DE60315815T2

DE60315815T2 - ANTAGONISTISCHE HUMANE ANTI-hFAS-LIGAND-ANTIKÖRPER UND FRAGMENTE DAVON

Info

Publication number: DE60315815T2
Application number: DE60315815T
Authority: DE
Inventors: Joanne Sloan Indianapolis LANCASTER
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2002-03-21
Filing date: 2003-03-12
Publication date: 2008-05-21
Anticipated expiration: 2023-03-13
Also published as: MXPA04009148A; BR0308401A; CN1283662C; DE60315815D1; EP1490405A4; AU2003219954A1; CA2478386A1; EP1490405B1; CN1642980A; JP2005520523A; AU2003219954B2; WO2003079750A3; US20050106140A1; IL164011A0; DK1490405T3; US7262277B2; ES2291626T3; PT1490405E; ATE370970T1; WO2003079750A2

Description

Der Fas Ligand ("FasL") ist ein Protein mit einer Aktivität zur Induktion der Apoptose einer Fas Antigen ("Fas")-exprimierenden Zelle. Die Apoptose der Fas Antigen exprimierenden Zellen dürfte durch die Bindung von FasL mit Fas auf der Zelloberfläche induziert werden, die im Transfer eines Apoptosesignals an die Zelle über das Fas Antigen führt. Die Nukleinsäure und die Proteinsequenzen von FasL aus dem Menschen, der Maus oder der Ratte sind in US 6 348 334 A (hiermit eingeführt) beschrieben.
Humaner Fas Ligand ("hFasL") ist ein 40 kDa großes Typ II membrangebundenes Protein, das ein Vertreter der TNF Familie ist. Das membrangebundene FasL kann durch Metalloproteinasen unter Bildung von löslichem FasL gespalten werden, das primär ein nicht kovalent gebundenes Homotrimer ist (Mariani et al., Eur. J. Immunol. 25: 2303-2307 (1995), Kayagaki et al., J. Exp. Med. 182: 1777-1783 (1995), Tanaka et al., EMBO 14(6): 1129-1135 (1995)). Lösliches FasL scheint weniger cytotoxisch zu sein als membranassoziiertes FasL (Nagata, Annu. Rev. Genet. 33: 29-55 (1999)).
FasL wird vorwiegend auf aktivierten T-Zellen und natürlichen Killerzellen (NK) exprimiert, während Fas auf verschiedenen Zelltypen exprimiert wird (Hanabuchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4930-4934 (1994), Suda et al., J. Immunol. 154: 3806-3813 (1995), Arase et al., J. Exp. Med. 181: 1235-1238 (1995)). Der Fas-FasL Signalweg ist bei der Modulation der Immunreaktionen durch die Induktion der zellulären Apoptose wichtig. Kürzlich wurde berichtet, dass FasL ein potenter Chemolockstoff für Neutrophile ist, was eine proinflammatorische Funktion des Moleküls nahelegt. Der Fas-FasL Signalweg ist auch bei der Pathogenese von mehreren Erkrankungen beteiligt, einschließlich Autoimmunerkrankungen, Nierenstörungen, Sepsis, viraler Hepatitis, HIV, Influenza und Graft-versus-Host Erkrankung (siehe beispielsweise Krammer et al., Immunol. Rev. 142: 175-191 (1994), Nagata und Goldstein, Science 267: 1449-1456 (1995), Yagita et al., Immunol. Rev. 146: 223-239 (1995), Elovaara et al., Acta Neutropathologica, 98 (4): 355-362 (1999), X. Leroy et al., APMIS, 109 (6): 469-473, 2001).
Antikörper gegen hFasL, die Antikörpermaussequenzen umfassen wie auch chimäre Antikörperspezies, die einen Teil der humanen Antikörpersequenz umfassen, wurden beschrieben (siehe beispielsweise WO 95 18 819 A und US 6 114 507 A und US 6 348 334 A und US 6 096 312 A . Jedoch verbleiben signifikante Immunogenitätsprobleme bei der Verwendung von chimären Antikörpern. Die Herstellung von humanisierten Antikörpern (das heißt chimären) über die rekombinante DNA Technologie liefert unsichere Ergebnisse, die zu Antikörpern mit unvorhersagbaren Bindungsaffinitäten führen. US 6 348 334 A legt nicht-beschreibend Antikörper offen, die gegen FasL gerichtet sind, beschreiben jedoch nicht spezifisch Strukturcharakteristiken solcher Antikörper.
Humane Antikörper sind, wie sie hierin beschrieben sind, gegenüber nicht-humanen Antikörpern und humanisierten, chimären Antikörpern zur Verwendung in der Humantherapie aus mehreren Gründen vorteilhaft. Ein humaner monoklonaler Antikörper, das heißt ein Antikörper, der vollkommen human ist, induziert weniger wahrscheinlich eine immunologische Reaktion bei Menschen als Antikörper, die nicht-humane Teile enthalten. Ferner wird ein humaner Antikörper weniger wahrscheinlich als ein "fremder" Antikörper beim Menschen erkannt. Dies führt zu einer langsameren Eliminierung des Humanantikörpers aus dem Körper als ein nicht-humaner oder partiell humaner Antikörper. Demnach kann ein humaner Antikörper in geringeren Dosen oder weniger oft verabreicht werden, als nicht-humane oder partiell humane Antikörper.
Um das Potential für die Spezieskreuzreaktivität zu minimieren, besteht ein Bedarf für humane Antikörper gegen FasL, insbesondere humanes FasL, mit einer hohen Affinität FasL zu binden und einer Kapazität zur Zerstörung oder Antagonisierung der Aktivität des Fas-FasL Signalwegs in vitro und in vivo. Die vorliegende Anmeldung beschreibt therapeutisch brauchbare humane Antikörper und Antigenbindende Teile hiervon, die gegen hFasL gerichtet sind und durch eine hochaffine Bindung an hFasL Polypeptide, langsame Dissoziationskinetiken und der Kapazität zur Zerstörung oder Antagonisierung zumindest einer in vitro und/oder in vivo Aktivität gekennzeichnet sind, die mit hFasL Polypeptiden assoziiert ist.
Die vorliegende Erfindung liefert isolierte anti-hFasL Humanantikörper und Antigen-bindende Teile hiervon. Die erfindungsgemäßen Antikörper sind durch eine hochaffine Bindung an ein hFasL Polypeptid, langsame Dissoziationskinetiken und der Fähigkeit zur Antagonisierung zumindest einer in vitro und/oder in situ Aktivität, die mit einem hFasL Polypeptid assoziiert ist, gekennzeichnet.
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein isolierter anti-hFasL Humanantikörper oder ein Antigen-bindender Teil hiervon mit einer variablen Region der leichten Kette (LCVR) und einer variablen Region der schweren Kette (HCVR) bereitgestellt, der zumindest 2 Polypeptide umfasst, die eine Sequenz aufweisen, welche ausgewählt ist aus SEQ ID Nr. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 und 24, worin der Antikörper einen Kp von weniger als 1 × 10^–9 M aufweist.
Vorzugsweise werden zumindest 3, 4, 5 oder 6 Polypeptide ausgewählt, worin die Polypeptide vorzugsweise in dem Antikörper an derselben CDR Position vorkommen, wie dies in den Tabellen 1, 2 oder 3 hierin gezeigt ist.
Vorzugsweise umfasst der LCVR ein Polypeptid mit der in SEQ ID Nr. 2 gezeigten Sequenz.
Vorzugsweise umfasst die LCVR die in SEQ ID Nr. 2 gezeigte Aminosäuresequenz und die HCVR umfasst die in SEQ ID Nr. 10 gezeigte Aminosäuresequenz.
Alternativ dazu umfasst die LCVR die in SEQ ID Nr. 2 gezeigte Aminosäuresequenz und die HCVR umfasst die SEQ ID Nr. 18 gezeigte Aminosäuresequenz.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die LCVR CDR1 Domäne die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 4.
Vorzugsweise umfasst die LCVR CDR2 Domäne die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 6.
Vorzugsweise umfasst die LCVR CDR3 Domäne die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 8.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine LCVR CDR1 Domäne bereitgestellt, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 4 und eine LCVR CDR2 Domäne umfasst, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 6 umfasst.
Vorzugsweise umfasst die LCVR CDR1 Domäne die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 4 und die LCVR CDR3 Domäne umfasst die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. B.
Vorzugsweise umfasst die LCVR CDR2 Domäne die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 6 und die LCVR CDR3 Domäne umfasst die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 8.
Bevorzugter umfasst die HCVR CDR1 Domäne die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 12 oder 20.
Vorzugsweise umfasst die HCVR CDR2 Domäne die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 14 oder 22.
Vorzugsweise umfasst die HCVR CDR3 Domäne die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 16 oder 24.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine HCVR CDR2 Domäne bereitgestellt, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 14 oder 22 und eine HCVR CDR3 Domäne umfasst, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 16 oder 24 umfasst.
Vorzugsweise umfasst die HCVR CDR1 Domäne die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 12 oder 20 und die HCVR CDR2 Domäne umfasst die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 14 oder 22.
Bevorzugter umfasst die HCVR CDR1 Domäne die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 12 oder 20 und die HCVR CDR3 Domäne umfasst die Aminsäuresequenz von SEQ ID Nr. 16 oder 24.
Der gemäß der vorliegenden Erfindung isolierte Antikörper weist eine konstante Region der schweren IgG1 Kette auf. Alternativ dazu weist der gemäß der vorliegenden Erfindung isolierte Antikörper eine konstante Region der schweren IgG4 Kette auf.
Vorzugsweise ist der isolierte Antigen-bindende Teil der vorliegenden Erfindung ein Fab Fragment. Alternativ dazu ist der isolierte Antigen-bindende Teil der vorliegenden Erfindung ein F(ab')₂ Fragment oder ein Einzelketten Fv Fragment.
Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, das ein Polynukleotid umfasst, welches für einen humanen anti-hFasL Antikörper oder einen Antigenbindungsteil hiervon kodiert.
Vorzugsweise umfasst das Polynukleotid zumindest 2 Polynukleotide mit einer Sequenz, die aus den SEQ ID Nr. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 und 23 und Varianten hiervon ausgewählt sind, wie dies die Degeneriertheit des genetischen Codes erlaubt.
Gemäß einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Vektor bereitgestellt, der das vorher erwähnte Nukleinsäuremolekül umfasst.
Vorzugsweise ist der Vektor ein rekombinanter Expressionsvektor.
Gemäß einem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Wirtszelle bereitgestellt, die den vorher erwähnten Vektor umfasst, der ganz oder teilweise in das Wirtszellchromosom integriert wurde.
Der humane anti-hFasL Antikörper oder der Antigen-bindende Teil hiervon kann durch die Kultivierung einer erfindungsgemäßen Wirtszelle im Kulturmedium so kultiviert werden, dass der humane antihFasL Antikörper oder der Antigen-bindende Teil hiervon der vorliegenden Erfindung in der Zelle exprimiert wird.
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung, das heißt ein humaner anti-hFasL Antikörper oder ein Antigen-bindender Teil hiervon, kann durch Kultivierung einer geeigneten Wirtszelle der Erfindung, die einen erfindungsgemäßen Expressionsvektor umfasst, unter Bedingungen, die die Expression des Polypeptids fördern, und Reinigung des Polypeptids hergestellt werden. Es wird in Betracht gezogen, dass die Reinigung aus der Wirtszelle, dem Kulturmedium, worin die Wirtszelle angezogen wird, oder beidem ausgeführt werden kann.
Durch das Zusammenbringen von hFasL mit einem humanen anti-hFasL Antikörper (oder Antigen-bindenden Teil hiervon) der vorliegenden Erfindung kann die hFasL Aktivität gehemmt werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die einen humanen anti-hFasL Antikörper oder einen Antigen-bindenden Teil hiervon der Erfindung umfasst. Es wird in Betracht gezogen, dass eine pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung mehr als einen humanen anti-hFasL Antikörper der Erfindung umfasst.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung kann ferner einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfassen.
