ml를 단독 또는 병용 처리하고 (병용처리의 경우 각 항체의 처리량을 각각 5 ug/ml로 함), 24시간 배양하였다. EGF는 cell lysate 만들기 30분 전에 100 ng/ml의 농도로 처리하였다. 이후, 항체가 처리된 세포를 용해(lysis)시키고 Human total HGF R/c-MET ELISA KIT (R&D systems, DYC358)와 인산화된 EGFR을 이용하여　총 c-Met　양의 변화 및 EGFR의 인산화 정도를 측정한 후 분석하였다.

상기 얻어진 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10에서 보는 바와 같이, 항 cMet/EGFR 이중 특이 항체(ME-03)는 항 EGFR scFv를 포함하여 EGFR 표적화 기능을 가지므로 EGFR의 인산화 저해 기능은 있지만, EGFR의 총량을 감소시키지 못하는 것으로 확인되었다. 이 결과는 세포막 상에 Driver 역할을 하는 c-Met이 충분한 양으로 존재하지 않는 경우에는 상기 이중 특이 항체가 표적 세포막 단백질의 분해를 유도하지 못한다는 것을 보여주는 것으로, 표적 세포막 단백질의 제거에 필요한 충분한 양의 Driver가 없는 상태에서는 이중 특이 항체 만으로 세포막 단백질의 분해를 유도할 수 없음을 의미한다.

실시예 5:　c- Met 저발현 세포에서의 항 c- Met /항 EGFR 이중 특이 항체에 의한 EGFR 제거 시험　

항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체 처리시에 c-Met 발현량 증가에 따른 EGFR 분해 여부 및 정도를 시험하였다.

HCC827 폐암 세포주에서 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체(ME-03S)를 처리하고 표적 세포막 단백질인 EGFR의 분해 여부를 Western Analysis 방법으로 확인하였으며, 구체적 방법은 상기 실시예 4의 방법을 참조하였다. 상기 세포주로서 wild type의 HCC827 폐암 세포주(HCC827 WT 세포; American Type Culture Collection, ATCC CRL-2868)와 Erlotinib 내성 HCC827 폐암 세포주(HCC827 ER#15 세포; HCC827 WT 폐암 세포주 (American Type Culture Collection, ATCC CRL-2868)를 배양하면서 5 nM 농도로부터 2 uM 농도까지 단계적으로 농도를 높이면서 Erlotinib(#S1023, Selleckchem)을 처리하고, Erlotinib 내성을 가진 세포주들을 선별, 이 가운데 c-Met의 발현량이 증가된 클론들을 선별함)를 사용하였다. 각 항체의 사용량은 도 11에 기재된 바와 같다 (도 11에 기재된 L3-1Y는 L3-1Y-IgG2(참고예 1)를 의미함).

상기 얻어진 결과를 도 11에 나타내었다. 모세포인 HCC827 WT 세포는 EGFR 억제제인 Erlotinib의 기능 연구에 많이 사용되는 세포로, Driver 역할을 하는 c-Met의 발현이 있기는 하지만 EGFR의 발현량에 비해 매우 적고 EGFR의 발현량이 월등하게 많은 세포이다. 도 11에 나타난 바와 같이, HCC827 WT 세포에서, 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체(ME-03S) 처리에 의하여 EGFR의 인산화는 저해되었지만, EGFR의 총량 감소는 관찰되지 않았다.

한편 HCC827 ER#15 세포는 Erlotinib에 대한 내성이 생기면서 c-Met의 발현량과 활성이 증가된 세포주이다. 도 11에 나타난 바와 같이, HCC827 ER#15 세포에서 Driver로 작용하는 c-Met의 발현량이 증가한 결과로, 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체(ME-03S) 처리에 의하여 EGFR 인산화가 저해됨은 물론이고 EGFR의 총량이 감소되었다. 위 결과는 세포막 상에 존재하는 Driver (c-Met)의 양에 따라서 이중 특이항체에 의한 표적 세포막 단백질의 분해 정도가 영향을 받음을 보여준다.

실시예 6:　c- Met 과/ Her2 이중 특이 항체에 의한 HER2 특이적 분해

세포막 단백질 제거 시스템의 표적 특이적 세포막 단백질 제거 활성을 새로운 표적 세포막 단백질인 HER2를 대상으로 MKN45 위암 세포주에서 시험하였다. 이를 위하여 세포막 단백질 제거 시스템으로 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체(ME-02; 실시예 1.1) 및 항 c-Met과/Her2 이중 특이 항체(MH2-01S; 실시예 1.2)를 사용하였다.

MKN45 위암 세포주에 상기 제작된 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체 MH2-01S와 항 c-Met과/Her2 이중 특이 항체 ME-03를 각각 처리한 후 HER2 수준을 웨스턴 블라팅으로 측정하였다.

구체적으로, MKN45 세포 및 EBC-1 세포를 96 well에 triplicates로 키우고 (2 x 10⁵ cells/ml), 여기에 erbitux(#ET509081213, Merck), Herceptin(Roche), L3-1Y-IgG2(참고예 1), 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체 ME-03(실시예 1.1), 및 항 c-Met/항 Her2 이중 특이 항체 MH2-01(실시예 1.2)를 각각 5 ug/ml의 농도로 각각 처리하고 24시간 배양하였다. EGF는 cell lysate 만들기 30분 전에 100 ng/ml의 농도로 처리하였다. 이후, 항체가 처리된 세포를 용해(lysis)시키고 Human total HGF R/c-MET ELISA KIT (R&D systems, DYC358)와 인산화된 EGFR을 이용하여　총 c-Met　양의 변화 및 EGFR의 인산화 정도를 측정한 후 분석하였다.

