KR102194142B1

KR102194142B1 - 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체 및 c-Src 저해제를 포함하는 병용 투여용 약학 조성물

Info

Publication number: KR102194142B1
Application number: KR1020140006903A
Authority: KR
Inventors: 린포웨이; 정광호; 고영준; 황재웅; 이승현; 이정욱
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2014-01-20
Filing date: 2014-01-20
Publication date: 2020-12-23
Also published as: KR20150086819A; US20150216972A1; US9730926B2

Abstract

항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체 및 c-Src 저해제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및/또는 치료를 위한 병용 투여용 약학 조성물이 제공된다.

Description

항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체 및 c-Src 저해제를 포함하는 병용 투여용 약학 조성물{Pharmaceutical composition for combination therapy containing bispecific anti-c-Met/anti-FGFR antibody and c-Src inhibitor}

c-Met은 배아발생, 상처치료 등을 조절하는 세포막 수용체의 일원으로서, 비정상적인 활성화는 종양 성장을 유발한다. EGFR은 세포의 성장 및 이동(migration)과 같은 몇 가지 세포 기능에 수반되는 세포 수용체의 일원이며, EGFR의 과발현 또는 변이는 종양 발생을 유발한다. c-Src은 EGFR 및 c-Met 경로를 포함하는 몇 가지 세포 신호 경로의 하류 매개자 (downstream mediator)이다.

이들을 표적으로 하는 다양한 치료제들이 개발되고 있다. 예컨대, 항 EGFR 단클론 항체인 어비툭스(Erbitux)가 결장암(colorectal tumor) 치료용으로, c-Met 소분자 저해제인 crizotinib이 ALK-유발 폐암 치료용으로, c-Src 소분자 저해제인 dasatinib이 만성기 필라델피아 염색체 양성 만성 골수성 백혈병(Chronic Phase　Philadelphia chromosome positive Chronic Myelogenous Leukemia; CP-CML)의 치료용으로 각각 FDA 승인을 받은 바 있다.

그러나, 이들 단일 약물을 사용하는 암 치료법은 특정 종류의 종양 세포에만 효과를 나타내어 그 적응증에 한계가 있거나, 다양한 종류 또는 변이 종양에서 만족할 말한 치료 효과를 나타내지 못하고 있는 실정이다.

따라서, 보다 표과적인 암 치료를 위하여 2 또는 그 이상을 표적으로 하는 다중 병용 치료법의 개발이 요구되고 있다.

본 발명은 c-Met, EGFR, 및 c-Src를 표적으로 하는 삼중 표적 병용 치료법에 관한 것이다.

일 예는 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체 및 c-Src 저해제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및/또는 치료를 위한 병용 투여용 약학 조성물을 제공한다.

다른 예는 유효성분으로 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체의 약학적 유효량을 포함하는 제1 약학 조성물 및 유효성분으로 c-Src 저해제의 약학적 유효량을 포함하는 제2 약학 조성물, 및 포장 용기를 포함하는, 암의 예방 및/또는 치료용 키트를 제공한다.

다른 예는 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체의 약학적 유효량과 c-Src 저해제의 약학적 유효량을 암의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자에게 병용 투여하는 단계를 포함하는암의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명은 c-Met, EGFR, 및 c-Src 간의 복잡한 관련성을 규명하고 이들 단백질 간의 상호작용이 다양한 종양이 발생 및 성장에 중요한 역할을 한다는 것을 밝혔다. 지금까지 EGFR, c-Met, 및 c-Src을 모두 표적으로 하는 삼중 표적 치료법은 보고된 바 없다. 이는 단일 약물을 동시에 투여하는 3중 병용 치료시 수반될지 모르는 안정성 문제 때문일 것으로 생각되며, 본 발명은 이중 특이 항체를 사용함으로써 이러한 문제를 해결하였다.　

이중특이 항체(bispecific antibody; bsAb)는 암치료에 있어서 가능성 높은 전략중 하나로 개발되고 있다. 이중 특이 항체는 2 개의 단클론 항체의 항원 결합 단편을 포함하며, 두 개의 항원에 모두 결합한다. 본 발명에서, 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체가 c-Met 및 EGFR 경로 간의 혼선에 의하여 야기되는 약물 저항성을 극복할 수 있음을 확인하였다. 또한 이중 특이 항체는 두 개의 단일 항체의 단순 조합보다 숙주세포에 미치는 독성이 낮다는 이점이 있다. 그러나 기존의 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체는 K-Ras 또는 T790M 변이 세포주와 같은 일부 변이 종양세포에서는 잘 작용하지 못하는 경향이 있었다. 이러한 문제는 상기 이중 특이 항체를 c-Src 저해제와 병용 투여함으로써 극복할 수 있음을 확인하였다.

이에, 본 발명은 c-Met, EGFR, 및 c-Src를 표적으로 하는 삼중 표적 병용 치료법으로서, 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체와 c-Src 저해제를 이용한 치료법을 제안한다.

본 발명에서 제안되는 치로법은 항체와 같이 표적 치료제에 의해 발생되기 쉬운 저항성을 방지하고자 저항성을 유발하는 인자를 함께 억제함으로써 표적 치료제의 효능을 극대화시키는 한편, 저항성이 나타나거나 변이가 발생하여 항암 효능을 나타내지 못하는 경우(예컨대, K-Ras 또는 T790M 변이 세포주 등)에도 적용 범위를 확장시킬 수 있고, 증진된 효능으로 인하여 그 투여량을 감소시킬 수 있고, 이에 따라서 생체에 미치는 독성은 최소화하여 부작용을 줄일 수 있다.

본 발명은 표적 항암제인 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체와 다른 유효 약물과의 병용 투여 요법을 제공한다. 이와 같은 병용 투여 요법은 병용 투여에 의한 상승효과 발생과 더불어 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체의 효능을 보다 증진시킴으로써 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체의 투여량을 효과적으로 줄일 수 있다. 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체의 투여량을 줄임으로써, 부작용은 최소화하면서 항암 효능을 극대화시킬 수 있다. 또한, 상기 병용 투여에 의하여, 항 c-Met 항체, 항 EGFR 항체, 또는 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체 단독으로 효능이 나타나지 않거나 미미한 암세포, 및/또는 변이(예컨대, K-Ras 또는 EGFR T790M 변이)에 의하여 유발되는 암세포에도 항암 효능이 발휘될 수 있고, 항 c-Met 항체, 항 EGFR 항체, 또는 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체 등과 같이 타이로신 카이네이즈 저해제(Tyrosine kinase inhibitor; TKI)에 대한 저항성을 극복할 수 있도록 할 수 있다. 항 c-Met 항체, 항 EGFR 항체, 또는 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체 단독으로는 효능이 나타나지 않는 암종은 타이로신 카이네이즈 저해제에 대해 내재적 저항성 (innate resistance)이 있다고 할 수 있는데, 이와 같은 타이로신 카이네이즈 저해제에 대한 내재적 저항성을 병용 처리를 통해 극복할 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명은 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체와 c-Src 저해제의 병용 투여 요법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 암세포의 중요한 성장인자로 알려진 HGF/c-Met과의 작용을 억제함과 동시에 RTK (receptor tyrosine kinase)의 일종인 섬유아세포성장인자 수용체(Epidermal growth factor receptor; EGFR) 의 작용을 억제하고, 그 하류의 신호 경로도 함께 차단함으로써, 보다 상승된 항암 효과가 얻어지고 각 약물의 유효 투여량을 낮출 수 있으며, 변이된 암세포 및/또는 타이로신 카이네이즈 저해제에 대하여 저항성을 갖는 암에도 항암 효과를 나타낼 수 있는, 병용 투여 요법이 제공된다. 즉, 본 발명에서는 c-Met, EGFR, 및 c-Src의 3 개의 표적을 동시에 저해함으로써, 증진된 항암효과, 이로 인한 유효 투여량의 감소, 이로 인한 부작용의 감소, 타이로신 카이네이즈 저해제에 대한 저항성 극복 및 변이(예컨대, K-Ras 또는 EGFR T790M 변이)에 의하여 유발된 암에 대한 항암 효능 발휘, 및 이로 인한 적응증 확대의 효과를 얻을 수 있다.

도 1은 c-Met, EGFR, 및 c-Src을 표적으로 하는 치료에 있어서, 단독 처리시와 병용처리시의 작용 메커니즘을 예시적으로 보여주는 모식도이다. 도 1의 좌측은 단독 처리시의 작용 메커니즘을 보여주는 모식도로, 단독 처리에 의하여 survival mechanism이 차단되지 않음을 보여주며, 이를 통하여 저항성이 획득될 수 있다. 도 1의 우측은 c-Src 저해제와 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체와의 병용 처리시의 작용 메커니즘을 보여주는 모식도로, survival mechanism이 효과적으로 차단되어 종양 성장이 억제됨을 보여준다.

또한, 본 발명에서는 c-Met, EGFR, 및 c-Src의 3 개의 표적에 대한 각각의 저해제를 단순 삼중 병용 투여하는 것이 아니고, c-Met과 EGFR를 동시에 표적화하는 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체를 사용함으로써, 3종의 표적에 대한 각각의 저해제의 단순 병용 투여시 야기될 수 있는 안전성의 문제를 해결하고, 단순 병용 투여시보다 상승된 치료 효과를 얻을 수 있다.

　본 발명의 일 예는 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체 및 c-Src 저해제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및/또는 치료를 위한 병용 투여용 약학 조성물을 제공한다.

일 구체예에서, 상기 병용 투여용 약학 조성물은 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체의 약학적 유효량 및 c-Src 저해제의 약학적 유효량이 혼합된 혼합제를 포함하는, 두 약물의 동시 투여를 위한 형태일 수 있다.

다른 구체예에서, 상기 병용 투여용 약학 조성물은 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체의 약학적 유효량 및 c-Src 저해제의 약학적 유효량이 각각 제제화되어, 두 약물을 동시적 또는 순차적으로 투여하기 위한 형태일 수 있다. 이 경우, 상기 병용 투여용 약학 조성물은 유효 성분으로 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체의 약학적 유효량을 포함하는 제1 약학 조성물 및 유효성분으로 c-Src 저해제의 약학적 유효량을 포함하는 제2 약학 조성물을 포함하는, 동시적 또는 순차적 투여를 위한 병용 투여용 약학 조성물일 수 있다. 순차적 투여의 경우 그 순서는 서로 바뀌어도 무방하다.

다른 예는 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체의 약학적 유효량을 포함하는 제1 약학 조성물, c-Src 저해제의 약학적 유효량을 포함하는 제2 약학 조성물, 및 포장 용기를 포함하는, 암의 예방 및/또는 치료용 키트를 제공한다.

본 발명에 있어서, 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체와 c-Src 저해제를 병용 투여함으로써, c-Met, EGFR, 및 c-Src을 각각 저해하는 단일 약물 사용시와 비교하여 우수한 상승 효과를 거둘 수 있을 뿐 아니라, 단일 약물 사용시와 비교하여 투여 농도 감소 및/또는 투여 간격 증가시에도 동등 이상의 효과를 얻을 수 있고, c-Met, EGFR, 및 c-Src 각각의 저해제가 효과를 나타내지 못하는 암, 변이에 의한 암세포(예컨대, K-Ras 또는 EGFR T790M 변이 세포주), 및/또는 타이로신 카이네이즈 억제제에 대하여 내성이 있는 암에서도 우수한 항암 효과를 얻을 수 있다.

본 발명의 표적 중 하나인 c-Src (Proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src; proto-oncogene c-Src)은 비수용체 단백질 타이로신 카이네이즈 (non-receptor protein tyrosine kinase)의 일원으로, 단백질 내의 특정 타이로신 잔기를 인산화시킨다. c-Src의 활성화는 세포 신호가 촉진에 의한 암 발생 및 암 진행과 관련이 있다. 상기 c-Src은 모든 종에서 유래하는 것일 수 있으며, 예컨대, 인간 c-Src (예컨대, NP_005408), 원숭이 c-Src (예컨대, XP_ 002830325) 등과 같은 영장류 유래의 것, 또는 마우스 c-Src (예컨대, NP_001020566), 래트 c-Src (예컨대, NP_114183) 등과 같은 설치류 유래의 것 등일 수 있다.

다른 표적인 "c-Met" 또는 "c-Met 단백질"은 간세포 성장 인자와 결합하는 수용체 티로신 키나제를 의미한다. 상기 c-Met 단백질은 모든 종에서 유래하는 것일 수 있으며, 예컨대, 인간 c-Met (예컨대, NP_000236), 원숭이 c-Met (예컨대, Macaca mulatta, NP_001162100) 등과 같은 영장류 유래의 것, 또는 마우스 c-Met (예컨대, NP_032617.2), 래트 c-Met (예컨대, NP_113705.1) 등과 같은 설치류 유래의 것 등일 수 있다. 상기 단백질은 예를 들면, GenBank Aceession Number NM_000245에 제공된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드, 또는 GenBank Aceession Number NM_000236에 제공된 폴리펩티드 서열에 의해 암호화된 단백질, 또는 그의 세포외 도메인을 포함한다. 수용체 티로신 키나제 c-Met은 예를 들면, 암발생, 암전이, 암세포 이동, 암세포 침투, 신생혈관 생성 과정 등의 여러 가지 기작에 관여한다.

또 다른 표적인 "EGFR(Epidermal growth factor receptor; 상피세포성장인자 수용체)"는 HER 패밀리의 수용체 티로신 키나아제(RTKs)의 일원이다. EGFR의 세포외 도메인에 대한 리간드의 결합은 다른 ErbB 수용체와의 리셉터 호모- 또는 헤테로이량체화를 유도하며, 이는 특이적인 티로신 잔기의 세포내 자가인산화를 유발한다. EGFR 자가인산화는 세포 증식, 혈관신생 및 전이에 영향을 미치는 MAPK 및 PI3K/Akt 활성화를 포함한 다운스트림 신호전달 네트워크를 이끈다. EGFR의 과발현, 유전자 증폭, 돌연변이, 또는 재배열은 여러 종류의 인간 악성 종양에서 빈번히 관찰되며, 암 치료의 불량한 예후 및 나쁜 임상적 결과와 관련 있다. 이러한 이유로, 이들 EGFR는 항암 요법에 있어서 중요한 표적이 된다. 상기 EGFR 또는 HER2는 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등의 포유류로부터 유래된 것일 수 있다. 예컨대, 상기 EGFR은 GenBank Accession Nos. JQ739160, JQ739161, JQ739162, JQ739163, JQ739164, JQ739165, JQ739166, JQ739167, NM_005228.3, NM_201284.1, NM_201282.1, 또는 NM_201283.1 등에 제공된 뉴클레오타이드 서열(mRNA)에 의하여 암호화된 폴리펩타이드일 수 있다.

