JP7463272B2 - キャピラリー電気泳動による純度の決定方法 - Google Patents
キャピラリー電気泳動による純度の決定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7463272B2 JP7463272B2 JP2020513903A JP2020513903A JP7463272B2 JP 7463272 B2 JP7463272 B2 JP 7463272B2 JP 2020513903 A JP2020513903 A JP 2020513903A JP 2020513903 A JP2020513903 A JP 2020513903A JP 7463272 B2 JP7463272 B2 JP 7463272B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- buffer
- sds
- sample
- electrophoresis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 title claims description 29
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 178
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 176
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 124
- GGHPAKFFUZUEKL-UHFFFAOYSA-M sodium;hexadecyl sulfate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O GGHPAKFFUZUEKL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 103
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 98
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 86
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 85
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 83
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 75
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 58
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 54
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 35
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 33
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 31
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 31
- 238000001818 capillary gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 28
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate group Chemical group S(=O)(=O)([O-])[O-] QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 23
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 claims description 14
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 claims description 10
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 9
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 8
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 8
- 239000006259 organic additive Substances 0.000 claims description 8
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 7
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 6
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 claims description 6
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 6
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 6
- NWZBFJYXRGSRGD-UHFFFAOYSA-M sodium;octadecyl sulfate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O NWZBFJYXRGSRGD-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 5
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 5
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 5
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 claims description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 4
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 4
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 claims description 4
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 claims description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims description 4
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims description 3
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 claims description 3
- QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N N,N-bis{2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl}glycine Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 3
- 238000004325 capillary sieving electrophoresis Methods 0.000 claims description 3
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 claims description 3
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 claims description 3
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 claims description 3
- 229960003330 pentetic acid Drugs 0.000 claims description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 3
- HHURSJAUVYNJBT-UHFFFAOYSA-M sodium;heptadecyl sulfate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O HHURSJAUVYNJBT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- SMECTXYFLVLAJE-UHFFFAOYSA-M sodium;pentadecyl sulfate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O SMECTXYFLVLAJE-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 claims 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 108
