NO338054B1

NO338054B1 - Humant monoklonalt antistoff mot IL-8, fremgangsmåte for fremstilling av antistoffet, farmasøytisk sammensetning som omfatter antistoffet, og anvendelse derav.

Info

Publication number: NO338054B1
Application number: NO20053417A
Authority: NO
Inventors: Ole D M Sch Baadsgaard; Paul Parren; Jørgen Petersen; Jessica Teeling; Debra Hudson
Original assignee: Cormorant Pharmaceuticals Ab
Priority date: 2002-12-16
Filing date: 2005-07-14
Publication date: 2016-07-25
Also published as: US20100303823A1; US10253093B2; JP4739763B2; CA2510087C; US20120164143A1; US7282568B2; HK1082749A1; NO20053417L; WO2004058797A3; US20080118517A1; WO2004058797A2; EP1590364A4; AU2003299641C1; US8603469B2; US7622559B2; AU2003299641A1; JP2006523088A; ATE527278T1; EP1590364B1; US20230042255A1

Description

Bakgrunn for oppfinnelsen

Kjemokiner representerer en superfamilie på ca. 30 kjemotaktiske cytokiner som virker som vitale initiatorer og som utbrer inflammatoriske reaksjoner. De kan variere i molekylvekt fra 8 til 11 kD, og er aktive i et konsentrasjonsområde fra 1 til 100 ng/ml, og produseres av en rekke forskjellige celletyper.

Interleukin 8 (IL-8), tidligere kalt monocyttavledet nøytrofil kjemotaktisk faktor (MDNCF) eller nøytrofil tiltrekkende/aktiveringsprotein-1 (NAP-1), er et kjemokin og hører til cytokinfamilien som oppviser kjemotaktisk aktivitet for spesifikke typer av leukocytter. IL-8 hører til CXC-kjemokinfamilien hvor en aminosyre er tilstede mellom de første to av fire sterkt konserverte cysteinrester. IL-8 er et polypeptid hvor de to dominerende former består av 72 aminosyrer og 77 aminosyrer. Monocytter, makrofager, nøytrofiler, lymfocytter, dermale fibroblaster, keratinocytter, vaskulære endoteliske celler, melanocytter, heptaocytter og forskjellige tumorcellelinjer produserer IL-8. IL-8 er en sterk nøytrofil kjemokin og deltar i vandringen av nøytrofiler mot inflammatoriske steder. Ved binding til sine høyaffinitetsreseptorer (CXCR1 og CXCR2) som er tilstede på overflaten av nøytrofiler, så aktiverer IL-8 nøytrofilene ved å akselerere degranulering og forhøye konsentrasjonen av fritt CA 2_|_ i cytoplasmaet og dessuten indusere nøytrofil-migrasjon som derved ødelegger det infiltrerte vevet.

Skjønt den nøytrofile inflammatoriske responsen er vesentlig for destruksjon av bakterier som invaderer kroppen, så vil en mistilpasset nøytrofil aktivering frembringe en rekke forskjellige inflammatoriske sykdommer. F.eks. er IL-8 innvunnet fra inflammatoriske steder så som pustulosis palmoplantaris (PPP) sår, psoriatiske avskallinger, synoviale væsker fra pasienter med reumatisk artritt (RA), pleural væske fra emfysem-pasienter, alveolare makrofager fra lunger hos pasienter med idiopatisk lungefibrose, bronkoalveolare utvaskingsvæsker fra pasienter med voksent respiratorisk distressyndrom, cystisk fibrose, kronisk bronkitt og bronkioektasi. IL-8 er også assosiert med sepsis, astma, glomerulonefritt, inflammatorisk tarmsykdom (IBD), ischemi-reperfusjonsskader og multippelt myelom. Slike tilstander erkarakterisert vedinflammasjon fulgt av en nøytrofil infiltrering og vevsskade. IL-8 er også kjent for å fremme angiogenese og således vekst av tumorer. Slik aktivitet er blitt assosiert med ELR-motivet inne i IL-8-sekvensen. Humane tumorcellelinjer så som tyroid karsinom, forbigående cellekarsinom, trichilemmona, skvamøs cellekarsinom og melanom vil konstitutivt uttrykke IL-8 som spiller en rolle ved tumorinvasjon og metastase.

Antistoffer som er spesifikke for IL-8 vil følgelig være terapeutisk viktige ved behandling av sykdommer som styres eller kontrolleres av IL-8-aktivitet. Et hybridom som produserer et humant antistoff mot human IL-8, betegnet som 2C6, er beskrevet tidligere (US patent nr. 6 300 129 til Lonberg og Kay). Det er imidlertid stadig et behov for ytterligere antistoffer som er spesifikke for IL-8.

Følgende dokumenter skal også nevnes:

Yang et al (1999) Journal of Leukocyte Biology 66:401-410 og Huang et al

(2002) American Journal of Pathology 161:125-134, hvor begge angår helt humane anti-IL-8-antistoffer for potensielt terapeutiske anvendelser.

WO 01/40306 og WO 01/25492, hvor begge angår det humane anti-IL-8-antistoffetMl-25.

Sammendrag av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer isolerte humane monoklonale antistoffer som binder seg til human IL-8, så vel som bi-spesifikke og multispesifikke molekyler og andre terapeutiske sammensetninger som inneholder slike antistoffer, enten alene eller i kombinasjon med ytterligere terapeutiske midler.

Spesielt tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse isolert humant monoklonalt antistoff som binder seg til human IL-8, kjennetegnet ved å omfatte de seks CDR-sekvensene: VLCDR1 av SEKV. ID nr. 16, VLCDR2 av SEKV. ID nr. 17, VLCDR3 av SEKV. ID nr. 18, VH CDR1 av SEKV. ID nr. 22, VH CDR2 av SEKV. ID nr. 23 og VH CDR3 av SEKV. ID nr. 24.

Oppfinnelsen tilveiebringer også antistoffene og sammensetningene i henhold til oppfinnelsen for anvendelse ved behandling av en rekke av IL-8 medierte sykdommer.

De fullt humane antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse binder seg til IL-8 og hemmer IL-8-funksjon (og IL-8 medierte effekter) ved å blokkere IL-8-binding til dens reseptor. F.eks. kan antistoffene hemme proinflammatoriske og angiogene effekter som induseres av IL-8, så som IL-8-indusert kjemotaktisk aktivitet for leukocytter og IL-8-indusert kalsiumfluks. Antistoffene kan også hemme en IL-8-indusert forsterket ekspresjon av CD1 lb (Mac-1) og nedsatt ekspresjon av L-selektin (CD62L). De spesielle antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse har følgelig én eller flere av de følgende egenskaper: (i) hemmer IL-8-binding til dens reseptorer (CXCR1 og CXCR2); (ii) hemmer IL-8-induserte proinflammatoriske effekter; (iii) hemmer IL-8-indusert kjemotaktisk aktivitet for nøytrofiler; (iv) hemmer IL-8-indusert kalsiumfluks; (v) hemmer IL-8-induserte forandringer med hensyn til ekspresjonsnivået for adhesjonsmolekyler på nøytrofiler; (vi) hemmer IL-8-indusert forsterket ekspresjon av CDllb (Mac-1) og hemmer IL-8-indusert nedsatt ekspresjon av L-selektin på nøytrofiler; (vii) kryssreagerer ikke med relaterte og beslektede kjemokiner valgt fra gruppen bestående av human GRO-a, human GRO-fi, human IP-10 og human NAP-2; (viii) hemmer signifikant kjemotaksis som er indusert av biologiske væsker som inneholder multiple kjemotaktiske faktorer inklusive IL-8.

De humane antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således forbedrede muligheter for å behandle og hemme eller hindre lidelser som er kontrollert av IL-8-aktivitet, noe som delvis skyldes deres enestående spesifisitet (f.eks. epitopspesifisitet og mangel på krys sr eakti vitet med beslektede kjemokiner), affinitet, struktur og funksjonell aktivitet, og det faktum at de er fullt humane, noe som gjør dem signifikant mindre immunogene og mer terapeutisk effektive og anvendbare når de administreres til humane pasienter, enn andre tidligere utviklede IL-8-antistoffer (f.eks. murine og humaniserte antistoffer).

Isolerte humane antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter en rekke antistoffisotyper, så som IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2, sekretorisk IgA, IgD og IgE. Typisk vil de innbefatte IgGl (f.eks. IgGl,Keller IgGl, X), IgG3, IgG4 og IgM isotyper. Antistoffene kan være intakte (f.eks. et IgGl - eller IgG3-antistoff) eller kan inkludere bare en antigenbindende del (f.eks. et Fab, F(ab')2, Fv eller et enkeltkjede Fv-fragment).

Spesielle terapeutiske antistoffer ifølge oppfinnelsen inkluderer humant monoklonalt antistoff (HuMab) 10F8.

De humane antistoffene ifølge oppfinnelsen innbefatter et CDR-domene med et humant tung- og lettkjede CDR1-område, et humant tung- og lettkjede CDR2-område og et humant tung- og lettkjede CDR3-område, hvor antistoffet omfatter de seks CDR-sekvensene: VLCDR1 av SEKV. ID nr. 16, VLCDR2 av SEKV. ID nr. 17, VLCDR3 av SEKV. ID nr. 18, VH CDR1 av SEKV. ID nr. 22, VH CDR2 av SEKV. ID nr. 23, og VH av SEKV. ID nr. 24.

Også omtalt er antistoffer som binder seg til en epitop på humant IL-8 slik dette er definert ved antistoff 10F8, og/eller som konkurrerer med binding til IL-8 ved antistoffet 10F8, eller har andre funksjonelle bindingsegenskaper som oppvises av antistoffet 10F8. Slike antistoffer inkluderer de som binder seg til IL-8 med en dissosiasjonslikevektskonstant (Kd) på ca. IO"<10>M eller mindre eller IO"<11>M eller endog mindre. Slike antistoffer innbefatter også de som ikke kryssreagerer med beslektede kjemokiner, f.eks. human GRO-a, human GRO-P, IP-10 eller human NAP-2, og således ikke hemmer deres funksjon.

I et annet aspekt kan de humane antistoffene ifølge oppfinnelsen ko-administreres med ett eller flere ytterligere terapeutiske midler. De kan ko-administreres samtidig med slike midler (f.eks. i en enkel sammensetning eller separat), eller de kan administreres før eller etter administreringen av slike midler. Slike ytterligere midler kan innbefatte midler for å behandle inflammatoriske eller hyperproliferative hudlidelser, immunosuppressive midler, antiinflammatoriske midler eller kjemoterapeutiske midler.

I et annet aspekt tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen sammensetninger, f.eks. farmasøytiske eller diagnostiske sammensetninger, som omfatter ett eller flere (f.eks. i en kombinasjon) av humane anti-IL-8-antistoffer sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer. Følgelig tilveiebringer oppfinnelsen en farmasøytisk sammensetning som omfatter antistoffet ifølge oppfinnelsen eller ekspresjonsvektoren ifølge oppfinnelsen og en farmasøytisk akseptabel bærer Sammensetningen kan videre inneholde ett eller flere andre terapeutiske midler av den type som er nevnt ovenfor.

Oppfinnelsen tilveiebringer også antistoffene i følge oppfinnelsen for anvendelse ved behandling eller prevensjon av IL-8-medierte sykdommer, hvor humane antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse administreres til pasienter (f.eks. mennesker) i terapeutisk effektive doser ved å anvende enhver egnet administrasjons vei, så som injeksjon eller infusjon, eller anvende andre administrasjons veier av den type som er kjent for antistoffbaserte kliniske produkter.

I et ytterligere aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse antistoffene, en ekspresjonsvektor eller en farmasøytisk sammensetning ifølge oppfinnelsen for anvendelse for å hemme de proinflammatoriske effektene av IL-8 i et individ. De proinflammatoriske effektene av IL-8, kan for eksempel være IL-8-indusert kjemotaktisk aktivitet for leukocytter.

Oppfinnelsen tilveiebringer også anvendelse av et antistoff, en ekspresjonsvektor eller en farmasøytisk sammensetning i følge oppfinnelsen i fremstilling av at medikament ved behandling eller prevensjon av en immun, autoimmun, inflammatorisk eller infeksjonslidelse mediert av human IL-8 eller som involverer human IL-8-aktivitet eller ved behandling eller prevensjon av kreft.

De humane antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse er således tilveiebrakt for anvendelse ved behandling og/eller prevensjon av en rekke IL-8-kontrollerte sykdommer ved at antistoffene administreres pasienter som lider av slike sykdommer.

Eksempler på sykdommer som kan behandles (f.eks. lindres) eller forhindres ved å anvende antistoffer og sammensetninger ifølge foreliggende oppfinnelse, inkluderer inflammatoriske eller hyperproliferative hudlidelser, immune, autoimmune, inflammatoriske eller infeksjonssykdommer, foruten sykdommer hvor det inngår en IL-8-mediert angionenese, så som tumorer og cancere.

I et ytterligere aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en in vitro fremgangsmåte for å påvise nærværet av IL-8 i en prøve eller et individ, f.eks. for å diagnostisere en IL-8-relatert sykdom. Dette kan være nyttig for å monitorere en IL-8-relatert sykdom og effekten av en behandling med et anti-IL-8-antistoff, og for å bestemme og justere den dose av antistoffet som skal administreres. I én utførelsesform påvises nærværet av IL-8 ved at en prøve som skal testes, eventuelt sammen med en kontrollprøve, settes i kontakt med et humant monoklonalt antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse under slike betingelser som muliggjør dannelsen av et kompleks mellom antistoffet og IL-8. Kompleksdannelsen kan så påvises (f.eks. ved å anvende en ELISA). Ved å anvende en kontrollprøve sammen med testprøven, så vil komplekset kunne påvises i begge prøvene og en eventuell statistisk signifikant forskjell med hensyn til dannelsen av komplekser mellom prøvene, vil så være en indikasjon på nærvær av IL-8 i testprøven.

I et ytterligere aspekt angår oppfinnelsen anti-idiotypiske antistoffer som binder seg til de humane monoklonale antistoffene ifølge oppfinnelsen. Disse anti-idiotypiske antistoffene kan anvendes som et immunodiagnostisk verktøy for å påvise og kvantifisere nivåer av humane monoklonale antistoffer mot IL-8 i laboratorie- og pasientprøver. Dette kan f.eks. være fordelaktig ved undersøkelse av anti-IL-8-antistoffets farmakokinetikk, eller for å bestemme og justere dosen av anti-IL-8-antistoffet og for å kontrollere og undersøke sykdommen og effekten av behandlingen på en pasient.

Muse anti-idiotypiske antistoffer kan f.eks. fremstilles ved å immunisere BALB/C-mus med de humane monoklonale antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse, og så utvikle hybridomer fra milten hos disse musene ved fusjon med myolomceller, så som NS 1-celler, ved hjelp av standardteknikk.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et transgent ikke-humant dyr som uttrykker et antistoff ifølge oppfinnelsen, hvor det transgene ikke-humane dyret har et genom som omfatter et humant tungkjedetransgen og et humant lettkjede transgen. Dyret kan for eksempel være en transgen mus.Det transgene ikke-humane dyret kan immuniseres med et renset eller anriket preparat av IL-8-antigen, rekombinant IL-8-antigen og/eller celler som uttrykker IL-8, inklusive celler som er transfektert med IL-8. Det transgene ikke-humane dyret, f.eks. den transgene musen, er fortrinnsvis i stand til å produsere multiple isotyper av humane monoklonale antistoffer til IL-8 (f.eks. IgG, IgA og/eller IgM), ved å gjennomgå en V-D-J-rekombinasjon og isotypeskifte. Isotypeskifte kan f.eks. skje ved klassisk eller ikke-klassisk isotypeskifte.

I et ytterligere aspekt tilveiebringer oppfinnelsen følgelig isolerte B-celler fra et transgent ikke-humant dyr slik dette er beskrevet ovenfor, f.eks. en transgen mus, som uttrykker humane anti-IL-8-antistoffene. De isolerte B-cellene kan så imortaliseres ved fusjon med en imortalisert celle, noe som vil gi en kilde (f.eks. et hybridom) for humane anti-IL-8-antistoffer. Slike hybridomer (dvs. som produserer humane anti-IL-8-antistoffer), inngår således også i oppfinnelsen.

Følgelig tilveiebringer foreliggende oppfinnelse også et hybridom som omfatter en B-celle oppnådd fra en transgene ikke-humane dyr hvor V- (D) -J-gensegment rearrangementer har resultert i dannelsen av en funksjonell human tung kjede og en funksjonell transgenet lett kjede transgen, fusjonert til en immortalisert celle, hvor hybridomet gir en påvisbar mengde av antistoffet ifølge oppfinnelsen. Oppfinnelsen tilveiebringer videre et transfektom, en eukaryot eller prokaryot vertscelle, eller en transgen ikke-humant dyr eller plante som omfatter nukleinsyrer som koder for en human tung kjede og en human lett kjede, eller en cellelinje, for eksempel en CHO eller NS / O-cellelinje, som produserer en påvisbar mengde av antistoffet ifølge oppfinnelsen.

Som eksemplifisert her kan de humane antistoffene ifølge oppfinnelsen

oppnås direkte fra hybridomer som uttrykker antistoffet, eller de kan være klonet og rekombinant uttrykt i en fjuVm (f.eks. en CHO-celle eller en NS/O-celle).Ytterligere eksempler på vertsceller er HEK293-celler, planteceller, mikroorganismer så som E. coli, og sopp, så som gjær. Alternativt kan de fremstilles rekombinant i et transgent ikke-humant dyr eller plante.

I et ytterligere aspekt tilveiebringer således oppfinnelsen rekombinante ekspresjonsvektorer inkludert nukleinsyremolekyler som koder humane anti-IL-8-antistoffer ifølge oppfinnelsen, foruten vertsceller som er transfektert med slike vektorer. Fremgangsmåter for å produsere antistoffene ved å dyrke disse vertscellene inngår også i oppfinnelsen. Spesielle nukleinsyrer som anvendes i oppfinnelsen innbefatter de nukleotidsekvenser, som er vist i SEKV. ID nr. 10 og SEKV. ID nr. 6; som koder de tunge og lette kjedene henholdsvis i 10F8.

Andre egenskaper og fordeler ved foreliggende oppfinnelse vil fremgå av den etterfølgende detaljerte beskrivelse og eksempler.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. 1 viser nukleotidseveksene for Vl- og VH-områdene (SEKV. ID nr. 1 og 3) henholdsvis, fra HuMab 10F8. Ledersekvensene er understreket. Fig. 2 er en alignmentsammenligning mellom nukleotidsekvensen for det lette (kappa) kjede V-området i HuMab 10F8 (SEKV. ID nr. 6) og den tilsvarende VKA-27 kimlinjenukleotidsekvensen (SEKV. ID nr. 5). Fig. 3 er en alignmentsammenligning mellom aminosyresekvensen for det lette (kappa) kjede V-området i HuMab 10F8 (SEKV. ID nr. 8) og den tilsvarende VKA-27 kimlinje-kodede aminosyresekvensen (SEKV. ID nr. 7). Fig. 4 er en alignmentsammenligning mellom nukleotidsekvensen for det tunge kjede V-området i HuMab 10F8 (SEKV. ID nr. 10) og den tilsvarende VH 3-33 kimlinjenukleotidsekvensen (SEKV. ID nr. 9). Fig. 5 er en alignmentsammenligning mellom aminosyresekvensen i det tungkjede V-området i HuMab 10F8 (SEKV. ID nr. 12) og den tilsvarende VH 3-33 kimlinje-kodede aminosyresekvensen (SEKV. ID nr. 11). Fig. 6 er et diagram som viser at HuMab 10F8 binder seg både til endotelcelleavledet og monocyttavledet IL-8, men ikke binder seg til IP-10, GRO-oc, GRO-p. Fig. 7 A er et diagram som viser hemming av [ 125I]-IL-8-binding til nøytrofiler ved HuMab 10F8 (åpne kvadrater) sammenlignet med et murint IL-8-spesifikt antistoff (m-a-IL8) (stjerner). Fig. 7B er et diagram som viser hemming av [ 125I]-IL-8-binding til nøytrofiler ved hybridom-avledet HuMab 10F8 (10F8 H) (åpne kvadrater) og transfektom-avledet HuMab 10F8 (10F8 T) (fylte kvadrater) henholdsvis. Fig. 8A er et diagram som viser hemmingen av IL-8-kontrollert nøytrofilkjemotaksis ved HuMab 10F8 (trekanter) sammenlignet med et murint IL-8-spesifikt antistoff (6217.111) (kvadrater). Fig. 8B er et diagram som viser hemming av IL-8-kontrollert nøytrofilkjemotaksis ved HuMab 10F8 slik dette ble bestemt ved en transmigreringsprøve ved hjelp av et Boyden-kammer. Fig. 9A er et diagram som viser hemming av IL-8-kontrollert avskalling av L-selektin (CD62L) på overflaten av nøytrofiler ved HuMab 10F8 (fylte kvadrater) sammenlignet med et irrelevant humant isotypekontrollantistoff (stjerner). Fig. 9B er et diagram som viser hemming av IL-8-kontrollert ekspresjon av CDllb på celleoverflaten av nøytrofiler ved hjelp av HuMab 10F8 (fylte kvadrater) sammenlignet med et irrelevant humant isotypekontrollantistoff (stjerner). Fig. 10 er et diagram som viser nærværet av IL-8 og GRO-a i et pustulosis palmoplantaris (PPP) pasientmateriale som bestemt ved ELISAs. Fig. 11 viser resultatene av målingen av IL-8, GRO-a og C5a som var tilstede i fotvannsvæske oppnådd fra friske kontrollpersoner (n=6), eksempasienter (n=6) eller PPP-pasienter (n=6).

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer forbedrede humane antistoffer som binder seg til human IL-8, og slike antistoffer for anvendelse ved behandling og diagnostisering av en rekke lidelser som er mediert av IL-8 (f.eks. lidelser som er forårsaket av de proinflammatoriske effektene og de angiogene effektene av IL-8). Med begrepet "proinflammatoriske effekter" slik det anvendes her inngår enhver humoral eller celle-kontrollert immunrespons som er indusert av IL-8, så som den kjemotaktiske aktiviteten til leukocytter. Begrepet "angiogene effekter av IL-8" inkluderer veksten av nye blodkar eller en vaskularisering av tumorceller som er indusert av IL-8. Oppfinnelsen anvender humane monoklonale antistoffer som binder seg til og hemmer slike funksjoner av IL-8, spesielt tilveiebringes slike antistoffer for anvendelse i metoder for human terapi.

I én utførelse er antistoffet et IgGl-antistoff, mer spesielt en IgGl,K eller IgGl, X isotype). I en annen utførelse er antistoffet et IgG3-antistoff, mer spesielt en IgG3,Keller IgG3,X isotype. I en ytterligere utførelse er antistoffet et IgG4-antistoff mer spesielt en IgG4,Keller IgG4,A. isotype. I en ytterligere utførelse er antistoffet et lg Al eller IgA2 antistoff. I en annen utførelse er antistoffet et IgM-antistoff.

I én utførelse blir de humane antistoffene produsert i et ikke-humant transgent dyr, f.eks. en transgen mus, som er i stand til å produsere multiple isotyper av humane monoklonale antistoffer til IL-8 (f.eks. IgG, IgA og/eller IgE) ved at det har skjedd en V-D-J-rekombinasjon og isotypeskifte. Et slikt transgent dyr kan også være en transgen kanin for fremstilling av polyklonale antistoffer, slik det er beskrevet i US 2003/0017534.

Spesielle aspekter av oppfinnelsen inkluderer følgelig ikke bare antistoffer, antistoff-fragmenter og farmasøytiske sammensetninger som inneholder disse, men også ikke-humane transgene dyr, B-celler, hybridomer og transfektomer som produserer monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen. Fremgangsmåter hvor det anvendes antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse for å påvise en celle som produserer IL-8 omfattes også av oppfinnelsen.

Oppfinnelsen tilveiebringer også antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse for anvendelse for å blokkere eller hemme IL-8-induserte aktiviteter, f.eks. proinflammatoriske aktiviteter, kjemotaktiske aktiviteter og angiogenese. Antistoffene er anvendbare ved behandling av lidelser assosiert ved IL-8.

I en utførelsesform kan de humane antistoffene ifølge oppfinnelsen anvendes ved behandling av inflammatoriske eller hyperproliferative hudlidelser, så som pustulosis palmoplantaris (PPP), psoriasis, inklusive plakkpsoriasis og guttat type psoriasis, bulbøse hudlidelser, så som bulløs pemfigoid, kontakt dermatitt, eksem, erytematose og atopisk dermatitt.

