JP5754740B2 - 細胞内薬物送達のためのfas(アポ−1,cd95)標的化プラットフォーム - Google Patents
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Description
重要な物質
FasFcキメラ − カタログ番号:F8799−50ug;供給業者:シグマアルドリッチ(英国)
ポリスチレン蛍光マイクロ粒子:ドラゴングリーン0.5μm − カタログ番号:FS03F/5069;ドラゴングリーン1.0μm − カタログ番号:FS03F/7220;供給業者:バングズラボラトリーズ(Bangs Laboratories)(米国)
乳酸−グリコール酸共重合体(PLGA) − カタログ番号 Resomer(登録商標)RG502H;供給業者:アルファケミカルズ(Alfa Chemicals)(英国)
DaoyおよびND7/23細胞株を、10%ウシ胎仔血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)を添加したDMEM(グルタミン含有)培地中、37℃および5%CO2にて培養した。細胞は、60mmのペトリ皿に播種し、実験グループあたり3つのペトリ皿とした。ND7/23細胞株は、培養中、フローサイトメトリーの5日前に神経成長因子(NGF)で分化させた。Daoy細胞は、NGFを添加せず、分化に必要である追加の成長因子なしで培養した。
免疫細胞化学的に標識した細胞を、顕微鏡を用いてウェル培養スライドから直接観察した。Leica DMRD顕微鏡(レイカ(Leica)、英国)を、蛍光顕微鏡観察のみに用い、共焦点分析にはZeiss LSM510顕微鏡(Zeiss(ゼイス)、英国)を用いた。顕微鏡に付属のソフトウェアおよびAdobe Photoshop 7.0を用いてイメージの取り込みと表示を行った。
透過型電子顕微鏡については、リン酸緩衝した4%グルタルアルデヒド中で細胞を1時間固定し、緩衝液中にて一晩静置した。細胞は、1%四酸化オスミウムで30分間の後固定を行った。それぞれ、Durcupan溶液の一連の勾配(50、70、90、100、および100%)、100%Durcupanと包埋媒体との混合物、ならびに純包埋媒体によって脱水を行った。70〜80nmの超薄切片を銅グリッド上に回収し、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色し、その後、加速電圧80kVでの観察を行った。
本研究には、セルクエストソフトウェア付きのFACScanフローサイトメーター(ベクトンディクソン(Beckton Dixon))を用いた。各実験グループからの細胞をプロトコルごとに調製し、ラベル付きフローサイトメトリーチューブに移して分析した。適切なゲーティングおよびコントロールを用いた。細胞は、適切な抗体を用いて検出した。インターナリゼーションの研究では、ポリスチレン粒子はFITCチャネル中で蛍光性であった。
死細胞集団を、7AAD(7−アミノアクチンミオシンD)(7−Aminoactinmyosin D)アッセイを用いて識別した。H2O2をポジティブコントロールとして用い、これを、37℃で4時間、最終濃度100mMにて培養物へ添加した。浮遊する細胞を、各ペトリ皿からファルコンチューブへ移し、遠心分離に掛けてフローサイトメトリー用に細胞を調製した。7AADアッセイについては、10μlの7AADを各フローチューブに添加し、サンプルを分析して細胞死を評価した。
マイクロ粒子を、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラット血清、IgG、またはFasFcを用いた単純吸着によって表面修飾した。これらを10μg/200μlの対応するリガンド中に少なくとも90分間懸濁させ、一方、未コーティングマイクロスフェアを、同体積のリン酸緩衝生理食塩水中に懸濁させた。この懸濁液を30分ごとにボルテックス攪拌し、マイクロスフェアの適切なコーティングを確保した。また、種々の化学結合技術を用いてマイクロ粒子を修飾することも可能であり、または、リガンドを生分解性マイクロ粒子のマトリックス中に組み込むこともできる。
