-
Gebiet der Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung von
neurologischen Krankheiten und Antikörper zur Verwendung in einem
solchen Verfahren.
-
Hintergrund der Erfindung
-
Schlaganfall
ist eine Hauptursache für
Tod und Invalidität
in der westlichen Welt. Es gibt keine andere anerkannte Therapie
für die
Behandlung von Schlaganfall als t-PA, das innerhalb von 3 h des
Einsetzens nach einer Computertomographie verabreicht werden muß, um Blutung
auszuschließen.
Bis heute haben die meisten auf die Behandlung von akutem Schlaganfall
gerichteten therapeutischen Mittel (d.h. Neuroprotektion) vorherrschend
das Abzielen auf Glutamatrezeptoren und ihre Signalwege stromabwärts involviert,
von denen bekannt ist, daß sie
an akutem Zelltod beteiligt sind. Jedoch haben sich diese Strategien
bis heute als erfolglos in klinischen Versuchen erwiesen und sind
häufig
mit dosisbeschränkenden
Nebenwirkungen verbunden (Hill & Hachinski,
The Lancet, 352: (Suppl. III) 10–14 (1998)). Es besteht deshalb
ein Bedarf an neuen Ansätzen, die
auf die Linderung von Zelltod nach dem Stillstand des Blutflusses
gerichtet sind.
-
Nach
dem Einsetzen von Schlaganfall wird bei vielen Patienten ein gewisser
Grad an spontaner funktionaler Erholung beobachtet, was nahelegt,
daß das
Hirn eine (wenn auch beschränkte)
Fähigkeit
zur Reparatur und/oder Neubildung nach der Verletzung hat. Mittel,
die das Potential zur Steigerung dieser Erholung haben, können deshalb
das Vornehmen eines Eingriffs zu einem viel späteren Zeitpunkt (möglicherweise
Tage) nach dem Einsetzen von zerebraler Ischämie erlauben. Mittel, die sowohl
akute Neuroprotektion bieten können
als auch die funktionale Erholung steigern können, können signifikante Vorteile
gegenüber
derzeitigen potentiellen neuroprotektiven Strategien liefern.
-
Der
funktionalen Erholung zugrundeliegende Mechanismen sind derzeit
unbekannt. Das Aussprossen von verletzten oder unverletzten Axonen
wurde als ein möglicher
Mechanismus vorgeschlagen. Obwohl Untersuchungen in vivo gezeigt
haben, daß die
Behandlung von Rückenmarksverletzung
oder Schlaganfall mit neurotrophen Faktoren zu einer gesteigerten
funktionalen Erholung und einem Grad von axonalem Aussprossen führt, haben
diese dennoch keine direkte Verbindung zwischen dem Grad des axonalen
Aussprossens und dem Ausmaß der
funktionalen Erholung bewiesen (Jakeman et al. 1998, Exp. Neurol.
154: 170–184,
Kawamata et al. 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:8179–8184, Ribotta
et al. 2000, J. Neurosci. 20: 5144–5152). Außerdem erfordert das axonale
Aussprossen ein lebensfähiges
Neuron. Bei Krankheiten wie Schlaganfall, der mit umfassendem Zelltod
verbunden ist, kann deshalb die Steigerung der funktionalen Erholung,
die durch ein nach dem Schlaganfall gegebenes Mittel angeboten wird,
durch andere Mechanismen als das axonale Aussprossen erfolgen, zum
Beispiel Differenzierung endogener Stammzellen, Aktivierung redundanter
Signalwege, Veränderungen
in der Rezeptorverteilung oder Erregbarkeit von Neuronen oder Glia
(Fawcett & Asher, 1999,
Brain Res. Bulletin, 49: 377–391,
Horner & Gage,
2000, Nature 407, 963–970).
-
Es
wird angenommen, daß die
beschränkte
Fähigkeit
des zentralen Nervensystems (ZNS) zur Reparatur nach einer Verletzung
zum Teil auf Molekülen
innerhalb der ZNS-Umgebung beruht, die eine inhibitorische Wirkung
auf das axonale Aussprossen haben (Neuritenauswuchs). Es wird angenommen,
daß ZNS-Myelin
inhibitorische Moleküle
enthält
(M.E. Schwab und P. Caroni (1988), J. Neurosci. 8, 2381–2193).
Zwei Myelinproteine, Myelinassoziiertes Glycoprotein (MAG) und Nogo,
wurden kloniert und als mutmaßliche
Inhibitoren von Neuritenauswuchs identifiziert (S. Sato et al. (1989),
Biochem. Biophys. Res. Comm. 163, 1473–1480; L. McKerracher et al.
(1994), Neuron 13, 805–811;
G. Mukhopadhyay et al. (1994), Neuron 13, 757–767; K. Torigoe und G. Lundborg
(1997), Exp. Neurology 150, 254–262;
Schafer et al. (1996), Neuron 16, 1107–1113; WO 95/22344; WO 97/01352;
R. Prinjha et al. (2000) Nature 403, 383–384; M.S. Chen et al. (2000),
Nature 403, 434–439;
T. GrandPre et al. (2000), Nature 403, 439–444; US 005250414A; WO 200005364A1;
WO 00/31235).
-
Myelin-assoziiertes
Glycoprotein ist ein Zelloberflächen-Transmembranmolekül, das auf
der Oberfläche
von Myelin exprimiert wird, das aus fünf extrazellulären Immunglobulindomänen, einer
einzelnen Transmembrandomäne
und einer intrazellulären
Domäne
besteht. Die MAG-Expression
ist auf myelinisierende Glia im ZNS und peripheren Nervensystem
(PNS) beschränkt.
Es wird angenommen, daß MAG
mit einem neuronalen Rezeptor (Rezeptoren) wechselwirkt, der Wirkungen
auf das neuronale Cytoskelett ver mittelt, einschließlich Neurofilamentphosphorylierung
und Inhibierung von Neuritenauswuchs in vitro. Obwohl Antagonisten
von MAG als nützlich
zur Förderung
von axonalem Aussprossen nach Verletzung postuliert wurden (WO 95/22344,
WO 97/01352 und WO 97/07810), werden diese Ansprüche nicht durch in-vivo-Daten
gestützt.
Außerdem
ist die Rolle von MAG als Inhibitor des axonalen Aussprossens aus
ZNS-Neuronen in vivo nicht bewiesen (C.M. Li et al. (1994), Nature
369, 747–750;
D. Montag et al. (1994), Neuron 13, 229–246; H. Lassman et al. (1997),
GLIA 19, 104–110;
C. Li et al. (1998), J. Neuro. Res. 51, 210–217; X. Yin et al. (1998),
J. Neurosci. 18, 1953–1962;
U. Bartsch et al. (1995), Neuron 15, 1375–1381; M. Li et al. (1996)
46, 404–414).
-
Es
wurde jetzt festgestellt, daß ein
monoklonaler Anti-MAG-Antikörper
bei Verabreichung entweder direkt in das Hirn oder intravenös nach fokaler
zerebraler Ischämie
in der Ratte (ein Modell für
Schlaganfall) Neuroprotektion liefert und die funktionale Erholung
steigert. Deshalb liefern Anti-MAG-Antikörper oder
MAG-Antagonisten potentielle therapeutische Mittel für sowohl
akute Neuroprotektion als auch für
die Förderung
von funktionaler Erholung nach Schlaganfall. Andere Mittel, die
die Wechselwirkung zwischen MAG und seinen neuronalen Rezeptoren
unterbrechen (wie Rezeptorantagonisten oder Antikörper, die
den MAG-Rezeptor (Rezeptoren) erkennen), können auch diesen therapeutischen
Nutzen liefern.
-
Der
Prozeß der
Neurodegeneration liegt vielen neurologischen Krankheiten zugrunde,
die akute Krankheiten wie Schlaganfall, traumatische Hirnverletzung
und Rückenmarksverletzung
sowie chronische Krankheiten einschließen, die Alzheimer-Krankheit,
fronto-temporale Demenzen (Tauopathien), periphere Neuropathie,
Parkinson-Krankheit, Huntington-Krankheit
und multiple Sklerose einschließen.
Monoklonale Anti-MAG-Antikörper oder
MAG-Antagonisten können
deshalb nützlich
in der Behandlung dieser Krankheiten sein, indem sie sowohl den
mit diesen Störungen
verbundenen Zelltod lindern als auch die funktionale Erholung fördern.
-
Kurze Zusammenfassung
der Erfindung
-
In
einem Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung eines Anti-MAG-Antikörpers in
der Herstellung eines intravenös
verabreichbaren Medikaments zur Behandlung oder Prophylaxe von ischämischem
Schlaganfall bereit.
-
In
einem anderen Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung eines Anti-MAG-Antikörpers in
der Herstellung eines intravenös
verabreichbaren Medikaments zur Inhibierung von Neurodegeneration
und/oder Förderung
von funktionaler Erholung in einem menschlichen Patienten bereit,
der an ischämischem
Schlaganfall leidet oder dem Risiko ausgesetzt ist, diesen zu entwickeln.
-
In
noch einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine intravenös verabreichbare
pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die einen (oder mehrere)
Anti-MAG-Antikörper
und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfaßt.
-
Andere
Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden weiter in
der ausführlichen
Beschreibung und ihren bevorzugten Ausführungsformen beschrieben.
-
Anti-MAG-Antikörper
-
Der
Antikörper
wird bevorzugt gegen humanes MAG erzeugt und ist bevorzugt ein monoklonaler
Antikörper
(mAb), der bevorzugt humanisiert oder umgeformt.
-
In
einem bevorzugten Aspekt ist der mAb aus der Klasse IgG.
-
In
einem weiteren bevorzugten Aspekt ist der Antikörper ein neutralisierender
Antikörper.
-
"Neutralisierend" bezeichnet die substantielle
Inhibierung der MAG-Funktion,
einschließlich
seiner Bindung an Neuronen und Inhibierung von Neuritenauswuchs.
-
"Substantielle Inhibierung" bezeichnet 75 %,
besonders bevorzugt 85 %, am meisten bevorzugt 95 % Inhibierung,
gemessen in in-vitro-Untersuchungen.
-
"Veränderter
Antikörper" bezeichnet ein durch
eine veränderte
Immunglobulin-codierende Region codiertes Protein, das durch Expression
in einer ausgewählten
Wirtszelle erhalten werden kann. Solche veränderten Antikörper schließen gentechnisch
hergestellte Antikörper
(z.B. chimäre,
umgeformte, humanisierte oder vektorisierte Antikörper) oder
Antikörperfragmente
ein, denen die gesamte oder ein Teil einer konstanten Immunglobulinregion
fehlt, z.B. Fv, Fab oder F(ab)2 und dgl.