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 68
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 60
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 51
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 45
- 238000013368 capillary electrophoresis sodium dodecyl sulfate analysis Methods 0.000 description 39
- 229960000776 sodium tetradecyl sulfate Drugs 0.000 description 39
- UPUIQOIQVMNQAP-UHFFFAOYSA-M sodium;tetradecyl sulfate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O UPUIQOIQVMNQAP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 39
- 241000894007 species Species 0.000 description 31
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 24
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 19
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 17
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 14
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 14
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 12
- 101100075829 Caenorhabditis elegans mab-3 gene Proteins 0.000 description 11
- 239000012722 SDS sample buffer Substances 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 11
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- UOWRKHDWHDWJHK-UHFFFAOYSA-M sodium;undecyl sulfate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O UOWRKHDWHDWJHK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 9
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 9
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 8
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 8
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 7
- -1 hydrogen ions Chemical class 0.000 description 7
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 101100476210 Caenorhabditis elegans rnt-1 gene Proteins 0.000 description 6
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 239000002585 base Substances 0.000 description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 238000013103 analytical ultracentrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000000113 differential scanning calorimetry Methods 0.000 description 5
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 5
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 5
- 102100029193 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Human genes 0.000 description 4
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 4
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 4
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 4
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 4
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- XZTJQQLJJCXOLP-UHFFFAOYSA-M sodium;decyl sulfate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O XZTJQQLJJCXOLP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- NUFBIAUZAMHTSP-UHFFFAOYSA-N 3-(n-morpholino)-2-hydroxypropanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CC(O)CN1CCOCC1 NUFBIAUZAMHTSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 3
- LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N Dimethyl ether Chemical compound COC LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010021472 Fc gamma receptor IIB Proteins 0.000 description 3
- OWXMKDGYPWMGEB-UHFFFAOYSA-N HEPPS Chemical compound OCCN1CCN(CCCS(O)(=O)=O)CC1 OWXMKDGYPWMGEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100029205 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-b Human genes 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCS(O)(=O)=O JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 3
- 238000000533 capillary isoelectric focusing Methods 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- QZTKDVCDBIDYMD-UHFFFAOYSA-N 2,2'-[(2-amino-2-oxoethyl)imino]diacetic acid Chemical compound NC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O QZTKDVCDBIDYMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 2,2'-piperazine-1,4-diylbisethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AJTVSSFTXWNIRG-UHFFFAOYSA-N 2-[bis(2-hydroxyethyl)amino]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+](CCO)CCS([O-])(=O)=O AJTVSSFTXWNIRG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940058020 2-amino-2-methyl-1-propanol Drugs 0.000 description 2
