SK283889B6 - Jednoreťazcové fragmenty protilátok a protilátky proti receptoru epidermálneho rastového faktoru, spôsob ich prípravy a farmaceutický prostriedok, ktorý ich obsahuje - Google Patents

Jednoreťazcové fragmenty protilátok a protilátky proti receptoru epidermálneho rastového faktoru, spôsob ich prípravy a farmaceutický prostriedok, ktorý ich obsahuje Download PDF

Info

Publication number
SK283889B6
SK283889B6 SK1430-95A SK143095A SK283889B6 SK 283889 B6 SK283889 B6 SK 283889B6 SK 143095 A SK143095 A SK 143095A SK 283889 B6 SK283889 B6 SK 283889B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
seq
egfr
ser
antibody
cells
Prior art date
Application number
SK1430-95A
Other languages
English (en)
Other versions
SK143095A3 (en
Inventor
A. Cathrine Kettleborough
Mary M. Bendig
Keith H. Ansell
Detlef G�Ssow
Jaime Adan
Francesc Mitjans
Elisabet Rosell
Francesc Blasco
Jaime Piulats
Original Assignee
Merck Patent Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck Patent Gmbh filed Critical Merck Patent Gmbh
Publication of SK143095A3 publication Critical patent/SK143095A3/sk
Publication of SK283889B6 publication Critical patent/SK283889B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Jednoreťazcový fragment protilátky proti receptoru epidermálneho rastového faktoru, získateľný z fágových protilátkových knižníc konštruovaných z buniek imunizovaných cicavcov, pričom variabilná oblasť reťazca Fv obsahuje ťažký reťazec aminokyselinovej sekcie zo súboru zahŕňajúceho sekv. ID.č.: 4, sekv. ID.č.: 8, sekv. ID.č.: 12, sekv. ID.č..: 16, sekv. ID.č.: 18, sekv. ID.č.: 20, sekv. ID.č.: 22, sekv. ID.č.: 24, sekv. ID.č.: 26 a sekv. ID.č.: 28 a ľahký reťazec aminokyselinové sekvencie zo súboru zahŕňajúceho sekv. ID.č.: 2, sekv. ID.č.: 6, sekv. ID.č.: 10, sekv. ID.č.: 14, sekv. ID.č.: 18, sekv. ID.č.: 20, sekv. ID.č.: 22, sekv. ID.č.: 24, sekv. ID.č.: 26 a sekv. ID.č.: 28. Molekula DNA kódujúca ťažký reťazec aminokyslinovej sekvencie alebo ľahký reťazec aminokyselinovej sekvencie tohto jednoreťazcového fragmentu. Spôsob jeho prípravy, jeho použitie a farmaceutický prostriedok na diagnostiku a liečenie ľudských nádorov.ŕ

