CN111316091A - 通过毛细管电泳进行纯度测定的方法 - Google Patents

Abstract

通过毛细管电泳使用包含具有长于12个碳原子的烷基链的疏水性去污剂的缓冲液组合物的蛋白质分离。抑制了高分子量伪迹的形成。

Description

通过毛细管电泳进行纯度测定的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2017年9月7日提交的美国临时申请号62/555335的权益，将该临时申请的公开内容以其全文通过引用并入本文。

技术领域

一种能够通过毛细管电泳改进蛋白质峰分离效率(PSE)的方法。该方法包括通过增加去污剂对蛋白质的亲和力来增加去污剂疏水性以改进蛋白质分离效率(PSE)。

背景技术

贯穿本申请，在圆括号中通过作者姓名和日期或通过专利或专利公开号引用各种公开物。这些公开物的公开内容在此通过引用整体并入本申请，以更充分地描述到本文所描述和要求保护的公开内容的日期为止，本领域技术人员已知的现有技术水平。然而，本文中对参考文献的引用不应被解读为承认所述参考文献是本公开的现有技术。

治疗性蛋白质的商业化需要可以从生物合成的复杂性来衡量产品异质性的分析技术(Chirino,A.J.等人(2004)Characterizing Biological Products and AssessingComparability Following Manufacturing Changes.Nat Biotechnol.22,1383-1391,2；Zhao,S.等人(2014)Applications of Capillary Electrophoresis in CharacteriziongRecombinant Protein Therapeutics.Electrophoresis 35,96-108)。为此，毛细管凝胶电泳(CGE)通过分子量和流体动力学半径对蛋白质进行分离和定量检测，有助于理解蛋白质尺寸的异质性(Rustandi,R.等人(2008)Applications of CE SDS Gel in Developmentof Biopharmaceutical Antibody-Based Products.Electrophoresis 29,3612-3620-4；Chen,T.等人(2016)Antibody-Drug Conjugate Characterization by Chromatographicand Electrophoretic Techniques.J.Chromatogr.B 1032,39-50)。在此程序中，将蛋白质用带电荷的去污剂进行变性，以产生具有一致质荷比的蛋白质-去污剂复合物，这些蛋白质-去污剂复合物通过分子量分离的同时通过填充有亲水性凝胶缓冲液的毛细管进行筛分。随后，当峰定量可以出现时理想地在沿着毛细管的某一点进行UV检测，这需要足够的蛋白质峰分离效率(PSE)，其由高塔板计数(high plate counts)和分辨率定义。在这方面，CGE很好地用于大多数治疗性蛋白质，尤其是IgG，并且在生物技术行业中已被接受为评估产品纯度的标准(Nunally,B.等人(2006)A Series of Collaborations Between VariousPharmaceutical Companies and Regulatory Authorities Concerning the Analysisof Biomolecules Using Capillary Electrophoresis.Chromatographia 64,359-368)。

十二烷基硫酸钠(SDS)已被用作CGE分离的默认去污剂，很大程度上是因为它已在常规聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中确立(Laemmli,U.K.(1970)Cleavage ofStructural Proteins During the Assembly of the Head of BacteriophageT4.Nature 227,680-685；Otzen,D.E.(2015)Proteins in a Brave New SurfactantWorld.Curr.Opin.Colloid Interface Sci.20,161-169)。此外，SDS能够以1.4g SDS比1g蛋白质的比率与典型蛋白质均匀结合，从而确保大多数情况下SDS:蛋白质复合物的均匀质量/电荷比(Reynolds,J.A.等人(1970)Binding of Dodecyl Sulfate to Proteins atHigh Binding Ratios.Possible Implications for the State of Proteins inBiological Membrane.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 66,1002-1007)。因此，CGE通常被称为SDS-CGE或CE-SDS。

发明内容

本发明的一个实施方案是一种用于分析蛋白质样品的方法，其包括通过毛细管电泳分离样品中的变性的目标蛋白质，所述毛细管电泳包含疏水性去污剂凝胶缓冲液。

本发明的一个实施方案是一种用于改进毛细管电泳蛋白质峰分离效率(PSE)的方法，其包括在疏水性去污剂凝胶缓冲液中分离样品中的变性的目标蛋白质。

本发明的一个实施方案是一种用于通过毛细管电泳改进蛋白质纯度测定的方法，其包括在疏水性去污剂凝胶缓冲液中分离样品中的变性的目标蛋白质。

本发明的另一实施方案是一种用于分析蛋白质样品的方法，其包括通过毛细管电泳分离样品中的变性的目标蛋白质，所述毛细管电泳包括疏水性去污剂凝胶缓冲液，其中所述疏水性去污剂具有相同的带电荷的硫酸根头部基团和钠抗衡离子并且具有选自11、14和16的烷基链长度。

本发明的另一实施方案是一种用于改进毛细管电泳蛋白质峰分离效率(PSE)的方法，其包括在疏水性去污剂凝胶缓冲液中分离样品中的变性的目标蛋白质，其中所述疏水性去污剂具有相同的带电荷的硫酸根头部基团和钠抗衡离子并且具有选自11、14和16的烷基链长度。

本发明的另一实施方案是一种改进通过毛细管电泳的蛋白质纯度测定的方法，其包括在疏水性去污剂凝胶缓冲液中分离样品中的变性的目标蛋白质，其中所述疏水性去污剂具有相同的带电荷的硫酸根头部基团和钠抗衡离子并且具有选自11、14和16的烷基链长度。

本发明的另一实施方案是一种用于分析蛋白质样品的方法，其包括通过毛细管电泳分离样品中的变性的目标蛋白质，所述毛细管电泳包括选自十一烷基硫酸钠(SUS)、十四烷基硫酸钠(STS)和十六烷基硫酸钠(SHS)的疏水性去污剂凝胶缓冲液。

本发明的另一实施方案是一种用于改进毛细管电泳蛋白质峰分离效率(PSE)的方法，其包括在疏水性去污剂凝胶缓冲液中分离样品中的变性的目标蛋白质，所述疏水性去污剂凝胶缓冲液选自十一烷基硫酸钠(SUS)、十四烷基硫酸钠(STS)和十六烷基硫酸钠(SHS)。

本发明的另一实施方案是一种改进通过毛细管电泳的蛋白质纯度测定的方法，其包括在疏水性去污剂凝胶缓冲液中分离样品中的变性的目标蛋白质，所述疏水性去污剂凝胶缓冲液选自十一烷基硫酸钠(SUS)、十四烷基硫酸钠(STS)和十六烷基硫酸钠(SHS)。

本发明的另一实施方案是一种用于分析蛋白质样品的方法，其包括通过毛细管电泳分离样品中的变性的目标蛋白质，所述毛细管电泳包括十六烷基硫酸钠(SHS)凝胶缓冲液。

本发明的另一实施方案是一种用于改进毛细管电泳蛋白质峰分离效率(PSE)的方法，其包括在十六烷基硫酸钠(SHS)凝胶缓冲液中分离样品中的变性的目标蛋白质。

本发明的另一实施方案是一种改进通过毛细管电泳的蛋白质纯度测定的方法，其包括在十六烷基硫酸钠(SHS)凝胶缓冲液中分离样品中的变性的目标蛋白质。

本发明的另一实施方案是一种用于蛋白质分离分析的毛细管电泳凝胶缓冲液，其包含疏水性去污剂。

在一些实施方案中，可用于本公开的电泳缓冲液组合物包含疏水性去污剂，所述疏水性去污剂包括硫酸根头部基团和包含具有大于12个碳原子的烷基链的疏水性尾部。

在一些实施方案中，疏水性去污剂具有碳原子数少于19或20的烷基链。在一些实施方案中，疏水性去污剂的烷基链具有13、14、15、16、17或18个碳原子。在一些实施方案中，缓冲液组合物包含比十二烷基硫酸钠更疏水的疏水性去污剂。

本发明的方法可以有效地提高蛋白质峰分离效率。在一些实施方案中，该疏水性去污剂能够通过毛细管筛分电泳引起与十二烷基硫酸钠相比改进的蛋白质峰分离效率。在其他实施方案中，疏水性去污剂能够去除HMW种类伪迹(artifact)。

在一些实施方案中，缓冲液组合物包含去污剂，所述去污剂选自十三烷基硫酸钠、十四烷基硫酸钠(STS)、十五烷基硫酸钠、十六烷基硫酸钠(SHS)、十七烷基硫酸钠和十八烷基硫酸钠(SOS)。在一些实施方案中，疏水性去污剂是十六烷基硫酸钠(SHS)。在一些实施方案中，疏水性去污剂的浓度为约0.02％至约4％w/v。

在一些实施方案中，缓冲液组合物可进一步包含额外组分。在一些实施方案中，缓冲液组合物还包含包含一种或多种选自缓冲组分、有机添加剂、亲水性聚合物、金属螯合剂及其任何组合的额外组分。在一些实施方案中，缓冲组分包括三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或其任何组合。在一些实施方案中，有机添加剂是甘露糖醇、甘油、乙二醇、乙醇、甲醇或其任何组合。在一些实施方案中，亲水性聚合物是右旋糖酐、聚丙烯酰胺、聚乙二醇或其任何组合。在一些实施方案中，金属螯合剂是乙二胺四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸或其任何组合。

本发明方法可用于通过电泳分离目的蛋白质，其中将电泳缓冲液添加到样品缓冲液、运行缓冲液和/或凝胶本身中。在一些实施方案中，用于通过电泳分离目的蛋白质的方法包括使目的蛋白质在样品缓冲液中变性。在一些实施方案中，该方法进一步包括使电泳凝胶在运行缓冲液中运行。在一些实施方案中，运行缓冲液和/或电泳凝胶包含电泳缓冲液组合物。

与使用十二烷基硫酸钠(SDS)进行的分离的蛋白质峰分离效率(PSE)相比，本发明方法可用于改进蛋白质峰分离效率(PSE)。在一些实施方案中，用于改进通过电泳的目的蛋白质的峰分离效率的方法包括使目的蛋白在样品缓冲液中变性和/或通过电泳使样品在运行缓冲液中运行，其中蛋白质峰分离效率(PSE)与使用十二烷基硫酸钠(SDS)进行的分离的蛋白质峰分离效率(PSE)相比得到改进。在一些实施方案中，电泳是毛细管凝胶电泳。在一些实施方案中，与用十二烷基硫酸钠进行的电泳凝胶相比，电泳凝胶结果显示出更少的伪迹高分子量种类。

在一些实施方案中，变性在至少约60℃、至少约65℃、至少约70℃、至少约75℃或至少约80℃的温度进行。在一些实施方案中，变性在约60℃至约70℃、约65℃至约70℃、或约60℃至约65℃的温度进行。在一些实施方案中，变性进行至少约3分钟、至少约4分钟、至少约5分钟、至少约6分钟、至少约7分钟、至少约8分钟、至少约9分钟、至少约10分钟。

在一些实施方案中，目的蛋白质是抗体。在一些实施方案中，抗体是选自IgM、IgA、IgE、IgD和IgG的同种型。在一些实施方案中，IgG抗体选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在一些实施方案中，目的蛋白质包括酶、激素、细胞因子、细胞表面受体、蛋白酶、细胞因子受体或其任何组合。在一些实施方案中，目的蛋白质是融合蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白与异源部分融合。在一些实施方案中，异源部分是延长半衰期的部分。在一些实施方案中，延长半衰期的部分包含Fc。