- UXFQFBNBSPQBJW-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-methylpropane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(C)CO UXFQFBNBSPQBJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ACERFIHBIWMFOR-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-3-[(1-hydroxy-2-methylpropan-2-yl)azaniumyl]propane-1-sulfonate Chemical compound OCC(C)(C)NCC(O)CS(O)(=O)=O ACERFIHBIWMFOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LVQFQZZGTZFUNF-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-3-[4-(2-hydroxy-3-sulfonatopropyl)piperazine-1,4-diium-1-yl]propane-1-sulfonate Chemical compound OS(=O)(=O)CC(O)CN1CCN(CC(O)CS(O)(=O)=O)CC1 LVQFQZZGTZFUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- INEWUCPYEUEQTN-UHFFFAOYSA-N 3-(cyclohexylamino)-2-hydroxy-1-propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CC(O)CNC1CCCCC1 INEWUCPYEUEQTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XNPKNHHFCKSMRV-UHFFFAOYSA-N 4-(cyclohexylamino)butane-1-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCCNC1CCCCC1 XNPKNHHFCKSMRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LOJNFONOHINEFI-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]butane-1-sulfonic acid Chemical compound OCCN1CCN(CCCCS(O)(=O)=O)CC1 LOJNFONOHINEFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- 101000668058 Infectious salmon anemia virus (isolate Atlantic salmon/Norway/810/9/99) RNA-directed RNA polymerase catalytic subunit Proteins 0.000 description 2
- 101710099301 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 101000878457 Macrocallista nimbosa FMRFamide Proteins 0.000 description 2
- FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)=O FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MKWKNSIESPFAQN-UHFFFAOYSA-N N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCNC1CCCCC1 MKWKNSIESPFAQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- CBTVGIZVANVGBH-UHFFFAOYSA-N aminomethyl propanol Chemical compound CC(C)(N)CO CBTVGIZVANVGBH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002547 anomalous effect Effects 0.000 description 2
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 238000005515 capillary zone electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000005350 fused silica glass Substances 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013628 high molecular weight specie Substances 0.000 description 2
- 229920001600 hydrophobic polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000001012 micellar electrokinetic chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 description 2
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- HQCFDOOSGDZRII-UHFFFAOYSA-M sodium;tridecyl sulfate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O HQCFDOOSGDZRII-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 2
- QQZMYQXCPCEZEA-UHFFFAOYSA-N 1,2-diaminopropane-1-sulfonic acid Chemical compound CC(N)C(N)S(O)(=O)=O QQZMYQXCPCEZEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DURPTKYDGMDSBL-UHFFFAOYSA-N 1-butoxybutane Chemical compound CCCCOCCCC DURPTKYDGMDSBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SBASXUCJHJRPEV-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methoxyethoxy)ethanol Chemical compound COCCOCCO SBASXUCJHJRPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000954 2-hydroxyethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- RZQXOGQSPBYUKH-UHFFFAOYSA-N 3-[[1,3-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)propan-2-yl]azaniumyl]-2-hydroxypropane-1-sulfonate Chemical compound OCC(CO)(CO)NCC(O)CS(O)(=O)=O RZQXOGQSPBYUKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XCBLFURAFHFFJF-UHFFFAOYSA-N 3-[bis(2-hydroxyethyl)azaniumyl]-2-hydroxypropane-1-sulfonate Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)CS(O)(=O)=O XCBLFURAFHFFJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VTOWJTPBPWTSMK-UHFFFAOYSA-N 4-morpholin-4-ylbutane-1-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCCN1CCOCC1 VTOWJTPBPWTSMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007991 ACES buffer Substances 0.000 description 1
- 108700016232 Arg(2)-Sar(4)- dermorphin (1-4) Proteins 0.000 description 1