상기 얻어진 결과를 도 12에 나타내었다.　도 12에서 보는 바와 같이, 세포막 상에 Driver 역할을 하는 c-Met이 과발현된 MKN45 위암 세포주에 항 cMet/HER2 이중 특이 항체 (MH2-01S)를 처리한 경우에는 표적 세포막 단백질인 HER2가 세포내로 이동 및 분해됨이 관찰된 반면, 항 cMet/EGFR 이중 특이 항체 ME-03를 처리한 경우에는 HER2 수준에 변화가 없음을 확인할 수 있다. 도 8에서 MH2-01S가 EGFR에 아무런 영향을 미치지 않음이 확인되었으므로, MH2-01S는 HER2만을 특이적으로 세포내로 이동 및 분해시키는 것을 확인할 수 있다. 이는 본 발명의 세포막 단백질 제거 시스템(이중 특이 항체)의 종류에 따라 특정한 표적 세포막 단백질만을 특이적으로 제거할 수 있음을 의미한다.

실시예 7:　 c- Met overexpression 후 항 c- Met /항 EGFR 이중 특이 항체에 의한 EGFR 분해 유도 확인

세포막 단백질 제거 시스템의 기술적인 응용성을 증명하기 위하여, A549 폐암세포에서 c-Met을 인위적으로 과발현시킨 후(pleniMet transfected cell)에 세포막 단백질 제거 시스템(항 cMet/EGFR 이중 특이 항체 ME-03S)을 가동시켜 EGFR의 분해 여부를 형광현미경으로 관찰하였다.

구체적으로, A549 세포주(American Type Culture Collection, ATCC CRL-185)를 2X10⁴ cell/well의 양으로 준비하고, Fugene6 transfection reagent(Invitrogen Lipofectamine^TM 2000)와 plentic-Met vector(SMC, Samsung Medical Center)의 혼합물(Invitrogen 제품 매뉴얼에 따라 Opti-MEM 용액에서 0.1-3.0 ug/ul DNA를 사용하여 transfection 진행)을 cell seeding과 동시에 첨가하여 역전사(reverse transcription) 방법으로 트랜스펙션(transfection)을 수행하였다. 24시간 배양 후에 여기에 L3-1Y-IgG2(참고예 1), anti-EGFR ab (실시예 3), 및 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체 ME03S(실시예 1.1)를　각각 단독 처리 또는 병용 처리의 방법으로 각 웰당 1 ug/ml의 농도가 되도록 첨가하여 4시간 동안 37℃에서 처리하였다. 병용투여의 경우 각 항체를 각각 1 ug/ml의 농도로 첨가하였다. 여기에 4%(v/v) formaldehyde를 15분 동안 처리하여 세포를　　　플레이트에 고정시키고,　PBS로 3번 세척하였다. 그 후, 블라킹 버퍼(0.5% triton x-100 and 5% donkey serum)를 상온에서 1시간 동안 처리한 후, c-Met (37-0100, Invitrogen) 및 EGFR (#5616, Cell signaling)에 대한 1차 항체를 1:100으로 희석하여 100 ul의 양으로 15시간 동안 4℃에서 처리하였다. PBS로 3번 세척한 후, 2차 항체 (A21433, Invitrogen) 를 1:1000으로 희석하여 100 ul 의 양으로 1시간 동안 상온에서 처리하고, 다시 PBS로 3번 세척하여 DAPI가 포함된 mounting medium (H-1200, Vector lab)으로 plate를 준비하였다. 상기 준비된 세포를 Confocal 현미경 (Zeiss, LSM710)으로 세포를 관찰하였다.

상기 얻어진 결과를 도 13에 나타내었다. 도 13의 마지막 사진은 ME03S 처리된 세포의 결과에서 red 이미지가 너무 강해서 green signal의 패턴이 잘 보이지 않기 때문에, green image를 통하여 EGFR의 세포내 이동을 보다 명확하게 보이기 위하여 green image만 따로 분리하여 나타낸 것이다. 도 13에서 보는 바와 같이 세포막 상에 Driver (c-Met)가 인위적으로 과발현된 세포에 항 cMet/EGFR 이중 특이 항체 ME-03S를 처리하는 경우 표적 세포막 단백질인 EGFR이 세포내로 이동 및 분해됨이 관찰되었다.　이는 세포막 단백질 제거 시스템이 Trigger의 종류에 따라 종류에 따라 특정한 타겟 세포막 단백질만을 특이적으로 제거할 수 있음을 의미한다.

　또한, 상기 도 13의 결과를 얻은 시험과정을 참조하여, HeLa 세포(CCL-2, ATCC)에서 c-Met을 인위적으로 과발현시킨 후(plenti::c-Met transfected cell)에 세포막 단백질 제거 시스템[항 cMet/EGFR 이중 특이 항체 ME-03S(실시예 1.1) 또는 항 cMet/HER2 이중 특이 항체 MH2-01(실시예 1.2)]을 가동시켜 EGFR의 분해 여부를 형광현미경으로 관찰하였다.

상기 얻어진 결과를 도 14에 나타내었다. 도 14 중의 Low exposure와 high exposure는 signal의 강도를 다르게 하여 나타낸 결과로, low exposure는 현미경 이미지를 찍을 때 gain 값을 낮추어서 찍은 결과를 보여주는 것이고, high exposure는 gain 값을 높여서 형광이 약한 세포의 c-Met signal (red)까지 가시화되도록 한 것이다. 도 14에서 보여지는 바와 같이, 세포막 상에 Driver (c-Met)이 인위적으로 과발현된 세포에 표적 세포막 단백질인 EGFR에 대한 Trigger인 항 cMet/EGFR 이중 특이 항체 (ME03S)를 처리하는 경우 EGFR이 세포내로 이동 및 분해됨이 관찰되었다. 반면 표적이 아닌 세포막 단백질 HER2에 대한 Trigger인 cMet/HER2 이중항체 MH2-01를 처리하는 경우에는 EGFR에 아무 영향이 없음이 관찰되었다. 　이는 본 발명의 세포막 단백질 제거 시스템이 Trigger의 종류에 따라 특정한 표적 세포막 단백질만을 특이적으로 제거할 수 있음을 의미한다.

