PT1490405E - Anticorpos humanos anti-ligando de hfas antagonistas e fragmentos dos mesmos - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "ANTICORPOS HUMANOS ANTI-LIGANDO de hFAS ANTAGONISTAS E FRAGMENTOS DOS MESMOS" O ligando de Fas ("FasL") é uma proteína com actividade indutora de apoptose numa célula que expresse o antigénio Fas ("Fas"). A apoptose das células que expressam o antigénio Fas crê-se ser induzida pela ligação de FasL a Fas na superfície celular, o que resulta na transferência de um sinal de apoptose para a célula através do antigénio Fas. As sequências de ácido nucleico e proteicas de FasL humano, de ratinho e de rato estão descritas na Patente U.S. 6 348 334 (aqui incluída como referência). O Ligando de Fas humano ("hFasL") é uma proteína de ligação a membranas tipo II, de 40 KDa, membro da família TNF. FasL ligado a membranas pode ser hidrolisado por metaloproteinases para gerar FasL solúvel, o qual é, essencialmente, um homotrímero ligado não covalentemente (Mariani, et ai., Eur. J. Immunol. 25:2303-7 (1995);

Kayagaki, et al., J. Exp. Med. 182:1777-83 (1995): Tanaka, et al., EMBO 14(6):1129-35 (1995)). FasL solúvel parece ser menos citotóxico do que FasL associado a membranas (Nagata, Annu. Ver. Genet. 33:29-55 (1999)).

FasL é, predominantemente, expresso em células T 2 ΡΕ1490405 activadas e células assassinas naturais (NK), enquanto que Fas é expresso em vários tipos de células (Hanabuchi, et al., Proc. Natl. Acad. Sei.,USA 91:4930-4 (1994); Suda, et al., J. Immunol. 154:3806-13 (1995); Arase, et al., J. Exp. Med. 181:1235-8 (1995)). A via de sinalização Fas-FasL é importante na modulação da resposta imune ao induzir a apoptose celular. Recentemente, FasL foi descrito como sendo um forte quimio-atractivo de neutrófilos, sugerindo uma função pró-inflamatória desta molécula. A via de sinalização Fas-FasL também foi implicada na patogénese de múltiplas doenças, incluindo doenças auto-imunes, perturbações renais, sepsia, hepatite virai, HIV, gripe e doença de enxerto versus hospedeiro (ver, e.g., Krammer, et al., Immunol. Ver. 142:175-91 (1994); Nagata e Golstein, Science 267:1449-56 (1995); Yagita, et al., Immunol. Ver. 146:223-39 (1995); Elovaara, et al., Acta Neuropathologica, 98(4):355-62 (1999); Leroy, X et al., APMIS, 109(6):469-73, 2001).

Foram descritos anticorpos contra hFasL compreendendo sequências de anticorpos de ratinho, assim como espécies de anticorpos quiméricos tendo uma fraeção de uma sequência de anticorpo humano (ver, e.g., Publicação de Patente Internacional N° WO 95/18819 e Patentes U.S. 6 114 507 e 6 348 334 e 6 096 312. No entanto, permanecem problemas de imunogenicidade significativos com a utilização dos anticorpos quiméricos. A produção de anticorpos humanizados (i.e., quiméricos) através de tecnologia de DNA recombinante proporciona resultados duvidosos, resultando 3 ΡΕ1490405 em anticorpos com afinidades de ligação imprevisíveis. A Patente US 6 348 334 relata, de forma não descritiva, anticorpos dirigidos contra FasL, no entanto não descreve especificamente as características estruturais de tais anticorpos.

Por vários motivos os anticorpos humanos, como aqui definido, são vantajosos relativamente a anticorpos quiméricos, não humanos e humanizados, para usar em terapia humana. Um anticorpo monoclonal humano, i.e., um anticorpo que seja totalmente humano, tem menor probabilidade de induzir uma resposta imunológica em seres humanos do que os anticorpos possuidores de partes não humanas. Ainda, é menos provável que um anticorpo humano seja reconhecido como um anticorpo "estranho" em seres humanos. Isto resulta numa eliminação mais lenta do anticorpo humano do corpo do que um anticorpo não humano ou parcialmente humano. Assim, um anticorpo humano pode ser administrado em doses mais baixas ou menos frequentemente do que os anticorpos não humanos ou parcialmente humanos.

Para minimizar o potencial da reactividade cruzada entre espécies, existe a necessidade de anticorpos humanos contra FasL, particularmente FasL humano, com elevada afinidade de ligação a FasL e com capacidade para destruir ou antagonizar a actividade da via de sinalização Fas-FasL in vitro e in vivo. O presente pedido de patente descreve anticorpos humanos terapeuticamente úteis e seus fragmentos de ligação a antigénio, dirigidos contra hFasL e 4 ΡΕ1490405 caracterizados por elevada afinidade de ligação aos polipéptidos hFasL, cinéticas de dissociação lentas e capacidade de destruir ou antagonizar pelo menos uma actividade in vitro e/ou in vivo associada aos polipéptidos hFasL. O presente invento proporciona anticorpos humanos isolados anti-hFasL e fragmentos de ligação ao antigénio dos mesmos. Os anticorpos do invento são caracterizados por elevada afinidade de ligação a um polipéptido hFasL, cinéticas de dissociação lentas e capacidade de anatagonizar pelo menos uma actividade in vitro e/ou in vivo e/ou in situ associada ao polipéptido hFasL.

De acordo com um primeiro aspecto do presente invento, é proporcionado um anticorpo humano isolado anti-hFasL, ou fragmento de ligação antigénio do mesmo, tendo uma região variável da cadeia leve (LCVR) e uma região variável da cadeia pesada (HCVR) e compreendendo pelo menos dois polipéptidos tendo uma sequência seleccionada entre SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24, em que o referido anticorpo tem um KD inferior a 1x10‘9M.

De preferência, são seleccionados pelo menos 3, 4, 5 ou 6 polipéptidos, em que os referidos polipéptidos, de preferência, existem nos referidos anticorpos na mesma posição CDR aqui mostrada nas Tabelas 1, 2 ou 3.

De preferência, a LCVR compreende um polipéptido com a sequência apresentada em SEQ ID NO:2. 5 ΡΕ1490405

De preferência, a LCVR compreende a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO:2 e a HCVR compreende a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO:10.

Como alternativa, a LCVR compreende a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO:2 e a HCVR compreende a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO:18.

De acordo com uma realização preferida do presente invento, o dominio CDRl de LCVR compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:4.

De preferência, o dominio CDR2 de LCVR compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:6.

De preferência, o domínio CDR3 de LCVR compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:8.

De acordo com uma outra realização do presente invento, é proporcionado um domínio CDRl de LCVR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:4 e um domínio CDR2 de LCVR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:6.

De preferência, o domínio CDRl de LCVR compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:4 e o domínio CDR3 de LCVR compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. 6 ΡΕ1490405

De preferência, o domínio CDR2 de LCVR compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:6 e o domínio CDR3 de LCVR compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

Mais de preferência, o domínio CDR1 de HCVR compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 ou 20.

De preferência, o domínio CDR2 de HCVR compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 ou 22.

De preferência, o domínio CDR3 de HCVR compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 ou 24.

De acordo com uma outra realização do presente invento, é proporcionado um domínio CDR2 de HCVR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 ou 22 e um domínio CDR3 de HCVR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 ou 24.

De preferência, o domínio CDRl de HCVR compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 ou 20 e o domínio CDR2 de HCVR compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 ou 22.

Mais de preferência, o domínio CDRl de HCVR compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 ou 20 e o domínio CDR3 de HCVR compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 ou 24. 7 ΡΕ1490405 O anticorpo isolado de acordo com o presente invento possui uma região constante da cadeia pesada de IgGl. Como alternativa, o anticorpo isolado de acordo com o presente invento possui uma região constante da cadeia pesada de IgG4.

De preferência, o fragmento isolado de ligação ao antigénio do presente invento é um fragmento Fab. Como alternativa, o fragmento isolado de ligação ao antigénio do presente invento é um fragmento F(ab')2 ou um fragmento Fv de cadeia simples.

De acordo com um segundo aspecto do presente invento, é proporcionada uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo um polinucleótido codificador de um anticorpo humano anti-hFasL ou um seu fragmento de ligação ao antigénio.

De preferência, o polinucleótido compreende pelo menos dois polinucleótidos tendo uma sequência seleccionada entre SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 e 23 e suas variantes, conforme permitido pela degenerescência do código genético.

De acordo com um terceiro aspecto do presente invento, é proporcionado um vector compreendendo a referida molécula de ácido nucleico. ΡΕ1490405

De preferência, o vector é um vector de expressão recombinante.

De acordo com um quarto aspecto do presente invento, é proporcionada uma célula hospedeira compreendendo o referido vector, o qual foi inserido na totalidade ou em parte no cromossoma da célula hospedeira. O anticorpo humano anti-hFasL ou um fragmento de ligação ao antigénio do mesmo, pode ser sintetizado através da cultura de uma célula hospedeira do invento em meio de cultura, para que um anticorpo humano anti-hFasL, ou o seu fragmento de ligação ao antigénio, do presente invento seja expresso na célula. 0 polipéptido do presente invento, í.e., um anticorpo humano anti-hFasL, ou o seu fragmento de ligação ao antigénio, pode ser preparado pela cultura de uma célula hospedeira adequada do invento, compreendendo um vector de expressão do invento, em condições que promovam a expressão do polipéptido e purificação do referido polipéptido. Considera-se que tal purificação possa ser a partir da célula hospedeira, do meio de cultura em que a célula é cultivada, ou de ambos.

Através do contacto de hFasL com um anticorpo humano anti-hFasL (ou fragmento de ligação ao antigénio do mesmo) do presente invento, a actividade de hFasL pode ser inibida. 9 ΡΕ1490405

De acordo com um outro aspecto do presente invento é proporcionada uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo humano anti-hFasL, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, do invento. Considera-se que uma composição farmacêutica do invento possa compreender mais de um dos anticorpos humanos anti-hFasL do invento.

Uma composição farmacêutica do invento pode ainda compreender um veiculo farmaceuticamente aceitável. 0 invento ainda inclui um método para a neutralização de uma actividade FasL e um método de tratamento ou prevenção de uma alteração em que a actividade de FasL seja danosa, compreendendo a administração, a um indivíduo necessitado, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica do invento. Nas realizações preferidas, a alteração em que a actividade de FasL é prejudicial consiste em síndrome de resposta inflamatória sistémica, sepsia, síndrome da disfunção de múltiplos órgãos, síndrome da insuficiência respiratória aguda, sepsia grave, trauma, doença de enxerto versus hospedeiro, rejeição de órgãos associada ao transplante de órgãos, esclerose múltipla, fibrose pulmonar idiopática, osteo-artrite, colite, doença de Crohn, colite ulcerativa, enfarte agudo do miocárdio, cardiomiopatia, lesão de reperfusão cardíaca, diabetes, cancros (de preferência tipos de cancro que expressam ou expressam um excesso de FasL como mecanismo de evasão à resposta imune; os tipos de cancro 10 ΡΕ1490405 contemplados incluem mas não estão limitados a cancro da mama, melanoma, cancro do ovário, NSCLC, linfoma e carcinoma hepatocelular), virus da imunodeficiência humana, virus da gripe, disfunção hepática incluindo mas não estando limitado a hepatite virai B ou C fulminante, vírus da hepatite C crónica, vírus da hepatite B crónica, hepatite alcoólica, cirrose hepática ou disfunções renais incluindo mas não estando limitado a doença renal crónica, doença renal aguda e nefropatia diabética.

Ainda num outro aspecto do presente invento, é proporcionado um anticorpo humano e composições compreendendo o anticorpo humano, produzido pelo hibridoma depositado como ATCC PTA-4017 ou o hibridoma depositado como ATCC PTA-4018 na American Type Cultura Collection, Manassas, Virgínia. O invento não está limitado às realizações particulares descritas abaixo, uma vez que podem ser feitas variações das realizações particulares e estas ainda estarem no âmbito das reivindicações apensas. Por outro lado, o âmbito do presente invento será estabelecido pelas reivindicações apensas.

Um anticorpo é uma molécula de imunoglobulina constituída por quatro cadeias polipeptídicas, duas cadeias pesadas (H) (cerca de 50-70 KDa quando de tamanho completo) e duas cadeias leves (L) (cerca de 25 KDa quando de tamanho completo) inter-ligadas por ligações dissulfureto. As 11 ΡΕ1490405 cadeias leves são classificadas como capa e lambda. As cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta ou épsilon, e definem o isotipo do anticorpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Cada uma das cadeias pesadas é constituída por uma região variável de cadeia pesada (aqui abreviado como HCVR) e uma região constante da cadeia pesada. A região constante da cadeia pesada é constituída por três dominios (CHI, CH2 e CH3) para IgG, IgD e IgA; e 4 dominios (CHI, CH2, CH3 e CH4) para IgM e IgE. Cada cadeia leve é constituída por uma região variável da cadeia leve (aqui abreviado como LCVR) e uma região constante da cadeia leve. A região constante da cadeia leve é constituída por um domínio, CL. As regiões HCVR e LCVR podem ainda ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, designadas regiões determinantes de complementaridade (CDRs), intercaladas com regiões que são mais conservadas, designadas regiões estruturais (FR). Cada HCVR e LCVR é composta por três CDRs e quatro FRs, arranjadas, do extremo amina para o extermo carboxilo, na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. A distribuição de aminoácidos por cada domínio é de acordo com convenções bem conhecidas (Kabat, "Sequences of Proteins of Immunlogical Ineterest", National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 e 1991); Chothia, et al., J. Mol. Biol. 196:901-17 (1987); Chothia, et al., Nature 342:878-83 (1989)). A capacidade funcional do anticorpo se ligar a um antigénio particular é largamente determinada pelas CDRs. 12 ΡΕ1490405 O termo "anticorpo", como aqui é usado, refere-se a um anticorpo monoclonal per se. Um anticorpo monoclonal pode ser uma anticorpo humano, anticorpo quimérico e/ou amticorpo humanizado. Um anticorpo monoclonal pode ser um fragmento Fab, fragmento Fab' ou fragmento F(ab')2 de um anticorpo humano, anticorpo quimérico e/ou anticorpo humanizado. Ainda, um anticorpo monoclonal pode ser um fragmento FV de cadeia simples. O termo "anticorpo humano", como aqui usado, é (i) um anticorpo intacto, (ii) um anticorpo substancialmente intacto, (iii) um fragmento de anticorpo compreendendo um local de ligação ao antigénio, ou (iv) uma porção de um anticorpo compreendendo um fragmento Fab, fragmento Fab' ou F(ab')2, tendo regiões variáveis e constantes codificadas pela informação da sequência de ácido nucleico que ocorre na região da imunoglobulina germinal humana ou em formas recombinadas e/ou mutadas da mesma, sejam ou não os referidos anticorpos produzidos em células humanas. 0 termo "anticorpo humano" também inclui um anticorpo humano manipulado para ter a forma de um fragmento FV de cadeia simples.