I en annen utførelsesform er de humane antistoffene ifølge oppfinnelsen tilveiebragt for anvendelse ved behandling av immune, autoimmune, inflammatoriske eller infeksjonssykdommer, så som psoriatisk artritt, systemisk skleroderma og sklerose, inflammatorisk tarmsykdom (IBD), Crohns sykdom, ulcerøs kolitt, akutt lungeskade, så som akutt respiratorisk stressyndrom eller adult respiratorisk stressyndrom, meningitt, encefalitt, uveititt, multippel myelom, glomerulonefritt, nefritt, astma, aterosklerose, leukocyttadhesjonssvikt, multippel sklerose, Raynauds syndrom, Sjøgrens syndrom, juvenil tidlig diabetes, Reiters sykdom, Behcets sykdom, immunkompleksnefritt, IgA nefropati, IgM polynevropatier, immunkontrollert trombocytopeni, så som akutt idiopatisk trombocytopenisk purpuria og kronisk idiopatisk trombocytopenisk purpuria, hemolytisk anemi, myastenia gravis, lupus nefritt, lupus erytematose, reumatisk artritt (RA), ankyloserende spodylitt, pemfigus, Graves sykdom, Hashimotos tyroiditt, småkarvaskulititt, så som Wegners granulomatose, Omens syndrom, kronisk nyresvikt, autoimmun tyroidsykdom, akutt infiserende mononukleose, HIV, herpesvirusassosierte sykdommer, humane virusinfeksjoner, så som vanlig forkjølelse som skyldes human rinovirus, koronavirus eller andre enterovirus, herpesvirus, influensavirus, parainfluensavirus, respiratorisk syncytialvirus eller adenovirusinfeksjon, bakterielungebetennelse, sår, betennelser, cerebralt slag, cerebralt ødem, ischemi-reperfusjonsskader og hepatitt C.

I én utførelsesform er de humane monoklonale antistoffene tilveiebrakt for anvendelse ved behandling av ischemi-reperfusjonsskade etter trombolyse, kardiopulmonær bypass, perkutan koronarinngrep (PCI), koronar arteriebypass eller hj ertetransplantering.

I en ytterligere utførelsesform er de humane antistoffene ifølge oppfinnelsen tilveiebrakt for anvendelse ved behandling av alkoholisk hepatitt og akutt pankreatitt.

I en enda ytterligere utførelsesform er de humane antistoffene ifølge oppfinnelsen tilveiebrakt for anvendelse ved behandling av sykdommer hvor det inngår IL-8-mediert angiogenese, så som tumorer og cancere, f.eks. melanom, tyroid karsinom, forbigående cellekarsinom, tricilemmona, skvamøs cellekarsinom og brystcancer.

I en annen utførelsesform er de humane antistoffene ifølge oppfinnelsen tilveiebrakt for anvendelse ved behandling av sykdommer hvor det er fordelaktig med en blokkering av granulocyttvandring, f.eks. i

sykdommer som påvirker det sentrale nervesystemet, så som isolert cerebral angitt;

sykdommer som påvirker det perifere nervesystemet, så som mononevrittmultipleks;

kardiovaskulære lidelser, så som akutt myokardialt infarkt, myokarditt, perikarditt og Liebman-Sachs endokarditt;

lungesykdommer, så som kronisk obstruktiv lungesykdom (COPD), alveolitt, oblitererende bronkiolitt, cystisk fibrose, allergisk aspergillose og Lofflers syndrom;

nyrelidelser, så som skleroserende cholangiolitt;

urogenitale lidelser, så som kronisk cyktitt;

nyrelidelser, så som tubulo-interstial nefritt;

infeksjonssykdommer, så som alvorlig akutt respiratorisk syndrom (SARS);

reumatiske lidelser, så som storkarvaskulitides (inklusive gigantcelleartritt, polymyalgia rheumatica, og Takayasu artritt), middelsstørrelse karvaskulitides (inklusive polyartritt nodosa, lokalisert polyarteritis nodosa og Kawasakis sykdom), småkarvaskulitides (inklusive Churg-Strauss syndrom, mikroskopisk polyarteritt, kryoglobulinemisk vaskulitt, og leukocytoklastisk angitt), sekundære vaskulitides (inklusive reumatisk vaskulitt og vaskulitt assosiert med systemisk lupus erytmatose eller Sjøgrens syndrom), isolert sakroleititt, og SAPHO syndromet og diskiititt (inklusive postpoerativ diskiitt).

endokrine lidelser, så som subakutt tyroidititt;

hudlidelser, så som sikatricikal pemfigoid, dermatitis herpetiformis, subkorneal pustulær dermatose, epidermolyse bullosa acquisita, rosacea, akutt febril dermatose, granuloma annulare (inklusive Sweets syndrom), pyoderma gangraenosum og akne (kviser) (inklusive akne conglobata);

bindevevslidelser, så som sarkiodose, relaperende polykondritt, familiær mediterranfeber, pannikulitt, erytmema nodosum, Weber-Christians sykdom og retroperitoneal fibrose.

I en annen utførelsesform er de humane antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebrakt for anvendelse ved behandling av sykdommer hvor det er fordelaktig å kunne påvirke interaksjonene mellom IL-8 og osteoklaster, så som osteoporose og osteolyttiske metastaser.

I en annen utførelsesform er de humane antistoffene ifølge oppfinnelsen tilveiebrakt for anvendelse ved behandling av sykdommer hvor det er fordelaktig å kunne påvirke interaksjonene mellom IL-8 og tumorceller, så som gastrisk cancer, kolorektal cancer og urinblærecancer.

For at den foreliggende oppfinnelse lettere skal kunne forstås, er det i det etterfølgende definert en rekke begreper. Ytterligere definisjoner er angitt fortløpende i den detaljerte beskrivelsen.

Begrepene "IL-8", "IL-8-antigen" og "interleukin 8" anvendes om hverandre, og inkluderer eventuelle varianter og isoformer som blir naturlig uttrykt av celler, eller som blir uttrykt av celler som er transfektert med IL-8-genet.

Begrepet "antistoff slik det anvendes her, inkluderer intakte antistoffer og alle typer antigenbindende fragmenter (f.eks. "antigen-bindende del") eller enkle kjeder av disse. Et "antistoff refererer seg til et glykoprotein som omfatter minst to tunge (H) kjeder og to lette (L) kjeder som er forbundet med hverandre ved hjelp av disulfidbindinger, eller en antigenbindende del av dette. Hver tunge kjede omfatter et tungkjedevariabelt område (her forkortet som Vr) og et tungkjedekonstant område. Hver lette kjede omfatter et lettkjedevariabelt område (her forkortet som Vl) og et lettkjedekonstant område. Vh- og Vl- områdene kan videre være underoppdelt i områder med hypervariabilitet, som betegnes som komplementaritetsbestemmende områder (CDR), fylt med områder som er mer konservert, som betegnes rammeverkområder (FR). Hver Vh og Vler sammensatt at tre CDRs og fire FRs, arrangert fra aminoterminus til karboksyterminus i følgende rekkefølge: FRI, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. De variable områdene i de tunge og lette kjedene inneholder et bindende domene som virker sammen med et antigen. De konstante områdene i antistoffene kan kontrollere og styre bindingen av immunoglobulinet til vertsvev eller faktorer, inklusive forskjellige celler i immunsystemet (f.eks. effektorceller) og den første komponenten (Clq) i det klassiske komplementsystemet.

Begrepet "antigen-bindende del" av et antistoff (eller ganske enkelt "antistoffdel"), slik det anvendes her, refererer seg til ett eller flere fragmenter av et antistoff som har beholdt evnen til å binde seg til et antigen (f.eks. IL-8). Det er blitt vist at den antigen-bindende funksjonen til et antistoff kan utføres av fragmenter av et intakt antistoff. Eksempler på bindende fragmenter inngår i begrepet "antigen-bindende del" av et antistoff, og inkluderer (i) et F ab -fragment, et monovalent fragment bestående av Vl-, Vh-, Cl- og Cm-domener; (ii) et F(ab')2-fragment, et bivalent fragment som omfatter to F ab-fragmenter som er forbundet med en disulfidbro i hengselsområdet; (iii) et Fd-fragment som består av Vh- og Cm-domenene; (iv) et Fv-fragment som består av Vl- og VH-domenene i en enkelt arm av et antistoff; (v) et dAb-fragment (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546). som består av et VH-domene; og (vi) et isolert komplementaritetsbestemmende område (CDR), f.eks. Vh CDR3. Skjønt de to domenene i Fv-fragmentet, dvs. Vlog Vr, er kodet av separate gener, så kan de imidlertid forenes ved å anvende rekombinante metoder, ved hjelp av en syntetisk linker som gjør det mulig at de kan fremstilles som en enkel proteinkjede, hvor Vl- og VH-områdeparene danner monovalente molekyler (kjent som enkeltkjede Fv (scFv); se f. eks. Bird et al., ( 1988) Science 242:423- 426; ogHuston et al, ( 1988) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85_ :5879- 5883). Slike enkeltkjedeantistoffer inngår også i begrepet "antigen-bindende del" av et antistoff. Videre kan antigen-bindende fragmenter inkludere bindende-domene immunoglobulinfusjonsproteiner som omfatter (i) et bindende domene polypeptid (så som et tungkjedevariabelt område, et lettkjedevariabelt område eller et tungkjedevariabelt område fusjonert til et lettkjedevariabelt område via et linkerpeptid), som er fusjonert til et immunoglobulin hengselsområdepolypeptid, (ii) et immunoglobulin tungkjede CH2-konstant område fusjonert til hengselsområdet, og (iii) et immunoglobulin tungkjede CH3-konstant område fusjonert til CH2-konstant området. Hengselsområdet er fortrinnsvis modifisert ved at ett eller flere cysteinrester er erstattet med serinrester, for derved å hindre dimerisering. Slike bindende-domene immunoglobulinfusjonsproteiner er videre beskrevet i US 2003/0118592 og US 2003/0133939. Disse antistoff - ragmentene kan fremstilles ved hjelp av vanlig kjent bioteknologisk teknikk, og fragmentene kan så screenes for eventuell anvendelse på samme måte som intakte antistoffer.

Begrepet "epitop" betyr en proteindeterminant som har evne til spesifikk binding til et antistoff. Epitoper består vanligvis av kjemisk aktive overflategrupper av molekyler så som aminosyrer eller sukkersidekjeder, og har vanligvis spesifikke tredimensjonale strukturelle egenskaper så vel som spesifikke ladningsegenskaper. Konformelle og ikke-konformelle epitoper skilles ved at bindingen til den førstnevnte, men ikke til den sistnevnte, går tapt ved behandling med denaturerende løsemidler.

Begrepene "hemmer binding" og "blokkerer binding" (f.eks. en hemming/blokkering av bindingen av IL-8 til dens reseptorer, CXCR1 og CXCR2) slik det anvendes her anvendes om hverandre og omfatter både delvis og fullstendig hemming/blokkering. Hemmingen/blokkeringen av IL-8 reduserer eller endrer fortrinnsvis det normale nivået eller type av aktivitet som skjer når IL-8-binding skjer uten hemming eller blokkering, f.eks. hemming av IL-8-indusert elastasefrigjøring eller kalsiumfluks, eller hemming av IL-8-indusert forhøyet ekspresjon av CDllb (Mac-1), eller nedsatt ekspresjon av L-selektin. Hemming og blokkering innbefatter også enhver målbar nedsatt bindingsaffinitet for IL-8 når denne er i kontakt med et IL-8-antistoff sammenlignet med IL-8, som ikke er i kontakt med et anti-IL-8-antistoff, f.eks. blokkeringen av bindingen av IL-8 til dets reseptor med minst 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 99 % eller 100 %.

Begrepene "monoklonalt antistoff eller "monoklonal antistoff-sammensetning" slik det anvendes her refererer seg til et preparat av antistoff-molekyler med enkel molekylær sammensetning. En monoklonal antistoff-sammensetning oppviser en enkeltbindende spesifisitet og affinitet for en spesiell epitop. Begrepet "humant monoklonalt antistoff refererer seg således til antistoffer som oppviser en enkelbindende spesifisitet som har variable og konstante områder, og som er avledet fra humane kimlinjeimmunoglobulinsekvenser. I én utførelse blir de humane monoklonale antistoffene produsert ved hjelp av et hybridom som inkluderer en B-celle, som er oppnådd fra et transgent ikke-humant dyr, f.eks. en transgen mus, med et genom som omfatter et humant tungkjedetransgen og et lettkjedetransgen fusjonert til en immortalisert celle.

Begrepet "rekombinant humant antistoff slik det anvendes her, er tenkt å omfatte alle humane antistoffer som blir fremstilt, uttrykt, skapt eller isolert ved hjelp av rekombinante fremgangsmåter eller metoder, så som (a) antistoffer som er isolert fra et dyr (f.eks. en mus) som er transgent eller transkromosomalt for humane immunoglobulingener, eller et hybridom som er fremstilt av slike (ytterligere beskrevet i avsnitt I i det etterfølgende), (b) antistoffer som er isolert fra en celle som er transformert slik at den uttrykker antistoffer, f.eks. fra et transfektom, (c) antistoffer isolert fra et rekombinant, kombinatorisk humant antistoffbibliotek, og (d) antistoffer fremstilt, uttrykt, skapt eller isolert på enhver annen måte som innbefatter spleising av humane immunoglobulingensekvenser til andre DNA-sekvenser. Slike rekombinante humane antistoffer har variable og konstante områder avledet fra humane kimlinjeimmunoglobulinsekvenser. I visse utførelser kan imidlertid slike rekombinante humane antistoffer være underkastet en in vitro mutagenese (eller når en anvender et dyr som er transgent for humane IgG-sekvenser, in vivo somatisk mutagenese), og således at aminosyresekvensene i Vh-og VL-områdene i de rekombinante antistoffene er sekvenser, skjønt de er avledet fra og er beslektet til human kimlinje Vr- og VL-sekvenser, vil være slike som ikke nødvendigvis naturlig vil eksistere inne i det humane antistoffkimlinjerepertoaret in vivo.

Slik det anvendes her er et "heterologt antistoff definert i forhold til den transgene ikke-humane organismen som produserer et slikt antistoff. Begrepet refererer seg til et antistoff med en aminosyresekvens eller en kodende nukleinsyresekvens som tilsvarer det som finnes i en organisme som ikke omfatter det transgene ikke-humane dyret, og vanligvis fra en art som er forskjellig fra det transgene ikke-humane dyret.

Et "isolert antistoff slik det anvendes her er ment å betegne et antistoff som i alt vesentlig er fritt for andre antistoffer med andre antigene spesifisiteter (f.eks. et isolert antistoff som binder seg til IL-8 vil i alt vesentlig være fritt for antistoffer som binder seg til antigener som er forskjellige fra IL-8). Et isolert antistoff som binder seg til en epitop, isoform eller variant av human IL-8, kan imidlertid ha krys sr eakti vitet til andre beslektede antigener, f.eks. fra andre arter (f.eks. IL-8-artshomologer). Et isolert antistoff kan videre i alt vesentlig være fritt for annet cellulært materiale og/eller kjemiske forbindelser. I én utførelse av oppfinnelsen er en kombinasjon av "isolerte" monoklonale antistoffer med forskjellige spesifisiteter kombinert eller blandet i en veldefinert sammensetning.

Med begrepet "spesifikk binding" forstås en antistoffbinding til et forutbestemt antigen. Typisk vil antistoffet binde seg med en affinitet som tilsvarer en KDpå a. IO"<8>M eller mindre, og binder seg til det forutbestemte antigenet med en affinitet (som uttrykt ved Kd) som er minst ti ganger mindre, og fortrinnsvis minst hundre ganger mindre enn dets affinitet for binding til et ikke-spesifikt antigen (f.eks. BSA, kasein) som er forskjellig fra det forutbestemte antigenet eller et nært beslektet antigen. Alternativt kan antistoffet binde seg med en affinitet som tilsvarer en Ka på ca. IO<7>M"<1>eller høyere, og binde seg til det forutbestemte antigenet med en affinitet (som uttrykt ved Ka) som er minst ti ganger høyere, og fortrinnsvis minst hundre ganger høyere enn dets affinitet for binding til et ikke-spesifikt antigen (f.eks. BSA, kasein) som er forskjellig fra det forutbestemte antigenet eller et nært beslektet antigen. Setningene "et antistoff gjenkjenner et antigen" og "et antistoff som er spesifikt for et antigen" anvendes her om hverandre sammen med begrepet "et antistoff som binder seg spesifikt til et antigen".

Begrepet "ka" (sek"<1>) slik det anvendes her er ment å betegne dissosiasjonshastighetskonstanten for en spesiell antistoff-antigen-interaksjon. Nevnte verdi er også betegnet som k0ff-verdien.

Begrepet "ka" (M"1 x sek"<1>) slik det anvendes her, er ment å betegne assosiasjonshastighetskonstanten for en spesiell antistoff-antigen-interaksjon. Begrepet "Ka" (M) slik det anvendes her er ment å referere seg til assosiasjons - likevektskonstanten for en spesiell antistoff-antigen-interaksjon.

Begrepet "Kd" (M"<1>) slik det anvendes her, er ment å betegne dissosiasjon-slikevektskonstanten for en spesiell antistoff-antigen-interaksjon.

Med begrepet "isotype" forstås en antistoffklasse (f.eks. IgM eller IgGl) som er kodet for genene i de tungkjedekonstante områdene.

Med begrepet "isotypeskifte" forstås det fenomen, ved hjelp av hvilket klassen, isotypen eller et antistoff forandrer seg fra én lg-klasse til en av de andre Ig-klassene.

Slik det anvendes her betyr "ikke-skiftet isotype" den isotypiske klassen for den tunge kjeden som produseres når det ikke har funnet sted noen isotypeskifte; og de CH-gen som koder den ikke-skiftede isotypen er typisk det første CH-genet umiddelbart nedstrøms fra det funksjonelt omleirede VDJ-genet. Isotypeskifte er blitt klassifisert som klassisk eller ikke-klassisk isotypeskifte. Klassisk isotypeskifte skjer ved rekombineringsreaksjoner som innbefatter et skifte av minst ett sekvensområde i transgenet. Ikke-klassisk isotypeskifte skjer f.eks. ved en homolog rekombinasjon mellom human a^. og human 2^ (5-assosiert delesjon). Alternative ikke-klassiske skiftemekanismer, så som intertransgen og/eller interkromosomal rekombinasjon, blant mange andre, kan inntreffe og frembringe et isotypeskifte.

Begrepet "skiftesekvens" slik det anvendes her, refererer til de DNA-sekvenser som er ansvarlig for skifterekombinasjon. En "skiftedonor" sekvens, er typisk et n-skifteområde, og vil være 5' (dvs. oppstrøms) for det konstruerte området som skal fjernes under skifte-rekombinasjonen. "skifte-akseptor" området vil være mellom det konstruerte området som skal fjernes og det erstatningskonstante området (f.eks. y, s, etc).

Med begrepet "glykosyleringsmønster" slik det anvendes her, forstås mønsteret av karbohydratenheter som kovalent er knyttet til et protein, mer spesifikt til et immunoglobulinprotein. Et glykosyleringsmønster for et heterologt antistoff kan karakteriseres ved å være i alt vesentlig likt de glykosyleringsmønstre som opptrer naturlig på antistoffer fremstilt av individer av det ikke-humane transgene dyret, når en kompetent fagperson vil kunne se at glykosyleringsmønsteret for det heterologe antistoffet er mer lik nevnte glykosyleringsmønster i individene for det ikke-humane transgene dyret, enn fra arter fra hvilke CH-genene i transgenet, er avledet.

Begrepet "naturlig forekommende" slik det anvendes her, når det anvendes i forbindelse med et individ eller en enhet, refererer seg til det faktum at nevnte individ eller enhet kan finnes i naturen. Et polypeptid eller en polynukleotidsekvens som er tilstede i en organisme (inklusive virus), kan f.eks. være isolert fra en kilde i naturen og er ikke med hensikt blitt modifisert i et laboratorium, vil være naturlig forekommende.

Begrepet "rearrangert" slik det anvendes her refererer seg til en konfigurasjon for et tungkjede eller lettkjede immunoglobulinlokus, hvor et V-segment er plassert umiddelbart inntil et D-J- eller J-segment i en konformasjon som i alt vesentlig koder et fullstendig Vh- eller VL-domene henholdsvis. Et rearrangert immuno-globulingenlokus kan identifiseres ved sammenligning med kimlinje DNA; og hvor et rearrangert lokus vil ha minst ett rekombinert heptamer/nonamer homologielement.

Begrepet"ikke-rearrangert" eller "kimlinjekonfigurasjon" slik det anvendes her i forbindelse med et V-segment, refererer seg til den konfigurasjonen, hvor V-segmentet ikke er rekombinert slik at det er umiddelbart plassert inntil et D- eller J-segment.

Begrepet "nukleinsyremolekyl" slik det anvendes her er ment å inkludere både DNA-molekyler og RNA-molekyler. Et nukleinsyremolekyl kan være enkelttrådet eller dobbelttrådet, men er fortrinnsvis dobbelttrådet DNA.

Begrepet "isolert nukleinsyremolekyl" slik det er brukt her i forbindelse med nukleinsyrer som koder intakte antistoffer eller antistoffdeler (f.eks. Vh, Vl, CDR3) som binder seg til IL-8, er ment å betegne et nukleinsyremolekyl hvor nukleotidsekvensene som koder det intakte antistoffet eller antistoffdelen, er fri for andre nukleotidsekvenser som koder intakte antistoffer eller antistoffdeler som binder seg til antigener som er forskjellig fra IL-8, og hvor nevnte andre sekvenser naturlig kan flankere nukleinsyren i det humane genomiske DNA. I én utførelse vil det humane anti-IL-8-antistoffet inkludere aminosyresekvensen for 10F8, så vel som tungkjede (Vh) og lettkjede (Vl) variable aminosyreområder med de sekvenser, som er vist i SEKV. ID nr. 12 og 8, eller kodet av de nukleotidsekvenser som er vist i SEKV. ID nr. 10 og 6.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også "derivater" av de aminosyresekvenser som er angitt i SEKV. ID nr. 8 eller 12, hvor én eller flere av aminosyre-gruppene er blitt derivatisert, f.eks. ved acylering eller glykosylering, uten at dette signifikant påvirker eller endrer bindingsegenskapene for det antistoffet som inneholder aminosyresekvensene.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre antistoffer hvor det er utført én eller flere endringer i Fc-området for derved å endre antistoffenes funksjonelle eller farmakokinetiske egenskaper. Slike endringer kan resultere i en nedsatt eller forsterket Clq-binding og CDC (komplementavhengig cytotoksisitet) eller FcyR-binding og antistoff-avhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC). Det kan f.eks. være utført substitusjoner i én eller flere av aminosyreposisjonene 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 og 322 i det tungkjedekonstante området, noe som vil frembringe en endring av effektorfunksjonen samtidig som bindingen til et antigen er beholdt, sammenlignet med umodifiserte antistoffer, konf. US 5 624 821 og US 5 648 260. Ytterligere referanser er WO 00/42072, som beskriver antistoffer med endrede Fc-områder som øker ADCC, og WO 94/29351 som beskriver antistoffer med mutasjoner i det N-terminale området av CH2-domenet, som endrer antistoffenes evne til å binde seg til FcRI, og derved nedsette antistoffenes evne til å binde seg til Clq, noe som igjen nedsetter antistoffenes evne til å fiksere komplement. Videre beskriver Shields et al., J. Biol. Chem. (2001) 276:6591-6604 kombinasjons-varianter, f.eks. T256A/S298A, S298A/E333A og S298A/E333A/K334A, som bedrer FcyRIII-binding.

In vivo halveringstiden for antistoffene kan også bedres ved å modifisere redningsreseptorepitopen i det Ig-konstante domenet eller et Ig-lignende konstant domene, slik at molekylet ikke omfatter et intakt CH2-domene eller et intakt lg Fc-område, konferer US 6 121 022 og US 6 194 551. In vivo halveringstid kan videre forlenges ved å frembringe mutasjoner i Fc-området, f.eks. ved å erstatte treonin med leucin i posisjonen 252, treonin med serin i posisjon 254, eller treonin istedenfor fenylalanin i posisjon 256, konferer US 6 277 375.

Videre kan antistoffenes glykosyleringsmønster modifiseres for å forandre antistoffenes effektorfunksjon. F.eks. kan antistoffene uttrykkes i et transfektom som ikke adderer fukoseenheten, som naturlig er knyttet til karbohydratet som er knyttet til Asn i posisjon 297 i Fc, for derved å bedre affiniteten for Fc for FcyRIII, noe som igjen vil resultere i en forsterket ADCC for antistoffene i nærvær av NK-celler, konferer Shield et al. (2002), J. Biol. Chem., 277:26733. Videre kan det utføres en modifikasjon av galaktosyleringen for å modifisere CDC. Det refereres her videre til WO 99/54342 og Umana et al., Nat. Biotechnol. (1999) 17:176, som beskriver en CHO-cellelinje som er blitt modifisert slik at den uttrykker GntUI, noe som resulterer i en ekspresjon av monoklonale antistoffer med endrede glukoformer og bedret ADCC-aktivitet.

Videre kan antistoffragmentene, f.eks. Fab-fragmentene ifølge foreliggende oppfinnelse, pegyleres for øke deres halvveringstid. Dette kan utføres ved hjelp av pegyleringsreaksjoner som er velkjente, f.eks. av den type som er beskrevet i Focus on Growth Factors (1992) 3:4-10, EP 154 316 og EP 401 384.