- 239000007989 BIS-Tris Propane buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008000 CHES buffer Substances 0.000 description 1
- PJWWRFATQTVXHA-UHFFFAOYSA-N Cyclohexylaminopropanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCNC1CCCCC1 PJWWRFATQTVXHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N Disodium Chemical compound [Na][Na] QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 1
- 108010021468 Fc gamma receptor IIA Proteins 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010008488 Glycylglycine Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007996 HEPPS buffer Substances 0.000 description 1
- GIZQLVPDAOBAFN-UHFFFAOYSA-N HEPPSO Chemical compound OCCN1CCN(CC(O)CS(O)(=O)=O)CC1 GIZQLVPDAOBAFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 102100029204 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Human genes 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- YNLCVAQJIKOXER-UHFFFAOYSA-N N-[tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCCS(O)(=O)=O YNLCVAQJIKOXER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VFTZCDVTMZWNBF-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methyl-4-aminobutanesulfonic acid Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCCCS(O)(=O)=O VFTZCDVTMZWNBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RRFPMDYYXYOXAH-UHFFFAOYSA-N OS(O)(=O)=O.CCCCCCCCCCCCCC[Na] Chemical compound OS(O)(=O)=O.CCCCCCCCCCCCCC[Na] RRFPMDYYXYOXAH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007990 PIPES buffer Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 238000001069 Raman spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000034953 Twin anemia-polycythemia sequence Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000611 antibody drug conjugate Substances 0.000 description 1
- 229940049595 antibody-drug conjugate Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000007998 bicine buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006177 biological buffer Substances 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000002051 biphasic effect Effects 0.000 description 1
- HHKZCCWKTZRCCL-UHFFFAOYSA-N bis-tris propane Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCCNC(CO)(CO)CO HHKZCCWKTZRCCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000012560 cell impurity Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011118 depth filtration Methods 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N dodecyl hydrogen sulfate Chemical compound CCCCCCCCCCCCOS(O)(=O)=O MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043264 dodecyl sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000001516 effect on protein Effects 0.000 description 1
- 239000008151 electrolyte solution Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003631 expected effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 125000001183 hydrocarbyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 108091008042 inhibitory receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000013383 initial experiment Methods 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000011165 process development Methods 0.000 description 1
- 230000003946 protein process Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- DZCAZXAJPZCSCU-UHFFFAOYSA-K sodium nitrilotriacetate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CN(CC([O-])=O)CC([O-])=O DZCAZXAJPZCSCU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- YCLWMUYXEGEIGD-UHFFFAOYSA-M sodium;2-hydroxy-3-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]propane-1-sulfonate Chemical compound [Na+].OCCN1CCN(CC(O)CS([O-])(=O)=O)CC1 YCLWMUYXEGEIGD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000012306 spectroscopic technique Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000012430 stability testing Methods 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- HXJUTPCZVOIRIF-UHFFFAOYSA-N sulfolane Chemical compound O=S1(=O)CCCC1 HXJUTPCZVOIRIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004416 surface enhanced Raman spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229960003080 taurine Drugs 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 229940048198 trisodium hedta Drugs 0.000 description 1
