DE69605181T3

DE69605181T3 - Antikörper gegen cd30, die proteolytische spaltung und abgabe des membrangebundenen cd30 antigens verhindern

Info

Publication number: DE69605181T3
Application number: DE69605181T
Authority: DE
Inventors: Hilmar Lemke; Hinrich-Peter Hansen
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1995-01-18
Filing date: 1996-01-11
Publication date: 2006-08-24
Anticipated expiration: 2016-01-12
Also published as: JP3066983B2; CA2210620C; WO1996022384A1; EP0805871B1; ES2141467T3; JPH10502544A; AU4485696A; DE69605181D1; ATE186745T1; EP0805871B2; US6033876A; DE69605181T2; CA2210620A1; EP0805871A1; ES2141467T5

Description

Die Erfindung umfaßt Hodgkin-Zell-spezifische Anti-CD30-Rntikörper hoher Affinität, die die proteolytische Spaltung und Freisetzung von membrangebundenem CD30-Antigen verhindern, ein Verfahren zur Herstellung und die Verwendung dieser Antikörper.
Einführung
Der CD30-Aktivierungsmarker wurde ursprünglich als Hodgkinassoziiertes Ki-1-Antigen entdeckt (Schwab et al. (1982) (1)). CD30 ist ein Membranglycoprotein mit einem Molekulargewicht von 120 kDa (Froese et al. (1987) (8)). Eine lösliche Form von CD30 (sCD30) wird aus Zellmembranen freigesetzt (Hansen et al. (1989) (2)), die in Seren von Hodgkin-Patienten nachweisbar ist (Josimovic-Rlasevic et al. (1989) (3), Pfreundschuh et al. (1990) (4)), wobei die Serumspiegel von sCD30 mit der Schwere und dem klinischen Stadium der Krankheit korrelieren (Pizzolo et al. (1990) (5)). sCD30 ist ein Spaltprodukt des Zelloberflächengebundenen CD30-Moleküls, denn es konnte gezeigt werden, daß die Glycosylierungsmuster von CD30 und sCD30 identisch sind. CD30 wird durch eine spezifisch wirkende Protease gespalten.
Das membranassoziierte CD30-Antigen wird als mögliches Ziel bei der Behandlung von Hodgkin-Patienten mit Immuntoxinen erachtet. Allerdings weisen die verschiedenen Antikörper/Toxin-Konjugate große Unterschiede in ihrer Wirksamkeit auf (Engert et al. (1990) (6)). Zudem verstärkt der CD30-spezifische monoklonale Antikörper (mAk) Ki-1 die Freisetzung von sCD30 aus den Hodgkin-abgeleiteten Zellinien L428 und L540 sowie aus der CD30+ Non-Hodgkin-Lymphom-Zellinie Karpas 299 (Hansen et al. (1991) (7)).
Die Ausschüttung von CD30-Molekülen von der Zelloberfläche von Tumorzellen schmälert die Anwendung dieses Antikörpers oder macht sie möglicherweise sogar obsolet, besonders in Form von Immuntoxinen bei der Behandlung von Krebs, da diese Antikörper an CD30 wie auch an sCD30 binden.
Das Konjugat des Antikörpers Ki-1 mit der Ricin A-Kette beispielsweise war ein recht unwirksames Immuntoxin, und man folgerte, daß diese Unwirksamkeit auf die recht geringe Affinität des Antikörpers Ki-1 zurückgeht (Engert et al. (1990) (6)). Zwei weitere Gründe könnten ebenfalls die schwache Toxizität von Ki-1/Ricin A-Kette-Konjugaten erklären: a) der Antikörper Ki-1 verstärkt die Freisetzung von sCD30 aus den Hodgkin-abgeleiteten Zellinien L428 und L540 sowie aus der CD30+ Non-Hodgkin-Lymphom-Zellinie Karpas 299 (Hansen et al. (1991) (7)); b) auch der relativ große Abstand des Ki-1-Epitops von der Zellmembran ist ungünstig für den Aufbau wirkungsstarker Immuntoxine (Press et al. (1988) (11), May et al. (1990) (12)).
Auf dem Fourth Workshop on Leukocyte Differentiation Antigens in Wien im Februar 1989 wurden von drei verschiedenen Laboratorien monoklonale Antikörper präsentiert und schließlich als der CD30-Grüppe zugehörig charakterisiert. Die von den Erfindern durchgeführten Cokultivierungsexperimente von L540-Zellen mit verschiedenen Antikörpern des Standes der Technik, gefolgt von der Isolierung von sCD30 aus Kulturüberständen zeigten, daß die Freisetzung von sCD30 am meisten durch den Antikörper Ki-1 erhöht wurde und wenig durch den Antikörper HeFi-1 verstärkt wurde, während sie durch den Antikörper Ber-H2 stärker gehemmt wurde. Allerdings markiert der Antikörper Ber-H2 auch eine Subpopulation von Plasmazellen (R. Schwarting et al. (1989) (10)), und G. Pallesen (9) beschreibt auf Seite 411, daß Ber-H2 eine Kreuzreaktion mit einem Epitop eines nichtverwandten Antigens eingeht, das durch Formaldehyd verändert wird. Es ist daher im Stande der Technik kein Anti-CD30-Antikörper bekannt, der nicht sCD30 freisetzt und für Hodgkin- und Reed-Sternberg-Zellen spezifisch ist.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Aufgabe der Erfindung war deshalb die Bereitstellung neuer CD30-spezifischer Antikörper, die die Freisetzung von sCD30 nicht fördern, sondern stattdessen die Bildung von sCD30 hemmen und so möglicherweise die Bildung starker Immuntoxine gestatten. In der vorliegenden Erfindung wird die Herstellung und Reaktivität neuer CD30-spezifischer Antikörper beschrieben, mit besonderer Berücksichtigung der relativen Positionen der Epitope, die von diesen und anderen, bereits bekannten Anti-CD30-Antikörpern auf dem extrazellulären Teil des CD30-Moleküls erkannt werden. Die neuen erfindungsgemäßen Antikörper zeigen nahezu vollständige Hemmung der Bildung von sCD30 und binden nicht wesentlich an Plasmazellen oder B-Zell-Non-Hodgkin-Lymphome und sind deshalb für Hodgkin- und Reed-Sternberg-Zellen spezifisch.
Mit Hilfe des Verfahrens gemäß vorliegender Erfindung ist es möglich, zu Antikörpern mit den vorstehend erwähnten Eigenschaften zu kommen. Ein Beispiel für einen Antikörper, der mit Hilfe des Verfahrens gemäß vorliegender Erfindung erhalten werden kann, ist der monoklonale Antikörper Ki-4, der von der Hybridom-Zellinie DSM ACC 2204 sezerniert wird.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung macht Antikörper verfügbar, die an das CD30-Antigen binden und

a) sCD30 aus Hodgkin-Zellen in einer Menge von oder weniger als etwa 10% freisetzen, bezogen auf die ohne Zusatz von Antikörpern anzutreffende Freisetzung;
b) nicht an B-Zell-Non-Hodgkin-Lymphome oder Plasmazellen in einer Weise binden, die durch Immunpräzipitation nachgewiesen werden kann.

So wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "sCD30 freisetzen" die Ausschüttung von CD30-Molekülen von der Zelloberfläche von Tumorzellen. Diese Freisetzung wird bei Verwendung der erfindungsgemäßen Antikörper gegenüber der Ausschüttung, die im Fall von CD30+ Hodgkin-Zellen in vitro und in vivo ohne Antikörper anzutreffen ist, in erheblichem Maße herabgesetzt. Die Freisetzung (Ausschüttung) von sCD30 läßt sich nach der von Hansen et al. (1989) (2) beschriebenen Methode überprüfen. Bei Anwendung dieser Methode wurde gefunden, daß sich die Freisetzung von sCD30 aus Hodgkin-Zellen bei Verwendung der erfindungsgemäßen Antikörper auf 10% oder weniger reduzieren läßt. Je nach Chase-Zeit hemmte der Antikörper Ki-4 die Ausschüttung von sCD30. Die Ausschüttung wurde bis zu 16 h nahezu vollständig gehemmt, d.h., weniger als 1%. Danach kann die Menge sCD30 im Vergleich zu der von nicht behandelten Kontrollzellen auf maximal 10% zunehmen.
Üblicherweise wird zur Bestimmung der Bindung die Immunpräzipitation angewandt. Die normale Fehlergrenze bei der Immunpräzipitation beträgt etwa ≤5%. Dies bedeutet, daß Bindung durch die Anwendung der üblichen Verfahren der Immunpräzipitation mit einer Fehlergrenze von ≤5% nicht nachweisbar ist.
So wie hierin verwendet, bedeutet "im wesentlichen rein", daß die Spezies eine vorherrschende vorhandene Spezies (d.h., daß sie molaritätsbezogen häufiger ist als jede andere einzelne Spezies in der Zusammensetzung) und vorzugsweise eine im wesentlichen gereinigte Fraktion ist, worin die Spezies wenigstens etwa 50% (molaritätsbezogen) aller vorhandenen makromolekularen Spezies umfaßt. Allgemein umfaßt eine im wesentlichen reine Zusammensetzung mehr als etwa 80 bis 90% aller in der Zusammensetzung vorhandenen makromolekularen Spezies. Besonders bevorzugt wird die Spezies auf Homogenität gereinigt (verunreinigende Spezies können mit Hilfe der üblichen Nachweismethoden in der Zusammensetzung nicht nachgewiesen werden), wobei die Zusammensetzung im wesentlichen aus einer einzigen makromolekularen Spezies besteht.
So wie verwendet, bezieht sich der Begriff "Antikörper" auf ein Protein, das aus einem oder mehreren Polypeptiden besteht, die im wesentlichen durch Antikörpergene codiert werden. Zu den erkannten Antikörpergenen gehören die verschiedenen Gene der konstanten Region sowie die zahllosen Antikörpergene der variablen Region. Antikörper können in einer Vielzahl von Formen vorliegen, darunter beispielsweise Fv, Pab, und F(ab)₂ sowie als einzelne Ketten (z.B. Houston et al. (1988) (57) und Bird et al. (1988) (58), und allgemein Hood et al. (1984) (59), und Hunkapiller und Hood (1986) (60)). Bevorzugte erfindungsgemäße Antikörper sind monoklonale Antikörper und deren Fragmente, die in bezug auf die CD30-Antigen-Wechselwirkung die gleichen Merkmale aufweisen.
Der Antikörper umfaßt vorzugsweise wenigstens zwei leichte Polypeptid-Ketten und zwei schwere Polypeptid-Ketten. Eine jede der schweren und leichten Polypeptid-Ketten enthält eine variable Region (im allgemeinen der Amino-terminale Teil der Polypeptid-Kette), die eine bindende Domäne enthält, die mit dem Antigen in Wechselwirkung tritt. Eine jede der schweren und leichten Polypeptid-Ketten umfaßt auch eine konstante Region der Polypeptid-Ketten (im allgemeinen der Carboxyl-terminale Teil), die die Bindung des Antikörpers an Wirtsgewebe oder Faktoren vermitteln kann, darunter verschiedene Zellen des Immunsystems, einige phagozytäre Zellen und eine erste Komponente (C1q) des klassischen Komplementsystems. Typischerweise sind die leichten und schweren Polypeptid-Ketten komplette Ketten, die jeweils im wesentlichen aus einer variablen Region und einer kompletten konstanten Region bestehen. Die variablen Regionen des erfindungsgemäßen Antikörpers können auf die konstanten Regionen anderer Isotypen aufgepfropft werden. Zum Beispiel kann ein Polynucleotid, das die variable Region einer schweren Ki-4-Kette des γ1-Isotyps codiert, auf ein Polynucleotid aufgepfropft werden, das die konstante Region einer anderen Klasse (oder Unterklasse) schwerer Ketten codiert.
Zudem können im allgemeinen eine bis mehrere Aminosäure-Substitutionen, insbesondere konservative Aminosäure-Substitutionen an der Aminosäure-Sequenz der schweren Ketten- und/oder leichten Kettensequenz der vorliegenden Antikörper erfolgen, ohne daß die Antigen-Bindung wesentlich beeinträchtigt wird und in einigen Ausführungsformen ohne wesentliche Zunahme der Antigenität der Antikörper beim Injizieren in einen menschlichen Patienten, Bei einigen Varianten können Deletionen oder Additionen einer bis mehrerer Aminosäuren erfolgen. Typischerweise werden die Aminosäure-Substitutionen, Additionen oder Deletionen an den konstanten Regionen oder den variablen Regionen, an den Gerüst-Sequenzen und komplementären determinierenden Sequenzen (CDR) vorgenommen.
Bei der konservativen Aminosäure-Substitution handelt es sich um die Substitution einer Aminosäure durch Ersetzen mit einer Aminosäure, die ähnliche Eigenschaften aufweist (z.B. solche mit sauren Eigenschaften: Asp oder Glu). Eine konservative Aminosäure-Substitution sollte die Strukturmerkmale der Muttersequenz nicht wesentlich verändern. Beispiele für derartige Polypeptid-Strukturen sind beschrieben in Proteins, Structures and Molecular Principles, Creighton (Hrsg.), W.H. Freeman and Company, New York (1984) (61), Introduction to Protein Structure, C. Brandon und J. Tooze, Garland Publishing, New York (1981) (62), und Thornton et al. (1991) (63).
Zum Beispiel können einzelne oder mehrfache Aminosäure-Substitutionen (vorzugsweise konservative Aminosäure-Substitu tionen) in der natürlich vorkommenden Sequenz erfolgen (vorzugsweise in dem Teil des Polypeptids, der nicht direkt mit dem Antigen in Berührung kommt).
Mit den erfindungsgemäßen Antikörpern ist es möglich, eine große Zahl weiterer Antikörper aufzufinden, die mit CD30 in analoger Weise in Wechselwirkung treten. Diese Antikörper lassen sich in einer Weise an das CD30-Antigen binden, die der der erfindungsgemäßen Antikörper, insbesondere Ki-4, äquivalent ist. Des weiteren müssen diese Antikörper auf Freisetzung von sCD30 aus Hodgkin-Zellen getestet werden, die Antikörper bzw. die Zellinien, die sCD30 in einer Menge von oder weniger als 10% freisetzen, bezogen auf die ohne Zugabe von Antikörpern anzutreffende Freisetzung, werden isoliert, weiterhin werden diejenigen Zellinien isoliert, die Antikörper produzieren, die an Hodgkin-Zellen, aber nicht an B-Zell-Non-Hodgkin-Lymphome oder Plasma-Zellen binden.
Unter dem Begriff "Antikörper, die in äquivalenter Weise gebunden werden können" sind Antikörper zu verstehen, bei denen eine Epitopüberlappung mit den fraglichen Antikörpern nachweisbar ist. Die Epitopüberlappung läßt sich mit Hilfe eines kompetitiven Testsystems nachweisen. Zu diesem Zweck wird beispielsweise mit Hilfe eines Enzymimmunassays das Ausmaß getestet, in dem der Antikörper mit dem bekannten Antikörper um Bindung an ein immobilisiertes CD30-Antigen konkurriert. Zu diesem Zweck wird ein in geeigneter Weise immobilisiertes Antigen (z.B. eine CD30+ Zelle wie z.B. L540-Zellen) mit dem Antikörper Ki-4 in markierter Form und einem Überschuß des fraglichen Antikörpers inkubiert. Durch Nachweisen der gebundenen Markierung läßt sich ohne weiteres das Ausmaß feststellen, in dem der fragliche Antikörper den bestimmten Antikörper aus der Bindung verdrängen kann. Besteht eine Verdrängung von wenigstens 50% bei der gleichen Konzentration oder bei höheren Konzentrationen, vorzugsweise bei einem 10⁵fachen Überschuß an fraglichem Antikörper, bezogen auf Ki-4, so liegt Epitopüberlappung vor.
Die Antikörper können als komplette monoklonale Antikörper, Fragmente derselben (z.B. Fv, (Fv)₂, Fab, Fab', F(ab)₂), chimäre, humanisierte oder humane Antikörper verwendet werden, solange sie in geeigneter Weise an CD30 binden. Kurzkettige Antikörperfragmente, die nur die CDR-Regionen oder Teile derselben enthalten, welche spezifische Bindung an CD30 verleihen, sind ebenfalls geeignet, besonders wenn der Antikörper markiert ist. Bevorzugt sind Antikörper vom IgG1-Isotyp.
Zur Herstellung monoklonaler Antikörper siehe zum Beispiel E. Harlow und D. Lane (1988) (45), Bessler et al. (1985) (46), Jung et al. (1985) (47) oder Cianfriglia et al. (1993) (48).
Die vorliegende Erfindung macht auch ein Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers verfügbar, der an das CD30-Antigen bindet und

a) sCD30 aus Hodgkin-Zellen in einer Menge von oder weniger als 10% freisetzt, bezogen auf die ohne Zusatz von Antikörper anzutreffende Freisetzung;
b) nicht an B-Zell-Non-Hodgkin-Lymphome oder Plasmazellen in einer Weise bindet, die durch Immunpräzipitation nachgewiesen werden kann,