본 발명의 병용 투여의 유효 성분 중 하나인 c-Src 저해제는 다사티닙(dasatinib), 사라카티닙(saracatinib), 보수티닙(bosutinib), 1-Naphthyl PP1 (CAS 221243-82-9; 1 -(1,1-Dimethylethyl)-3-(1-naphthalenyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine), A 419259 trihydrochloride (CAS 364042-47-7; 7-[trans-4-(4-Methyl-1-piperazinyl)cyclohexyl]-5-(4-phenoxyphenyl)-7H-Pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amine trihydrochloride), AG 538 (CAS 133550-18-2; α-Cyano-(3,4-dihydroxy)cinnamoyl-(3',4'-dihydroxyphenyl)ketone), AGL 2263 ((E)-2-(3,4-dihydroxybenzoyl)-3-(2-oxo-3H-1,3-benzoxazol-5-yl)prop-2-enenitrile), Bcr-abl Inhibitor II (CAS 607702-99-8; 4-fluoro-N-{5-[(4-fluorobenzyl)sulfanyl]-1,3,4-thiadiazol-2-yl}benzamide), Bosutinib (CAS 380843-75-4; 4-[(2,4-Dichloro-5-methoxyphenyl)amino]-6-methoxy-7-[3-(4-methyl-1-piperazinyl)propoxy]-3-quinolinecarbonitrile), Altenusin (CAS 31186-12-6), Herbimycin A (CAS 70563-58-5;(15R)-17-demethoxy-15-methoxy-11-O-methyl-geldanamycin), PD 166285 (CAS 212391-63-4; 6-(2,6-Dichlorophenyl)-2-[[4-[2-(diethylamino)ethoxy]phenyl]amino]-8-methylpyrido[2,3-d]pyrimidin-7(8H)-one), PKC-412 (CAS 120685-11-2; [9S-(9α,10β,11β,13α]-N-(2,3,10,11,12,13-Hexahydro-10-methoxy-9-methyl-1-oxo-9,13-epoxy-1H,9H-diindolo[1,2,3-gh:3',2',1'-lm]pyrrolo[3,4-j][1,7]benzodiazonin-11-yl)-N-methylbenzamide), PDGFR Tyrosine Kinase Inhibitor IV (CAS 627518-40-5; 3-Fluoro-N-(6,7-dimethoxy-2,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol-3-yl)phenylamine), Calphostin C (CAS 121263-19-2; (1R)-2-[12-[(2R)-2-(Benzoyloxy)propyl]-3,10-dihydro-4,9-dihydroxy-2,6,7,11-tetramethoxy-3,10-dioxo-1-perylenyl]-1-methylethylcarbonic acid 4-hydroxyphenyl ester), PP 1 (CAS 172889-26-8; 1-tert-butyl-3-(4-methylphenyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine), PP 2 (CAS 172889-27-9; 4-Amino-5-(4-chlorophenyl)-7-(t-butyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidine), Src Kinase Inhibitor I (CAS 179248-59-0; 4-(4′-Phenoxyanilino)-6,7-dimethoxyquinazoline), EGF/FGF/PDGF Receptor Tyrosine Kinase Inhibitor (CAS 1135256-66-4; 1-(2-Amino-6-(2,6-dichlorophenyl)pyrido[2,3-d]pyrimidin-7-yl)-3-tert-butyl urea), Staurosporine (CAS 62996-74-1; [9S-(9α,10β,11β,13α]-2,3,10,11,12,13-Hexahydro-10-methoxy-9-methyl-11-(methylamino)-9,13-epoxy-1H,9H-diindolo[1,2,3-gh:3',2',1'-lm]pyrrolo[3,4-j][1,7]benzodiazonin-1-one), Lavendustin A (CAS 125697-92-9; 5-[[(2,5-Dihydroxyphenyl)methyl][(2-hydroxyphenyl)methyl]amino]-2-hydroxybenzoic acid), Indirubin-3'-(2,3-dihydroxypropyl)oximether, Luteolin (CAS 491-70-3; 2-(3,4-Dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-4H-1-benzopyran-4-one), SU6656 (CAS 330161-87-0; (3Z)-N,N-Dimethyl-2-oxo-3-(4,5,6,7-tetrahydro-1H-indol-2-ylmethylidene)-2,3-dihydro-1H-indole-5-sulfonamide), TX-1918 (CAS 503473-32-3; 2-((3,5-dimethyl-4-hydroxyphenyl)-methylene)-4-cyclopentene-1,3-dione), Geldanamycin (CAS 30562-34-6; 2-azabicyclo[16.3.1]docasa-4, 6, 10, 18, 21-pentaene-3, 20, 22-trione, 9, 13-dihydroxy-8, 14, 19-trimethoxy-4, 10, 12, 16-tetramethyl-9-carbamate), MNS (CAS 1485-00-3; 3,4-Methylenedioxy-nitrostyrene), TX-1123 (CAS 157397-06-3; 2-((3,5-di-tert-Butyl-4-hydroxyphenyl)-methylene)-4-cyclopentene-1,3-dione), GW5074 (CAS 220904-83-6; 3-(3,5-Dibromo-4-hydroxy-benzylidene)-5-iodo-1,3-dihydro-indol-2-one), Erlotinib HCl (CAS 183319-69-9; N-(3-ethynylphenyl)-6,7-bis(2-methoxyethoxy)quinazolin-4-amine hydrochloride), NVP-BHG712 (CAS 940310-85-0; 4-methyl-3-(1-methyl-6-(pyridin-3-yl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-ylamino)-N-(3-(trifluoromethyl)phenyl)benzamide), GW2580 (CAS 870483-87-7; 5-[[3-methoxy-4-[(4-methoxyphenyl)methoxy]phenyl]methyl]-2,4-Pyrimidinediamine), AEE788 (CAS 497839-62-0; (R)-6-(4-((4-ethylpiperazin-1-yl)methyl)phenyl)-N-(1-phenylethyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amine), TAK-901 (CAS 934541-31-8; 5-(3-(ethylsulfonyl)phenyl)-3,8-dimethyl-N-(1-methylpiperidin-4-yl)-9H-pyrido[2,3-b]indole-7-carboxamide), Midostaurin (CAS 120685-11-2; N-[(9S,10R,11R,13R)-2,3,10,11,12,13-hexahydro-10-methoxy-9-methyl-1-oxo-9,13-epoxy-1H,9H-diindolo[1,2,3-gh:3',2',1'-lm]pyrrolo[3,4-j][1,7]benzodiazonin-11-yl]-N-methyl-benzamide), PD173074 (CAS 219580-11-7; 1-tert-butyl-3-(2-(4-(diethylamino)butylamino)-6-(3,5-dimethoxyphenyl)pyrido[2,3-d]pyrimidin-7-yl)urea) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

일 예에서, 상기 c-Src 저해제는 다사티닙, 사라카티닙, 및 보수티닙으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

다사티닙(dasatinib; N-(2-chloro-6-methylphenyl)-2-[[6-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-2-methyl-4-pyrimidinyl]amino]-5-thiazole carboxamide monohydrate)은 다음의 구조를 갖는다:

사라카티닙(saracatinib; AZD0530; 4-Quinazolinamine, N-(5-Chloro-1,3-benzodioxol-4-yl)-7-[2-(4-methyl-1-piperazinyl)ethoxy]-5-[(tetrahydro-2H-pyran-4-yl)oxy]-4-quinazolinamine)은 다음의 구조를 갖는다:

보수티닙(bosutinib; 4-[(2,4-dichloro-5-methoxyphenyl)amino]-6-methoxy-7-[3-(4-methylpiperazin-1-yl)propoxy]quinoline-3-carbonitrile)은 다음의 구조를 갖는다:

상기 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체는 c-Met과 EGFR을 동시에 표적으로 하여 활성을 저해하는 모든 항체일 수 있다.

상기 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체는 다른 예는 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 항 EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 것일 수 있다. 상기 항원결합 단편은 scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체는 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 C 말단 또는 N 말단, 예컨대 C 말단에 연결된 EGFR 결합 부위를 포함하는 상하 비대칭형의 이중 특이 항체일 수 있다. 상기 EGFR 결합 부위는 항 EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 EGFR에 특이적으로 결합하는 항 EGFR DARPin (또는 EGFR 결합 DARPin)일 수 있다.

또 다른 예에서, 상기 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체는 항 c-Met 항체의 단일가닥 항원 결합 단편 (예컨대, scFv, scFv-Fc 등)과 항 EGFR 항체의 단일가닥 항원 결합 단편 (예컨대, scFv, scFv-Fc 등)이 이합체 구조를 이루는 좌우 비대칭형 이중 특이 항체일 수 있다.

상기 상하 비대칭형 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체에 있어서, 항 c-Met 항체는 c-Met 단백질이 세포 내로 이동하고 분해되는 것을 매개하는 역할을 하므로, 이러한 역할을 온전히 수행하기 위하여 완전한 항체 구조를 갖는 것이 유리할 수 있고, EGFR 결합 부위는 EGFR에 대한 특이적 인식 및 결합이 중요하므로, EGFR을 인식하는 항 EGFR 항체의 완전한 형태뿐 아니라 상기 항원 결합 단편 또는 항 EGFR DARPin을 포함하여도 무방할 수 있다. 따라서, 일 구체예에서, 상기 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체는 항 c-Met에 대한 완전한 항체 (예컨대 IgG형 항체) 및 상기 항체의 C 말단에 연결된 항 EGFR 항체의 항원 결합 단편 또는 항 EGFR DARPin을 포함하는 것일 수 있다.

상기 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체에 있어서, 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 항 EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 항 EGFR DARPin은 링커, 예컨대, 펩타이드 링커를 통하거나 통하지 않고 연결될 수 있다. 또한 항원 결합 단편 내의 중쇄 부분과 경쇄 부분, 예컨대 scFv 단편 내의 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역도 펩타이드 링커를 통하거나 통하지 않고 연결될 수 있다. 상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 항 EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 항 EGFR DARPin을 연결하는 펩타이드 링커와 항원 결합 단편 내의 중쇄 부분과 경쇄 부분을 연결하는 펩타이드 링커는 동일하거나 상이할 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 1 내지 100개 또는 2 내지 50개의 임의의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있으며, 그 포함된 아미노산 종류는 제한이 없다. 상기 펩타이드 링커는, 예컨대, Gly, Asn 및/또는 Ser 잔기를 포함할 수 있으며, Thr 및/또는 Ala과 같은 중성 아미노산들도 포함될 수 있다. 펩타이드 링커에 적합한 아미노산 서열은 당 업계에 공지되어 있다. 한편, 상기 링커는 상기 이중 특이 항체의 기능에 영향을 미치지 않는 한도 내에서, 그 길이를 다양하게 결정할 수 있다. 예컨대, 상기 펩타이드 링커는 Gly, Asn, Ser, Thr 및 Ala로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 총 1 내지 100개, 2 내지 50개, 또는 5 내지 25개를 포함하여 이루어진 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 펩타이드 링커는 (G4S)n (n은 (G4S)의 반복수)로서, 1 내지 10의 정수, 예컨대 2 내지 5의 정수)로 표현되는 것일 수 있다.

구체예에서, 상기 항 EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,

시툭시맙(Cetuximab; Erbitux), 패니투무맙(Panitumumab), 서열번호 109의 중쇄 가변 영역, 서열번호 111의 경쇄 가변 영역, 또는 이들의 조합을 포함하는 항 EGFR 항체, 또는 서열번호 113의 중쇄 가변 영역, 서열번호 114의 경쇄 가변 영역, 또는 이들의 조합을 포함하는 항 EGFR 항체, 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.

예컨대, 상기 항 EGFR 항체 또는 항원 결합 단편은 시툭시맙(Cetuximab; Erbitux), 패니투무맙(Panitumumab), 또는 서열번호 109 또는 서열번호 113의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 111 또는 서열번호 114로의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 (예컨대, scFv, scFv-Fc 등)일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 항 EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,

서열번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역;

서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 120의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역;

상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역 및 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역의 조합; 또는

상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합

을 포함하는 것일 수 있다.

항 EGFR 항체의 CDR 서열
	중쇄 CDR		경쇄 CDR
CDR-H1	NYDMS(서열번호115)	CDR-L1	TGSSSNIGNNDVS(서열번호118)
CDR-H2	GISHSSGSKYYADSVKG(서열번호116)	CDR-L2	DDNKRPS(서열번호119)
CDR-H3	KDATPRPLKPFDY(서열번호117)	CDR-L3	GSWDASLNA(서열번호120)

예컨대, 상기 항 EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 121 또는 서열번호 122의 중쇄 가변 영역, 서열번호 123 또는 서열번호 124의 경쇄 가변 영역, 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 항 EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 121 또는 서열번호 122의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 123 또는 서열번호 124의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항 EGFR 항체, 항 EGFR scFv, 또는 항 EGFR scFv-Fc 일 수 있다.

<서열번호 121: 항 EGFR 항체의 중쇄 가변 영역 >

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYDMSWVRQAPGKGLEWVSGISHSSGSKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDATPRPLKPFDYWGQGTLVTVSS　　

(상기 서열에서 굵은 글씨로 표시한 부분이 CDR 부위이며, 순서대로 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3이다)

<서열번호 123: 항 EGFR 항체의 경쇄 가변 영역 >

QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGNNDVSWYQQLPGTAPKLLIYDDNKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDASLNAYVFGGGTKLTVLG

일 구체예에서, 상기 항 EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 109, 서열번호 113, 서열번호 121, 또는 서열번호 122의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 111, 서열번호 114, 서열번호 123, 또는 서열번호 124의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항 EGFR 항체, 항 EGFR scFv, 또는 항 EGFR scFv-Fc일 수 있다.

상기 항 EGFR scFv 또는 항 EGFR scFv-Fc에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역은 링커, 예컨대, 펩타이드 링커를 통하거나 통하지 않고 연결될 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 1 내지 100개 또는 2 내지 50개의 임의의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있으며, 그 포함된 아미노산 종류는 제한이 없다. 상기 펩타이드 링커는, 예컨대, Gly, Asn 및/또는 Ser 잔기를 포함할 수 있으며, Thr 및/또는 Ala과 같은 중성 아미노산들도 포함될 수 있다. 펩타이드 링커에 적합한 아미노산 서열은 당 업계에 공지되어 있다. 한편, 상기 링커는 상기 이중 특이 항체의 기능에 영향을 미치지 않는 한도 내에서, 그 길이를 다양하게 결정할 수 있다. 예컨대, 상기 펩타이드 링커는 Gly, Asn, Ser, Thr 및 Ala로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 총 1 내지 100개, 2 내지 50개, 또는 5 내지 25개를 포함하여 이루어진 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 펩타이드 링커는 (G4S)n (n은 (G4S)의 반복수)로서, 1 내지 10의 정수, 예컨대 2 내지 5의 정수)로 표현되는 것일 수 있다.

상기 항 EGFR DARPin은 DARPin 고유의 구조를 가지면서 EGFR에 특이적으로 결합하는 모든 DARPin일 수 있다.

DARPin (designed ankyrin repeat protein)은 표적 단백질에 대하여 높은 특이성과 높은 결합 친화도를 보이는 유전공학적으로 제작된 항체 모사 단백질 (antibody mimetic protein)이다. DARPin은 천연 안키린 (ankyrin) 단백질로부터 유래된 것으로 반복 단위체(ankyrin repeat motif)가 2개 이상 또는 3개 이상, 예컨대 4 또는 5개 반복된 구조를 갖는다. 상기 반복 단위체가 3개, 4개, 또는 5개 반복된 DARPin의 경우 분자량이 각각 약 10 kDa, 14 kDa 또는 약 18 kDa 정도이다. DARPin은 주로 구조적 기능을 하는 코어 부분과 표적과 결합하는 표적 결합 부분을 포함하며, 상기 코어 부분은 보존된 아미노산 서열을 갖고, 상기 표적 결합 부분은 상기 코어 바깥쪽에 위치하는 부분으로 표적에 따라서 상이한 아미노산 서열을 갖는다.

예컨대, 상기 항 EGFR DARPin은 다음의 4종 중에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있다:

항 EGFR DARPin-01 (서열번호 125):

dlgkklleaaragqddevrilmangadvnaddtwgwtplhlaayqghleivevllkngadvnaydyigwtplhlaadghleivevllkngadvnasdyigdtplhlaahnghleivevllkhgadvnaqdkfgktafdisidngnedlaeilq

항 EGFR DARPin-67 (서열번호 126):

dlgkklleaaragqddevrilmangadvnatdndgntplhlsawighleivevllkhgadvnaddllgmtplhlaadtghleivevllkygadvnardtrgktplhlaardghleivevllkhdadvnaqdkfgktafdisidngnedlaeilq

항 EGFR DARPin-68 (서열번호 127):

dlgkklleaaragqddevrilmangadvnafdywgmtplhlaadnghleivevllkhgadvnasdnfgftplhlaafyghleivevllkhgadvnafdmwgntplhlaaqnghleivevllkngadvnaqdkfgktafdisidngnedlaeilq

항 EGFR DARPin-69 (서열번호 128):

Dlgkklleaaragqddevrilmangadvnaddnagrtplhlaanfghleivevllkngadvnakghhcntplhlaawaghleivevllkygadvnadddegytplhlaadigdleivevllkygadvnawdmygrtplhlaasaghleivevllkygadvnaqdkfgktafdisidngnedlaeilq

상기 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체에 있어서, EGFR 결합 부위로서 포함된 항 EGFR DARPin은 상기 서열번호 125 내지 서열번호 127 중에서 선택된 1종 이상(이하, "단위체")이 1개 내지 10개, 1 내지 5개, 또는 1 내지 3개 반복된 형태, 즉, 상기 단위체를 하나 포함하거나, 상기 단위체가 2 내지 10개, 2 내지 5개 또는 2 또는 3개가 반복된 형태일 수 있다.

상기 항 c-Met 항체는 c-Met의 특정 부위, 예컨대 SEMA 도메인 내의 특정 부위를 에피토프로 인식하는 것일 수 있으며, c-Met에 작용하여 세포내이동(internalization) 및 분해(degradation)를 유도하는 모든 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다.

