CN115125238B - 一种肿瘤细胞外囊泡dna的分离纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体为一种肿瘤细胞外囊泡DNA的分离纯化方法，包括以下步骤：S1、将囊泡裂解液与含DNA的生物样本混匀后共孵育，得到裂解溶液；所述含DNA的生物样本为肿瘤细胞外囊泡；S2、向所述裂解溶液中加入沉淀液混匀，离心得到上清液；S3、向所述上清液中加入析出液，析出DNA并离心获得沉淀物；S4、用洗涤液对沉淀物进行洗涤，得到纯化的DNA。整个操作步骤简便，所需时间不超过40min，大大简化了肿瘤细胞外囊泡DNA的提取流程，同时提高了肿瘤细胞外囊泡DNA的提取效率和纯度。

Description

一种肿瘤细胞外囊泡DNA的分离纯化方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种肿瘤细胞外囊泡DNA的分离纯化方法。
背景技术
肿瘤细胞外囊泡是肿瘤细胞被刺激或进入细胞凋亡进程时，由肿瘤细胞释放的各种具有膜结构的囊泡统称，其直径范围为1nm至1000nm。肿瘤细胞外囊泡携带少量来自肿瘤细胞基因组的DNA片段。研究表明：肿瘤细胞外囊泡来源的DNA在肿瘤的发展、转移过程中发挥显著作用；与此同时，肿瘤细胞外囊泡作为肿瘤疫苗发挥抗肿瘤作用的过程中，DNA也起着重要作用。在临床方面，肿瘤细胞外囊泡来源的DNA作为肿瘤标志物在体外诊断、用药及预后等领域有重要发展前景。而提取高质量的肿瘤细胞外囊泡DNA是开展上述工作的先决条件。
现在实验室人员常采用细胞外囊泡DNA提取试剂盒提取DNA，多数试剂盒经由以下步骤提取DNA：样品首先在裂解液和蛋白酶K作用下裂解消化，将DNA释放到裂解液中，然后加入Buffer1和乙醇后，转移至柱子中离心，使DNA吸附在柱子的膜上，而蛋白质不被吸附并随溶液滤出除去。柱子经Buffer2洗涤盐分等杂质，最后DNA被溶解缓冲液洗脱。完成整个操作所需时间较长，费用偏高，不适用于肿瘤细胞外囊泡DNA的大规模提取。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种肿瘤细胞外囊泡DNA的分离纯化方法。
一种肿瘤细胞外囊泡DNA的分离纯化方法，包括以下步骤：
S1、将囊泡裂解液与含DNA的生物样本混匀后共孵育，得到裂解溶液，所述含DNA的生物样本为肿瘤细胞外囊泡；
S2、向所述裂解溶液中加入沉淀液混匀，离心得到上清液；
S3、向所述上清液中加入析出液，析出DNA并离心获得沉淀物；
S4、用洗涤液对沉淀物进行洗涤，得到纯化的DNA。
优选的，所述囊泡裂解液为质量分数为10-15％的SDS溶液。
优选的，所述孵育的温度为50-70℃，时间为10-20min。
优选的，所述沉淀液为在4℃-10℃的条件下冷处理过的醋酸钾溶液。
优选的，所述醋酸钾溶液的浓度为3-3.5mol/L。
优选的，S2与S3中的离心温度为4℃。
优选的，所述析出液为在-20℃条件下冷处理过的乙醇，所述析出液与所述囊泡裂解液的体积比为2-3:1。
优选的，所述洗涤液为体积分数为70％的乙醇。
优选的，所述DNA的生物样本中囊泡数量、所述囊泡裂解液体积、所述沉淀液体积之间的比例为1×1010-3×1010个：500μL：170μL。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、整个操作步骤简便，所需时间不超过40min，大大简化了肿瘤细胞外囊泡DNA的提取流程，同时提高了肿瘤细胞外囊泡DNA的提取效率和纯度；
2、SDS一方面作为离子型去污剂，可使肿瘤细胞外囊泡破裂，使之释放出囊泡内容物；另一方面，SDS以其烃链与蛋白质分子的侧链结合成复合体，使蛋白质变性。醋酸钾与SDS反应生成十二烷基硫酸钾(potassium dodecylsulfate，PDS)，而PDS是水不溶的，因此可以通过离心把SDS和蛋白质沉淀至管底；对醋酸钾溶液进行冷处理，可以促进沉淀的生成；