한국세포주연구재단

KCLRFBP00220

20091006

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Ltd <120> Composition for Target-Specific Membrane Protein Depletion <130> DPP20142867KR <150> KR 10-2013-0061282 <151> 2013-05-29 <160> 137 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR1 of AbF46 <400> 1 Asp Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR2 of AbF46 <400> 2 Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR3 of AbF46 <400> 3 Asp Asn Trp Phe Ala Tyr 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR1 of c-Met antibody <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> X is Pro or Ser or absent <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> X is Glu or Asp <400> 4 Xaa Xaa Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR2 of c-Met antibody <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> X is Asn or Lys 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cacctacagc 540 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 600 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 660 tgactcgag 669 <210> 53 <211> 669 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of H4-light <400> 53 gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc 60 atcacctgca agtccagtca gagtctttta gctagtggca accaaaataa ctacttggcc 120 tggcaccaac agaaaccagg aaaagctccg aaaatgctga ttatttgggc atccactagg 180 gtatctggag tcccttctcg cttctctgga tccgggtctg ggacggattt cactctgacc 240 atcagcagtc tgcagccgga agacttcgca acttattact gtcagcagtc ctacagcgct 300 ccgctcacgt tcggacaggg taccaaggtg gagatcaaac gtacggtggc tgcaccatct 360 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 420 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 480 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 540 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 600 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 660 tgactcgag 669 <210> 54 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker between VH and VL <400> 54 Gly Leu Gly Gly Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Ser Ser Gly Val Gly Ser 20 <210> 55 <211> 1088 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding scFv of huAbF46 antibody <400> 55 gctagcgttt tagcagaagt tcaattggtt gaatctggtg gtggtttggt tcaaccaggt 60 ggttctttga gattgtcttg tgctgcttct ggttttactt tcaccgatta ttacatgtcc 120 tgggttagac aagctccagg taaaggtttg gaatggttgg gtttcattag aaacaaggct 180 aacggttaca ctaccgaata ttctgcttct gttaagggta gattcaccat ttctagagac 240 aactctaaga acaccttgta cttgcaaatg aactccttga gagctgaaga tactgctgtt 300 tattactgcg ctagagataa ttggtttgct tattggggtc aaggtacttt ggttactgtt 360 tcttctggcc tcgggggcct cggaggagga ggtagtggcg gaggaggctc cggtggatcc 420 agcggtgtgg gttccgatat tcaaatgacc caatctccat cttctttgtc tgcttcagtt 480 ggtgatagag ttaccattac ttgtaagtcc tcccaatctt 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aaccagaaga tttcgctact tactactgtc aacaatctta ctctgctcca ttgacttttg 1320 gtcaaggtac aaaggtcgaa atcaagagag aattcggtaa gcctatccct aaccctctcc 1380 tcggtctcga ttctacgggt ggtggtggat ctggtggtgg tggttctggt ggtggtggtt 1440 ctcaggaact gacaactata tgcgagcaaa tcccctcacc aactttagaa tcgacgccgt 1500 actctttgtc aacgactact attttggcca acgggaaggc aatgcaagga gtttttgaat 1560 attacaaatc agtaacgttt gtcagtaatt gcggttctca cccctcaaca actagcaaag 1620 gcagccccat aaacacacag tatgtttttt gagtttaaac ccgctgatct gataacaaca 1680 gtgtagatgt aacaaaatcg actttgttcc cactgtactt ttagctcgta caaaatacaa 1740 tatacttttc atttctccgt aaacaacatg ttttcccatg taatatcctt ttctattttt 1800 cgttccgtta ccaactttac acatacttta tatagctatt cacttctata cactaaaaaa 1860 ctaagacaat tttaattttg ctgcctgcca tatttcaatt tgttataaat tcctataatt 1920 tatcctatta gtagctaaaa aaagatgaat gtgaatcgaa tcctaagaga attgggcaag 1980 tgcacaaaca atacttaaat aaatactact cagtaataac ctatttctta gcatttttga 2040 cgaaatttgc tattttgtta gagtctttta caccatttgt ctccacacct ccgcttacat 2100 caacaccaat aacgccattt aatctaagcg catcaccaac attttctggc gtcagtccac 2160 cagctaacat aaaatgtaag ctctcggggc tctcttgcct tccaacccag tcagaaatcg 2220 agttccaatc caaaagttca cctgtcccac ctgcttctga atcaaacaag ggaataaacg 2280 aatgaggttt ctgtgaagct gcactgagta gtatgttgca gtcttttgga aatacgagtc 2340 ttttaataac tggcaaaccg aggaactctt ggtattcttg ccacgactca tctccgtgca 2400 gttggacgat atcaatgccg taatcattga ccagagccaa aacatcctcc ttaggttgat 2460 tacgaaacac gccaaccaag tatttcggag tgcctgaact atttttatat gcttttacaa 2520 gacttgaaat tttccttgca ataaccgggt caattgttct ctttctattg ggcacacata 2580 taatacccag caagtcagca tcggaatcta gagcacattc tgcggcctct gtgctctgca 2640 agccgcaaac tttcaccaat ggaccagaac tacctgtgaa attaataaca gacatactcc 2700 aagctgcctt tgtgtgctta atcacgtata ctcacgtgct caatagtcac caatgccctc 2760 cctcttggcc ctctcctttt cttttttcga ccgaatttct tgaagacgaa agggcctcgt 2820 gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttagg acggatcgct 2880 tgcctgtaac ttacacgcgc ctcgtatctt ttaatgatgg aataatttgg gaatttactc 2940 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U6-HC7 hinge and constant region of human IgG1 <400> 62 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly Ile Gln 1 5 10 15 Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 20 25 30 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp 35 40 45 Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 50 55 60 Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser 65 70 75 80 Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 130 135 140 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 145 150 155 160 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 165 170 175 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 180 185 190 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 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gcagcagggg 1320 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380 ctctccctgt ctccgggtaa atgactcgag 1410 <210> 64 <211> 461 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide consisting of heavy chain of huAbF46-H4-A1, human IgG2 