HGF(Hepatocyte growth factor)의 수용체인 c-Met은 세포외 부위, 막투과 부위, 세포내 부위의 세 부분으로 구분되며, 세포외 부위의 경우, 이황화 결합에 의해 α-소단위체와 β-소단위체가 연결된 형태로 HGF 결합 도메인인 SEMA 도메인, PSI 도메인(plexin-semaphorins-integrin homology domain) 및 IPT 도메인(immunoglobulin-like fold shared by plexins and transcriptional factors domain)으로 이루어진다. c-Met 단백질의 SEMA 도메인은 서열번호 79의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, c-Met의 세포외 부위에 존재하는 도메인으로서, HGF가 결합하는 부위에 해당한다. SEMA 도메인 중에서 특정 부위, 예컨대, 106번째부터 124번째까지에 해당하는 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖는 영역은 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 에피토프 중 2번과 3번 프로펠러 도메인 사이의 루프(loop) 부위에 해당하며, 본 발명에서 제안되는 항 c-Met 항체의 에피토프로 작용할 수 있다.

용어, "에피토프(epitope)"는 항원 결정 부위(antigenic determinant)로서, 항체에 의해 인지되는 항원의 일부분을 의미하는 것으로 해석된다. 일 구체예에 따르면, 상기 에피토프는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인(서열번호 79) 내의 연속하는 5개 이상의 아미노산을 포함하는 부위, 예컨대, c-Met 단백질의 SEMA 도메인(서열번호 79) 내의 106번째부터 124번째까지에 해당하는 서열번호 71 내에 위치하는 연속하는 5개 내지 19개의 아미노산을 포함하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 에피토프는 서열번호 71의 아미노산 서열 중 서열번호 73(EEPSQ)을 포함하여 연속하는 5 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다.

상기 서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 에피토프는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 2번과 3번 프로펠러 구조의 도메인 사이의 루프 부위 중 가장 바깥으로 위치한 부위에 해당하며, 상기 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 에피토프는 일 구체예에 따른 항체 또는 항원 결합 단편이 가장 특이적으로 결합하는 부위이다.

따라서, 항 c-Met 항체는 서열번호 서열번호 71의 아미노산 서열 중 서열번호 73(EEPSQ)을 포함하는 연속하는 5 내지 19개의 아미노산을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 것일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 71, 서열번호 72, 또는 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 항 c-Met 항체는,

서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5의 아미노산 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열, 또는 서열번호 2의 아미노산 서열 내의 3번째부터 10번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 8 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열, 서열번호 85의 아미노산 서열, 또는 서열번호 85의 아미노산 서열 내의 1번째부터 6번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 6 내지 13개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR), 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역;

서열번호 7의 아미노산 서열의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 9의 아미노산 서열, 서열번호 86의 아미노산 서열, 또는 서열번호 89의 아미노산 서열 내의 1번째부터 9번째까지의 아미노산을 포함하는 9 내지 17개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역;

상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합

을 포함하고,

상기 서열번호 4 내지 서열번호 9는 각각 하기 일반식 Ⅰ 내지 일반식 Ⅵ으로 표시되는 아미노산 서열인 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다:

일반식 Ⅰ

Xaa₁-Xaa₂-Tyr-Tyr-Met-Ser (서열번호 4),

일반식 Ⅱ

Arg-Asn-Xaa₃-Xaa₄-Asn-Gly-Xaa₅-Thr (서열번호 5),

일반식 Ⅲ

Asp-Asn-Trp-Leu-Xaa₆-Tyr (서열번호 6),

일반식 Ⅳ

Lys-Ser-Ser-Xaa₇-Ser-Leu-Leu-Ala-Xaa₈-Gly-Asn-Xaa₉-Xaa₁₀-Asn-Tyr-Leu-Ala (서열번호 7)

일반식 Ⅴ

Trp-Xaa₁₁-Ser-Xaa₁₂-Arg-Val-Xaa₁₃ (서열번호 8)

일반식 Ⅵ

Xaa₁₄-Gln-Ser-Tyr-Ser-Xaa₁₅-Pro-Xaa₁₆-Thr (서열번호 9)

상기 일반식 Ⅰ에서, Xaa₁은 존재하지 않거나 Pro 또는 Ser이고, Xaa₂는 Glu 또는 Asp이며,

상기 일반식 Ⅱ에서, Xaa₃은 Asn 또는 Lys이며, Xaa₄는 Ala 또는 Val이고, Xaa₅는 Asn 또는 Thr이며,

상기 일반식 Ⅲ에서, Xaa₆은 Ser 또는 Thr이고,

상기 일반식 Ⅳ에서, Xaa₇은 His, Arg, Gln 또는 Lys이고, Xaa₈은 Ser 또는 Trp이고, Xaa₉은 His 또는 Gln이며, Xaa₁₀는 Lys 또는 Asn이고,

상기 일반식 Ⅴ에서, Xaa₁₁은 Ala 또는 Gly이며, Xaa₁₂은 Thr 또는 Lys이고, Xaa₁₃는 Ser 또는 Pro이며,

상기 일반식 Ⅵ에서, Xaa₁₄은 Gly, Ala 또는 Gln이고, Xaa₁₅는 Arg, His, Ser, Ala, Gly 또는 Lys이며, Xaa₁₆는 Leu, Tyr, Phe 또는 Met이다.

일 구체예에서, 상기 CDR-H1은 서열번호 1, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CDR-H2는 서열번호 2, 서열번호 25, 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CDR-H3는 서열번호 3, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 85로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 CDR-L1은 서열번호 10, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CDR-L2는 서열번호 11, 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CDR-L3은 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 37, 서열번호 86, 및 서열번호 89로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은

서열번호 1, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 2, 서열번호 25, 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 3, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 85으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H3)를 포함하는 중쇄 가변 영역;

서열번호 10, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 11, 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 37, 서열번호 86, 및 서열번호 89로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L3)를 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는

상기 중쇄 가변 영역과 상기 경쇄 가변 영역의 조합

을 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 항 c-Met 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 17, 서열번호 74, 서열번호 87, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93 또는 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 상기 중쇄 가변 영역, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 75, 서열번호 88, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99 또는 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 상기 경쇄 가변 영역, 또는 상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 항 c-Met 항체는 수탁번호 KCLRF-BP-00220인 하이브리도마 세포에서 생산되는, c-Met 단백질의 세포외 부위(extracellular region)에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체일 수 있다 (대한민국 공개특허 제2011-0047698호 참조; 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 포함됨).

상기의 항 c-Met 항체는 대한민국 공개특허 제2011-0047698호에 정의된 항체를 모두 포함할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 항 c-Met 항체는,

서열번호 62의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 64의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임) 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 66의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 및 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및

서열번호 68의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 20번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 70의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 20번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열, 및 서열번호 108의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄

를 포함하는 것일 수 있다.

예컨대, 상기 항-c-Met 항체는,

서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;

서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;

서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;

서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 70의 아미노산 서열 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;

서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 70의 아미노산 서열 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체; 또는

서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 70 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체

서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;

서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체; 및

서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체

로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 항 c-Met 항체는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체일 수 있다.

한편, 상기 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 경쇄이며, 서열번호 68의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 상기 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에서 36번 (kabat numbering에 따름, 서열번호 68 내의 62번째 아미노산 위치) 히스티딘 (histidine)이 티로신 (tyrosine)으로 치환된 형태의 폴리펩티드이다. 상기 치환으로 인하여, 일 구체예에 따른 항체의 생산량이 증가될 수 있다. 또한 상기 서열번호 108의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 상기 서열번호 68의 아미노산 서열 중 1번째부터 20번째까지의 시그널 펩타이드를 제외한 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에서 kabat numbering에 의한 27e 위치(kabat numbering에 따름, 서열번호 108 내 32번째 위치; CDR-L1 내부)의 세린(Ser)이 트립토판(Trp)으로 치환된 것으로, 상기 치환으로 인하여, 일 구체예에 따른 항체의 활성(예컨대, c-Met에 대한 결합친화도, c-Met 분해 활성 및 Akt 인산화 억제 활성 등)이 보다 증진될 수 있다.

원하는 항원을 피면역 동물에게 면역시켜 생산하는 동물 유래 항체는 일반적으로 치료 목적으로 인간에 투여 시 면역거부반응이 일어날 수 있으며, 이러한 면역거부반응을 억제하고자 키메릭 항체(chimeric antibody)가 개발되었다. 키메릭 항체는 유전공학적 방법을 이용하여 항-아이소타입(anti-isotype) 반응의 원인이 되는 동물 유래 항체의 불변 영역을 인간 항체의 불변 영역으로 치환한 것이다. 키메릭 항체는 동물 유래 항체에 비하여 항-아이소타입 반응에 있어서 상당 부분 개선되었으나, 여전히 동물 유래 아미노산들이 가변 영역에 존재하고 있어 잠재적인 항-이디오타입(anti-idiotypic) 반응에 대한 부작용을 내포하고 있다. 이러한 부작용을 개선하고자 개발된 것이 인간화 항체(humanized antibody)이다. 이는 키메릭 항체의 가변 영역 중 항원의 결합에 중요한 역할을 하는 CDR(complementaritiy determining regions) 부위를 인간 항체 골격(framework)에 이식하여 제작된다.

인간화 항체를 제작하기 위한 CDR 이식(grafting) 기술에 있어서 가장 중요한 것은 동물 유래 항체의 CDR 부위를 가장 잘 받아들일 수 있는 최적화된 인간 항체를 선정하는 것이며, 이를 위하여 항체 데이터베이스의 활용, 결정구조(crystal structure)의 분석, 분자모델링 기술 등이 활용된다. 그러나, 최적화된 인간 항체 골격에 동물 유래 항체의 CDR 부위를 이식할지라도 동물 유래 항체의 골격에 위치하면서 항원 결합에 영향을 미치는 아미노산이 존재하는 경우가 있기 때문에, 항원 결합력이 보존되지 못하는 경우가 상당수 존재하므로, 항원 결합력을 복원하기 위한 추가적인 항체 공학 기술의 적용은 필수적이라고 할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 항체는 마우스 유래 항체, 마우스-인간 키메릭 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체일 수 있다.

완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.

용어, "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 V_H 및 3개의 불변 영역 도메인 C_H1, C_H2 및 C_H3과 힌지(hinge)를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 V_L 및 불변 영역 도메인 C_L을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.

용어, "CDR(complementarity determining region)"은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다(CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다. 한편, 본 명세서에 있어서, 용어, "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 인식"은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.

용어 "힌지 영역(hunge region)"은 항체의 중쇄에 포함되어 있는 영역으로서, CH1 및 CH2 영역 사이에 존재하며, 항체 내 항원 결합 부위의 유연성(flexibility)를 제공하는 기능을 하는 영역을 의미한다.

동물 유래 항체가 키메릭화(chimerization) 과정을 거치게 되면, 동물 유래의 IgG1 힌지는 인간 IgG1 힌지로 치환되지만, 동물 유래 IgG1 힌지는 인간 IgG1 힌지에 비하여 그 길이가 짧고, 두 개의 중쇄 사이의 이황화결합(disulfide bond)이 3개에서 2개로 감소하여 힌지의 경직성(rigidity)이 서로 상이한 효과를 보이게 된다. 따라서, 힌지 영역의 변형(modification)은 인간화 항체의 항원 결합 효율성을 증가시킬 수 있다. 상기 힌지 영역의 아미노산 서열을 변형시키기 위한 아미노산의 결실, 부가 또는 치환 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.

이에, 본 발명의 일 구체예에서, 항원 결합 효율성을 증진시키기 위하여, 상기 항 c-Met 항체 또는 항원 결합 단편은 하나 이상의 아미노산이 결실, 부가 또는 치환되어 아미노산 서열이 변형된 힌지 영역을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 항체는 서열번호 100, 서열번호 101, 서열번호 102, 서열번호 103, 서열번호 104, 또는 서열번호 105의 아미노산 서열을 갖는 힌지 영역을 포함하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 힌지 영역은 서열번호 100 또는 서열번호 101의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 항 c-Met 항체 또는 항 EGFR 항체의 앞서 정의된 CDR 부위 또는 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역을 제외한 경쇄 불변 영역과 중쇄 불변 영역은 모든 서브타입의 면역글로불린(예컨대, IgA, IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, 등)의 경쇄 불변 영역과 중쇄 불변 영역일 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩타이드의 일부를 의미한다. 예를 들어, scFv, (scFv)₂, scFv-Fc, Fab, Fab' 또는 F(ab')₂일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 본 발명에서의 항체의 항원 결합 단편은 상기한 상보성 결정 영역을 하나 이상 포함하는 항체 단편, 예컨대, scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

상기 항원 결합 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(C_H1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다.

Fab'는 중쇄 C_H1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')₂ 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다.

Fv는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역이 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 앞서 설명한 바와 같을 수 있으며, 예컨대, 1 내지 100개, 예컨대 2 내지 50개 또는 5 내지 25개 아미노산 길이의 것일 수 있으며, 그 포함된 아미노산 종류는 제한이 없다.

상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')₂단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

상기 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체는 항 c-Met 항체의 세포 내재화 (internalization) 및 분해 (degradation) 활성에 의하여, c-Met 및 EGFR의 활성 저해뿐 아니라 c-Met 및 EGFR을 분해시켜 총량을 감소시킴으로써 보다 근본적인 차단을 가능하게 한다. 따라서, 상기 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체는 기존의 EGFR 표적 치료제, 예컨대 항 EGFR 항체에 대하여 내성이 생긴 환자에 적용시에도 유효한 효과를 얻을 수 있다.

상기한 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체의 약학적 유효량과 c-Src 저해제의 약학적 유효량을 혼합한 혼합제, 유효 성분으로 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체의 약학적 유효량을 포함하는 제1 약학 조성물, 및/또는 유효성분으로 c-Src 저해제의 약학적 유효량을 포함하는 제2 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 및/또는 부형제 등과 함께 제공될 수 있다.

상기 혼합제, 또는 약학 조성물에 포함되는 약학적으로 허용 가능한 담체는, 약물의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 혼합제 또는 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 약학 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 희석제, 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.

상기 혼합제 또는 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 명세서에 있어서 "약학적 유효량"은 약물이 약학적으로 의미있는 효과를 나타낼 수 있는 양을 의미한다. 1회 투여를 위한 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체의 약학적 유효량과 c-Src 저해제의 약학적 유효량은 각각의 약물의 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 따라서 다양하게 처방될 수 있다. 예컨대, 1회 투여를 위한 상기 c-Src 저해제의 약학적 유효량은 0.001 내지 100㎎/kg, 또는 0.02 내지 10㎎/kg 범위일 수 있고, 1회 투여를 위한 상기 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체의 약학적 유효량은 0.001 내지 100㎎/kg, 또는 0.02 내지 10 ㎎/kg 범위일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 1회 투여를 위한 약학적 유효량은 단위 용량 형태로 하나의 제제로 제제화되거나, 적절하게 분량하여 제제화되거나, 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 상기 키트에 있어서, 1회 투여를 위한 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체의 약학적 유효량 및 c-Src 저해제의 약학적 유효량이 기본단위로 각각 포장용기에 포함되어 있는 것일 수 있다.

상기 병용 투여 후 다음 병용 투여까지의 기간으로 정의되는 병용 투여간 투여 간격은 24 시간 내지 30일, 구체적으로 7일 내지 14일일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 병용 투여가 유효 성분으로 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체의 약학적 유효량을 포함하는 제1 약학 조성물 및 유효성분으로 c-Src 저해제의 약학적 유효량을 포함하는 제2 약학 조성물을 순차적으로 투여하는 것인 경우, 제1 약학 조성물과 제2 약학 조성물 간의 투여 간격은 동시, 또는 1 내지 60분, 구체적으로 1 내지 10분일 수 있으며, 그 투여 순서는 서로 바뀌어도 무방하다.

상기 혼합제 또는 약학 조성물은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 등의 형태로 제형화될 수 있으며, 제형화를 위하여 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

유효성분으로 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체 (또는 그의 항원 결합 단편)을 포함하는 약학 조성물은 면역 리포좀으로 제형화될 수 있다. 항체를 포함하는 리포좀은 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 면역 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 폴리에틸렌글리콜-유도체화된 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 지질 조성물로서 역상 증발법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fab' 단편은 디설파이드-교체 반응을 통해 리포좀에 접합될 수 있다. 독소루비신과 같은 화학치료제가 추가로 리포좀 내에 포함될 수 있다.

