CN105393121B - 诊断癌症的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于诊断癌症疾病的方法，包括(a)测定癌症样品中CD95L的表达，和(b)根据CD95L表达的水平将癌症疾病分类。

Description

诊断癌症的方法
本发明涉及诊断癌症疾病的方法，包括(a)测定癌症样品中CD95L的表达，和(b)根据CD95L表达的水平将癌症疾病分类。
另一方面是与CD95L特异性结合的试剂，以用于通过根据CD95L表达的水平将癌症疾病分类来诊断癌症疾病。
还有另一方面是预测癌症患者的总存活期和/或无复发存活期的方法，所述方法包括(a)测定癌症样品中CD95L的表达，和(b)根据CD95L表达的水平预测患者的存活期和/或无复发存活期，其中CD95L表达与存活期负相关。
本发明的另一方面是治疗癌症的方法，所述方法包括(a)测定从患者获得的癌症样品中CD95L的表达，和(b)如果在步骤(a)中在癌症样品中检测到CD95L的表达，施用CD95L抑制剂。
进一步的方面涉及CD95L用于治疗癌症疾病，其中癌症疾病是CD95L阳性的癌症疾病。
孤立肿瘤细胞对周围脑组织的侵袭是多形性胶质母细胞瘤(GBM)的有效治疗的主要障碍之一。神经胶质瘤包括大部分起源于中枢神经系统(CNS)的肿瘤。在成年人中，最常见的肿瘤是来源于星形胶质细胞或少突胶质细胞的高级别赘生物。世界卫生组织根据它们间变的程度将这些恶性肿瘤分为II期(弥漫性星形细胞瘤)、III期(间变性星形细胞瘤)和IV期(GBM)(Kleihues,P.,Burger,P.C.,&Scheithauer,B.W.The new WHO classificationof brain tumors Brain Pathol.3,255-268,1993)。神经胶质瘤占所有脑肿瘤的超过50％，而且到目前为止是成年人中最常见的原发性脑肿瘤。尽管开发了新的诊断技术，存活率还是非常低。只有3％在诊断后五年仍然存活。恶性胶质瘤的临床结果依赖于孤立肿瘤细胞在正常脑组织中的侵袭。迁移细胞可以避开肿瘤的手术切除，并且是随后的放疗和辅助性化疗的主要目标。化疗剂和放射主要通过诱导凋亡发挥作用。这种对凋亡的诱导通常涉及CD95(Apo-1/Fas)死亡受体/配体系统的激活。尽管如此，大部分恶性胶质瘤细胞对于CD95诱导的凋亡有抵抗力。
在癌症诊断中，CD95L还没有被视为是预后因素。在癌症治疗中，CD95L的表达还没有被认为与治疗策略的确定相关。
在本发明中，令人惊讶地发现，癌症样品中CD95L的表达与降低的患者存活率有关。这意味着CD95L的表达是癌症患者总存活期的预后因素。实施例1证明在临床II期研究中，在诊断为“胶质母细胞瘤”的肿瘤样品中，CD95L以不同程度被表达。
而且，实施例1令人惊讶地证明CD95L抑制剂，例如APG101，可以在患者中提高癌症存活率，所述患者患有表达CD95L的癌症。相反，患有不表达CD95L的癌症的患者不能从CD95L抑制剂的治疗受益。实施例1使得这样的治疗策略成为可能，所述治疗策略包括诊断步骤，所述诊断步骤包括测定癌症样品中的CD95L表达，如果表达CD95L，随后用CD95L抑制剂治疗患者。通过CD95L的表达对癌症进行诊断性区分是可行的。这导致在CD95L表达的程度上对癌症(例如胶质母细胞瘤)有新的诊断分类，由此导致对于那些患有表达CD95L的癌症的患者进行适应性治疗。该策略是有利的，因为仅仅给那些预期能够成功治疗的患者施用CD95L抑制剂。这对于那些患有不表达CD95L的癌症的患者没有不利影响，因为这些患者可能不会从CD95L抑制剂的治疗中受益。
因此，可以看出，本发明的问题是癌症诊断和治疗的改进。本文提供的解决方案包括对癌症进行诊断性区分，区分为表达CD95L的亚型，和不表达CD95L的亚型。这些亚型至今尚未被鉴别，也未被认为需要基于CD95L表达进行特异性治疗。本发明提供的解决方案包括根据本发明鉴别的亚型的诊断进行的特异性治疗。
本发明的第一方面是用于诊断癌症疾病的方法，包括
(a)测定癌症样品中CD95L的表达，和
(b)根据CD95L表达水平将癌症疾病分类。
在本发明的优选实施方案中，用于诊断癌症疾病的方法可以包括步骤(c)，即确定和/或选择适合于已进行过诊断的这种类型的癌症的治疗方法，和/或进行治疗。
在本发明中，可以通过任何已知的适合的方法测定CD95L的表达。例如，可以测定CD95L mRNA。适合的方法的优选实例是组织学、组织化学和/或免疫组化方法。
本文所述的癌症诊断中使用的样品可以是存档的肿瘤组织，例如包埋在石蜡中的组织活检或手术材料，其是在疾病早期获得的。
可以根据CD95L表达的水平将癌症疾病分为CD95L阳性癌症疾病或CD95L阴性癌症疾病。
特别地，CD95L阳性癌症疾病的特征在于在细胞表面表达CD95L的细胞。但是，本文所述的方法还可以是基于CD95L的胞内表位的检测。
如果癌症样品中至少1％、至少2％、至少5％、至少10％、至少20％、或至少50％的细胞表达CD95L，则癌症可以被认为是CD95L阳性的。可以通过对显微切片中的细胞进行计数来确定CD95L阳性细胞的数量。
如果在组织样品中基本检测不到表达CD95L的细胞，或者如果样品是不符合本文定义的CD95L阳性样品标准的样品(非阳性样品)，则认为没有CD95L表达(CD95L阴性)。在CD95L阴性样品中，表达CD95L的肿瘤细胞的数量可以低于本文定义的CD95L阳性样品的阈值，例如的低于肿瘤细胞的1％、低于肿瘤细胞的2％、低于肿瘤细胞的3％、低于肿瘤细胞的4％、低于肿瘤细胞的5％、或低于肿瘤细胞的10％。
可以通过组织化学方法测定细胞中CD95L的表达，例如实施例2中公开的方法。特别地，可以通过使样品与特异性结合CD95L的试剂接触，来测定癌症样品中CD95L的表达。例如，CD95L抑制剂，如本文公开的，可用于测定CD95L，因为这些抑制剂可以特异性结合CD95L。可以使用特异性结合CD95L的抗体。适合的抗体可以通过已知的方法制备，适合的抗体的实例在实施例2和7中给出。这种抗-CD95L-特异性抗体或它的CD95L-识别片段可以结合CD95L的胞外或胞内域。根据优选的实施方案，抗-CD95L-特异性抗体或它的CD95L-识别片段结合CD95L的胞内表位。根据特别优选的实施方案，抗-CD95L-特异性抗体或它的CD95L-识别片段结合人CD95L的N-末端位置13上的酪氨酸(Y)。位置13上的这个酪氨酸是定义根据本发明的特别优选的抗体的特异性所必需的。根据特别优选的实施方案，抗-CD95L-特异性抗体或它的CD95L-识别片段识别编码人CD95L的N-末端氨基酸13-19的表位(参见图9)。