-
"Veränderte Immunglobulin-codierende
Region" bezeichnet
eine Nukleinsäuresequenz,
die veränderten
Antikörper
codiert. Wenn der veränderte
Antikörper
ein CDR-grafted oder humanisierter Antikörper ist, werden die Sequenzen,
die die Komplementaritäts-bestimmenden
Regionen (CDRs) aus einem nicht-humanen Immunglobulin codieren,
in einen ersten Immunglobulinpartner inseriert, der humane variable
Gerüstsequenzen
umfaßt.
Gegebenenfalls ist der erste Immunglobulinpartner operativ mit einem
zweiten Immunglobulinpartner verbunden.
-
"Erster Immunglobulinpartner" bezeichnet eine
Nukleinsäuresequenz,
die eine humane Gerüstregion oder
variable Region eines humanen Immunglobulins codiert, worin die
nativen (oder natürlich
vorkommenden) CDR-codierenden Regionen durch die CDR-codierenden
Regionen eines Donor-Antikörpers ersetzt
sind. Die humane variable Region kann eine schwere Kette, eine leichte
Kette (oder beide Ketten) eines Immunglobulins, ein Analogon oder
funktionelle Fragmente davon sein. Solche CDR-Regionen, die sich
innerhalb der variablen Region von Antikörpern (Immunglobulinen) befinden,
können
durch fachbekannte Verfahren bestimmt werden. Zum Beispiel offenbaren
Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4. Aufl.,
U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes
of Health (1987)) Regeln zur Lokalisierung von CDRs. Zusätzlich sind
Computerprogramme bekannt, die zur Identifizierung von CDR-Regionen/Strukturen
nützlich
sind.
-
"Zweiter Immunglobulinpartner" bezeichnet eine
andere Nukleotidsequenz, die ein Protein oder Peptid codiert, an
das der erste Immunglobulinpartner im Raster oder mittels einer
optionalen herkömmlichen
Linker-Sequenz fusioniert ist (d.h. operativ gebunden). Bevorzugt
ist er ein Immunglobulin-Gen. Der zweite Immunglobulinpartner kann
eine Nukleinsäuresequenz
einschließen,
die die gesamte konstante Region für den gleichen (d.h. homologen – der erste
und der zweite veränderte
Antikörper
stammen aus der gleichen Quelle) oder einen zusätzlichen (d.h. heterologen)
Antikörper
von Interesse codiert. Er kann eine schwere Kette oder leichte Kette
eines Immunglobulins sein (oder beide Ketten als Teil eines einzelnen
Polypeptids). Der zweite Immunglobulinpartner ist nicht auf eine
besondere Immunglobulinklasse oder einen Isotyp beschränkt. Zusätzlich kann
der zweite Immunglobulinpartner einen Teil einer konstanten Region
eines Immunglobulins umfassen, wie er in einem Fab oder F(ab)2 gefunden wird (d.h. ein diskreter Teil
einer humanen konstanten Region oder Gerüstregion). Ein solcher zweiter
Immunglobulinpartner kann auch eine Sequenz umfassen, die ein integrales
Membranprotein codiert, das an der äußeren Oberfläche einer
Wirtszelle exponiert ist, zum Beispiel als Teil einer Phagen-Display-Bibliothek,
oder eine Sequenz, die ein Protein für den analytischen oder diagnostischen
Nachweis codiert, z.B. Meerrettichperoxidase, β-Galactosidase etc.
-
Die
Begriffe Fv, Fc, Fd, Fab oder F(ab)2 werden
mit ihren Standardbedeutungen verwendet (siehe z.B. Harlow et al.,
Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)).
-
Wie
hier verwendet beschreibt ein "gentechnisch
hergestellter Antikörper" einen Typ von verändertem Antikörper, d.h.
einen synthetischen Antikörper
voller Länge
(z.B. einen chimären,
ungeformten oder humanisierten Antikörper im Gegensatz zu einem
Antikörperfragment),
in dem ein Teil der variablen Domänen der leichten und/oder schweren
Kette eines ausgewählten
Akzeptorantikörper
durch analoge Teile aus einem oder mehreren Donor-Antikörpern ersetzt
ist, die Spezifität
für das
ausgewählte
Epitop haben. Zum Beispiel können solche
Moleküle
Antikörper
einschließen,
die durch eine humanisierte schwere Kette charakterisiert sind,
die mit einer unmodifizierten leichten Kette oder (oder chimären leichten
Kette) assoziiert sind, oder umgekehrt. Gentechnisch hergestellte
Antikörper
können
auch durch Veränderung
der Nukleinsäuresequenzen
gekennzeichnet sein, die die Gerüstregionen
der leichten und/oder schweren variablen Domäne des Akzeptor-Antikörpers codieren,
um die Donor-Antikörper-Bindungsspezifität beizubehalten.
Diese Antikörper
können
einen Austausch eines oder mehrerer CDRs (bevorzugt aller) aus dem
Akzeptor-Antikörper
gegen CDRs aus einem hier beschriebenen Donor-Antikörper umfassen.
-
Ein "chimärer Antikörper" bezeichnet einen
Typ von gentechnisch hergestelltem Antikörper, der eine natürlich vorkommende
variable Region (leichte Kette und schwere Ketten), die aus einem
Donor-Antikörper stammt,
in Verbindung mit konstanten Regionen der leichten und schweren
Kette enthält,
die aus einem Akzeptor-Antikörper
stammen.
-
Ein "humanisierter Antikörper" bezeichnet einen
Typ von gentechnisch hergestelltem Antikörper, dessen CDRs aus einem
nicht-humanen Donor-Immunglobulin
stammen, wobei die verbleibenden aus Immunglobulin stammenden Teile
des Moleküls
aus einem (oder mehreren) humanen Immunglobulinen stammen. Zusätzlich können Gerüstträgerreste
verändert
sein, um die Bindungsaffinität
zu bewahren (siehe z.B. Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
86: 10029–10032
(1989), Hodgson et al., Bio/Technology, 9:421 (1991)).
-
"Umgeformter humaner
Antikörper" bezeichnet einen
veränderten
Antikörper,
in dem minimal zumindest ein CDR aus einem humanen monoklonalen
Donor-Antikörper
gegen ein CDR in einem zweiten humanen Akzeptor-Antikörper substituiert
ist. Bevorzugt sind alle sechs CDRs ersetzt. Besonders bevorzugt
ist eine gesamte Antigen-kombinierende Region (z.B. Fv, Fab oder
F(ab')2)
aus einem ersten humanen monoklonalen Donor-Antikörper gegen
die entsprechende Region in einem zweiten humanen monoklonalen Akzeptor-Antikörper substituiert.
Am meisten bevorzugt ist die Fab-Region aus einem ersten humanen
Donor operativ mit den geeigneten konstanten Regionen aus einem
zweiten humanen Akzeptor-Antikörper
verbunden, um einen monoklonalen Antikörper voller Länger zu
bilden.
-
Ein "vektorisierter Antikörper" bezeichnet einen
Antikörper,
an das ein Mittel gebunden wurden, um den Transport durch die Blut-Hirn-Schranke
(BBB) zu verbessern. Die Anbringung kann chemisch sein, oder alternativ
kann die Einheit gentechnisch in den Antikörper eingebaut werden. Ein
Beispiel ist die Herstellung einer Chimäre mit einem Antikörper, der
auf einen kapillaren Endothelzellrezeptor des Hirns gerichtet ist,
z.B. ein Anti-Insulin-Rezeptor-Antikörper oder Anti-Transferrin-Rezeptor-Antikörper (Saito
et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 10227–31; Pardridge
et al. (1995), Pharm. Res. 12 807–816; Broadwell et al. (1996),
Exp. Neurol. 142, 47–65;
Bickel et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2618–2622; Friden
et al. (1996), J. Pharm. Exp. Ther. 278, 1491–1498,
US-PS 5,182,107 ,
US-PS 5,154,924 ,
US-PS 5,833,988 ,
US-PS 5,527,527 ). Sobald sie an den
Rezeptor gebunden sind, gelangen beide Komponente des bispezifischen
Antikörpers
durch die BBB durch den Prozeß der
Transcytose. Alternativ kann das Mittel ein Ligand sein, der an solche
Zolloberflächenrezeptoren
bindet, z.B. Insulin, Transferrin oder niederdichtes Lipoprotein
(Descamps et al. (1996), Am. J. Physiol. 270, H1149–H1158;
Duffy et al. (1987), Brain Res. 420, 32–38; Dehouck et al. (1997),
J. Cell Biol. 1997, 877–889).
Natürlich
vorkommende Peptide wie Penetratin und SynB1 und SynB3, die für die Verbesserung
des Transports durch die BBB bekannt sind, können auch verwendet werden
(Rouselle et al. (2000), Mol. Pharm. 57, 679–686 und Rouselle et al. (2001),
Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 296, 124–131).
-
Der
Begriff "Donor-Antikörper" bezeichnet einen
Antikörper
(monoklonal oder rekombinant), der die Nukleinsäuresequenzen seiner variablen
Regionen, CDRs oder andere funktionale Fragmente oder Analoga davon
für einen
ersten Immunglobulinpartner beiträgt, um die veränderte Immunglobulin-codierende
Region und den resultierenden exprimierten veränderten Antikörper mit
der antigenen Spezifität
und neutralisierenden Aktivitätseigenschaft
des Donor-Antikörpers
zu versehen.
-
Der
Begriff "Akzeptor-Antikörper" bezeichnet einen
Antikörper
(monoklonal oder rekombinant), der heterolog für den Donor-Antikörper ist
und alle (oder einen Teil, aber bevorzugt alle) Nukleinsäuresequenzen,
die seine Gerüstregionen
der schweren und/oder leichten Kette und/oder seine konstanten Regionen
der schweren und/oder leichten Kette codieren, für den ersten Immunglobulinpartner
beiträgt.
Bevorzugt ist ein humaner Antikörper
der Akzeptor-Antikörper.
-
"CDRs" werden als die Aminosäuresequenzen
der Komplementarität
bestimmenden Region eines Antikörpers
definiert, die die hypervariablen Regionen der schweren und leichten
Ketten eines Immunglobulins sind. Siehe z.B. Kabat et al., Sequences
of Proteins of Immunological Interest, 4. Aufl., U.S. Department
of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987).
Es gibt drei CDRs der schweren Kette und drei CDRs der leichten
Kette (oder CDR-Regionen) im variablen Teil eines Immunglobulins.
So bezeichnet "CDRs" wie hier verwendet
alle drei CDRs der schweren Kette oder alle drei CDRs der leichten
Kette (oder sowohl alle CDRs der schweren und alle der leichten
Kette, falls passend). Die Struktur und Proteinfaltung des Antikörpers kann
bedeuten, daß andere
Reste als Teil der Antigen-Bindungsregion betrachtet werden, und
sie würden
so von einem Fachmann verstanden werden. Siehe zum Beispiel Chothia
et al. (1989), Conformations of immunoglobulin hypervariable regions;
Nature 342, S. 877–883.