3、本发明先采用10％ SDS溶液裂解肿瘤细胞外囊泡，使囊泡内容物释放出来，同时SDS使蛋白质变性；然后通过加入醋酸钾，使得SDS和蛋白质沉淀下来，DNA留在上层水相；之后用乙醇析出水相中的DNA，并用70％乙醇洗涤，得到纯化的细胞外囊泡DNA。本发明所需试剂为实验室常见试剂，不需要使用具有刺激性气味的试剂，比如酚试剂、氯仿等；所用为数不多的仪器均为实验室常用仪器，整个操作流程简易，实验成本低，效率高。
附图说明
图1为不同种类肿瘤细胞来源的细胞外囊泡DNA示意图。
图中M代表Marker。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
所用肿瘤细胞外囊泡的提取方法参见中国专利CN 103446580A。
所用肿瘤细胞来源：H22(小鼠)、B16-F10(小鼠)、Lewis(小鼠)、MCF-7(人)。
所用肿瘤细胞外囊泡的计数方式：精确的计数方式为使用纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)来进行计数，计数方法：将肿瘤细胞外囊泡用500μLPBS重悬，将囊泡悬液稀释100倍后(10μL囊泡悬液+990μL PBS)上机检测。
简易的计数方法：用中国专利CN 103446580 A中的方法提取肿瘤细胞外囊泡，1个细胞大概可以分泌10个细胞外囊泡，比如：1×109个肿瘤细胞可以提取到大概1×1010个细胞外囊泡。所以，可以根据肿瘤细胞数量来估算获得的肿瘤细胞外囊泡数量。
肿瘤细胞外囊泡在裂解前的处理方法：将含有相应囊泡数量的囊泡悬液于14000g4℃离心30min，弃上清，得到沉淀的肿瘤细胞外囊泡，用于与囊泡裂解液混匀后孵育。
实施例1
一种肿瘤细胞外囊泡DNA的分离纯化方法，包括以下步骤：
S1、将1×1010个H22细胞来源的细胞外囊泡与500μL质量分数为10％的SDS溶液混匀后在50℃下孵育10min，得到裂解溶液；
S2、向裂解溶液中加入170μL浓度为3mol/L的醋酸钾溶液，醋酸钾溶液预先在4℃的条件下冷处理12h，颠倒混合，14,000g4℃离心10min，得到上清液移入新的EP管中；
S3、向上清液中加入1mL在-20℃条件下冷处理过的乙醇，反复颠倒，14,000g 4℃离心10min，获得沉淀物；
S4、将沉淀物用1mL体积分数为70％的乙醇洗涤一次，得到纯化的肿瘤细胞外囊泡DNA，晾干，用适量的TE溶解。
实施例2
一种肿瘤细胞外囊泡DNA的分离纯化方法，包括以下步骤：
S1、将2×1010个H22细胞来源的细胞外囊泡与500μL质量分数为15％的SDS溶液混匀后在60℃下孵育20min，得到裂解溶液；
S2、向裂解溶液中加入170μL浓度为3.5mol/L的醋酸钾溶液，醋酸钾溶液预先在4℃的条件下冷处理12h，颠倒混合，14,000g4℃离心10min，得到上清液移入新的EP管中；
S3、向上清液中加入1.5mL在-20℃条件下冷处理过的乙醇，反复颠倒，14,000g 4℃离心10min，获得沉淀物；
S4、将沉淀物用1mL体积分数为70％的乙醇洗涤一次，得到纯化的肿瘤细胞外囊泡DNA，晾干，用适量的TE溶解。
实施例3
一种肿瘤细胞外囊泡DNA的分离纯化方法，包括以下步骤：
S1、将3×1010个H22细胞来源的细胞外囊泡与500μL质量分数为12％的SDS溶液混匀后在70℃下孵育15min，得到裂解溶液；
S2、向缓冲溶液中加入170μL浓度为3mol/L的醋酸钾溶液，醋酸钾溶液预先在4℃的条件下冷处理12h，颠倒混合，14,000g4℃离心10min，得到上清液移入新的EP管中；
S3、向上清液中加入1.3mL在-20℃条件下冷处理过的乙醇，反复颠倒，14,000g 4℃离心10min，获得沉淀物；
S4、将沉淀物用1mL体积分数为70％的乙醇洗涤一次，得到纯化的肿瘤细胞外囊泡DNA，晾干，用适量的TE溶解。
对比例1
对比例1与实施例1的不同之处在于，S1中SDS溶液的质量分数为1％，其他操作与步骤均与实施例1相同。
对比例2
对比例2与实施例1的不同之处在于，S1中SDS溶液的质量分数为5％，其他操作与步骤均与实施例1相同。