또 다른 예는 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체의 약학적 유효량 및 c-Src 저해제의 약학적 유효량을 암의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자에게 병용 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 투여하는 단계 이전에 암의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

한 구체예에서, 상기 병용 투여는 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체의 약학적 유효량과 c-Src 저해제의 약학적 유효량을 혼합한 혼합제를 투여함으로써 수행될 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 병용 투여는 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체의 약학적 유효량을 투여하는 제1 단계 및 c-Src 저해제의 약학적 유효량을 투여하는 제2 단계를 동시에 또는 순차적으로 수행하는 것일 수 있다. 순차적으로 투여하는 경우 그 순서는 서로 바뀌어도 무방하다.

상기 환자는 인간, 원숭이 등을 포함하는 영장류, 마우스, 래트 등을 포함하는 설치류 등을 포함하는 포유류, 또는 이로부터 분리된 세포 또는 조직 또는 이의 배양물일 수 있다.

또 다른 예는 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체 및 c-Src 저해제의 암의 예방 및/또는 치료를 위한 병용 투여 용도를 제공한다.

본 발명에서 제안되는 병용 투여용 약학 조성물 또는 방법은 암의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다. 상기 암은 c-Met 및/또는 EGFR의 과발현 및/또는 비정상적인 활성화와 관련된 암일 수 있으며, 고형암 또는 혈액암일 수 있다. 또한 상기 암은 타이로신 카이네이즈 억제제, 예컨대, 항 c-Met 항체, 항 EGFR 항체 또는 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체에 대하여 저항성을 갖거나, 변이(예컨대, K-Ras 또는 EGFR T790M 변이)에 의하여 유발된 암일 수 있다. 일 예에서, 상기 암은, 이에 제한되지 않지만, 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암, 뇌암 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 암은 원발성 암 뿐아니라 전이성 암을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 암은 타이로신 카티네이즈 억제제에 대하여 저항성을 갖는 암, 또는 K-Ras 변이에 의하여 유발된 결장암(colorectal cancer) 또는 EGFR T790M 변이에 의하여 유발된 비소세포폐암일 수 있다.

상기 암의 예방 및/또는 치료 효과는 암세포의 성장을 억제하는 효과뿐 아니라, 이동(migration), 침습(invasion), 전이(metastasis) 등으로 인한 암의 악화를 억제하는 효과를 포함한다.

항 c-Met/항 EGFR 이중특이 항체 및 c-Src 저해제를 사용하는 삼중 표적 병용 치료에 의하여 상승 효과를 보일 수 있는 암치료법을 제공한다. 이러한 삼중 표적 병용 치료에 의하여, 치료 효과가 개선되고, 투여 용량은 감소되면서 동등 이상의 치료 효과를 얻을 수 있으며, 약물에 대한 저항성 획득을 약화 또는 둔화시킬 수 있고, 독성을 줄일 수 있다는 이점이 있다.

도 1은 c-Met, EGFR, 및 c-Src을 표적으로 하는 치료에 있어서, 단독 처리시와 병용처리시의 작용 메커니즘을 예시적으로 보여주는 모식도이다.
도 2 및 도 3은 K-Ras 변이 결장암 세포주(Lovo 세포주)에서의 항 c-Met/항 EGFR 이중특이 항체 ME19 (도 2) 또는 ME22 (도 3)와 c-Src 저해제와의 병용 처리에 따른 세포 증식 정도를 보여주는 그래프이다.
도 4 및 도 5는 Lovo 세포주에서의 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체 ME19 (도 4) 또는 ME22S (도 5)와 c-Src 저해제를 병용 투여한 경우의 세포 증식 정도를 항체 처리 농도에 따라서 보여주는 그래프이다.
도 6 및 도 7은 Lovo 세포주에서의 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체와 c-Src 저해제 다사티닙 (도 6) 또는 사라카티닙 (도 7)를 병용 투여한 경우의 세포 증식 정도를 c-Src 저해제 처리 농도에 따라서 보여주는 그래프이다.
도 8 및 도 9는 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체와 c-Src 저해제 다사티닙을 병용투여한 경우의 EGFR T790M 변이된 비소세포성 폐암 세포 (H820 세포주)의 증식 정도를 보여주는 그래프로서, 도 8은 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체 5ug/ml와 다사티닙 30nM를 병용투여한 결과이고, 도 9는 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체 5ug/ml와 다사티닙 5nM를 병용투여한 결과이다.
도 10 내지 도 12는 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체 또는 c-Src 저해제 중 어느 하나의 처리량을 고정시키고, 다른 하나의 농도를 변화시키면서 병용투여한 경우의 EGFR T790M 변이된 비소세포성 폐암 세포 (H820 세포주)의 증식 정도를 보여주는 그래프이다.
도 13은 K-Ras 변이 결장암 세포주(HCT-116 세포주)에서의 항 c-Met/항 EGFR 이중특이 항체 ME19와 c-Src 저해제와의 병용 처리에 따른 세포 증식 정도를 보여주는 그래프이다.
도 14 및 15는 HCT-116 세포주에서의 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체와 c-Src 저해제 다사티닙 (도 14) 또는 사라카티닙 (도 15)를 병용 투여한 경우의 세포 증식 정도를 c-Src 저해제 처리 농도에 따라서 보여주는 그래프이다.
도 16는 HCT-116 세포주에 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체와 c-Src 저해제 다사티닙 또는 사라카티닙를 병용 처리한 경우의 세포 모양을 inverted microscope로 관찰한 결과를 보여주는 사진이다.
도 17 내지 19은 EGFR T790M 변이 H1975 세포주에서의 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체와 c-Src 저해제 다사티닙(도 17), 사라카티닙(도 18), 또는 보수티닙(도 19)을 병용 투여한 경우의 세포 증식 정도를 c-Src 저해제 처리 농도에 따라서 보여주는 그래프이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

참고예 : 항 c- Met /항 EGFR 이중 특이 항체의 제작

1.1. c- Met 에 대한 마우스 항체 ' AbF46' 의 생산

1.1.1. 마우스의 면역화

하이브리도마 세포주의 개발에 필요한 면역화 된 마우스를 얻기 위하여, 5마리의 마우스에 한 마리당 100 ㎍의 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질(R&D Systems)과 동량의 완전 프로인드 어주번트(Freund's adjuvant)를 혼합하여 4-6 주된 BALB/c 마우스(Japan SLC, Inc.)의 복강 내에 주사하였다. 2주 후에 상기와 동일한 방법으로 상기 항원으로 사용된 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질을 앞서 주사한 양의 절반인 50 ㎍을 동량의 불완전 프로인드 어주번트(incomplete Freund's adjuvant)과 혼합하여 마우스의 복강 내에 주사하였다. 일주일 후 마지막 부스팅(boosting)이 수행되고 3일 후에 상기 마우스의 꼬리에서 채혈하여 혈청을 얻은 뒤 1/1000로 PBS에 희석하여 ELISA로 c-Met을 인지하는 항체의 역가가 증가됨을 확인하였다. 상기의 결과로 항체의 양이 충분하게 얻어지는 마우스를 선별하여 하기의 세포융합과정을 수행하였다.

1.1.2. 세포 융합 및 하이브리도마의 제조

세포융합 실험 3일 전에 50 ㎍의 PBS에 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질 혼합물을 BALB/c 마우스(Japan SLC, Inc.)의 복강 내에 주사하고, 면역화 된 마우스를 마취한 후 몸통의 좌측에 위치한 비장(spleen)을 적출하였다. 적출한 비장을 메쉬로 갈아서 세포를 분리하고, 배양 배지(DMEM, GIBCO, Invitrogen)와 혼합하여 비장세포 현탁액을 만들었다. 상기 현탁액을 원심분리하여 세포층을 회수하였다. 상기 얻어진 비장세포 1 x 10⁸개와 골수종세포(Sp2/0) 1 x 10⁸개를 혼합한 다음, 원심분리하여 세포를 침전시켰다. 상기 원심분리된 침전물을 천천히 분산시키고, 배양 배지(DMEM)에 들어있는 45% 폴리에틸렌글리콜(PEG)(1 ㎖)을 처리하고, 37 ℃에서 1분 동안 유지시킨 후, 배양 배지(DMEM) 1 ㎖을 첨가하였다. 이후 배양배지(DMEM) 10 ㎖을 1분 동안 첨가하고, 37℃의 물에서 5분 동안 방치한 후 50 ㎖로 맞추어 다시 원심분리하였다. 세포 침전물을 분리 배지(HAT 배지)에 1~2×10⁵/㎖ 정도로 재현탁시키고, 96-웰(well) 플레이트에 0.1 ㎖씩 분주한 후 37℃ 이산화탄소 배양기에서 배양하여 하이브리도마 세포군을 제작하였다.

1.1.3. c- Met 단백질에 대한 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 선별

상기 참고예 1.1.2에서 제조된 하이브리도마 세포군 중에서 c-Met 단백질에만 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포를 선별하기 위하여 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질과 인간의 Fc 단백질을 항원으로 이용한 ELISA 분석 방법을 통하여 스크리닝하였다.

마이크로타이터 플레이트에 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질을 한 웰당 각각 50 ㎕ (2 ug(microgram)/㎖)씩 가하여 플레이트 표면에 부착시키고, 반응하지 않은 항원은 세척하여 제거하였다. c-Met이 아닌 Fc에 결합되는 항체를 선별하여 제외시키기 위하여 인간의 Fc 단백질을 위와 동일한 방법으로 플레이트 표면에 부착시켰다.

상기 참고예 1.1.2에서 얻어진 하이브리도마 세포의 배양액을 상기 준비된 각각 웰에 50 ㎕씩을 가하여 1 시간 동안 반응시킨 후 인산 완충용액-트윈 20(TBST) 용액으로 충분히 세척하여 반응하지 않은 배양액을 제거하였다. 여기에 염소 항-마우스 IgG-호스래디쉬 퍼옥시다제(goat anti-mouse IgG-HRP)를 가하여 1 시간 동안 실온에서 반응시킨 다음, TBST 용액으로 충분히 세척하였다. 이어서 퍼옥시다제의 기질용액(OPD)을 가하여 반응시키고, 그 반응 정도는 ELISA Reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하여 확인하였다.

위와 같은 반응 정도 확인에 의하여, 인간의 Fc에는 결합되지 않고, 인간의 c-Met 단백질에만 특이적으로 높은 결합력을 갖는 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주들을 반복하여 선별하였다. 반복 선별을 통해 얻은 하이브리도마 세포주를 제한 희석(limiting dilution)하여 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주 1개의 클론을 최종적으로 얻었다. 최종 선별된 단일클론 항체 생산 하이브리도마를 2009년 10월 6일자로 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 대한민국 서울 종로구 연건동에 소재하는 한국 세포주연구재단에 기탁하여 수탁번호 KCLRF-BP-00220를 부여받았다 (한국 공개특허 제2011-0047698 참조).

1.1.4. 단일클론 항체의 생산 및 정제

상기 참고예 1.1.3에서 얻은 하이브리도마 세포를 무혈청 배지에서 배양하고 배양액으로부터 단일클론 항체를 생산 정제하였다.

먼저 10%(v/v) FBS가 포함된 배양 배지(DMEM) 배지 50 ㎖에서 배양된 상기 하이브리도마 세포를 원심분리하여 세포 침전물을 20 ㎖ PBS로 2회 이상 세척하여 FBS가 제거된 상태에서, 상기 세포 침전물을 배양 배지(DMEM) 배지 50 ㎖에 재현탁시킨 후, 3일 동안 37℃ 이산화탄소 배양기에서 배양하였다.

이후, 원심분리하여, 항체를 생산하는 세포를 제거하고 항체들이 분비된 배양액을 분리하여, 4℃에 보관하거나 바로 모아서 항체의 분리 정제에 사용하였다. 친화성 칼럼(Protein G agarose column; Pharmacia, USA)을 장착한 AKTA 정제 기기(GE Healthcare)를 이용하여 상기 준비된 배양액 50 ㎖ 내지 300 ㎖로부터 항체를 순수 정제한 후, 단백질 응집용 필터(Amicon)를 사용하여 PBS로 상층액을 치환하여 정제된 항체를 보관하고, 이후의 실시예에 사용하였다.

1.2. c- Met 에 대한 키메릭 항체 chAbF46 의 제작

일반적으로 마우스 항체는 치료 목적으로 인간에게 주입되었을 때 면역거부반응(immunogenicity)을 보일 가능성이 높으므로, 이를 해결하기 위하여, 상기 실시예 1에서 제작된 마우스 항체 AbF46으로부터, 항원 결합에 관련된 변이 영역(variable region)을 제외한 불변 영역(constant region)을 인간 IgG1 항체의 서열로 치환하는 키메릭 항체 chAbF46을 제작하였다.

중쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열은 'EcoRI-signal sequence-VH-NheI-CH-TGA-XhoI'(서열번호 38)로, 경쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열은 'EcoRI-signal sequence-VL- BsiWI-CL-TGA-XhoI'(서열번호 39)로 구성되도록 각각 디자인하여 유전자를 합성하였다. 이후, Invitrogen 사의 OptiCHO^TM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVEC^TM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편(서열번호 38)을, pcDNA^TM3.3-TOPOTA Cloning Kit(Cat no. 8300-01)에 상기 경쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편(서열번호 39)을 각각 EcoRI(NEB, R0101S)과 XhoI(NEB, R0146S) 제한 효소를 사용하여 클로닝함으로써, 키메릭 항체의 발현을 위한 중쇄를 포함하는 벡터 및 경쇄를 포함하는 벡터를 각각 구축하였다.

상기 구축된 벡터는 각각 Qiagen Maxiprep kit (Cat no. 12662)을 이용하여 증폭되었으며, 임시발현은 Freestyle^TM MAX 293 Expression System (invitrogen)을 이용하여 진행 되었다. 사용된 세포주는 293 F cell 이며, FreeStyle™ 293 Expression Medium를 배지로 사용하여 부유배양방식으로 배양되었다. 임시발현 하루 전 세포를 5x10⁵cells/ml의 농도로 준비한 후, 24시간이 지난 뒤 cell수가 1x10⁶cells/ml이 되었을 때 임시발현을 진행하였다. Freestyle^TM MAX reagent (invitrogen)을 사용한 liposomal reagent법으로 형질도입(transfection)을 진행 하였으며, 15ml tube에 중쇄 DNA: 경쇄 DNA=1:1 의 비율로 DNA를 준비하여 OptiPro™ SFM (invtrogen) 2ml과 mix하고(A), 또 다른 15ml tube에 Freestyle^TM MAX reagent 100㎕와 OptiPro™ SFM 2ml을 mix(B)한 후, (A)와 (B)을 mix하여 15분간 incubation 한 후, 하루 전에 준비한 세포에 혼합액을 천천히 섞어주었다. 형질도입 완료 후, 37 ℃, 80% humidity, 8% CO₂ _,130 rpm incubator에서 5일간 배양하였다.

상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액을 각각 100 ml 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출시켰다. 얻어진 용출물을 PBS 버퍼로 교환하여 최종적으로 키메릭 항체 AbF46(이하, chAbF46로 명명함)을 정제하였다.

1.3. 키메릭 항체 chAbF46 으로부터 인간화 항체 huAbF46 의 제작

1.3.1. 중쇄의 인간화( Heavy chain humanization )

H1-heavy 및 H3-heavy 2종의 디자인을 위하여, 우선 Ig Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 통하여 상기 참고예 1.2에서 정제된 마우스 항체 AbF46의 VH 유전자와 가장 상동성이 높은 인간의 생식선(germline) 유전자를 분석하였다. 그 결과, VH3-71이 아미노산 레벨에서 83%의 상동성을 가짐을 확인하였으며, 마우스 항체 AbF46의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3를 Kabat numbering으로 정의하고, 마우스 항체 AbF46의 CDR 부분이 VH3-71의 골격(framework)에 도입되도록 디자인하였다. 이때, 30번(S→T), 48번(V→L), 73번(D→N), 78번(T→L) 아미노산은 원래 마우스 AbF46 항체의 아미노산 서열로 back-mutation 하였다. 이후, H1은 추가로 83번(R→K)과 84번(A→T) 아미노산에 돌연변이를 주어 최종적으로 H1-heavy(서열번호 40)와 H3-heavy(서열번호 41)를 구축하였다.

H4-heavy의 디자인을 위하여 인간항체의 골격(framework) 서열을 찾아 본 결과, AbF46 항체의 마우스 골격 서열과 서열이 매우 유사함과 동시에, 기존의 가장 안정하다고 알려진 VH3 subtype을 사용하여 Kabat numbering으로 정의된 마우스 항체 AbF46의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3를 도입하였다. 이를 통하여 H4-heavy (서열번호 42)를 구축하였다.