特别优选根据本发明的抗体是单克隆抗体。
其它特异性结合CD95L的试剂包括CD95的胞外受体域，或者它的功能性片段，它们例如被包含在进一步包含Fc域的融合多肽，或者它的功能性片段中。适合的融合多肽的实例是APG101，如本文所述的。适合的标记和染色方法是已知的。用与生物素化的二级抗体结合的链霉亲合素偶联的碱性磷酸酶染色的实例在实施例2中给出。
如果在组织切片中的肿瘤组织的至少1％、至少2％、至少5％、至少10％、至少20％、或至少50％的区域上能够检测到CD95L，也可以认为癌症是CD95L阳性的。该值在本文中被称为“肿瘤组织的CD95L阳性区域％”。在该分析中排除非肿瘤组织。组织切片可以通过已知的方法制备。用于检测CD95L的适合的方法在本文中描述。示例性的方法在实施例2中描述。确定CD95L阳性肿瘤组织的区域的实例在实施例3中给出。如果在组织样品中基本检测不到CD95L，或者如果肿瘤组织的CD95L阳性区域％低于本文定义的CD95阳性样品的阈值，例如低于肿瘤区域的1％、低于肿瘤区域的2％、低于肿瘤区域的3％、低于肿瘤区域的4％、低于肿瘤区域的5％、或低于肿瘤区域的10％，则认为没有CD95L表达(CD95L阴性)。
可以通过已知的方法测定CD95L的表达(例如根据组织切片中的细胞数量或表面)，例如通过基于组织切片的自动化分析的方法。
通过本发明的方法，可以用CD95L的表达诊断癌症，特别是实体肿瘤组织的类型。要被诊断和/或治疗的癌症还可以是淋巴或骨髓来源的癌症。
基于CD95L表达的诊断对于一些癌症类型的诊断和治疗是特别重要的，所述癌症类型是那些到目前为止还没有被认为是包括CD95L表达亚型，并且还没有被认为是需要进行适合于所诊断的CD95L表达亚型的特异性治疗的癌症类型。在本发明中鉴别的胶质母细胞瘤的CD95L表达亚型的实例是CD95L阳性胶质母细胞瘤和CD95L阴性胶质母细胞瘤，如本文所述的。本文提供的解决方案包括根据本发明鉴别的CD95L表达亚型的诊断进行的特异性治疗。
本发明提供了到目前为止还是未知的疾病模式，所述疾病模式是基于癌症细胞中的CD95L表达。任何类型的癌症，特别是实体肿瘤组织，可以被确定为是CD95L表达阳性或CD95L表达阴性的。癌症可以是以侵袭性生长为特征的。根据本发明要被诊断为CD95L阳性癌症或CD95L阴性癌症的癌症疾病可以选自由脑癌、结肠癌、结肠直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、肾癌、肝癌和/或它们的转移性疾病组成的组。特别地，癌症疾病是胶质瘤，特别是胶质母细胞瘤。
例如，根据本发明，根据肿瘤样品中CD95L表达的测定结果，通过到目前为止已知的诊断方法诊断的脑肿瘤可以被确定为CD95L阳性脑肿瘤或CD95L阴性脑肿瘤，如本文所述的。这些已知的诊断方法包括已知的组织学或组织病理学方法例如已知的组织染色方法和已知的免疫组化方法。
根据本发明，通过到目前为止已知的诊断方法得到的胶质瘤诊断可以被确定为CD95L阳性胶质瘤或CD95L阴性胶质瘤。
根据本发明，通过到目前为止已知的诊断方法得到的胶质母细胞瘤诊断可以被确定为CD95L阳性胶质母细胞瘤或CD95L阴性胶质母细胞瘤。
根据本发明，通过到目前为止已知的诊断方法得到的结肠直肠癌诊断可以被确定为CD95L阳性结肠直肠癌或CD95L阴性结肠直肠癌。
根据本发明，通过到目前为止已知的诊断方法得到的胰腺癌诊断可以被确定为CD95L阳性胰腺癌或CD95L阴性胰腺癌。
根据本发明，通过到目前为止已知的诊断方法得到的结肠癌诊断可以被确定为CD95L阳性结肠癌或CD95L阴性结肠癌。
根据本发明，通过到目前为止已知的诊断方法得到的乳腺癌诊断可以被确定为CD95L阳性乳腺癌或CD95L阴性乳腺癌。
根据本发明，通过到目前为止已知的诊断方法得到的肺癌诊断可以被确定为CD95L阳性肺癌或CD95L阴性肺癌。
根据本发明，通过到目前为止已知的诊断方法得到的肾癌诊断可以被确定为CD95L阳性肾癌或CD95L阴性肾癌。
根据本发明，通过到目前为止已知的诊断方法得到的肝癌诊断可以被确定为CD95L阳性肝癌或CD95L阴性肝癌。
根据本发明，由特定类型的癌症引起的转移性疾病，如本文所述的，可以被指定为CD95L阳性转移性疾病或CD95L阴性转移性疾病。
本发明中使用的CD95L抑制剂可以包含融合蛋白，所述融合蛋白包含至少胞外CD95域或它的功能性片段，和至少Fc域或它的功能性片段。特别地，融合蛋白选自APG101、与APG101具有至少70％同一性的多肽和APG101的功能性片段。
融合蛋白包含死亡受体CD95(Apo-1；Fas)的胞外域，其与PCT/EP04/03239中所述的免疫球蛋白Fc域融合，通过引用将PCT/EP04/03239公开的内容合并入本文。“融合蛋白”，如本文使用的，包括融合蛋白同种型的混合物，每一个融合蛋白包含至少胞外CD95域(APO-1；Fas)或它的功能性片段和至少第二个域，所述第二个域是分布在大约4.0至大约8.5的pI范围的Fc域或它的功能性片段。相应地，本文使用的胞外CD95域也被称为“第一域”，而Fc域可以被称为“第二域”。
融合蛋白混合物可以在组合物中提供。
第一域是胞外CD95域，优选哺乳动物胞外域，特别是人蛋白，即人胞外CD95域。融合蛋白的第一域，即胞外CD95域包含直到人CD95(SEQ ID NO.1)的氨基酸170、171、172或173的氨基酸序列。可以存在或不存在信号肽(例如SEQ ID NO:1的位置1-25)。特别地，为了治疗目的，人蛋白的应用是优选的。
融合蛋白可以包含一个或多个第一域，它们可以是相同的或不同的。优选在融合蛋白中存在一个第一域，即一个胞外CD95域。
根据优选的实施方案，Fc域或它的功能性片段，即根据本发明的融合蛋白的第二域，包含CH2和/或CH3域，和任选地至少铰链区的一部分，或来源于它们的修饰的免疫球蛋白域。免疫球蛋白域可以是IgG、IgM、IgD、或IgE免疫球蛋白域，或者来源于它们的修饰的免疫球蛋白域。优选地，第二域包含至少恒定IgG免疫球蛋白域的一部分。IgG免疫球蛋白域可以选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4域或者选自它们的修饰的域。优选地，第二域是人Fc域，例如IgG Fc域，例如人IgG1Fc域。
