CN107779451A - 一种人类游离dna提取方法及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人类游离DNA提取方法及其试剂盒，包括磁珠预处理液、细胞裂解液、结合液、漂洗液Ⅰ、漂洗液Ⅱ、核酸洗脱液以及羧基化磁珠，所述结合液包括以下浓度的组分：0.1～0.3mmol/L聚山梨酯80降解物、12～26mmol/L聚乙二醇8000以及1～2mmol/L氯化钠。本发明试剂盒的提取效率，提取纯度和CT值均显著优于现有试剂盒，具有低成本，易操作的优点。

Description

一种人类游离DNA提取方法及其试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人类游离DNA提取方法及其试剂盒。

背景技术

核酸包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两类，是一类带有遗传信息的生物大分子。真核生物的DNA主要以染色体的形式存在于细胞核内，但在人类的外周血中也游离着片段性的游离DNA(Cell-free DNA,cfDNA)，这些游离DNA可以单链或双链DNA的形式存在，大多数游离DNA是以核蛋白形式存在的双链DNA，且片段较小，长度一般在几十或几百个bp之间。

研究发现，游离DNA中含有非常重要的遗传信息。1997年YMD Lo等人在怀有男胎的孕妇外周血中检测到了Y染色体存在，证明了孕妇外周血中存在胎儿游离DNA。目前临床上游离DNA主要运用于父源性DNA检测，如SRY基因型鉴定胎儿性别、检测RhD血型；产前诊断，如21三体等非整倍体疾病检测；以及肿瘤检测等方面。

使用游离的DNA进行检测的第一步就是要对人类血清血浆中的游离DNA进行提取纯化，提取产物的质量直接影响到后续检测结果的准确性和可靠性。而游离DNA的片段小、在血清和血浆中含量低，这无疑给试剂盒提取的得率提出了更高的要求。目前，游离DNA的提取方法主要有酚/仿抽提、吸附柱法和磁珠法。酚/仿抽提法最为经典，但由于操作繁琐而且在提取过程中使用酚和氯仿两种可对操作人员带来伤害的有机溶剂，越来越难以被操作人员接受。吸附柱法是目前主要使用的方法，该方法不需要使用毒性较大的有机溶剂，操作方法较酚/仿抽提操作简单，但很难实验自动化，难以高效率的批量提取样本。

磁珠法是指以超顺磁性氧化硅纳米磁性微球(即磁珠)为载体，通过磁珠在高盐、低PH溶液中吸附核酸，而在低盐溶液中将核酸从磁珠表面脱离的原理进行核酸提取的方法。如中国专利申请CN105112400公开了一种提取游离DNA的试剂盒，其含有磁珠、蛋白酶K、Blinding Buffer，特征是通过一、二次结合，能够提取大于500bp和小于500bp的游离DNA。又如中国专利申请CN105671030A公开了一种基于磁珠法的高效血浆细胞游离DNA提取方法，其特征是在结合液B中加入非极性溶剂，促进核酸分子被纳米磁珠的吸附，提高提取率，同时结合物理强化作用，促使核酸从纳米磁珠上的解吸，增加洗脱效率。

目前公开的基于磁珠提取法的试剂盒均存在一些问题：一是均采用蛋白酶K对样品进行预处理，导致生产成本较高，操作繁琐，对生产或运输、储存条件要求较高；二是，在结合液中使用了较高浓度的异丙醇，而使用异丙醇沉淀容易产生盐类与DNA共沉淀的问题；三是，虽然磁珠在前期与DNA具有较高的结合率，但后期洗脱率较低，导致DNA提取收率难以保证；四是，为了确保核酸的提取纯度，一般在后续漂洗阶段均需要经过多次的漂洗才能完全去除杂质，导致成本的上升。