附图说明

图1A–1C示出了重组治疗性蛋白-1(RTP-1)的毛细管凝胶电泳(CGE)电泳图谱，比较了向凝胶缓冲溶液中添加或不添加0.2％十六烷基硫酸钠(SHS)的结果。裁剪图像以仅显示感兴趣的区域。图1A示出了高水平的叠加图，其示出了SDS与SHS凝胶缓冲液之间的峰分离效率(PSE)的相对差异。基线放大视图突出显示了SDS凝胶(图1B)或SHS凝胶(图1C)对杂质峰1(IP1)与主RTP-1峰的分辨率的影响。

图2A和2B示出了SHS对RTP-1纯度方法范围(线性度)的影响。图2A示出了在筛分凝胶缓冲液中存在SDS、0.2％SHS或0.4％SHS情况下的IP₁的表观相对比例。图2B示出了在SDS、0.2％SHS或0.4％SHS情况下的IP₁面积信号线性度比较。注意在存在SHS的情况下在整个测试浓度范围内的一致性。综合来看，数据显示，没有SHS时，测定范围仅限于峰面积信号≤10k，而相对于当使用SHS时≥30k。

图3示出了电泳图谱，其示出了各种去污剂对RTP-1PSE的影响(被缩小到相关区域中，具有轻微的偏移)。插图：添加到凝胶缓冲溶液中的去污剂的结构。注入的RTP-1样品和凝胶缓冲液仅含有电泳图谱上方注明的去污剂。在表1中列出了凝胶缓冲去污剂组合物对主峰塔板计数和主峰与IP₁之间的分辨率的影响。

图4示出了改变凝胶缓冲液SDS(0.2％、1％、2％或4％)或SHS(0.2％或1％)浓度对RTP-1主峰塔板计数的影响。在浓度>2.0％时，SDS对塔板数的影响达到接近饱和。

图5A和图5B示出了RTP-1的结构域2部分的电荷表面轮廓。红色和蓝色分别表示负静电荷和正静电荷。图5A和图5B示出了相反的表面暴露视图。注意，在图5A中所示的表面上的高度的负电荷，其可能是去污剂结合的障碍，除了具有较长的疏水性尾巴的那些去污剂例如SHS，其可以更好地与蛋白质的疏水性核心建立能量上有利的相互作用以启动解折叠。

图6A-6D示出了SDS:RTP-1和SHS:RTP-1差示扫描量热法(DSC)图谱比较。图6A示出了改变SDS浓度对RTP-1DSC图谱的影响，图6B示出了改变SHS浓度的影响。清晰可见两条吸热图谱，E₁和E₂，分别代表结构域1和2，对它们的变性温度(T_m1和T_m2)和焓(ΔH₁和ΔH₂)进行评估。在表2中列出了这些函数的值。在图6C和6D中示出了这两个结构域相对于去污剂浓度的焓变化的图。

图7A和7B示出了使用SDS和SHS凝胶缓冲溶液获得的其他蛋白质的CGE图谱：mAbRTP-2(图7A)和mAb RTP-3(图7B)。与RTP-3(显示为RTP-3)相比，RTP-2(显示为RTP-2)在其表面上具有相对高比例的疏水性，表明蛋白质PSE与蛋白质/去污剂疏水性之间存在相关性。黑色和红色迹线分别是从SDS和SHS凝胶缓冲溶液获得的电泳图谱。

图8示出了所评估的去污剂(SUS、SDS、STS和SHS)的化学结构。

图9A和9B示出了通过CE-SDS的还原的mAb-1和mAb-3的电泳图谱叠加图，(B)为在基线水平处放大的(A)中的迹线，以示出NGHC的峰形和HC后HMW种类。LC＝轻链；HC＝重链；NGHC＝非糖基化重链；HMW＝高分子量。图9A示出了全视图，图9B示出了放大图。对于图9A和图9B，顶线示出了mAb-1，而底线示出了mAb-3。

图10示出了在非还原(无2-巯基乙醇(BME))、部分还原(0.005％和0.02％BME)和还原(5％BME)条件下，通过CE-SDS的mAb-1的放大电泳图谱叠加图。注意：在非还原和部分还原的CE-SDS条件中添加烷基化试剂IAM，以防止由二硫键扰乱引起的mAb-1分子片段化。顶部第一线是对于5％BME(完全还原的)；第二线是对于0.02％BME；第三线是对于0.005％BME；第四线是对于无BME(未还原的)。

图11A和11B示出了纯度(LC+HC)(图11A)和总的HC后HMW种类(图11B)的相对百分比作为在0.23-1.23mg/mL范围内的蛋白质浓度的函数的图。

图12示出了使用含有0.5％-4％SDS的样品缓冲液制备并通过基于SDS的凝胶分离的还原的mAb-1样品的放大电泳图谱叠加图。顶部第一线是对于4％SDS；第二线是对于3％SDS；第三线是对于2％SDS；第四线是对于1％SDS；底部的第五线是对于0.5％SDS。

图13示出了使用含有1％SDS的样品缓冲液制备并使用含有0.2％-4％SDS的凝胶基质分离的还原的mAb-1样品的放大电泳图谱叠加图。顶部的第一线是对于0.2％SDS凝胶；第二线是对于0.5％SDS凝胶；第三线是对于1％SDS凝胶；第四线是对于2％SDS凝胶；底部的第五线是对于4％SDS凝胶。

图14A和14B示出了通过CE-SDS(1％SDS样品缓冲液+基于SDS的凝胶)使用不同的孵育条件制备的还原的mAb-1(图14A)和mAb-3(图14B)样品的放大电泳图谱叠加图。对于图14A和14B两者，顶部第一线示出了在60℃下持续5分钟的孵育条件；第二线示出了60℃持续10分钟，第三线示出了70℃持续10分钟；第四线示出了80℃持续10分钟；底部的第五线示出了90℃持续15分钟。

图15示出了在通过CE-SDS进行的样品机载(on-board)稳定性的测试中还原的mAb-1的放大电泳图谱叠加图。底线示出了在15℃存储样品在存储开始时的电泳图谱结果；中间线示出了在10小时后；顶线示出了在20小时后。

图16A和16B示出了通过不同的样品缓冲液和凝胶基质条件组合分析的还原的mAb-1样品的放大电泳图谱叠加图。在图16A中，使用含有不同去污剂的样品缓冲液(2％SC₁₀S样品缓冲液、1％SDS样品缓冲液和0.5％STS样品缓冲液)产生还原的mAb-1样品，并通过运行基于SDS的凝胶(AB Sciex)进行分离。顶线示出了2％SC₁₀S样品缓冲液的电泳图谱结果。中间线示出了1％SDS样品缓冲液的电泳图谱结果。底线示出了0.5％STS样品缓冲液的电泳图谱结果。在图16B中，使用含有不同去污剂的样品缓冲液(2％SC₁₀S样品缓冲液、1％SDS样品缓冲液和0.5％STS样品缓冲液)产生还原的mAb-1样品，并通过运行基于SHS的凝胶进行分离。顶线示出了2％SC₁₀S样品缓冲液的电泳图谱结果。中间线示出了1％SDS样品缓冲液的电泳图谱结果。底线示出了0.5％STS样品缓冲液的电泳图谱结果。

图17示出了使用含有去污剂0.2％SHS或SDS和SHS混合物(1％SDS+0.2％SHS或0.5％SDS+0.2％SHS)的样品缓冲液产生并通过运行基于SHS的凝胶进行分离的还原的mAb-1样品的放大电泳图谱叠加图。顶线示出了1％SDS+0.2％SHS样品缓冲液的电泳图谱结果。中间线示出了0.5％SDS+0.2％SHS样品缓冲液的电泳图谱结果。底线示出了0.2％SHS样品缓冲液的电泳图谱结果。

图18示出了使用含有STS的样品缓冲液产生并通过运行基于SHS和基于STS的凝胶进行分离的还原的mAb-1样品的放大电泳图谱叠加图。顶线示出了基于STS的凝胶的结果；底线示出了基于SHS的凝胶的结果。

图19A和19B示出了通过CE-SDS方法(图19A)和CE-SCXS方法(使用具有相同的头部基团但烷基链长度与SDS不同的疏水性去污剂的方法)(图19B)的还原的mAb样品的放大电泳图谱叠加图。图19A示出了含有SDS的样品缓冲液和基于SDS的筛分凝胶(AB Sciex)的结果；图19B示出了含有STS的样品缓冲液和基于SHS的筛分凝胶的结果。顶线示出了mAb-2的结果；中间线示出了mAb-1的结果；底线示出了mAb-3的结果。

图20示出了SC₁₀S、SDS和比SDS更疏水的六种去污剂(SC₁₃S至SC₁₈S)的化学结构。

具体实施方式

I.术语

为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下每个术语应具有以下阐述的含义。贯穿本申请阐述了附加的定义。

在本文中使用时，术语“和/或”应被视为两个指定的特征或组分中的每一个具有或不具有另一个的具体公开内容。因此，如本文中的短语“A和/或B”中所用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样，例如“A、B和/或C”的短语中所用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。

应理解的是，无论在何处用语言“包含”来描述方面，也都提供了以“由……组成”和/或“基本上由……组成”的术语描述的类似方面。

除非另外定义，本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本公开相关的领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。例如，the Concise Dictionary of Biomedicineand Molecular Biology,Juo,Pei-Show，第二版，2002，CRC出版社；The Dictionary ofCell and Molecular Biology，第三版，1999,美国学术出版社；和Oxford Dictionary OfBiochemistry And Molecular Biology，修订版，2000，牛津大学出版社，为本领域技术人员提供本公开中所使用的许多术语的一般词典。

单位、前缀和符号均以其国际单位制(Système International de Unites,(SI))可接受的形式表示。数字范围包括定义所述范围的数字。本文提供的标题并不是对本公开的各个方面的限制，这些方面可通过参考整个说明书而得出。因此，即将在下文定义的术语通过参考说明书全文而得到更充分地定义。

替代方案的使用(例如，“或”)应当被理解为意指替代方案中的一个、两个或其任何组合。如本文中所使用的，不定冠词“一个/种”应被理解为是指任何列举或枚举的组分中的“一个/种或多个/种”。

术语“约”或“基本上包含”是指值或组成在由本领域普通技术人员确定的该特定值或组成的可接受误差范围内，这将部分取决于如何测量或确定该值或组成，即测量系统的局限性。例如，根据本领域的实践，“约”或“基本上包含”可以意指在1个或大于1个标准偏差之内。可替代地，“约”或“基本上包含”可以意指最高达20％的范围。此外，特别是关于生物系统或过程，这些术语可以意指某一值的最高达一个数量级或最高达5倍。当在本申请和权利要求书中提供特定值或组成时，除非另有说明，否则应假设“约”或“基本上包含”的含义在该特定值或组成的可接受误差范围内。

如本文所述，任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数的值，并且在适当时，除非另有说明，否则包括其分数(例如整数的十分之一和百分之一)。

如本文所用，术语“目的蛋白质”以其最广义使用，以包括存在于混合物中需要纯化的任何蛋白质(天然的或重组的)。此类目的蛋白质包括但不限于酶、激素、生长因子、细胞因子、免疫球蛋白(例如抗体)和/或任何融合蛋白。

本文可互换使用的术语“分离(separating)”或“分离(isolating)”是指从包含目的蛋白质和一种或多种杂质的组合物或样品中提高目的蛋白质的纯度。分离可经由电泳进行，其中电场用于使带负电的颗粒穿过物质。当颗粒具有相同的均匀电荷时，它们根据其大小迁移穿过电场，并且不同的迁移率导致包括目的蛋白质在内的颗粒被分离。

如本文所用，术语“缓冲液”是指通过其存在于溶液中而增加必须添加以引起pH单位变化的酸或碱的量的物质。缓冲溶液通过其酸碱共轭物组分的作用来抵抗pH的变化。与生物试剂一起使用的缓冲溶液通常能够保持恒定的氢离子浓度，使得溶液的pH在生理范围内。传统的缓冲液组分包括但不限于有机盐和无机盐、酸和碱。