Bevorzugt ist ein Verfahren zur Herstellung von mAk mit verminderter Immunogenität am Menschen, worin variable Regionen von Ki-4 mit konstanten Regionen eines menschlichen Antikörpers verknüpft sind.
Die vorliegende Erfindung macht auch Derivate von erfindungsgemäßen Antikörpern verfügbar, die deren Bindungsspezifität aufweisen, jedoch mit Modifikationen in der Region, die für die Antigen-Bindung nicht von Bedeutung ist. Diese Antikörper-Derivate lassen sich möglicherweise aus erfindungsgemäßen Antikörpern durch Austausch einer oder mehrerer konstanter Domänen und/oder durch Verknüpfungen mit anderen Molekülen erhalten. So kann zum Beispiel ein Austausch konstanter Domänen für einen Isotyp durchgeführt werden, wobei zum Beispiel ein Antikörper der Klasse IgM in einen Antikörper der Klasse IgG unter Beibehaltung seiner Antigenspezifität umgewandelt wird. Ein solcher Isotypenwechsel kann mit Hilfe bekannter zellbiologischer oder molekularbiologischer Methoden vor sich gehen (siehe zum Beispiel P. Rothman et al. (1990) (13)).
Die vorliegende Erfindung befaßt sich auch mit der Verwendung eines Antikörpers gemäß vorliegender Erfindung für die Diagnose oder Therapie der Hodgkin-Krankheit. Dabei wird die Verwendung des Antikörpers Ki-4 bevorzugt, der von der Zelllinie DSM ACC 2204 sezerniert wird.
Da die mit Hilfe des Verfahrens gemäß vorliegender Erfindung erhaltenen Antikörper an oberflächengebundene CD30-Moleküle gebunden werden können, jedoch die sCD30-Freisetzung hemmen, sind sie in hervorragender Weise für den qualitativen oder quantitativen Nachweis der Hodgkin-Krankheit geeignet. Der Nachweis erfolgt dabei in bekannter Weise mit Hilfe eines immunologischen Bestimmungsverfahrens. Verfahren dieser Art sind wohlbekannt und müssen hier nicht weiter erklärt werden. Die gemäß vorliegender Erfindung erhaltenen Antikörper können dabei als nichtmarkierte und/oder immobilisierte Rezeptoren verwendet werden.
Ausgewertet wird bei diesem immunologischen Diagnoseverfahren jeweils eine Signaländerung nach Bindung wenigstens eines erfindungsgemäßen Antikörpers, an den eine nachweisbare Markierung gebunden ist.
Die diagnostische Bedeutung des CD30-Antigens wird zum Beispiel von G. Pallesen (1990) (9) beschrieben.
Die vorliegende Erfindung macht auch ein Verfahren zur Therapie von Hodgkin-Krankheit verfügbar, wobei ein Antikörper oder eine Mischung aus mehreren Antikörpern gemäß vorliegender Erfindung gegebenenfalls zusammen mit herkömmlichen pharmazeutischen Trägern, Hilfsstoffen, Füll- oder Zusatzstoffen verabreicht wird.
Zur Verhütung einer Immunantwort wird die Verwendung von Antikörpern bevorzugt, die Antikörpern menschlichem Ursprungs so ähnlich wie möglich sind (Glassy und Dillman (1988) (39)). Vorzugsweise werden Antikörper verwendet, bei denen die variable Region von Ki-4 in dem Teil weiter modifiziert ist oder alle Nicht-CD30-Bindungssequenzen des Antikörpers durch die entsprechenden Sequenzen aus einer humanen variablen Region ersetzt sind. Solche Antikörper sind zum Beispiel chimäre oder humanisierte (CDR-gepfropfte) Antikörper. Diese Antikörper werden normalerweise aus einem monoklonalen Nager-Antikörper hergestellt (eine Übersicht findet sich z.B. bei Morrison (1992) (39); Winter und Milstein (1991) (40)). Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden tumorspezifische menschliche Antikörper (Borrebaeck et al. (1988) (41); Borrebaeck (1988) (42)) für therapeutische Zwecke eingesetzt. Zudem wird besonders bevorzugt, menschliche mAk über Phagen-Display-Bibliotheken herzustellen, wie zum Beispiel von Griffith et al. (1993) (43) beschrieben ist.
Für therapeutische Zwecke wird insbesondere die Verwendung zytotoxischer Antikörper bevorzugt, die Effektorfunktionen (ADCC, CDC) verleihen (Brüggemann et al. (1987) (44)).
Da die mit Hilfe des Verfahrens gemäß vorliegender Erfindung erhaltenen monoklonalen Antikörper an zelloberflächengebundenes CD30-Antigen binden, können sie für eine in vivo-Behandlung am Menschen verwendet werden. Somit macht die vorliegende Erfindung auch eine pharmazeutische Zusammensetzung verfügbar, die einen oder mehrere Antikörper gemäß vorliegender Erfindung gegebenenfalls zusammen mit herkömmlichen pharmazeutischen Trägern, Hilfsstoffen, Füll- oder Zusatzstoffen umfaßt. Die Verabreichung eines Medikaments gemäß vorliegender Erfindung ist für die Behandlung der Hodgkin-Krankheit hilfreich.
Eine geeignete Dosierung des Antikörpers gemäß vorliegender Erfindung zur Behandlung der Hodgkin-Krankheit ist etwa 1 bis 10 mg/kg Körpergewicht, wobei diese Dosierung eventuell wiederholt zu verabreichen ist.
Bei einem anderen Ansatz wird der Antikörper oder ein Teil davon an ein Toxinmolekül (Immuntoxin) konjugiert oder durch Translation ankondensiert, so daß ein spezifisches Abtöten von Tumorzellen herbeigeführt wird (Brinkmann et al. (1991) (30); Pastan et al. (1991) (31); FitzGerald und Pastan (1989) (32)). Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden bispezifische Antikörper für die Tumortherapie verwendet (Bonino et al. (1992) (33)), die durch in vitro-Reassoziation von Polypeptid-Ketten, durch Hybrid/Hybridom-Bildung oder durch Aufbau von Diakörpern aufgebaut werden können (Holliger et al. (1993) (34); Holliger und Winter (1993) (35)).
Was die Immuntoxine anbelangt, so wird bevorzugt, den erfindungsgemäßen Antikörper an ein Toxin wie beispielsweise Pseudomonas-Exotoxin, Diphtherietoxin oder andere Toxine zu binden (FitzGerald und Pastan (1989) (32)). Bevorzugt ist auch die Bindung der Antikörper an Chemotherapeutika wie beispielsweise Doxorubicin oder an radioaktiv markierte Substanzen, die zytotoxische Wirkung aufweisen.
Konjugate der erfindungsgemäßen Antikörper, insbesondere von menschlichen Antikörpern, für die in vivo-Bildgebung beispielsweise mit radioaktiven oder fluoreszierenden Substanzen sind ebenfalls bevorzugt.
Immuntoxine sind Konjugate von Antikörpern oder von Antigenbindenden Regionen von Antikörpern mit Toxinen oder wirksamen Fragmenten derselben. Immuntoxine lassen sich mit Hilfe zweier grundsätzlich verschiedener Methoden herstellen:
Bei der einen Methode wird ein Antikörper oder ein Fragment desselben (normalerweise proteolytisch gebildet, z.B. ein Fab-Fragment) in vitro an ein Toxin oder ein Toxinfragment chemisch gebunden. Aus praktischen Gründen ist der Antikörperteil bei dieser Art Immuntoxin entweder ein kompletter Antikörper (bestehend aus zwei leichten und zwei schweren Ketten) oder mehrbevorzugt ein Fab-Fragment (bestehend aus einer leichten Kette und den VH- und CH1-Regionen der schweren Kette).
Bei der anderen Methode wird das Immuntoxin mit Hilfe von DNA-Rekombinationstechniken erzeugt, was in jedem Falle zu einem definierten, homogenen Molekül führt. Die Größe des Antikörperteils sollte möglichst gering sein, um ein kleines Immuntoxin mit guter Gewebedurchdringung zu erhalten. Bei dieser Methode ist das kleinste, praktisch verfügbare Antikörperfragment nicht das Fab-Fragment, sondern die funktionelle variable Domäne eines Antikörper, die nur aus der VH- Region der schweren Kette und der VL-Region der leichten Kette besteht. VH- und VL-Region (Polypeptid-Ketten mit jeweils etwa 100 Aminosäuren) müssen eine funktionelle Einheit bilden – die variable Domäne, die Antigen-Bindung verleiht. Fehlen irgendwelche der übrigen Teile eines Antikörpers, so bilden die VH- und VL-Region nur sehr labile Komplexe. Daher wird deren Komplex vorzugsweise durch covalente Bindungen stabilisiert.
Eine Möglichkeit ist die Verschmelzung von VH-Region, VL-Region (oder umgekehrt) und des Toxinteils auf DNA-Ebene. Nach der Expression bildet sich eine einzelne Polypeptid-Kette, wobei die VH- und VL-Region, die über einen Peptidlinker verknüpft sind, sich zu einer stabilen variablen Domäne falten, während das Toxin über einen zweiten Peptidlinker z.B. an VL ankondensiert wird (siehe Brinkmann et al. (1992) (49)). Die Länge der beidem Peptidlinker ist variabel und kann in einigen Fällen sogar bis auf eine einzige Peptidbindung reduziert sein. Ein Molekül dieses Typs wird als "einkettiges Immuntoxin" bezeichnet, analog zum Begriff "einkettiger Antikörper" oder scFV, der für eine einzelne Polypeptid-Kette verwendet wird, die sowohl VH als auch VL enthält, welche durch einen Peptidlinker oder eine Peptidbindung verknüpft sind.
Eine weitere Möglichkeit zur Stabilisierung der Einheit aus VH und VL ist bei Brinkmann et al. beschrieben (1993) (50)). Bei dieser Technik werden die Aminosäuren auf VH und VL, die im VH-VL-Komplex eng benachbart sind, mit Hilfe eines computergestützten Modells definiert. Die natürlich vorkommenden Aminosäuren in diesen Positionen werden dann auf DNA-Ebene jeweils durch ein Cystein ersetzt. Um in diesem Fall zu einem funktionellen Immuntoxin zu kommen, werden zwei separate Polypeptid-Ketten exprimiert (in separaten Zellen, z.B. prokaryontischen Zellen, z.B. E. coli), von denen eine nur die VH-Region und die andere die VL-Region ist, die durch einen Peptidlinker an den Toxinteil ankondensiert ist.