Oppfinnelsen omfatter følgelig antistoffer som kodes av de (tungkjede- og lettkjedevariable område) nukleotidsekvenser som er beskrevet her og/eller som inneholder de (tungkjede- og lettkjedevariable områder) aminosyresekvenser som er beskrevet her (dvs. SEKV. ID nr. 10, 6, 12 og 8 henholdsvis).

For nukleinsyre og aminosyresekvenser vil begrepet "homologi" indikere graden av identitet mellom to sekvenser, når de optimalt er alignet og sammenlignet, med passende innsetninger eller delesjoner. Alternativt vil det kunne eksistere vesentlig homologi når DNA-segmentene vil hybridisere under selektive hybridiseringsbetingelser, til komplementet til tråden.

Prosent identitet mellom to sekvenser er en funksjon av det antall felles identiske posisjoner i de to sekvensene (dvs. % homologi er antall identiske posisjoner/totalt antall posisjoner x 100), idet en tar hensyn til antall gap, og lengden på hvert enkelt gap, som nødvendigvis må innføres for å oppnå optimal alignment mellom de to sekvensene. En sammenligning mellom sekvenser og bestemmelse av prosent identitet mellom to sekvenser, kan oppnås ved å anvende en matematisk algoritme, slik det er beskrevet i de etterfølgende ikke-begrensende eksempler.

Prosent identitet mellom to nukleotidsekvenser kan bestemmes ved å anvende GAP-programmet i GCG-programvaren (tilgjengelig ved http:// www. gcg. com), ved å anvende en NWSgapdna.CMP-matrise og en gap-vekt på 40, 50, 60, 70 eller 80, og en lengdevekt på 1, 2, 3, 4, 5 eller 6. Prosent identitet mellom to nukleotid- eller aminosyresekvenser kan også bestemmes ved å anvende algoritmen til E. Meyers og W. Miller ( Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)), som er inkorporert i ALIGN-programmet (versjon 2.0), ved å anvende en PAMI20 vektrest tabell, en gap-lengdepenalitet på 12 og en gap-penalitet på 4.1 tillegg kan prosent identitet mellom to aminosyresekvenser bestemmes ved å anvende Needleman og Wunsch ( J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) algoritmen som er inkorporert i GAP-programmet i GCG-programvaren (tilgjengelig ved http:// www. gcg. com), ved å anvende enten en Blossum 62 matrise eller en PAM250-matrise, og en gapvekt på 16, 14, 12, 10, 8, 6 eller 4, og en lengdevekt på 1, 2, 3, 4, 5 eller 6.

Nukleinsyre og proteinsekvensene ifølge foreliggende oppfinnelse kan videre anvendes som en "søkesekvens" for å utføre et søk i forhold til offentlige databaser, f.eks. for å identifisere nærstående sekvenser. Slike søk kan utføres ved å anvende NBLAST- og XBLAST-programmene (versjon 2.0) til Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. BLAST-nukleotidsøkene kan utføres med NBLAST-programmet, skår = 100, ordlengde =12, for derved å oppnå nukleotidsekvenser som er homologe til nukleinsyremolekylene ifølge oppfinnelsen. BLAST-proteinsøkene kan utføres med XBLAST-programmet, skår = 50, ordlengde = 3, for å oppnå aminosyresekvenser som er homologe med proteinmolekylene ifølge oppfinnelsen. For å oppnå alignments med gap for sammenligningsformål, kan en anvende gapped BLAST slik det er beskrevet av Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Ved anvendelse av BLAST- og gapped BLAST-programmene kan standardparameterne for de respektive programmene (dvs. XBLAST og NBLAST) anvendes. Se http:// ncbi. nlm. nih. gov.

Nukleinsyrene kan være tilstede i hele celler, i et cellelysat eller i en delvis renset eller i alt vesentlig ren form. En nukleinsyre er "isolert" eller "gjort i alt vesentlig ren" når andre cellulære komponenter eller andre forurensninger er fjernet, f.eks. andre cellulære nukleinsyrer eller proteiner, ved hjelp av standardteknikk, så som alkalisk/SDS-behandling, CsCl-bånddannelse, kolonne-kromatografi, agarosegelelektroforese eller andre velkjente metoder. Se F. Ausubel et al., red. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing og Wiley Interscience, New York (1987).

Nukleinsyresammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelsen, skjønt de ofte befinner seg i form av en naturlig sekvens (bortsett fra modifiserte restriksjonsseter og lignende), enten fra cDNA, genomisk eller blandinger av disse, kan muteres ved hjelp av standardteknikk for å tilveiebringe gensekvenser. For kodende sekvenser så kan disse mutasjonene påvirke aminosyresekvensen som ønsket. Dette gjelder spesielt DNA-sekvenser som i alt vesentlig er homologe eller er avledet fra naturlig V, D, J, enten disse er konstante eller skiftede, og andre sekvenser slik det er beskrevet her (hvor "avledet" indikerer at en sekvens er identisk eller modifisert fra en annen sekvens).

En nukleinsyre er "operativt forbundet" når den er plassert i et funksjonelt forhold til en annen nukleinsyresekvens. F.eks. vil en promoter eller en forsterker være operativt forbundet med en kodende sekvens hvis den påvirker transkripsjonen av sekvensen. Med hensyn til transkriberende regulerende sekvenser, så betyr operativt forbundet at DNA-sekvensene som er forbundet, er sammenhengende, og hvor det er nødvendig å forene to proteinkodende områder, så er disse sammenhengende og i en leseramme. For skiftesekvenser indikerer operativt forbundet at sekvensen er i stand til å frembringe en skifterekombinasjon.

Begrepet "vektor" slik det anvendes her, refererer seg til et nukleinsyremolekyl som er i stand til å transportere en annen nukleinsyre til hvilken den er blitt forbundet. En type vektor er et "plasmid", som refererer seg til en sirkulær dobbelttrådet DNA-sløyfe hvor ytterligere DNA-segmenter kan ligeres. En annen type vektor er en viral vektor, hvor ytterligere DNA-segmenter kan ligeres inn i det virale genomet. Visse vektorer er i stand til autonom replikasjon i en vertscelle i hvilken de er innført (f.eks. bakterievektorer med et bakterielt replikasjonsorigo og episomale pattedyrvektorer). Andre vektorer (f.eks. ikke-episomale pattedyr-vektorer) kan integreres i genomet til en vertscelle ved innføring i vertscellen, og kan så oppformeres sammen med vertsgenomet. Visse vektorer er videre i stand til å styre ekspresjonen av gener til hvilket de operativt er forbundet. Slike vektorer er her betegnet som "rekombinante ekspresjonsvektorer" (eller ganske enkelt "ekspresjonsvektorer"). De ekspresjonsvektorene som anvendes i rekombinante DNA-teknikker er generelt ofte i form av plasmider. I foreliggende beskrivelse anvendes "plasmid" og "vektor" om hverandre, ettersom plasmidet er den mest vanlige anvendte formen for vektor. Det er imidlertid underforstått at oppfinnelsen også omfatter andre former av ekspresjonsvektorer, så som virale vektorer (f.eks. retrovirus med replikasjonssvikt, adenovirus og adeno-assosierte virus), som har tilsvarende funksjoner.

Begrepet "rekombinant vertscelle" (eller ganske enkelt "vertscelle"), slik det anvendes her, refererer seg til en celle hvor det er innført en rekombinant ekspresjons-vektor. Det er underforstått at slike begreper ikke bare refererer seg til en enkeltcelle, men også til avkommet av en slik celle. Ettersom visse modifikasjoner kan opptre i etterfølgende generasjoner, enten dette skyldes mutasjon eller påvirkninger fra miljøet, så kan det være tilfeller hvor nevnte avkom ikke er identisk med foreldrecellen, men ikke desto mindre så inngår slikt avkom i begrepet "vertscelle" slik det anvendes her. Rekombinante vertsceller innbefatter f.eks. CHO-celler og NS/O-celler.

Begrepet "transfektom" slik det anvendes her, inkluderer en rekombinant eukaryotisk vertscelle som uttrykker antistoffet, så som CHO-celler, NS/O-celler, HEK293-celler, planteceller eller soppceller, inklusive gjærceller.

Slik det anvendes her inkluderer begrepet "individ" ethvert menneske eller ikke-humant dyr. Begrepet "ikke-humant dyr" innbefatter alle typer vertebrater, f.eks. pattedyr og ikke-pattedyr, så som ikke-humane primater, sauer, hunder, kuer, kyllinger, amfibier, reptiler, etc.

Begrepet "transgent ikke-humant dyr" refererer seg til et ikke-humant dyr med et genom som omfatter én eller flere humane tunge og/eller lettkjedetransgener eller transkromosomer (enten disse er integrert eller ikke integrert i dyrets naturlige genomiske DNA), og som er i stand til å uttrykke fullt humane antistoffer. F.eks. kan en transgen mus ha et humant lettkjedetransgen og enten et humant tungkjedetransgen eller humant tungkjedet transkromosom, slik at musen vil produsere humane anti-IL-8-antistoffer når den immuniseres med IL-8-antigen, og/eller celler som uttrykker IL-8. Det humane tungkjedetransgenet kan integreres i musens kromosomale DNA, noe som f.eks. er tilfelle med den transgene HuMAb-musen, eller det humane tungkjedetransgenet kan være tilstede ekstrakromosomalt, noe som er tilfelle for den transkromosomale (f.eks. KM) musen som er beskrevet i WO 02/43478. Slike transgene og transkromosomale mus er i stand til å produsere multiple isotyper av humane monoklonale antistoffer til IL-8 (f.eks. IgG, IgA og/eller IgE), ved at det skjer en V-D-J-rekombinasjon og isotypeskifte. Transgene ikke-humane dyr kan også anvendes for produksjon av et spesifikt anti-IL-8-antistoff ved at det innføres gener som koder et slikt spesifikt anti-IL-8-antistoff, ved f.eks. operativt å forbinde genene til et annet gen som uttrykkes i dyrets melk.

Forskjellige aspekter av oppfinnelsen vil nå ytterligere detaljert bli beskrevet i de følgende avsnitt.

I. Produksjon av humane antistoffer til IL- 8

De humane monoklonale antistoffene ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved en rekke forskjellige typer teknikker, så som vanlig kjent monoklonal antistoff-metodologi (f.eks. den standardsomatiske cellehybridiseringsteknikken som er beskrevet av Kohler og Milstein (1975) Nature 256:495. Skjønt det er foretrukket å anvendes somatiske cellehybridiseringsmetoder, så er det i prinsipp også mulig å anvene andre teknikker for produksjon av monoklonale antistoffer, f.eks. ved en viral eller onkogen transformasjon av B-lymfocytter.

Det foretrukne dyresystemet for fremstilling av hybridomer er det murine systemet. Hybridomproduksjon i mus er en veletablert fremgangsmåte. Immuniseringsprotokoller og teknikker for isolering av immuniserte splenocytter for fusjon er velkjent innenfor bioteknologien. Fusjonspartnere (f.eks. murine myelomceller) og fusjonsmetoder er også kjente.

I en foretrukket utførelse kan humane monoklonale antistoffer som er rettet inn mot IL-8, utvikles ved å anvendes transgene mus som bærer deler av det humane immunsystemet snarere enn musesystemet. Disse transgene mus, som her er betegnet som "HuMab"-mus, inneholder et humant immunoglobulin genminiloki, som koder uonleirede humane tunge (\ i og y) og k lettkjedeimmunoglobulin-sekvenser, sammen med målsøkende mutasjoner som inaktiverer de endogene \ i og k kjedeloki (Lonberg et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859). Disse musene vil følgelig ha redusert ekspresjon av mus IgM eller k lettkjede, og som en respons på immunisering, ved innføring av humane tung- og lettkjedetransgener, gjennomgå et klasseskifte og somatisk mutasjon, slik at de utvikler humane IgGic monoklonale antistoffer med høy affinitet (Lonberg N. et al. (1994), supra; oversikt i Lonberg, N.

(1994) Handbook ofExperimentalPharmacology 113:49-101; Lonberg N. og Huszar D. (1995) Intern. Rev. Immunol. vol. 13:65-93 og Harding F. og Lonberg N.

(1995) Ann. NY. Acad. Sei. 764:536-546). Fremstillingen av HuMAb-mus er beskrevet detaljert i avsnitt II i det etterfølgende, og i Taylor L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen J et al. (1993) International Immunology 5:647-656; Tuaillon et al. (1993) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genettes 4:117-123; Chen J et al. (1993) EMBO J. 12:821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Lonberg N. et al.,

(1994) Nature 368(6474): 856-859; Lonberg N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Taylor L. et al. (1994) International Immunology 6:579-591; Lonberg N. og Huszar D. (1995) Intern. Rev. Immunol. vol. 13:65-93; Harding F. og Lonberg N. (1995) Ann. NY. Acad. Sei. 764:536-546; Fishwild D. et al.

(1996) Nature Biotechnology 14:845-851. Se ytterligere US patenter nr. 5 545 806, 5 569 825, 5 625 126; 5 633 425; 5 789 650; 5 877 397; 5 661 016; 5 814 318; 5 874 299 og 5 770 429; alle til Lonberg N. og Kay R. M. og GenPharm International; US patent nr. 5 545 807 til Surani et al.; internasjonal publikasjon nr. WO 98/24884, publisert 11. juni 1998; WO 94/25585, publisert 10. november 1994; WO 93/1227, publisert 24. juni 1993; WO 92/22645, publisert 23. desember 1992; og WO 92/03918, publisert 19. mars 1992. Foretrukne HuMAb-mus har et JKD-brudd i sine endogene lettkjede (kappa) gener (slik det er beskrevet i Chen et al.

(1993) EMBO J. 12:821-830), et CMD-brudd i sine endogene tungkjedegener (slik det er beskrevet i eksempel 1 i WO 01/14424 av Korman et al.), et KCo5 humant kappa lettkjedetransgen (slik det er beskrevet i Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851) og et HCo7 humant tungkjedetransgen (slik det er beskrevet i US patent nr. 5 770 429 av Lonberg N. og Kay R. M.) og/eller et HCol2 humant tungkjedetransgen (slik det er beskrevet i eksempel 2 i WO 01/14424 til Korman et al.).

Alternativt er det mulig å anvende mus som bærer humane immunoglobulingener på et transkromosomalt fragment, for å utvikle anti-IL-8-antistoffer. Fremstilling av slike transkromosomale mus er beskrevet i WO 97/07671 av Tomizuka et al. En foretrukket mus er én hvor visse humane immunoglobulingener bæres på et transgen, mens andre er båret på et transkromosom, så som en mus som bærer et humant lettkjedetransgen (f.eks. KCo5 kappakjedetransgenet) og et humant tungkjedetranskromosom (f.eks. SC20-transkromosomet), slik det detaljert er beskrevet i WO 02/43478 av Ishida et al.

HuMA b- immuniseringer

For å utvikle fullt humane monoklonale antistoffer til IL-8, kan HuMAb-mus immuniseres med et renset eller anriket preparat av IL-8-antigen og/eller celler som produserer IL-8 og/eller rekombinant IL-8, slik det er beskrevet av Lonberg N. et al.

(1994) Nature 368(6474):856-859; Fishwild D et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851 og WO 98/24884. Musene bør fortrinnsvis være 6-16 uker gamle ved den første infusjonen. F.eks. kan rekombinant IL-8 anvendes for å immunisere HuMAb-musene intraperetonealt.

Samlet erfaring med forskjellige antigener har vist at de HuMAb-transgene musene responderer best når de først immuniseres interaperitonealt (IP) med antigen i fullstendig Freunds adjuvant, fulgt hver annen uke med i.p. immuniseringer (opptil totalt 6 immuniseringer) med antigen i ufullstendig Freunds adjuvant. Immunreaksjonen kan kontrolleres i løpet av immuniseringsperioden med plasmaprøver som oppnås ved hjelp av retroorbitale blodprøver. Plasma kan så screenes ved hjelp av ELISA (slik det er beskrevet i det etterfølgende), og mus med tilstrekkelig titer med hensyn til anti-IL-8-humant immunoglobulin kan så anvendes ved fusjoner. Musene kan forsterkes intravenøst med antigen tre dager før avliving og fjerning av milten. Det er forventet at det kan være nødvendig å gjennomføre 2-3 fusjoner for hvert antigen. Flere mus vil bli immunisert for hvert antigen. F.eks. kan totalt 12 HuMAb-mus av HCo7- og HCol2-stammer immuniseres.

Utvikling av hybridomer som produserer humane monoklonale antistoffer til IL- 8

Musesplenocyttene kan isoleres og fusjoneres med PEG til en musemyelom-cellelinje basert på standardprotokoller. De resulterende hybridomer kan så screenes for produksjonen av antigen-spesifikke antistoffer. F.eks. kan enkeltcelle-suspensjoner av miltlymfocytter fra immuniserte mus fusjoneres til en sjettedel av antallet av P3X63-Ag8.653 ikke-sekretive musemyelomceller (ATCC, CRL 1580) med 50 % PEG. Cellene utplates i en mengde på ca. 2 x 10<5>i flatbundede mikrotitreringsplater, fulgt av en 2 ukers inkubering i et selektivt medium som inneholder 20 % føtalt kloneserum, 18 % "653" kondisjonert media, 5 % origen (IGEN), 4 mM L-glutamin, 1 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 5 mM HEPES, 0,055 mM 2-merkaptoetanol, 50 enheter/ml penicillin, 50 mg/ml streptomycin, 50 mg/ml gentamycin og IX HAT (Sigma; nevnte HAT tilsettes 24 timer etter fusjonen). Etter 2 uker blir cellene dyrket i et medium hvor nevnte HAT er erstattet med HT. Individuelle brønner blir så screenet ved hjelp av ELISA for humant anti-IL-8 monoklonalt IgM og IgG antistoffer. Så snart det skjer en omfattende hybridomvekst, vil mediet vanligvis bli observert etter 10-14 dager. Antiutskillende hybridomer blir så platet ut på nytt, igjen screenet og hvis de stadig er positive for humane IgG, anti-IL-8-monoklonale antistoffer, så kan de subklones minst to ganger ved hjelp av såkalt begrensende fortynning. Stabile subkloner kan så dyrkes in vitro til å utvikle små mengder av antistoff i et vevskulturmedium for karakterisering.

Utvikling av transfektomer som produserer humane monoklonale antistoffer til IL- 8

Humane antistoffer ifølge oppfinnelsen kan også produseres i en vertscelle-transfektom, f.eks. ved å anvende en kombinasjon av rekombinante DNA-teknikker og gentransfeksjonsmetoder av velkjent type (Morrison S. (1985) Science 229:1202).

F.eks. for å uttrykke antistoffene eller antistoffragmenter av disse, så kan DNA-molekyler som koder delvis eller hellengde lette og tunge kjeder, oppnås ved standardmolekylær biologisk teknikk (f.eks. PCR-amplifisering eller seterettet mutagenese) og innsettes i ekspresjonsvektorer, slik at genene blir operativt forbundet med transkriberende og translaterende kontrollsekvenser. I denne sammenheng betyr begrepet "operativt forbundet" at et antistoffgen blir ligert inn i en vektor slik at de transkriberende og translaterende kontrollsekvensene inne i vektoren utøver sin påtenkte funksjon med hensyn til regulering av transkripsjon og translatering av antistoffgenet. Ekspresjonsvektoren og ekspresjonskontroll-sekvensene velges slik at de er forenlige med den anvendte ekspresjonsvertscellen. Antistoff lettkjedegenet og antistoff tungkjedegenet kan innsettes i separate vektorer, eller mer typisk vil begge genene innsettes i den samme ekspresjonsvektoren. Antistoffgenene kan innsettes i ekspresjonsvektoren ved hjelp av standardmetoder (f.eks. ligering av komplementære restriksjonsseter på antistoffgenfragmentet og vektoren, eller ligering i den avrundede enden hvis det ikke er tilstede noen restriksjonsseter). De lette og tungkjedevariable områdene i antistoffene som er beskrevet her, kan anvendes for å skape hele antistoffgener for enhver antistoffisotype ved at de innsettes i ekspresjonsvektorer som allerede koder tungkjedekonstante og lettkjedekonstante områder av den forønskede isotype, slik at Vn-segmentet er operativt forbundet med CH-segmentet(er) inne i vektoren, og Vl-segmentet er operativt forbundet med CL-segmentet i vektoren. Ytterligere eller alternativt kan de rekombinante ekspresjonsvektoren kode et signalpeptid som letter utskillelsen av antistoffkjeden fra en vertscelle. Antistoffkjedegenet kan klones inn i vektoren slik at signalpeptidet er forbundet i ramme med aminoterminus i antistoffkjedegenet. Signalpeptidet kan være et immunoglobulinsignalpeptid eller et heterologt signalpeptid (dvs. et signalpeptid fra et ikke-immunoglobulinprotein).

I tillegg til antistoffkjedegenene kan rekombinante ekspresjonsvektorer ifølge oppfinnelsen også bære regulerende sekvenser som kontrollerer ekspresjonen av antistoffkjedegenene i en vertscelle. Med begrepte "regulerende sekvens" forstås promotere, forsterkere og andre ekspresjonskontrollelementer (f.eks. poly-adenyleringssignaler), som kontrollerer transkripsjonen og translateringen av antistoffkjedegenene. Slike regulerende sekvenser er f.eks. beskrevet i Goeddel; Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Claifornia (1990). Det er underforstått at utformingen av ekspresjonsvektoren, inklusive valg av regulerende sekvenser, vil være avhengig av faktorer som valg av den vertscellen som skal transformeres, nivået med hensyn til ekspresjon av det forønskede protein, etc. Foretrukne regulerende sekvenser for pattedyrvertscelleekspresjon omfatter virale elementer som gir et høyt nivå av proteinekspresjon i pattedyrceller, så som promotere og/eller forsterkere avledet fra cytomegalovirus (CMV), Simian Virus 40 (SV40), adenovirus (f.eks. den store sene promoteren fra adenovirus (AdMLP)) og polyoma. Alternativt er det mulig å anvende ikke-virale regulerende sekvenser, så som ubiquitinpromoteren eller globin-promoteren.

I tillegg til antistoffkjedegenene og regulerende sekvenser kan de rekombinante ekspresjonsvektorene ifølge oppfinnelsen også bære ytterligere sekvenser, så som sekvenser som regulerer replikasjonen av vektoren i vertscellene (f.eks. replikasjonsorigo) og selekterbare markørgener. Det selekterbare markørgenet vil lette en seleksjon av vertsceller hvor vektoren er blitt innført (se f.eks. US patenter nr. 4 399 216, 4 634 665 og 5 179 017, alle til Axel et al.). Typisk vil f.eks. det selekterbare markørgenet gi resistens mot visse medikamenter, så som G418, hygromycin eller metotreksat, i den vertscellen i hvilken vektoren er blitt innført. Foretrukne selekterbare markørgener innbefatter dihydrofolatreduktase

(DHFR) genet (for anvendelse i dhfr-vertsceller med metotreksatseleksjon/- amplifisering) og neogenet (for G418-seleksjon).

For ekspresjon av de lette og tunge kjedene, så kan ekspresjonsvektorer som koder de tunge og lette kjedene bli transfektert inn i en vertscelle ved hjelp av standardteknikk. De forskjellige formene med hensyn til begrepet "transfeksjon" omfatter en rekke forskjellige typer teknikker som er vanlig kjente for innføring av eksogent DNA i en prokaryotisk eller en eukrayotisk vertscelle, f.eks. elektroporering, kalsiumfosfatutfelning, DEAE-dekstrantransfeksjon og lignende. Skjønt det teoretisk er mulig å uttrykke antistoffene ifølge oppfinnelsen enten i prokaryotiske eller eukaryotiske vertsceller, så er en ekspresjon av antistoffene i eukaryotiske celler, og da fortrinnsvis pattedyrceller, mest foretrukket, fordi slike eukaryotiske celler, og da spesielt pattedyrceller, er mer sannsynlig enn prokaryotiske celler til å settes sammen og utskille et riktig foldet og immunologisk aktivt antistoff.

Foretrukne pattedyrvertsceller for å uttrykke de rekombinante antistoffene ifølge oppfinnelsen innbefatter CHO-celler (inklusive dhfr-CHO-celler som er beskrevet i Urlaub og Chasin (1980) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77:4216-4220, som er anvendt med en DHFR-selekterbar markør, f.eks. slik det er beskrevet i R. J. Kaufamn og P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), NS/0 myelomceller, COS-celler, HEK293-celler og SP2.0-celler. Spesielt for anvendelse sammen med NS/0 myelomceller så vil et annet foretrukket ekspresjonssystem være GS (glutaminsyntetase) genekspresjonssystemet som er beskrevet i WO 87/04462, WO 89/01036 og EP 338 841. Når rekombinante ekspresjonsvektorer som koder antistoffgener innføres i en pattedyrvertscelle, så kan antistoffene fremstilles ved å dyrke vertscellene i et tilstrekkelig langt tidsrom til at det skjer en ekspresjon av antistoffet i vertscellene, eller mer foretrukket, at antistoffet skilles ut i det dyrkningsmedium i hvilket vertscellene dyrkes. Antistoffene kan så gjenvinnes fra dyrkningsmediet ved å anvende standard proteinrensemetoder.