-
CDRs
liefern die Mehrzahl der Kontaktreste für die Bindung des Antikörpers an
das Antigen oder Epitop. CDRs von Interesse in dieser Erfindung
stammen aus den Sequenzen der variablen schweren und leichten Kette
des Donor-Antikörper
und schließen
Analoga der natürlich
vorkommenden CDRs ein, wobei die Analoga die gleiche Antigen-Bindungsspezifität und/oder
neutralisierende Fähigkeit
wie der Donor-Antikörper
teilen oder beibehalten, aus dem sie abgeleitet wurden.
-
Ein "funktionales Fragment" ist eine partielle
variable Sequenz der schweren oder leichten Kette (z.B. geringfügige Deletionen
am Amino- oder Carboxy-Terminus der variablen Region des Immunglobulins),
die die gleiche Antigen-Bindungsspezifität und/oder neutralisierende
Fähigkeit
wie der Antikörper
beibehält,
aus dem das Fragment abgeleitet wurde.
-
Ein "Analogon" ist eine mit wenigstens
einer Aminosäure
modifizierte Aminosäuresequenz,
worin die Modifikation chemisch oder eine Substitution oder Umlagerung
einiger weniger Aminosäuren
(d.h. nicht mehr als 10) sein kann, wobei die Modifikation der Aminosäuresequenz
erlaubt, die biologischen Eigenschaften, zum Beispiel Antigenspezifität und hohe
Affinität,
der unmodifizierten Sequenz zu bewahren. Zum Beispiel können (stumme)
Mutationen über
Substitutionen konstruiert werden, wenn bestimmte Endonuklease-Restriktionsorte
innerhalb oder umgebend um CDR-codierende Regionen geschaffen werden.
Die vorliegende Erfindung erwägt
die Verwendung von Analoga des Antikörpers der Erfindung. Es ist
allgemein bekannt, daß geringfügige Veränderungen
von Aminosäure-
oder Nukleinsäuresequenzen
zum Beispiel zu einer allelischen Form des ursprünglichen Proteins führen können, die
im wesentlichen ähnliche
Eigenschaften beibehält.
Somit schließen
Analoga des Antikörpers
der Erfindung diejenigen ein, in denen die CDRs in der hypervariablen
Region der schweren und leichten Ketten wenigstens 80 % homolog,
bevorzugt wenigstens 90 % homolog und besonders bevorzugt wenigstens
95 % homolog zu den CDRs wie oben definiert als CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1,
CDRL2 und CDRL3 sind und MAG-neutralisierende Aktivität beibehalten.
Aminosäuresequenzen
sind wenigstens 80 % homolog, falls sie 80 % identische Aminosäurereste
in einer ähnlichen
Position haben, wenn die Sequenzen optimal angeglichen sind, wobei
Lücken
oder Insertionen als nicht-identische Reste gezählt werden.
-
Analoga
können
auch als allelische Variationen auftreten. Eine "allelische Variation oder Modifikation" ist eine Veränderung
in der Nukleinsäuresequenz.
Solche Variationen oder Modifikationen können auf der Degeneriertheit
des genetischen Codes beruhen oder können absichtlich gentechnisch
hergestellt werden, um gewünschten
Eigenschaften zu liefern. Diese Variationen und Modifikationen können oder
können
nicht zu Veränderungen
in einer codierten Aminosäuresequenz
führen.
-
Der
Begriff "Effektormittel" bezeichnet Nicht-Protein-Trägermoleküle, an die
die veränderten
Antikörper
und/oder natürliche
oder synthetische leichte oder schwere Ketten des Donor-Antikörpers oder
andere Fragmente des Donor-Antikörpers
durch herkömmliche
Mittel assoziiert werden können.
Solche Nicht-Proteinträger
können
herkömmliche
Träger
einschließen,
die auf dem diagnostischen Gebiet verwendet werden, zum Beispiel
Polystyrol oder andere Kunststoffkügelchen, Polysaccharide, z.B.
wie im BIAcore-System [Pharmacia] verwendet, oder andere Nicht-Proteinsubstanzen,
die auf dem medizinischen Gebiet nützlich und sicher zu Verabreichung
an Menschen und Tiere sind. Andere Effektormittel können einen
Makrocyclus zur Komplexierung eines Schwermetallatoms oder Radioisotope
einschließen.
Solche Effektormittel können
auch nützlich
zur Erhöhung
der Halbwertszeit der veränderten
Antikörper
sein, z.B. Polyethylenglykol.
-
Ein
für MAG
spezifischer neutralisierender Antikörper wurde beschrieben (Poltorak
et al. (1987), Journal of Cell Biology 105, 1893–1899, DeBellard et al. (1996),
Mol. Cell. Neurosci. 7, 89–101;
Tang et al. (1997), Mol. Cell. Neurosci. 9, 333–346; K. Torigoe und G. Lundborg
(1997), Exp. Neurology 150, 254–262)
und ist kommerziell erhältlich
(MAB1567 (Chemicon)).
-
Ein
weiterer Aspekt der Erfindung stellt eine pharmazeutische Zusammensetzung
bereit, die einen Anti-MAG-Antikörper
zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmittel
oder Träger
umfaßt. Der
veränderte
Antikörper
ist bevorzugt monoklonal, bevorzugt humanisiert.
-
Alternativ
kann man Antikörper,
veränderte
Antikörper
und Fragmente durch Immunisieren einer nicht-humanen Art (zum Beispiel
bovin, ovin, Affe, Huhn, Nagetier (z.B. murin und Ratte) etc.) konstruieren, um
ein wünschenswertes
Immunglobulin bei Präsentation
mit nativem MAG aus jeder Art zu erzeugen, gegen die Antikörper, die
kreuzreaktiv gegenüber
humanem MAG sind, erzeugt werden können, z.B. human oder Huhn.
Herkömmliche
Hybridomtechniken werden eingesetzt, um eine Hybridom-Zellinie bereitzustellen,
die einen nicht-humanen monoklonalen Antikörper gegen MAG sezerniert.
Solche Hybridome werden dann auf Bindung unter Verwendung von auf
Platten mit 384 oder 96 Vertiefungen aufgetragenem MAG, wobei biotinyliertes
MAG an eine Streptavidin-beschichtete Platte gebunden ist, oder
in einem homogenen Europium-APC-gekoppelten Immunoassay unter Verwendung
von biotinyliertem MAG durchmustert.
-
Ein
nativer humaner Antikörper
kann in einer humanen Antikörper-Maus
wie der "Xenomouse" (Abgenix) erzeugt
werden, worin die Immunglobulin-Gene der Maus entfernt und Gene,
die die humanen Immunglobuline codieren, in das Maus-Chromosom inseriert
wurden. Die Mäuse
werden normal immunisiert und entwickeln eine Antikörperreaktion,
die aus den humanen Genen stammt. Somit erzeugt die Maus humane
Antikörper
unter Umgehung der Notwendigkeit zur Humanisierung nach Selektion
positiver Hybridome (siehe L.L. Green, J. Immunol. Methods, 10.
Dez. 1999; 231 (1–2):11–23).
-
Ein
Fab-Fragment enthält
die gesamte leichte Kette und den Aminoterminalen Teil der schweren
Kette; und ein F(ab')2-Fragment ist das durch zwei Fab-Fragmente,
die durch Disulfidbindungen gebunden sind, gebildete Fragment. Fab-Fragmente
und F(ab')2-Fragmente können durch herkömmliche
Mittel, z.B. Spaltung von mAb mit den geeigneten proteolytischen
Enzymen, Papain und/oder Pepsin, oder durch rekombinante Verfahren
erhalten werden. Die Fab- und F(ab')2-Fragmente
sind selbst als Therapeutikum oder Prophylaktikum und als Donoren
für Sequenzen
nützlich,
die die variablen Regionen und CDR-Sequenzen einschließen, die
nützlich
in der Bildung von rekombinanten oder humanisierten Antikörpern wie
hier beschrieben sind.
-
Die
Fab- und F(ab')2-Fragmente können auch über eine kombinatorische Phagen-Bibliothek
konstruiert werden (siehe z.B. Winter et al., Ann. Rev. Immunol.,
12:433–455
(1994)), oder über
Immunglobulin-Kettenaustausch ("chain
shuffling") (siehe
z.B. Marks et al., Bio Technology, 10:779–783 (1992)), die hier beide durch
Verweis in ihrer Gesamtheit eingeführt werden.
-
So
können
humane Antikörperfragmente
(Fv, scFv, Fab), die für
MAG spezifisch sind, unter Verwendung humaner Antikörperfragment-Phagen-Display-Bibliotheken
isoliert werden. Eine Bibliothek von Bakteriophagenpartikeln, die
die humanen Antikörperfragmentproteine
darstellen, werden gegen das MAG-Protein getestet. Diejenigen Phagen,
die Antikörperfragmente
darstellen, die das MAG binden, werden aus der Bibliothek zurückbehalten
und klonierend amplifiziert. Die humanen Antikörper-Gene werden dann aus dem
spezifischen Bakteriophagen ausgeschnitten und in humane IgG-Expressionskonstrukte
inseriert, die die konstanten Regionen von humanem IgG enthalten,
um das intakte humane IgG-Molekül
mit den variablen Regionen aus dem für MAG spezifischen, isolierten
Bakteriophagen zu bilden.
-
Die
Donor-Antikörper
können
Sequenzen, wie z.B. Peptidsequenzen der variablen schweren und/oder leichten
Kette, Gerüstsequenzen,
CDR-Sequenzen, funktionale Fragmente und Analoga davon, und die
sie codierenden Nukleinsäuresequenzen
beitragen, die nützlich
in der Konstruktion und im Erhalt verschiedener veränderter
Antikörper
sind, die durch die Antigen-Bindungsspezifität des Donor-Antikörpers gekennzeichnet sind.
-
Unter
Berücksichtigung
der Degeneriertheit des genetischen Codes können verschiedene codierende Sequenzen
konstruiert werden, die die Aminosäuresequenzen der variablen
schweren und leichten Kette codieren, und CDR-Sequenzen sowie funktionale
Fragmente und Analoga davon, die die Antigenspezifität des Donor-Antikörpers teilen.
Isolierte Nukleinsäuresequenzen
oder Fragmente davon, die die Peptidsequenzen der variablen Kette
oder CDRs codieren, können
zur Erzeugung veränderter
Antikörper,
zum Beispiel chimärer oder
humanisierter Antikörper,
oder anderer gentechnisch hergestellter Antikörper verwendet werden, wenn sie
operativ mit einem zweiten Immunglobulinpartner kombiniert werden.
-
Veränderte Immunglobulinmoleküle können veränderte Antikörper codieren,
die gentechnisch veränderte
Antikörper
wie chimäre
Antikörper
und humanisierte Antikörper
einschließen.