Die Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Neutralisierung einer FasL Aktivität und ein Verfahren zur Behandlung oder Prävention einer Störung, worin eine FasL Aktivität schädlich ist, das die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung an ein Individuum umfasst, das dessen bedarf. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Störung, bei der die FasL Aktivität schädlich ist, systemisches Entzündungsreaktionssyndrom, Sepsis, multiples Organdysfunktionssyndrom, akutes Atemstresssyndrom, schwere Sepsis, Trauma, Graft-versus-Host Erkrankung, Organabstoßung, die mit einer Organtransplantation assoziiert ist, multiple Sklerose, idiopathische Lungenfibrose, Osteoarthritis, entzündliche Darmerkrankung, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, akuter Myokardinfarkt, Kardiomyopathie, kardiale Reperfusionsverletzung, Diabetes, Krebsarten (vorzugsweise Krebsarten, die FasL als Mechanismus exprimieren, der Immunantwort zu entkommen, wobei betroffene Krebsarten unter anderem Brustkrebs, Melanom, Ovarkrebs, Kolonkrebs, NSCLC, Lymphom und hepatozelluläres Carzinom umfassen), humanes Immundefizienzvirus, Influenzavirus, Leberstörungen, einschließlich unter anderem fulminante virale Hepatitis B oder C, chronisches Hepatitis C Virus, chronisches Hepatitis B Virus, Alkoholhepatitis, Leberzirrhose oder Nierenstörungen, die unter anderem chronische Nierenerkrankung, akute Nierenerkrankung und diabetische Nephropathie umfassen.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein humaner Antikörper bereitgestellt und Zusammensetzungen die den humanen Antikörper enthalten, der durch das Hybridom gebildet wird, das als ATCC PTA-4017 oder als ATCC PTA-4018 bei der American Type Culture Collection, Manassas, Virginia hinterlegt ist.
Die Erfindung ist nicht auf die bestimmten unten beschriebenen Ausführungsformen beschränkt, da Variationen der bestimmten Ausführungsformen vorgenommen werden können und immer noch unter den Umfang der Ansprüche fallen. Anstelle dessen wird der Umfang der vorliegenden Erfindung durch die Ansprüche definiert.
Ein Antikörper ist ein Immunglobulinmolekül, das sich aus vier Polypeptidketten zusammengesetzt, zwei schweren Ketten (H) (etwa 50-70 kDa bei voller Länge) und zwei leichten Ketten (L) (etwa 25 kDa bei voller Länge), die durch Disulfidbindungen untereinander verbunden sind. Die leichten Ketten werden als kappa und lambda klassifiziert. Die schweren Ketten werden als gamma, mu, alpha, delta oder epsilon klassifiziert und definieren den Isotyp des Antikörpers jeweils als IgG, IgM, IgA, IgD und IgE. Jede schwere Kette setzt sich aus einer variablen Region der schweren Kette (hierin als HCVR abgekürzt) und einer konstanten Region der schweren Kette zusammen. Die konstante Region der schweren Kette setzt sich aus 3 Domänen (CH1, CH2 und CH3) für IgG, IgD und IgA und 4 Domänen (CH1, CH2, CH3 und CH4) für IgM und IgE zusammen. Jede leichte Kette setzt sich aus einer variablen Region der leichten Kette (hierin abgekürzt als LCVR) und einer konstanten Region der leichten Kette zusammen. Die konstante Region der leichten Kette setzt sich aus einer Domäne CL zusammen. Die HCVR und LCVR Regionen können ferner in Hypervariabilitätsregionen unterteilt werden, die Komplementaritäts bestimmende Regionen (CDRs) genannt werden, die durch Regionen abgesetzt sind, die konservierter sind und Framework-Regionen (FR) genannt werden. Jede HCVR und LCVR setzt sich aus 3 CDRs und 4 FRs zusammen, die vom Aminoterminus zum Carboxyterminus in der folgenden Reihenfolge angeordnet sind: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Die Zuordnung der Aminosäuren zu jeder Domäne erfolgt gemäß gut bekannter Konventionen (Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987 und 1991), Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987), Chothia et al., Nature 342: 878-883 (1989)). Die funktionelle Fähigkeit des Antikörpers an ein bestimmtes Antigen zu binden, wird großteils durch die CDRs bestimmt.
Der Ausdruck "Antikörper" bezieht sich, wie er hierin verwendet wird, auf einen monoklonalen Antikörper an sich. Ein monoklonaler Antikörper kann ein humaner Antikörper, ein chimärer Antikörper und/oder humanisierter Antikörper sein. Ein monoklonaler Antikörper kann ein Fab Fragment, Fab' Fragment oder F(ab')₂ Fragment eines humanen Antikörpers, chimären Antikörpers und/oder humanisierten Antikörpers sein. Ferner kann ein monoklonaler Antikörper ein Einzelketten Fv Fragment sein.
Der Ausdruck "humaner Antikörper" ist, wie er hierin verwendet wird, (i) ein intakter Antikörper, (ii) ein im wesentlichen intakter Antikörper, (iii) ein Teil eines Antikörpers, der eine Antigenbindungsstelle umfasst oder (iv) ein Teil eines Antikörpers, der ein Fab Fragment, Fab Fragment oder F(ab')₂ Fragment mit variablen und konstanten Regionen umfasst, die durch die Nukleinsäuresequenzinformation kodiert werden, die in der humanen Immunglobulinregion der Keimlinie oder in rekombinanten und/oder mutierten Formen hiervon kodiert sind, unabhängig davon, ob die Antikörper in humanen Zellen gebildet werden oder nicht. Der Ausdruck "humaner Antikörper" umfasst auch einen humanen Antikörper, der so verändert ist, dass er die Form eines Einzelketten Fv Fragments annimmt.
Chimäre, humanisierte oder CDR-transplantierte Antikörper, die zumindest eine nicht-humane Fc, FR oder CDR Region enthalten, sind nicht humane Antikörper, wie dies hierin beschrieben ist.
Der Ausdruck "hFasL" bezieht sich auf den humanen Fas Liganden, einen Vertreter der Tumornekrosefaktorfamilie an Liganden, die in Suda et al., Cell 75: 1169-1178 (1993) beschrieben ist. Die Funktion von hFasL wird ferner in Kramme et al., Immunol. Rev. 142: 175-191 (1994), Nagata und Goldstein, Science 267 (5203): 1449-1456 (1995) und Yagita et al., Immunol. Rev. 146: 223-239 (1995) beschrieben. Der Ausdruck "Fas Ligand" wird so interpretiert, dass er hFasL wie auch Homologe von hFasL umfasst, die von anderen Spezies stammen. Die Ausdrücke "hFasL" und "FasL" sollen Formen hiervon umfassen, die durch Standardrekombinationsexpressionsverfahren hergestellt werden können oder im Handel bezogen werden können (Alexis^® Biochemicals, Katalog Nr. 522-001) wie auch synthetisch erzeugt werden können.
Der Ausdruck "löslich" bezieht sich, wenn er in Zusammenhang mit FasL verwendet wird, auf eine abgespaltene Form der "membranassoziierten" oder "membrangebundenen" Form von FasL. Lösliches FasL beschreibt lösliche Fragmente, die zumindest einen Teil der extrazellulären Domäne des membrangebundenen FasL enthalten. Lösliches FasL wird durch eine Metalloproteinasespaltung an einer spezifischen Stelle in der extrazellulären Region von FasL erzeugt, was zu einem löslichen Molekül führt (Hohlbaum et al., J. Exp. Med. 191 (7): 1209-1220 (2000), Tanaka et al., Nat. Med. 2 (3): 317-322 (1996) und Kayagaki et al., J. Exp. Med. 182 (6): 1777-1783 (1995)). Ähnlich der membrangebundenen Form ist lösliches FasL zur Induktion der Apoptose nach der Bindung an Fas fähig.
Die Ausdrücke "biologische Eigenschaft" oder "biologische Charakteristik" oder die Ausdrücke "Aktivität" und "Bioaktivität" werden in Bezug auf einen Antikörper oder ein Antikörperfragment der vorliegenden Erfindung hierin austauschbar verwendet, sind aber nicht beschränkt auf die Epitopaffinität und -spezifität (beispielsweise humaner anti-hFasL Antikörper, der an hFasL bindet), die Fähigkeit zur Antagonisierung der Aktivität des Zielpolypeptids in vivo und/oder in vitro (beispielsweise FasL Bioaktivität), die in vivo Stabilität des Antikörpers und die immunogenen Eigenschaften des Antikörpers. Andere identifizierbare biologische Eigenschaften oder Charakteristiken eines in der Technik bekannten Antikörpers umfassen beispielsweise Kreuzreaktivität (das heißt mit nicht-humanen Homologen des Zielpolypeptids oder anderen Proteinen oder Geweben allgemein) und der Fähigkeit zur Konservierung der hohen Expressionsmengen von Protein in Säugerzellen. Die vorher erwähnten Eigenschaften oder Charakteristiken eines in der Technik bekannten Antikörpers umfassen unter anderem ELISA, KompetitionsELISA, BIAcore^® Oberflächenplasmonresonanzanalyse, in vitro und in vivo Neutralisationstests (beispielsweise Beispiele 1, 2 und 3) und Immunhistochemie mit Gewebeschnitten aus unterschiedlichen Quellen, einschließlich Menschen, Primaten oder einer anderen Quelle, wie dies erforderlich ist.
Der Ausdruck "Epitop" bezieht sich, wie er hierin verwendet wird, auf eine Region eines Proteinmoleküls, an das ein Antikörper binden kann. Ein "immunogenes Epitop" wird als Teil eines Proteins definiert, das eine Antikörperreaktion auslöst, wenn des gesamte Protein immunogen ist. Siehe beispielsweise Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002 (1984). Ein "Antigen-bindender Teil" eines Antikörpers, wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Region eines Antikörpers, die an ein Epitop bindet oder mit diesem wechselwirkt, an das der Antikörper bindet, wenn der Antigen-bindende Teil innerhalb des Antikörpers vorhanden ist. Der Antigen-bindende Teil kann außerhalb des Zusammenhangs des Vollängenantikörpers vorkommen und immer noch als Antigen-bindender Teil des Antikörpers betrachtet werden, unabhängig davon, ob er noch an ein Epitop bindet oder mit diesem wechselwirkt.
Der Ausdruck "hemmen" oder "Hemmung" meint die Neutralisierung, Antagonisierung, Verhinderung, Prävention, Zurückdrängung, Verlangsamung, Zerstörung, Anhalten oder Umkehr der Progression oder Schwere dessen, was gehemmt werden soll, einschließlich unter anderem einer Aktivität, einer Erkrankung oder eines Zustands.
Der Ausdruck "isoliert" bezieht sich, wenn er hierin in Bezug auf eine Nukleinsäure oder ein Protein (beispielsweise einen Antikörper) verwendet wird, auf eine Nukleinsäuresequenz oder ein Protein, das identifiziert und von zumindest einer Kontaminante (jeweils Nukleinsäure oder Protein) abgetrennt wird, mit der sie normalerweise im natürlichem Umfeld assoziiert ist. Die isolierte Nukleinsäure oder das Protein kommt in einer Form oder Umgebung vor, die sich von der unterscheidet, in der sie in der Natur gefunden wird. Im Gegensatz dazu findet man nicht-isolierte Nukleinsäuren oder Proteine in dem Zustand, in dem sie in der Natur existieren. Vorzugsweise ist ein "isolierter Antikörper" ein Antikörper, der im wesentlichen frei von anderen Antikörpern ist, die unterschiedliche Antigenspezifitäten aufweisen (beispielsweise ein isolierter Antikörper, der spezifisch den hFas Liganden bindet und im wesentlichen frei ist von Antikörpern, die spezifisch andere Antigene als das hFas Ligandenpolypeptid binden).
Wie hierin verwendet meint der Ausdruck "gereinigt" oder "zu reinigen" das Ergebnis jedes Verfahrens, das einige Kontaminanten aus der Komponente von Interesse entfernt, wie ein Protein oder eine Nukleinsäure. Der Prozentsatz einer gereinigten Komponente wird hierbei in der Probe erhöht. In bevorzugten Ausführungsformen wird der Antikörper (1) zu mehr als 95 Gewichtsprozent Antikörper, wie dies durch das Lowry Verfahren bestimmt wird und vorzugsweise mehr als 99 Gewichtsprozent gereinigt und (2) zur Homogenität durch SDS-PAGE unter reduzierenden oder nicht-reduzierenden Bedingungen mittels Coomassie Blau oder vorzugsweise Silberfärbung gereinigt.
Die Ausdrücke "Kabat Nummerierung" und "Kabat Markierung" werden hierin austauschbar verwendet. Diese Ausdrücke, die in der Technik bekannt sind, beziehen sich auf ein System zur Nummerierung von Aminosäureresten, die variabler (das heißt hypervariabel) sind als andere Aminosäurereste in den variablen Regionen der schweren und leichten Kette eines Antikörpers (Kabat et al., Ann. NY Acad. Sci. 190: 382-393 (1971), Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. Ausgabe, US Department of Health and Human Services, NIH Publications Nr. 91-3242 (1991)).
Ein Polynukleotid wird "funktionsfähig verbunden", wenn es in eine funktionelle Beziehung mit anderen Polypeptiden gestellt wird. Beispielsweise wird die DNA für eine Präsequenz oder ein Sekretionssignalpeptid funktionsfähig an DNA für ein Polypeptid gebunden, falls es als Präprotein exprimiert wird, das bei der Sekretion des Polypeptids teilnimmt, wobei ein Promotor oder Enhancer funktionsfähig an eine kodierende Sequenz gebunden wird, falls es die Transkription der Sequenz beeinflusst.