Ytterligere rekombinante fremgangsmåter for fremstilling av humane monoklonale antistoffer til IL- 8

Alternativt kan de klonede antistoffene igjen uttrykkes i andre ekspresjons-systemer, inklusive prokaryotiske celler, f.eks. i mikroorganismer som E. coli, for produksjon av scFv-antistoffer, alge-, så vel som innsektceller. Videre kan antistoffene produseres i transgene ikke-humane dyr, så som i melken fra sauer og kaniner eller i egg fra høner, eller i transgene planter. Se f.eks. Verma R. et al.,

(1998) . Antibody engineering: Comparison of bacterial, yeast, insect and mammalian expression systems. J. Immunol. Meth. 216:165-181; Pollock et al.

(1999) . Transgen melk er en fremgangsmåte for produksjon av rekombinante antistoffer. J. Immunol. Meth. 231:147-157; og Fischer R. et al. (1999). Molecular farming of recombinant antibodies in plants. Biol. Chem. 380:825-839.

Anvendelse av delvise antistoffsekvenser for å uttrykke intakte antistoffer

Antistoffer virker sammen med målsøkte antigener i alt vesentlig via aminosyrerester som er plassert i de seks tung- og lettkjede komplementære bestemmende områdene (CDRs). På grunn av dette vil aminosyresekvensene inne i nevnte CDRs være mer diverse mellom individuelle antistoffer enn sekvenser utenfor CDRs. Fordi CDR-sekvensene er ansvarlig for de fleste antistoff - antigeninteraksjonene, er det mulig å uttrykke rekombinante antistoffer som etterligner de egenskaper som forefinnes i de spesifikke naturlig forekommende antistoffene ved å konstruere ekspresj onsvektorer som inkluderer CDR-sekvenser fra det spesifikke og naturlig forekommende antistoff, og pode dette på rammeverksekvenser fra et annet antistoff med andre egenskaper (se f.eks. Riechmann L. et al., 1998, Nature 332:323-327; Jones P. et al., 1986, Nature 321:522-525; og Queen C. et al., 1989, Proe. Nati. Acad. See. USA 86:10029-10033). Slike rammeverksekvenser kan oppnås fra offentlige DNA-databaser som inkluderer kimlinjeantistoffgensekvenser. Disse kimlinjesekvensene vil skille seg fra de mature antistoffgensekvensene ettersom de ikke vil inkludere fullstendig sammensatte variable gener, som er blitt dannet ved V(D)J-forbindelse under B-cellemodning. Kimlinjegensekvensene vil også skille seg fra sekvensene i et høyaffinitetssekundært repertoarantistoff som inneholder mutasjoner i hele det variable genet, men vil typisk være samlet i nevnte CDRs. F.eks. er somatisk mutasjoner relativt lite frekvente i den aminoterminale delen av rammeverksområdet 1, og i den karboksy-terminale delen av rammeverksområdet 4. Videre vil mange somatiske mutasjoner ikke signifikant endre antistoffets bindingsegenskaper. På grunn av dette er det ikke nødvendig å oppnå hele DNA-sekvensen for et spesielt antistoff for å på nytt skape et intakt rekombinant antistoff som har bindende egenskaper av samme type som i det opprinnelige antistoffet (se WO 99/45962). Delvis tung- og lettkjedesekvenser som spenner over CDR-områdene vil typisk være tilstrekkelig for dette formål. Den delvise sekvensen kan anvendes for å bestemme hvilke kimlinjevariable og forbindende gensegmenter som bidrar til de rekombinerte antistoffvariable genene. Kimlinjesekvensen anvendes så for å fylle inn de manglende delene av de variable områdene. Tung- og lettkjedeledersekvenser vil spaltes under proteinmodning og bidrar ikke til det endelige antistoffets egenskaper. For å addere manglende sekvenser, kan klonede cDNA-sekvenser kombineres med syntetiske oligonukleotider ved ligering eller PCR-amplifisering. Alternativt kan hele det variable området syntetiseres som et sett av korte og overlappende oligonukleotider og kombineres ved hjelp av PCR-amplifisering, slik at en får skapt en klon som inneholder hele det syntetiske variable området. Denne fremgangsmåten har visse fordeler, så som at det er mulig å eliminere eller inkludere spesielle restriksjonsseter, eller utføre en optimalisering av spesielle kodoner.

Nukleotidsekvensene fra tung- og lettkjedetranskripter fra et hybridom kan så anvendes for å utforme et overlappende sett av syntetiske oligonukleotider, for derved å skape syntetiske V-sekvenser med identiske aminosyrekodende egenskaper som de naturlige sekvensene. De syntetiske tung- og kappakjedesekvensene kan skille seg fra de naturlige sekvensene på tre måter: strenger av repeterende nukleotidbaser er brutt for å lette oligonukleotidsyntese og PCR-amplifisering; optimale translateringsstartseter er inkorporert ifølge Kozaks regler (Kozak (1991) J. Biol. Chem. 266:19867-19870); og #z'/fcÆII-seter er plassert oppstrøms for translateringsstartsetene.

For både de tung- og lettkjedevariable områdene vil de optimaliserte kodende og tilsvarende ikke-kodende trådsekvensene brytes ned i fra 30-50 nukleotider, omtrent midt på det tilsvarende ikke-kodende oligonukleotidet. For hver kjede kan således oligonukleotider settes sammen til overlappende dobbelttrådede sett som spenner over segmenter på fra 150-400 nukleotider. Samlingen av oligonukleotidene kan så anvendes som templater for å fremstille PCR-amplifiseringsprodukter på fra 150-400 nukleotider. Typisk vil et enkelt variabelt områdeoligonukleotidsett brytes ned til to samlinger som separat amplifiseres for å utvikle to overlappende PCR-produkter. Disse to overlappende produkter kan så kombineres ved PCR-amplifisering for å få dannet det fullstendige variable området. Det kan også være ønskelig å inkludere et overlappende fragment fra det tung- eller lettkjedekonstante området (inklusive Bbsl- setet for kappa lettkjeden, eller Agel- setet for den gamma tungkjeden) i PCR-amplifiseringen, for derved å utvikle fragmenter som lettere kan klones inn i

ekspresjonsvektorkonstruktene.

De rekonstruerte tung- og lettkjedevariable områdene blir så kombinert med en klonet promoter, en ledersekvens, translateringsstartsekvens, konstant område, 3' utranslatert sekvens, polyadenylerings- og transkriberingstermineringssekvenser for å danne ekspresjonsvektorkonstrukter. De tunge og lette kjedeekspresjons-konstruktene kan kombineres i en enkelt vektor, samtransfekteres, serietransfekteres eller separat transfekteres over i vertsceller som så fusjoneres for å danne en vertscelle som uttrykker begge kjedene.

Plasmider som kan anvendes ved konstruksjonen av ekspresjonsvektorer for human IgGic er beskrevet i det etterfølgende. Plasmidene ble konstruert slik at PCR-amplifiserte V-tunge og V-kappa lette kjede cDNA-sekvensene som så kan anvendes for å rekonstruere de fullstendige tunge og lette kjedeminiogenene. Disse plasmidene kan anvendes for å uttrykke fullstendige humane IgGl ,k eller IgG4,Kantistoffer. Lignende plasmider kan konstrueres for ekspresjon av andre tunge kjedeisotyper eller for å uttrykke antistoffer som omfatter lambda lette kjeder.

I et annet aspekt blir således de strukturelle trekk for et humant anti-IL-8-antistoff ifølge oppfinnelsen, f.eks. 10F8, anvendt for å skape strukturelt beslektede humane anti-IL-8-antistoffer som har beholdt minst én funksjonell evne til antistoffene ifølge oppfinnelsen, så som binding til IL-8. Mer spesifikt kan de seks CDRene i 10F8 kombineres rekombinant med kjente humane rammeverks-områder, foruten at CDRs kan anvendes for å skape ytterligere, rekombinant konstruerte humane anti-IL-8-antistoffer ifølge oppfinnelsen.

I en annen utførelse tilveiebringer således oppfinnelsen en fremgangsmåte for å fremstille et anti-IL-8-antistoff som omfatter: å fremstille et antistoff som omfatter (1) humane tungkjederammeverks-områder og humane tungkjede CDRs, hvor minst ett av de humane tungkjede CDRs omfatter en aminosyresekvens valgt fra aminosyresekvensene til de CDRs som er vist på fig. 5 (SEKV. ID nr. 22, 23 eller 24); og (2) humane lettkjederamme-verksområder og humane lettkjede CDRs, hvor minst én av de lettkjede CDRs omfatter en aminosyresekvens valgt fra aminosyresekvensene for CDRs, som er vist på fig. 3 (SEKV. ID nr. 16, 17 eller 18);

hvor antistoffet har beholdt sin evne til å binde seg til IL-8.

Antistoffets evne til å binde seg til IL-8 kan bestemmes ved hjelp av standardbindingsprøver, f.eks. av den type som er beskrevet i de etterfølgende eksempler (f.eks. en ELISA).

Det vises også til anti-IL-8-antistoffer som omfatter et tungkjedevariabelt område og/eller et lettkjedevariabelt område som er homologt til eller avledet fra sin tilsvarende, kimlinjevariabelområdesekvens, f.eks. Vk A-27 kimlinjenukleotidet og de aminosyresekvenser som er vist på fig. 2 og 3 (SEKV. ID nr. 5 og 7 henholdsvis), og/eller Vh 3-33 kimlinjenukleotidet og de aminosyresekvenser som er vist på fig. 4 og 5 (SEKV. ID nr. 9 og 11 henholdsvis), hvilke har beholdt minst én funksjonell evne til antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse, så som binding til IL-8.

Andre spesielle antistoffer binder seg til human IL-8 og omfatter et lettkjedevariabelt område med en aminosyresekvens som er minst 94 % identisk, fortrinnsvis 96 %, og mer foretrukket 97 %, 98 % eller 99 % identisk med den kimlinjeaminosyresekvens som er vist på fig. 3 (SEKV. ID nr. 7) og/eller et tungkjedevariabelt område med en aminosyresekvens som er minst 92 % identisk, fortrinnsvis ca. 94 %, mer foretrukket ca. 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % identisk med den aminosyresekvens som er vist på fig. 5 (SEKV. ID nr. 11). Alternativt kan antistoffene omfatte et lettkjedevariabelt område som kodes av en nukleotidsekvens som er minst ca. 95 % identisk, fortrinnsvis ca. 96 %, mer foretrukket ca. 97 %, 98 % eller 99 % identisk med den kimlinjenukleotidsekvens, som er vist på fig. 2

(SEKV. ID nr. 5) og/eller et tungkjedevariabelt område som kodes av en nukleotidsekvens som er minst 92 % identisk, fortrinnsvis ca. 94 %, mer foretrukket ca. 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % identisk med den nukleotidsekvens, som er vist på fig. 4 (SEKV. ID nr. 9).

Det vises også til humane antistoffer som binder seg til human IL-8 og omfatter et lettkjedevariabelt område avledet fra den Vk A-27-kimlinjeaminosyresekvens som er vist på fig. 3 (SEKV. ID nr. 7), og med en aminosyresekvens som omfatter minst en rest valgt fra gruppen bestående av en isoleucin i posisjon 29, en prolinrest i posisjon 52, nt alaninrest i posisjon 93, en glysinrest i posisjon 94, en leucinrest i posisjon 96, en prolinrest i posisjon 100, en aspartinsyre i posisjon 105 som vist på fig. 3, eller enhver kombinasjon av disse. Alternativt eller i tillegg, kan antistoffene omfatte et tungkjedevariabelt område avledet fra den Vh 3-33 kimlinjeaminosyresekvens som er vist på fig. 5 (SEKV. ID nr. 11), og med en aminosyresekvens som omfatter minst én rest valgt fra gruppen bestående av en glutamin i posisjon 3, en histidinrest i posisjon 31, en tyrosinrest i posisjon 35, en isoleucinrest i posisjon 51, en tyrosinrest i posisjon 57, en asparaginrest i posisjon 60, en alaninrest i posisjon 61, en isoleucinrest i posisjon 70, en asparaginrest i posisjon 74, en glutaminrest i posisjon 82, en argininrest i posisjon 100 og en leucinrest i posisjon 130, som vist på fig. 5, og enhver kombinasjon av disse.

Det vises også til humane anti-IL-8-antistoffer som omfatter et CDR-domene med et humant tung- og lettkjede CDR1-område, et humant tung- og lettkjede CDR2-område og et humant tung- og lettkjede CDR3-område, hvor CDR1, CDR2 og CDR3 tungkjedeområdene er avledet fra den Vh 3-33 kimlinjeaminosyre-sekvensen som er vist på fig. 5 (SEKV. ID nr. 11), eller hvor CDR1, CDR2 og CDR3 lettkjedeområdene er avledet fra den Vk A-27-kimlinjeaminosyresekvensen som er vist på fig. 3 (SEKV. ID nr. 7), og hvor

(a) det CDR1 humane tungkjedeområdet omfatter et histidin og et tyrosinrest i posisjonene 1 og 5 henholdsvis, som vist på fig. 5 (SEKV. ID nr. 22); (b) det CDR2 humane tungkj edeområdet omfatter en leucin-, tyrosin-, asparagin- og alaninrest i posisjonene 2, 8, 11 og 12 henholdsvis, som vist på fig. 5 (SEKV. ID nr. 23); (c) det CDR3 humane tungkj edeområdet omfatter en arginin- og leucinrest i posisjonene 2 og 5 henholdsvis, som vist på fig. 5 (SEKV. ID nr. 24); (d) det CDR1 humane lettkj edeområdet omfatter en isoleucinrest i posisjon 6, slik det er vist på fig. 3 (SEKV. ID nr. 16); (e) det CDR2 humane lettkj edeområdet omfatter en prolinrest i posisjon 2, som vist på fig. 3 (SEKV. ID nr. 17); (f) det CDR3 humane lettkj edeområdet omfatter en tyrosin-, alanin-, glysin-og leucinrest i posisjonene 3, 4, 5 og 6 henholdsvis, som vist på fig. 3 (SEKV. ID nr. 18); og

(g) enhver kombinasjon av (a), (b), (c), (d), (e) eller (f).

Det vises også til humane antistoffer som kan omfatte et humant tung- og lettkjede CDR1-område, et humant tung- og lettkjede CDR2-område og et humant tung- og lettkjede CDR3 -område, hvor CDR1, CDR2 og CDR3 tungkj edeområdene er avledet fra den Vh 3-33-kimlinjeaminosyresekvensen som er vist på fig. 5 (SEKV. ID nr. 11) og/eller hvor de CDR1, CDR2 og CDR3 lettkj edeområdene er avledet fra den VkA-27-kimlinjeaminosyresekvensen som er vist på fig. 3 (SEKV. ID nr. 7), og hvor minst ett av CDR-domenene er valgt fra guppen bestående av: (a) et lettkjede CDR1-område som omfatter en aminosyresekvens som er minst 92 % identisk til den aminosyresekvensen som er vist på fig. 3 (SEKV. ID nr. 16); (b) et lettkjede CDR2-område som omfatter en aminosyresekvens som er minst 86 % identisk med den aminosyresekvensen som er vist på fig. 3 (SEKV. ID nr. 17); (c) et lettkjede CDR3-område som omfatter en aminosyresekvens som er minst 43 % identisk til den aminosyresekvensen som er vist på fig. 3 (SEKV. ID nr. 18); (d) et tungkjede CDR1-område som omfatter en aminosyresekvens som er minst 61 % identisk til den aminosyresekvensen som er vist på fig. 5 (SEKV. ID nr. 22) ; (e) et tungkjede CDR2-område som omfatter en aminosyresekvens som er minst 77 % identisk til den aminosyresekvensen som er vist på fig. 5 (SEKV. ID nr.

23) ; og

(f) et tungkjede CDR3-område som omfatter en aminosyresekvens som er minst 76 % identisk med den aminosyresekvensen som er vist på fig. 5 (SEKV. ID nr. 24); og

(g) enhver kombinasjon av (a), (b), (c), (d), (e) eller (f).

Minst ett av CDR-domenene i de humane antistoffene en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av: (a) aminosyresekvensen i det lettkjedede CDR1-området omfatter en isoleucinrest i posisjon 6, slik det er vist på fig. 3 (SEKV. ID nr. 16); (b) aminosyresekvensen i det lettkj edede CDR2-området omfatter en prolinrest i posisjon 2, slik det er vist på fig. 3 (SEKV. ID nr. 17); (c) aminosyresekvensen i det lettkjede CDR3 -området omfatter et tyrosinrest i posisjon 3, et alaninrest i posisjon 6, en glysinrest i posisjon 5 og en leucinrest i posisjon 7, slik det er vist på fig, 3 (SEKV. ID nr. 18); (d) aminosyresekvensen i det tungkjede CDR1 -området omfatter en histidinrest i posisjon 1 og en tyrosinrest i posisjon 5, slik det er vist på fig. 5 (SEKV. ID nr. 22); (e) aminosyresekvensen i det tungkjede CDR2-området omfatter en isoleucinrest i posisjon 2, en tyrosinrest i posisjon 6, en asparaginrest i posisjon 11 og en alaninrest i posisjon 12, slik det er vist på fig. 5 (SEKV. ID nr. 23); (f) aminosyresekvensen i det tungkjede CDR3-området omfatter en argininrest i posisjon 2 og en leucinrest i posisjon 5, slik det er vist på fig. 5 (SEKV. ID nr. 24); og

(g) enhver kombinasjon av (a), (b), (c), (d) eller (f).

Det vises også til et isolert humant monoklonalt antistoff som binder seg til human IL-8, og omfatter et VlCDR3-domene med følgende aminosyresekvens:

hvor Xi, X2og X3hver representerer en naturlig aminosyrerest, og Xi er forskjellig fra Gly, eller X2er forskjellig fra Ser, eller X3er forskjellig fra Pro.

I ett tilfelle er Xi forskjellig fra Gly, X2er forskjellig fra Ser og X3er forskjellig fra Pro.

I ett ytterligere tilfelle er Xi Ala, X2og X3uavhengig av hverandre Gly, Ala, Val, Leu eller Ile.

Det vises også til et isolert humant monoklonalt antistoff som binder seg til human IL-8, og som omfatter et Vh CDR3-domene med følgende aminosyresekvens:

hvor X4er Lys, Arg eller His, og X5er Gly, Ala, Val, Leu eller Ile.

Det vises også til et isolert humant monoklonalt antistoff som binder seg til human IL-8, og som omfatter et VlCDR3-domene som beskrevet over, og et Vh CDR3-domene slik dette er beskrevet over.

I tillegg eller alternativt til en enkel binding til IL-8, så kan antistoffene slik disse er beskrevet ovenfor, også velges på grunn av sin evne til å beholde andre funksjonelle egenskaper, så som: (1) binding til human IL-8 og hemming av IL-8-induserte proinflammatoriske effekter; (2) hemming av binding til IL-8 og dens reseptorer på nøytrofiler; (3) hemming av IL-8-indusert kjemotaktisk aktivitet for nøytrofiler; (4) hemming av IL-8-indusert kalsiumfluks; (5) hemming av IL-8-induserte forandringer med hensyn til ekspresjonsnivåene for adhesjonsmolekyler og nøytrofiler; (6) binding til human IL-8 og hemming av en IL-8-indusert forsterket ekspresjon av CDllb (Mac-1) og nedsatt ekspresjon av L-selektin på nøytrofiler; (7) ingen kryssreaksjon med relaterte kjemokiner, så som human GRO-a, human GRO-fi, human IP-10 og human NAP-2; (8) binding til human IL-8 med en dissosiasjonslikevektskonstant (KD) på ca.IO"<8>M eller mindre, så somIO"<9>M eller mindre, IO"<10>M eller mindre eller IO"11 M eller enda mindre; og/eller (9) signifikant hemming av den kjemotaksis som er indusert av biologiske væsker som inneholder multiple kjemotaktiske faktorer inklusive IL-8.

Karakterisering av binding av humane monoklonale antistoffer til IL- 8

For å karakterisere binding av humane monoklonale IL-8-antistoffer ifølge oppfinnelsen, ble sera fra immuniserte mus testet, f.eks. ved ELISA. I et typisk (men ikke-begrensende) eksempel på en ELISA-protokoll, ble mikrotitreringsplater belagt med renset IL-8 i en konsentrasjon på 0,25 ug/ml i PBS, og så blokkert med 5 % bovin serumalbumin (BSA) i PBS. Fortynninger i plasma fra IL-8-immuniserte mus ble tilsatt hver brønn og inkubering ble utført i fra 1 -2 timer ved 37°C. Platene ble vasket med PBS/Tween og så inkubert med en geit-anti-human IgG Fc-spesifikk polyklonal reagens konjugert til alkalisk fosfatase i 1 time ved 37°C. Etter vasking ble platene fremkalt med pNPP-substrat (1 mg/ml), og analysert ved OD på 405-650. Mus som hadde de høyeste titer blir fortrinnsvis anvendt ved fusjoner.

En ELISA-prøve slik den er beskrevet ovenfor, kan også anvendes for screening for hybridomer som viser positiv reaktivitet med IL-8-immunogen. Hybridomer som binder seg hurtig og sterkt til IL-8 vil så bli subklonet og ytterligerekarakterisert. En klon fra hvert hybridom, som har beholdt foreldrecellenes reaktivitet (ved ELISA), kan så velges slik at man får fremstilt en cellebank med fra 5-10 ampuller som så lagres ved -140°C og senere anvendes for antistoffrensing.

For å rense humane anti-IL-8-antistoffer kan utvalgte hybridomer dyrkes i 2 liters spinnekolber for monoklonal antistoffrensing. Supernatantene kan filtreres og konsentreres før det utføres en affinitetskromatografi med protein A-sefarose (Pharmacia, Piscataway, NJ). Eluert IgG kan kontrolleres ved gelelektroforese og høytrykks væskekromatografi for å sikre renhet. Bufferløsningen kan byttes til PBS, og konsentrasjonen kan bestemmes ved OD 280 ved å anvende en ekstinksjons-koeffisient på 1,43. De monoklonale antistoffene kan deles i porsjoner og lagres ved -80°C.

For å bestemme hvorvidt de utvalgte humane anti-IL-8-monoklonale antistoffene binder seg til unike epitoper, kan en anvende seterettet eller multi-seterettet mutagenese.

For å bestemme isotypen på de rensede antistoffene kan det utføres en isotype ELISA. F.eks. kan brønnene på mikrotitreringsplater belegges med 10 ug/ml av anti-humant lg over natten ved 4°C. Etter blokkering med 5 % BSA ble platene reagert med 10 ug/ml av monoklonale antistoffer eller renset isotypekontroller ved romtemperatur i 2 timer. Brønnene kan så reageres enten med human IgGl eller humane IgM-spesifikke alkaliske fosfatase-konjugerte prober. Platene kan fremkalles og analyseres som beskrevet ovenfor.

Anti-IL-8-humane IgGs kan testes for sin reaktivitet med IL-8-antigen ved Western blotting. F.eks. kan celleekstrakter fra celler som produserer IL-8 fremstilles og underkastes en natriumdodekylsulfat (SDS) polyakrylamidgelelektroforese. Etter elektroforesen kan de utskilte antigenene overføres til nitrocellulosemembraner, blokkeres med 20 % museserum og probes med de monoklonale antistoffer som skal testes. Human IgG-binding kan påvises ved å anvende anti-human IgG-alkalisk fosfatase og fremkalling med BCIP/NBT-substrattabletter (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO).

II. Produksjon avtransgene ikke- humane dyr som utvikler humane monoklonale anti - IL- 8 - antistoffer

I ennå et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen transgene og transkromosomale ikke-humane dyr, så som transgene eller transkromosomale mus, som er i stand til å uttrykke de humane antistoffene ifølge oppfinnelsen som spesifikt binder seg til IL-8. I en spesiell utførelse tilveiebringer oppfinnelsen en transgen eller transkromosomal mus med et genom som omfatter et humant tungkjedetransgen, slik at musen produserer de humane anti-IL-8-antistoff ifølge oppfinnelsen når den immuniseres med celler som produserer IL-8. Nevnte humane tungkjedetransgen kan integreres i musens kromosomale DNA, noe som er tilfelle for den transgene, f.eks. HuMAb-musen, slik det detaljert er beskrevet her og eksemplifisert i det etterfølgende. Alternativt kan det humane tungkjedetransgenet plasseres ekstra kromosomalt, noe som er tilfelle for transkromosomale (f.eks. KM) mus. I KM-musestammen kan mer spesielt det endogene mus kappa lettkjedegenet være homozytog brutt slik det er beskrevet i Chen et al. (1993) EMBO J. 12:811-820, og det endogene muse tungkjedegenet være homozygot brutt slik det er beskrevet i eksempel 1 i WO 01/09187. Denne musestammen bærer et humant kappa lettkjedetransgen, KCo5, slik det er beskrevet i Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851. Denne musestammen bærer også et humant tungkjedetranskromosom som er sammensatt av kromosom 14-fragmentet hCF (SC20), slik det er beskrevet i WO 02/43478.