Eine gewünschte
veränderte
Immunglobulin-codierende Region enthält CDR-codierende Regionen,
die Peptide mit der Antigenspezifität eines Anti-MAG-Antikörpers codieren, bevorzugt
eines hochaffinen Antikörpers,
inseriert in einen ersten Immunglobulinpartner (eine humane Gerüstregion
oder variable Region eines humanen Immunglobulins).
-
Bevorzugt
ist der erste Immunglobulinpartner operativ mit einem zweiten Immunglobulinpartner
verbunden. Der zweite Immunglobulinpartner ist oben definiert und
kann eine Sequenz einschließen,
die eine zweite Antikörperregion
von Interesse codiert, z.B. eine Fc-Region. Zweite Immunglobulinpartner
können
auch Sequenzen einschließen,
die ein anderes Immunglobulin codieren, an das die konstante Region
der leichten oder schweren Kette im Raster oder mittels einer Linker-Sequenz
fusioniert ist. Gentechnisch hergestellte Antikörper, die gegen funktionale
Fragmente oder Analoga von MAG gerichtet sind, können zur Hervorrufung einer
gesteigerten Bindung konstruiert werden.
-
Der
zweite Immunglobulinpartner kann auch mit Effektormitteln wie oben
definiert assoziiert sein, einschließlich von Nicht-Protein-Trägermolekülen, an
die der zweite Immunglobulinpartner operativ durch herkömmliche
Mittel gebunden sein kann.
-
Die
Fusion oder Bindung zwischen den zweiten Immunglobulinpartnern,
zum Beispiel Antikörpersequenzen,
und dem Effektormittel kann durch jedes geeignete Mittel erfolgen,
zum Beispiel durch herkömmliche kovalente
oder ionische Bindungen, Proteinfusionen oder heterobifunktionelle
Vernetzer, z.B. Carbodiimid, Glutaraldehyd und dgl. Solche Techniken
sind fachbekannt und allgemein in herkömmlichen Chemie- und Biochemietexten
beschrieben.
-
Zusätzlich können herkömmliche
Linker-Sequenzen, die einfach eine gewünschte Menge an Raum zwischen
dem zweiten Immunglobulinpartner und dem Effektormittel vorsehen,
auch in die veränderte
Immunglobulin-codierende Region konstruiert werden. Die Konstruktion
solcher Linker ist den Fachleuten allgemein bekannt.
-
In
noch einer weiteren Ausführungsform
kann der Antikörper
ein zusätzliches
Mittel daran angebracht aufweisen. Zum Beispiel kann das Verfahren
der rekombinanten DNA-Technik verwendet werden, um einen gentechnisch
hergestellten Antikörper
der Erfindung zu erzeugen, in dem das Fc-Fragment oder die CH2-CH3-Domäne eines
kompletten Antikörpermoleküls durch
ein Enzym oder ein anderes detektierbares Molekül (d.h. einen Polypeptid-Effektor
oder ein Reportermolekül)
ersetzt wurde.
-
Der
zweite Immunglobulinpartner kann auch operativ mit einem Nicht-Immunglobulinpeptid,
-protein oder -fragment davon verbunden sein, das heterolog zur
CDR-haltigen Sequenz mit der Antigenspezifität von Anti-MAG- Antikörper ist.
Das resultierende Protein kann sowohl Anti-MAG-Antigenspezifität als auch
Eigenschaften des Nicht-Immunglobulins bei der Expression aufweisen.
Die Eigenschaft des Fusionspartners kann z.B. eine funktionale Eigenschaft
wie eine andere Bindungs- oder Rezeptordomäne oder eine therapeutische Eigenschaft,
falls der Fusionspartner selbst ein therapeutisches Protein ist,
oder zusätzliche
antigene Eigenschaften sein.
-
Ein
anderes wünschenswertes
Protein dieser Erfindung kann ein komplettes Antikörpermolekül mit schweren
und leichten Ketten voller Länger
oder jedes diskrete Fragment davon wie die Fab- oder F(ab')2-Fragmente,
ein Dimer der schweren Kette oder beliebige minimale rekombinante
Fragmente davon wie ein Fv oder ein einkettiger
Antikörper
(SCA) oder jedes andere Molekül
mit der gleichen Spezifität
wie der ausgewählte
Donor-mAb sein. Ein solches Protein kann in Form eines veränderten
Antikörpers
verwendet werden oder kann in seiner unfusionierten Form verwendet
werden.
-
Immer
wenn der zweite Immunglobulinpartner aus einem Antikörper stammt,
der sich vom Donor-Antikörper
unterscheidet, z.B. jedem Isotyp oder jeder Klasse vom Immunglobulin-Gerüst- oder
konstanten Regionen, resultiert ein gentechnisch hergestellter Antikörper. Gentechnisch
hergestellte Antikörper
können
konstante Regionen des Immunglobulins (Ig) und variable Gerüstregionen
aus einer Quelle, z.B. dem Akzeptor-Antikörper, und ein oder mehrere
(bevorzugt alle) CDRs aus dem Donor-Antikörper umfassen. Zusätzlich können Veränderungen,
z.B. Deletionen, Substitutionen oder Additionen, der Gerüstregion
der leichten und/oder schweren variablen Domäne des Akzeptor-mAb auf der Nukleinsäure- oder
Aminosäureebene
oder der Donor-CDR-Regionen durchgeführt werden, um die Antigen-Bindungsspezifität des Donor-Antikörpers beizubehalten.
-
Solche
gentechnisch hergestellten Antikörper
werden konstruiert, um eine (oder beide) der variablen schweren
und/oder leichten Ketten des Anti-MAG-mAb oder eine oder mehrere der CDRs
der schweren oder leichten Kette einzusetzen. Die gentechnisch hergestellten
Antikörper
können
neutralisierend wie oben definiert sein.
-
Solche
gentechnisch hergestellten Antikörper
können
einen humanisierten Antikörper,
der die Gerüstregionen
eines ausgewählten
humanen Immunglobulins oder Subtyps enthält, oder einen chimären Antikörper einschließen, der
die konstanten Regionen der humanen schweren und leichten Kette
enthält,
fusioniert an die funktionalen Fragmente des Anti-MAG-Antikörpers. Ein
geeigneter humaner (oder anderer tierischer) Akzeptor-Antikörper kann
ein aus einer herkömmlichen
Datenbank, z.B. der KABAT®- Datenbank, der Los Alamos-Datenbank
und Swiss Protein-Datenbank, durch Homologie mit den Nukleotid-
und Aminosäuresequenzen
des Donor-Antikörpers
ausgewählter
sein. Ein humaner Antikörper,
der durch eine Homologie mit den Gerüstregionen des Donor-Antikörpers (auf
einer Aminosäurebasis)
gekennzeichnet ist, kann geeignet sein, um eine konstante Region
der schweren Kette und/oder eine variable Gerüstregion der schweren Kette
zur Insertion der Donor-CDRs bereitzustellen. Ein geeigneter Akzeptor-Antikörper, der
konstante oder variable Gerüstregionen
der leichten Kette spenden kann, kann in einer ähnlichen Weise ausgewählt werden.
Es sollte beachtet werden, daß die
schweren und leichten Ketten des Akzeptor-Antikörpers nicht aus dem gleichen
Akzeptor-Antikörper
stammen müssen.
-
Wünschenswert
werden das heterologe Gerüstregionen
und die konstanten Regionen aus humanen Immunglobulinklassen und
-isotypen wie IgG (Subtypen 1 bis 4), IgM, IgA und IgE ausgewählt. Jedoch
braucht der Akzeptor-Antikörper
nicht nur humane Immunglobulin-Proteinsequenzen umfassen. Zum Beispiel
kann ein Gen konstruiert werden, in dem eine DNA-Sequenz, die einen
Teil einer humanen Immunglobulinkette codiert, an eine DNA-Sequenz
fusioniert ist, die eine Nicht-Immunglobulin-Aminosäuresequenz
wie einen Polypeptideffektor oder ein Reportermolekül codiert.
-
Bevorzugt
wurden in einem humanisierten Antikörper die variablen Domänen sowohl
in den humanen schweren als auch leichten Ketten durch eine oder
mehrere CDR-Austauschungen gentechnisch hergestellt. Es ist möglich, alle
sechs CDRs oder verschiedene Kombinationen aus weniger als den sechs
CDRs zu verwenden. Bevorzugt werden alle sechs CDRs ausgetauscht.
Es ist möglich,
die CDRs nur in der humanen schweren Kette auszutauschen, wobei
als leichte Kette die unmodifizierte leichte Kette aus dem humanen
Akzeptor-Antikörper
verwendet wird. Alternativ kann eine kompatible leichte Kette aus
einem anderen humanen Antikörper
durch Rückgriff
auf die herkömmlichen
Antikörper-Datenbanken
ausgewählt
werden. Die Rest des gentechnisch hergestellten Antikörpers kann
aus jedem geeigneten humanen Akzeptor-Immunglobulin stammen.
-
Der
gentechnisch hergestellte humanisierte Antikörper hat somit bevorzugt die
Struktur eines natürlichen
humanen Antikörpers
oder eines Fragments davon und besitzt die Kombination von Eigenschaften,
die für
eine wirksame therapeutische Verwendung erforderlich sind.
-
Die
Fachleute werden verstehen, daß ein
gentechnisch hergestellter Antikörper
weiter durch Veränderungen
der Aminosäuren
der variablen Domäne
modifiziert werden kann, ohne daß notwendigerweise die Spezifität und hohe Affinität des Donor-Antikörpers beeinflußt wird
(d.h. ein Anologon). Es wird vorhergesehen, daß Aminosäuren der schweren und leichten
Kette durch andere Aminosäuren
entweder in den Gerüsten
der variablen Domäne
oder CDRs oder beiden substituiert werden können.
-
Zusätzlich kann
die konstante Region verändert
werden, um selektive Eigenschaften der Moleküle der vorliegenden Erfindung
zu steigern oder zu verringern. Zum Beispiel Dimerisierung, Bindung
an Fc-Rezeptoren oder die Fähigkeit
zur Bindung und Aktivierung von Komplement (siehe z.B. Angal et
al., Mol. Immunol. 30:105–108
(1993), Xu et al., J. Biol. Chem. 239:3469–3474 (1994), Winter et al.,
EP 307,434-B).
-
Ein
veränderter
Antikörper,
der ein chimärer
Antikörper
ist, unterscheidet sich von den oben beschriebenen humanisierten
Antikörpern,
indem er die gesamten variablen Regionen der schweren Kette und
leichten Kette des nicht-humanen Donor-Antikörpers, einschließlich der
Gerüstregionen,
in Verbindung mit den konstanten Regionen des humanen Immunglobulins
für beide
Ketten bereitstellt.