Transgene Tiere (beispielsweise Mäuse), die nach einer Immunisierung zur Bildung von humanen Antikörpern in Abwesenheit einer endogenen Immunglobulinbildung fähig sind, können in der Erfindung verwendet werden. Der Transfer des humanen Keimlinienimmunglobulintests führt in einer solchen Keimlinienmutantenmaus zur Bildung von humanen Antikörpern nach einer Antigenprovokation. Siehe Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551-2555 (1993), Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immun. 7: 33 (1993), Nature 148: 1547-1453 (1994), Nature Biotechnology 14: 826 (1996), Gross et al., Nature 404: 995-999 (2000) und US 5 877 397 A , US 5 874 299 A , US 5 814 318 A , US 5 789 650 A , US 5 770 429 A , US 5 661 016 A , US 5 633 425 A , US 5 625 126 A , US 5 569 825 A und US 5 545 806 A .
Humane Antikörper können auch in Phagendisplaybanken hergestellt werden (Hoogenboom und Winter, J. Mol. Biol. 227: 381-388 (1992)). Die Techniken von Cole et al. und Boerner et al befinden sich auch unter den Techniken, die zur Präparation der humanen monoklonalen Antikörper verfügbar sind (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Seite 77 (1985) und Boerner et al., J. Immunol. 147: 86-95 (1991)).
Rekombinante humane Antikörper können auch einer in vitro Mutagenese (oder wenn ein Tier, das für humane Ig Sequenzen transgen ist, verwendet wird, somatische in vivo Mutagenese) unterzogen werden und so können die Aminosäuresequenzen der HCVR und LCVR Regionen der rekombinanten Antikörper Sequenzen, die während sie von denen abgeleitet sind, die mit den humanen HCVR und LCVR Sequenzen der Keimlinie verwandt sind, natürlicherweise nicht innerhalb des Keimlinienrepertoires des humanen Antikörpers in vivo vorkommen.
Der Ausdruck "neutralisieren "oder "antagonisieren" soll in Bezug auf einen anti-FasL Antikörper oder der Ausdruck "Antikörper, der FasL Aktivität antagonisiert (neutralisiert)" oder antagonisiert (neutralisiert) FasL" sich auf einen Antikörper oder einen Antigen-bindenden Teil hiervon beziehen, dessen Bindung an oder Kontakt mit FasL zur Hemmung einer biologischen Aktivität führt, die durch FasL Polypeptide induziert wird. Die Hemmung der biologischen Aktivität von FasL kann durch Messen einer oder mehrerer in vitro oder in vivo Indikatoren der biologischen FasL Aktivität untersucht werden, einschließlich unter anderem der Induktion der FasL-vermittelten intrazellulären Signalübertragung, Apoptose, Neutro philenchemotaxis oder Hemmung der Rezeptorbindung in einem FasL Rezeptorbindungstest. Indikatoren der biologischen FasL Aktivität können durch einen oder mehrere in vitro oder in vivo Tests untersucht werden, die in der Technik bekannt sind. Vorzugsweise wird die Fähigkeit eines Antikörpers zur Neutralisierung oder Antagionisierung der FasL Aktivität durch die Hemmung von Fas-FasL vermittelter Apoptose untersucht.
Die Ausdrücke "Individuum", "Subjekt" und "Patient" werden hierin austauschbar verwendet, um einen Säuger zu bezeichnen, wie unter anderem Maus, Affen, Mensch, Säugerfarmtiere, Säugersporttiere und Säugerhaustiere.
Der Ausdruck "K_off" bezieht sich, wie er hierin verwendet wird, auf die Off-Geschwindigkeitskonstante für die Dissoziation eines Antikörpers vom Antikörper/Antigenkomplex. Die Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante (K_off) eines human anti-hFasL Antikörpers kann durch BIAcore^® Oberflächenplasmonresonanz bestimmt werden, wie dies allgemein in Beispiel 3 beschrieben ist. Im allgemeinen misst die BIAcore^® Analyse die Echtzeitbindungswechselwirkungen zwischen dem Liganden (rekombinantes FasL Polypeptid, das auf eine Biosensormatrix immobilisiert ist) und dem Analysten (Antikörper in Lösung) durch Oberflächenplasmonresonanz (SPR) mittels des BIA core Systems (Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ). SPR kann auch durch eine Immobilisierung des Analyten (Antikörper in einer Biosensormatrix) und der Präsentation des Liganden in Lösung ausgeführt werden. Eine geringe Off-Geschwindigkeit für den Antigen/Antikörper Komplex bezieht sich auf K_off von 10^–3 sek^–1 oder weniger, vorzugsweise 10^–4 sek^–1 oder weniger, oder vor allem 10^–5 sek^–1 oder weniger.
Der Ausdruck "K_D" bezieht sich, wie er hierin verwendet wird, auf die Gleichgewichtsdissoziationskonstante einer bestimmten Antikörper-Antigen-Wechselwirkung. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann K_D wie in Beispiel 3 gezeigt bestimmt werden. Antikörper mit hoher Avidität und/oder hoher Affinität, die ein bestimmtes Epitop binden, haben eine K_D von 10^–7 M oder weniger, vorzugsweise 10^–8 M oder weniger, bevorzugter 10^–9 M oder weniger.
Der Ausdruck "Vektor" umfasst ein Nukleinsäuremolekül, das zum Transport einer weiteren Nukleinsäure fähig ist, an die sie gebunden ist, einschließlich unter anderem Plasmide und virale Vektoren. Bestimmte Vektoren sind zur autonomen Replikation in einer Wirtszelle fähig, in die sie eingeführt werden, während andere Vektoren in das Genom einer Wirtszelle nach Einführung in die Wirtszelle integriert werden können und hierbei zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert werden. Darüberhinaus sind bestimmte Vektoren zur Steuerung der Expression von Genen fähig, an die sie funktionsfähig gebunden sind. Solche Vektoren werden hierin als "rekombinante Expressionsvektoren" (oder einfach "Expressionsvektoren") bezeichnet.
Der Ausdruck "Wirtszelle" umfasst eine einzelne Zelle oder Zellkultur, die ein Empfänger für einen rekombinanten Vektor oder ein isoliertes Polynukleotid der Erfindung war oder sein kann. Wirtszellen umfassen die Nachkommen einer einzelnen Wirtszelle und die Nachkommen müssen nicht notwendigerweise vollständig identisch sein (in der Morphologie oder dem gesamten DNA Komplement) zur ursprünglichen Ausgangszelle aufgrund von natürlicher, zufälliger oder bewusster Mutation und/oder Veränderung. Eine Wirtszelle umfasst eine Zelle, die in vivo oder in vitro mit einem rekombinanten Vektor oder einem Polynukleotid der Erfindung transfiziert oder infiziert ist. Eine Wirtszelle, die einen rekombinanten Vektor der Erfindung umfasst, kann auch als "rekombinante Wirtszelle" bezeichnet werden. Vor zugsweise ist die Wirtszelle eine Bakterien- oder Säugerzelle und falls es eine Säugerzelle ist, ist sie vorzugsweise eine CHO, COS, NSO oder 293 Zelle.
Die vorliegende Erfindung betrifft humane monoklonale Antikörper, die für ein FasL Polypeptid, ein antigenes Fragment hiervon oder eine hFasL Aktivität spezifisch sind und neutralisieren. Ebenfalls beschrieben werden Fragmente der schweren und/oder leichten Kette des Antikörpers, die für ein FasL Polypeptid, ein antigenes Fragment oder ein Epitop hievon spezifisch sind und neutralisieren, oder eine hFasL Aktivität, vorzugsweise die Bindung von hFasL an Fas. Diese hohe Spezifität für die Bindung von FasL ermöglicht es den humanen anti-hFasL Antikörpern, Antigen-bindenden Teilen hiervon und humanen monoklonalen Antikörpern mit ähnlicher Spezifität für Fas-FasL assoziierte Erkrankungen immuntherapeutisch zu sein.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform liefert die Erfindung einen isolierten humanen antihFasL Antikörper oder einen Antigen-bindenden Teil hiervon, der zumindest zwei der Aminosäuresequenzen umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus den SEQ ID Nr. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 und 24. Die Sequenzen, die in den SEQ ID Nr. 4, 6, 8, 12, 14, 16, 20, 22 und 24 gezeigt sind, werden, wenn sie in einem erfindungsgemäßen Antikörper vorkommen, vorzugsweise im erfindungsgemäßen Antikörper an derselben CDR Lage positioniert, wie dies in den Tabelle 1, 2 und 3 hierin gezeigt ist und wie sie in SEQ ID Nr. 2 (für SEQ ID Nr. 4, 6 und 8), SEQ ID Nr. 10 (für SEQ ID Nr. 12, 14 und 16) und SEQ ID Nr. 18 (für SEQ ID Nr. 20, 22 und 24), positioniert sind.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform liefert die Erfindung einen isolierten humanen anti-FasL Antikörper oder einen Antigen-bindenden Teil hiervon, der ein lösliches FasL Polypeptid (oder antigenes Fragment hiervon) mit einer Gleichgewichtsdissoziationskonstante Kp von 2 × 10^–7 M oder weniger, bevorzugter 2 × 10^–8 M oder weniger oder noch bevorzugter 2 × 10^–9 M oder weniger (wie dies durch Festphasen BIAcore^® Oberflächenplamonresonanz bei Raumtemperatur bestimmt wird), bindet vom FasL Polypeptid mit einer geringen K_off Geschwindigkeitskonstante dissoziiert, und eine Kapazität zur Antagonisierung einer FasL Polypeptidaktivität aufweist.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung liefert einen isolierten humanen anti-hFasL Antikörper oder einen Antigen-bindenden Teil hiervon, der die FasL-vermittelte Apoptose in einem in vitro Neutralisationstest mit einer HK₅₀ von 10 nM oder weniger (alternativ 9 nM oder weniger, 8 nM oder weniger, 7 nM oder weniger, 6 nM oder weniger oder 5 nM oder weniger) für membrangebundenes FasL oder eine HK₅₀ von 0,2 nM oder weniger (alternativ dazu 0,19 nM oder weniger, 0,18 nM oder weniger, 0,17 nM oder weniger oder 0,15 nM oder weniger) für lösliches FasL hemmt. Ein solcher Antigen-bindender Teil der Erfindung kann alleine oder innerhalb eines humanen hFasL Antikörpers vorkommen. In einer bevorzugteren Ausführungsform bindet der isolierte anti-hFasL Antikörper ein lösliches FasL Polypeptid mit einer Gleichgewichtsdissoziationskonstante Kp von 1 × 10^–7 M oder weniger, vorzugsweise 1 × 10^–8 M oder weniger, noch bevorzugter 1 × 10^–9 M oder weniger (wie dies durch Festphasen BIAcore bei Raumtemperatur bestimmt wird). Beispiele für humane anti-hFasL Antikörper, die die vorher erwähnten kinetischen und neutralisierenden Kriterien erfüllen, umfassen 3E1 und 4G11 Antikörper, wie sie in den Beispielen 1, 2 und 3 beschrieben sind.
Der am meisten bevorzugte humane anti-hFasL Antikörper der vorliegenden Erfindung ist der, welcher hierin als 3E1 bezeichnet wird. Der 3E1 Antikörper weist LCVR und HCVR auf, die ein Polypeptid mit einer Sequenz aufweisen, wie sie in jeweils SEQ ID Nr. 2 und SEQ ID Nr. 10 gezeigt ist (siehe Tabel le 1 und 3 hierin). Beispielhafte Polynukleotidsequenzen, die die LCVR und HCVR von 3E1 kodieren, sind jeweils in SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 9 gezeigt.
In einer weiteren Ausführungsform ist ein bevorzugter humaner anti-hFasL Antikörper einer, der hierin als 4G11 bezeichnet wird. Der 4G11 Antikörper weist LCVR und HCVR auf, die ein Polypeptid mit einer Sequenz umfassen, wie sie in jeweils in SEQ ID Nr. 2 und SEQ ID Nr. 18 gezeigt ist (siehe Tabelle 2 und 3 hierin). Beispielhafte Polynukleotidsequenzen, die die LCVR und HCVR von 4G1 kodieren, sind jeweils in SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 17 gezeigt.
