DE69934241T2

DE69934241T2 - Agonistische antikörper gegen tie2

Info

Publication number: DE69934241T2
Application number: DE69934241T
Authority: DE
Inventors: D. Stephen HOLMES; L. Connie Exton ERICKSON-MILLER; D. James Fort Washington WINKLER
Original assignee: SmithKline Beecham Ltd; SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Ltd; SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1998-09-28
Filing date: 1999-09-28
Publication date: 2007-05-31
Anticipated expiration: 2019-09-29
Also published as: US6365154B1; EP1117692B1; ATE346869T1; EP1117692A1; EP1117692A4; ES2277450T3; DE69934241D1; WO2000018804A1; JP2002525104A

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft agonistische monoklonale Antikörper (mAk), die an den Tie2-Rezeptor binden, und die Verwendung solcher Antikörper für therapeutische Zwecke.
Hintergrund der Erfindung
Die Angiogenese oder Gefäßneubildung ist das Verfahren der Entwicklung von neuen oder Ersatz-Blutgefäßen. Es handelt sich um einen notwendigen und normalen Prozess, durch den die Vaskulatur im Embryo etabliert wird. Die Angiogenese tritt im allgemeinen in den meisten normalen Erwachsenengeweben nicht auf, wobei Ausnahmen die Stellen der Ovulation, der Mensis und der Wundheilung sind.
Eine angehobene Blutzufuhr ist bei vielen Zuständen, wie z.B. ischämischen Zuständen, die sich aus einem Schlaganfall, einem Myokardinfarkt und anderen Infarkten ergeben, günstig und auch bei Zuständen eines schlechten Blutflusses, der sich aus Erkrankungen, wie Diabetes oder peripheren vaskulären Erkrankungen ergibt. Der vaskuläre endothele Wachstumsfaktor und der basische Fibroblastenwachstumsfaktor sind Faktoren, von denen gezeigt wurde, dass sie die Angiogenese unterstützen. Kürzliche Arbeiten mit dem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) und dem basischen Fibroblastenwachstumsfaktor haben demonstriert, dass die Unterstützung der Angiogenese durch diese Faktoren bei ischämischen Erkrankungen und vaskulären Erkrankungen von Nutzen sein kann (Bauters, C. et al., Circulation, 91: 2802-2809,1995; Bauters, C. et al., Journal of Vascular Surgery, 21: 314-24, 1995; Isner, J. M. et al., Human Gene Therapy, 7: 959-988,1996; Takeshita, S., et al., Biochemical &. Biophysical Research Communications, 227: 628-635,1996; Tsurumi, Y., et al., Circulation, 96: 382-388,1997).
In den letzten Jahren wurde deutlich, dass es sich bei der Angiogenese um ein komplexes, multizelluläres Phänomen handelt, worin spezifische Liganden und ihre Rezeptoren eine Schlüsselrolle spielen. Insbesondere legt eine Kombination von Studien nahe, dass der Tie2-Rezeptor und sein Ligand bei der Angiogenese wichtig sind.
Der Tie2-Rezeptor wurde in Endothelzellen von allen blutbildenden Gefäßen und im Endokard von Mausembryos lokalisiert (Korhonen et al., Blood 80: 2548-2555,1992). Selektive Muster der Expression in Endothelzellen während der Embryonalentwicklung wurden ebenfalls demonstriert (Schlaeger et al., Development 121: 1089-1098,1995).
In Erwachsenengeweben kann Tie-mRNA in der Haut nicht beobachtet werden, außer an Stellen einer aktiven Wundheilung, wo die proliferierenden Kapillaren im Granulationsgewebe überschüssige Tie-mRNA enthalten (Korhonen et al., Blood 80: 2548-2555,1992). Weiterhin wird der Tie-Rezeptor im vaskulären Endothel von metastasierenden Melanomen exprimiert (Kaipainen et al., Cancer Res. 54: 6571-6577,1994). Während die Tie-Rezeptor-Expression in der etablierten Vaskulatur herabreguliert ist, ist sie bei der Angiogenese herauf reguliert, die in den Ovarien während der Ovulation auftritt, bei Wunden und in Tumor (Brust, Melanom und Nierenzellkarzinom) Vaskulatur, konsistent mit der vorherrschenden Meinung, dass die Angiogenese beim Erwachsenen sich an embryonale angiogenetische Mechanismen anlehnt.
Homozygote Mäuse mit einem Tie2-Knockout oder die ein Transgen tragen, das einen dominant negativen Tie2-Rezeptor codiert, bestätigten, dass der Tie2-Rezeptor für die embryonale Entwicklung kritisch ist (Dumont et al., Genes Dev. 8: 1897-1909,1994; Sato et al., Nature 376: 70-74,1995). Ein embryonaler Tod bei diesen Mäusen trat aufgrund einer vaskulären Insuffizienz auf, und es gab eine dramatisch reduzierte Anzahl an Endothelzellen. Die Vaskulogenese – d.h. die Differenzierung von Endothelzellen und die in situ-Bildung von Gefäßen – schien bei Mäusen, denen Tie2 fehlte, relativ normal zu sein. Die darauf folgende Sprossung und Remodellierung, die zu der Bildung von Gefäßabzweigungen führt (Angiogenese), war bei den Tie2-mutierten Mausembryos drastisch reduziert. Dieses Fehlen einer Sprossung und Angiogenese führte zu einer darauffolgenden substantiellen Wachstumsverzögerung, insbesondere des Gehirns, des Neuralrohrs und des Herzens und führte zu einem Fehlen an Lebensfähigkeit. Diese Ergebnisse stellen beispielhaft die kritische Wichtigkeit von Tie2 bei der Angiogenese dar. Dies ist signifikant, da die Angiogenese durch eine Anzahl von Wachstumsfaktoren reguliert wird. Interessanterweise zeigen Flk1 (VEGF-Rezeptor)-Knockout-Mäuse embryolethale Defekte bei der Vaskulogenese, die früher als die diejenigen der Tie2-Unterbrechung auftreten. Die Unterbrechung des Tie-1-Rezeptors führte zu einem sehr deutlich anderen und späteren defekten Phänoty; der Mausembryo stirbt spät in der Entwicklung aufgrund einer Blutung, die sich aus einer defekten Integrität von andererseits gut gebildeter Vaskulatur ergibt. Zusammengenommen legen diese Studien nahe, dass die VEGF/Flk1- und Tie-Systeme in sequenzieller Weise agieren, wobei Tie2 eine kritische Rolle bei der Angiogenese spielt.
Kürzlich wurde über zwei Liganden für den Tie2-Rezeptor berichtet. Angiopoietin-1 bindet und induziert die Tyrosinphosphorylierung von Tie2 und die Expression in vivo befindet sich in enger Nachbarschaft zu sich entwickelnden Blutgefäßen (Davis et al., Cell 87: 1161-1169,1996). Mäuse, die genetisch so manipuliert wurden, dass ihnen Angiopoietin-1 fehlte, zeigen angiogene Defizite, die an diejenigen erinnern, die vorher bei Mäusen beobachtet wurden, denen Tie2-Rezeptoren fehlten und demonstrieren, dass Angiopoietin-1 ein primärer physiologischer Ligand für Tie2 ist und dass Tie2 kritische in vivo angiogene Wirkungen aufweist (Suri et al., Cell 87: 1171-1180,1996). Angiopoietin-2 wurde durch Homologiescreening identifiziert, und es wurde gezeigt, dass es sich um einen natürlich auftretenden Antagonisten für Tie2-Rezeptoren handelt. Die transgene Überexpression von Angiopoietin-2 unterbricht die Blutgefäßbildung beim Mäuseembryo (Maisonpierre et al., Science 277: 55-60,1997). Zusammengenommen unterstützen diese Ergebnisse eine Rolle für Tie2-Rezeptoren bei der Angiogenese.
Die Tie-1- und Tie2-Rezeptoren sind Einzel-Transmembran-Tyrosinkinaserezeptoren (Tie steht für Tyrosinkinaserezeptoren mit Immunoglobulin und EGF-Homologiedomänen). Sie sind die einzigen Rezeptortyrosinkinasen, außer denjenigen Rezeptoren für VEGF, die in ihrer Expression im wesentlichen auf Endothelzellen begrenzt sind. Beide wurden kloniert, und von etlichen Gruppen wurde darüber berichtet (Dumont et al., Oncogene 8: 1293-1301,1993; Partanen et al., Mol. Cell Biol. 12: 1698-1707,1992; Sato et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 9355-9358,1993).
Tie-Rezeptoren sind Proteine mit ungefähr 125 kDa mit einer einzelnen putativen Transmembranregion. Die extrazelluläre Domäne dieser Rezeptoren ist einzigartig in drei Regionen unterteilt, die ein Muster einer Cysteinexpression aufweisen, das in EGF-ähnlichen Domänen angetroffen wird; zwei Regionen, die etwas geringe Homologie zu Immunglobulin-ähnlichen Domänen aufweisen und zu strukturellen Charakteristiken derselben und drei Regionen mit einer Homologie zu der Fibronectin-III-Repeatstruktur. Der intrazelluläre Bereich von Tie2 ist besonders eng (ungefähr 40% Identität) mit den Kinasendomänen von FGR-R1, PDGF-R und c-Kit verwandt. Die intra zellulären Bereiche von Tie2 enthalten alle Merkmale der Tyrosinkinasen, einschließlich einer GXGXXG ATP-Bindungsstellen-Consensussequenz und typischen Tyrosinkinasemotiven (d.h., HRDLAARN und DFGL).
Basierend auf der Wichtigkeit der Tie2-Rezeptoren bei der Angiogenese wird vorhergesagt, dass die Tie2-Rezeptor-agonistische Aktivität die Angiogenese stimuliert und erkrankungsspezifische therapeutische Wirkungen bereitstellt. Es besteht eindeutig ein Bedarf, hochaffine wirksame agonistische Antikörper gegen den Tie2-Rezeptor zu entwickeln, die eine ausreichende Aktivität aufweisen, um in vivo in therapeutisch annehmbaren Konzentrationen zu wirken.
Die Tie2-Rezeptoren werden auf hämatopoetischen Vorläufern exprimiert, einschließlich CD34+-Zellen, Megakaryozytenvorläufern und Megakaryozyten-abgeleiteten Zelllinien (Kukk et al., Brit J Haematol. 98: 195-203,1997; Batard et al., Blood 87: 2212-2220,1996). Der Tie2-Rezeptor hat eine Homologie zu anderen hämatopoetischen Wachstumsfaktorrezeptoren, wie z.B. c-Kit (Chabot et al, Nature 335: 88,1988; Yarden et al., EMBO J. 6: 3341,1987) und flk-2 (Matthews et al, Cell 65: 1143,1991). Die Expression von Tie2 nahm bei reiferen hämatopoetischen Zellen ab, obwohl sie in einem signifikanten Anteil von Zellen während der Megakaryozyten-Differenzierung aufrechterhalten wurde. Diese Daten legen zusammengenommen nahe, dass Tie2 ein Rezeptor für einen hämatopoetischen Wachstumsfaktor ist, der auf frühe Vorläufer wirkt und während der Differenzierung der Megakaryozytenzelllinie.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein Aspekt der Erfindung ist ein Antikörper, umfassend ein schwere Ketten-variables Regionpolypeptid, wie dargestellt in SEQ ID NO: 2 und ein leichtes Ketten-variables Regionpolypeptid, wie dargestellt in SEQ ID NO: 4 und isolierte Polynucleotide, die diese codieren.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein agonistischer anti-Tie2-Antikörper, umfassend schwere Ketten-CDRs mit einer Aminosäuresequenz, wie dargestellt in SEQ ID NOS: 5, 6 und 7, und leichte Ketten-CDRs mit einer Aminosäuresequenz, wie dargestellt in SEQ ID NOS: 8, 9 und 10.
Ein anderer Aspekt der Offenbarung ist ein Antikörper, umfassend ein schweres Ketten-variables Regionpolypeptid, wie dargestellt in SEQ ID NO: 21 und ein leichtes Ketten-variables Regionpolypeptid, wie dargestellt in SEQ ID NO: 14 und isolierte Polynucleotide, die diese codieren.
Ein anderer Aspekt der Offenbarung ist eine schwere Ketten-CDR mit einer Aminosäuresequenz, wie dargestellt in SEQ ID NO: 15, 16 oder 17.
Ein anderer Aspekt der Offenbarung ist eine leichte Ketten-CDR mit einer Aminosäuresequenz, wie dargestellt in SEQ ID NO: 18, 19 oder 20.