Slike transgene og transkromosomale dyr er i stand til å produsere multiple isotyper av humane monoklonale antistoffer til IL-8 (f.eks. IgG, IgA og/eller IgE) ved å gjennomgå en V-D-J/V-J-rekombinasjon og isotypeskifte.

Designet av et transgent eller transkromosomalt ikke-humant dyr som reagerer på fremmed antigenstimulering med et heterologt antistoffrepertoar, krever at de heterologe immunoglobulintransgenene som forefinnes i det transgene dyret, fungerer riktig gjennom hele utviklingen av B-cellene. Dette inkluderer f.eks. en isotypeskifte av det heterologe tungkjedetransgenet. Følgelig er transgenene konstruert slik at isotypeskifte kan induseres, og én eller flere av de følgende egenskaper til antistoffgenene: (1) høyt nivå og celletypespesifikk ekspresjon, (2) funksjonell genomleiring, (3) aktivering av og respons på allelisk eksklusjon, (4) ekspresjon av tilstrekkelig primært repertoar, (5) signaloverføring, (6) somatisk hypermutasjon og (7) dominering av det transgene antistofflokus under immunreaksj onen.

Det er ikke nødvendig at alle de forannevnte kriterier oppfylles. I de utførelser hvor det endogene immunoglobulinloki i det transgene dyret er funksjonelt brutt, så er det f.eks. ikke nødvendig at transgenet aktiverer allelisk eksklusjon. Videre, i de utførelser hvor transgenet omfatter et funksjonelt rearrangert tung- og/eller lettkj edeimmunoglobulingen, så vil det andre kriterium med hensyn til funksjonell genomleiring være unødvendig, i et minste for det transgenet som allerede er rearrangert. For mer innsikt i molekylær immunologi, se Fundamental Immunology, 2. utgave (1989), Paul William E., red. Raven Press,

N.Y.

I visse utførelsesformer vil de transgene eller transkromosomale ikke-humane dyrene, som anvendes for å utvikle de humane monoklonale antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse, inneholde rearrangerte, ikke-rearrangerte eller en kombinasjon av rearrangerte og ikke-rearrangerte heterologe immunoglobulin tung-og lettkj ede-transgener i kimlinjen for det transgene dyret. Hver av de tungkjedetransgene vil omfatte minst et CH-gen. I tillegg kan det tungkjede transgenet inneholde funksjonelle isotypeskiftesekvenser, som er i stand til å understøtte eller stimulere isotypeskifte for et heterologt transgen som koder multiple CH-gener i det transgene dyrets B-celler. Slike vekselsekvenser kan være de som opptrer naturlig i kimlinjeimmunoglobulinlokuset for den art som tjener som kilde for de transgene Cn-genene, eller slike vekselsekvenser kan være avledet fra de som opptrer i arter som skal motta transgenkonstruktet (det transgene dyret). F.eks. kan et humant transgenkonstrukt som anvendes for å fremstille en transgen mus, gi en høy frekvens av isotypeskifte hvis det inkorporerer vekselsekvenser som er lik de som opptrer naturlig i musens tungkjedelokus, noe som sannsynligvis gjør at mus eveks el sekvens ene blir optimalisert slik at de fungerer sammen med vekselrekombinaseenzymsystemet til musen, mens dette ikke er tilfelle for de humane vekselsekvensene. Vekselsekvenser kan isoleres og klones ved hjelp av vanlige kjente kloningsmetoder, eller kan syntetiseres de novo fra overlappende syntetiske oligonukleotider som er utformet på basis av publisert sekvens-informasjon som angår immunoglobulinvekselområdesekvenser (Mills et al., Nucl. AcidsRes. 15:7305-7316 (1991); Sideras et al., Intl. Immunol. 1:631-642 (1989)). For hvert av de foregående transgene dyrene så vil de funksjonelt omleirede heterologe tung- og lettkjede immunoglobulintransgenene finnes i en signifikant andel av B-cellene i det transgene dyret (i minst 10 %).

De transgenene som anvendes for å utvikle de transgene ikke-humane dyrene ifølge oppfinnelsen innbefatter et tungkjedetransgen som omfatter DNA som koder minst ett variabelt gensegment, et diversitetsgensegment, et forbindende gensegment og minst ett konstant områdegensegment. Immunoglobulin lettkjedetransgenet omfatter DNA som koder minst ett variabelt gensegment, et forbindende gensegment og minst ett konstantområde gensegment. De gensegmentene som koder de lette og tunge kjedegensegmentene er heterologe for det transgene dyret, ettersom de er avledet fra, eller tilsvarer det DNA som koder immunoglobulin tung- og lettkjede gensegmentene, er fra arter som er forskjellig fra det transgene ikke-humane dyret. I ett aspekt av oppfinnelsen er transgenet konstruert slik at de individuelle gensegmentene er uomleirede, dvs. at de ikke er rearrangert eller endret slik at de koder en funksjonell immunoglobulin lett eller tung kjede. Slike uomleirede transgener vil stimulere rekombinasjon av V-, D- og J-gensegmentene (funksjonell omleiring), og fortrinnsvis stimulere inkorporering av hele eller en del av et D-områdegensegment i den resulterende omleirede immunoglobulintungekjeden inne i det transgene dyret når dette ekspanderes for et IL-8-antigen.

I en alternativ utførelse vil transgenene omfatte et ikke-rearrangert "minilokus". Slike transgener vil typisk omfatte en vesentlig del av C-, D- og J-segmentene så vel som et undersett av V-gensegmentene. I slike transgenkonstrukter vil de forskjellige regulerende sekvensene, f.eks. promotere, forsterkere, klasseveksel-områder, spleise-donor- og spleise-akseptorsekvenser for RNA-bearbeiding, rekombineringssignaler og lignende, omfatte tilsvarende sekvenser som er avledet fra det heterologe DNA. Slike regulerende sekvenser kan inkorporeres i transgenet fra den samme arten eller fra en nærstående art til det ikke-humane dyret som anvendes i oppfinnelsen. F.eks. kan humane immunoglobulin-segmenter kombineres i et transgen med en gnagerimmunoglobulin-forsterker-sekvens for anvendelse i en transgen mus. Alternativt kan syntetiske regulerende sekvenser inkorporeres i transgenet, og hvor slike syntetiske regulerende sekvenser ikke er homologe med en funksjonell DNA-sekvens, som er kjent for å opptre naturlig i pattedyrenes genomer. Syntetiske regulerende sekvenser er utformet ifølge konsensusregler, f.eks. slike som spesifiserer mulige og tillatte sekvenser for et spleise-akseptorsete eller et promoter-forsterkermotiv. F.eks. kan et minilokus omfatte en del av det genomiske immunglobulinlokuset som har minst én intern (dvs. ikke ved terminus i delen) delesjon av en ikke-essensiell DNA-del (f.eks. mellomliggnede sekvens; intron eller en del av denne) sammenlignet med det naturlig forekommende kimlinje Ig-lokus.

Foretrukne transgene og transkromosomale ikke-humane dyr, f.eks. mus, vil kunne oppvise en immunoglobulinproduksjon med et signifikant repertoar, ideelt i alt vesentlig lik det som skjer i et menneske etter justering for volum.

Repertoaret vil ideelt ligge nær opptil det som vises i et menneske når det justeres for volum, vanligvis med en diversitet på minst 10 % eller mer, fortrinnsvis 25-50 % eller mer. Generelt vil minst 1000 forskjellige immunoglobuliner (ideelt IgG), fortrinnsvis IO4 eller IO<6>eller flere, bli produsert avhengig av antallet forskjellige V-, J- og D-områder som er innført i musegenomet, og som drives ytterligere av den diversitet som er utviklet ved V(-D-)J-gensegmentrearrangering og vilkårlige nukleotidadderinger i de forbindende områdene. Typisk vil immunoglobulinet ha en affinitet (KD) for forvalgte antigener på ca. 10"<10>M eller enda lavere.

Transgene og transkromosomale ikke-humane dyr, f.eks. mus, slik det er beskrevet ovenfor, kan f.eks. immuniseres med f.eks. celler som produserer IL-8. Alternativt kan de transgene dyrene immuniseres med DNA som koder human IL-8. Dyrene ville så produsere B-celler som gjennomgår klasseskifte via vekselrekombinasjon (cis-skifte) og uttrykke immunoglobuliner som er reaktive med IL-8. Immuno-globulinen vil være humane antistoffer (også betegnet som "humane sekvens-antistoffer"), hvor de tung- og lettkjedepolypeptidene er kodet av humane transgensekvenser, som kan inkludere sekvenser som er avledet eller fremstilt ved hjelp av somatisk mutasjon og V-områderekombinatoriske sammenknytnings-punkter, så vel som kimlinje-kodede sekvenser; og disse humane antistoffene kan betegnes som i alt vesentlig identiske til en polypeptidsekvens som er kodet av humane Vlog Jl eller Vh, Dhog Jhgensegmenter, skjønt andre ikke-kimlinjesekvenser kan være tilstede som et resultat av somatisk mutasjon og differensiell V-J- og V-D-J-rekombinasjonstilknytningspunkter. De variable områdene i hver antistoffkjede er typisk minst 80 % lik de humane kimlinjer V- og J-gensegmentene, og i forbindelse med tunge kjeder, humane kimlinjer V-, D- og J-gensegmenter, ofte minst 85 % lik de humane kimlinjesekvenser som er tilstede på transgenet; og ofte 90 eller 95 % eller mer lik de humane kimlinjesekvenser som er tilstede på transgenet. Ettersom ikke-kimlinjesekvenser er innført med somatisk mutasjon og VJ- og VDJ-forening, så vil imidlertid de humane sekvensantistoffene ofte ha noen variable områdesekvenser som ikke er kodet av de humane V-, D- eller J-gensegmenter som finnes i det eller de humane transgenene som forefinnes i kimlinjen hos musene. Typisk vil slike ikke-kimlinjesekvenser (eller individuelle nukleotidposisjoner) ofte ligge i grupper eller klynger i eller nær CDRs, eller i områder hvor det er kjent at somatiske mutasjoner ofte forekommer.

Et annet aspekt av oppfinnelsen innbefatter B-celler som er avledet fra transgene eller transkromosomale ikke-humane dyr slik disse er beskrevet her. B-cellene kan anvendes for å utvikle hybridomer som uttrykker humane monoklonale antistoffer som med høy affinitet binder seg til human IL-8. I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen således et hybridom som produserer et humant antistoff med en affinitet (KD) på ca. 10"<10>M eller mindre, når dette er bestemt ved overflateplasmonresonans (SPR) teknologi i et BIACORE 3000 instrument ved å anvende rekombinant human IL-8 som analytt og antistoffet som ligand, eller bestemt ved en scatchard-analyse av IL-8-uttrykkende celler ved å anvende et radioaktivt merket monoklonalt antistoff, eller ved å bestemme den halvmaksimale bindende konsentrasjonen ved å anvende faksanalyse.

Det monoklonale antistoffet slik det er beskrevet her, omfatter en human sekvens lett kjede sammensatt av (1) et lettkjedevariabelt område med en polypeptidsekvens som i alt vesentlig er identisk med en polypeptidsekvens som er kodet av et humant VL-gensegment og et humant JL-segment, og (2) et lett kjedekonstant område som er kodet av et humant CL-gensegment; og en human sekvens tung kjede sammensatt av (1) et tung kjede variabelt område med en polypeptidsekvens som i alt vesentlig er identisk med en polypeptidsekvens som kodes av et humant Vn-gensegment, et D-område og et humant Jn-segment, og (2) et konstant område som kodes av et humant CH-gensegment

Utviklingen av humane monoklonale antistoffer med høy affinitet mot IL-8, kan forenkles ved en fremgangsmåte for å utvide repertoaret for de humane variable område-gensegmentene i et transgent ikke-humant dyr som har et genom som omfatter et integrert humant immunoglobulintransgen, og hvor nevnte fremgangsmåte omfatter at det innføres i genomet et V-gentransgen som omfatter V-områdegensegmenter, som ikke er tilstede i nevnte integrerte humane immunoglobulintransgen. Ofte vil V-områdetransgenet være et gjærkunstig kromosom (YAC) som omfatter en del av en human Vh eller Vl(Vk) gensegmentmatrise, som kan opptre naturlig i et humant genom, eller kan være spleiset sammen separat ved rekombinante metoder, som kan innbefatte V-gensegmenter som ikke ligger i rekkefølge eller som er utelatt. Ofte vil minst fem eller flere V-gensegmenter forekomme i nevnte YAC. I denne varianten er det mulig å fremstille et transgent dyr fremstilt ved V-repertoarekspansjons-metoden, hvor dyret uttrykker en immunoglobulinkjede som omfatter en variabel områdesekvens som kodes av et V-områdegensegment som er tilstede på V-områdetransgenet, og et C-område som kodes av det humane IgG-transgenet. Ved hjelp av V-repertoarekspansjonsmetoden, kan det utvikles transgene dyr med minst fem distinkte V-gener; og det samme er tilfelle med dyr som kan inneholde opptil minst 24 V-gener eller flere. Enkelte V-gensegmenter kan være ikke-funksjonelle (f.eks. pseudogener og lignende); og disse segmentene kan være beholdt eller kan selektivt være fjernet ved rekombinante metoder hvis dette er ønskelig.

Så snart musekimlinjen er blitt endret slik at den inneholder et funksjonelt YAC med et utvidet V-segmentrepertoar, noe som i alt vesentlig ikke er tilstede i det humane Ig-transgenet som inneholder J- og C-gensegmentene, så kan denne egenskapen oppformeres og avles over i andre genetiske enheter, så som enheter hvor den funksjonelle YAC med et utvidet V-segmentrepertoar, avles inn i en ikke-human dyrekimlinje med et annet humant lg-transgen. Multiple funksjonelle YACs med utvidet V-segmentrepertoar kan avles over i en kimlinje for der å kunne virke sammen med et humant Ig-transgen (eller multiple humane lg-transgener). Skjønt de her er betegnet som YAC-transgener, så kan slike transgener når de er integrert i genomet, i alt vesentlig mangle gjærsekvenser, f.eks. slike sekvenser som er nødvendig for autonom replikasjon i gjær; og slike sekvenser kan eventuelt være fjernet ved genetisk manipulering (f.eks. restriksjonskutting og pulsfeltgel-elektroforese eller andre egnede metoder), ettersom replikasjon i gjær ikke nå lenger er nødvendig (dvs. før innføring i en muse ES-celle eller musprozygot). Fremgangsmåter for oppformering av nevnte egenskap med hensyn til human sekvensimmunoglobulinekspresjon, innbefatter at en avler transgene dyr med det humane Ig-transgenet (eller gener), og eventuelt også har en funksjonell YAC med et utvidet V-segmentrepertoar. Både Vh- og VL-gensegmenter kan være tilstede på YAC. Det transgene dyret kan så oppavles slik at en kan overføre dets genetiske egenskaper til andre dyr som inneholder andre humane transgener, inklusive humane Ig-transgen er og/eller transgener som koder andre humane lymfocyttproteiner. Oppfinnelsen tilveiebringer også et høyaffinitets humant sekvensimmunoglobulin som er produsert av en transgen mus med et utvidet V-områderepertoar YAC-transgen. Skjønt det ovenfor er beskrevet en foretrukken utførelse av det transgene dyret ifølge oppfinnelsen, så er det mulig å tenke seg også andre utførelser som kan klassifiseres i tre kategorier: I. transgene dyr som inneholder et ikke-rearrangert tungt og ikke-rearrangert lettkj ede immunoglobulintransgen; II. transgene dyr som inneholder et ikke-rearrangert tungt og ikke-rearrangert lettkj edeimmunoglobulintransgen; og III. transgene dyr som inneholder et rearrangert tungt og et rearrangert lettkjedeimmunoglobulintransgen.

Av disse kategorier av transgene dyr så er den foretrukne rekkefølgen som følger II > I > III, hvor de endogene lettkjedegenene (eller i det minste K-genet) er blitt slått ut ved homolog rekombinasjon (eller ved en annen fremgangsmåte), og I > II > III, hvor de endogene lettkj edegenene ikke er blitt slått ut, og må domineres ved allelisk eksklusjon.

III. Farmasøytiske sammensetninger

I et annet aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en sammensetning, f.eks. en farmasøytisk sammensetning, som inneholder minst ett humant monoklonalt antistoff ifølge oppfinnelsen, opparbeidet med en farmasøytisk akseptabel bærer. I én utførelse inneholder sammensetningen en kombinasjon av multiple (f.eks. to eller flere) isolerte humane antistoffer ifølge oppfinnelsen. Hvert av antistoffene i sammensetningen vil fortrinnsvis binde seg til en distinkt, på forhånd valgt epitop av IL-8.

Farmasøytiske sammensetninger ifølge oppfinnelsen kan også administreres i kombinasjonsterapi, dvs. sammen med andre midler. F.eks. kan kombinasjons-terapien omfatte en sammensetning ifølge foreliggende oppfinnelse med minst ett middel for å behandle inflammatoriske eller hyperproliferative hudlidelser, og minst ett anti-inflammatorisk middel, og minst ett immunosupresivt middel eller minst ett kjemoterapeutisk middel.

I én utførelse vil slike terapeutiske midler innbefatte ett eller flere midler ved behandling av inflammatoriske eller hyperproliferative hudlidelser, så som topiske medikamenter, inklusive kulltjære, A-vitamin, antralin, kalsipotrien, tarazoten og kortikosteroider, orale eller injiserte medikamenter så som kortikosteroider, metotreksat, retinoider, f.eks. acitretin, syklosporin, etanercept, alefacept, efalizumab, 6-tioguanin, mykofenolat mofetil, takrolimus (FK-506) og hydroksyurea. Andre eksempler er CTLA4Ig og infliximab. Andre behandlinger kan omfatte eksponering for sollys eller fototerapi, inklusive UVB (bredbånd eller smalbånd ultrafiolett B), UVA (ultrafiolett A) og PUVA (psoralenmetoksalen pluss ultrafiolett A).

I en ytterligere utførelse blir sammensetningen ifølge oppfinnelsen administrert sammen med to eller flere av de ovennevnte terapier, så som metotreksat + fototerapi (PUVA eller UVA); metotreksat + acitretin; acitretin + fototerapi (PUVA eller UVA); metotreksat + acitretin + fototerapi (PUVA eller UVB); hydroksyurea + fototerapi (PUVA eller UVB); hydroksyurea + acitretin; syklosporin + metotreksat; eller kalsipotrien + fototerapi (UVB).

I en annen utførelse vil slike terapeutiske midler innbefatte ett eller flere antiinflammato riske midler, så som et steroidalt medikament eller et NS AID (ikke-steroidalt antiinflammatorisk medikament). Foretrukne midler innbefatter f.eks. aspirin og andre salisylater, Cox-2-hemmere, så som rofecoxib og celecoxib, NSAIDs, så som ibuprofen, fenoprofen, naproksen, sulindak, diklofenak, piroksykam, ketoprofen, diflunisal, nabumeton, etodolak, oksaprozin og indometacin.

I en annen utførelse vil slike terapeutiske midler innbefatte én eller flere DMARDs (sykdomsmodifiserende antireumatiske medikamenter), så som metotreksat, hydroksyklorquin, sulfaasalin, pyrimidinsyntesehemmere, f.eks. leflunomid, IL-l-reseptorblokkerende midler, f.eks. anakinra, og TNF-oc-blokkerende midler, f.eks. etanersept, infliximab og adalimumab. Ytterligere representative midler er IL-10, anti-IL-15-antistoffer, løselig IL-15R og anti-CD20-antistoffer.

I en annen utførelse kan slike terapeutiske midler innbefatte ett eller flere immunosuppressive midler, så som syklosporin, azatioprin, mykofenolsyre, mykofenolat mofetil, kortikosteroider, så som prednison, metoktreksat, gullsalter, sulfasalazin, antimalariamidler, brequinar, leflunomid, mizoribin, 15- deoksyspergualin, 6-merkaptopurin, syklofosfamid, rapamycin og takrolimus (FK-506).

I en annen utførelse vil sammensetningen ifølge oppfinnelsen administreres i kombinasjon med to eller flere immunosupressive midler, så som prednison og syklosporin; prednison, syklosporin og azotioprin; eller prednison, syklosporin og mykofenolat mofetil.

I en annen utførelse vil slike terapeutiske midler innbefatte ett eller flere kjemoterapeutiske midler så som doksorubisin, cisplatin, bleomycin, karmustin, suklofosfamid og klorambucil.

I en ytterligere utførelse vil de foreliggende humane monoklonale antistoffene bli administrert i samband med radioterapi.

I en ytterligere utførelse kan de humane antistoffene ifølge oppfinnelsen administreres i kombinasjon med ett eller flere andre antistoffer, f.eks. ett eller flere humane antistoffer så som f.eks. anti-CD4-antistoffer, anti-EGFr-antistoffer, anti-CD20-antistoffer, anti-IL15-antistoffer eller anti-IL15R-antistoffer.

I en enda ytterligere utførelse kan de humane antistoffene ifølge oppfinnelsen administreres i kombinasjon med ett eller flere midler som blokkerer eller påvirker funksjonen av CC- eller CXC-kjemokinreseptorer, så som antistoffer til CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2 eller CCR5, eller naturlige eller syntetiske molekyler som virker som kjemokinreseptorantagonister.

I en ytterligere utførelse kan de humane antistoffene ifølge oppfinnelsen administreres i kombinasjon med ett eller flere midler som blokkerer funksjonen til kjemokinligander, så som antistoffer til MIP-la, MIP-lp, RANTES, MCP-1, MCP-2, MCP-3 eller MCP-4.

Videre kan de humane anti-IL-8-antistoffene ifølge oppfinnelsen derivatiseres, forbindes eller uttrykkes sammen med andre bindende forbindelser eller midler. I en spesiell utførelse tilveiebringer oppfinnelsen et bispesifikt eller multispesifikt molekyl som omfatter minst én bindende enhet for IL-8 (f.eks. et humant anti-IL-8-antistoff eller en etterligning av dette), og en annen bindende enhet eller forbindelse eller middel for en human effektorcelle, så som en bindende enhet, stoff eller forbindelse for en Fc-reseptor (f.eks. en human Fcy-reseptor, så som FcyRI, eller en human Fca-reseptor), eller en T-cellereseptor, f.eks. CD3.

Den følgende oppfinnelsen innbefatter følgelig bispesifikke og multispesifikke molekyler som binder seg både til human IL-8 og til en Fc-reseptor eller en T-cellereseptor, f.eks. CD3. Eksempler på Fc-reseptorer er f.eks. en human IgG-reseptor, f.eks. en Fcy-reseptor (FcyR), så som FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), og FcyRIII (CD16). Andre Fc-reseptorer, så som humane lg A-reseptorer (f.eks. FcaRI), kan også være et mål ved behandlingen. Fc-reseptoren er fortrinnsvis plassert på overflaten av en effektorcelle, f.eks. en monocytt, makrofag eller en aktivert mononukleær celle. I en foretrukket utførelse binder de bispesifikke og multispesfikke molekylene seg til en Fc-reseptor i en posisjon eller sete som er distinkt fra immunoglobulin Fc (f.eks. IgG eller IgA) bindingssetet for reseptoren. Bindingen til de bispesifikke og multispesifikke molekylene vil derfor ikke bli blokkert av fysiologiske nivåer av immunoglobuliner.

Med begrepet "farmasøytisk akseptabel bærer" slik det anvendes her forstås ethvert og alle typer løsemidler, dispergerende media, belegg, antibakterielle og antisoppmidler, isotonisitets- og absorpsjonsforsinkende midler, og lignende som er fysiologisk forenlige. Det er foretrukket at bæreren er egnet for intravenøs, intramuskulær, sub kutan, parenteral, spinal eller epidermal administrering (f.eks. ved injeksjon eller infusjon).

Et "farmasøytisk akseptabelt salt" refererer seg til et salt som har beholdt den forønskede biologiske aktiviteten til foreldre- eller utgangsforbindelsen, og som ikke utøver noen uønskede toksikologiske effekter (se f.eks. Berge S.M., et al.

(1977) J. Pharm Sei. 66:1-19). Eksempler på slike salter innbefatter syreaddisjonssalter og baseaddisjonssalter. Syreaddisjonssalter innbefatter de som er avledet eller fremstilt fra ikke-toksiske uorganiske syrer, så som saltsyre, salpetersyre, fosforsyre, svovelsyre, hydrobromsyre, hydrojodsyre, fosforsyrer og lignende, så vel fra ikke-toksiske organiske syrer så som alifatiske mono- og dikarboksylsyrer, fenyl-substituerte alkanoinsyrer, hydroksyalkanoinsyrer, aromatiske syrer, alifatiske og aromatiske sulfonsyrer og lignende. Baseaddisjonssalter innbefatter de som er avledet av jordalkalimetaller, så som natrium, kalium, magnesium, kalsium og lignende, så vel som fra ikke-toksiske organiske aminer så som en N,N' -dibenzyletylendiamin, N-metylglukamin, klorprokain, cholion, dietanolamin, etylendiamin, prokain og lignende.