融合蛋白可以包含一个或多个第二域，它们可以是相同的或不同的。优选在融合蛋白中存在一个第二域，即一个Fc域。
进一步，第一和第二域优选都来自于同一个物种。
第一域，即胞外CD95域或它的功能性片段可以位于N-或C-末端。第二域，即Fc域或它的功能性片段也可以位于融合蛋白的C-或N-末端。但是，位于融合蛋白的N-末端的胞外CD95域是优选的。
根据进一步优选的实施方案，融合蛋白是APG101(CD95-Fc，SEQ ID NO:1中的位置26-400)。如SEQ ID NO:1所定义的，APG101可以是包含人胞外CD95域(氨基酸26-172)和人IgG1Fc域(氨基酸172-400)的融合蛋白，所述融合蛋白进一步任选地包含N-末端信号肽(例如SEQ ID NO:1的氨基酸1-25)。信号肽的存在表示APG101的不成熟形式。在成熟过程中，信号肽被切除。根据特别优选的实施方案，信号肽被切除。信号肽被切除的APG101也被包括在术语“未修饰的APG101”中。在进一步的实施方案中，融合蛋白是与APG101具有至少70％同一性，更优选75％同一性、80％同一性、85％同一性、90％同一性、95％同一性、96％同一性、97％同一性、98％同一性、99％同一性的多肽。根据本发明，术语“同一性”涉及所比较的两个氨基酸序列相同的程度，换句话说，在相同位置上具有相同氨基酸的程度。
术语“APG101”包括SEQ ID NO:1的位置26-400的融合蛋白，其具有或不具有信号肽。术语“APG101”还包括在N-末端具有CD95胞外域的截短形式的融合蛋白。
在另一个优选的实施方案中，根据本发明的融合蛋白是APG101的功能性片段。如本文所使用的，术语“片段”通常是指“功能性片段”，即与相应的野生型或全长蛋白具有基本上相同的生物活性和/或特性的野生型或全长蛋白的片段或部分。
本领域技术人员知晓设计和产生根据本发明的融合蛋白的方法。融合蛋白同种型，特别是APG101同种型的混合物可以通过例如PCT/EP04/03239中所述的方法获得，通过引用将其公开的内容合并入本文。根据优选的实施方案，设计本发明的融合蛋白包括选择第一域和第二域的末端氨基酸以使得两个域之间形成至少一个氨基酸的重叠。第一和第二域之间的重叠或两个第一域之间的重叠具有优选1、2或3个氨基酸的长度。更优选地，重叠具有一个氨基酸的长度。重叠氨基酸的实例是S、E、K、H、T、P、和D。
如上面所指出的，“融合蛋白”，如本文所使用的，包括同种型的混合物。本文使用的术语“同种型”指相同蛋白的不同形式，例如APG101的不同形式，特别是没有信号序列的APG101。这些同种型与相应的未修饰的蛋白，即从没有任何修饰的给定编码序列翻译和表达的蛋白相比，在例如蛋白质长度、氨基酸、即取代和/或缺失、和/或翻译后修饰上可能有所不同。可以，例如通过电泳，例如SDS-电泳、和/或等点聚焦区分不同的同种型，根据本发明所述等点聚焦是优选的。
在蛋白长度上有所不同的同种型可以是，例如，与相应的未修饰蛋白相比在N-末端和/或C-末端延长和/或缩短的。例如，根据本发明，APG101同种型的混合物可以包含未修饰形式的APG101以及它的在N-末端和/或C-末端延长和/或缩短的变体。因此，根据优选的实施方案，根据本发明的混合物包含APG101的在N-末端和/或C-末端缩短的变体。特别优选的是包含在N-末端缩短的融合蛋白的融合蛋白同种型混合物。这种在N-末端缩短的融合蛋白可以包含未修饰的APG101的-1,-2,-3,-4,-5,-6,-7,-8,-9,-10,-11,-12,-13,-14,-15,-16,-17,-18,-19,-20,-21,-22,-23,-24,-25,-26,-27,-28,-29,-30,-35,-40,-45和/或-50的在N-末端缩短的变体。特别优选的是N-末端-17,-21和/或-26的缩短的变体。编号参照根据SEQ ID NO:1的包括信号序列的APG101蛋白。换句话说，缩短的融合蛋白可以包含在N-末端截短1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,35,40,45和/或50个氨基酸的SEQ ID NO:1的序列。优选的缩短的融合蛋白是在N-末端截短16,20或25个氨基酸的SEQ ID NO:1。
APG101同种型的C-末端缩短的实例是C-末端Lys-修剪。
根据本发明的一个优选的实施方案，根据本发明的组合物的融合蛋白的混合物优选包含相对于经修饰的同种型而言50摩尔％的未修饰的APG101，更优选40摩尔％的未修饰的APG101，更优选30摩尔％的未修饰的APG101，更优选20摩尔％的未修饰的APG101，更优选10摩尔％的未修饰的APG101，更优选5摩尔％的未修饰的APG101，和更加优选3摩尔％的未修饰的APG101，和最优选1摩尔％和/或更少的未修饰的APG101。最优选的是这样的实施方案，其包括不包含任何未修饰的APG101的融合蛋白同种型的混合物。
如上面所概括的，同种型也可以因氨基酸取代、氨基酸缺失和/或氨基酸添加而不同。这样的置换和/或缺失可以包含一个或多个氨基酸。但是，根据该实施方案，单个氨基酸的取代是优选的。
根据本发明的同种型也可以在翻译后修饰方面有所不同。根据本发明的翻译后修饰可以涉及但不限于：添加疏水基团，特别是用于膜定位，例如豆蔻酰化、棕榈酰化、异戊二烯化或糖基磷脂酰肌醇化；添加辅因子用于增强酶活性，例如硫辛酰化；添加较小的化学基团，例如酰化、甲酰化、烷基化、甲基化、在C-末端处的酰胺化、氨基酸添加、γ-羧基化、糖基化、羟基化、氧化、甘氨酰化、生物素化和/或PEG化。
根据本发明，添加唾液酸，基于Fc的糖基化，特别是基于Fc的N-末端糖基化，和/或pyro-Glu修饰，是翻译后修饰的优选的实施方案。