Diese beiden Polypeptid-Ketten werden unter geeigneten Bedingungen gemischt und fügen sich so zu einem funktionellen Immuntoxin zusammen, wobei VH und VL in der variablen Antikörper-Domäne durch eine Disulfid-Bindung zwischen den beiden Cysteinen verknüpft sind, die mittels Gentechnik eingeführt wurden. Der Antikörperteil bei dieser Art von Immuntoxin wird als dsFV bezeichnet und das ganze Molekül infolgedessen als "dsFV-Immuntoxin".
Natürlich bestehen noch weitere Möglichkeiten zur Herstellung von Immuntoxinen mit Hilfe von DNA-Rekombinationstechniken, beispielsweise durch Verwendung des größeren Fab-Fragments (VH-CH1 nicht covalent an VL-CL angefügt, während eines derselben durch einen Peptidlinker an das Toxin ankondensiert ist). Allerdings sind die von Brinkmann et al. (1992) (49) und Brinkmann et al. (1993) (50) beschriebenen Möglichkeiten zu bevorzugen.
Was den Toxinteil des Immuntoxins anbelangt, so sind die bevorzugten Fragmente des Pseudomonas-Exotoxins (PE) PE38 und PE40 und Derivate derselben (I. Pastan et al., WO 92/07271 (28), WO 90/12592 (29)).
Einkettiges F_v-Kette-Immuntoxin wird vorzugsweise als einzelne Polypeptid-Kette in E. coli unter Verwendung des T7-RNA-Polymerase-Expressionssystem hergestellt. Das Polypeptid wird in einer aktiven Form erhalten und muß durch in vitro-Renaturierung aktiviert werden.
Weitere Methoden zur Herstellung von peptidgebundenen einkettigen Immuntoxinen sind in WO 88/09344 (51) beschrieben. Einkettige Antikörper mit einem Peptidlinker zwischen der leichten und der schweren Kette sind in WO 88/01649 (52) beschrieben. Die Herstellung chimärer Antikörper, die wenigstens die variablen Regionen einer schweren und leichten Kette umfassen, wobei eine dieser Ketten durch eine Peptidbindung an ein Non-Ig-Molekül geknüpft ist, ist in EP-B- 0 193 276 (53) beschrieben. Das T7-RNA-Polymerase-Expressionssystem ist in den US-Patenten Nr. 7 648 971 (54), 4 952 496 (55) und 6 595 016 (56) beschrieben.
Die erfindungsgemäßen Polynucleotide und rekombinant erzeugten erfindungsgemäßen Anti-CD30-Antikörper lassen sich auf der Grundlage der Sequenzdaten nach Methoden herstellen, die in der Fachwelt bekannt und bei Sambrook et al. (1989) (64) und Berger und Kimmel (1987) (65) beschrieben sind. Die erfindungsgemäßen Polynucleotide werden vorzugsweise aus synthetischen Oligonucleotiden gebildet.
Derartige rekombinante Polypeptide können in eukaryontischen oder prokaryontischen Wirtszellen nach den üblichen, in der Fachwelt bekannten Methoden exprimiert werden. Vorzugsweise können Säugerzellen wie z.B. Lymphozyten-Zellinien als Wirtszellen verwendet werden. Typischerweise codieren diese Polynucleotid-Konstrukte eine komplette schwere Kette eines menschlichen Antikörpers und/oder eine komplette leichte Kette eines menschlichen Antikörpers, die wenigstens die Aminosäure-Sequenzen der variablen Regionen der schweren und/oder leichten Ketten von Ki-4 aufweisen. Alternative Sequenzen der humanen konstanten Region (schwere und/oder leichte Kette) außer den natürlicherweise mit Ki-4-Antikörperketten assoziierten können substituiert sein, darunter Isotypen der humanen konstanten Region, und diese alternativen Sequenzen der humanen konstanten Region können von Fachleuten aus verschiedenen Bezugsquellen ausgewählt werden, darunter – ohne darauf beschränkt zu sein – die bei E.A. Kabat et al. (1987) (37) zusammengestellten. Bei einer Ausführungsform der Erfindung werden eine Polynucleotid-Sequenz, die eine leichte Kette eines Antikörpers codiert, umfassend die konstante Region einer humanen leichten Kette mit einer Amino-terminalen Peptidverknüpfung (d.h., eine gerüstinterne Verschmelzung) an eine variable Region der leichten Kette von Ki-4, und eine entsprechende schwere Kette exprimiert und bilden Dimere aus schwerer/leichter Kette sowie andere Antikörpertypen.
Im allgemeinen können Prokaryonten zum Klonieren der DNA-Sequenzen verwendet werden, die eine Ki-4-Antikörperkette codieren. E. coli ist ein prokaryontischer Wirt, der besonders brauchbar zum Klonieren der DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung ist. Alternativ können Oligonucleotide mit Hilfe einer Vielzahl von Methoden chemisch synthetisiert werden, darunter die Phosphoramidit-Synthese.
Die Polynucleotid-Konstrukte enthalten typischerweise eine Expressionskontrollsequenz, die wirksam an die codierenden Sequenzen gebunden ist, darunter natürlich assoziierte oder heterologe Promotor-Regionen. Vorzugsweise sind die Expressionskontrollsequenzen eukaryontische Promotor-Systeme in Vektoren, die eukaryontische Wirtszellen transformieren oder transfizieren können. Sobald der Vektor in den geeigneten Wirt eingebracht worden ist, wird der Wirt unter Bedingungen gehalten, die für die hochgradige Expression der Nucleotidsequenzen und die Gewinnung und Reinigung der erfindungsgemäßen Antikörper geeignet sind. Als eukaryontische Wirtszellen können auch Säugergewebe-Zellkulturen zur Herstellung der Polypeptide der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Tatsächlich sind Säugerzellen bevorzugt, weil eine Reihe geeigneter Wirtszellinien, die intakte heterologe Proteine sezernieren können, in der Fachwelt bereits entwickelt worden sind, darunter die CHO-Zellinien, verschiedene COS-Zellinien, HeLa-Zellen, Myelom-Zellen etc..
Typischerweise werden die Polynucleotid-Sequenzen, welche die schweren und/oder leichten Ketten des erfindungsgemäßen Antikörpers codieren, in glycosylierende Zellen – die den Antikörper glycosylieren – eingebracht und dort exprimiert. So wie hierin verwendet ist "glycosylierende Zelle" eine Zelle, die Proteine glycosylieren kann, insbesondere eine eukaryontische Zelle, die imstande ist, ein N-verknüpftes "Kernoligosaccharid", das wenigstens einen Mannose-Rest enthält, und/oder einen O-verknüpften Zucker an wenigstens eine Sequenz am Glycosylierungsort in wenigstens einem in der Zelle exprimierten Polypeptid, insbesondere einem sezernierten Protein, zu addieren. Somit enthält eine glycosylierende Zelle wenigstens eine enzymatische Aktivität, welche die Anlagerung eines Zuckerrests an eine Sequenz am Glycosylierungsort in einem Protein oder Polypeptid katalysiert, und die Zelle glycosyliert tatsächlich wenigstens ein exprimiertes Polypeptid. Zum Beispiel sind Säugerzellen typische glycosylierende Zellen, was aber nicht einschränkend sein soll. Auch andere eukaryontische Zellen wie etwa Insektenzellen und Hefe können glycosylierende Zellen sein.
Nach erfolgter Expression können die erfindungsgemäßen Ki-4-Antikörper nach den üblichen fachgemäßen Verfahren gereinigt werden, darunter HPLC-Reinigung, fraktionierende Säulenchromatographie, Gelelektrophorese und dergleichen (siehe allgemein R. Scopes (1982) (36)).
Die erfindungsgemäßen therapeutischen Verbindungen können parenteral verabreicht werden, etwa intravaskulär, intraperitoneal, subkutan, intramuskulär, unter Verwendung von Formen, die in der pharmazeutischen Fachwelt bekannt sind. Die Wirkstoff-Bestandteile der vorliegenden Erfindung werden in flüssiger, pulveriger, oder lyophilisierter Form eingesetzt und können mit einem geeigneten Verdünnungsmittel oder Träger wie etwa Wasser, Salzlösung, wäßrige Dextrose, wäßriger Puffer und dergleichen kombiniert werden. Es können auch Konservierungsmittel zugesetzt werden.
Ungeachtet der gewählten Verabreichungsart werden die Verbindungen der vorliegenden Erfindung mit Hilfe der üblichen, Fachleuten bekannten Methoden zu pharmazeutisch annehmbaren Dosierungsformen formuliert. Die Verbindungen können auch unter Verwendung pharmakologisch annehmbarer Säure- oder Basenadditionssalze formuliert werden. Des weiteren können die Verbindungen oder die Salze derselben in einer geeigneten hydratisierten Form verwendet werden.
Ungeachtet der gewählten Verabreichungsart wird eine nichttoxische, aber therapeutisch wirksame Menge einer oder mehrerer erfindungsgemäßer Verbindungen bei jeder Behandlung eingesetzt. Das Dosierungsregime für die Behandlung wird nach einer Vielzahl von Faktoren ausgewählt, darunter Typ, Alter, Gewicht, Geschlecht und medizinischer Zustand des Patienten, Art des Tumors, Verabreichungsart und die im einzelnen bei der Behandlung eingesetzte Verbindung. Ein durchschnittlich versierter Arzt kann unter Berücksichtigung der bekannten Antikörpertherapie-Ansätze die erforderliche wirksame Arzneimittelmenge ohne weiteres bestimmen und verschreiben. Bei dieser Vorgehensweise kann der Arzt zunächst relativ niedrige Dosen und später höhere Dosen einsetzen, bis maximales Ansprechen erreicht wird.
Für die therapeutische Anwendung wird dem Patienten zur Behandlung der Hodgkin-Krankheit eine sterile Zusammensetzung verabreicht, die eine pharmakologisch wirksame Dosierung eines oder mehrerer erfindungsgemäßer Antikörper enthält. Typischerweise umfaßt die Zusammensetzung einen chimären oder humanisierten Antikörper, der wegen der verminderten Immunogenität die CDR-Region von Ki-4 enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die einen Ki-4-Antikörper gemäß vorliegender Erfindung enthalten, sind brauchbar für die topische oder parenterale Verabreichung, d.h., subkutan, intramuskulär, intravenös oder transdermal. Die Zusammensetzungen für die parenterale Verabreichung umfassen im allgemeinen eine Lösung eines Ki-4-Antikörpers, gelöst in einem annehmbaren Träger, vorzugsweise in einem wäßrigen Träger.