- WHNXAQZPEBNFBC-UHFFFAOYSA-K trisodium;2-[2-[bis(carboxylatomethyl)amino]ethyl-(2-hydroxyethyl)amino]acetate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].OCCN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CC([O-])=O WHNXAQZPEBNFBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- SOBHUZYZLFQYFK-UHFFFAOYSA-K trisodium;hydroxy-[[phosphonatomethyl(phosphonomethyl)amino]methyl]phosphinate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].OP(O)(=O)CN(CP(O)([O-])=O)CP([O-])([O-])=O SOBHUZYZLFQYFK-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/416—Systems
- G01N27/447—Systems using electrophoresis
- G01N27/44704—Details; Accessories
- G01N27/44747—Composition of gel or of carrier mixture
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
本願は、米国仮特許出願第62/555335号(2017年9月7日出願)の優先権を主張し、この開示は引用によってその全体が本明細書に援用される。
キャピラリー電気泳動によってタンパク質ピーク分離効率(PSE)を向上させることができる方法。当該方法は、界面活性剤のタンパク質への親和性を向上させることによってタンパク質分離効率(PSE)を向上させるために、界面活性剤の疎水性を上昇させることを含む。
I.用語
本開示をさらに容易に理解することができるように、いくつかの用語を最初に定義する。本開示で用いられる場合、本明細書で別段の定めがない限り、以下のそれぞれの用語は、以下に記載される意味を有するものとする。本開示全体にわたって、追加の定義が記載される。
N=16(Rt/W)2
[式中、N=理論段数(段数)、Rtはピークの保持/移動時間、およびWはピーク高の61%に描かれた接線を有するベースラインにおけるピーク幅。]
R=2(Rt2-Rt1)/(W2+W1)
[式中、R=2つのピーク間の分離、Rt1およびRt2はそれぞれ、ピーク1および2の保持/移動時間、およびW2+W1はピーク高の50%に描かれた接線を有するベースラインにおけるピーク幅の合計。]
組み換えタンパク質発現、例えば、組み換えモノクローナル抗体の発現は複雑であり、化学的および物理的分解と共に多数の翻訳後修飾を必要とする。そのため、治療タンパク質の発現には、開発と生産の各段階において定期的な観察が必要である。タンパク質の純度、不均一性、および安定性の、信頼できる頑強な評価を提供することができる分析方法が、治療タンパク質のプロセス開発および品質管理における製品の特性評価を助けるために必要である。
本開示は、本開示の電気泳動緩衝組成物を含むサンプル緩衝液中で、対象のタンパク質を変性させることを含む、電気泳動によって対象のタンパク質を分離する方法に関する。いくつかの実施態様において、電気泳動はキャピラリーゲル電気泳動である。
発明者らは、CE-SDSによるPSEが不十分なタンパク質について、界面活性剤の疎水性を増加させることによって、界面活性剤のタンパク質に対する親和性が向上し、PSEを向上させることができることを発見した。図1は、典型的なCE-SDS条件下で、ヘキサデシル硫酸ナトリウム(SHS)を含むゲルマトリクスを用いた、組み換え治療タンパク質-1(RTP-1)の泳動の、電気泳動図のオーバーレイを示す。SHSの存在によって、PSEにおいて認識できる向上が生じ、顕著な不純物ピーク(不純物ピーク1、またはIP1、図1)から主要なタンパク質ピークをベースライン分離することができた。ピーク形状と分離能の向上によって、検出および定量化限界などのアッセイの測定範囲が拡大した。特に、サンプルの添加量は、直線性を失うことなく向上させることができるため、アッセイ感度は3~4倍増加した(図2)。
a、b 界面活性剤の種類に関係なく、[界面活性剤]と同等のTmの減少
c 界面活性剤の種類に関係なく、[界面活性剤]と同等のΔH1の減少(図6C)
d ΔH2は、特定の濃度(0.1mM SDSおよび0.013mM SHS)に達した後、SHSによってさらに著しく減少した(図6D)。
試薬。グリセロール(>99%)、エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA、>99%)、デキストラン(MW~2000kDa)、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(トリズマ、>99.9%)、ホウ酸(>99.5%)、およびβ-メルカプトエタノール(>99%)は、Sigma (St. Louis, MO)から購入した。ウンデシル硫酸ナトリウム(SUS、>99%)、テトラデシル硫酸ナトリウム(STS、>95%)、およびヘキサデシル硫酸ナトリウム(SHS、>98%)の粉末は、Alfa Aesar (Wood Hill、MA)から購入した。ドデシル硫酸ナトリウム(SDS、>99%)の粉末は、Avantor (Center Valley、PA)から購入した。CGEアッセイ応用においては、10kDa 内部標準(I.S.)、0.1N 酸/塩基洗浄溶液、SDS-MWゲルおよびSDS-サンプル緩衝液、組立済みのベアフューズドシリカキャピラリーカートリッジ、および2mL ユニバーサルバイアルおよびキャップは、AB Sciex (Framingham、MA)から購入した。
チャイニーズハムスター卵巣細胞を用いて、組み換えIgG1タンパク質mAb-1、mAb-2およびmAb-3を製造した。タンパク質を使用前に-80℃から解凍した。グリセロール(>99%)、エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA、>99%)、デキストラン(MW~2000kDa)、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(トリズマ、>99.9%)、1M トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンヒドロクロライド溶液(バイオパフォーマンス認定)、ホウ酸(>99.5%)、β-メルカプトエタノール(BME、>99%)、ヨードアセトアミド(IAM、>99%)および粉末デシル硫酸ナトリウム(SC10S、>99%)を、Sigma-Aldrich (St. Louis、MO)から購入した。粉末ヘキサデシル硫酸ナトリウム(SHS、>98%)および1-テトラデシル硫酸ナトリウム(STS、>95%)は、Alfa Aesar (Wood Hill、MA)から購入し、粉末ドデシル硫酸ナトリウム(SDS、>99%)は、Avantor (Center Valley、PA)から購入した。CGE応用については、10kDa 内部標準(I.S.)、0.1N 酸/塩基洗浄溶液、組立済みのベアフューズドシリカキャピラリーカートリッジ、および2mL ユニバーサルバイアルおよびキャップは、AB Sciex (Framingham、MA)から購入した。
CE-SDS応用について、SDS-MWゲル緩衝液およびSDS-MWサンプル緩衝液(100mM トリス-HCl、1%w/v SDS、pH9.0)は、AB Sciex (Framingham、MA)から購入した。トリズマ塩基、ホウ酸、EDTA、およびグリセロールを合わせて、0.2μmフィルターを介して濾過した。界面活性剤およびデキストランを次に加えた。全ての成分が溶解した後、Thermo Scientific (Waltham、MA)から購入した、適切な大きさのPTEEボトルに液体をゆっくりと注いだ。別の界面活性剤を含むサンプル緩衝液は、以下のように調製した:特定のpH値において、1M トリス-HCl溶液を適切な濃度に希釈し、さらに界面活性剤を混合して、均一な溶液を作成した。
非還元条件下におけるCGE応用については、SDSサンプル緩衝液(100mM トリス-HCl、1%w/v SDS、pH9.0、AB Sciex)を用いて、0.9mg/mLの最終タンパク質濃度および30mM IAMで、mAbサンプルを調製した。還元条件下におけるCGE応用については、SDS-MWサンプル緩衝液、SHS含有サンプル緩衝液(0.2%w/v SHS)、STS含有サンプル緩衝液(0.5%w/v SHS)、およびSC10S含有サンプル緩衝液(2%w/v、SC10S)などの、異なるサンプル緩衝液条件を用いて、0.9mg/mLの最終タンパク質濃度および5%v/v BMEで、mAbサンプルを調製した。他に言及されない限り、非還元条件下および還元条件下におけるサンプル変性は、それぞれ70℃で5分間、および70℃で10分間行った。