Ein anderer Aspekt der Offenbarung ist ein Hybridom mit den identifizierenden Eigenschaften der Zelllinie 15B8 oder 13H10.
Ein anderer Aspekt der Offenbarung ist ein Verfahren zur Verstärkung der Angiogenese bei einem Tier, umfassend die Verabreichung einer effektiven Dosis eines Tie2-Rezeptoragonisten-Antikörpers mit den identifizierenden Eigenschaften des monoklonalen Antikörpers 15B8 oder 13H10.
Ein anderer Aspekt der Offenbarung ist ein Verfahren zur Verstärkung des Endothelzellüberlebens bei einem Säuger, umfassend die Verabreichung einer effektiven Dosis eines Tie2-Rezeptor-agonistischen Antikörpers.
Ein anderer Aspekt der Offenbarung ist ein Verfahren zur Verstärkung der hämatopoetischen oder megakaryozytischen Zellproliferation bei einem Säuger, umfassend die Verabreichung einer effektiven Dosis eines Tie2-Rezeptoragonisten-Antikörpers.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Graphik experimenteller Ergebnisse, die die Aktivität des monoklonalen Antikörpers 15B8 bei dem Matrigelvaskularisierungsmodell demonstriert.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Wie verwendet, bedeutet die Bezeichnung "Verstärkung der Angiogenese" die Verstärkung der Entwicklung von neuen oder Ersatzblutgefäßen (Neovaskularisierung).
Wie hier verwendet, bedeutet die Bezeichnung "agonistische Aktivität" die Aktivität eines Antikörpers, der an den Tie2-Rezeptor bindet und die Angiogenese verstärkt.
Wie hier verwendet, bedeutet die Bezeichnung "Behandeln" und Derivate davon eine prophylaktive, palliative oder therapeutische Therapie.
Die vorliegende Offenbarung stellt eine Varietät von Antikörpern bereit, einschließlich veränderter Antikörper und Fragmente davon, gerichtet gegen den Tie2-Rezeptor, die durch eine agonistische Aktivität gekennzeichnet sind. Beispielhafte Tie2-Rezeptoragonisten-Antikörper sind die murinen monoklonalen Antikörper 15B8 oder 13H10.
"Antikörper" beziehen sich auf Immunglobuline, die durch konventionelle Hybridomtechniken, Phagendisplaykombinationsbibliotheken, Immunoglobulinketten-Shuffling und Humanisierungstechniken hergestellt werden können. Auch beinhaltet sind vollständig menschliche monoklonale Antikörper. Wie hier verwendet, bedeutet "Antikörper" "geänderte Anti körper", was sich auf ein Protein bezieht, das durch eine veränderte Immunglobulin-codierende Region codiert wird, erhaltbar durch Expression in einer selektierten Wirtszelle. Solche veränderten Antikörper sind genetisch manipulierte Antikörper (z.B. chimäre oder humanisierte Antikörper) oder Antikörperfragmente, denen die Gesamtheit oder ein Teil einer Immunoglobulin-konstanten Region, z.B. Fv, Fab, Fab' oder F(ab')₂, fehlt. Diese Antikörperprodukte sind nützlich bei therapeutischen und pharmazeutischen Zusammensetzungen für die Behandlung akuter und chronischer ischämischer und vaskulärer Insuffizienzerkrankungen und anderer Zustände, bei denen ein verstärkter Blutfluss angezeigt ist. Beispielhafte ischämische Erkrankungen beinhalten den Myokardinfarkt und einen Gehirnschlag. Beispielhafte vaskuläre Insuffizienzerkrankungen beinhalten Diabetes.
"Veränderte Immunglobulin-codierende Region" betrifft eine Nucleinsäuresequenz, die einen veränderten Antikörper codiert. Wenn der veränderte Antikörper ein Komplementaritäts-bestimmender Region-gepfropfter (CDR-gepfropfter) oder humanisierter Antikörper ist, werden die Sequenzen, die die CDRS von einem nicht-menschlichen Immunglobulin codieren, in einen ersten Immunglobulinpartner inseriert, umfassend menschliche variable framework-Sequenzen. Optional wird der erste Immunglobulinpartner operativ an einen zweiten Immunglobulinpartner gebunden.
"Erster Immunglobulinpartner" bezieht sich auf eine Nucleinsäuresequenz, die ein menschliches framework oder eine menschliche Immunglobulin-variable Region codiert, worin die nativen (oder natürlich auftretenden) CDR-codierenden Regionen durch die CDR-codierenden Regionen eines Donorantikörpers ersetzt sind. Die menschliche variable Region kann eine Immunglobulin-schwere Kette, eine -leichte Kette (oder beide Ketten), analoge oder funktionale Fragmente davon, sein. Solche CDR-Regionen, lokalisiert innerhalb der variablen Region von Antikörpern (Immunglobulinen) können durch auf dem Gebiet bekannte Verfahren bestimmt werden. Beispielsweise offenbaren Kabat et al. in "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 4. Ausgabe, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987) Regeln für die Lokalisierung von CDRs. Zusätzlich sind Computerprogramme bekannt, die für die Identifizierung von CDR-Regionen/Strukturen nützlich sind.
"Zweiter Immunglobulinpartner" bezieht sich auf eine andere Nucleotidsequenz, die ein Protein oder Peptid codiert, an das der erste Immunglobulinpartner im Gerüst fusioniert ist oder durch eine optional konventionelle Linkersequenz (d.h. operativ verbunden). Vorzugsweise handelt es sich um ein Immunglobulingen. Der zweite Immunglobulinpartner kann eine Nucleinsäuresequenz beinhalten, die die gesamte konstante Region für denselben (d.h. homologen, wenn die ersten und zweiten veränderten Antikörper von derselben Quelle abstammen) oder einem zusätzlichen (d.h., heterologen) Antikörper von Interesse codieren. Es kann sich um eine Immunglobulin-schwere oder -leichte Kette handeln (oder beide Ketten als Teil eines einzelnen Polypeptids). Der zweite Immunglobulinpartner ist nicht auf eine bestimmte Immunglobulinklasse oder einen Isotyp begrenzt. Zusätzlich kann der zweite Immunglobulinpartner einen Teil einer Immunglobulin-konstanten Region umfassen, wie z.B. in einem Fab oder F(ab)₂ angetroffen (d.h., ein diskreter Teil einer geeigneten menschlichen konstanten Region oder Framework-Region). Ein solcher zweiter Immunglobulinpartner kann auch eine Sequenz umfassen, die ein integrales Membranprotein codiert, exponiert an der äußeren Oberfläche einer Wirtszelle, z.B. als Teil einer Phagendisplaybibliothek oder eine Sequenz, codierend ein Protein für den analytischen oder diagnostischen Nachweis, z.B. Meerrettichperoxidase, β-Galactosidase.
Die Bezeichnungen Fv, Fc, Fd, Fab, Fab' oder F(ab')₂ werden mit ihren Standardbedeutungen verwendet. Siehe z.B. Harlow et al. in "Antibodies A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, (1988).
Wie hier verwendet, beschreibt ein "genetisch manipulierter Antikörper" einen Typ eines veränderten Antikörpers, d.h. einen Gesamtlängen-synthetischen Antikörper (z.B. einen chimären oder humanisierten Antikörper, im Gegensatz zu einem Antikörperfragment), worin ein Teil der leichten und/oder schweren Ketten-variablen Domänen eines gewähnten Akzeptorantikörpers durch analoge Teile von einem oder mehreren Donorantikörpern ersetzt sind, die für das gewählte Epitop eine Spezifität aufweisen. Solche Moleküle können beispielsweise Antikörper beinhalten, die durch eine humanisierte schwere Kette gekennzeichnet sind, assoziiert mit einer nicht-modifizierten leichten Kette (oder chimären leichten Kette) oder umgekehrt. Genetisch manipulierte Antikörper können auch durch Veränderung der Nucleinsäuresequenzen gekennzeichnet sein, die die Akzeptorantikörper leichten und/oder schweren variablen Domänen-Framework-Regionen codieren, um die Donorantikörper-Bindungsspezifität zu erhalten. Diese Antikörper können einen Ersatz von ein oder mehr CDRs (vorzugsweise allen) des Akzeptorantikörpers durch CDRs von einem Donorantikörper, wie hier beschrieben, umfassen.
Ein "chimärer Antikörper" bezieht sich auf einen Typ eines genetisch manipulierten Antikörpers, der eine natürlich auftretende variable Region (leichte Kette und schwere Kette), abstammend von einem Donorantikörper in Assoziation mit leichten und schweren Ketten-konstanten Regionen enthält, abstammend von einem Akzeptorantikörper.
Ein "humanisierter Antikörper" bezieht sich auf einen Typ eines genetisch manipulierten Antikörpers, dessen CDRs von einem nicht-menschlichen Donorimmunglobulin abstammen, wobei die verbleibenden Immunglobulin-abstammenden Teile des Moleküls von ein oder mehr menschlichen Immunglobulinen abstammen. Zusätzlich können Framework-Stützreste geändert sein, um die Bindungsaffinität zu konservieren. Siehe beispielsweise Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technology 9,421 (1991). Wie hier weiterhin beschrieben, können zusätzliche Reste verändert werden, um die agonistische Aktivität des Donorantikörpers zu konservieren.
Die Bezeichnung "Donorantikörper" bezieht sich auf einen monoklonalen oder rekombinanten Antikörper, der die Nucleinsäuresequenzen seiner variablen Regionen, CDRs oder anderer funktionaler Fragmente oder Analoga davon zu einem ersten Immunglobulinpartner beiträgt, um die veränderte Immunglobulin-codierende Region bereitzustellen und zu einem exprimierten veränderten Antikörper mit der Antigenspezifität und den neutralisierenden Aktivitätseigenschaften des Donorantikörpers zu führen. Donorantikörper, die zur Verwendung in dieser Offenbarung geeignet sind, sind murine agonistische monoklonale Antikörper, bezeichnet als 15B8 und 13H10.
Die Bezeichnung "Akzeptorantikörper" bezieht sich auf monoklonale oder rekombinante Antikörper, die zu dem Donorantikörper heterolog sind, die alle oder ein Teil der Nucleinsäuresequenzen, codierend die schweren und/oder leichten Ketten-Frameworkregionen und/oder die schweren und/oder leichten Ketten-konstanten Regionen oder V-Region-Subfamilien-Consensussequenzen dem ersten Immunglobulinpartner zutragen. Vorzugsweise ist ein menschlicher Antikörper der Akzeptorantikörper.
"CDRs" werden als Komplementaritäts-bestimmende Region-Aminosäuresequenzen eines Antikörpers definiert, wobei es sich um die hypervariablen Regionen von Immunglobulin-schweren und -leichten Ketten handelt. Siehe z.B. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4. Auflage, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987). Es gibt drei schwere Ketten- und drei leichte Ketten-CDRs oder CDR-Regionen im variablen Teil eines Immunglobulins. So bezieht sich "CDRs" wie hier verwendet auf alle drei schwere Ketten-CDRs oder alle drei leichte Ketten-CDRs oder sowohl alle schweren als auch alle leichte Ketten-CDRs, falls passend.
CDRs stellen die Hauptzahl der Kontaktreste für die Bindung des Antikörpers an das Antigen oder Epitop bereit. Interessierende CDRs stammen von Donorantikörper-variablen schweren und leichten Kettensequenzen ab und beinhalten Analoga der natürlich auftretenden CDRs, wobei die Analoga dieselbe Antigenbindungsspezifität und/oder angonistische Fähigkeit wie der der Donorantikörper aufweisen oder sich erhalten, von dem sie abstammen, jedoch eine erhöhte Affinität für das Antigen zeigen können. Ein beispielhafter Prozess zur Erhaltung von Analoga ist eine Affinitätsreifung durch eine Phagendisplay-Technologie, wie dargestellt von Hoogenboom, Trends in Biotechnology 15,62-70 (1997); Barbas et al., Trends in Biotechnology 14,230-234 (1996); und Winter et al., Ann. Rev. Immunol. 12,433-455 (1994) und beschrieben von Irving et al., Immunotechnology 2,127-143 (1996).
Unter "Teilung der Antigenbindungsspezifität oder Angonistenfähigkeit" wird beispielsweise verstanden, dass, obwohl die mAk 15B8 oder 13H10 durch ein gewisses Niveau der agonistischen Aktivität gekennzeichnet sein können, eine CDR, codiert durch eine Nucleinsäuresequenz von 15B8 oder 13H10 in einer geeigneten strukturellen Umgebung eine niedrigere oder höhere Aktivität aufweisen kann. Es wird erwartet, dass die CDRs von 15B8 oder 13H10 in solchen Umgebungen nichtsdestotrotz dasselbe Epitop (dieselben Epitope) wie 15B8 oder 13H10 erkennen werden.