Description

Oblasť techniky
Vynález sa týka nových protilátok proti receptoru epidermálneho rastového faktora (anti-EGFR) a fragmentov protilátok predovšetkým jednoreťazcových fragmentov (scFv), ktoré je možné získať z knižníc fágových protilátok konštruovaných z buniek imunizovaných cicavcov, výhodne myší. Fragmenty protilátok, izolované z knižníc fágových protilátok, je možné konštruovať na vytvorenie čiastočne humanizovaných úplných proti látkových molekúl. Tieto chimerické ani-EGFR protilátky obsahujú konštantné oblasti ľudských imunoglobulínov a je možné ich použiť rovnako ako ich fragmentov ako činidlá na diagnostiku a terapiu ľudských nádorov.
Vynález dokladá, že knižnice fágových protilátok sú alternatívnym a všestrannejším spôsobom na izolovanie protilátok z imunizovaných cicavcov v porovnaní so štandardnou hybridómovou technológiou.
Vynález sa tiež týka farmaceutických prostriedkov obsahujúcich protilátky alebo fragmenty protilátok na liečenie nádorov, ako je melanóm, glióm alebo karcinóm. Protilátky môžu byt tiež použité na diagnostické účely lokalizácie a posúdenia nádorov in vitro alebo in vivo.
Jednotlivé používané výrazy majú tento význam.
Výraz „FRs“ (rámcové oblasti) znamená štyri podoblasti variabilných oblastí ľahkých alebo ťažkých reťazcov, ktoré nesú tri CDRs.
Výraz „CDRs“ (complementarity determining regions) znamená tri suboblasti variabilných oblastí ľahkých a ťažkých reťazcov, ktoré majú hypervariabilné sekvencie a tvoria slučkové štruktúry, ktoré sú primárne zodpovedné za vytváranie priameho styku s antigénom.
Výraz „chimerické“ alebo čiastočne humanizované protilátky znamená protilátky zahŕňajúce konštantné oblasti odvodené z ľudských zdrojov a variabilné oblasti (vrátane CDRs) odvodené z neľudských zdrojov, napríklad z myši.
Výraz „humanizované“ alebo úplne humanizované protilátky znamená protilátky obsahujúce konštantné oblasti a FRs odvodené z ľudských zdrojov, zatiaľ čo CDRs z neľudských zdrojov.
Výraz „EGF“ znamená epidermálny rastový faktor a „EGFR“ znamená receptor epidermálneho rastového faktora.
Výraz „PCR“ znamená polymerázovú reťazovú reakciu.
Výraz „scFv“ znamená jednoreťazcový Fv. ktorý je protilátkovým fragmentom.
Výraz „VL“ znamená variabilnú oblasť ľahkého reťazca.
Výraz „VK znamená variabilnú oblasť kappa ľahkého reť azca.
Výraz „VH“ znamená variabilnú oblasť ťažkého reťazca.
Výraz PBS znamená fosfátom tlmenú solanku.
Výraz FCS znamená zárodočné teliace sérum.
Výraz HBSS znamená Hankov vyvážený soľný roztok.
Výraz FITC znamená fluoresceinizokyanát.
Výraz MTC znamená zmesovú bunkovú kultúru.
Doterajší stav techniky
Epidermálny rastový faktor (EGF) je polypeptidový hormón, ktorý je mitogenický pre epidermálne a epiteliálne bunky. Keď dôjde k interakcii EGF so senzitívnymi bunkami, viaže sa na membránové receptory (EGFR). EGFR je transmembránový glykoprotcin s približne 170 kD a jc génovým produktom c-erb-B protoonkogénu.
MAb 425 je myšia monoklonálna protilátka vypestovaná proti dobre známej ľudskej karcinómovej bunkovej línii A431 (ATCC CRL 1555), viaže sa na polypeptidový epitop externej domény ľudského EGFR a inhibuje väzbu EGF. Zistilo sa, že MAb 425 (ATCC HB 9629) sprostredkováva nádorovú cvtotoxickosť in vitro a potláča rast bunkových línii odvodených z epidermálnych a colorektálnych karcinómov in vitro (Rodcck a kol., Canccr Res. 47, str. 3692, 1987). Humanizované a chimerické verzie MAb 425 sú opísané v patentovom spise číslo WO 92/15683.
V posledných niekoľkých málo rokoch boli opísané spôsoby (Skerra a Pliickthun, Science 240, str. 1038, 1988; Better a kol. Science 240. str. 1041, 1988) umožňujúce produkovať funkčné protilátkové fragmenty v eukaryotických hostiteľských bunkách, ako je E. coli. Zahŕňajú Fv fragment a Fab fragment, pričom osobitne zaujímavý je Fv fragment. Boli tiež opísané jednoreťazcové Fv (kde reťazce VL a VH sú spolu zviazané) (Bird a kol., Science 242, str. 423, 1988; Huston a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, Str. 5879,1988).
Garrard a kol. opisujú systém, ktorý umožňuje expresiu jednej kópie protilátkovej Fab molekuly na povrch vláknitého bakteriofágu M13. Dokladá užitočnosť tohto systému pri obohatení špecifického „Fab fágu“ (Bio/Technologv. 9(12), str. 1373, 1991). V časopise Gene (128, str. 103. 1993) opisuje rôzne Fab knižnice obsahujúce 2 až 3 x 108 členov, ktoré sa generujú náhodným začleňovaním aminokyselinových zvyškov v štyroch zo šiestich komplementárnych regiónov humanizovanej verzie anti-HER-2 protilátky.
Knižnice fágových protilátok umožňujú alternatívnu technológiu hybridomovej technológie na izoláciu protilátok z imunizovaných zvierat. Pri hybridomovej technológii sa imortalizujú bunky, ktoré produkujú protilátky. Pri fágovej protilátkovej technológii sa imortalizujú gény, ktoré kódujú protilátky (Winter G. a Milstein C., Náture 349, str. 293. 1991). Pri fágovej protilátkovej technológii sa protilátkové variabilné oblasti ťažkého reťazca (VH) a variabilné oblasti ľahkého reťazca (VL) zosilňujú polymerázovou reťazovou reakciou PCR, variabilné oblasti sa štatisticky skombinujú a produkujú ako protilátkové fragmenty na povrchu fágových častíc a knižnice fágových protilátok sa testujú na protilátky, ktoré sa viažu na príslušné antigény.
Hybridomová technológia bola veľmi úspešná pri izolovaní myších monoklonálnych protilátok, keď bolo možné vyvolať silnú imunitnú odozvu v slezinách zvierat. Napríklad myšie MAbs proti ľudskému epidermálnemu rastovému faktoru (EGFR) boli izolované zo slezín myší imunizovaných intraperitoneálne ľudskými nádorovými bunkami A431 (Murthy a kol., Árch. Biochem. Biophys. 252, str. 549, 1987). Potenciálnou prednosťou fágovej protilátkovej technológie pred hybridomovou technológiou je možnosť použitia skutočne akéhokoľvek zdroja buniek vytvárajúcich protilátku ako východiskový materiál a možnosť rýchleho testovania veľkého množstva rôznych protilátok. Inou výhodou fágovej protilátkovej technológie je skutočnosť, že gény, kódujúce variabilné oblasti príslušných protilátok, už boli klonované a sú okamžite dostupné na ďalšie génové inžinierstvo.
Uvádza sa, že antitetánový toxoidný Fab fragment, izolovaný z fágovej protilátkovej knižnice bol premenený na úplnú protilátkovú molekulu (Bender a kol., Hum. Antibod. Hybridomas4, str. 74, 1993).
V posledných desiatich rokoch bola použitá imunizácia in vitro ako alternatívna technika na aktiváciu imunizácie na vytvorenie monoklonálnych protilátok (mAb) oproti širokej rozmanitosti antigénov tak z ľudských, ako z myších systémov (napríklad Vaux D. .1. T.. Helenius A. a Mellman I., Náture 336, str. 36, 1988; Gathuru J. K. a kol., J. Imunol. Methods 137, str. 95, 1991; Borrebaeck C. A. K., Jmmunol. Today 9, str. 355, 1988). Výhodou tohto pristupuje potreba len malých množstiev antigénu a možnosť použitia na generovanie ľudských hybridomov. Ale vytváranie protilátok IgM nízkej afinity a obtiažnosť imortalizácie ľudských lymfocytov po imunizácii in vitro sa stali pretrvávajúcimi problémami spojenými s touto technológiou.
Novou cestou na získanie protilátok je zosilňovanie polymerázovou reťazovou reakciou repertoárov variabilných oblastí ťažkých (VH) a ľahkých (VL) reťazcov génov, ktoré sa potom štatisticky rekombinujú a produkujú ako fágové exhibičné knižnice (7-9). Protilátkové gény variabilnej oblasti sa klonujú a fuzujú na malý povlakový proteín (gén 3) ako jednoreťazcový Fv fragment (scFv) (10). Fágová častica má na svojom povrchu protilátkový fragment a môže byť selektovaná pri využití väzbových vlastností protilátky. Výhodou tejto technológie je skutočnosť, že štatistická rekombinácia V génov môže vytvoriť nové spárovanie s novými špecifikáciami a afinitami, ktoré nebolo možné selektovať prírodnými postupmi. Okrem toho umožňuje taký prístup použitie naivných alebo in vitro imunizovaných lymfocytov z myších alebo z ľudských zdrojov.
Skoršie snahy získať mAbs proti EGFR myšími bunkami B imunizáciou in vitro a hybridomová technológia poskytovali navzájom reagujúce protilátky s nízkou afinitou. Aby sa predišlo týmto nedostatkom, bola vykonaná kombinácia imunizácie in vitro, nasledovaná klonovacou technológiou PCR.
Úlohou vynálezu je vyvinúť protilátky a fragmenty protilátok, ktoré majú vysokú afinitu k receptoru EGF.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je jednoreťazcový fragment protilátky proti receptoru epidermálneho rastového faktora, získatelný z fágových protilátkových knižníc konštruovaných z buniek imunizovaných cicavcov, pričom variabilná oblasť reťazca Fv obsahuje ťažký reťazec aminokyselinovej sekvencie zo súboru zahŕňajúceho sekv. ID. č.: 4, sekv. ID. č.: 8, sekv. ID. č.: 12, sekv. ID. č.: 16, sekv. ID. č.: 18, sekv. ID. č.: 20, sekv. ID. č.: 22, sekv. ID. č.: 24, sekv. ID. č.: 26 a sekv. ID. č.: 28 a ľahký reťazec aminokyselinovej sekvencie zo súboru zahŕňajúceho sekv. ID. č.: 2, sekv. ID. č.: 6, sekv. ID. č.: 10, sekv. ID. č.: 14, sekv. ID. č.: 18, sekv. ID. č.: 20, sekv. ID. č.: 22, sekv. ID. č.: 24, sekv. ID. č.: 26 a sekv. ID. č.: 28.
Porovnávajú sa myšie anti-EGFR protilátky izolované z troch rôznych fágových protilátkových knižníc s myším MAb (425) izolovaným štandardnou hybridomovou technológiou (Murthy a kol., Árch. Biochem. Biophys. 1987, 252, str. 549; Kettleborough a kol., Proteín Eng. 1991, 4, str. 773). Knižnice sa pripravujú nielen zo sleziny imunizovaných myší, ale tiež z lymfatickej uzliny imunizovaných myší a z in vitro imunizovaných myších buniek. Upravia sa dva protilátkové fragmenty Fv s jedným reťazcom (scFv), izolované z knižníc, na vytvorenie chimerických úplných protilátkových molekúl s myšími variabilnými oblasťami pripojenými k ľudským konštantným oblastiam.
Osobitne sa vynález týka anti-EGFR jednoreťazcového FV fragmentu, získateľného z fágových protilátkových knižníc konštruovaných z buniek, výhodne zo sleziny alebo z miazgovej uzliny imunizovaných cicavcov, výhodne myší, alebo z in vitro imunizovaných buniek. V zásade nie je vynález obmedzený na scFv, ale zahŕňa tiež iné anti-EGFR protilátkové fragmenty, ako je Fab alebo F(ab')2
Niektoré scFv podľa vynálezu majú dobre definované DNA a aminokyselinové sekvencie. Preto sa vynález ďalej týka jednoreťazcového protilátkového fragmentu Fv, pričom variabilné oblasti ťažkého a ľahkého reťazca zahŕňajú DNA a/alebo aminokyselinové sekvencie vybrané zo sek vencií ťažkého a ľahkého reťazca daných v sekvencií ID číslo 1 až 32, výhodne podľa obr. 5 až 8.
Pretože na diagnostické a terapeutické účely môžu byť v mnohých prípadoch využité iba plne fungujúce, úplné protilátky, je úlohou vynálezu spojovať variabilné oblasti jednoreťazcového Fv s konštantnými oblasťami ľudských imunoglobulínov za vytvárania úplných, čiastočných alebo humanizovaných protilátok anti-EGFR.
Vynález sa preto týka úplnej protilátky anti-EGFR konštruovanej zo sekvencií DNA, odvodených od definovaných protilátkových fragmentov, a zo sekvencií DNA odvodených od konštantných oblastí ľudských imunoglobulínov, pričom - ako výhodné rozpracovanie - sa ťažký reťazec skladá z aminokyselinovej sekvencie reťazca gama-1 a ľahký reťazec z aminokyselinovej sekvencie reťazca kappa.
Podľa vynálezu sa anti-EGFR scFv izolujú technológiou využívajúcou fágové protilátkové knižnice. Spôsob prípravy anti-EGFR jednoreťazcového Fv spočíva podľa vynálezu v tom, že sa: i) izoluje RNA z imunizovaných cicavčích buniek, výhodne z myších buniek, ii) syntetizuje sa prvý reťazec cDNA, iii) zosilňujú sa gény VH a VK v cDNA z imunizovaných buniek, iv) klonujú sa tieto gény spolu s vhodnými reštrikčnými miestami do fágemidového vektora,
v) transformujú sa prokaryotické bunky s ligačnými zmesami, vi) testujú sa fágové knižnice na fágové protilátky, zamerané na EGFR pomocou vyčisteného EGFR a vii) produkuje sa žiadaný jednoreťazcový Fv v prokaryotických hostiteľských bunkách, výhodne v E. coli.
Vynález sa tiež týka spôsobu prípravy úplnej protilátky anti-EGFR klonovanim DNA kódujúcej variabilnej oblasti fragmentov protilátky anti-EGFR, produkovaných uvedeným spôsobom, do aspoň jedného eukaryotického expresného vektora obsahujúceho genomickú DNA, ktorá kóduje konštantné oblasti ľudských imunoglobulínov, transformovaním eukaryotických buniek uvedeným vektorom alebo vektormi a expresiou a izolovaním protilátky.
Anti-EGFR scFv, a predovšetkým úplné protilátky anti-EFGR je možné použiť na diagnózu a ošetrovanie ľudských nádorov. Vynález sa preto tiež týka farmaceutického prostriedku obsahujúceho anti-EGFR jednoreťazcový Fv alebo úplnú anti-EDFR protilátku. Výsledky a prednosti vynálezu sú nasledujúce.
Z knižníc fágových protilátok boli izolované nové myšie protilátky anti-EGFR. Nové protilátky reprezentujú najmenej štyri rôzne podskupiny vH a štyri rôzne podskupiny VK (Kabát a kol., Sequences of proteíns of immunological interest. 5. vydanie, U. S. Dept. of Health and Human Services, Bethesda 1991). Majú odlišné páry a sekvencie líšiace sa od sekvencií používaných myších MAb izolovaných hybridomovou technológiou. Myšia 425 MAb má vH2b a VK4 páry, ktoré neboli pozorované vo fágových protilátkach. vH scFv L311D má najvyššiu percentuálnu identitu s 425Vh (84,9 %). Väčšina odlišností je v CDR. Vk scFv S4 2D má najvyššiu percentuálnu identitu s 425Vk (83,2 %). Väčšina odlišností je opät pri CDR, predovšetkým pri CDR3. Podľa vynálezu je rad nových protilátok anti-EGFR izolovaný z fágových protilátkových knižníc a všetky tieto protilátky sa líšia od 425 MAb aspoň dvoma z scFv majúcim odlišný epitop EGFR od epitopu vykazovaného pomocou 425 MAb. To je v rozporu s predchádzajúcou správou, kde sa uvádza, že protilátky izolované z kombinatorných knižníc sú veľmi podobné protilátkam izolovaným hybridomovou technológiou. (Caton a Koprowski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990, 87 str. 6450).
Z troch knižníc fágových protilátok je najlepšou knižnicou z hľadiska počtu selekčných krokov potrebných na dosiahnutie protilátok s vysokou afinitou a z hľadiska rozmanitosti izolovaných protilátok s vysokou afinitou, je knižnica generovaná z lymfatických uzlín. Lymfatické uzliny sa volia ako zdroj RNA na konštrukciu knižníc fágových protilátok z dvoch dôvodov. Skoršie práce ukázali, že vyšší podiel B-buniek produkujúcich protilátky IgG s vysokou afinitou, sa získa z podkolenných lymfatických uzlín po imunizácii cestou labiek ako zo slezín po imunizácii cestou peritonea (Venn a Dresser, J. Immunol. Methods 102, str. 95, 1987). Po druhé sú drenážované lymfatické uzliny považované za dobrý zdroj na izoláciu ľudských protinádorovych protilátok. Preto izolácia myších antiEGFR protilátok z podkolennej miazgovej uzliny myši imunizovanej prostredníctvom labky je modelom na izoláciu ľudských anti-EGFR protilátok z podpazuchových lymfatických uzlín pacientky s rakovinou prsníka. Je dokázaná ľahkosť prípravy knižníc s dobrou veľkosťou z malých množstiev materiálu z lymfatických uzlín a potom z nich izolovanie protilátky s vysokou afinitou.
Hoci myšie protilátky anti-EGFR boli izolované zo všetkých troch knižníc fágových protilátok, nie je jasné, či niektorá z novo izolovaných protilátok má vyššiu afinitu ako myšia 425 MAb izolovaná pomocou hybridomovej technológie. V prvých analýzach sa zdá, že fágové proti látkové odvodené scFv viažu EGFR lepšie ako scFv konštruované z 425 MAb (obr. 2). V iných pokusoch s chimerickými úplnými protilátkovými molekulami má jedna z chimerických protilátok (S4 2D) afinitu k EGFR, ktorá sa rovná afinite chimerickej protilátky 425. Druhá chimerická protilátka (L3 11D) má afinitu štyrikrát nižšiu ako chimerická protilátka 425 (obr. 4). Väzbové hodnoty, získané pomocou scFv boli zavádzajúce pravdepodobne preto, že pripravený scFv môže obsahovať zmesi monomérov a dimérov (Griffiths a kol., EMBO J. 12, str. 725, 1993). Na rozdiel od toho sa neočakáva, že chimcrickc protilátky IgG vytvárajú diméry a ukázalo sa, že chimerické protilátky L3 11D a S4 2D majú veľkosť očakávanú pre bivalentné, monomérne chimerické protilátky IgG. Analýzy afinity vyčistených prípravkov scFv 425, L3 1 ID a S4 2D však ukazujú, že tieto prípravky scFv obsahovali monomérne, dimérne a iné multimérne formy. Okrem toho sa líšia relatívne podiely monomérnych a multimérnych foriem pre každý scFv. scFv 425 má najnižšie percento dimérnych foriem. Ako bolo predpovedané, dimérne a predovšetkým väčšie multimérne formy majú silnejšiu väzbu na čistený EGFR ako monomérna forma. Zdá sa teda, že 425 scFv má slabší sklon k dimenzovaniu ako niektoré novo izolované scFv.
Hoci expresia protilátkových fragmentov na povrchu fágových častíc tvorí základ účinnej metódy rýchlej selekcie protilátok so žiaducimi vlastnosťami, je pravdepodobné, že ani fágové protilátky, ani protilátkové fragmenty samotné (scFv alebo Fab) nie sú pravdepodobne žiadaným konečným produktom. Ďalej je ukázané, ako môžu byť myšie scFv, izolované z fágových knižníc, ľahko premenené na úplné protilátkové molekuly. V tomto prípade sú myšie variabilné oblasti spojené s ľudskými konštantnými oblasťami na vytvorenie čiastočne humanizovaných chimerických protilátok.
Tieto výsledky ukazujú, že je možné použiť technológie fágových protilátok na izolovanie radu anti-EGFR protilátkových fragmentov z imunizovaných myši. Z protilátkových fragmentov jc možné potom skonštruovať úplné protilátkové molekuly s požadovanými konštantnými oblasťami. V niektorých prípadoch môže byť ešte hybridomová technológia zvolenou metódou na izolovanie mono klonálnych protilátok z myší. Keď je k dispozícii vysoko imunogénny antigén a keď postačuje niekolko hybridomových bunkových línii vytvárajúcich jednu alebo niekoľko rôznych protilátok, potom je pravdepodobne málo dôvodov na uvažovanie o fágovej protilátkovej technológii. Keď by však boli výhodné na vytváranie protilátok s vysokou afinitou špeciálne imunizačné protokoly, ako je injekcia do labiek, alebo keď sa potrebuje veľký počet protilátok proti radu epitopov na antigén, alebo keď sa potrebujú protilátky proti veľmi diskrétnemu a možná menej imunogénnomu epitopu, potom môže byť volený spôsob fágovej protilátkovej technológie. Takisto, keď sa očakáva ďalšie génové inžinierstvo protilátok, potom je fágová protilátková technológia výhodná v tom, že protilátkové gény už boli klonované.
Kombinovanie imunizácie in vitro s príslušným antigénom podľa vynálezu a technológia PCR-klonovania vytvárajú fragmenty scFv, ktoré reagujú s EGFR a nereagujú s inými antigénmi. Tu uvádzaný imunizačný protokol závisí od polohy antigénu, ktorý nie je rozpustný, je však membránovým vezikulom a na kultivačnom médie samotnom, ktoré je bez FCS. Obidve metodiky sú tu uvedené ako prostriedok na zvyšovanie účinnosti imunizácie in vitro tým, žc sa antigén urobí dostupný pre bunky s polohou pre antigén (napríklad Brams P. a koľ, J. Immunol. Methods, 98, str. II, 1987).
Výsledky získané s MTC súhlasia s predchádzajúcimi publikáciami (napríklad Borrebaeck C. A. K. a Môller S. A., Immunol. 136, str. 3710, 1986; Moller S. A. a Borrebaeck C. A. K., Borrebaeck C. A. K. (vyd.):In Vitro Immunization in Hybridoma Technology, Elsevier Science Publishers B. V„ Amsterdam 1988, str. 3), kde sa opisuje použitie supernatantov MTC ako zdroja lymfokinov na zlepšenie imunizačného procesu in vitro. Membránový vezikul by sa mal považovať za polyantigén, pretože v takých vezikuloch sú obsiahnuté početné rôzne antigénové determinanty. Z tohto dôvodu by sa zdalo, že navodzujú určitú úroveň polyklonálnej aktivácie. To sa však vylúčilo, pretože špecifická odozva anti-EGFR je zreteľne odlišná od odozvy získanej štandardným polyklonálnym aktivátorom.
Miesto imortalizácie B-buniek po imunizácii in vitro sa podľa vynálezu používa molekulárna stratégia imortalizácie protilátkových génov VH a VL. Tieto monoklonálne protilátkové fragmenty sa expresujú a produkujú v baktériách. Fágový dispelejový systém je úspešný spôsob izolovania protilátkových fragmentov proti špecifickým antigénom. Prítomnosť stôp kodónu medzi protilátkovým fragmentom a povlakovým proteínom g3p umožňuje prepnutie medzi povrchovým dispelejom a sekréciou v podobe rozpustného fragmentu scFv použitím supresívnych alebo nesupresívnych kmeňov (Hoogenboom a kol., Nucl., Acids Res. 19. str. 4133, 1991).
Vzhľadom na nárast špecifickej odozvy a hladín mRNA v antigénom in vitro stimulovaných B-bunkách, prispieva imunizácia in vitro k izolácii protilátkových fragmentov s vysokou špecifickosťou k antigénu. Po dvoch behoch selekcie je 100 % klonov pozitívnych na väzbu EGFR. Na rozdiel od toho klony, odvodené od procesov imunizácie in vivo, sú 100 % pozitívne iba po štyroch behoch selekcie (Kettleborough a kol., EP 94104160 a Eur. J. Immunol., 24 str. 952, 1994).
Použitie fágových dispejových knižníc od naivných protilátkových génov môže umožniť vytváranie špecifických ľudských protilátkových fragmentov bez imunizácie alebo po imunizácii in vitro. Protilátkové fragmenty môžu byť preto produkované priamo v baktériách jednoduchým, rýchlym a ekonomickým spôsobom.
Biologický materiál a všeobecné spôsoby
Mikroorganizmy, bunkové línie, plazmidy, fágemidy, promótory, rezistentné markéry (signálne znaky), replikačné zdroje alebo iné fragmenty vektorov, tu uvádzané, sú obchodne alebo inak všeobecne dostupné. Pokiaľ to nie je uvedené inak, sú tu použité iba ako príklady a nie sú pre vynález podstatné a môžu byť nahradené inými vhodnými činidlami a biologickými materiálmi.
Na klonovanie scFv a na produkciu scFv proteínov sú prednostne použité bakteriálne hostitelia. Príkladom takých hostiteľov sú: E. coli alebo bacillus.
Na vytváranie úplných protilátok anti-EGFR podľa vynálezu sú použité výhodne eukaryotické hostitelia, napríklad COS, CHO alebo kvasinky.
Potrebné techniky podľa vynálezu sú následne podrobne opísané. Iné neopísané techniky zodpovedajú známym štandardným spôsobom, ktoré sú pracovníkom v odbore dobre známe, alebo sú podrobnejšie opísané v citovaných prameňoch a prihláškach vynálezov.
Vynález bližšie objasňuje nasledujúci podrobný opis doplnený obrázkami.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Na obr. 1 sú vyznačené sekvencie aminokyselín scFv, izolované z fágových protilátkových knižníc. (A) scFv z knižnice lymfatických uzlín. (B) scFv z knižnice sleziny. Vyznačené sú komplementaritu určujúce oblasti (CDR) a rámcové oblasti (FR).
Na obr. 2 je znázornená väzba scFv na EGFR. Sú stanovené koncentrácie scFv v bakteriálnych supematantoch a scFv testované pomocou ELISA na väzbu k vyčisteným EGFR. (A) scFv z knižnice lymfatických uzlín. (B) scFv z knižnice sleziny. Pl (pozitívna kontrola) je scFv odvodený z MAb 425. L1 a SI (negatívne kontroly) sú neviažuce scFv z vopred vybraných knižníc lymfatických uzlín a sleziny.
Na obr. 3 sú intermediáme vektory použité na rekonštrukciu variabilných oblastí na expresiu v cicavčích bunkách. (A) VH vektor. (B) VK vektor.
Na obr. 4 je znázornená väzba chimerických úplných protilátok na EGFR. Koncentrácie protilátok v bunkových supematantoch COS sú zistené technikou ELISA a protilátky sú testované technikou ELISA na väzbu k vyčisteným EGFR.
Na obr. 5 je DNA a aminokyselinova sekvencia scFv č. L211IC.
(A): ľahký reťazec; (B): ťažký reťazec.
Polohy aminokyseliny
FR-1: 1-23, CDR-1: 24 - 34,
FR-2: 35 - 49, CDR-2: 50 - 56,
FR-3: 57 - 88, CDR-3: 89 - 97,
FR-4: 98- 109.
FR-1: 1 -30, CDR-1: 31 -35,
FR-2: 36 - 49, CDR-2: 50 - 66,
FR-3: 67-98, CDR-3: 99-108
FR-4: 109-119.
Na obr. 6 je DNA a aminokyselinova sekvencia scFv č.
L212B.
Polohy aminokyseliny
(A): ľahký reťazec; (B): ťažký reťazec.
(A) FR-1: FR-2: FR-3: FR-4: 1 -23, 39-49, 57 - 88, 98- 109. CDR-1: CDR-2: CDR-3: 24 - 38, 50 - 56, 89 - 97,
(B) FR-1: 1 -30, CDR-1: 31 -35,
FR-2: 36 - 49, CDR-2: 50 - 66,
FR-3: 67 - 98, CDR-3: 99-108
FR-4: 109-119.
Na obr. 7 je DNA a aminokyselinova sekvencia scFv Č. L311D.
(A): ľahký reťazec; (B): ťažký reťazec.
Polohy aminokyseliny FR a CDR zodpovedajú polohám udaným na obr. 6.
Na obr. 8 je DNA a aminokyselinova sekvencia scFv č. S4 2D.
(A): ľahký reťazec; (B): tažký reťazec.
Polohy aminokyseliny
(A) FR-1: 1-23, CDR-1: 24-35
FR-2: 36 - 49, CDR-2: 51-57
FR-3: 58 - 89, CDR-3: 90-98
FR-4: 99-110.
(B) FR-1: 1-30, CDR-1: 31-35
FR-2: 36-49, CDR-2: 50-66
FR-3: 67 - 98, CDR-3: 99-107
FR-4: 108-118.