In einer weiteren Ausführungsform liefert die Erfindung ein isoliertes humanes anti-hFasL Antikörper Fab Fragment und ein humanes anti-hFasL Antikörper F(ab')₂ Fragment, das eine HCVR umfasst, die ein Polypeptid mit den Aminosäuresequenzen der SEQ ID Nr. 10 oder SEQ ID Nr. 18 umfasst und ferner eine LCVR, die ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2 jeweils für den Antikörper 3E1 und 4G11 umfasst. In einer weiteren Ausführungsform liefert die Erfindung einen isolierten, humanen anti-hFasL Antikörer oder Antigen-bindende Teile hiervon, die zumindest 2, vorzugsweise 3, 4, 5 oder 6 Polypeptide mit einer Aminosäuresequenz umfassen, die aus SEQ ID Nr. 4, 6, 8, 12, 14, 16, 20, 22 und 24 ausgewählt ist. Vorzugsweise liegt die in SEQ ID Nr. 4, 12 oder 20 gezeigte Aminosäuresequenz, wenn sie in einem erfindungsgemäßen Antikörper vorkommt, an CDR1. Vorzugsweise liegt die Aminosäuresequenz, wie dies in den SEQ ID Nr. 6, 14 oder 22 gezeigt ist, wenn sie in einem erfindungsgemäßen Antikörper vorkommt, an CDR2. Vorzugsweise liegt die Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID Nr. 8, 16 oder 24 gezeigt ist, wenn sie in einem erfindungsgemäßen Antikörper vorkommt, an CDR3. Bevorzugte Ausführungsformen liefern einen isolierten, humanen anti-hFasL Antikörper oder Antigenbindende Teile hiervon, der die durch lösliches FasL induzierte Apoptose in einem in vitro Neutralisationstest mit einer HK₅₀ von 0,5 nM oder weniger, bevorzugter etwa 0,3 oder weniger, noch bevorzugter etwa 0,15 nM oder weniger hemmt oder die membrangebundene FasL induzierte Proliferation oder Apoptose in einem in vitro Neutralisationstest mit einem HK₅₀ von 10 nM oder weniger, vorzugsweise etwa 9, 8, 7, 6 oder 5 nM oder weniger hemmt.
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf Zelllinien, die einen hierin beschriebenen humanen anti-hFasL Antikörper bilden. Die Isolierung von Zelllinien, die einen monoklonalen Antikörper bilden, kann durch Routinescreeningtechniken erreicht werden, die in der Technik bekannt sind. Es wurden mehrere Zelllinien, die einen humanen anti-hFasL Antikörper der vorliegenden Erfindung bilden, bei der ATCC (American Type Culture Collection) hinterlegt. Ein Maushybridom, das humanes IgG4 kappa (aus einer Hublab-Maus^®) 3E1 sekretiert, wird der Hinterlegungsnummer ATCC PTA-4017 zugeordnet und ein Maushybridom, das einen humanen IgG4 kappa (aus einer MuMab Maus^®) 4G11 sekretiert, wird der Hinterlegungsnummer ATCC PTA-4018 zugeordnet. Am bevorzugtesten haben humane anti-hFasL Antikörper der vorliegenden Erfindung dieselbe oder im wesentlichen ähnliche Aminosäuresequenzen innerhalb von zumindest 2, 3, 4, 5 oder 6 hypervariablen Regionen (das heißt CRDs) wie sie in einem oder mehreren der oben erwähnten bei der ATCC hinterlegten Antikörpern vorkommen.
Es kann eine große Vielzahl an Wirtsexpressionssystemen verwendet werden, um einen erfindungsgemäßen Antikörper zu exprimieren, einschließlich prokaryontischer (bakterieller) und eukaryontischer Expressionssysteme (wie Hefe-, Baculovirus-, Pflanzen-, Säuger- und andere Tierzellen, transgene Tiere und Hybridomzellen), wie auch Phagendisplayexpressionssysteme. Ein Beispiel für einen geeigneten bakteriellen Expressionsvektor ist pUC1 19 (Sfi) und ein geeigneter eukaryontischer Expressionsvek tor ist ein modifizierter pcDNA3.1 Vektor mit einem geschwächten DHFR Selektionssystem. Andere Antikörperexpressionssysteme sind auch in der Technik bekannt und hierin umfasst. Es sind mehrere geeignete Säugerwirtszellen in der Technik bekannt einschließlich unter anderem COS, CHO, NSO und 293 Zellen.
Ein erfindungsgemäßer Antikörper kann durch rekombinante Expression von Genen für leichte und schwere Immunglobulinketten in einer Wirtszelle hergestellt werden. Um einen Antikörper rekombinant zu exprimieren, wird die Wirtszelle mit einem oder mehreren rekombinanten Expressionsvektoren transfiziert, die DNA Fragmente tragen, welche die leichten und schweren Immunglobulinketten des Antikörpers tragen, so dass die leichten und schweren Ketten in der Wirtszelle exprimiert werden. Vorzugsweise werden die rekombinanten Antikörper in das Medium sekretiert, in dem die Wirtszellen kultiviert werden, aus dem die Antikörper gewonnen werden können. Rekombinante DNA Standardverfahren werden verwendet, um die Gene der schweren und leichten Ketten zu erhalten, diese Gene in rekombinante Expressionsvektoren einzubauen und diese Vektoren in Wirtszellen einzuführen. Solche Standard DNA Rekombinationstechnologien sind beispielsweise in Sambrook, Fritsch und Maniatis (Herausgeber), Molecular Cloning: A Laborstory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), Ausubel et al., (Herausgeber), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) und in US 4 816 397 A von Boss et al. beschrieben.
Eine isolierte DNA, die für eine HCVR Region kodiert, kann in ein Vollängengen für die schwere Kette umgewandelt werden, indem sie die für HCVR kodierende DNA an ein weiteres DNA Molekül funktionsfähig gebunden wird, das für die konstanten Regionen der schweren Kette kodiert (CH1, CH2 und CH3). Die Sequenzen der Gene für die konstante Region der humanen schweren Kette sind in der Technik bekannt. Siehe beispielsweise Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. Ausgabe, US Department of Health and Human Services, NIH Publication Nr. 91.3242 (1991). Die DNA Fragmente, die diese Regionen umfassen, können durch Standard PCR Amplifikation erhalten werden. Die konstante Region der schweren Kette kann eine konstante Region von IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM oder IgD sein und jede allotypische Variante hiervon, wie dies in Kabat (siehe obige Literaturstelle) beschrieben ist, ist aber am bevorzugtesten eine konstante IgG4 oder IgG1 Region. Alternativ dazu kann der Antigenbindungsteil ein Fab Fragment, ein F(ab')₂ Fragment oder ein Einketten Fv Fragment (scFv) sein. Für ein Gen der schweren Kette des Fab Fragments kann die für HCVR kodierende DNA funktionsfähig an ein anderes DNA Molekül gebunden werden, das nur für eine konstante Region CH1 der schweren Kette kodiert.
Eine isolierte DNA, die für eine LCVR Region kodiert, kann in ein Vollängengen für die leichte Kette (wie auch ein Gen für die leichte Kette eines Fab Fragments) umgewandelt werden, indem man die für LCVR kodierende DNA funktionsfähig an ein anderes DNA Molekül bindet, das für die konstante Region der leichten Kette CL kodiert. Die Sequenzen der Gene für die konstante Region der humanen leichten Kette sind in der Technik bekannt. Siehe beispielsweise Kabat obige Literaturstelle. Die DNA Fragmente, die diese Regionen umfassen, können durch Standard PCR Amplifizierung erhalten werden. Die konstante Region der leichten Kette kann eine konstante kappa oder lambda Region sein.
Um ein scFv Gen zu erzeugen, werden die für HCVR und LCVR kodierenden DNA Fragmente funktionsfähig an ein weiteres Fragment gebunden, das für einen flexiblen Linker kodiert, der beispielsweise für die Aminosäuresequenz (Gly₄-Ser)₃ kodiert, so dass die HCVR und LCVR Sequenzen als kon tinuierliches Einzelkettenprotein exprimiert werden, wobei die LCVR und d HCVR Regionen an den flexiblen Linker gebunden sind. Siehe beispielsweise Bird et al., Science 242: 423-426 (1988), Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988), McCafferty et al., Nature 348, 552-554 (1990).
Um den Antikörper der Erfindung zu exprimieren, wird eine DNA, die für eine leichte und/oder schwere Kette partieller oder voller Länge kodiert, so in einen Expressionsvektor inseriert, dass das Gen operativ an Transkriptions- und Translationskontrollsequenzen gebunden ist. In diesem Zusammenhang meint der Ausdruck "funktionsfähig verbunden", dass ein Antikörpergen so in einen Vektor ligiert wird, dass die Transkriptions- und Translationskontrollsequenzen innerhalb des Vektors ihrer beabsichtigten Funktion der Regulation der Transkription und Translation des Antikörpergens dienen. Der Expressionsvektor und die Expressionskontrollsequenzen werden so ausgewählt, dass sie mit der verwendeten Expressionszelle kompatibel sind. Das Gen für die leichte Kette des Antikörpers und das Gen für die schwere Kette des Antikörpers können in getrennte Vektoren eingebaut werden oder typischerweise werden beide Gene in denselben Expressionsvektor eingebaut. Die Antikörpergene werden in den Expressionsvektor durch Standardverfahren inseriert. Zusätzlich kann der rekombinante Expressionsvektor ein Signalpeptid kodieren, das die Sekretion der leichten und/oder schweren Kette des humanen anti-hFasL Antikörpers aus einer Wirtszelle erleichtert. Das Gen der leichten und/oder schweren Kette des humanen anti-hFasL Antikörpers kann so in den Vektor kloniert werden, dass das Signalpeptid operativ im Leserahmen an den Aminoterminus des Antikörperkettengens gebunden ist. Das Signalpeptid kann ein Immunglobulinsignalpeptid oder ein heterologes Signalpeptid sein.
Zusätzlich zu den schweren und/oder leichten Ketten des Antikörpers trägt der erfindungsgemäße Expressionsvektor Regulationssequenzen, die die Expression der Antikörperkettengene in einer Wirtszelle kontrollieren. Der Ausdruck "Regulationssequenz" soll erforderlichenfalls Promotoren, Enhancer und andere Expressionskontrollsequenzen (beispielsweise Polyadenylierungssignale) umfassen, die die Transkription und Translation der Antikörperkettengene kontrollieren. Das Design des Expressionsvektors, einschließlich der Auswahl der Regulationssequenzen, kann von Faktoren abhängen, wie der Wahl der zu transformierenden Wirtszelle und dem Expressionsausmaß an gewünschtem Protein. Bevorzugte Regulationssequenzen für Säugerwirtszellexpression umfassen virale Elemente, die große Mengen an Proteinexpression in Säugerzellen steuern, wie Promotoren und/oder Enhancer, die vom Cytomegalievirus (CMV), Simian Virus 40 (SV 40), Adenovirus (beispielsweise dem späten Hauptpromotor von Adenovirus (AdMLP)) und Polyomavirus abgeleitet sind.
Zusätzlich zu den Genen der schweren und/oder leichten Ketten des Antikörpers und den Regulationssequenzen können die erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektoren zusätzliche Sequenzen tragen, wie Sequenzen, die die Replikation des Vektors in Wirtszellen regulieren (beispielsweise Replikationsursprünge) und ein oder mehrere Selektionsmarkergene. Das Selektionsmarkergen erleichtert die Selektion von Wirtszellen, in die der Vektor eingeführt wurde. Beispielsweise verleihen typischerweise das Selektionsmarkergen eine Resistenz gegen Arzneimittel, wie G418, Hygromycin oder Methotrexat in einer Wirtszelle, in die der Vektor eingeführt wurde. Bevorzugte Selektionsmarkergene, die das Dihydrofolatreduktasegen (DHFR) (zur Verwendung in DHFR-minus Wirtszellen mit einer Methotrexatselektion/-amplifikation), das neo Gen (für eine G418 Selektion) und Glutaminsynthetase (GS) in einer GS-negativen Zelllinie (wie NS0) zur Selektion/Amplifikation umfassen.
Zur Expression der leichten und/oder schweren Ketten wird der Expressionsvektor, der für die schweren und/oder leichten Ketten kodiert, in eine Wirtszelle durch Standardtechniken transfiziert, wie beispielsweise Elektroporation, Calciumphosphatfällung, DEAE Dextran Transfektion und dergleichen. Obwohl es theoretisch möglich ist, die erfindungsgemäßen Antikörper entweder in prokaryontischen als auch eukaryontischen Wirtszellen zu exprimieren, sind eukaryontische Zellen bevorzugt und am meisten Säugerwirtszellen, da solche Zellen mit größerer Wahrscheinlichkeit einen richtig gefalteten und immunologisch aktiven Antikörper zusammensetzen und sekretieren. Bevorzugte Säugerzellen zur Expression der rekombinanten Antikörper der Erfindung umfassen Quarzellen vom Chinesischen Hamster (CHO Zellen) (einschließlich DHFR-CHO Zellen, die in Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220 (1980) beschrieben sind und mit einem DHFR Selektionsmarker verwendet werden, wie dies in Kaufman und Sharp, J. Mol. Biol. 159: 601-621 (1982) beschrieben ist), NS0 Myelomzellen, COS Zellen und SP2/0 Zellen. Wenn rekombinante Expressionsvektoren, die für Antikörpergene kodieren, in Säugerzellen eingeführt werden, werden die Antikörper durch die Kultivierung der Wirtszelle für einen Zeitraum gebildet, der ausreicht, um die Expression des Antikörpers in den Wirtszellen zu erlauben, bevorzugter die Sekretion des Antikörpers in das Kulturmedium, in dem die Wirtszellen angezogen werden. Antikörper können aus der Wirtszelle und/oder dem Kulturmedium durch Standardreinigungsverfahren gewonnen werden.