Es kann eine Vielzahl wäßriger Träger verwendet werden, z.B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4% Salzlösung, 0,3% Glycin und dergleichen. Die Lösungen sind steril und im allgemeinen aus suspendierten Partikeln. Die Zusammensetzungen können mit Hilfe der üblichen bekannten Techniken sterilisiert werden. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch annehmbare Hilfssubstanzen enthalten, etwa solche, die zur Annäherung an physiologische Bedingungen erforderlich sind, wie z.B. pH-Regulierungs- und Puffermittel, toxizitätsregulierende Mittel und dergleichen, zum Beispiel Natriumacetat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Natriumlactat etc.. Die Konzentration der erfindungsgemäßen Antikörper in diesen Formulierungen kann in weiten Grenzen variiert werden, z.B. von weniger als etwa 0,01%, normalerweise wenigstens etwa 0,1% bis zu einer Höhe von 5 Gew.-%, und sie wird hauptsächlich auf der Grundlage des Flüssigkeitsvolumens, der Viskosität etc. oder nach der im einzelnen gewählten Form der Verabreichung ausgewählt.
Somit kann eine typische pharmazeutische Zusammensetzung für die intramuskuläre Injektion so zubereitet werden, daß sie 1 ml steriles gepuffertes Wasser und etwa 1 bis 50 mg erfindungsgemäßen Antikörper enthält.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können zur Lagerung lyophilisiert und vor Gebrauch in einem geeigneten Träger wiederhergestellt werden. Es können die üblichen Lyophilisierungs- und Wiederherstellungstechniken angewandt werden. Fachleuten wird klar sein, daß die Lyophilisierung und Wiederherstellung in unterschiedlichem Ausmaß zu einem Verlust an biologischer Aktivität führen kann, und daß die Gebrauchskonzentrationen zum Ausgleich möglicherweise eingestellt werden müssen.
Die in der vorliegenden Erfindung erwähnte Zellinie DSM ACC 2204, die den Antikörper Ki-4 sezerniert, wurde von Boehringer Mannheim GmbH bei der Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, am 21. Dezember 1994 hinterlegt.
Beispiele
Beispiel 1
Material und Methoden
Antikörper
Es wurden mehrere bereits bekannte Anti-CD30-mAk als Bezugsantikörper verwendet: Ki-1, welcher der Antikörper-Prototyp für das CD30-Antigen ist (Schwab et al. (1982) (1)), Ber-H2 (Schwarting et al. (1988) (14)), mAk HRS-1 und 4 von Dr. M. Pfreundschuh, Homburg; HeFi-1 (Hecht et al. (1985) (15)), die Antikörper M44 und M67 (Smith et al. (1993) (16)) und der Antikörper C10 (Bowen et al. (1993) (17)).
Zellinien
Die Hodgkin-abgeleitete Zellinie L540 ist bei Diehl et al. (1981) (18) im Hinblick auf die Isolierung von CD30+ Zellen beschrieben. Die L540-Zellen wurden zur Immunisierung von BALB/c-Mäusen und für die Immunpräzipitation des CD30-Antigens verwendet. Die immunisierten BALB/c-Milzzellen wurden mit der Non-Sekretor-Myelom-Zellinie X63-Ag8.653 wie beschrieben hybridisiert (Lemke et al. (1985) (19)). Die EBV-transformierte B-lymphoblastische CD30-negative Zellinie PDe-B-1 ist von Gatti und Leibold (1979) (20) beschrieben.
Herstellung monoklonaler Antikörper
BALB/c-Mäuse wurden mit L540-Zellen durch drei i.p.-Injektionen von jeweils 10⁷ Zellen in Abständen von 3 Wochen immunisiert. Die hyperimmunisierten Milzzellen dieser Mäuse (5·10⁷) wurden zusammen mit 10⁷ L540-Zellen zur passiven Immunisierung in syngene Empfängermäuse übertragen, die am Tag zuvor eine Ganzkörper-Röntgenbestrahlung mit 6 Gy erhalten hatten. Eine solche Übertragung von Zellen zur passiven Immunisierung zusammen mit dem Antigen in bestrahlte syngene Empfänger führt zu vermehrter Häufigkeit antigenspezifischer Hybridome (Fox et al., 1981). Sieben Tage später wurden die Milzzellen dieser Mäuse mit X63-Ag8.653 Myelom-Zellen wie beschrieben verschmolzen (Lemke et al. (1985) (19)). Die verschmolzenen Zellen einer Milz wurden in vier Verschmelzungsplatten mit 24 Mulden (Greiner, Nürtingen) gegeben. Die größeren Mulden dieser Platten sind am Boden in 16 kleinere Kompartimente unterteilt, mit denen sichergestellt ist, daß sich die verschiedenen Hybridomklone getrennt entwickeln. Die Kulturüberstände der sich vermehrenden Hybridome wurden in einem Zell-Radioimmunassay auf Antikörper-Aktivität geprüft, wobei ¹²⁵I-radiomarkierter Ziegen-Antimaus-Antikörper (GaMIg; Dianova, Hamburg) oder Staphylokokken-Protein A (SpA; Boehringer Mannheim, Mannheim) als sekundäre Reagenzien wie beschrieben verwendet wurden (Lemke et al. (1985) (19)).
Immunhistochemie
Die Spezifität der mAk wurde an menschlichen Gewebeproben geprüft, die bei chirurgischen Operationen gesammelt, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80°C kältekonserviert worden waren. Die Methode mit Immunperoxidase (Schwab et al. (1982) (1)) oder alkalischer Immunphosphatase wurde an 5 μm-Gefrierschnitten von nahezu allen normalen Gewebetypen durchgeführt. Außerdem wurden Proben der Hodgkin-Krankheit mit gemischten Zellformen (n=12), Unterarten der nodulären Sklerose (n=8) und Fälle von großem anaplastischen Lymphom (n=5) miteinbezogen. Untersucht wurden zudem Fälle von B-Zell-Lymphom des zentroblastischen Typs und T-Zell-Lymphom (n=5) gemäß Kieler Klassifikation. Bei den in dieser Studie miteinbezogenen nichtlymphoiden Neoplasien handelte es sich um Adenokarzinome (n=5), squamöse Zellkarzinome (n=3), maligne Melanome (n=8) und maligne faserige Histiozytome (n=3). Bei Antikörpern, die ein paraffinresistentes Epitop erkennen, wurden routinemäßig behandelte Gewebeproben, fixiert in 4% Formalin und eingebettet in Paraffin, nach 10minütigem Verdau mit Trypsin (Sigma Chemicals, München) bei 37°C einer Immunperoxidase-Reaktion unterzogen. In parallelen Studien entfiel der Trypsin-Verdau. Alle Fälle wurden beim Kieler Lymphom-Register der Gesellschaft deutscher Pathologen durch Lichtmikroskopie in H&E- und Giemsa-angefärbten Paraffinschnitten diagnostiziert. Die Diagnose wurde zudem durch Immunhistochemie mit einem Längsschnitt Zellklonspezifischer mAk gestützt (Parwaresch et al., in Vorbereitung (22)).
Immunpräzipitation des CD30-Antigens
Es wurden CD30-spezifische mAk verwendet, um die auf L540-Zellen erkannten Membranantigene zu isolieren. Die biosynthetische Markierung der L540-Zellen mit ³⁵S-Methionin und die Immunpräzipitation erfolgten wie vorbeschrieben (Hansen et al. (1989) (2)). Die Spezifität der Antikörper für CD30 wurde wie beschrieben durch sequentielle Immunpräzipitation überprüft (Hansen et al. (1990) (23)).
Studien zur Hemmung der Bindung
Die Experimente zur Bestimmung der gegenseitigen Bindungshemmung der Anti-CD30-Antikörper erfolgten wie beschrieben (Lemke und Hämmerling (1982) (24)). Die Antikörper wurden durch Affinitätschromatographie entweder mit Hilfe von covalent an CNBr-aktivierte Sepharose^TM CL4b (Pharmacia, Freiburg) gebundenem SpA-S oder GaMIg von Kulturüberständen gereinigt. Die Konzentration an eluiertem Protein wurde mit Hilfe des Verfahrens von Whitaker und Granum (1980) (25) bestimmt, und der Gehalt an spezifischem Antikörper wurde wie beschrieben berechnet (Lemke und Hämmerling (1982) (24)).
Ergebnisse
Herstellung von Anti-CD30-Antikörpern
Die Milzzellen zweier mit L540-Zellen immunisierter BALB/c- Mäuse wurden separat mit X63-Ag8.653-Myelom-Zellen verschmolzen. Die Kulturüberstände der sich vermehrenden Hybridome wurden nacheinander auf Antikörper-Aktivität gegen L540-Zellen und ein CD30+-Haut-T-Zell-Lymphom sowie auf Negativität auf CD30-EBV-transformierte PDe-B-1-Zellen und ein CD30-Haut-T-Lymphom getestet. Die Antikörper, die diesen Anforderungen genügten, wurden auf Paraffinbett- und Kälteschnitten verschiedener lymphoider Gewebe auf eine für CD30 charakteristische Färbung geprüft (siehe unten). Nach diesen Tests verblieben die erfindungsgemäßen Antikörper und zeigten ein CD30-spezifisches Färbungsmuster. Die charakteristischen Eigenschaften sind in Tabelle I gezeigt.
Spezifität der Antikörper
Die neuen mAk zeigten ein stark eingeschränktes immunhistochemisches Verteilungsmuster in menschlichem Gewebe, und ihre Spezifität wurde daher in weiteren Studien ermittelt. Was normales menschliches Gewebe anbetrifft, so war keine Reaktivität in Gewebeproben aus Gehirn, Haut, Lunge, Herz und Gefäßen, endokrinen und exokrinen Drüsen, Gastrointestinaltrakt, Leber- und Gallensystem, Nieren und Urogenitaltrakt, Muskeln, Knochen, Knorpel und Weichgewebe anzutreffen. Auch die hämatopoetischen Zellen des Blutes waren bei diesen Antikörpern völlig negativ, während wie bei Antikörper Ki-1 einige Zellen im Knochenmark (Schwab et al. (1982) (1)) auch mit Ki-Antikörpern reagierten. In lymphoiden Geweben wie etwa den Mandeln, Lymphknoten und Milz zeigten nur einige wenige lymphoide Zellen in den perifollikulären Bereichen eine schwache oberflächengebundene Reaktivität gegenüber den neuen Antikörpern. Das Thymusgewebe war völlig negativ. Wir überprüften auch einen großen Längsschnitt permanenter Zellinien, die aus transformierten menschlichen Zellen gebildet wurden. Die neuen Antikörper zeigten ein identisches Reaktivitätsmuster wie die bereits bekannten Anti-CD30-Antikörper Ki-1 und Ber-H2.
