DE19744531A1 - Bindemoleküle gegen Rezeptor-Ligand-Komplexe - Google Patents

Bindemoleküle gegen Rezeptor-Ligand-Komplexe

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Description

Feld der Erfindung
Die Suche nach Strukturen, die möglichst selektiv mit einer Erkrankung verbunden sind, ist eine Aufgabe, die seit vielen Jahrzehnten die Wissenschaft und die pharmazeutische Industrie beschäftigt. Viele Pharmaka sind zum Beispiel niedermolekulare Inhibitoren von Enzymen, die mit bestimmten Pathomechanismen in Verbindung gebracht werden. Häufig sind die inhibierten Enzyme jedoch weder selektiv für die Erkrankung noch in der zu behandelnden Erkrankung überexprimiert. Dieser häufig beobachtete Mangel an Selektivität ist unter anderem für unerwünschte Effekte auf Normalgewebe verantwortlich, welche die Verträglichkeit des Pharmakums (Enzyminhibitors) nachteilig beeinflußt. Andere Pharmaka interagieren zum Beispiel mit Rezeptorstrukturen auf der Zelloberfläche und hemmen die Interaktion des Rezeptors mit seinem natürlichen Liganden (Rezeptorantagonist). Hierdurch wird die Weitergabe des Signals durch den Liganden über den Rezeptor in die Zelle verhindert (Blockade der Signaltransduktion). Da die von den Rezeptorantagonisten inhibitierten Rezeptor/Ligand-Interaktionen ebenso wie die oben erwähnten Enzyme nicht nur in erkrankten, sondern auch gesunden Geweben vorkommen, ist auch der Verwendung von Rezeptorantagonisten meist mit Nebenwirkungen verbunden. Nebenwirkungen würden höchstwahrscheinlich nicht oder in nur sehr eingeschränktem Ausmaße auftreten, wenn die Rezeptorantagonisten den Rezeptor ausschließlich im erkrankten Gewebe inhibieren würden und die gesunden Gewebe unbeeinträchtig ließen.
Viele Forscher haben in den letzten 15 Jahren versucht Therapeutika zu entwickeln, die selektiv für proliferierende Endothelien in vitro und in vivo sein sollen. (Siehe als Zusammenfassung über diese Arbeiten: EP 0 696 456 A2, Seite 3 sowie Senger et al, October 24 1994 USP 08/327,709, Rockwell et al, February 10 1994, WO 95/21868, Thorpe and Burrows, 1992, WO 93/17715).
Diese potentiellen Therapeutika erkennen in vielen Fällen allerdings Antigene, die auf proliferierendem Endothel stärker exprimiert sind als auf ruhendem Endothel (Thorpe and Burrows, 1992, WO 93/17715) Therapeutika, die ausschließlich mit nur auf proliferierendem Endothel vorhandenen Antigenen reagieren, wurden zum ersten Mal von Bosslet et al in EP 0 696 456 A2 auf Seite 3, Zeile 13 (VEGFJVEGF-Rezeptor Komplex) beschrieben.
Bei unserer Suche nach für die therapeutische Anwendung besonders geeigneten Zielstrukturen, Immunogenen und Liganden, sind wir überraschenderweise auf Strukturen gestoßen, die selektiv nur in oder in der Nähe der Erkrankung vorkommen. Desweiteren ist es uns gelungen, diese Strukturen zu isolieren, zu stabilisieren und als Immunogen zur Erzeugung von Bindemolekülen, wie z.Bsp. Antikörpern, Antikörperfragmenten, (scFv, DABs,CRABS, diabodies, miniflexantibodies, miniantibodies, tetravalente mono- oder polyspezifische Antikörper) Peptiden, cyclischen Peptiden, Peptidomimetika und hieraus abgeleiteten niedermolekularen Synthetika, einzusetzen.
Diese Bindemoleküle, wie z.Bsp. Antikörper, reagieren mit Epitopen, die weder auf dem Rezeptor noch auf dem Liganden alleine vorhanden sind. Solche neuen Epitope (Neoepitope) entstehen zum Beispiel an den Stellen, an denen der Rezeptor mit seinem Liganden interagiert. Hieraus resultiert, daß Antikörper, die weder mit dem Rezeptor noch mit seinem natürlichen Liganden reagieren, den Rezeptor(en)/Ligand(en) - Komplex aber spezifisch binden, selektiv für den "Aktivierungszustand" eines Rezeptors sind und demzufolge selektiver für eine Erkrankung sind als Moleküle, die den Rezeptor oder dessen Liganden auch im nicht aktivierten Zustand beeinflussen (konventionelle Rezeptorantagonisten).