Ein "funktionales Fragment" ist eine partielle schwere oder leichte Ketten-variable Sequenz (z.B. geringfügige Deletionen am Amino- oder Carboxy-Terminus der Immunglobulin-variablen Region), das sich dieselbe Antigenbindungsspezifität und/oder agonistische Fähigkeit wie der Antikörper, von dem das Fragment abgeleitet ist, erhält.
Ein "Analog" ist eine Aminosäuresequenz, modifiziert durch mindestens eine Aminosäure, wobei die Modifikation chemisch sein kann oder eine Substitution oder Umanordnung einiger Aminosäuren (d.h. nicht mehr als 10) und korrespondierende Nucleinsäuresequenzen, wobei die Modifikation es der Aminosäuresequenz ermöglicht, sich die biologischen Eigenschaften zu erhalten, z.B. die Antigenspezifität und hohe Affinität der nicht-modifizierten Sequenz. Beispielhafte Nucleinsäureanaloga beinhalten stille Mutationen, die über Substitutionen konstruiert werden können, um bestimmte Endonucleaserestriktionsstellen innerhalb oder umgebend die CDR codierenden Regionen zu erzeugen.
Analoga können sich auch allelische Variationen ergeben. Eine "allelische Variation oder Modifikation" ist eine Veränderung in der Nucleinsäuresequenz, codierend die Aminosäure oder Peptidsequenzen der Erfindung. Solche Variationen oder Modifikationen können auf die Redundanz im genetischen Code zurückzuführen sein oder können absichtlich so manipuliert sein, um gewünschte Eigenschaften bereitzustellen. Diese Variationen oder Modifikationen können zu Veränderungen jeder codierten Aminosäuresequenz führen oder auch nicht.
Die Bezeichnung "Effektormittel" bezieht sich auf Nicht-Proteinträgermoleküle, an die die veränderten Antikörper und/oder natürlichen oder synthetischen leichten oder schweren Ketten der Donorantikörper oder andere Fragmente des Donorantikörpers durch konventionelle Mittel assoziiert sein können. Solche Nicht-Proteinträger können konventionelle Träger beinhalten, die auf dem diagnostischen Gebiet verwendet werden, beispielsweise Polystyrol oder andere Kunststoffkügelchen, Polysaccharide, z.B. wie verwendet in dem BIAcore^TM-(Pharmacia)-System, oder andere Nicht-Proteinsubstanzen, die auf dem medizinischen Gebiet nützlich und für die Verabreichung an Menschen und Tiere sicher sind. Andere Effektormittel können einen Makrozyklus zur Chelatbildung eines Schwermetallatoms oder Radioisotope beinhalten. Solche Effektormittel können auch zur Erhöhung der Halbwertszeit der veränderten Antikörper nützlich sein, beispielsweise Polyethylenglykol.
Für die Verwendung bei der Konstruktion der Antikörper können veränderte Antikörper und Fragmente dieser Erfindung, einer nicht-menschlichen Species, wie z.B. Rind, Schaf, Affe, Huhn, Nager (z.B. Maus und Ratte), verwendet werden, um ein gewünschtes Immunglobulin bei Präsentation mit menschlichen Tie2-Rezeptor oder einem Peptidepitop davon zu erzeugen. Konventionelle Hybridom-Techniken werden verwendet, um eine Hybridomzelllinie bereitzustellen, die einen nicht-menschlichen mAk für den Tie2-Rezeptor sezerniert. Solche Hybridome werden dann im Hinblick auf ihre Bindungs- und agonistischen Aktivitäten, wie im Beispielteil beschrieben, einem Screening unterworfen. Alternativ können vollständig menschliche mAks durch dem auf dem Gebiet versierten Fachmann bekannte Techniken erzeugt werden.
Beispielhafte agonistische mAks der vorliegenden Offenbarung sind die mAks 15B8 und 13H10, murine Antikörper, die für die Entwicklung eines chimären oder humanisierten Moleküls verwendet werden können. Die 15B8- und 13H10 mAks sind durch eine agonistische Aktivität auf den menschlichen Tie2-Rezeptor und darauffolgende Aktivierung der Signaltransduktion des Rezeptors gekennzeichnet, was zu einer Verstärkung der Angiogenese führt. Diese mAks werden durch die Hybridomzelllinien 15B8 bzw. 13H10 erzeugt.
Die gegenwärtige Offenbarung beschreibt auch die Verwendung von Fab-Fragmenten oder F(ab')₂-Fragmenten, abstammend von mAks, die gegen den Tie2-Rezeptor gerichtet sind, als bivalente Fragmente. Diese Fragmente sind als Mittel mit agonistischer Aktivität auf den Tie2-Rezeptor nützlich. Ein Fab-Fragment enthält den gesamten leichten Ketten- und Amino-terminalen Teil der schweren Kette. Ein F(ab')₂-Fragment ist das Fragment, das von zwei Fab-Fragmenten gebildet wird, gebunden durch Disulfidbindungen. Die mAks 15B8 und 13H10 und andere ähnlich hochaffine Antikörper stellen Quellen für Fab-Fragmente und F(ab')₂-Fragmente bereit, die durch konventionelle Mittel erhältlich sind, z.B. Spaltung des mAks mit den geeigneten proteolytischen Enzymen, Papain und/oder Pepsin oder durch rekombinante Verfahren. Diese Fab- und F(ab')₂-Fragmente sind selbst als therapeutische, prophylaktische oder diagnostische Mittel nützlich und als Donoren von Sequenzen, einschließlich der variablen Regionen und CDR-Sequenzen, die bei der Bildung rekombinanter und humanisierter Antikörper, wie hier beschrieben, nützlich sind.
Die Fab- und F(ab')₂-Fragmente können über eine Kombinationsphagenbibliothek (siehe z.B. Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)) oder über ein Immunglobulin-Kettenshuffling (siehe z.B. Marks et al., BioTechnology, 10: 779-783 (1992)) konstruiert werden, worin das Fd- oder vh-Immunglobulin von einem selektiven Antikörper (z.B. 3G9) mit einem Repertoire von leichten Ketten-Immunglobulinen, ν_L (oder ν_K) assoziieren kann, um neue Fabs zu bilden. Umgekehrt kann man dem leichten Ketten-Immunglobulin von einem gewählten Antikörper ermöglichen, sich mit einem Repertoire von schwere Ketten-Immunglobulinen, ν_H (oder Fd) zu assozieren, um neue Fabs zu bilden. Die Tie2-Rezeptor-Agonisten-Fabs können erhalten werden, indem man dem Fd des mAk 15B8 oder 13H10 ermöglicht, sich mit einem Repertoire von leichten Ketten-Immunglobulinen zu assoziieren. Daher ist man dazu in der Lage, neutralisierende Fabs zu gewinnen, die einzigartige Sequenzen (Nucleotid- und Aminosäure) aufweisen, und zwar durch das Ketten-Shuffling-Verfahren.
Die mAks 15B8 oder 13H10 können Sequenzen beitragen, wie z.B. variable schwere und/oder leichte Kettenpeptidsequenzen, Frameworksequenzen, CDR-Sequenzen, funktionale Fragmente und Analoga davon und die Nucleinsäuresequenzen, die sie codieren, die für den Entwurf und Erhalt verschiedener veränderter Antikörper nützlich sind, die durch die Antigenbindungsspezifität des Donorantikörpers gekennzeichnet sind.
Die Nucleinsäuresequenzen dieser Erfindung oder Fragmente davon, die die variablen leichten Ketten- und schweren Ketten-Peptidsequenzen codieren, sind auch für die mutagene Einführung spezifischer Veränderungen in die Nucleinsäuresequenzen nützlich, die die CDRs oder Frameworkregionen codieren und für den Einbau der resultierenden modifizierten oder fusionierten Nucleinsäuresequenz in ein Plasmid für die Expression. Beispielsweise können stille Substitutionen in der Nucleotidsequenz des Frameworks und CDR-codierenden Regionen verwendet wurden, um Restriktionsenzymstellen zu erzeugen, die die Insertion mutagenisierter CDR- und/oder Frameworkregionen erleichtern. Diese CDR-codierenden Regionen können bei der Konstruktion der humanisierten Antikörper verwendet werden.
Die Nuclein- und Aminosäuresequenzen der 15B8-schwere Kettenvariablen Region ist in SEQ ID NO: 1 aufgeführt. Die CDR-Aminosäuresequenzen von dieser Region sind in SEQ ID NOS: 5, 6 und 7 aufgeführt.
Die Nuclein- und Aminosäuresequenzen der 15B8-leichte Kettenvariablen Region sind in SEQ ID NO: 3 aufgelistet. Die CDR-Aminosäuresequenzen von dieser Region sind in SEQ ID NOS: 8, 9 und 10 aufgeführt.
Die Nuclein- und Aminosäuresequenzen der 13H10-schwere Kettenvariablen Region, beginnend bei Aminosäure 7, ist in SEQ ID NO: 11 aufgeführt. Die CDR-Aminosäuresequenzen von dieser Region sind in SEQ ID NOS: 15, 16 und 17 aufgeführt. Die komplette Aminosäuresequenz der 13H10-schwere Ketten-variablen Region ist in SEQ ID NO: 21 aufgeführt.
Die Nuclein- und Aminosäuresequenzen der 13H10-leichte Kettenvariablen Region sind in SEQ ID NO: 13 aufgelistet. Die CDR-Aminosäuresequenzen von dieser Region sind in SEQ ID NOS: 18, 19 und 20 aufgeführt.
Wenn man die Redundanz des genetischen Codes mit in die Betrachtung einbezieht, können verschiedene codierende Sequenzen konstruiert werden, die die variablen schweren und leichten Ketten-Aminosäuresequenzen und CDR-Sequenzen codieren, wie auch funktionale Fragmente und Analoga davon, die sich die Antigenspezifität mit dem Donorantikörper teilen. Die isolierten Nucleinsäuresequenzen dieser Erfindung oder Fragmente davon, die die variablen Ketten-Peptidsequenzen oder CDRs codieren, können verwendet werden, um veränderte Antikörper zu erzeugen, z.B. chimäre oder humanisierte Antikörper oder andere genetisch manipulierte Antikörper dieser Erfindung, wenn sie operativ mit einem zweiten Immunglobulinpartner kombiniert werden.
Es sollte festgehalten werden, dass zusätzlich zu den isolierten Nucleinsäuresequenzen, die Teile der veränderten Antikörper oder des Antikörpers, wie hier beschrieben, codieren, andere solche Nucleinsäuresequenzen beschrieben werden, wie z.B. diejenigen, die zu den nativen CDR-codierenden Sequenzen komplementär sind, oder die zu den modifizierten menschlichen Frameworkregionen komplementär sind, die die CDR-codierenden Regionen umgeben. Nützliche DNA-Sequenzen beinhalten diejenigen Sequenzen, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit den DNA-Sequenzen hybridisieren. Siehe T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982), S. 387-389. Ein Beispiel einer solchen stringenten Hybridisierungsbedingung ist eine Hybridisierung bei 4XSSC bei 65°C, gefolgt von einem Waschen in 0,1XSSC bei 65°C für 1 Stunde. Alternativ ist eine beispielhafte stringente Hybridisierungsbedingung 50% Formamid, 4XSSC bei 42°C. Vorzugsweise haben diese hybridisierenden DNA-Sequenzen eine Länge von mindestens ungefähr 18 Nucleotiden, d.h. ungefähr die Größe einer CDR.
Veränderte Immunglobulinmoleküle können veränderte Antikörper codieren, die genetisch manipulierte Antikörper beinhalten, wie z.B. chimäre Antikörper und humanisierte Antikörper. Eine gewünschte veränderte Immunglobulin-codierende Region enthält CDR-codierende Regionen, die Peptide codieren, mit der Antigenspezifität eines Tie2-Rezeptor-Antikörpers, vorzugsweise eines hochaffinen agonistischen Antikörpers, wie z.B. durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt, inseriert in einen ersten Immunglobulinpartner, wie z.B. eine menschliche Framework- oder menschliche Immunglobulin-variable Region.
Vorzugsweise ist der erste Immunglobulinpartner operativ an einen zweiten Immunglobulinpartner gebunden. Der zweite Immunglobulinpartner ist oben definiert und kann eine Sequenz beinhalten, die eine zweite Antikörperregion von Interesse codiert, beispielsweise eine Fc-Region. Zweite Immunglobulinpartner können auch Sequenzen beinhalten, die ein anderes Immunglobulin codieren, an das die leichte- oder schwere Kettenkonstante Region im Gerüst oder durch eine Linkersequenz fusioniert ist. Genetisch manipulierte Antikörper, die gegen funktionale Fragmente oder Analoga des Tie2-Rezeptors gerichtet sind, können entworfen werden, um eine verstärkte Bindung an denselben Antikörper hervorzurufen.