En sammensetning ifølge foreliggende oppfinnelse kan administreres på en rekke forskjellige måter slik dette er velkjent for en behandlende lege. Det er innlysende at vei og/eller type av administrering vil variere alt ettersom de resultater som er ønskelige. De aktive forbindelsene kan fremstilles med bærere som beskytter forbindelsen mot rask frigjøring, så som et kontrollert frigjørende preparat, inklusive implanteringer, transdermale plastere og mikroinnkapslede tilførselssystemer. Bionedbrytbare og bioforenlige polymerer kan anvendes, så som etylenvinylacetat, polyanhydrider, polyglykolinsyre, kollagen, polyortoestere og polymelkesyre. Det er generelt kjent mange fremgangsmåter for fremstilling av slike preparater, se f.eks. Substained and ControlledRelease Drug Delivery System, J.R. Robinson, red., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

For å administrere en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse via visse administrasjons veier, så kan det være nødvendig å belegge forbindelsen med eller administrere den sammen med et stoff eller et middel som hindrer dets inaktivering. F.eks. kan forbindelsen administreres en pasient i en passende bærer, f.eks. liposomer eller et fortynningsmiddel. Farmasøytisk akseptable fortynningsmidler innbefatter saltløsninger og vandige bufferløsninger. Liposomer innbefatter vann-i-olje-i-vann CGF-emulsjoner så vel som vanlige liposomer (Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7:27).

Farmasøytisk akseptable bærere innbefatter sterile vandige løsninger eller dispersjoner eller sterile pulvere for ekstratemporær fremstilling av sterile injiserbare løsninger eller dispersjoner. Anvenden av slike media og midler for farmasøytisk aktive stoffer er velkjent. Bortsett fra de tilfeller hvor vanlige media eller midler er uforenlige med den aktive forbindelsen, så kan en tenke seg bruk av alle farmasøytiske sammensetninger ifølge oppfinnelsen. Supplerende aktive forbindelser kan også inkorporeres i sammensetningene.

Terapeutiske sammensetninger må typisk være sterile og stabile ved de betingelser som anvendes ved fremstilling og lagring. Sammensetningen kan opparbeides som en løsning, mikroemulsjon, som en liposom eller andre ordnede former som er egnet for høy konsentrasjon av den aktive bestanddel. Bæreren kan være et løsemiddel eller en dispersjon som f.eks. inneholder vann, etanol, polyol (f.eks. glyserol, propylenglykol og flytende polyetylenglykol og lignende), eller egnede blandinger av disse. Passende fluiditet kan f.eks. opprettholdes ved å anvende et belegg så som lecitin, ved å opprettholde den nødvendige eller ønskede partikkelstørrelsen i forbindelse med dispersjoner, eller ved å anvende overflateaktive midler. I mange tilfeller vil det være foretrukket å anvende isotonisitetsmidler, f.eks. sukre, polyalkoholer så som glyserol, mannitol, sorbitol eller natriumklorid i sammensetningen. Forlenget absorpsjon av injiserbare sammensetninger kan frembringes ved at sammensetningen inkluderer et middel som forsinker absorpsjonen, f.eks. monostearatsalter og gelatin.

I én utførelse kan de humane monoklonale antistoffene ifølge oppfinnelsen administreres i krystallinsk form ved subkutan injeksjon, konfr. Yang et al. (2003) PNAS, 100(12):6934-6939.

Sterile injiserbare løsninger kan fremstilles ved at den aktive forbindelsen inkorporeres i den nødvendige mengde av et passende løsemiddel med én eller flere av de kombinasjonsbestanddeler som er nevnt ovenfor alt etter behov, fulgt av sterilisering ved mikrofiltrering. Generelt vil dispersjonen fremstilles ved at den aktive forbindelsen inkorporeres i en steril bærevæske som inneholder et grunnleggende dispergerende medium og de nødvendige andre ingredienser slik disse er nevnt ovenfor. I forbindelse med sterile pulvere for fremstilling av sterile injiserbare løsninger, så vil de foretrukne fremstillingsmetodene være vakuumtørking og frysetørking (lyofilisering), som gir et pulver av den aktive bestanddelen pluss eventuelle andre ønskelige ingredienser fra en på forhånd sterilfiltret løsning.

Doseringsregimene justeres slik at en får den optimalt forønskede respons (f.eks. en terapeutisk respons). F.eks. er det mulig å administrere én enkelt bolus, flere oppdelte doser kan også administreres over tid, eller dosen kan proporsjonalt reduseres eller økes alt etter hvorledes den terapeutiske situasjonen utvikler seg. Det er spesielt fordelaktig å opparbeide parenterale sammensetninger i doseringsenhetsform for lettere å kunne administrere en ensartet dose. Doseringsenhetsformer slik det anvendes her refererer seg til fysisk diskrete enheter som er egnet for enhetsdoser for pasienter som skal behandles, og hvor hver enhet inneholder en forutbestemt mengde av en aktiv forbindelse som er beregnet slik at den gir den forønskede terapeutiske effekt i assosiasjon med den forønskede eller nødvendige farmasøytiske bæreren. Spesifikajon med hensyn til doseringsenhetsformer ifølge oppfinnelsen er fastlagt ved og direkte avhengig av (a) de enestående egenskapene til den aktive forbindelsen og den spesielle terapeutiske effekt som ønskes oppnådd, og (b) de kjente begrensninger som foreligger med hensyn til en slik aktiv forbindelse ved behandling av sensitivitet i enkelte pasienter. Eksempler på farmasøytisk akseptable antioksidanter innbefatter: (1) vannløselige antioksidanter så som askorbinsyre, cysteinhydroklorid, natriumbisulfat, natriummetabisulfitt, natriumsulfitt og lignende; (2) oljeløselige antioksidanter så som askorbylpalmitat, butylert hydroksyanisol (BHA), butylert hydroksytoluen (BHT), lecitin, propylgallat, alfa-tokoferol og lignende; og (3) metallgelaterende midler så som sitronsyre, etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), sorbitol, tartarsyre, fosforsyre og lignende.

Terapeutiske sammensetninger ifølge oppfinnelsen innbefatter også de som er egnet for oral, nasal, topisk (inklusive bukkal og sublingual) rektal, vaginal og/eller parenteral administrering. Preparatene kan hensiktsmessig være i enhetsdoseform og kan fremstilles ved enhver fremgangsmåte som er kjent innen den farmasøytiske industri. Den mengde av den aktive forbindelse som kombineres med bæreren for å få fremstilt en enkelt doseringsform, vil være avhengig av den pasient som behandles og den spesielle administrasjonsvei som anvendes. Mengden av aktiv forbindelse som kan kombineres med en bærer for derved å få fremstilt en enkelt doseringsform, vil generelt være den mengde av sammensetningen som gir en terapeutisk effekt. Ut av 100 % så vil denne mengden generelt variere fra 0,01 % til ca. 99 % aktiv bestanddel, fortrinnsvis fra 0,1 % til ca. 70 %, og mest foretrukket fra ca. 1 % til ca. 30 %.

Preparater ifølge foreliggende oppfinnelse som er egnet for vaginal administrering innbefatter også pessarier, tamponger, kremer, geler, pastaer, skum og spraypreparater som inneholder bærere av velkjent type. Doseringsformer for topikal eller transdermal administrering av sammensetningen ifølge oppfinnelsen innbefatter pulvere, spray, salver, pastaer, kremer, hudvann, geler, løsninger, plastere og inhaleringspreparater. Den aktive forbindelsen kan under sterile betingelser blandes med en farmasøytisk akseptabel bærer og alt etter behov med eventuelle konserveringsmidler, buffere eller drivmidler.

Begrepene "parenteral administrering" og "administrert parenteralt" slik det anvendes her innbefatter typer av administrering som er forskjellig fra enteral eller topikal administrering, generelt ved injeksjon eller infusjon, og innbefatter uten begrensning, intravenøs, intramuskulær, intraarteriell, intratracheal, intrakapsulær, intraorbital, intrakardial, intradermal, intraperitoneal, transtracheal, subkutan, subkutikulær, intraartikulær, subkapsulær, subaraknoid, intraspinal, epidural og intrasternal injeksjon og infusjon.

Eksempler på egnede vandige og ikke-vandige bærere som kan anvendes i farmasøytiske sammensetninger ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter vann, etanol, polyoler (så som glyserol, propylenglykol, polyetylenglykol og lignende), og egnede blandinger av disse, vegetabilske oljer så som olivenolje og injiserbare organiske estere, så som etyloleat. Passende fluiditet kan opprettholdes f.eks. ved å anvende beleggende materialer så som lecitin, eller ved å opprettholde den nødvendige partikkelstørrelse i forbindelse med dispersjoner, eller ved å anvende overflateaktive midler.

Sammensetningene kan også inneholde adjuvanter så som konserveringsmidler, fuktemidler, emulgeringsmidler og dispergeringsmidler. Et nærvær av mikroorganismer kan hindres ved å sikre både passende sterilisering slik dette er nevnt ovenfor, eller ved å tilsette forskjellige antibakterielle eller antisoppmidler, f.eks. paraben, klorbutanol, fenol, sorbinsyre og lignende. Det kan også være ønskelig å tilsette isotone midler så som sukre, natriumklorid og lignende til sammensetningene. I tillegg kan en forlenget absorpsjon av den injiserbare farmasøytiske formen tilveiebringes ved å tilsette midler som forsinker absorpsjon, så som aluminiummonostearat og gelatin.

Når forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse administreres som farmasøytika til mennesker og dyr, så kan de gis alene eller som en farmasøytisk sammensetning som kan inneholde fra f.eks. 0,01-99,5 % (mer foretrukket fra 0,1-90 %) av den aktive bestanddelen i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer.

Uansett hvilken administrasjonsvei som velges, så vil forbindelsene i foreliggende oppfinnelse som kan anvendes i en egnet hydratisert form, og/eller som farmasøytiske sammensetninger ifølge foreliggende oppfinnelse, opparbeides i farmasøytisk akseptable doseringsformer ved hjelp av velkjente fremgangsmåter som er kjent innenfor den farmasøytiske industri.

Virkelige doseringsnivåer for de aktive bestanddeler i farmasøytiske sammensetninger ifølge foreliggende oppfinnelse kan varieres slik at man oppnår en mengde av den aktive forbindelsen som effektivt oppnår den forønskede terapeutiske respons for en spesiell pasient, sammensetning og tilførselsvei, uten å være toksisk for pasienten. Det valgte doseringsnivået vil være avhengig av en rekke farmakokinetiske faktorer så som aktiviteten til den spesielle sammensetning ifølge foreliggende oppfinnelse som anvendes, eller esteren, saltet eller amidet av denne, administrasjonsveien, tidspunkt for administrering, hastigheten med hensyn til utskillelse av den spesielle forbindelse som anvendes, varigheten av behandlingen, andre medikamenter, forbindelser og/eller stoffer som anvendes i kombinasjon med den eller de spesielle sammensetninger som anvendes, alder, kjønn, vekt, tilstand og generell helse og tidligere medisinsk historie for den pasient som behandles, og lignende som er velkjent innenfor den medisinske vitenskap.

En vel erfaren lege eller veterinær kan lett bestemme og foreskrive den effektive mengden av den farmasøytiske sammensetningen som måtte være nødvendig. F.eks. vil legen eller veterinæren starte med doser av forbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse som anvendes i de farmasøytiske sammensetninger, på nivåer som er lavere enn det som er vanligvis nødvendig for å oppnå den forønskede terapeutiske effekt, og så gradvis øke dosen inntil den forønskede effekten er oppnådd. Generelt vil en egnet daglig dose av sammensetninger ifølge foreliggende oppfinnelse være den mengden av forbindelsen som er den laveste dose som effektivt gir den forønskede terapeutiske effekt. Slike effektive doser vil generelt være avhengig av de faktorer som er nevnt ovenfor. Det er foretrukket at administreringen er intravenøs, intramuskulær, intraperitoneal eller subkutan, fortrinnsvis administrert nær selve målstedet ved behandlingen. Hvis ønskelig kan den effektive daglige dose av en terapeutisk sammensetning administreres som 2,3, 4, 5, 6 eller flere subdoser som blir administrert separat med passende mellomrom gjennom døgnet, eventuelt i enhetsdoseringsformer. Skjønt det er mulig at en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse kan administreres som sådan, så er det foretrukket at den administreres i form av et farmasøytisk preparat eller sammensetning. Dosen kan bestemmes eller justeres ved å måle mengden av sirkulerende monoklonale anti-IL-8-antistoffer på forskjellige tidspunkter etter administrering i en biologisk prøve ved å anvende anti-idiotypiske antistoffer, som søker mot anti-IL-8-antistoffer, eller ved å anvende andre spesifikke metoder for å påvise anti-IL-8-antistoffer, f.eks. ved hjelp av en ELISA-prøve hvor det anvendes IL-8 som et belegg.

I én utførelse blir de humane monoklonale antistoffene ifølge oppfinnelsen administrert ved infusjon i en dose fra 0,15-8 mg/kg, f.eks. 0,15 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4 mg/kg, eller 8 mg/kg på dag 0, fulgt av 2-8 administreringer én gang i uken, så som fire administreringer én gang i uken ved å starte på dag 28. Administreringen kan utføres ved kontinuerlig infusjon over en periode på 24 timer eller en periode på mer enn 24 timer for å redusere eventuelle toksiske sideeffekter.

I en ytterligere utførelse kan de humane monoklonale antistoffene administreres ved såkalt opprettholdende terapi, så som f.eks. én gang i uken, én gang hver annen uke eller én gang pr. måned i en periode på 6 måneder eller mer.

Terapeutiske sammensetninger kan administreres ved hjelp av medisinske anordninger av velkjent type. I en foretrukket utførelse kan f.eks. en terapeutisk sammensetning ifølge oppfinnelsen administreres med en nålløs hypoderm injeksjonsanordning, f.eks. av den type som er beskrevet i US patentene nr. 5 399 163, 5 383 851, 5 312 335, 5 064 413, 4 941 880, 4 790 824 eller 4 596 556. Eksempler på velkjente implantater og moduler som kan anvendes i foreliggende oppfinnelse innbefatter: US patent nr. 4 487 603 som beskriver en implanterbar mikro-infusjonspumpe for tilførsel av et medikament i kontrollert mengde; US patent nr. 4 486 194 som beskriver en terapeutisk anordning for å administrere medikamenter gjennom huden; US patent nr. 4 447 233 som beskriver en medikamentinfusjonspumpe for å tilføre et medikament med en presis infusjonshastighet; US patent nr. 4 447 224 som beskriver et variabelt strømimplanterbart infusjonsapparat for kontinuerlig medikamenttilførsel; US patent nr. 4 439 196 som beskriver et osmotiskmedikamenttilførselssystem med flerkammeravdelinger; og US patent nr. 4 475 196 som beskriver et osmotisk medikamenttilførselssystem. Mange andre slike implantater, tilførselssystemer og moduler er også velkjente innenfor den medisinske vitenskap. I visse utførelser kan de humane monoklonale antistoffene ifølge oppfinnelsen formuleres slik at de sikrer jevn og passende fordeling in vivo. F.eks. vil blod-hjerne-barrieren (BBB) stoppe mange sterkt hydrofile forbindelser. For å sikre at de terapeutiske forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan krysse BBB (hvis dette er ønskelig), så kan de f.eks. opparbeides eller formuleres i form av liposomer. Fremgangsmåter for fremstilling av liposomer er f.eks. beskrevet i US patentene 4 522 811, 5 374 548 og 5 399 331. Liposomene kan omfatte én eller flere grupper som selektivt blir transportert inn i spesifikke celler eller organer, og således bedrer tilførselen av medikamentet til det eller de målsøkte celler eller vev (se f.eks. V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Eksempler på målsøkende grupper innbefatter folat eller biotin (se f.eks. US patent 5 416 016 til Low et al.); mannosider (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. COmmun. 153:1038); antistoffer (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); overflateprotein A-reseptor (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134), forskjellige forbindelser og medikamenter som kan omfatte medikamentene ifølge foreliggende oppfinnelse, så vel som komponenter av de her beskrevne molekyler; pl20 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); se også K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273.1 én utførelse av oppfinnelsen blir de terapeutiske forbindelsene ifølge oppfinnelsen formulert eller opparbeidet i liposomer; og i en mer foretrukket utførelse vil liposomene omfatte en målsøkende gruppe. I en mest foretrukken utførelse vil de terapeutiske forbindelsene i liposomene bli tilført ved en bolusinjeksjon på et sted som ligger proksimalt til det forønskede området, f.eks. inflammasjons- eller infeksjonsstedet, eller der hvor det forefinnes en tumor. Sammensetningen må være tilstrekkelig flytende til at den lett kan tilføres ved hjelp av en sprøyte. Den må videre være stabil ved de betingelser som anvendes under fremstilling og lagring, og må dessuten beskyttes mot en forurensende påvirkning av mikroorganismer, så som bakterier og sopp.

Effektive doser og doseringsregimer for de humane monoklonale antistoffene ifølge oppfinnelsen, er avhengig av den sykdom eller tilstand som skal behandles, og vil lett kunne bestemmes av den behandlende legen.

En "terapeutisk effektiv dose" for PPP vil fortrinnsvis resultere i en reduksjon av den totale PPP-bedømmelse, ved å sammenligne forbedringseffekten etter medikamentbehandling med tilstanden før behandling. Dette kan f.eks. bedømmes ved reduksjonen av antallet friske pusteler (liten verkfylt blære), en PASI-lignende skår tilpasset PPP betegnet PPPASI. Behandlingen vil fortrinnsvis resultere i en PPP AS 150, mer foretrukket en PPASI75 og mest foretrukket en PPPASI90.

En "terapeutisk effektiv dose" for psoriasis vil fortrinnsvis resultere i en PASI50, mer foretrukket en PASI75 og aller mest foretrukket en PASI90 i pasienter, eller en reduksjon av den totale psoriasisbedømmelsen, ved å sammenligne bedringen etter medikamentbehandlingen med tilstanden før behandlingen. PASI (psoriasisområde og gradsindeks) er et skårsystem som anvendes for å bedømme området og graden av sykdommen. PASI50 er definert som > 50 % bedring av nevnte skår. På samme måte så er PASI75 og PASI90 definert som > 75 og > 90 % bedring av nevnte skår henholdsvis.

En "terapeutisk effektiv dose" for reumatisk artritt vil fortrinnsvis resultere i en ACR20 preliminær bedringsdefinisjon i pasientene, mer foretrukket en ACR50 preliminær bedringsdefinisjon og aller mest foretrukket en ACR70 preliminær bedringsdefinisjon.

En ACR20 preliminær bedringsdefinisjon er definert som følger: > 20 % forbedring i: antall ømme ledd (TJC) og antall svellede ledd (SJC) og > 20 % forbedring i tre av de følgende fem bedømmelser: pasientsmertebedømmelse (VAS), pasientglobal bedømmelse (VAS), legens globale bedømmelse (VAS), pasientens selvbedømte uførhet (HAQ) og akutt fasereaktant (CRP eller ESR).

ACR50 og ACR70 er definert på samme måte med lik eller mer enn 50 % og lik eller mer enn 70 % bedring henholdsvis. For ytterligere detaljer, se Felson et al.

i American College of Rheumatology Preliminaryu Definition of Improvement in Rheumatoid Arthritis; Arthritis Rheumatism (1995) 38:727-735.

Alternativt kan en terapeutisk effektiv dose for reumatisk artritt måles ved DAS (sykdomsaktivitetsskår) inklusive DAS28, og mer foretrukket DAS56 slik dette er definert av EULAR.

En "terapeutisk effektiv dose" for tumorterapi kan måles ved objektive tumorreaksjoner eller responser som enten kan være fullstendige eller delvise. En fullstendig respons (CR) er definert som en total manglende klinisk, radiologisk eller på annen måte påvisning av sykdom. En partiell respons (PR) er et resultat av en reduksjon av den samlede tumorstørrelsen på mer enn 50 %. Måling av mediantid for en progresjon er et mål som karakteriserer varigheten av den objektive tumorresponsen.

En "terapeutisk effektiv dose" for tumorterapi kan også måles ved medikamentets evne til å stabilisere progresjonen av sykdommen. En forbindelses evne til å hemme cancer kan bedømmes i et dyremodellsystem som predikerer effekten i humane tumorer. En terapeutisk effektiv mengde av en terapeutisk forbindelse kan nedsette tumorstørrelsen eller på annen måte lindre eller lette symptomene hos pasienten. Den behandlende legen vil lett kunne bestemme de nødvendige mengder basert på slike faktorer som pasientens størrelse, graden av pasientens symptomer og den spesielle sammensetning og administrasjonsvei som anvendes.

IV. Anvendelser og fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen

De humane antistoffer og antistoffsammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse har tallrike in vivo og in vitro terapeutiske og diagnostiske anvendelsesområder, som blant annet involverer behandling og diagnose av IL-8-medierte lidelser, eller lidelser hvor det inngår H-8-aktivitet. Disse molekylene kan administreres til humane pasienter, f.eks. in vivo, eller til celler i kultur, f.eks. in vitro eller ex vivo, for å behandle, forhindre og diagnostisere en rekke forskjellige sykdommer. Med begrepet "pasient" forstås her både mennesker og dyr. Foretrukne pasienter omfatter humane pasienter med lidelser som er frembragt av, eller som er assosiert med IL-8-aktivitet.

Mer spesielt kan de humane antistoffene og derivater av disse bli tilveiebrakt for anvendelse for å hemme IL-8-indusert aktivitet som er assosiert med visse lidelser, f.eks. proinflammatorisk aktivitet, kjemotaktisk aktivitet og angiogenese. Andre IL-8-induserte aktiviteter som kan hemmes ved hjelp av antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse, innbefatter en hemming av IL-8-indusert forsterket ekspresjon av CDllb (Mac-1) og hemming av en IL-8-indusert forsterket ekspresjon av L-selektin. Ved å kontakte antistoffet med IL-8 (f.eks. ved at antistoffet administreres til en pasient), så vil evnen til IL-8 til å binde seg til sine reseptorer og deretter indusere forskjellige typer aktiviteter, bli hemmet, hvorved den assosierte lidelse behandles. Foretrukne antistoffer binder seg til epitoper som er spesifikke for IL-8, og således fordelaktig hemmer IL-8-induserte aktiviter, men påvirker ikke aktiviteten til strukturelt beslektede kjemokiner, såom GRO-a og GRO-p iP-10 og NAP-2.

I én utførelsesform kan de humane antistoffene ifølge oppfinnelsen bli tilveiebrakt for anvendelse for å behandle inflammatoriske og hyperproliferative hudlidelser, så som PPP, psoriasis, inklusive plakkpsoriasis, og psoriasis av gutattypen, buløse hudlidelser, så som bull øs pemfigoid, kontaktdermatitt, eksem, erytematose og atopisk dermatitt.

I en annen utførelsesform kan de humane antistoffene ifølge oppfinnelsen bli tilveiebrakt for anvendelse for å behandle immune, autoimmune, inflammatoriske eller infeksjonssykdommer, så som psoriatisk artritt, systemisk skleroderma og sklerose, inflammatorisk tarmsykdom (TBD), Crohns sykdom, ulcerøs kolitt, akutt lungeskade, så som akutt respiratorisk stressyndrom eller adult respiratorisk stressyndrom, meningitt, encefalitt, uveititt, multippel myelom, glomerulonefritt, nefritt, astma, aterosklerose, leukocyttadhesjonssvikt, multippel sklerose, Raynauds syndrom, Sjøgrens syndrom, juvenil tidlig diabetes, Reiters sykdom, Behcets sykdom, immunkompleksnefritt, IgA nefropati, IgM polynevropatier, immunkontrollert trombocytopenias, så som akutt idiopatisk trombocytopenisk purpuria og kronisk idiopatisk trombocytopenisk purpuria, hemolytisk anemi, myastenia gravis, lupus nefritt, lupus erytematose, reumatisk artritt (RA), ankyloserende spodylitt, pemfigus, Graves sykdom, Hashimotos tyroiditt, småkarvaskulititt, så som Wegners granulomatose, Omens syndrom, kronisk nyresvikt, autoimmun tyroidsykdom, akutt infiserende mononukleose, HIV, herpesvirusassosierte sykdommer, humane virusinfeksjoner, så som vanlig forkjølelse som skyldes human rinovirus, koronavirus eller andre enterovirus, herpesvirus, influensavirus, parainfluensavirus, respiratorisk syncytialvirus eller adenovirusinfeksjon, bakterielungebetennelse, sår, betennelser, serebralt slag, serebralt ødem, ischemi-reperfusjonsskader og hepatitt C.

I én utførelsesform kan de humane monoklonale antistoffene bli tilveiebrakt for anvendelse ved behandling av ischemi-reperfusjonsskade etter trombolyse, kardiopulmonær bypass, perkutan koronarinngrep (PCI), koronar arteriebypass eller hj ertetransplantering.

I en ytterligere utførelsesform kan de humane antistoffene ifølge oppfinnelsen bli tilveiebrakt for anvendelse ved behandling av alkoholisk hepatitt og akutt pankreatitt.