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung betrifft Bindemoleküle, die durch Immunisierung bzw. Immunselektion mit einem Rezeptor-Ligand-Komplex erhalten werden, wobei Rezeptor und Ligand durch mindestens eine kovalente Bindung miteinander verbunden sind, Verfahren zur deren Herstellung der Bindemoleküle und deren Verwendung als Arzneimittel oder Diagnostikum. Ferner betrifft die Erfindung Nukleinsäuremoleküle, die für die Antikörper kodieren, Vektoren oder Expressionsvektoren, die diese Nukleinsäuren enthalten, sowie Tiere, Zellen oder Zellinien, die die genannten Antikörper herstellen.
Hintergrund der Erfindung
Bekannte Antikörper sind spezifisch gegen den Rezeptor oder den Liganden alleine (EP 0 696 456, Millauer et al. (1993), Cell 72, 835-846), aber nicht gegen den Rezeptor-Ligand-Komplex gerichtet.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es Antikörper zu erzeugen, die im wesentlichen nur an den Rezeptor-Ligand-Komplex binden, aber nicht an den Rezeptor oder den Liganden alleine binden und daher wesentlich spezifischer für den Aktivierungszustand einer Zelle sind als Antikörper gegen den Rezeptor oder gegen den Liganden.
Es wurde gefunden, daß Antikörper, die durch Immunisierung bzw. Immunselektion mit einem Rezeptor-Ligand-Komplex erhalten werden, wobei Rezeptor und Ligand durch mindestens eine kovalente Bindung miteinander verbunden sind, sich zur Lösung dieser Aufgabe eignen.
Die Erfindung betrifft daher Antikörper, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie im wesentlichen nur an den Rezeptor-Ligand-Komplex binden.
Weitere Bindemoleküle mit Spezifität für einen Rezeptor-Ligand-Komplex können z. B. auch über das SELEX Verfahren (NeXstar Pharmaceuticals Inc.) gewonnen werden. Diese Bindemoleküle sind synthetische Oligonukleotide, sog. Aptamere. Eine Abwandlung dieser Aptamere sind die Spiegelmere (Nolte et al. (1996), Nature Biotechnology 14, 1116-1119), die aus nicht natürlich vorkommenden Nukleotiden bestehen und daher eine höhere Stabilität aufweisen.
Unter dem Begriff Rezeptor werden folgende Strukturen verstanden:
Moleküle auf Zelloberflächen, die einen Liganden binden können, oder Teile davon, die einen Liganden binden können. Dies sind beispielsweise Proteine, Glykolipide oder durch Lipide, Zucker, Ribonukleinsäure, Phosphate, Protoporphyrine, Flavinnukleotide oder Metalle modifizierte Proteine. Rezeptoren sind z. B. Tyrosinphosphokinasen wie Flt 1, KDR, Tie, Tek. Eine Zusammenfassung weiterer geeigneter Rezeptoren ist in Tabelle I und Anhang 1 gegeben.
Tabelle 1
Unter dem Begriff "Ligand" werden folgende Strukturen verstanden: Lösliche Moleküle, die an einen Rezeptor binden. Dies sind beispielsweise Proteine, Glykolipide, Peptide, Glykopeptide, Oligosaccharide, niedermolekulare Synthetika, Glykoside oder durch Lipide, Zucker, Ribonukleinsäuren, Phosphate, Protoporphyrine, Flavinadeninnukleotide oder Metall modifizierte Proteine. Liganden sind z. B. VEGF, VEGF-B, VEGF-C, Interleukin 12, PIGF, TEKL-1, TEKL-2.
Die kovalente Bindung zwischen Rezeptor und Ligand ist vorzugsweise ein Peptid oder wird durch einen bifunktionellen Vernetzer gebildet. Im Falle von Proteinrezeptor und Kohlenhy­ dratliganden können aber auch andere kovalente Bindungen verwendet werden. Als Peptid können Aminosäuresequenzen von 1 bis 30 Aminosäuren verwendet werden, z. B. die Sequenz (Gly4 Ser)3.
Die kovalente Bindung zwischen Rezeptor und Ligand wird beispielsweise so hergestellt, daß gereinigte und/oder ungereinigte Rezeptor- und Ligandmoleküle mit einem bifunktionellen Vernetzer wie Bis-Sulfosuccinimidylsuberat, N-5-Azido-2-nitrobenzoyloxysuccinimid, N- Hydroxysuccinimidyl-4-Azidobenzoat, p-Nitrophenyl-2-diazo-3,3,3-trifluoro-propionat (Pierce, Rockford, Illinois, USA) inkubiert werden und anschließend der kovalent verbundene Rezeptor-Ligand-Komplex von den Einzelkomponenten abgetrennt wird.