CGE実験は、UV検出器および32Karat取得ソフトウェア(Version9)を備えた、PA800+機器(AB Sciex、Framingham、MA)において行った。電気泳動分離は、サンプル注入点から20cmの位置におけて検出を行い、15kVの定電圧で、内径50μmのプレカットキャピラリーにおいて生じた。32karatからのデータは、データ処理のためにEmpower3(Build 3471、Waters、Milford、MA)に転送した。
図9は、一般的なCE-SDS還元条件下における、mAb-1およびmAb-3の泳動の電気泳動図のオーバーレイを示す。これらの2つの還元されたmAb分子は、主な成分に関しては同等の分離プロファイルを示すが、HC後の高分子量領域において、マイナー種の異なるパターン(図9BにおいてA~Dと表示)を示す。これらのマイナー種のうち、種A(赤い長方形で強調される)がmAb-1およびmAb-3のサンプルトレースにおいて見られる。ピークAの移動時間は、1つの重鎖および1つの軽鎖(H:L)から成る半抗体フラグメントに対応する。種D(矢印で示される)はまた、有意なレベルにおいて両方のサンプルトレースにおいて見られ、これは非還元CE-SDS条件下で観察された、抗体の重鎖-重鎖フラグメントに非常に近い分子量を有する(図9)。2つの共通のマイナー種に加えて、mAb-1サンプルトレースのHC後領域に存在する、さらなるグループB(破線の長方形で囲まれる)およびピークC(一部ピークDと共に移動する)が存在し、これはAおよびD種に対する移動位置から、75~100kDaの範囲内の分子量(MW)を有すると推定される。CE-SDS還元条件を用いて、mAb-1の純度は、LC(31.2%)およびHC(64.0%)の相対率の合計を含めて、95.3%と測定された。NGHC種は0.6%であり、これは純度の計算から除外された。mAb-1の全てのHC後のHMW種の合計パーセントは、3.0%と決定され、グループB種は約2.0%であった。
サンプル緩衝液/ゲルマトリックス調製
多くの場合、タンパク質サンプルに作用するサンプル緩衝液のSDS量を増加させることが、タンパク質変性の完了を促進させるための最初の試みである。開始時のCE-SDSサンプル緩衝液のSDS%を0.5%から4%で変化させることによって、1成分ずつ(OFAT)の研究を行い、還元mAb-1サンプルの得られた電気泳動図を、図12において重ねた。SDS%はサンプルロード効率に影響するため、サンプル泳動の注入時間は、標準化したピーク面積に到達するように適宜調節した。より高いSDS%を含むサンプル緩衝液によって調製した還元mAb-1サンプルにおいて、より多くのグループBのHMW人工物がさらに観察され、一方で試験範囲においてA種の量は一定に保たれた。サンプル緩衝液のSDS%が0.5%から4%で変化するとき、%総HMWの全体的な増加は、約1.5%(絶対値)であった。一方で、ふるいゲルマトリックスに存在するSDS%の影響もまた調査した。図13は、1%SDSサンプル緩衝液を用いて生成し、0.2%~4%SDSを含むゲルマトリックスによって分離した、還元mAb-1サンプルの電気泳動図を比較する。サンプル緩衝液のSDS%のOFAT研究において観測された傾向と同様に、グループBのHMW種における有意な上昇もまた、ゲルマトリックスにおいて存在するSDS%の上昇と共に認められた。上記の2つの実験のセットから得られた結果によって、サンプルおよびゲル緩衝液の両方におけるSDSの濃度の単純な調整では、HMW人工物の問題を軽減することはできないことが確認された。
温度および時間などの、サンプルインキュベート条件が、タンパク質の変性に大きな影響を与えることは周知である。タンパク質の変性が不十分であるため、穏やかなインキュベート条件下で変性させたmAbサンプルのCE-SDSプロファイルにおいては、通常明らかにHMW種が存在する。インキュベート条件の変更が、人工HMW種の生成を抑制するのに有効であるかとうかを調査するために。60℃、5分から90℃、15分にわたる、異なるインキュベート条件セットにおいて、mAb-1サンプルを変性および還元させた。その後、販売会社によって供給されたSDSに基づくゲルを用いて、還元mAb-1サンプルを分離し、得られた電気泳動図を図14Aに示す。60℃、5分の最も穏やかなインキュベート条件において、11%より多いグループB種が生じた。インキュベート時間を10分に延長することによって、グループB種の量は3.5%に劇的に減少したが、さらに厳しいインキュベート条件を適用しても、その生成は有意に減少しなかった。比較のために、典型的なCE-SDS条件下で良好な挙動を示すmAb-3分子もまた、同様のインキュベート条件を用いて評価し、得られた分離プロファイルを図14Bに列挙する。mAb-1サンプルにおいて見られるグループB種と同等のMWを有するHMW種はまた、60℃、3分の穏やかなインキュベート条件下で、mAb-3サンプルにおいても生じたことが分かった。
通常のCE-SDS法の最適化戦略は、還元条件下におけるmAb-1分子の十分な変性を助けることができなかった。非還元条件下におけるHMW人工物の抑制に関して、mAb-1分子の純度解析にSHSゲルを用いることによってもたらされる利益を考慮すると、サンプル緩衝液および/またはふるいゲルマトリックスにおいて用いられる、標準的な界面活性剤SDSを、さらに疎水性の界面活性剤に置き換えることによって、還元mAb-1分子のHC後HMW人工物に対処する可能性があるという仮説を立てた。
表2.還元mAB-1サンプル解析におけるピーク率
還元条件下におけるmAb-2分子の純度測定はまた、偏りのない純度結果および向上した分離効果を得ることができるように、、サンプル緩衝液およびふるいゲルマトリックスの両方において、比較的疎水性の界面活性剤が存在する必要がある。対照的に、mAb-3分子は、相対的な疎水性界面活性剤、または通常のCE-SDS法において用いられる標準的な界面活性剤SDSを用いて、同等のCGE効果を得た。
***
Claims (32)
- 硫酸ヘッド基および14個より多い炭素原子を有するアルキル鎖を含む疎水性テールを含む、疎水性界面活性剤を含む緩衝組成物中で、キャピラリー電気泳動によって、サンプル中の変性された対象のタンパク質を分離することを含む、タンパク質サンプルの解析方法。
- 硫酸ヘッド基および14個より多い炭素原子を有するアルキル鎖を含む疎水性テールを含む、疎水性界面活性剤を含む緩衝組成物中で、サンプル中の変性された対象のタンパク質を分離することを含む、キャピラリー電気泳動タンパク質ピーク分離効率(PSE)を向上させる方法。
- 硫酸ヘッド基および14個より多い炭素原子を有するアルキル鎖を含む疎水性テールを含む、疎水性界面活性剤を含む緩衝組成物中で、サンプル中の変性された対象のタンパク質を分離することを含む、キャピラリー電気泳動によって決定されるタンパク質純度を向上させる方法。
- 疎水性界面活性剤が同じ電荷の硫酸ヘッド基、および16のアルキル鎖長のナトリウム対イオンを含む、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- アルキル鎖が19または20より少ない炭素原子を有する、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- アルキル鎖が15、16、17、または18個の炭素原子を有する、請求項5に記載の方法。
- 疎水性界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムよりも疎水性である、請求項1~3および5~6のいずれか1項に記載の方法。
- 疎水性界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウムと比較して、キャピラリーふるい電気泳動によるタンパク質ピーク分離効率の向上を誘導することができる、請求項1~3および5~6のいずれか1項に記載の方法。
- 疎水性界面活性剤が、ペンタデシル硫酸ナトリウム、ヘキサデシル硫酸ナトリウム(SHS)、ヘプタデシル硫酸ナトリウム、およびオクタデシル硫酸ナトリウム(SOS)から成る群から選択される、請求項1~3および5~6のいずれか1項に記載の方法。
- 疎水性界面活性剤がヘキサデシル硫酸ナトリウム(SHS)である、請求項9に記載の方法。
- 疎水性界面活性剤が約0.001%から約4%w/vの濃度である、請求項1~3および5~6のいずれか1項に記載の方法。
- 組成物がさらに、緩衝成分、有機性添加剤、親水性ポリマー、金属キレーター、およびそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される、1つ以上のさらなる成分を含む、請求項1~11のいずれか1項に記載の方法。
- 緩衝成分がトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項12に記載の方法。
- 有機性添加剤がマンニトール、グリセロール、エチレングリコール、エタノール、メタノール、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項12または13に記載の方法。
- 親水性ポリマーがデキストラン、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項12~14のいずれか1項に記載の方法。
- 金属キレーターがエチレンジアミンテトラ酢酸、ジエチレントリアミンペンタ酢酸、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項12~15のいずれか1項に記載の方法。