Os anticorpos quiméricos, humanizados ou com enxertos de CDR, possuindo pelo menos uma região Fc, FR ou CDR não humana não são anticorpos humanos como aqui referidos. O termo "hFasL" refere-se ao Ligando Fas humano, 13 ΡΕ1490405 um membro dos ligandos da família do factor de necrose tumoral descrito em Suda, et al., Cell 75:1169-78 (1993). A função de hFasL está descrita ainda em Krammer, et al., Immunol. Ver. 142:175-91 (1994); Nagata e Golstein, Science 267(5203):1449-56 (1995); e Yagita et ai., Immunol.Rev. 146:223-39(1995). O termo "Ligando de Fas" destina-se a incluir hFasL assim como homólogos de hFasL derivados de outras espécies. Os termos "hFasL" e "FasL" destinam-se a incluir formas que podem ser preparadas por métodos de expressão recombinante convencionais ou adquiridas comercialmente (Alexis® Biochemicals, Catálogo #522-001) assim como as geradas sinteticamente. O termo "solúvel", quando usado conjuntamente com FasL, refere-se a uma forma clivada da forma de FasL "associada a membrana" ou "ligada a membrana". FasL solúvel descreve fragmentos solúveis contendo pelo menos um fragmento do domínio extracelular de FasL ligado a membrana. FasL solúvel é gerado por clivagem com metaloproteinase num local específico na região extracelular de FasL, resultando numa molécula solúvel (Hohlbaum, et al., J. Exp. Med. 191(7):1209-20 (2000); Tanaka, et al., Nat. Med. 2(3):317-22 (1996); e Kayagaki, et al., J. Exp. Med. 182(6):1777-83 (1995)). Tal como a forma ligada a membrana, FasL solúvel é capaz de induzir apoptose quando da ligação a Fas.

As frases "propriedade biológica" ou "caracterís-tica biológica", ou os termos "actividade" ou "bioacti-vidade" referindo-se a um anticorpo ou fragmento de 14 ΡΕ1490405 anticorpo do presente invento, são aqui usados indiferentemente e incluem, mas não estão limitados a afinidade e especificidade de epitopos (e.g., anticorpo humano anti-hFasL que se liga a hFasL) , capacidade de antagonizar a actividade do polipéptido alvo in vivo e/ou in vitro (e.g., bioactividade de FasL), estabilidade in vivo do anticorpo e propriedades imunogénicas do anticorpo. Outras propriedades biológicas identificáveis ou características de um anticorpo reconhecidas na área incluem, por exemplo, reactividade cruzada (í.e., com homólogos não humanos do polipéptido alvo ou com outras proteínas ou tecidos, em geral) e capacidade para preservar níveis elevados de expressão de proteína em células de mamífero. As referidas propriedades ou características podem ser observadas ou medidas usando técnicas reconhecidas na área incluindo, mas não estando limitado a ELISA, ELISA competitiva, análise de ressonância de plasmões de superfície BIAcore ®, ensaios de neutralização in vitro e in vivo (e.g., Exemplos 1, 2 e 3) e imuno-histoquímica com secções de tecido de diferentes fontes, incluindo seres humanos, primatas ou qualquer outra fonte conforme o que se pretenda. O termo "epitopo" como aqui usado refere-se a uma região de uma molécula proteica à qual se pode ligar um anticorpo. Um "epitopo imunogénico" é definido como a parte de uma proteína que induz uma resposta de anticorpo quando a proteína completa é o imunogénio. Ver, por exemplo, Geysen, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:3998-4002 (1984) . Um "fragmento de ligação ao antigénio" de um 15 ΡΕ1490405 anticorpo, como aqui usado, refere-se a uma região de um anticorpo que interage ou se liga a um epitopo ao qual o anticorpo se liga quando o fragmento de ligação ao antigénio está contido no anticorpo. O fragmento de ligação ao antigénio pode existir fora do contexto do anticorpo de tamanho completo e ainda ser considerado como um fragmento de ligação ao antigénio de anticorpo quer interaja ou não com o epitopo e se ligue ou não a ele. O termo "inibir" ou "inibição" significa neutralizar, antagonizar, proibir, prevenir, restringir, travar, destruir, parar ou reverter a progressão ou gravidade do que se pretende inibir, e.g., incluindo, mas não estando limitado a uma actividade, doença ou condição. 0 termo "isolado" quando usado relativamente a um ácido nucleico ou proteina (e.g., um anticorpo), refere-se a uma sequência de ácido nucleico ou proteina que é identificada e separada de pelo menos um contaminante (ácido nucleico ou proteina, respectivamente) com o qual está normalmente associado na sua fonte natural. 0 ácido nucleico ou proteina isolada está presente numa forma ou apresentação diferente da encontrada na natureza. Pelo contrário, ácidos nucleicos ou proteínas não isolados são encontrados no estado em que existem na natureza. De preferência, um "anticorpo isolado" é um anticorpo que está substancialmente livre de outros anticorpos tendo diferentes especificidades antigénicas (e.g., um anticorpo isolado que especif icamente se liga ao Ligando de hFas 16 ΡΕ1490405 substancialmente livre de anticorpos que especificamente se ligam a antigénios diferentes do polipéptido Ligando de hFas).

Como aqui usado, o termo "purificado" ou "purificar" significa o resultado de qualquer processo que remove algum contaminante do componente com interesse, como seja uma proteína ou ácido nucleico. A percentagem de componente purificado é assim aumentada na amostra. Em realizações preferidas, o anticorpo será purificado (1) em mais de 95% por peso de anticorpo, conforme determinado pelo método de Lowry, e, mais de preferência, mais de 99% por peso, e (2) até homogeneidade por SDS-PAGE em condições redutoras ou não redutoras usando coloração com azul Coomassie ou, de preferência, com prata.

Os termos "numeração Kabat" e "marcação kabat" são aqui usados indiscriminadamente. Estes termos, que são conhecidos na área, referem-se a um sistema de numeração de resíduos de aminoácidos que são mais variáveis (i.e., hipervariáveis) do que outros resíduos de aminoácidos nas regiões variáveis das cadeias pesada e leve de um anticorpo (Kabat, et al., Ann. NY Acad, Sei. 190: 382-93 (1971); Kabat, et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Fifth Edition, U.S. Department of Health and

Human Services, NIH Publication N° 91-3242 (1991)).

Um polinucleótido está "operacionalmente ligado" quando é colocado numa relação funcional com um outro 17 ΡΕ1490405 polinucleótido. Por exemplo, DNA de uma pré-sequência ou líder de secreção é operacionalmente ligado a DNA de um polipéptido se for expresso como uma preproteína que participa na secreção do polipéptido; um promotor ou estimulador é operacionalmente ligado a uma sequência codificadora se afectar a transcrição da sequência.

Animais transgénicos (e.g., ratinho) que são capazes, quando imunizados, de produzir anticorpos humanos na ausência da produção de imunoglobulinas endógenas podem ser empregues no invento. A transferência do arranjo germinal de genes de imunoglobulina humana para tal ratinho mutante germinal resultará na produção de anticorpos humanos quando da exposição ao antigénio. Ver, e.g., Jakobovits, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:2551-5 (1993); Jakobovits, et al., Nature 362:255-8 (1993); Bruggemann, et al., Year in Immun. 7 :33 (1993) ; Nature 148 :1547-53 (1994), Nature Biotechnology 14 :826 (1996) ; Gross, et al., Nature 404 :995-9 (2000) ; e Patente U.S. números 5877397 ; 5874299 ; 5814318 ; 5789650 ; 5770429 ; 5661016 ; 5633425 ; 5625126 ; 5569825 e 5545806.

Os anticorpos humanos podem ser igualmente produzidos em bibliotecas de apresentação fágica (Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227:381-8 (1992)). As técnicas de Cole, et al., e Boerner, et al., estão entre as técnicas disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos (Cole, et al., Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77(1985); e Boerner, et al., J. 18 ΡΕ1490405

Immunol. 147:86-95 (1991)).

Os anticorpos humanos recombinantes podem também ser sujeitos a mutagénese in vitro (ou, quando um animal transgénico para sequências de Ig humana for usado, mutagénese somática in vivo) e, assim, as sequências de aminoácidos das regiões HCVR e LCVR dos anticorpos recombinantes são sequências que, derivarão das relacionadas com as sequências germinais humanas para HCVR e LCVR, podem não existir naturalmente no reportório germinal de anticorpos humanos in vivo. O termo "neutralização" ou "antagonização" referindo-se a um anticorpo anti-FasL ou a frase "anticorpo que antagoniza (neutraliza) a actividade FasL" ou "antagoniza (neutraliza) FasL" destina-se a referir um anticorpo, ou seu fragmento de ligação a antigénio, cuja ligação ou contacto com FasL resulta na inibição de uma actividade biológica induzida por polipéptidos FasL. A inibição da actividade biológica FasL pode ser avaliada medindo um ou mais indicadores in vitro ou in vivo da actividade biológica incluindo, mas não estando limitado a indução da sinalização intracelular mediada por FasL, apoptose, quimiotaxia de neutrófilos ou inibição da ligação a receptores num ensaio de ligação ao receptor de FasL. Os indicadores da actividade biológica de FasL podem ser analisados através de um ou mais de vários ensaios, in vitro ou in vivo, conhecidos na área. De preferência, a capacidade de um anticorpo para neutralizar ou antagonizar 19 ΡΕ1490405 a actividade FasL é avaliada através da inibição da apoptose mediada por Fas-FasL.

Os termos "indivíduo", "sujeito" e "doente" são usados indiscriminadamente, referindo-se a um mamífero, incluindo, mas não estando limitado a roedores, símios, Homem, gado, mamíferos de desporto e mamíferos de estimação. O termo "K0ff", como aqui é usado, refere-se à constante de velocidade de dissociação de um anticorpo do complexo anticorpo/antigénio. A constante de velocidade de dissociação (Koff) de um anticorpo humano anti-hFasL pode ser determinada por ressonância de plasmões de superfície BIAcore® como descrito, de um modo geral, no Exemplo 3. Geralmente, a análise BIACORE® mede as interacções de ligação em tempo real entre o ligando (polipéptido FasL recombinante imobilizado numa matriz de biossensor) e o analito (anticorpos em solução) através da ressonância de plasmões de superfície (SPR) usando o sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ) . SPR pode também ser realizado através da imobilização do analito (anticorpos numa matriz de biossensor) e o ligando presente na solução. Uma baixa velocidade de dissociação de um complexo antigénio/anticorpo refere-se a uma Koff de 10 seg ou inferior, de preferência 10“4seg_1 ou inferior, ou mesmo, mais de preferência, 10'5seg_1 ou inferior. 0 termo "KD", como aqui usado, refere-se à 20 ΡΕ1490405 constante de equilíbrio de dissociação de uma interacção particular anticorpo-antigénio. Para fins do presente invento, KD pode ser determinado como se mostra no Exemplo 3. Os anticorpos com avidez elevada e/ou ligação de elevada afinidade com um epitopo particular possuem um KD de 10~7 M ou inferior, de preferência 10“8 M ou inferior, mais de preferência 10~9M ou inferior. O termo "vector" inclui uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar um outro ácido nucleico ao qual foi ligado incluindo, mas não estando limitado a plasmídeos e vectores virais. Determinados vectores são capazes de replicação autónoma numa célula hospedeira em que são introduzidos, enquanto outros vectores podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira quando da introdução na célula hospedeira e, assim, são replicados juntamente com o genoma hospedeiro. Ainda, determinados vectores são capazes de dirigir a expressão de genes aos quais estão operacionalmente ligados. Tais vectores são referidos aqui como "vectores de expressão recombinantes" (ou simplesmente "vectores de expressão"). O termo "célula hospedeira" inclui uma célula individual ou cultura celular que pode ser ou foi recipiente de qualquer vector recombinante ou polinucleótido isolado do invento. As células hospedeiras incluem a descendência de uma única célula hospedeira e a descendência pode não ser totalmente idêntica (na morfologia ou no complemento de DNA total) à célula parental original 21 ΡΕ1490405 devido a mutação e/ou alteração natural, acidental ou deliberada. Uma célula hospedeira inclui uma célula transfectada ou infectada in vivo ou in vitro com um vector recombinante ou um polinucleótido do invento. Uma célula hospedeira que compreende um vector recombinante do invento pode também ser referida como uma "células hospedeira recombinante". De preferência, a célula hospedeira é bacte-riana ou de mamífero; se de mamífero, é de preferência uma célula CHO, COS, NSO ou 293. O presente invento está relacionado com anticorpos monoclonais humanos que são específicos e neutralizam um polipéptido hFasL, seu fragmento antigénico ou uma actividade hFasL. São igualmente descritos fragmentos da cadeia pesada e/ou leve de anticorpo altamente específicos e que neutralizam o polipéptido FasL, seu fragmento antigénico ou epitopo, ou uma actividade hFasL, de preferência a ligação de hFasL a Fas. Esta elevada especificidade de ligação a FasL permite que os anticorpos anti-hFasL humanos, seus fragmentos de ligação ao antigénio e anticorpos monoclonais humanos com tal especificidade, sejam imunoterapêuticos para doenças associadas a Fas-FasL.

De acordo com uma realização preferida, o invento proporciona um anticorpo humano anti-hFasL ou seu fragmento de ligação ao antigénio, compreendendo pelo menos duas das sequências de aminoácidos seleccionadas do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24. As sequências representadas em SEQ ID NOS: 4, 6, 8, 22 ΡΕ1490405 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24, quando presentes num anticorpo do invento, estão preferencialmente posicionadas no anticorpo do invento na mesma localização de CDR como descrito nas Tabelas 1, 2 e 3 apresentadas e como estão posicionadas em SEQ ID NO:2 (para SEQ ID NOs:4, 6 e 8), SEQ ID NO:10 (para SEQ ID NOS:12, 14 e 16) e SEQ ID NO:18 (para SEQ ID NOS: 20, 22 e 24).