Geeignete Immunogene bzw. Antigene sind auch rekombinante Fusionsproteine, enthaltend die Sequenzen eines Proteinrezeptors, Peptid - als Verbindung (linker) von Rezeptor und Ligand - sowie einen Protein-oder Peptidliganden.
Geeignete Antigene zur Herstellung der erfindungsgemäßen Antikörper sind auch ein, zwei oder drei gleiche oder verschiedene Rezeptoren, die kovalent mit einem, zwei oder drei gleichen oder verschiedenen Liganden verbunden sein können. Dabei können sich folgende Rezeptor-Ligand-Komplexe ergeben:
R1-L1-R1; R1-L2-R2; R1-L1-R2; R1-L1-R2-L2-R1; R1-L1-R1-L1-R1; R1-L1-R2-L1-R1; R1-L1-R2-L1-R2; R1-L1-R2-L2-R1; R1-L1-L2-R1; R2-L1-L1-R2; R1-L1-L1-R1.
R1 und R2 stehen für zwei verschiedene Rezeptoren und L1 und L2 stehen für zwei verschiedene Liganden; "-" steht für eine kovalente Bindung zwischen Rezeptor und Ligand. Der Ligand kann auch ein Homo-oder Heterodimer sein.
Bevorzugt werden zwei gleiche Rezeptoren mit einem Liganden gekoppelt. Beispielsweise bindet ein vascular endothelial growth factor (VEGF)-Ligand an zwei kinase domain insert receptor (KDR)-Rezeptoren. Bevorzugt werden VEGF-bindende Domänen von einem KDR- Rezeptor oder einem fms-like tyrosine kinase feceptor (Flt-Rezeptor) als lösliche Komponente an einen vEGF-Liganden gebunden. Weitere mögliche und bevorzugte Rezeptor-Ligand- Komplexe enthalten die in Shawver et al., Drug Discovery Today, Vol. 2; 50-63, 1993 in Fig. 4 und 5 beschriebenen Rezeptoren und Liganden.
Darüberhinaus kann auch der nur auf proliferierenden Zellen vorkommende Komplex aus den Membranproteinen Fas-Antigen und Tumor-Nekrose Faktor Rezeptor (Yonehara et al., J. Exp. Med. 169, 1747-1756, 1989) als Immunogen/Antigen verwendet werden.
Die Erfindung betrifft ferner die folgenden DNA-Sequenzen eines single-chain Antikörperfragments (scFv), welcher die über einen Linker verbundenen variablen Domänen einer leichten (VL) und schweren (VH) Antikörperkette darstellt (VH-linker-VL). Der Linker hat die Sequenz:
und durch Mutation entstandene Derivate hiervon.
oder scFv mit partiell deletierter VH Domäne:
Die Erfindung betrifft auch funktionell äquivalente Varianten der SEQ ID NO. 1-6. Der Begriff "funktionell äquivalente Varianten" steht für Modifikationen der DNA-Sequenzen und deren entsprechende Aminosäurensequenzen, die für die leichte und/oder schwere Antikörperkette stehen, und die an den Rezeptor-Ligand-Komplex binden, aber im wesentlichen nicht an den Rezeptor oder Liganden alleine binden und deren entsprechend gebildeter Antikörper im Vergleich mit den von SEQ ID NO. 1-6 kodierten Antikörpern ähnliche Affinität zum Rezeptor-Ligand-Komplex besitzen. Die Affinität zum Rezeptor- Ligand-Komplex bestimmt nach Scatchard-Analyse beträgt von 10-3 l/Mol bis 10-15l/Mol, bevorzugt von 10-7 1/Mol bis 10-12 1/Mol.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein molekulares Konstrukt, bestehend aus der Aminosäurekette, die durch die SEQ ID NO. 1-6 oder deren Analoge kodiert werden und weitere mit den genannten Sequenzen verknüpfte Aminosäureketten, wobei diese Aminosäureketten verschieden von den erfindungsgemäßen Sequenzen und vorzugsweise Teile eines humanen Antikörpers sind, beispielsweise Teile der konstanten Bereiche der schweren und leichten Ketten. Weitere molekulare Konstrukte sind beispielsweise single domain Fragmente oder single chain Fragmente.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch humanisierte monoklonale Antikörper (humMAK) oder funktionell aktive Teile davon, die die erfindungsgemäßen leichten Antikörperketten und schweren Antikörperketten enthalten. Funktionell aktive Teile davon sind beispielsweise F(ab)- oder F(ab')2-Fragmente mit einer oder mehreren Hinge-Regionen. Funktionell äquivalente Varianten sind auch die Complementarity Determining Regions (CDRs) der Antikörper­ sequenzen, sowie von den CDRs abgeleitete Peptide oder Mimetika.