Wirtszellen können auch verwendet werden, um Teile oder Fragmente intakter Antikörper zu bilden, beispielsweise Fab Fragmente oder scFv Moleküle. Es ist verständlich, dass Variationen der obigen Verfahren innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung liegen. Beispielsweise kann es erwünscht sein, eine Wirtszelle mit DNA zu transfizieren, die entweder die leichte Kette oder schwere Kette (aber nicht beide) des erfindungsgemäßen Antikörpers kodiert. Die rekombinante DNA Technologie kann auch zur Entfernung eines Teils oder der gesamten DNA verwendet werden, die eine oder beide der leichten und schweren Ketten kodiert, die zur Bindung an den hFas Liganden nicht erforderlich ist. Die von solchen verkürzten DNA Molekülen exprimierten Moleküle werden auch durch die erfindungsgemäßen Antikörper umfasst.
In einem bevorzugten System zur rekombinanten Expression eines erfindungsgemäßen Antikörpers wird ein rekombiannter Expressionsvektor, der sowohl die leichte Kette als auch die schwere Kette des Antikörpers kodiert, in DHFR-CHO Zellen durch eine Calciumphosphat vermittelte Transfektion eingeführt. Innerhalb des rekombinanten Expressionsvektors sind die Gene für die schweren und leichten Ketten des Antikörpers jeweils funktionsfähig an Enhancer/Promotor Regulationselemente verbunden (die beispielsweise von SV40, CMV, Adenovirus und dergleichen abgeleitet sind, wie CMV Enhancer/AdMLP Promotorregulationselement oder ein SV40 Enhancer/AdMLP Promotorregulatorelement), um große Mengen der Transkription der Gene zu steuern. Der rekombinante Expressionsvektor trägt auch ein DHFR Gen, das die Selektion von Zellen, beispielsweise CHO Zellen, die mit dem Vektor transfiziert wurden, mittels einer Methotrexatselektion/-amplifikation erlaubt. Die selektierten Transformationswirtszellen werden kultiviert, um die Expression der schweren und leichten ketten des Antikörpers zu erlauben und es wird ein intakter Antikörper aus dem Kulturmedium gewonnen. Es werden Standardmolekularbiologietechniken verwendet, um den rekombinanten Expressionsvektor herzustellen, die Wirtszellen zu transfizieren, auf Transformanden zu selektieren, die Wirtszellen zu kultivieren und den Antikörper aus dem Kulturmedium zu gewinnen. Antikörper oder Antigen-bindende Teile hiervon der Erfindung können in einem Tier (beispielsweise einer Maus) exprimiert werden, das für humane Immunglobulingene transgen ist (siehe beispielsweise Taylor et al., Nucleic Acids Res. 20: 6287-6295 (1992)). Pflanzenzellen können ebenfalls so unter Bildung von transgenen Pflanzen modifiziert werden, dass sie den Antikörper oder einen Antigen-bindenden Teil hiervon der Erfindung exprimieren.
In Anbetracht des Vorangehenden betrifft eine weitere Ausführungsform der Erfindung die Nukleinsäuren, Vektoren und Wirtszellzusammensetzungen, die für eine rekombinante Expression der Antikörper und Antikörperteile der Erfindung verwendet werden. Vorzugsweise liefert die Erfindung isolierte Nukleinsäuren, die eine Region umfassen, welche für 2 oder mehr CDRs von 3E1 oder 4G11 kodieren und noch bevorzugter, dass solche CDRs im exprimierten Protein (beispielsweise Antikörper oder Antigen-bindender Teil hiervon) an derselben CDR Position innerhalb der Antikörperstruktur vorkommen, wie sie im Antikörper 3E1 oder 4G11 vorkommen. Vorzugsweise liefert die Erfindung isolierte Nukleinsäuren, die für eine Region kodieren, die für die variable Region der schweren Kette von 3E1 oder 4G11 kodieren und/oder die variable Region der leichten Kette von 3E1 oder 4G11. Gemäß einer Ausführungsform liefert die Erfindung eine isolierte Nukleinsäure, die für ein Polypeptid kodiert, das eine CDR3 variable Region der schweren Kette des Antikörpers von 3E1 mit einer Sequenz umfasst, wie sie in SEQ ID Nr. 16 gezeigt ist und/oder eine CDR2 schwere Kette mit einer Sequenz, wie dies in SEQ ID Nr. 14 gezeigt ist und/oder die CDR1 der schweren Kette von 3E1 mit der Sequenz, wie sie in SEQ ID Nr. 12 gezeigt ist. Am bevorzugtesten kodiert die isolierte Nukleinsäure für ein Polypeptid, das eine variable Region der schweren Kette des Antikörpers mit einer Sequenz umfasst, wie sie in SEQ ID Nr. 10 gezeigt ist (die volle HCVR Region von 3E1).
In einer weiteren Ausführungsform liefert die Erfindung eine isolierte Nukleinsäure, die für ein Polypeptid kodiert, das eine variable CDR3 Region der schweren Kette von 4G11 mit einer Sequenz, wie sie in SEQ ID Nr. 24 gezeigt ist und/oder die CDR2 der schweren Kette von 4G11 mit einer Sequenz, wie sie in SEQ ID Nr. 22 gezeigt ist und/oder die CDR1 der schweren Kette von 4G11 mit der Sequenz umfasst, wie sie in SEQ ID Nr. 20 gezeigt ist. Noch bevorzugter kodiert die isolierte Nukleinsäure für ein Polypeptid, das eine variable Region der schweren Kette des Antikörpers umfasst, welche die Sequenz aufweist, die in SEQ ID Nr. 18 gezeigt ist (die volle HCVR Region von 4G11).
Es wird in Betracht gezogen, dass die schwere Kette und/oder leichte Kette, die in einem erfindungsgemäßen Antikörper vorkommt, verschiedene Kombinationen der erfindungsgemäßen CDRs umfassen kann, beispielsweise CDR1 und CDR2, CDR1 und CDR3, CDR2 und CDR3 oder CDR1, CDR2 und CDR3. (CDR1 mit einer Sequenz, wie sie in SEQ ID Nr. 4, 12 oder 20 gezeigt ist, CDR2 mit einer Sequenz, wie sie in SEQ ID Nr. 6, 14 oder 22 gezeigt ist, CDR3 mit einer Sequenz, wie sie in SEQ ID Nr. 8, 16 oder 24 gezeigt ist). Vorzugsweise kommen die CDR Sequenzen, wenn sie in einem erfindungsgemäßen Antikörper vorkommen, an derselben CDR Position in einem erfindungsgemäßen Antikörper vor, wie sie dies in Antikörper 3E1 oder 4G11 tun. Es wird in Betracht gezogen, dass die CDRs in verschiedenen Ketten in anderen erfindungsgemäßen Antikörpern vorkommen können, wie sie es in Antikörper 3E1 oder 4G1 tun. Jedoch ist es am meisten bevorzugt, dass die CDR Sequenzen, wenn sie in einem erfindungsgemäßen Antikörper vorkommen, an derselben CDR Position und in derselben Kette (leicht oder schwer) vorkommen, wie sie dies in Antikörper 3E1 oder 4G11 tun.
In einer weiteren Ausführungsform liefert die Erfindung eine isolierte Nukleinsäure, die für eine variable Region der leichten Antikörperkette kodiert, die die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2 umfasst (das heißt die 3E1 oder 4G11 LCVR). Vorzugsweise umfasst diese Nukleinsäure die Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 1, obwohl der Fachmann erkennt, dass aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes andere Nukleotidsequenzen die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 kodieren können. Die Nukleinsäure kann nur die LCVR kodieren oder kann auch eine konstante Region der leichten Antikörperkette kodieren, die funktionsfähig an die LCVR gebunden ist. In einer Ausführungsform ist diese Nukleinsäure ein rekombinanter Expressionsvektor.
In einer weiteren Ausführungsform liefert die Erfindung eine isolierte Nukleinsäure, die für eine variable Region der schweren Antikörperkette kodiert, die die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 10 umfasst (das heißt 3E1 HCVR). Die Nukleinsäure kann die Nukleinsäuresequenz der SEQ ID Nr. 9 umfassen, obwohl der Fachmann erkennt, dass aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes andere Nukleotidsequenzen die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 10 kodieren können. Die Nukleinsäure kann nur die HCVR kodieren oder kann auch eine konstante Region der schweren Kette kodieren, die funktionsfähig an die HCVR gebunden ist. Beispielsweise kann die Nukleinsäure eine konstante Region von IgG4 oder IgG1 umfassen. In einer Ausführungsform ist diese Nukleinsäure ein rekombinanter Expressionsvektor.
In einer weiteren Ausführungsform liefert die Erfindung eine isolierte Nukleinsäure, die für eine variable Region der schweren Kette kodiert, die die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 18 umfasst (das heißt 4G11 HCVR). Die Nukleinsäure kann die Nukleinsäuresequenz der SEQ ID Nr. 17 umfassen, obwohl der Fachmann erkennt, dass aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes andere Nukleotidsequenzen die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 18 kodieren können. Die Nukleinsäure kann nur die HCVR kodieren oder kann auch eine konstante Region der schweren Kette kodieren, die funktionsfähig an die HCVR gebunden ist. In einer weiteren Ausführungsform ist diese Nukleinsäure ein rekombinanter Expressionsvektor.
Die Erfindung liefert auch einen rekombinanten Expressionsvektor, der sowohl eine schwere Antikörperkette als auch eine leichte Antikörperkette kodiert. Beispielsweise liefert die Erfindung in einer Ausführungsform einen rekombinanten Expressionsvektor, der kodiert: a) Eine schwere Antikörperkette, die eine variable Region aufweist, welche die Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus SEQ ID Nr. 10 und 18 und b) eine leichte Antikörperkette, die eine variable Region aufweist, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 umfasst.
Die Erfindung liefert auch Wirtszellen, in die eine oder mehrere der rekombinanten Expressionsvektoren der Erfindung eingeführt wurden. Vorzugsweise ist die Wirtszelle eine Säugerwirtszelle, bevorzugter ist die Wirtszelle eine CHO Zelle, eine NS0 Zelle oder COS Zelle. Ferner liefert die Erfindung ein Verfahren zur Synthese eines rekombinanten humanen Antikörpers der Erfindung durch die Kultivierung einer erfindungsgemäßen Wirtszelle in einem geeigneten Kulturmedium, bis ein rekombinanter, humaner Antikörper der Erfindung synthetisiert ist. Das Verfahren kann ferner die Isolierung des rekombinanten humanen Antikörpers aus dem Kulturmedium, der Wirtszelle oder beidem umfassen.
Nach der Expression können die ganzen Antikörper, ihre Dimere, einzelne leichte und schwere Ketten oder andere Immunglobulinformen der vorliegenden Erfindung gemäß Standardverfahren der Technik gereinigt werden, einschließlich Ammoniumsulfatfällung, Ionenaustausch-, Affinitäts-, Umkehrphasen-, hydrophobe Interaktionssäulenchromatographie, Gelelektrophorese und dergleichen. Es werden für pharmazeutische Anwendungen im wesentlichen reine Immunglobuline mit mindestens etwa 90 bis 95 % Homogenität bevorzugt und 98 bis 99 % Homogenität sind am meisten bevorzugt. Einmal gereinigt, partiell oder zur Homogenität, wie dies gewünscht ist, können die Polypeptide dann therapeutisch oder prophylaktisch verwendet werden, wie dies hierin beschrieben ist.