Die immunhistochemische Analyse eines Längsschnitts nicht-hämatopoetischer menschlicher Malignitäten zeigte, daß die neuen Antikörper mit keinem der Adenokarzinome (n=5), squamösen Zellkarzinome (n=3), malignen Melanome (n=8), malignen faserigen Histiozytome (n=3) und 2 Fällen von Neurosarkomen reagierten. Bei den auf CD30 negativen hämatopoetischen Neoplasien wurde keine Coreaktivität dieser Antikörper mit akuter myeloischer Leukämie (n=3), akuter monozytischer Leukämie (n=3), chronischer myeloischer Leukämie (n=3), prä-B-lymphoblastischer Leukämie (n=2), lymphoblastischer Thymus-Leukämie (n=1), malignem T-Lymphom (n=5) und malignem B-Lymphom (n=3) aufgefunden. In einem Längsschnitt aus 18 Fällen von CD30-positiven humanen Lymphom-Typen waren die monoklonalen Antikörper in völliger Übereinstimmung mit der Reaktivität der bereits bekannten Anti-CD30-Antikörper Ki-1 und Ber-H2 regelmäßig positiv. Die charakteristischen Sternberg-Reed- und Hodgkin-Zellen bei der nodulären Sklerose oder die gemischten Zellformtypen der Hodgkin-Krankheit zeigten bei allen sechs Antikörpern variable Reaktivität. Bei den Ki-1-positiven großzelligen anaplastischen Lymphomen, bei denen über 60% der Tumorzellen CD30 exprimieren, zeigten die neuen Antikörper eine vergleichbare Häufigkeit bei der Positivität.
Eigenschaften der Anti-CD30 Antikörper
Zudem wurde die Spezifität der neuen Anti-CD30-Antikörper durch Immunpräzipitation der erkannten Moleküle aus CD30-positiven und zu Kontrollzwecken aus negativen Zellinien geprüft. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Tabelle I zusammengefaßt. Die Antikörper ermöglichten die Isolierung zweier Moleküle mit 90 bzw. 120 kDa aus positiven, nicht aber aus CD30-negativen Zellinien, die höchstwahrscheinlich mit dem 90 kDa-Vorläufer und der reifen 120 kDa-Membranform des CD30-Antigens identisch waren (Hansen et al. (1989) (2)). Die Identität der mit Hilfe der Antikörper mit dem CD30-Aktivierungsmarker isolierten 90/120 kDa-Moleküle wurde durch sequentielle Immunpräzipitation unter Verwendung der Antikörper Ki-1 und Ber-H2 als CD30-spezifische Bezugsantikörper bestätigt.
Bindungshemmungsexperimente mit monoklonalen Anti-CD30-Antikörpern
Zur Bewertung der räumlichen Beziehung der CD30-spezifischen Determinanten, die von den verschiedenen mAk auf dem CD30-Antigen erkannt werden, wurden kompetitive Antikörper-Bindungshemmungsstudien durchgeführt. Die ersten Experimente wurden mit 10 CD30-spezifischen Antikörpern durchgeführt: Ki-4 und die bereits bekannten mAk Ki-1 und Ber-H2 wurden als iodierte Indikatoren sowie als unmarkierte Konkurrenten eingesetzt, während die mAk HRS-1 und HRS-4 nur in geringen Mengen aus Kulturüberständen verfügbar waren und nur als ungereinigte kalte Konkurrenten eingesetzt werden konnten.
Bei der Bindung des radiomarkierten mAk Ki-1 an CD30+ Hodgkin-abgeleitete L540-Zielzellen bestand Konkurrenz mit anderen CD30-spezifischen mAk. Hierfür wurde der Iod-125-markierte mAk Ki-1 (0,2 μg/ml) mit 2·10⁵ L540-Zellen in Gegenwart verschiedener Konzentrationen an nichtmarkiertem mAk als Hemmer in einem Gesamtvolumen von 60 μl über 90 min bei RT inkubiert. Im Experiment entspricht der 100%-Bindungswert ohne Hemmer 4,540 min^–1 Gebundenem. Die Bindung des mAk Ki-1 wurde durch den unmarkierten mAk Ki-1 gleich gut gehemmt und nicht durch den mAk Ki4 beeinflußt, während sie durch Ber-H2 verstärkt wurde. Aus diesen Bindungshemmungskurven konnten Bindungshemmungsfaktoren errechnet werden, die zeigen, um wieviel mehr der heterologe Konkurrent eingesetzt werden muß, um 50% Hemmung zu erhalten, verglichen mit der Menge an kaltem homologen Antikörper, der 50% Hemmung ergibt. Diese Daten sind in Tabelle II zusammengefaßt. Kürzlich wurden die mAk M44 und M67 (Smith et al. (1993) (16)) und der mAk C10 (Bowen et al. (1993) (17)) in diese Studie miteinbezogen. Die Mengen der gereinigten Antikörper M44 und M67 waren ausreichend, um sie als radiomarkierte Indikatoren zu verwenden, und der mAk C10 konnte als kalter Konkurrent verwendet werden.
Die CD30-spezifischen mAk lassen sich in drei Gruppen einteilen. Gruppe A setzt sich zusammen aus den Antikörpern Ki-4, Ber-H2, HRS-1 und HRS-4, die den größten Block antigenspezifischer Epitope auf dem CD30-Membranantigen definieren. Die meisten Vertreter der Gruppe A können wechselseitig die Bindung anderer Vertreter dieser Gruppe an L540-Zielzellen hemmen, hemmen aber nicht die Bindung anderer Antikörper. Eine zweite Gruppe B setzt sich zusammen aus den mAk Ki-1 und M67, die wechselseitig Bindungshemmung an L540-Zielzellen aufweisen. Interessanterweise wird die Bindung des Antikörpers Ki-1 durch den der Gruppe A zugehörigen Antikörper Ber-H2 leicht verstärkt (Tabelle II). Die dritte Gruppe C der CD30-spezifischen Epitope wird durch die Antikörper M44, HeFi-1 und C10 definiert. Diese Antikörper zeigen wechselseitige Bindungshemmung an L540-Zellen, doch wird ihre Bindung durch keinen der Antikörper der Gruppen A und B beeinflußt (Tabelle II).
Einfluß spezifischer Antikörper auf die Ausschüttung von CD30-Membranantigen
Der Anti-CD30-Antikörper Ki-1 verstärkt die Ausschüttung des CD30-Membranantigens (Hansen et al. (1991) (7)). Da dieses Phänomen der toxischen Wirkung von Immuntoxinen entgegenwirken würde, wurde geprüft, ob die erfindungsgemäßen Anti-CD30-mAk die Ausschüttung dieses Aktivierungsmarkers wie beschrieben beeinflussen (Hansen et al. (1989) (2)). Hierfür wurden L540-Zellen mit ³⁵S-Methionin 10 min lang pulsmarkiert, gewaschen und in frischem Medium resuspendiert. Dann wurden Aliquote von 2·10⁵ Zellen über eine Chase-Dauer von 16 h entweder ohne Antikörper oder mit den mAk Ki-1, Ber-H2, Ki-4 und HeFi-1 kultiviert. Das sCD30 wurde wie in Beispiel 1 beschrieben isoliert, mittels SDS-PAGE (Gele mit 7,5-15% Gradient unter reduzierenden Bedingungen) analysiert und durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Im Vergleich zu den negativen Kontrollkulturen ohne Antikörper wurde die Freisetzung von sCD30 durch Ki-1 am meisten verstärkt und in unterschiedlichem Ausmaß durch M44 und HeFi-1. Dagegen hemmten die mAk Ber-H2 und Ki-4 die Freisetzung von sCD30 aus L540-Zellen deutlich. Die Verminderung von sCD30 durch den mAk Ki-4 schien reproduzierbar etwas stärker zu sein als die von Ber-H2 induzierte.
Beispiel 2
Isolierung des sCD30-Antigens
CD30-positive Zellen, z.B. Hodgkin-analoge L540-Zellen, wurden mit ³⁵S-Methionin 10 min lang pulsmarkiert, worauf nicht-aufgenommenes Material abgetrennt und ein Überschuß an kaltem Methionin in frischem RPMI 1640-Medium zugesetzt wurde. Nach unterschiedlichen Chase-Zeiten wurde das CD30-Antigen entweder aus den Zellen oder den Überständen dieser Zellproben durch Immunpräzipitation mit Hilfe der Anti-CD30-Antikörper isoliert. Die Immunkomplexe wurden durch Affinitätschromatographie auf Staphylokokken-Protein A/Sepharose^TM CL-4B isoliert, und die antigenen Moleküle wurden nach Trennung mittels Natriumdodecylsulfonat/Polyacrylamid-Gelelektrophorese mit Hilfe der Autoradiographie analysiert. Die Menge an isoliertem sCD30 wurde aus der Intensität der markierten Banden errechnet, oder diese Banden wurden aus den Gelen herausgeschnitten und die Radioaktivitätsmenge durch Flüssigkeits-Szintillationszählung gemessen.
Beispiel 3
Herstellung von Immuntoxin (Engert et al. (1990) (6))
Immuntoxine gegen das CD30-Antigen werden durch Anlagerung von Ricin A-Kette-Toxin an Ki-4 hergestellt.
Hierfür wurden aus Ki-4 Fab-Fragmente hergestellt. durch Dialysieren des kompletten Antikörpers in 0,2 mol/l Citrat-Puffer, pH 8,0, und Einengen durch Ultrafiltration (Amicon^TM PM-10-Membran) auf 7,5 mg/ml. Der pH wurde durch Zugabe von 1 mol/l Citronensäure auf 3,7 abgesenkt, und die Antikörper-Lösungen wurden anschließend 4 Stunden lang bei 37°C mit Pepsin inkubiert (Enzym/Protein-Verhältnis 1:6, gewichtsbezogen). Der Verdau wurde durch Anheben des pH auf 8,0 mit 1 mol/l Tris-Puffer beendet. Die F(ab')₂-Fragmente wurden isoliert durch Gelfiltration auf Säulen mit Sephacryl^TM S-200 HR, äquilibriert in PBS, pH 7,5. Die F(ab')₂-Fragmente wurden mit 1-5 mmol/l DTT (Dithiothreit) zu Fab'-Monomeren reduziert. Das restliche DTT wurde durch Gelfiltration auf Sephadex^TM G25 abgetrennt.
IgG-Immuntoxine wurden hergestellt unter Verwendung des Verknüpfungsmittels 4-Succinimidyloxycarbonyl-α-methyl-(2-pyridyldithio)toluol, das von Thorpe et al. (1987) (26) beschrieben ist.
Fab'-Immuntoxine wurden nach der Methode von Ghetie et al. (1988) (27) hergestellt. Kurz umrissen wurden die Fab'-Fragmente (5 mg/ml in 0,1 mol/l Natriumphosphat-Puffer, pH 7,5, enthaltend 1 mmol/l EDTA) mit 5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure (Ellmans Reagens) bei einer Endkonzentration von 2 mmol/l derivatisiert. Unumgesetztes Ellman-Reagens wurde abgetrennt durch Gelfiltration auf einer Sephadex^TM G25-Säule, äquilibriert in PBS. Die derivatisierten Fab'-Fragmente, die 1-2 aktivierte Disulfid-Gruppen enthielten, wurden mit einem 1,5fachen molaren Überschuß frisch reduzierter A-Kette 2 Stunden lang bei Raumtemperatur reagieren lassen. Die Fab'-dgA-Immuntoxine wurden anschließend auf Säulen mit Sephadex^TM S200 HR und Blue Sepharose^TM wie von Thorp et al. (1987) (26) beschrieben gereinigt. Tabelle I Eigenschaften des monoklonalen Anti-CD30-Antikörpers Ki-4