-
Bevorzugt
werden die Sequenzen der variablen leichten und/oder schweren Kette
und die CDRs von geeigneten Donor-mAbs und ihre codierenden Nukleinsäuresequenzen
in der Konstruktion veränderter
Antikörper,
bevorzugt humanisierter Antikörper,
dieser Erfindung durch das folgende Verfahren verwendet. Die gleichen
oder ähnlichen
Techniken können
auch zur Erzeugung anderer Ausführungsformen
dieser Erfindung eingesetzt werden.
-
Ein
Hybridom, das einen ausgewählten
Donor-mAb erzeugt, wird herkömmlich
kloniert und die DNA seiner variablen Regionen der schweren und
leichten Kette durch einem Fachmann bekannte Techniken erhalten,
z.B. durch die in Sambrook et al. beschriebenen Techniken (Molecular
Cloning (A Laboratory Manual), 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory
(1989)). Die variablen schweren und leichten Regionen, die wenigstens
die CDR-codierenden
Regionen und diejenigen Teile der Gerüstregionen der leichten und/oder
schweren variablen Domäne
des Akzeptor-mAb enthalten, die erforderlich sind, um die Bindungsspezifität des Donor-mAb
beizubehalten, sowie die verbleibenden aus Immunglobulin stammenden
Teile der Antikörperkette, die
aus einem humanen Immunglobulin stammen, werden unter Verwendung
von Polynukleotidprimern und Umkehrtranskriptase erhalten. Die CDR-codierenden
Regionen werden unter Verwendung einer bekannten Datenbank und durch
Vergleich mit anderen Antikörpern
identifiziert.
-
Ein
Maus/humaner chimärer
Antikörper
kann dann hergestellt und auf Bindungsfähigkeit untersucht werden.
Ein solcher chimärer
Antikörper enthält die gesamten
VH- und VL-Regionen des nicht-humanen Donor-Antikörpers in
Verbindung mit den konstanten Regionen von humanem Ig für beide
Ketten.
-
Homologe
Gerüstregionen
einer variablen Region der schweren Kette aus einem humanen Antikörper können unter
Verwendung computerisierter Datenbanken, z.B. KABAT®, identifiziert
werden, und ein humaner Antikörper
mit Homologie zum Donor-Antikörper
wird als Akzeptor-Antikörper
ausgewählt
werden. Eine geeignete variable Gerüstregion der leichten Kette
kann in einer ähnlichen
Weise geschaffen werden.
-
Ein
humanisierter Antikörper
kann aus dem chimären
Antikörper
stammen oder bevorzugt synthetisch durch Inserieren der CDR-codierenden
Regionen des Donor-mAb aus den schweren und leichten Ketten in geeigneter
Weise innerhalb des ausgewählten
Gerüsts
der schweren und leichten Kette hergestellt werden. Alternativ kann
ein humanisierter Antikörper
unter Verwendung von Mutagenese-Standardtechniken hergestellt werden.
Somit enthält
der resultierende humanisierte Antikörper humane Gerüstregionen
und CDR-codierende Regionen des Donor-mAb. Es kann eine anschließende Manipulation
von Gerüstresten
geben. Der resultierende humanisierte Antikörper kann in rekombinanten
Wirtszellen, z.B. COS-, CHO- oder Myelomzellen, exprimiert werden.
-
Ein
herkömmlicher
Expressionsvektor oder ein rekombinantes Plasmid wird durch Plazieren
dieser codierenden Sequenzen für
den Antikörper
in operativer Assoziation mit herkömmlichen regulatorischen Kontrollsequenzen
hergestellt, die die Vermehrung und Expression in und/oder Sekretion
aus einer Wirtszelle kontrollieren können. Regulatorische Sequenzen
schließen
Promotorsequenzen, zum Beispiel einen CMV-Promotor, und Signalsequenzen
ein, die aus anderen bekannten Antikörpern stammen können. In ähnlicher
Weise kann ein zweiter Expressionsvektor mit einer DNA-Sequenz hergestellt
werden, die eine komplementäre
leichte oder schwere Kette eines Antikörpers codiert. Bevorzugt ist
dieser zweite Expressionsvektor identisch mit dem ersten, ausgenommen
insoweit die codierenden Sequenzen und selektierbaren Marker betroffen
sind, um soweit wie möglich
sicherzustellen, daß jede
Polypeptidkette funktionell exprimiert wird. Alternativ können die
codierenden Sequenzen der schweren und leichten Kette für den veränderten
Antikörper
auf einem einzelnen Vektor ruhen.
-
Eine
ausgewählte
Wirtszelle wird durch herkömmliche
Techniken mit sowohl dem ersten als auch dem zweiten Vektor co-transfiziert
(oder einfach mit einem einzelnen Vektor transfiziert), um die transfizierte
Wirtszelle der Erfindung zu erzeugen, die sowohl die rekombinanten
oder synthetischen leichten als auch schweren Ketten umfaßt. Die
transfizierte Zelle wird dann durch herkömmliche Techniken kultiviert,
um den gentechnisch hergestellten Antikörper der Erfindung zu erzeugen.
Der humanisierte Antikörper,
der die Assoziation der rekombinanten schweren Kette und/oder leichten
Kette einschließt,
wird aus der Kultur durch einen geeigneten Assay, zum Beispiel ELISA
oder RIA, durchmustert. Ähnliche
herkömmliche
Techniken können
eingesetzt werden, um andere veränderte
Antikörpermoleküle zu konstruieren.
-
Geeignete
Vektoren für
die in den Verfahren und der Konstruktion der Zusammensetzungen
dieser Erfindung eingesetzten Klonierungs- und Subklonierungsschritte
können
durch einen Fachmann ausgewählt werden.
Zum Beispiel kann die herkömmliche
pUC-Reihe von Klonierungsvektoren verwendet werden. Ein Vektor,
pUC19, ist kommerziell erhältlich
von Lieferanten wie Amersham (Buckinghamshire, United Kingdom) oder
Pharmacia (Uppsala, Schweden). Zusätzlich kann jeder Vektor, der
leicht vervielfältigt
werden kann, eine Vielzahl von Klonierungsorten und selektierbaren
Genen (z.B. Antibiotikaresistenz) aufweist und leicht manipuliert
wird, zur Klonierung verwendet werden. So ist die Selektion des
Klonierungsvektors kein beschränkender
Faktor in dieser Erfindung.
-
In ähnlicher
Weise können
die für
die Expression der Antikörper
eingesetzten Vektoren durch einen Fachmann aus jedem herkömmlichen
Vektor selektiert werden. Die Vektoren enthalten auch ausgewählte regulatorische
Sequenzen (wie CMV-Promotoren), die die Vervielfältigung und Expression heterologer
DNA-Sequenzen in ausgewählten
Wirtszellen ausrichten. Diese Vektoren enthalten die oben beschriebenen
DNA-Sequenzen, die für
den Antikörper
oder die veränderte
Immunglobulin-codierende Region codieren. Zusätzlich können die Vektoren die ausgewählten Immunglobulin-Sequenzen
aufnehmen, die durch die Insertion gewünschter Restriktionsorte zur
leichten Manipulation modifiziert sind.
-
Die
Expressionsvektoren können
auch durch Gene gekennzeichnet werden, die zur Amplifizierung der Expression
der heterologen DNA-Sequenzen, zum Beispiel des Dihydrofolatreduktase-Gens
(DHFR) aus Säugetier,
geeignet sind. Andere bevorzugte Vektorsequenzen schließen eine
Poly A-Signalsequenz ein, wie zum Beispiel aus bovinem Wachstumshormon
(BGH); und die Betaglobin-Promotorsequenz (Betaglopro). Die hier nützlichen
Expressionsvektoren können
durch den Fachleuten allgemein bekannte Techniken synthetisiert werden.
-
Die
Komponenten solcher Vektor, z.B. Replikons, Selektionsgene, Verstärker, Promotoren,
Signalsequenzen und dgl., können
aus gewerblichen oder natürlichen
Quellen erhalten oder durch bekannte Verfahren zur Verwendung in
der Ausrichtung der Expression und/oder Sekretion des Produkts der
rekombinanten DNA in einem ausgewählten Wirt erhalten werden.
Andere geeignete Expressionsvektoren, von denen zahlreiche Typen
auf diesem Gebiet für
die Säugetier-,
bakterielle, Insekten-, Hefe- und pilzliche Expression bekannt sind, können ebenfalls
für diesen
Zweck ausgewählt
werden.
-
Die
vorliegende Erfindung umfaßt
auch eine Zellinie, die mit einem rekombinanten Plasmid transfiziert ist,
das die codierenden Sequenzen der Antikörper oder veränderten
Immunglobulinmoleküle
davon enthält. Für die Klonierung
und andere Manipulationen dieser Klonierungsvektoren nützliche
Wirtszellen sind ebenfalls herkömmlich.
Jedoch werden am wünschenswertesten
Zellen aus verschiedenen Stämmen
von E. coli zur Vervielfältigung
der Klonierungsvektoren und für
andere Schritte in der Konstruktion veränderter Antikörper dieser
Erfindung verwendet.
-
Geeignete
Wirtszellen oder Zellinien zur Expression des Antikörpers der
Erfindung sind bevorzugt Säugetierzellen
wie NS0, Sp2/0, CHO, COS, eine Fibroblastenzelle (z.B. 3T3) und
Myeloidzellen und besonders bevorzugt eine CHO- oder Myeloidzelle.
Humane Zellen können
verwendet werden, wodurch es möglich wird,
das Molekül
mit humanen Glycosylierungsmustern zu modifiieren. Alternativ können andere
eukaryontische Zellinien eingesetzt werden. Die Auswahl geeigneter
Säugetier-Wirtszellen
und Verfahren zur Transformation, Kultur, Amplifikation, Durchmusterung
und Produktherstellung und -reinigung sind fachbekannt. Siehe z.B.
Sambrook et al., oben zitiert.
-
Bakterielle
Zellen können
sich als nützlich
als Wirtszellen erweisen, die für
die Expression der rekombinanten Fabs der vorliegenden Erfindung
geeignet sind (siehe z.B. A. Plückthun,
Immunol. Rev., 130:151–188 (1992)).
Jedoch müßte aufgrund
der Tendenz von Proteinen, die in bakteriellen Zellen exprimiert
werden, in einer ungefalteten oder ungeeignet gefalteten Form oder
in einer nicht-glycosylierten Form zu sein, jedes in einer bakteriellen
Zelle erzeugte rekombinante Fab auf Beibehaltung der Antigen-Bindungsfähigkeit
durchmustert werden. Falls das durch die bakterielle Zelle exprimierte
Molekül
in einer geeignet gefalteten Form erzeugt würde, wäre die bakterielle Zelle ein
wünschenswerter
Wirt. Zum Beispiel sind verschiedene Stämme von E. coli, die zur Expression
verwendet werden, allgemein als Wirtszellen auf dem Gebiet der Biotechnologie bekannt.