ドキソルビシンまたはパクリタキセル充填PLGAマイクロ粒子を、標準的な二重エマルジョン技術を用いて合成した。PLGA(RG502H、ベーリンガーインゲルハイム(Boehringer Ingelheim)、ドイツ)プラセボ(未充填)マイクロスフェアを、単一エマルジョン溶媒蒸発技術、マイクロシーブ乳化によって作製した。乳化の前に、ジクロロメタン中7重量/体積%のPLGA溶液を0.2μmPTFEフィルターを通してろ過した。その後、このPLGAを、表面一帯に均一な細孔を有する微細加工された膜であるマイクロシーブ膜(Nanomi BV、オランダ)を通して、乳化剤を含有する水溶液中へ乳化した。得られたエマルジョンを、室温にて少なくとも3時間攪拌し、溶媒を蒸発させた。固化されたマイクロスフェアを、ろ過によって濃縮し、繰り返し洗浄した。次に、粒子を凍結乾燥し、評価まで−20℃で保存した。パクリタキセル充填PLGA(RG502H、ベーリンガーインゲルハイム、ドイツ)マイクロスフェアについては、パクリタキセルを、ジクロロメタン中6重量/体積%のPLGA溶液に添加、溶解し、25重量/重量%の最終マイクロ粒子薬物濃度を得た。この溶液を、0.2μmPTFEフィルターを通してろ過し、シリコンマイクロシーブを通して乳化した。乳化剤を含有する超純水を連続相として用いた。エマルジョンをマグネティックスターラーにより室温にて少なくとも3時間攪拌し、ジクロロメタンを蒸発させた。固化後、マイクロスフェアをやはりろ過によって回収し、繰り返し洗浄した。次に、粒子を凍結乾燥し、評価まで−20℃で保存した。均一なサイズのパクリタキセル充填およびプラセボマイクロ粒子(約1.5μm)がNanomi BV(オランダ)から得られた。
5×106 IGROV1−ルシフェラーゼ細胞を、第1日にメスBalb C nu/nuマウスへIP接種した。パクリタキセル(20mg/kg)およびPLGAマイクロスフェアを、週1回(第7、14、21、および28日)IP投与した。バイオルミネセンスイメージングでは、マウスに125mg/kg D−ルシフェリン(キャリパーライフサイエンスイズ(Calliper Life Sciences)、英国)をIP注射し、次に麻酔した(2%イソフランの吸入による)。5分後、依然として麻酔下のマウスを、加温ステージ上(37℃)の遮光チャンバーに配置し、腹側表面上の定めた対象領域からの発光を、Xenogen IVIS Imaging System 100のシステム(アラメダ、カリフォルニア州、米国)でイメージングした。データは、Living Imageソフトウェア(これもゼノゲン(Xenogen)、アラメダ、カリフォルニア州、米国)を用いて分析し、相対ラジアンスで表す(平均ラジアンス 光子/s/cm2/srから算出)。
平均値の標準誤差(SEM)を用いて各実験グループ間の整合性を評価した。ボンフェローニポストテストと共に一元配置ANOVAを用いてグループ間の差を評価した。両側t検定を用いて2つのグループを比較した。
未修飾ポリスチレン粒子の非プロフェッショナル貪食細胞による取り込み
発明者らは、ニューロンがマイクロ粒子およびデブリをインビトロおよびインビボで取り込む能力を有することをこれまでに実証してきた(Bowen et al.,2007)。図(1および2)は、ポリスチレン粒子の場合の一次感覚ニューロン培養物におけるこのことの例を示しており、また、別の薬物送達システム;高分子電解質カプセルについてのこれまでに未発表のデータも含まれている。発明者らはまた、フローサイトメトリー実験から得られた、Daoyヒト髄芽腫細胞株(図3)、ND7/23感覚ニューロン細胞株(図4)、および一次皮質ニューロン(図5)を含むその他の細胞による未修飾合成粒子の取り込みも示す。
この研究では、未修飾1μmポリスチレン(PS)マイクロスフェアを添加することによる、種々の細胞型の生存能に対する影響について調べた。マイクロスフェアは濃度を上昇させながら添加し、24時間後、視野あたりのDRGニューロン、その他の細胞の数を定量した(図6)。このモデルについての重要な観察結果は、極めて高い濃度であってもマイクロスフェアの存在下にて細胞数の減少が見られなかったということである。このことは、これらの培養物における粒子の取り込みが、有意な毒性をまったくもたらさないことを示唆している。このことはまた、透過型および走査型電子顕微鏡観察による詳細な超微細構造の研究を含む独立した反復実験でも確認された(図7)。Daoyヒト髄芽腫細胞株(図8)およびND7/23感覚ニューロン細胞株(図9)を用いたフローサイトメトリー実験では、7−AAD細胞死アッセイにより細胞生存能への効果について調べた。