根据优选的实施方案，本发明组合物所包含的融合蛋白包含大量的唾液酸。根据本发明，唾液酸的含量优选是大约4.0至7.0mol NeuAc/mol APG101，更优选是4.5至6.0molNeuAc/mol APG101，最优选是大约5.0mol NeuAc/mol APG101。如本文中所使用的，唾液酸是指神经氨酸的N-或O-取代的衍生物。优选的唾液酸为N-乙酰神经氨酸(NeuAc)。氨基基团通常携带乙酰基或羟乙酰基基团，但其他修饰也有描述。羟基取代基可以变化较大。优选的羟基取代基是乙酰基、乳酰基、甲基、硫酸和/或磷酸基团。唾液酸的添加通常导致带更多阴离子的蛋白质。产生负电荷使得这种修饰能够改变蛋白质的表面电荷和结合能力。高的唾液酸量导致更好的血清稳定性，以及因此而导致的改善的药物代谢动力学和更低的免疫原性。本发明的APG101同种型的高唾液酸化程度可以通过高的二触角结构数量来解释。必须认为非常令人惊讶的是，在通过本发明方法获得的本发明的组合物中的APG101同种型显示出如此高程度的唾液酸添加。
根据本发明，糖基化指这样的反应，其中碳水化合物与本文所定义的融合蛋白、它的功能性片段的官能团连接。特别地，它涉及碳水化合物向APG101或其同种型的添加。碳水化合物可以例如通过N-连接或O-连接进行添加。N-连接的碳水化合物与天冬酰胺或精氨酸侧链的氮连接。O-连接的碳水化合物与丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、羟赖氨酸或羟脯氨酸侧链的羟基氧连接。根据本发明，N-连接，特别是基于Fc的N-末端糖基化是优选的。特别优选的N-联糖基化位点位于APG101(SEQ ID NO:1)的位置N118、N136和/或N250。
根据本发明的岩藻糖基化涉及岩藻糖单元向分子的添加。就本发明而言，这种岩藻糖单元向融合蛋白(特别是APG101)的添加代表了特别优选的糖基化类型。高比例的岩藻糖基化形式导致降低的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。因此，融合蛋白同种型的混合物的特征在于降低的ADCC，这对于药物和诊断用途来说是有益的。
除了本文中定义的第一和第二域之外，根据本发明的融合蛋白可以包含其它域例如其它靶域，例如单链抗体或其片段和/或信号域。根据进一步的实施方案，根据本发明使用的融合蛋白可以包含N-末端信号序列，其允许在重组表达后从宿主细胞中分泌。信号序列可以是与融合蛋白的第一域同源的信号序列。或者，信号序列也可以是异源信号序列。在不同的实施方案中，融合蛋白不包含额外的N-末端序列，例如信号肽。
本文所述的融合蛋白可以是在N-末端封闭的融合蛋白，其对于蛋白酶对N-末端的降解提供了更高的稳定性，以及具有游离N-末端的融合蛋白，对于蛋白酶对N-末端的降解提供了更高的稳定性。
封闭蛋白质的N-末端的修饰是本领域技术人员已知的。但是，根据本发明，优选的封闭N-末端的翻译后修饰是pyro-Glu修饰。pyro-Glu也称为吡咯烷酮羧酸。根据本发明的pyro-Glu修饰涉及通过经由α-氨基基团与侧链羧基基团的缩合而发生的谷氨酰胺的环化来修饰N-末端谷氨酰胺。经修饰的蛋白质显示出增加的半衰期。这样的修饰也可以发生在谷氨酸残基上。对于在N-末端缩短的融合蛋白-26，特别优选的是pyro-Glu修饰，即吡咯烷酮羧酸。
本文所述的混合物可以包含80-99摩尔％的在N-末端封闭的融合蛋白和/或1-20摩尔％的具有游离N-末端的融合蛋白。
根据进一步优选的实施方案，本文所述的混合物包含0.0-5.0摩尔％，更优选0.0-3.0摩尔％，甚至更优选0.0-1.0摩尔％的融合蛋白高分子量形式，例如聚集体。在优选的实施方案中，混合物不包含任何融合蛋白同种型的聚集体，特别是没有APG101的二聚体或聚集体。二聚体或聚集体通常是不希望的，因为他们对于溶解性和免疫原性具有负面影响。
APG101的功能形式包含两个融合蛋白，如本文描述的，它们通过位于这两个分子相应于SEQ ID NO:1的位置179或/和182的位置处的铰链区的二硫桥相偶联。二硫桥还可以在这两个分子相应于SEQ ID NO:1的位置173的位置上形成，获得提高的稳定性。如果在相应于SEQ ID NO:1的位置173处的二硫桥是不需要的，那么该位置处的Cys残基可以被另一种氨基酸替换，或可以被缺失。
根据本发明，融合蛋白同种型的混合物分布在大约4.0至大约8.5的pI范围内。在进一步的实施方案中，根据本发明的组合物所包含的融合蛋白同种型的混合物的pI范围为大约4.5至大约7.8，更优选大约5.0至大约7.5。
等电点(pI)由特定分子或表面不携带电荷时所处的pH值定义。依赖于周围介质的pH范围，蛋白质的氨基酸可以携带不同的正或负电荷。在特定的pH范围，它的等电点，即pI值，蛋白质的所有电荷的总和为零。如果电场中的蛋白质分子到达具有该pH值的介质的点，它的电泳迁移率减小并且它停留在该位点。本领域技术人员熟悉用于确定给定蛋白质的pI值的方法，例如等电聚焦。该技术能够具有极其高的分辨率。具有单个电荷差别的蛋白质可以被分开和/或分级。
本发明的另一方面是与CD95L特异性结合的试剂，用于通过根据CD95L表达的水平将癌症疾病分类来诊断癌症疾病。在这一方面，癌症疾病可以根据CD95L表达的水平被分为CD95L阳性癌症疾病或CD95L阴性癌症疾病。
在这一方面中，癌症可以是任何癌症，如本文所述的。特别地，癌症疾病选自由脑癌、结肠癌、结肠直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、肾癌、肝癌或/和它们的转移性疾病组成的组。更特别地，癌症疾病是胶质瘤，更特别是胶质母细胞瘤。
在这一方面，试剂可以是如本文所述的与CD95L特异性结合的试剂。试剂可以是如本文所述的任何CD95L抑制剂。
特别地，与CD95L特异性结合的试剂包含如本文所述的融合蛋白，所述融合蛋白包含至少胞外CD95域或它的功能性片段，和至少Fc域或它的功能性片段。更特别地，融合蛋白选自APG101、与APG101具有至少70％同一性的多肽和APG101的功能性片段。
本发明的另一方面是与CD95L特异性结合的试剂，用于通过根据CD95L表达的水平将患者的癌症疾病分类，来预测癌症患者的总存活期和/或无复发存活期。
在这一方面，癌症可以是任何癌症，如本文所述的。特别地，癌症疾病选自由脑癌、结肠癌、结肠直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、肾癌、肝癌和/或它们的转移性疾病组成的组。更特别地，癌症疾病是胶质瘤，更特别是胶质母细胞瘤。