对比例3
对比例3与实施例1的不同之处在于，S1中孵育温度为27℃，其他操作与步骤均与实施例1相同。
对比例4
对比例4与实施例1的不同之处在于，S1中孵育温度为37℃，其他操作与步骤均与实施例1相同。
为验证本发明DNA的分离纯化效果，用超微量分光光度计Thermo NanoDrop ONE检测实施例与对比例获得的DNA浓度和纯度，结果见表1和表2。
表1实施例与对比例1-2的DNA分离纯化结果
表2实施例与对比例3-4的DNA分离纯化结果
由表1可知：使用质量分数为1％、5％、10％、12％和15％的SDS溶液都能得到一定浓度和纯度的DNA。通过分析可知，随着SDS溶液浓度的升高，DNA的浓度变大，说明高浓度的SDS溶液使细胞外囊泡裂解更充分，蛋白质变性更彻底，因而可以得到更多的DNA。但是当SDS溶液浓度由10％升至12％，乃至15％时，DNA的浓度变化不大，可见10％ SDS溶液已经能够达到最优的效果。另外，当SDS浓度偏低时，DNA A260/280＜1.8，表示DNA中有蛋白质污染，可能是由于SDS的量偏少，导致蛋白质变性不充分，从而使DNA中残留有蛋白质。
由表2可知：使用27℃、37℃、50℃、60℃、70℃的孵育温度都能得到一定浓度和纯度的DNA。通过分析可知，随着温度的升高，DNA的浓度变大，说明较高温度使细胞外囊泡裂解更充分，因而可以得到更多的DNA。但是当SDS溶液浓度由50℃升至60℃，乃至70℃时，DNA的浓度变化不大，可见50℃已经能够达到最优的效果。另外，当孵育温度偏低时，DNA 1.8＜A260/280＜2.0，表明温度对DNA的纯度影响不大，可能是因为即使有部分囊泡没有破裂，但是这部分囊泡可以被沉淀下来，因而不会有蛋白质污染DNA，但温度降低时DNA的浓度降低。
为了验证本发明的方法是否适用于对不同种属、不同类型肿瘤细胞来源的细胞外囊泡，利用本发明的方法对小鼠黑色素瘤B16-F10的细胞外囊泡、小鼠肺癌Lewis的细胞外囊泡和来源于人的乳腺癌MCF-7的细胞外囊泡的DNA进行分离纯化，囊泡的数量均为1×1010个，其他步骤与条件均与实施例1相同。用超微量分光光度计Thermo NanoDrop ONE检测获得的DNA浓度和纯度，结果见表3。
表3不同种属、类型肿瘤细胞来源的细胞外囊泡DNA分离纯化结果
由表3可知：本发明所用方法适用于不同种属、不同来源的肿瘤细胞外囊泡，均可获得高质量的DNA。
需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (4)

1.一种肿瘤细胞外囊泡DNA的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将囊泡裂解液与含DNA的生物样本混匀后共孵育，得到裂解溶液；所述含DNA的生物样本为肿瘤细胞外囊泡；
所述孵育的温度为50-70℃，时间为10-20min；
S2、向所述裂解溶液中加入沉淀液混匀，离心得到上清液；
S3、向所述上清液中加入析出液，析出DNA并离心获得沉淀物；
S4、用洗涤液对沉淀物进行洗涤，得到纯化的DNA；
所述囊泡裂解液为质量分数为10-15%的十二烷基硫酸钠溶液，所述沉淀液为在4℃-10℃的条件下冷处理过的醋酸钾溶液，所述DNA的生物样本中囊泡数量、所述囊泡裂解液体积、所述沉淀液体积之间的比例为1×1010-3×1010个：500μL：170μL；所述醋酸钾溶液的浓度为3-3.5 mol/L。
2.根据权利要求1所述的一种肿瘤细胞外囊泡DNA的分离纯化方法，其特征在于，S2与S3中的离心温度为4℃。
3.根据权利要求1所述的一种肿瘤细胞外囊泡DNA的分离纯化方法，其特征在于，所述析出液为在-20℃条件下冷处理过的乙醇，所述析出液与所述囊泡裂解液的体积比为2-3:1。
4.根据权利要求1所述的一种肿瘤细胞外囊泡DNA的分离纯化方法，其特征在于，所述洗涤液为体积分数为70%的乙醇。
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