Ferner können die erfindungsgemäßen molekularen Konstrukte oder die erfindungsgemäßen humMak Effektor-oder Reportermoleküle enthalten, beispielsweise ein Chelat zur Komplexierung mit Metallionen (z. B. EDTA, DTPA), heterologe toxische Enzyme (z. B. Ricin), eine zweite Binderegion anderer Spezifität bzw. mit katalytischen Eigenschaften und/oder ein humanes oder von nicht humanen Primaten abgeleitetes toxisches oder untoxisches Enzym. Die erfindungsgemäßen Konstrukte oder die erfindungsgemäßen humMAk können beispielsweise auch nach der Methode von Schwarz (Schwarz, A. & Steinsträsser, A. (1987), A novel approach to Tc-99 labelled monoclonal antibodies. J. Nucl. Med., 28, 721) mit Tc-99m oder gemäß allgemein bekannten Methoden mit Re oder Y markiert werden. Die Markierung mit Tc-99m ist für den diagnostischen Bereich hierbei bevorzugt.
Die Erfindung schließt im allgemeinen auch jede beliebige andere Markierung mit Alpha-, Beta-oder Gamma-Strahlern ein. Die Verknüpfung der erfindungsgemäßen Sequenzen mit je nach Verwendung beliebigen Aminosäureresten kann entweder chemisch vorgenommen werden, oder mit Hilfe gentechnologischer Methoden, indem die erfindungsgemäße Sequenz oder die schweren oder leichten Ketten mit dem für das zu verknüpfende Molekül nach allgemein bekannten Verfahren chemisch oder gentechnologisch verbunden werden. Die erfindungsgemäßen Sequenzen selbst können ebenso chemisch oder gentechnologisch hergestellt werden. In dem Fall, daß der humMAk nicht aus einem intakten Antikörpermolekül besteht, sondern aus einem Fab oder F(ab')2 Fragment oder scFv, werden bei der Konstruktion der Gene für die schweren Ketten die mit der Entfernung des Fc Teiks des Antikörpers verloren gegangenen 3' Regulationssequenzen (Stop Codon, 3' nicht-translatierter Bereich und Poly-A Additionssignal) durch das C3 Exon, den 3' nicht-translatierten Bereich und das poly-A Additionssignal eines menschlichen MHC Klasse I Gens, vorzugsweise eines HLA B27 Gens, ersetzt. Die Herstellung der erfindungsgemäßen Sequenz kann wiederum entweder chemisch oder gentechnologisch nach für dem Fachmann bekannten Verfahren erfolgen.
Für die gentechologische Herstellung der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen oder deren molekularen Konstrukte kann die Wirtszelle im allgemeinen mit zwei oder mehr Vektoren transfiziert werden. Der erste Vektor enthält beispielsweise ein Operon, das für ein von einer leichten Antikörperkette abgeleitetes Polypeptid kodiert und der zweite Vektor enthält beispielsweise ein Operon, das für ein von einer schweren Antikörperkette abgeleitetes Polypeptid kodiert. Vorzugsweise sind diese beiden Vektoren mit Ausnahme der für die leichten und schweren Ketten kodierenden Bereiche identisch, um eine möglichst gleich gute Expression der leichten und schweren Ketten zu gewährleisten. Die weiteren Vektoren enthalten im allgemeinen selektierbare Marker.
Alternativ kann für die Transfektion der Wirtszelle auch ein Vektor verwendet werden, welcher sowohl die für die leichte Kette kodierenden als auch die für die schwere Kette kodierenden DNA-Sequenzen enthält.
Die DNA Sequenzen, welche für die leichten und schweren Ketten kodieren, bestehen entweder aus genomischen Sequenzen oder aus cDNA Sequenzen oder aus einer Mischung von beiden. Vorzugsweise bestehen die genannten DNA Sequenzen zumindest teilweise aus genomischer DNA.
Die Wirtszelle welche für die Expression des in dieser Erfindung beschriebenen humMAK verwendet wird, ist eine prokaryotische oder eine eukaryotische Zelle, im besonderen Escherichia coli, eine Hefe wie Saccharomyces oder CHO-Zellen.
Weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind daher auch Klonierungs- und Expressionsvektoren und transfizierte Zellen. Zudem umfaßt die Erfindung therapeutische und diagnostische Formulierungen, die die Antikörpersequenzen oder davon abgeleitete Sequenzen oder Mimetika enthalten und deren Herstellung sowie die Verwendung solcher Kompositionen in der Therapie und Diagnose von vorzugsweise Entzündungen, soliden Tumoren, insbesondere Mammakarzinom, Magenkarzinom, Prostatakarzinom, Lungenkarzinom, Colonkarzinom, Pankreaskarzinom, Kaposisarkom etc., sowie nicht soliden Tumoren wie Leukämien etc.
Die generellen Methoden, mit denen die Vektoren konstruiert werden können, die Transformationstechnologie und die Kulturtechnologie sind dem Fachmann bekannt und zum Beispiel von Maniatis (Sambrook, Fritsch, Maniatis; Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition; Cold Spring Harbor Press, S. 16.2-16.22, 16.30-16.40, 16.54-16.55 (1989)) beschrieben.
Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Antikörper geht man beispielsweise so vor, daß man den kovalent gebundenen Rezeptor-Ligand-Komplex als solchen oder in Verbindung mit einem Adjuvans zur Immunisierung, oder den Komplex zur Immunselektion von V-Regionen der naiven oder andersweitig erzeugten Antikörper-Genbanken einsetzt.
Die Immunisierung eines Wirbeltiers mit dem Rezeptor-Ligand-Komplex oder mit dem carrier­ gebundenen Rezeptor-Ligand-Komplex geschieht nach literaturbekannten Verfahren, beispielsweise durch subkutane oder intraperitoneale Injektion des Immunogens, gegebenenfalls mit einem Adjuvans wie KFA (komplettes Freund'sches Adjuvans) oder IFA (inkomplettes Freund'sches Adjuvans) oder Quil A. Sofern erforderlich, kann zur Verstärkung der Immunantwort ein- oder mehrmals "geboostert" werden. Die Auswahl der Spezies ist nicht kritisch, beispielsweise eignen sich Mäuse, Ratten, Kaninchen, Affen (Macaca fascicularis), Schafe, Ziegen oder Kamele.
Alternativ zu der oben beschriebenen Methode der Gewinnung polyklonaler Antikörper können natürlich auch monoklonale Antikörper hergestellt werden. Dies geschieht beispielsweise durch Immunisierung von Mäusen, wie oben beschrieben und anschließender Fusion der Mäusemilzzellen beispielsweise mit NS 1 Myelomzellen und Klonierung von geeigneten Zellen. Gegebenenfalls können die so gewonnenen monoklonalen Antikörper beispielsweise durch Injektion der antikörperproduzierenden Zellen in Nacktmäuse vermehrt werden. Prinzipiell ist die Herstellung solcher monoklonalen Antikörper dem Fachmann bekannt und in der Literatur beschrieben.
Alternativ kann auch mRNA aus den Milzzellen der immunisierten Tiere isoliert werden, anschließend mit reverser Transkriptase cDNA hergestellt werden und nach Amplifikation mittels PCR (polymerase chain reaction) erfolgt eine Klonierung von Antikörpergenen in einen geeigneten Wirt. Mittels Immunselektion unter Verwendung eines immobilisierten Rezeptor- Ligand-Komplexes werden Wirtszellen selektiert, die nur an den Rezeptor-Ligand-Komplex binden. Anschließend werden in einer geeigneten Wirtszelle die entsprechenden Antikörper exprimiert.
Alternativ dazu kann auch eine naive humane, murine oder Primaten-V-Genbank aus mRNA von peripheralen B-Zellen im Phagen-Genbank-System hergestellt und daraus durch Immunselektion geeignete Antikörper isoliert werden.
Bevorzugt wird alternativ zu obigen Verfahren nach Amplifikation mittels PCR eine Klonierung in eine Phagen-Genbank vorgenommen. Die Selektion der auf der Phagenoberfläche exprimierten Antikörperfragmente erfolgt mit dem immobilisierten Rezeptor- Ligand-Komplex. In einem Screening werden Phagenklone identifiziert, die den auf einer Festphase immobilisierten Komplex erkennen (positive Klone). Diese positiven Klone werden in einem 2. Screening auf Bindung an die Einzelkomponenten des Komplexes getestet. Klone, die im 1. Screening positiv und im 2. Screening negativ sind, werden weiterbearbeitet. Gene der so selektierten Klone werden in geeignete Vektoren subkloniert und in einem geeigneten Wirt exprimiert.
Die Erfindung betrifft ferner Antikörper (Ak)-Enzym-Fusionsproteine, beispielsweise Ak- RNase (Saxena, S.K. et al., J Biol. Chem. 267: 21982-6,1992), Ak-DNase I (Kreuder V. et al. (1984), Eur. J. Biochem. 139, 389-400), Ak-Onconase (Wu, Y. et al. J Biol Chem. 268: 10686- 93, 1993), Ak-Perforin (Tschopp, J. & Nabholz, M. Annu. Rev. Immunol. 8: 279-302, 1990) oder Ak-TIA (Tian et al 1991, Cell 67, 629-39), wobei die Enzyme an das 3' Ende des Antikörpers angehängt werden. Weitere Fusionsproteine bestehen aus Ak und einem Aktivatormolekül der Gerinnung, z. B. tPA (tissue plasminogen activator) oder aus Ak und einem Molekül der Gerinnungskaskade, z. B. tissue factor (TF) oder truncated tissue factor (WO 96/01653, 1994). Ein weiteres Enzym mit zytotoxischer Funktion ist das rekombinante Mistellektin (M. Langer et al., 1997. EJC Vol. 33, Suppl. 5, 49). Zellyse kann erreicht werden durch Kopplung von Antikörper an z. B. Lymphotoxin (Aggarval et al. (1984) J. Biol. Chem.
259, 686-691) oder an ein Leukalexin (z. B. das von Liu et al. beschriebene (Liu et al. (1987) Cell 51, 393-403)).
Des weiteren können die Antikörper auch an Toxine gekoppelt werden, z. B. an das rekombinante Pseudomonas Exotoxin A (ETA'; Barth et al. 1997, EJC Vol. 33, Suppl. 5, S22, 39).
Herstellbar sind diese Fusionsproteine auch durch Subklonierung der scFv in pDN22 (pUC1 19-Derivat) über Sfi I und Not I-Restriktionsschnittstellen (D. Neri, pers. Mitteilung). Dieser Vektor erlaubt die Expression von scFv mit C-terminalem Cystein. Das Cystein kann benutzt werden zur chemischen Modifikation von Antikörperfragmenten mit thiolspezifischen Substanzen, z. B. für Kopplung an ein zweites Protein über eine Disulfidbrücke, oder mit einem kopplungsfähigen Komplexbildner.
Ferner können die Antikörper nach Subklonierung des Antikörpergens in pDN268 (Neri et al. (1996), Nature Biotechnology 14, 4, 485-490) und Expression mit 32P radioaktiv markiert werden. Der Vektor pDN268 enthält C-terminal als Phosphorylierungssequenz die Erkennungssequenz für die humane Caseinkinase II. Eine Variante ist die Herstellung von scFv mit radioaktiv markierbarem Peptidlinker. 32P wird für Diagnose und Therapie eingesetzt.
Die Einführung mehrerer Cysteine in die Peptidlinker-Sequenz erlaubt die radioaktive Markierung mit 99mTc. Ein Beispiel für die Linker-Sequenz ist die Hinge-Region aus dem Maus IgGl Molekül, oder homologen humanen Ig Hinge-Regionen, die als antiparallele Peptidsequenzen engineered werden können.
Ferner können bispezifische Antikörper hergestellt werden, beispielsweise im single chain diabody Format. Hierbei wird ein Antikörperfragment mit oben beschriebener Spezifität (im Folgenden als Fragment A bezeichnet) mit einem zweiten Antikörperfragment (Fragment B) verbunden. Das zweite Fragment ist spezifisch gegen einen Faktor aus der Gerinnungskaskade (z. B. Clq) oder ein Oberflächenmolekül von T Zellen (CD8, CD24) oder TF oder TPA oder TNF oder ein anderes Effektormolekül gerichtet. Das erste und zweite Fragment werden als scFv Fragmente (VH-Domäne mit der VL-Domäne des jeweils anderen Fragments, z. B. VHB mit VLA und VHA mit VLB, mit einem 5 AS langen linker) hintereinander als eine Kette kloniert und über einen 15 AS langen linker verbunden. Durch die Expression als eine Kette werden höhere Stabilität sowie höhere Ausbeuten erreicht.
Beispiel 1 Herstellung von Antikörpern spezifisch für einen sFLT-VEGF-Komplex
VEGF (vascular endothelial growth factor) ist ein von Tumorzellen, aktivierten Makrophagen, aktivierten Granulozyten und transformierten Synoviocyten ausgeschiedener Wachstumsfaktor (Ligand), der hochselektiv an zwei auf der Cytoplasmamembran von Endothelzellen vorkommende Rezeptoren (human: KDR/Flt-1, Maus: Flk) bindet. Die Bindung des VEGF als Homodimer an KDR (VEGF-Rezeptor) führt zu einer Rezeptordimerisierung auf der Cytoplasmamembran.
Zur Isolierung und Reinigung von funktionellen Rezeptoren werden die extrazellulären (VEGF-bindenden) Domänen von Flt als lösliche Rezeptoren (sFlt = löslicher Flt) exprimiert und als funktionell aktive Moleküle isoliert (Kendall, R.L. & Thomas, K.A. 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 10705-10709; Kendall, R.L: et al. 1994, Biochem. Biophys. Res. Commun. 201, 326-330).
84 µg sFlt werden mit 1,94 µg VEGF in PBS pH 7,4 zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wird der Vernetzer BS3 (Bis-Sulfosuccinimidylsuberat) in einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben und 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wird mit 1 M Tris-HCl, pH7,4 (Endkonzentration 5 mM) gestoppt. Freier Vernetzer und nicht komplexiertes VEGF werden durch Ultrafiltration (Filter-Porengröße: 30kD) aus der Lösung entfernt und die Lösung auf ein für die Immunisierung geeignetes Volumen eingeengt.
Nach Immunisierung von Balb/c Mäusen mit 3×25 µg des VEGF-sFlt-Komplexes in Quil A wird die mRNA aus den Milzzellen der immunlsierten Tiere isoliert (E. Hornes & L. Korsnes, 1990, Genet. Anan. Tech. Appl. 7: 145-150). Anschließend wird mit der reversen Trankriptase cDNA synthetisiert (Sambrook, Fritsch, Maniatis 1990; Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition; Cold Spring Harbor Press). Amplifikation mittels PCR unter Verwendung geeigneter Primer, gefolgt von einer Klonierung unter Verwendung des Vektors pCANTAB 5E (Cambridge Antibody Technology; Pharmacia Biotech Europe GmbH; Freiburg; Recombinant Phage Antibody System) und des Helferphagen M13K07 (Vieira, J. & Messing, J., Methods in Enzymol. 153, 3, 1987) in Escherichia coli (E. coli) führt zu einer Phagen-Genbank, welche die V-Regiongene aus den Milzzellen der oben immunisierten Mäuse im scFv Format als Fusionsgene mit dem Gen III (Hüllproteingen) des Phagen enthält. Mittels Immunselektion unter Verwendung von auf Festphase immobilisiertem sFLT-VEGF-Kbmplex werden Phagen selektiert, die nur mit dem sFLT-VEGF-Komplex reagieren. Dazu werden die Phagen und/oder löslichen Antikörper-Fragmente in einem ELISA-Assay auf Bindung an den immobilisierten VEGF-sFLT-Komplex getestet. Bindende Antikörper werden auf Bindung gegen den Rezeptor (sFLT) oder Ligand (VEGF) alleine getestet. (Phagen-)Antikörper, die im zweiten Test negativ sind, werden weiterbearbeitet. Im Westernblot zeigen diese Antikörper keine Bindung an VEGF,sFLT oder sKDR alleine. Die so immunselektierten spezifischen Phagen werden in E.coli durch Ko-Infektion mit dem Helferphagen vermehrt. Die auf der, Oberfläche der Phagenklone exprimierten scFv werden durch Infektion von E.coli HB2151 als lösliche Antikörper produziert.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims (22)

1. Bindemoleküle, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch Immunisierung bzw. Immunselektion mit einem Rezeptor-Ligand-Komplex, wobei Rezeptor und Ligand durch mindestens eine kovalente Bindung miteinander verbunden sind, erhalten werden.
2. Bindemoleküle nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Rezeptor ein Protein oder ein durch Lipide, Zucker, Ribonukleinsäure, Phosphate, Protoporphyrine, Flavinadeninnukleotide oder Metalle modifiziertes Protein ist.
3. Bindemoleküle nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand ein Proteine Peptid, niedermolekulares Synthetikum, Glykosid, oder ein durch Lipide, Zucker, Ribonukleinsäuren, Phosphate, Protoporphyrin, Flavinadeninnukleotide oder Metall modifiziertes Protein ist.