因此，有必要提供一种成本低廉，核酸提取效率和纯度高，操作简单的游离DNA提取试剂盒。

发明内容

本发明旨在提供一种人类游离DNA提取方法及其试剂盒，与传统试剂盒相比，本发明提供了一种新的裂解液，在样本预处理阶段不加入蛋白酶K，因此可以很好的控制成本；提供了一种新的结合液，一方面不用加入异丙醇，因此无需担心加入异丙醇导致的盐类共沉淀问题，另一方面，意外地，发现新的结合液还能够使后续漂洗次数降至1次，就能够得到较高纯度的核酸，节省了成本；本发明还提供了一种磁珠预处理液，处理磁珠后可以提高后续DNA的洗脱率，提高DNA的得率。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：一种人类游离DNA提取试剂盒，包括磁珠预处理液、细胞裂解液、结合液、漂洗液Ⅰ、漂洗液Ⅱ、核酸洗脱液以及羧基化磁珠，所述结合液包括以下浓度的组分：0.1～0.3mmol/L聚山梨酯80降解物、12～26mmol/L聚乙二醇8000以及1～2mmol/L氯化钠。

进一步地，所述结合液包括以下浓度的组分：0.2mmol/L聚山梨酯80降解物、16mmol/L聚乙二醇8000以及1.5mmol/L氯化钠。

进一步地，所述细胞裂解液为：20～100mmol/L Tris-Hcl、50～200mmol/L NaCl、10～100mmol/L乙二胺四乙酸二钠、1～10mol/L异硫氰酸胍、0.5～3mol/L醋酸钾、0.5％～5wt％曲拉通以及1～10wt％吐温20，PH值为4.0～6.8。

进一步地，所述漂洗液Ⅰ为：20～200mmol/L Tris-Hcl、50～250mmol/L NaCl、10～100mmol/L乙二胺四乙酸二钠、1～10mol/L盐酸胍、0.5～5wt％曲拉通、1～10wt％吐温20以及异丙醇30wt％，PH值为4.0～6.8。

进一步地，所述漂洗液Ⅱ为：70-80％的乙醇。

进一步地，所述核酸洗脱液为：5～30mmol/L Tris-Hcl和0.2～2mmol/LEDTA，pH为6.5～8.0。

进一步地，所述聚山梨酯80降解物由以下步骤制得：往100ml摇瓶内加入聚山梨酯80溶液，接种2～5wt％的浓度为800～1000cfu/mL的绿色木霉，设置温度为30～35℃，转速为120r/min，培养15d，离心，取上清；依次对上清进行微滤、阳离子交换和灭菌，制得聚山梨酯80降解物。

进一步地，所述磁珠预处理液包括非极性氨基酸和低聚果糖。

进一步地，所述非极性氨基酸以200～1000ppm的浓度存在。

进一步地，所述非极性氨基酸选自亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸中的一种或两种以上。

进一步地，所述非极性氨基酸由亮氨酸和缬氨酸按1：(0.01～1)的重量比组成。

相应地，一种利用上述的试剂盒提取人类游离DNA的方法，包括以下步骤：

A)将所述羧基化磁珠通过所述磁珠预处理液进行处理，备用；

B)在离心管中加入血浆/血清，细胞裂解液和结合液，上下颠倒混匀，加入上述经预处理后的羧基化磁珠，涡旋混匀，55～65℃水浴5～10min；

C)待冷却至室温，瞬时离心，将离心管置于磁力架上，进行磁珠分离，移去上清，保留磁珠；

D)往离心管中加入漂洗液Ⅰ，涡旋混匀，瞬时离心，将离心管置于磁力架上，进行磁珠分离，轻轻缓慢转动离心管2-3圈，弃去上清；

E)往离心管中加入漂洗液Ⅱ，涡旋混匀，瞬时离心，将离心管置于磁力架上，进行磁珠分离，轻轻缓慢转动离心管2-3圈，弃去上清；

F)将离心管置于磁力架上，晾干5～10min，加入洗脱液，涡旋混匀，使磁珠分散与溶液中，室温静置3～5min；瞬时离心，将离心管置于磁力架上进行磁珠分离，吸取上清液体，此液体即为提取的血浆/血清游离DNA。