Sekvencie z obr. 5 až 8 sú tiež v pripojenom zozname sekvencii, ktorý je súčastou opisu.
Podrobný opis vynálezu
1. Konštrukcia a skríning knižníc fágových protilátok
Skonštruované boli tri knižnice protilátok, jedna zo sleziny myší imunizovaných ľudskou karcinómovou bunkovou líniou A431 (8,8 x 105 členov), jednak z podkolcnných lymfatických uzlín myší imunizovaných do labky vyčisteným EGFR (6,5 x 106 členov) a tretia z myších lymfocytov imunizovaných in vitro vezikulmi A431 (1,1 x 105 členov); (podrobnosti o konštrukcii vezikulov A431 a imunizácia in vitro sú opísané v príkladoch 1 a 2). Pred selekciou sa analyzuje najmenej 46 klonov každej knižnice mapovaním peptidov BstNl (Clackson a kol., Náture 1991, 352, str. 624) na zistenie rozdielnosti repertoárov. Pozoruje sa veľký rozsah digesčných obrazcov. Tiež pred selekciou sa testujú ELISOU scFv z 96 klonov z každej knižnice na väzbu k EGFR. Žiadny z scFv zo slezinovej knižnice a z knižnice lymfatických uzlín sa neviaže na EGFR. Jeden z scFv z knižnice imunizovanej in vitro má väzbu k EGFR. Po jednom behu selekcie pri použití imuno-skúmaviek potiahnutých EGFR sa pozoruje zreteľné obohatenie pri scFv viazaných na EGFR pri knižnici z lymfatických uzlín a pri knižnici imunizovanej in vitro. Druhý beh selekcie je nutný pred detekciou nejakej scFv viazanej k EGFR pri knižnici zo sleziny. Pri treťom behu selekcie je z hľadiska väzby k EGFR pozitívna väčšina scFv z knižnice z lymfatickej uzliny a z knižnice imunizovanej in vitro. Po štvrtom behu selekcie s knižnicou zo sleziny je väčšina scFv pozitívna z hľadiska väzby k EGFR (tabuľka I).
Tabuľka I
Percento klonov viažucich EGFR po každom behu selekcie
K n i žnica
z lymfatických uzlín zo sleziny z buniek irounizovaných in vitro
predselekcia 0 0 1
prvý beh 77 0 84
druhý beh 86 26 100
tretí beh 90 77 100
štvrtý beh neskúšané 97 neskúšané
2. Sekvenčná analýza klonov viažucich EGFR
Po každom behu selekcie sa analyzujú inzerty z klonov viažucich EGFR pomocou mapovania peptidov BstNl (Clackson a kol. Náture 352, str. 624, 1991). Ukazuje sa, že dochádza k obohateniu určitých digesčných obrazcov. Klony s rôznym mapovaním peptidov BstNl sa vyberú z druhého a tretieho behu selekcie knižnice z lymfatických uzlín a z tretieho a štvrtého behu selekcie knižnice zo sleziny na sekvenovanie DNA VH a VK. Klony z neskorších behov selekcie sa analyzujú, pretože sa očakáva vyššia afinita protilátok v neskorších behoch (Clackson a kol. Náture 352, str. 624, 1991).
Šestnást klonov z knižnice lymfatických uzlín sa sekvenuje a získa sa šesť rôznych scFv (obr. 1). Päť z nich sú páry jedinečných VH a VR. Tých šesť scFv sú variantmi skôr sa vyskytujúcich VH so šiestimi zmenami aminokyselín, z ktorých päť je v rámcovej oblasti (FR) 1. Dve z týchto zmien je možné prirátať použitiu degenerovaného prajmeru VH1BACKSF1 (Hoogenboom a kol., Nucl. Acids Res. 19, str. 4133, 1991). Ostatné môžu byť výsledkom omylov PCR. VH sú zaradené do dvoch podskupín VH2b a VH3d, zatiaľ čo VK spadajú do štyroch podskupín VR3, VK4, Vr5 a Vr6 (Kabát a kol., Sequences of proteins of immunologoical interest, 5. vydaní U. S. Dept. of Health and Human Services Bethesda 1991). Desať jednotlivých klonov zo slezinovej knižnice sa sekvenuje a sú zistené štyri rôzne scFv. Tri z nich sú páry jedinečných VH a VK, zatiaľ čo štvrtý je podobný jednému zo skorších párov s iba dvoma rozdielmi aminokyselín vo VH, z ktorých jeden sa vyskytol v komplementarite určujúcej oblasť (CDR) 2 a dva rozdiely aminokyselín vo VK. Rozdelenie do podskupín ukazuje VH z podskupín VH2a, VH2c a VH3d a vK z podskupín VK3 a VK4. Porovnanie scFv získaných z knižnice lymfatických uzlín a zo slezinovej knižnice má iba jeden scFv, ktorý je spoločný pre obidve knižnice, scFv L3 lOA/'scFv S4 10H (obr. 1). Tento kloň sa zdá ako silne viažuci na EGFR pri testovaní metódou ELISA. Zatiaľ čo bolo vynaložené veľké úsilie na eliminovanie vzájomnej kontaminácie medzi knižnicami, je tažké vylúčit malé znečistenie pri klonoch sa silnou väzbou k EGFR. Keď sa však zoberie do úvahy príbuzná povaha myšej Balb/c, je možné, že rovnaký scFv pochádza nezávisle z dvoch rôznych knižníc.
3. Analýza afinity a špecifickosti väzby na EGFR
Na základe dobrej väzby k antigénu a diverzity sekvencii DNA sa na ďalšie analýzy vyberá niekoľko scFv z knižnice lymfatických žliaz a zo slezinovej knižnice. Tieto scFv sa analyzujú metódou ELISA na väzbu k vyčistenému EGFR. väzbu k irelevantným antigénom a väzbu k radu nádorových buniek, ktoré expresujú a neexpresujú EGFR. Ako pozitívna kontrola sa pripraví scFv z myši 425 MAb (PI). Ako negatívna kontrola sa pripraví scFv z fágových protilátok izolovaných z knižnice lymfatických uzlín a zo slezinovej knižnice pred selekciou (L1 a SI). Koncentrácia scFv sa stanovuje porovnaním zriedených roztokov scFv, určených na testovanie, s roztokmi vyčistenej scFv so známou koncentráciou pri skúške Western Blot.
Testujú sa scFv spôsobom ELISA na väzbu k vyčistenému EGFR a výsledky sa vynesú do grafu (obr. 2). Je možné zoradiť scFv vzhľadom na ich väzbu k EGFR. Toto zoradenie je reprodukovateľné medzi pokusmi. Skúšané scFv, ktoré majú najsilnejšiu väzbu k EGFR. sú L2 1C a L3 10A z knižnice lymfatických uzlín a S4 10H zo slezinovej knižnice. Ako bolo opísané, scFv L3 10A a S4 10H majú rovnaké sekvencie DNA. Skúšaný scFv (S4 5A). ktorý je veľmi podobný scFv 10H. s dvoma zmenami aminokyselín vo VH, a s dvoma zmenami vo VR dáva konzistentne nižšie zaradenie ako S4 I0H. Na rozdiel od toho sekvencie, pozorované medzi L2 12B a L3 11 D, nemajú, ako sa zdá, výrazný vplyv na väzbu. L izolovaných scFv iba dva, L2 8C a L2 11C sa zdajú ako menej viažuce ako scFv 425.
Testujú sa scFv spôsobom ELISA na väzbu k plastu a k panelu nepríbuzných proteínov ©albumín, lyzozým slepačích vajec, cytochróm c, glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenáza, CBA albumín a BSA). Žiadny z scFv nedáva signál nad pozadím.
Testujú sa scFv spôsobom ELISA na väzbu k trom líniám nádorových buniek. Bunkové línie A431 a MDEA MB 468 sú EGFR nesúce nádorové bunky izolované z vulvy a z prsníka. Bunková línia SK-MEL-23 je gangliozid nesúci melanómové bunková línie a je zaradená ako negatívna kontrola. Z desiatich testovaných scFv sa viažu iba štyri tak k vyčisteným ĽGFR, ako k EGFR nesúcim nádorovým bunkám (L2 12B, L3 11D, L2 11C a S4 2D, obr. 5 až 8). Nebola zistená väzba na bunky SK-MEL-23. Je niekolko rôznych vysvetlení tohto prekvapujúceho výsledku. Jedným z nich môže byť, že EGFR, ktorý bol použitý na imunizáciu, výber a ELISA, bol sekrétovaný EGFR príbuzný proteín (Weber a kol., Science 224, str. 294, 1984). Tento proteín má na C zakončení 17 prídavných aminokyselín (Gtinther a kol.,J. Biol. Chem. 265, str. 22082, 1990). Testujú sa scFv spôsobom ELISA na väzbu k tomuto 17 aminokyselinovému peptidu a nepozoruje sa žiadna väzba. Je možné, že sekrétovaný proteín príbuzný EGFR a EGFR na povrchu nádorových buniek majú rozdiely v konformácii alebo glykozylácii.
Na ďalšie skúmanie väzby k nádorovým bunkám sa vyčistia tri scFv (L2 11A, L3 1 ID a S4 2D) a analyzujú sa na väzbu k nádorovým bunkám A431 prietokovou cytomctriou. Použije sa scFv 425 ako pozitívna kontrola. Z troch testovaných scFv majú väzbu k bunkám A431 iba L3 11D a S4 2D. Tieto dva scFv majú podobný profil väzby k scFv 425.
Vyčistené scFv, pripravené z dvoch izolátov, ktoré sa viažu tak k EGFR, ako k EGFR nesúcim nádorovým bunkám (L3 11D a S4 2D) sa testujú v konkurenčných skúškach väzby s myšou 425 MAb. Zatiaľ čo vyčistený scFv 4125 je schopný inhibovať väzbu myšej 425 MAb väzbu na EGFR v danom rozsahu koncentrácie, scFv L3 11D a S4 2D neinhibuje väzbu myšej 425 MAb na EGFR pri týchto koncentráciách. Zdá sa, že tieto obidva scFv rozoznávajú epitop EGFR, ktorý je odlišný od epitopu rozoznávaného myším 425 MAb.
4. Úplné chimerické protilátky odvodené od scFv
Na premenu na úplné protilátkové molekuly sa vyberú dva scFv (L3 11D a S4 2D). DNA kódujúca myší VH a VK sa klonujú do prechodných vektorov obsahujúcich sekvencie DNA kódujúce imunoglobulínové vodcovské sekvencie a zostrihové donorové signály („splice donor signál”) (obr. 3). Poloha klonovacích miest v prechodnom vektore VH znamená, že prvý zvyšok VH sa mení z asparágovej na glutámovú kyselinu. Z prechodných vektorov sa teraz pripojené fragmenty DNA obsahujúce VH a VK k vodcovským a k zostrihovým donorovým sekvenciám klonujú do cicavčích bunkových expresných vektorov obsahujúcich DNA kódujúcu buď ľudskú gama-1 konštantnú oblasť, alebo ľudskú kappa konštantnú oblasť (Maeda a kol., Hum. Antibod. Hybridomy 2, str. 124, 1991). Pre každú chimerickú protilátku sa kotransfektujú do buniek COS expresné vektory ťažkého a ľahkého reťazca. Ako pozitívna kontrola sa bunky tiež kotransfektujú s expresnými vektormi s ťažkým a s ľahkým reťazcom kódujúcimi chimerickú protilátku 425 (Kettleborough a kol., Proteín Eng. 4, str. 773, 1991). Médium sa zhromaždí z buniek a analyzuje sa testom ELISA na určenie koncentrácie obsiahnutej protilátky a schopnosti protilátky viazať sa na EGFR (obr. 4), Keď sa porovná koncentrácia protilátky, potrebná na dosiahnutie polovice maxima väzby na antigén, viaže sa chimerická protilátka S4 2D na EGFR rovnako dobre ako chimerická protilátka 425. Chimerická protilátka L3 1 ID sa však viaže na EGFR približne štvornásobne menej dobre ako chimerická protilátka 425. Afinita chimerickej protilátky 425 (Kettleborough a kol., Proteín Eng. 4, str. 773, 1991), stanovená analýzou konkurenčnej väzby je 1,9 x 108 M'1. Tieto výsledky sú prekvapujúce, pretože predchádzajúce údaje analyzujúce scFv naznačovali, že scFv S4 2D a L3 11D sa obidva viažu k EGFR lepšie ako scFv 254 (obr. 2). Vyčistené vzorky proteínu A chimerických protilátok L3 11D a S4 2D sa analyzujú SDS-PAGE za redukčných a neredukčných podmienok. Chimerické protilátky L3 11D a S4 2D sa tiež testujú prietokovou cytometriou na väzbu k bunkám A431 a SK-MEL-23. Obidve chimerické protilátky sa viažu dobre na EGFR expresujúce bunky A431 a neviažu sa k EGFR negatívnym bunkám SK-MEL-23.
5. Terapeutické a diagnostické použitie
Protilátkové fragmenty a úplné protilátky podľa vynálezu môžu byť podávané pacientom na liečenie. Vynález sa preto tiež týka farmaceutického prostriedku obsahujúceho ako účinnú látku najmenej jednu protilátku alebo protilátkový fragment definovaný spolu s jedným alebo s niekoľkými farmaceutický vhodnými nosičmi, excipientmi alebo ich riedidlami.
Spravidla sa protilátka podľa vynálezu podáva intravenózne alebo parenterálne. Všeobecne je dávka na podávanie protilátkových fragmentov dostatočne veľká, aby vyvolala žiaduce potlačenie nádoru a narušenie nádoru. Dávka závisí od veku, stavu, pohlavia a rozsahu ochorenia pacienta a je 0,1 až 200 mg/kg telesnej hmotnosti, výhodne 0,1 až 100 mg/kg, pričom sa taká dávka podáva naraz alebo v niekoľkých denných dávkach počas jedného alebo niekoľkých dní.
Farmaceutické prostriedky na parenterálne podanie zahŕňajú sterilné vodné alebo bezvodé roztoky, suspenzie a emulzie. Ako príklady nevodných roztokov sa uvádzajú roztoky v propylénglykole, v polyetylénglykole, v rastlinných olejoch, ako je olivový olej, a v injektovateľných organických esteroch, ako je etyloleát a v iných rozpúštadlách známych v odbore, ktoré sú vhodné na tieto účely. Protilátky podľa vynálezu je možné používať v prostriedkoch obsahujúcich fyziologicky vhodný nosič. Ako príklady takých vhodných nosičov sa uvádzajú solanka, PBS, Ringerov roztok alebo laktátovaný Ringerov roztok. Ochranné látky a iné prísady, ako sú antibiotiká, antioxidanty a chelatizačné činidlá, môžu farmaceutické prostriedky rovnako obsahovať.
Protilátka (fragment) môže byť tiež konjugovaná známymi spôsobmi na cytokiny ako je IL-2 na podporu ich cytotoxickosti.
Farmaceutické prostriedky podľa vynálezu sú vhodné na ošetrovanie nádorov všetkých druhov, vrátane melanómov, gliómov a karcinómov, rovnako ako nádorov obehového systému a pevných nádorov.
Na diagnostické účely môže byť protilátka konjugovaná napríklad k farbivu nepreniknuteľnému žiarením alebo môže byť rádiologický značená. Výhodnou metódou značenia je spôsob lodogén. Protilátka sa výhodne podáva ako F(ab')2 alebo ako fragmenty scFv na diagnostické účely. To zaručuje vynikajúce výsledky, takže odčítanie pozadia nie je nutné.
Vynález bližšie objasňujú, žiadnym spôsobom však neobmedzujú, nasledujúce príklady praktického uskutočnenia. Percentá sa rozumejú hmotnostné, pokiaľ to nie je inak uvedené.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Vezikuly A431
Prípravky vezikulov s odbúrateľnými membránami sa získajú trocha modifikovanými spôsobmi opísanými v literatúre (Cohen a kol., J. Biol. Chem. 257 str. 1523, 1982; Yeaton a kol., J. Biol, Chem. 258, str. 9254, 1983). Banky, obsahujúce bunky A431, sa premyjú PBS obsahujúcim vápnik a horčík. Pridá sa hypotonické PBS a banky sa pretrepávajú 15 minút. Bunky sa premyjú vezikulačným tlmivým roztokom (100 mM chloridu sodného, 50 mM dinátriumhydrogenfosforečnanu, 5 mM chloridu draselného, 0,5 mM síranu horečnatého, hodnota pH 8,5). Pridá sa vezikulačný tlmivý roztok a banky sa miešajú pri teplote miestnosti a pri teplote 37 °C. Tlmivý roztok sa dekantuje cez kovové sitko do 50 ml skúmaviek v ľade a odstreďuje sa päť minút pri 150 x g pri teplote 4 °C. Pelety sa odložia a supernatant sa ultra-odstreďuje pri otáčkach 39000/min. počas 90 minút. Získané pelety sa resuspendujú v 10 mM tlmivého roztoku Hepes (hodnota pH 7,4). Na analyzovanie EGFR z vezikulov sa vzorky vyzrážajú 9 objemami etanolu, resuspendujú sa s 0,08 M Tris, s hodnotou pH 6,8, a potom sa vykoná SDS-PAGE s MAb 425 ako štandardom.
Obsah proteínov produktov sa kvantifikuje modifikovaným spôsobom Coomassie Plus pomocou BSA ako štandardu a odčíta sa pri 595 nm. Na analyzovanie EGFR z vezikulov sa vzorky vyzrážajú deviatimi objemami etanolu cez noc pri teplote 4 °C. Pelety sa resuspendujú s Tris (0,08 M, hodnota pH 6,8) a vykoná sa SDS-PAGE (5 % gél, 1 hodina, 35 mA, 10 % tekutý gél, 2,5-hodiny, 40 mA). Vzorky a štandard sú dvojité. Jedna z nich sa ofarbí Coomassie modrosťou a ostatné sa nakvapkajú na nitrocelulózové listy (12 V, 16 hodín pri teplote 4 °C) a spracujú sa myším mAb 425 (anti-EGFR) a antimyšou protilátkou IgG konjugovanou k alkalickému fosfátu.
Na imunizáciu in vitro sa použijú tri médiá. Médium 1 (Ml), médium 2 (M2) a zmiešané médium tymocitovej kultúry (MTC). Ml sa skladá z HLI (Ventrex Laboratories, Sp. st. a.) suspendované s 50 mM 2-merkaptoetanolu a 2 mM L-glutamínu (Gibco). M2 sa skladá z HLI doplneného 50 mM 2-merkaptoetanolu; 40 U/ml IL-2 (Genzyme); 20 mg/ml adjuvans peptidu (Sigma); 2mM L-glutaminu; 100 U/ml penicilínu (Gibco); 100 mg/ml streptomycínu (Gibco). Do M2 sa pridá 4 % alebo 20 % FCS (Biological Industries). MTC sa pripraví spôsobom, ktorý opísal Vaux (1). Pri tomto spôsobe sa jednobunkové suspenzie týmusu tri týždne starých myší Balb/c a C57/ML-1 pripravia pretlačením týmusových uzlín sterilným sitom s veľkostou otvorov sita 300 mikrometrov (50 mesh). Suspenzia buniek sa zhromaždí, premyje sa dvakrát HBSS a počet živých buniek sa zistí vylúčením trypánovej modrosti. Tymocyty sa potom kultivujú pri hustote 2,5 x 106 tymocytov každého kmeňa na 1 ml v médie HLI obsahujúcom 4 % FCS, 2mM L-glutamínu, 100 U/ml penicilínu a 100 mg/ml streptomycínu. Po 48 hodinách sa supematant oddelí, sfiltruje sa cez 0,22 mm filter a uloží sa pri teplote -70 °C.
Suspenzia splenocytov z neimunizovaných osem týždňov starých myši BALB/c sa získa spôsobom opísaným pre tymocyty. Životnosť sa zistí vylúčením trypánovej modrosti.
Príklad 2
Imunizácia in vitro a skrining
Na imunizáciu in vitro sa použijú tri médiá. Médium 1 (Ml), médium 2 (M2) a médium zmiešaných tymocytových kultúr (MTC). Ml tvorí HLI (Ventrex Laboratories, Sp. st. a.) doplnené 50 mM 2-merkaptoetanolu a 2mM L-glutamínu (Gibco). M2 tvorí HLI doplnené 50 mM 2-merkaptoetanolu; 40 U/ml IL-2 (Genzyme); 20 mg/ml adjuvans peptidu (Sigma); 2 mM L-glutamínu; 100 U/ml penicilínu (Gibco); 100 mg/ml streptomycínu (Gibco). Do M2 sa pridá 3 % alebo 20 % FCS (Biological Industries). MTC sa pripraví spôsobom opísaným Vauxom (1). Pri spôsobe sa jednobunková suspenzia týmusov tri týždne starých myší Balb/c a C57/ML-1 pripraví pretlačením týmusových uzlín sterilným sitom s veľkostou otvorov sita 300 mikrometrov (50 mesh). Suspenzia buniek sa zhromaždí, premyje sa dvakrát HBSS a počet živých buniek sa zistí vylúčením trypánovej modrosti. Tymocyty sa potom kultivujú pri hustote 2,5 x 106 tymocytov každého kmeňa na 1 ml v médie HLI obsahujúcom 4 % FCS, 2mM L-glutamínu, 100 U/ml penicilínu a 100 mg/ml streptomycínu. Po 48 hodinách sa supematant oddelí, sfiltruje sa cez 0,22 mm filter a uloží sa pri teplote -70 °C.
Suspenzia splenocytov z neimunizovaných osem týždňov starých myší BALB/c sa získa ako je opísané pre tymocyty. Životnosť sa zistí vylúčením trypánovej modrosti.
Jednobunková suspenzia týmusov tri týždne starých myší Balb/c a C57/ML-1 sa pripraví pretlačením týmusových uzlín sterilným sitom s veľkosťou otvorov sita 300 mikrometrov (50 mesh). Suspenzia buniek sa zhromaždí, premyje sa dvakrát HBSS a počet živých buniek sa zistí vylúčením trypánovej modrosti. Tymocyty sa potom kultivujú pri hustote 2.5 x IOJ tymocytov každého kmeňa na 1 ml v médie HLI obsahujúcom 4 % FCS, 2mM L-glutamínu, 100 U/ml penicilínu a 100 mg/ml streptomycínu. Po 48 hodinách sa supematant oddelí, sfiltruje sa a uloží. Suspenzia splenocytov z neimunizovaných osem týždňov starých myší BALB/c sa získa spôsobom opísaným pre tymocyty. Životnosť sa zistí vylúčením trypánovej modrosti.
Imunizácia in vitro sa vykoná v 6-jamkových doštičkách (Costar). Jamky obsahujúce 107 splenocytov v 3,5 ml média Ml (tvoreného médiom HLI (Ventrex Laboratories. Sp. st. a.) doplneným 50 mM 2-merkaptoetanolu a 2mM L-glutamínu (Gibco)) sa inkubujú (37 °C, 5 % oxidu uhličitého) s vezikulami nesúcimi EGFR v požadovanej koncentrácii. Vezikuly z buniek, ktoré neexpresujú EGFR alebo PBS sa pridajú do kontrolných jamiek. Po niekoľkých hodinách sa do každej jamky pridá 3,5 ml média M2 (tvoreného médiom HLI doplneným 50 mM 2-merkaptoetanolu. 40 U/ml IL-2 (Genzyme), 20 pg/'ml adjuvans peptidu (Sigma), 2 mM L-glutamínu, 100 U/ml penicilínu (Gibco), 100 mg/ml streptomycínu (Gibco), obsahujúceho 3 % alebo 20 % FCS (Biological Industries). Pri niekoľkých pokusoch je M2 nahradené médiom MTC (zmiešané tymocytové kultivačné médium (Vaux a kol., Náture 336, str.36, 1988) doplnené adjuvans peptidom (20 pg/ml) a IL-2 (40 U/ml)) (pripomína sa, že konečná koncentrácia FCS, IL2 a adjuvans peptidu v kultúre je znížená o 50 %). Bunky sa inkubujú za rovnakých podmienok počas 72, 96, 120 a 144 hodín a nakoniec sa bunky testujú na prítomnosť špecifického imunoglobulínu alebo sa spracujú na izoláciu RNA.
Skrining sa vykoná vyčistenými antigénmi alebo fixovanými bunkami A431. Postup je v podstate rovnaký ako je opísané (Carroll a kol., Hybridoma 9, str. 81, 1990) len s určitými modifikáciami. Postupuje sa tak, že sa sterilné 96 jamkové doštičky (Nunc, Maxisorb) cez noc potiahnu vyčisteným EGFR (2,5 pg/ml), GD3 gangliozidom (2 pg/ml) alebo RNázou (10 pg/ml) v PBS. Keď sa použijú bunky A431 ako antigén, kultivujú sa bunky v 96-jamkových doštičkách až do spojenia a fixujú sa 0,1% glutaraldehydom. Lymfocyty imunizované in vitro sa premyjú a resuspendujú sa v médiu HLI doplnenom 2 % FCS a 2mM L-glutamínu pri 5 x 105 buniek/ml a do každej jamky sa pridá 1 x 105 buniek a inkubujú sa (37 °C, 5 % oxidu uhličitého) počas 48 hodín. Urobí sa 16 duplikátov z každej skupiny. Lymfocyty sa odstránia 5-násobnvm premytím PBS obsahujúcim 0,1 % Tween-20. Špecifické imunoglobulíny sa detekujú pomocou značeného králičieho antimyšieho imunoglobulinu (Dáko) (1 hodina, 37 CC). Ako substrát sa použije diamóniová soľ kyseliny 2,2'-azino-bis-(3-ctyIbcnztiazolín-6-sulfónovej (ABTS) (Sigma) v citrát-fosfátovom tlmivom roztoku (0,55 mg/ml).
Príklad 3 Konštrukcia knižnice
Tri knižnice sa konštruujú z RNA pripravenej z myšej sleziny imunizovanej intraperitoneálne bunkami A431 (Murthy a kol., Árch. Biochem. Biophys. 252, str. 549, 1987) z podkolennej lymfatickej uzliny myši imunizovanej v labke vyčisteným EGFR a z myších buniek imunizovaných vezikulami A431 in vitro. Syntetizuje sa prvý reťazec cDNA. Gény VH a VK sa zosilnia PCR a zhromaždia sa (Clackson a kol., Náture 352, str. 624, 1991). Pomocou PCR sa pripoja Notl a Sfil reštrikčné miesta a scFv sa klonujú do fágemidového vektoru pHĽNl (Hoogenboom a kol.. Nucl. Acids Res.19. str. 4133, 1991). Ligačné zmesi sa elektroporujú do buniek E. coli a výsledné kolónie sa zoškriabu do média na vytvorenie knižnice (Marks a kol.. J. Mol. Biol. 222, str. 581, 1991).
Príklad 4
Skrining knižnice
Fágové protilátky sa z knižníc vyberú pomocným fágom M13KO7 (Promega, Madison, WI) (Marks a kol., J. Mol. Biol. 222, str. 581. 1991). Imunoskúmavky (Nunc, Life Sciences, Paisley, UK) sa potiahnu 4 ml 2,5 pg/ml EGFR v PBS cez noc. Po trojnásobnom premytí PBS sa skúmavky inkubujú pri teplote 37 °C počas najmenej jednej hodiny v PBS obsahujúcom 2 % práškového mlieka (PBSM). Fág (1012 až 1013) sa resuspenduje v 4 ml PBSM a inkubuje sa v skúmavke pokrytej EGFR 1 hodinu pri teplote miestnosti. Skúmavka sa premyje 20-krát PBS 0,1% Tween a 20-krát PBS. Viazaný fág sa eluuje po 10 minútovej inkubácii v 1 ml 0,1 M trietylamínu za stáleho miešania. Eluovaný fág sa neutralizuje prísadou 0,5 ml IM Tris-HCl s hodnotou pH 7,5 a použije sa na infikovanie log fázy buniek TG1 E. coli. Infikované bunky sa rozprestrú a očkujú a individuálne kolónie sa zachytia na indukciu scFv v malom meradle. Zostávajúce kolónie sa zoškrabú do média a podiel sa použije na prípravu fágu pre ďalší beh skríningu.
Príklad 5
Výroba a analýza scFv
Rozpustné scFv sa produkujú v E. coli HB2151 ako je opísané (napríklad Kettleborrough a kol.). Koncentrácia scFv v bakteriálnych supernatantoch sa stanoví pri použití čisteného scFv so známou koncentráciou ako štandardu. Supematanty sa sfiltrujú a pridá sa azid sodný do 0,1 %. Sériové zriedenia supematantov a štandardu sa nakvapkajú na filtre Ímmobillon-PVDF (Millipore, Watford, UK) v 96-jamkovej doštičke. Filtre sa spracujú ako Western blot (Towbin a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, str. 4350, 1979). Detekujú sa scFv pri použití protilátky (9E10) zameranej na C-zakončenie (Munro a Pelham, Celí 46, str. 291, 1986) a potom peroxidázou konjugovanej kozej antimyšej protilátky IgG a IgM (Jackson Immuno Research Lab Inc. West Grove, PA). Reakcie sa vyvolajú pri použití systému ECL (Amersham, Aylesbury, UK). Denzitometrom sa premiéri pre-flešové autorádiogramy. Pripraví sa štandardná krivka a použije sa na určenie koncentrácií scFv v supernatantoch.
Vykonajú sa testy ELISA antigénovej väzby s doštičkami potiahnutými EGFR (2,5 pg/ml) . Supematantový povlak scFv sa zriedi v PBSM a pridá sa na doštičky. Viazané scFv sa detekujú pomocou 9E10 protilátky, ako je opísané Supematanty sa tiež testujú na väzbu k panelu nepríbuzných proteínov a plastu. Doštičky ELISA sa potiahnu cez noc 100 pg/ml ovalbumínom, lyzozymom slepačích vajec, cytochrómom c, glyceraldehydom 3-fosfátdehydrogenázy, myším albumínom (kmeň CBA) a B SA. Nezdedené supematanty', obsahujúce 2 % práškového mlieka, sa pridajú ako duplikát k potiahnutým doštičkám a viazané scFv sa detekujú opísaným spôsobom.
Testy ELISA väzby k bunkám sa vykonajú pomocou línií nádorových buniek, A431 (ATCC CRL 1555), MDA MB 468 (ATCC HTB 132) a SK-MEL-23 (negatívna kontrola). Bunky sa nechajú rásť až do spojenia v miskách s poly-D-lyzínom spracovanými 96-jamkovými tkanivovými kultúrami (Nunc). Bunky sa premyjú DMEM a blokujú sa pri teplote 37 “C dve hodiny s PBSA obsahujúcim 2,5 % BSA. Po odsatí sa do každej jamky pridajú supematanty spolu s rovnakým objemom média 2xYT obsahujúceho 4 % práškového mlieka a inkubujú sa pri teplote 4 °C jednu hodinu. Viazané scFv sa detekujú opísaným spôsobom.
Testy ELISA na konkurenčnej báze sa robia preinkubáciou EGFR potiahnutých doštičiek ELISA s 50 μΐ vyčisteného scFv (100 Mg/ml) počas 10 minút. Potom sa pridá myší MAb 425 (50 μΐ) na dosiahnutie koncentrácie 3,13 až 200 ng/ml. Po inkubácii a premytí sa detekujú myšie MAb 425 pomocou peroxidázou konjugovanej kozej antimyšej protilátky IgG a IgM.
