CN113189183A - 含有还原剂的毛细管凝胶电泳检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种含有还原剂的毛细管凝胶电泳检测试剂盒,所述还原剂选自单硫醇化合物和双硫醇化合物,其中单硫醇化合物选自11‑巯基‑1‑十一醇,双硫醇化合物选自2,2’‑(1,2‑乙二基双氧代)双乙硫醇和双巯基乙酸乙二醇酯。本发明的试剂盒可以降低还原型毛细管凝胶电泳分析生物制药如单克隆抗体过程中的对环境的污染和对人体的危害,同时确保还原条件下纯度的准确性,这些生物药包括重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体、重组抗HER2人源化单克隆抗体、T‑DM1和注射用重组人II型肿瘤坏死因子受体‑抗体融合蛋白。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及还原型毛细管凝胶电泳对蛋白质的分析,尤其涉及一种能够准确检测生物制药如抗体纯度的含有还原剂的毛细管凝胶电泳检测试剂盒。
背景技术
随着生物制药领域的不断发展,越来越多的技术被应用于治疗性蛋白的异质性表征。其中,毛细管凝胶电泳(CGE)作为一项从传统的板凝胶电泳发展而来的技术,以其自动化、快速、高分辨率和在线定量等优点,逐步成为诸多生物制药尤其是抗体的纯度表征工具之一。以单抗为例,在还原型分析中,蛋白分子会被还原剂还原并与表面活性剂结合,形成均一质荷比(m/z)的蛋白质-去污剂复合物,随后在电场作用下进行分离。该方法能很好地表征单抗样品的轻重链以及非糖基化重链,被广泛应用于生物制药的批量释放和稳定性试验中,以确定样品的纯度和生产一致性。
目前,巯基乙醇已在生物制药领域内被广泛应用于蛋白样品的还原,并以其较强的还原能力成为了还原型CE-SDS分析中常用的还原剂,参考药典的公示方法(2020中华人民共和国药典<3127>单抗分子大小变异体测定法(CE-SDS法))。但是在该药典规定的还原供试品溶液制备方法中,有5μL巯基乙醇原液被添加进95μL供试品溶液(1mg/mL)中,以进行样品的彻底还原。一方面,这是为了保证还原效果以不影响还原型CE-SDS的分析,该样品制备方法是可取的。但是另一方面,考虑到巯基乙醇原液浓度较高(14M),在高温下有引起燃烧的危险,且巯基乙醇极易挥发,具有极强的刺激性气味,具有较高的生物毒性和环境污染风险等等。因此,实验人员在实验过程中被提醒穿实验服,佩戴防毒面具并在通风橱操作,并且妥善丢弃实验垃圾,但是关于巯基乙醇的危害仍旧不容忽视。我们认为需要将还原型CE-SDS方法进行进一步优化,开发出具有等同还原效果的新方法,同时降低对环境的污染和对实验人员实验安全的影响,以便还原型CE-SDS分析能够更加安全地进行以适应当前蛋白类生物药分析业内的需求。
发明内容
本发明实际所要解决的技术问题,就是针对现有的还原型CE-SDS检测方法的危害性较大的问题,提供了一种含有还原剂的毛细管凝胶电泳检测试剂盒,所述试剂盒的样品缓冲液中含有一种还原剂,该试剂盒能降低还原型CE-SDS检测对实验人员和环境的危害性的同时确保抗体分子大小异构体结果的准确性。
本发明公开了一种含有还原剂的毛细管凝胶电泳检测试剂盒,所述样品缓冲液中含有至少一种还原剂;所述的还原剂选自11-巯基-1-十一醇、2,2’-(1,2-乙二基双氧代)双乙硫醇或双巯基乙酸乙二醇酯中的一种或多种。
优选的,所述样品缓冲液中游离巯基的浓度为0.07-700mM,优选0.7-70mM,更优选7-70mM。
优选的,所述样品缓冲液选自Tris缓冲液或者磷酸盐缓冲液,所述样品缓冲液的pH值在3.0-10.0之间,优选的,所述样品缓冲液选自Tris-HCl缓冲液或者磷酸盐-柠檬酸缓冲液,pH值在6.5-10.0之间。更优选的,所述样品缓冲液选自pH 9.0的Tris-HCl缓冲液或pH6.5的磷酸盐-柠檬酸缓冲液。
所述样品缓冲液进一步含有十二烷基硫酸钠,其含量在0.1-5%(w/w)之间,优选0.5-2%(w/w),更优选1%(w/w)。
优选的,所述样品缓冲液含有如下组分:
(1)Tris-HCl缓冲液100mM;
(2)十二烷基硫酸钠1%(w/w);
(3)选自11-巯基-1-十一醇、2,2’-(1,2-乙二基双氧代)双乙硫醇或双巯基乙酸乙二醇酯中的一种或多种的还原剂,其总游离巯基的浓度为7mM;
pH值为9.0。
上述样品缓冲液的制备方法为:将处方量的Tris缓冲盐,处方量的十二烷基硫酸钠和处方量的还原剂溶解在去离子水中,用盐酸调节pH至9.0,接着用去离子水定容至50mL,得到样品缓冲液。
优选的,所述样品缓冲液含有如下组分:
(1)磷酸盐-柠檬酸缓冲液20mM;
(2)十二烷基硫酸钠1%(w/w);
(3)选自11-巯基-1-十一醇、2,2’-(1,2-乙二基双氧代)双乙硫醇或双巯基乙酸乙二醇酯中的一种或多种的还原剂,其总游离巯基的浓度为7 0mM;
pH值为6.5。
上述样品缓冲液的制备方法为:将处方量的磷酸盐,处方量的十二烷基硫酸钠和处方量的还原剂溶解在适量的去离子水中,用柠檬酸调节pH至6.5,接着用去离子水定容至50mL,得到样品缓冲液。
本发明还公开了上述的试剂盒对蛋白样品进行还原型CE-SDS检测的应用,其中,所述蛋白样品选自重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)、重组抗HER2人源化单克隆抗体(mAb2)、T-DM1(ADC)和注射用重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(Fusionprotein)。
本发明的有益效果为:
使用本发明的添加了还原剂的毛细管凝胶电泳检测试剂盒,根据CE厂商Beckman公司推荐的样品处理方法(70℃加热15分钟),可以准确表征生物制药如抗体纯度的准确性,同时显著降低传统的还原方法带来的安全问题,降低对环境的污染以及对人体的伤害。
附图说明
图1单硫醇化合物如巯基乙醇,11-巯基-1-十一醇和巯基丁二酸的结构;
图2双硫醇化合物如二硫苏糖醇,2,2’-(1,2-乙二基双氧代)双乙硫醇和双巯基乙酸乙二醇酯的结构;
图3实施例1中不同浓度巯基乙醇在pH 9.0的缓冲液中对重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)的还原型CE-SDS纯度影响;
图4实施例2中不同浓度11-巯基-1-十一醇在pH 9.0的缓冲液中对重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)的还原型CE-SDS纯度影响;
图5实施例3中不同浓度巯基丁二酸在pH 9.0的缓冲液中对重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)的还原型CE-SDS纯度影响;
图6实施例4中不同浓度二硫苏糖醇在pH 9.0的缓冲液中对重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)的还原型CE-SDS纯度影响;
图7实施例5中不同浓度2,2’-(1,2-乙二基双氧代)双乙硫醇在pH 9.0的缓冲液中对重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)的还原型CE-SDS纯度影响;
图8实施例6中不同浓度双巯基乙酸乙二醇酯在pH 9.0的缓冲液中对重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)的还原型CE-SDS纯度影响;
图9实施例7中游离巯基浓度为7mM的不同还原剂在pH 9.0的缓冲液中对重组抗HER2人源化单克隆抗体(mAb2,2013年批次)的还原型CE-SDS纯度影响;各谱图分别为:巯基乙醇(a);11-巯基-1-十一醇(b);巯基丁二酸(c);二硫苏糖醇(d);2,2’-(1,2-乙二基双氧代)双乙硫醇(e);双巯基乙酸乙二醇酯(f);
图10实施例8中游离巯基浓度为7mM的不同还原剂在pH 9.0的缓冲液中对重组抗HER2人源化单克隆抗体(mAb2,2016年批次)的还原型CE-SDS纯度影响;各谱图分别为:巯基乙醇(a);11-巯基-1-十一醇(b);巯基丁二酸(c);二硫苏糖醇(d);2,2’-(1,2-乙二基双氧代)双乙硫醇(e);双巯基乙酸乙二醇酯(f);
图11实施例9中游离巯基浓度为7mM的不同还原剂在pH 9.0的缓冲液中对T-DM1(ADC)的还原型CE-SDS纯度影响;各谱图分别为:巯基乙醇(a);11-巯基-1-十一醇(b);巯基丁二酸(c);二硫苏糖醇(d);2,2’-(1,2-乙二基双氧代)双乙硫醇(e);双巯基乙酸乙二醇酯(f);
图12实施例10中游离巯基浓度为7mM的不同还原剂在pH 9.0的缓冲液中对注射用重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(Fusion protein)的还原型CE-SDS纯度影响;各谱图分别为:巯基乙醇(a);11-巯基-1-十一醇(b);巯基丁二酸(c);二硫苏糖醇(d);2,2’-(1,2-乙二基双氧代)双乙硫醇(e);双巯基乙酸乙二醇酯(f);
图13实施例11中不同浓度巯基乙醇在pH 6.5的缓冲液中对重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)的还原型CE-SDS纯度影响;
图14实施例12中不同浓度11-巯基-1-十一醇在pH 6.5的缓冲液中对重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)的还原型CE-SDS纯度影响;
图15实施例13中不同浓度二硫苏糖醇在pH 6.5的缓冲液中对重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)的还原型CE-SDS纯度影响;
图16实施例14中不同浓度2,2’-(1,2-乙二基双氧代)双乙硫醇在pH 6.5的缓冲液中对重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)的还原型CE-SDS纯度影响;
图17实施例15中不同浓度双巯基乙酸乙二醇酯在pH 6.5的缓冲液中对重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)的还原型CE-SDS纯度影响;
图18实施例16中70mM巯基乙醇在pH 9.0的缓冲液中(无SDS)对胰高血糖素亲水/疏水性的影响;还原剂在pH 9.0的缓冲液中70℃加热15分钟(a);胰高血糖素在pH 9.0的缓冲液中70℃加热15分钟(b);还原剂和胰高血糖素在pH 9.0的缓冲液中70℃加热15分钟(c);
图19实施例17中70mM 11-巯基-1-十一醇在pH 9.0的缓冲液中对胰高血糖素亲水/疏水性的影响;还原剂在pH 9.0的缓冲液中70℃加热15分钟(a);胰高血糖素在pH 9.0的缓冲液中70℃加热15分钟(b);还原剂和胰高血糖素在pH 9.0的缓冲液中70℃加热15分钟(c);
图20实施例18中70mM巯基丁二酸在pH 9.0的缓冲液中对胰高血糖素亲水/疏水性的影响;还原剂在pH 9.0的缓冲液中70℃加热15分钟(a);胰高血糖素在pH 9.0的缓冲液中70℃加热15分钟(b);还原剂和胰高血糖素在pH 9.0的缓冲液中70℃加热15分钟(c);
图21实施例19中35mM二硫苏糖醇在pH 9.0的缓冲液中对胰高血糖素亲水/疏水性的影响;还原剂在pH 9.0的缓冲液中70℃加热15分钟(a);胰高血糖素在pH 9.0的缓冲液中70℃加热15分钟(b);还原剂和胰高血糖素在pH 9.0的缓冲液中70℃加热15分钟(c);
图22实施例20中35mM 2,2’-(1,2-乙二基双氧代)双乙硫醇在pH 9.0的缓冲液中对胰高血糖素亲水/疏水性的影响;还原剂在pH 9.0的缓冲液中70℃加热15分钟(a);胰高血糖素在pH 9.0的缓冲液中70℃加热15分钟(b);还原剂和胰高血糖素在pH 9.0的缓冲液中70℃加热15分钟(c);
图23实施例21中35mM双巯基乙酸乙二醇酯在pH 9.0的缓冲液中对胰高血糖素亲水/疏水性的影响;还原剂在pH 9.0的缓冲液中70℃加热15分钟(a);胰高血糖素在pH 9.0的缓冲液中70℃加热15分钟(b);还原剂和胰高血糖素在pH 9.0的缓冲液中70℃加热15分钟(c)。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明进一步进行说明。必须指出,以下实施例是用于说明本发明,而不是对本发明的限制。
本发明考虑到巯基乙醇具有极强的刺激性气味,具有较高的生物毒性和环境污染风险等等问题,且原方法的巯基乙醇终浓度为700mM,因此考虑寻找替代性的还原剂。并评估了多款硫醇化合物的还原效果,其中单硫醇化合物包括11-巯基-1-十一醇和巯基丁二酸,双硫醇化合物包括二硫苏糖醇,2,2’-(1,2-乙二基双氧代)双乙硫醇和双巯基乙酸乙二醇酯。
11-巯基-1-十一醇是比巯基乙醇多了9个碳原子的化合物,其结构见图1。11-巯基-1-十一醇的熔点为33-37C(lit.),密度为0.790g/mL(25C),其一定程度上溶于水,基本无挥发性,无刺激性气味,常用于两步法合成不对称二硫化物,用于制备亲水性自组装单分子层(Wang等.Direct quantification of cancerous exosomes via surface plasmonresonance with dual gold nanoparticle-assisted signal amplification.BiosensBioelectron.2019,135:129-136;Lacour等.Formation kinetics of mixed self-assembled monolayers of alkanethiols on GaAs(100).Langmuir.2019,35(13):4415-4427.)
巯基丁二酸一般指DL-巯基琥珀酸,其结构见图1,为无色结晶或白色粉末,熔点为155-157C(lit.),是冷烫剂的主要组分,还用于络合隐蔽、生化研究、重金属解毒剂及橡胶工业(Yapor,JP等.Biodegradable crosslinked polyesters derived from thiomalicacid and S-nitrosothiol analogues for nitric oxide release.J Mater ChemB.2018,6(24):4071-4081;Sheini,A.A paper-based device for the colorimetricdetermination of ammonia and carbon dioxide using thiomalic acid and maltolfunctionalized silver nanoparticles:application to the enzymaticdetermination of urea in saliva and blood.Mikrochim Acta.2020,187(10):565.)。
二硫苏糖醇(Dithiothreitol,简称为DTT)是一种小分子有机还原剂,其结构见图2。其熔点为41-44C(lit.),沸点为125℃,密度为1.04g/mL(20℃),酸度系数(pKa)为8.9(25℃),白色粉末,水溶性较好。其还原性很大程度上取决于氧化状态六元环(含二硫键)的构象稳定性,还原力受pH值的影响,在pH值大于7的情况下还原效果较好。近些年,在蛋白质的还原型分析中,二硫苏糖醇较有应用(Cherkaoui,S等.Tracking of antibody reductionfragments by capillary gel electrophoresis during the coupling tomicroparticles surface.J Pharm Biomed Anal.2010,53(2):172-8;Santarino,IB等.Protein reducing agents dithiothreitol and tris(2-carboxyethyl)phosphineanodic oxidation.Electrochem commun.2012,23:114-117;Wiesner,R等.A comparativestudy of CE-SDS,SDS-PAGE,and Simple Western:Influences of sample preparationon molecular weight determination of proteins.Electrophoresis.2021,42(3):206-218.)。
2,2’-(1,2-乙二基双氧代)双乙硫醇是一种醇类衍生物,其结构见图2。其沸点为225℃(lit.),密度为1.12g/mL(25℃)(lit.),易溶于有机溶剂,常用作医药中间体(Du GL等.Tough and biocompatible hydrogels based on in situ interpenetratingnetworks of dithiol-connected graphene oxide and poly(vinyl alcohol).ACS ApplMater Interfaces.2015,7(5):3003-8;Yun,S等.Low-density,hydrophobic,highlyflexible ambientpressure-dried monolithic bridged silsesquioxane aerogels.JMater Chem A Mater.2015,3(7):3390-3398;Elkassih,SA 等.Degradable redox-responsive disulfide-based nanogel drug carriers via dithiol oxidationpolymerization.Biomater Sci.2019,7(2):607-617.)。
双巯基乙酸乙二醇酯,其结构见图2。其沸点为137-139C 2mm Hg(lit.),密度为1.313g/mL(25C)(lit.),溶解度为20g/L(20℃),用于还原剂和有机合成(TANG,LH等.Themodulation of N-methyl-D-aspartate receptors by redox and alkylating reagentsin rat cortical neurones in vitro.J Physiol.1993,465:303-23;Yao,Z等.Kineticsbased on the base-catalyzed mechanism of a click reaction between glycoldimercaptoacetate and glycidyl phenyl ether.RSC Adv.2017,7(18):10881-10884.)。
气味内容:巯基乙醇为挥发性液体,具有强烈的刺激性气味,在Chemical Book这一致力于为化学行业用户提供最有价值信息的资源平台中,巯基乙醇被规定属于精神药品或易制毒化学品或管制类产品,不得非法销售或购买。公司或单位需取得相关部门发放的许可证并按法律规定进行登记备案。物流、仓储均需具有相应资质的物流公司和仓储公司,严禁使用快递运输。
11-巯基-1-十一醇的相比于巯基乙醇,其碳骨架延长了9个碳原子,分子量更大,一定程度上溶于水并且挥发性显著减弱,几乎无明显恶臭味。
2,2’-(1,2-乙二基双氧代)双乙硫醇是醇类衍生物,沸点为225℃(lit.),挥发性较弱,在本专利的优选浓度下可以溶于水,几乎无明显的恶臭味。
双巯基乙酸乙二醇酯属于酯类化合物,其沸点为137-139C 2mm Hg(lit.),挥发性较弱,在本发明的优选浓度下可以溶于水,几乎无明显的恶臭味。
以下各实施例中的抗体非还原型CE-SDS纯度检测均使用Beckman公司推荐的方法。
实施例1不同浓度巯基乙醇在pH 9.0的缓冲液中对重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)的还原型CE-SDS纯度影响
称取Tris 0.606g,SDS 0.5g,用42mL去离子水溶解至清,加入2.5mL巯基乙醇原液(14M),再用3M盐酸调节pH至9.0,接着用去离子水定容至50mL,得到含700mM巯基乙醇的样品缓冲液。接着用不含还原剂的样品缓冲液与含有700mM巯基乙醇的样品缓冲液,依次稀释得到含有70mM、7mM、0.7mM和0.07mM巯基乙醇的样品缓冲液。将重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)用上述配制好的样品缓冲液稀释至1mg/mL,随后经水浴变性,进行毛细管凝胶电泳分析。
随后比较了不同浓度的巯基乙醇对重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)的还原型CE-SDS纯度的影响。结果见表1和图3。其中,发现游离巯基浓度在7mM及以上时,还原较彻底。
表1.不同浓度巯基乙醇对重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)的还原型CE-SDS轻重链纯度影响
实施例2不同浓度11-巯基-1-十一醇在pH 9.0的缓冲液中对重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)的还原型CE-SDS纯度影响
称取Tris 0.606g,SDS 0.5g,11-巯基-1-十一醇(MW:204.37)0.7153g,用42mL去离子水溶解至清,再用3M盐酸调节pH至9.0,接着用去离子水定容至50mL,得到含70mM 11-巯基-1-十一醇的样品缓冲液。由于溶解度的限制,无法得到700mM浓度的缓冲液。接着用不含还原剂的样品缓冲液与含有70mM 11-巯基-1-十一醇的样品缓冲液,依次稀释得到含有7mM、0.7mM和0.07mM 11-巯基-1-十一醇的样品缓冲液。将重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)用上述配制好的样品缓冲液稀释至1mg/mL,随后经水浴变性,进行毛细管凝胶电泳分析。
随后比较了不同浓度的11-巯基-1-十一醇对重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)的还原型CE-SDS纯度的影响。结果见表2和图4。其中,发现游离巯基浓度在7mM及以上时,还原较彻底。
表2.不同浓度11-巯基-1-十一醇对重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)的还原型CE-SDS轻重链纯度影响
实施例3不同浓度巯基丁二酸在pH 9.0的缓冲液中对重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)的还原型CE-SDS纯度影响
称取Tris 0.606g,SDS 0.5g,巯基丁二酸(MW:150.15)5.255g,用42mL去离子水溶解至清,再用3M盐酸调节pH至9.0,接着用去离子水定容至50mL,得到含700mM巯基丁二酸的样品缓冲液。接着用不含还原剂的样品缓冲液与含有700mM巯基丁二酸的样品缓冲液,依次稀释得到含有70mM、7mM、0.7mM和0.07mM巯基丁二酸的样品缓冲液。将重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)用上述配制好的样品缓冲液稀释至1mg/mL,随后经水浴变性,进行毛细管凝胶电泳分析。
随后比较了不同浓度的巯基丁二酸对重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)的还原型CE-SDS纯度的影响。结果见图5。其中,发现不论游离巯基浓度如何,还原均不彻底,甚至高浓度的巯基丁二酸存在下,单抗样品的信号受到显著抑制。
实施例4不同浓度二硫苏糖醇在pH 9.0的缓冲液中对重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)的还原型CE-SDS纯度影响
称取Tris 0.606g,SDS 0.5g,二硫苏糖醇(MW:154.25)2.699g,用42mL去离子水溶解至清,再用3M盐酸调节pH至9.0,接着用去离子水定容至50mL,得到含350mM二硫苏糖醇的样品缓冲液。接着用不含还原剂的样品缓冲液与含有350mM二硫苏糖醇的样品缓冲液,依次稀释得到含有35mM、3.5mM、0.35mM和0.035mM二硫苏糖醇的样品缓冲液。将重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)用上述配制好的样品缓冲液稀释至1mg/mL,随后经水浴变性,进行毛细管凝胶电泳分析。
随后比较了不同浓度的二硫苏糖醇对重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)的还原型CE-SDS纯度的影响。结果见图6。其中,发现游离巯基浓度在0.7mM及以上时,还原较彻底。但是发现二硫苏糖醇的浓度过高会形成干扰峰,因此推测游离巯基的合适浓度不得低于0.7mM,不得高于70mM,优选0.7-7mM。
实施例5不同浓度2,2’-(1,2-乙二基双氧代)双乙硫醇在pH 9.0的缓冲液中对重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)的还原型CE-SDS纯度影响
称取Tris 0.606g,SDS 0.5g,用42mL去离子水溶解至清,加入0.29mL 2,2’-(1,2-乙二基双氧代)双乙硫醇原液(6M),再用3M盐酸调节pH至9.0,接着用去离子水定容至50mL,得到含35mM 2,2’-(1,2-乙二基双氧代)双乙硫醇的样品缓冲液。由于溶解度的限制,无法得到350mM浓度的缓冲液。接着用不含还原剂的样品缓冲液与含有35mM 2,2’-(1,2-乙二基双氧代)双乙硫醇的样品缓冲液,依次稀释得到含有3.5mM、0.35mM和0.035mM 2,2’-(1,2-乙二基双氧代)双乙硫醇的样品缓冲液。将重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)用上述配制好的样品缓冲液稀释至1mg/mL,随后经水浴变性,进行毛细管凝胶电泳分析。
随后比较了不同浓度的2,2’-(1,2-乙二基双氧代)双乙硫醇对重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)的还原型CE-SDS纯度的影响。结果见表3和图7。其中,发现游离巯基浓度在0.7mM及以上时,还原较彻底。
表3.不同浓度2,2’-(1,2-乙二基双氧代)双乙硫醇对重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)的还原型CE-SDS轻重链纯度影响
实施例6不同浓度双巯基乙酸乙二醇酯在pH 9.0的缓冲液中对重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)的还原型CE-SDS纯度影响
称取Tris 0.606g,SDS 0.5g,用42mL去离子水溶解至清,加入0.29mL双巯基乙酸乙二醇酯(6M),再用3M盐酸调节pH至9.0,接着用去离子水定容至50mL,得到含35mM双巯基乙酸乙二醇酯的样品缓冲液。由于溶解度的限制,无法得到350mM浓度的缓冲液。接着用不含还原剂的样品缓冲液与含有35mM双巯基乙酸乙二醇酯的样品缓冲液,依次稀释得到含有3.5mM、0.35mM和0.035mM双巯基乙酸乙二醇酯的样品缓冲液。将重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)用上述配制好的样品缓冲液稀释至1mg/mL,随后经水浴变性,进行毛细管凝胶电泳分析。
随后比较了不同浓度的双巯基乙酸乙二醇酯对重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)的还原型CE-SDS纯度的影响。结果见表4和图8。其中,发现游离巯基浓度在0.7mM及以上时,还原较彻底。
表4.不同浓度双巯基乙酸乙二醇酯对重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)的还原型CE-SDS轻重链纯度影响
实施例7在pH 9.0的缓冲液中游离巯基浓度为7mM的不同还原剂对重组抗HER2人源化单克隆抗体(mAb2,2013年批次)的还原型CE-SDS纯度影响
比较了在pH 9.0的缓冲液中游离巯基浓度为7mM的不同还原剂对重组抗HER2人源化单克隆抗体(mAb2,2013年批次)的还原型CE-SDS纯度影响,结果见表5和图9。发现除了巯基丁二酸以外,其他还原剂在游离巯基浓度为7mM时,还原较彻底。
表5.不同还原剂对重组抗HER2人源化单克隆抗体(mAb2,2013年批次)的还原型CE-SDS纯度影响
实施例8在pH 9.0的缓冲液中游离巯基浓度为7mM的不同还原剂对重组抗HER2人源化单克隆抗体(mAb2,2016年批次)的还原型CE-SDS纯度影响
比较了在pH 9.0的缓冲液中游离巯基浓度为7mM的不同还原剂对重组抗HER2人源化单克隆抗体(mAb2,2016年批次)的还原型CE-SDS纯度影响,结果见表6和图10。发现除了巯基丁二酸以外,其他还原剂在游离巯基浓度为7mM时,还原较彻底。
表6.不同还原剂对重组抗HER2人源化单克隆抗体(mAb2,2016年批次)的还原型CE-SDS纯度影响
实施例9在pH 9.0的缓冲液中游离巯基浓度为7mM的不同还原剂对T-DM1(ADC)的还原型CE-SDS纯度影响
比较了在pH 9.0的缓冲液中游离巯基浓度为7mM的不同还原剂对T-DM1(ADC)的还原型CE-SDS纯度影响,结果见表7和图11。发现除了巯基丁二酸以外,其他还原剂在游离巯基浓度为7mM时,还原较彻底。
表7.不同还原剂对T-DM1(ADC)的还原型CE-SDS纯度影响
实施例10在pH 9.0的缓冲液中游离巯基浓度为7mM的不同还原剂对注射用重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(Fusion protein)的还原型CE-SDS纯度影响
比较了在pH 9.0的缓冲液中游离巯基浓度为7mM的不同还原剂对注射用重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(Fusion protein)的还原型CE-SDS纯度影响,结果见表8和图12。发现除了巯基丁二酸以外,其他还原剂在游离巯基浓度为7mM时,还原较彻底。
表8.不同还原剂对注射用重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(Fusionprotein)的还原型CE-SDS纯度影响
实施例11不同浓度巯基乙醇在pH 6.5的缓冲液中对重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)的还原型CE-SDS纯度影响
称取磷酸钠0.164g,SDS 0.5g,用42mL去离子水溶解至清,加入2.5mL巯基乙醇原液(14M),再用1M柠檬酸调节pH至6.5,接着用去离子水定容至50mL,得到含700mM巯基乙醇的样品缓冲液。接着用该不含还原剂的样品缓冲液与含有700mM巯基乙醇的样品缓冲液,依次稀释得到含有70mM和7mM巯基乙醇的样品缓冲液。将重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)用上述配制好的样品缓冲液稀释至1mg/mL,随后经水浴变性,进行毛细管凝胶电泳分析。
随后比较了不同浓度的巯基乙醇对重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)的还原型CE-SDS纯度的影响。结果见图13。其中,发现游离巯基浓度在7mM以上时,还原较彻底,优选70mM。
实施例12不同浓度11-巯基-1-十一醇在pH 6.5的缓冲液中对重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)的还原型CE-SDS纯度影响
称取磷酸钠0.164g,SDS 0.5g,11-巯基-1-十一醇(MW:204.37)0.7153g,用42mL去离子水溶解至清,再用1M柠檬酸调节pH至6.5,接着用去离子水定容至50mL,得到含70mM11-巯基-1-十一醇的样品缓冲液。由于溶解度的限制,无法得到700mM浓度的缓冲液。接着用不含还原剂的样品缓冲液与含有70mM 11-巯基-1-十一醇的样品缓冲液,依次稀释得到含有7mM和0.7mM 11-巯基-1-十一醇的样品缓冲液。将重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)用上述配制好的样品缓冲液稀释至1mg/mL,随后经水浴变性,进行毛细管凝胶电泳分析。
随后比较了不同浓度的11-巯基-1-十一醇对重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)的还原型CE-SDS纯度的影响。结果见图14。结果表明,在三种游离巯基浓度下,还原均未彻底。
实施例13不同浓度二硫苏糖醇在pH 6.5的缓冲液中对重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)的还原型CE-SDS纯度影响
称取磷酸钠0.164g,SDS 0.5g,二硫苏糖醇(MW:154.25)2.699g,用42mL去离子水溶解至清,再用1M柠檬酸调节pH至6.5,接着用去离子水定容至50mL,得到含350mM二硫苏糖醇的样品缓冲液。接着用不含还原剂的样品缓冲液与含有350mM二硫苏糖醇的样品缓冲液,依次稀释得到含有35mM、3.5mM和0.35mM二硫苏糖醇的样品缓冲液。将重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)用上述配制好的样品缓冲液稀释至1mg/mL,随后经水浴变性,进行毛细管凝胶电泳分析。
随后比较了不同浓度的二硫苏糖醇对重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)的还原型CE-SDS纯度的影响。结果见图15。其中,发现游离巯基浓度在7mM及以上时,还原较彻底。但是发现游离巯基的浓度过高如达到70mM或者700mM时,会形成干扰峰,因此推测游离巯基的合适浓度不得低于7mM,不得高于70mM,优选7mM。
实施例14不同浓度2,2’-(1,2-乙二基双氧代)双乙硫醇在pH 6.5的缓冲液中对重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)的还原型CE-SDS纯度影响
称取磷酸钠0.164g,SDS 0.5g,用42mL去离子水溶解至清,加入0.29mL2,2’-(1,2-乙二基双氧代)双乙硫醇原液(6M),再用1M柠檬酸调节pH至6.5,接着用去离子水定容至50mL,得到含35mM 2,2’-(1,2-乙二基双氧代)双乙硫醇的样品缓冲液。由于溶解度的限制,无法得到350mM浓度的缓冲液。接着用不含还原剂的样品缓冲液与含有35mM 2,2’-(1,2-乙二基双氧代)双乙硫醇的样品缓冲液,依次稀释得到含有3.5mM和0.35mM 2,2’-(1,2-乙二基双氧代)双乙硫醇的样品缓冲液。将重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)用上述配制好的样品缓冲液稀释至1mg/mL,随后经水浴变性,进行毛细管凝胶电泳分析。
随后比较了不同浓度的2,2’-(1,2-乙二基双氧代)双乙硫醇对重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)的还原型CE-SDS纯度的影响。结果见图16。其中,发现游离巯基浓度在7mM以上时,还原较彻底,优选70mM。
实施例15不同浓度双巯基乙酸乙二醇酯在pH 6.5的缓冲液中对重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)的还原型CE-SDS纯度影响
称取磷酸钠0.164g,SDS 0.5g,用42mL去离子水溶解至清,加入0.29mL双巯基乙酸乙二醇酯(6M),再用1M柠檬酸调节pH至6.5,接着用去离子水定容至50mL,得到含35mM双巯基乙酸乙二醇酯的样品缓冲液。由于溶解度的限制,无法得到350mM浓度的缓冲液。接着用不含还原剂的样品缓冲液与含有35mM双巯基乙酸乙二醇酯的样品缓冲液,依次稀释得到含有3.5mM和0.35mM双巯基乙酸乙二醇酯的样品缓冲液。将重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)用上述配制好的样品缓冲液稀释至1mg/mL,随后经水浴变性,进行毛细管凝胶电泳分析。
随后比较了不同浓度的双巯基乙酸乙二醇酯对重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)的还原型CE-SDS纯度的影响。结果见图17。其中,发现游离巯基浓度在0.7mM以上时,还原较彻底,优选70mM。
实施例16在pH 9.0的缓冲液中游离巯基浓度为70mM的不同还原剂对胰高血糖素亲水/疏水性的影响
为了探究以上几种还原剂潜在的副反应,我们利用胰高血糖素进行了反相色谱的研究。采用Agilent 1200高效液相色谱系统(Agilent Technologies,Santa Clara,California)和Elite supersil C18反相色谱柱(Dalian,China)对从而对样品的疏水/亲水杂质进行了表征。流动相A为水(含0.1%甲酸),流动相B为乙腈(含0.1%甲酸),使用前用0.45μm尼龙膜过滤脱气。检测波长为214nm,柱温37℃下,流速为0.8mL/min。初始流动相为10%溶剂B,持续5min,然后在25分钟内,B相比例上升至60%。进样量为20μL。
配置了不含SDS,pH 9.0的Tris-HCl缓冲液,为空白缓冲液。利用空白缓冲液溶解胰高血糖素,终浓度为0.5mg/mL,经过热孵育后进行反相色谱分析,以判断胰高血糖素的亲水/疏水性是否随热处理而改变。同时,配置了含不同还原剂的空白缓冲液,游离巯基终浓度为70mM,将其经过水浴后,进行反相色谱分析,以作为空白对照。最后利用含有不同还原剂的缓冲液分别溶解胰高血糖素,经过热孵育后进行反相色谱分析,以判断胰高血糖素的亲水/疏水性是否改变。结果如图18-23所示。
结果表明,胰高血糖素自身较为稳定,并且当还原剂与胰高血糖素同时存在并加热处理后,其反相色谱图几乎不变,表明还原剂未与胰高血糖素发生反应,表明以上探讨的各还原剂较为安全。
Claims (10)
1.一种含有还原剂的毛细管凝胶电泳检测试剂盒,其特征在于,所述样品缓冲液中含有至少一种还原剂;所述的还原剂选自11-巯基-1-十一醇、2,2’-(1,2-乙二基双氧代)双乙硫醇或双巯基乙酸乙二醇酯中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述样品缓冲液中游离巯基的浓度为0.07-700mM,优选0.7-70mM,更优选7-70mM。
3.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述样品缓冲液选自Tris缓冲液或者磷酸盐缓冲液,所述样品缓冲液的pH值在3.0-10.0之间,优选的,所述样品缓冲液选自Tris-HCl缓冲液或者磷酸盐-柠檬酸缓冲液,pH值在6.5-10.0之间。
4.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述样品缓冲液选自pH 9.0的Tris-HCl缓冲液或pH 6.5的磷酸盐-柠檬酸缓冲液。
5.根据权利要求1-4任一项所述的样试剂盒,其特征在于,所述样品缓冲液进一步含有十二烷基硫酸钠,其含量在0.1-5%(w/w)之间,优选0.5-2%(w/w),更优选1%(w/w)。
6.根据权利要求1-4任一项所述的试剂盒,其特征在于,所述样品缓冲液含有如下组分:
(1)Tris-HCl缓冲液100mM;
(2)十二烷基硫酸钠1%(w/w);
(3)选自11-巯基-1-十一醇、2,2’-(1,2-乙二基双氧代)双乙硫醇或双巯基乙酸乙二醇酯中的一种或多种的还原剂,其总游离巯基的浓度为7mM;
pH值为9.0。
7.根据权利要求1-6任一项所述的试剂盒,其特征在于,所述样品缓冲液含有如下组分:
(1)磷酸盐-柠檬酸缓冲液20mM;
(2)十二烷基硫酸钠1%(w/w);
(3)选自11-巯基-1-十一醇、2,2’-(1,2-乙二基双氧代)双乙硫醇或双巯基乙酸乙二醇酯中的一种或多种的还原剂,其总游离巯基的浓度为7 0mM;
pH值为6.5。
8.一种制备权利要求6所述试剂盒中的样品缓冲液的方法,其特征在于,所述方法包括:
将处方量的Tris缓冲盐,处方量的十二烷基硫酸钠和处方量的还原剂溶解在去离子水中,用盐酸调节pH至9.0,接着用去离子水定容至50mL,得到样品缓冲液。
9.一种制备权利要求7所述试剂盒中的样品缓冲液的方法,其特征在于,所述方法包括:
将处方量的磷酸盐,处方量的十二烷基硫酸钠和处方量的还原剂溶解在适量的去离子水中,用柠檬酸调节pH至6.5,接着用去离子水定容至50mL,得到样品缓冲液。
10.权利要求1-9任一项所述的试剂盒对蛋白样品进行还原型CE-SDS检测的应用,其中,所述蛋白样品选自重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(mAb1)、重组抗HER2人源化单克隆抗体(mAb2)、T-DM1(ADC)和注射用重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(Fusionprotein)。
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Citations (1)
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Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
L H TANG, E AIZENMAN: "The modulation of N-methyl-D-aspartate receptors by redox and alkylating reagents in rat cortical neurones in vitro.", JOURNAL OF PHYSIOLOGY, vol. 465, no. 1, 1 June 1993 (1993-06-01), pages 303 - 323, XP055981248, DOI: 10.1113/jphysiol.1993.sp019678 * |
Cited By (1)
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