如本文所用，术语“电泳缓冲液组合物”是指包含至少一种能够使蛋白质变性的去污剂的物质。电泳缓冲液组合物可以作为样品缓冲液的一部分直接添加到样品制备中，也可以添加到电泳运行缓冲液、电泳凝胶本身中。电泳缓冲液组合物的实例在本文其他地方进行描述。

术语“运行缓冲液”是指电泳中使用的电泳缓冲液，用于在电泳过程中当电流流过时帮助保持特定的pH范围。它是指一种物质，通过其存在于溶液中而增加必须添加以引起pH单位变化的酸或碱的量。缓冲溶液通过其酸碱共轭物组分的作用来抵抗pH的变化。

术语“样品缓冲液”是指添加到蛋白质样品中的缓冲液，用于制备样品使其在凝胶上运行以进行电泳分析。它是指一种物质，通过其存在于溶液中而增加必须添加以引起pH单位变化的酸或碱的量。缓冲溶液通过其酸碱共轭物组分的作用来抵抗pH的变化。样品缓冲液可包含用于使蛋白质变性并使它们带负电荷的去污剂。样品缓冲液还可包含其他组分，例如用于破坏二硫键的β-巯基乙醇，或用于跟踪凝胶中蛋白质样品运行的溴酚蓝。

术语“峰分离效率”或“PSE”由塔板计数和/或分辨率定义。塔板计数是指理论塔板数(N)，其是指示柱效的指标。它描述了根据塔板理论定义的塔板数，并可用于基于计算确定柱效率，其中理论塔板数越大，峰越尖锐。理论塔板数作为数值包含在柱使用说明书和检验报告中。假设高斯分布(正态分布)，则理论塔板数可通过以下公式计算：

N＝16(R_t/W)²

其中N＝理论塔板数(塔板计数)，Rt是峰的保留/迁移时间，W是基线处的峰宽，其中切线绘制至峰高的61％。

比较而言，洗脱的分辨率是对色谱分离中两个洗脱峰可以区分程度的定量度量。它被定义为这两个峰之间的保留时间之差除以洗脱峰的宽度的加和，表示如下：

R＝2(R_t2–R_t1)/(W₂+W₁)

其中R＝两个峰之间的分辨率，R_t1和R_t2分别为峰1和2的保留/迁移时间，W₂+W₁为基线处峰宽的总和，其中在50％峰高处绘制了切线。

如本文所用，术语“污染物”以其最广义使用，以覆盖混合物内的任何不期望的组分或化合物。在细胞培养物、细胞裂解物或澄清化的本体(例如澄清的细胞培养物上清液)中，污染物包括例如存在于细胞培养基中的宿主细胞核酸(例如DNA)和宿主细胞蛋白质。宿主细胞污染物蛋白质包括但不限于由宿主细胞天然或重组产生的蛋白质，以及与目的蛋白质有关的或来源于目的蛋白质的蛋白质(例如，蛋白水解片段)和与其他过程有关的污染物。在某些实施方案中，使用诸如离心、无菌过滤、深度过滤和正切流动过滤等手段将污染物沉淀与细胞培养物分离。

在一些实施方案中，术语“抗体”是指包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的蛋白质。每条重链由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区(本文缩写为CH)组成。在某些抗体，例如天然存在的IgG抗体中，重链恒定区由铰链和三个结构域CH1、CH2和CH3组成。在一些抗体，例如天然存在的IgG抗体中，每个轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域(在本文中缩写为CL)组成。VH和VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布着称为框架区(FR)的更保守的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，它们从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链及轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。重链可以具有或不具有C-末端赖氨酸。术语“抗体”可以包括双特异性抗体或多特异性抗体。

在一些实施方案中，本文所用的“IgG抗体”，例如人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4抗体，具有天然存在的IgG抗体的结构，即，其具有与同一亚类的天然存在的IgG抗体相同数目的重链和轻链和二硫键。例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体可以由两个重链(HC)和两个轻链(LC)组成，其中两个HC和LC通过相同数量和位置的二硫键连接，所述二硫键分别在天然存在的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4抗体中出现(除非已对抗体进行了突变以修饰二硫键)。

免疫球蛋白可以来自任何通常已知的同种型，包括但不限于IgA、分泌型IgA、IgG和IgM。IgG同种型在某些物种中分为亚类：在人类中分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，在小鼠中分为IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。免疫球蛋白(例如IgG1)存在数种同种异型，其在最多几个氨基酸方面彼此不同。举例来说，“抗体”包括天然存在的抗体和非天然存在的抗体；单克隆和多克隆抗体；嵌合和人源化抗体；人类和非人类抗体以及完全合成抗体。

如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”是指保留特异性结合至抗原的能力的抗体的一个或多个片段。已显示，抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段执行。涵盖于术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括：(i)由VL、VH、LC和CH1结构域组成的Fab片段(来自木瓜蛋白酶切割的片段)或类似的单价片段；(ii)包含由铰链区二硫键连接的两个Fab片段的F(ab')2片段(来自胃蛋白酶切割的片段)或类似的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人,(1989)Nature341:544-546)；和(vi)分离的互补决定区(CDR)以及(vii)可任选地由合成接头相连的两个或更多个分离的CDR的组合。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH是由单独的基因编码的，但是可以使用重组方法将这两个结构域通过使它们能够形成为单一蛋白链的合成接头来相连，其中VL区和VH区配对以形成单价分子(被称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等人(1988)Science 242:423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。此类单链抗体也旨在涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内。这些抗体片段是使用本领域的技术人员已知的常规技术获得的，并且以与完整抗体相同的方式针对效用来筛选这些片段。抗原结合部分可以通过重组DNA技术产生，或通过完整的免疫球蛋白的酶促或化学切割产生。

“Fc区”(片段可结晶区)、“Fc结构域”或“Fc”是指抗体重链的C-末端区，其介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括与位于免疫系统各种细胞(例如效应细胞)上的Fc受体的结合或与经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。因此，Fc区包含抗体的除第一恒定区免疫球蛋白结构域(例如，CH1或CL)之外的恒定区。在IgG、IgA和IgD抗体同种型中，Fc区包含两个相同的蛋白质片段，该蛋白质片段源自抗体的两条重链的第二(CH2)和第三(CH3)恒定结构域；IgM和IgE Fc区在每一多肽链中包含三个重链恒定结构域(CH结构域2-4)。IgG同种型在某些物种中分为亚类：在人类中分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，在小鼠中分为IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。对于IgG，Fc区包含免疫球蛋白结构域CH2和CH3以及在CH1与CH2结构域之间的铰链。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界的限定是可变的，但如本文所定义，将人IgG重链Fc区定义为从IgG1的氨基酸残基D221、IgG2的氨基酸残基V222、IgG3的氨基酸残基L221和IgG4的氨基酸残基P224延伸至重链的羧基末端，其中编号是根据Kabat中的EU索引。人IgG Fc区的CH2结构域从氨基酸237延伸至氨基酸340，而CH3结构域位于Fc区中的CH2结构域的C-末端侧上，即，其从IgG的氨基酸341延伸至氨基酸447或446(如果不存在C-末端赖氨酸残基)或445(如果不存在C-末端甘氨酸和赖氨酸残基)。如本文所用，Fc区可以是天然序列Fc(包括任何异型变体)或变体Fc(例如，非天然存在的Fc)。

“Fc受体”或“FcR”是与免疫球蛋白的Fc区结合的受体。与IgG抗体结合的FcR包含FcγR家族的受体，包括这些受体的等位基因变体和可替代地剪接形式。FcγR家族由三种活化性(小鼠中为FcγRI、FcγRIII和FcγRIV；人类中为FcγRIA、FcγRIIA和FcγRIIIA)受体和一种抑制性(FcγRIIB)受体组成。人FcγR的多种性质是本领域已知的。大多数先天效应细胞类型共表达一种或多种活化性FcγR和抑制性FcγRIIB，而天然杀伤(NK)细胞选择性表达一种活化性Fc受体(小鼠中为FcγRIII，人类中为FcγRIIIA)而在小鼠和人类中不表达抑制性FcγRIIB。人IgG1与大多数人Fc受体结合，并且就其结合的活化性Fc受体的类型而言被认为等同于鼠类IgG2a。

如本文所用的，术语“重组人类抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人类抗体，例如(a)从针对人类免疫球蛋白基因转基因或转染色体的动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤中分离的抗体，(b)从转化以表达抗体的宿主细胞(例如从转染瘤)中分离的抗体，(c)从重组、组合人类抗体文库中分离的抗体，和(d)通过涉及将人类免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。

如本文所用，“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE抗体)。

氨基酸在本文中由它们通常已知的三个字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来指代。同样，核苷酸由其普遍接受的单字母代码来指代。

如本文所用，术语“多肽”是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何一条或多条链，并不指产物的特定长度。如本文所用，术语“蛋白质”旨在涵盖由一个或多个多肽组成的分子，所述多肽可在一些情况下通过不同于酰胺键的键来缔合。另一方面，蛋白质也可以是单个多肽链。在后一种情况下，单个多肽链在某些情况下可包含两个或多个融合在一起形成蛋白质的多肽亚单位。术语“多肽”和“蛋白质”还指表达后修饰的产物，所述修饰包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护基/阻断基团进行衍生化、蛋白水解切割或通过非天然存在的氨基酸进行修饰。多肽或蛋白质可来源于天然。术语“HMW种类”是指相对于完整的目的蛋白质例如mAb-1具有更高表观分子量的任何一种或多种蛋白质。HMW种类可与目的蛋白质无关，或者是该完整蛋白质或其任何片段的聚集体，例如二聚体或多聚体或任何组合。具有不同分子量的两种蛋白质或其蛋白质片段在电泳过程中可能会一起迁移，这是因为蛋白质的去污剂包被不均匀导致电荷密度不均匀。

生物来源或通过重组技术生产，但不一定从指定的核酸序列翻译而来。它可按任何方式产生，包括通过化学合成。

如本文所述，任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数的值，并且在适当时，包括其分数(例如整数的十分之一和百分之一)，除非另有说明。

如本文所用，术语“HMW种类伪迹”或“HMW伪迹”是指在还原和/或非还原条件下由于效率低的电泳而可能出现的峰或带。因此，HMW伪迹可能导致低估的纯度结果和不足的测定稳健性。在非还原条件下，两种mAb谱图中显示的HMW伪迹可能是未完全变性并且因此未被去污剂均匀地覆盖的蛋白质种类，其与固有的蛋白质聚集体种类共迁移。通过非还原CE-SDS方法测量的具有HMW种类伪迹的聚集体水平可能显著高于其他正交方法(例如，天然尺寸排阻色谱(SEC)和分析型超速离心(AUC))报告的值。

如本文所用，术语“mAb-1”是指抗IL8抗体(HuMax-IL8)。任何抗IL-8抗体均可用于本公开，但是本文中用作实例的抗IL8抗体描述于2004年7月15日公开的PCT公开号WO2004/058797中。

如本文所用，术语“mAb-2”或“RTP-2”是指抗TIGIT抗体。任何抗TIGIT抗体均可用于本公开，但是本公开中使用的抗TIGIT抗体描述于2016年6月30日公开的PCT公开号WO2016/106302中。

如本文所用，术语“mAb-3”是指抗IP-10抗体。任何抗IL-10抗体可以用于本公开，但是在本申请中使用的抗IP-10抗体描述于2005年6月30日公开的PCT公开号WO2005/058815、2017年6月8日公开的WO2017/095875和2016年8月30日公开的美国专利9,429,581中。