Príklad 6
Analýza DNA
Na BstNI mapovanie peptidov sa zosilnia PCR inzerty scFv z jednotlivých klonov a produkty sa digerujú s BstNI (Clackson a kol., Náture 352, atr. 624, 1991). DNA sa sekvenuje pri použití kitu Sequenase (United States Biochemical, Cleveland, OH)
Príklad 7 Čistenie scFv
Bakteriálne supematanty sa vyčíria odstredením a filtráciou 0,2 pm filtrami pred vnesením na 1 ml stĺpec vyčisteného EGFR (5 mg) kopulovaného na brómkyánom ak tivovanej Sepharose 4B (Pharmacia, Upsala, Švédsko). Stĺpec sa premyje 30 ml PBS, následne 5 ml 0,2M glycínom s hodnotou pH 5,0. Eluujú sa scFv pri použití systému 0,2M glycín/kyselina chlorovodíková s hodnotou pH 2,8. Eluát sa neutralizuje 10 x PBS. Frakcie, obsahujúce proteín, sa zhromaždia a tlmivý roztok sa zamení ultrafiltráciou (Amicon, Stonehouse, UK) na PBS obsahujúcu 1 % BSA a 0,05 % azidu sodného.
Príklad 8
Analýza FACS vyčistených scFv
Bunky A431 sa trypsinujú a inkubujú v DMEM obsahujúcom 10 % FCS. Bunky sa premyjú dvakrát studeným DMEM a sfiltrujú sa sitom 45 pm. Bunky (106) sa inkubujú na ľade 30 minút v 50 μί PBS, 1 % BSA, s vyčistenými scFv. Po dvoch premytiach studeným PBS sa detekujú viazané scFv pomocou 50 pl FITC-konjugovanou protilátkou 9E10 (100 pg/ml. Po 30 minútach na ľade sa bunky premyjú raz PBS, fixujú sa v PBS obsahujúcom 1 % formaldehydu a analyzujú sa pomocou FACSCAN (Becton-Dickinson, Cowley, UK).
Príklad 9
Konštrukcia, analýza a expresia úplných chimerických protilátok
Pri použití miest Pstl a BstEII sa subklonujú DNA kódujúce VH vybraných scFv do prechodného vektoru VH obsahujúceho eukaryotickú vodcovskú sekvenciu odvodenú z ľudskej protilátky HG3 CL (Rechavi a koľ,Proc. Natl. Acad. Sci, USA 80, str. 855, 1983) a zostrihového donorového miesta (obr.3). DNA kódujúce VK sa adaptujú pre inzerciu do prechodného vektoru VK pomocou PCR prajmerov na začlenenie miest Xhol a Sstl na zakončenia 5' a 3' (VkFor: 5'CCG TTT CAG CTC GAG CTT GGT CCC-3', VkBack: 5’-GAG ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA-3'). Fragmenty Sstl-Xhol sa klonujú do prechodného vektoru VR obsahujúceho eukaryotickú vodcovskú sekvenciu odvodenú od pretvarovaného ľahkého reťazca ľudskej CAMPATH-1 (Rcichmann a kol., Náture 332, str. 21, 1988) a od zostrihového donorového miesta (obr. 3). DNA kódujúca variabilné pluseukaryotické lemovacie oblasti sa klonujú ako fragmenty Hindiii-BamHI do expresných vektorov cicavčích buniek obsahujúcich genómové DNA kódujúce konštantnú ľudskú oblasť gama-1 alebo konštantnú ľudskú kappa-oblasť (Maeda a kol., Hum. Antibod. Hybridomas 2, str. 124, 1991). Expresné vektory s ťažkým a ľahkým reťazcom sa elektroporujú do buniek COPS. Po 72 hodinách sa médium zhromaždí a chimerické anti-EGFR protilátky sa analyzujú metódou ELISA (Kettleborrough a kol., Protein Eng. 4, str. 773, 1991).
Príklad 10
Príprava scFv odvodených z buniek imunizovaných in vitro
Ďalej opísané spôsoby sú miernou modifikáciou opísaných spôsobov. Imunizácia, konštrukcia knižnice a skríning sú uvedené v príkladoch 1 až 4. Nasledujúce stupne sú ďalej podrobne opísané.
Po skríningu primárnej knižnice a klonov odvodených z troch behov spracovania sa vyberie niekoľko jednotlivých k ampicilínu rezistentných kolónií. Alkalickou lýzou sa pripraví fágemid DNA a použije sa na transfektovanie nesupresorového kmeňa E. coli HB2151 tepelným šokom. Kolónie sa inokulujú do 2 x TY-Amp-Glu a nechajú sa rásť cez noc pri teplote 30 °C. Použije sa 5 ml podielov na inokuláciu 50 ml 2 x TY pôdy obsahujúceho 100 mg ampicilínu/ml a 0,1 % glukózy a rast sa vykoná za pretrepávania pri 30 °C počas jednej hodiny (až do log-fázy). Bunky sa zoberú a expresia rozpustných scFv sa navodí prísadou izopropyl-β-D-tiogalaktopyranozidu (1PTG) do konečnej koncentrácie 1 mM (De Bellis D. a Schwartz I., Nucleic Acids Res. 18, str. 1311, 1990). Kultúry sa nechávajú rásť cez noc pri 30 °C za pretrepávania. Odoberú sa supernatanty obsahujúce scFv vyčistené odstredením a filtráciou cez 0,22 mm filtrami a testujú sa. Bakteriálne supernatanty sa testujú na väzbu k EGFR metódou ELISA (Kettleborrough a kol., EP 94104160 a Eur, J. Immunol. 24, str. 952, 1994). Špecifickosť selektovaných fragmentov scFv sa kontroluje spôsobom ELISA pomocou doštičiek potiahnutých rôznymi proteínmi príbuznými alebo nepríbuznými EGFR i inými antigénmi a plastmi. Použitými antigénmi sú: RNáza, BSA. OVA, gangliozid GD3, vitrorektínový receptor (VNR), došičkový glykoproteín llbllla (GPllbllla) a disialyl-lakto-N-tetraóza (DSLNT). Povlaky sa vykonajú cez noc pri optimálnej koncentrácii pre každý antigén. Potiahnuté doštičky ELISA sa blokujú počas jednej hodiny pri teplote 37 °C 1,5 % odstredeným mliekom v PBS (hmotnosť k objemu). Po premytí sa pridá 100 ml supernatantov scFv do mikrotitrových jamiek a inkubuje sa počas dvoch hodín pri teplote 37 °C. Viazané scFv sa detekujú pomocou protilátky anti-c-myc 9EI0 (odpadné kultivačné prostredie od Myc 1-9 E 10.2 hybridu) a králičej anti-myšej protilátky (Dáko) konjugovanej alkalickou fosfatázou.
Na testovanie schopnosti scFv väzby k EGFR na bunkách sA použijú tri rady nádorových buniek, nesúcich EGFR, A431, MDA MB 231 ľudského adenokarcinómu prsníka (ATCC HTB 26) a HT29 ľudského adenokarcinómu hrubého čreva (ATCC, HTB 38) a jednej EGFR neexpresujúcej bunkovej línie WM 164 pomocou analýzy FACS a imunofluorescencie s nefixovanými bunkami. Na nepriamu imunofluorescenčnú analýzu sa bunky vnesú do ľerasaki doštičiek (2 x 104 buniek/jamka) a kultivujú sa počas 24 hodín. Potom sa bunky inkubujú 20 ml surového bakteriálneho supernatantu obsahujúceho fragmenty scFv počas 90 minút pri teplote miestnosti. Inkubácia s primárnou protilátkou (anti-c-myc) a sekundárnou protilátkou sa uskutočni počas 60 minút pri teplote miestnosti. Sekundárna protilátka, FlCT-konjugovaná králičia anti-myšia protilátka (Dáko) sa zriedi v pomere 1 : 20.
Na analýzu FACS sa premyje 5 x 105 buniek PBS s 1 % BSA a s 0,1 % azidu sodného (PBS-BSA) a inkubuje sa pri teplote 4 °C počas 20 minút s 50 ml surového bakteriálneho supernatantu. Po dvojnásobnom premytí studenou PBS-BSA sa viazané scFv detekujú pomocou protilátky anti-c-myc a konjugované FľľC-konjugovanej kozej antimyšej protilátky (Becton-Dickinson) zriedenej 1 : 25 v PBS-BSA. Do konečnej koncentrácie 5 mg/ml sa pridá propídiumjodid (PI). Prietoková cytometrická analýza sa urobí v EP1CS Profilu II vybavenom vzduchom chladeným argónovým laserom. Na excitáciu sa použije čara 488 nm (15 mV). Na zhromaždenie emisie FITC sa použije pásmový filter 530 nm a na zhromaždenie emisie PI sa použije pásmový filter 625 nm. Živé bunky sa vyberú zostavením bitovej mapy na predný a bočný rozptyl a vylučovaním na bunkách ofarbených PI.
Rozmanitosť primárnej a vybranej knižnice sa určí zosilnením PCR klonovaných fragmentov (Giissow D., Clacksonm T., Nucleic Acids Res. 17, str. 4000, 1989) a analýzou BstNI digesčného obrazca (8). Niekoľko klonov sa sekvenuje pri použití kitu Sequenase (USB) spôsobom dideoxy-reťazcového zakončenia (Sanger F. a koľ, J. Proc. Nat. Acad. Sci., USA 74, str. 5463, 1977).
Surové bakteriálne supernatanty (10 ml) sa podrobia SDS-PAGE pri použití 12,5 % gélu. Vykoná sa Western blotting v podstate spôsobom, ktorý opísal Towbin (Tow bin a kol., J. Proc. Nat. Acad. Sci. USA , 76, str. 4350, 1979). Proteíny sa transferujú elektroblottingom na Immobilon-P (Millipore) alebo na nitrocelulózu (Bio-Rad). Škvrna (blot) sa blokuje PBS obsahujúcim 2 % odstredeného mlieka (hmotnosť/objem). Fragmenty scFv sa detekujú pri použití anti-c-myc protilátky (9E10), peroxidázou konjugovanej protilátky anti-myšej (Jackson) a podporeného systému chemiluminiscencie (ECL, Amersham).
Kvantitatívna analýza odlúčených membránových vezikulov ukazuje celkovú proteínovú koncentráciu 2,5 mg/ml, z ktorej iba 10 až 14 % zodpovedá EGFR (Sato a kol., J. Natl. Cancer Inst. 21, str. 1601, 1989; Yeaton R. a kol., J. Biol. Chem. 1983,258, str. 9254. 1983,), 250 až 350 ng/ml. Elektroforézna analýza pri použití PAGE-SDS nasledovaná vyfarbovaním Coomassie modrosťou ukazuje, že vezikuly obsahujú skôr komplexnú zmes proteínov. Nezisťuje sa žiadne odbúranie proteínov. Western blot analýza ukazuje, že za daných experimentálnych podmienok sú v prípravku membránového vezikulu obsiahnuté úplné molekuly receptora EGF.
Na určenie požiadaviek pre FCS a limphokiny sa porovnávajú MTC a M2 obsahujúce 20 % alebo 4 % FCS. Ako antigén a kontrola sa používajú vezikuly nesúce EGFR a PBS. Splenocyty sa inkubujú v šesť-jamkových doštičkách s antigénom a bez neho počas troch hodín v Ml (bez séra). Potom sa pridá MTC alebo M2 a po 72, 96, 120 a 144 hodinách sa uskutočni skríning pri použití buniek fixovaných A431. Pri všetkých pokusoch je počet získaných žijúcich buniek 20 až 40 % v súlade s publikovanými výsledkami (Gavilondo-Cowley J. a kol., In Vitro Immunization in Hybridoma Technology, Elsevier Science Publishers B.V. , Amsterdam, str. 131. 1988). Maximálna špecifická odozva sa získa štvrtý deň s MTC; zatiaľ čo M2 pri 4 % alebo 20 % FCS (2 % alebo 10 % konečnej koncentrácie) posúva maximálnu odozvu až do šiesteho dňa (tabuľka II). Ale MTC a 10 % FCS spúšťa nešpecifickú odozvu, snáď polyklonálnou aktiváciou, ako je možné pozorovať, keď sú výsledky vyjadrené ako pomer špecifickej k nešpecifickej odozve. Na ďalšie skúšky sa používa M2 doplnený 4 % FCFS a šesťdenná kultúra.
Prítomnosť EGFR v povrchu vezikulov silne podporuje odozvu na tento antigén. V podobných protokoloch, ako je opísané, sa porovnávajú vezikuly z EGFR expresujúcich a neexpresujúcich bunkových línií. Lymfocyty sa kultivujú s vezikulamí v Ml počas troch hodín. Potom sa pridá M2 obsahujúci 4 % FCS. Po šiestich dňoch sa lymfocyty z každej skupiny kultivujú 48 hodín v 96-jamkových doštičkách potiahnutých EGFR, fixovanými bunkami A431, RNázou alebo GD3. Podľa očakávania ukazujú výsledky analýz multišpecifický obraz odozvy (tabuľka III). Reaktivita proti EGFR je zreteľne zvýšená podľa optickej hustoty, keď sa použije EGFR expresujúci vezikuly ako antigén.
V súhrne ukazujú výsledky, že hoci nedokonalá, je merateľná od antigénu závislá odozva po imunizácii in vitro, čo vytvára niekoľko očkovacích imunizovaných lymfocytov proti EGFR vhodných na klonovanie PCR variabilných oblastí.
Knižnica 1,1 x 105 klonov sa získa po klonovaní fragmentov scFv odvodených z imunizácie in vitro imunizácie do fágemidu pHENI. Táto knižnica je generovaná paralelne s dvoma ďalšími knižnicami za predpokladu imunizácie in vivo. Konštrukcia týchto fágových knižníc bola opísaná už skôr (Kettleborrough a kol., EP 94104160 a Eur. J. Immunol. 24, str. 952, 1994).
Na selekciu fragmentov scFv, viazaných k EGFR, sa pestujú fágy pri použití imunoskúmaviek potiahnutých EGFR. Eluované fágy sú použité na reinfektovanie SupE
Deň sereeningu proti A431
3. deň 4. deň 5. deň 6. deň
Test Antigén O.D.c^Pomer^^ O.D. Pomer O.D. Pomer O.D. Pomer subkmeňa E. coli. Celkovo sa uskutočnia tri behy selekcie. V každom behu sa testuje skúmavka bez antigénu paralelne na vyrátanie pozadia. Pri prvom behu sa aplikuje 1,5 x 1O10 fágových častíc do imunoskúmavky a 6,6 x 104 sa eluuje z potiahnutej imunoskúmavky, zatiaľ čo iba 200 kolónií sa získa z populácie pozadia. Po treťom behu sa aplikuje 1 x x I O11 fágov a eluuje sa 5,6 x 1O10.
Na ďalšiu charakterizáciu fragmentov scFv sa vyberie 22 klonov z fágových populácií pred selekciou a po každom behu selekcie.
Rozličnosť knižnice sa analyzuje BstNl digesčnými obrazcami klonovaných fragmentov. Pred selekciou sa knižnica zdá ako veľmi rozmanitá. Mapovanie peptidov väzbových klonov, odvodených po prvom behu selekcie, naznačuje prítomnosť niekoľkých skupín s rovnakým reštrikčným obrazcom.
Klony sa vyberajú z rôznych behov selekcie na základe ich digesčných obrazcov. Sekvenovanie DNA ukazuje prítomnosť rôznych sekvencií vo väčšine selektovaných klonov. Dĺžka a zloženie oblastí určujúcich komplementaritu (CDR) klonov 1OD2, 5D3, 1OE2, 1B3, 4B3 a 5E2 sú rôzne. Väčšina variácií sa pozoruje v sekvenciách CDR3 VH a VL. Klony 5D3 a 1E3 sú odvodené od tretieho behu selekcie. Silne sa viažu k EGFR ako je analyzované metódou ELISA a prietokovou cytometriou a majú rovnakú sekvenciu.
Rozpustné fragmenty scFv sa získajú rastom nesupresorového kmeňa E. coli HB 2151 v prítomnosti IPTG.
Na overenie produkcie scFv sa analyzuje bakteriálne médium z individuálnych klonov gélovou elektroforézou. Analýza Western blot ukazuje zreteľný pruh okolo 35 000 kD.
Klony s väzbovými aktivitami k EGFR sa identifikujú metódou ELISA. Na preskúmanie vzájomnej reaktivity vybraných klonov sa uskutočnia testy ELISA pri použití rôznych antigénov. Antigény (EGFR, RNáza, BSA, KLH, OVA, GD3 gangliozid, vitronektínový receptor, doštičkový glykoproteín llbllla a disialyllakto-N-tetraóza) sa nanesú ako povlak do doštičiek ELISA pri optimálnej koncentrácii (tabuľka IV). Nezistuje sa žiadna väzba k ne-EGFR antigénom Testujú sa tiež scFv na väzbu k trom EGFR nesúcim nádorové bunkové línie (ľudský epidermálny karcinóm Λ431, ľudský adenokarcinóm prsníka MDA MB 231 a ľudský adenokarcinóm hrubého čreva HT29). WM 164 ľudský melanóm neexpresujúci EGFR sa použije ako negatívna kontrola. Fragmenty, ktoré viažu línie nádorových buniek, sa testujú nepriamo imunofluorescenciou pri použití nefixovaných buniek a kvantifikujú sa FACS analýzou. Použitie nefixovaných buniek zaručuje prírodnú konformáciu membránových receptorov. Pozitívne klony majú zreteľnú fluorescenciu použitím buniek A431. Fluorescencia s inými nádorovými bunkovými radami nesúcimi EGFR je slabá. Nezisťuje sa žiadna väzba k negatívnej línii buniek. Výsledky sú potvrdené prietokovou cytometriou. Sedemnásť pozitívnych klonov a tri negatívne klony sa analyzujú na väzbu k bunkám A431, MDA MB 231 a HT 29 prietokovou cytometriou. WM 164 sa použije ako negatívne bunkové rady. Ako pozitívna kontrola sa použije 425 scFv (PI kloň) a klonový vektor (HEN) ako negatívna kontrola. Výsledky sú zhrnuté v tabuľke V. Dva klony, 4B2 a 5E2 sú pozitívne z hľadiska väzby k EGFR podľa testu ELISA, ale negatívne z hľadiska väzby k EGFR expresujúcim radám nádorových buniek.
Tabuľka II
Vplyv rôznych médií na imunizáciu in vitroa>
1 vezikuly PBS 0,393 0,186 2,11 0,801 3,76 0,213 0,7B4 3,90 0,201 0,951 10,3 0,092
2 vezikuly 0,527 2,50 0,852 1,76 0,863 2,75 1,168 3,94
PBS 0,210 0,482 0,313 0,296
3 vezikuly 0,763 1,48 1,169 2,01 1,089 2,07 1,115 1,91
PBS 0,513 0,581 0,525 0,581
Test 1: Ml plus M2, 4 % FCS (konečné FCS: 2 %) Test 2: Ml plus M2, 20 % FCS (konečné FCS: 10 %) Test 3: A-médium plus MTC, 4 % FCS (konečné FCS: 2 %)
a) Slezinné myšie bunky BALB/c (107) sa inkubujú v 3.5 ml Ml s vezikulami z buniek A431 alebo PBS počas troch hodín v jamkách šesť-jamkových doštičiek. Potom sa pridá 3,5 ml MTCD alebo M2 obsahujúceho 4 % alebo 20 % FCS a doštičky sa inkubujú. Z kultivačného prostredia sa 3., 4., 5. alebo 6. deň vyberú lymfocyty imunizované in vitro, premyjú sa HBSS na odstránenie vezikulov a naočkujú sa do 96-jamkových doštičiek potiahnutých fixovanými bunkami A431 a inkubujú sa počas 48 hodín (pozri metódy)·
b) Konečná koncentrácia FCS v kultivačnom prostredí.
c) O. D.= optická hustota (Optical Density) odčítaná pri 405 nm. Predstavuje priemer zo 60 jamiek.
d) Pomer špecifickej odozvy (vezikuly ako antigén) k nešpecifickej odozve (PBS ako antigén).
Tabuľka III
Multi-špecifickosť odozvy po imunizácii in vitro1*
Skupina antigénov Bunky A431 EGFR CD3 RNáza
Test 1 EGFR* 0,512fa> 0,326 0,140 0,249
EGFR·* 0,427 0,070 0,123 0,304
Test 2 EGFR* 1,430 0,730 0,233 0,670
EGFR- 0,7B9 0,195 Ο,ΙΙΒ 0,561
a) Lymfocyty sú imunizované in vitro pomocou buď EGFR expresujúcich vezikulov (EGFR+), alebo vezikulov neexpresujúcich EGFR (EGFR-). Po šiestich dňoch inkubácie sa bunky z kultivačného prostredia vyberajú a testujú sa proti uvedeným antigénom.
b) Odozva je vyjadrená ako optická hustota (405 nm).
Tabuľka IV
Vzájomná reaktivita vybraných fragmentov scFv proti niekoľkým antigénom3*
Antigén^ Povlak ng/ml Výsledok
EGFR 2,5 +
RNáza 10,0
BSA 10,0
KLH 10,0
OVA 10,0
GD^ gangliozid 2,0
VNR 1.0
GPIIblIIa 1.0
DSLNT 5,0
a) Testy ELISA boli urobené ako je opísané.
b) Vitronektínový receptor (VNR); doštičkový glykoproteín IlblIIa (GPIIblIIa): disialyllakto-N-tetraóza (DSLNT).
Tabuľka V
Reaktivita klonov scFv proti EGFR. Komparatívne výsledky medzi metódou ELISA s vyčisteným rozpustným antigénom a cytometrickou analýzou bunkových radov.
Klony Cytonetrická analýza radov nádorových buniek*)(priemer lubovolných fluorescenčných jednotiek) ELISA (O.D.)
Pozitívny WM164 A431 MDAAMB231 HT29 EGFR
7H1 1,5 112,9 16,4 2,6 1,2
4B2 1,2 5,3 4,2 0,6 2
10D2 1,5 145,3 36,3 4,6 2
12D2 1,8 129,5 29,3 5,7 2
5E2 1,4 2,5 7,1 0,5 1.8
8E2 1,5 134,5 47,7 5,1 1,9
5F2 1,3 146,3 40,6 5,7 1.9
1LH2 1,9 152,2 25,3 2 1,9
1B3 0,6 10,1 36,4 5,2 >2
4B3 0,5 78 15,8 2,3 2
3D3 1,2 94,3 25,1 4,6 1 < 9
5D3 0,5 112 22,2 5,5 >2
4F3 0,4 110,3 32,3 6,2 >2
4G3 0,4 76,5 20,4 2 >2
1E3 0,4 118,3 33,8 5,1 2
3N3 0,6 76,5 33,7 4 ,2 >2
Negatívny
5F1 2,4 2,3 3,6 1,8 0,2
7G1 1,4 10,2 4 2,3 0,2
1H1 0,5 5 4 0,75 0,2
Kontroly
HEN 0,4 4,1 3,7 1,0 0,2
PI 0,6 85,5 21,3 2,5 1,9
a) Tri bunkové : rady nesúce EGFR (A431.
MDAAMB231 a HT29) a jeden neexpresujúci bunkový rad (WM164) použité na skúšku schopnosti scFv viazať rady nádorových buniek opísanou cytometrickou analýzou.
b) Ako negatívna kontrola použitý vektor bez fragmentu (HEN) a ako pozitívna kontrola použitý scFv fragment z 425 mAb (PI).
Priemyselná využiteľnosť
Jednoreťazcové fragmenty a protilátky proti receptoru epidermálneho rastového faktora na výrobu farmaceutických prostriedkov na liečenie nádorov, ako je melanóm, glióm alebo karcinóm. Protilátky môžu byť tiež použité na diagnostické účely lokalizácie a posúdenie nádorov in vitro alebo in vivo.
Zoznam sekvencií (1) Všeobecné informácie
i) Prihlasovateľ
A. meno: Merck Patent GmbH
B. ulica: Frankfurter Str. 255
C. mesto: Darmstadt
E. štát: Nemecko
F. poštové údaje: (ZIP): 64271
G. telefón: 49-6151-727022
H. fax:49-6151-727191 ii) Názov vynálezu
Anti-epidermálny rastový faktor a jeho receptorový jednoreťazcový protilátkový fragment, spôsob jeho prípravy a farmaceutický prostriedok, ktorý ho obsahuje iii) Počet sekvencií: 32 iv) Forma pre počítač
A. Typ média: Floppy disk
B. Počítač: IBM PC kompatibilný
C. Operačný systém: PC-DOS/MS-DOS
D. Softvér: Patentln Release ti 1.0, verzia ti 1,30 (EPO)
2. Informácie o sekv. ID. Č. 1:
i) Charakteristiky sekvencie
A. Dĺžka: 327 párov báz
B. Typ: nukleová kyselina
C. Reťazce: jeden
D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: cDNA iii) IIypotetická: žiadna iv) Anti-zmysel: žiadny
v) Typ fragmentu: N-zakončenie vi) Zdroj pôvodu
Λ. Organizmus: myš
B. Kmeň: Balb/c
D. Stav vývoja: dospelá
F. Typ tkaniva: lymfatická uzlina vii) Bezprostredný zdroj
B. Kloň: L2 1 IC (ľahký reťazec) ix) Charakteristika
A. Meno/klúč: CDS
B. Lokácia: I..327 xi) Opis sekvencie ID. č. 1
GAC ATT GAG CTC ACC Glu Leu Thr 5 CAG TCT CCA Pro GCC TCC CTG GCT GCA TCT GTG CGA Ala Ser Leu Al* Ala Ser Val Gly 4a
Α·Ρ 1 íle Gin Ser
10 1S
GAA ACT GTC ACC ATC ACA TGT CGA GCA AGT CAG AAC ATT TAC TAT ACT 96
Glu Thr Val Thr íle Thť cy· Arg Ala ser ciu λβη íle Tyr Tyr ser
20 25 30
TTA GCA TGG TAT CAG CAG AAG CAA GGG AAA TCT CCT CAG CTC CTG ATC 144
Leu Alt Trp Tyr Gin Gin Lys Cln Gly Lys Ser Pro Gin Leu Leu rie
35 40 45
TAT AGT GCA AGC GCC TTG CAA CAT GGT GTC CCA TCG AGG TTC ACT GCC 192
Tyr Ser Ale Ser Ala Leu Clu Asp Gly Val Pro Sar Arg Phe Ser Gly
50 ss 60
AGT GGA TCT CGG ACA CAG TAT TCT TTA AAG ATC AAC AAC ATG CAG CCT 140
Ser Gly Ser Cly Thr Cln Tyr Ser Leu Lys íle Aen Asn Met Gin Pro
65 70 75 80
GAA GAT ACC CCT ACT TAC TTC TGT AAA CAG ACT TAT GAC GTT CCG TGG 188
Glu Asp Thr Al* Thr Tyr Phe Cys Ly· Gin Thr Tyr Asp Val Pro Trp
85 90 95
ACG TIC GGT CCA GCC ACC AAG CTC GAA ATA AAA CGG GCG 327
Thr Phe Gly Gly Gly Thr lys Leu Glu íle Lys Arg Ala
103 105
2. Informácie o sekv. ID. Č. 2: í) Charakteristiky sekvencie
A. Dĺžka: 109 aminokyselín
B. Typ: aminokyselina
D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie ID. č. 2
Asp 1 íle Glu Leu Thr 5 Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Ala Ser Val Cly
10 15
Clu Thr val Thr íle Thr cys Arg Ala Ser Glu Asn íle Tyr Tyr Sar
20 2S 30
Leu Al* Trp Tyr Gin Gltl Lys Gin Cly Lys Ser Pro Gin Leu Leu íle
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Ala Leu Glu Asp Cly Val Pro Ser Arg Phe Ser Cly
SO 55 60
Ser Gly Ser Cly Thr Gin Tyr Ser Leu Lys íle Asn Asn Met Cln Pro
6S 70 75 80
Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cye Lys Gin Thr Tyr Asp Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu íle Lys Arg Ala
i nn 105
2. Informácie o sekv. ID. Č. 3:
i) Charakteristiky sekvencie
A. Dĺžka: 357 párov báz
B. Typ: nukleová kyselina
C. Reťazce: jeden
D. Topológia: lineárna i i) Typ molekuly: cDNA iii) Hypotetická: žiadna iv) Anti-zmysel: žiadny
v) Typ fragmentu: N-zakončenie vi) Zdroj pôvodu
A. Organizmus: myš
B. Kmeň: Balb/c
D. Stav vývoja: dospelá
F. Typ tkaniva: lymfatická uzlina vii) Bezprostredný zdroj
B. Kloň: L2 11C (ťažký reťazec) ix) Charakteristika
A. Meno/kľúč: CDS
B. Lokácia: 1..357 xi) Opis sekvencie ID. č. 3
CAG CTG CAA CTG Gin Leu CAG GAC TCA GGG CCT GAG CTG GTG AGG CCT GGG GCT 46
Gin 110 Val Gin Glu 115 Ser Gly Pr© Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
120 125
TCA GTG AAG ATG TCC TCC AAC CCT TCA GCC TAT ACC TTC ACT ACC TAC 96
Ser Val Lye Met Ser Cya Lye Ala Str Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
130 13S 140
TGG ATA CAC TGG ATG AAA CAG AGG CCT GGA CAA GGC CTT CAG TGG ATT 144
Trp 11· Hia Trp Het Lya Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Gin Trp íle
145 150 155
GGC ATG ATT GAT CCT TCC AAT AGT GAA ACT AGG TTA AAT CAG AAT TTC 192
Gly Met íle Aap Pro Str Aan Ser Clu Thr Arg Leu Aan Gin Aen Pb·
160 165 170
AGG GAC AAG GCC ACA TTG ACT GTA GAC AAA TCC TCC AAT AAA GCC TAC 240
Arg Aep Lye Ala Thr Leu Ser Val Asp Lya Ser Ser Aan Lya Ala Tyr
175 180 185
ATG CAG CIC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCA ATC TAT TAC TCT 29B
Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Aap Ser Ala íle Tyr Tyr Cys
190 195 2C0 205
GCA AGA TGG GAC TAC GGT ACT GGC CAC TTT GAC TAC TGG GGC CAA CGG 336
Ala Arg Trp Aep Tyr Gly Ser Cly Hla Phe Aap Tyr Trp Gly Gin Gly
210 215 220
ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA 357
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
22S
2. Informácie o sekv. ID. č.4:
i) Charakteristiky sekvencie
A. Dĺžka: 119 aminokyselín
B. Typ: aminokyselina
D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie ID. č. 4
Gin Val Gin Leu Gin Clu Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 $ 10 15
Ser Val Ly· Met Sar Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 2$ 30
Trp íle HÍB Trp Met Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu cln Trp íle
35 40 45
Gly Met íle Asp Pro Ser Am Ser Clu Thr Arg Leu Asn Gin Aen Phe
SO 55 60
Arg Asp Lye Ala Thr Leu Ser Val Asp Lys Ser Ser Aan Lys Ala Tyr
65 70 75 80
Kat Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala íle Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Tyr Gly Ser Gly Hls Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
Thr Thr val Thr Val Sar Ser
lis
2. Informácie o sekv. ID. Č.5:
i) Charakteristiky sekvencie
A. Dĺžka: 339 párov báz
B. Typ: nukleová kyselina
C. Reťazce: jeden
D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: cDNA iii) Hypotetická: žiadna i v) .Anti-zmysel: žiadny
v) Typ fragmentu: N-zakončenie vi) Zdroj pôvodu
A. Organizmus: myš
B. Kmeň: Balb/c
D. Stav vývoja: dospelá
F. Typ tkaniva: lymfatická uzlina vii) Bezprostredný zdroj
B. Kloň: L2 12B (ľahký reťazec) ix) Charakteristika
A. Meno/klúč: CDS
B. Lokácia: 1..339 xi) Opis sekvencie ID. č. 5
GAC . ATT GAG CTC ACC CAC TCT CCA CCT TCT TTG GCT GTG TCT CTA GCG 42
Aep íle Glu Leu Thr Gin Ser Pro Ala ser Leu Ala Val ser Leu Gly
120 125 130 135
CAG . AGG GCC ACC ATC TCC TCC AGA CCC ACC GAA ACT CTT GAT AAT TTT 96
Gin i Arg Ala Thr íle Ser Cya Arg Al* Ser Clu Ser Val Aap A»n Phe
140 145 150
GGC ATT AGT TTT ATG AAC TGG TTC CAA CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC 144