Die Antikörper oder Antikörperfragmente der vorliegenden Erfindung können in pharmazeutische Zusammensetzungen eingearbeitet werden, die zur Verabreichung an ein Individuum geeignet sind. Typischerweise umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung einen Antikörper oder einen Antikörperteil der Erfindung und pharmazeutisch annehmbare Verdünnungsmittel, Träger und/oder Hilfsstoffe. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Verabreichung sind so entworfen, dass sie für die gewählte Verabreichungsart geeignet sind und die pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel, Träger und/oder Hilfsstoffe, wie Dispergiermittel, Puffer, Tenside, Konservierungsstoffe, Löslichkeitsvermittler, Isotonizitätsmittel, Stabilisiermittel und dergleichen werden verwendet, wie dies geeignet ist.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen humanen anti-hFasL Antikörper der vorliegenden Erfindung umfasst, kann einem Säuger verabreicht werden, der einem Risiko ausgesetzt ist, Pathologien zu entwickeln, die mit Fas-FasL Wechselwirkungen assoziiert sind, wobei Standardverabreichungstechniken durch intravenöse, intraperitoneale, subkutane, pulmonale, transdermale, intramuskuläre, intranasale, bukkale, sublinguale oder zäpfchenartige Verabreichung verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können in eine pharmazeutische Zusammensetzung eingearbeitet werden, die zur parenteralen Verabreichung geeignet ist. Periphere systemische Abgabe durch intravenöse oder intraperitoneale oder subkutane Injektion ist bevorzugt. Geeignete Träger für solche Injektionen sind Stand der Technik und dem Fachmann bekannt.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen müssen typischerweise steril sein und unter den Bedingungen der Herstellung und Lagerung stabil sein. Daher können die pharmazeutischen Zusammensetzungen nach der Herstellung der Formulierung sterilfiltriert oder auf andere Art mikrobiologisch annehmbar gemacht werden. Eine typische Zusammensetzung für eine intravenöse Infusion kann ein Volumen aufweisen, wie 250 ml Flüssigkeit, wie sterile Ringer Lösung und 1 bis 100 mg/ml oder eine höhere Antikörperkonzentration. Therapeutische Mittel der Erfindung können alle zur Lagerung eingefroren oder lyophilisiert werden und in einem geeigneten sterilen Träger vor der Verwendung rekonstituiert werden. Die Lyophilisierung und Rekonstitution kann zu einem verschiedenen Ausmaß an Antikörperaktivitätsverlust führen (beispielsweise mit herkömmlichen Immunglobulinen, wobei IgM Antikörper zu einem größeren Aktivitätsverlust führen, wie IgG Antikörper). Die Dosierungen müssen angepasst werden, um dies zu kompensieren. Im allgemeinen ist ein pH zwischen 6 und 8 bevorzugt.
FasL spielt eine kritische Rolle bei der Pathologie, die mit einer Vielzahl an Erkrankungen assoziiert ist, die Immun- und Entzündungsfaktoren umfassen. Daher kann eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen humanen anti-hFasL Antikörper der Erfindung umfasst, zur Behandlung oder Prävention von autoimmunen und entzündlichen Erkrankungen verwendet werden, einschließlich unter anderem systemisches Entzündungsreaktionssyndrom, Sepsis, multiples Organdysfunktionssyndrom, akutes A temstresssyndrom, schwere Sepsis, Trauma, Graft-versus-Host Erkrankung, Organabstoßung, die mit einer Organtransplantation assoziiert ist, multiple Sklerose, idiopathische Lungenfibrose, Osteoarthritis, entzündliche Darmerkrankung, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, akuter Myokardinfarkt, Kardiomyopathie, kardiale Reperfusionsverletzung, Diabetes, Krebsarten (vorzugsweise Krebsarten, die FasL als Mechanismus exprimieren, der Immunantwort zu entkommen, wobei betroffene Krebsarten unter anderem Brustkrebs, Melanom, Ovarkrebs, Kolonkrebs, NSCLC, Lymphom und hepatozelluläres Carzinom umfassen), humanes Immundefizienzvirus, Influenzavirus, Leberstörungen durch fulminante virale Hepatitis B oder C, chronisches Hepatitis C Virus, chronisches Hepatitis B Virus, Alkoholhepatitis, Leberzirrhose oder Nierenstörungen, die unter anderem chronische Nierenerkrankung, akute Nierenerkrankung und diabetische Nephropathie umfassen.
Die Verwendung eines humanen anti-hFasL Antikörpers der vorliegenden Erfindung zur Behandlung von zumindest einer der vorher erwähnten Störungen, worin die FasL Aktivität störend ist, sind hierin ebenfalls umfasst. Zusätzlich wird die Verwendung des Antikörpers eines humanen anti-hFasL Antikörpers der vorliegenden Erfindung zur Verwendung bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von mindestens einer der vorher erwähnten Erkrankungen, worin die FasL Aktivität störend ist, in Betracht gezogen.
Wie hierin verwendet beziehen sich die Ausdrücke "Behandlung" und "behandeln" und dergleichen auf die Erlangung des gewünschten pharmakologischen und/oder physiologischen Effekts. Der Effekt kann in Bezug auf die vollständige oder partielle Prävention einer Krankheit oder eines Symptoms hiervon gemeint sein und/oder kann in Bezug auf eine partielle oder vollständige Heilung für eine Krankheit und/oder einen schädlichen Effekt therapeutisch sein, der dieser Krankheit zuzuordnen ist. "Behandlung", deckt, wie es hierin verwendet wird, jede Behandlung einer Erkrankung bei einem Säuger, insbesondere einem Menschen ab und umfasst: (a) Prävention des Auftretens einer Erkrankung bei einem Individuum, das in Bezug auf diese Krankheit prädisponiert ist, aber bisher nicht diagnostiziert wurde, dass es sie bereits hat, (b) Hemmung der Erkrankung, das heißt das Anhalten der Entwicklung hiervon und (c) Linderung der Erkrankung, das heißt Verursachung einer Regression der Erkrankung.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung ist vorzugsweise eine "therapeutisch wirksame Menge" oder eine "prophylaktisch wirksame Menge" eines erfindungsgemäßen Antikörpers. Eine "therapeutisch wirksame Menge" bezieht sich auf eine Menge, die in den erforderlichen Dosierungen und der Zeit wirksam ist, um das gewünschte therapeutische Ergebnis zu erreichen. Eine therapeutisch wirksame Menge des Antikörpers kann gemäß Faktoren variieren, wie dem Krankheitszustand, dem Alter, Geschlecht und Gewicht des Individuums und der Fähigkeit des Antikörpers oder Antikörperteils, eine gewünschte Reaktion im Individuum hervorzurufen. Eine therapeutisch wirksame Menge ist auch eine, worin jeder toxische oder schädliche Effekt des Antikörpers oder Antigen-bindenden Teils hiervon durch die nützlichen therapeutischen Effekte aufgewogen wird. Eine "prophylaktisch wirksame Menge" bezieht sich auf eine Menge, die in den erforderlichen Dosierungen und Zeitspannen wirksam ist, um das gewünschte prophylaktische Ergebnis zu erhalten. Typischerweise ist die prophylaktisch wirksame Menge geringer als die therapeutisch wirksame Menge, da eine prophylaktische Dosis in Patienten vor oder in früheren Stadien der Erkrankung verwendet wird.
Dosispläne können so angepasst werden, dass sie die optimal gewünschte Reaktion bereitstellen (beispielsweise eine therapeutische oder prophylaktische Reaktion). Beispielsweise kann ein Einzelbolus in mehreren verteilten Dosen über einen Zeitraum verabreicht werden oder die Dosis kann proportional verringert oder erhöht werden, wie dies durch die Zwänge der therapeutischen Situation indiziert ist.
Durch ihre Fähigkeit an hFasL zu binden, können die erfindungsgemäßen Antikörper zur Detektion von FasL Polypeptiden (beispielsweise in einer biologischen Probe, wie Serum oder Plasma) mittels eines herkömmlichen Immuntests verwendet werden, wie einem Enzym-gebundenen Immunosorbenttests (ELISA), einem Radioimmutest (RIA) oder Gewebeimmunhistochemie. Die Erfindung liefert ein Verfahren zur Detektion von FasL in einer biologischen Probe, die das Zusammenbringen einer biologischen Probe mit einem Antikörper (oder einem Antikörperteil), der an hFasL gebunden ist oder ungebundenen Antikörper (oder Antikörperteil) zur direkten Detektion von hFasL in der biologischen Probe umfasst. Der Antikörper ist direkt oder indirekt mit einer detektierbaren Substanz markiert, um die Detektion des gebundenen oder ungebundenen Antikörpers zu erleichtern. Geeignete detektierbare Substanzen umfassen verschiedene Enzyme, prosthetische Gruppen, fluoreszierende Materialien, lumineszente Materialien und radioaktive Materialien. Beispiele für geeignete Enzyme umfassen Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase, beta-Galactosidase oder Acetylcholinesterase, wobei Beispiele für prosthetische Gruppenkomplexe Streptavidin/Biotin und Avidin/Biotin umfassen, Beispiele für geeignete fluoreszierende Materialien Umbelliferon, Fluoreszein, Fluoreszeinisothiocyanat, Rhodamin, Dichlortriazinylaminfluorescein, Dansylchlorid oder Phycoerythrin umfassen, ein Beispiel für ein lumineszentes Material umfasst Luminol und Beispiele für ein radioaktives Material umfassen ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S oder ³H.
FasL kann leicht in biologischen Flüssigkeiten durch einen Kompetitionsimmuntest getestet werden, der FasL Standards verwendet, die mit einer detektierbaren Substanz und einem unmarkierten humanen anti-hFasL Antikörper detektierbar sind. In diesem Test werden die biologische Probe, die markierten FasL Standards und der humane anti-hFasL Antikörper vereinigt und die Menge an markiertem FasL Standard, die an den unmarkierten Antikörper gebunden ist, wird bestimmt. Die Menge an FasL in der Probe ist invers proportional zur Menge des markierten FasL Standards, der an den humanen antihFasL Antikörper gebunden ist.
Ein anti-hFasL Antikörper der vorliegenden Erfindung kann in einem diagnostischen Test für die FasL Expression verwendet werden. Es können verschiedene diagnostische Testtechniken, die in der Technik bekannt sind, verwendet werden, wie kompetitive Bindungstests, direkte oder indirekte ELISA Sandwichtests und Immunfällungstests, die entweder in heterogenen oder homogenen Phasen verwendet werden. Siehe beispielsweise Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press Inc., (1987) Seiten 147-158. Der im Test verwendete Antikörper kann mit einem detektierbaren Rest markiert werden. Der detektierbare Rest sollte entweder direkt oder indirekt zur Bildung eines detektierbaren Signals verwendet werden. Beispielsweise kann der detektierbare Rest ein Radioisotop sein, wie ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S oder ¹²⁵I, eine fluoreszente oder chemolumineszente Verbindung (wie Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin oder Luciferin) oder ein Enzym (wie alkalische Phosphatase, ß-Galactosidase oder Meerrettichperoxidase). Jedes in der Technik bekannte Verfahren zur Konjugation des Antikörpers an den detektierbaren Rest kann verwendet werden.
Beispiel 1: Funktionelle Aktivität, die mittels eines Jurkat Tests mit löslichem hFasL bestimmt wird
FasL/Enhancer Medium wird mit einer 4fach Konzentration hergestellt. Das einfache Medium enthält 50 ng/ml rekombinantes, humanes, lösliches FasL (Alexis^® Biochemicals, Katalog Nr. 522-001) und 1 μg/ml anti-FLAG M2 monoklonalen Antikörper der Maus (Enhancer, Sigma Chemical Co., Katalognummer F-31165) in Jurkat Zelltestmedium (DMEM: F-12 (3:1), 10 % FBS, 20 mM HEPES und 50 μg/ml Gentamycin). Das einfache Medium wird als "100 % Apoptosekontrolle" verwendet. Jurkat Zellmedium ohne FasL oder Enhancer wird als "0 % Apoptosekontrolle" verwendet.
Das Medium wird bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert. Für jede Bestimmung werden 25 μl an entweder 4fach verstärktem Fas Ligandenmedium oder eine Kontrollprobe zu jeder Vertiefung in einer Platte mit 96 Vertiefungen gegeben. Als nächstes werden 25 μl entweder einer Inhibitorprobe (3E1 oder 4G11 anti-hFasL Antikörper) oder einer Kontrollprobe zu jeder Vertiefung gegeben. Diese Zugabe verdünnt alle Proben und Medium auf die Hälfte der ursprünglichen Konzentrationen. Die Proben werden 45 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Als nächstes werden 50 μl Jurkat Zellen mit einer Konzentration von 10⁶ Zellen/ml Lösung zu jeder Vertiefung gegeben. Dies führt zu einfach verstärktem FasL, Proben mit einem Viertel ihrer Anfangskonzentration und 5 x 10⁴ Jurkatzellen/Vertiefung. Die Platten werden für 3 Stunden bei 37°C in 5 % Kohlendioxid inkubiert. WST-1 Zellproliferationsreagenz (Roche, Katalog Nr. 1 644 807) wird in einer Konzentration von 10 μl/Vertiefung zugegeben. Die Platten werden erneut für etwa 18 Stunden bei 37°C in 5 % Kohlendioxid inkubiert. Die Platten werden dann auf einem spektrophotometrischen Plattenlesegerät bei einer optimalen Wellenlänge von 450 nm ausgelesen. Die Ergebnisse zeigen, dass beide humanen anti-hFasL Antikörper, nämlich 3E1 und 4G11, bei der Neutralisierung von durch lösliches FasL vermittelter Apoptose in diesem Test wirksam sind.