在以下小节中将进一步详细描述本公开的各个方面。

II.电泳缓冲液组合物

重组蛋白质的表达，例如重组单克隆抗体的表达，是复杂的并且需要大量的翻译后修饰以及化学和物理降解。因此，治疗性蛋白质的表达在开发和生产的每个阶段都需要持续观察。能够提供蛋白质纯度、异质性和稳定性评估的可靠且稳健的分析方法对于支持治疗性蛋白质的过程开发和质量控制中的产品表征是必不可少的。

使用十二烷基硫酸钠的毛细管凝胶电泳(CGE)，通常称为CE-SDS，是聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的毛细管形式，其中聚丙烯酰胺平板凝胶被填充有可替换的聚合物筛分基质的窄孔玻璃毛细管代替。与传统的对劳动不敏感的SDS-PAGE相比，CE-SDS能够测量整体片段化模式并进行准确的蛋白质定量，优点包括直接在柱上进行UV或荧光检测、自动化以及增强的分辨率和重现性。

SDS已广泛用作用于蛋白质变性的SDS-PAGE和CE-SDS技术两者中的默认去污剂，这可以归因于以下普遍认可的事实：蛋白质倾向于与在重量基础上相对恒定量的SDS结合(～1.4g SDS/1g蛋白质)，从而在大多数情况下产生SDS-蛋白质复合物的均匀质荷比。因此，蛋白质分子的固有多肽电荷变得可忽略不计，并且最终的分离完全取决于其变性多肽相对分子量的差异。

然而，存在以下情形，其中SDS由于蛋白质的电荷和糖基化特性而无法均匀地结合某些蛋白质，因此蛋白质峰分离效率较差，这表明SDS结合亲和力较低和/或变性不完全。最近在分析中发现了问题，部分归因于在非还原和还原CE-SDS条件下在纯度分析蛋白质分子中诱发了高分子量(HMW)伪迹，导致低估的纯度结果和不足的测定稳健性。在非还原条件下，两种mAb谱图中显示的HMW伪迹可能是未完全变性并且因此不能被去污剂SDS均匀地覆盖的蛋白质种类，其与固有的蛋白质聚集体种类共迁移。通过非还原CE-SDS方法测量的它们的聚集体水平显著高于其他正交方法(例如，天然尺寸排阻色谱(SEC)和分析型超速离心(AUC))报告的值。通过应用含SHS的筛分凝胶并使用常规的基于SDS的样品缓冲液保持样品变性，成功抑制了HMW伪迹的形成，并且因此针对这两种mAb报告了更可靠的纯度结果并伴随有合理的聚集体水平。这些伪迹的水平受样品制备参数(例如蛋白浓度，样品缓冲液、运行缓冲液或凝胶基质中的SDS量)的影响很大。发现将相对疏水性去污剂添加到样品(不仅仅是凝胶缓冲液)中展现出增强的能力而充分使单克隆抗体1(mAb-1)和单克隆抗体2(mAb-2)的HC变性，从而防止产生HC后HMW伪迹。

被评估并且可用于本公开的去污剂可以包含相同的带电荷的硫酸根头部基团和钠抗衡离子，仅烷基链长度方面有所改变。去污剂可以包含在缓冲液和/或作为电泳缓冲液组合物包含在凝胶中。在一些实施方案中，用于本公开的电泳缓冲液组合物包含疏水性去污剂，所述疏水性去污剂包含硫酸根头部基团和疏水性尾部，所述疏水性尾部包含具有11个碳原子的烷基链或具有大于12个碳原子的烷基链。在一些实施方案中，电泳缓冲液组合物包含具有烷基链的疏水性去污剂，所述烷基链具有小于19或20个碳原子。在一些实施方案中，疏水性去污剂具有硫酸根头部基团和烷基链，所述烷基链具有13至20个碳原子、13至19个碳原子、13至18个碳原子、14至18个碳原子、14至19个碳原子、14至20个碳原子、15至20个碳原子、15至19个碳原子、15至18个碳原子、16至20个碳原子、16至19个碳原子、16至18个碳原子、17至20个碳原子、17至19个碳原子或17至18个碳原子。在其他实施方案中，疏水性去污剂具有硫酸根头部基团和具有13、14、15、16、17、18、19或20个碳原子的烷基链。在其他实施方案中，疏水性去污剂具有硫酸根头部基团和具有18个原子的烷基链。在一些实施方案中，疏水性去污剂具有硫酸根头部基团和具有16个原子的烷基链。为了本公开的目的，疏水性去污剂中的硫酸根头部基团具有至少与十二烷基硫酸钠中的硫酸根头部基团一样高的净负点电荷。在一些实施方案中，疏水性去污剂比十二烷基硫酸钠更疏水。在其他实施方案中，与十二烷基硫酸钠相比，疏水性去污剂能够通过毛细管筛分电泳引起改进的蛋白质峰分离效率。

在一些实施方案中，疏水性去污剂选自十三烷基硫酸钠、十四烷基硫酸钠(STS)、十五烷基硫酸钠、十六烷基硫酸钠(SHS)、十七烷基硫酸钠和十八烷基硫酸钠(SOS)。在一些实施方案中，疏水性去污剂是十六烷基硫酸钠(SHS)。这些实施方案在图20中表示。

在一些实施方案中，疏水性去污剂在样品缓冲液、运行缓冲液和/或凝胶中的浓度为约0.001％至约4％w/v。在一些实施方案中，疏水性去污剂可用于制备根据本公开的电泳缓冲液或凝胶的浓度范围为例如，约5％或更少、约4.5％或更少、约4％或更少、约3.5％或更少、约3％或更少、约2.5％或更少、约2％或更少、约1.5％或更少、约1％或更少、约0.9％或更少、约0.8％或更少、约0.7％或更少、约0.6％或更少、约0.5％或更少、约0.4％或更少、约0.3％或更少、约0.2％或更少、约0.1％或更少、约0.09％或更少、约0.08％或更少、约0.07％或更少、约0.06％或更少、约0.05％或更少、约0.04％或更少、约0.03％或更少、约0.02％或更少、约0.01％或更少、约0.001％或更少。疏水性去污剂的范围可为约0.001％至约0.5％、0.01％至约0.5％、约0.02％至约0.5％、0.03％至约0.5％、0.04％至约0.5％、0.05％至约0.5％、0.06％至约0.5％、0.07％至约0.5％、0.08％至约0.5％、0.09％至约0.5％、约0.1％至约0.5％、约0.2％至约0.5％、约0.3％至约0.5％、约0.4％至约0.5％、约0.02％至约0.4％、0.03％至约0.4％、0.04％至约0.4％、0.05％至约0.4％、0.06％至约0.4％、0.07％至约0.4％、0.08％至约0.4％、0.09％至约0.4％、约0.1％至约0.4％、约0.2％至约0.4％、约0.3％至约0.4％、约0.02％至约0.3％、0.03％至约0.3％、0.04％至约0.3％、0.05％至约0.3％、0.06％至约0.3％、0.07％至约0.3％、0.08％至约0.3％、0.09％至约0.3％、约0.1％至约0.3％、约0.2％至约0.3％、约0.02％至约0.2％、0.03％至约0.2％、0.04％至约0.2％、0.05％至约0.2％、0.06％至约0.2％、0.07％至约0.2％、0.08％至约0.2％、0.09％至约0.2％、约0.1％至约0.2％、约0.02％至约0.1％、0.03％至约0.1％、0.04％至约0.1％、0.05％至约0.1％、0.06％至约0.1％、0.07％至约0.1％、0.08％至约0.1％、或0.09％至约0.1％。在其他实施方案中，疏水性去污剂的浓度范围为约0.001％至约4％、约0.01％至约4％、约0.02％至约4％、约0.03％至约4％、约0.04％至约4％、约0.05％至约4％、约0.06％至约4％、约0.07％至约4％、约0.08％至约4％、约0.09％至约4％、约0.1％至约4％、约0.2％至约4％、约0.3％至约4％、约0.4％至约4％、约0.5％至约4％、约0.6％至约4％、约0.7％至约4％、约0.8％至约4％、约0.9％至约4％、约1％至约4％、约0.1％至约3％、约0.2％至约3％、约0.3％至约3％、约0.4％至约3％、约0.5％至约3％、约0.6％至约3％、约0.7％至约3％、约0.8％至约3％、约0.9％至约3％、约1％至约3％、约0.1％至约2％、约0.2％至约2％、约0.3％至约2％、约0.4％至约2％、约0.5％至约2％、约0.6％至约2％、约0.7％至约2％、约0.8％至约2％、约0.9％至约2％、约1％至约2％、约0.1％至约1％、约0.2％至约1％、约0.3％至约1％、约0.4％至约1％、约0.5％至约1％、约0.6％至约1％、约0.7％至约1％、约0.8％至约1％、约0.9％至约1％或约1％至约2％。在一些实施方案中，疏水性去污剂的浓度可以为约0.001％、约0.01％、约0.02％、约0.03％、约0.04％、约0.05％、约0.06％、约0.07％、约0.08％、约0.09％、约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1％、约1.1％、约1.2％、约1.3％、约1.4％、约1.5％、约1.6％、约1.7％、约1.8％、约1.9％、约2.0％、约2.1％、约2.2％、约2.3％、约2.4％、约2.5％、约2.6％、约2.7％、约2.8％、约2.9％或约3.0％。

在一些实施方案中，电泳缓冲液组合物包含两种或更多种去污剂的混合物，其中这些去污剂中的至少一种是疏水性去污剂，即，具有至少13个碳原子的烷基链，例如SC₁₃S、SC₁₄S、SC₁₅S、SC₁₆S、SC₁₇S或SC₁₈S。在一些实施方案中，电泳缓冲液组合物包含SDS和疏水性去污剂的混合物，疏水性去污剂即具有至少13个碳原子的烷基链，例如SC₁₃S、SC₁₄S、SC₁₅S、SC₁₆S、SC₁₇S或SC₁₈S。在其他实施方案中，电泳缓冲液组合物包含两种疏水性去污剂的混合物，例如，SC₁₃S和SC₁₄S、SC₁₃S和SC₁₅S、SC₁₃S和SC₁₆S、SC₁₃S和SC₁₇S、SC₁₃S和SC₁₈S、SC₁₄S和SC₁₅S、SC₁₄S和SC₁₆S、SC₁₄S和SC₁₇S、SC₁₄S和SC₁₈S、SC₁₅S和SC₁₆S、SC₁₅S和SC₁₇S、SC₁₅S和SC₁₈S、SC₁₆S和SC₁₇S、SC₁₆S和SC₁₈S或SC₁₇S和SC₁₈S。

在一些实施方案中，可用于电泳的去污剂类型的确定可基于目的蛋白质的分子量。在一些实施方案中，可以通过SDS和疏水性去污剂(即，具有至少13个碳原子的烷基链，例如SC₁₃S、SC₁₄S、SC₁₅S、SC₁₆S、SC₁₇S或SC₁₈S)的混合物分离的目的蛋白质的分子量小于约20kDa、小于约19kDa、小于约18kDa、小于约17kDa、小于约16kDa、小于约15kDa、小于约14kDa、小于约13kDa、小于约12kDa、小于约11kDa或小于约10kDa，例如5kD至15kD。

在其他实施方案中，可以通过疏水性去污剂(即，具有至少13个碳原子的烷基链，例如SC₁₃S、SC₁₄S、SC₁₅S、SC₁₆S、SC₁₇S或SC₁₈S)分离的目的蛋白质的分子量为高于约20kDa、高于约30kDa、高于约40kDa、高于约50kDa、高于约60kDa、高于约70kDa、高于约80kDa、高于约90kDa、高于约100kDa、高于约110kDa、高于约120kDa、高于约130kDa、高于约140kDa、高于约150kDa、高于约160kDa、高于约170kDa、高于约180kDa、高于约190kD或高于约200kDa。