在这一方面，试剂可以是如本文所述的与CD95L特异性结合的试剂。试剂可以是如本文所述的任何CD95L抑制剂。
特别地，与CD95L特异性结合的试剂包含如本文所述的融合蛋白，所述融合蛋白包含至少胞外CD95域或它的功能性片段，和至少Fc域或它的功能性片段。更特别地，融合蛋白选自APG101、与APG101具有至少70％同一性的多肽和APG101的功能性片段。
在本发明中，总存活期(OS)表示患有癌症的一群个体保持存活的可能性。它表示在该群中在特定时间之后还有可能生存的个体的百分比。
本发明的另一个方面是预测癌症患者的总存活期或/和无复发存活期的方法，所述方法包括
(a)测定癌症样品中CD95L的表达，和
(b)根据CD95L表达的水平预测患者的存活期或/和无复发存活期，其中CD95L表达与存活期负相关。
在这一方面，癌症样品可以从患者获得。优选地，该方法不包括从患者获得癌症样品的步骤。
在这一方面，可以根据CD95L表达的水平将癌症疾病分为CD95L阳性癌症疾病或CD95L阴性癌症疾病。
在这一方面，癌症可以是任何癌症，如本文所述的。特别地，癌症疾病选自由脑癌、结肠癌、结肠直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、肾癌、肝癌和/或它们的转移性疾病组成的组。更特别地，癌症疾病是胶质瘤，更特别是胶质母细胞瘤。
在这一方面，试剂可以是如本文所述的与CD95L特异性结合的试剂。试剂可以是如本文所述的任何CD95L抑制剂。
特别地，与CD95L特异性结合的试剂包含如本文所述的融合蛋白，所述融合蛋白包含至少胞外CD95域或它的功能性片段，和至少Fc域或它的功能性片段。更特别地，融合蛋白选自APG101、与APG101具有至少70％同一性的多肽和APG101的功能性片段。
本发明的进一步的方面是治疗癌症的方法，所述方法包括
(a)测定从患者获得的癌症样品中CD95L的表达，和
(b)如果在步骤(a)在癌症样品中检测到CD95L的表达，施用CD95L抑制剂。
本发明的另一方面是CD95L抑制剂，用于治疗癌症疾病，其中癌症疾病是CD95L阳性癌症疾病。癌症疾病可以是本文所述的任何癌症疾病。CD95L抑制剂可以是本文所述的任何CD95L抑制剂。
本发明的进一步的方面涉及CD95L抑制剂在制造用于治疗癌症疾病的药物中的用途，其中癌症疾病是CD95L阳性癌症疾病。CD95L抑制剂可以是本文所述的任何CD95L抑制剂。
如本文所述的要被诊断或/和治疗的癌症患者可以是癌症，例如胶质母细胞瘤初次或二次复发或者发展的患者。患者可以是这样的患者，其中在胶质母细胞瘤的治疗中，标准治疗包括放疗(例如60Gy)或/和替莫唑胺已失败。特别地，患者是再次放射治疗的候选者，例如用于治疗胶质母细胞瘤。
在本文所述的治疗用途中，CD95L抑制剂可以系统性施用，例如通过输注或注射。
本发明通过下述附图和实施例进行进一步说明。
附图说明
图1:随机分为仅进行放疗(RT)组(对照组)和放疗加上APG101组(试验组)的GBM患者的存活分析(Kaplan-Meier图)。(1)试验组。(2)对照组。横坐标：存活期(天)。纵坐标：存活率。存活率为1.0表示100％存活。
图2:从图1所述的患者中选出的CD95L阳性患者亚组的存活数据比较(Kaplan-Meier图)。(1)试验组，放疗加上APG101。(2)对照组，仅放疗。横坐标：存活期(天)。纵坐标：存活率。存活率为1.0表示100％存活。
图3:从图1所述的患者中选出的CD95L阴性患者亚组的存活数据比较(Kaplan-Meier图)。(1)试验组，放疗加上APG101。(2)对照组，仅放疗。横坐标：存活期(天)。纵坐标：存活率。存活率为1.0表示100％存活。
图4:根据实施例3的胶质母细胞瘤组织切片中CD95L表达水平的实例。给出了高表达(CD95L阳性)和低CD95L表达(CD95L阴性)的实例。图片中显示了每个表达水平的两个实例。
图5:纯化的抗-CD95L单克隆兔抗体的比较。A)纯化的抗-CD95L单克隆兔抗体的非还原性SDS-Page/银染色。第1道显示了在HEK-细胞中表达后纯化的重组抗体(APG1181)。第3道显示了从兔杂交瘤克隆24-8中纯化的纯化抗体。
B)纯化抗体的ELISA分析：分析APG1181和来自克隆24-8的抗体识别固定化CD95L-肽(CD95L-NT_1-21)的特异性，所述CD95L-肽(CD95L-NT_1-21)用于免疫兔。两种抗体都与固定化的肽特异性结合。通过加入表位特异性肽(+特异性肽)进行竞争，证实两种抗体都能特异性识别。但是，非特异性的肽对于两种抗体都没有显著的竞争效果。
在APG1181和克隆24-8之间没有观察到在特异性或灵敏度上有差异。
图6:在基于IHC的分析中抗-CD95L兔单克隆抗体的特异性。
在缺乏或存在特异性肽(CD95L-NT_1-21)的条件下，用来自克隆24-8的纯化抗体分析已知在浆细胞亚集中表达CD95L的人扁桃腺切片，如所指出的。在缺乏(克隆24-8)所述肽的条件下观察到的特定信号在存在竞争肽的条件下完全消失，这证实了抗体的特异性。
图7:纯化的抗-CD95L单克隆兔抗体的比较。
在IHC-分析中在胶质母细胞瘤切片上分析纯化的抗体APG1181和来自克隆24-8的抗体识别CD95L的特异性。为了进行分析，选择两个之前分别确定为CD95L阴性或CD95L阳性的胶质母细胞瘤切片，使用商购的多克隆抗-CD95L抗体。从图中可以看出，在对胶质母细胞瘤组织的基于IHC的分析中，在APG1181和克隆24-8之间没有观察到在特异性或灵敏度上有差异。
图8:用于CD95L-抗体的表位作图的肽。
所显示的肽被用于鉴别抗-CD95L兔单克隆抗体的表位。肽编码人CD95L的N-末端部分。第一个肽CD95L-NT_1-21)被用于免疫兔以产生兔单克隆抗体。较短的、截短的版本(肽2-7)以及各个置换的肽(8-11)被用于对单个抗体的表位进行精细作图。
图9:抗-CD95L兔单克隆抗体(APG1181)的表位作图。
为了进行表位作图，各个肽(参见图8)与BSA偶联，肽-BSA-缀合物(如所指出的)固定在ELISA板上，并与重组抗-CD95L兔单克隆抗体(APG1181)温育，然后与特异性过氧化物酶-缀合的抗-兔二级抗体温育。如图所示，APG1181特异性识别编码人CD95L的N-末端aa13-19的表位。