Numa outra realização preferida, o invento proporciona um anticorpo humano anti-FasL isolado, ou seu fragmento de ligação ao antigénio, que se liga a um polipéptido FasL solúvel (ou seu fragmento antigénico) com um constante de equilíbrio de dissociação, KD, de 10~7 M ou inferior, de preferência 10"8 M ou inferior, mais de preferência 10~9 M ou inferior (determinado por ressonânica de plasmões de superfície BIAcore®l em fase sólida à temperatura ambiente), dissocia-se de um polipéptido FasL com uma constante de dissociação K0ff baixo e tem capacidade de antagonizar uma actividade de polipéptido FasL.

Uma outra realização do invento proporciona um anticorpo humano anti-hFasL isolado, ou seu fragmento de ligação ao antigénio, que inibe a apoptose mediada por FasL num ensaio de neutralização in vitro com um IC50 de 10 nM ou menos (como alternativa 9 nM ou inferior, 8 nM ou inferior, 7 nM ou inferior, 6 nM ou inferior ou 5 nM ou inferior) para FasL ligado a membranas ou um IC5o de 0,2 nM ou inferior (como alternativa 0,19 nM ou inferior, 0,18 nM ou inferior, 0,17 nM ou 0,15 nM ou inferior) para FasL 23 ΡΕ1490405 solúvel. Tal fragmento de ligação ao antigénio do invento pode existir sozinho ou num anticorpo humano anti-hFasL. Numa realização mais preferida, o anticorpo humano anti-hFasL isolado liga-se a um polipéptido FasL solúvel com uma constante de equilíbrio de dissociação, KD, de IO'7 M ou inferior, de preferência 10~8 M ou inferior, mais de preferência 10'9 M ou inferior (determinado por BIAcore®l em fase sólida à temperatura ambiente). Exemplos de anticorpos anti-hFasL que preenchem os critérios cinéticos e de neutralização atrás referidos incluem os anticorpos 3E1 e 4G11, como descrito nos Exemplos 1, 2 e 3. 0 anticorpo humano anti-hFasL mais preferido do presente invento é o referido como 3E1. O anticorpo 3E1 tem LCVR e HCVR compreendendo um polipéptido com uma sequência mostrada em SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO: 10, respectivamente (ver Tabelas 1 e 3 apresentadas) . Exemplos de sequências polinucleotídicas codificadoras de LCVR e de HCVR de 3E1 estão apresentados em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 9, respectivamente.

Ainda numa outra realização, um anticorpo humano anti-hFasL preferido é o referido aqui como 4G11. O anticorpo 4G11 tem LCVR e HCVR compreendendo um polipéptido com uma sequência mostrada em SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:18, respectivamente (ver Tabelas 2 e 3 aqui apresentadas). Exemplos de sequências polinucleotídicas codificadoras de LCVR e HCVR de 4G11 estão apresentados em SEQ ID NO:l e SEQ ID NO:17, respectivamente. 24 ΡΕ1490405

Numa outra realização, o invento proporciona um Fab isolado de anticorpo humano anti-hFasL e um fragmento F(ab')2 do anticorpo humano anti-hFasL, compreendendo uma HCVR consistindo nas sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:18 e ainda compreendendo uma LCVR tendo um polipéptido com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2 para cada um dos anticorpos, 3E1 e 4G11. Ainda numa outra realização, o invento proporciona anticorpo humano anti-hFasL isolado ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, compreendendo pelo menos dois, de preferência 3, 4, 5 OU 6 polipéptidos com uma sequência de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NOS: 4, 6, 8, 12, 14, 16, 20, 22 e 24. De preferência, a sequência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NOS: 4, 12 ou 20, quando existe num anticorpo do invento, está situada em CDR1. De preferência, a sequência de aminoácidos como apresentada em SEQ ID NOS: 6, 14 ou 22, quando existe num anticorpo do invento, está situada em CDR2. E, de preferência, a sequência de aminoácidos como apresentada em SEQ ID NOS: 8,16 ou 24, quando existe num anticorpo do invento, está situada em CDR3. As realizações preferidas proporcionam um anticorpo humano isolado anti-hFasL ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, que inibe a apoptose induzida por FasL solúvel num ensaio de neutralização in vitro com um IC5o de 0,5 nM ou inferior, mais de preferência cerca de 0,3 ou inferior, mais de preferência cerca de 0,15 nM ou inferior; ou proliferação ou apoptose induzida por FasL associado a membrana num ensaio de neutralização in vitro com um IC5o 25 ΡΕ1490405 de 10 nM ou inferior, de preferência cerca de 9, 8, 7, 6 ou 5 nM ou inferior. O presente invento é igualmente dirigido a linhas celulares que produzem um anticorpo humano anti-hFasL aqui descrito. O isolamento de linhas celulares produtoras de um anticorpo monoclonal do invento pode ser conseguido usando técnicas de rastreio de rotina conhecidas. Várias linhas celulares que podem produzir um anticorpo humano anti-hFasL do presente invento foram depositadas na ATCC (American Type Culture Collection). A um hibridoma de ratinho secretor de IgG4 capa humana (de um HuMab-mouse®) 3E1 foi atribuída a referência ATCC PTA-4017 e um hibridoma de ratinho secretor de IgG4 capa humana (de um HuMab-mouse®) 4G1 1 foi atribuída a referência ATCC PTA-4018. Os anticorpos humanos anti-hFasL mais preferidos do presente invento possuem a mesma, ou substancialmente a mesma, sequência de aminoácidos dentro de pelo menos 2, 3, 4, 5 ou 6 regiões hipervariáveis (i.e., CDRs) como presente num ou mais dos anticorpos atrás referidos depositados na ATCC.

Uma larga variedade de sistemas de hospedeiros de expressão pode ser usada para expressar um anticorpo do presente invento, incluindo sistemas de expressão procarióticos (bacterianos) e eucarióticos (como sejam leveduras, baculovírus, plantas, mamíferos e outras células animais, animais transgénicos e células de hibridoma), assim como sistemas de expressão de apresentação em fagos. Um exemplo de um vector de expressão bacteriano adequado é 26 ΡΕ1490405 pUCl 19(Sfi) e de um vector de expressão eucariótico adequado é um vector pcDNA3.1 modificado com um sistema de selecção DHFR enfraquecido. Outros sistemas de expressão de anticorpos são igualmente conhecidos na área e são aqui contemplados. Na área, são conhecidas numerosas células hospedeiras adequadas de mamífero, incluindo mas não estando limitado a células COS, CHO, NSO e 293.

Um anticorpo do presente invento pode ser preparado através da expressão recombinante de genes das cadeias leve e pesada de imunoglobulina numa célula hospedeira. Para expressar um anticorpo por via recombinante, uma célula hospedeira foi transfectada com um ou mais vectores de expressão recombinantes, portadores de fragmentos de DNA codificadores das cadeias leve e pesada de imunoglobulina do anticorpo, de forma que as cadeias leve e pesada sejam expressas na célula hospedeira. De preferência, os anticorpos recombinantes são secretados para o meio, onde as células hospedeiras são cultivadas, a partir do qual os anticorpos podem ser recuperados. Metodologias de DNA recombinante convencionais foram usadas para obter os genes das cadeias pesada e leve de anticorpo, inserir estes genes em vectores de expressão recombinantes e introduzir os vectores em células hospedeiras. Tais tecnologias de DNA recombinante convencionais estão descritas, por exemplo, em Sambrook, Fritsch e Maniatis (Eds), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989); Ausubel, et al. (Eds) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989); e na Patente U.S. N° 4,816,397 de Boss, et al. 27 ΡΕ1490405

Um DNA isolado codificador de uma região HCVR pode ser convertido num gene de cadeia pesada de tamanho completo, através da ligação operacional do DNA codificador de HCVR a uma outra molécula de DNA codificadora de regiões constantes da cadeia pesada (CHI, CH2 e CH3). As sequências dos genes das regiões constantes da cadeia pesada humana são conhecidas na área. Ver, e.g. Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Sevices, NIH Publication N° 91-3242 (1991). Fragmentos de DNA incluindo estas regiões podem ser obtidos através de técnicas de amplificação por PCR convencionais. A região constante da cadeia pesada pode ser uma região constante de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD e qualquer sua variante alotipica como descrito em Kabat (supra), mas mais de preferência é uma região constante de IgG4 ou de IgGl. Como alternativa, o fragmento de ligação ao antigénio pode ser um fragmento Fab, um fragmento F(ab')2 ou um fragmento Fv de cadeia simples (scFv). Para um gene da cadeia pesada do fragmento Fab, o DNA codificador de HCVR pode ser operacionalmente ligado a uma outra molécula de DNA codificadora de apenas uma região constante CHI da cadeia pesada.

Um DNA isolado, codificador de uma região LCVR, pode ser convertido num gene de cadeia leve de tamanho completo (assim como num gene de cadeia leve Fab) através da ligação operacional do DNA codificador de LCVR a uma outra molécula de DNA codificadora de uma região constante 28 ΡΕ1490405 da cadeia leve, CL. As sequências dos genes das regiões constantes da cadeia leve humana são conhecidas na área. Ver, e.g., Kabat, supra. Os fragmentos de DNA incluindo estas regiões podem ser obtidos através de amplificação convencional por PCR. A região constante da cadeia leve pode ser uma região constante capa ou lambda.

Para criar um gene scFv, os fragmentos de DNA codificadores de HCVR e de LCVR são operacionalmente ligados a um outro fragmento codificador de um adaptador flexivel, e.g., codificador da sequência de aminoácidos (Gli4-Ser)3, de forma que as sequências LCVR e HCVR possam ser expressas como uma proteína de cadeia simples contígua, com as regiões LCVR e HCVR ligadas pelo adaptador flexível. Ver, e.g., Bird, et al., Science 242:423-6 (1988); Huston, et al., Proc.Natl. Acad. Sei. USA 85 :5876-83 (1988); McCafferty, et al., Nature 348:552-4 (1990).

Para expressar um anticorpo do invento, um DNA codificador de uma cadeia leve e/ou pesada, parcial ou total, obtido como descrito atrás, foi inserido num vector de expressão de forma ao gene ficar operacionalmente ligado a sequências de controlo da transcrição e tradução. Neste contexto, o termo "ligado operacionalmente" pretende significar que um gene de anticorpo é ligado num vector, de forma que sequências de controlo da transcrição e da tradução dentro do vector sirvam a sua função de regulação da transcrição e da tradução do gene do anticorpo. O vector de expressão e sequências de controlo de expressão são 29 ΡΕ1490405 escolhidos para serem compatíveis com a célula hospedeira de expressão a ser usada. O gene da cadeia leve de anticorpo e o gene da cadeia pesada de anticorpo podem ser inseridos em vectores separados ou, mais tipicamente, ambos os genes são inseridos no mesmo vector de expressão. Os genes de anticorpo são inseridos no vector de expressão por métodos convencionais. Ainda, o vector de expressão recombinante pode codificar um peptídeo sinal que facilite a secreção da cadeia leve e/ou pesada do anticorpo humano anti-hFasL pela célula hospedeira. 0 gene da cadeia leve e/ou pesada do anticorpo humano anti-hFasL pode ser clonado no vector de forma que o peptídeo sinal seja operacionalmente ligado em grelha com o extremo amina do gene da cadeia de anticorpo. O peptídeo sinal pode ser um peptídeo sinal de imunoglobulina ou um peptídeo sinal heterólogo.

Para além do ou dos genes da cadeia pesada e/ou leve de anticorpo, um vector de expressão recombinante do invento possui sequências reguladoras que controlam a expressão do ou dos genes das cadeias de anticorpo numa célula hospedeira. O termo "sequência reguladora" destina-se a incluir promotores, estimuladores e outros elementos de controlo da expressão (e.g., sinais de poliadenilação), conforme necessário, que controlam a transcrição ou tradução do ou dos genes das cadeias de anticorpo. O desenho do vector de expressão, incluindo a selecção de sequências reguladoras pode depender de factores tais como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão da proteína com interesse. As sequências regula- 30 ΡΕ1490405 doras preferidas para a expressão em células hospedeiras de mamífero incluem elementos virais que dirigem níveis elevados de expressão proteica em células de mamífero, tais como promotores e/ou estimuladores derivados de citome-galovírus (CMV), vírus símio 40 (SV40), adenovírus, (e.g., o principal promotor tardio de adenovírus (AdMLP)) e de vírus polioma.

Para além dos genes das cadeias pesada e/ou leve de anticorpo e sequências reguladoras, os vectores de expressão recombinantes do invento podem possuir sequências adicionais, tais como sequências que regulam a replicação do vector nas células hospedeiras (e.g., origens de replicação) e um ou mais genes de marcas selectivas. O gene da marca selectiva facilita a selecção de células hospedeiras em que o vector foi introduzido. Por exemplo, tipicamente o gene da marca seleccionável confere resistência a drogas, tais como G418, higromicina ou metotrexato, numa célula hospedeira em que o vector foi introduzido. Os genes de marcas seleccionáveis incluem o gene da redutase de di-hidrofolato (DHFR) (para usar em células hospedeiras defectivas para DHFR com selec-ção/amplificação com metotrexato), o gene neo (para selecção com G418) e glutamina sintetase (GS) numa linha celular negativa para GS (como seja NSO) para selec-ção/amplificação.

Para expressão das cadeias leve e/ou pesada, o ou os vectores de expressão codificadores das cadeias pesada 31 ΡΕ1490405 e/ou leve foram transfectados numa célula hospedeira através de técnicas convencionais, e.g., electroporação, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção com DEAE-dextrano e similares. Apesar de ser teoricamente impossível expressar os anticorpos do invento em células procarióticas ou eucarióticas, de preferência células eucarióticas, e mais de preferência células hospedeiras de mamífero, devido a tais células terem mais probabilidade de montar e secretar um anticorpo adequadamente enrolado e imunolo-gicamente activo. Células hospedeiras de mamífero preferidas, para a expressão de anticorpos recombinantes do invento, incluem células de ovário de hamster chinês (CHO) (incluindo células DHFR-CHO, descritas em Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216-20 (1980), usadas com uma marca de selecção DHFR, e.g., como descrito em Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol. 159:601-21 (1982), células de mieloma NS0, células COS e células SP2/0. Quando os vectores de expressão recombinantes codificadores de genes de anticorpos são introduzidos nas células hospedeiras de mamífero, os anticorpos são produzidos cultivando as células hospedeiras durante um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, mais de preferência, secreção do anticorpo para o meio de cultura no qual as células hospedeiras crescem. Os anticorpos podem ser recuperados, da célula hospedeira e/ou meio de cultura, usando métodos de purificação convencionais.