在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种选自缓冲组分、有机添加剂、亲水性聚合物、金属螯合剂及其任何组合的额外组分。

可用的生物缓冲液的实例包括但不限于，双-TRIS(2-双[2-羟乙基]氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇)、ADA(N-[2-乙酰氨基]-2-亚氨基二乙酸)、ACES(2-[2-乙酰氨基[-2-氨基乙磺酸])、PIPES(1,4-哌嗪二乙磺酸)、MOPSO(3-[N-吗啉代]-2-羟基丙磺酸)、双-TRIS丙烷(1,3-双[三(羟甲基)甲基氨基丙烷])、BES(N,N-双[2-羟乙基]-2-氨基乙磺酸)、MOPS(3-[N-吗啉代]丙磺酸)、TES(2-[2-羟基-1,1-双(羟甲基)乙基氨基]乙磺酸)、HEPES(N-[2-羟乙基]哌嗪-N′-(2-乙磺)酸)、DIPSO(3-N,N-双[2-羟乙基]氨基-2-羟基丙磺酸、MOBS(4-N-吗啉代丁磺酸)、TAPSO(3[N-三羟甲基-甲基氨基]-2-羟基丙磺酸)、TRIS(2-氨基-2-[羟甲基]-1,3-丙二醇)、HEPPSO(N-[2-羟乙基]哌嗪-N′-[2-羟基丙磺]酸)、POPSO(哌嗪-N,N′-双[2-羟基丙磺]酸、TEA(三乙醇胺)、EPPS(或HEPPS)(N-[2-羟乙基]-哌嗪-N′-[3-丙磺]酸)、TRICINE(N-三[羟甲基]甲基甘氨酸]、GLY-GLY(二甘氨酸)、BICINE(N,N-双[2-羟乙基]甘氨酸)、HEPBS(N-[2-羟乙基]哌嗪-N′-[4-丁磺]酸)、TAPS(N-三[羟甲基]甲基-3-氨基丙磺酸)、AMPD(2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇)、TABS(N-三[羟甲基]甲基-4-氨基丁磺酸)、AMPSO(3-[((1,1-二甲基-2-羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸)、CHES(2-(N-环己基氨基)乙磺酸)、CAPSO(3-[环己基氨基]-2-羟基-1-丙磺酸)、AMP(2-氨基-2-甲基-1-丙醇)、CAPS(3-环己基氨基-1-丙磺酸)、CABS(4-[环己基氨基]-1-丁磺酸)或其任何组合。在其他实施方案中，缓冲组分包括TRIS缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或其任何组合。

在其他实施方案中，电泳缓冲液组合物包含一种或多种有机添加剂。在一些实施方案中，有机添加剂包括甘露糖醇、甘油、乙二醇、乙醇、甲醇或其任何组合。在一些实施方案中，该一种或多种有机添加剂包括，替代性溶剂的非限制性实例包括，乙二醇、丙二醇、二甘醇的单甲醚、二甘醇的二甲醚、甲基卡必醇、四氢呋喃、二丁醚、二甲基甲酰胺、环丁砜或具有1-4个碳原子的醇类。

在某些实施方案中，电泳缓冲液组合物包含一种或多种聚合物。在一些实施方案中，这些聚合物是亲水聚合物。在其他实施方案中，这些聚合物是疏水性聚合物。在一些实施方案中，亲水性聚合物包括右旋糖酐、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇或其任何组合。

在其他实施方案中，电泳缓冲液组合物还包含金属螯合剂，即能够螯合金属离子如Ca2+和Fe3+的分子。在一些实施方案中，金属螯合剂包括乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸或其任何组合。在被金属螯合剂例如EDTA结合之后，金属离子保留在溶液中，但是展现出削弱的反应性。其他螯合剂可包括乙二醇四乙酸(EGTA)、次氮基三乙酸三钠、羟乙基乙二胺乙酸三钠(HEDTA三钠)、二亚乙基三氨基乙酸五钠或2-氨基丙二酰脲乙酸二钠(uramil disodium acetate)。

金属螯合剂例如EDTA可用于制备根据本公开的电泳缓冲液组合物的浓度范围为约0.5％更少、或约0.4％更少、或约0.3％更少、或约0.2％更少、或约0.1％更少、或约0.05％更少、或约0.03％至约0.5％、或约0.05％至约0.5％或约0.1％至约0.5％、或约0.2％至约0.5％、或约0.3％至约0.5％、或约0.4％至约0.5％、或约0.03％至约0.4％、或约0.05％至约0.4％或约0.1％至约0.4％、或约0.2％至约0.4％、或约0.3％至约0.4％、或约0.03％至约0.3％、或约0.05％至约0.3％或约0.1％至约0.3％、或约0.2％至约0.3％、或约0.03％至约0.5％、或约0.05％至约0.2％或约0.1％至约0.2％、或约0.03％至约0.1％、或约0.05％至约0.1％、或约0.03％至约0.05％。优选约0.05％或更少，最优选0.03％。

在一些实施方案中，可以将本文所述的电泳缓冲液组合物添加到用于毛细管凝胶电泳的样品缓冲液、运行缓冲液和/或凝胶中。

在一些实施方案中，电泳缓冲液组合物的pH高于约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5、约9.0、约9.5或约10.0。在其他实施方案中，电泳缓冲液组合物的pH为约6.0至约11.0、约6.5至约11.0、约7.0至约10.5、约7.0至约10.0、约7.0至约9.5、约7.0至约9.0、约7.0至约8.5、约7.0至约8.0或约7.0至约7.5。在其他实施方案中，电泳缓冲液组合物的pH为约6.5、约7.0、约7.2、约7.4、约7.6、约7.8、约8.0、约8.2、约8.4、约8.6、约8.8、约9.0、约9.2、约9.4、约9.6、约9.8、约10.0、约10.5、约11.0或约11.5。

在一些实施方案中，电泳缓冲液组合物的pH高于约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5、约9.0、约9.5或约10.0。在一些实施方案中，电泳缓冲液组合物的pH高于约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7或约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7或约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8.0、约8.1、约8.2、约8.3、约8.4、约8.5、约8.6、约8.7、约8.8、约8.9、约9.0、约9.1、约9.2、约9.3、约9.4、约9.5、约9.6、约9.7或约9.8、约9.9或约10.0。在一些实施方案中,电泳缓冲液组合物的pH为约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、或约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、或约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8.0、约8.1、约8.2、约8.3、约8.4、约8.5、约8.6、约8.7、约8.8、约8.9、约9.0、约9.1、约9.2、约9.3、约9.4、约9.5、约9.6、约9.7、约9.8、约9.9或约10.0。

III.分离蛋白质的方法

本公开涉及通过电泳分离目的蛋白质的方法，其包括使目的蛋白质在包含本文所述的电泳缓冲液组合物的样品缓冲液中变性。在一些实施方案中，电泳是毛细管凝胶电泳。

毛细管电泳(CE)是在亚毫米直径的毛细管中和在微流体和纳流体通道中进行的一系列电动分离方法。CE可以包括毛细管区带电泳(CZE)，但其他电泳技术包括毛细管凝胶电泳(CGE)、毛细管等电聚焦(CIEF)、毛细管等速电泳和胶束电动色谱(MEKC)。在CE方法中，包括目的蛋白质的分析物在电场的影响下迁移通过电解质溶液。分析物可以根据离子迁移率和/或经由非共价相互作用分配到交替相中而进行分离。另外，分析物可以通过电导率和pH的梯度来浓缩或“集中(focus)”。

在一些实施方案中，该方法进一步包括使电泳凝胶在运行缓冲液中运行。在一些实施方案中，运行缓冲液和/或凝胶包含本文所述的电泳缓冲液组合物。

本公开还包括一种用于改进通过电泳的目的蛋白质的峰分离效率的方法，其包括使目的蛋白质在包含本文所述的电泳缓冲液组合物的样品缓冲液中变性，并使电泳凝胶在运行缓冲液中运行。在一些实施方案中，与使用十二烷基硫酸钠(SDS)进行的分离的蛋白质峰分离效率(PSE)相比，蛋白质峰分离效率(PSE)得到了改进。在一些实施方案中，与用SDS进行的电泳凝胶相比，电泳凝胶结果显示出更少的伪迹高分子量种类。

在一些实施方案中，变性可以在至少约60℃、至少约65℃、至少约70℃、至少约75℃或至少约80℃的温度，例如，约60℃至约70℃、约65℃至约70℃或约60℃至约65℃的温度进行。在其他实施方案中，变性进行至少约3分钟、至少约4分钟、至少约5分钟、至少约6分钟、至少约7分钟、至少约8分钟、至少约9分钟或至少约10分钟。

本公开的方法可以进一步包括在分离之后检测目的蛋白质。用于检测的系统可为将UV或UV-Vis吸光度作为其主要检测模式。在这些系统中，毛细管本身的一部分可以用作检测池。使用管上检测可以实现检测分离的分析物，而不会降低分辨率。

荧光检测也可用于自然发荧光或经过化学修饰以包含荧光标记的样品的毛细管电泳中。这种检测模式为这些样品提供了高灵敏度和提高的选择性，但不能用于不发出荧光的样品。许多标记策略用于产生非荧光分子(包括蛋白质和DNA)的荧光衍生物或缀合物。

为了获得样品组分的身份，可以将毛细管电泳直接与质谱仪或表面增强拉曼光谱(SERS)联用。在大多数系统中，将毛细管出口引入到利用电喷雾电离(ESI)的离子源中。然后通过质谱仪分析所得离子。这种设置需要挥发性缓冲溶液，其将影响可采用的分离模式的范围和可实现的分辨度。测量和分析主要是通过专门的凝胶分析软件完成的。

对于CE-SERS，可以将毛细管电泳洗脱液沉积到SERS活性基底上。通过在毛细管电泳过程中以恒定速率移动SERS活性基底，可以将分析物的保留时间转换为空间距离。这使得随后的光谱技术应用于特定的洗脱液，从而以高灵敏度进行鉴别。可以选择不干扰分析物光谱的SERS活性基底。

在一些实施方案中，分析物或样品缓冲液中的目的蛋白质是待分离的天然存在的蛋白质或重组制备的蛋白质。在其他实施方案中，目的蛋白质可以是酶、激素、细胞因子、细胞表面受体、蛋白酶、细胞因子受体或其任何组合。在其他实施方案中，目的蛋白质是抗体。

在一些实施方案中，抗体是选自IgM、IgA、IgE、IgD和IgG的同种型。在其他实施方案中，IgG抗体选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。

在其他实施方案中，目的蛋白质是融合蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白包括酶、激素、细胞因子、细胞表面受体、蛋白酶、细胞因子受体或其任何组合。在其他实施方案中，融合蛋白与异源部分融合。在一些实施方案中，异源部分是延长半衰期的部分。在其他实施方案中，延长半衰期的部分包含Fc。

在一些实施方案中，有待通过本发明方法分析的目的蛋白质的分子量高于约5kD、约10kD、约15kD、约20kD、约25kD、约30kD、约35kD、约40kD、约50kD、约60kD、约70kD、约80kD、约90kD、约100kD、约110kD、约120kD、约130kD、约140kD、约150kD、约160kD、约170kD、约180kD、约190kD或约200kD。在某些实施方案中，目的蛋白质的分子量高于约15kD。在其他实施方案中，目的蛋白质的分子量为约15kD至约200kD、约20kD至约200kD、约30kD至约200kD、约40kD至约200kD、约50kD至约200kD、约30kD至约150kD、约40kD至约150kD、约50kD至约150kD。