Der zweite Immunglobulinpartner kann auch mit Effektormitteln, wie oben definiert, assoziiert sein, einschließlich nicht-proteinartigen Trägermolekülen, an die der zweite Immunglobulinpartner durch konventionelle Mittel operativ angebunden sein kann.
Die Fusion oder Bindung zwischen den zweiten Immunglobulinpartnern, z.B. Antikörpersequenzen, und dem Effektormittel kann durch jedes geeignete Mittel geschehen, z.B. durch konventionelle kovalente oder ionische Bindungen, Proteinfusionen oder heterobifunktionelle Vernetzungsmittel, z.B. Carbodiimid, Glutaraldehyd. Solche Techniken sind auf dem Gebiet bekannt und werden in konventionellen Chemie- und Biochemietexten beschrieben.
Zusätzlich können auch konventionelle Linkersequenzen, die einfach eine gewünschte Menge an Raum zwischen dem zweiten Immunglobulinpartner und dem Effektormittel bereitstellen, in der veränderten Immunglobulincodierenden Region konstruiert werden. Das Design solcher Linker ist dem Fachmann auf dem Gebiet wohl bekannt.
Zusätzlich können Signalsequenzen für die Moleküle der Erfindung durch Techniken modifiziert werden, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, um die Expression zu verstärken.
Ein bevorzugter veränderter Antikörper enthält eine variable schwere und/oder leichte Kettenpeptid- oder -proteinsequenz mit der Antigenspezifität des mAk 15B8 oder 13H10, z.B. die ν_H- und ν_L-Ketten. Noch ein weiterer gewünschter veränderter Antikörper ist durch die Aminosäuresequenz gekennzeichnet, enthaltend mindestens eine und vorzugsweise alle CDRs der variablen Region der schweren und/oder leichten Ketten der murinen Antikörpermoleküle 15B8 oder 13H10, wobei die verbleibenden Sequenzen von einer menschlichen Quelle abstammen, oder ein funktionales Fragment oder Analogon davon.
Weiterhin kann der Antikörper der Erfindung ein zusätzliches Mittel angebunden aufweisen. Zum Beispiel kann die Rekombinations-DNA-Technologie verwendet werden, um einen veränderten Antikörper der Offenbarung zu erzeugen, worin das Fc-Fragment oder die CH₂CH₃-Domäne eines kompletten Antikörpermoleküls durch ein Enzym oder durch ein anderes nachweisbares Molekül (d.h. einen Polypeptideffektor oder ein Reportermolekül) ersetzt wurde, unter der Voraussetzung, dass die dimeren Eigenschaften des vollständigen Antikörpermoleküls erhalten bleiben.
Der zweite Immunglobulinpartner kann auch operativ an ein Nicht-Immunglobulinpeptid, Protein oder Fragment davon, heterolog zu der CDR- enthaltenden Sequenz gebunden sein, mit einer Antigenspezifität für den Tie2-Rezeptor. Das resultierende Protein kann sowohl Antigenspezifitätsals auch Eigenschaften des Nicht-Immunglobulins bei der Expression ausüben. Die Fusionspartnereigenschaft kann beispielsweise eine funktioniale Eigenschaft sein, wie z.B. eine andere Bindungs- oder Rezeptordomäne oder eine therapeutische Eigenschaft, wenn der Fusionspartner selbst ein therapeutisches Protein ist oder zusätzliche antigene Eigenschaften.
Ein weiteres wünschenswertes Protein dieser Erfindung kann ein vollständiges Antikörpermolekül umfassen, mit Gesamtlängen-schweren und -leichten Ketten oder jedes diskrete Fragment davon, wie z.B. Fab- oder F(ab')₂-Fragmente, ein schweres Kettendimer oder irgendwelche minimalen rekombinanten Fragmente davon, wie z.B. Fν oder ein Einzelkettenantikörper (SCA) oder irgendein anderes Molekül mit derselben Spezifität, wie der gewähnte Donor mAk, z.B. 15B8 oder 13H10 mAk. Ein solches Protein kann in Form eines veränderten Antikörpers verwendet werden oder kann in unfusionierter Form verwendet werden.
Wenn der zweite Immunglobulinpartner von einem Antikörper abstammt, der sich von dem Donorantikörper unterscheidet, z.B. irgendein Isotyp oder eine Klasse von Immunglobulin-Framework- oder konstanten Bereichen, ergibt sich ein genetisch manipulierter Antikörper. Genetisch manipulierte Antikörper können konstante Immunglobulinregionen und variable Frameworkregionen von einer Quelle, z.B. dem Akzeptorantikörper umfassen und ein oder mehr (vorzugsweise alle) CDRs von dem Donorantikörper, z.B. dem 15B8 oder 13H10 mAk. Zusätzlich können Veränderungen, z.B. Deletionen, Substitutionen oder Additionen der Akzeptor mAk-leichten und/oder -schweren variablen Domänen-Frameworkregion auf dem Nucleinsäure- oder Aminosäureniveau oder in den Donor-CDR-Regionen durchgeführt werden, um die Donorantikörper-Antigenspezifität zu erhalten.
Solche genetisch manipulierten Antikörper sind so entworfen, dass sie eine (oder beide) der variablen schweren und/oder leichten Ketten des Tie2-Rezeptors mAk verwenden (optional wie oben beschrieben modifiziert) oder ein oder mehr der schweren oder leichten Ketten-CDRs. Die genetisch manipulierten Antikörper der Erfindung haben eine agonistische Aktivität.
Solche genetisch manipulierten Antikörper können einen humanisierten Antikörper beinhalten, enthaltend die Frameworkregionen eines gewählten menschlichen Immunglobulins oder Subtyps oder einen chimären Antikörper, enthaltend die menschlichen schweren und leichten Ketten-konstanten Regionen, fusioniert mit den Tie2-Rezeptor mAk-funtionalen Fragmenten. Ein geeigneter menschlicher (oder anderer tierischer) Akzeptorantikörper kann einer sein, der aus einer konventionellen Datenbank gewählt wurde, z.B. der KABAT^®-Datenbank, der Los Alamos-Datenbank und der Swiss Protein-Datenbank, durch Homologie mit den Nucleotid- und Aminosäuresequenzen des Donorantikörpers. Ein menschlicher Antikörper, der durch eine Homologie mit dem V-Region-Framework des Donorantikörpers oder den V-Region-Subfamilien-Consensus-Sequenzen (auf einer Aminosäurebasis) gekennzeichnet ist, kann geeignet sein, um eine schwere Ketten-variable Frameworkregion für die Insertion der Donor-CDRs bereitzustellen. Ein geeigneter Akzeptor-Antikörper, der leichte Ketten-variable Framework-Regionen beitragen kann, kann auf ähnliche Weise gewählt werden. Es sollte festgehalten werden, dass die Akzeptorantikörper-schweren und -leichten Ketten nicht notwendigerweise von demselben Akzeptorantikörper abstammen müssen.
Vorzugsweise werden die heterologen Framework- und konstanten Regionen von menschlichen Immunglobulinklassen und Isotypen gewählt, wie z.B. IgG (Subtypen 1 bis 4) IgM, IgA, und IgE. IgG1, k und IgG4, k werden bevorzugt. Besonders bevorzugt wird IgG 4, k. Noch besonders bevorzugter wird die IgG4-Subtypvariante, die die Mutationen S228P und L235E (PE-Mutation) in der schweren Ketten-konstanten Region enthält, die zu einer reduzierten Effektorfunktion führt. Diese IgG4-Subtypvariante ist hier als IgG4PE bekannt. Siehe US-Patente Nrn. 5,624,821 and 5,648,260.
Der Akzeptorantikörper muss nicht nur menschliche Immunglobulinproteinsequenzen umfassen. Beispielsweise kann ein Gen konstruiert werden, worin eine DNA-Sequenz, codierend einen Teil einer menschlichen Immunglobulinkette, mit einer DNA-Sequenz fusioniert ist, die eine Nicht-Immunglobulinaminosäuresequenz codiert, wie z.B. ein Polypeptideffektor oder Reportermolekül.
Ein besonders bevorzugter humanisierter Antikörper enthält CDRs von 15B8 oder 13H10 mAk, inseriert in die Frameworkregionen einer gewählten menschlichen Antikörpersequenz. Für agonistische humanisierte Antikörper werden 1, 2 oder vorzugsweise 3 CDRs von den 15B8- oder 13H10-Antikörperschweren Ketten und/oder -leichten Ketten-variablen Regionen in die Frameworkregionen der gewählten menschlichen Antikörpersequenz inseriert und ersetzen die nativen CDRs des menschlichen Antikörpers.
Vorzugsweise wurden in dem humanisierten Antikörper die variablen Domänen in beiden menschlichen schweren und leichten Ketten durch ein mehr CDR-Ersatzstücke genetisch manipuliert. Es ist möglich, alle sechs CDRs zu verwenden oder verschiedene Kombinationen von weniger als den sechs CDRs.
Vorzugsweise werden alle sechs CDRs ersetzt. Es ist möglich, die CDRs nur in der menschlichen schweren Kette zu ersetzen, wobei als leichte Kette die unmodifizierte leichte Kette von dem menschlichen Akzeptorantikörper verwendet wird. In einer alternativen Form kann eine kompatible leichte Kette von einem anderen menschlichen Antikörper durch Rückgriff auf eine konventionelle Antikörperdatenbank gewählt werden. Der Rest des genetisch manipulierten Antikörpers kann von jedem geeigneten Akzeptor menschlichen Immunglobulin abstammen.
Der genetisch manipulierte humanisierte Antikörper hat so vorzugsweise die Struktur eines natürlichen menschlichen Antikörpers oder eines Fragments davon und besitzt die Kombination der Eigenschaften, die für eine effektive therapeutische Verwendung benötigt werden, z.B. die Behandlung von ischämischen Erkrankungen, wie z.B. Myokardinfarkt oder Gehirnschlag oder die Behandlung von vaskulären Insuffizienzerkrankungen, wie dem Diabetes.
Der Fachmann auf dem Gebiet wird verstehen, dass ein genetisch manipulierter Antikörper weiter durch Veränderungen der variablen Domänenaminosäure modifiziert werden kann, ohne dass notwendigerweise Spezifität und hohe Affinität des Donorantikörpers beeinflusst werden (z.B. ein Analogon). Es wird vorhergesagt, dass schwere und leichte Ketten-Aminosäuren durch andere Aminosäuren ersetzt werden können, entweder in den variablen Domänen-Frameworks oder CDRs oder beiden. Diese Substitutionen können von dem Donorantikörper zur Verfügung gestellt werden oder Consensus-Sequenzen von einer bestimmten Subgruppe.
Zusätzlich kann die konstante Region verändert werden, um die selektiven Eigenschaften der Moleküle dieser Erfindung zu verstärken oder zu vermindern. Beispielsweise durch Dimerisierung, Bindung an Fc-Rezeptoren oder die Fähigkeit, Komplement zu binden oder zu aktivieren (siehe z.B. Angal et al., Mol. Immunol., 30,105-108 (1993), Xu et al., J. Biol. Chem., 269,3469-3474 (1994), Winter et al., EP 0 307 434 B ).
Ein veränderter Antikörper, der ein chimärer Antikörper ist, unterscheidet sich von den oben beschriebenen humanisierten Antikörpern durch Bereitstellung der gesamten, nicht-menschlichen Donorantikörperschweren und -leichten Ketten-variablen Regionen, einschließlich Frameworkregionen in Assoziation mit menschlichen Immunglobulin-konstanten Regionen für beide Ketten. Es wird vorhergesagt, dass chimäre Antikörper, die sich zusätzliche nicht-menschliche Sequenzen relativ zu dem humanisierten Antikörpern dieser Offenbarung erhalten, eine signifikante erythropoetische Reaktion beim Menschen hervorrufen können. Solche Antikörper sind für die Prävention und die Behandlung von ischämischen Erkrankungen, wie z.B. Myokardinfarkt oder Gehirnschlag, oder die Behandlung vaskulärer Insuffienzerkrankungen, wie Diabetes, nützlich.