Beispiel 2: CHO-K1/Jurkat Test mit membrangebundenem FasL
Eine CHO K1 Zelllinie, die stabil eine nicht abspaltbare Version von hFasL exprimiert, die DelhuFasL CHO K1 genannt wird, wird so verändert, dass sie die Fähigkeit der Antikörper 3E1 und 4G11 testen kann, die Aktivität von membranassoziierten FasL zu blockieren. Diese Zelllinie exprimiert Oberflächenmengen von FasL, die bei einer Co-Kultivierung mit Jurkat Zellen, die Jurkat Apoptose induzieren.
Es wird ein adhärentes CHO 1 Zellmedium mittels DMEM: F-12 (3:1), 5 % FBS, 40 μl/ml L-Prolin (Sigma), 50 μg/ml Gentamicin (Sigma) und 600 μg/ml G418 hergestellt. Für jede Bestimmung werden etwa 10⁴ CHO K1 Zellen (entweder Del.huFasL oder ursprüngliche CHO K1) zu jeder Vertiefung von Platten mit 96 Vertiefungen gegeben. Die Zellen werden über Nacht bei 37°C in 5 % Kohlendioxid inkubiert. Das Medium wird entfernt und 100 μl jeder Inihibitorprobe (3E1 oder 4G11 Antikörper, mehrere Verdünnungen, die einen Bereich an Konzentrationen abdecken) oder Kontrolle (Medium) werden zu jeder Vertiefung gegeben. Die Platten werden für 1 Stunde bei 37°C in 5 % Kohlendioxid inkubiert. 50 μl Jurkat Zellen (2,5 × 10⁵ Zellen/Vertiefung) werden zu jeder Vertiefung gegeben und die Platten werden für 2 Stunden bei 37°C in 5 % Kohlendioxid inkubiert. 10 μl an WST-1 Zellproliferationsreagenz werden zu jeder Vertiefung gegeben. Die Platten werden erneut für 4 Stunden bei 37°C in 5 % Kohlendioxid inkubiert. Die Platten werden dann auf einem Plattenspektrophotometer bei einer optimalen Wellenlänge von 450 nm ausgelesen. Die Ergebnisse zeigen an, dass beide Antikörper 3E1 und 4G11 bei der Blockierung der durch membrangebundenes FasL vermittelten Apoptose in diesem Test wirksam sind.
Beispiel 3: Affinitätsmessung monoklonaler Antikörper
Die Affinität von verschiedenen anti-hFasL Antikörpern für rekombinantes, humanes, lösliches (rhs) FasL (Alexis^® Biochemicals, Katalog Nr. 522-001) wird mittels eines BIAcore^®2000 Geräts gemessen. Das BIAcore^® verwendet die optischen Eigenschaften der Oberflächenplasmonresonanz, um die Veränderung der Proteinkonzentration von wechselwirkenden Molekülen innerhalb einer Dextranbiosensormatrix zu detektieren. Falls nichts anderes erwähnt ist werden alle Reagenzien und Materialien von BIAcore^®AB (Upsala, Schweden) bezogen. Alle Messungen werden bei Raumtemperatur ausgeführt. Die Proben werden in HBS-EP Puffer (150 mM Natriumchlorid, 3 mM EDTA, 0,005 % (G/V) Tensid P-20 und 10 mM HEPES, pH 7,4) ausgeführt. Ziege-anti-human Fc Antikörper wird auf den Durchflusszellen 1 und 2 eines B1 Sensorchips in einem Ausmaß von 500 Reaktionseinheiten (RUs) mittels eines Aminkupplungskits immobilisiert.
Die Bindung von rhs FasL wird mittels multipler analytischer Zyklen evaluiert. Jeder Zyklus wird bei einer Flussrate von 50 μl/Minute ausgeführt und besteht aus den folgenden Schritten: Injektion von 10 μl an anti-hFasL 3E1 Antikörper mit 1 μg/ml, Injektion von 240 μl an rhs FasL (beginnt bei 100 nM und unter Verwendung zweifacher serieller Verdünnungen für jeden Zyklus), gefolgt von 20 Minuten für die Dissoziation und einer Regeneration unter Verwendung von 50 μl an 10 mM Glycinhydrochlorid, pH 1,5. Die Assoziations- und Dissoziationsgeschwindigkeiten werden für jeden Zyklus mittels "Langmuir 1:1 mit Massentransport" Bindungsmodell in der BIA Evaluierungssoftware evaluiert.
Beispiel 4: HepG2 Apoptosetest mit dem rekombinanten löslichen Fas Liganden
Es wird eine HepG2 Zelllinie (hepatozelluläres Carcinom, ATCC Nr. HB-8065) verwendet, um die Neutralisation von rekombinantem, löslichem FasL durch die Antikörper 3E1 und 4G11 zu untersuchen. Das Zellmedium wird mittels DMEM: F-12 (3:1), 10 % FBS, 20 mM HEPES und 50 μg/ml Gentamycin hergestellt. Für jede Bestimmung werden HepG2 Zellen in Poly-D-Lysin beschichteten Platten mit 96 Vertiefungen in einer Konzentration von 1 × 10⁴ Zellen/Vertiefung in 200 μl Medium angeimpft. Die Zellen werden über Nacht bei 37°C in 5 % Kohlendioxid inkubiert. Das Medium wird entfernt und mit 100 μl Medium, worin 60 μg/ml Bleomycinsulfat (Sigma Chemical, Katalog Nr. 68416) enthalten sind, ersetzt. Die Platten werden über Nacht unter Verwendung einer Feuchtigkeitskammer inkubiert.
Eine Stammlösung von humanem FasL-FLAG wird in Testmedium hergestellt (die Endkonzentration beträgt 50 ng/ml FasL und 1 μg/ml anti-FLAG Enhancer unter Bildung von verstärktem FasL). Die anti-FasL Antikörper werden zu einem Teil der Stammlösung zur Herstellung von verstärktem FasL Medium mit Inhibitor gegeben. Jede Lösung wird für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Für 100 % Apoptosekontrollproben werden 50 μl/Vertiefung der verstärkten FasL Lösung zu dem Bleomycinenthaltendem Medium gegeben, das sich bereits in den Vertiefungen befindet. Für die Inhibitorproben werden 100 μl/Vertiefung der verstärkten FasL plus Antikörperlösung zu dem Bleomycin-enthaltendem Medium gegeben, das sich bereits in den Vertiefungen befindet. Die Platten werden dann über Nacht bei 37°C in 5 % Kohlendioxid inkubiert.
Eine 1:1 Verdünnung von WST-1 Zellproliferationsreagenz und Medium wird hergestellt. 20 μl verdünntes WST-1 werden zu jeder Vertiefung gegeben. Die Platten werden dann erneut über Nacht bei 37°C in 5 % Kohlendioxid gegeben. Die Platten werden dann auf einem Plattenspektrophotometer bei einer optimalen Wellenlänge von 450 nm ausgelesen. Die Ergebnisse zeigen, dass wenn die Konzentration des Antikörpers abnimmt, die Apoptose zunimmt.
Beispiel 5: Klonierung und Sequenzierung der Antigenbindungsregionen der schweren und leichten Kette
Die variable Region für die schwere und leichte Kette des neutralisierenden humanen mAb 3E1 wird mittels der folgenden Protokolle kloniert und sequenziert.
Die mRNA wird aus 2 × 10⁶ Hybridomzellen mittels des Micro-Fast Track Protokolls (Invitrogen) präpariert, das mit dem Kit geliefert wird. Die cDNA wird aus 200 μl Ethanolfällung der mRNA mittels cDNA Cycle Kit (Invitrogen) durch Zentrifugation des Aliquots an mRNA für 30 Minuten bei 14 000 Upm bei 4°C, gefolgt vom Waschen des Pellets mit 70 % Ethanol präpariert. Das luftgetrocknete Pellet wird in 11,5 μl sterilem Wasser resuspendiert und die cDNA wird gemäß den Anleitungen des Kits präpariert. Die cDNA wird mittels Ethanol gefällt und dann in 30 μl Wasser zur Verwendung in der PCR resuspendiert.
Die PCR Reaktionen werden mit degenerierten Primern am 5' Ende der variablen Region für die schwere und leichte Kette gepaart mit 3' Primern in der konstanten Region angesetzt. Für jede 50 μl Reaktion wird 1 μl cDNA verwendet. Die Reaktion wird zur Verwendung mit Pful gefolgt von 20 Zyklen angesetzt. Die PCR Produkte werden durch einen Lauf von 5 μl jeder Reaktion auf einem 2 % Agarosegel überprüft. Die positiven Reaktionen werden mittels Zero Blunt TOPO PCR Klonierungskit (Invitrogen) kloniert. Es werden Minipräparationen aus den positiven Klonen sequenziert und auf produktive Genumlagerungen analysiert. Die Ergebnisse aus unabhängigen PCR Reaktionen und der Sequenzierung von mehreren Klonen ergeben die Sequenzen der vorliegenden Erfindung.
Beispiel 6: Test mit primären Rattenhepatocyten
Die Apoptose spielt eine Rolle bei der toxischen Leberschädigung, fulminantem Leberversagen, hepatozellulärem Carcinom, Immun-vermittelter Lebererkrankung und viraler Hepatitis (Kanzler und Galle, Seminars Cancer Biol. 10 (3): 173-184 (2000)). Vorhergehende Studien haben gezeigt, dass primäre, humane Hepatozyten gegenüber einer durch FasL induzierten Apoptose empfindlich sind. Leichter erhältliche primäre Hepatozyten der Ratte haben gezeigt, dass diese Zellen ebenfalls gegenüber einer durch hFasL induzierten Apoptose empfindlich sind. Dieses Testsystem wird verwendet, um zu demonstrieren, dass der Rattenhepatozytentod und die Caspaseaktivierung, die einen intrazellulären Signalvorgang anzeigen, der durch Fas-FasL Wechselwirkung induziert wird, durch humane, monoklonale anti-hFasL Antikörper, nämlich 3E1 und 4G11, gehemmt werden.
Primäre Rattenhepatozyten werden in Matrigel in Platten mit 12 Vertiefungen mit 7 × 10⁵ Zellen/Vertiefung bezogen (In Vitro Technologies, Katalog Nr. M00717MG). Die Zellen werden für entweder 4 oder 24 Stunden unter den folgenden Bedingungen inkubiert: (1) Unstimuliert, (2) mit humanem FasL stimuliert, (3) hFasL stimuliert plus FasL gehemmt (mittels 3E1 und 4G11 Antikörper) oder (4) hFasL stimuliert plus Caspase 3 gehemmt. Diese Zellen werden gemäß den zwei Tests analysiert: (a) Lactatdehydrogenaseanalyse und (b) Caspase 3/8 Analyse, wie sie jeweils in Beispiel 6a und 6b beispielhaft dargestellt werden. Die Lactasedehydrogenasefreisetzung aus den Zellen zeigt einen Zelltod durch jedes Verfahren an. Die Freisetzung von Caspase 3 und/oder 8 aus Zellen zeigt eine durch Fas-FasL vermittelte Apoptose an.
Beispiel 6a: Lactatdehydrogenaseanalyse
Lactatdehydrogenase LD-L20 Reagenz (Sigma Chemical, Katalog Nr. 228-20) ist ein Gemisch aus Lactat und NAD, das zur quantitativen, kinetischen Bestimmung der Lactatdehydrogenaseaktivität verwendet wird. Die Lactatdehydrogenase katalysiert die Oxidation von Lactat zu Pyruvat mit einer simultanen Reduktion von NAD. Die Bildung von NADH führt zu einer Zunahme der Absorption bei λ 340 nm. Die Geschwindigkeit bei der Zunahme in der Absorption bei λ 340 nm ist direkt proportional zur LD Aktivität in der Probe.
In einer Platte mit 96 Vertiefungen werden 10 μl Probe in einem Zellkulturmedium mit 200 μl vorgewärmten LD-L Reagenz gemischt. Die Platte wird in ein 37°C Plattenlesegerät für eine Inkubationsperiode von 60 Sekunden gestellt, wobei die Absorption bei λ 340 nm an drei Zeitpunkten abgelesen wird: 0, 30 und 60 Sekunden. Die anfängliche Absorptionsablesung (Zeitpunkt 0 Sekunden) wird von der schließlichen Absorptionsablesung (Zeitpunkt 60 Sekunden) subtrahiert, um die Δ Absorption/Minute zu erhalten. Die Δ Absorption/Minute wird in eine LD Aktivität (U/L) gemäß der Berechnung umgewandelt, die durch den Reagenzienlieferanten bereitgestellt wird. Die Ergebnisse legen nahe, dass das Vorkommen von Antikörper die Freisetzung von Lactatdehydrogenase aus den Zellen verringert, was eine Abnahme im Zelltod bedeutet.