hinge and constant region of human IgG1 <400> 64 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly Ile Gln 1 5 10 15 Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 20 25 30 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp 35 40 45 Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 50 55 60 Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser 65 70 75 80 Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 130 135 140 Leu Ala Pro Ser Ser 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acaacagagt acagtgcatc tgtgaagggt cgtttcacta taagcagaga taattccaaa 300 aacacactgt acctgcagat gaacagcctg cgtgctgagg acactgccgt ctattattgt 360 gctagagata actggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcaccgt ctcctcggct 420 agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 480 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagaggaag 720 tgctgtgtgg agtgcccccc ctgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 780 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 840 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 900 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 960 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1020 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1080 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 1140 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1260 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1320 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1380 tccctgtctc cgggtaaatg actcgag 1407 <210> 66 <211> 460 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide consisting of heavy chain of huAbF46-H4-A1, human IgG2 hinge and constant region of human IgG2 <400> 66 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly Ile Gln 1 5 10 15 Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 20 25 30 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp 35 40 45 Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 50 55 60 Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser 65 70 75 80 Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 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ggacggcgtg 900 gaggtgcata atgccaagac aaagccacgg gaggagcagt tcaacagcac gttccgtgtg 960 gtcagcgtcc tcaccgttgt gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 1020 gtctccaaca aaggcctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaagggcag 1080 ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg aggagatgac caagaaccag 1140 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1200 agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccatgctgga ctccgacggc 1260 tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1320 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1380 ctgtctccgg gtaaatgact cgag 1404 <210> 68 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide consisting of light chain of huAbF46-H4-A1(H36Y) and human kappa constant region <400> 68 Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Met Leu Leu Leu Leu Ser Val Ser 1 5 10 15 Gly Thr Cys Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 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tggcaaggag 1020 tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1080 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 1140 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1200 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1260 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1380 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga ctcgag 1416 <210> 77 <211> 759 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of light chain of anti-c-Met antibody (AbF46 or huAbF46-H1) <220> <221> misc_difference <222> (1)..(6) <223> EcoRI restriction site <220> <221> misc_difference <222> (7)..(90) <223> signal sequence <220> <221> misc_difference <222> (91)..(432) <223> VL - light chain variable region <220> <221> misc_difference <222> (430)..(435) <223> BsiWI restriction site <220> <221> misc_difference <222> (433)..(750) <223> CL - light chain constant region <220> <221> misc_difference <222> (751)..(753) <223> stop codon <220> <221> misc_difference <222> (754)..(759) <223> XhoI restriction site <400> 77 gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60 ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gacattttga tgacccagtc tccatcctcc 120 ctgactgtgt cagcaggaga gaaggtcact atgagctgca agtccagtca gagtctttta 180 gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccagc agaaaccagg acgatctcct 240 aaaatgctga taatttgggc atccactagg gtatctggag tccctgatcg cttcataggc 300 agtggatctg ggacggattt cactctgacc atcaacagtg tgcaggctga agatctggct 360 gtttattact gtcagcagtc ctacagcgct ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg 420 gagctgaaac gtacggtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag 480 ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc 540 aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca 600 gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca 660 gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc 720 gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt tgactcgag 759 <210> 78 <211> 4170 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding c-Met protein <400> 78 atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag 60 aggagcaatg gggagtgtaa agaggcacta gcaaagtccg agatgaatgt gaatatgaag 120 tatcagcttc ccaacttcac cgcggaaaca cccatccaga atgtcattct acatgagcat 180 cacattttcc ttggtgccac taactacatt tatgttttaa atgaggaaga ccttcagaag 240 gttgctgagt acaagactgg gcctgtgctg gaacacccag attgtttccc atgtcaggac 300 tgcagcagca aagccaattt atcaggaggt gtttggaaag ataacatcaa catggctcta 360 gttgtcgaca cctactatga tgatcaactc attagctgtg gcagcgtcaa cagagggacc 420 tgccagcgac atgtctttcc ccacaatcat actgctgaca tacagtcgga ggttcactgc 480 atattctccc cacagataga agagcccagc cagtgtcctg actgtgtggt gagcgccctg 540 ggagccaaag tcctttcatc tgtaaaggac cggttcatca acttctttgt aggcaatacc 600 ataaattctt cttatttccc agatcatcca ttgcattcga tatcagtgag aaggctaaag 660 gaaacgaaag atggttttat gtttttgacg gaccagtcct acattgatgt tttacctgag 720 ttcagagatt cttaccccat taagtatgtc catgcctttg aaagcaacaa ttttatttac 780 ttcttgacgg tccaaaggga aactctagat gctcagactt ttcacacaag aataatcagg 840 ttctgttcca taaactctgg attgcattcc tacatggaaa tgcctctgga gtgtattctc 900 acagaaaaga gaaaaaagag atccacaaag aaggaagtgt ttaatatact tcaggctgcg 960 tatgtcagca agcctggggc ccagcttgct agacaaatag gagccagcct gaatgatgac 1020 attcttttcg gggtgttcgc acaaagcaag ccagattctg ccgaaccaat ggatcgatct 1080 gccatgtgtg cattccctat caaatatgtc aacgacttct tcaacaagat cgtcaacaaa 1140 aacaatgtga gatgtctcca gcatttttac ggacccaatc atgagcactg ctttaatagg 1200 acacttctga gaaattcatc aggctgtgaa gcgcgccgtg atgaatatcg aacagagttt 1260 accacagctt tgcagcgcgt tgacttattc atgggtcaat tcagcgaagt cctcttaaca 1320 tctatatcca ccttcattaa aggagacctc accatagcta atcttgggac atcagagggt 1380 cgcttcatgc aggttgtggt ttctcgatca ggaccatcaa cccctcatgt gaattttctc 1440 ctggactccc atccagtgtc tccagaagtg attgtggagc atacattaaa ccaaaatggc 1500 tacacactgg ttatcactgg gaagaagatc acgaagatcc cattgaatgg cttgggctgc 1560 agacatttcc agtcctgcag tcaatgcctc tctgccccac cctttgttca gtgtggctgg 1620 tgccacgaca aatgtgtgcg atcggaggaa tgcctgagcg ggacatggac tcaacagatc 1680 tgtctgcctg caatctacaa ggttttccca aatagtgcac cccttgaagg agggacaagg 1740 ctgaccatat gtggctggga ctttggattt cggaggaata ataaatttga tttaaagaaa 1800 actagagttc tccttggaaa tgagagctgc accttgactt taagtgagag cacgatgaat 1860 acattgaaat gcacagttgg tcctgccatg aataagcatt tcaatatgtc cataattatt 1920 tcaaatggcc acgggacaac acaatacagt acattctcct atgtggatcc tgtaataaca 1980 agtatttcgc cgaaatacgg tcctatggct ggtggcactt tacttacttt aactggaaat 2040 tacctaaaca gtgggaattc tagacacatt tcaattggtg gaaaaacatg tactttaaaa 2100 agtgtgtcaa acagtattct tgaatgttat accccagccc aaaccatttc aactgagttt 2160 gctgttaaat tgaaaattga cttagccaac cgagagacaa gcatcttcag ttaccgtgaa 2220 gatcccattg tctatgaaat tcatccaacc aaatctttta ttagtggtgg gagcacaata 2280 acaggtgttg ggaaaaacct gaattcagtt agtgtcccga gaatggtcat aaatgtgcat 2340 gaagcaggaa ggaactttac agtggcatgt caacatcgct ctaattcaga gataatctgt 2400 tgtaccactc cttccctgca acagctgaat ctgcaactcc ccctgaaaac caaagccttt 2460 ttcatgttag atgggatcct ttccaaatac tttgatctca tttatgtaca taatcctgtg 2520 tttaagcctt ttgaaaagcc agtgatgatc tcaatgggca atgaaaatgt actggaaatt 2580 aagggaaatg atattgaccc tgaagcagtt aaaggtgaag tgttaaaagt tggaaataag 2640 agctgtgaga atatacactt acattctgaa gccgttttat gcacggtccc caatgacctg 2700 ctgaaattga acagcgagct aaatatagag tggaagcaag caatttcttc aaccgtcctt 2760 ggaaaagtaa tagttcaacc agatcagaat ttcacaggat tgattgctgg tgttgtctca 2820 atatcaacag cactgttatt actacttggg tttttcctgt ggctgaaaaa gagaaagcaa 2880 attaaagatc tgggcagtga attagttcgc tacgatgcaa gagtacacac tcctcatttg 2940 gataggcttg taagtgcccg aagtgtaagc ccaactacag aaatggtttc aaatgaatct 3000 gtagactacc gagctacttt tccagaagat cagtttccta attcatctca gaacggttca 3060 tgccgacaag tgcagtatcc tctgacagac atgtccccca tcctaactag tggggactct 3120 gatatatcca gtccattact gcaaaatact gtccacattg acctcagtgc tctaaatcca 3180 gagctggtcc aggcagtgca gcatgtagtg attgggccca gtagcctgat tgtgcatttc 3240 aatgaagtca taggaagagg gcattttggt tgtgtatatc atgggacttt gttggacaat 3300 gatggcaaga aaattcactg tgctgtgaaa tccttgaaca gaatcactga cataggagaa 3360 gtttcccaat ttctgaccga gggaatcatc atgaaagatt ttagtcatcc caatgtcctc 3420 tcgctcctgg gaatctgcct gcgaagtgaa gggtctccgc tggtggtcct accatacatg 3480 aaacatggag atcttcgaaa tttcattcga aatgagactc ataatccaac tgtaaaagat 3540 cttattggct ttggtcttca agtagccaaa ggcatgaaat atcttgcaag caaaaagttt 3600 gtccacagag acttggctgc aagaaactgt atgctggatg aaaaattcac agtcaaggtt 3660 gctgattttg gtcttgccag agacatgtat gataaagaat actatagtgt acacaacaaa 3720 acaggtgcaa agctgccagt gaagtggatg gctttggaaa gtctgcaaac tcaaaagttt 3780 accaccaagt cagatgtgtg gtcctttggc gtgctcctct gggagctgat gacaagagga 3840 gccccacctt atcctgacgt aaacaccttt gatataactg tttacttgtt gcaagggaga 3900 agactcctac aacccgaata ctgcccagac cccttatatg aagtaatgct aaaatgctgg 3960 caccctaaag ccgaaatgcg cccatccttt tctgaactgg tgtcccggat atcagcgatc 4020 ttctctactt tcattgggga gcactatgtc catgtgaacg ctacttatgt gaacgtaaaa 4080 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gaaactctag atgctcagac ttttcacaca 660 agaataatca ggttctgttc cataaactct ggattgcatt cctacatgga aatgcctctg 720 gagtgtattc tcacagaaaa gagaaaaaag agatccacaa agaaggaagt gtttaatata 780 cttcaggctg cgtatgtcag caagcctggg gcccagcttg ctagacaaat aggagccagc 840 ctgaatgatg acattctttt cggggtgttc gcacaaagca agccagattc tgccgaacca 900 atggatcgat ctgccatgtg tgcattccct atcaaatatg tcaacgactt cttcaacaag 960 atcgtcaaca aaaacaatgt gagatgtctc cagcattttt acggacccaa tcatgagcac 1020 tgctttaata ggacacttct gagaaattca tcaggctgtg aagcgcgccg tgatgaatat 1080 cgaacagagt ttaccacagc tttgcagcgc gttgacttat tcatgggtca attcagcgaa 1140 gtcctcttaa catctatatc caccttcatt aaaggagacc tcaccatagc taatcttggg 1200 acatcagagg gtcgcttcat gcaggttgtg gtttctcgat caggaccatc aacccctcat 1260 gtgaattttc tcctggactc ccatccagtg tctccagaag tgattgtgga gcatacatta 1320 aaccaaaatg gc 1332 <210> 83 <211> 1299 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding PSI-IPT domain of c-Met <400> 83 tacacactgg ttatcactgg gaagaagatc acgaagatcc 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900 tgtaccactc cttccctgca acagctgaat ctgcaactcc ccctgaaaac caaagccttt 960 ttcatgttag atgggatcct ttccaaatac tttgatctca tttatgtaca taatcctgtg 1020 tttaagcctt ttgaaaagcc agtgatgatc tcaatgggca atgaaaatgt actggaaatt 1080 aagggaaatg atattgaccc tgaagcagtt aaaggtgaag tgttaaaagt tggaaataag 1140 agctgtgaga atatacactt acattctgaa gccgttttat gcacggtccc caatgacctg 1200 ctgaaattga acagcgagct aaatatagag tggaagcaag caatttcttc aaccgtcctt 1260 ggaaaagtaa tagttcaacc agatcagaat ttcacagga 1299 <210> 84 <211> 939 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding TyrKc domain of c-Met <400> 84 gtgcatttca atgaagtcat aggaagaggg cattttggtt gtgtatatca tgggactttg 60 ttggacaatg atggcaagaa aattcactgt gctgtgaaat ccttgaacag aatcactgac 120 ataggagaag tttcccaatt tctgaccgag ggaatcatca tgaaagattt tagtcatccc 180 aatgtcctct cgctcctggg aatctgcctg cgaagtgaag ggtctccgct ggtggtccta 240 ccatacatga aacatggaga tcttcgaaat ttcattcgaa atgagactca taatccaact 300 gtaaaagatc ttattggctt tggtcttcaa gtagccaaag gcatgaaata tcttgcaagc 360 aaaaagtttg tccacagaga cttggctgca agaaactgta tgctggatga aaaattcaca 420 gtcaaggttg ctgattttgg tcttgccaga gacatgtatg ataaagaata ctatagtgta 480 cacaacaaaa caggtgcaaa gctgccagtg aagtggatgg ctttggaaag tctgcaaact 540 caaaagttta ccaccaagtc agatgtgtgg tcctttggcg tgctcctctg ggagctgatg 600 acaagaggag ccccacctta tcctgacgta aacacctttg atataactgt ttacttgttg 660 caagggagaa gactcctaca acccgaatac tgcccagacc ccttatatga agtaatgcta 720 aaatgctggc accctaaagc cgaaatgcgc ccatcctttt ctgaactggt gtcccggata 780 tcagcgatct tctctacttt cattggggag cactatgtcc atgtgaacgc tacttatgtg 840 aacgtaaaat gtgtcgctcc gtatccttct ctgttgtcat cagaagataa cgctgatgat 900 gaggtggaca cacgaccagc ctccttctgg gagacatca 939 <210> 85 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR3 of anti-c-Met antibody <400> 85 Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 1 5 10 <210> 86 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR3 of anti-c-Met antibody <400> 86 Leu Thr 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of light chain of antibody L3-11Y <400> 108 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Trp 20 25 30 Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Arg Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 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cacattcact gactacaaga tacactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggctcgagtg gatgggatat ttcaacccta acagcggtta tagtacctac 180 gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagactatcc 300 ccaggcggtt actatgttat ggatgcctgg ggccaaggga ccaccgtgac cgtctcctca 360 360 <210> 111 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light-chain variable region of anti-EGFR antibody <400> 111 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Phe Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 <210> 112 <211> 324 <212> DNA <213> 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ggggacggct tctatgctat ggactactgg ggtcaaggaa ccctggtcac cgtctcctcg 360 360 <210> 117 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region of anti-Her2 antibody <400> 117 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 118 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA encoding light chain variable region of anti-Her2 antibody <400> 118 gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc 60 atcacctgcc gtgccagtca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca acagaaacca 120 ggaaaagctc cgaaactact gatttactcg gcatccttcc tctactctgg agtcccttct 180 cgcttctctg gttccagatc tgggacggat ttcactctga ccatcagcag tctgcagccg 240 gaagacttcg caacttatta ctgtcagcaa cattatacta ctcctcccac gttcggacag 300 ggtaccaagg tggagatcaa acga 324 <210> 119 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized peptide sequence for epitope mapping <400> 119 Phe Ala Pro Gln Ile Glu Glu Pro Ser Gln Cys Pro Asp Cys Val Val 1 5 10 15 Ser Ala Leu Gly Ala Lys Val Leu 20 <210> 120 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized peptide sequence for epitope mapping <400> 120 Cys Ser Pro Gln Ile Glu Glu Pro Ser Gln Cys 1 5 10 <210> 121 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized peptide sequence for epitope mapping <400> 121 Cys Pro Gln Ile Glu Glu Pro Ser Gln Ala Cys 1 5 10 <210> 122 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized peptide sequence for epitope mapping <400> 122 Cys Gln Ile Glu Glu Pro Ser Gln Ala Pro Cys 1 5 10 <210> 123 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized peptide sequence for epitope mapping <400> 123 Cys Ile Glu Glu Pro Ser Gln Ala Pro Asp Cys 1 5 10 <210> 124 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized peptide sequence for epitope mapping <400> 124 Cys Glu Glu Pro Ser Gln Ala Pro Asp Ala Cys 1 5 10 <210> 125 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> core peptide sequence for epitope mapping <400> 125 Glu Asp Pro Ser Gln 1 5 <210> 126 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized peptide sequence for epitope mapping <400> 126 Phe Ser Pro Gln Ile Glu Asp Pro Ser Gln Cys Pro Asp Cys Val Val 1 5 10 15 Ser Ala Leu Gly Ala Lys Val Leu 20 <210> 127 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized peptide sequence for epitope mapping <400> 127 Cys Ser Pro Gln Ile Glu Asp Pro Ser Gln Cys 1 5 10 <210> 128 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized peptide sequence for epitope mapping <400> 128 Cys Pro Gln Ile Glu Asp Pro Ser Gln Ala Cys 1 5 10 <210> 129 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized peptide sequence for epitope mapping <400> 129 Cys Gln Ile Glu Asp Pro Ser Gln Ala Pro Cys 1 5 10 <210> 130 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized peptide sequence for epitope mapping <400> 130 Cys Ile Glu Asp Pro Ser Gln Ala Pro Asp Cys 1 5 10 <210> 131 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized peptide sequence for epitope mapping <400> 131 Cys Glu Asp Pro Ser Gln Ala Pro Asp Ala Cys 1 5 10 <210> 132 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope variant <400> 132 Ala Ala Ala Ala Ala 1 5 <210> 133 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope variant <400> 133 Ala Glu Pro Ser Gln 1 5 <210> 134 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope variant <400> 134 Glu Ala Pro Ser Gln 1 5 <210> 135 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope variant <400> 135 Glu Glu Ala Ser Gln 1 5 <210> 136 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope variant <400> 136 Glu Glu Pro Ala Gln 1 5 <210> 137 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope variant <400> 137 Glu Glu Pro Ser Ala 1 5

Claims

드라이버 세포막 단백질에 결합하는 제1 결합 도메인, 및 표적 세포막 단백질에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중 결합 분자를 포함하고,
상기 드라이버 세포막 단백질은 상기 표적 세포막 단백질과 동일한 세포의 세포막에 위치하는 c-Met 단백질이고, 상기 제1 결합 도메인이 결합하면 세포 내로 이동하여 분해되는 것이고,
상기 제1 결합 도메인은 서열번호 71의 아미노산 서열 내의 서열번호 73의 아미노산 서열(EEPSQ)을 포함하는 연속하는 5 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 에피토프에 특이적으로 결합하는 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편이며,
상기 제2 결합 도메인은 상피세포 성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor; EGFR), 혈관내피 성장인자 수용체(vascular endothelial growth factor receptor; VEGFR), HER2 단백질(Human Epidermal growth factor Receptor 2 protein), HER3 단백질(Human Epidermal growth factor Receptor 3 protein), 혈소판유래 성장인자 수용체 (platelet-derived growth factor receptors; PDGFR), 인슐린-유사 성장인자 1 수용체 (Insulin-like Growth Factor 1 Receptor; IGF1R), CD9, CD81, CD 151, CD63, CD37, CD53, NET1, NET2, NET4, NET5, NET6, TM4SF6, Tspan2, Tspan3, TM4B, CD22, CD 79b, CD22, GPNMB, CD19, CD56, CD138, PSMA, EGFR, CD74, TACSTD2, CEA, 엽산 수용체 1 (Folate receptor 1), CD37, Mucin16, ETB, STEAP1, CD70, SLC44A4, Nectin4, AGS-16, 구아닐 시클라제 C (Guanylyl cyclase C), Mucin1, EGFRvIII, 및 메소텔린 (Mesothelin)으로 이루어진 군에서 선택된 표적 세포막 단백질에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고,
상기 이중 결합 분자는 c-Met 단백질 및 상기 표적 세포막 단백질에 대한 이중 특이 항체인,
표적 세포막 단백질 제거용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 표적 세포막 단백질은 상피세포 성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor; EGFR), 혈관내피 성장인자 수용체(vascular endothelial growth factor receptor; VEGFR), HER2 단백질(Human Epidermal growth factor Receptor 2 protein), HER3 단백질(Human Epidermal growth factor Receptor 3 protein), 혈소판유래 성장인자 수용체 (platelet-derived growth factor receptors; PDGFR), 및 인슐린-유사 성장인자 1 수용체 (Insulin-like Growth Factor 1 Receptor; IGF1R)로 이루어진 군에서 선택된 것인, 표적 세포막 단백질 제거용 조성물.
제2항에 있어서, 상기 표적 세포막 단백질은 상피세포 성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor; EGFR), 또는 HER2 단백질(Human Epidermal growth factor Receptor 2 protein)인,
표적 세포막 단백질 제거용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 EGFR에 대한 항체는 시툭시맙(Cetuximab), 패니투무맙(Panitumumab), 마투주맙(Matuzumab), 네시투무맙(Necitumumab), 니모투주맙(Nimotuzumab), 잘루투무맙(Zalutumumab), MM-151, 또는 서열번호 109 또는 서열번호 111의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄가변부위와 서열번호 110 또는 서열번호 112로의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄가변부위를 포함하는 항체이고,
상기 HER2 단백질에 대한 항체는 트라스투주맙(Trastuzumab) 또는 퍼투주맙(Pertuzumab)이고,
상기 HER3 단백질에 대한 항체는 RG-7597이고,
상기 VEGFR에 대한 항체는 라무시루맙(Ramucirumab)이고,
상기 PDGFR에 대한 항체는 올라라투맙 (Olaratumab)이고,
상기 IGF1R에 대한 항체는 식수투무맙(Cixutumumab)인,
표적 세포막 단백질 제거용 조성물.
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제1항에 있어서, 상기 항 c-Met 항체는,
서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, 서열번호 5의 아미노산 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열, 또는 서열번호 2의 아미노산 서열 내의 2번째부터 10번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 8 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열, 서열번호 85의 아미노산 서열, 또는 서열번호 85의 아미노산 서열 내의 1번째부터 6번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 6 내지 13개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 86의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2, 및 서열번호 9의 아미노산 서열, 서열번호 86의 아미노산 서열, 또는 서열번호 89의 아미노산 서열 내의 1번째부터 9번째까지의 아미노산을 포함하는 9 내지 17개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고,
상기 서열번호 4 내지 서열번호 9는 각각 하기 일반식 Ⅰ 내지 일반식 Ⅵ으로 표시되는 아미노산 서열인 항체인, 표적 세포막 단백질 제거용 조성물:
일반식 Ⅰ
Xaa₁-Xaa₂-Tyr-Tyr-Met-Ser (서열번호 4),
일반식 Ⅱ
Arg-Asn-Xaa₃-Xaa₄-Asn-Gly-Xaa₅-Thr (서열번호 5),
일반식 Ⅲ
Asp-Asn-Trp-Leu-Xaa₆-Tyr (서열번호 6),
일반식 Ⅳ
Lys-Ser-Ser-Xaa₇-Ser-Leu-Leu-Ala-Xaa₈-Gly-Asn-Xaa₉-Xaa₁₀-Asn-Tyr-Leu-Ala (서열번호 7)
일반식 Ⅴ
Trp-Xaa₁₁-Ser-Xaa₁₂-Arg-Val-Xaa₁₃(서열번호 8)
일반식 Ⅵ
Xaa₁₄-Gln-Ser-Tyr-Ser-Xaa₁₅-Pro-Xaa₁₆-Thr (서열번호 9)
상기 일반식 Ⅰ에서, Xaa₁은 존재하지 않거나 Pro 또는 Ser이고, Xaa₂는 Glu 또는 Asp이며,
상기 일반식 Ⅱ에서, Xaa₃은 Asn 또는 Lys이며, Xaa₄는 Ala 또는 Val이고, Xaa₅는 Asn 또는 Thr이며,
상기 일반식 Ⅲ에서, Xaa₆은 Ser 또는 Thr이고,
상기 일반식 Ⅳ에서, Xaa₇은 His, Arg, Gln 또는 Lys이고, Xaa₈은 Ser 또는 Trp이고, Xaa₉은 His 또는 Gln이며, Xaa₁₀는 Lys 또는 Asn이고,
상기 일반식 Ⅴ에서, Xaa₁₁은 Ala 또는 Gly이며, Xaa₁₂은 Thr 또는 Lys이고, Xaa₁₃는 Ser 또는 Pro이며,
상기 일반식 Ⅵ에서, Xaa₁₄은 Gly, Ala 또는 Gln이고, Xaa₁₅는 Arg, His, Ser, Ala, Gly 또는 Lys이며, Xaa₁₆는 Leu, Tyr, Phe 또는 Met이다.
제10항에 있어서,
상기 CDR-H1은 서열번호 1, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것이고,
상기 CDR-H2는 서열번호 2, 서열번호 25, 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것이며,
상기 CDR-H3는 서열번호 3, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 85로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것이고,
상기 CDR-L1은 서열번호 10, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 및 서열번호 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것이며,
상기 CDR-L2는 서열번호 11, 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것이고,
상기 CDR-L3는 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 37, 서열번호 86, 및 서열번호 89로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것인,
표적 세포막 단백질 제거용 조성물.
제11항에 있어서, 상기 항 c-Met 항체는,
서열번호 1, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 2, 서열번호 25, 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 3, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 85으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H3)를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
서열번호 10, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 및 서열번호 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 11, 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 37, 서열번호 86, 및 서열번호 89로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L3)를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체인, 표적 세포막 단백질 제거용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 항 c-Met 항체는 서열번호 62, 서열번호 64, 및 서열번호 66으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 68, 서열번호 70, 및 서열번호 108로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 경쇄로 이루어진 항체인,
표적 세포막 단백질 제거용 조성물.
제1항 내지 제4항 및 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항 c-Met 항체 및 상기 표적 세포막 단백질에 대한 항체는 각각 마우스 유래 항체, 마우스-인간 키메릭 항체 또는 인간화 항체인, 표적 세포막 단백질 제거용 조성물.
제1항 내지 제4항 및 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항 c-Met 항체의 C 말단에 연결된 표적 세포막 단백질에 대한 항체의 scFv, (scFv)₂, Fab, Fab', F(ab')₂, 또는 항체 모조체(antibody mimics)
를 포함하는 것인, 표적 세포막 단백질 제거용 조성물.
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제1항 내지 제4항 및 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항의 표적 세포막 단백질 제거용 조성물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항 내지 제4항 및 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항의 표적 세포막 단백질 제거용 조성물을 생체로부터 분리된 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 표적 세포막 단백질 제거 방법.