- 硫酸ヘッド基および14個より多い炭素原子を有するアルキル鎖を含む疎水性テールを含む、疎水性界面活性剤を含む緩衝組成物中で、対象のタンパク質を変性させることを含む、電気泳動によるサンプル中の対象のタンパク質の分離方法。
- さらにサンプルを泳動緩衝液中の電気泳動ゲルに泳動させることを含む、請求項17に記載の方法。
- 泳動緩衝液が、硫酸ヘッド基および14個より多い炭素原子を有するアルキル鎖を含む疎水性テールを含む疎水性界面活性剤を含む、請求項18に記載の方法。
- 電気泳動によるサンプル中の対象のタンパク質のピーク分離効率を向上させる方法であって、硫酸ヘッド基および14個より多い炭素原子を有するアルキル鎖を含む疎水性テールを含む、疎水性界面活性剤を含む緩衝組成物中で、対象のタンパク質を変性させること、およびサンプルを泳動緩衝液中の電気泳動ゲルに泳動させることを含み、タンパク質ピーク分離効率(PSE)が、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を用いて行った分離のタンパク質ピーク分離効率(PSE)に比べて向上する、方法。
- 電気泳動がキャピラリーゲル電気泳動である、請求項17~20のいずれか1項に記載の方法。
- 変性が、少なくとも約60℃の温度で行われる、請求項1~3および17~21のいずれか1項に記載の方法。
- 変性が、約60℃および約70℃の間の温度で行われる、請求項1~3および17~22のいずれか1項に記載の方法。
- 変性が、少なくとも約3分にわたって行われる、請求項1~3および17~23のいずれか1項に記載の方法。
- 対象のタンパク質が抗体である、請求項1~3および17~24のいずれか1項に記載の方法。
- 抗体がIgM、IgA、IgE、IgD、およびIgGから選択されるアイソタイプである、請求項25に記載の方法。
- IgG抗体がIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4から選択される、請求項26に記載の方法。
- 対象のタンパク質が、酵素、ホルモン、サイトカイン、細胞表面受容体、プロテアーゼ、サイトカイン受容体、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項1~3および17~24のいずれか1項に記載の方法。
- 対象のタンパク質が融合タンパク質である、請求項28に記載の方法。
- 融合タンパク質が非相同部位に融合している、請求項29に記載の方法。
- 非相同部位が半減期延長部位である、請求項30に記載の方法。
- 半減期延長部位がFcを含む、請求項31に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201762555335P | 2017-09-07 | 2017-09-07 | |
US62/555,335 | 2017-09-07 | ||
PCT/US2018/049992 WO2019051252A1 (en) | 2017-09-07 | 2018-09-07 | METHOD FOR DETERMINING PURITY BY CAPILLARY ELECTROPHORESIS |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2020533582A JP2020533582A (ja) | 2020-11-19 |
JP7463272B2 true JP7463272B2 (ja) | 2024-04-08 |
Family
ID=63684605
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020513903A Active JP7463272B2 (ja) | 2017-09-07 | 2018-09-07 | キャピラリー電気泳動による純度の決定方法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US11698358B2 (ja) |
EP (1) | EP3679364A1 (ja) |
JP (1) | JP7463272B2 (ja) |
KR (1) | KR20200050999A (ja) |
CN (1) | CN111316091A (ja) |
WO (1) | WO2019051252A1 (ja) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111220676B (zh) * | 2019-11-13 | 2022-11-29 | 上海药明生物技术有限公司 | 利用毛细管电泳技术检测含聚乙二醇的蛋白质样品纯度的方法 |
JP2021173705A (ja) * | 2020-04-28 | 2021-11-01 | 国立大学法人北海道大学 | 標的ポリペプチドの情報取得方法および試薬キット |
CN111781240A (zh) * | 2020-07-06 | 2020-10-16 | 上海理工大学 | 差示扫描量热法dsc曲线的分峰拟合方法 |
CN112649488B (zh) * | 2020-11-30 | 2022-08-23 | 深圳市人民医院 | 一种低背景银染聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的方法 |
CN112305048B (zh) * | 2020-12-22 | 2021-03-30 | 苏桥生物(苏州)有限公司 | Mes和sds缓冲液在降低毛细管电泳碎片峰中的应用 |
CN113189183A (zh) * | 2021-04-28 | 2021-07-30 | 浙江大学 | 含有还原剂的毛细管凝胶电泳检测试剂盒 |
CN114791458A (zh) * | 2022-04-25 | 2022-07-26 | 大连博格林生物科技有限公司 | 一种通过电泳分离蛋白的凝胶、配合使用的缓冲液及其试剂盒 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005099031A (ja) | 1995-05-19 | 2005-04-14 | Molecular Probes Inc | メロシアニン染料タンパク質染色 |
US20060160235A1 (en) | 2004-11-19 | 2006-07-20 | Craighead Harold G | Separation of denatured proteins in free solution |
US20090314638A1 (en) | 2002-08-12 | 2009-12-24 | Beckman Coulter, Inc. | Methods and Compositions for Capillary Electrophoresis |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1993015394A1 (en) * | 1992-01-31 | 1993-08-05 | Beckman Instruments, Inc. | Capillary column containing removable separation gel composition and method of use |
US6579718B1 (en) * | 2000-08-04 | 2003-06-17 | Molecular Probes, Inc. | Carbazolylvinyl dye protein stains |
FR2819888B1 (fr) * | 2001-01-19 | 2003-09-12 | Sebia Sa | Procede de separation de proteines par electrophorese capillaire et compositions de tampon pour electrophorese capillaire |
JP4739763B2 (ja) | 2002-12-16 | 2011-08-03 | ゲンマブ エー/エス | インターロイキン8(il−8)に対するヒトモノクローナル抗体 |
KR20130133302A (ko) | 2003-12-10 | 2013-12-06 | 메다렉스, 인코포레이티드 | Ip―10 항체 및 그의 용도 |
FR2869995B1 (fr) * | 2004-05-10 | 2006-09-22 | Sebia Sa | Procede ameliore de separation de proteines par electrophorese capillaire et compositions de tampon pour electrophorese capillaire |
US8449880B2 (en) * | 2010-11-22 | 2013-05-28 | Vladislav Dolnik | Chemical modification of proteins for their more accurate molecular-weight determination by electrophoresis |
EA201391582A1 (ru) | 2011-04-29 | 2014-03-31 | Бристол-Майерс Сквибб Компани | Режимы повышения дозы антител против ip-10 |
EP2865685A1 (en) * | 2013-10-24 | 2015-04-29 | Westfälische Wilhelms-Universität Münster | Electrophoretic analysis of a sample using N-Lauroylsarcosine |