As células hospedeiras podem também ser usadas 32 ΡΕ1490405 para produzir porções ou fragmentos de anticorpos intactos, e.g. fragmentos Fab ou moléculas scFv. Deverá ser entendido que variações ao procedimento descrito estão dentro do âmbito do presente invento. Por exemplo, pode ser desejável transfectar uma célula hospedeira com DNA codificador da cadeia leve ou da cadeia pesada (mas não de ambas) de um anticorpo deste invento. A tecnologia de DNA recombinante pode também ser usada para remover parte ou a totalidade do DNA codificador de uma ou de ambas as cadeias leve e pesada não necessário à ligação ao Ligando hFas. As moléculas expressas a partir de tais moléculas de DNA truncado estão também incluídas nos anticorpos do invento.

Num sistema preferido para a expressão recombinante de um anticorpo do invento, um vector de expressão recombinante codificador da cadeia pesada do anticorpo e da cadeia leve do anticorpo é introduzido nas células DHFR-CHO pelo método de transfecção com fosfato de cálcio. Dentro do vector de expressão recombinante, os genes das cadeias pesada e leve do anticorpo estão operacionalmente ligados aos elementos reguladores do estimulador/promotor (e.g., derivados de SV40, CMV, adenovirus e similares, como seja um elemento regulador estimulador de CMV/promotor AdMLP ou um elemento regulador estimulador SV40/promotor AdNLP) para dirigir níveis elevados de transcrição dos genes. O vector de expressão recombinante também é portador de um gene DHFR, o qual permite a selecção de células, e.g., células CHO, que foram transfectadas com o vector usando selec-ção/amplificação com metotrexato. As células hospedeiras 33 ΡΕ1490405 transformantes seleccionadas são cultivadas para permitir a expressão das cadeias pesada e leve de anticorpo e o anticorpo intacto é recuperado a partir do meio de cultura. Técnicas convencionais de biologia molecular são usadas para preparar o vector de expressão recombinante, trans-fectar as células hospedeiras, seleccionar transformantes, cultivar as células hospedeiras e recuperar o anticorpo a partir do meio de cultura. Os anticorpos, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, do invento podem ser expressos num animal (e.g., um ratinho) que seja transgénico para genes de imunoglobulina humana (ver, e.g., Taylor, et al., Nucleic Acids Res. 20:6287-95 (1992)). As células vegetais podem também ser modificadas para criar plantas transgé-nicas que expressem o anticorpo, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, do invento.

Face ao que foi dito, uma outra realização do invento diz respeito a composições de ácidos nucleicos, vectores e células hospedeiras que podem ser usadas para a expressão recombinante dos anticorpos e fragmentos de anticorpo do invento. De preferência, o invento proporciona ácidos nucleicos isolados que compreendem uma região codificadora de duas ou mais CDRs de 3E1 ou 4G11 e mesmo mais de preferência as CDRs existem na proteína expressa (e.g., anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio) no mesmo local CDR dentro da estrutura do anticorpo em que existem no anticorpo 3E1 ou 4G11. De preferência, o invento proporciona ácidos nucleicos isolados que compreendem uma região codificadora da região variável da cadeia pesada de 34 ΡΕ1490405 3Ε1 ou 4G11 e/ou a região variável da cadeia leve de 3E1 ou 4G11. Assim, numa realização, o invento proporciona um ácido nucleico isolado codificador de um polipeptideo compreendendo uma região variável da cadeia pesada de anticorpo da CDR3 da cadeia pesada de 3E1, com uma sequência como a mostrada em SEQ ID NO:16, e/ou uma CDR2 da cadeia pesada, como mostrado em SEQ ID NO: 14, e/ou a CDR1 da cadeia pesada 3E1, com a sequência como mostrada em SEQ ID NO:12. Mais de preferência, o ácido nucleico isolado codifica um polipeptideo compreendendo uma região variável da cadeia pesada de anticorpo, com uma sequência como a mostrada em SEQ ID NO:10 (a região HCVR completa de 3E1).

Numa outra realização, o invento proporciona um ácido nucleico isolado codificador de um polipetideo compreendendo uma região variável da cadeia pesada da CDR3 da cadeia pesada de 4G11, com uma sequência como a mostrada em SEQ ID NO:24, e/ou a CDR2 da cadeia pesada de 4G11, com uma sequência como a mostrada em SEQ ID NO:22, e/ou a CDR11 da cadeia pesada de 4G11, com a sequência como a mostrada em SEQ ID NO:20. Mesmo mais de preferência, o ácido nucleico isolado codifica um polipéptido compreendendo uma região variável da cadeia pesada de anticorpo compreendendo a sequência como mostrado em SEQ ID NO: 18 (a região HCVR completa de 4G11). É considerado que a cadeia pesada e/ou a cadeia leve presente num anticorpo do invento pode compreender várias combinações das CDRs do invento, e.g., CDR1 e CDR2; 35 ΡΕ1490405 CDRl e CDR3; CDR2 e CDR3; OU CDRl, CDR2 e CDR3. (CDRl com a sequência como mostrado em SEQ ID NOS: 4, 12 ou 20; CDR2 com uma sequência como mostrada em SEQ ID NOS:6, 14 ou 22; CDR3 com uma sequência como mostrado em SEQ ID NOS: 8, 16 ou 24) . De preferência, as sequências CDR, quando existem num anticorpo do invento, existem na mesma posição CDR tal como estão no anticorpo 3E1 ou 4G11. É considerado que as CDRs possam existir em diferentes cadeias noutros anticorpos do invento relativamente aquelas em que surgem no anticorpo 3E1 ou 4G11. No entanto, mais de preferência, as sequências CDRs quando existem num anticorpo do invento, existem na mesma posição CDR e na mesma cadeia (leve ou pesada) em que existem no anticorpo 3E1 ou 4G11.

Ainda numa outra realização, o invento proporciona um ácido nucleico isolado, codificador de uma região variável de cadeia leve de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2 (i.e., a LCVR 3E1 ou 4G11) . De preferência este ácido nucleico compreende a sequência nucleotidica de SEQ ID NO:l, se bem que os familiarizados com a matéria saberão que devido à degenerescência do código genético, outras sequências nucleotidicas podem codificar a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2. O ácido nucleico pode codificar apenas a LCVR ou pode também codificar uma região constante da cadeia leve de anticorpo, operacionalmente ligado ao LCVR. Numa realização, este ácido nucleico é um vector de expressão recombinante. 36 ΡΕ1490405

Ainda numa outra realização, o invento proporciona um ácido nucleico isolado codificador da região variável da cadeia pesada de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 (i.e., a HCVR de 3E!). Este ácido nucleico pode compreender a sequência nucleotidica de SEQ ID NO: 9, se bem que os familiarizados com a matéria saberão que devido à degenerescência do código genético, outras sequências nucleotidicas podem codificar a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:10. O ácido nucleico pode codificar apenas a HCVR ou pode também codificar, e.g. uma região constante da cadeia pesada, operacionalmente ligada ao HCVR. Por exemplo, o ácido nucleico pode compreender uma região constante de IgG4 ou de IgGl. Numa realização, este ácido nucleico está inserido num vector de expressão recombinante.

Ainda numa outra realização, o invento proporciona um ácido nucleico isolado codificador de uma região variável da cadeia pesada de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:18 (i.e., a HCVR 4011) . Este ácido nucleico pode compreender a sequência nucleotidica de SEQ ID NO:17, ainda que os familiarizados com a matéria saibam que, devido à degenerescência do código genético, outras sequências nucleotidicas possam codificar a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:18. O ácido nucleico pode codificar apenas a HCVR ou pode também codificar uma região constante da cadeia pesada, operacionalmente ligada à HCVR. Numa outra realização, este ácido nucleico está inserido num vector de expressão. 37 ΡΕ1490405 O invento também proporciona vectores de expressão recombinantes codificadores de uma cadeia pesada de anticorpo e de uma cadeia leve de anticorpo. Por exemplo, numa realização, o invento proporciona um vector de expressão recombinante codificador de: a) uma cadeia pesada de anticorpo tendo uma região variável compreendendo a sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 10 e 18; e b) uma cadeia leve de anticorpo tendo uma região variável compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2. O invento também proporciona células hospedeiras nas quais foram introduzidos um ou mais dos vectores de expressão recombinantes do invento. De preferência, a célula hospedeira é uma célula hospedeira de mamífero, mais de preferência a célula hospedeira é uma célula CHO, uma célula NSO ou uma célula COS. 0 invento proporciona ainda um método de síntese de um anticorpo recombinante do invento através da cultura de uma célula hospedeira do invento num meio de cultura adequado até um anticorpo humano recombinante do invento ser sintetizado. 0 método pode ainda compreender o isolamento de anticorpo humano recombinante a partir do meio de cultura, da célula hospedeira ou de ambos.

Uma vez expressos, os anticorpos totais, seus 38 ΡΕ1490405 dímeros, cadeias leves e pesadas individuais, ou outras formas de imunoglobulina do presente invento podem ser purificados de acordo com processos convencionais da área, incluindo precipitação com sulfato de amónio, permuta iónica, afinidade, fase reversa, cromatografia em coluna de interacção hidrofóbica, electroforese em gel e similares. São preferidas imunoglobulinas substancialmente puras com pelo menos cerca de 90 a 95% de homogeneidade e ainda mais preferido 98 a 99% ou mais de homogeneidade, para utilização farmacêutica. Uma vez purificados, parcialmente ou até à homogeneidade conforme pretendido, os poli-peptídeos podem ser então usados terapeuticamente ou profilacticamente, como aqui descrito.

Os anticorpos ou fragmentos de anticorpo do presente invento podem ser incluídos em composições farmacêuticas adequadas para administração a um indivíduo. Tipicamente, a composição farmacêutica compreende um anticorpo ou um fragmento de anticorpo do invento e um diluente, veiculo e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável. As composições farmacêuticas para administração são projecta-das para serem adequadas ao modo de administração seleccio-nado, e diluentes, veículos e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis, tais como agentes de dispersão, tampos, tensioactivos, preservativos, agentes de solubilização, agentes de isotonicidade, agentes estabilizadores e similares são usados conforme adequado.

Uma composição farmacêutica compreendendo um 39 ΡΕ1490405 anticorpo humano anti-hFasL do presente invento pode ser administrada a um mamífero em risco ou apresentando patologias associadas a interacções Fas-FasL, usando técnicas de administração convencionais por administração intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, pulmonar, transdérmica, intramuscular, intranasal, bucal, sublingual ou com supositórios .

Os anticorpos do invento podem ser incorporados numa composição farmacêutica adequada para administração parentérica. Prefere-se a administração sistémica periférica por injecção intravenosa ou intraperitoneal ou subcutânea. Veículos adequados para tais injecções são de obtenção fácil e conhecidos na área.

As composições farmacêuticas tipicamente devem ser estéreis e estáveis nas condições de produção e armazenamento. Assim, as composições farmacêuticas podem ser esterilizadas por filtração, após preparação da formulação, ou de outra forma tornados aceitáveis em termos microbiológicos. Uma composição típica para infusão intravenosa poderá ter um volume até 250 ml de fluido, como seja solução de Ringer estéril ela 100 mg/ml, ou mais, na concentração de anticorpo. Os agentes terapêuticos podem todos ser congelados ou liofilizados para armazenamento e reconstituídos num veículo estéril adequado antes de serem usados. A liofilização e reconstituição podem conduzir a vários graus de perda de actividade do anticorpo (e.g., com imunoglobulinas convencionais, os anticorpos IgM tendem a 40 ΡΕ1490405 ter maior perda de actividade do que os anticorpos IgG). As dosagens podem ter de ser ajustadas para compensar. De um modo geral, é preferido o pH entre 6 e 8.

FasL desempenha um papel critico na patologia associada a uma variedade de doenças envolvendo factores imunes e inflamatórios. Assim, uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo humano anti-hFasL do invento pode ser usada para tratar ou prevenir doenças auto-imunes e inflamatórias incluindo, mas não estando limitado a sindrome de resposta inflamatória sistémica, sepsia, sindrome da disfunção de múltiplos órgãos, sindrome da insuficiência respiratória aguda, sepsia grave, trauma, doença de enxerto versus hospedeiro, rejeição de órgãos associada ao transplante de órgãos, esclerose múltipla, fibrose pulmonar idiopática, osteoartrite, colite, doença de Crohn, colite ulcerativa, enfarte agudo do miocárdio, lesão de reperfusão cardíaca, diabetes, cancros (incluindo e.g., cancros que expressam FasL como mecanismo de evasão da resposta imune, e determinados tipos de cancro tais como cancro da mama, melanoma, cancro do ovário, cancro do cólon, NSCLC, linfoma e carcinoma hepatocelular), vírus da imunodeficiência humana e alterações hepáticas incluindo mas não estando limitado a hepatite virai B ou C fulminante, vírus da hepatite C crónica, vírus da hepatite B crónica, hepatite alcoólica e cirrose hepática, e alterações renais incluindo mas não estando limitado a doença renal, doença renal crónica, nefropatia diabética. 41 ΡΕ1490405 É igualmente considerada a utilização de anticorpo humano anti-hFasL do presente invento para o tratamento de pelo menos uma das alterações referidas, em que a actividade FasL é prejudicial. Ainda, é contemplada a utilização do anticorpo de um anticorpo anti-hFasL do presente invento para usar na produção de um medicamento para o tratamento de pelo menos uma das alterações atrás referidas, em que é lesiva a actividade FasL.

Como aqui é usado, os termos "tratamento" e similares, referem-se à obtenção de um efeito farmacológico e/ou fisiológico pretendido. 0 efeito pode ser profiláctico, em termos de prevenção completa ou parcial de uma doença ou sintoma, e/ou pode ser terapêutico, em termos de uma cura parcial ou completa de uma doença e/ou efeito adverso atribuível à doença. "Tratamento", como aqui é usado abrange qualquer tratamento de uma doença num mamífero, particularmente num ser humano, e inclui: (a) prevenção da ocorrência da doença num indivíduo que possa estar predisposto para a doença mas em que ainda não tenha sido diagnosticada; (b) inibição da doença, i.e., paragem do seu desenvolvimento; e (c) alívio da doença, i.e., indução da regressão da doença.