-
Verschiedene
Stämme
von B. subtilis, Streptomyces, anderen Bacilli und dgl. können auch
in diesem Verfahren eingesetzt werden.
-
Nach
Wunsch sind auch Stämme
von Hefezellen, die den Fachleuten bekannt sind, als Wirtszellen verfügbar, ebenso
wie Insektenzellen, z.B. Drosophila und Lepidoptera, und virale
Expressionssysteme. Siehe z.B. Miller et al., Genetic Engineering,
8:277–298,
Plenum Press (1986) und darin zitierte Literaturstellen.
-
Die
allgemeinen Verfahren, durch die die Vektoren konstruiert werden
können,
die Transfektionsverfahren, die zur Erzeugung der Wirtszellen der
Erfindung erforderlich sind, und Kulturverfahren, die zur Erzeugung
des veränderten
Antikörpers
der Erfindung aus solchen Wirtszellen notwendig sind, sind allesamt
herkömmliche
Techniken. Gleichsam können
die Antikörper
der Erfindung, sobald sie erzeugt sind, aus den Zellkulturinhalten
gemäß Standardverfahren
auf diesem Gebiet gereinigt werden, die Ammoniumsulfat-Präzipitation,
Affinitätssäulen, Säulenchromatographie,
Gelelektrophorese und dgl. einschließen. Solche Techniken gehören zum
Können
des Fachmanns und beschränken
diese Erfindung nicht.
-
Noch
ein anderes Verfahren zur Expression der Antikörper kann die Expression in
einem transgenen Tier nutzen, wie zum Beispiel in
US-PS 4,873,316 beschrieben. Dies
betrifft ein Expressionssystem unter Verwendung des Casein-Promotors
des Tieres, der es bei transgener Aufnahme in einem Säugetier
dem weiblichen Tier erlaubt, das gewünschte rekombinante Protein
in seiner Milch zu erzeugen.
-
Sobald
er durch das gewünschte
Verfahren exprimiert wird, wird der Antikörper dann auf In-vitro-Aktivität durch
Verwendung eines geeigneten Tests (Assay) untersucht. Derzeit herkömmliche
ELISA-Testformate werden eingesetzt, um die qualitative und quantitative
Bindung des Antikörpers
an MAG zu beurteilen. Zusätzlich
können
andere In-vitro-Assays zur Verifizierung der neutralisierenden Wirksamkeit
vor anschließenden
humanen klinischen Studien verwendet werden, die zur Auswertung
der Fortdauer des Antikörpers
im Körpers trotz
der gewöhnlichen
Clearance-Mechanismen durchgeführt
werden.
-
Die
therapeutischen Mittel dieser Erfindung können als Prophylaktikum oder
nach der Verletzung oder ansonsten nach Bedarf verabreicht werden.
Die Dosis und Dauer der Behandlung steht in Beziehung zur relativen
Dauer der Moleküle
der vorliegenden Erfindung im humanen Kreislauf und kann durch einen
Fachmann in Abhängigkeit
vom behandelten Zustand und der allgemeinen Gesundheit des Patienten
eingestellt werden.
-
Der
Verabreichungsmodus des therapeutischen Mittels der Erfindung kann
jeder geeignete Weg sein, der das Mittel an den Wirt abgibt. Die
Antagonisten und Antikörper
und pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung sind besonders
nützlich
zur parenteralen Verabreichung, d.h. subkutan, intramuskulär, intravenös oder intranasal.
-
Therapeutische
Mittel der Erfindung können
als pharmazeutische Zusammensetzungen hergestellt werden, die eine
wirksame Menge des Antagonisten oder Antikörpers der Erfindung als aktiven
Bestandteil in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger enthalten.
Im prophylaktischen Mittel der Erfindung ist eine wäßrige Suspension
oder Lösung,
die den gentechnisch hergestellten Antikörper, bevorzugt gepuffert bei
physiologischem pH, in einer injektionsfertigen Form enthält. Die
Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung werden üblicherweise
einer Lösung
des Antagonisten oder Antikörpers
der Erfindung oder einen Cocktail davon umfassen, gelöst in einem
pharmazeutisch akzeptablen Träger,
bevorzugt einem wäßrigen Träger. Eine Vielzahl
wäßriger Träger kann
eingesetzt werden, z.B. 0,9%ige Kochsalzlösung, 0,3%iges Glycin und dgl.
Diese Lösungen
sind steril und allgemein frei von teilchenförmiger Substanz. Diese Lösungen können durch
herkömmliche,
allgemein bekannte Sterilisationstechniken (z.B. Filtration) sterilisiert
werden. Die Zusammensetzungen können
pharmazeutisch akzeptable Hilfsstoffe nach Bedarf enthalten, um
sich physiologischen Bedingungen anzunähern, wie zum Beispiel pH-Einstellungs-
und -Puffermittel etc. Die Konzentration des Antagonisten oder Antikörpers der
Erfindung in einer solchen pharmazeutischen Formulierung kann weithin
variieren, d.h. von weniger als 0,5, gewöhnlich bei oder wenigstens
ca. 1 bis zu 15 oder 20 Gew.%, und wird primär auf Basis von Flüssigkeitsvolumina,
Viskositäten
etc. gemäß dem besonderen
ausgewählten
Verabreichungsmodus ausgewählt
werden.
-
So
könnte
eine pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung zur intramuskulären Injektion
hergestellt werden, so daß sie
1 ml steriles gepuffertes Wasser und ca. 1 ng bis 100 mg, z.B. ca.
50 ng bis ca. 30 mg oder besonders bevorzugt ca. 5 bis ca. 25 mg,
eines Antagonisten oder Antikörpers
der Erfindung enthält. In ähnlicher
Weise könnte
eine pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung zur intravenösen Infusion zusammengestellt
werden, so daß sie
ca. 250 ml sterile Ringer-Lösung
und ca. 1 bis ca. 30 und bevorzugt 5 bis ca. 25 mg eines gentechnisch
hergestellten Antikörpers
der Erfindung enthält.
Tatsächliche
Verfahren zur Herstellung parenteral verabreichbarer Zusammensetzungen
sind den Fachleuten allgemein bekannt oder werden ihnen ersichtlich
sein und werden zum Beispiel in größerem Detail beschrieben in
Remington's Pharmaceutical
Science, 15. Auflage, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.
-
Es
ist bevorzugt, daß das
therapeutische Mittel der Erfindung, wenn es in einer pharmazeutischen
Zubereitung ist, in Einheitsdosisformen vorhanden ist. Die geeignete
therapeutisch wirksame Dosis kann leicht durch die Fachleute bestimmt
werden. Zur wirksamen Behandlung von Schlaganfall und anderen neurologischen
Krankheiten in einem Menschen sollte eine Dosis mit bis zu 700 mg
eines Antagonisten oder Antikörpers dieser
Erfindung auf 70 kg Körpergewicht
parenteral verabreicht werden, bevorzugt i.v. oder i.m. (intramuskulär). Eine
solche Dosis kann, falls notwendig, in geeigneten Zeitintervallen
wiederholt werden, die nach Bedarf durch einen Arzt ausgewählt werden.
-
Die
hier beschriebenen Antikörper
können
zur Lagerung lyophilisiert und in einem geeigneten Träger vor
der Verwendung rekonstitutiert werden. Diese Technik hat sich als
wirksam mit herkömmlichen
Immunglobulinen erwiesen, und fachbekannte Lyophilisierungs- und
Rekonstituierungstechniken können
eingesetzt werden.
-
In
einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische
Zusammensetzung bereit, die einen Anti-MAG-Antikörper und einen pharmazeutisch
akzeptablen Träger
zur Behandlung oder Prophylaxe von Schlaganfall umfaßt.
-
In
noch einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine pharmazeutische
Zusammensetzung bereit, die einen Anti-MAG-Antikörper, einschließlich veränderter
Antikörper
oder eines funktionellen Fragments davon, und einen pharmazeutisch
akzeptablen Träger
umfaßt,
zur Inhibierung der Neurodegeneration und/oder Förderung der funktionellen Erholung
in einem menschlichen Patienten, der an Schlaganfall leidet oder
dem Risiko unterliegt, Schlaganfall zu entwickeln.
-
Die
folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
-
Materialien und Methoden
-
Monoklonaler Anti-MAG-Antikörper
-
Monoklonaler
Anti-MAG-Antikörper
war der Maus-Anti-Huhn-MAG-Antikörper
MAB 1567, erhalten von Chemicon. Der Antikörper hat die folgenden Eigenschaften:
Antigen:
Myelin-assoziiertes Glycoprotein (human, Maus, Ratte, bovin, Huhn,
Frosch).
Isotyp: IgG1
Neutralisierende Fähigkeit.
Siehe DeBellard et al. (1996), Mol. Cell. Neusosci. 7, 89–101; Tang
et al. (1997), Mol. Cell. Neurosci. 9, 333–346; K. Torigoe und G. Lundborg
(1997), Exp. Neurology 150, 254–262.
-
Kontroll-IgG1-mAb
wurde von R+D Systems erworben.
-
Dieser
Antikörper
wurde sequenziert und die Ergebnisse sind in den 1 und 2 gezeigt. 1 zeigt die
Sequenz der variablen Kette (SEQ ID NO:7) und der konstanten Kette
(SEQ ID NO:8) der leichten Kette. 2 zeigt
die Sequenz der variablen Kette (SEQ ID NO:9) und der konstanten
Kette (SEQ ID NO:10) der schweren Kette.
-
Intrazerebrale ventrikuläre Kanülenlegung
(für nur
1 Studie)
-
Unter
Halothan-Anästhesie
wurden intrazerebrale ventrikuläre
(i.c.v.) Kanülen
im linken lateralen zerebralen Ventrikel positioniert (Koordinaten:
1,6 mm von der Mittellinie, 0,8 mm kaudal vom Bregma, 4,1 mm von
der Schädeloberfläche, Einschnittsbalken –3,2 mm
unterhalb 0, gemäß Paxinos
und Watson, 1986). Alle Ratten wurden einzeln gehalten, um Beschädigung der
Führung
oder der Atrappenkanüle
zu vermeiden. 7 Tage nach der Operation wurde die richtige Kanülenplazierung
durch eine intensive Trinkreaktion auf Angiotensin II verifiziert
(100 ng, Simpson et al., 1978). 9 Tage später wurden die Tiere zerebraler
Ischämie
unterworfen.