Gly íle Ser Phe Met Asn Trp Phe Gin Cln Lye Pro Gly Cln Pro Pro
155 150 165
AAA CTC CTC ATC TAT GGT CCA TCC AAC CAA CGA TCC GGG GTC CCT GCC 192
Lys Leu Leu íle Tyr Gly Ala ser Asn Gin Gly Sar Gly Val Pro Ala
170 175 180
AGG TTT AGT GGC AGT CCG TCT CGG ACA GAC TTC AGC CTC AAC ATC CAT 240
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Aep Phe Ser Leu Aen íle Hla
165 190 195
CCT CTG GAG GAG GAT GAT ACT GCA ATG TAT TTC TGT CAG CAA AGT AAG 288
Pro Leu Glu Glu Aep Asp Thr Ala Het Tyr Phe Cys Gin Gin Ser Lys
200 20$ 210 215
GAG GTT CCG CTC ACG TTC GCT GCT GGC ACC AAG CTG GAA ATA AAA CGG 336
Glu val Fro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lya Leu Glu íle Lys Arg
220 22S 230
CCC 339
Ala
2. Informácie o sekv. ID. Č. 6:
i) Charakteristiky sekvencie
A. Dĺžka: 113 aminokyselín
B. Typ: aminokyselina
D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie ID. č. 6
Asp íle Glu Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gin Arg Ala Thr íle Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Phe
20 25 30
Gly íle ser Phe Met Asn Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro
35 40 4S
Lys Leu Leu íle Tyr Gly Ala Ser Asn Gin Gly Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Cly Ser Cly Thr Asp Phe Ser Leu Asn íle HÍS
65 70 75 80
Pro Leu Glu Glu Asp ASp Thr Ala Het Tyr Phe Cys Gin Gin Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu íle Lys Arg
100 105 110
Ala
2. Informácie o sekv. ID. Č.7:
i) Charakteristiky sekvencie
A. Dĺžka: 357 párov báz
B. Typ: nukleová kyselina
C. Reťazce:jeden
D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: cDNA iii) Hypotetická: žiadna i v) Anti-zmysel: žiadny
v) Typ fragmentu: N-zakončenie vi) Zdroj pôvodu
A. Organizmus: myš
B. Kmeň: Balb/c
D. Stav vývoja: dospelá
F. Typ tkaniva: lymfatická uzlina vii) Bezprostredný zdroj
B. Kloň: L2 12B (ťažký reťazec) ix) Charakteristika
A. Meno/kľúč: CDS
B. Lokácia: 1..359 xi) Opis sekvencie ID. č. 7
CAG GTG CAG Gin Val Gin CTG CAG Leu Gin GAC TCT GGA CCT GAG CTG GTG AAG CCT GGG GCT 48
Glu Ser 120 Gly Pro Clu Leu Val 125 Lys Pro Gly Ala
115
TTA GTG AAG ATA TCC TGC AAG GCT TCT GGT TAC ACC TTC ACC AGC TAC 56
Leu val Lys íle Ser Cya Lya Ala Ser Cly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
130 135 140 14S
TGG ATG CAC TGG GTG AAG CAG AGG CCT GCA CAA GGC CIT CAG TGG ATC 144
Trp Met Hla Trp Val Lye Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Clu Trp íle
150 155 160
GGA GAG ATT G AT CCT TCT GAT AGT TÄT ACT AAC TAC AAT CAA AAC TTC 192
Gly Glu íle Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Cln Lye Phe
165 170 175
AAG GGC AAG GCC ACA TTG ACT GTA GAC AAA TCC TCC AAC ACA GCC TAC 240
Lye Gly Lys Ale Thr Leu Thr Val Asp LyB Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
180 185 190
ATG CAG CTC AGC ACC CTG ACA TCT GAC CAC TCT GCG GTC TAT TAC TGT 288
Net Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
19S 200 205
GCA AGA TCG GAC TAC CCT AGT AGC CAC TTT GAC TAC TGG GCC CAA GCG 336
Ala Arg Ser Asp Tyr Gly Ser Ser Hla Phe Aap Tyr Trp Gly Gin Gly
210 215 220 225
ACC ACC GTC ACC GTC TCC TCA 35?
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
230
2. Informácie o sekv. ID. Č. 8:
i) Charakteristiky sekvencie
A. Dĺžka: 119 aminokyselín
B. Typ: aminokyselina
D Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie ID. č. 8
Cln Val Gin Leu Cln Clu Ser Cly Pro Glu Leu Val Lye Pro Gly Ala
1 $ 10 15
Leu Val Lys íle Ser Cys Lya Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Hla Trp Val Lya cm Arg Pro Cly Gin Gly Leu Glu Trp íle
35 40 45
Gly Glu íle Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gin Lys Phe
50 55 60
Lys Cly Lya Ala Thr Leu Thr val Asp Lye Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 7S 80
Met Cln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Aap Ser Ale Val Tyr Tyr Cya
85 90 95
Ala Arg Ser Asp Tyr Gly S«r Ser His Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Cly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
2. Informácie o sekv. ID. Č. 9:
i) Charakteristiky sekvencie
A. Dĺžka: 339 párov báz
B. Typ: nukleová kyselina
C. Reťazce: jeden
D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: cDNA iii) Hypotetická: žiadna i v) Anti-zmysel: žiadny
v) Typ fragmentu: N-zakončenie vi) Zdroj pôvodu
A. Organizmus: myš
B. Kmeň: Balb/c
D. Stav vývoja: dospelá
F. Typ tkaniva: lymfatická uzlina vii) Bezprostredný zdroj
B. Kloň: L3 1 ID (ľahký reťazec) ix) Charakteristika
A. Meno/kľúč: CDS
B. Lokácia: 1..339 xi) Opis sekvencie ID. č. 9
GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA GCT TCT TTG GCT GTG TCT CIA GCG 43
Asp íle Glu Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Ala Val Ser Leu Gly
120 125 130 135
CAG AGG GCC ACC ATC TCC TGC CGA GCC AGC GAA ACT GTT GAT AAT TTT 96
Gin Arg Ala Thr íle ser cys Ala ser G1U ser val Asp Asn Phe
140 14S 150
GGC ATT AGT TTT ATG MC TGG TTC CAA CAG AAA CCA GGA CAG CCA ccc 144
Gly íle ser Phe Met Asn Trp Phe Gin Cln Lye Pro Gly Cln Pro Pro
1S5 160 165
AAA CTC CTC ATC TAT GGT GCA TCC AAC CAA GGA TCC GGG GTC CCT GCC 192
Lys Leu Leu íle Tyr Gly Ala Ser Asn Gin Gly ser Gly val Pro Ala
170 175 180
AGC TTT ACT GGC AGT CGC TCT GGC ACA CAC TTC AGC CTC AAC ATC CAT 240
Arg Phe Ser Cly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn íle His
185 190 195
CCT TTO GAG GAG GAT CAT ACT GCA ATG TAT TTC 1GT CAG CAA AGT AAG 288
Pro Leu Glu Glu A»P Aap Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gin Gin Ser Lys
200 2OS 210 215
GAG GTT CCG CTC ACG TTC GGT GCT GGG ACC AAG CTG GAG CTG AAA CGG 336
Glu Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Cly Thr Lys Leu Clu Leu ty. Arg
220 225 230
GCC 339
Ala
2. Informácie o sekv. ID. Č. 10:
i) Charakteristiky sekvencie
A. Dĺžka: 113 aminokyselín
B. Typ: aminokyselina
D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie ID. č. 10
Asp 1 íle Glu Leu Thr S Gin Ser F 'ro A la S er Leu Ala Va 10 il Se r Lei 1! j Gly 5
cln Arg Ala Thr 20 íle Ser Cys A .rg A la S 25 er Glu S« r Va i As 3' p Ast Q i Phe
Gly íle Ser Phe Met Aen Trp Phe Gin Gin LyS Pro Gly Gin Pro Pro
3S 40 45
Lye Leu Leu íle Tyr Gly Ala Ser Aen Gin Gly Ser Gly val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Cly Thr A«p Phe Ser Leu Asn íle His
65 70 7S 80
Pro Leu Glu Glu Asp Asp Thr AU Met Tyr Phe Cys Cln Gin Ser Lys
85 90 95
Clu Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu clu Leu Lys Arg
100 105 110
Ala
2. Informácie o sekv. ID. č. 11:
i) Charakteristiky sekvencie
A. Dĺžka: 357 párov báz
B. Typ: nukleová kyselina
C. Reťazce: jeden
D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: cDNA iii) Hypotetická: žiadna i v) Anti-zmysel: žiadny
v) Typ fragmentu: N-zakončenie vi) Zdroj pôvodu
A. Organizmus: myš
B. Kmeň: Balb/c
D. Stav vývoja: dospelá
F. Typ tkaniva: lymfatická uzlina vii) Bezprostredný zdroj
B. Kloň: L3 1 ID (ťažký reťazec) ix) Charakteristika
A. Meno/kľúč: CDS
B. Lokácia: 1..357 xi) Opis sekvencie ID. č. 11
GAG GTG CAG CTG CAG CAG TCA GGG GCT GAG CTT GTG AAG CCT GGG GCT 48
Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Clu Leu Val Lys Pro Gly Ala
115 120 125
TCA GTG AAC CTG TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ACC TTC ACC AGC TAC 96
ser Val Lys Leu Ser Cys Lye Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
130 135 140 14S
TGG ATG CAC TGG GTG AAG CAG AGG Trp Het His Trp V*L Lys Gin Arg 150
GCA GAG ATT GAT CCT TCT GAT AGT Gly Glu Zle Asp Pro Ser A>p Ser 165
AAG GGC AAG GCC ÄCA TTG ACT GTA Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr val 180185
ATG CAG CTC AGC AGC CTG ACA TCT Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser 19S200
GCA AGA TCG CAC TAC CGT ACT AGC Ala Arg Ser Αβρ Tyr Gly Ser Ser 210215
ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
CCT GGA CAA GGC CTT GAG TGG ATC 144 Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp íle
155 160
ΤΛΤ AGT AAC TAC AAT CAA AAG TTC 192
Tyr Thr Asn Tyr Asn Gin Lys Phe 170 175
GAC AAA TCC TCC AGC ACA GCC TAC 240
Asp Lys ser Ser Ser Thr Ala Tyr
190
GAG GAC TCT GCG GTC TAT TAC TGT 288
Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cya
20S
CAC TTT CAC TAC TGG GGC CAA GGG 336 His Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly
220 225
357
230
2. Informácie o sekv. ID. č. 12:
i) Charakteristiky sekvencie
A. Dĺžka: 119 aminokyselín
B. Typ: aminokyselina
D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie ID. č. 12
GCT GAA GAT GTT GCC Ale Glu Aep Val Ala 200
CGC ACG TTC GGA GGG Arg Thr Phe Gly Gly
220
ACT TAC TAC TGC CAG CAG Thr Tyr Tyr Cya oin Gin 205 210
GGC ACC AAG CTG GAA ATC Gly Thr Lys Leu Glu íle
225
GGT AGT AGT ATA CCA 286 Gly Ser Ser íle Pro
215
AAA CGG 327
Lys Arg
2. Informácie o sekv. ID. č. 14:
i) Charakteristiky sekvencie
A. Dĺžka: 109 aminokyselín
B. Typ: aminokyselina
D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie ID. č. 14
Aep íle Glu Leu Thr Gin Ser Pro Thr Thr Met Ala Ala Ser Pro Gly 1 s io15
Glu Lya íle Thr íle Thr Cys sar Ala sar ser ser íle Sar Ser Asn
2530
Tyr Leu Hla Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Phe Ser Pro Lya Leu Leu
3S 404$ íle Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Oly Val Pro Ale Arg Phe Ser 50 5$60
Gly Sex Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Sar Leu Thr íle Gly Thr Met Glu
70 7S80
Ala Glu Aep Val Ala Thr Tyr Tyr cys Gin Gin Gly Ser Ser íle Pro
9095
Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lya Leu Glu íle Lya Arg
100105
G1U val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
ser val Ly· Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Mís Trp VaL Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp íle
35 40 45
Gly Glu Íle Αβρ Pro Ser Atp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gin Lys Phe
50 55 60
Ly« Gly Lys Ala Thr Leu Thr val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met; Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu ASp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Al* Arg Ser Asp Tyr Gly Ser Ser HLs Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr val Ser ser
115
2. Informácie o sekv. ID. č. 13:
i) Charakteristiky sekvencie
A. Dĺžka: 327 párov báz
B. Typ: nukleová kyselina
C. Reťazce: jeden
D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: cDNA iii) Hypotetická: žiadna iv) Anti-zmysel: žiadny
v) Typ fragmentu: N-zakončenie vi) Zdroj pôvodu
A. Organizmus: myš
B. Kmeň: Balb/c
D. Stav vývoja: dospelá
F. Typ tkaniva: lymfatická uzlina vii) Bczprostrcdný zdroj
B. Kloň: S4 2D (ľahký reťazec) ix) Charakteristika
A. Meno/kľúč: CDS
B. Lokácia: 1. 327 xi) Opis sekvencie ID. č. 13
GAC ÄTT CAG CTC ACC CAG TCT CCA ACC ACC ATG GCT GCA TCT CCC GGG48
Asp íle Glu Leu Thr Gin Ser Pro Thr Thr Met Ala Ala Ser ProGly
120 125 130135
GAG AAG ATC ACT ATC ACC TCC AGT GCC AGC TCA AGT ΑΓΑ AGT TCC AAT96
Glu Lys Ila Thr II· Thr Cys S«r Ala ser sar sar Ila Ser SerAsn
140 145150
TAC TTG CAT TCG TAT CAG CAG AAG CCA CCA TTC TCC CCT AAA CTC TTG144
Tyr Leu Hla Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ph· Sar Pro Lys LeuLeu
155 160165
ÄTT TAT AGG ACA TCC AAT CTG GCT TCT CCA GTC CCA GCT CGC TTC AGT192
Ila Tyr Arg Thr Sar Aan Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg PheSer
170 175180
GGC AGT GCG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACA ATT GGC ACC ATG GAG240
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr 11« Gly Thr MetGlu
185 19019S
2. Informácie o sekv. ID. č. 15:
i) Charakteristiky sekvencie
A. Dĺžka: 354 párov báz
B. Typ: nukleová kyselina
C. Reťazce: jeden
D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: cDNA iii) Hypotetická: žiadna iv) Anti-zmysel: žiadny
v) Typ fragmentu: N-zakončenie vi) Zdroj pôvodu
A. Organizmus: myš
B. Kmeň: Balb/c
D. Stav vývoja: dospelá
F. Typ tkaniva: lymfatická uzlina vii) Bezprostredný zdroj
B. Kloň: S4 2D (tažký reťazec) ix) Charakteristika
A. Meno/kľúč: CDS
B. Lokácia: 1..354
xi) Opis sekvencie ID .č. 15
CAG GTC AAG CTG CAG CAG TCA GGA CCT CAG CTG GTA AAG CCT CGG GCT 48
Glu Val Lys Leu Gin Gin Ser Gly Pro Clu Leu Val Lys Pro Gly Ala
110 lis 120 125
TCA GTG AAG ATG TCC TCC AAC CCT TCT GCA TAC GCA TTC ATA ACT TTT 96
Ser Val Lya Met Ser Cys Ly· Ala Ser Gly Tyr Ala Phe íle Ser Phe
130 135 140
GTT ATG CAC TGG GTG AAC CAG AAG CCT GGG CAG GGC CTT CAG TCC ATT 144
Val Het His Trp Val Lya Gin Lys Pro Gly Gin Gly Leu Clu Trp íle
145 150 155
GGA TTT ATT AAT CCT TAC AAT GAT CGT ACT AAG TAC AAT CAG AAG TTC 192
Gly Phe ZL· Asn Pro Tyr Aan A»p Gly Thr Lys Tyr Asn Clu Lys Phe
160 16S 170
AAA GAC AAG GCC ACA CTG ACT TCA CAC AAA TCC TCC AGC ACA GCC TAC 240
Lys Α·Ρ Lys Al* Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Al* Tyr
17S 180 185
ATG CAG CTC ACC AGC CTG ACC TCT GAG CAC TCT GCG GTC TAT TAC TGT 2B8
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
190 195 200 2OS
GCA ACT GGC GAT TAC CAC ACG GCT ATG GAC TAC TCG GGC CAA CCG ACC 336
Ala Ser Gly Asp Tyr Asp Arg Ale Het Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
210 21S 220
ACG GTC ACC GTC TCC TCA 354
Thr Val Thr Val Ser Ser
225
2. Informácie o sekv. ID. č. 16:
i) Charakteristiky sekvencie
A. Dĺžka: 118 aminokyselín
B. Typ: aminokyselina
D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie ID. č. 16
Glu Val Lye Leu Gin Gin ser Gly Pro Clu Leu Val Ly· Pro Cly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lya Met Ser Cy· Ly. Ale Ser Gly Tyr Ala Phe íle Ser Phe
20 2S 30
Val Het Hl· Trp Val ty# Gin ty· Pro Cly Gin Gly Leu Glu Trp íle
35 40 45
Gly Phe Ila Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lya Tyr Asn C1U Lys Phe
50 55 50
Lye Asp Lya Ale Thr Leu Thr Ser Asp Lye Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 SO
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cye
65 $0 95
Ale Ser Gly Asp Tyr Aep Arg Ala Het Asp Tyr Trp Gly Gin Cly Thr
100 10S no
Thr Val Thr Val ser ser lis
2. Informácie o sekv. ID. č. 17:
i) Charakteristiky sekvencie
A. Dĺžka: 717 párov báz
B. Typ: nukleová kyselina
C. Reťazce:jeden
D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: cDNA iii) Hypotetická: žiadna iv) Anti-zmysel: žiadny
v) Typ fragmentu: N-zakončenie vi) Zdroj pôvodu
A. Organizmus: myš
B. Kmeň: Balb/c
D. Stav vývoja: dospelá F. Typ tkaniva: splenocyty vii) Bezprostredný zdroj
B. Kloň: 4 B 2 ix) Charakteristika
A. Meno/kľúč: CDS
B. Lokácia: 1..717 xi) Opis sekvencie ID. č. 17
GAG CTG AAG CTG CAO GAG TCT GCG GCA GAC TTA GTG AAG CCT GGA GGG 48
Glu Val Lys Leu 120 Gin Glu Ser 125 Gly Gly Asp Leu Val Lys 130 Pro Gly Gly
TCC CTG ΛΑΑ CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACT TTC AGT ACC TAT 96
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Cly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
135 140 145 150
GGC ATG TCT TGG GTT CGG CAG ACT CCA GAC AAG AGG CTG GAG TCT GTC 144
Cly Het Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Asp Lye Arg Leu Glu Ser Val
1S5 160 165
GCA ACC ΑΤΊ AGT AGT GGT GCT GCT TAC ATC TAC TAT CCA GAC AGT GTG 192
Ala Thr íle Ser Ser Cly Gly Ala Tyr íle Tyr Tyr Pro Α·Ρ Ser val
170 175 180
AAG GGG CCA TTC ACC ATC TCC ACA GAC AAT GCC AAG AAC ACC CTG TAC 240
Lye Gly Arg Phe Thr íle Sar Arg Asp Asn Ala Ly· Asn Thr Leu Tyr
185 190 195
CTG CAA ATG AGC AGT CTG AAG TCT GAG GAC ACA GCC ATG TAT TAC TGT 288
Leu Gin Het Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
200 205 210
GCA AGA CTT GAA ACC GGG GAC TAT GCT TTG GAC TAC TGG GGC CAA GGG 336
Ala Arg Leu Glu Thr Gly Asp Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp cly Gin Gly
215 220 22S 230
ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGC GGT GGC TCG GGC GGT GGT CGG 384
Thr Tbr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
235 240 245
TCG GGT GGC GGC GGA TCT GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA GCT TCT 432
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Aep íle Glu Leu Thr Gin Ser Pro Ala Sar
250 255 250
TTG GCT GTC TCT CTA GGG CAG AGG GCC ACC ΑΓΑ TTC TGC AAG GAC AGC 480
Leu Ala Val Ser Leu Gly Gin Arg Ala Thr íle Phe Cys Lys Asp Ser
265 270 275
CAA AGT GTT GAT TAT GAT oor GAT AGT TAT ATG AAC TGG TAC CAA CAG S28
Gin Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gin Gin
280 285 290
ΑΆΑ CCA GGA CAG CCA CCC ΑΑΛ CTC CTC ATC TAT GCT CGA TCC AAT CTA 576
Lye Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu Íle Tyr Ala Arg Ser Asn Leu
295 300 305 310
CAA TCT GGG GTC CCT GCC AGG TTT AGT CCC AGT GGG TCT GGC ACA CAC 624
Clu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly ser Gly Thr Asp
315 320 325
TTC ACC CTC AAC ATC CAT CCT GTG GAG GAG GAT GAT ATT GCA ATG TAT 672
Phe Ser Leu Asn íle Hks Pre Val Glu Clu Asp Asp Íle Ala Het Tyr
330 335 340
rre TGT CAG CAA AGT AGG AAG GTT CCG TGG TCG TTC GGT GCA GGG 717
Phe Cys Gin Gin Ser Arg Lys Val Pro Trp Ser Phe Gly Gly Gly
345 350 355
i) Charakteristiky sekvencie
A. Dĺžka: 239 aminokyselín
B. Typ: aminokyselina
D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie ID. č. 18
G1U val Lys Leu Gin Glu ser Gly Gly Asp Leu Val Lye Pro GLy Gly
1 5 10 15
Ser Leu Ly. Leu Ser Cys Ala Ala Ser Cly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Het Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Ser Val
35 40 45
Ala Thr íle Ser Ser Gly Gly Ala Tyr íle Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp Asn Ala Lye Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 SO
Leu Gin Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Het Tyr Tyr cys
Ô5 90 95
Ala Arg Leu Clu Thr Gly Asp Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cly Gly Ser Cly Gly Gly Gly
115 120 125
ser Gly Gly Gly Gly ser Asp íle Glu Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser
130 13S 140
Leu Ala Val Ser Leu Gly Gin Arg Ala Thr íle Phe Cys Lys Asp Ser
145 1S0 155 160
Gin Ser Val Aep Tyr Aep Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gin Gin
165 170 175
Lye Pro Gly Gin Pro Pro Lye Leu Leu íle Tyr Ala Arg Ser Asn Leu
180 185 190
Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
195 200 20S
Phe Ser Leu Asn 11« His Pro val Glu Clu Asp A8P íle Ala Met Tyr
210 215 220
Phe Cye Gin Cln Ser Arg Lys Val Pro Trp Ser Phe Cly Gly Gly
225 230 235
2. Informácie o sekv. ID. č. 19:
i) Charakteristiky sekvencie
A. Dĺžka: 732 párov báz
B. Typ: nukleová kyselina
C. Reťazce:jeden
D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: cDNA iii) Hypotetická: žiadna iv) Anti-zmysel: žiadny
v) Typ fragmentu: N-zakončenie vi) Zdroj pôvodu
A. Organizmus: myš
B. Kmeň: Balb/c
F. Typ tkaniva: splenocyty vii) Bezprostredný zdroj
B. Kloň: 10 D 2 (jednoreťazcový Fv, ťažký a ľahký reťazec plus spojovník) ix) Charakteristika
A. Meno/kľúč: CDS
B. Lokácia: 1..732 xi) Opis sekvencie ID. č. 19
GAG GTG Glu Val 240 CAG CTG CAG CAG TCT GGG GCT GAA CTG GTG AAG CCT GGG GCT 48
Gin Leu Gin Gin 24S Ser Gly Ala Glu Leu 250 Val Lys Pro Gly Ala 25S
TCA GTG AAG TTG TCC TGC AAG GCT TCC GGC TAC ACC TTC ACC AGC CAC 96
Ser val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His
260 265 270
TGG ATG CAC TGG GTG AAG CAG AGG GCT GGA CAA GGC CTT GAG TGG ATC 144
Trp Met His Trp Val Lys Gin Arg Ala Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ila
275 230 2B5
GGA CAG TTT AAT CCC AGC AAC GGC CGT ACT AAC TAC AAT GAG AAA TTC 192
Gly Glu Phe Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
290 295 300
AAG AGC AAG GCC ACA CTG ACT GTA GAC AAA TCC TCC AGC ACA GCC TAC 240
Lys Ser Lys Ala Thr Lau Thr val Asp Lys ser Ser Ser Tbr Ala Tyr
305 310 315
ATG CAA CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCG GTC TAT TAC TGT 288
Het Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala val Tyr Tyr Cys
320 325 330 335
2. Informácie o sekv. ID. č. 18:
GCC Ala AGT CGG GAC TAT βΚΤ TAC GAC CCA CC G TAC TTT GAC TAC TGG GGC 336
Ser Arg A»p Tyr 340 A»p Tyr A»p Gly Arg 34 5 Tyr Phe A.p Tyr Trp Gly 350
CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGC GGT GGC TCG GGC GGT 384
Gin Gly Thr Thr val Thr Vil Ser Ser Cly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
355 360 36S
GGT GGG TCG GGT GGC CCC GGA TCT GAC ATT GAC CTC ACC CAG TCT CCA 432
Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly ser A«p íle GLu Leu Thr Gin Ser Pro
370 375 380
GCA ATC ATG TCT GCA TCT CCA GGG GAG AAG GTC ACC ATC ACC TGC AGT 480
Ala íle Met Ser Ala Ser Pro Cly Glu Lya Val Thr Met Thr Cy· Ser
385 350 395
GCC AGC TCA AGT GTA AGT TAC ATG TAC TGG TAC CAG CAG AAA CCA GGA 528
Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr net Tyr Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly
400 4C5 410 415
vi) Zdroj pôvodu
A. Organizmus: myš
B. Kmeň: Balb/c
F. Typ tkaniva: splenocyty vii) Bezprostredný zdroj
B. Kloň: 3 D 3 (jednoreťazcový Fv, ťažký a ľahký reťazec plus spojovník) ix) Charakteristika
A. Meno/kľúč: CDS
B. Lokácia: 1. 732 xi) Opis sekvencie ID. č. 21
GTC CCT GIT CGC TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC
Val Pro Val Arg Phe Ser Cly ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu
435 440 44S
ACA ATC AGC CGA ATG GAG CCT GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG
Thr íle Ser Arg Met Clu Ala Glu Aap Ala Ala Thr Tyr Tyr Cye Gin
450 455 460
CAG TGG AGT ACT TAC CCA CCC ATG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG
Gin Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Met Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lya
465 470 475
624
672
720
CTG GAA ATA AAA
Leu Glu II» Lys
480
732
2. Informácie o sekv. ID. č. 20:
i) Charakteristiky sekvencie
A. Dĺžka: 244 aminokyselín
B. Typ: aminokyselina
D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie ID. č. 20
GAG G1U 245 GTC CAA CTG CAG Val Gin Leu Gin CAG TCA GGG GCT GAA CTG CTG AAG CCT GGG GCT 48
Gin Ser 250 Gly Ala Glu Leu 255 Val Lys Pro Oly Ala 260
TCA GTG AAG TTG TCC TGC AAG GCT TCC GGC TAC ACC TTC ACC AGC CAC 96
Ser Val Lys Leu ser Cys Lys Ala ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His
265 270 275
TGG ATG CAC TGG GTG AAG CAG AGG GCT GGA CAA GGC CTT GAG TGG ATC 144
Trp Met His Trp Val Lys Gin Arg Ala Gly GLn Gly Leu Glu Trp íle
280 285 290
GGA GAG TTT AAT CCC AGC AAC GGC CGT ACT AAC TAC AAT GAG AAA ATC 192
Gly Glu Phe Asn Pre Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys íle
295 300 305
AAG AGC AAG GCC ACA CTG ACT GTA GAC AAA TCC TCC AGC ACA GCC TAC 240
Lys ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
310 315 320
GlU Val Gin Leu Gin Gin Ser GLy Ala Glu Leu val Lys pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lye Leu Ser cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His
20 25 30
Trp Met His Trp val Ly» Gin Arg Ala Gly Gin Gly Leu Glu Trp íle
35 40 45
cly Glu Phe Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lvs ser Lys Ale Thr Leu Thr Val Asp Lys ser Ser Ser Thr Ala Tyr
6$ 70 75 80
Met Gin Leu Ser Ser 85 Leu Thr Ser Glu Asp 90 > Ser Ala Val Tyr Tyr 95 Cys
Ala Ser Arg Asp 100 Tyr Asp Tyr Asp Gly 105 Arg Tyr Phe Asp Tyr 110 Trp Gly
Gin Gly Thr 115 Thr val Thr Val Ser 120 Ser Gly Gly Gly Gly 125 Ser Gly Gly
Gly Gly 130 Ser Gly Gly Gly Gly 135 Ser Asp íle Glu Leu 140 Thr Gin Ser Pro
Ala 145 íle Met Ser Ala Ser 150 Pro Gly Glu Lys Val 155 Thr Met Thr Cys Ser 160
Ala Ser Ser Ser Val 16S Ser Tyr Met Tyr Trp 170 Tyr Gin Gin Lys Pro 175 Gly
ser Ser Pro Arg 180 Leu Leu íle Tyr Asp 185 Thr Ser Asn Leu Ala 190 Ser Gly
VaL Pro val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr ser Leu
195 200 205
Thr íle Ser Arg Met Clu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr cys Gin
210 21S 220
GLn 225 Trp Ser Ser Tyr Pro 230 Pro Met Tyr Thr Phe 235 Gly Gly Gly Thr Lys 240
ATG CAA CTC AGC AGC CTC ACA TCT GAG GAC TCT GCG CTC TAT TAC TGT
Met 325 Gin Leu Ser Ser Leu 330 Thr s»r Glu Asp Ser 335 Ala Val Tyr Tyr Cye 340
GCC AGT CGG GAC TAT GAT TAC GAC GGA CGG TAC TTT GAC TAC TGG GGC
Ala Ser Arg Aap Tyr Asp Tyr Asp Cly Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Cly
345 350 355
CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGC GGT CGC TCG GGC GGT
Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
360 365 370
GGT GGG TCG GGT GGC GGC GGA TCT GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp íle Glu Leu Thr Gin Ser Pro
375 380 385
ACA ATC ATG TCT GCA TCT CCA GGG CAG AAG GTC ACC ATG ACC TGC AGT
Thr Zle Mat Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser
390 395 400
GAC AGC TCA AGT GTA AGT TAC ATG TAC TGG TAC CAG CAG AAG ACA GGA
Asp Ser Ser Ser Val Ser Tyr Het Tyr Trp Tyr Gin Gin iy· Thr Gly
405 410 415 420
TCC TCC CCC AGA CTC CTG ATT TAT GAC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA
Ser Ser Pro Arg Leu Leu Íle Tyr Asp Thr Ser Asn Le« Ala Ser Gly
425 430 435
GTC CCT GTT CGC TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC
Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr ser Leu
440 44S 450
ACA ATC AGC CCA ATG CAC CCT GAA GAT CCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG Thr íle Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cye Gin 45$ 460 465
CAG TGC AGT ACT TAC CCA CCC ATC TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG
Gin Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Met Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 470 475 480
CTG GAA ATA AAA
Leu Glu íle Lys
485
Leu Glu íle Lys
2. Informácie o sekv. ID. č. 22:
i) Charakteristiky sekvencie
A. Dĺžka: 244 aminokyselín
B. Typ: aminokyselina
D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie ID. č. 22
288
336
384
432
480
528
S76
624
672
720
732
2. Informácie o sekv. ID. č. 21:
i) Charakteristiky sekvencie
A. Dĺžka: 732 párov báz
B. Typ: nukleová kyselina
C. Reťazce: jeden
D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: cDNA iii) Hypotetická: žiadna i v) Anti-zmysel: žiadny
v) Typ fragmentu: N-zakončenie
Clu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Set; Val Lys Leu Sar Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His
20 25 30
Trp Met HĹs Trp Val Lys Cln Arg Ala Gly Cln Gly Lau Glu Trp íle
35 40 45
Gly Glu Phe Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys íle
50 55 60
Lys Ser Lyfl Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 BO
Met Gin Leu Ser ser Leu Thr Ser GLu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
SS 90 95
Ala ser Arg Asp Tyr Asp Tyr Asp GLy Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly
115 120 12S
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp 11« Glu Leu Thr Gin Ser Pro
130 135 140
Thr íle Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser
145 150 155 160
Asp Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gin Gin Lys Thr Gly
165 170 17S
ser ser Pro Arg Leu Leu íle Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly
180 185 190
Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu
195 200 205
Thr íle Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin
210 215 220
Gin Trp Ser Ser Tyr Pro ?ro Met Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
22S 230 235 240
Leu Glu íle Lys
2. Informácie o sekv. ID. č. 23:
i) Charakteristiky sekvencie
A. Dĺžka: 738 párov báz
B. Typ: nukleová kyselina
C. Reťazce: jeden
D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: cDNA iii) Hypotetická: žiadna iv) Anti-zmysel: žiadny
v) Typ fragmentu: N-zakončenie vi) Zdroj pôvodu
A. Organizmus: myš
B. Kmeň: Balb/c
F. Typ tkaniva: splenocyty vii) Bezprostredný zdroj
B. Kloň: 1 E 3 (jednoreťazcový Fv, ťažký a ľahký reťazec plus spojovník) ix) Charakteristika
A. Meno/kľúč: CDS
B. Lokácia: I..738 xi) Opis sekvencie ID. č. 23
GAG GTG CAC CTG CAG CAG TCT GGC GCT CAA CTC GTG AAG CCT GGG GCT 48
Glu Val 245 Gin Leu Gin Gin 2S0 Ser Gly Ala Glu Leu Val 255 Lys Pro Gly Ala 260
rcA GTG AAC TTG TCC TGC AAC CCT TCC CCC TAC ACC TTC ACC AGC CAC 96
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His
265 270 275
TGG ATG CAC TGG CTG AAG CAG AGG GCT GGA CAA GGC CTT GAG TGG ATC 144
Trp Met His Trp Val Lys Cln Arg Ala Gly Gin Gly Leu Clu Trp íle
280 285 290
GCA CAG TTT AAT CCC AGC AAC CGC CGT ACT AAC TAC AAT GAG AAA TTC 192
Gly Glu Pha Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
295 300 305
AAG AGC AAG GCC ACA CTG ACT GTA CAC AAA TCC TCC AGC ACA GCT TAC 240
LyS Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Sex Ser Thr Ala Tyr
310 31S 320
ATG CAA CTC AGC ACC CTC ACA TCT GAC CAC TCT CCG GTC TAT TAC TGT 288
Mat 325 Gin Leu ser Ser Lau 330 Thr ser clu Aep sar Ala Val Tyr Tyr Cys
335 340
CCC ACT CGC CAC TAT CAT TAC GAC CCA CCG TAC TTT GAC TAC TGG GCC 336
Ala Ser Arg Αβρ Tyr Asp Tyr Aap Gly Arg Tyr Phe Aep Tyr Trp Gly
345 350 355
CAA GGC ACC ACC GTC ACC CTC TCC TCA CGT GCC GGT GCC TCG CGC GCT 384
Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Sar Cly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
360 365 370
GGT GGG TCG GGT CGC GGC GGA TCT GGA TCT GAC ATT GAG CTC ACC CAG 432
Gly Gly Sar Gly Gly Cly Cly Ser Gly Ser A«P 11· Glu Leu Thr Gin
37S 380 385
TCT CCA ACA ATC ATG ŤCT GCA TCT CCA CGG GAG AAG CTC ACC ATG ACC 480
Ser Pro Thr íle Mat Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lye Val Thr Met Thr
390 395 400
TGC AGT GAC AGC TCA AGT CTA ACT TAC ATC TAC TGG TAC CAG CAG AAG 528
Cys Ser Asp Ser Sar Sar Val Ser Tyr Het Tyr Trp Tyr Gin Gin Lys
405 410 415 420
CCA GGA TCC TCC CCC AGA CTC CTC ATT TAT GAC ACA TCC AAC CTG GCT 576
Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu íle Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala
425 430 43S
TCT GGA CTC CCT GTT CCC TTC ACT CCC ACT GGC TCT GGG ACC TCT TAC 624
Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr
440 445 450
TCT CTC ACA ATC ACC CGA ATC CAC GCT GAA GAT CCT CCC ACT TAT TAC 672
Ser Leu Thr íle Ser Arg Het Clu Ala Glu Asp ALä Ala Thr Tyr Tyr
455 4 60 465
TGC CAG CAG TCG AGT AGT TAC CCA CCC ATG TAC ACC TTC GGA GGG GGG 720
Cys Gin Cln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Met Tyr Thr Phe Cly Gly Gly
470 475 4Θ0
2. Informácie o sekv. ID. č. 24:
i) Charakteristiky sekvencie
A. Dĺžka: 246 aminokyselín
B. Typ: aminokyselina
D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie ID. č. 24
CLu val Cln Leu Gin Gin Ser Gly Ala Clu Leu val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Sar Val Lys Leu 20 Ser Cys Lys Ala Ser 25 Cly Tyr Thr Phe Thr 30 Ser His
Trp Met HĹB 35 Trp Val Lys Gin Arg 40 Ala Cly Gin Gly Leu 45 Glu Trp iLa
Gly Glu SO Phe Asn Pro Ser Asn 55 Gly Arg Thr Asn Tyr 60 Asn Glu Lys Phe
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 00
Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Arg Asp Tyr Asp Tyr Aíp Gly Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gin Gly Thr Thr val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Cly Ser Gly Ser Asp íle Glu Leu Thr Gin
130 135 140
Ser Pro Thr íle Met Ser Ala Sar Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr
145 150 155 160
Cys Ser Asp Ser Ser Ser Val Ser Tyr Het Tyr Trp Tyr Gin Gin Lys
165 170 175
Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu íle Tyr ASp Thr ser Asn Leu Ala
180 185 150
Ser Gly val Pro val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser GLy Thr Ser Tyr
19S 200 205
Ser Leu Thr íle Ser Arg Mét Glu Ala Glu Aep Ala Ala Thr Tyr Tyr
210 215 220
Cya Gin Gin Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Het Tyr Thr Phe Gly Gly Gly
225 230 23S 240
Thr Lys Leu Glu íle Lys
245
2. Informácie o sekv. ID. č. 25:
i) Charakteristiky sekvencie
A. Dĺžka: 726 párov báz
B. Typ: nukleová kyselina
C. Reťazce: jeden
D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: cDNA iii) Hypotetická: žiadna iv) Anti-zmysel: žiadny
v) Typ fragmentu: N-zakončenie vi) Zdroj pôvodu
A. Organizmus: myš
B. Kmeň: Balb/c
F. Typ tkaniva: splenocyty vii)Bezprostredný zdroj
B. Kloň: 5 F 1 (jednoreťazcový Fv, ťažký a ľahký reťazec plus spojovník) ix) Charakteristika
A. Meno/kľúč: CDS
B. Lokácia: 1..726 xi) Opis sekvencie ID. č. 25
CAG GTG AAA CTG CAG GAG TCT GGG GCT GAA CTG GTG AAG CCT GGG GCT 46
Gin Val Lys Leu 250 Gin Glu ser Gly Ala 255 Glu Leu val Lys Pro 260 Gly Ala
TCA CTG AAG TTG TCC TGC AAG GCT TCC GGC TAC ACC TTC ACC AGC CAC 96
Ser Val Lys Leu Ser CyS Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Hla
265 210 275
TGG ATG CAC TGG GTG AAG CAG AGG GCT GGA CAA GGC CTT GAG TGG ATC 144
Trp Met His Trp Val Lys Gin Arg Ala Gly Gin Gly Leu Glu Trp íle
280 255 290
GGA GAG ATT AAT CCC AGA ACG GCG CCT ACT AAC TAC AAT GAG AAA TTC 192
Gly Clu íle Asn Pro Arg Thr Ala Pro Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
295 300 305 310
AAG AGC AAG GCC ACA CTC ACT GTA GAC AAA TCC TCC AGC ACA GCC TAC 240
Lys ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
315 320 325
ATG CAA CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCG GTC TAT TAC TCT 288
Het Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
330 335 340
GCC AGT CGG GAC TAT GAT TAC GAC GGA CGG TAC TTT GAC TAC TGG GGC 336
Ala Ser Arg Asp Tyr Asp Tyr Asp Gly Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Oly
345 350 355
CAA GGG ACA ACG CTC ACC GTC TCC TCA GGT GGC GCT GGC TCG GGC GGT 384
Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Oly
350 365 370
GGT GGG TCG GGT GGC GGC GGA TCT GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA 432
Gly Oly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tie GLu Leu Thr Gin Ser Pro
375 380 385 390
ACA ÄTC ATG TCT GCA TCT CCA GCG GAG AAG GTC ACC ATG ACC TCC AGT 480
Thr íle Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Het Thr Cy· Ser
395 400 405
GAC AGC TCA ACT GTA AGT TAC ACG TAC TCG TAC CAG CAG AAG ACA GGA 528
Asp Ser Ser Ser val Ser Tyr Thr Tyr Trp Týr Gin Gin Lye Thť Gly
410 415 420
TCC TCC CCC AGA CTC CTG ATT TAT GAC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA 576
Ser Ser Pro Arg Leu Leu íle Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly
425 430 43S
Val Pro Val Arg Ph« Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu 195 200 205
Thr XI· Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cy· Gin 210 21$ 220
Gin Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu
225 230 235 240 íle Lye
2. Informácie o sekv. ID. č. 27:
i) Charakteristiky sekvencie
A. Dĺžka: 726 párov báz
B. Typ: nukleová kyselina
C. Reťazce: jeden
D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: cDNA iii) Hypotetická: žiadna iv) Anti-zmysel: žiadny
v) Typ fragmentu: N-zakončenie vi) Zdroj pôvodu
A. Organizmus: myš
B. Kmeň: Balb/c
F. Typ tkaniva: splenocyty vii) Bezprostredný zdroj
A. Knihovňa: 7 G 1 (jednoreťazcový Fv, ťažký a ľahký reťazec plus spojovník) ix) Charakteristika
A. Meno/kľúč: CDS
B. Lokácia: 1..726 xi) Opis sekvencie ID. č. 27
GAG G ÍTC AAG C Γ3 CAG CAG IC A GG3 : GCT GAA CTG GTG AAC CCT GGG CCT 48
Glu Val L ys L< bu Gin Gin $·: r Gly Ala Glu Leu val Lye Pro Gly Ala
2 45 250 25S
TCA c ITG AAG T‘ ΓΟ TCC TGC AA 3 GCT ' TCC GGC TAC ACC TTC ACC AGC CAC 96
Ser val L ys L< bu Ser Cy* Ly b Ala . Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Hla
2 :60 26 $ 270
TTG OAT CAC TGG C >TG AAG Cl KG AGG GG< : TGG CAA . GGC CTT GAG TGG ATC 144
Leu Asp Hl· Trp Val Ly» G. Ln Ar g Gl; f Trp Gin . Gly Leu Glu Trp íle
275 280 295 290
GTC CCT CTT CGC TTC AGT CGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC 624
val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu
440 445 450
ACA ATC AGC CCA ATG GAG GCT GAA GAT GCT CCC ACT TAT TAC TGC CAG 672
Thr íle Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr cy· Gin
45S 460 465 470
CAG TGG AGT AGT TAC CCC CTC ACG TTC GGT GCT GGG ACC AAG CTG CAA 720
Gin Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ale Gly Thr Lyt Leu Clu
475 480 485
ATA AAA 726
íle Lys
2. Informácie o sekv. ID. č. 26:
i) Charakteristiky sekvencie
A. Dĺžka: 242 aminokyselín
B. Typ: aminokyselina
D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: protein xi) Opis sekvencie ID. č. 26
Gin Val Lys Leu Gin Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Fro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser cy« Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr ser His
20 2$ 30
Trp Ker Kla Trp V<1 ty» Gin Arg Ala Gly Gin Gly Leu Glu Trp íle
35 40 45
Gly Glu 11· Asn Pro Arg Thr Ala Pro Thr Asn Tyr Asn Clu lya Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Lbu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Het Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr cys
85 90 95
Ala Ser Arg A«P Tyr Aep Tyr A»P Gly Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Cly
100 105 110
Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
315 120 12S
Gly Gly ser Gly oly Gly Gly ser Λ·ρ íle Glu Leu Thr cín Ser Pro
130 135 140
Thr íle Het Ser Ala ser Pro Gly Glu Lye Val Thr Met Thr Cys Ser
145 150 15S 160
Asp Ser Ser Ser Val Ser Tyr Thr Tyr Trp Tyr Gin Gin Lye Thr Gly
165 170 175
Ser ser Pro Arg Leu Leu íle Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ale Ser Oly
180 185 190
GGA CAG TTT AAT CCC ACC AAC GGC CCT ACT AAC TAC AAT CAG AAA TTC 192
Cly Cln Phe Asn Pro 29S Ser Asn Gly Arg Thr 300 Asn Tyr Asn Clu Lya 30S Phe
AAG AGC AAG GCC ACA CTG ACT GTA GAC AAA TCC TCC AGC ACA GCC TAC 240
Lys Ser Lya Ala Thr Leu Thr val Asp Lye Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
310 315 320
ATC CAA CTC ACC ACC CTG ACA TCT CAG CAC TGC TCG CTC TAT TAC TG7 288
íle Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Clu λβρ Cys Ser Val Tyr Tyr Cy·
32$ 330 335
GCC AGT CGG GAC TAT GAT TAC CAC GGA CGC TAC TTT CAC TAC TGG GGC 336
Ala Ser Arg Asp Tyr Aep Tyr λβρ Cly Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
340 345 350
CAA GG8 ACC ACG GTC ACC CTC TCC TCA CCT CGC GGT GGC TCG GGC GGT 384
Gin Gly Thr Thr Vil Thr Val Ser Ser Cly ciy Gly Gly Ser Gly Gly
355 360 365 370
GGT GGG TCG GGT GGC GGC CGA TCT CAC ATT CAG CTC ACC CAG TCT CCA 432
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp íle Clu Leu Thr Gin Ser Pxo
375 380 365
ACA ATC ATG TCT GCA TCT CCA GGG CAG AAG CTC ACC ATG ACC TGC AGT 480
Thr íle Met Ser Ala Ser Pro Cly Clu Lye Val Thr Het Thr Cys ser
390 395 400
GAC AGC TCA AGT GTA AGT TAC ATG TAC TGG TAC CAG CAG AAG ACA CCA 528
Λ·ρ Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gin Gin Lys Thr Cly
4C5 410 415
TCC TCC CCC AGA CTT CTG ATT TAT GAC ACA TCC AAC CTG CCT TCT GGA 576
Ser Ser Pro Arg Leu Leu 11a Ty, Aep Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly
420 425 430
GTC CCT CTT CGC TTC AGT GCC ACT CGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC 624
val Pro val Arg Phe Ser Cly Ser cly ser Gly Thr ser Tyr Ser Leu
435 440 445 450
ACA ATC AGC CGA ATG GAG CCT GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG 672
Thr íle Ser Arg Het Glu Ale Clu Asp Ala Ale Thr Tyr Tyr Cye Cln
45S 460 465
CAC TGG ACT AGT TAC CCC CTC ACG rre CCT CCT CCG ACC AAC CTC CAA 720
Gin Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr PhB Gly Ala Gly Thr Lys Leu GlU
470 475 480
ATA AAA 726
íle Lye
2. Informácie o sekv. ID. č. 28:
i) Charakteristiky sekvencie
A. Dĺžka: 242 aminokyselín
SK 283889 Β6
AAG GTC ACC ATG ACC TCC ACT
Lvt Val Thr Het Thr Cys Ser
400
TGG 1AC CAG CM AAG ACA GGA Tyr Gin Gin Ly· Thr Gly 41S
TCA ATC ATG TCT GCA TCT CCA GGC CAG see íle Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu
390 -395
GAC AGC TCA AGT GTA ACT TAC ATG TAC Aep Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr 405 *10
B. Typ: aminokyselina
D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie ID. č. 28
Glu Vil Ly. Leu Gin Gin Ser Cly Ala Clu Leu Val Ly. Pro 01y Ala
1 5 10 15
Jer Val Ly· Leu Ser Cya Lya Ala Ser Cly Tyr Thr Phe Thr Ser His
20 25 30
Leu A Sp Hi« Trp val Ly· Gin Arg Gly Trp Gin Gly Leu Glu Trp Ila
35 40 45
Gly Gin Pb· A.n Pro Str A.n Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
so 5S 60
Lye Ser Ly. Ala Thr Leu Thr Val Aep Ly. Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
11· Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser G1U Asp Cya Ser Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Arg Asp Tyr Asp Tyr Asp Gly Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 no
Gin Gly Thr Thr Val Thr val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
lis 120 125
Gly Gly S*r Gly Gly Gly Gly Ser Asp Íle Glu Leu Thr Gin Ser Pro
130 135 140
Thr íle Met Ser Ala Ser Pro Gly Clu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser
14S 150 15$ 160
A«p Ser Ser Ser val ser Tyr Het Tyr Trp Tyr Gin Gin Lye Thr Gly
165 170 175
Ser S»r Pro Arg Leu Leu n· Tyr Aep Thr Ser Aan Leu Ala Ser Gly
180 185 190
VU pro val Arg Phe Ser Gly Ser Cly Ser Cly Thr Ser Tyr Ser Leu
19$ 200 205
Thr íle Ser Arg Met Glu Ala Clu Aap Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin
210 21S 220
Gin Trp Set Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lye Leu Glu
225 210 235 240
I i e Ly»
TCC TCC CCC ACA CTC CTG ATT TAT GAC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA
Ser Ser Pro Arg Leu Leu íle Tyr Aep Thr Ser A.n Leu Ala Ser Gly
420 428 430
GTC CCT GTT CCC TTC AGT CGC AGT GGC TCT GCG ACC TCT TAC TCT CTC
Val Pro Val Arg Phe Ser Cly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu
43S 440 445 450
ACA ATC Aee CCA ATC GAG CCT GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAC
Thr íle ser Arg Het Glu Ala G1U A.p Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Cln
455 460 465
CAG TGG AGT AGT TAC CCA CAC ACG TTC GCT GCT CGG ACC AAG CTG CAA
Gin Trp Ser Ser Tyr Pro Eie Thr Phe Gly Ale Cly Thr Ly. Leu Glu 470 473 4B0
ÄTA AAA íle Ly.
2. Informácie o sekv. ID. č. 30:
i) Charakteristiky sekvencie
A. Dĺžka: 242 aminokyselín
B. Typ: aminokyselina
D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie ID. č. 30
576
624
672
726
2. Informácie o sekv. ID. č. 29:
i) Charakteristiky sekvencie
A. Dĺžka: 726 párov báz
B. Typ: nukleová kyselina
C. Reťazce:jeden
D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: cDNA iii) Hypotetická: žiadna iv) Anti-zmysel: žiadny
v) Typ fragmentu: N-zakončenie vi) Zdroj pôvodu
A. Organizmus: myš
B. Kmeň: Balb/c
D. Stupeň vývoja: dospelá
F. Typ tkaniva: splenocyty vii) Bezprostredný zdroj
B. Kloň: 11 H 1 (jednoreťazcový Fv, ťažký a ľahký reťazec plus spojovník) ix) Charakteristika
A. Meno/kľúč: CDS
B. Lokácia: 1..726 xi) Opis sekvencie ID. č. 29
Glu 1 Val Lys Leu Gin 5 Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
10 15
Ser Val Lys Leu Ser cys Ly» Ala Ser Cly Tyr Thr Phe Thr Ser Hi.
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Cln Arg Ala Gly Cln Gly Leu Glu Trp íle
35 40 45
Gly Glu Phe Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Ly. Phe
50 $5 60
Lys Ser Ly» Ala Thr Leu “hr val Asp Lys ser ser Ser Thr Ala Tyr
6S 70 75 80
Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cya
85 90 95
Ala Ser Arg Asp Tyr Aep Tyr Asp Gly Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Cly
100 105 110
Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Cly Ser Asp íle Clu Leu Thr Gin Ser Pro
130 135 140
Ser 145 íle Met ser Ala Ser 150 Pro Gly Glu Lys Val 155 . Thr Met Thr Cya Ser 160
Asp Ser Ser Ser Val
165
Ser Tyr Het Tyr Trp Tyr Gin Gin Ly* Thr Gly
170 175
ser Ser Pro Arg Leu L«u íle Tyr A.p Thr Ser A.n Leu Ala Ser Gly
180 185 190
Val Pro Val Arg Phe Ser Gly ser Cly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu
195 200 205
Thr íle Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin
210 215 220
Gin 225 Trp Ser Ser Tyr Pro 230 His Thr Phe Gly Ala 235 Gly Thr Ly. Leu Glu 240
íle Lys
GAG GTC AAC CTG CAG Gin Gin TCA GGC GCT GAA CTG CTG AAG CCT GGG GCT 43
Glu v*i Ly» 245 Leu Ser Cly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
250 2S5
TCA GTC AAG TTG TCC TCC AAG GCT TCC GCC TAC ACC TTC ACC AGC CAC 96
Ser Val Lys Leu Ser Cys Ly* Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser HL.
260 26$ 270
TGG ATG CAC TGG GTC AAG CAG AGG GCT GCA CAA GGC TTO GAG TGG ATC 144
Trp Met Hl. Trp Val ty. Gin Arg Ala Gly Gin Gly Leu Glu Trp íle
275 280 285 290
GGA GAG TTT AAT CCC AGC AAC GGC CCT ACT AAC TAC AAT CAG AAA TTC 192
Gly Glu Phe Asn Pro Ser Aan Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Ly. Ph«
295 300 305
AAG ACC AAG CCC ACA CTG ACT GTA GAC AAA TCC TCC AGC ACA GCC TAC 240
Ly. Ser Ly* Ala Thr Leu Thr Val Aep Ly. Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
310 315 320
ATG CAA CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCG GTC TAT TAC TGT 288
Met Cln Leu Jer Ser Leu Thr Ser Glu A»P Ser Ala Val Tyr Tyr Cy.
325 330 335
GCC AGT CGG CAC TAT GAT TAC GAC GGA CGG TAC TTT GAC TAC TGG GGC 336
Ala Ser Arg A«P Tyr Asp Tyr Asp Cly Arg Tyr Phe Aap Tyr Trp Gly
340 345 350
CAA CGG ACC ACG GTC ACC CTC TCC TCA GGT GGC GGT GGC TCG GGC GGT 33 4
Cln Cly Thr Thr Val Thr Víl Ser Ser cly ely Gly GLy Ser Gly Gly
355 360 365 370
GGT GGG TCC GGT GGC GGC GCA TCT CAC ATT GAG CTC ACC CAC TCT CCA 432
Gly cly ser Cly Gly Gly Gly ser A »P íle Glu Leu Thr cln Ser Pro
37$ 380 385
2. Informácie o sekv. ID. č. 31:
i) Charakteristiky sekvencie
A. Dĺžka: 732 párov báz
B. Typ: nukleová kyselina
C. Reťazce:jeden
D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: cDNA iii) Hypotetická: žiadna iv) Anti-zmysel: žiadny
v) Typ fragmentu: N-zakončenie vi) Zdroj pôvodu
A. Organizmus: myš
B. Kmeň: Balb/c
F. Typ tkaniva: splenocyty viijBezprostredný zdroj
B. Kloň: 1 A 1 (jednoreťazcový Fv, ťažký a ľahký reťazec plus spojovník) ix) Charakteristika
A. Meno/kľúč: CDS
B. Lokácia: 1..732 xi) Opis sekvencie ID. č. 31 'CAC CTG CAG CTG CAG CAC Glu Val Gin Leu Gin Gin 245
TCA GTC AAG TTC TCC TGC Ser Val Ly· Lau Ser Cye 260
TCT GGG GCT GAA CTG GTC Sar Gly Al* Leu Val 250
AAG GCT TCC GCC TAC ACC Ly· Ala Sar Gly Tyr Thr 165 270
AAC CCT GGO GCT 46
Ly· Pro Gly Ala
2S5
TTC ACC ACC CAC 96 Phe Thr Ser Hl·
TGG ATG CAC TGG GTG AAG CAC AGG GCT GGA CAA ggc CTT GAG TGG ATC 144
Trp Hla Trp val Lya Gin Arg Al· Gly Cln Gly Lau Clu Trp Ila
275 280 285 290
CGA GAG TTT AAT CCC AGC AAC CGC CCT ACT AAC TAC AAT GAG AAA TTC 192
Cly G1U PM Aan pro ser A»n Gly Arg Thr A*n Tyr Asn Glu Ly· Phe
295 300 305
AAG AGC AAG GCC ACA CTG ACT GTA GAC AAA TCC TCC AGC ACA GCT TAC 240
ty· Ser Ly» All Thr Leu Thr Val Λ·ρ Ly· Str Sar Sar Thr Ala Tyr
310 315 320
ATG CAA CTC Mat Gin Lau AGC Sar ACC CTG Ser Lau ACA TCT CAC GAC TCT CCG CTC TAT TAC TCT 2 88
Thr Sex 330 Glu Aap Ser Ala Val 338 Tyr Tyr Cy·
32S
GCC ACT CCC CAC TAT CAT TAC CAC CCA CCC TAC TTT CAC TAC TGG CCC 336
Ala Sar Arg λ·ρ Tyr Aap Tyr Aip Gly Arg Tyr Phe Aep Tyr Trp Gly
340 345 3S0
CAA GGG ACC ACG GTC ACC CTC TCC TCA 6GT GGC GGT GGC TCG GGC GGT 384
Gin Gly Thr Thr Val Thr v«i Ser Ser Gly Oly Gly Gly ser Gly Gly
3!5S 360 36S 370
GGT GGG TCG CGT GCC GCC CCA TCT CAC ATT CAG CTC ACC CAC TCT CCA 432
Gly Gly Ser Gly Cly Cly Gly Ser A»p íle Glu Lau Thr Gin Ser Pro
375 380 3SS
ACA ATC ATG TCT GCA TCT CCA GGG GAC AAG CTC ACC ATC ACC TGC AGT 480
Thr íl· Mat ser Λ1» Ser P r© Gly Glu Ly· val Thr Het Thr Cy· Ser
390 395 400
GAC AGC TCA AGT GTA AGT TAC ATG TAC TGG TAC CAG CAG AAG ACA GGA 528
Aiip Ser Ser Ser Val Sar Tyr Met Tyr Trp Tyr Gin Gin Ly. Thr Gly
405 410 41$
TCC TCC CCC AGA CTC CTG ATT TAT GAC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA 576
Ser Ser Pro Arg Leu Lau íle Tyr Α·ρ Thr ser Aan Leu Ala Ser Gly
420 43S 430
GTC CCT GTT CGC TTC AGT CCC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC 624
Val Pro Val Arg Phe ser Gly Ser Gly Sar Gly Thr sar Tyr Ser Leu
435 440 449 450
ACA ATC AGC CGA ATG GAG OCT CAA CAT GCT GCC ACT TAT TAC T«C CAG 672
Thr Ila Sar Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Al· Thr Tyr Tyr Cy· Gin
4SS 460 465
CAG TGO AGT AGT TAC CCA CCC ATO TAC ACG TTC GGA GGC GGG ACA AAG 720
Gin Trp Sar Sar Tyr Pro Pro Mat Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Ly·
470 475 480
732
TTC GAA ATA AAA
Lau Clu Ila Ly·
48S
2. Informácie o sekv. ID. č. 32:
i) Charakteristiky sekvencie
A. Dĺžka: 244 aminokyselín
B. Typ: aminokyselina
D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie ID. č. 32
Glu val Cln Leu Gin Gin Ser Gly Ale Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 S 10 15
Ser Val Lye Leu Ser Cya Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr ser His
20 25 30
Trp Het Hla Trp Val Lys Gin Arg Ala Cly Gin Gly Leu Clu Trp Íle
35 40 45
Gly Glu Phe λ·η Pro Ser Aan Gly Arg Thr Aen Tyr Aen Glu Ly· Phe
50 55 60
ty· Ser Lye Ala Thr Leu Thr Val Aap Lye Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Het Gin Leu Ser ser Leu Thr Ser Glu Aap Ser Ala Val Tyr Tyr Cya
85 90 95
Ala $er Arg Aap Tyr Asp Tyr Asp Gly Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly Ser Aap íle Glu Leu Thr Gin Ser Pro
130 13$ 140
Thr íle Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr cye Ser
145 150 155 160
Aup Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gin Gin Lys Thr Gly
165 170 175
Ser Ser Pro Arg Leu Leu íle Tyr Abd Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly
180 185 190
Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Cly Thr Ser Tyr ser Leu
19S 200 205
Thr 11* Ser Arg Het Glu Ala Clu A.p Ala Ala Thr Tyr Tyr Cya Gin
210 215 220
Gin Trp Ser Ser Tyr Pre Pro Het Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lya
225 230 235 240
Leu Glu íle Lys