a) Es wurde geprüft, ob der Antikörper die lösliche Form von CD30 (sCD30) aus Kulturüberständen von Hodgkin-abgeleiteten, mit ³⁵S-Methionin markierten L540-Zellen isolieren kann.
b) Die Zahlen geben die Molekulargewichte der immunpräzipitierten verschiedenen Formen von CD30 an.

^a)

a) Der Test wurde mit Hodgkin-abgeleiteten CD30+ L540-Zellen durchgeführt.
b) Die Antikörper HSR-1 und -4 waren nur in geringen Mengen als ungereinigte Kulturüberstände verfügbar. Die Mengen an gereinigtem M44 und M67 ermöglichten die Anwendung als radiomarkierter Indikator, aber nicht als unmarkierter Konkurrent.
c) Die Menge an homologem Antikörper, die 50% Hemmung ergab, wird gleich 1 gesetzt.
d) Die Zahlen geben den Faktor an, um den der homologe Bindungshemmungswert 50% erhöht werden muß, um 50% Hemmung mit dem heterologen Antikörper zu erhalten.
e) Keine nennenswerte Hemmung.
f) Nennenswerte Hemmung wurde bei hohen Konzentrationen an heterologem Antikörper beobachtet, doch wurden 50% Hemmung nicht erreicht.
h) = nicht geprüft.
i) +/+ + + = Antikörper C10 enthaltende Bauchwassersucht-Flüssigkeit induzierte 45% Hemmung des radiomarkierten Antikörpers K-3 (+) und vollständige Hemmung der Antikörper M44 und HeFi-1 (+ + +).