图10:抗-CD95L兔单克隆抗体(APG1181)的精细表位作图。
肽-BSA-缀合物(如所指出的)固定在ELISA板上，并与重组抗-CD95L兔单克隆抗体(APG1181)温育，然后与特异性过氧化物酶-缀合的抗-兔二级抗体温育。
(A)如所示的，APG1181特异性识别编码人CD95L的N-末端aa13-19的表位。使用置换的肽(8-11，图8)对表位进行精细作图表明位置13的Y(酪氨酸)对于定义各个抗体APG1181/24-8的特异性来说是绝对必需的。位置14的W(色氨酸)和位置19的A(丙氨酸)分别对抗体的结合特异性(表位)只具有边缘影响。
(B)识别类似表位但是不绝对需要位置13的“Y”的不同抗体(克隆39-9)，令人惊讶地在基于IHC的分析中显示出对于CD95L没有特异的反应性。
图11:抗-CD95L兔单克隆抗体在基于IHC的分析中的特异性的比较。
分析来自克隆24-8和克隆39-9的纯化抗体检测人扁桃腺切片上浆细胞子集中CD95L的能力。虽然两种抗体具有类似的表位，克隆39-9令人惊讶地在基于IHC的分析中显示出对于CD95L没有反应性。根据该结果，可以得出结论，位置13的“Y”对于克隆24-8的IHC反应性来说是先决条件。
实施例1
APG101(CD95配体抑制剂)用于治疗癌症：II期研究
II期研究是随机的、非盲的、多中心的研究，在胶质母细胞瘤首次或二次复发或发展的患者的治疗中，每周一次，进行APG101加上再次照射(APG101+RT组，试验组)相对于单独的再次照射(RT组，对照组)。该研究中总共包括91名患者。ITT人群由84名患者组成，58名在APG101+RT组，26名在RT组。不能进行肿瘤切除或在切除后具有肉眼可见的残余肿瘤的胶质母细胞瘤首次或二次复发的男性和女性患者是本研究的候选者。合格的患者必须是标准治疗失败的，所述标准治疗必须包括放疗(60Gy)和替莫唑胺并且必须是再照射的候选者。本研究中包括的患者接受单独的再照射或再照射加上400mg APG101，APG101以30min静脉内输注的形式施用，每周一次，直至有进展。
从(ITT人群的)81名患者获得用于组织分析的存档的肿瘤组织以证实胶质母细胞瘤诊断。对于中央组织检查(central histology review)，必须得到包埋在石蜡中的组织活检或手术材料，以进行中央检查，以证实胶质母细胞瘤的初步诊断。所有获得的样品都是来自于最初的手术和疾病诊断或研究前手术切除的存档样品。在患者登记后，由研究中心收集石蜡包埋的肿瘤样品。由这些肿瘤样品制备组织切片，以通过免疫组化染色(IHC)评估各种“标志物”，包括CD95L。
参与这项临床研究的多形性胶质母细胞瘤(GBM)患者被随机分为对照组和试验组。
结果
图1描述了对照组和试验组的患者的存活率(总存活率，OS)。该图表明接受APG101和放疗的试验组的患者与仅接受放疗的对照组相比具有提高的存活率(参见表1)。
表1：所有患者的总体存活率
仅RT(OS率) APG+RT(OS率)
6m 77％ 90％
12m 50％ 50％
18m 23％ 34％
24m 7.3％ 22％
通过免疫组化染色分析对照组患者和试验组患者的GBM肿瘤样品切片中CD95配体(CD95L)的存在(参见实施例2)。
令人惊讶地发现，CD95L表达的水平和分布在患者中是非常不同的。大约三分之一的患者显示出在肿瘤组织中有强阳性的CD95L表达。还有另外三分之一的患者显示出CD95L阴性的表型。其余患者显示出CD95L的少量表达。这种表型可以称为“低水平阳性(lowpositive)”表型。
在接受APG101加上放疗的试验组患者中(N＝58)，18名患者的肿瘤组织表现为强阳性CD95L表达的表型。18名患者表现为CD95L阴性的表型。在对照组中(N＝26)，10名患者显示为强阳性CD95L表型，9名患者显示出CD95L阴性表型(表2)。
表2:试验组(APG101加上放疗，“APG+RT”)和对照组(仅放疗，“仅RT”)的总存活期。N：患者数量。中位数按天计。“95％(-/+)”表示95％的置信区间。
*在APG组中3名患者被检查过(仍然生存)
令人惊讶地是，对照组GBM患者的总存活期与CD95L表达的水平负相关。显示出强CD95L阳性表型的GBM的患者与具有CD95L阴性GBM的患者相比，预后更差。CD95L阳性患者存活250天，而CD95L阴性患者存活460天(参见表2)。
在试验组中，显示出强CD95L阳性表型的GBM的患者从治疗中受益。CD95L阳性患者存活350天。
图2的Kaplan-Meyer图比较了对照组和试验组的CD95L阳性患者中获得的存活数据。用APG101治疗后，曲线变为更长的存活期。这意味着显示出CD95L阳性表型的GBM的患者从APG101的施用中受益。中位数总存活期从250天(对照组)增加至350天。
在试验组中，CD95阴性患者的中位数总存活期是410天。与显示为阴性CD95L表型的对照组患者相比，在用APG101治疗后，中位数总存活率从460天减少到410天。该数据在图3的Kaplan-Meyer图中描述。该图表明试验组和对照组的曲线在很大程度上是重叠的，并且在统计学不显著。
总结
该实施例证明了癌症中CD95L的表达与降低的患者存活率有关。这意味着CD95L适合作为癌症的预后因素。这特别在那些以不同程度表达CD95L的癌症类型(例如胶质母细胞瘤)中是重要的。因此，本发明使得可以根据CD95L的表达对癌症进行诊断性区分。这导致对癌症(例如胶质母细胞瘤)的新的诊断性区分，区分为CD95L阳性癌症和CD95L阴性癌症。
而且，该实施例令人惊讶地证明CD95L抑制剂，例如APG101，可以提高患有表达CD95L的癌症的患者的存活率。相反，患有不表达CD95L的癌症的患者不能从CD95L抑制剂的治疗中受益。该实施例使得这样的治疗策略成为可能，所述治疗策略包括测定癌症样品中CD95L的表达，如果CD95L表达，对患者进行治疗。该策略是有利的，因为可以给那些预期能够成功治疗的患者施用CD95L抑制剂。这对于那些患有不表达CD95L的癌症的患者没有不利影响，因为这些患者不会从CD95L抑制剂的治疗中受益。
实施例2
CD95L的免疫组化测定
可以通过下述过程在组织切片(例如肿瘤组织切片)中测定CD95L：
●在4％缓冲的甲醛中固定组织样品并在石蜡中包埋。
●对3μm后的切片进行脱蜡：
1.二甲苯10min.