Uma composição farmacêutica do invento é, de preferência, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" ou uma "quantidade profilacticamente eficaz" de um anticorpo do invento. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e durante 42 ΡΕ1490405 períodos de tempo necessários, para se conseguir o resultado terapêutico pretendido. Uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo do invento pode variar de acordo com factores tais como estado da doença, idade, sexo e peso do indivíduo e da capacidade do anticorpo ou fragmento de anticorpo para induzir uma resposta pretendida no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é igualmente uma em que qualquer efeito tóxico ou lesivo do anticorpo, ou seu fragmento de ligação ao antigénio, seja ultrapassado pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma "quantidade profilacticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e durante períodos de tempo necessários, para se conseguir o resultado profiláctico pretendido. Tipicamente, uma vez que uma dose profiláctica é usada em indivíduos antes da doença ou numa fase inicial da doença, a quantidade profilacticamente eficaz será inferior à quantidade terapeuticamente eficaz.

Os regimes de dosagem podem ser ajustados para proporcionar a resposta pretendida óptima (e.g., uma resposta terapêutica ou profiláctica). Por exemplo, pode ser administrado um bolus, podem ser administradas múltiplas doses ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica.

Dada a sua capacidade para se ligarem a hFasL, os anticorpos do invento podem ser usados para detectar polipeptídeos FasL (e.g., numa amostra biológica, como seja 43 ΡΕ1490405 soro ou plasma), usando um imunoensaio convencional, como sejam ensaios imunossorventes ligados a enzimas (ELISA), um radio-imunoensaio (RIA)ou imuno-histoquímica de tecidos. O invento proporciona um método para detectar FasL numa amostra biológica compreendendo o contacto de uma amostra biológica com um anticorpo, ou fragmento de anticorpo, do invento e detecção do anticorpo (ou fragmento de anticorpo) ligado a hFasL ou anticorpo não ligado (ou fragmento de anticorpo), para assim detectar hFasL na amostra biológica. O anticorpo é directamente ou indirectamente marcado com uma substância detectável para facilitar a detecção do anticorpo ligado ou não ligado. Substâncias detectáveis adequadas incluem várias enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes e materiais radioactivos. Exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, betaga-lactosidase ou acetilcolinesterase; exemplos de complexos de grupos prostéticos adequados incluem estreptavidi-na/biotina e avidina/biotina; exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceina, isotiocianato de fluoresceina, rodamina, diclorotriazi-nilamina-fluoresceína, cloreto de dansilo ou ficoeritrina; um exemplo de material luminescente inclui luminol; e exemplos de um material radioactivo incluem 125I, 131I, 35S ou 3H.

FasL pode ser testado em fluidos biológicos através de um imunoensaio de competição, usando padrões de FasL marcados com uma substância detectável e um anticorpo humano anti-hFasL não marcado. Neste ensaio, a amostra biológica, os padrões FasL marcados e o anticorpo humano anti- 44 ΡΕ1490405 hFasL foram combinados e determinada a quantidade de padrão FasL ligado ao anticorpo não marcado. A quantidade de FasL na amostra é inversamente proporcional à quantidade de padrão FasL marcado ligado ao anticorpo humano anti-FasL.

Um anticorpo anti-hFasL do presente invento pode ser usado num ensaio de diagnóstico para a expressão de FasL. Podem ser usadas várias técnicas de ensaio de diagnóstico conhecidas na área, tais como ensaios de ligação competitiva, ensaios tipo sanduíche de ELISA direc-ta ou indirecta e ensaios de imunoprecipitação realizados em fases heterogéneas ou homogéneas. Ver, e.g., Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158. 0 anticorpo usado no ensaio pode ser marcado com um grupo detectável. 0 grupo detectável deverá ser capaz de produzir, directamente ou indirectamen-te, um sinal detectável. Por exemplo, o grupo detectável pode ser um isótopo radioactivo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S ou 125I, um composto fluorescente ou quimioluminescente (como seja isotiocianato de fluoresceína, rodamina ou luci-ferina) ou uma enzima (como seja fosfatase alacalina, β-galactosidase ou peroxidase de rábano silvestre). Pode ser empregue qualquer método conhecido na área para conjugação do anticorpo ao grupo detectável.

Exemplo 1: Actividade funcional determinada usando um ensaio de Jurkat com hFasL solúvel

Meio FasL/estimulador foi preparado numa concentração de 4X. O meio IX possui 50 ng/ml de FasL humano 45 ΡΕ1490405 recombinante solúvel a 50 ng/ml (Alexis® Biochemicals, Catálogo # 522-001) e 1 μg/ml de anticorpo monoclonal de ratinho anti-FLAG M2 (estimulador; Sigma Chemical Co., Catálogo # F-3165) em meio de ensaio de células Jurkat (DMEM: F-12 (3:1), 10% FBS, HEPES 20 mM e 50 μg/ml de gentamicina) . O meio IX foi usado como o controlo para "100% de apoptose". O meio de células Jurkat sem FasL ou estimulador foi usado como controlo de "0% de apoptose". O meio foi incubado à temperatura ambiente durante uma hora. Para cada determinação, 25 μΐ de meio Ligando Fas estimulado 4X ou uma amostra controlo foram adicionados a cada alvéolo numa placa de 96 alvéolos. Em seguida, adicionou-se a cada alvéolo 25 μΐ de amostra de inibidor (anticorpo anti-hFasL 3E1 ou 4G11) ou de uma amostra testemunha. Esta adição dilui todas as amostras e meio para metade da concentração original. As amostras foram incubadas 45 a 60 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, adicionou-se 50 μΐ de células Jurkat, numa concentração de 106 células/ml. Esta adição origina amostras a um quarto da sua concentração inicial estimuladas com FasL IX e 5 x 104 células Jurkat/alvéolo. As placas foram incubadas durante três horas a 37°C em 5% de dióxido de carbono. O reagente de proliferação celular WST-1 (Roche, Catálogo # 1644807) foi adicionado numa concentração de 10 μΐ/alvéolo. As placas foram incubadas novamente durante aproximadamente 18 horas a 37°C em 5% de dióxido de carbono. As placas foram então lidas num espectrofotómetro leitor de placas a um comprimento de onda óptimo de 450 nm. Os resultados indicam 46 ΡΕ1490405 que ambos os anticorpos humanos anti-hFasL, 3E1 e 4G11, são eficazes na neutralização da apoptose mediada por FasL neste ensaio.

Exemplo 2: Ensaio CHO-K 1/Jurkat com FasL ligado a mem-branas

Uma linha celular CHO-Kl expressando estavelmente uma versão não clivável de hFasL, CHO-Kl Del.huFasL marcada, foi manipulada para testar a capacidade dos anticorpos 3E1 e 4G11 para bloquear a actividade de FasL associado a membranas. Esta linha celular expressa niveis de FasL à superfície que, quando cocultivada com células Jurkat, induz apoptose de Jurkat. O meio de células CHO-1 aderentes foi preparado usando DMEM: F—12 (3:1), 5% FBS, 40 μς/ιηΐ de L-prolina (Sigma) , 50 μς/ιηΐ de Gentamicina (Sigma) e 600 μρ/ιηΐ de G418. Para cada uma das determinações, aproximadamente 104 células CHO-Kl (CHO-Kl Del.huFasL ou parental) foram adicionadas por alvéolo em placas de 96 alvéolos. As células foram incubadas durante a noite a 37°C em 5% de dióxido de carbono. O meio foi removido, e adicionou-se, a cada alvéolo, 100 μΐ de amostra de inibidor (anticorpo 3E1 ou 4G11; diluições seriadas cobrindo uma gama de concentrações) ou controlo (meio). As placas foram incubadas durante uma hora a 37°C em 5% de dióxido de carbono. Cinquenta microlitros de células Jurkat (2,5 x 105 células/alvéolo) foram adicionados a cada alvéolo e as 47 ΡΕ1490405 placas foram incubadas durante duas horas a 37°C em 5% de dióxido de carbono. Dez microlitros de reagente de proliferação celular WST-1 foram adicionados a cada alvéolo. As placas foram novamente incubadas, durante quatro horas a 37°C em 5% de dióxido de carbono. As placas foram então lidas num espectrofotómetro leitor de placas a um comprimento de onda óptimo de 450 nm. Os resultados indicam que ambos os anticorpos, 3E1 e 4G11, foram eficazes no bloqueio da apoptose mediada por FasL ligado a membranas neste ensaio.

Exemplo 3: Medição da afinidade dos anticorpos monoclonais A afinidade de vários anticorpos anti-hFasL para FasL humano recombinante solúvel (rhs) (Alexis®Bioche-micals, Catálogo # 522-001) foi medida usando um instrumento BIAcore® 2000. O BIAcore® utiliza as propriedades ópticas da ressonância de plasmões de superfície para detectar a alteração na concentração proteica de moléculas que interagem com uma matriz de biosensor dextrano. Excepto quando especificamente referido, todos os reagentes e materiais foram adquiridos à BIAcore® AB (Upsala, Suécia) . Todas as medições foram realizadas à temperatura ambiente. As amostras foram dissolvidas em tampão HBS-EP (cloreto de sódio 150 mM, EDTA 3 mM, 0,005% (p/v) tensioactivo P-20 e HEPES 10 mM, pH 7,4). Anticorpo de cabra anti-Fc humana foi imobilizado nas células de fluxo 1 e 2 de um chip sensor BI num nível de 500 unidades de resposta (RUs) usando um estojo ("kit") de acoplagem de aminas. 48 ΡΕ1490405 A ligação de FasL rhs foi avaliada usando múltiplos ciclos analíticos. Cada um dos ciclos foi realizado a um fluxo de 50 μΐ/minuto e consistiu nos seguintes passos: injecção de 10 μΐ de um anticorpo anti-hFasL3El a 1 μρ/πιΐ, injecção de 240 μΐ de FasL rhs (começando em 100 nM e usando diluições seriadas de duas vezes para cada ciclo) seguido de 20 minutos para dissociação e regeneração usando 50 μΐ de cloreto de glicina 10 mM, pH 1,5. As velocidades de associação e dissociação, para cada ciclo, foram avaliadas usando um modelo de ligação "Langmuir 1:1 com transporte de massa" no software BlAevaluation.

Exemplo 4: Ensaio de apoptose HepG2 com Ligando Faz recombinante solúvel A linha celular HepG2 (carcinoma hepatocelular; ATCC # HB-8065) foi usada para avaliar a neutralização de FasL solúvel recombinante por anticorpos 3E1 e 4G11. O meio celular foi preparado usando DMEM:F-12 (3:1), 10% FBS, HEPES 20 mM e 50 μρ/ιηΐ de gentamicina. Para cada determinação, células HepG2 foram semeadas em placas de 96 alvéolos revestidas com poli-D-lisina numa concentração de 1 x 104 células/alvéolo em 200 μΐ de meio. As células foram incubadas durante a noite a 37 °C em 5% de dióxido de carbono. O meio foi removido e substituído por 100 μΐ de meio contendo 60 μρ/πιΐ de sulfato de bleomicina (Sigma Chemical, Catálogo # B8416) . As placas foram incubadas durante a noite usando uma câmara húmida. 49 ΡΕ1490405

Uma solução stock de FasL-FLAG humana em meio de ensaio (a concentração final é de 50 ng/ml de FasL e 1 μς/ιτιΐ de estimulador anti-FLAG para formar FasL estimulado). Os anticorpos anti-FasL foram adicionados a uma porção da solução stock para preparar meio FasL estimulado com inibidor. Cada solução foi incubada durante uma hora à temperatura ambiente. Para as amostras do controlo de 100% de apoptose, 50 μΐ/alvéolo da solução FasL estimulado foram adicionados ao meio contendo bleomicina já nos alvéolos. Para as amostras de inibidor, 100 μΐ/alvéolo de FasL estimulado mais solução de anticorpo foram adicionados ao meio contendo bleomicina já presente nos alvéolos. As placas foram então incubadas durante a noite, a 37°C, em 5% de dióxido de carbono.

Preparou-se uma diluição a um para um de reagente de proliferação celular WST-1 e meio. Vinte microlitros de WST-1 diluido foram adicionados a cada alvéolo. As placas foram novamente incubadas durante a noite, a 37°C, em 5% de dióxido de carbono. As placas foram então lidas num espectrofotómetro leitor de placas a um comprimento de onda óptimo de 450 nm. Os resultados indicam que à medida que a concentração de anticorpo decresce a apoptose aumenta.

Exemplo 5: Clonagem e sequenciação de regiões de ligação ao antigénio da cadeia pesada e da cadeia leve

As regiões variáveis das cadeias pesada e leve para o mAb 3E1 humano neutralizante foram clonadas e sequenciadas usando os seguintes protocolos. 50 ΡΕ1490405

Preparou-se mRNA a partir de 2 x 106 células de hibridoma usando o protocolo Micro-Fast Track (Invitrogen) fornecido com o estojo ("kit"). Preparou-se cDNA a partir de 200 μΐ de mRNA precipitado com etanol usando o estojo ("kit") cDNA Cycle (Invitrogen) através de sequenciação da aliquota de mRNA durante trinta minutos a 14000 rpm a 4°C, seguido de lavagem do sedimento com 70% de etanol. O sedimento seco ao ar foi ressuspenso em 11,5 μΐ de água estéril e o cDNA foi preparado seguindo as instruções do estojo ("kit"). O cDNA foi precipitado usando etanol, depois ressuspenso em 30 μΐ de água para PCR.

As reacções de PCR foram preparadas com sequências iniciadoras degeneradas no extremo 5' da região variável, para a cadeia pesada e leve, emparelhadas com sequências iniciadoras 3' na região constante. Para cada 50 μΐ de reacção, usou-se 1 μΐ de cDNA. A reacção foi preparada para usar com Pfu I seguido de vinte ciclos. Os produtos de PCR foram analisados correndo 5 μΐ de cada reacção num gel de 2% de agarose. As reacções positivas foram clonadas usando o estojo ("kit") de clonagem de PCR Zero Blunt TOPO (Invitrogen). Minipreparações dos clones positivos foram sequenciadas e analisadas relativamente aos rearranjos de genes produtivos. Os resultados de reacções de PCR independentes e sequenciação de múltiplos clones revelaram sequências do presente invento. 51 ΡΕ1490405

Exemplo 6: Ensaio com hepatócitos de rato isolados A apoptose desempenha um papel na lesão tóxica do fígado, carcinoma hepatocelular, doença do fígado mediada por imunidade e hepatite virai (Kanzler and Galle, Seminars Câncer Biol. 10(3):173-84 (2000)). Estudos anteriores demonstraram que hepatócitos humanos primários são susceptíveis de apoptose induzida por FasL. Mais fáceis de conseguir, os hepatócitos primários de rato são igualmente susceptíveis à apoptose induzida por hFasL. Este sistema de ensaio foi usado para demonstrar que a morte de hepatócitos de rato e a activação de caspases, indicadoras de sinalização celular induzida por Fas-FasL, são inibidas pelos anticorpos monoclonais humanos anti-hFasL, 3E1 e 4G11.