-
Transiente fokale zerebrale
Ischämie
-
Transiente
(90 min) fokale zerebrale Ischämie
wurde in männlichen
Sprague Dawley-Ratten mit einem Gewicht von jeweils zwischen 300
und 350 g induziert. Die Tiere wurden zunächst mit einer Mischung aus
5 % Halothan, 60 % Stickoxid und 30 % Sauerstoff anästhesiert,
auf eine Gesichtsmaske gelegt und anschließend unter Anästhesie
mit 1,5 % Halothan gehalten. Der mittlere zerebrale Arterienverschluß (MCAO)
wurde unter Verwendung der intraluminalen Fadentechnik wie zuvor
beschrieben durchgeführt
(Zea Longa et al., 1989). Die Tiere wurden normotherm während des
chirurgischen Verfahrens gehalten, und man ließ sie sich für 1 h in
einem Inkubator erholen, bevor sie einzeln gehalten wurden. Nur
diejenigen Tiere mit einer neurologischen Bewertung von 3 eine Stunde
nach dem Verschluß wurden
in der Studie eingeschlossen (bewertet unter Verwendung eines 5-Punkt-Bewertungssystems:
0, kein Defizit; 1, kontralateraler Reflex; 2, geschwächter Griff;
3, Kreiseln; 4, unbeweglich; 5, tot). Die Tiere wurden für bis zu
1 Woche gehalten, worauf die Tiere durch transkardiale Perfusion
mit 0,9%iger Kochsalzlösung
gefolgt von 4 % Paraformaldehyd in 100 mM Phosphatpuffer getötet wurden.
Die Gehirne wurden in 4 % Paraformaldehyd bei 4°C für 48 h nachfixiert, worauf
sie aus den Schädeln
entfernt und in 2 mm-Blöcke
unter Verwendung einer Rattenhirn-Matrix geschnitten wurden. Die
2 mm-Schnitte wurden dann in Paraffin unter Verwendung eines Shandon
Citadel 1000-Gewebeverarbeiters eingebettet, in 6 μm-Schnitte
unter Verwendung eines Mikrotoms geschnitten und auf Poly-L-lysin-beschichteten
Objektträgern
montiert. Die Schnitte wurden dann zur Cresyl Fast Violet-(CFV)-Anfärbung verarbeitet.
-
Dosierungsschema
-
Monoklonaler
Anti-MAG-Antikörper
und Kontroll-Antikörper
vom Maus-IgG1-Isotyp
wurden gegen steriles 0,9%iges Natriumchlorid über Nacht dialysiert und entsprechend
auf konzentriert.
Studie 1: Die Tiere erhielten 2,5 μg Anti-MAG-mAb
oder 2,5 μg
Maus-IgG i.c.v.
zu 1, 24 und 72 h nach MCAO (5 μl
pro Dosis).
Studie 2: Die Tiere erhielten 200 μg Anti-MAG-mAb
oder 200 μg
Maus-IgG i.v. zu
1 und 24 h nach MCAO.
-
Der
Prüfer
wurde bezüglich
der Identität
jeder Sondierungslösung
geblendet.
-
Neurologische Bewertung
-
Vor
der Induktion von zerebraler Ischämie erhielten die Ratten für Studie
1 Training im Balkenlaufen und Aufkleber-Test. Tiere, die nicht
die Kriterien in beiden Tests erreichten, wurde aus der weiteren
Studie ausgeschlossen. Nach dem Training wurde der Rest der Tiere
gemäß Leistung
in zwei ausgeglichene Gruppen eingeteilt. Während der neurologischen Bewertung
wurden die Prüfer
bezüglich
der Behandlungsgruppe des Tieres geblendet.
-
Bilateraler Aufkleber-Test
("sticky label")
-
Der
bilaterale Aufkleber-Test (Schallert et al., Pharmacology Biochemistry
and Behaviour 16:455–462 (1983))
wurde zur Bewertung von kontralateraler Vernachlässigung/ipsilateraler Tendenz
verwendet. Dies ahmt die bei menschlichen Schlaganfallpatienten
beobachtete taktile Extinktion nach (Rose et al., 1994). Dieser
Test wurde zuvor im Detail beschrieben (Hunter et al., Neuropharmacology
39:806–816
(2000); Virley et al., Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism, 20:563–582 (2000)).
Kurz gesagt wurde ein runder Papieraufklebertest um die haarlose
Fläche
der Vorderpfoten mit gleichem Druck plaziert, wobei die Reihenfolge
der Plazierung (links, rechts) randomisiert wurde. Die Trainungssitzungen
wurden für
6 Tage vor dem MCAO durchgeführt,
und die Daten von Tag 6 wurden als voroperative Basislinie (Tag
0) verwendet. Den Tieren wurden zwei Versuche 24 und 7 Tage nach
MCAO gegeben, und die Daten stellen den Mittelwert der zwei Versuche
dar. Die Wartezeit bis zum Kontaktieren und Entfernen der Aufkleber
wurde aufgezeichnet und unter Verwendung des Log-Rang-Tests analysiert
(Cox, J. Royal Statistical Society B 34: 187–220 (1972)).
-
Balkenlaufen
-
Balkenlaufen
wurde als Maß für die Hintergliedmaßen- und
Vordergliedmaßenkoordination
mittels der Distanz verwendet, die auf einem erhöhten 100 cm-Balken (2,3 cm
Durchmesser, 48 cm über
dem Boden) zurückgelegt
wurde, wie zuvor im Detail beschrieben (Virley et al., Journal of
Cerebral Blood Flow & Metabolism, 20:563–582 (2000)).
Die Ratten wurden trainieret, den Balken vom Beginn bis zum Ende
zu überqueren.
Für den
Test wurden den Ratten 2 Versuche 24 h und 7d nach dem MCAO gegeben,
und die Daten stellen den Mittelwert der zwei Versuche dar. Die
statistische Analyse war ANOVA, gefolgt vom Student-t-Test.
-
Die neurologische 27-Punkt-Bewertung
(Studie 1)
-
Diese
Studie besteht aus einer Batterie von Untersuchungen, um den neurologischen
Status zu bewerten, einschließlich
Pfotenplazierung, visuelles Vorderpfotenerreichen, horizontaler
Balken, kontralaterale Rotation, schräge Ebene, Ausrichtungsreflex,
kontralateraler Reflex, Motilität & allgemeiner Zustand,
wie zuvor beschrieben (Hunter et al., Neuropharmacology 39:806–816 (2000)),
unter Addition von Greifstärkenmessungen
(Bewertungen 2 für
guten Griff der rechten Vordergliedmaßen, 1 für schwachen Griff). Gesamtbewertung =
27 für
normale Tiere.
-
Für Studie
2 wurde dieser Test weiter modifiziert: Greifstärke – normal bewertet 3, gut – 3, schwach – 1, sehr
schwach – 0;
Motilität – normal
bewertet 4, ausgezeichnet – 3,
sehr gut – 2,
gut – 1,
ausreichend – 0; allgemeiner
Zustand – normal
bewertet 4, ausgezeichnet – 3,
sehr gut – 2,
gut – 1,
ausreichend – 0;
Kreiseln – ohne
bewertet 5, bevorzugt eine Seite bewertet 4, großer Kreis – 3, mittlerer Kreis – 2, kleiner
Kreis – 1,
rotieren – 0).
Gesamtbewertung = 32 für
ein normales Tier.
-
In
beiden Studien wurden die Tiere 1, 24, 48 h und 7 d nach MCAO untersucht,
ein gesundes normales Tier erreicht 27 bzw. 32. Die Daten werden
als Medianwerte angegeben, die statistische Analyse war nach Kruskil
Wallis ANOVA.
-
Läsionsbewertung
-
- Studie 1 – Für jedes
Tier wurden Läsionen
in Schnitten aus 3 vorher festgelegten Ebenen im Hirn bewertet (0, –2,0 bzw. –6,0 aus
Bregma). Die neuronale Schädigung
wurde unter Verwendung von Cresyl-Fast-Violet-Anfärbung bewertet
und die Schädigungsfläche unter
Verwendung eines Optimas 6.1- Bildgebungspaketes
gemessen. Die Daten werden als mittlere Fläche (mm2) ± Standardfehler
ausgedrückt.
- Studie 2 – Für jedes
Tier wurden die Läsionsareale
in Schnitten aus sieben vorher festgelegten Ebenen im Hirn bewertet
(+3 mm bis –8
mm bezügliche
Bregma). Die neuronale Schädigung
wurde unter Verwendung von Cresyl-Fast-Violet-Anfärbung bewertet und die Fläche der
Schädigung
unter Verwendung eines Optimas 6.1-Bildgebungspaketes gemessen.
Die Daten sind als mittlere Fläche
(mm2) ± Standardfehler
ausgedrückt.
-
Ergebnisse
-
Studie 1 – intrazerebrale
ventrikuläre
(i.c.v.) Verabreichung von Anti-MAG-mAb
-
Neurologische Bewertung
-
Eine
Stunde nach MCAO zeigten die Tiere in beiden Behandlungsgruppen
eine deutliche Beeinträchtigung
der neurologischen Bewertung (Medianbewertung 12 in jeder Gruppe).
Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen zu
diesem Zeitpunkt. Jedoch zeigten die mit Anti-MAG-mAb (2,5 μg, 1,24 und 72
h nach MCAO) behandelten Tiere 24 (p=0,02), 48 (p=0,005) h und 7d
(p=0,006) nach MCAO eine signifikant verbesserte neurologische Gesamtbewertung
im Vergleich mit den mit Kontroll-IgG behandelten Tieren. Neurologische
Medianbewertungen 24, 48 h und 7 d nach MCAO in der 2gG1-behandelten
Gruppe betrugen 15, 14 bzw. 18 im Vergleich zu 19,5, 21,5 und 22
in den mit Anti-MAG-mAb behandelten Tieren. Bei weiterer Analyse
des individuellen Verhaltens, das die Gesamtbewertung umfaßt, konnte
diese signifikante Verbesserung hauptsächlich der verbesserten Leistung
in den folgenden Untersuchungen zugeordnet werden: Pfotenplazierung
(24 h, p=0,045; 48 h p=0,016; 7d, p=0,008), Greifstärke (24
h, p=0,049; 48 h, p=0,0495; 7d, p=0,243); Motilität (24 h,
p=0,199; 48 h, p=0,012; 7d, p=0,067), horizontaler Balken (24 h,
p=0,065; 48 h, p=0,005; 7d, p=0,016), schräge Ebene (24 h, p=0,006; 48
h, p=0,006; 7d, p=0,169), visuelles Vorderpfotenerreichen (48 h, p=0,049,
7d, p=0,049) und Grad des Kreiselns (24 h, p=0,417; 48 h, p=0,034;
7d, p=0,183).
-
Balkenlaufen
-
Vor
der Operation wurden alle Tiere trainiert, um den Balken (100 cm)
zu überqueren.
24 Stunden nach der Operation gab es eine signifikante Beeinträchtigung
der auf dem Balken zurückgelegten
Distanz sowohl bei den mit Anti-MAG (50 ± 18 cm) als auch bei den
mit IgG1 (22 ± 14 cm) behandelten Tieren
im Vergleich mit den voroperativen Werten. Obwohl es nicht signifikant
ist, zeigten die Anti-MAG-behandelten Tiere eine deutliche Ver besserung
gegenüber
IgG1-behandelten Tieren, indem sie das zweifache
der Distanz der mit IgG1 behandelten Tiere
24 h nach tMCAO zurücklegten.