本发明一个关键点在于，在PEG/NaCl的基础上加入聚山梨酯80降解物构成了一种新的结合液。其中，聚山梨酯80降解物是以聚山梨酯80为唯一的碳源，接种绿色木霉培养后取上清经提纯得到。在绿色木霉的作用下，聚山梨酯80能够形成多种降解副产物。而发明人发现，加入这种降解副产物一方面可以使PEG加入量从45mmol/L以上降至30mmol/L以下，另一方面意外地发现，加入这种降解副产物，提高了核酸的提取纯度，且更重要的是，正因为如此，可显著减少后续的漂洗次数，大大节省了操作成本。这一点从本发明试验例一中的表2看出，不含有这种降解副产物的试剂盒，其OD260/OD280值均比加入这种降解副产物试剂盒的OD260/OD280值更远离1.8。

本发明另一个关键点在于，提供了一种磁珠预处理液，经该磁珠处理液处理后，能够提高后续DNA的洗脱率，提高DNA的收率。这一点从本发明试验例一表1中可以看出，含有磁珠预处理液的试剂盒的CT值均比不含有磁珠预处理液的试剂盒靠前。

本发明具有以下优点：

1)本发明试剂盒不含有蛋白酶K，大大地节约了成本；

2)本发明提供了一种新的结合液，其不含有异丙醇，一方面克服了传统的试剂盒存在的异丙醇引起盐类与DNA共沉淀，DNA提取纯度降低的问题；另一方面该新的结合液还能够降低PEG的用量，节省了成本，同时，提高了核酸的提取纯度，显著降低了后续的漂洗次数，大大节省了操作成本，取得了意料不到的技术效果。

3)本发明还提供了一种磁珠处理液，其能够显著促进DNA在磁珠上的解吸，提高了DNA的收率。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。

本发明羧基化磁珠购于无锡中德伯尔生物技术有限公司。

实施例1聚山梨酯80降解物的制备

往100ml摇瓶内加入聚山梨酯80溶液，接种3wt％的浓度为1000cfu/mL的绿色木霉，设置温度为30℃，转速为120r/min，培养15d，离心，取上清；依次对上清进行微滤、阳离子交换和灭菌，制得聚山梨酯80降解物。

实施例2一种人类游离DNA提取试剂盒

实施例2所述试剂盒由以下试剂组成：

①细胞裂解液：35mmol/L Tris-Hcl、100mmol/LNaCl、10mmol/L乙二胺四乙酸二钠、5mol/L异硫氰酸胍、2mol/L醋酸钾、1.5wt％曲拉通以及3wt％吐温20，pH值为5.0；

②磁珠预处理液：500ppm的非极性氨基酸和1000ppm的低聚果糖，其中非极性氨基酸由亮氨酸和缬氨酸按1：0.5的重量比组成。

③漂洗液Ⅰ：100mmol/L Tris-Hcl、50mmol/LNaCl、10mmol/L乙二胺四乙酸二钠、3mol/L盐酸胍、2wt％曲拉通、5wt％吐温20以及异丙醇30wt％，pH值为5.2；

④漂洗液Ⅱ：75％的乙醇；

⑤结合液：0.2mmol/L聚山梨酯80降解物、16mmol/L聚乙二醇8000以及1.5mmol/L氯化钠；

⑥核酸洗脱液：15mmol/LTris-Hcl和1mmol/L EDTA，pH为8.0；

⑦羧基化磁珠。

实施例3一种人类游离DNA提取试剂盒

实施例3与实施例2的区别在于，不包括②磁珠预处理液，其余参数及操作如实施例2所示。

实施例4一种人类游离DNA提取试剂盒

实施例4与实施例2的区别在于，所述磁珠预处理液由1000ppm的非极性氨基酸和1000ppm的低聚果糖组成，其中非极性氨基酸由亮氨酸和苯丙氨酸按1：0.5的重量比组成；结合液为0.1mmol/L聚山梨酯80降解物、12mmol/L聚乙二醇8000以及1mmol/L氯化钠。