Vorzugsweise werden die variablen leichten und/oder schweren Kettensequenzen und die CDRs der mAks 15B8 oder 13H10 oder anderer geeigneter Donor-mAks und ihre codierenden Nucleinsäuresequenzen für die Konstruktion veränderter Antikörper verwendet, vorzugsweise humanisierter Antikörper der Offenbarung, durch das folgende Verfahren. Dasselbe oder ähnliche Techniken können ebenfalls verwendet werden, um andere Ausführungsformen dieser Erfindung zu erzeugen.
Ein Hybridom, das einen gewählten Donor mAk erzeugt, z.B. den murinen Antikörper 15B8 oder 13H10, wird konventionell kloniert und die DNA seiner schweren und leichten Ketten-variablen Regionen, erhalten durch dem Fachmann auf dem Gebiet bekannte Verfahren, z.B. die in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) beschriebenen Verfahren erhalten. Die variablen schweren und leichten Regionen, enthaltend mindestens die CDR-codierenden Regionen und diejenigen Teile der Akzeptor mAk leichten und/oder schweren variablen Domän-Frameworkregionen, die benötigt werden, um die Donor-mAk-Bindungsspezifität zu erhalten, wie auch die verbleibenden Immunglobulin-abgeleiteten Teile der Antikörperkette, abstammend von einem menschlichen Immunglobulin, werden unter Verwendung von Polynucleotidprimern und einer reversen Transkriptase erhalten. Die CDR-codierenden Regionen werden unter Verwendung einer bekannten Datenbank und durch Vergleich mit anderen Antikörpern identifiziert.
Ein Maus/menschlicher chimärer Antikörper kann dann hergestellt und im Hinblick auf seine Bindungsfähigkeit untersucht werden. Ein solcher chimärer Antikörper enthält die gesamten, nicht-menschlichen Donorantikörper ν_H- und ν_L-Regionen, zusammen mit menschlichen Ig-konstanten Regionen für beide Ketten.
Homologe Frameworkregionen einer schweren Ketten-variablen Region von einem menschlichen Antikörper werden unter Verwendung computerisierter Datenbanken, z.B. KABAT^®, identifiziert, und ein menschlicher Antikörper, gekennzeichnet durch eine Homologie mit den V-Region-Frameworks des Donorantikörpers oder V-Region-Subfamilien-Consensussequenzen (auf einer Aminosäurebasis) mit 15B8 oder 13H10 wird als Akzeptor-Antikörper gewählt. Die Sequenzen der synthetischen schweren Ketten-variablen Regionen, enthaltend die CDR-codierenden Regionen in den menschlichen Antikörper-Frameworks werden mit optionalen Nucleotidersatzstücken in den Framework-Regionen entworfen, um Restriktionsstellen einzubauen. Diese entworfene Sequenz wird dann unter Verwendung langer synthetischer Oligomere synthetisiert. Alternativ kann die entworfene Sequenz durch überlappende Oligonucleotide synthetisiert werden, amplifiziert durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) und im Hinblick auf Fehler korrigiert werden. Eine geeignete leichte Ketten-variable Framework-Region kann auf ähnliche Weise entworfen werden.
Ein humanisierter Antikörper kann von dem chimären Antikörper abgeleitet sein oder kann vorzugsweise durch Insertion der Donor-mAk-CDR-codierenden Regionen von den schweren und leichten Ketten in geeigneter Weise in dem gewählten schwere und leichte Ketten-Framework synthetisch hergestellt werden. Alternativ kann ein humanisierter Antikörper dieser Offenbarung unter Verwendung von Standardmutagenese-Techniken hergestellt werden. So enthält der resultierende humanisierende Antikörper menschliche Framework-Regionen und Donor-mAk-CDR-codierende Regionen. Es kann eine darauffolgende Manipulation von Framework-Resten stattfinden. Der resultierende humanisierte Antikörper kann in rekombinanten Wirtszellen, z.B. COS, CHO oder Myelomzellen exprimiert werden.
Ein konventioneller Expressionsvektor oder ein rekombinantes Plasmid wird erzeugt, indem diese codierenden Sequenzen für den veränderten Antikörper in operative Assoziation mit konventionellen regulatorischen Kontrollsequenzen platziert wird, die die Replikation und Expression in und/oder Sekretion aus einer Wirtszelle kontrollieren können. Regulatorische Sequenzen beinhalten Promotorsequenzen, z.B. CMV oder den Rous Sarcoma-Viruspromotor und Signalsequenzen, die von anderen bekannten Antikörpern abgeleitet sein können. Auf ähnliche Weise kann ein zweiter Expressionsvektor erzeugt werden, der eine DNA-Sequenz aufweist, die eine komplementäre Antikörper-leichte oder schwere Kette codiert. Vorzugsweise ist dieser zweite Expressionsvektor zum ersten identisch, außer im Hinblick auf die codierenden Sequenzen und selektierbare Marker, um so weit wie möglich sicherzustellen, dass jede Polypeptidkette funktional exprimiert wird. Alternativ können die schweren und leichten Ketten-codierenden Sequenzen für den veränderten Antikörper auf einem einzelnen Vektor vorliegen.
Eine gewählte Wirtszelle wird durch konventionelle Techniken mit sowohl den ersten als auch zweiten Vektoren co-transfiziert (oder einfach durch einen einzelnen Vektor transfiziert), um die transfizierte Wirtszelle der Erfindung zu erzeugen, umfassend die rekombinanten oder synthetischen leichten und schweren Ketten. Die transfizierte Zelle wird dann durch konventionelle Techniken kultiviert, um den genetisch manipulierten Antikörper der Erfindung zu erzeugen. Der humanisierte Antikörper, der die Assoziation von sowohl der rekombinanten schweren Kette und/oder leichten Kette beinhaltet, wird aus der Kultur durch einen geeigneten Assay, wie z.B. ELISA oder RIA, einem Screening unterzogen. Ähnliche konventionelle Techniken können verwendet werden, um andere veränderte Antikörper und Moleküle dieser Offenbarung zu konstruieren.
Geeignete Vektoren für die Klonierungs- und Subklonierungsschritte, die in den Verfahren und der Konstruktion der Zusammensetzungen dieser Erfindung verwendet werden, können durch den Fachmann gewählt werden. Beispielsweise kann die pUC-Serie von Klonierungsvektoren, wie z.B. pUC19, der von Firmen, wie z.B. Amersham oder Pharmacia, kommerziell erhältlich ist, verwendet werden. Zusätzlich kann jeder Vektor, der einfach replizierbar ist und einen Überschuss an Klonierungsstellen und selektieren Genen aufweist (z.B. Antibiotikaresistenz) und einfach manipuliert werden kann, für das Klonieren verwendet werden. So ist die Selektion des Klonierungsvektors nicht ein limitierender Faktor dieser Erfindung.
Auf ähnliche Weise können die für die Expression der genetisch manipulierten Antikörper gemäß dieser Erfindung verwendeten Vektoren durch einen Fachmann auf diesem Gebiet aus den konventionellen Vektoren gewählt werden. Die Vektoren enthalten auch gewählte regulatorische Sequenzen (wie z.B. CMV oder Rous Sarcoma-Viruspromotoren), die die Replikation und Expression heterologer DNA-Sequenzen in gewählten Wirtszellen dirigieren. Diese Vektoren enthalten die oben beschriebenen DNA-Sequenzen, die den genetisch manipulierten Antikörper oder die veränderte Immunglobulincodierende Region codieren. Zusätzlich können die Vektoren die gewählten Immunglobulinsequenzen inkorporieren, modifiziert durch Insertion gewünschter Restriktionsstellen für die einfache Manipulation.
Die Expressionsvektoren können auch durch Gene gekennzeichnet sein, die für eine Amplifikation der Expression der heterologen DNA-Sequenzen geeignet sind, z.B. das Säuger-Dihydrofolatreduktasegen (DHFR). Andere bevorzugte Vektorsequenzen beinhalten eine Poly-A-Signalsequenz, wie z.B. von dem Rinderwachstumshormon (BGH) und der β-Globinpromotorsequenz (betaglopro). Die hier nützlichen Expressionsvektoren können durch Techniken synthetisiert werden, die dem Fachmann auf dem Gebiet wohl bekannt sind.
Die Komponenten solcher Vektoren, z.B. Replikons, Selektionsgene, Enhancer, Promotoren, Signalsequenzen können von kommerziellen oder natürlichen Quellen erhalten werden oder durch bekannte Verfahren synthetisiert werden, zur Verwendung bei der Steuerung der Expression und/oder Sekretion des Produkts der rekombinanten DNA in einem gewählten Wirt. Andere geeignete Expressionsvektoren, von denen vielzählige Arten auf dem Gebiet für die Expression in Säugern, Bakterien, Insekten, Hefen und Pilzen bekannt sind, können für diesen Zweck ebenfalls gewählt werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch eine Zelllinie, transfiziert mit einem rekombinanten Plasmid, enthaltend die codierenden Sequenzen der genetisch manipulierten Antikörper, wie in Anspruch 1 definiert. Für die Klonierung nützliche Wirtszellen und andere Manipulationen dieser Klonierungsvektoren sind ebenfalls konventionell. Besonders wünschenswert werden jedoch Zellen von verschiedenen Stämmen von E. coli für die Replikation der Klonierungsvektoren und andere Schritte bei der Konstruktion der genetisch veränderten Antikörper dieser Erfindung verwendet.
Geeignete Wirtszellen oder Zelllinien für die Expression des genetisch manipulierten Antikörpers oder veränderten Antikörpers der Erfindung sind vorzugsweise Säugerzellen, wie z.B. CHO, COS, eine Fibroblastenzellen (z.B. 3T3) und Myeloidzellen, und bevorzugter eine CHO- oder eine Myeloidzelle. Menschliche Zellen können verwendet werden, was es dem Molekül ermöglicht, mit menschlichen Glycosylierungsmustern modifiziert zu werden. Alternativ können andere eukaryontische Zelllinien verwendet werden. Die Selektion geeigneter Säugerwirtszellen und Verfahren für die Transformation, Kultur, Amplifikation, das Screening und die Produktproduktion und Reinigung sind auf dem Gebiet bekannt. Siehe z.B. Sambrook et al., supra.
Bakterielle Zellen können sich als Wirtszellen nützlich erwiesen, die für die Expression der rekombinanten Fabs der vorliegenden Erfindung geeignet sind (siehe z.B. Plückthun, A., Immunol. Rev., 130,151-188 (1992)). Aufgrund der Tendenz der Proteine, die in bakteriellen Zellen exprimiert werden, in nicht gefalteter oder ungenügend gefalteter Form oder in nicht glycosylierter Form vorzulegen, müsste jedoch jedes rekombinante Fab, das in einer bakteriellen Zelle erzeugt wurde, im Hinblick auf den Beibehalt der Antigenbindungsfähigkeit einem Screening unterworfen werden.
Wenn das durch die bakterielle Zelle exprimierte Molekül in geeignet gefalteter Form erzeugt wurde, würde die bakterielle Zelle ein wünschenswerter Wirt sein. Beispielsweise sind verschiedene Stämme von E. coli, die für die Expression verwendet werden, als Wirtszellen auf dem Gebiet der Biotechnologie wohl bekannt. Verschiedene Stämme von B. subtilis, Streptomyces, andere Bazillen, können ebenfalls verwendet werden.
Falls gewünscht, sind auch Stämme von Hefezellen, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, als Wirtszellen verfügbar, wie auch Insektenzellen, z.B. Drosophila und Lepidoptera, und virale Expressionssysteme. Siehe z.B. Miller et al., Genetic Engineering, 8,277-298, Plenum Press (1986) und darin zitierte Referenzen.
Die allgemeinen Verfahren, durch die die Vektoren der Offenbarung konstruiert werden können, die Transfektionsverfahren, die benötigt werden, um die Wirtszellen der Erfindung zu erzeugen und die Kultivierungsverfahren, die notwendig sind, um den veränderten Antikörper der Erfindung aus einer solchen Wirtszelle zu erzeugen, sind alles konventionelle Techniken. Auf ähnliche Weise können die veränderten Antikörper der Erfindung, sobald sie erzeugt sind, aus dem Zellkulturinhalt gemäß Standardverfahren auf dem Gebiet gereinigt werden, einschließlich einer Ammoniumsulfatpräzipitation, Affinitätssäulen, Säulenchromatographie und Gelelektrophorese. Solche Techniken liegen in dem Wissen auf dem Gebiet und begrenzen diese Erfindung nicht.
Noch ein weiteres Verfahren zur Expression der humanisierten Antikörper kann die Expression in einem transgenen Tier verwenden, wie z.B. im US-Patent Nr. 4,873,316 beschrieben. Dies betrifft ein Expressionssystem unter Verwendung des tierischen Caseinpromotors, der, wenn er transgen in einen Säuger inkorporiert wird, es dem Weibchen ermöglicht, das gewünschte rekombinante Protein in der Milch zu erzeugen.