2.二甲苯10min.
3.二甲苯10min.
1. 100％乙醇5min.
2. 100％乙醇5min.
96％乙醇5min.
90％乙醇5min.
70％乙醇5min.
1.蒸馏H2O 1min
2.蒸馏H2O 5min.
●高温抗原解蔽过程：
Citrat pH 6.0(Target Retrieval Solution),99℃,(DAKO,Cat.No.S1699),25min.
●在室温冷却15min
●在PBS中洗涤2x5min
●对于具有高内源性生物素的组织：Biotin-Block(DAKO,Biotin BlockingSystem,X0590)，例如对于从胰腺、肝、肾获得的样品，
→抗生物素蛋白10min.，室温(RT)
→在PBS中漂洗1x5min
→生物素10min.RT
→在PBS中漂洗1x5min
●为了阻断非特异性的抗体结合，切片与封闭液1(PBS,BSA 20mg/ml；Serva,Germany,Cat.No.11924)、人IgG 1mg/ml,(Gammunex10％,Talecris)温育20min。
●在封闭液1中稀释第一抗体
→抗CD95aAPG101兔Fc耗尽的2μg/ml
→抗CD95L多克隆兔(Dianova,Cat.No.DLN-14047)1:100
→兔IgG同种型对照(Invitrogen(Zytomed),Cat.No.08-6199)
●在室温温育60分钟。
●在PBS中洗涤2x5min
●用封闭液2封闭20分钟。用封闭液2封闭＝用封闭液1封闭+20％常规羊血清，Dianova,Cat.No.005-000-121。
●在封闭液2中稀释第二抗体，例如生物素化的山羊F(ab′)2抗_兔IgG(H+L链)(SouthernBiotech,Cat.No.4052-08)1:100，在室温温育30分钟
●在PBS中洗涤2x5min
●链霉亲合素-碱性磷酸酶(Concentrated AP label,BioGenex,Cat:No.HK321-UK)，在封闭液1中稀释，在室温温育30分钟
●在PBS中洗涤2x5min
●与碱性磷酸酶底物(DAKO Liquid Permanent Red,DakoCytomation GmbH,Glostrup,Denmark,Cat.No.K0640)温育
●用苏木精(Merck,MayersCat.No.1.09249.0500)复染
●确定相对于细胞总数量的染色细胞数量(CD95L阳性细胞％)，或/和相对于总面积的染色面积的大小(CD95L阳性面积％)。如果检查的是肿瘤组织：确定相对于肿瘤细胞总数量的染色肿瘤细胞数量(CD95L阳性肿瘤细胞％)，或/和相对于肿瘤组织总面积的肿瘤组织染色面积的大小(CD95L阳性的肿瘤组织面积％)。不考虑非肿瘤组织。
实施例3
CD95L免疫组化染色玻片的评价
1.一般方面
由一位神经肿瘤领域的具有丰富经验的通过资格验证的神经病理学家(C.H.)对所有CD95L染色的玻片(参见实施例2)进行评价。在一次评价过程中一个个玻片进行所有的评价。在所有的评价过程中最长的暂停时间为彼此之间不超过60分钟。神经病理学家对于患者的临床数据是盲性的。由同一个神经病理学家根据H&E-和银染，并组合之前的Mib1-、GFAP-和IDH1 R132H免疫组化，作出参考组织学诊断。但是，在CD95L-评价时，这些诊断相关的玻片都不可得。神经病理学家仅有关于该诊断的个人告知。进一步，神经病理学家评价了MGMT状态，当评估CD95L玻片时，就会从该分析中知道结果。
2.校准图的生成
由Apogenix公司进行CD95L的免疫组化染色。评价的神经病理学家(C.H.)不参与染色的技术方面，他对于所使用的方案是盲性的。在CD95L免疫组化建立过程结束之后，将少量的CD95L染色玻片交给神经病理学家以检查其质量。神经病理学家确认所应用的免疫组化能够获得高质量的结果，并同意将该方案定义为其它CD95L染色的标准。
根据这些产生出来用于质量评估的玻片，生成校准图，其允许进行CD95L免疫组化强度的比较。在Carl Zeiss AxioPlan2显微镜上用AxioCamHR数码相机和软件AxioVision4.8拍摄照片。在CorelDraw v14.0中直接加入未修改的照片并进行排列。两张具有类似CD95L免疫组化强度的来自不同样品的照片放置在一行上。概括地说，产生2行照片，其代表了CD95L免疫组化强度“CD95L阳性(高)”或“CD95L阴性(低)”(参见图4)。
3.概况和组织选择
在第一步中，在低分辨率的显微镜(Olympus BX46)下扫描玻片以评价实体肿瘤组织的量。正常脑实质的区域和肿瘤浸润区域被排除，不进行进一步分析。如果满足下述标准，选择肿瘤组织进行进一步评价：
●表现出有生命力的没有缺氧损伤迹象的肿瘤组织。
●没有切除诱导的新鲜出血的肿瘤组织。
●没有切割导致的人工行为迹象的肿瘤组织。
4.单一玻片评价–标准“强度”
对每张玻片的适合的肿瘤组织进行评价，评价涉及CD95L阳性或CD95L阴性染色强度。使用CD95L校准图对评价进行标准化。由于大部分肿瘤在不同的区域表现出不同的染色强度，计算这些总的区域的百分比。每一个肿瘤都赋有一个特定的百分比值，该值代表了显示出CD95L阳性或CD95L阴性染色强度的区域：
强度 百分比
没有(CD95L 阴性) <2％