Adquiriam-se hepatócitos primários de ratos em matrigel, em placas de 12 alvéolos a 7 x 105 célu-las/alvéolo In vitro Technologies, Catálogo # M00717MG). As células foram incubadas durante quatro a vinte e quatro horas nas seguintes condições: (1) não estimuladas, (2) estimuladas com FasL humano, (3) estimuladas com hFasL mais FasL inibido (usando os anticorpos 3E1 e 4G11) ou (4) estimuladas com hFasL mais caspase 3 inibida. Estas células foram analisadas de acordo com duas vias: (a) análise da desidrogenase de lactato e (b) análise das capases 3/8, exemplificado como no Exemplo 6a e 6b, respectivamente. A 52 ΡΕ1490405 libertação de desidrogenase de lactato pelas células indica morte celular por qualquer método. A libertação das caspases 3 e/ou 8 pelas células indica apoptose mediada por Fas-FasL.

Exemplo 6a: Análise da desidrogenase de lactato 0 reagente LD-L20 da desidrogenase de lactato (Sigma Chemical, Catálogo # 228-20) é uma mistura de lactato e NAD usada para a determinação cinética e quantitativa da actividade de desidrogenase de lactato. A desidrogenase de lactato catalisa a oxidação de lactato para piruvato com redução simultânea de NAD. A formação de NADH resulta num aumento na absorvância a λ340 nm. A velocidade de aumento na absorvância a λ340 nm é directa-mente proporcional à actividade LD na amostra.

Numa placa de 96 alvéolos, 10 μΐ de amostra de meio de cultura celular foram misturados com 200 μΐ de reagente LD-L pré-aquecido. A placa foi colocada num leitor de placas a 37°C, durante um período de incubação de 60 segundos, lendo a absorvância a λ340 nm em três pontos do tempo: 0, 30 e 60 segundos. A leitura de absorvância inicial (ponto do tempo 0 segundos) foi subtraída da leitura de absorvância final (ponto de tempo 60 segundos) para se obter Δ absorvância/minuto. A Δ absorvância/minuto foi convertida em actividade LD (U/l) de acordo com um cálculo 53 ΡΕ1490405 proporcionado pelo fornecedor do reagente. Os resultados indicam que a presença de anticorpo reduz grandemente a libertação de desidrogenase de lactato pelas células, significando um decréscimo na morte celular.

Exemplo 6b: Análise de caspases 3/8 0 estojo ("kit") ApoAlert Caspase Fluorescent Assay (Clontech, Catálogo # K2026-2) foi usado para detec-tar a actividade de caspases especificas (3, 8 ou 9/6), que se tornam activas em diferentes fases do processo apoptó-tico. 7-amino-4-trifluorometilcoumarina (AFC), conjugada com um substrato, é clivada proteoliticamente pela caspase adequada na amostra e a AFC livre fluoresce a λ 505 nm.

Numa placa preta de 96 alvéolos, 50 μΐ de lisado celular foram misturados com 50 μΐ de tampão de reacção e 5 μΐ de substrato caspase-3 ou caspase-8. A mistura foi incubada a 37 °C durante uma hora e lida num leitor de placas para fluorescência a λ 400 nm de excitação/λ 505 nm de emissão. As emissões pelas amostras apoptóticas foram comparadas com controlos não induzidos e inibidos, permitindo a determinação do aumento da actividade de protease. Os resultados indicam que a activação das caspases 3/8 é completamente inibida em amostras contendo FasL mais anticorpo anti-hFasL. 54 ΡΕ1490405

Exemplo 7: Actividade funcional usando células Jurkat com FasL nativo regulado positivamente A estimulação de células Jurkat com um anticorpo imobilizado contra o receptor de células T CD3 induz activação celular e regulação positiva de FasL nativa. A morte celular induzida por activação ocorre então, o que pode ser medido directamente pela avaliação da sobrevivência celular ou actividade de caspase 3 activa. Este sistema foi usado para determinar a capacidade do anticorpo anti-FasL (3E1 foi usado apesar de se considerar que 4G11 ou outros anticorpos do invento podem ser usados) para bloquear a morte celular.

Placas de 96 alvéolos de fundo plano, não tratadas para cultura de tecidos foram revestidas com anticorpo anti-CD3 humano (50 μΐ/alvéolo, 1 μς/ιηΐ em PBS) a 4°C durante a noite. As placas foram então lavadas com PBS para remover anticorpo não ligado. As células T jurkat foram adicionadas aos alvéolos (50 000 células/alvéolo) sozinhas ou juntamente com inibidor (Anticorpo 3E1) ou uma IgG4 testemunha, em várias concentrações (5 μρ/ιηΐ a 5 ng/ml num volume final de 100 μΐ em meio de ensaio para Jurkat) e incubadas durante 24 horas a 37°C em 5% de dióxido de carbono. O reagente WST-1 (disponível, e.g., na Panvera) foi então adicionado (10 μΐ/alvéolo) e as placas incubadas durante mais 24 horas. As placas foram lidas num 55 ΡΕ1490405 espectrofotómetro leitor de placas a 450 nm. WST-1 foi usado para medir o número de células viáveis. Os resultados indicam que os anticorpos anti-hFasL usados no ensaio foram eficazes na neutralização da apoptose mediada por FasL nativo neste ensaio.

Como alternativa, placas de 24 alvéolos (não para cultura de tecidos) foram revestidas com o anticorpo anti-CD3 como descrito atrás. Células T Jurkat foram então adicionadas (200000 células/alvéolo) sozinhas ou juntamente com o inibidor ou anticorpo controlo (volume final de 400 μΐ) e incubadas durante 24 a 48 horas, a 37°C, em 5% de dióxido de carbono. As células foram então colhidas e lavadas. As células foram permeabilizadas (Cytoperm/Cyto-fix, Pharmingen # 554722) e coradas com um anticorpo anti-capase 3 activa-FITC (Pharmingen # 559341) e a coloração das células avaliada num citómetro de fluxo. Os resultados indicam que os anticorpos anti-hFasL foram eficazes na inibição da activação de caspase 3 (a actividade de caspase 3 conduz a apoptose celular).

Exemplo 8: Anticorpos anti-FasL inibem apoptose de células T humanas infectadas com HIV

As células T do sangue periférico estão geralmente quiescentes, até ser estimulada uma resposta imune. No entanto, as células T periféricas de doentes infectados 56 ΡΕ1490405 com HIV apresentam um fenótipo activado, que inclui regulação positiva de Fas na superfície e indução de FasL. Considera-se que esta interacção Fas-FasL na superfície é responsável pela perda de muitas das células T periféricas não infectadas por HIV, via apoptose. Para estudar se os anticorpos anti-FasL poderão bloquear esta morte celular, foi efectuada a experiência que se segue. Células mononucleadas do sangue periférico (PBMCs) foram purificadas a partir de sangue total de doentes infectados com HIV usando Ficoll-Hypaque. As células foram adicionadas a placas de 24 alvéolos a 700000 células/alvéolo em meio sozinho ou juntamente com PHA (5 μg/ml) e IL-2 recombinante (50 U/ml) , que activam ainda mais as células. As células foram incubadas com ou sem os anticorpos anti-FasL (2 μρ/πιΐ a 200 ng/ml num volume final de 500 μΐ) . As placas foram incubadas durante 24 horas ou 72 horas a 37°C em 5% de dióxido de carbono. As células foram então colhidas, lavadas e incubadas com anticorpo anti-CD4-PE. As células foram então novamente lavadas, permeabilizadas e coradas com um anticorpo anti-caspase 3 activa-FTC e a coloração das células avaliada num citómetro de fluxo. Os resultados indicaram que os anticorpos anti-hFasL foram eficazes na redução da activação de caspase 3, e portanto da apoptose, em linfócitos de sangue periférico positivos para CD4 e negativos para CD4. 57 ΡΕ1490405

Tabela 1. Sequência de DNA & aminoácidos da região variável da cadeia pesada de 3E1

$ V Q L V OS β & E Ϊ t K F 0 A S i cmamcmc tggtgcagtc tggagcyg&g ουο&μ&αοο cwjgggcctc GTCCRCGTCa ACC*CStC&8 acctcsactc cácxfcttcg c&ccccggag

CDRI

V K V S C X Ά ã G Y 1 F I R HO SI MTGMGGTÇ TCCPSCSA^S CTTCTQGTIA CSKfÇtTTSflPC AímCS^SfA TCACTfCOÃS AOOACamiC O&AQACCAA? OTÃGAAAYM YCT5YACCAT I f W V A Q A. R G O G A E V M S W 101 TG^CCTSSST GCmaGSCC CCTGSA.CAA<? eSOTOftâTG GMXSQSMSG &OTGOACCC& escTGTCCGa ús&ccmnc eosAACYCAC emceeráce

1 MA t M 0 M f M ? Á Q K V Q 0 & isx mcam&cy? acamnsgiaa ç^cm^cmT QÇhcmmm ycogggcas

TÃâOTSCmA T3TTACCATT GTGTTTGATA CSTOTCTTCC AGGfCCCGTC

V T N f T β 1 § Y S Y A Y MIL .5801 AOTGACCAY® AO&CAGACA AATCGMJOAÍS GMAOCCY&C AfQQMSCTm YC&STGST&C TQ8YSYC3OT TYAOSYBGTC GTOTCSS^KPS mCSCffitY R $ L R i E D h A V Y ¥ C A S E T 251 GSAGCCTíme ATOPG&ame OTSCOSTG? ATYATfSSTSC GASftG&GAfíf CCTCQ3ACTC Y&GACTSCTS CmEGCAGA TMTAM3WCS CTCTCYCTG&

Μ ¥ R Q ¥ P h D Y W 0 Q G T L V f 301 ATeSTfCSSG GÃGTTCOCCY TG&CTACTGG OOCC&SGGfiA CCCYGCTCAC TACCAftSCCC CTC&AGGSOA ACYSAYG&CC CCeSTCCCTY GSGACCSOTS

V & S ii f 1 0 P 8 V f i5 ;lf A 3·Bi esra^em ismraMx* ^meernc «πταα ereece

OCASftSaftGT CGMGGT00T TCGCGSGTA®· TCAGAAGG3G SACC8C ΡΕ1490405 58

Tabela 2. Sequência de DNA & aminoácidos da região variável da cadeia pesada de 4G11 Q V Q ϊ» Ϋ 0 É € A B V K K F Q A & l CaGGTSCASC 70S3OC&STC TSS&eCTSÃG <m&&(SUUSC C7G®5GCei€! GKPCCÃOSKPGG AGSMHmm ACCfCGâCTC C&OTJCSTO «Rccoceeas| CDR1 1 V K V S G K A S ΰ V I F I S H 6 51 AGTG&AGGTC SOCTGCMSG CSTCTOGim CmCfTmm mTCmmTATCMrmçm Mmamwsç qaaúaccaat mmMmm fcmtmxm X 8 W V SR Q & P G Q € L· K K Μ O W ui tc&otosíjt gcsrca&scc ccrosAcafts sArsasMKíeAsrawGtx» cseeisfccss GâàccfOTe ee&*»e*eAe ernseei® I CDR2 I I ir A f 8 0 í ΤΙ I A QI L Q O R 151 ATCAROGCT? ACACTGG7M «C&CASMES TCCASGGCfiJS τμχτοομ tgkagcrtt cmrnoiaA tmmcsrm mmxxmc 201 V T Μ T Τ' D R s f s T A Y MEL &GfACSACAG&CA. «rtccaco^ cwsmuccyacfadYGG:mc! físSYSfc*mr emoG^scrc ©tstcosáts mccremcr I 8 L R S D D T A V Y Y C A R B T 2 SI GQM3CCTSAS ATCimCSmC AOSQCOGTQT ATTACTSTeC QAGAGAGACT CCTOSGACTC mSÃOfGCTO TKÍQ^esem. TAATOaCRCe €tctctcrs& 3 01

Μ V R 0 ?í> € D Y W 8 Q 0 f L V Y ATGOTTC0Ô<3 GRGTTGCCTG mdYÃCTSG 8S<3C»fl0G*A COTSâfí&C mCÇAftíSCCíC CTCMSSGAC ACTOA1S&CC C03GTCCCTT GGSftCCÃSTS V S 3 A S f K 0 i 8 V F F L A 3 Sl CGYCSflCCTCA CK^PtCCROa AGGGCCCAYC eSTCYTCOCe CfGGCG ocãg&ogmw osaAOSTosT tcccgggsag scs^sjywso o&ccee ΡΕ1490405 59

Tabela 3. Sequência de DNA & aminoácidos da região variável da cadeia leve de 3E1 e 4G11 i B I V L T $ S P G T L S L· 8 P G S mMmmm: TemmcMxz çmwmm ctccagsgsa ewrMc&GA actsostcãg agotootqg mcMmhCk múúrcmcf 51 K Ã TmamccACQTserç®®Tm

am L s C S & B Q $ ¥ S $ s Y cropccTGca tmoamck mmGTrmc mcmemx COT CCCCWfCAGT CTCMJMTCQ TOTC^AfQÀ 101

& à w y maccmsíA Q Q K F ú Q k f E L TU I Y ccsácaeiiM çctg@cca®s eseccaoscs cctc^tctay sstqstcteot «@&oc®«c g&rsstccga I CDE2 Ii A S ""S.......1 A f s