Sobald der genetisch manipulierte Antikörper durch das gewünschte Verfahren exprimiert wurde, wird er dann im Hinblick auf seine in vitro-Aktivität durch Verwendung eines geeigneten Assays hin untersucht. Gegenwärtig wird eine Oberflächenplasmonresonanz verwendet, um die qualitative und quantitative Bindung des genetisch manipulierten Antikörpers an den Tie2-Rezeptor zu untersuchen. Zusätzlich können auch andere in vitro-Assays, wie z.B. das Matrigel-Vaskularisierungsmodell verwendet werden, um die agonistische Aktivität zu bestimmen, bevor darauffolgend menschliche klinische Studien durchgeführt werden, um die Persistenz des genetisch manipulierten Antikörpers im Körper zu bewerten, trotz dem üblichen Clearance-Mechanismus.
Folgend den für die humanisierten Antikörper beschriebenen Verfahren, die aus 15B8 oder 13H10 hergestellt wurden, kann ein Fachmann auf dem Gebiet auch humanisierte Antikörper von anderen Donorantikörpern konstruieren, wie auch variable Regionsequenzen und CDR-Peptide, wie hier beschrieben. Genetisch manipulierte Antikörper können mit variablen Region-Frameworks erzeugt werden, die potenziell als "selbst" von den Empfängern des genetisch manipulierten Antikörpers erkannt werden. Modifikationen an den variablen Regionframeworks können implementiert werden, um Anstiege der Antigenbindungs- und agonistischen Aktivität zu bewirken, ohne eine deutlich erhöhte Immunogenizität für den Empfänger. Solche genetisch manipulierten Antikörper können effektiv einen Menschen im Hinblick auf ischämische Erkrankungen, wie z.B. Myokardinfarkt oder Gehirnschlag, behandeln oder für die Behandlung von vaskulärer Insuffienzerkrankung, wie z.B. Diabetes, geeignet sein. Solche Antikörper können auch bei der Diagnose dieser Zustände nützlich sein.
Diese Offenbarung betrifft auch ein Verfahren zur Verstärkung der Angiogenese bei einem Säuger, insbesondere einem Menschen, das die Verabreichung einer effektiven Dosis eines Tie2-Rezeptor-monoklonalen Antikörpers mit agonistischer Aktivität umfasst. Der mAk kann ein oder mehr der genetisch manipulierten Antikörper oder der veränderten Antikörper, wie hier beschrieben, oder Fragmente davon beinhalten.
Die durch die Verwendung der Moleküle dieser Erfindung induzierte therapeutische Reaktion wird durch die Bindung an den Tie2-Rezeptor und die darauf folgende agonistische Aktivität des angiogenen Verfahrens erzeugt. So sind die Moleküle der vorliegenden Erfindung, wenn sie in Präparationen und Formulierungen vorliegen, die für die therapeutische Verwendung geeignet sind, für Personen hoch wünschenswert, die für ischämische Erkrankungen, wie z.B. einen Myokardinfarkt oder einen Gehirnschlag, oder vaskuläre Insuffienzerkrankungen, wie z.B. Diabetes, empfänglich sind oder bereits an diesen leiden.
Diese Offenbarung betrifft auch ein Verfahren zur Erhöhung des Endothelzellenüberlebens bei einem Säuger, umfassend die Verabreichung einer effektiven Dosis eines Tie2-Rezeptor-agonistischen Antikörpers.
Diese Offenbarung betrifft auch ein Verfahren zur Erhöhung der hämatopoetischen oder Megakaryozytenzellproliferation bei einem Säuger, umfassend die Verabreichung einer effektiven Dosis eines Tie2-Rezeptor- agonisten-Antikörpers. Der in den Verfahren der Offenbarung verwendete mAk kann ein oder mehr der Antikörper oder veränderten Antikörper, wie hier beschrieben, oder Fragmente davon, beinhalten. Vorzugsweise hat der Tie2-Rezeptor-agonistische Antikörper, der in den Verfahren der Offenbarung verwendet wird, die identifizierenden Kennzeichen des mAk 15B8 oder 13H10.
Die veränderten Antikörper, Antikörper und Fragmente davon können auch zusammen mit anderen Antikörpern verwendet werden, insbesondere menschlichen mAks, die mit anderen Markern (Epitopen) reaktiv sind, die für den Zustand verantwortlich sind, gegen den sich der genetisch manipulierte Antikörper der Erfindung richtet.
Agonistische Antikörper gegen den Tie2-Rezeptor würden dieselbe therapeutische Nützlichkeit wie der natürliche Ligand aufweisen, würden jedoch den Vorteil einer längeren Halblebenszeit und daher einer verlängerten Aktivität in vivo aufweisen. Diese Agonisten können so verwendet werden, um die biologische Kaskade zu aktivieren, die sich aus der Rezeptor/Liganden-Bindung ergibt. Die Vorteile der Tie2-Rezeptor-agonistischen Antikörper beinhalten die Fähigkeit, niedrigere Dosierungen des Antikörpers als Ligand zu verabreichen, einer einfacheren und weniger häufigen Verabreichung eines Pharmazeutikums, basierend auf dem agonistischen Antikörper, wie auch einer einfacheren Reinigung.
Die Tie2-Rezeptor-agonistischen Antikörper der Erfindung können in pharmazeutische Zusammensetzungen formuliert werden und auf dieselbe Weise wie für reife Proteine beschrieben verabreicht werden. Siehe z.B. Internationale Patentanmeldung, Veröffentlichungs-Nr. WO 90/02762 (22. März 1990). Allgemein enthalten diese Zusammensetzungen eine therapeutisch wirksame Menge eines agonistischen Antikörpers dieser Erfindung und einen annehmbaren pharmazeutischen Träger. Geeignete Träger sind dem Fachmann auf dem Gebiet wohl bekannt und beinhalten beispielsweise Salzlösung. Alternativ können solche Zusammensetzungen konventionelle Zufuhrsysteme beinhalten, in die das Protein der Erfindung inkorporiert ist. Optional können diese Zusammensetzungen andere Wirkstoffe enthalten.
Die Therapeutika dieser Erfindung können durch jeden geeigneten internen Weg verabreicht werden und können falls nötig wiederholt werden, z.B. so häufig wie 1- bis 3-mal täglich für 1 Tag bis ungefähr 3 Wochen bis einmal pro Woche oder einmal alle 2 Wochen. Vorzugsweise wird der agonistische Antikörper weniger häufig als der Ligand verabreicht, wenn er therapeutisch verwendet wird. Dosis und Dauer der Behandlung beziehen sich auf relative Verbleibszeit der Moleküle der vorliegenden Erfindung in der menschlichen Zirkulation und können durch einen Fachmann auf dem Gebiet, abhängig von dem zu behandelnden Zustand und dem allgemeinen Gesundheitszustand des Patienten eingestellt werden.
Wie hier verwendet, beinhaltet die Bezeichnung "pharmazeutisch" veterinärmedizinische Anwendungen der Erfindung. Die Bezeichnung "therapeutisch effektive Menge" bezieht sich auf diejenige Menge eines Rezeptor-agonistischen Antikörpers, die für die Abschwächung eines gewählten Zustandes nützlich ist. Diese therapeutischen Zusammensetzungen der Erfindung können verabreicht werden, um die Wirkung des normalen Rezeptorliganden nachzuahmen.
Die Verabreichungsweise des Therapeutikums der Erfindung kann jeder geeignete Weg sein, der das Mittel dem Wirt zuführt. Die veränderten Antikörper, Antikörper, genetisch manipulierten Antikörper und Fragmente davon und pharmazeutische Zusammensetzungen der Erfindung sind insbesondere für die parenterale Verabreichung, d.h. subkutan, intramuskulär, intravenös oder intranasal geeignet.
Therapeutika der Erfindung können als pharmazeutische Zusammensetzungen hergestellt werden, die eine effektive Menge des genetisch manipulierten (z.B. humanisierten) Antikörpers der Erfindung als Wirkstoff in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger enthalten. In den Zusammensetzungen der Erfindung wird eine wässrige Suspension oder Lösung, enthaltend den genetisch manipulierten Antikörper, vorzugsweise auf einen physiologischen pH gepuffert, in einer für die Injektion fertigen Form, bevorzugt. Die Zusammensetzungen für die parenterale Verabreichung werden üblicherweise eine Lösung des genetisch manipulierten Antikörpers der Erfindung oder einen Cocktail davon umfassen, gelöst in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, vorzugsweise einem wässrigen Träger. Eine Vielzahl von wässrigen Trägern kann verwendet werden, z.B. 0,4% Salzlösung, 0,3% Glycin und ähnliche. Diese Lösungen sind steril und allgemein frei von partikulären Stoffen. Diese Lösungen können durch konventionell wohl bekannte Sterilisationstechniken (z.B. Filtration) sterilisiert werden. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch annehmbare Hilfssubstanzen enthalten, die benötigt werden können, um sich an physiologische Bedingungen anzunähern, wie z.B. pH-Einstellungs- und Puffermittel usw. Die Konzentration des erfindungsgemäßen Antikörpers in einer solchen pharmazeutischen Formulierung kann breit variieren, d.h. von weniger als 0,5%, in der Regel bei oder mindestens ungefähr 1% bis so viel wie 15 oder 20 Gew.-% und wird im wesentlichen basierend auf Flüssigkeitsvolumina, Viskositäten usw. gemäß der bestimmten gewählten Verabreichungsweise gewählt werden.
So könnte eine pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung für die intramuskuläre Injektion so hergestellt werden, dass sie 1 ml steriles gepuffertes Wasser und ungefähr 1 ng bis ungefähr 100 mg, z.B. ungefähr 50 ng bis ungefähr 30 mg oder noch bevorzugter ungefähr 5 mg bis ungefähr 25 mg eines genetisch manipulierten Antikörpers der Erfindung enthält. Auf ähnliche Weise könnte eine pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung für die intravenöse Infusion hergestellt werden, um ungefähr 250 ml sterile Ringer-Lösung und ungefähr 1 mg bis ungefähr 30 mg und vorzugsweise 5 mg bis ungefähr 25 mg eines genetisch manipulierten Antikörpers der Erfindung zu enthalten. Aktuelle Verfahren zur Herstellung parenteral verabreichter Zusammensetzungen sind wohl bekannt oder werden dem Fachmann auf dem Gebiet einleuchten und werden im Detail in beispielsweise "Remington's Pharmaceutical Science", 15. Ausgabe, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania beschrieben.
Es wird bevorzugt, dass das Therapeutikum der Erfindung, wenn es in einer pharmazeutischen Präparation vorliegt, in Einheitsdosisformen präsentiert wird. Die geeignete therapeutisch effektive Dosis kann einfach durch den Fachmann auf dem Gebiet bestimmt werden. Um eine Anämie bei einem Menschen oder einem anderen Tier effektiv zu behandeln, sollte eine Dosis von ungefähr 0,01 mg bis ungefähr 20 mg pro kg Körpergewicht eines Proteins oder eines Antikörpers dieser Erfindung parenteral, vorzugsweise i.v. oder i.m. verabreicht werden. Eine solche Dosis kann, falls nötig, in geeigneten Zeitintervallen wiederholt werden, die je nach Bedarf durch den behandelnden Arzt während der Reaktionsperiode gewählt werden.
Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden spezifischen nicht begrenzenden Beispiele beschrieben.
Beispiel 1
Präparation und Screening von Tie2-agonistischen monoklonalen Antikörpern
Mäuse (F1-Hybride von Balb/c und C57BL/6) wurden subkutan mit einer rekombinaten Tie2-extrazellulären Domänen-Fc-Fusion in RIBI-Adjuvans immunisiert und mit derselben einer Boosterbehandlung unterzogen. Alternativ wurden die Mäuse unter Verwendung von Tie2-Rezeptor-Fc-Fusions-DNA immunisiert und mit Proteinen in RIBI-Adjuvans einer Booster-Behandlung unterzogen. Eine Splenektomie wurde 3 bis 4 Tage, folgend auf die endgültige Immunisierung durchgeführt. Mausmilzzellen wurden verwendet, um Hybridome durch Standardverfahren zu erzeugen (Zola, H., Hrsg., Monoclonal Antibodies, CRC Press Inc. (1987)). Positive Hybridome wurden durch das limitierende Verdünnungsverfahren kloniert.