CD95L 阳性 >5％
最终，结果以中央病理学检查表的形式告知。
5.单一玻片评价–标准“分布模式”
神经胶质肿瘤(例如胶质母细胞瘤)由肿瘤细胞和肿瘤细胞过程的纤丝基质组成。使用光学显微镜时，无法将这些过程归属于特定的肿瘤细胞。如果观察到在这种基质的细胞区室中CD95L抗体结合占优势，染色模式被定义为“弥漫的”。如果明显肿瘤细胞是CD95L-标记的，染色模式被定义为“局部的”。如果在肿瘤组织中基本上没有观察到CD95L标记，或者CD95L阳性区域为肿瘤组织的低于2％，不评价分布模式。最终，结果以中央病理学检查表的形式告知。
6.CD95L结果的报告
CD95L评价的结果以中央病理学检查表的形式告知(见上文)。该表注明日期并由负责的神经病理学家签字。
7.适合于基于IHC的分析的特定CD95L-抗体的产生
开发了CD95L特异性兔单克隆抗体，所述抗体是用合成的N-末端肽免疫兔获得的，所述N-末端肽编码人CD95L的前21个氨基酸(CD95L_NT 1-21:MQQPFNYPYPQIYWVDSSASS)。对于适合于在基于IHC的测定中进行检测的合适抗体的选择，对于候选的抗-CD95L兔单克隆抗体进行彻底的表征，包括IHC-分析。筛选过程鉴别了多个特异性识别用于免疫的N-末端肽的抗体。但是，一个兔单克隆抗体“克隆24-8”特别适合于在基于IHC的分析中检测CD95L。
为了确保稳定的抗体供应，在HEK细胞中进行源自于克隆24-8的抗体的重组表达。源自于克隆24-8的重组抗体是基于各自的IgG的重链和轻链序列，并且被称为APG1181。重组抗体的特异性与源自于杂交瘤克隆24-8的抗体相同(参见图5和图7)。通过ELISA、IHC分析和特异性表位作图来表征抗体的特异性。

Claims (16)

1.用于测定癌症样品中CD95L的表达的试剂在制备用于诊断癌症疾病的诊断剂中的用途，其中所述癌症疾病根据CD95L表达的水平来进行分类，其中通过CD95L表达的水平将所述癌症疾病分类为CD95L阳性癌症疾病或CD95L阴性癌症疾病，其中如果癌症样品中至少5％的细胞在细胞表面上表达CD95L和/或如果在组织切片中的肿瘤组织的至少5％的区域上能够检测到CD95L，那么癌症样品被认为是CD95L阳性的，并且其中所述癌症疾病是胶质母细胞瘤。
2.根据权利要求1的用途，其中所述CD95L阳性癌症疾病的特征在于在细胞表面上表达CD95L的细胞。
3.根据权利要求1的用途，其中通过使所述样品与特异性结合CD95L的试剂接触来测定癌症样品中CD95L的表达。
4.根据权利要求3的用途，其中所述特异性结合CD95L的试剂包括融合蛋白，所述融合蛋白包含至少胞外CD95域或它的功能性片段和至少Fc域或它的功能性片段，和/或所述特异性结合CD95L的试剂是抗-CD95L特异性抗体或它的识别CD95L的片段。
5.根据权利要求4的用途，其中所述融合蛋白选自APG101和APG101的功能性片段。
6.根据权利要求4的用途，其中所述特异性结合CD95L的试剂是抗-CD95L特异性抗体或它的识别CD95L的片段，其与CD95L的胞内表位结合。
7.根据权利要求6的用途，其中所述CD95L是在N-末端位置13处包含氨基酸Y的人CD95L。
8.根据权利要求6的用途，其中所述抗-CD95L特异性抗体或它的识别CD95L的片段识别编码人CD95L的N-末端氨基酸13-19的表位。
9.根据权利要求1-8中任一项的用途，其进一步包括确定和/或选择适合于已被诊断出的癌症类型的治疗方法，和/或进行治疗。
10.用于测定癌症样品中CD95L的表达的试剂在制备用于在癌症患者中预测总存活期和/或无复发存活期的诊断剂中的用途，其中通过CD95L表达的水平将所述癌症疾病分类为CD95L阳性癌症疾病或CD95L阴性癌症疾病，其中通过CD95L表达的水平来预测患者的存活期和/或无复发存活期，其中CD95L表达与患者的存活期负相关，并且其中所述癌症疾病是胶质母细胞瘤。
11.根据权利要求10的用途，其中通过融合蛋白来测定CD95L表达的水平，所述融合蛋白包含至少胞外CD95域或它的功能性片段和至少Fc域或它的功能性片段，和/或通过抗-CD95L特异性抗体或它的识别CD95L的片段来测定CD95L表达的水平。
12.根据权利要求11的用途，其中所述融合蛋白选自APG101和APG101的功能性片段。
13.根据权利要求10-12中任一项的用途，其中所述试剂是抗-CD95L特异性抗体或它的识别CD95L的片段，其与CD95L的胞内表位结合。
14.根据权利要求13的用途，其中所述CD95L是在N-末端位置13处包含氨基酸Y的人CD95L。
15.根据权利要求13的用途，其中所述抗-CD95L特异性抗体或它的识别CD95L的片段识别编码人CD95L的N-末端氨基酸13-19的表位。
16.CD95L抑制剂在制备用于治疗癌症疾病的药物中的用途，其中所述癌症疾病已经通过经由使用特异性结合CD95L的试剂测定癌症样品中CD95L的表达而被分类为CD95L阳性癌症疾病，这是由于癌症样品中至少5％的细胞在细胞表面上表达CD95L和/或在组织切片中的肿瘤组织的至少5％的区域上能够检测到CD95L；并且其中所述癌症疾病是胶质母细胞瘤。
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