Claims (10)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Jednoreťazcový fragment protilátky proti receptoru epidermálneho rastového faktora, získateľný z fágových protilátkových knižníc konštruovaných z buniek imunizovaných cicavcov, pričom variabilná oblasť reťazca Fv obsahuje ťažký reťazec aminokyselinovej sekvencie zo súboru zahŕňajúceho sekv. ID. č.: 4, sekv. ID. č.: 8, sekv. ID. č.: 12, sekv. ID. č.: 16, sekv. ID. č.: 18, sekv. ID. č.: 20, sekv. ID. č.: 22, sekv. ID. č.: 24, sekv. ID. č.: 26 a sekv. ID. č.: 28 a ľahký reťazec aminokyselinovej sekvencie zo súboru zahŕňajúceho sekv. ID. č.: 2, sekv. ID. č.: 6, sekv. ID. č.: 10, sekv. ID. č.: 14, sekv. ID. č.: 18, sekv. ID. č.: 20, sekv. ID. č.: 22, sekv. ID. č.: 24, sekv. ID. č.: 26 a sekv. ID. č.: 28.
  2. 2. Protilátkový fragment podľa nároku 1 získateľný z buniek imunizovanej myši.
  3. 3. Protilátkový fragment podľa nároku 1 alebo 2 získateľný z buniek i) lymfatickej uzliny, ii) sleziny alebo iii) imunizovaných in vitro.
  4. 4. Molekula DNA kódujúca ťažký reťazec aminokyselinovej sekvencie alebo ľahký reťazec aminokyselinovej sekvencie jednoreťazcového fragmentu protilátky proti receptoru epidermálneho rastového faktora podľa nároku 1 až 3 z DNA sekvencií zo súboru zahŕňajúceho sekv. ID. č.: 1, sekv. ID. č.: 3, sekv. ID. č.: 5, sekv. ID. č.: 7, sekv. ID. č.: 9, sekv. ID. č.: 11, sekv. ID. č.: 13, sekv. ID. č.: 15, alebo molekula DNA kódujúca ťažký a ľahký reťazec aminokyselinovej sekvencie jednoreťazcového fragmentu protilátky proti receptoru epidermálneho rastového faktora podľa nároku 1 až 3 z DNA sekvencií zo súboru zahŕňajúceho sekv. ID. č.: 17, sekv. ID. č.: 19, sekv. ID. č.: 21, sekv. ID. č.: 23, sekv. ID. č.: 25, sekv. ID. č.: 27, sekv. ID. č.: 29 a sekv. ID. č.: 31.
  5. 5. Protilátka anti-EGFR, kódovaná DNA molekulou obsahujúca sekvencie podľa nároku 4 a DNA sekvencie odvodené z konštantných oblastí ľudských imunoglobulínov.
  6. 6. Protilátka podľa nároku 5, pričom oblasť ťažkého konštantného reťazca obsahuje aminokyselinovú sekvenciu ľudského reťazca gama-1 a oblasť konštantného ľahkého reťazca obsahuje aminokyselinovú sekvenciu ľudského reťazca kappa.
  7. 7. Spôsob prípravy jednoreťazcového fragmentu protilátok proti receptoru epidermálneho rastového faktora, podľa nároku laž 3, vyznačujúci sa tým, že sa i) izoluje RNA z imunizovaných cicavčích buniek, výhodne z myších buniek, ii) syntetizuje sa prvý reťazec cDNA, iii) zosilňujú sa gény VH a VK v cDNA z imunizovaných buniek, iv) klonujú sa tieto gény spolu s vhodnými reštrikčnými miestami do fágemidového vektora, v) transformujú sa prokaryotické bunky ligačnými zmesami, vi) vykonáva sa skríning fágových knižníc na fágové protilátky, zamerané na EGFR pomocou vyčistenej EGFR a vii) produkuje sa žiadaný jednoreťazcový fragment v prokaryotických hostiteľských bunkách, výhodne v E.coli.
  8. 8. Spôsob prípravy úplnej protilátky anti-EGFR, vyznačujúci sa tým, že sa klonuje DNA podľa nároku 4, kódujúca variabilné oblasti fragmentov protilátky proti EGFR, získateľných podľa nároku 7, do aspoň jedného eukaryotického expresného vektora obsahujúceho genómovú DNA, ktorá kóduje konštantné oblasti ľudských imunoglobulínov, transformujú sa eukaryotické bunky uvedeným vektorom alebo uvedenými vektormi a expresuje sa a izoluje sa protilátka.
  9. 9. Farmaceutický prostriedok na diagnostiku a liečenie ľudských nádorov, vyznačujúci sa tým, že obsahuje jednoreťazcový fragment protilátky proti receptoru cpidcrmálncho rastového faktora podľa nároku 1 až 3, alebo úplnú protilátku anti-EGFR podľa nárokov 5 alebo 6.
  10. 10. Použitie jednoreťazcového fragmentu protilátky proti receptoru epidermálneho rastového faktora podľa nároku 1 až 3, alebo úplnú protilátku anti-EGFR podľa nárokov 5 alebo 6 na výrobu drog zameraných na nádory alebo na diagnostickú lokalizáciu a na vyhodnocovanie rastu nádorov.
SK1430-95A 1994-03-17 1995-03-16 Jednoreťazcové fragmenty protilátok a protilátky proti receptoru epidermálneho rastového faktoru, spôsob ich prípravy a farmaceutický prostriedok, ktorý ich obsahuje SK283889B6 (sk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP94104160 1994-03-17
EP94118970 1994-12-02
PCT/EP1995/000978 WO1995025167A1 (en) 1994-03-17 1995-03-16 Anti-egfr single-chain fvs and anti-egfr antibodies