P í! K F β S q 111

GSTGCi^XA. OTU3G3CCAC CCftCGTASfGT

TOSCATCCC& SMMGWOA A*5C6S»05GT CTOYCOtíyKP GTGBCSUCTGKJ çmxmmc B Ú f » F t 1* T 1 5 R fc B PR» 8Θ1 {STCTGGSkCA QftCTTCÃCTC TCACCATCAG casacxogais CCKMÍMT G&GACCCTST CmSOTSO a@T(2GT»0TC STCT<SVCCTC ©fiAOTam CDR3 W A V Y Y e Q 0' y $ $ s P W f F o ssi rmmsfGYA ^kar&mxs cAqmTásm scrcAcosTs GRCGmssoe Â&CáfCACAT MfáACàQfC OTCATACCAT CSR.G3S3SCAC cnxAA&ccs 0 g τ κ v e i κ m τ v A h w s v p 301 CMGGQ&OCA J^TQGRA&T CAAAOSMCT OITOíSCfGCâC CATCTSTCTT «tocctoot YccAccTrm ot*t&ctoa OAecmmm QTm&Gmm Ϊ f F 351 Cft3fCTTCCCS <ms&ms®c 60 ΡΕ1490405

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SEQ ID NO:l —> sequência polinucleotídica codificadora da região variável da cadeia leve de 3El ou 4G11

CCcMíSCTCCTCATCTAKSâitáCASCCAGCAC^CCACtOSi^TCCi^ACAGSrrcWi^aiGT S-SC^CTGSCAC^^CTTCAd^TC^CCATCASCJ^eTCCAQaClN^A^WTTGOÂe^TAWie TGT®GCACTÁTGGW3Cf€ÀCaí^^

Gf<SGC3'GCACC&TCI^CTlC3VSCn,CC<Jff SEQ ID NO:2 —* sequência de aminoácidos codificadora da região variável da cadeia leve de 3E1 ou 4G11 SEQ ID NO:3 —* sequência polinucleotídica codificadora de CDRl da cadeia leve de 3E1 ou 4G11

ÂGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCÂGCÂGCTACTTÂGCC SEQ ID NO:4 —> sequência de aminoácidos codificadora de CDRl da cadeia leve de 3E1 ou 4G11

RASQS'VSSS¥LA SEQ ID NO:5 —> sequência polinucleotídica codificadora de CDR2 da cadeia leve de 3E1 ou 4G11

GGTQCATCCAGGÁQGGCCACT SEQ ID NO:6 —» sequência de aminoácidos codificadora de CDR2 da cadeia leve de 3E1 ou 4G11

GASSRÂT SEQ ID NO:7 —► sequência polinucleotídica codificadora de CDR3 da cadeia leve de 3E1 ou 4G11

ÂGCÂGTATSGTAGOFCÁCOSTGGACG SEQ ID NO:8 —*· sequência de aminoácidos codificadora de CDR3 da cadeia leve de 3E1 ou 4G11

GQYSSSPWT SEQ ID NO:9 —>· sequência polinucleotídica codificadora da região variável da cadeia pesada de 3E1 61 ΡΕ1490405

Aí3ÃSíGAcmmccAC;AG#icmÃTccÃamíGÃm^cmcÁTQ^scT«^ficcK3aáftTCT sAC&Aa5ce®oosiCTM"iwmmx:mGM»^^^ GGCCÃGG<máeeCTÍ^OieeGTefCi^C&G^^ SEQ ID NO:10 —> sequência de aminoácidos codificadora da região variável da cadeia pesada de 3E1 QVQI^S^BWKSmfA^SCKRSSyiFIimSITSmQA^GQlígWHQSimyííQíi^^QWQÇ SEQ ID NO:11 —> sequência polinucleotidica codificadora de CDR1 da cadeia pesada de 3E1

A6ACÂTGGTÂTCÃCC SEQ ID NO:12 —» sequência de aminoácidos codificadora de CDR1 da cadeia pesada de 3E1

RHQT SEQ ID NO:13 —► sequência polinucleotidica codificadora de CDR2 da cadeia leve de 3E1 ou 4G11

TGGA ÍAAGGCTTACAATGGTAACACaAaCTATSCAí

AGAAGGTCCáGGGC SEQ ID NO: 14 —> sequência de aminoácidos codificadora de CDR2 da cadeia pesada de 3E1

WmY^GtiTNYAGKVQG SEQ ID NO:15 —> sequência polinucleotidica codificadora de CDR3 da cadeia pesada de 3E1

GAGACTATSOTTCGGGGAGTTCCCCTTGACTAC SEQ ID NO: 16 —» sequência de aminoácidos codificadora de CDR3 da cadeia pesada de 3E1

ETKVBGVPLDY SEQ ID NO:17 —> sequência polinucleotidica codificadora da região variável da cadeia pesada de 4G11

CTS^GITfXAfGGGAt^AÍKSAOGCl^fACÃGfGGTMCACAAACTAÍCsCACA-QÃASCSFCCAOGSC

AGAGTCÁCCA^^MCCACAQãCÍV^TCOViiGÃGCACAs^CTACAlSej^CTGftGGÃSCCTOísíiftXCT 62 ΡΕ1490405 SEQ ID NO:18 -> sequência de aminoácidos codificadora da região variável da cadeia pesada de 4G11 SEQ ID NO:19 —► sequência polinucleotídica codificadora de CDR1 da cadeia pesada de 4G11

ÂGTCATGGTATCAGT SEQ ID NO:20 —> sequência de aminoácidos codificadora de CDR1 da cadeia pesada de 4G11

SHSÍS SEQ ID NO:21 —> sequência polinucleotídica codificadora de CDR2 da cadeia leve de 4G11

TGGATCAâCGCTTACâGTGGTã&CACáMCTMGCáCàGAASCTCCAGGGC SEQ ID NO:22 —► sequência de aminoácidos codificadora de CDR2 da cadeia pesada de 4G11 SEQ ID NO:23 —► sequência polinucleotídica codificadora de CDR3 da cadeia pesada de 4G11

GAGÂCTÂTGíjTTCGG^GÂteTTCCCTGTGACTAC SEQ ID NO:16 —► sequência de aminoácidos codificadora de CDR3 da cadeia pesada de 4G11

ETtôVRSyFCDY LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Eli Lilly and Company <120> Anticorpos humanos anti-Ligando de hFas antagonistas e fragmentos dos mesmos <130> X15450 <160> 24 <170> Patentln versão 3.1 63 ΡΕ1490405 <210> 1 <211> 360

<212 > DNA <213> Homo sapiens <22 0 >

<221> CDS <222> (1)..(360) <223> <400> 1 gãã att gtú ttg acg cag tet eca g«c acc Thr etg tet ttg tet cca 48 C*u i1e vai léi Thr Gltl ser ΡΤΰ Gly Leu ser Leu ser PfO çty 1 5 10 15 gaa aqa qcc aee etc tcc tgc agg m agt esu Glrt aqt gtt Vai age age age 96 Glu Arg Al a Thr 29 Leu ser Cys Arg Ala i 5 ser Se** Ser 30 SSr Sêr tac tta qcc tgg t.at: rag eag aaa cct 30·' caq G1 fi gct; Ala Ce c *39 etc etc 144 Tyr teu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys pro GÍy Pro Arg Leu teu 3S 40 45 ate tat gqt qca tce aqc *99 qcc act ggt ate cca qac agg ttc a«t 192 ílè Tyr Sly Âlà Sèt Sèr m Ãla Thr 6iy lie Pfõ ÃSp m ?kê Ser SÔ 5S 69 flSC agi: 939 tet ata gac ttc act: etc acc ate age aga ctg gag 240 dy ser GÍy ser GÍy Thr Asp Phe Thr Leu thr lie ser Arg teu 61« 65 70 75 60 cet ga*s gat ttt gea gtg tat tat Ult tsq esg tat Sgt age tea ccg 288 pro G Ί U ÁSp Phe Ã1 a Va í Tyr Tyr cys Glfí Gin Tyr GÍy sêr Ser .PfÔ

SS 90 " 9S tqg acg ttc phç gge caâ 999 ace aag Trp Thr gTv 3JOO Gle Gly Thr Lys. gcá CCS tet gtc ttc ate ttc ccg Ala pro Ser vai phe ile ehe erb 115 129 <210> 2 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens gaa ate «aa tga act gtg gct 336 Vai Glu Ile L.ys Arg Thr Vai Ala 195 lio <4 00> 2 360 64 ΡΕ1490405 61 u rle vai Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 '10 15'

Gla Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Aía Ser 61o Ser Vai Ser Ser Ser 20 " 25 30

Tyr teu Ala Trp ryr sl« Gin ivs Pro Gly 61« Ale Pro Arg Leu Leu 35 m 45

Xle jyr Gly Ala Ser* ser Arg Ala Thr Gly ile pro Asp Arq Phe ser 50 55' 60 61y ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr íle Ser Arg teu 61u 65 70 75 80 pro Glu Asp Phe Ala vai Tvr iyr cys 6ln 61o Tyr slv Ser ser pro S5 SO ' 35

Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Xl« tys Arg Thr Vai AlA 100 105 1:10

Ala Pro ser vai phe Tle Pho Pro 115 120 <210> 3 <211> 36

<212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(36) <223> <4 00> 3 agg gce agt cag agt gtt age age age tac tta gee 36

Arg Ala sêr 61 r* Ser Vai sèr ser sêr Tyr Leu Ala 1 ' 5 10

<210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 00> 4

Arg Ala Ser 6l« ser vai ser Ser Ser Tyr teu Ala 1 5 1.0 <210> 5 65 ΡΕ1490405 q<jt qta t<x ágc ãm qce <K-t i?l

Gly Ãla ser ser Ar<j Àla Tbf 1 ' $ <210> 6

Gly Ala Mr §«r Ar§ Ala. Thf I I ' <210> 7 <211> 27

<212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(27) <223> <400> 7 Càg tat §dt ãqc ttâ <cg tg§ âeg GIr Glri tyr Giy ser s«r prõ τφ Thr 1 5

<210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 00> 8

Gla Gla tyr Sly Ser Ser Hro trp thr I 5 <210> 9 <211> 396

<212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (1)..(396) <223> <4 00> 9 66 ΡΕ1490405 e&g qvg cag ctg g% cag tet gga 9Çt Sfu 10 gta AAÇS aag cct acc 48 Gin Vai 1 61 a teu Vai 5 Gin Ser 61 y Ala vai Lys iys Pro Gly 15' Ala fcca gtg. aa.g gtc vai 20 tcc tge aag gçt tet: fGt tac. ate ttt ate &às tat 06 Ser vaí tys ser Cys Lyt À1 a Ser 25 Gly Tyr Ile Phe 11e Arg 39: His got ate. acc Th r 35 tgg gtg vai cga cag ecc ctt gaa c&a 9Ô9 ctt gag t m atg 144 t)y li® Trp Arç Gin Ala 40 Pr a GÍy Gin GÍy t eu Gk* 45 Trp Mét «ia xm ate aae gtt tac aãt ggt ase aca ããc tat gea esg aag gtc m. G i y Trp 50 lie Asn Ala. Tyr Asn 55 Gly A.SH Thr Asn Tyr 60 Ala. Gin Lys val cag ggc aga qtf. val iiCC atg acc aca §ac aaa tcc acg age aca qet tac 240 Gin GÍy 65 Arg Thr hei m Thr Thr Asp Lys Ser 75 Thr Ser Thr Àía ryr m at:§ gag ctg aqg age ctg íiga tet gaç gac gcg gee gtg tat val Tyr tat tgt 288 •»íet Glu Leu Arg Ser 85 teu Arg Ser Ã$p Àsp m Ala Ai ,i Tyr 3'5 Cy? gcg ágá gãg act Thr 100 m m c§9 99 a Qtt ccc ctt gac tac tgg “9 336 Ala Arg Ol lí «et vai Atg GÍy val 105 pro Leu ASp 'ryr Trp no Gly Gin qaa acc etg gtc ate: gtx tcc tea çet tcc acc aag SSC «» tea gtc val 384 Gly Thr ttc ccc fhe pro 130 L£Lt 115 ctg usii Vai geg Ata Thr val Ser Ser 120 Ala Ser Thr Lys Gly Pro 125 Ser 396

<210 > 10 <211> 132 <212 > PRT <213> Homo sapiens <400> 10 67 ΡΕ1490405 61n Vai ela Leu vai 5l« Ser Gly Ala Glu vai Lys tys pró fíly Ãla l s .1.0 1$ ser vai lvs vai ser cys Lys Ala ser Gly iyr ile Phe ile Af§ 0'*s 20 25 ' 30

Gly He Thr Trp vai Arq Gin Ala Pra Gly Gin Gly teu Gle Trp «et 3$ 40 4S

Gly Trp Ik Asrs Ala Tyr Asn çly Asn Thr Asn Tyr Ala Gin Lys vai 50' ' 53 60

Gin Gly Arq Vai Thr «et Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr aU Tyr 65 " 7f; ?3 w «et Glu teu Arg Ser Leu Arq Ser Asp Asp Ala Ala vai Tyr Tyr Cys S5 90 Ú

Ala Arg Glu Thr mt vai Are Gly Vai Pro L«u Asp Tyr Trp Gly Gin

100 105 HO

Gly Thr i.e« vai Thr vai Ser Ser Ala $«r Thr Lys Gly Pro Ser vai m '120 m

phe Pro L.eu Ala BO <210> 11 <211> 15

<212> DNA <213> Homo sapiens <2 2 0 >

<221> CDS <222> (1)..(15) <223> <4 0 0 > 11

aga cat ggt ate ace Arg His Gly fie Thr I S

<210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0 > 12

Arg His Gly Il8 1 ~ ' s ΡΕ1490405 68 <210 > 13 <211> 51 <212 > DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(51) <223> <4 0 0 > 13 $:¾¾ áfcc *aç tâC a&t gíit M€ aca â&í. tíit gç-a £&§ à⧠pç tâçt 48 frp Í1é ASrt Àla tvf AS st êly Asn fhr AS« tyr Ala 61« l.vS Vai Gin 1 $ ' l<) ' 15 <:K1C Siôly <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14

Trp íle Asn Ala Tvr Asn Giy As,ft fhr A&rt tyr Ais 61« i»ys Vât Gini f ' m ' y <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1). <223> (33) <4 0 0 > 15 p$ aet âiçj §tt «6® 66» ccc ett gac tac Oly Thr «st;: vai Afia èly Vai f»ro isw âsjb Tyj* 1 S ' 10