FasFc融合タンパク質による粒子の表面修飾により、特定の種類の神経および癌細胞による粒子の取り込みが大きく増加する結果となった。図10は、この増加を、後根神経節一次ニューロンについて、コントロールおよび他のリガンドによる修飾と比較して示している。これらの結果は、本発明で達成されるニューロンによる粒子の取り込みの改善を強く示すものである。透過型電子顕微鏡を用いた研究により(図11)、後根神経節一次ニューロンでのこれらの結果が確認された。Daoyヒト髄芽腫細胞株(図12)およびND7/23感覚ニューロン細胞株(図13)でのさらなる実例から、FasFc修飾粒子を用いることによって、特定の細胞型による取り込みを増加させることができることが示された。さらに、Daoyヒト髄芽腫細胞のマウス皮質ニューロンとの共培養において、皮質ニューロンと比較したDaoy細胞による粒子の選択的な取り込みが見られ、このことは、脳腫瘍の治療での有用性を示している(図14)。
乳酸−グリコール酸共重合体(PLGA)生分解性粒子を、確立された二重エマルジョン法を用いて合成し、またはNanomi BV(オランダ)からその商標であるマイクロシーブ(商標)技術(www.nanomi.com)を用いて粒子を合成した。合成の過程で、小分子、ペプチド、タンパク質、および核酸を含む種々の薬理学的活性剤またはマーカーを粒子に組み込むことができる。発明者らは、エチジウムホモダイマー核酸染色剤、ならびに抗癌薬ドキソルビシンおよびパクリタキセルを組み込んだマイクロ粒子を用いて、本発明を例証した。発明者らは、FasFc修飾したエチジウムホモダイマー充填PLGAが、取り込み、およびそれに続く薬剤の送達を高め(図15H)、粒子の摂取のないコントロール細胞では細胞質核酸の染色が見られないこと(図15D)を示した。未修飾コントロール粒子をコントロールに添加した場合、取り込みおよび薬剤送達の例は見られなかった。同様に、発明者らは、ドキソルビシン充填PLGA粒子をND7/23細胞に添加したところ、FACSによる細胞分離後、ドキソルビシン充填粒子を摂取した細胞の増殖が阻害された(図16)。パクリタキセル充填粒子をDaoyヒト髄芽腫細胞に添加した場合、未充填プラセボ粒子と比較して、パクリタキセル充填粒子では、薬物単独と同様の機能的効果が第1日および3日に見られた(図17)。これらの結果は、本発明の薬物送達用途での有用性を示している。
より臨床上関連のあるシナリオへ進み、発明者らは、同所性卵巣癌モデルを用い、腹腔内注射によって、コンパートメント空間内のCD95L発現IGROV1−ルシフェラーゼ細胞をその他の競合細胞型(例:マクロファージ)の存在下にて標的とした(図18C、D)。生体イメージングより、臨床標準治療であるTaxol(Cremophor ELに溶解したパクリタキセル)の等用量と比較した+CD95−Fc PLGAパクリタキセル処理のグループにおいて、第4週までの腫瘍バイオルミネセンスの>65倍の減少が示された(図18C)。未処理(−CD95−Fc)PLGAパクリタキセルは、Taxolと同等であった。このモデルでは、いずれのプラセボも(+CD95−Fcおよび−CD95−Fc)効果がなかった。+CD95−Fc PLGAパクリタキセル処理における著しい腫瘍減少効果は、処理中断後も持続された(図18C)。このグループのマウスはすべて第48日まで生存し、第62日の終了時には、80%の動物が無症状のままであった(データ示さず)。これまでの研究は、高用量にて組成変更されたパクリタキセルを用いることによる腫瘍増殖阻害の可能性を明らかにした。また、死亡リスクの25%の低減が報告されたことから、臨床状況において、静脈内治療から抗卵巣癌薬の腹腔内送達への転換も行われる。しかし、本明細書で報告されるように、通常の用量で腫瘍量の減少が見られることは稀である。データは、CD95修飾薬物充填マイクロ粒子が、卵巣癌における標的化細胞内薬物送達を向上させる重要な役割を有することを強く支持している。これは、進行期の卵巣癌での治療は成功させることが困難であることから、臨床上必要とされている重要な領域である。