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK143095A3 SK143095A3 (en) 1996-11-06
SK283889B6 true SK283889B6 (sk) 2004-04-06

Family

ID=26135522

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1430-95A SK283889B6 (sk) 1994-03-17 1995-03-16 Jednoreťazcové fragmenty protilátok a protilátky proti receptoru epidermálneho rastového faktoru, spôsob ich prípravy a farmaceutický prostriedok, ktorý ich obsahuje

Country Status (20)

Country Link
US (1) US5844093A (sk)
EP (1) EP0699237B1 (sk)
JP (2) JPH08510922A (sk)
KR (1) KR100376038B1 (sk)
AT (1) ATE232902T1 (sk)
AU (1) AU2071695A (sk)
CA (1) CA2163012C (sk)
CZ (1) CZ292061B6 (sk)
DE (1) DE69529649T2 (sk)
DK (1) DK0699237T3 (sk)
ES (1) ES2191702T3 (sk)
HU (1) HU221001B1 (sk)
MX (1) MX9504802A (sk)
NO (1) NO322252B1 (sk)
PL (1) PL181342B1 (sk)
PT (1) PT699237E (sk)
RU (1) RU2170257C2 (sk)
SK (1) SK283889B6 (sk)
UA (1) UA41929C2 (sk)
WO (1) WO1995025167A1 (sk)

Families Citing this family (126)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69428764T2 (de) * 1993-12-24 2002-06-20 Merck Patent Gmbh Immunokonjugate
US7060808B1 (en) * 1995-06-07 2006-06-13 Imclone Systems Incorporated Humanized anti-EGF receptor monoclonal antibody
AU4373197A (en) * 1996-09-19 1998-04-14 Diagnocure Inc. Recombinant single chain antibodies directed against the gp54 cancer marker, composition comprising same and use thereof
CA2616914C (en) * 1996-12-03 2012-05-29 Abgenix, Inc. Egfr-binding antibody
US6562599B1 (en) 1997-09-02 2003-05-13 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Single-stranded antibody against hepatitis B virus core protein, gene thereof, and therapeutic agent for hepatitis B containing these
DE19744531A1 (de) * 1997-10-09 1999-05-27 Klaus Dr Rer Nat Bosslet Bindemoleküle gegen Rezeptor-Ligand-Komplexe
US7435549B1 (en) 1997-11-17 2008-10-14 Micromet Ag Method of identifying binding site domains that retain the capacity of binding to an epitope
US20030224001A1 (en) * 1998-03-19 2003-12-04 Goldstein Neil I. Antibody and antibody fragments for inhibiting the growth of tumors
ZA200007412B (en) * 1998-05-15 2002-03-12 Imclone Systems Inc Treatment of human tumors with radiation and inhibitors of growth factor receptor tyrosine kinases.
JP4638035B2 (ja) 1998-08-28 2011-02-23 ジェネンテック， インコーポレイテッド ヒト抗−ＩＸ／ＩＸａ因子抗体
EE200100603A (et) * 1999-05-14 2003-02-17 Imclone Systems Incorporated Inimese refraktaarsete kasvajate ravi epidermaalse kasvufaktori retseptori antagonistidega
US7144991B2 (en) 1999-06-07 2006-12-05 Aletheon Pharmaceuticals, Inc. Streptavidin expressed gene fusions and methods of use thereof
US7361338B2 (en) * 1999-10-05 2008-04-22 Agensys, Inc. Methods to inhibit growth of prostate cancer cells
US6790631B1 (en) * 1999-10-05 2004-09-14 Agensys, Inc. G protein-coupled receptor up-regulated in prostate cancer and uses thereof
AU2001258567A1 (en) * 2000-05-19 2001-11-26 Scancell Limited Humanised antibodies to the epidermal growth factor receptor
WO2001096401A1 (fr) * 2000-06-14 2001-12-20 Medical & Biological Laboratories Co., Ltd. Procede de construction d'un anticorps scfv fusionne a une proteine fluorescente
US8697394B2 (en) 2000-06-28 2014-04-15 Glycofi, Inc. Production of modified glycoproteins having multiple antennary structures
AU7684201A (en) * 2000-06-28 2002-01-08 Glycofi Inc Methods for producing modified glycoproteins
US7598055B2 (en) * 2000-06-28 2009-10-06 Glycofi, Inc. N-acetylglucosaminyltransferase III expression in lower eukaryotes
US7449308B2 (en) 2000-06-28 2008-11-11 Glycofi, Inc. Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes
WO2002011677A2 (en) * 2000-08-09 2002-02-14 Imclone Systems Incorporated Treatment of hyperproliferative diseases with epidermal growth factor receptor antagonists
AU2001288342A1 (en) * 2000-08-21 2002-03-04 Smith Kline Beecham Corporation Anti-rank ligand monoclonal antibodies useful in treatment of rank ligand mediated disorders
CN1911965B (zh) * 2001-01-17 2013-05-29 新兴产品开发西雅图有限公司 结合域-免疫球蛋白融合蛋白
US7829084B2 (en) * 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
US7754208B2 (en) * 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
GB0103389D0 (en) * 2001-02-12 2001-03-28 Novartis Ag Organic compounds
ES2328796T3 (es) 2001-03-14 2009-11-18 Myriad Genetics, Inc. Interaccion tsg101-gag y uso de la misma.
US20080008704A1 (en) * 2001-03-16 2008-01-10 Mark Rubin Methods of treating colorectal cancer with anti-epidermal growth factor antibodies
EP1392359B2 (en) 2001-05-11 2013-03-13 Ludwig Institute for Cancer Research Ltd. Specific binding proteins and uses thereof
US20100056762A1 (en) 2001-05-11 2010-03-04 Old Lloyd J Specific binding proteins and uses thereof
US20020193569A1 (en) * 2001-06-04 2002-12-19 Idec Pharmaceuticals Corporation Bispecific fusion protein and method of use for enhancing effector cell killing of target cells
US7595378B2 (en) * 2001-06-13 2009-09-29 Genmab A/S Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor (EGFR)
CA2450285C (en) * 2001-06-13 2016-08-02 Genmab A/S Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor (egfr)
AU2003222568B2 (en) 2002-01-11 2009-05-07 Bioasis Technologies, Inc. Use of P97 as an enzyme delivery system for the delivery of therapeutic lysosomal enzymes
US8034904B2 (en) * 2002-06-14 2011-10-11 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
HUP0600340A3 (en) 2002-07-15 2011-06-28 Genentech Inc Methods for identifying tumors that are responsive to treatment with anti-erbb2 antibodies
CA2501077C (en) 2002-11-12 2016-06-21 Gerald B. Pier Polysaccharide vaccine for staphylococcal infections
US20040147428A1 (en) * 2002-11-15 2004-07-29 Pluenneke John D. Methods of treatment using an inhibitor of epidermal growth factor receptor
US7332299B2 (en) 2003-02-20 2008-02-19 Glycofi, Inc. Endomannosidases in the modification of glycoproteins in eukaryotes
EP1622941A2 (en) * 2003-03-20 2006-02-08 ImClone Systems Incorporated Method of producing an antibody to epidermal growth factor receptor
US7754209B2 (en) 2003-07-26 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals Binding constructs and methods for use thereof
ATE485307T1 (de) 2003-11-07 2010-11-15 Ablynx Nv Camelidae schwere ketten antikörper vhhs gegen epidermalen wachstumfaktor rezeptor (egfr) und ihre verwendung
EP1735348B1 (en) * 2004-03-19 2012-06-20 Imclone LLC Human anti-epidermal growth factor receptor antibody
AU2005236068C1 (en) 2004-04-21 2012-08-30 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Poly-N-acetyl glucosamine (PNAG/DPNAG)-binding peptides and methods of use thereof
GB0410627D0 (en) * 2004-05-12 2004-06-16 Scancell Ltd Specific binding members
KR101200133B1 (ko) 2004-06-01 2012-11-13 제넨테크, 인크. 항체 약물 접합체 및 방법
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
CA2580141C (en) 2004-09-23 2013-12-10 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
UA97469C2 (uk) 2005-07-25 2012-02-27 Емерджент Продакт Дівелопмент Сіетл, Елелсі Гуманізована специфічна до cd37 зв'язувальна молекула імуноглобуліну
KR20080077261A (ko) * 2005-12-06 2008-08-21 도만티스 리미티드 Ｅｇｆｒ 및/또는 ｖｅｇｆ에 대해 결합 특이성이 있는리간드 및 그의 사용 방법
US7503217B2 (en) * 2006-01-27 2009-03-17 Weatherford/Lamb, Inc. Sonar sand detection
EP1994144B1 (en) * 2006-03-06 2017-11-22 Agency for Science, Technology and Research Human embryonic stem cell methods and podxl expression
NZ573646A (en) 2006-06-12 2012-04-27 Wyeth Llc Single-chain multivalent binding proteins with effector function
EP2975057A1 (en) * 2006-07-10 2016-01-20 Fujita Health University Novel anti-cd73 antibody
KR20140119831A (ko) * 2006-12-07 2014-10-10 노파르티스 아게 Ｅｐｈｂ３에 대한 길항제 항체
JP2010513321A (ja) * 2006-12-22 2010-04-30 ノヴェリクス・セラピューティクス・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング 少なくとも一種の上皮細胞増殖因子受容体特異抗体またはその誘導体を用いる糖尿病の治療
US9090693B2 (en) 2007-01-25 2015-07-28 Dana-Farber Cancer Institute Use of anti-EGFR antibodies in treatment of EGFR mutant mediated disease
US9023356B2 (en) 2007-03-15 2015-05-05 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd Treatment method using EGFR antibodies and SRC inhibitors and related formulations
WO2008154927A1 (en) * 2007-06-21 2008-12-24 Genmab A/S Novel methods for treating egfr-associated tumors
ES2609915T3 (es) 2007-08-14 2017-04-25 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Anticuerpo monoclonal 175 direccionado al receptor de EGF y derivados y usos del mismo
CN108129573B (zh) 2007-09-21 2021-10-08 加利福尼亚大学董事会 被导靶的干扰素显示强的细胞凋亡和抗肿瘤活性
NZ603059A (en) * 2008-04-11 2014-07-25 Emergent Product Dev Seattle Cd37 immunotherapeutic and combination with bifunctional chemotherapeutic thereof
KR20110014607A (ko) 2008-04-29 2011-02-11 아보트 러보러터리즈 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
NZ589434A (en) 2008-06-03 2012-11-30 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
EP2297208A4 (en) 2008-06-03 2012-07-11 Abbott Lab DUAL VARIABLE DOMAIN IMMUNOGLOBULINS AND ITS USES
CA2729949A1 (en) 2008-07-08 2010-01-14 Abbott Laboratories Prostaglandin e2 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
RU2532911C2 (ru) 2008-07-21 2014-11-20 Дзе Брихэм Энд Уимен'З Хоспитал, Инк. Способы и композиции, относящиеся к синтетическим бета-1,6-глюкозаминолигосахаридам
KR101108642B1 (ko) * 2009-09-29 2012-02-09 주식회사 녹십자 표피 성장 인자 수용체에 특이적으로 결합하는 항체
MX2012004415A (es) 2009-10-15 2012-05-08 Abbott Lab Inmunoglobulinas de dominio variable doble y usos de las mismas.
UY32979A (es) 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
WO2011063346A1 (en) * 2009-11-20 2011-05-26 Northshore University Health System Research Institute Targeting of the c-terminal segment of c. difficile toxin b for improved clinical diagnosis, prevention, and treatment
JP6184695B2 (ja) 2009-12-04 2017-08-23 ジェネンテック， インコーポレイテッド 多重特異性抗体、抗体アナログ、組成物、及び方法
CN102167743B (zh) * 2010-02-25 2014-05-14 上海百迈博制药有限公司 一种全人源抗egfr单克隆抗体、其制备方法及用途
TWI586806B (zh) 2010-04-23 2017-06-11 建南德克公司 異多聚體蛋白質之製造
US9029513B2 (en) 2010-06-04 2015-05-12 Toagosei Co. Ltd. Anti-EGFR antibody and use thereof
AU2011285852B2 (en) 2010-08-03 2014-12-11 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
PE20140229A1 (es) 2010-08-26 2014-03-27 Abbvie Inc Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
KR101273918B1 (ko) * 2010-09-17 2013-06-13 강원대학교산학협력단 인간 항-상피세포성 성장인자수용체 Ｆａｂ 항체 및 이를 포함하는 종양 치료용 약학 조성물
CN105399831A (zh) 2010-10-29 2016-03-16 伊缪诺金公司 非拮抗性egfr结合分子及其免疫偶联物
MX2013004761A (es) 2010-10-29 2013-08-27 Immunogen Inc Nuevas moleculas de union al receptor del factor de crecimiento epidermico (egfr) e inmunoconjugados de estas.
EP2670776B1 (en) 2011-02-04 2018-11-21 F. Hoffmann-La Roche AG Fc VARIANTS AND METHODS FOR THEIR PRODUCTION
US10689447B2 (en) 2011-02-04 2020-06-23 Genentech, Inc. Fc variants and methods for their production
DK3138581T3 (en) 2011-03-17 2019-04-15 Univ Birmingham REDIRECTED IMMUNTERY
PL2717917T3 (pl) 2011-07-05 2016-12-30 Koniugaty p97 - przeciwciało
DK2739649T3 (en) 2011-08-05 2018-01-08 Bioasis Technologies Inc P97 FRAGMENTS WITH TRANSFER ACTIVITY
EP2760893B1 (en) 2011-09-30 2018-09-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbb3 antibodies and uses thereof
US9273143B2 (en) 2011-09-30 2016-03-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions comprising a combination of an anti-ErbB3 antibody and an anti-EGFR antibody
BR112014009925B1 (pt) 2011-10-28 2022-09-20 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Construtores de polipeptídeos e seus usos
EP2794010A4 (en) 2011-11-21 2015-10-21 Immunogen Inc METHOD OF TREATING TUMORS RESISTANT TO EGFR THERAPIES BY A CYTOTOXIC EGFR-AGENT ANTIBODY CONJUGATE
AU2012362326A1 (en) 2011-12-30 2014-07-24 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins against IL-13 and/or IL-17
EP2827906A1 (en) 2012-03-21 2015-01-28 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der Angewandten Forschung e.V. Novel photoimmunoconjugates for use in photodynamic therapy
US9944707B2 (en) 2012-05-17 2018-04-17 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibodies that bind epidermal growth factor receptor (EGFR)
TW201843172A (zh) 2012-06-25 2018-12-16 美商再生元醫藥公司 抗－ｅｇｆｒ抗體及其用途
JP6433424B2 (ja) 2012-07-31 2018-12-05 バイオアシス テクノロジーズ インコーポレイテッド 脱リン酸化されたリソソーム蓄積症タンパク質およびその使用方法
SG11201503412RA (en) 2012-11-01 2015-05-28 Abbvie Inc Anti-vegf/dll4 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
BR112015022416A2 (pt) 2013-03-13 2017-10-24 Bioasis Technologies Inc fragmentos de p97 e seus usos
JP2016522793A (ja) 2013-03-15 2016-08-04 アッヴィ・インコーポレイテッド ＩＬ−１βおよび／またはＩＬ−１７に対して指向された二重特異的結合タンパク質
US11117975B2 (en) 2013-04-29 2021-09-14 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-CD38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2B
PL3677591T3 (pl) 2013-04-29 2023-06-26 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Przeciwciała anty-cd38 i fuzje z interferonem alfa-2b o osłabionej aktywności
WO2015031673A2 (en) 2013-08-28 2015-03-05 Bioasis Technologies Inc. Cns-targeted conjugates having modified fc regions and methods of use thereof
US20160347821A1 (en) 2014-02-03 2016-12-01 Bioasis Technologies, Inc. P97 fusion proteins
ES2762672T3 (es) 2014-02-19 2020-05-25 Bioasis Technologies Inc Proteínas de fusión de P97-IDS
JP6847664B2 (ja) 2014-05-01 2021-03-24 バイオアシス テクノロジーズ インコーポレイテッド Ｐ９７−ポリヌクレオチド複合体
UA119352C2 (uk) 2014-05-01 2019-06-10 Тева Фармасьютикалз Острейліа Пті Лтд Комбінація леналідоміду або помалідоміду і конструкції анти-cd38 антитіло-атенуйований інтерферон альфа-2b та спосіб лікування суб'єкта, який має cd38-експресуючу пухлину
JP5924795B2 (ja) 2014-06-13 2016-05-25 テンボロン オイ 複合体
CA2965414C (en) 2014-10-29 2024-01-09 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Interferon .alpha.2.beta. variants
WO2016094881A2 (en) 2014-12-11 2016-06-16 Abbvie Inc. Lrp-8 binding proteins
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
US11352426B2 (en) 2015-09-21 2022-06-07 Aptevo Research And Development Llc CD3 binding polypeptides
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
US10100106B2 (en) 2016-05-20 2018-10-16 Harpoon Therapeutics, Inc. Single domain serum albumin binding protein
WO2018014067A1 (en) 2016-07-19 2018-01-25 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-cd47 combination therapy
CN110300603B (zh) * 2017-02-14 2023-04-14 亘喜生物科技（上海）有限公司 Cd47-car-t细胞
WO2018160754A2 (en) 2017-02-28 2018-09-07 Harpoon Therapeutics, Inc. Inducible monovalent antigen binding protein
US10543271B2 (en) 2017-05-12 2020-01-28 Harpoon Therapeutics, Inc. Mesothelin binding proteins
US10927180B2 (en) 2017-10-13 2021-02-23 Harpoon Therapeutics, Inc. B cell maturation antigen binding proteins
CN109879964B (zh) * 2017-12-06 2022-08-05 北京科立思维生物科技有限公司 抗egfr单链抗体、抗pd1单链抗体及融合蛋白
WO2019195959A1 (en) 2018-04-08 2019-10-17 Cothera Biosciences, Inc. Combination therapy for cancers with braf mutation
IL297931A (en) 2018-09-25 2023-01-01 Harpoon Therapeutics Inc dll3 binding proteins and methods of use
EP3897851A2 (en) 2018-12-17 2021-10-27 Revitope Limited Twin immune cell engager
WO2021222944A1 (en) * 2020-04-30 2021-11-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Anti-cd79b antibodies and chimeric antigen receptors and methods of use thereof
CA3128035A1 (en) 2020-08-13 2022-02-13 Bioasis Technologies, Inc. Combination therapies for delivery across the blood brain barrier
WO2022074206A1 (en) 2020-10-08 2022-04-14 Affimed Gmbh Trispecific binders
AU2022320948A1 (en) 2021-07-30 2024-01-18 Affimed Gmbh Duplexbodies
CA3233696A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 Joachim Koch Bispecific cd16a binders

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2016842A1 (en) * 1989-05-16 1990-11-16 Richard A. Lerner Method for tapping the immunological repertoire
US5395750A (en) * 1992-02-28 1995-03-07 Hoffmann-La Roche Inc. Methods for producing proteins which bind to predetermined antigens
GB9401182D0 (en) * 1994-01-21 1994-03-16 Inst Of Cancer The Research Antibodies to EGF receptor and their antitumour effect

Also Published As

Publication number Publication date
KR100376038B1 (ko) 2003-06-09
NO954626D0 (no) 1995-11-16
EP0699237B1 (en) 2003-02-19
UA41929C2 (uk) 2001-10-15
HU221001B1 (hu) 2002-07-29
RU2170257C2 (ru) 2001-07-10
DE69529649D1 (de) 2003-03-27
EP0699237A1 (en) 1996-03-06
CA2163012C (en) 2009-12-08
NO322252B1 (no) 2006-09-04
WO1995025167A1 (en) 1995-09-21
US5844093A (en) 1998-12-01
DE69529649T2 (de) 2003-12-18
SK143095A3 (en) 1996-11-06
JPH08510922A (ja) 1996-11-19
JP2006025794A (ja) 2006-02-02
PL181342B1 (pl) 2001-07-31
AU2071695A (en) 1995-10-03
HU9503285D0 (en) 1996-02-28
DK0699237T3 (da) 2003-05-26
HUT73461A (en) 1996-08-28
NO954626L (no) 1995-11-16
ES2191702T3 (es) 2003-09-16
MX9504802A (es) 1997-05-31
CZ301495A3 (en) 1996-02-14
PT699237E (pt) 2003-07-31
ATE232902T1 (de) 2003-03-15
PL311661A1 (en) 1996-03-04
CZ292061B6 (cs) 2003-07-16
CA2163012A1 (en) 1995-09-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK283889B6 (sk) Jednoreťazcové fragmenty protilátok a protilátky proti receptoru epidermálneho rastového faktoru, spôsob ich prípravy a farmaceutický prostriedok, ktorý ich obsahuje
KR20210020999A (ko) CD47-SIRPα 상호 작용을 차단할 수 있는 항체 및 이의 응용
JP3653093B2 (ja) 人化抗体
JP4460155B2 (ja) マウス抗体のヒト化
US6790938B1 (en) Anti-GPIIb/IIIa recombinant antibodies
JP2015110597A (ja) 抗ｃｄ３８ヒト抗体及びその用途
JPH0789873A (ja) リンパ球抗原ｃｄ２および腫瘍抗原を認識する二特異性トリガー分子
JPH06509944A (ja) 特定Ｆｃεレセプターのための免疫グロブリン変異体
CN1976950B (zh) 抗cd38人抗体及其用途
US20080038256A1 (en) Anti-hgf/sf humanized antibody and method for the preparation thereof
CN101389791A (zh) 融合蛋白文库的产生和筛选方法及其应用
JP7457822B2 (ja) 抗ｃｄ３および抗ｃｄ１２３二重特異性抗体およびその使用
CN116234559A (zh) 抗cd22单结构域抗体和治疗性构建体
RU2402568C2 (ru) Человеческие анти-cd38-антитела и их применение
JP2002520021A (ja) ヒトゼータ鎖の細胞外ドメインと特異的に相互作用する免疫学的試薬
CN116496396B (zh) 抗cd70纳米抗体及其用途
CN115947855B (zh) 抗cd24抗体的制备及其用途
AU724562B2 (en) Anti-EGFR single-chain Fvs and anti-EGFR antibodies
JPH10155489A (ja) 組換え抗体及びそれをコードする核酸
Nadal Isolation and validation of novel monoclonal antibodies targeting the tumor microenvironment for the selective delivery of cytokines payloads
WO2020248156A1 (zh) Pd-l1靶向结合剂及其用途
CN116903757A (zh) Cd70纳米抗体和双靶向嵌合抗原受体
CN117264055A (zh) 一种特异性结合人cd318的vhh抗体或其抗原结合片段及其制备方法和应用
CN117586402A (zh) NKp80抗体及其应用
MXPA01000325A (en) Immunological reagent specifically interacting with the extracellular domain of the human zeta chain

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees

Effective date: 20110316