CN112305048B - Mes和sds缓冲液在降低毛细管电泳碎片峰中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于蛋白质电泳技术领域，具体涉及MES和SDS缓冲液在降低毛细管电泳碎片峰中的应用。所述的MES和SDS缓冲液含有2‑3g/L MES，5‑15g/L SDS，余量超纯水，pH值为6.3‑6.7。所述的MES和SDS缓冲液不仅能使蛋白充分变性、带上电荷，还能明显减少人为碎片峰的产生，保证电泳结果的准确性，显著提高样品峰的响应值，可以代替传统的SCIEX配方（含有1%SDS的100mM Tris‑HCl pH9.0的电泳缓冲液），适用于单抗非还原的CE‑SDS检测。

Description

MES和SDS缓冲液在降低毛细管电泳碎片峰中的应用
技术领域
本发明涉及蛋白质电泳技术领域，具体涉及MES和SDS缓冲液在降低毛细管电泳碎片峰中的应用。
背景技术
十二烷基硫酸钠毛细管电泳（CE-SDS）是一类以毛细管为分离通道，以高压电场为驱动力，依据样品组分之间分子大小的差异而实现分离的新型液相分离技术。该技术可以测定完整蛋白以及碎片的比例。CE-SDS技术能有效的监控在蛋白药物的研发、生产及储存过程中发生的断裂，监测其纯度，保证蛋白质量。
在CE-SDS的检测中，一般采用SCIEX公司所提供的试剂盒IgG Purity andHeterogeneity Assay。该试剂盒中的样品缓冲液为含有1% SDS的100mM Tris-HCl pH9.0，该样品缓冲液主要用于样品变性以及使蛋白带上负电荷。该试剂盒的检测方法包括如下步骤：将供试品用超纯水稀释至4mg/mL，然后制备供试品溶液（70µL SDS样品缓冲液，25µL供试品，5µL IAM）。将上述制备好的供试品溶液混匀，68-72℃金属浴10min，冷却离心后，加入至内衬管中，上机分析。上述方法的缺点是：该试剂盒中的样品缓冲液容易使蛋白在加热变性过程中产生额外的碎片峰，人为导致检测纯度偏低。
现有的20X MES /SDS电泳缓冲液仅报道过可用于蛋白质电泳，并没有报道过可用于降低毛细管电泳碎片峰。因此，有必要研发一种新型电泳缓冲液，能有效减少CE-SDS电泳过程中产生的碎片峰，且不影响电泳结果的准确性。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明要解决的技术问题是提供一种MES和SDS缓冲液，能减少CE-SDS电泳过程中产生的碎片峰，且不影响电泳结果的准确性。该MES和SDS缓冲液可用于降低毛细管电泳碎片峰。
为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：
一方面，本发明提供了MES和SDS缓冲液在降低毛细管电泳碎片峰中的应用。
具体地，所述的MES和SDS缓冲液含有2-3g/L MES，5-15g/L SDS，余量超纯水，pH值为6.3-6.7。
优选地，所述的MES和SDS缓冲液含有2.1-2.5g/L MES，8-12g/L SDS，余量超纯水，pH值为6.4-6.6。
更优选地，所述的MES和SDS缓冲液含有2.13g/L MES，10g/L SDS，余量超纯水，pH值为6.5。
另一方面，本发明提供了上述MES和SDS缓冲液的制备方法，包括如下步骤：称量2-3g MES、5-15g SDS，溶于900mL超纯水中混匀，用6M NaOH调节pH至6.3-6.7，再用余量超纯水定容至1L，即得。
优选地，所述制备方法包括如下步骤：称量2.1-2.5g MES、8-12g SDS，溶于900mL超纯水中混匀，用6M NaOH调节pH至6.4-6.6，再用余量超纯水定容至1L，即得。
更优选地，所述制备方法包括如下步骤：称量2.13g MES、10g SDS，溶于900mL超纯水中混匀，用6M NaOH调节pH至6.5，再用余量超纯水定容至1L，即得。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明所提供的MES和SDS缓冲液不仅能使蛋白充分变性、带上电荷，还能明显减少人为碎片峰的产生，保证电泳结果的准确性，显著提高样品峰的响应值，可以代替传统的SCIEX配方（含有1% SDS的100mM Tris-HCl pH9.0的电泳缓冲液），适用于单抗非还原的CE-SDS检测。
附图说明
图1为分别采用本发明MES和SDS缓冲液配方与传统SCIEX公司缓冲液配方进行CE-SDS的电泳结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
MES：2-(N-吗啡啉)乙磺酸，购自Sigma。
SDS：十二烷基硫酸钠，购自Sigma。
仪器：毛细管电泳仪PA800 Plus。
材料：供试品为一种单克隆抗体IgG1，产自苏桥生物。
原理解释：单抗上通常会存在游离的巯基，而在变性的过程会由于高温会导致游离的巯基攻击单抗上的二硫键，从而导致单抗碎片峰的增加，而在加入烷基化试剂后，烷基化试剂可与游离巯基反应，屏蔽其攻击二硫键，不同缓冲液产生的效果不同，MES/SDS缓冲液搭配NEM烷基化试剂更充分的屏蔽游离的巯基，从而更好的保护单抗。
实施例1
按照如下步骤配置MES和SDS缓冲液（100mL）：
称量213mg MES和 1g SDS混匀，溶解于90mL 超纯水中，用6M NaOH调节pH至6.5，用超纯水定容至100mL。用0.22 µm滤膜过滤，室温保存一个月。
按照如下步骤进行供试品的单抗CE-SDS（非还原）检测：
将供试品用超纯水稀释至4mg/mL，加入70µL MES/SDS缓冲液，25µL供试品，5µL100mM NEM。将上述制备好的供试品溶液混匀，70℃金属浴10min，冷却离心后，加入至内衬管中，上机分析。
试验结果如表1及图1所示：
表1 两种缓冲液的电泳结果
缓冲液名称 纯度 碎片含量 总校正峰面积
传统SCIEX配方 97.2% 2.8% 17480
本发明MES和SDS缓冲液配方 98.5% 1.5% 31553
由表1结果可知，用本发明的MES和SDS缓冲液配方测定的样品纯度结果比传统SCIEX配方测定的纯度结果高1.3%，碎片峰含量低1.3%。表明本发明的MES和SDS缓冲液能够起到减少人为碎片峰产生的作用。另外，用本发明的MES和SDS缓冲液测得的样品总校正峰面积显著高于传统SCIEX配方，表明本发明的MES和SDS缓冲液能够使样品峰有更高的响应值，这对提高方法的检测灵敏度具有重要意义。
由图1可知，两种配方测定结果的差异主要体现在碎片1上，本发明的MES和SDS缓冲液配方为0.6%，而传统SCIEX配方为1.6%，高出本发明的MES和SDS缓冲液配方1.0%。另外，由对比图谱可知，本发明的MES和SDS缓冲液配方的测定结果的峰高显著高于传统SCIEX配方。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (2)

1.MES和SDS缓冲液在降低毛细管电泳碎片峰中的应用，其特征在于，所述的MES和SDS缓冲液含有2.13g/L MES，10g/L SDS，余量超纯水，pH值为6.5。
2.权利要求1所述的MES和SDS缓冲液的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：称量2.13g MES、10g SDS，溶于900mL超纯水中混匀，用6M NaOH调节pH至6.5，再用余量超纯水定容至1L，即得。
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