SG11201610431WA (en) * | 2014-06-25 | 2017-01-27 | Jhl Biotech Inc | Methods and reagents for purification of proteins |
CA2971732A1 (en) | 2014-12-23 | 2016-06-30 | Bristol-Myers Squibb Company | Antibodies to tigit |
US10556948B2 (en) | 2015-11-30 | 2020-02-11 | Bristol-Myers Squibb Company | IP-10 antibodies and their uses |
-
2018
- 2018-09-07 WO PCT/US2018/049992 patent/WO2019051252A1/en unknown
- 2018-09-07 JP JP2020513903A patent/JP7463272B2/ja active Active
- 2018-09-07 EP EP18778772.6A patent/EP3679364A1/en active Pending
- 2018-09-07 CN CN201880071480.7A patent/CN111316091A/zh active Pending
- 2018-09-07 US US16/645,059 patent/US11698358B2/en active Active
- 2018-09-07 KR KR1020207009586A patent/KR20200050999A/ko not_active Application Discontinuation
-
2023
- 2023-05-25 US US18/324,079 patent/US20230393094A1/en active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005099031A (ja) | 1995-05-19 | 2005-04-14 | Molecular Probes Inc | メロシアニン染料タンパク質染色 |
US20090314638A1 (en) | 2002-08-12 | 2009-12-24 | Beckman Coulter, Inc. | Methods and Compositions for Capillary Electrophoresis |
US20060160235A1 (en) | 2004-11-19 | 2006-07-20 | Craighead Harold G | Separation of denatured proteins in free solution |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
BRYAN F SHAW. ET AL,EFFECT OF SURFACTANT HYDROPHOBICITY ON THE PATHWAY FOR UNFOLDING OF UBIQUITIN,JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY,米国,AMERICAN CHEMICAL SOCIETY,2012年11月14日,VOL:134, NR:45,PAGE(S):18739 - 18745,http://dx.doi.org/10.1021/ja3079863 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20230393094A1 (en) | 2023-12-07 |
JP2020533582A (ja) | 2020-11-19 |
US11698358B2 (en) | 2023-07-11 |
CN111316091A (zh) | 2020-06-19 |
EP3679364A1 (en) | 2020-07-15 |
WO2019051252A1 (en) | 2019-03-14 |
US20210025847A1 (en) | 2021-01-28 |
KR20200050999A (ko) | 2020-05-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7463272B2 (ja) | キャピラリー電気泳動による純度の決定方法 | |
CN109716127B (zh) | 定量包含非离子表面活性剂和多肽的组合物中非离子表面活性剂的层析方法 | |
Kinoshita et al. | Quality assurance of monoclonal antibody pharmaceuticals based on their charge variants using microchip isoelectric focusing method | |
EP3294775B1 (en) | Multimeric protein purity determination | |
ES2705700T3 (es) | Elucidación de la optimización de entrada en cromatografía de intercambio iónico | |
US20230417701A1 (en) | Ce-western applications for antibody development | |
Zhang et al. | Imaged capillary isoelectric focusing in native condition: a novel and successful example | |
US20200393455A1 (en) | Methods for identifying and quantitating host cell protein | |
US20230296559A1 (en) | Methods and systems for analyzing polypeptide variants | |
Marie et al. | Capillary electrophoresis for the quality control of intact therapeutic monoclonal antibodies | |
JP7482853B2 (ja) | アフィニティキャピラリ電気泳動のシステム及び方法 | |
WO2015079977A1 (ja) | 抗体分離方法、抗体評価方法、医薬の評価方法、及び、抗体の2次元電気泳動用キット | |
US20200081003A1 (en) | Systems and methods for affinity capillary electrophoresis | |
Lock et al. | Native State Charge Variant Analysis of Commercialized Monoclonal Antibodies |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210823 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20220531 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220621 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20220920 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20221118 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20221221 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230328 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20230627 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20230825 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230926 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20231017 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20240216 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20240226 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20240319 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20240327 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7463272 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |