JP2020533582A - キャピラリー電気泳動による純度の決定方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、米国仮特許出願第62/555335号(2017年9月7日出願)の優先権を主張し、この開示は引用によってその全体が本明細書に援用される。
キャピラリー電気泳動によってタンパク質ピーク分離効率(PSE)を向上させることができる方法。当該方法は、界面活性剤のタンパク質への親和性を向上させることによってタンパク質分離効率(PSE)を向上させるために、界面活性剤の疎水性を上昇させることを含む。
I.用語
本開示をさらに容易に理解することができるように、いくつかの用語を最初に定義する。本開示で用いられる場合、本明細書で別段の定めがない限り、以下のそれぞれの用語は、以下に記載される意味を有するものとする。本開示全体にわたって、追加の定義が記載される。
N=16(Rt/W)2
[式中、N=理論段数(段数)、Rtはピークの保持/移動時間、およびWはピーク高の61%に描かれた接線を有するベースラインにおけるピーク幅。]
R=2(Rt2−Rt1)/(W2+W1)
[式中、R=2つのピーク間の分離、Rt1およびRt2はそれぞれ、ピーク1および2の保持/移動時間、およびW2+W1はピーク高の50%に描かれた接線を有するベースラインにおけるピーク幅の合計。]
組み換えタンパク質発現、例えば、組み換えモノクローナル抗体の発現は複雑であり、化学的および物理的分解と共に多数の翻訳後修飾を必要とする。そのため、治療タンパク質の発現には、開発と生産の各段階において定期的な観察が必要である。タンパク質の純度、不均一性、および安定性の、信頼できる頑強な評価を提供することができる分析方法が、治療タンパク質のプロセス開発および品質管理における製品の特性評価を助けるために必要である。
本開示は、本開示の電気泳動緩衝組成物を含むサンプル緩衝液中で、対象のタンパク質を変性させることを含む、電気泳動によって対象のタンパク質を分離する方法に関する。いくつかの実施態様において、電気泳動はキャピラリーゲル電気泳動である。
発明者らは、CE−SDSによるPSEが不十分なタンパク質について、界面活性剤の疎水性を増加させることによって、界面活性剤のタンパク質に対する親和性が向上し、PSEを向上させることができることを発見した。図1は、典型的なCE−SDS条件下で、ヘキサデシル硫酸ナトリウム(SHS)を含むゲルマトリクスを用いた、組み換え治療タンパク質−1(RTP−1)の泳動の、電気泳動図のオーバーレイを示す。SHSの存在によって、PSEにおいて認識できる向上が生じ、顕著な不純物ピーク(不純物ピーク1、またはIP1、図1)から主要なタンパク質ピークをベースライン分離することができた。ピーク形状と分離能の向上によって、検出および定量化限界などのアッセイの測定範囲が拡大した。特に、サンプルの添加量は、直線性を失うことなく向上させることができるため、アッセイ感度は3〜4倍増加した(図2)。
a RTP−1サンプル溶液は対応する界面活性剤を含んでいた。
a、b 界面活性剤の種類に関係なく、[界面活性剤]と同等のTmの減少
c 界面活性剤の種類に関係なく、[界面活性剤]と同等のΔH1の減少(図6C)
d ΔH2は、特定の濃度(0.1mM SDSおよび0.013mM SHS)に達した後、SHSによってさらに著しく減少した(図6D)。
試薬。グリセロール(>99%)、エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA、>99%)、デキストラン(MW〜2000kDa)、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(トリズマ、>99.9%)、ホウ酸(>99.5%)、およびβ−メルカプトエタノール(>99%)は、Sigma (St. Louis, MO)から購入した。ウンデシル硫酸ナトリウム(SUS、>99%)、テトラデシル硫酸ナトリウム(STS、>95%)、およびヘキサデシル硫酸ナトリウム(SHS、>98%)の粉末は、Alfa Aesar (Wood Hill、MA)から購入した。ドデシル硫酸ナトリウム(SDS、>99%)の粉末は、Avantor (Center Valley、PA)から購入した。CGEアッセイ応用においては、10kDa 内部標準(I.S.)、0.1N 酸/塩基洗浄溶液、SDS−MWゲルおよびSDS−サンプル緩衝液、組立済みのベアフューズドシリカキャピラリーカートリッジ、および2mL ユニバーサルバイアルおよびキャップは、AB Sciex (Framingham、MA)から購入した。
チャイニーズハムスター卵巣細胞を用いて、組み換えIgG1タンパク質mAb−1、mAb−2およびmAb−3を製造した。タンパク質を使用前に−80℃から解凍した。グリセロール(>99%)、エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA、>99%)、デキストラン(MW〜2000kDa)、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(トリズマ、>99.9%)、1M トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンヒドロクロライド溶液(バイオパフォーマンス認定)、ホウ酸(>99.5%)、β−メルカプトエタノール(BME、>99%)、ヨードアセトアミド(IAM、>99%)および粉末デシル硫酸ナトリウム(SC10S、>99%)を、Sigma−Aldrich (St. Louis、MO)から購入した。粉末ヘキサデシル硫酸ナトリウム(SHS、>98%)および1−テトラデシル硫酸ナトリウム(STS、>95%)は、Alfa Aesar (Wood Hill、MA)から購入し、粉末ドデシル硫酸ナトリウム(SDS、>99%)は、Avantor (Center Valley、PA)から購入した。CGE応用については、10kDa 内部標準(I.S.)、0.1N 酸/塩基洗浄溶液、組立済みのベアフューズドシリカキャピラリーカートリッジ、および2mL ユニバーサルバイアルおよびキャップは、AB Sciex (Framingham、MA)から購入した。
CE−SDS応用について、SDS−MWゲル緩衝液およびSDS−MWサンプル緩衝液(100mM トリス−HCl、1%w/v SDS、pH9.0)は、AB Sciex (Framingham、MA)から購入した。トリズマ塩基、ホウ酸、EDTA、およびグリセロールを合わせて、0.2μmフィルターを介して濾過した。界面活性剤およびデキストランを次に加えた。全ての成分が溶解した後、Thermo Scientific (Waltham、MA)から購入した、適切な大きさのPTEEボトルに液体をゆっくりと注いだ。別の界面活性剤を含むサンプル緩衝液は、以下のように調製した:特定のpH値において、1M トリス−HCl溶液を適切な濃度に希釈し、さらに界面活性剤を混合して、均一な溶液を作成した。
非還元条件下におけるCGE応用については、SDSサンプル緩衝液(100mM トリス−HCl、1%w/v SDS、pH9.0、AB Sciex)を用いて、0.9mg/mLの最終タンパク質濃度および30mM IAMで、mAbサンプルを調製した。還元条件下におけるCGE応用については、SDS−MWサンプル緩衝液、SHS含有サンプル緩衝液(0.2%w/v SHS)、STS含有サンプル緩衝液(0.5%w/v SHS)、およびSC10S含有サンプル緩衝液(2%w/v、SC10S)などの、異なるサンプル緩衝液条件を用いて、0.9mg/mLの最終タンパク質濃度および5%v/v BMEで、mAbサンプルを調製した。他に言及されない限り、非還元条件下および還元条件下におけるサンプル変性は、それぞれ70℃で5分間、および70℃で10分間行った。
CGE実験は、UV検出器および32Karat取得ソフトウェア(Version9)を備えた、PA800+機器(AB Sciex、Framingham、MA)において行った。電気泳動分離は、サンプル注入点から20cmの位置におけて検出を行い、15kVの定電圧で、内径50μmのプレカットキャピラリーにおいて生じた。32karatからのデータは、データ処理のためにEmpower3(Build 3471、Waters、Milford、MA)に転送した。
図9は、一般的なCE−SDS還元条件下における、mAb−1およびmAb−3の泳動の電気泳動図のオーバーレイを示す。これらの2つの還元されたmAb分子は、主な成分に関しては同等の分離プロファイルを示すが、HC後の高分子量領域において、マイナー種の異なるパターン(図9BにおいてA〜Dと表示)を示す。これらのマイナー種のうち、種A(赤い長方形で強調される)がmAb−1およびmAb−3のサンプルトレースにおいて見られる。ピークAの移動時間は、1つの重鎖および1つの軽鎖(H:L)から成る半抗体フラグメントに対応する。種D(矢印で示される)はまた、有意なレベルにおいて両方のサンプルトレースにおいて見られ、これは非還元CE−SDS条件下で観察された、抗体の重鎖−重鎖フラグメントに非常に近い分子量を有する(図9)。2つの共通のマイナー種に加えて、mAb−1サンプルトレースのHC後領域に存在する、さらなるグループB(破線の長方形で囲まれる)およびピークC(一部ピークDと共に移動する)が存在し、これはAおよびD種に対する移動位置から、75〜100kDaの範囲内の分子量(MW)を有すると推定される。CE−SDS還元条件を用いて、mAb−1の純度は、LC(31.2%)およびHC(64.0%)の相対率の合計を含めて、95.3%と測定された。NGHC種は0.6%であり、これは純度の計算から除外された。mAb−1の全てのHC後のHMW種の合計パーセントは、3.0%と決定され、グループB種は約2.0%であった。
サンプル緩衝液/ゲルマトリックス調製
多くの場合、タンパク質サンプルに作用するサンプル緩衝液のSDS量を増加させることが、タンパク質変性の完了を促進させるための最初の試みである。開始時のCE−SDSサンプル緩衝液のSDS%を0.5%から4%で変化させることによって、1成分ずつ(OFAT)の研究を行い、還元mAb−1サンプルの得られた電気泳動図を、図12において重ねた。SDS%はサンプルロード効率に影響するため、サンプル泳動の注入時間は、標準化したピーク面積に到達するように適宜調節した。より高いSDS%を含むサンプル緩衝液によって調製した還元mAb−1サンプルにおいて、より多くのグループBのHMW人工物がさらに観察され、一方で試験範囲においてA種の量は一定に保たれた。サンプル緩衝液のSDS%が0.5%から4%で変化するとき、%総HMWの全体的な増加は、約1.5%(絶対値)であった。一方で、ふるいゲルマトリックスに存在するSDS%の影響もまた調査した。図13は、1%SDSサンプル緩衝液を用いて生成し、0.2%〜4%SDSを含むゲルマトリックスによって分離した、還元mAb−1サンプルの電気泳動図を比較する。サンプル緩衝液のSDS%のOFAT研究において観測された傾向と同様に、グループBのHMW種における有意な上昇もまた、ゲルマトリックスにおいて存在するSDS%の上昇と共に認められた。上記の2つの実験のセットから得られた結果によって、サンプルおよびゲル緩衝液の両方におけるSDSの濃度の単純な調整では、HMW人工物の問題を軽減することはできないことが確認された。
温度および時間などの、サンプルインキュベート条件が、タンパク質の変性に大きな影響を与えることは周知である。タンパク質の変性が不十分であるため、穏やかなインキュベート条件下で変性させたmAbサンプルのCE−SDSプロファイルにおいては、通常明らかにHMW種が存在する。インキュベート条件の変更が、人工HMW種の生成を抑制するのに有効であるかとうかを調査するために。60℃、5分から90℃、15分にわたる、異なるインキュベート条件セットにおいて、mAb−1サンプルを変性および還元させた。その後、販売会社によって供給されたSDSに基づくゲルを用いて、還元mAb−1サンプルを分離し、得られた電気泳動図を図14Aに示す。60℃、5分の最も穏やかなインキュベート条件において、11%より多いグループB種が生じた。インキュベート時間を10分に延長することによって、グループB種の量は3.5%に劇的に減少したが、さらに厳しいインキュベート条件を適用しても、その生成は有意に減少しなかった。比較のために、典型的なCE−SDS条件下で良好な挙動を示すmAb−3分子もまた、同様のインキュベート条件を用いて評価し、得られた分離プロファイルを図14Bに列挙する。mAb−1サンプルにおいて見られるグループB種と同等のMWを有するHMW種はまた、60℃、3分の穏やかなインキュベート条件下で、mAb−3サンプルにおいても生じたことが分かった。
通常のCE−SDS法の最適化戦略は、還元条件下におけるmAb−1分子の十分な変性を助けることができなかった。非還元条件下におけるHMW人工物の抑制に関して、mAb−1分子の純度解析にSHSゲルを用いることによってもたらされる利益を考慮すると、サンプル緩衝液および/またはふるいゲルマトリックスにおいて用いられる、標準的な界面活性剤SDSを、さらに疎水性の界面活性剤に置き換えることによって、還元mAb−1分子のHC後HMW人工物に対処する可能性があるという仮説を立てた。
表2.還元mAB−1サンプル解析におけるピーク率
還元条件下におけるmAb−2分子の純度測定はまた、偏りのない純度結果および向上した分離効果を得ることができるように、、サンプル緩衝液およびふるいゲルマトリックスの両方において、比較的疎水性の界面活性剤が存在する必要がある。対照的に、mAb−3分子は、相対的な疎水性界面活性剤、または通常のCE−SDS法において用いられる標準的な界面活性剤SDSを用いて、同等のCGE効果を得た。
***
Claims (37)
- 疎水性界面活性剤ゲル緩衝液を含む、キャピラリー電気泳動によって、サンプル中の変性された対象のタンパク質を分離することを含む、タンパク質サンプルの解析方法。
- 疎水性界面活性剤ゲル緩衝液中のサンプル中の変性された対象のタンパク質を分離することを含む、キャピラリー電気泳動タンパク質ピーク分離効率(PSE)を向上させる方法。
- 疎水性界面活性剤ゲル緩衝液中のサンプル中の変性された対象のタンパク質を分離することを含む、キャピラリー電気泳動によって決定されるタンパク質純度を向上させる方法。
- 疎水性界面活性剤を含む、タンパク質分離解析のためのキャピラリー電気泳動ゲル緩衝液。
- 疎水性界面活性剤が同じ電荷の硫酸ヘッド基、および14〜16から選択されるアルキル鎖長のナトリウム対イオンを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 疎水性界面活性剤がテトラデシル硫酸ナトリウム(STS)およびヘキサデシル硫酸ナトリウム(SHS)から成る群から選択される、請求項5に記載の方法。
- 疎水性界面活性剤がヘキサデシル硫酸ナトリウム(SHS)である、請求項6に記載の方法。
- 硫酸ヘッド基、および12個より多い炭素原子を有するアルキル鎖を含む疎水性テールを含む疎水性界面活性剤を含む、電気泳動緩衝組成物。
- アルキル鎖が19または20より少ない炭素原子を有する、請求項8に記載の緩衝組成物。
- アルキル鎖が13、14、15、16、17、または18個の炭素原子を有する、請求項9に記載の緩衝組成物。
- 疎水性界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムよりも疎水性である、請求項8〜10のいずれか1項に記載の緩衝組成物。
- 疎水性界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウムと比較して、キャピラリーふるい電気泳動によるタンパク質ピーク分離効率の向上を誘導することができる、請求項8〜11のいずれか1項に記載の緩衝組成物。
- 疎水性界面活性剤が、トリデシル硫酸ナトリウム、テトラデシル硫酸ナトリウム(STS)、ペンタデシル硫酸ナトリウム、ヘキサデシル硫酸ナトリウム(SHS)、ヘプタデシル硫酸ナトリウム、およびオクタデシル硫酸ナトリウム(SOS)から成る群から選択される、請求項8〜12のいずれか1項に記載の緩衝組成物。
- 疎水性界面活性剤がヘキサデシル硫酸ナトリウム(SHS)である、請求項13に記載の緩衝組成物。
- 疎水性界面活性剤が約0.001%から約4%w/vの濃度である、請求項8〜14のいずれか1項に記載の緩衝組成物。
- 組成物がさらに、緩衝成分、有機性添加剤、親水性ポリマー、金属キレーター、およびそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される、1つ以上のさらなる成分を含む、請求項8〜15のいずれか1項に記載の緩衝組成物。
- 緩衝成分がトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項16に記載の緩衝組成物。
- 有機性添加剤がマンニトール、グリセロール、エチレングリコール、エタノール、メタノール、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項16または17に記載の緩衝組成物。
- 親水性ポリマーがデキストラン、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項16〜18のいずれか1項に記載の緩衝組成物。
- 金属キレーターがエチレンジアミンテトラ酢酸、ジエチレントリアミンペンタ酢酸、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項16〜19のいずれか1項に記載の緩衝組成物。
- 請求項4に記載の緩衝液、または請求項8〜20のいずれか1項に記載の組成物を含むサンプル緩衝液中の、対象のタンパク質を変性させることを含む、電気泳動による対象のタンパク質の分離方法。
- さらに泳動緩衝液中で電気泳動ゲルを泳動させることを含む、請求項21に記載の方法。
- 泳動緩衝液および/または電気泳動ゲルが、請求項4に記載の緩衝液または請求項8〜20のいずれか1項に記載の組成物を含む、請求項22に記載の方法。
- 請求項4に記載の緩衝液、または請求項8〜20のいずれか1項に記載の組成物を含むサンプル緩衝液中の、対象のタンパク質を変性させること、および泳動緩衝液中で電気泳動ゲルを泳動させることを含む、電気泳動による対象のタンパク質のピーク分離効率を向上させる方法であって、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を用いて行った分離のタンパク質ピーク分離効率(PSE)に比べて、タンパク質ピーク分離効率(PSE)が向上する、方法。
- 電気泳動がキャピラリーゲル電気泳動である、請求項21〜24のいずれか1項に記載の方法。
- 電気泳動ゲルの結果が、ドデシル硫酸ナトリウムを用いて行われた電気泳動ゲルに比べて、人工高分子量種が少ないことを示す、請求項1〜3、5〜7、および21〜25のいずれか1項に記載の方法。
- 変性が、少なくとも約60℃、少なくとも約65℃、少なくとも約70℃、少なくとも約75℃、または少なくとも約80℃の温度で行われる、請求項1〜3、5〜7、および21〜26のいずれか1項に記載の方法。
- 変性が、約60℃および約70℃の間、約65℃および約70℃の間、または約60℃および約65℃の間の温度で行われる、請求項1〜3、5〜7、および21〜26のいずれか1項に記載の方法。
- 変性が、少なくとも約3分、少なくとも約4分、少なくとも約5分、少なくとも約6分、少なくとも約7分、少なくとも約8分、少なくとも約9分、少なくとも約10分にわたって行われる、請求項1〜3、5〜7、および21〜28のいずれか1項に記載の方法。
- 対象のタンパク質が抗体である、請求項1〜3、5〜7、および21〜29のいずれか1項に記載の方法。
- 抗体がIgM、IgA、IgE、IgD、およびIgGから選択されるアイソタイプである、請求項30に記載の方法。
- IgG抗体がIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4から選択される、請求項31に記載の方法。
- 対象のタンパク質が、酵素、ホルモン、サイトカイン、細胞表面受容体、プロテアーゼ、サイトカイン受容体、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項1〜3、5〜7、および21〜29のいずれか1項に記載の方法。
- 対象のタンパク質が融合タンパク質である、請求項33に記載の方法。
- 融合タンパク質が非相同部位に融合している、請求項34に記載の方法。
- 非相同部位が半減期延長部位である、請求項35に記載の方法。
- 半減期延長部位がFcを含む、請求項36に記載の方法。
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