7 Tage nach der Operation blieb jedoch die Leistung der mit IgG
behandelten Tiere signifikant beeinträchtigt im Vergleich zur Basislinie
(55 ± 15
cm; p=0,005), obwohl beide Gruppe eine deutliche Verbesserung im
Zeitverlauf zeigten. im Gegensatz jedoch war 7d nach MCAO die Leistung
bei mit Anti-MAG-mAb
behandelten Tieren (2,5 μg
1, 24 und 72 h i.c.v. nach MCAO) nicht signifikant anders als die
Basislinie (75 ± 15
cm; p=0,07). Diese Daten zeigen, daß die Anti-MAG-mAb-Behandlung
die Erholung dieser Balkenlaufaufgabe im Vergleich zu den mit Maus-IgG1 behandelten Kontrollen beschleunigte.
-
Aufkleber
-
Vor
der Operation kontaktierten und entfernten die Tiere in jeder der
Behandlungsgruppen schnell die Aufkleber von jeder Vorderpfote,
und es gab keine signifikante Differenz in den Gruppen vor der Behandlung (Tabelle
1). 24 Stunden und 7d nach MCAO blieb die Verweilzeit bis zum Kontaktieren
der linken Pfote in jeder der Behandlungsgruppen relativ unverändert, während die
der rechten Pfote deutlich erhöht
war. Jedoch gab es keine signifikanten Unterschiede zwischen den
Entfernungszeiten in Anti-MAG- und IgG
1-behandelten Tieren.
Zusätzlich
war 24 h nach MCAO die Verweilzeit zur Entfernung sowohl von der
linken als auch der rechten Vorderpfote signifikant in beiden Behandlungsgruppen
im Vergleich mit der Basislinie erhöht, jedoch war die Verweilzeit
zur Entfernung von der linken Pfote in Anti-MAG-behandelten Tieren signifikant kürzer als
diejenige von IgG
1-behandelten Tieren (p=0,03).
Es gab ebenfalls einen Trend für
eine reduzierte Verweilzeit zur Entfernung von der rechten Pfote
in Anti-MAG-behandelten Tieren im Vergleich mit den mit IgG
1 behandelten (p=0,08) (Tabelle 1). Nach
7d gab es einen gewissen Erholungsgrad in IgG
1-behandelten
Tieren, indem die Verweilzeit zur Entfernung für jede Vorderpfote im Vergleich
mit denjenigen zu 24 h reduziert war (Tabelle 1). Diese Daten legen
nahe, daß die
Behandlung von Ratten mit Anti-MAG-mAb die Erholung in diesem Aufklebertest
nach tMCAO beschleunigt. Tabelle
1 – Aufkleberdaten
- (*p = 0,03 Anti-MAG gegenüber IgG1 unter Verwendung des Log-Rang-Tests)
-
Messungen der Läsionsfläche
-
Die
Verabreichung von Anti-MAG-mAb i.c.v. reduzierte signifikant die
Läsionsfläche in zwei
der drei untersuchten Hirnebenen im Vergleich mit denjenigen Tieren,
die mit gleichen Mengen von Maus-IgG
1 behandelt
wurden, bei Untersuchung 7 Tage nach tMCAO (Tabelle 2) Tabelle
2
- (*p=0,02, $p=0,03, #p=0,06, Anti-MAG gegenüber IgG1,
einfacher, ungepaarter Student-t-Test)
-
Studie 2 – Intravenöse (i.v.)
Verabreichung
-
Neurologische Bewertung
-
Eine
und 24 Stunden nach MCAO zeigten die Tiere in beiden Gruppen eine
deutliche Beeinträchtigung der
neurologischen Bewertung. Es gab keinen signifikanten Unterschied
zwischen Gruppen zu diesem Zeitpunkt, und die Medianbewertungen
24 h nach Anti-MAG-mAb und IgG1-Behandlung
waren 20 bzw. 18 (p=0,5). 48 Stunden nach MCAO zeigten die mit Anti-MAG-mAb
behandelten Tiere (200 μg,
i.v. 1 und 24 h nach MCAO) eine signifikante Verbesserung der Pfotenplazierung
(p=0,048) und der Greifstärke
(p=0,033). 7 Tage nach dem Einsetzen von zerebraler Ischämie verbesserten
sich die mit Anti-MAG- mAb
behandelten Tiere fortgesetzt (Pfotenplazierung p=0,041; Greifstärke p=0,048;
Motilität
p=0,05) und zeigten eine signifikante Verbesserung der neurologischen
Gesamtbewertung (Medianbewertung 25) im Vergleich mit den mit Maus-IgG1 behandelten Tieren (Medianbewertung 23,
p=0,047).
-
Messungen der Läsionsfläche
-
Bei
Verabreichung i.v. reduzierte der Anti-MAG-Antikörper signifikant die Läsionsfläche bei
5 von 7 vorher festgelegten Hirnebenen (+3 bis –8 mm bzgl. Bregma) im Vergleich
mit Isotyp-Kontrollen bei Untersuchung 7d nach MCAO.
- *
p<0,05 – ungepaart,
einfacher Student-t-Test
-
Schlußfolgerungen
-
Ein
monoklonaler Anti-MAG-Antikörper,
der entweder direkt in die zerebrospinale Flüssigkeit oder intravenös nach transienten
Verschluß der
mittleren zerebralen Arterie in der Ratte verabreicht wurde, reduzierte sowohl
das Gebiet des Zelltods als auch verbesserte er die funktionale
Erholung im Vergleich mit kontrollbehandelten Tieren. Der in diesen
Studien beobachtete Grad der Neuroprotektion legt nahe, daß dieser
Effekt nicht einem axonalen Aussprossen zugeordnet werden kann,
da dies nicht neuronalem Ersatz führen würde. Die 24 und 48 h nach MCAO
beobachtete Verbesserung der funktionalen Erholung spiegelt wahrscheinlich den
Grad der Neuroprotektion wider, der durch diesen Antikörper im
Vergleich mit kontrollbehandelten Tieren angeboten wird. Jedoch
scheinen sich die Tiere im Zeitverlauf weiter zu verbessern, was
nahelegt, daß ein Blockieren
der MAG-Aktivität
auch die funktionale Erholung im Zeitverlauf steigern kann.
-
Die
hier dargestellten Studien belegen, daß das Blockieren der Wirkungen
von MAG sowohl Neuroprotektion als auch eine gesteigerte funktionale
Erholung in einem Rattenmodell des Schlaganfalls liefert und deshalb
Anti-MAG-Antikörper
oder MAG-Antagonisten potentielle therapeuti sche Mittel für die akute
Neuroprotektion und/oder die Förderung
der funktionalen Erholung nach Schlaganfall bereitstellen. Anti-MAG-Antikörper oder
MAG-Antagonisten besitzen ebenfalls potentielle Verwendung in der
Behandlung anderer neurologischer Störungen, in denen die Degeneration
von Zellen oder Nervenfasern offensichtlich ist, wie Rückenmarksverletzung,
traumatische Hirnverletzung, periphere Neuropathie, Alzheimer-Krankheit,
fronto-temporale Demenzen (Tauopathien), Parkinson-Krankheit, Huntington-Krankheit und multiple
Sklerose.
-
Beispiel 2 – Chimärer Antikörper
-
Veränderte Antikörper schließen chimäre Antikörper ein,
die variable Regionen umfassen, die aus einer Art stammen und an
konstante Regionen aus einer anderen Art gebunden sind. Ein Beispiel
für einen
chimären
Maus-Mensch-Anti-MAG-Antikörper der
Erfindung wird in den 5 und 6 bereitgestellt. Maus-Mensch-Chimären unter
Verwendung der konstanten Regionen von humanem IgG1, IgG2, IgG3,
IgG4, IgA, IgE, IgM oder IgD können
ebenso hergestellt werden wie Chimären, die die variablen Regionen
aus der Maus mit konstanten Regionen der schweren oder leichten
Kette aus nicht-humanen
Arten in Verbindung bringen.
-
5 liefert die Aminosäuresequenz einer schweren Kette
aus chimärem
Immunglobulin, worin die variable Region des murinen Anti-MAG mit
einer funktionalen Immunglobulin-Sekretionssignalsequenz und mit einer
veränderten
Form der konstanten Region aus humanem IgG1 verbunden
ist, worin die Kabat-Reste 248 und 250 zu Alanin mutiert wurden,
um die Effektorfunktionen der Bindung an FcγRI und Komplementprotein C1q
zu unterbinden (A.R. Duncan und G. Winter, Localization of the C1q
binding site on antibodies by surface scanning. Nature 332, 738–740, 1988.
A.R. Duncan, J.M. Woolf, L.J. Partridge, D.R. Burton und G. Winter,
Localisation of the binding site for human FcR1 on IgG. Nature 332,
563–564,
1988). Solche Mutationen werden optional durchgeführt, um
die Eigenschaften eines veränderten
Antikörpers
maßzuschneidern,
um eine besondere therapeutische Wirkung zu erreichen – zum Beispiel
Bindung an und Blockierung der Funktion eines Antigens ohne Aktivierung
lytischer Effektormechanismen. Andere veränderte Antikörper der
Erfindung verwenden humane konstante Regionen ohne solche unterbindenden
Mutationen.
-
6 liefert die Aminosäuresequenz der leichten Kette
eines chimären
Immunglobulins, worin die variable Region von murinem Anti-MAG mit
einer funktionalen Immunglobulin-Sekretionssignalsequenz und mit der
humanen konstanten kappa-Region assoziiert ist.
-
Mit
den in 5 und 6 bereitgestellten
Informationen können
cDNA-Inserts, die diese chimären
Ketten codieren, durch Standardtechniken der Molekularbiologie hergestellt
werden, die den Fachleuten allgemein bekannt sind. Kurz gesagt wird
der genetische Code verwendet, um Nukleotidcodonen zu identifizieren,
die die gewünschten
Aminosäuren
codieren, wodurch eine virtuelle cDNA-Sequenz geschaffen wird, die
das chimäre
Protein codiert. Falls das cDNA-Insert in einem besonderen Organismus
exprimiert werden soll, dann können
besonders bevorzugte Codonen gemäß bekannten
Codonenverwendungsbetonungen ausgewählt werden. Die gewünschte Nukleotidsequenz
wird dann mittels PCR-Amplifikation einer Matrize synthetisiert,
die überlappende
synthetische Oligonukleotide umfaßt, die als zusammenhängende Sequenz
die gewünschte
Sequenz darstellen. Das resultierende Produkt kann auch durch PCR
oder Mutagenese modifiziert werden, um Restriktionsorte zur Erleichterung
der Klonierung in ein Plasmid zur Expression oder weiterer Manipulationen anzubinden.