4. Bindemoleküle nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein, zwei oder drei gleiche oder verschiedene Rezeptoren über einen, zwei oder drei gleiche oder verschiedene Liganden miteinander verbunden sind.
5. Bindemoleküle nach einen oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Rezeptor ein unmodifizierter oder modifizierter Teil eines natürlich vorkommenden Rezeptors ist.
6. Bindemoleküle nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand ein unmodifizierter oder modifizierter Teil eines natürlich vorkommenden Liganden oder ein niedermolekulares Synthetikum ist.
7. Bindemoleküle nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Rezeptor Kinase-domain insert-containing Rezeptor (KDR), fms-like tyrosine kinase Rezeptor (Flt), löslicher Kinase-domain insert-containing Rezeptor (sKDR) oder löslicher fms-like tyrosine kinase Rezeptor (sFlt) ist.
8. Bindemoleküle nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand vascular endothelial growth factor (VEGF) ist.
9. Bindemoleküle nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die kovalente Bindung durch Bis-Sulfosuccinimidylsuberat gebildet wird.
10. Bindemoleküle nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie im wesentlichen nur an den Rezeptor-Ligand-Komplex binden.
11. Bindemoleküle nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch rekombinante Methoden erhältlich sind.
12. Bindemoleküle nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Bindemolekül ein chimäres, humanisiertes, bi- oder oligospezifisches Bindemolekül ist.
13. Tier, Zelle oder Zellinie, dadurch gekennzeichnet, daß diese/s Bindemoleküle nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 12 herstellt.
14. Phagen-Genbank, dadurch gekennzeichnet, daß die darin enthaltenen Antikörpergene aus der mRNA von Milzzellen von mit dem Rezeptor-Ligand-Komplex immunisierten Tieren stammen.
15. Verfahren zur Herstellung von einem Antikörper nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 13 dadurch gekennzeichnet, daß man
  • a) ein immunkompetentes Wirbeltier mit einem Rezeptor-Ligand-Komplex immunisiert und anschließend die Antikörper aus dem Serum isoliert,
  • b) ein immunkompetentes Wirbeltier mit einem Rezeptor-Ligand-Komplex immunisiert, die Immunzellen aus dem Wirbeltier isoliert und durch Fusion mit Myelomzellen immortalisiert und die geeigneten spezifischen Hybridomzellen isoliert oder
  • c) mRNA aus Milzzellen der immunisierten Tiere gemäß Verfahren b) isoliert, mit reverser Transkriptase cDNA herstellt und nach Amplifikation mittels PCR in einen geeigneten Wirt kloniert und durch Immunselektion unter Verwendung eines immobilisierten Rezeptor- Ligand-Komplexes Zellen selektiert, die im wesentlichen nur an den Rezeptor-Ligand-Komplex binden und anschließend in einer geeigneten Wirtszelle die entsprechenden Antikörper exprimiert.
16. Polynukleotid mit der Sequenz
SEQ ID NO. 1
kodierend für ein Fragment aus V-Regionen der schweren und leichten Antikörperketten (scFv), oder
SEQ ID NO. 2
kodierend für ein Fragment aus V-Regionen der schweren und leichten Antikörperketten (scFv), oder
SEQ ID NO. 3
kodierend für ein scFv mit partiell deletierter VH-Domäne, oder
SEQ ID NO. 4
kodierend für ein scFv mit partiell deletierter VH-Domäne, oder
SEQ ID NO. 5
kodierend für ein scFv mit partiell deletierter VH-Domäne, oder
SEQ ID NO. 6
kodierend für ein scFv mit partiell deletierter VH-Domäne.
17. Polynukleotid nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenzhomologie von 80% bis 99% beträgt.
18. Vektor, enthaltend ein Polynukleotid nach Anspruch 15 oder 16.
19. Wirtszelle, enthaltend ein Polynukleotid nach Anspruch 15 oder 16 oder einen Vektor nach Anspruch 17.
20. Wirtszelle nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine BHK-, CHO-, myeloide, E.coli, Hefe- oder Insektenzelle ist.
21. Fusionsproteine, enthaltend einen Antikörper gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 12 und einem Effektor.
22. Fusionsproteine gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Effektor eine RNase, DNase, Onconase, TIA, rekombinantes mistletoe Lektin (MT), rekombinantes Pseudomonas Exotoxin A (ETA'), Lymphotoxin, ein Leukalexin, tissue plasminogen activator oder ein Gerinnungsfaktor (vorzugsweise tf) ist.
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