I en enda ytterligere utførelsesform kan de humane antistoffene ifølge oppfinnelsen bli tilveiebrakt for anvendelse ved behandling av sykdommer hvor det inngår IL-8-mediert angiogenese, så som tumorer og cancere, f.eks. melanom, tyroid karsinom, forbigående cellekarsinom, tricilemmona, skvamøs cellekarsinom og brystcancer.

I en annen utførelsesform kan de humane antistoffene ifølge oppfinnelsen bli tilveiebrakt for anvendelse ved behandling av sykdommer hvor det er fordelaktig med en blokkering av granulocyttvandring, f.eks. i

nyrelidelser, så som skleroserende cholangiolitt;

urogenitale lidelser, så som kronisk cyktitt;

nyrelidelser, så som tubulo-interstial nefritt;

infeksjonssykdommer, så som alvorlig akutt respiratorisk syndrom (SARS);

endokrine lidelser, så som subakutt tyroidititt;

bindevevslidelser, så som sarciodose, relaperende polykondritt, familiær mediterranfeber, pannikulitt, erytmema nodosum, Weber-Christians sykdom og retroperitoneal fibrose.

I en annen utførelsesform kan de humane antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse bli tilveiebrakt for anvendelse ved behandling av sykdommer hvor det er fordelaktig å kunne påvirke interaksjonene mellom IL-8 og osteoklaster, så som osteoporose og osteolyttiske metastaser.

I en annen utførelsesform kan de humane antistoffene ifølge oppfinnelsen bli tilveiebrakt for anvendelse ved behandling av sykdommer hvor det er fordelaktig å kunne påvirke interaksjonene mellom IL-8 og tumorceller, så som gastrisk cancer, kolorektal cancer og urinblærecancer.

Anvendelsen innbefatter at en pasient administreres en antistoff - sammensetning ifølge foreliggende oppfinnelse i en mengde som er effektiv til å behandle eller forebygge lidelsen. Antistoffsammensetningen kan administreres alene eller sammen med ytterligere terapeutiske midler, så som ett eller flere midler valgt fra midler for å behandle inflammatoriske eller hyperproliferative hudlidelser, antiinflammatoriske midler, immunosuppressive midler og kjemoterapeutiske midler, som virker sammen med eller synergistisk med antistoffsammensetningen for å behandle eller å forebygge den IL-8-kontrollerte eller styrte sykdommen.

Egnede måter for administrering av antistoffsammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse in vivo eller in vitro, er velkjente og kan lett velges av kompetente fagpersoner FFor eksempel kan antistoffsammensetningene administreres ved injeksjon eller infusjon (f.eks. intravenøst eller subkutant). Egnede doser av de molekylene som anvendes vil være avhengig av pasientens alder og vekt, konsentrasjonen og/eller sammensetningen av antistoffsammensetningen, og den sykdommen som behandles.

Som nevnt tidligere kan de humane anti-IL-8-antistoffene ifølge oppfinnelsen administreres sammen med ett eller flere andre terapeutiske midler. Antistoffet kan administreres før, sammen med eller etter administreringen av nevnte andre middel.

Oppfinnelsen angår også sett som omfatter antistoffsammensetningene ifølge oppfinnelsen og instruksjoner for deres anvendelse. Settet kan ytterligere inneholde ett eller flere ytterligere midler, så som et immunosuppresivt middel, eller ett eller flere ytterligere humane antistoffer ifølge oppfinnelsen (f.eks. et humant antistoff med en komplementær aktivitet som binder seg til en epitop på IL-8-antigenet, og som skiller seg fra det første humane antistoffet).

Pasienter som behandles med antistoffsammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse kan følgelig ytterligere administreres (før, samtidig med eller etter administreringen av det humane antistoffet ifølge oppfinnelsen), et annet terapeutisk middel, så som et antiinflammatorisk middel, som forsterker eller bedrer den terapeutiske effekten av de humane antistoffene.

I en ytterligere utførelse tilveiebringer oppfinnelsen fremgangsmåter for å diagnostisere sykdommer som er assosiert med IL-8, ved å påvise ex vivo eller in vitro IL-8 i en prøve, f.eks. en vevsprøve, en kroppsvæskeprøve eller i en celleprøve. Dette kan f.eks. oppnås ved at den prøven som skal testes settes i kontakt med, eventuelt sammen med en kontrollprøve, det humane antistoffet under betingelser som muliggjør dannelsen av et kompleks mellom antistoffet og IL-8. En eventuell kompleksdannelse kan så påvises (f.eks. ved å anvende en ELISA). Når det anvendes en kontrollprøve sammen med testprøven, så vil kompleks eventuelt kunne påvises i begge prøver, og i slike tilfeller så vil en eventuell statistisk signifikant forskjell med hensyn til dannelsen av kompleksene mellom prøvene, være en indikasjon på nærværet av IL-8 i testprøven.

Den foreliggende oppfinnelsen er ytterligere illustrert ved hjelp av de følgende eksempler.

EKSEMPLER

Eksempel 1 Produksjon av humane monoklonale antistoffer (HuMabs) mot IL-8

Humane monoklonale antistoffer mot human IL-8 (72 aminosyreformen) ble produsert som følger i transgene mus som bærer human immunoglobulintransgener.

Antigen: Rekombinant humant IL-8-antigen (rhIL-8) ble fremstilt ved å anvende standard rekombinant DNA-teknikk og tilveiebragt i en proteinkonsentrasjon på 0,713 mg/ml i PBS. Det løselige antigenet ble lagret ved - 80°C inntil det skulle anvendes. Løselig IL-8 ble blandet med Freunds komplette adjuvans (CF) (Sigma F5881) for den første immuniseringen. Deretter ble antigenet blandet med Freunds inkomplette adjuvans (IF) (Sigma F5506). 25 \ ig av rekombinant IL-8 i 100 ul PBS ble blandet 1:1 med adjuvanset ved å anvende en emulgerende nål. Musene ble injisert med 0,2 ml fremstilt antigen i bukhinnehulen.

Transgene mus: Musene var plassert i filterbur og ble vurdert til å være i god fysisk tilstand på dagen for immunisering og senere for blodprøver, og på dagen for infusjonen.

Den musen som produserte det monoklonale antistoffet (mAb) 10F8 var en hannmus, ID #81645 av (CMD)++; (HCo7) 19952+; (JKD)++; (KCo5) 9272+ genotypen. Individuelle transgenbetegnelser er angitt i parentes, fulgt av linjetallene for de vilkårlig integrerte transgenene. Symbolene ++ og + indikerer henholdsvis homozygoti eller hemizygoti. Ettersom musene rutinemessig ble undersøkt ved å anvende en PCR-basert prøve som ikke muliggjør en distinksjon mellom heterozygositi og homozygositi for de vilkårlig integrerte humane lg-transgenene, så ble imidlertid en +-betegnelse kunne gis til mus som i virkeligheten er homozygote for disse elementene.

HCo7-musene har et JKD-brudd i sine endogene lettkjede (kappa) gener (slik det er beskrevet i Chen et al. (1993) EMBO J. 12:821-830), et CMD-brudd i sine endogene tungkjedegener (slik det er beskrevet i eksempel 1 i WO 01/14424), et KCo5 humant kappalettkjedetransgen (slik det er beskrevet i Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851), og et HCo7-humant tungkjedetransgen (slik det er beskrevet i US patent nr. 5 770 429).

HCol2-musene har et JKD-brudd i sine endogene lettkjede (kappa) gener (slik et er beskrevet i Chen et al. (1993) EMBO J. 12:821-830), et CMD-brudd i sine endogene tungkjedegener (som beskrevet i eksempel 1 i WO 01/14424 til Korman et al.), et KCo5 humant kappa lettkjedetransgen (som beskrevet i Fishwild et al.

(1996) Nature Biotechnology 14:845-851), og et HCol2 humant tungkjedetransgen (som beskrevet i eksempel 2 i WO 01/14424 av Korman et al.).

Immuniseringsmetode: Det immuniseringsregime som ble brukt for musene er angitt i den etterfølgende tabell 1. Splenocytter fra 10 mus av HCo7- og HCol2-genotypene, immunisert med rIL-8, ble fusjonert på dag 101.

Hybridomfremstilling: P3 X63 ag8.653 myolomcellelinjen (ATCC CRL 1580, lot F-15173) ble brukt for fusjonene. Den opprinnelige ATCC-ampullen ble opptint og ekspandert i kultur. En lagerløsning av frosne ampuller ble fremstilt ved denne ekspansjonen. Cellene ble holdt i kultur fra 3-6 måneder, overført to ganger i uken. P388D1-cellelinjen (ATCC TB-63 FL) ble ekspandert til 200 ml og uttømt. Supernatanten ble sentrifugert og filtrert og brukt som en mediatilsetning, kjent som kondisjonert media. Denne cellelinjen ble overført i fra 3-6 måneder, hvoretter en ny ampulle ble opptint.

Høyglykose DMEM (Mediatech, Cellgro #10013245) som inneholdt 5 % FBS og penicillin-streptomycin (Cellgro #30004030) ble brukt for å dyrke myolomet og P388D1-cellene. Ytterligere mediasupplement ble tilsatt vekstmedia for nevnte hybridom, og disse supplementene inkluderte: 3 % Origen-hybridomkloningsfaktor (Igjen, 36335), 10 % P388D1-kondisjonert media (8/10/99 DH), 10 % FBS (Hyclone, SH30071 lot #AGH6843), L-glutamin (Gibco # 1016483) 0,1 % gentamycin (Gibco # 1020070), 2-merkaptoetanol (Gibco # 1019091), HAT (Sigma, H0262) 1,0 x IO<4>M hypoxantin, 4,0 x IO"<7>M aminopterin, 1,6 x 10"<5>M tymidin), eller HT (Sigma, HOI37) 1,0 x IO"<4>M hypoxantin, 1,6 x 10"<5>M tymidin).

Milten fra mus #18645 hadde normal størrelse og ga 1,8 x 10 o levende celler. Det ble brukt 10 96-brønnsplater og hver brønn fikk 200 ul. Splenocyttene ble så fusjonert og det ble deretter utført en første ELISA-screen for humane IgG,K-antistoffer 10-12 dager etter fusjonen.

De brønnene som var human IgG,K-positive ble så screenet på løselige IL-8-belagte ELISA-plater. Antigenpositive hybridomer ble så overført til 24-brønnsplater og så til vevsdyrkningskolber. IL-8-spesifikke hybridomer ble subklonet ved begrensende fortynning for å sikre monoklonalitet. Antigenpositive hybridomer ble bevart på flere trinn under utviklingsprosessen ved å fryse celler i DMEM supplert med 50 % FBS pluss 10 % DMSO (Sigma, D2650).

Titer for mus #|8645 er vist nedenfor i tabell 2. Titrene er Huy-antigenspesifikke. Titrene er definert som den resiproke verdien for den høyeste fortynning som resulterte i en OD som er lik to ganger bakgrunnsverdien.

Fusjonen ble så screenet for Huy-antigenreaktivitet ved hjelp av ELISA. Etter screeningen for antigen (ELISA-basert), ble to mulige antigenspesifikke hybridomer identifisert fra fusjonen. Disse to hybridomene sammen med seks andre hybridomer fra tidligere fusjoner, ble deretter evaluert for sitt terapeutiske potensiale. Disse cellelinjene ble så subklonet og uttømte supernatanter ble renset over protein-A. Bestemmelse av Kd-verdi er ble utført ved hjelp av BIAcore. Ved sammenligning med kontrollmAb, ble hybridom 10F8 identifisert som én som hadde meget høy affinitet, og denne ble så valgt for ytterligere karakterisering.

Eksempel 2 Bestemmelse av Vh- og VL-områdene for antistoffene

Cellekultur: HuMab 10F8-hybridomcellelinjen ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM, Gibco BRL) supplert med 10 % FCS, 2 mM L- glutamin, 100 IU/ml penicillin, 100 ug/ml streptomycin (pen/strep) (alle fra Gibco BRL, Life Technologies, Paisley, UK) og 1 mM natriumpyruvat. Cellene ble holdt ved 37°C i en fuktet atmosfære som inneholdt 5 % CO2.

RNA- fremstilling: PolyA+ mRNA ble fremstilt fra 2x10<6>HuMab-IL-8 (10F8) celler ved å anvende Micro-Fast Track settet (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ved å følge fabrikantens protokoll.

cDNA- fremstilling: Komplementært DNA (cDNA) fra RNA fra HuMab-IL-8 (10F8) celler ble fremstilt fra ca. % av det mRNA som var oppnådd, ved å anvende cDNA Cycle settet (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ved å følge fabrikantens protokoll.

Vh- og VL-områdene ble amplifisert ved å anvende de følgende primere:

Vh FRI 5' primere:

Vh leder 5' primere

Vh 3' primer: Vkleder 5' primere

Vk3' primer

I de ovennevnte primersekvenser så har symbolene K, S, R, Y og W følgende betydning: K = G eller T; S = C eller G; R = A eller G; Y = C eller T; og W = A eller T.

PCR-betingelser som ble brukt for å amplifisere Vh- og VL-områdene for kloning: polymerasekjedereaksjoner (PCR) ble utført med klonet Pfu-polymerase (Stratagene, La Jolla, CA, USA) i et GeneAmp PCR-system 9700 (Perkin Eimer, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

PCR- svklusprotokoll:

Kloning av Vh og Vli pCR- Blunt- vektorsystem: Etter en analyse av PCR-produktene på en agarosegel, ble produktene direkte ligert inn i pCR-Blunt-vektorsystemet (Invitrogen) ved å følge fabrikantens protokoll. Tre uavhengige amplifiserte Vh PCR-produkter og fem uavhengige amplifiserte VlPCR-produkter ved å anvende FRI eller lederprimere, ble klonet og sekvensert.

Etter transformering inn i E. coli TOP 10 (Invitrogen) ble plasmid DNA fra koloniene renset ved å anvende Qiaprep Spin miniprepsettet (Qiagen, Valencia, CA, USA). Individuelle kloner ble screenet for innsatte Vh eller VlPCR-produkter ved kutting med EcoRI (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) og analyse på en agarosegel.

Sekvensering: V-områdene ble sekvensert etter kloning i pCR-Blunt-vektorsystemet, ved å anvende T7- og T3-primere ved ACGT, Inc., Northbook, IL, USA. Sekvensene ble analysert med programmet DNAStar, Seqmanll. Sekvensene ble alignet til kimlinje V-gensekvensene i Vbase ( www. mrc- cpe. cam. ac. uk/ imt-doc/ public/ intro. htm).

Kimlinjefamilien for VH-området fra 10F8 ifølge alignment i Vbase: Vh3-33 (Vh3-undergruppe), Jn4(b) (Jn-segment). Ingen komplementære områder for DH- segment ble funnet ved hjelp av V-baseprogramvaren, noe som sannsynligvis skyldes somatiske hypermutasjoner i D-segmentet.

Kimlinjefamilien for VL-området i 10F8 ifølge alignment i Vbase: VkA-27 (VKlH-undergruppe) og Jk3 (JK-segment).

Fig. 1 viser nukleotidseveksene for Vl- og VH-områdene i 10F8. Fig. 2 og 4 viser alignment for 10F8 Vl- og Vn-områdenukleotidsekvensene henholdsvis, med deres tilsvarende kimlinjesekvenser. Fig. 3 og 5 viser alignment av 10F8 Vl- og Vh-områdeaminosekvensene henholdsvis, med deres tilsvarende kimlinje-kodede sekvenser.

10F8: et humant monoklonalt IgGl,Kantistoff med Vr- og Vl-aminosyresekvenser: SEKV. ID nr. 12 og 8 henholdsvis.

Eksempel 3 Ekspresjon av rekombinant HuMab 10F8

De klonede Vl- og Vn-områdene fra HuMab 10F8 ble subklonet inn i ekspresjonskassetter fra en immunoglobulinekspresjonsvektor. V-områdene ble innsatt oppstrøms for humane kappa- og gammal-konstante områder og koder hellengde 10F8 tunge og lette kjeder. 10F8-ekspresjonsvektoren ble transfektert over i kinesisk hamstereggstokk (CHO) celler, og det ble etablert transfektomcellelinj er som uttrykker det rekombinante antistoffet. Affiniteten for rekombinant 10F8 fremstilt fra nevnte CHO-celler ble målt til å være identisk med affiniteten for det hybridom-avledede 1 OF8-antistoffet, slik dette kunne bedømmes ved en kinetisk analyse av plasmonoverflateresonans ved å anvende et BIAcore-system.

Eksempel 4 Binding av HuMab 10F8 (Fab og IgG) til IL-8

Rensing av monoklonalt antistoff fra dyrkningssupernatant: HuMab 10F8 ble renset ved protein-A affinitetskromatografi ved å anvende følgende fremgangsmåte: (1) påsettingsbetingelser: supernatanten ble påsatt en 5 ml protein-A kolonne som var ekvilibrert med fosfatbufret saltløsning (PBS); (2) vasking: PBS; (3) eluering: 0,1 M glycin med 150 mM NaCl, pH 2,9. Eluatet ble nøytralisert med 1 M Tris-buffer (30 ul for hver 2 ml fraksjon). Hver eluert fraksjon ble kjørt på en gel før de ble slått sammen. Så snart renheten var verifisert ved coomassie-farging, ble fraksjonene slått sammen og dialysert mot en 10 mM natriumfosfatbuffer med 15 mM NaCl, pH 7,2.

Fab- fragmentfremstilling: Fremstilling av et Fab-fragment fra HuMab 10F8 ble utført ved å følge instruksjonene i et sett (Pierce Technical literature 44885). 5 g av det rensede IgG ble brukt for dette formål. Det isolerte Fab-produktet ble dialysert mot 10 mM natriumfosfat med 150 mM NaCl, pH 7,2, og dets proteinkonsentrasjon ble bestemt ved BCA (Pierce) assay ved å anvende BSA som en standard. Fab-fragmentet blekarakterisertmed hensyn til renhet og identitet ved

SDS-PAGE.

Affinitetskonstanter: Affinitetskonstanter for 10F8 Fab ble bestemt og sammenlignet med tilsvarende verdier for 10F8 IgGl,K. Hele IgG-molekyler fører til fornyede bindingseffekter under dissosiasjonsfasen i den eksperimentelle metoden som ble brukt for å bestemme affinitetskonstantene, noe som tilsynelatende fører til en lavere dissosiasjonshastighetskonstant og følgelig mye høyere affinitetskonstant. For å eliminere disse kunstige effektene ble Fab-molekyler brukt istedenfor IgGl,Kfor å bestemme affiniteten og hastighetskonstantene. En CM-5-brikke ble brukt for å immobilisere IL-8 via aminkobling.

Ved å anvende et BIAcore 3000-system, ble diassosiasjons- og hastighetskonstanter bestemt basert på sensogrammer (data ikke vist) for IgGl,Kog Fab ved 25°C og 37°C som oppsummert nedenfor.

Assosiasjon og hastighetskonstanter @ 25°C

Assosiasjon og hastighetskonstanter @ 37°C

Interaksjonen mellom intakt IgGl,Kog IL-8 ga en dissosiasjonshastighetskonstant på 0,21 x 10"<5>sek."<1>, mens den tilsvarende verdien for Fab var 1,96 x 10"<5>sek."<1>, noe som indikerer at re-bindings- og aviditetseffekter påvirker dissosiasjonshastighetskonstanten for IgGl,K (som derved får en høyere affinitetskonstant). Disse artefaktene ble eliminert ved anvenden av Fab istedenfor intakt IgGl,K.

Analyse av interaksjonen ved den fysiologiske temperaturen på 37°C sammenlignet med 25°C (romtemperatur) viste at hastighetskonstantene er ytterligere påvirket, noe som fører til relativt lavere affinitetskonstanter, for både IgGl,Kog Fab. Affinitetskonstanten for Fab ved 37°C tilsvarer den virkelige affiniteten for hvert enkelt bindingssete ved den fysiologiske temperaturen.

Halveringstiden (tidsrommet for at 50 % av komplekset er dissosiert), ble redusert med 50 % ved 37°C. Dette er en tilnærming hva angår den virkelige biologiske halveringstiden ved fysiologiske temperaturer.

Hvis intet annet er angitt så er det hybridomavledede 10F8-antistoffet blitt brukt i de følgende eksempler.

Eksempel 5 Binding av HuMab 10F8 til nativ IL-8 uten kryssreaksjon med andre CXC-kjemokiner

Mulig krys sr eakti vitet for HuMab 10F8-klonen i forhold til andre kjemokiner ble bedømt ved hjelp av ELISA. Kort beskrevet ble mikrotiterELISA-plater (Greiner, Tyskland) belagt over natten ved romtemperatur (RT) med 1 ug/ml av rekombinant humant (rh) GRO-a, rh-GRO-P, rh-IP-10, rh-IL-8 72 aa form, som er monocyttavledet (IL-8M eller IL-8Mpepretech) eller rh-IL-8 77 aa form (IL-8E) som var avledet fra endoteliske celler, 100 ul/brønn. Platene ble vasket 2 ganger med PBST (fosfatbufret saltløsning supplert med 0,05 % v/v Tween-20 (Fischer Scientific, USA)), hvoretter brønnene ble blokkert med 100 ul/brønn av PBSTC (PBST pluss 2 % volum/volum kyllingserum) i 1 time ved RT. Deretter ble brønnene inkubert i 1 time ved R-temperatur under risting med HuMab-IL-8-klonen 10F8, 20 ug/ml 1:3 fortynnet i PBSTC. Deretter ble brønnene vasket tre ganger med PBST og inkubert enten med HRP-konjugerte kanin-anti-mus IgG F(ab')2-fragmenter (Jackson; fortynnet 1:3000 i PBSTC) eller HRP-konjugert kanin-anti-human IgG F(ab')2(DAKO, Danmark, fortynnet 1:2000 i PBSTC) for påvisning av henholdsvis muse- eller humane antistoffer. Platene ble vasket tre ganger med PBST og prøvene ble fremkalt med en nylig fremstilt ABTS-løsning (1 mg/ml)

(ABTS: 2,2'-azinobis (3-etylbenztiazolin-6-sulfonsyre; 2 tabletter på 5 mg i 10 ml ABTS-buffer, Boehringer, Mannheim, Tyskland) i 30 min. ved RT i mørke. Absorpsjonen ble målt ved 405 nm på en ELISA-plateleser (Biotek Instruments Inc., Winochi, USA). Resultatene som er vist på fig. 6 er representative for de tre eksperimentene som ble utført. Det fremgår at HuMab 10F8 binder seg både til endotelcelleavledet human IL-8 og til monocyttavledet humant IL-8. Det kryssreagerer derimot ikke med kjemokinene GRO-a, GRO-P eller IP-10.

Eksempel 6 Hemming av IL-8-binding til IL-8R på nøytrofiler

Evnen til HuMab 10F8 til å hemme radiomerket IL-8-binding til IL-8-reseptorer (CXCR1 og CXCR2) på nøytrofiler ble undersøkt som følger: Nøytrofiler ble anriket fra heparinisert fullblod fra normale frivillige forsøks-personer. Blodet ble lagdelt på Ficoll-hypaque og sentrifugert ved 1500 rpm i 30 min. Det mononukleære cellelaget ble fjernet, og erytrocyttene ble hypotonisk lysert. De resulterende nøytrofilene ble på nytt suspendert i PBS inneholdende 0,1 % BSA og 0,02 % Na azid (0,1 % PB A) og plassert på is. IL-8-bindingsprøven ble utført som beskrevet tidligere (Yang et al. (1999) J. Leukoc. Biol. 66:401-410). Kort beskrevet ble et sluttvolum på 150 ul med 4 x 105 nøytrofiler inkubert i fra 1,5-3 timer på is med 0,25 nM[125I]rekombinant human IL-8 (Amersham Life Sciences, Piscataway, NJ) sammen med varierende konsentrasjoner av 10F8 (hybridomavledet), 10F8 (transfektomavledet), mus anti-human-IL-8 mAb 6712,111 R & D Systems, og kontrollantistoff. Alle inkuberinger ble utført i 96-brønns Multiscreen filterplater (Millipore, Bedfore, MA). Platene ble flere ganger vasket med kald 0,1 % PB A, hvoretter filtrene ble tellet på en Wallac gammateller. Resultatene er vist på fig. 7A og 7B uttrykt som middelverdier etter tre eller fire parallelle forsøk. Hemmingen av binding er uttrykt som prosent i forhold til kontrollantistoff et.

Som vist på fig. 7A og 7B så hemmer HuMab 10F8 bindingen av merket IL-8 til nøytrofiler på en doseavhengig måte. Det murine anti-IL-8-antistoffet var også i stand til å hemme binding av merket IL-8 til nøytrofiler på en doseavhengig måte, men 10F8 var konsistent langt sterkere enn det murine antistoffet for hemming av IL-8-binding til nøytrofiler. I det eksperimentet som er vist på fig. 7B, så var ICsosfor 10F8 (hybridomavledet) (10F8 H) og 10F8 (transfektom-avledet) (10F8 T) 0,19 nM og 0,30 nM henholdsvis.