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Claims (16)
- 薬理学的活性剤又はマーカーを細胞内に送達するための送達媒体が、Fasリガンドに特異的であるリガンド結合部分、及び前記薬理学的活性剤又はマーカーのためのキャリアを含み、Fasリガンドに特異的である前記リガンド結合部分が:
(a)Fas受容体;
(b)完全長Fasタンパク質又はその断片;
(c)Fasタンパク質の細胞外ドメイン又はその断片;
(d)Fasタンパク質のリガンド結合ドメイン;又は
(e)免疫グロブリンの結晶化可能断片領域(Fc領域)と融合してキメラ融合タンパク質を形成したFasタンパク質、またはその断片;
を含む、又は、からなることを特徴とする送達媒体。 - 前記キャリアがマイクロ粒子、ナノ粒子、マイクロカプセル、マイクロスフェア、ミセル、又はリポソームであり、前記キャリアがマイクロ粒子のとき、前記キャリアは0.1μmまでの平均径を有するか、又は0.1μmから1μmの平均径を有する、ことを特徴とする請求項1に記載の送達媒体。
- Fasリガンドに特異的な複数のリガンド結合部分を含む、ことを特徴とする請求項1または2のいずれか一項に記載の送達媒体。
- (a)前記リガンド結合部分又はその各々がヒト又はマウス由来である;
(b)前記リガンド結合部分又はその各々が表面吸収、吸着、化学結合、又はマトリックス内組み込みによって前記キャリアとカップリングしている;
(c)前記リガンド結合部分又はその各々が前記キャリアと共有結合又は非共有結合によって会合している;
(d)前記リガンド結合部分又はその各々が前記キャリアと免疫グロブリンの結晶化可能断片領域(Fc)を介して連結している;
(e)前記薬理学的活性剤又はマーカーがFasリガンドと特異的に結合する能力を持たない剤である;
(f)前記薬理学的活性剤又はマーカーが、標的細胞で又は標的細胞内で放出されるように、前記キャリアと結合しているか、又は前記キャリアに含有されているか、もしくは包覆されている;
(g)前記薬理学的活性剤又はマーカーが前記キャリア又はマイクロ粒子によって含有されるか又は包覆されている;及び/又は
(h)前記薬理学的活性剤又はマーカーが、化学結合によって前記キャリア又はマイクロ粒子に結合しているかもしくは前記キャリア内又はマイクロ粒子内に保持されており、あるいは、前記キャリア又はマイクロ粒子を形成する物質のマトリックス内に物理的に組み込まれている、
ことを特徴とする請求項1から3のいずれか一項に記載の送達媒体。 - (a)前記送達媒体が薬理学的活性物質を含有するマイクロ粒子であり、当該マイクロ粒子がFasリガンドに特異的である前記リガンド結合部分と共有結合又は非共有結合で会合している;
(b)前記薬理学的活性剤がタンパク質、ペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ポリサッカリド、脂質、小分子薬物、又はその他のいずれの生物学的活性物質である;
(c)前記薬理学的活性剤が、細胞内で活性であるか、又は標的細胞内部の成分に対して特異的である;及び又は、
(d)前記薬理学的活性剤が細胞毒性剤又は細胞分裂阻害剤であることを特徴とする請求項1から4のいずれか一項に記載の送達媒体。 - 前記細胞毒性剤又は細胞分裂阻害剤が抗癌剤であることを特徴とする請求項5に記載の送達媒体。
- 前記抗癌剤がドキソルビシン又はパクリタキセルであることを特徴とする請求項6に記載の送達媒体。
- 前記マーカーが、蛍光マーカー、放射性核種、又は造影剤である、ことを特徴とする請求項1から4のいずれか一項に記載の送達媒体。
- 薬用及び/又は治療用であり、
前記薬理学的活性剤又はマーカーが、前記キャリアと結合しているか、又は前記キャリアに含有されているか、もしくは包覆されている、
ことを特徴とする請求項1から8のいずれか一項に記載の送達媒体。 - 新生物もしくは神経障害に関連する疾患又は医学的病状の治療用の送達媒体であり:
(a)前記疾患又は病状が、脳腫瘍、卵巣癌、前立腺癌、乳癌、腹腔内腫瘍、卵巣腫瘍、胃腸腫瘍、結腸癌、肺癌、膵臓癌、又はFasリガンドが腫瘍細胞中で発現される癌の種類もしくは腫瘍である;又は、