Beispiel 6b: Caspase 3/8 Analyse
Der ApoAlert Caspase Fluorescent Assay Kit (Clontech, Katalog Nr. K2026-2) wird verwendet, um die Aktivität der spezifischen Caspasen (3, 8 oder 9/6) zu detektieren, die in unterschiedlichen Stadien des apoptotischen Prozesses aktiv sind. 7-Amino-4-trifluormethylcoumarin (AFC), das an ein Substrat konjugiert ist, wird proteolytisch durch die geeignete Caspase in der Probe gespalten und freies AFC fluoresziert bei λ 505 nm.
In einer schwarzen Platte mit 96 Vertiefungen werden 50 μl Zelllysat mit 50 μl Reaktionspuffer und 5 μl Caspase 3 oder Caspase 8 Substrat gemischt. Das Gemisch wird bei 37°C für 1 Stunde inkubiert und in einem Fluoreszenzplattenlesegerät bei λ 400 nm Anregung/λ 505 nm Emission ausgelesen. Die Emissionen aus den apoptotischen Proben werden mit nicht induzierten und gehemmten Kontrollen verglichen, was die Bestimmung der Erhöhung in der Proteaseaktivität erlaubt. Die Ergebnisse zeigen an, dass die Caspase 3/8 Aktivierung vollkommen in Proben gehemmt ist, die FasL plus anti-hFasL Antikörper enthalten.
Beispiel 7: Funktionelle Aktivität mittels Jurkat Zellen mit hochreguliertem, nativem FasL
Die Stimulierung der Jurkat T Zellen mit einem immobilisierten Antikörper an den T Zellrezeptor CD3 Komplex induziert eine zelluläre Aktivierung und Hochregulierung von nativem FasL. Der durch die Aktivierung induzierte Zelltod tritt dann ein, der direkt durch die Ermittlung der Zellüberlebensrate oder der aktiven Caspase 3 Aktivität gemessen werden kann. Dieses System wird zur Bestimmung der Fähigkeit von anti-FasL Antikörper (3E1 wird verwendet, obwohl umfasst wird, dass 4G11 oder andere Antikörper der Erfindung verwendet werden können), um den Zelltod zu blockieren.
Nicht-Gewebekultur-behandelte Flachbodenplatten mit 96 Vertiefungen werden mit anti-humanem CD3 Antikörper (50 μl/Vertiefung, 1 μg/ml in PBS) bei 4°C über Nacht beschichtet. Die Platten werden dann mit PBS gewaschen, um nicht-gebundenen Antikörper zu entfernen. Jurkat T Zellen werden zu den Vertiefungen (50 000 Zellen/Vertiefung) alleine oder zusammen mit Inhibitor (Antikörper 3E1) oder einem Kontroll-IgG4 in verschiedenen Konzentrationen (5 μg/ml bis 5 ng/ml in einem Endvolumen von 100 μl in Jurkat Testmedium) und für 24 Stunden bei 37°C in 5 % Kohlendioxid inkubiert. WST-1 Reagenz (erhältlich beispielsweise von Panvera) wird dann zugegeben (10 μl/Vertiefung) und die Platten werden für weitere 24 Stunden inkubiert. Die Platten werden auf einem spektrophotometrischen Plattenlesegerät bei 450 nm gelesen. WST-1 wird zur Messung der Anzahl an lebenden Zellen verwendet. Die Ergebnisse zeigen, dass die im Test verwendeten hFasL Antikörper bei der Neutralisation der durch natives FasL vermittelten Apoptose in diesem Test wirksam sind.
Alternativ dazu werden Platten mit 24 Vertiefungen (nicht Gewebekultur) mit dem anti-CD 3 Antikörper beschichtet, wie dies oben beschrieben ist. Jurkat T Zellen (200 000 Zellen/Vertiefung) werden dann alleine oder zusammen mit dem Inhibitor oder dem Kontrollantikörper zugegeben (Endvolumen 400 μl) und für 24 oder 48 Stunden bei 37°C in 5 % Kohlendioxid inkubiert. Die Zellen werden dann geerntet und gewaschen. Die Zellen werden permeabilisiert (Cytoperm/Cytofix, Pharmingen Nr. 554722) und mit einem anti-aktive Caspase 3 FITC Antikörper (Pharmingen Nr. 559341) gefärbt und die Zellfärbung wird auf einem Durchflusscytometer untersucht. Die Ergebnisse zeigen an, dass die anti hFasL Antikörper bei der Hemmung der Caspase 3 Aktivierung wirksam sind (Caspase 3 Aktivität führt zu einer zellulären Apoptose).
Beispiel 8: Anti FasL Antikörper hemmen die Apoptose von HIV infizierten, humanen T Zellen
Periphere Blut T Zellen sind normalerweise still bis eine Immunreaktion stimuliert wird. Jedoch zeigen periphere T Zellen von HIV infizierten Patienten einen aktivierten Phänotyp, der eine Hochregulierung von Oberflächen-Fas und Induktion von FasL umfasst. Es wird in Betracht gezogen, dass diese Oberflächen-Fas-FasL Wechselwirkung für den Verlust vieler der peripheren, nicht HIV infizierten T Zellen durch Apoptose verantwortlich ist. Um zu untersuchen, ob anti FasL Antikörper diesen Zelltod blockieren können, wird das folgende Experiment ausgeführt.
Periphere mononukleare Blutzellen (PBMC) werden aus dem Vollblut von HIV infizierten Patienten mittels Ficoll-Hypaque gereinigt. Die Zellen werden zu Platten mit 24 Vertiefungen mit 700 000 Zellen/Vertiefung in Medium alleine oder zusammen mit PHA (5 μg/ml) und rekombinantem IL-2 (50 E/ml) gegeben, das die Zellen weiter aktiviert. Die Zellen werden mit oder ohne den anti-FasL Antikörpern (2 μg/ml bis 200 ng/ml in einem Endvolumen von 500 μl) inkubiert. Die Platten werden für 24 Stunden oder 72 Stunden bei 37°C in 5 % Kohlendioxid inkubiert. Die Zellen werden dann geerntet, gewaschen und mit anti-CD4-PE Antikörper inkubiert. Die Zellen werden dann erneut gewaschen, permeabilisiert und mit einem anti-aktive Caspase 3 FITC Antikörper gefärbt und die Zellfärbung wird auf einem Duchflusscytometer ermittelt. Die Ergebnisse zeigen, dass die anti-hFasL Antikörper bei der Verringerung der Aktivierung der Caspase 3 und daher der Apoptose sowohl in den CD4 positiven als auch CD4 negativen peripheren Blutlymphozyten wirksam sind.
Tabelle 1: DNA und Aminosäuresequenz der variablen Region der schweren Kette von 3E1
Tabelle 2: DNA und Aminosäuresequenz der variablen Region der schweren Kette von 4G11
Tabelle 3: DNA und Aminosäuresequenz der variablen Region der leichten Kette von 3E1 und 4G11
Sequenzliste
Sequenzliste

Claims

Isolierter humaner anti-hFasL Antikörper oder Antigen-bindender Teil hiervon mit einer variablen Region der leichten Kette (LCVR) und einer variablen Region der schweren Kette (HCVR) und umfassend zumindest zwei Polypeptide mit einer Sequenz, die aus den SEQ ID Nr 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 und 24 ausgewählt sind, worin der Antikörper einen Kp von weniger als 1 × 10^–9 M aufweist.
Isolierter humaner anti-FasL Antikörper oder Antigen-bindender Teil hiervon nach Anspruch 1, worin die LCVR ein Polypeptid mit der in SEQ ID Nr. 2 gezeigten Sequenz umfasst.
Isolierter humaner anti-hFasL Antikörper oder Antigen-bindender Teil hiervon nach Anspruch 1, worin die LCVR die in SEQ ID Nr. 2 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst und worin die HCVR die in SEQ ID Nr. 10 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst.
Isolierter humaner anti-hFasL Antikörper oder Antigen-bindender Teil hiervon nach Anspruch 1, worin die LCVR die in SEQ ID Nr. 2 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst und worin die HCVR die in SEQ ID Nr. 18 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst.
Isolierter humaner anti-hFasL Antikörper oder Antigen-bindender Teil hiervon nach Anspruch 1, worin die LCVR CDR1 Domäne die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 4 umfasst.
Isolierter humaner anti-hFasL Antikörper oder Antigen-bindender Teil hiervon nach Anspruch 1, worin die LCVR CDR2 Domäne die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 6 umfasst.
Isolierter humaner anti-hFasL Antikörper oder Antigen-bindender Teil hiervon nach Anspruch 1, worin die LCVR CDR3 Domäne die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 8 umfasst.
Isolierter humaner anti-hFasL Antikörper oder Antigen-bindender Teil hiervon nach Anspruch 1, worin die LCVR CDR1 Domäne die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 4 umfasst und worin die LCVR CDR2 Domäne die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 6 umfasst.
Isolierter humaner anti-hFasL Antikörper oder Antigen-bindender Teil hiervon nach Anspruch 1, worin die LCVR CDR1 Domäne die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 4 umfasst und worin die LCVR CDR3 Domäne die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 8 umfasst.
Isolierter humaner anti-hFasL Antikörper oder Antigen-bindender Teil hiervon nach Anspruch 1, worin die LCVR CDR2 Domäne die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 6 umfasst und worin die LCVR CDR3 Domäne die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 8 umfasst.
Isolierter humaner anti-hFasL Antikörper oder Antigen-bindender Teil hiervon nach Anspruch 1, worin die HCVR CDR 1 Domäne die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 12 oder 20 umfasst.
Isolierter humaner anti-hFasL Antikörper oder Antigen-bindender Teil hiervon nach Anspruch 1, worin die HCVR CDR 2 Domäne die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 14 oder 22 umfasst.
Isolierter humaner anti-hFasL Antikörper oder Antigen-bindender Teil hiervon nach Anspruch 1, worin die HCVR CDR 3 Domäne die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 16 oder 24 umfasst.
Isolierter humaner anti-hFasL Antikörper oder Antigen-bindender Teil hiervon nach Anspruch 1, worin die HCVR CDR 2 Domäne die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 14 oder 22 umfasst und worin die HCVR CDR 3 Domäne die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 16 oder 24 umfasst.
Isolierter humaner anti-hFasL Antikörper oder Antigen-bindender Teil hiervon nach Anspruch 1, worin die HCVR CDR 1 Domäne die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 12 oder 20 umfasst und worin die HCVR CDR 2 Domäne die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 14 oder 22 umfasst.
Isolierter humaner anti-hFasL Antikörper oder Antigen-bindender Teil hiervon nach Anspruch 1, worin die HCVR CDR 1 Domäne die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 12 oder 20 umfasst und worin die HCVR CDR 3 Domäne die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 16 oder 24 umfasst.
Isolierter Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 16, der eine schwere Kette der konstanten Region von IgG1 umfasst.
Isolierter Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 16, der eine schwere Kette der konstanten Region von IgG4 umfasst.
Isolierter Antigen-bindender Teil nach einem der Ansprüche 1 bis 16, der ein Fab Fragment ist.
Isolierter Antigen-bindender Teil nach einem der Ansprüche 1 bis 16, der ein F(ab')₂ Fragment ist.
Isolierter Antigen-bindender Teil nach einem der Ansprüche 1 bis 16, der ein Einketten Fv Fragment ist.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ein Polynukleotid umfasst, das für einen humanen anti-hFasL Antikörper kodiert oder ein Antigen-bindender Teil hiervon nach einem der Ansprüche 1 bis 21.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ein Polynukleotid nach Anspruch 22 umfasst, worin das Polynukleotid zumindest zwei Polynukleotide mit einer Sequenz umfasst, die ausgewählt ist aus den SEQ ID Nr. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 und 23 und Varianten hiervon, wie dies durch die Degeneration des genetischen Codes erlaubt ist.
Vektor, der das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 22 und 23 umfasst.
Vektor nach Anspruch 24, worin der Vektor ein Expressionsvektor ist.
Wirtszelle, die den Vektor nach Anspruch 24 oder Anspruch 25 umfasst.
Humaner Antikörper, der durch das Hybridom gebildet wird, das aus dem als ATCC PTA-4017 hinterlegten Hybridom und dem als ATCC PTA-4018 hinterlegten Hybridom ausgewählt ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die den Antikörper oder einen Antigen-bindenden Teil hiervon nach einem der Ansprüche 1 bis 21 oder Anspruch 27 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Antikörper oder Antigen-bindender Teil hiervon nach einem der Ansprüche 1 bis 21 oder Anspruch 27 zur Verwendung als Arzneimittel.