De forannevnte resultater viser generelt av HuMab 10F8 hemmer binding av IL-8 til dens reseptorer på en doseavhengig måte, og er i stand til å hemme denne bindingen ved lavere konsentrasjoner enn et kommersielt tilgjengelig murint anti-IL-8-antistoff.

Eksempel 7 Hemming av IL-8-kontrollert nøytrofilkjemotaksis

Evnen til HuMab 10F8 og murint anti-IL-8-antistoff (MAb 6217.111 R & D Systems) til å hemme en IL-8-indusert nøytrofilmigrasjon ble bedømt ved å anvende en kjemotaksisprøve.

Nøytrofiler ble inkubert i et kammer i en transbrønnplate. IL-8 (rhIL-8) ble inkubert med varierende konsentrasjoner av HuMab 10F8, det murine anti-IL-8 MAb og et kontrollantistoff i et annet kammer av transbrønnplaten. Prøveplaten ble så inkubert ved 37°C i 2 timer, og cellemigrasjonen ble kvantifisert.

De data som er vist på fig. 8A viser at nøytrofilkjemotaksis ble hemmet på en doseavhengig måte ved HuMab 10F8 og også av det murine IL-8-spesifikke antistoffet. Kontrollantistoffet hemmet ikke kjemotaksis. Disse data viser at HuMab 10F8 kan hemme nøytrofilmigrasjon, en viktig funksjon for IL-8 in vivo.

HuMab 10F8's evne til å hemme transmigrering av humane nøytrofiler mot human IL-8, ble ytterligere undersøkt ved å anvende et Boydenkammer.

Human IL-8 (10" M) ble inkubert med varierende konsentrasjoner av HuMab 10F8 i den lavere delen av Boydenkammeret. Nøytrofiler (4 x 105 celler) ble inkubert i den øvre delen. Prøven ble inkubert ved 37°C i 1 time, og cellemigrasjonen ble kvantifisert.

De data som er vist på fig. 8B, viser at nøytrofilkjemotaksis ble hemmet på en doseavhengig måte av HuMab 10F8. Disse data viser også at HuMab 10F8 kan hemme nøytrofilmigrasjon, en viktig funksjon for IL-8 in vivo.

Eksempel 8 Forandring av IL-8-indusert adhesjonsmolekylekspresjon på nøytrofiler

Humane nøytrofiler viser forsterket ekspresjon av CDllb (Mac-1) og nedsatt ekspresjon av L-selektin (CD62L) når de ble stimulert med IL-8. 10F8's evne til å hemme IL-8-induserte forandringer med hensyn til ekspresjonen av adhesjonsmolekyler på PMN, ble studert ved hjelp av flow cytometri. Kort beskrevet ble 100 ul av 1:5 fortynnet fullblod inkubert med seriefortynninger av 10F8 (5, 25, 1,25, 0,625, 0,312 og 0 ug/ml) i fravær eller nærvær av 25 ng/ml rekombinant human IL-8 (rh-IL-8, 72 aa, Peprotech) i 96-brønns flatbundete dyrkningsplater til et sluttvolum på 200 ul/brønn i 2 timer ved 37°C og 5 % CO2. Deretter ble cellene sentrifugert ned, og supernatanten ble lagret ved 20°C inntil den skulle undersøkes for nærvær av laktoferin. Cellene ble på nytt tilsatt 200 ul kald FACS-buffer (PBS, supplert med 0,02 % (v/v) azid og 0,1 % (vekt/volum) BSA) og vasket to ganger med 200 ul kald FACS-buffer. Cellene ble igjen nedsentrifugert og inkubert med 1,5 mg/ml av PE-konjugert mus anti-human CD1 lb (Becton Dickinson) og 1,5 mg/ml FITC-konjugert mus anti-human CD62L (Becton Dickinson) til et sluttvolum på 20 ul/brønn i 30 min. ved 4°C i mørket. Deretter ble erytrocyttene lysert med FACSlysisbuffer ved å følge fabrikantens protokoll (FACSlysing løsningssett, Becton Dickinson, kat. #A 349202). Deretter ble cellene vasket med kald FACS-buffer. Fluorescensintensiteten for cellene ble analysert ved hjelp av flow cytometri (FACS Calibur, Becton Dickinson) ved å anvende Cell Quest programvare.

Stimulering av PMN med IL-8 resulterte i en endret ekspresjon av adhesjonsmolekyler, dvs. en forbedret ekspresjon av CDllb, og en nedsatt ekspresjon av CD62L, noe som skyldes en avskalling av molekylet. Den midlere basislinjeekspresjonen av CD1 lb på PMN var 1538+37 (n=3) MFI (midlere fluorescensintensitet, et mål for antall molekyler pr. celle) og ekspresjonen av CD1 lb ble oppregulert til 2341+274 enheter etter at cellene var stimulert med 25 ng/ml av IL-8. Basislinjeekspresjonen av CD62L var 274+24 (n=3), og MFI og ekspresjonen av CD62L ble nedregulert til 176+60 enheter etter tilsetning av 25 ng/ml av IL-8. I denne undersøkelsen ble det vist at 10F8 er i stand til å hemme disse IL-8-induserte forandringene med hensyn til ekspresjon av celleoverflate-molekyler. Celleoverflateekspresjonen av CDllb så vel som CD62L, ble målt ved flow cytometri etter at cellene var stimulert med 25 ng/ml av IL-8 alene eller i nærvær av 10F8 og et irrelevant kontrollantistoff. Fig. 9A viser ekspresjonen av CD62L på IL-8 stimulert PMN. I nærvær av et irrelevant isotypekontrollantistoff (stjerner) så varierte MFI for disse stimulerte PMN omkring 150, noe som indikerer at dette antistoffet ikke blokkerer en IL-8-styrt PM-aktivering. Når cellene imidlertid ble stimulert med IL-8 i nærvær av økende konsentrasjoner av 10F8 (fylte kvadrater), så ble det observert en redusert IL-8-kontrollert CD62L-avstøtning på en doseavhengig måte, noe som indikerer at 10F8 hemmet den IL-8-induserte celleaktiviteten. I overenstemmelse med dette så reduserte 10F8 (fylte kvadrater) en IL-8-kontrollert CD1 lb-oppregulering, mens et irrelevant isotypekontrollantistoff (stjerner) ikke viste en slik effekt, dvs. at ekspresjonsnivået av CDllb forble upåvirket (MFI omkring 2400) (n=3; fig. 9B). Økende konsentrasjoner av 10F8 var korrelert med svakere ekspresjon av CD1 lb, noe som klart viser at 10F8 har en hemmende effekt på PMN-aktivering av IL-8.

Samlet viser resultatene som er vist på fig. 9A og 9B, at HuMab 10F8 er i stand til å hemme: a) en økende ekspresjon av CD1 lb på nøytrofiler som er kontrollert av IL-8; b) avstøtning av L-selektin (CD62L) på overflaten av nøytrofiler som er kontrollert av IL-8.

Eksempel 9 IL-8 tilstede i pustulosis palmoplantaris (PPP) materiale

Sterilt materiale ble tatt fra blemmer hos PPP-pasienter (ppp-blemmer), eksempasienter og friske forsøkspersoner. I tillegg ble det tilveiebragt prøvemateriale fra pasienter og friske frivillige forsøkspersoner ved at disse pakket eller svøpte inn føtter eller hender i en folie som inneholdt 2 ml fosfatbufret saltløsning (PBS). De innpakkede føttene eller hendene ble plassert i et vannbad ved 37°C for å lette diffusjonen av blæreinnholdet over i PBS (ppp vannbad). Blistermaterialet eller vannbadmaterialet ble analysert for nærvær av CXC-kjemokiner eller komplementfaktor C5a ved kommersielt tilgjengelige ELISA-prøver (IL-8: Pelikine Compact™, CLB, Amsterdam, Nederland; eller IL-8: Quantikine<®>Human IL-8-sett, R&D sett; GRO-a: Quantikine<®>Human GRO-a-sett, R&D Systems; ENA-78: Quantikine<®>ENA-78-sett, R&D Systems; C5a-sett, Opteia, BD-Pharmingen). Normalt humant serum ble brukt som en negativ kontroll. ELISA-prøvene ble utført ved å følge fabrikantenes protokoller.

De data som er vist på fig. 10 viser at IL-8 er tilstede i pasientmaterialet fra blemmene og vannbadmaterialet, mens IL-8 ikke kunne påvises i normalt serum fra en frisk forsøksperson. IL-8 ble målt på to separate tidspunkter og det ble vist at IL-8-innholdet i pasientmaterialet avtok ikke med tid. GRO-a var også tilstede i pasientmaterialet, skjønt i noe mindre grad. CXC-kjemokinet ENA-78 kunne ikke påvises i noen av prøvene.

Tabell 3 viser at IL-8 er tilstede i PPP-pasientene, mens IL-8 ikke lot seg påvise i vannbadmaterialet fra en eksempasient eller en frisk forsøksperson. GRO-a var også tilstede i PPP-pasientmaterialet skjønt i mindre grad. Prøvene ble målt på tre separate tidspunkter og viste at innholdet av IL-8 eller GRO-a i pasientmaterialet avtok ikke med tid og ikke ble brutt ned ved nærvær av proteaser.

Fig. 11 viser resultatene av målingene av kjemokiner som var tilstede i fotvannsvæske fra friske forsøkspersoner (n=6), eksempasienter (n=6) eller PPP-pasienter (n=6). Analysene ble utført på log-transformerte data ved envei ANOVA med Tukey-test. P < 0,05 ble ansett å være signifikant forskjellige.

Både eksem- og PPP-pasientene viste signifikant økning av IL-8 og GRO-a sammenlignet med friske kontrollpersoner. En sammenligning mellom eksem- og PPP-pasientene viste at mengden av IL-8 er signifikant forskjellig mellom disse to gruppene pasienter (P < 0,05), mens mengden av GRO-a ikke er signifikant forskjellig mellom de to gruppene (P > 0,05). Videre ble mengden av C5a også målt, og skjønt at noen prøver viste en økende mengde av C5a (tilstede både i PPP-og eksemgruppene), så kunne en ikke observere noen signifikante forskjeller mellom disse gruppene og kontrollgruppen.

Disse data understreker nærværet av IL-8 i materialet fra PPP-pasienter og gir et logisk grunnlag for å kunne anvende et anti-IL-8-antistoff som et terapeutisk middel ved behandling av denne sykdommen.

Claims

1. Isolert humant monoklonalt antistoff som binder seg til human IL-8,karakterisert vedå omfatte de seks CDR-sekvensene: VlCDR1 av SEKV. ID nr. 16, VLCDR2 av SEKV. ID nr. 17, VLCDR3 av SEKV. ID nr. 18, VH CDR1 av SEKV. ID nr. 22, VH CDR2 av SEKV. ID nr. 23 og VH CDR3 av SEKV. ID nr. 24.

2. Antistoff ifølge krav 1, hvor det omfatter en variabel tungkjede-aminosyresekvens som angitt i SEKV. ID nr. 12 og/eller en variabel lettkj ede-aminosyresekvens som angitt i SEKV. ID nr. 83. Antistoff ifølge kravene 1 eller 2, hvor antistoffet er valgt fra gruppen bestående av et IgGl, et IgG2, et IgG3, et IgG4, et IgM, et IgAl, et IgA2, et sekretorisk IgA, et IgD og et IgE-antistoff.4. Antistoff ifølge krav 3, hvor antistoffet er en IgGl,K eller IgGl,X-isotype 5. Antistoff ifølge krav 3, hvor antistoffet er en IgG4,K eller IgG4,X-isotype.

6. Antistoff ifølge krav 3 eller 4, hvor det omfatter en IgGl eller IgG3 tung kjede.

7. Antistoff ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor antistoffet har én eller flere av de følgende karakteristika: (i) hemmer IL-8-binding til dens reseptorer (CXCR1 og CXCR2); (ii) hemmer IL-8-induserte proinflammatoriske effekter; (iii) hemmer IL-8-indusert kjemotaktisk aktivitet for nøytrofiler; (iv) hemmer IL-8-indusert kalsiumfluks; (v) hemmer IL-8-induserte forandringer med hensyn til ekspresjonsnivået for adhesjonsmolekyler på nøytrofiler; (vi) hemmer IL-8-indusert forsterket ekspresjon av CDllb (Mac-1) og hemmer IL-8-indusert nedsatt ekspresjon av L-selektin på nøytrofiler; (vii) kryssreagerer ikke med relaterte og beslekted kjemokiner valgt fra gruppen bestående av human GRO-a, human GRO-P, human IP-10 og human NAP-2; (viii) hemmer signifikant kjemotaksis som er indusert av biologiske væsker som inneholder multiple kjemotaktiske faktorer inklusive IL-8.

8. Antistoff ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor det har ha en dissosiasjonslikevektskonstant (KD) på ca. IO"<10>M eller mindre, når dette er bestemt ved overflateplasmonresonans (SPR) teknologi i et BIACORE 3000 instrument ved å anvende rekombinant human IL-8 som analytten og antistoffet som liganden.

9. Antistoff ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor det er et intakt antistoff valgt fra gruppen bestående av et intakt IgGl -antistoff, et intakt IgG2-antistoff, et intakt IgG3-antistoff, et intakt IgG4-antistoff, et inntant IgM-antistoff, et intakt lg Al-antistoff, et intakt IgA2-antistoff, et intakt sekretorisk IgA-antistoff, et intakt IgD-antistoff, og et intakt IgE-antistoff, hvor antistoffet er glykosylert i en eukaryotisk celle

10. Antistoff ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene 1 -8, hvor det er et antistoffragment eller et enkeltkjedeantistoff.

11. Antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1-8, hvor det er et bindende-domene-immunoglobulinfusjons-protein som omfatter (i) et tungt kjedevariabelt område som definert i krav 2, et lettkjedevariabelt område som definert i krav 2, eller et tungkjedevariabelt område som definert i krav 2, fusjonert til et lettkjedevariabelt område som definert i krav 2 via et linkerpeptid som er fusjonert til et immunoglobulin hengselsområdepolypeptid; (ii) et immunoglobulin tungkjede CH2-konstant omårde fusjonert til hengselområdet; og (iii) et immunoglobulin tungkjede CH3-konstant område fusjonert til det CH2-konstante området.

12. Hybridom, karakterisert vedå produsere en påvisbar mengde av et antistoff ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene.

13. Hybridom ifølge krav 12, hvor det omfatter omfatte en B-celle oppnådd fra et transgent ikke-humant dyr hvor V-(D)-J-gensegmentomleiringer har resultert i dannelsen av et funksjonelt humant tungkjedetransgen og et funksjonelt lettkjedetransgen, fusjonert til en imortalisert celle, og hvor hybridomet produserer en påvisbar mengde av et antistoff ifølge ethvert av de foregående krav.

14. Hybridom ifølge krav 12 eller 13, hvor det produserer et humant monoklonalt antistoff som er kodet av humane IgGl -tungkjede- og humane kappa-lettkjedenukleinsyrer.

15. Transgent ikke-humant dyr, karakterisert vedå uttrykke et antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1-11, hvor det transgene ikke-humane dyret har et genom som omfatter et humant tungkjedetransgen og et humant lettkjedetransgen.

16. Transfektom eller eukaryotisk eller prokaryotisk vertscelle eller transgent ikke-humant dyr eller plante, karakterisert vedå omfatte nukleinsyrer som koder en human tung kjede og en human lett kjede, eller en cellelinje, så som en CHO- eller NS/O-cellelinje, som produserer en påvisbar mengde av antistoffet ifølge et hvilket som helst av kravene 1-11.

17. Fremgangsmåte for å fremstille antistoffet ifølge kravene 1-11,karakterisert vedå: immunisere et transgent ikke-humant dyr med et genom som omfatter et humant tungkjedetransgen og et humant lettkjedetransgen med human IL-8 eller en celle som uttrykker human IL-8, slik at antistoffene blir fremstilt av B-celler i dyret; isolere B-cellene fra dyret; fusjonere B-cellene med myelomceller for derved å danne imortale hybridomceller som skiller ut humane monoklonale antistoffer som binder seg til human IL-8; og isolere de humane monoklonale antistoffene som er spesifikke for human IL-8 fra dyrkingssupernatanten av hybridomet, eller fra et transfektom som er avledet fra et slikt hybridom.

18. Bispesifikt eller multispesifikt molekyl, karakterisert vedå omfatte et antistoff ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene 1-11, og med en bindende spesifisitet for en human effektorcelle, så som en bindingssepsifisitet for en Fc-reseptor, så som en human Fcy-reseptor, f.eks. FcyRI, eller en human Fca-reseptor, eller en T-cellereseptor så som CD3.

19. Ekspresjonsvektor, karakterisert vedå omfatte en nukleotidsekvens som koder et antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1-11.

20. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert vedå omfatte antistoffet ifølge et hvilket som helst av kravene 1-11, eller ekspresjonsvektoren ifølge krav 19 og en farmasøytisk akseptabel bærer.

21. Sammensetning ifølge krav 20, hvor den omfatter eller flere ytterligere terapeutiske midler.

22. Sammensetning ifølge krav 21, hvor nevnte ett eller flere ytterligere midler er valgt fra midler for å behandle inflammatoriske eller hyperproliferative hudlidelser, immunosupressive midler, antiinflamatoriske midler og kjemoterapeutiske midler

23. Antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1-11, en ekspresjonsvektor ifølge krav 19 eller en farmasøytisk sammensetning ifølge krav 20 for bruk i en metode for å hemme IL-8-induserte proinflammatoriske effekter i en pasient.

24. Anvendelse av antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1-11, en ekspresjonsvektor ifølge krav 19 eller en farmasøytisk sammensetning ifølge krav 20 i fremstilling av at medikament for å behandle eller å forebygge en immun, autoimmun, inflammatorisk eller infeksjonslidelse kontrollert av human IL-8 eller som involverer human IL-8-aktivitet eller for å behandle eller forebygge kreft.

25. Anvendelse ifølge krav 24, hvor lidelsen er i) en inflammatorisk eller hyperproliferativ hudlidelse valgt fra gruppen bestående av PPP, psoriasis, inklusive plakkpsoriasis og gutattype psoriasis, buløse hudlidelser så som buløs femfigoid, kontaktdermatitt, eksem, erytmatose og atopisk dermatitt; ii) en immun, autoimmun eller inflammatorisk sykdom valgt fra gruppen bestående av psoriatisk artritt, systemisk skleroderma og sklerose, inflammatorisk tarmsykdom (IBD), Crohns sykdom, ulserøs kolitt, akutt lungeskade, så som akutt respiratorisk stressyndrom og adult respiratorisk distressyndrom, meningitt, encefalitt, uveititt, multippel myelom, glomerulonefritt, nefritt, astma, aterosklerose, leukocyttadhesjonssvikt, multippel sklerose, Reynauds syndrom, Sjøgrens syndrom, ungdomsdiabetes, Reiters sykdom, Behcets sykdom, immunkompleksnefritt, IgA-nefropati, IgM-polynevropatier, immun-kontrollerte trombocyttopenier, så som akutt idiopatisk trombocytopenisk purpura og kronisk idiopatisk trombocytopenisk purpura, hemolyttisk anemi, myastenia gravis, lupus nefritt, lupus erytematose, reumatisk artritt (RA), ankyloserende spondylitt, pemfigus, Graces sykdom, Hashimotos tyroidititt, småkarvaskulitides, så som Wegeners granulomatose, Omens syndrom, kronisk nyresvikt, autoimmun tyroid sykdom, akutt infiserende mononukleose, HIV, herpesvirus assosiert med sykdommer, humane virusinfeksjoner så som vanlig forkjølelse som skyldes human rinovirus, koronovirus og andre enterovirus, herpesvirus, influensavirus, parainfluensavirus, respiratorisk synkytial virus eller adenovirusinfeksjon, bakterielungebetennelse, sår, sepsis, cerebralt slag/cerebralt ødem, ischemi-reperfusjonsskader og hepatitt C, eller; iii) er valgt fra isolert cerebral angiititt, mononevrittisk multipleks, akutt myokardialt infarkt, mykoardititt, perikardititt og Liebman-Sachs endokardititt, kronisk obstruktiv lungesykdom (COPD), alveolitt, oblitererende bronkiolitt, cystisk fibrose, allergisk aspergillose, Lofflers syndrom, skleroserende cholangiolitt, kronisk cytititt, tubulo-interstial nefritt, alvorlig akutt respiratorisk syndrom (SARS), storkarvaskulitidis (inklusive gigantcelleartritt, polymyalgi reumatika og Takayasu artritt), mellomstor karvaskulitides (inklusive polyarterititt nodosa, lokalisert polyarterititt nodosa, og Kawasaki sykdom), småkarvaskulititeds (inklusive Churg-Strauss syndrom, mikroskopisk polyartritt, kryoglobulinemisk vaskulititt, og leukocyttoklasitisk angiitt), sekundære vaskulitides (inklusive reumatisk vaskulitis og vaskulitis assosiert med systemisk lupus erytromatose eller Sjøgrens syndrom), isolert sakroleitis, SAPHO-syndromet, diskiitt (inklusive postoperativ diskiitt), subakutt tyroiditt, sikatrikial pemfigoid, dermatittis herpetiformis, subkorneal pustulær dermatose, epidermolyse bullosa acquisita, rosacea, akutt febril dermatose, granuloma annulare (inklusive Sweets syndrom), pyoderma ganbgrenosum, akne (inklusive akne conglobata), sarkoidose, tilbakevendende polykondritt, familiær mediteran feber, pannikulitt, erytema nodosum, Weber-Christians sykdom og retroperitoneal fibrose, osteoporose, osteolyttiske metastaser, mavesekkkreft, kolorektal kreft og urinblærekreft.

26. Anvendelse ifølge krav 24, hvor lidelsen velges fra gruppen bestående av melanom, tyroid karsinom, forbigående cellekarsinom, trichelenoma, skvamøs cellekarsinom og brystkreft.

27. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 23-26 hvor nevnte fremgangsmåte omfatter å administrere ett eller flere ytterligere terapeutiske midler valgt fra midler for å behandle inflammatoriske eller hyperproliferative hudlidelser, immunosupressive midler, antiinflammatoriske midler og kjemoterapeutiske midler og eventuelt ytterligere å omfatte eksponering for sollys eller fototerapi, så som UVB (bredbånd eller smalbånd ultrafiolett B), UVA (ultrafiolett A) og PUVA (psoralenmetoksalen pluss ultrafiolett A).

28. Anvendelse ifølge krav 27 hvor nevnte ett eller flere ytterligere midler er valgt fra midler for å behandle inflammatoriske eller hyperproliferative hudlidelser, valgt fra topiske, orale eller injiserte medikamenter.

29. Anvendelse ifølge krav 28, hvor nevnte topiske medikamenter er valgt fra kulltjære, A-vitamin, antralin, kalsipotrien, tarazoten og kortikosteroider, orale eller injiserte medikamenter er valgt fra kortikosteroider, metotreksat, retionider, f.eks. acitretin, syklosporin, etanresept, alefacept, efalizumab, 6-tioguanin, mykofenolat mofetil, takrolimus (FK-506) og hydroksyurea.

30. Anvendelse ifølge krav 29, hvor retinoidet er acitretin.

31. Anvendelse ifølge krav 27, hvor nevnte ett eller flere ytterligere midler er valgt fra midler som blokkerer eller påvirker funksjonen til CC- eller CXC-kjemokin-reseptorer, eller midler som blokkerer funksjonen til kjemokinligander.

32. Anvendelse ifølge krav 31, hvor nevnte middel som blokkerer eller påvirker funksjonen til CC- eller CXC-kjemokinreseptorer, er valgt fra et antistoff mot eller en naturlig eller syntetisk antagonist av CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2 eller CCR5.

33. Anvendelse ifølge krav 31, hvor nevnte middel som blokkerer funksjonen til kjemokinligander, er valgt fra et antistoff til MIP-loc, MIP-lp, RANTES, MCP-1, MCP-2, MCP-3 eller MCP-4.

34. Fremgangsmåte for å påvise nærvær av IL-8-antigen eller en celle som uttrykker IL-8 i en prøve, karakterisert vedå: kontakte prøven og en kontrollprøve med antistoffet ifølge et hvilket som helst av kravene 1-11 under betingelser som muliggjør dannelsen av et kompleks mellom antistoffet og IL-8, og påvise dannelsen av et kompleks; hvor en forskjell med hensyn til kompleksdannelse mellom prøven og kontrollprøven er en indikasjon på nærvær av IL-8 i prøven.

35. Sett for å påvise nærvær av IL-8 eller en celle som produserer IL-8 i en prøve, karakterisert vedå omfatte antistoffet ifølge et hvilket som helst av de foregående krav 1-11.

36. Sett ifølge krav 35, hvor antistoffet er i merket form.

37. Anti-idiotypisk antistoff som binder seg til et antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1-11.

38. Anvendelse av et anti-idiotypisk antistoff ifølge krav 37, for å påvise nivået av humant monoklonalt antistoff mot IL-8 i en prøve.