(b)前記疾患又は病状が、神経疾患であり、選択的に、運動ニューロン疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、神経因性疼痛症候群、又は末梢神経又は脊髄の損傷である、
ことを特徴とする請求項9に記載の送達媒体。 - Fasリガンド発現細胞の検出を含む診断方法に用いる送達媒体であって、
マーカーが前記キャリアと結合しているか、又は前記キャリアに含有されているか、もしくは包覆されており、
前記診断方法が新生物又は神経障害を診断する方法である、
ことを特徴とする請求項1から9のいずれか一項に記載の送達媒体。 - 請求項1から11のいずれか一項に記載の送達媒体及び1又はそれ以上の生理学的又は薬理学的に許容されるキャリア、賦形剤、又は安定化剤を含む、ことを特徴とする医薬組成物。
- 薬理学的活性物質を有するマイクロ粒子を含む送達媒体であって、当該マイクロ粒子が、Fasリガンドに特異的である前記リガンド結合部位と共有結合又は非共有結合によって会合しており、10μmまでの平均径を有する、ことを特徴とする請求項1に記載の送達媒体。
- 前記キャリア又はマイクロ粒子が、
(a)PLGA(乳酸−グリコール酸共重合体マトリックス)、PLA(ポリ乳酸)、PCL(ポリ−ε−カプロラクトン)、もしくはPHB(ポリヒドロキシブチレート)を含むか、又は、キトサン生分解性マイクロスフェア、ケイ素系粒子、高分子電解質カプセル、デンドリマー、もしくはリポソームを含む、
(b)ポリアルキレン、ポリカーボネート、ポリ(ジオキサノン)、ポリ酸無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリフマレート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ(オルソエステル)、ポリヒドロキシブチレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリウレア、ポリスチレン、ポリアミン、ポリ(アリレート)、ポリカーボネート、ポリ(プロピレンフマレート)、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリケタール、ポリエステルアミド、ポリヒドロキシバリレート、ポリオルソカーボネート、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリアルキレンオキサレート、ポリアルキレンスクシネート、ポリ(リンゴ酸)、ポリ(メチルビニルエーテル)、およびポリ(無水マレイン酸)から成る群より選択されるポリマーを含む;又は、
(c)非ポリマーである、
ことを特徴とする請求項1から11及び13のいずれか一項に記載の送達媒体。 - (a)前記マイクロ粒子が、表面吸収、吸着、化学結合、又はマトリックス内組み込みによってFasリガンドに特異的である前記リガンド結合部分に共有結合又は非共有結合によって会合しており;
(b)前記マイクロ粒子が医療用であり;
(c)前記マイクロ粒子が脳腫瘍、卵巣癌、前立腺癌、乳癌、腹腔内腫瘍、卵巣腫瘍、胃腸腫瘍、結腸癌、肺癌、膵臓癌、及びFasリガンドが腫瘍細胞中で発現される癌の種類及び腫瘍から成る群より選択される疾患または病状の治療に用いられ;
(d)前記マイクロ粒子が神経疾患、運動ニューロン疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、神経因性疼痛症候群、及び末梢神経及び脊髄の損傷から成る群より選択される疾患又は病状の治療に用いられる、
ことを特徴とする請求項13又は14のいずれか一項に記載のマイクロ粒子を有する送達媒体。 - 薬理学的活性物質を有するマイクロ粒子を含む、請求項1に記載の送達媒体の作製方法において、前記マイクロ粒子が、Fasリガンドに特異的である前記リガンド結合部分と、表面吸収、吸着、化学結合、又はマトリックス内組み込みによって、共有結合、または非共有結合によって会合するステップを具えることを特徴とする方法。
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