Immunassay
Um die Spezifität der erzeugten anti-Tie2-mAks zu bestimmen, wurden Platten mit 96 Vertiefungen mit Tie2-Fc beschichtet und blockiert. Alle folgenden Inkubationen wurden in einem Schüttlerinkubator bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach Waschen der Vertiefungen wurden Tie2-Fc oder Assaypuffer und mAk/Hybridom-Überstände in Gegenwart von 20 μg/ml menschlichen IgG1 (zum Eliminieren von anti-Fc mAks) hinzugefügt und 60 min inkubiert. Nach einem Waschen der Vertiefungen wurde Eu³⁺-markierter anti-Maus-Antikörper in Assaypuffer 60 min zugefügt, die Vertiefungen gewaschen und dann wurde Enhancer (Wallac) zugefügt, und es wurde 5 min bei Raumtemperatur inkubiert und die Fluoreszenz gemessen. Alle positiven Hybridome zeigten eine Bindung an Tie2.
Selektion von Antikörpern durch BIAcore-Bindungseigenschaften
BIAcore^TM wurde verwendet, um Hybridome und primäre Klone zu selektieren, die an die externe Domäne des Wildtyp Tie2-Rezeptors binden. Die Antikörper wurden im Hinblick auf ihre Fähigkeit, eine Bindung an Tie2-Fc einzugehen durch eine Oberflächenplasmonresonanz unter Verwendung eines BIAcore-Instruments bewertet. Kaninchen-anti-Maus-IgG-Fc-spezischer Antikörper wurde auf einer Sensorchip-Oberfläche immobilisiert und mAk wurde injiziert, die Brechungsindexeinheiten (RU; die RU sind ein direktes Maß der Menge von jedem Protein, das binden kann) aufgezeichnet, gefolgt von Injektionen von Tie2-Fc oder IgG, und die RU aufgezeichnet. Die Oberfläche wurde mit einer Injektion von 15 μl 0,1 M Phosphorsäure regeneriert. Das Obige wurde auf einer Ziegen-anti-menschlichen-IgG-Fc-spezifischen Sensorchip-Oberfläche wiederholt, d.h. eine sequenzielle Zugabe von Tie2-Fc oder IgG und monoklonalem Antikörper. Zwei Hybridomüberstände zeigten die Gegenwart von hochaffinen Antikörpern. Die Hybridomzelllinien und erzeugten Antikörper wurden als 15B8 und 13H10 bezeichnet.
Reinigung von Mabs
Die monoklonalen Antikörper 15B8 und 13H10 wurden durch eine Protein-A-Chromatographie nach den Anweisungen des Herstellers aus den gewählten Hybridomüberständen gereinigt. Die Mabs waren in SDS-PAGE > 95% rein.
Affinitätsmessungen des monoklonalen Antikörpers
Die Affinität der gereinigten mAks wurde in dem BIAcore^TM gemessen. Unter Verwendung einer Flussrate von 10 μl/min wurde der mAk (verdünnt in HBS-Puffer) über eine Kaninchen-anti-Maus-IgG-Fc-Oberfläche injiziert, gefolgt von einem Pufferfluss, und die RU aufgezeichnet. Tie2-Fc, verdünnt in HBS-Puffer wurde dann für 120 Sekunden injiziert, gefolgt von einem Pufferfluss für 240 Sekunden und einer Regeneration der Sensorchipoberfläche mit einer Injektion von 15 μl 0,1 M Phosphorsäure. Die BIAcore^TM-Software wurde für eine Assoziations- und Dissoziationsphasenanalyse verwendet. Die murinen monoklonalen Antikörper banden an den löslichen monomeren Tie2-Rezeptor. Die on-Raten (k_ass) und off-Raten (k_diss) wurden berechnet. Zusammengefasst ergeben diese eine berechnete Gleichgewichtskonstante (K_D) von 0,24 nM for mAk 15B8 und 3,1 nM für mAk 13H10.
Beispiel 2
Funktionales Screening von Tie2-agonistischen monoklonalen Antikörpern Gesamtzellaktivitäts-Assays für den Tie2-Rezeptor
HEL-Zellen (ATCC # TIB180) werden mit 1 bis 5 × 10⁵ ml RPMI-1640-Medium, supplementiert mit 2 mM Glutamin und 10% FBS als Suspensionskultur kultiviert. 16 bis 36 Stunden vor einem Experiment lässt man die notwendige Zahl von Zellen in 0,5% FBS/RPMI-Medium passieren. Am Tag eines Experiments werden die Zellen geerntet und mit einer Dichte von 0,5 bis 1,10 × 10⁷ Zellen pro ml in 0,5% FBS RPMI resuspendiert und mit 2-3 ml/Vertiefung in Platten mit sechs Vertiefungen ausgesät. Alternativ können menschliche Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) (Cell Systems – Kirkland, WA) für den Assay verwendet werden. HUVECs zwischen den Passagen 2 und 12 werden mit 2 × 10⁵ und 1 × 10⁶ Zellen pro Vertiefung in einer Platte mit 6 Vertiefungen in CS-C-Medium, supplementiert mit 10% Serum und Endothelzellwachstumsfaktor (Cell Systems) ausplattiert. Nach 24 Stunden werden die Medien zu CS-C-Medium, supplementiert nur mit 2% Serum, verändert, und die Zellen werden über Nacht kultiviert und für den Assay am folgenden Tag verwendet.
Die Zellen werden mit Liganden oder Antikörper in geeigneten Konzentrationen für 10 min behandelt (die exakte Zeit der Aussetzung und Konzentration des Liganden muss empirisch für die experimentellen Bedingungen bestimmt werden). Der Inhalt der Vertiefungen wird kurz auf einer Schüttelvorrichtung (ungefähr 30 Sekunden) vermischt und dann bei 37°C inkubiert. Für jedes Experiment lässt man geeignete Kontrollen laufen, so dass es mindestens 1 Kontrolle für jedes Gel gibt (z.B. für ein Zehnspuren-Gel wird es bis zu acht experimentelle Behandlungen, eine Kontrolle und eine Spur für Marker geben). Geeignete Kontrollen hängen von analysierten Aktivitäten ab. Für die agonistischen Wirkungen wird eine unbehandelte Kontrolle für einen Basislinienvergleich verwendet. Für Antagonisten und Inhibitoren der Phosphorylierung wird eine Kultur, stimuliert nur mit einem äquivalenten Agonisten (z.B. konditioniertes Medium von kultivierten rheumatoiden Fibroblasten) verwendet.
Nach Ende der 5 bis 15-minütigen Inkubationsperiode wird die Platte auf Eis platziert. HEL-Zellen werden mit einer Pipette geerntet. Die Medien von den HUVECs werden entfernt, durch kaltes PBS ersetzt und die Zellen mechanisch von der Plattenoberfläche durch einen "policeman" oder Zellschaber freigesetzt. Die Zellen werden bei 4°C abzentrifugiert und das Medium aspiriert. Das Zellpellet wird mit kaltem PBS gewaschen, wiederum zentrifugiert, der PBS-Überstand abgezogen und die Röhrchen/Zellpellets in einem Trockeneis/Ethanolbad eingetaucht. Das Zellpellet wird zu Eis entfernt, und man lässt es leicht auftauen. Das Pellet wird in 500 μl Lysepuffer (RIPA-Lysepuffer: 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1,0% NP-40, 0,5% Desoxycholat, 0,1% SDS + Inhibitoren: 1 mM Natriumorthovanadat, 1 mM Natriumfluorid, 1 mM EDTA + Proteaseinhibitoren, Sigma Säugerzellproteaseinhibitor-Cocktail (#P8340) oder einer Mischung aus PMSF, 1 mM Aprotinin und Leupeptin –10 μg/ml) resuspendiert. Die Suspension wird für 5 Pulse in einer Mediumaufbau ultraschallbehandelt und auf Eis zurückgebracht. Das Homogenat wird zentrifugiert, um nicht-lysierte Zellen zu entfernen, und die Überstände werden in Mikrozentrifugenröhrchen übertragen und auf Eis gehalten.
Der Phosphorylierungszustand des Tie2-Rezeptors wird durch Immunpräzipitation des Tie2-Rezeptors bestimmt, Isolation durch Elektrophorese und Nachweis durch anti-Phosphotyrosin Ak, wie unten im Detail dargestellt (Harlow, E., und Lane, D. P., Antibodies-a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York, 1988.). Ein alternativer Assay wurde durchgeführt, wobei der Antikörper gegen SH-PTP2 verwendet wurde, um Tie2-Rezeptoren auszufällen. Ungefähr 7 μg des Tie2-Antikörpers (TIE2 polyklonaler Antikörper, Santa Cruz, Biotechnology, Kat.# sc-324) werden jedem Lysat zugefügt, und jede Probe wird 1 Stunde mit Mischen bei 4°C inkubiert. 20 μl einer Protein A- oder Protein G-Agaroseaufschlämmung wurden zugefügt und die Proben für eine zusätzliche Stunde durch Mischen bei 4°C inkubiert. Die Agarose/Antikörperkomplexe werden 2 min bei 2.000 bis 5.000 U/min und 4°C in einer Mikrozentrifuge pelletisiert. Der Überstand wird vorsichtig aspiriert und das Pellet in 1 ml kaltem Lysepuffer resuspendiert und wieder zentrifugiert. Dieser Waschschritt wird für zusätzliche zwei Mal wiederholt. Nach der letzten Aspiration werden 40 μl 1XSDS-PAGE-Probenpuffer (Laemli) +2,5% 2-Mercaptoethanol zugefügt. Die Probe wird mit einem Vortex behandelt und 3 min gekocht. 30 μl lässt man auf einem 7,5% SDS/Polyacrylamidgel laufen. Das Gel wird dann auf Nitrocellulose oder eine PVDF-Membran nach den Anweisungen des Herstellers für den Western-Blot übertragen.
Die Blots werden mit PBS 0,05% Tween-20 gewaschen und dann mit 5% entfetteter Trockenmilch/PBS/Tween 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert. Die Blots werden dann mit 1 μg/ml anti-Phosphotyrosin-Antikörper (z.B. Santa Cruz Biotech #SC508 oder Upstate Biotech #05-321) in PBS/0,05% Tween für 1 Stunde inkubiert. Der Blot wird dann 4 Mal mit PBS/Tween jeweils 5 Minuten gewaschen.
Der Blot wird mit einem anti-Maus-HRP-Konjugat-sekundären Antikörper bei der vom Hersteller empfohlenen Verdünnung, in PBS/Tween für 1 Stunde inkubiert. Der Blot wird in PBS/Tween gewaschen, und zwar jeweils 4 Mal für 5 Minuten. Nach dem letzten Waschen wird der Blot durch das ECL-Verfahren (Amersham) oder ein äquivalentes Verfahren entwickelt.
Nach Erzeugung eines zufriedenstellenden Bildes wird der Blot in 0,05% Tween 20-PBS 5 Minuten gewaschen und dann wird der Antikörper unter Verwendung von 100 mM 2-Mercaptoethanol-2% SDS-62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8 für 30 Minuten bei 50°C mit gelegentlicher Bewegung ausgetrieben. Der Blot wird wiederum in 0,05% Tween 20-PBS gewaschen. Als Vorbereitung für eine zweiten Sondendurchsuchung werden die Blots mit 5% entfetteter Milch PBS/Tween 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert, dann mit 200 ng/ml anti-Tie2-Antikörper-3% entfetteter Milch PBS/Tween 1 Stunde inkubiert. Der Blot wird vier Mal mit PBS/Tween jeweils 5 Minuten gewaschen, dann mit einem anti-Kaninchen-HRP-Antikörperkonjugat inkubiert, nach den Anweisungen des Herstellers in PBS/Tween 1 Stunde verdünnt. Nachdem der Blot 4 Mal mit PBS/Tween für jeweils 5 Minuten gewaschen wurde, wird das Bild durch das ECL-Verfahren entwickelt.
Unter Verwendung eines Densitometers oder eines Graphik-Programms (z.G. ImageQuant – Molecular Dynamics) wird jeder Blot gescannt. Die Tie2-Bande wird isoliert und für jede Spur "boxed out". Das Pixelvolumen oder ein vergleichbarer Maßstab für jede Probe wird analysiert, für sowohl die Tie2-Färbung als auch die korrespondierende Phosphotyrosinfärbung. Außerdem wird ein geeigneter Hintergrundbereich derselben Dimensionen für jede Probe bestimmt. Nach Einstellung auf den Hintergrund wird die Phosphorylierung als Verhältnis der Phosphotyrosinfärbung relativ zu der korrespondierenden Tie2-Färbung der Probe ausgedrückt.