通过以下实施例进一步说明本公开，这些实施例不应解释为进一步的限制。贯穿本申请引用的所有参考文献的内容清楚地并入本文中以作参考。

实施例

以下实施例阐述了本发明的具体方面，以说明本发明并且为本领域技术人员提供本发明方法的描述。这些实施例不应被解释为限制本发明，因为这些实施例仅提供可用于理解和实践本发明及其各个方面的特定方法和例证。

实施例1

发明人发现，对于具有通过CE-SDS的较差PSE的蛋白质，去污剂疏水性的增加可以通过增加去污剂对蛋白质的亲和力来改进PSE。图1示出了在典型的CE-SDS条件下以及在具有含有十六烷基硫酸钠(SHS)的凝胶基质下运行的重组治疗性蛋白1(RTP-1)的叠加电泳图谱。SHS的存在导致PSE明显改善，导致主要蛋白质峰与显著的杂质峰(杂质峰1或IP₁，图1)的基线分离。改进的峰形和分辨率扩大了测定的工作范围，包括检测和定量极限。特别地，随着可增加上样量，测定灵敏度增加了3-4倍，而不影响线性度(图2)。

所评估的去污剂包含相同的带电荷的硫酸根头部基团和钠抗衡离子，仅烷基链长度不同。为了使烷基链长度直接有助于RTP-1PSE的潜在改进，初始实验在运行凝胶缓冲液和样品溶液两者中仅包括感兴趣的去污剂。如图3所示，随着烷基链长度增加，PSE显著改进，其中相比于SDS，SHS使塔板计数提高8倍(11820/1450，图4)，使主峰和杂质IP₁之间的分辨率提高2.3倍(1.8/0.8，图4)。相比于SDS，SUS略微改进了PSE，这是以前用稍小的癸基硫酸钠(17)观察到的现象，并且归因于具有较小烷基链的去污剂能够更均匀地包被伸长的蛋白质的能力(尽管亲和力较低)。有趣的是，这些作者还发现STS和SHS降低了其模型蛋白通过PAGE的PSE(17)。一种解释是，RTP-1不能由这些模型蛋白代表，鉴于其特性(在下面讨论)可能是这种情况。

通过较长链的去污剂的CGE分辨能力不仅仅取决于浓度，因为无论浓度如何，SDS都无法达到与SHS相同的PSE水平(图4)。

较长的烃链去污剂与RTP-1分辨率改进之间的相关性。假设地，更稳定的去污剂:蛋白质复合物应导致更高的分离效率，因为结构将更均质(17)。基于RTP-1的特定物理特性，SDS可能不足以稳定均匀变性的RTP-1复合物，并且反而可能需要更多的疏水性去污剂。RTP-1的两个结构域之一(表示为“结构域2”)是嗜热的，该性质表明其总体结构是刚性的(18)并且包含一个相对疏水性核心(19)。与典型蛋白质(18,20)相比，在天然或变性条件下(有或没有SDS)，通常需要嗜热蛋白质来克服朝向变性的更高过渡态能量势垒。建模研究表明，结构域2的一个面具有高比例的负电荷电势，这将引起去污剂硫酸根基团的静电排斥。这种排斥可能需要SHS的更高疏水性尾部以建立与蛋白质的疏水性核心的总体能量上有利的相互作用，从而启动解折叠(图5)。

差示扫描量热法(DSC)用于量化SHS和SDS使RTP-1完全变性的能量需求。去污剂:RTP-1复合物的吸热图谱是双相的，表示为图6A和6B中的峰E₁和E₂。E₁和E₂分别归因于RTP-1结构域1和2(数据未示出)。热力学数据概括在表1中。

表1.使用各种凝胶缓冲液去污剂获得的RTP-1峰分离效率(PSE)值

^a RTP-1样品溶液包含相应的去污剂。

在由E₁峰表示的结构域1的热变性过程中观察到的焓变化对于两种去污剂是可比较的(图6C)。

表2.通过将各种浓度的SDS或SHS添加到RTP-1中而获得的DSC函数

^a,b无论去污剂类型如何，在用[去污剂]的情况下，Tm具有相当的下降

^c无论去污剂类型如何，在用[去污剂]的情况下，ΔH₁具有相当的下降(图6C)

^d在达到特定浓度(0.1mM SDS和0.013mM SHS)后，在用SHS的情况下，ΔH₂下降更显著(图6D)

然而，如图6D所示，取决于去污剂，嗜热结构域2或E₂的热变性图谱不同。SHS使该结构域变性所需的能量更少，特别是在预期的临界胶束浓度(CMC)范围内，对于SDS，临界胶束浓度将小于8mM，对于SHS，临界胶束浓度将小于2mM(22)，并且表明SHS:RTP-1复合物在SHS结合的情况下更稳定。

使用SHS更好地分辨的其他蛋白质。对于一些其他蛋白质也进行了使用SHS增加CGE分辨能力与蛋白质疏水性之间的相关性研究。图7A示出了与SDS相比，使用SHS凝胶缓冲液大大改进了第二种蛋白质RTP-2的CGE图谱。RTP-2是一种mAb，在其表面上具有根据其空间聚集倾向(SAP)分数(26)确定的高比例的疏水性斑块(hydrophobic patches)。相比之下，RTP-3(图7B)是一种相对亲水性mAb，其SAP分数远低于RTP-2，无论凝胶缓冲液中存在的去污剂(SDS或SHS)如何，其产生高的PSE。

用于产品发布的含有SHS的凝胶缓冲液的开发以及CE-SHS纯度方法的评定。将SHS凝胶缓冲液组合物开发为稳健的、可重现的且和稳定的，有效期≥15个月。最终的RTP-1纯度方法已成功经过评定合格，其中标称蛋白质负载量比在完全优化的CE-SDS条件下另外获得的负载量高3-4倍(图2)。

材料和方法

试剂。甘油(≥99％)、乙二胺四乙酸(EDTA，≥99％)、右旋糖酐(MW～2000kDa)、三(羟甲基)氨基甲烷(Trizma，≥99.9％)、硼酸(≥99.5％)和β-巯基乙醇(≥99％)购自Sigma(密苏里州圣路易斯)。十一烷基硫酸钠(SUS，≥99％)、十四烷基硫酸钠(STS，>95％)和十六烷基硫酸钠(SHS，>98％)的粉末购自Alfa Aesar(马萨诸塞州伍德希尔)。粉末状的十二烷基硫酸钠(SDS，>99％)购自Avantor(宾夕法尼亚州中心谷)。对于CGE测定应用，从AB Sciex(马萨诸塞州弗雷明汉)购买了10kDa内标物(I.S.)、0.1N酸/碱洗涤液、SDS-MW凝胶和SDS样品缓冲液、预组装的裸露熔融硅胶毛细管柱以及2mL通用小瓶和盖。

样品制备。除非另有说明，否则将RTP-1以0.9mg/mL与0.76％SDS、5％β-巯基乙醇和76mM Tris-HCl一起制备。使用配备有SI Analytics探针的Schott pH计制备500mMTris-HCl pH 9.0，然后添加去离子水和去污剂粉末以达到所需浓度。对于相对疏水性的去污剂，将粉末溶解在Tris-HCl缓冲液中需要超声处理和在70°水浴中加热的组合。

凝胶缓冲溶液的制备。凝胶缓冲液的制备如下：将Trizma碱、硼酸、EDTA和甘油混合在一起，并通过0.2微米过滤器过滤。随后添加一种或多种去污剂和右旋糖酐。一旦所有组分在溶液中，将液体缓慢倒入购自Thermo Scientific(马萨诸塞州沃尔瑟姆)的适当尺寸的PTFE瓶中，并在室温保存。

毛细管电泳。在配备有光电二极管阵列检测器和32Karat采集软件(版本9)的PA800+仪器(AB Sciex，马萨诸塞州弗雷明汉)上进行CGE实验。电泳分离发生在15kV恒定电压下，内径为50μm的预切毛细管中，检测位置距样品注入点20cm。将来自32karat的数据传输到Empower 3(Build 3471,Waters，马萨诸塞州米尔福德)进行数据处理。注意，Empower是基于色谱的软件，因此在评估PSE时，将迁移时间转换为保留时间并如此进行计算，请参见下面的公式(1)和(2)。

峰分离效率(PSE)的评估。使用以下公式评估PSE的塔板计数(公式(1))和分辨率(公式(2))(美国药典，第621章)。Empower自动将这些值计算为字段选项(field option)。

N ＝ 16(R_t/W)² (1)

其中N＝理论塔板数(塔板计数)，R_t是峰的保留/迁移时间，W是基线处的峰宽，其中切线绘制至峰高的61％。

R ＝ 2(R_t2 – R_t1)/(W₂ + W₁) (2)

其中R＝两个峰之间的分辨率，R_t1和R_t2分别为峰1和2的保留/迁移时间，W₂+W₁为基线处峰宽的加和，其中在50％峰高处绘制了切线。

差示扫描量热法。将RTP-1用具有各种量的SDS或SHS的1x PBS(150mM NaCl和20mM磷酸盐pH 7.2)稀释至0.5mg/mL。测量在Malvern MicroCal VP-DSC系统(MalvernInstruments，马萨诸塞州北安普敦)上进行，其中细胞体积约为0.5mL。以1℃/min的扫描速度在20至95℃进行温度扫描。在浓度归一化之前，从每个样品扫描中减去缓冲液参考扫描。在Origin7.0(Origin Lab，马萨诸塞州北安普敦)中通过转换前和转换后基线的三次插值创建了基线。

蛋白质建模。将RTP-1的两个结构域之一(结构域2)的氨基酸序列与作为模板的具有已知结构的相似结构域进行比对。使用同源建模工具MODELLER(15)构建了该结构域的3D结构。使这些同源模型进行侧链优化和最小化步骤，然后进行模型验证。使用AdaptivePoisson-Boltzmann Solver(16)根据Propka输出文件中的残基电荷和残基的可接近性计算结构域的表面电荷。最后，通过程序PyMOL(

LLC)将静电地图可视化。

实施例2

使用中国仓鼠卵巢细胞制造重组IgG1蛋白mAb-1、mAb-2和mAb-3。在使用前，将蛋白质从-80℃解冻。甘油(≥99％)、乙二胺四乙酸(EDTA，≥99％)、右旋糖酐(MW～2000kDa)、三(羟甲基)氨基甲烷(Trizma，≥99.9％)、1M三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐溶液(生物性能得到认证)、硼酸(≥99.5％)、β-巯基乙醇(BME，≥99％)、碘乙酰胺(IAM，≥99％)和粉末状癸基硫酸钠(SC10S，≥99％))购自Sigma-Aldrich(密苏里州圣路易斯)。粉末状的十六烷基硫酸钠(SHS，>98％)和1-十四烷基硫酸钠(STS，>95％)购自Alfa Aesar(马萨诸塞州伍德希尔)，粉末状的十二烷基硫酸钠(SDS，>99％)购自Avantor(宾夕法尼亚州中心谷)。对于CGE应用，从AB Sciex(马萨诸塞州弗雷明汉)购买了10kDa内标物(I.S.)、0.1N酸/碱洗涤液、预组装的裸露熔融硅胶毛细管柱以及2mL通用小瓶和盖。

样品缓冲液和凝胶缓冲液的制备

对于CE-SDS应用，从AB Sciex(马萨诸塞州弗雷明汉)购买SDS-MW凝胶缓冲液和SDS-MW样品缓冲液(100mM Tris-HCl，1％w/v SDS，pH 9.0)。将Trizma碱、硼酸、EDTA和甘油混合在一起，并通过0.2μm过滤器过滤。随后添加去污剂和右旋糖酐。一旦所有组分在溶液中，将液体缓慢倒入购自Thermo Scientific(马萨诸塞州沃尔瑟姆)的适当尺寸的PTEE瓶中。含有替代去污剂的样品缓冲液的制备如下：将某些pH值的1M Tris-HCl溶液稀释至适当的浓度,然后进一步与去污剂混合以制成均质溶液。

制备具有以下组分的样品缓冲液：含有SC₁₆S(SHS)的样品缓冲液(50mM Tris-HCl，0.2％w/v SHS，pH 8.0)；含有SC₁₄S(STS)的样品缓冲液(50mM Tris-HCl，0.5％w/v STS，pH8.0)；和含有SC₁₀S的样品缓冲液(50mM mM Tris-HCl，2％w/v SC₁₀S，pH 9.0)

在非还原和还原条件下的样品制备

对于在非还原条件下的CGE应用，使用SDS样品缓冲液(100mM Tris-HCl，1％w/vSDS，pH 9.0，AB Sciex)制备具有0.9mg/mL最终蛋白质浓度和30mM IAM的mAb样品。对于在还原条件下的CGE应用，使用不同的样品缓冲液条件(包括SDS-MW样品缓冲液，含有SHS的样品缓冲液(0.2％w/v SHS)，含有STS的样品缓冲液(0.5％w/v SHS)和含有SC₁₀S的样品缓冲液(2％w/v,SC₁₀S))制备具有0.9mg/mL最终蛋白质浓度和5％v/v BME的mAb样品。除非另有说明，否则在非还原条件和还原条件下的样品变性分别在70℃进行5min和70℃进行10min。

毛细管凝胶电泳方法

在配备有UV检测器和32Karat采集软件(版本9)的PA800+仪器(ABSciex，马萨诸塞州弗雷明汉)上进行CGE实验。电泳分离发生在15kV恒定电压下，内径为50μm的预切毛细管中，检测位置距样品注入点20cm。将来自32karat的数据传输到Empower 3(Build 3471,Waters，马萨诸塞州米尔福德)进行数据处理。

由于作为mAb的主要类别的IgG分子的结构和尺寸相似，因此其中在样品缓冲液和筛分凝胶缓冲液两者中均应用SDS的通用CE-SDS方法通常适用于分析宽范围的IgG分子。在还原条件下，用还原剂(例如β-巯基乙醇(BME))处理IgG分子，以切割二硫键。包括轻链(LC)、重链(HC)和非糖基化重链(NGHC)的蛋白质片段通过尺寸和电泳迁移率分开。

实施例3(HC后HMW种类和伪迹的确认)

图9显示了在通用CE-SDS还原条件下运行的mAb-1和m-Ab3的电泳图谱叠加图。这两种还原的mAb分子在HC后高分子量区域展现了在主要组分方面可比较的分离图谱，但次要种类具有不同模式(在图9B中标记为A～D)。在这些次要种类之中，在mAb-1和mAb-3的样品迹线中看到种类A(用红色矩形突出显示)。峰A的迁移时间对应于由一条重链和一条轻链(H:L)组成的半抗体片段。在两个样品迹线中也都以明显的水平发现了种类D(箭头所示)，其分子量非常接近在非还原性CE-SDS条件下观察到的抗体的重链-重链片段(图9)。除了两种常见的次要种类外，在mAb-1样品迹线的HC后区域还存在额外的组B(由虚线矩形包围)和峰C(与峰D部分共迁移)种类，根据它们相对于A和D种类的迁移位置估算它们具有在75～100kDa之内的分子量(MW)。使用CE-SDS还原条件，通过包括LC(31.2％)和HC(64.0％)的相对百分比之和，测得mAb-1的纯度为95.3％。NGHC种类为0.6％，其被从纯度计算中排除。确定mAb-1的所有HC后HMW种类的总百分比为3.0％，其中组B种类的总百分比约为2.0％。

在mAb-1电泳图谱的HC后区域观察到的一些HMW种类似乎是在CE-SDS还原条件下诱发的伪迹。首先，在非还原条件下mAb-1的CE-SDS分析中，该方法报告了比分别为0.8％和0.4％的天然和变性SEC测量更高的聚集体水平(～2.5％)。此mAb分子的AUC评估进一步证实了SEC并没有低估聚集体结果，并且在CE-SDS分析中观察到的高HMW量实际上是不完全蛋白质变性的结果，这很可能是由于SDS不足以均匀包被完整的mAb-1分子。相同的SDS样品缓冲液和基于SDS的凝胶基质应用于非还原和还原CE-SDS分析两者中，因此还原的mAb-1分子片段也可能发生不完全变性。其次，为了检查所有HC后HMW种类是否都是固有的产品相关杂质，通过在CE-SDS非还原、部分还原和完全还原条件下运行mAb-1分子进行了研究。

在图10中重叠的电泳图谱清楚地表明，在还原的mAb-1样品迹线中显示的HC后组B种类在其未还原样品和两个部分还原样品的图谱中不可见。相比之下，在所有四个迹线中都看到了峰A种类。该观察结果表明，组B种类很可能是由完全还原的mAb-1片段的不完全变性而诱发的伪迹。最后，mAb-1的所有HC后HMW种类的总百分比展现出与蛋白质浓度很强的相关性。图11显示了在标称蛋白质浓度(0.9mg/mL)的25％-135％范围内测得的纯度％和总HMW％的图。这两种响应的趋势线表明，在不同的蛋白质浓度水平下，所应用的CE-SDS方法未达到足够且一致的样品变性，并且因此与低浓度情况(0.23mg/mL)相比，在高蛋白质浓度(1.23mg/mL)条件下观察到总HMW％的大于2.5％的增加，伴随有所产生的纯度测量值降低。进一步发现，组B和峰C种类的变化对总HMW％变化作出了主要贡献，而A和D类种类的相对百分比则保持不变(数据未示出)。这些研究的结论是，还原CE-SDS方法不能够真正反映mAb-1分子的纯度，因为HC后组B和C种类是方法诱发的伪迹，而不是与产品相关的真实杂质。因此，需要优化所应用的CE-SDS方法，以便可以实现无偏的纯度评估。

在鉴定可以消除HMW伪迹形成的最终溶液之前，首先评估了通常对蛋白质变性展现较大影响的一些参数，包括样品缓冲液和凝胶基质中利用的SDS的水平以及孵育条件。

实施例4(SDS基质研究)

样品缓冲液/凝胶基质制备

通常，增加在蛋白质样品上作用的样品缓冲液的SDS水平是促进蛋白质完全变性的主要尝试。进行通过将起始CE-SDS样品缓冲液的SDS％从0.5％改变至4％的一次一个因素(OFAT)研究，所得的还原的mAb-1样品的电泳图谱叠加在图12中。相应地调整样品运行的进样时间，以达到归一化的峰面积，因为SDS％影响上样效率。在通过含有较高SDS％的样品缓冲液制备的还原的mAb-1样品中观察到了更多的组B的HMW伪迹，而A种类的水平在测试范围内保持恒定。由于样品缓冲液的SDS％从0.5％至4％变化，总HMW％的总体增加大致为1.5％(绝对值)。另一方面，还研究了筛分凝胶基质中存在的SDS％的影响。图13比较了使用1％SDS样品缓冲液产生并通过含有0.2％-4％SDS的凝胶基质进行分离的还原的mAb-1样品的电泳图谱。与在样品缓冲液SDS％的OFAT研究中观察到的趋势相似，随着凝胶基质中存在的SDS％升高，也注意到组B的HMW种类的显著增加。从以上两组实验得出的结果证实，简单调整样品和凝胶缓冲液两者中SDS的浓度不能减轻HMW伪迹问题。

变性/还原的孵育条件

众所周知，样品孵育条件(例如温度和时间)对蛋白质变性有重要影响。由于蛋白质变性不足，在温和的孵育条件下变性的mAb样品的CE-SDS图谱中常常看到明显的HMW种类。为了探索孵育条件的改变是否有助于抑制伪迹HMW种类的形成。在60℃，5min至90℃，15min范围内的一组不同孵育条件下将mAb-1样品变性并还原。随后，将还原的mAb-1样品使用供应商提供的基于SDS的凝胶进行分离，所得电泳图谱如图14A所示。在最温和的60℃，5min孵育条件下，产生了多于11％的组B种类。将孵育时间延长至10min使组B种类的水平急剧降低至3.5％，但进一步应用更苛刻的孵育条件并不会显著降低其形成。为了进行比较，还使用相似的孵育条件评估了在典型的CE-SDS条件下表现良好的mAb-3分子，所得的分离图谱列于图14B中。发现在60℃，3min的温和孵育条件下，在mAb-3样品中也产生了具有与在mAB-1样品中看到的组B种类相当的MW的HMW种类。

然而，随着孵育条件达到70℃，10min，这些HMW种类逐渐下降到不明显的水平，并且在更苛刻的条件下没有重新形成，证明了样品变性/还原的完成。在此孵育条件研究下两种mAb分子之间的谱图比较提供了又一个置信水平，即组B的HMW种类实际上是方法诱发的伪迹。与通常情况不同，在还原的mAb-1分子中观察到的组B的HMW伪迹即使在最苛刻的90℃，15min的孵育条件下也能抵抗SDS变性，这可能与SDS对这种蛋白质的特定氨基酸残基的低亲和力有关。然而，进一步的研究表明，mAb-1分子也可以在还原条件下完全变性，其中在适用于大多数mAb分子的典型孵育条件下(例如70℃，10min)，通过在样品缓冲液和凝胶基质两者中添加相对疏水性去污剂例如SHS或STS，而彻底消除了所有组B的HMW伪迹。

使用CE-SDS方法运行时，还检验了在15℃自动进样器中储存的还原的mAb-1样品的机载(on-board)稳定性。图15示出了在24-进样序列的开始(T0)、中间(T 10小时)和结束(T 20小时)时运行的还原的mAb-1样品的分离图谱。从最早的进样(T0)到最晚的进样(T20h)，注意到这些组B种类图谱的可区分的差异。这些图谱变化伴随着组B种类的百分比增加0.6％(绝对值)以及相应地纯度％减少0.6％，表明通过还原CE-SDS方法的mAb-1分子分析的机载不稳定性升高。

通过改变样品缓冲液和凝胶基质两者中的去污剂，最小化HC后HMW伪迹

常规的CE-SDS方法优化策略无法为还原条件下mAb-1分子的充分变性提供帮助。考虑到在非还原条件下应用SHS凝胶进行mAb-1分子纯度分析对于抑制HMW伪迹所带来的益处，提出了一个假设，即有可能通过用更疏水性的去污剂代替样品缓冲液和/或筛分凝胶基质中使用的标准去污剂SDS，解决还原的mAb-1分子的HC后HMW伪迹。

为了更好地了解去污剂疏水性对mab-1分子的变性和还原的影响，选择了可替代的去污剂癸基硫酸钠(SC₁₀S)和十四烷基硫酸钠(SC₁₄S或STS)作为代表性去污剂用于进一步的方法优化。去污剂SC₁₀S和SC₁₄S(STS)具有相同的硫酸根头部基团，但相对于标准去污剂SDS(也称为SC₁₂S)，烷基碳链少2个或多2个碳原子，并且因此分别表现出比SDS更少或更多的疏水性。若干还原的mAb-1样品使用含有2％(w/v)SC₁₀S、1％(w/v)SDS或0.5％(w/v)STS的样品缓冲液进行制备，并且然后使用两种类型的筛分凝胶(包括基于SDS的凝胶(由ABSciex提供)和我们自制的基于SHS的凝胶)单独进行分离。在图16中比较了在本研究的不同样品缓冲液和凝胶基质条件组合下产生的还原的mAb-1样品的电泳图谱。表2概括了它们关于纯度、主要组分峰和HC后HMW种类的正确峰面积的相对百分比所得到的方法响应。

表2.还原的mAB-1样品分析的峰百分比

通过用基于SDS的凝胶运行还原的mAb-1样品，随着样品缓冲液去污剂的烷基碳链长度从10增加到14，测得的具有大于1倍减少的％HMW伪迹从4.4％变为1.8％。该观察结果符合我们的预期，并且可以归因于更疏水的去污剂与还原的mAb-1片段的亲和力增强，如由组B种类数量减少和它们的更集中的峰形所证明的。此外，样品缓冲液去污剂的烷基链长度延长至16没有显示出进一步的改进，并且该方法仍然由于由于B组HMW种类的存在而受到低估的纯度结果和不足的稳健性的损害。由于具有甚至更长链长度的去污剂在水溶液中的有限溶解度，因此未对其进行评估。另一方面，当切换到基于SHS的凝胶时，也发现％HMW伪迹与样品缓冲液去污剂的烷基链长度之间的相似关系。更重要的是，通过注意到通过在样品缓冲液和凝胶基质两者中添加相对疏水性去污剂(在这种情况下分别为STS和SHS)而从还原的mAb-1样品迹线中完全清除了组B种类，实现了抑制HC后HMW伪迹的极大改进。因此，使用该联合应用测得的纯度结果为96.5％，比典型的CE-SDS方法获得的值低约2.4％(绝对值)。此外，通过监测表1中所示主峰组分的水平，不难发现在不同的去污剂条件下％LC和％NGHC均未发生明显变化。因此，％HC和％纯度的变化可能主要与％HMW伪迹的变化相关，从而得出我们的结论，即这些HC后HMW伪迹很可能是未完全变性的mAb-1 HC种类。

在此，在相对疏水性去污剂SHS或STS仅存在于样品缓冲液或凝胶基质中的情况下，观察到HMW伪迹的部分减少。这些现象可能与附着在蛋白质/片段上的去污剂胶束和凝胶基质中存在的去污剂胶束之间的动态平衡有关。当这些种类在一定的时间窗口内(例如30min)在典型的分离温度(例如25℃)在毛细管中行进时，可能发生从和/或至现存的去污剂-分析物复合物的具有不同亲和力的去污剂胶束的竞争性解离和再次结合。在应用SDS样品缓冲液和SHS凝胶的情况下，由于SDS的亲和力低，还原的mAB-1分子最初并未完全变性。而且，通过用在凝胶基质中存在的相对疏水性SHS胶束逐渐部分置换相对低亲和力的SDS胶束，在分离过程中可能发生进一步的毛细管内的样品变性，但不能完全完成。因此，在这种情况下，仍可检测到HMW伪迹的水平为0.9％。在具有相反的去污剂应用(STS-样品缓冲液和SDS-凝胶)的情况下，更好变性的mAb-1片段可能仍经受原始附着的STS胶束与凝胶中存在的较不疏水的SDS胶束的部分互换，尽管这一过程就蛋白质亲和力而言是不太有利的，使得HMW伪迹以约1.8％的水平重新形成。

为了扩大可用于此应用的相对疏水性去污剂的范围，评估了含有0.2％(w/v)SHS或不同组合水平的SHS和SDS混合物的样品缓冲液。如图17所示，结合基于SHS的凝胶，含有SHS的样品缓冲液在去除HC后HMW伪迹方面表现出预期的性能，因为该去污剂甚至比STS更疏水。此外，HMW伪迹在向SHS样品缓冲液中添加0.5％(w/v)SDS后开始重新出现，并且随着SDS水平的升高而进一步增加。该发现仍可归因于SHS和SDS胶束与mAb-1片段的竞争性结合，即使后者的亲和力低于前者。除了该评估之外，还通过用STS代替原始去污剂SHS产生了另一种凝胶，STS的疏水性更小但对mAb-1的亲和力仍然高于SDS。图18示出了通过基于SHS和基于STS的筛分凝胶运行的相同还原的mAb-1样品的可比较的分离图谱。在这两种情况下，均未观察到HC后HMW伪迹。

相对疏水性去污剂在其他mAb分子的CGE分析中的应用

在还原条件下对mAb-2分子进行纯度分析还需要在样品缓冲液和筛分凝胶基质两者中都存在相对疏水性去污剂，以便可以实现无偏的纯度结果和改进的分离性能。相比之下，使用相对疏水性去污剂或典型的CE-SDS方法中采用的标准去污剂SDS，mAb-3分子产生可比较的CGE性能。

在图19A中示出，在典型的CE-SDS还原条件下，在mAb-2分子的图谱中不仅观察到了多种非典型的HC后HMW种类(组B和E)，而且还观察到异常宽的HC峰，这强烈表明需要相对疏水性去污剂进行更充足的样品变性。使用分别在样品缓冲液和筛分凝胶中具有相对疏水性去污剂STS和SHS的优化方法，已经实现如图19B所示方法性能的显著改进，包括去除所有非典型HMW种类以及HC种类的峰高和塔板计数分别增加了3.5倍和6倍。

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应当理解，具体实施方式部分而非发明内容和摘要部分旨在用于解释权利要求书。发明内容和摘要部分可以阐述诸位发明人考虑的本发明的一个或多个但不是全部示例性方面，因此不旨在以任何方式限制本发明和所附权利要求书。

上面已经借助于说明实现特定功能及其关系的功能构造块描述了本发明。这些功能构造块的边界在本文中是被任意定义的，以便于描述。只要适当执行这些特定功能及其关系，可以定义替代的边界。

前面对特定方面的描述将充分揭示本发明的一般性质，使得其他人可以通过应用本领域技术范围内的知识，在无需过度试验并且不偏离本发明总体概念的情况下容易地修改和/或适配此类特定方面用于各种应用。因此，基于本文提出的传授内容和指导，这样的适配和修改旨在处于所披露的方面的等效物的含义和范围内。应理解的是，本文中的措辞或术语是出于描述的目的而非限制的目的，使得本说明书的术语或措辞将由本领域技术人员根据传授内容和指导来解释。

本发明的宽度和范围不应由上述示例性方面中的任一个限制，而应仅根据所附权利要求书和其等同物来限定。

Claims (37)

1.一种用于分析蛋白质样品的方法，其包括通过毛细管电泳分离所述样品中的变性的目标蛋白质，所述毛细管电泳包括疏水性去污剂凝胶缓冲液。

2.一种用于改进毛细管电泳蛋白质峰分离效率(PSE)的方法，其包括在疏水性去污剂凝胶缓冲液中分离样品中的变性的目标蛋白质。

3.一种用于改进通过毛细管电泳的蛋白质纯度测定的方法，其包括在疏水性去污剂凝胶缓冲液中分离样品中的变性的目标蛋白质。

4.一种用于蛋白质分离分析的毛细管电泳凝胶缓冲液，其包含疏水性去污剂。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述疏水性去污剂包含相同的带电荷的硫酸根头部基团和钠抗衡离子并且具有选自14至16的烷基链长度。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述疏水性去污剂选自十四烷基硫酸钠(STS)和十六烷基硫酸钠(SHS)。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述疏水性去污剂是十六烷基硫酸钠(SHS)。

8.一种电泳缓冲液组合物，其包含疏水性去污剂，所述疏水性去污剂包含硫酸根头部基团和疏水性尾部，所述疏水性尾部包含具有大于12个碳原子的烷基链。

9.根据权利要求8所述的缓冲液组合物，其中所述烷基链具有小于19或20个碳原子。

10.根据权利要求9所述的缓冲液组合物，其中所述烷基链具有13、14、15、16、17或18个碳原子。

11.根据权利要求8至10中任一项所述的缓冲液组合物，其中所述疏水性去污剂比十二烷基硫酸钠更疏水。

12.根据权利要求8至11中任一项所述的缓冲液组合物，其中与十二烷基硫酸钠相比，所述疏水性去污剂能够通过毛细管筛分电泳引起改进的蛋白质峰分离效率。

13.根据权利要求8至12中任一项所述的缓冲液组合物，其中所述疏水性去污剂选自十三烷基硫酸钠、十四烷基硫酸钠(STS)、十五烷基硫酸钠、十六烷基硫酸钠(SHS)、十七烷基硫酸钠和十八烷基硫酸钠(SOS)。

14.根据权利要求13所述的缓冲液组合物，其中所述疏水性去污剂是十六烷基硫酸钠(SHS)。

15.根据权利要求8至14中任一项所述的缓冲液组合物，其中所述疏水性去污剂的浓度为约0.001％至约4％w/v。

16.根据权利要求8至15中任一项所述的缓冲液组合物，其中所述组合物还包含一种或多种选自缓冲组分、有机添加剂、亲水性聚合物、金属螯合剂及其任何组合的额外组分。

17.根据权利要求16所述的缓冲液组合物，其中所述缓冲组分包括三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或其任何组合。

18.根据权利要求16或17所述的缓冲液组合物，其中所述有机添加剂包括甘露糖醇、甘油、乙二醇、乙醇、甲醇或其任何组合。

19.根据权利要求16至18中任一项所述的缓冲液组合物，其中所述亲水性聚合物包括右旋糖酐、聚丙烯酰胺、聚乙二醇或其任何组合。

20.根据权利要求16至19中任一项所述的缓冲液组合物，其中所述金属螯合剂包括乙二胺四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸或其任何组合。

21.一种用于通过电泳分离目的蛋白质的方法，其包括在样品缓冲液中使目的蛋白质变性，所述样品缓冲液包含根据权利要求4所述的缓冲液或根据权利要求8至20中任一项所述的组合物。

22.根据权利要求21所述的方法，其进一步包括使电泳凝胶在运行缓冲液中运行。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述运行缓冲液和/或所述电泳凝胶包含根据权利要求4所述的缓冲液或根据权利要求8至20中任一项所述的组合物。

24.一种用于改进通过电泳的目的蛋白质的峰分离效率的方法，其包括使所述目的蛋白质在包含根据权利要求4所述的缓冲液或根据权利要求8至20中任一项所述的组合物的样品缓冲液中变性，并使电泳凝胶在运行缓冲液中运行，其中与使用十二烷基硫酸钠(SDS)进行的分离的蛋白质峰分离效率(PSE)相比，蛋白质峰分离效率(PSE)得到改进。

25.根据权利要求21至24中任一项所述的方法，其中所述电泳是毛细管凝胶电泳。

26.根据权利要求1至3、5至7和21至25中任一项所述的方法，其中电泳凝胶结果显示出与用十二烷基硫酸钠进行的电泳凝胶相比更少的伪迹高分子量种类。

27.根据权利要求1至3、5至7和21至26中任一项所述的方法，其中所述变性在至少约60℃、至少约65℃、至少约70℃、至少约75℃或至少约80℃的温度进行。

28.根据权利要求1至3、5至7和21至26中任一项所述的方法，其中所述变性在约60℃至约70℃、约65℃至约70℃、或约60℃至约65℃的温度进行。

29.根据权利要求1至3、5至7和21至28中任一项所述的方法，其中所述变性进行至少约3分钟、至少约4分钟、至少约5分钟、至少约6分钟、至少约7分钟、至少约8分钟、至少约9分钟、至少约10分钟。

30.根据权利要求1至3、5至7和21至29中任一项所述的方法，其中所述目的蛋白质是抗体。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述抗体是选自IgM、IgA、IgE、IgD和IgG的同种型。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述IgG抗体选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。

33.根据权利要求1至3、5至7和21至29中任一项所述的方法，其中所述目的蛋白质包括酶、激素、细胞因子、细胞表面受体、蛋白酶、细胞因子受体或其任何组合。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述目的蛋白质是融合蛋白。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述融合蛋白与异源部分融合。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述异源部分是延长半衰期的部分。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述延长半衰期的部分包含Fc。

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