1.3.2. 경쇄의 인간화( Light chain humanization )

H1-light(서열번호 43) 및 H2-light(서열번호 44) 2종의 디자인을 위하여, Ig Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 통하여, 마우스 항체 AbF46의 VL 유전자와 가장 상동성이 높은 인간 생식선 유전자를 분석하였다. 그 결과, VK4-1이 아미노산 레벨에서 75%의 상동성을 가짐을 확인하였으며, 마우스 항체 AbF46의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3를 Kabat numbering으로 정의하고, 마우스 항체 AbF46의 CDR부분이 VK4-1의 골격에 도입되도록 디자인하였다. 이때, H1-light는 36번(Y→H), 46번(L→M), 49번(Y→I) 3개의 아미노산을 back-mutation 하였으며, H2-light는 49번 아미노산(Y→I) 1개만을 back-mutation 하여 구축하였다.

H3-light(서열번호 45)의 디자인을 위하여, Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 통하여 마우스 항체 AbF46의 VL 유전자와 가장 상동성이 높은 인간 생식선 유전자를 분석한 결과 중, 상기 VK4-1 이외에 VK2-40을 선정하였다. 마우스 항체 AbF46 VL과 VK2-40은 아미노산 레벨에서 61%의 상동성을 가짐을 확인하였으며, 마우스 항체 AbF46의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3를 Kabat numbering으로 정의하고, 마우스 항체 AbF46의 CDR부분이 VK4-1의 골격에 도입되도록 디자인하였다. 이때, H3-light는 36번(Y→H), 46번(L→M), 49번(Y→I) 3개의 아미노산을 back-mutation 하여 구축하였다.

H4-light(서열번호 46)의 디자인을 위하여, 인간항체의 골격(framework) 서열을 찾아 본 결과, 기존의 가장 안정하다고 알려진 Vk1 subtype을 사용하여 Kabat numbering으로 정의된 마우스 항체 AbF46의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3를 도입하였다. 이때, H4-light는 36번(Y→H), 46번(L→M), 49번(Y→I) 3개의 아미노산을 추가로 back-mutation 하여 구축하였다.

이후, Invitrogen 사의 OptiCHO^TM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVEC^TM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편(H1-heavy; 서열번호 47, H3-heavy; 서열번호 48, H4-heavy; 서열번호 49)을 pcDNA^TM3.3-TOPOTA Cloning Kit 에 상기 경쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편(H1-light; 서열번호 50, H2-light; 서열번호 51, H3-light; 서열번호 52, H4-light; 서열번호 53)을 각각 EcoRI(NEB, R0101S)과 XhoI(NEB, R0146S) 제한 효소를 사용하여, 클로닝함으로써, 인간화 항체의 발현을 위한 벡터를 구축하였다.

상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액 각 100 ml을 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출하였다. 이를 PBS buffer로 교환하여 최종적으로 인간화 항체 AbF46(이하, huAbF46로 명명함)을 정제하였다. 한편, 이후 실시예에서 사용한 인간화 항체 huAbF46의 중쇄, 경쇄 조합은 H4-heavy (서열번호 42) 및 H4-light(서열번호 46)이다.

1.4. huAbF46 항체의 scFv 라이브러리 제작

huAbF46 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 이용하여 huAbF46 항체의 scFv를 제작하기 위한 유전자를 디자인하였다. 각각의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 'VH-링커-VL'의 형태가 되도록 하고, 상기 링커는 'GLGGLGGGGSGGGGSGGSSGVGS'(서열번호 54)의 아미노산 서열을 가지도록 디자인하였다. 이렇게 디자인된 huAbF46 항체의 scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 55)를 바이오니아에 의뢰하여 합성하였으며, 이를 발현시키기 위한 벡터를 서열번호 56에 나타내었다.

이후, 상기 벡터로부터 발현된 결과물을 분석하여, c-Met에 특이적인 결합력을 보임을 확인하였다.

1.5. 친화도 성숙( affinity maturation )을 위한 라이브러리 유전자의 제작

1.5.1. 표적 CDR 의 선정 및 프라이머 제작

huAbF46 항체의 친화도 성숙(affinity maturation)을 위하여 6개의 상보성 결정 부위(complementary determining region, CDR)를 상기 제작된 마우스 항체 AbF46으로부터 'Kabat numbering'에 의하여 정의하였으며, 각각의 CDR은 하기 표 2과 같다.

CDR	아미노산 서열
CDR-H1	DYYMS(서열번호 1)
CDR-H2	FIRNKANGYTTEYSASVKG(서열번호 2)
CDR-H3	DNWFAY(서열번호 3)
CDR-L1	KSSQSLLASGNQNNYLA(서열번호 10)
CDR-L2	WASTRVS(서열번호 11)
CDR-L3	QQSYSAPLT(서열번호 12)

항체 CDR의 무작위 서열 도입을 위하여 다음과 같이 프라이머를 제작하였다. 기존의 무작위 서열 도입 방식은 돌연변이를 주고자 하는 부위에 동일한 비율의 염기 (25% A, 25% G, 25% C, 25% T)가 도입되도록 N 코돈을 이용하였으나, 본 실시예에서는 huAbF46 항체의 CDR에 무작위 염기를 도입하기 위하여, 각 CDR의 아미노산을 코딩하는 3개의 야생형(wild-type) 뉴클레오타이드 중 첫번째와 두번째 뉴클레오타이드의 85%는 그대로 보존하고, 나머지 3개의 염기를 각각 5%씩 도입하는 방식을 취하였다. 또한, 세 번째 뉴클레오타이드는 동일하게(33% G, 33% C, 33% T)가 도입되도록 프라이머를 디자인하였다.

1.5.2. huAbF46 항체의 라이브러리 제작 및 c- Met 에 대한 결합력 확인

CDR의 무작위 서열 도입을 통한 항체 라이브러리 유전자의 구축은 상기 참고예 1.5.1과 같은 방법으로 제작된 프라이머를 이용하여 수행하였다. 주형으로 huAbF46 항체의 scFv를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 이용하여, 도 1에 나타낸 방법과 같이 2개의 PCR 절편을 제작하고, 이를 중복 확장 중합효소연쇄반응(overlap extension PCR) 방법을 통하여, 원하는 CDR만 각각 돌연변이된 huAbF46 항체의 scFv 라이브러리 유전자를 확보하여 제작된 6개의 CDR을 각각 표적으로 하는 라이브러리들을 구축하였다.

이렇게 제작된 라이브러리는 야생형과 각 라이브러리의 c-Met에 대한 결합력을 확인하였으며,　각각의 라이브러리는 야생형에 비하여 c-Met에 대한 결합력이 대부분 낮아지는 경향을 보였으나, 일부 c-Met에 대한 결합력이 유지되는 돌연변이들을 확인하였다.

1.6. 제작된 라이브러리로부터 친화도가 개선된 항체의 선별

상기 구축된 라이브러리로부터 c-Met에 대한 라이브러리의 결합력을 향상시킨 후, 각각의 개별 클론으로부터 scFv의 유전자 서열을 분석하였다. 확보된 유전자 서열은 각각 하기 표 3과 같으며, 이를 IgG 형태로 변환하였다. 하기 클론 중에서, L3-1, L3-2, L3-3, L3-5으로부터 생산된 4종의 항체를 선별하여 후속 실험을 수행하였다.

클론 이름	도출된 라이브러리	CDR 서열
H11-4	CDR-H1	PEYYMS(서열번호 22)
YC151	CDR-H1	PDYYMS(서열번호 23)
YC193	CDR-H1	SDYYMS(서열번호 24)
YC244	CDR-H2	RNNANGNT(서열번호 25)
YC321	CDR-H2	RNKVNGYT(서열번호 26)
YC354	CDR-H3	DNWLSY(서열번호 27)
YC374	CDR-H3	DNWLTY(서열번호 28)
L1-1	CDR-L1	KSSHSLLASGNQNNYLA(서열번호 29)
L1-3	CDR-L1	KSSRSLLSSGNHKNYLA(서열번호 30)
L1-4	CDR-L1	KSSKSLLASGNQNNYLA(서열번호 31)
L1-12	CDR-L1	KSSRSLLASGNQNNYLA(서열번호 32)
L1-22	CDR-L1	KSSHSLLASGNQNNYLA(서열번호 33)
L2-9	CDR-L2	WASKRVS(서열번호 34)
L2-12	CDR-L2	WGSTRVS(서열번호 35)
L2-16	CDR-L2	WGSTRVP(서열번호 36)
L3-1	CDR-L3	QQSYSRPYT(서열번호 13)
L3-2	CDR-L3	GQSYSRPLT(서열번호 14)
L3-3	CDR-L3	AQSYSHPFS(서열번호 15)
L3-5	CDR-L3	QQSYSRPFT(서열번호 16)
L3-32	CDR-L3	QQSYSKPFT(서열번호 37)

1.7. 선별된 항체의 IgG 로의 변환

선별된 4종의 항체의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 'EcoRI-signal sequence-VH-NheI-CH-XhoI'(서열번호 38)로 구성되며, 중쇄의 경우 친화도 성숙 후에 항체의 아미노산이 변경되지 않았으므로, huAbF46 항체의 중쇄를 그대로 사용하였다. 다만, 힌지 영역(hinge region)은 인간 IgG1의 힌지가 아닌 U6-HC7 힌지(서열번호 57) 로 치환하였다. 경쇄는 'EcoRI-signal sequence-VL-BsiWI-CL-XhoI'로 구성되도록 각각 디자인하여 유전자를 합성하였으며, 친화도 성숙 후에 선별된 상기 4종 항체의 경쇄 가변영역을 포함하여 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 58 내지 서열번호 61)를 바이오니아에 의뢰하여 합성하였다. 이후, Invitrogen 사의 OptiCHO^TM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVEC^TM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편(서열번호 38)을, pcDNA^TM3.3-TOPOTA Cloning Kit(Cat no. 8300-01)에 상기 경쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편(L3-1 유래 CDR-L3를 포함하는 DNA 절편: 서열번호 58, L3-2 유래 CDR-L3를 포함하는 DNA 절편: 서열번호 59, L3-3 유래 CDR-L3를 포함하는 DNA 절편: 서열번호 60, L3-5 유래 CDR-L3를 포함하는 DNA 절편: 서열번호 61)을 각각 EcoRI(NEB, R0101S)과 XhoI(NEB, R0146S) 제한 효소를 사용하여 클로닝함으로써, 친화력 성숙된 항체의 발현을 위한 벡터를 구축하였다.

상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액 각 100 ml을 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출하였다. 이를 PBS buffer로 교환하여 최종적으로 친화력 성숙된 4종의 항체(이하, huAbF46-H4-A1(L3-1 유래), huAbF46-H4-A2 (L3-2 유래), huAbF46-H4-A3 (L3-3 유래), 및 huAbF46-H4-A5(L3-5 유래)로 명명함)를 정제하였다.

1.8. 불변영역 및/또는 힌지영역이 치환된 huAbF46 - H4 -A1의 제조

상기 참고예 1.7에서 선별된 4종의 항체 중에서, c-Met과의 결합친화도가 가장 높고, Akt 인산화 및 c-Met 분화 정도가 가장 낮은 것으로 측정된 huAbF46-H4-A1을 대상으로, 힌지영역 또는 불변영역 및 힌지영역이 치환된 항체를 제작하였다.

huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변영역, U6-HC7 힌지 및 인간의 IgG1 불변영역으로 이루어진 중쇄 및 huAbF46-H4-A1의 경쇄 가변영역 및 인간의 카파(kappa) 불변영역으로 이루어진 경쇄로 이루어진 항체를 huAbF46-H4-A1(U6-HC7)으로; huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변영역, 인간의 IgG2 힌지 및 인간의 IgG1 불변영역으로 이루어진 중쇄 및 huAbF46-H4-A1의 경쇄 가변영역 및 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 경쇄로 이루어진 항체를 huAbF46-H4-A1(IgG2 hinge)로; huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변영역, 인간의 IgG2 힌지 및 인간의 IgG2 불변영역으로 이루어진 중쇄 및 huAbF46-H4-A1의 경쇄 가변영역 및 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 경쇄로 이루어진 항체를 huAbF46-H4-A1(IgG2 Fc)로 각각 명명하였다. 또한, 한편, 상기 3종의 항체는 생산량 증대를 위하여 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 경쇄의 36번 히스티딘 (histidine)을 모두 티로신 (tyrosine)으로 치환하였다.

상기 3종 항체를 제작하기 위해, huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변영역, U6-HC7힌지 및 인간의 IgG1 불변영역으로 이루어진 폴리펩티드(서열번호 62)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 63), huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변영역, 인간의 IgG2 힌지 및 인간의 IgG1 불변영역으로 이루어진 폴리펩티드(서열번호 64)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 65), huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변영역, 인간의 IgG2 힌지 및 인간의 IgG2 불변영역으로 이루어진 폴리펩티드(서열번호 66)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 67), 36번 히스티틴이 티로신으로 치환된 huAbF46-H4-A1의 경쇄 가변영역 및 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 폴리펩티드(서열번호 68)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 69)를 바이오니아에 의뢰하여 합성하였다. 이후, Invitrogen 사의 OptiCHO^TM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVEC^TM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 염기서열을 갖는 DNA 절편을, pcDNA^TM3.3-TOPOTA Cloning Kit(Cat no. 8300-01)에 상기 경쇄에 해당하는 염기서열을 갖는 DNA 절편을 삽입하여, 상기 항체의 발현을 위한 벡터를 구축하였다.

상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액 각 100 ml을 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출하였다. 이를 PBS buffer로 교환하여 최종적으로 3종의 항체(huAbF46-H4-A1(U6-HC7), huAbF46-H4-A1(IgG2 hinge), huAbF46-H4-A1(IgG2 Fc))를 정제하였다. 이 중에서 본 발명에 따른 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체를 대표하여 huAbF46-H4-A1(IgG2 Fc)을 선택하여 하기의 실시예에 사용하였으며, 편의상 상기 항체를 L3-1Y 항체로 명명하였다.

실시예 1: 항 EGFR scFv 의 제작

EGFR에 결합하는 항 EGFR scFv는 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역 사이에 (GGGGS)₃ 펩타이드 링커를 넣어서 제작하였다.

구체적으로, 자동화 유전자 합성(㈜바이오니아에 의뢰)으로 인간화 항 EGFR 항체 중쇄가변부위 (서열번호 109) 코딩 DNA 서열(서열번호 110)과 경쇄가변부위(서열번호 111) 코딩 DNA 서열(서열번호 112)에 (GGGGS)₃ linker peptide 코딩 DNA 서열을 첨가하여 항 EGFR 항체의 scFv (ME01 scFv) 코딩 DNA를 합성하였다.

한편, 중쇄가변부위(서열번호 109)의 51번 아미노산 F를 I로, 44번 아미노산 G를 C로, 62번 아미노산 Q를 S로, 경쇄가변부위 (서열번호 111)의 46번 아미노산 R을 L로, 83번 아미노산 F를 E로, 100번 G를 C로 치환하여 사용한 것을 제외하고, 상기와 동일한 방법으로 변형된 항 EGFR scFv (중쇄가변부위: 서열번호 113; 경쇄가변부위: 서열번호 114; ME03S scFv) 코딩 DNA를 제작하였다. 상기 항체 내 아미노산 위치는 kabat numbering에 따랐다.

또한, 자동화 유전자 합성(㈜바이오니아에 의뢰)으로 인간화 항 EGFR 항체 중쇄 가변 영역 (서열번호 121)의 44번째 아미노산 G를 C로 치환한 서열번호 122의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열과 경쇄 가변 영역(서열번호 123)의 103번째 아미노산 G를 C로 치환한 서열번호 124의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열에 (GGGGS)₃ linker peptide 코딩 DNA 서열을 첨가하여 항 EGFR 항체의 scFv (ME22S scFv) 코딩 DNA를 합성하였다. 상기 항체 내 아미노산 위치는 kabat numbering에 따랐다.

실시예 2: 항 c- Met /항 EGFR 이중 특이 항체의 제작

상기 참고예 1에서 제작된 항 cMet 항체 L3-1Y의 Fc의 c-말단에 상기 실시예 1에서 제작된 항 EGFR scFv (ME-01 scFv, ME-03S scFv, ME22S scFv)를 융합하여 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체를 제작하였다.

구체적으로, Invitrogen 사의 OptiCHO^TM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pcDNA^TM3.3-TOPOTA Cloning Kit(Cat no. 8300-01)에 상기 참고예 1에서 제작된 항 c-Met 항체 L3-1Y의 중쇄에 해당하는 염기서열(서열번호 66)을 갖는 DNA 절편을 삽입하고, pOptiVEC^TM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 항 c-Met 항체 L3-1Y의 경쇄에 해당하는 염기서열(서열번호 68)을 갖는 DNA 절편을 삽입하였다. 이후, pcDNA^TM3.3 에 삽입된 L3-1Y의 Fc의 c-말단에 상기 실시예 1에서 준비된 항 EGFR scFv의 코딩 DNA를 (G4S)2로 이루어진 10개의 아미노산 길이를 가진 linker pepetide의 코딩 DNA 서열을 사용하여 융합함으로써 이중항체의 발현을 위한 벡터를 구축하였다.

상기 구축된 벡터를 각각 Qiagen Maxiprep kit (Cat no. 12662)을 이용하여 증폭하였으며, 임시발현은 Freestyle^TM MAX 293 Expression System (invitrogen)을 이용하여 진행 되었다. 사용된 세포주는 293 F cell 이며, FreeStyle™ 293 Expression Medium를 배지로 사용하여 부유배양방식으로 배양되었다. 임시발현 하루 전 세포를 5x10⁵cells/ml의 농도로 준비한 후, 24시간이 지난 뒤 cell수가 1x10⁶cells/ml이 되었을 때 임시발현을 진행하였다. Freestyle^TM MAX reagent (invitrogen)을 사용한 liposomal reagent법으로 형질도입(transfection)을 진행 하였으며, 15ml tube에 중쇄 DNA: 경쇄 DNA=3:2 의 비율로 DNA를 준비하여 OptiPro™ SFM (invtrogen) 2ml과 mix하고(A), 또 다른 15ml tube에 Freestyle^TM MAX reagent 100㎕와 OptiPro™ SFM 2ml을 mix(B)한 후, (A)와 (B)을 mix하여 15분간 incubation 한 후, 하루 전에 준비한 세포에 혼합액을 천천히 섞어주었다. 형질도입 완료 후, 37 ℃, 80% humidity, 8% CO₂ _,130 rpm incubator에서 5일간 배양하였다.

상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액 각 100 ml을 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출하였다. 이를 PBS buffer로 교환하여 최종적으로 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체를 정제하였다.

상기 제작된 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체를 각각 ME01, ME03S, 및 ME22S로 명명하였다.

또한, 상기 참고예 1에서 제작된　　L3-1Y의 c-말단에 4종의 항 EGFR DARPins (서열번호 125)을 각각 융합시켜 4종의 항 c-Met 항체/항 EGFR DARPin 융합체(항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체)를 제작하였다. L3-1Y 항체의 중쇄와 항 EGFR DARpin은 10개의 아미노산으로 구성된 'GGGGSGGGGS' (G4S)2 링커를 이용하여 'L3-1Y 중쇄-(G4S)2-항 EGFR DARPins'의 형태로 제작하였다.

항 EGFR DARPin-01 (서열번호 125):

상기 제작된 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체를 ME-19로 명명하였다. 상기 항체는 Biacore T100(GE) 사용하여 측정된 EGFR (R&D Systems)에 대한 친화도(Kd)가 약 0.35nM 정도로 나타났다.

실시예 3: K- Ras 변이 결장암 세포(K- Ras mutant colorectal cancer cell lines) ( Lovo 세포주) 증식 저해 효과 확인

상기 실시예 2에서 제작된 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체인 ME-19 또는 ME22S와 c-Src 저해제인 다사티닙(dasatinib) 또는 사라카티닙(saracatinib)의 병용 투여효과를 K-Ras 변이 결장암 세포주 (Lovo 세포주)에서 확인하였다.

Lovo 세포주는 ATCC에서 구입하였다 (ATCC CCL-229). 상기 Lovo 세포주는 K-Ras 변이 (K-Ras overexpression)을 포함한다 (http://www.atcc.org/products/all/CCL-229.aspx#85786B46AA23451B94BC5D45200673F7 참조). 상기 세포를 시험시까지 10%(v/v) FBS가 들어있는 RPMI1640 배지(GIBCO)에서 5% CO₂ 및 37℃의 조건 하에서 보관하였다. 세포 증식 assay는 다음과 같은 방법으로 수행하였다.

구체적으로,　96well plate에 10% FBS가 들어있는 RPMI1640 배지(GIBCO)를 넣고 Lovo 세포(ATCC)를 5,000 cells/well의 양으로 시딩한 후, 37℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 다음날(24시간 후), 상기 배양된 세포에　L3-1Y 항체 (c-Met mAb; 참고예 1) 5ug/ml, 어비툭스 (erbitux; EGFR mAb; Merck Serono, Germany) 5ug/ml, L3-1Y 항체 5ug/ml + 어비툭스 5ug/ml, ME19 또는 ME22S (c-Met/EGFR bsAb; 실시예 2) 5ug/ml, 다사티닙 (c-Src 저해제; S1021, Selleckchem, US) 30nM, 다사티닙 30nM + L3-1Y 항체 5ug/ml, 다사티닙 30nM + 어비툭스 5ug/ml, 다사티닙 30nM + L3-1Y 항체 5ug/ml + 어비툭스 5ug/ml, 및 다사티닙 30nM + ME19 또는 ME22S 5ug/ml를 각각 처리하였다. 이 때, HGF (#294-HG/CF, R&D SYSTEMS, Minneapolis, MN) 100ng/ml와 EGF (#236-EG, R&D SYSTEMS, Minneapolis, MN) 100ng/ml를 상기 배양물에 함께 처리하였다.

상기 처리 72시간 후에, Cell Counting Kit-8 용액 (Dojindo Molecular Technologies, Gaithersburg, MD)　10 uL(microliter)를 각 웰에 첨가한 후, 실온에서 2시간 방치하였다. 세포 수는 발광 신호를 통해 계수하며 발광 신호는 Envision 2104 Multi-label Reader (Perkin Elmer)를 사용하여 기록하였다. 얻어진 data는 T-test를 통하여 유의성을 확인하였다 (SigmaPlot 12.3; Systat Software Inc., Chicago, IL; ***: P-value <0.001; **: P-value <0.01; *: P-value <0.05).

상기 얻어진 결과를 도 2 (ME19) 및 도 3(ME22S)에 나타내었다. 도 2 및 도 3에서 보여지는 바와 같이, K-Ras 변이 Lovo 세포에 있어서, 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체 ME19 또는 ME22S와 c-Src 저해제 다사티닙(DA로 표시)를 병용 처리하는 경우, 이들을 각각 단독 처리하는 경우와 비교하여, 현저한 세포 증식 억제 효과가 얻어짐을 확인할 수 있다. 또한, L3-1Y 항체(S로 표시)와 어비툭스(ERBITUX 또는 E로 표시)를 단독 처리하거나 병용 처리하는 경우 오히려 세포 증식이 증가되는 효과가 나타나는 것을 확인할 수 있다. 이러한 결과는 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체와 c-Src 저해제와의 병용 투여에 의하여 K-Ras 변이 암세포에 대한 현저한 항암 효과를 얻을 수 있음을 보여주는 것이다. 또한, 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체 (ME-19 또는 ME22S)와 c-Src 저해제 다사티닙(DA로 표시)를 병용 처리하는 경우, 이중 특이 항체가 아닌 항 c-Met 항체(S)와 항 EGFR 항체(E)를 c-Src 저해제(DA)와 함께 병용 처리하는 경우와 비교하여, 현저한 암세포 증식 억제 효과를 보임이 확인되었으며, 이는 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체와 c-Src 저해제를 병용 투여함으로써 상기 3개 표적에 대한 각각의 약물을 병용 투여하는 경우보다 현저한 항암 효과를 얻을 수 있음을 입증하는 것이다.

또한, 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체 처리량 또는 다사티닙 또는 사라카티닙의 처리량에 따른 세포 증식 저해 효과를 시험하였다.

우선, 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체 처리량에 따른 증식 저해 효과를 시험하기 위하여, 다사티닙의 처리량은 30nM로 고정시키고, 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체 처리량을 달리하며 시험하였다. 　구체적으로, 96well plate에 10% FBS가 들어있는 RPMI1640 배지(GIBCO)를 넣고 Lovo 세포(ATCC, CCL-229)를 5,000 cells/well의 양으로 시딩한 후, 37℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 다음날(24시간 후), 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체 ME19 또는 ME22S를 농도를 달리하여 (ME-19: 10, 1, 0.1, 0.01 ug/ml, ME22S: 1, 0.1, 0.01 ug/ml), 단독 또는 다사티닙 (c-Src 저해제; S1021, Selleckchem, US) 30nM와 함께, 처리하였다. 이 때, HGF (#294-HG/CF, R&D SYSTEMS, Minneapolis, MN) 100ng/ml와 EGF (#236-EG, R&D SYSTEMS, Minneapolis, MN) 100ng/ml를 상기 배양물에 함께 처리하였다.

상기 처리 72시간 후에, Cell Counting Kit-8 용액 (Dojindo Molecular Technologies, Gaithersburg, MD)　10 uL(microliter)를 각 웰에 첨가한 후, 실온에서 2시간 방치하였다. 세포 수는 발광 신호를 통해 계수하며 발광 신호는 Envision 2104 Multi-label Reader (Perkin Elmer)를 사용하여 기록하였다. 얻어진 data는 ANOVA를 통하여 유의성을 확인하였다 (SigmaPlot 12.3; Systat Software Inc., Chicago, IL; ***: P-value <0.001; **: P-value <0.01; *: P-value <0.05).

상기 얻어진 결과를 도 4 (ME19) 및 도 5(ME22S)에 나타내었다. 도 4 및 도 5에서 보여지는 바와 같이, 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체와 c-Src 저해제를 병용 투여한 경우, 상기 항체를 단독 투여한 경우와 비교하여, 현저한 상승 효과가 나타남은 물론이고, 이러한 상승 효과 (병용투여시 효과와 단독 투여시 효과의 차이)는 항체의 용량 의존적으로 나타나는 것으로 확인되었다.

또한, 다사티닙 또는 사라카티닙의 처리량에 따른 증식 저해 효과를 시험하기 위하여, 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체(ME22S)의 처리량은 5 ug/ml로 고정시키고, c-Src 저해제인 다사티닙 또는 사라카티닙의 처리량을 0 (control), 10, 100, 1000 nM로 달리하며 시험하였다. 본 시험은 항체 처리량과 c-Src 저해제의 처리량을 제외하고, 앞서 설명한 항체 처리량에 따른 세포 증식 저해 시험과 동일하게 수행하였다. 구체적으로, 96well plate에 10% FBS가 들어있는 RPMI1640 배지(GIBCO)를 넣고 Lovo 세포(ATCC, CCL-229)를 5,000 cells/well의 양으로 시딩한 후, 37℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 다음날(24시간 후), c-Src 저해제인 다사티닙(S1021, Selleckchem, US) 또는 사라카티닙(S1006, Selleckchem, US)을 농도를 달리하여 (0 (control), 10, 100, 1000 nM), 단독 또는 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체 ME22S 5 ug/ml와 함께, 처리하였다. 이 때, HGF (#294-HG/CF, R&D SYSTEMS, Minneapolis, MN) 100ng/ml와 EGF (#236-EG, R&D SYSTEMS, Minneapolis, MN) 100ng/ml를 상기 배양물에 함께 처리하였다.

상기 얻어진 결과를 도 6 (다사티닙) 및 도 7(사라카티닙)에 나타내었다. 　도 6 및 도 7에서 보여지는 바와 같이, c-Src 저해제와 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체를 병용 투여한 경우, 상기 c-Src 저해제를 단독 투여한 경우와 비교하여, 현저한 상승 효과가 나타남은 물론이고, 이러한 상승 효과 (병용투여시 효과와 단독 투여시 효과의 차이)는 대체적으로 c-Src 저해제의 용량 의존적으로 나타나는 것으로 확인되었다.

실시예 4: EGFR T790M 변이된 비소세포성 폐암 세포( T790M mutant non - small cell lung cancer cell lines ) ( H820 세포주) 증식 저해 효과 확인

상기 실시예 2에서 제작된 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체인 ME-19와 c-Src 저해제인 다사티닙(dasatinib)의 병용 투여효과를 EGFR T790M 변이된 비소세포성 폐암 세포주(H820 세포주)에서 확인하였다.

H820 세포주는 ATCC에서 구입하였다. 상기 H820 세포는 EGFR T790M 변이를 포함한다. 상기 세포를 시험시까지 10%(v/v) FBS가 들어있는 RPMI1640 배지(GIBCO)에서 5% CO₂ 및 37℃의 조건 하에서 보관하였다. 세포 증식 assay는 다음과 같은 방법으로 수행하였다.

구체적으로,　96well plate에 10% FBS가 들어있는 RPMI1640 배지(GIBCO)를 넣고 Lovo 세포(ATCC)를 5,000 cells/well의 양으로 시딩한 후, 37℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 다음날(24시간 후), 상기 배양된 세포에　L3-1Y 항체 (c-Met mAb; 참고예 1) 5ug/ml, 어비툭스 (erbitux; EGFR mAb; Merck Serono, Germany) 5ug/ml, L3-1Y 항체 5ug/ml + 어비툭스 5ug/ml, ME19 또는 ME22S 5ug/ml, 다사티닙(c-Src 저해제; S1021, Selleckchem, US) 5nM 또는 30nM, 다사티닙 5nM 또는 30nM + L3-1Y 항체 5ug/ml, 다사티닙 5nM 또는 30nM + 어비툭스 5ug/ml, 다사티닙 5nM 또는 30nM + L3-1Y 항체 5ug/ml + 어비툭스 5ug/ml, 및 다사티닙 5nM 또는 30nM + ME19 또는 ME22S 5ug/ml를 각각 처리하였다. 또한 상기와 같은 방법으로 L3-1Y 항체 ME19 또는 ME22S의 처리 농도를 0 또는 5ug/ml로 하고, 다사티닙 또는 사라카티닙을 다양한 농도 (다사티닙: 0, 1, 10, 100, 또는 1000 nM; 사라카티닙: 0, 10, 100, 1000, 또는 10000 nM)로 처리하거나, 다사티닙의 처리 농도를 0 또는 30nM로 하고, L3-1Y 항체 ME19의 처리 농도를 0, 0.01, 0.1, 1 또는 10 ug/ml로 변화시키면서 처리하였다. 이 때, HGF(#294-HG/CF, R&D SYSTEMS, Minneapolis, MN) 100ng/ml와 EGF (#236-EG, R&D SYSTEMS, Minneapolis, MN) 100ng/ml를 상기 배양물에 함께 처리하였다.

상기 얻어진 결과를 도 8(ME19 5ug/ml, 다사티닙 30nM), 도 9(ME19 5ug/ml, 다사티닙 5nM), 도 10(ME19 0, 0.01, 0.1, 1 또는 10 ug/ml, 다사티닙 0 또는 30nM), 도 11 (ME22 0 또는 5ug/ml, 다사티닙 0, 1, 10, 100, 또는 1000 nM) 및 도 12 (ME22 0 또는 5ug/ml, 사라카티닙 0, 10, 100, 1000, 또는 10000 nM)에 나타내었다.

도 8 및 도 9에서 보여지는 바와 같이, EGFR T790M 변이 H820 세포에 있어서, 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체와 c-Src 저해제 다사티닙(DA로 표시)를 병용 처리하는 경우, 이들을 각각 단독 처리하는 경우와 비교하여, 현저한 세포 증식 억제 효과가 얻어짐을 확인할 수 있다. 또한, L3-1Y 항체(S로 표시)와 어비툭스(ERBITUX 또는 E로 표시)를 단독 처리하거나 병용 처리하는 경우 오히려 세포 증식이 증가되는 효과가 나타나는 것을 확인할 수 있다. 이러한 결과는 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체와 c-Src 저해제와의 병용 투여에 의하여 EGFR T790M 변이 암세포에 대한 현저한 항암 효과를 얻을 수 있음을 보여주는 것이다. 또한, 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체와 c-Src 저해제 다사티닙(DA로 표시)를 병용 처리하는 경우, 이중 특이 항체가 아닌 항 c-Met 항체(S)와 항 EGFR 항체(E)를 c-Src 저해제(DA)와 함께 병용 처리하는 경우와 비교하여, 현저한 암세포 증식 억제 효과를 보임이 확인되었으며, 이는 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체와 c-Src 저해제를 병용 투여함으로써 상기 3개 표적에 대한 각각의 약물을 병용 투여하는 경우보다 현저한 항암 효과를 얻을 수 있음을 입증하는 것이다.