Zitate

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Claims

Antikörper, der an das CD30-Antigen bindet und a) sCD30 aus Hodgkin-Zellen in einer Menge von oder weniger als 10% freisetzt, bezogen auf die ohne Zusatz von Antikörper anzutreffende Freisetzung; b) nicht an B-Zell-Non-Hodgkin-Lymphome oder Plasmazellen in einer Weise bindet, die durch Immunpräzipitation nachgewiesen werden kann.
Antikörper nach Anspruch 1, der aus der Zellinie DSM ACC 2204 erhalten werden kann.
Antikörper nach den Ansprüchen 1 bis 2, wobei der Antikörper an ein Toxin gebunden ist.
Antikörper nach den Ansprüchen 1 bis 3, worin die variable Region von Ki-4 in dem Teil modifiziert ist oder alle Nicht-CD30-Bindungssequenzen des Antikörpers durch die entsprechenden Sequenzen aus einer humanen variablen Region ersetzt werden.
Die Zellinie DSM ACC 2204.
Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers, der an das CD30-Antigen bindet und a) sCD30 aus Hodgkin-Zellen in einer Menge von oder weniger als 10% freisetzt, bezogen auf die ohne Zusatz von Antikörper anzutreffende Freisetzung; b) nicht an B-Zell-Non-Hodgkin-Lymphome oder Plasmazellen in einer Weise bindet, die durch Immunpräzipitation nachgewiesen werden kann, wobei eine Säuger-Spezies mit einer Hodgkin-Zellinie immunisiert wird, anti-CD30-Antikörper produzierende B-Zellen isoliert und mit Myelom-Zellinien verschmolzen werden, die verschmolzenen Zellinien isoliert und auf Antikörper-Wirkung gegen Hodgkin-Zellen sowie auf Freisetzung von sCD30 aus Hodgkin-Zellen geprüft werden, die Zellinien, die Antikörper erzeugen, die an Hodgkin-Zellinien, aber nicht an B-Zell-Non-Hodgkin-Lymphome oder Plasmazellen in einer Weise binden, die durch Immunpräzipitation nachgewiesen werden kann, und sCD30 in einer Menge von oder weniger als 10% freisetzen, isoliert werden, monoklonale Antikörper aus diesen Zellinien erzeugt und isoliert werden.
Verfahren zur Herstellung eines anti-CD30-Antikörpers nach Anspruch 6, mit einer verminderten Immunogenizität am Menschen, wobei die variablen Regionen von Ki-4 an die konstanten Regionen eines menschlichen Antikörpers gebunden sind.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die konstante Region von Ki-4 in dem Teil modifiziert ist oder alle Nicht-CD30-Bindungssequenzen des Antikörpers durch die entsprechenden Sequenzen aus einer humanen variablen Region ersetzt werden.
Verwendung eines Antikörpers nach den Ansprüchen 1 bis 4 zur Herstellung eines Therapeutikums für die Behandlung der Hodgkin-Krankheit.
Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend einen Antikörper nach den Ansprüchen 1 bis 4.