B <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0 > 16 ΡΕ1490405 69 βία Thr «et vai Arg 6ly vai pro teu Asp Tyr i s ' 10 <210> 17 <211> 396 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> <223> (D .. , (396) <400> 17 CM 9tg cag ctg 9*9 CM tçt 99¾ gçt ffl stg aag aag cct 989 gee 4S Gin vai Glfl leu vai Gin Ser’ Gly Ala Vàl tyi Lys p-ro Gly Ala 1 5 10 15 tca gta Val aag gtç tec tgc aag gçt tet as* tac ate ttt ate agt cat 96 Ser Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser 6Íy Tyr Xle Phe Ile Ser Mis 20 25 3Q 9ft Sty a.tc rie agt ser *99 Trp 9*3 vai eqa Arf cag Gin gçc Á1 â cct Pro « ca a Gin a? ctt teu 61 u t§9 Trp atg wet 144 35 40 45 99« tgg AtC aâc 9« ta.c agt 991 áac ãcá aae. tat g ca caq aag etc m dy Trp· Xis ASFl Ala Tyr Ser «iy A 5« Thr Asn Tyr Ala 61 fs lys Léu 50 55 60 cag âíjã. gtc ace atQ acc aca (JíiC aqa tcc acg age a ca gee tac 240 Glfl êly Arg Vãl Ϊ h r· Mftt Thr Tihr ÀSP Arg ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 n m atg gag ctg *83 age ctg sga tet gsc gae acg gçc ata tat tac tgt 2SS Κβΐ 61 o L.eu Arg Sesr 85 teú Arg Ser Asp Àsp 9Õ Thr Ala vai ryr Tyr 95 Cys m aqa gag act Thr at:g gtt cgg gaa ftt cec tgt qac tac tgg m eag 336 Ala Arg 61a wet vai Arg 61 y Vai Pro Cys A5p Tyr -rrp GÍy Gin 100 1ÔS 110 gs* acc ctg gtç acc gtc tcc tca gçt tcc acc aag 39C cea tcc gtc 384 Gly Thr Leis Vai Thr vai Ser ser Ala Ser Th r rys Gly Pro ser vai 115 120 125 ttc ca: ctg OCO 396 Phe Pr» Leu Ala 130

<210> 18 <211> 132 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 70 ΡΕ1490405

Gin vai Gin Leu vai Gin Ser 61 y Ala Glu vai lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser vai Lys vai ser cy$ lys Ala Ser Glv Tyr i1e Phe ile ser hís 2ΐ) 25 30

Glv xle ser Trp vai Atq Gin Ala Pro G'ly Gin Gly Leu Gin Trp «et 35 ‘ 40 43

Gly Trp He Asn Ala Tvr Ser Gly Asn Thr Ast> Tyr Ala Glu tys L.eu 50 ' 55 60

Gin Glv Ara V«1 Thr Wet Thr Thr A$p Artj $«r Thr Ser Thr Al« Tyr 65 70 ' n 8Ò wet Gla teu atíj ser teu Arq ser Asp Asp Thr Ala vai Tyr tyr Cys * 8S " 90 95

Ala Aro 6lu Thr Met vai Arq Gly vai hro Cys ASp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Leu vai Thr vai ser Ser Ais Ser Thr tys Gly Pro Ser vai 115 120 123

Phe ^ro E-fen Alá 130 <210 > 19 <211> 15

<212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(15) <223> <400> 19 agt cat ggt ate agt ser Hís Gly xle ser X 3

<210> 20 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 ΡΕ1490405 71

Ser Mis Gly ile ser 1 5 <210> 21 <211> 51

<212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(51) <223> <400> 21

4$ U tgg ate aac gei tac agt ggt aac aça aac tat gça çag aag etc cag

Trp ile Asn Ala Tyr sèr §1y asi» Thr Asa Tyr Àla. Gin lys Leu Gin 1 S' 10 1.5 §gc G1 y <210> 22 <211> 17

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22

Trp xU. Asfs Aís Tyr Ser gly Asrs ihr asr Tyr Ala lvs <*1a J. % M 15

Gly <210> 23 <211> 33

<212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(33) <223> <400> 23 gag act atg gtt cçg gga qtt ccc tgt qac tac 33 èlít rhr «et vai Arg èty vai Pro cys Asp Tyr 1 > ‘ 10 <210> 24 <211> 11 72 ΡΕ1490405

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24

Slu Thr vset vai Artj €ly vai Pro Cys Asp τ I S ' 19

Lisboa, 25 de Outubro de 2007

Claims (27)

1. ΡΕ1490405 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um anticorpo humano isolado anti-hFasL, ou fragmento de ligação ao antigénio do mesmo, tendo uma região variável da cadeia leve (LCVR) e uma região variável da cadeia pesada (HCVR) e compreendendo pelo menos dois polipéptidos tendo uma seguência seleccionada entre SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24, em que o referido anticorpo tem um KD inferior a 1 x 10~1 2 3 4 5 6M.
2. 2. O anticorpo humano isolado anti-hFasL, ou fragmento de ligação ao antigénio do mesmo, da reivindicação 1 em que a LCVR compreende um polipeptideo com a sequência apresentada em SEQ ID NO:2.
3. 3. O anticorpo humano isolado anti-hFasL, ou fragmento de ligação ao antigénio do mesmo, da reivindi cação 1 em que a LCVR compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:2 e em que a HCVR compreende a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO:10. 1 O anticorpo humano isolado anti-hFasL, ou 2 fragmento de ligação ao antigénio do mesmo, da reivindi 3 cação 1, em que a LCVR compreende a sequência de amino 4 ácidos apresentada em SEQ ID NO:2 e em que a HCVR 5 compreende a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID 6 NO:18. 2 ΡΕ1490405
4. 5. O anticorpo humano isolado anti-hFasL, ou fragmento de ligação ao antigénio do mesmo, da reivindicação 1, em que o domínio CDR1 de LCVR compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:4.
5. 6. O anticorpo humano isolado anti-hFasL, ou fragmento de ligação ao antigénio do mesmo, da reivindicação 1, em que o domínio CDR2 de LCVR compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:6.
6. 7. O anticorpo humano isolado anti-hFasL, ou fragmento de ligação ao antigénio do mesmo, da reivindicação 1, em que o domínio CDR3 de LCVR compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:8.
7. 8. O anticorpo humano isolado anti-hFasL, ou fragmento de ligação ao antigénio do mesmo, da reivindicação 1, em que o domínio CDR1 de LCVR compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 4 e em que o domínio CDR2 de LCVR compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:6.
8. 9. O anticorpo humano isolado anti-hFasL, ou fragmento de ligação ao antigénio do mesmo, da reivindicação 1, em que o domínio CDR1 de LCVR compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 4 e em que o domínio CDR3 de LCVR compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:8. 3 ΡΕ1490405
9. 10. O anticorpo humano isolado anti-hFasL, ou fragmento de ligação ao antigénio do mesmo, da reivindicação 1, em que o dominio CDR2 de LCVR compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 6 e em que o dominio CDR3 de LCVR compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:8.
10. 11. O anticorpo humano isolado anti-hFasL, ou fragmento de ligação ao antigénio do mesmo, da reivindicação 1, em que o dominio CDR1 de HCVR compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:12 ou 20.
11. 12. O anticorpo humano isolado anti-hFasL, ou fragmento de ligação ao antigénio do mesmo, da reivindicação 1, em que o dominio CDR2 de HCVR compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:14 ou 22.
12. 13. O anticorpo humano isolado anti-hFasL, ou fragmento de ligação ao antigénio do mesmo, da reivindicação 1, em que o dominio CDR3 de HCVR compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:16 ou 24.
13. 14. O anticorpo humano isolado anti-hFasL, ou fragmento de ligação ao antigénio do mesmo, da reivindicação 1, em que o dominio CDR2 de HCVR compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:14 ou 22 e em que o dominio CDR3 de HCVR compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:16 ou 24. 4 ΡΕ1490405
14. 15. O anticorpo humano isolado anti-hFasL, ou fragmento de ligação ao antigénio do mesmo, da reivindicação 1, em que o dominio CDR1 de HCVR compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:12 ou 20 e em que o dominio CDR2 de HCVR compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14 ou 22.
15. 16. O anticorpo humano isolado anti-hFasL, ou fragmento de ligação ao antigénio do mesmo, da reivindicação 1, em que o dominio CDR1 de HCVR compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:12 ou 20 e em que o dominio CDR3 de HCVR compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:16 ou 24.
16. 17. O anticorpo isolado de qualquer uma das revindicações 1 a 16 que possui uma região constante da cadeia pesada de IgGl.
17. 18. O anticorpo isolado de qualquer uma das reivindicações 1 a 16 que possui a região constante da cadeia pesada de IgG4.
18. 19. O fragmento de ligação ao antigénio isolado de qualquer uma das reivindicações 1 a 16 que é um fragmento Fab.
19. 20. O fragmento de ligação ao antigénio isolado de qualquer uma das reivindicações 1 a 16 que é um fragmento F(ab')2. 5 ΡΕ1490405
20. 21. O fragmento de ligação ao antigénio isolado de qualquer uma das reivindicações 1 a 16 que é um fragmento Fv de cadeia simples.
21. 22. Uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo um polinucleótido codificador de um anticorpo humano anti-hFasL, ou um fragmento de ligação a antigénio do mesmo, de qualquer uma das reivindicações 1 a 21.
22. 23. Uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo um polinucleótido da reivindicação 22, em que o polinucleótido compreende pelo menos dois polinucleótidos tendo uma sequência seleccionada entre SEQ ID Nos: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 e 23 e variantes da mesma, como é permitido pela degenerescência do código genético.
23. 24. Um vector compreendendo as moléculas de ácido nucleico da reivindicação 22 e da revindicação 23. 25. 0 vector da reivindicação 24, em que o vector é um vector de expressão.
24. 26. Uma célula hospedeira compreendendo o vector da reivindicação 24 ou da reivindicação 25.
25. 27. Um anticorpo humano produzido pelo hibridoma seleccionado de entre o hibridoma depositado como ATCC PTA-4017 e o hibridoma depositado como ATCC PTA-4018. 6 ΡΕ1490405
26. 28. Uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antigénio do mesmo, de qualquer uma das reivindicações 1 a 21 ou reivindicação 27 e um veiculo farmaceuticamente aceitável.
27. 29. Um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antigénio do mesmo, de qualquer uma das reivindicações 1 a 21 ou reivindicação 27 para usar como medicamento. Lisboa, 25 de Outubro de 2007 1 ΡΕ1490405 REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e a EPO rejeita quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição US 5778429 A US 5681816 A US 5633425 Λ US 5825126 A US 5583825 A US 5545806 A US 4318397 A, Bcss * US 634: 334 5 * WO 951 MIS A * US 5114507 A * US 6S963Í2 Ã * U5S377397Â * U5 5S74299A * US 531431 SÃ * US S738350 A Literatura que não é de patentes citada na Descrição « MARÍAM et ai Eur. J immH, 1993. vsl. 25, 2303-7 • KAYAGAK1 et aí, J. Exp Afctô. 1885, voi. 182, 4777-83 • TAMAKA et «I, EhmO, 1395, vol 14 íSi 1129-3S • NAGATA. Atm. Λ8Υ. Gmei, 1389, Vffll.. 33, 29-53 • HANA8UCHI ei ai, Ptoc. tis». .Asad. Scs.. US4, 1594, voí. 31,4*20-4 • SUDA. J. immmot., 1*95., voi. 154, '3808-13 • A RASE.. J. Ε;φ. ftfcd, 1995, vol, 161,1235-8 • KRAilMER et ai, famiwi. Rav.y 1994, voi 142, 175-31 - NAGATA; GôLSTESi Science, 1995. voí. 267, 1449-56 • ΥΑ6ΓΓΑ etaL tommsS. R*v.,193S. vol 143.223-39 • ELOVAARA et aí. AdslMxrpafhektgles, 1SS9, vsl. 88 i4i, 355-62 • LEROY, X. et al. APMSS, 2S01, voí. 138 Ç8), 469-72 • CHQTHÍA et al. 1 MM Sioí.. 1987. voí. 188,901-1 ? • CHQTiHÍA ei al. Nahae, 1888, voi. 342. 873-83 • SUDA et aí. Oeíf, 1883, vol.75.1183-78 {BÔ44} NAGATA} GQLSTEÍÍI. ScwfJCft 1995, vcí. 267 {52831, 144845 • HOHLEAUM et al. J. Ε.ψ. Meti.. 200G, VSi. 181 {?), 1229-20 . TAMAKA et al fiai. 44«#., 1896, voí. 2 {3|( 317-22 - KAYAGAKI «t si. J. Exp. Mod., 1995, να. 182 <S}, 1777-83 • GEYSER et al. Pasc. Mad. Ac*#. Se. USA, 1884, VOÍ 81,3898-4062 * KABAT et al. Am M%casL Set, 1871, voi 183, 362-93 * KABAT et al. Sesiiensse- ef Frsíelits of íismuíiolas-icsl inierest. U.S. Dspwimsnrcf Health and Human Services. 1981, (51-3242 « JAKOSOVITS et ai, Pme. Natt. Aead. Ss(. USA, 1993, voí. 90, 2551-5 * JAKOSOVITS et al. Atotee, 1SS3, voí. 382, 2SS-8 > BRUGGEMANN et al. Vear m .iamm., 1993, vol. 7, 35 * íVatea, 1994, VOÍ. 148,1547-53 * (Yafone SíbíeetKWfcSK. 1996, voí. 14, 826 * GRQSS et aí, Wafaw, 2000, vol. 434, 395-9 * HGOGENBOOM; WSHTER. 4. Moi. S«i, 1992, vol. 227,361-8 * COLE et si,· ftfcnoc&mf AntiMías and Cansar Tharapy, 1955,77 . BQERNER et al. J. wmmo!.,. 1991. vol. 147, 86-95· * tfctocuíer Cionlng, A Laboratey Maoiasí. Colct Spring Hanfeor, 1933 * CsB«1t PtOseoís sa Moiesiflaf Bioiogy. Sisene Piife- SsstàsnSI Asaosiaíss, 1889 * Sespastee» of Protesr» <af ífsvmmíosteeí íntweei KABAT et al U.S. D^jatsnasíolHefsttand Huraan Setvisea·. 1891 * BIRD ei ali, Samee, 1388.. voi 242,423-3 [66743 HUSTOtl «4 aí. Píoc. NatS. AeaA Sei. USA, 1888, VOI. 86, 5878453 MCCAEFERTY et al Ateàs*, 19S0, voi. 348, 552-4 .. URLAUB; CBASIft. Pmc. ífafi Acad. Sã USA 1980, voí. 77, 4216-20 * KAUFMAí;SHARP, J. Mal. SM., 1962, soí. ;5S;. 301-21 2 ΡΕ1490405