또한, 도 10 내지 도 12는 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체 또는 c-Src 저해제 중 어느 하나의 처리량을 고정시키고, 다른 하나의 농도를 0(무처리)에서부터 변화시키면서 측정한 세포 증식 저해 정도를 보여주는 것이다. 도 10에서 보여지는 바와 같이, c-Src 저해제의 농도를 0 또는 30nM로 고정하고 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체를 농도를 달리하면서 처리할 때, 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체만 처리하는 경우 (c-Src 저해제의 농도가 0인 경우) 또는 c-Src 저해제만 처리하는 경우 (ME19의 농도가 0인 경우)와 비교하여, 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체와 c-Src 저해제를 병용 처리하는 경우에 현저한 세포 증식 저해 효과가 얻어짐은 물론이고, 이러한 증식 저해 효과는 대체적으로 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체의 농도 의존적인 양상을 보였다. 또한 도 11 및 도 12에서 보여지는 바와 같이, 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체 의 농도를 0 또는 5ug/ml로 고정하고 c-Src 저해제를 농도를 달리하면서 처리할 때, 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체만 처리하는 경우 (c-Src 저해제의 농도가 0인 경우; Ctrl) 또는 c-Src 저해제만 처리하는 경우 (ME22S의 농도가 0인 경우)와 비교하여, 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체와 c-Src 저해제를 병용 처리하는 경우에 현저한 세포 증식 저해 효과가 얻어짐은 물론이고, 이러한 증식 저해 효과는 대체적으로 c-Src 저해제의 농도 의존적인 양상을 보였다.

실시예 5: K- Ras 변이 결장암 세포(K- Ras mutant colorectal cancer cell lines) ( HCT -116 세포주) 증식 저해 효과 확인

상기 실시예 2에서 제작된 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체인 ME-19, 또는 ME22S와 c-Src 저해제인 다사티닙(dasatinib) 또는 사라카티닙(saracatinib)의 병용 투여효과를 K-Ras 변이 결장암 세포주 (HCT-116)에서 확인하였다.

HCT-116 세포주는 ATCC에서 구입하였다 (ATCC CCL-247). 상기 Lovo 세포주는 K-Ras 변이을 포함한다 (www.atcc.org/products/all/CCL-247.aspx 참조). 상기 세포를 시험시까지 10%(v/v) FBS가 들어있는 RPMI1640 배지(GIBCO)에서 5% CO₂ 및 37℃의 조건 하에서 보관하였다. 세포 증식 assay는 다음과 같은 방법으로 수행하였다.

구체적으로,　96-well plate에 10% FBS가 들어있는 RPMI-1640 배지(GIBCO)를 넣고 HCT-116 세포(ATCC)를 5,000 cells/well의 양으로 시딩한 후, 37℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 다음날(24시간 후), 상기 배양된 세포에　L3-1Y 항체 5ug/ml, 어비툭스 (erbitux; EGFR mAb; Merck Serono, Germany) 5ug/ml, L3-1Y 항체 5ug/ml + 어비툭스 5ug/ml, ME19 5ug/ml, 다사티닙 (c-Src 저해제; S1021, Selleckchem, US) 5nM, 다사티닙 5nM + L3-1Y 항체 5ug/ml, 다사티닙 5nM + 어비툭스 5ug/ml, 다사티닙 5nM + L3-1Y 항체 5ug/ml + 어비툭스 5ug/ml, 및 다사티닙 5nM + ME19 5ug/ml를 각각 처리하였다. 이 때, HGF (#294-HG/CF, R&D SYSTEMS, Minneapolis, MN) 100ng/ml와 EGF (#236-EG, R&D SYSTEMS, Minneapolis, MN) 100ng/ml를 상기 배양물에 함께 처리하였다.

상기 얻어진 결과를 도 13에 나타내었다. 도 13에서 보여지는 바와 같이, K-Ras 변이 HCT-116 세포에 있어서, 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체 ME19와 c-Src 저해제 다사티닙(DA로 표시)를 병용 처리하는 경우, 이들을 각각 단독 처리하는 경우와 비교하여, 현저한 세포 증식 억제 효과가 얻어짐을 확인할 수 있다. 이러한 결과는 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체와 c-Src 저해제와의 병용 투여에 의하여 K-Ras 변이 암세포에 대한 현저한 항암 효과를 얻을 수 있음을 보여주는 것이다. 또한, 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체와 c-Src 저해제 다사티닙(DA로 표시)를 병용 처리하는 경우, 이중 특이 항체가 아닌 항 c-Met 항체(S)와 항 EGFR 항체(E)를 c-Src 저해제(DA)와 함께 병용 처리하는 경우와 비교하여, 현저한 암세포 증식 억제 효과를 보임이 확인되었으며, 이는 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체와 c-Src 저해제를 병용 투여함으로써 상기 3개 표적에 대한 각각의 약물을 병용 투여하는 경우보다 현저한 항암 효과를 얻을 수 있음을 입증하는 것이다.

또한, 다사티닙 또는 사라카티닙의 처리량에 따른 세포 증식 저해 효과를 시험하였다.

구체적으로, 96-well plate에 10% FBS가 들어있는 RPMI1640 배지(GIBCO)를 넣고 HCT-116 세포(ATCC, CCL-247)를 5,000 cells/well의 양으로 시딩한 후, 37℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 다음날(24시간 후), c-Src 저해제인 다사티닙(S1021, Selleckchem, US) 또는 사라카티닙(S1006, Selleckchem, US)을 농도를 달리하여 (다사티닙: 0 (control), 10, 100, 1000 nM, 사라카티닙: 0 (control), 10, 100, 1000, 10000 nM), 단독 또는 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체 ME22S 5 ug/ml와 함께, 처리하였다. 이 때, HGF (#294-HG/CF, R&D SYSTEMS, Minneapolis, MN) 100ng/ml와 EGF (#236-EG, R&D SYSTEMS, Minneapolis, MN) 100ng/ml를 상기 배양물에 함께 처리하였다.

상기 얻어진 결과를 도 14 (다사티닙) 및 도 15 (사라카티닙)에 나타내었다. 　도 14 및 도 15에서 보여지는 바와 같이, c-Src 저해제와 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체를 병용 투여한 경우, 상기 c-Src 저해제를 단독 투여한 경우와 비교하여, 유의한 상승 효과가 나타나며, 이러한 효과는 대체적으로 c-Src 저해제의 농도 의존적임을 확인할 수 있다.

또한, 96-well plate에 1% FBS가 들어있는 RPMI-1640 배지(GIBCO)를 넣고 HCT-116 세포(ATCC)를 5,000 cells/well의 양으로 시딩한 후, 37℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 다음날(24시간 후), 상기 배양된 세포에　ME19 5ug/ml 또는 M22S 5ug/ml와 다사티닙 0, 10, 100 또는 1000 nM을 처리하였다. 이 때, HGF (#294-HG/CF, R&D SYSTEMS, Minneapolis, MN) 100ng/ml와 EGF (#236-EG, R&D SYSTEMS, Minneapolis, MN) 100ng/ml를 상기 배양물에 함께 처리하였다. 72시간 후, 도립현미경 (inverted microscopy; Model: Nikon ECLIPSE Ti-U; object lens: 10X)을 사용하여 관찰하였다.

상기 얻어진 결과를 도 16에 나타내었다. 도 16에서 보여지는 바와 같이, c-Src 저해제와 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체를 병용 처리하는 경우, 이들을 단독 처리한 경우와 비교하여, 세포 형태가 규칙적이고 정상화되는 것을 확인할 수 있다.

실시예 6: EGFR T790M 변이된 비소세포성 폐암 세포( T790M mutant non - small cell lung cancer cell lines ) ( H1975 세포주) 증식 저해 효과 확인

상기 실시예 2에서 제작된 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체인 ME22S와 c-Src 저해제인 다사티닙(dasatinib), 사라카티닙(saracatinib), 또는 보수티닙(bosutinib)와의 병용 투여 효과를 EGFR T790M 변이된 비소세포성 폐암 세포주 (H1975)에서 확인하였다.

H1975 세포주는 ATCC에서 구입하였다 (ATCC CRL-5908). 상기 H1975 세포는 EGFR T790M 변이를 포함한다 (http://www.atcc.org/products/all/CRL-5908.aspx x 참조). 상기 세포를 시험시까지 10%(v/v) FBS가 들어있는 RPMI1640 배지(GIBCO)에서 5% CO₂ 및 37℃의 조건 하에서 보관하였다. 세포 증식 assay는 다음과 같은 방법으로 수행하였다.

다사티닙, 사라카티닙, 또는 보수티닙의 처리량에 따른 세포 증식 저해 효과를 시험하였다.

구체적으로, 96well plate에 10% FBS가 들어있는 RPMI1640 배지(GIBCO)를 넣고 H1975 세포(ATCC, CCL-5908)를 5,000 cells/well의 양으로 시딩한 후, 37℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 다음날(24시간 후), c-Src 저해제인 다사티닙(S1021, Selleckchem, US), 사라카티닙(S1006, Selleckchem, US), 또는 보수티닙(S1014, Selleckchem, US)을 농도를 달리하여 (0 (control), 10, 100, 1000 nM), 단독 또는 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체 ME22S 5 ug/ml와 함께, 처리하였다. 이 때, HGF (#294-HG/CF, R&D SYSTEMS, Minneapolis, MN) 100ng/ml와 EGF (#236-EG, R&D SYSTEMS, Minneapolis, MN) 100ng/ml를 상기 배양물에 함께 처리하였다.

상기 얻어진 결과를 도 17 (다사티닙), 도 18 (사라카티닙), 및 도 19 (보수타닙)에 나타내었다. 　도 17 내지 도 19에서 보여지는 바와 같이, c-Src 저해제와 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체를 병용 투여한 경우, 상기 c-Src 저해제를 단독 투여한 경우와 비교하여, 유의한 상승 효과가 나타나며, 이러한 효과는 대체적으로 c-Src 저해제의 농도 의존적임을 확인할 수 있다