Die Ergebnisse zeigten an, dass der mAk 15B8 bei einer Konzentration von 50 μg/ml konsistent eine maximale Phosphorylierung induzierte, die mehr als 2-fach über der Grundlinie lag. Erkennbare Anstiege über den Grundzustand sind bis auf 1 μg/ml hinab erkennbar. Weiterhin war der mAk 15B8 dazu in der Lage, die Assoziation des Tie2-Rezeptors mit dem Signalprotein SH-PTP2 über einen Bereich von 1 μg/ml bis 50 μg/ml zu stimulieren.
Messung der Angiogenese, in vivo – Matrigel-Vaskularisierungsmodell
Die Angiogenese wird in vivo modelliert, indem ein extrazelluläres Matrixgel unter die Haut einer Maus für ungefähr 1 Woche platziert wird und dann etliche Maßnahmen ergriffen werden, um die angiogene Invasion des Gels zu quantifizieren (Biancone, L., et al., J. Exp. Med. 186: 147, 1997). Kurz gefasst ist das reduzierte Wachstumsfaktor Endotoxin-freie Matrigel (Becton-Dickinson, Bedford, MA) bei niedrigen Temperaturen ein Gel. Antikörper oder bekannte angiogene Mittel werden mit dem Gel vermischt, so dass sie nicht mehr als 2% des Gesamtvolumens ausmachen. Acht Wochen alten oder älteren weiblichen C57-Mäusen werden 0,5 ml des Matrigels durch dorsale subkutane Injektion durch gekühlte Spritzen verabreicht. Bei physiologischer Temperatur bildet das flüssige Matrigel schnell ein festes und kohäsives Gel. Nach 6 Tagen werden die Mäuse geopfert und Matrigelstopfen gewonnen. Die Angiogenese wird durch Analyse des Hämoglobingehalts des Gels durch das Verfahren von Drabkin (Drabkin, D.L. und Austin, J.H., J. Biol. Chem. 112:51, 1935) (Sigma, St. Louis, MO) oder durch Färbung oder Quantifizierung der Blutgefäße mit der CD31-Färbung quantifiziert.
Normalerweise bleibt das Matrigel im wesentlichen avaskulär. Wie jedoch in 1 dargestellt, stimulierte mAk 15B8 bei einer Konzentration von 100 μg/ml konsistent einen Anstieg der vaskulären Penetration um das 5- bis 8-Fache, gemessen durch einen Anstieg des Hämoglobingehalts des Gels. Weder ein hoch affiner, jedoch inaktiver mAk 11H10, noch der Antagonist mAk, 12H8, stimulierte bei derselben Konzentration die Angiogenese signifikant auf mehr als die Kontrolle. Bekannte positive Kontrollen, wie z.B. der Basische Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) und der Blutplättchen-Aktivierungsfaktor (PAF) induzieren die Angiogenese in diesen selben Experimenten.
Endothelzell-Überleben
Menschliche Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) (Cell Systems – Kirkland, WA) zwischen den Passagen 2 und 12, wurden mit Dichten zwischen 2 × 10⁵ und 1 × 10⁶ Zellen pro Vertiefung in einer Platte mit 6 Vertiefungen in einem CS-C-Medium (Cell Systems), supplementiert mit 10% fötalem Rinderserum (Hyclone) und Endothelzellwachstumsfaktor (Sigma), ausplattiert. Nach 24 bis 48 Stunden wurden die Medien auf CS-C-Medium, supplementiert nur mit 1-2% Serum, verändert und die Zellen wurden über Nacht kultiviert und am folgenden Tag für den Assay verwendet. Für die Überlebensstudien wurden sie mit Antikörpern in den angegebenen Dosierungen behandelt und für eine zusätzliche Zeitspanne in serumfreiem Medium kultiviert, dann durch visuelle Überprüfung und einen Trypan-Blau-Farbstoffausschluss im Hinblick auf das Zellüberleben bewertet.
HUVEC-Zellen sind außerordentlich empfindlich gegenüber Umweltbedingungen und benötigen die Zugabe von Wachstumsfaktoren (z.B. aFGF) im Kulturmedium zusätzlich zu dem fötalen Rinderserum. In Abwesenheit solcher Faktoren und Serum werden die Zellen nicht deutlich proliferieren und werden sehr schnell dem Zelltod unterliegen. In unserem System zeigen die Zellen, die über Nacht in Minimalmedium kultiviert wurden, eine signifikante Morbidität und sind innerhalb von 24 Stunden zu fast 100% nicht mehr lebensfähig.
Die Ergebnisse zeigen an, dass der mAk 15B8 das Überleben von Endothelzellen unterstützt. Die Zugabe des Antikörpers 15B8 mit 50 μg/ml unterstützte ein verstärktes Überleben über eine 48-stündige Zeitspanne. Die Zellen blieben adhärent und erhielten sich eine Endothelmorphologie.
Dementsprechend kann Tie2 eine Schlüsselrolle bei der Stabilisierung des Endothels spielen. Die Stimulierung der Tie2-Rezeptoren in HUVECs, die in Nährmedium- und Wachstumsfaktor reduziertem Medium gezüchtet werden, durch Behandlung mit dem agonistischen mAk, führte zu einem erhöhten Überleben jenseits ähnlich kultivierter Kontrollzellen. Die Anhaftung an Substrat und die zelluläre Morphologie wurden ebenfalls aufrechterhalten. Die Stimulierung der Tie2-Rezeptoren bei einem Säuger würde zu einem erhöhten Überleben existierender Vaskulatur führen, was die Wirkungen ischämischer Attacken vermindern würde. Die Bestimmung der Menge des verwendeten Antikörpers zur Behandlung eines Säugers liegt in dem Wissen von dem durchschnittlichen Fachmann auf dem Gebiet.
Wachstum von UT7 (GM-CSF)-Zellen
Megakaryozyten, ihre Vorläufer und megakaryoblastische Leukämiezellen, wie z.B. UT7, exprimieren Tie2-Rezeptoren. Eine GM-CSF-abhängige Zelllinie, UT7 (GM-CSF), wurde mit 5 × 10⁴ Zellen/ml in Iscove's modifiziertem Dulbecco-Medium mit 10% FCS ausplattiert. GM-CSF wurde mit entweder 10 ng/ml (optimal) oder 5 ng/ml (sub-optimal) verwendet, und der Tie2-Agonist mAk 15B8 mit 1 μg/ml. Nach 24, 48 und 72 Stunden wurde eine Probe der Zellen aus der Kultur entfernt und gezählt.
Der agonistische mAk 15B8 allein hatte keine Wirkung auf das Wachstum der Zytokin-abhängigen hämapoetischen Zelllinie UT7 (GM-CSF). Der 15B8-mAk hatte jedoch eine synergistische Wirkung mit suboptimalen Mengen von GM-CSF, um die UT7 (GM-CSF)-Zellzahl nach 24 und 48 Stunden der Kultur zu erhöhen. Die Stimulierung der Tie2-Rezeptoren bei Säugern würde die Proliferation von hämatopoetischen Zellen, einschließlich Megakaryozyten-Vorläufern in vivo erhöhen und dadurch die Zahl von Blutzellen und Blutplättchen, die erzeugt würden, erhöhen. Die Bestimmung der verwendeten Menge des Antikörpers, um einen Säuger zu behandeln, liegt in dem Wissen des durchschnittlichen Fachmanns auf dem Gebiet.
Beispiel 3
Klonierung und Sequenzierung von anti-Tie2-Kinaserezeptor-monoklonalen Antikörper-leichten und schweren Ketten-cDNAs
Die Aminosäuresequenzen der leichten und schweren Ketten-N-Termini wurden für den anti-TIE2-Kinasezeptor mAk 15B8 durch ein Protein-Mikrosequenzierungsverfahren bestimmt. Pyroglutaminsäure-blockierte N-Termini wurden zunächst enzymatisch unter Verwendung von Pyroglutamataminopeptidase von der Blockierung befreit.
Gesamt-15B8-Hybridom-RNA wurde gereinigt, revers transkribiert und PCR amplifiziert. Für die schwere Kette wurde das RNA/DNA-Hybrid mit PCR unter Verwendung eines Maus-IgG-CH1-spezifischen Primers und eines degenerierten Primers, basierend auf der N-terminalen Proteinsequenz, amplifiziert. Auf ähnliche Weise wurde für die leichte Kette das RNA/DNA-Hybrid durch PCR unter Verwendung eines Maus C-kappa-Primers und eines degenerierten Primers, basierend auf der N-terminalen Proteinsequenz, amplifiziert. PCR-Produkte mit der geeigneten Größe, d.h. ungefähr 350, wurden in einen Plasmidvektor kloniert und durch eine Modifikation des Sanger-Verfahrens sequenziert. In jedem Fall wurde die Sequenz von VH- und Vk-Klonen verglichen, um eine Consensus-15B8-schwere Ketten-variable Regionsequenzen (SEQ ID NOS: 1 und 2) bzw. Consensus-15B8-leichte Ketten- variable Regionsequenzen (SEQ ID NOS: 3 und 4) zu erzeugen. Die schwere Ketten-CDR 1, 2 und 3 Aminosäuresequenzen sind in den SEQ ID NOS: 5, 6 bzw. 7 dargestellt. Die leichte Ketten-CDR 1, 2 und 3 Aminosäuresequenzen sind in den SEQ ID NOS. 8, 9 bzw. 10 dargestellt.
Die Aminosäuresequenz des leichte Ketten-N-Terminus wurde für den anti-TIE2-Kinaserezeptor mAk 13H10 durch ein Proteinmikrosequenzierungsverfahren bestimmt. Die Pyroglutaminsäure-blockierten N-Termini wurden zuerst enzymatisch unter Verwendung von pyroglutamataminopeptidase von der Blockierung befreit.
Gesamt-13H10-Hybridom-RNA wurde gereinigt, revers transkribiert und PCR amplifiziert. Für die schwere Kette wurde das RNA/DNA-Hybrid mit PCR unter Verwendung eines Maus-IgG-CH1-spezifischen Primers und eines degenerierten Primers amplifiziert. Auf ähnliche Weise wurde für die leichte Kette das RNA/DNA-Hybrid durch PCR unter Verwendung eines Maus C-kappa-Primers und eines universellen degenerierten Primers amplifiziert. PCR-Produkte mit der geeigneten Größe, d.h. ungefähr 350, wurden in einen Plasmidvektor kloniert und durch eine Modifikation des Sanger-Verfahrens sequenziert. Die N-terminale Aminosäuresequenz der schweren Kette wurde wie oben beschrieben bestimmt und die VH-Klone wurden verglichen, um eine Consensus-13H10-schwere Ketten-variable Regionsequenz zu erzeugen. Die SEQ ID NOS: 11 und 12 führen die 13H10-schwere Ketten-variable Regionsequenz auf, beginnend bei Aminosäure 7. Die SEQ ID NO: 21 führt die vollständige Aminosäuresequenz der 13H10-schweren Kette-variablen Region auf. Ein Vergleich der Vk-Klone erzeugte eine Consensus-13H10-leichte Ketten-variable Regionsequenz (SEQ ID NOS: 13 bzw. 14). Die schwere Ketten-CDR 1, 2 und 3 Aminosäuresequenzen sind in SEQ ID NOS: 15, 16 bzw. 17 dargestellt. Die leichte Ketten-CDR 1, 2 und 3 Aminosäuresequenzen sind in den SEQ ID NOS: 18, 19 bzw. 20 dargestellt. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Agonistischer Antikörper, der spezifisch Tie2 bindet, umfassend eine schwere Kette und eine leichte Kette, wobei die Framework-Bereiche der schweren und der leichten Ketten von mindestens einem gewählten Antikörper abstammen und die Aminosäuresequenzen der schweren Kettenkomplementaritäts-bestimmenden Regionen (CDRs) wie in den SEQ ID NOs: 5, 6 und 7 dargestellt sind und die Aminosäuresequenzen der leichten Ketten-CDRs wie in den SEQ ID NOs: 8, 9 und 10 dargestellt sind.
Antikörper gemäß Anspruch 1, umfassend ein schweres Ketten-variables Region-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2 und ein leichtes Kettenvariables Region-Polypeptid, wie dargestellt in SEQ ID NO: 4.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend den Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2.
Antikörper gemäß Anspruch 1 oder 2, der humanisiert oder menschlich ist.
Isoliertes Polynucleotid, codierend die schwere und/oder leichte Kette des Antikörpers gemäß Anspruch 1.
Wirtszelle, die den Antikörper gemäß Anspruch 1 oder 2 sezernieren kann, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus CHO, COS, einer Fibroblastenzelle, einer Myeloidzelle.