한국세포주연구재단

KCLRFBP00220

20091006

<110> Samsung Electronics Co. Ltd <120> Pharmaceutical composition for combination therapy containing bispecific anti-c-Met/anti-FGFR antibody and c-Src inhibitor <130> DPP20132766KR <160> 128 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR1 of AbF46 <400> 1 Asp Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR2 of AbF46 <400> 2 Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR3 of AbF46 <400> 3 Asp Asn Trp Phe Ala Tyr 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR1 of c-Met antibody <220> <221> UNSURE <222> (1) <223> X is Pro or Ser or absent <220> <221> UNSURE <222> (2) <223> X is Glu or Asp <400> 4 Xaa Xaa Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR2 of c-Met antibody <220> <221> UNSURE <222> (3) <223> X 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tcctgggggg accgtcagtc 720 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1080 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320 ctctccctgt ctccgggtaa atgactcgag 1350 <210> 49 <211> 1350 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of H4-heavy <400> 49 gaggttcagc tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg 60 tcctgtgcag cttctggctt caccttcact gattactaca 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ggagtacaag 960 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1080 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320 ctctccctgt ctccgggtaa atgactcgag 1350 <210> 50 <211> 669 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of H1-light <400> 50 gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcaactgca agtccagcca gagtctttta gctagcggca accaaaataa ctacttagct 120 tggcaccagc agaaaccagg acagcctcct aagatgctca ttatttgggc atctacccgg 180 gtatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaatc ctatagtgct 300 cctctcacgt tcggaggcgg taccaaggtg gagatcaaac gtacggtggc tgcaccatct 360 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 420 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 480 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 540 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 600 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 660 tgactcgag 669 <210> 51 <211> 669 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of H2-light <400> 51 gatattgtga tgacccagac tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcctgca agtccagtca gagtctttta gctagtggca accaaaataa ctacttggcc 120 tggcacctgc agaagccagg gcagtctcca cagatgctga tcatttgggc atccactagg 180 gtatctggag tcccagacag gttcagtggc agtgggtcag gcactgattt cacactgaaa 240 atcagcaggg tggaggctga ggatgttgga gtttattact gccagcagtc ctacagcgct 300 ccgctcacgt tcggacaggg taccaagctg gagctcaaac gtacggtggc tgcaccatct 360 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 420 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 480 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 540 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 600 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 660 tgactcgag 669 <210> 52 <211> 669 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of H3-light <400> 52 gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcaactgca agtccagcca gagtctttta gctagcggca accaaaataa ctacttagct 120 tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca ttatttgggc atctacccgg 180 gtatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaatc ctatagtgct 300 cctctcacgt tcggaggcgg taccaaggtg gagatcaaac gtacggtggc tgcaccatct 360 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 420 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 480 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 540 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 600 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 660 tgactcgag 669 <210> 53 <211> 669 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of H4-light <400> 53 gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc 60 atcacctgca agtccagtca gagtctttta gctagtggca accaaaataa ctacttggcc 120 tggcaccaac agaaaccagg aaaagctccg aaaatgctga ttatttgggc atccactagg 180 gtatctggag tcccttctcg cttctctgga tccgggtctg ggacggattt cactctgacc 240 atcagcagtc tgcagccgga agacttcgca acttattact gtcagcagtc ctacagcgct 300 ccgctcacgt tcggacaggg taccaaggtg gagatcaaac gtacggtggc tgcaccatct 360 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 420 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 480 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 540 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 600 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 660 tgactcgag 669 <210> 54 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker between VH and VL <400> 54 Gly Leu Gly Gly Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Ser Ser Gly Val Gly Ser 20 <210> 55 <211> 1088 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding scFv of huAbF46 antibody <400> 55 gctagcgttt tagcagaagt tcaattggtt gaatctggtg gtggtttggt tcaaccaggt 60 ggttctttga gattgtcttg tgctgcttct ggttttactt tcaccgatta ttacatgtcc 120 tgggttagac aagctccagg taaaggtttg gaatggttgg gtttcattag aaacaaggct 180 aacggttaca ctaccgaata ttctgcttct gttaagggta gattcaccat ttctagagac 240 aactctaaga acaccttgta cttgcaaatg aactccttga gagctgaaga tactgctgtt 300 tattactgcg ctagagataa ttggtttgct tattggggtc aaggtacttt ggttactgtt 360 tcttctggcc tcgggggcct cggaggagga ggtagtggcg gaggaggctc cggtggatcc 420 agcggtgtgg gttccgatat tcaaatgacc caatctccat cttctttgtc tgcttcagtt 480 ggtgatagag ttaccattac ttgtaagtcc tcccaatctt 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gttaatatac 420 ctctatactt taacgtcaag gagaaaaaac cccggatcgg actactagca gctgtaatac 480 gactcactat agggaatatt aagctaattc tacttcatac attttcaatt aagatgcagt 540 tacttcgctg tttttcaata ttttctgtta ttgctagcgt tttagcagaa gttcaattgg 600 ttgaatctgg tggtggtttg gttcaaccag gtggttcttt gagattgtct tgtgctgctt 660 ctggttttac tttcaccgat tattacatgt cctgggttag acaagctcca ggtaaaggtt 720 tggaatggtt gggtttcatt agaaacaagg ctaacggtta cactaccgaa tattctgctt 780 ctgttaaggg tagattcacc atttctagag acaactctaa gaacaccttg tacttgcaaa 840 tgaactcctt gagagctgaa gatactgctg tttattactg cgctagagat aattggtttg 900 cttattgggg tcaaggtact ttggttactg tttcttctgg cctcgggggc ctcggaggag 960 gaggtagtgg cggaggaggc tccggtggat ccagcggtgt gggttccgat attcaaatga 1020 cccaatctcc atcttctttg tctgcttcag ttggtgatag agttaccatt acttgtaagt 1080 cctcccaatc tttgttggct tctggtaatc agaacaatta cttggcttgg catcaacaaa 1140 aaccaggtaa agctccaaag atgttgatta tttgggcttc taccagagtt tctggtgttc 1200 catctagatt ttctggttct ggttccggta ctgattttac tttgaccatt tcatccttgc 1260 aaccagaaga tttcgctact tactactgtc aacaatctta ctctgctcca ttgacttttg 1320 gtcaaggtac aaaggtcgaa atcaagagag aattcggtaa gcctatccct aaccctctcc 1380 tcggtctcga ttctacgggt ggtggtggat ctggtggtgg tggttctggt ggtggtggtt 1440 ctcaggaact gacaactata tgcgagcaaa tcccctcacc aactttagaa tcgacgccgt 1500 actctttgtc aacgactact attttggcca acgggaaggc aatgcaagga gtttttgaat 1560 attacaaatc agtaacgttt gtcagtaatt gcggttctca cccctcaaca actagcaaag 1620 gcagccccat aaacacacag tatgtttttt gagtttaaac ccgctgatct gataacaaca 1680 gtgtagatgt aacaaaatcg actttgttcc cactgtactt ttagctcgta caaaatacaa 1740 tatacttttc atttctccgt aaacaacatg ttttcccatg taatatcctt ttctattttt 1800 cgttccgtta ccaactttac acatacttta tatagctatt cacttctata cactaaaaaa 1860 ctaagacaat tttaattttg ctgcctgcca tatttcaatt tgttataaat tcctataatt 1920 tatcctatta gtagctaaaa aaagatgaat gtgaatcgaa tcctaagaga attgggcaag 1980 tgcacaaaca atacttaaat aaatactact cagtaataac ctatttctta gcatttttga 2040 cgaaatttgc tattttgtta gagtctttta caccatttgt ctccacacct ccgcttacat 2100 caacaccaat aacgccattt aatctaagcg catcaccaac attttctggc gtcagtccac 2160 cagctaacat aaaatgtaag ctctcggggc tctcttgcct tccaacccag tcagaaatcg 2220 agttccaatc caaaagttca cctgtcccac ctgcttctga atcaaacaag ggaataaacg 2280 aatgaggttt ctgtgaagct gcactgagta gtatgttgca gtcttttgga aatacgagtc 2340 ttttaataac tggcaaaccg aggaactctt ggtattcttg ccacgactca tctccgtgca 2400 gttggacgat atcaatgccg taatcattga ccagagccaa aacatcctcc ttaggttgat 2460 tacgaaacac gccaaccaag tatttcggag tgcctgaact atttttatat gcttttacaa 2520 gacttgaaat tttccttgca ataaccgggt caattgttct ctttctattg ggcacacata 2580 taatacccag caagtcagca tcggaatcta gagcacattc tgcggcctct gtgctctgca 2640 agccgcaaac tttcaccaat ggaccagaac tacctgtgaa attaataaca gacatactcc 2700 aagctgcctt tgtgtgctta atcacgtata ctcacgtgct caatagtcac caatgccctc 2760 cctcttggcc ctctcctttt cttttttcga ccgaatttct tgaagacgaa agggcctcgt 2820 gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttagg acggatcgct 2880 tgcctgtaac ttacacgcgc ctcgtatctt ttaatgatgg aataatttgg gaatttactc 2940 tgtgtttatt tatttttatg ttttgtattt ggattttaga aagtaaataa agaaggtaga 3000 agagttacgg aatgaagaaa aaaaaataaa caaaggttta aaaaatttca acaaaaagcg 3060 tactttacat atatatttat tagacaagaa aagcagatta aatagatata cattcgatta 3120 acgataagta aaatgtaaaa tcacaggatt ttcgtgtgtg gtcttctaca cagacaagat 3180 gaaacaattc ggcattaata cctgagagca ggaagagcaa gataaaaggt agtatttgtt 3240 ggcgatcccc ctagagtctt ttacatcttc ggaaaacaaa aactattttt tctttaattt 3300 ctttttttac tttctatttt taatttatat atttatatta aaaaatttaa attataatta 3360 tttttatagc acgtgatgaa aaggacccag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa 3420 cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac 3480 cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg 3540 tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc 3600 tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg 3660 atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga 3720 gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tgttgacgcc gggcaagagc 3780 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gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc 4680 agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg 4740 tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg 4800 ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt 4860 cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac 4920 tgagatacct acagcgtgag cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg 4980 acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg 5040 ggaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat 5100 ttttgtgatg ctcgtcaggg gggccgagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt 5160 tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg 5220 attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa 5280 cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc 5340 ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga 5400 aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttacct cactcattag gcaccccagg 5460 ctttacactt tatgcttccg gctcctatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc 5520 acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagctcgg aattaaccct cactaaaggg 5580 aacaaaagct ggctagt 5597 <210> 57 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> U6-HC7 hinge <400> 57 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Cys His Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 58 <211> 435 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding CDR-L3 derived from L3-1 clone <400> 58 gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60 ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc 120 ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc atcacctgca agtccagtca gagtctttta 180 gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccaac agaaaccagg aaaagctccg 240 aaaatgctga ttatttgggc atccactagg gtatctggag tcccttctcg cttctctgga 300 tccgggtctg ggacggattt cactctgacc atcagcagtc tgcagccgga agacttcgca 360 acttattact gtcagcagtc ctacagccgc ccgtacacgt tcggacaggg taccaaggtg 420 gagatcaaac gtacg 435 <210> 59 <211> 435 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding CDR-L3 derived from L3-2 clone <400> 59 gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60 ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc 120 ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc atcacctgca agtccagtca gagtctttta 180 gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccaac agaaaccagg aaaagctccg 240 aaaatgctga ttatttgggc atccactagg gtatctggag tcccttctcg cttctctgga 300 tccgggtctg ggacggattt cactctgacc atcagcagtc tgcagccgga agacttcgca 360 acttattact gtgggcagtc ctacagccgt ccgctcacgt tcggacaggg taccaaggtg 420 gagatcaaac gtacg 435 <210> 60 <211> 435 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding CDR-L3 derived from L3-3 clone <400> 60 gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60 ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc 120 ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc atcacctgca agtccagtca gagtctttta 180 gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccaac agaaaccagg aaaagctccg 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U6-HC7 hinge and constant region of human IgG1 <400> 62 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly Ile Gln 1 5 10 15 Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 20 25 30 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp 35 40 45 Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 50 55 60 Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser 65 70 75 80 Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 130 135 140 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 145 150 155 160 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 165 170 175 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 180 185 190 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 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ccaagagcac ctctgggggc 480 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 720 agctgcgatt gccactgtcc tccatgtcca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 780 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg 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acaacagagt acagtgcatc tgtgaagggt cgtttcacta taagcagaga taattccaaa 300 aacacactgt acctgcagat gaacagcctg cgtgctgagg acactgccgt ctattattgt 360 gctagagata actggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcaccgt ctcctcggct 420 agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 480 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagaggaag 720 tgctgtgtgg agtgcccccc ctgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 780 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 840 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 900 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 960 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1020 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1080 cagccccgag 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ggacggcgtg 900 gaggtgcata atgccaagac aaagccacgg gaggagcagt tcaacagcac gttccgtgtg 960 gtcagcgtcc tcaccgttgt gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 1020 gtctccaaca aaggcctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaagggcag 1080 ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg aggagatgac caagaaccag 1140 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1200 agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccatgctgga ctccgacggc 1260 tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1320 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1380 ctgtctccgg gtaaatgact cgag 1404 <210> 68 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide consisting of light chain of huAbF46-H4-A1(H36Y) and human kappa constant region <400> 68 Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Met Leu Leu Leu Leu Ser Val Ser 1 5 10 15 Gly Thr Cys Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 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encoding polypeptide consisting of light chain of huAbF46-H4-A1(H36Y) and human kappa constant region <400> 69 aattcactag tgattaattc gccgccacca tggattcaca ggcccaggtc ctcatgttgc 60 tgctgctatc ggtatctggt acctgtggag atatccagat gacccagtcc ccgagctccc 120 tgtccgcctc tgtgggcgat agggtcacca tcacctgcaa gtccagtcag agtcttttag 180 ctagtggcaa ccaaaataac tacttggcct ggtaccaaca gaaaccagga aaagctccga 240 aaatgctgat tatttgggca tccactaggg tatctggagt cccttctcgc ttctctggat 300 ccgggtctgg gacggatttc actctgacca tcagcagtct gcagccggaa gacttcgcaa 360 cttattactg tcagcagtcc tacagccgcc cgtacacgtt cggacagggt accaaggtgg 420 agatcaaacg tacggtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt 480 tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca 540 aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag 600 agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag 660 actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg 720 tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt gactcgag 758 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tggcaaggag 1020 tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1080 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 1140 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1200 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1260 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1380 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga ctcgag 1416 <210> 77 <211> 759 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of light chain of anti-c-Met antibody (AbF46 or huAbF46-H1) <220> <221> misc_difference <222> (1)..(6) <223> EcoRI restriction site <220> <221> misc_difference <222> (7)..(90) <223> signal sequence <220> <221> misc_difference <222> (91)..(432) <223> VL - light chain variable region <220> <221> misc_difference <222> (430)..(435) <223> BsiWI restriction site <220> <221> misc_difference <222> (433)..(750) <223> CL - light chain constant region <220> <221> misc_difference <222> (751)..(753) <223> stop codon <220> <221> misc_difference <222> (754)..(759) <223> XhoI restriction site <400> 77 gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60 ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gacattttga tgacccagtc tccatcctcc 120 ctgactgtgt cagcaggaga gaaggtcact atgagctgca agtccagtca gagtctttta 180 gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccagc agaaaccagg acgatctcct 240 aaaatgctga taatttgggc atccactagg gtatctggag tccctgatcg cttcataggc 300 agtggatctg ggacggattt cactctgacc atcaacagtg tgcaggctga agatctggct 360 gtttattact gtcagcagtc ctacagcgct ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg 420 gagctgaaac gtacggtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag 480 ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc 540 aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca 600 gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca 660 gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct 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tttacctgag 720 ttcagagatt cttaccccat taagtatgtc catgcctttg aaagcaacaa ttttatttac 780 ttcttgacgg tccaaaggga aactctagat gctcagactt ttcacacaag aataatcagg 840 ttctgttcca taaactctgg attgcattcc tacatggaaa tgcctctgga gtgtattctc 900 acagaaaaga gaaaaaagag atccacaaag aaggaagtgt ttaatatact tcaggctgcg 960 tatgtcagca agcctggggc ccagcttgct agacaaatag gagccagcct gaatgatgac 1020 attcttttcg gggtgttcgc acaaagcaag ccagattctg ccgaaccaat ggatcgatct 1080 gccatgtgtg cattccctat caaatatgtc aacgacttct tcaacaagat cgtcaacaaa 1140 aacaatgtga gatgtctcca gcatttttac ggacccaatc atgagcactg ctttaatagg 1200 acacttctga gaaattcatc aggctgtgaa gcgcgccgtg atgaatatcg aacagagttt 1260 accacagctt tgcagcgcgt tgacttattc atgggtcaat tcagcgaagt cctcttaaca 1320 tctatatcca ccttcattaa aggagacctc accatagcta atcttgggac atcagagggt 1380 cgcttcatgc aggttgtggt ttctcgatca ggaccatcaa cccctcatgt gaattttctc 1440 ctggactccc atccagtgtc tccagaagtg attgtggagc atacattaaa ccaaaatggc 1500 tacacactgg ttatcactgg gaagaagatc acgaagatcc cattgaatgg cttgggctgc 1560 agacatttcc agtcctgcag tcaatgcctc tctgccccac cctttgttca gtgtggctgg 1620 tgccacgaca aatgtgtgcg atcggaggaa tgcctgagcg ggacatggac tcaacagatc 1680 tgtctgcctg caatctacaa ggttttccca aatagtgcac cccttgaagg agggacaagg 1740 ctgaccatat gtggctggga ctttggattt cggaggaata ataaatttga tttaaagaaa 1800 actagagttc tccttggaaa tgagagctgc accttgactt taagtgagag cacgatgaat 1860 acattgaaat gcacagttgg tcctgccatg aataagcatt tcaatatgtc cataattatt 1920 tcaaatggcc acgggacaac acaatacagt acattctcct atgtggatcc tgtaataaca 1980 agtatttcgc cgaaatacgg tcctatggct ggtggcactt tacttacttt aactggaaat 2040 tacctaaaca gtgggaattc tagacacatt tcaattggtg gaaaaacatg tactttaaaa 2100 agtgtgtcaa acagtattct tgaatgttat accccagccc aaaccatttc aactgagttt 2160 gctgttaaat tgaaaattga cttagccaac cgagagacaa gcatcttcag ttaccgtgaa 2220 gatcccattg tctatgaaat tcatccaacc aaatctttta ttagtggtgg gagcacaata 2280 acaggtgttg ggaaaaacct gaattcagtt agtgtcccga gaatggtcat aaatgtgcat 2340 gaagcaggaa ggaactttac agtggcatgt caacatcgct ctaattcaga gataatctgt 2400 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aatgaagtca taggaagagg gcattttggt tgtgtatatc atgggacttt gttggacaat 3300 gatggcaaga aaattcactg tgctgtgaaa tccttgaaca gaatcactga cataggagaa 3360 gtttcccaat ttctgaccga gggaatcatc atgaaagatt ttagtcatcc caatgtcctc 3420 tcgctcctgg gaatctgcct gcgaagtgaa gggtctccgc tggtggtcct accatacatg 3480 aaacatggag atcttcgaaa tttcattcga aatgagactc ataatccaac tgtaaaagat 3540 cttattggct ttggtcttca agtagccaaa ggcatgaaat atcttgcaag caaaaagttt 3600 gtccacagag acttggctgc aagaaactgt atgctggatg aaaaattcac agtcaaggtt 3660 gctgattttg gtcttgccag agacatgtat gataaagaat actatagtgt acacaacaaa 3720 acaggtgcaa agctgccagt gaagtggatg gctttggaaa gtctgcaaac tcaaaagttt 3780 accaccaagt cagatgtgtg gtcctttggc gtgctcctct gggagctgat gacaagagga 3840 gccccacctt atcctgacgt aaacaccttt gatataactg tttacttgtt gcaagggaga 3900 agactcctac aacccgaata ctgcccagac cccttatatg aagtaatgct aaaatgctgg 3960 caccctaaag ccgaaatgcg cccatccttt tctgaactgg tgtcccggat atcagcgatc 4020 ttctctactt tcattgggga gcactatgtc catgtgaacg ctacttatgt gaacgtaaaa 4080 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5 10 15 Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Asp Asp 20 25 30 Asn Ala Gly Arg Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Phe Gly His Leu 35 40 45 Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Gly His His Cys Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp Ala Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Asp Asp Asp Glu Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ile Gly 100 105 110 Asp Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn 115 120 125 Ala Trp Asp Met Tyr Gly Arg Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Ala 130 135 140 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val 145 150 155 160 Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp 165 170 175 Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln 180 185

Claims

항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체; 및
c-Src 저해제
를 유효성분으로 포함하며,
상기 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체는 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 EGFR 결합부위를 포함하고,
상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H1, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H2, 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H3, 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L1, 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L2, 및 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L3을 포함하는 것이고,
상기 EGFR 결합부위는 서열번호 115의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H1, 서열번호 116의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H2, 서열번호 117의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H3, 서열번호 118의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L1, 서열번호 119의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L2, 및 서열번호 120의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L3을 포함하는 항 EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편이거나
서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 항 EGFR DARPin이며,
상기 c-Src 저해제는 다사티닙(dasatinib), 사라카티닙(saracatinib), 보수티닙(bosutinib), 또는 이의 조합인,
K-Ras 변이에 의하여 유발된 결장암 또는 EGFR T790M 변이에 의하여 유발된 비소세포폐암의 예방 또는 치료를 위한 병용 투여용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 병용 투여용 약학 조성물은 c-Src 저해제와 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체가 혼합된 혼합제 형태이거나, c-Src 저해제와 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체가 각각 제제화되어 동시적 또는 순차적으로 투여되는 형태인,
약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 71의 아미노산 서열 내의 서열번호 73의 아미노산 서열(EEPSQ)을 포함하는 연속하는 5 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 에피토프에 특이적으로 결합하는 것인,
약학 조성물.
제3항에 있어서,
상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 71, 서열번호 72, 또는 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 에피토프에 특이적으로 결합하는 것인,
약학 조성물.
삭제
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제1항에 있어서, 상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체인,
약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 항 c-Met 항체는,
서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;
서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;
서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;
서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 70의 아미노산 서열 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;
서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 70의 아미노산 서열 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체; 및
서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 70 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체
로 이루어진 군에서 선택된 것인,
약학 조성물.
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제1항에 있어서, 상기 EGFR 결합부위는 서열번호 122 의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄가변부위와 서열번호 124의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄가변부위를 포함하는 항 EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편인, 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 EGFR 결합부위는 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 항 EGFR DARPin인, 약학 조성물.
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