实施例5一种人类游离DNA提取试剂盒

实施例5与实施例2的区别在于，所述磁珠预处理液由200ppm的非极性氨基酸和1000ppm的低聚果糖组成，其中非极性氨基酸由苯丙氨酸和缬氨酸按1：0.1的重量比组成；结合液为0.3mmol/L聚山梨酯80降解物、23mmol/L聚乙二醇8000以及2mmol/L氯化钠。

实施例6一种人类游离DNA提取方法

A)将所述羧基化磁珠通过所述磁珠预处理液进行处理，处理时间为5min，备用；

B)在离心管中加入血浆/血清，细胞裂解液和结合液，上下颠倒混匀，加入上述经预处理后的羧基化磁珠，涡旋混匀，65℃水浴5min；

C)待冷却至室温，瞬时离心，将离心管置于磁力架上，进行磁珠分离，移去上清，保留磁珠；

D)往离心管中加入漂洗液Ⅰ，涡旋混匀，瞬时离心，将离心管置于磁力架上，进行磁珠分离，轻轻缓慢转动离心管2-3圈，弃去上清；

E)往离心管中加入漂洗液Ⅱ，涡旋混匀，瞬时离心，将离心管置于磁力架上，进行磁珠分离，轻轻缓慢转动离心管2-3圈，弃去上清；

F)将离心管置于磁力架上，晾干10min，加入洗脱液，涡旋混匀，使磁珠分散与溶液中，室温静置5min；瞬时离心，将离心管置于磁力架上进行磁珠分离，吸取上清液体，此液体即为提取的血浆/血清游离DNA。

对比例1一种人类游离DNA提取试剂盒

对比例1与实施例2的区别在于，结合液为50mmol/L聚乙二醇8000以及1.5mmol/L氯化钠，其余参数及操作如实施例2所示。

对比例2、一种人类游离DNA提取试剂盒

对比例2与实施例2的区别在于，结合液为0.2mmol/L聚山梨酯80、50mmol/L聚乙二醇8000以及1.5mmol/L氯化钠，其余参数及操作如实施例2所示。

对比例3一种人类游离DNA提取试剂盒

对比例3与实施例2的区别在于，所述磁珠预处理液为1000ppm的低聚果糖。

对比例4一种人类游离DNA提取试剂盒

对比例4与实施例2的区别在于，所述磁珠预处理液为1500ppm的非极性氨基酸，其中非极性氨基酸由亮氨酸和缬氨酸按1：0.5的重量比组成。

试验例一、不同试剂盒提取血浆结果比较

取8个成人外周血浆样本(样本1～8)，各取200μl，使用本发明实施例2～5以及对比例1～4所述试剂盒按照实施例6提取方法进行提取，对提取得到的核酸采用下列方式进行检测：

1.1使用安捷伦2100生物分析仪检测浓度，检测提取效率，结果如下表1所示。

表1 8个样本的核酸浓度提取结果比较

2.nanodrop 2000检测OD260/OD280反应提取纯度，检测结果如表2所示。

表2核酸提取纯度比较

注：纯DNA：OD260/OD280≈1.8；酚类、蛋白质污染：OD260/OD280＜1.6。

3使用GAPDH体系，通过实时荧光PCR检测扩增效率

3.1引物探针信息

3.2检测体系：

3.3上机程序：ABI(Step One Plus)95℃5min；95℃10s、60℃10s、72℃20s(收集荧光)、40Cycle；95℃15s；65℃1min(收集荧光)。

3.4检测结果如表3所示。

表3检测结果

4.结果分析：

4.1核酸浓度提取结果：

由表1可以看出，实施例2所述试剂盒提取的核酸浓度最高，为本发明最佳实施例，实施例4和5次之。而实施例3试剂盒(与实施例2的区别仅在于不含有磁珠处理液)提取的核酸浓度最低，这说明，本发明提供的磁珠预处理液能够显著提高核酸的洗脱率；

令人意外地是，对比例3和对比例4与实施例2相比仅在于磁珠预处理液的成分不同，其提取的核酸浓度与实施例2相比也有较大幅度的下降，这说明，本发明磁珠预处理液的成分变化均会导致不可预期的效果。

对比例1所述试剂盒(与实施例2相比，结合液不含有聚山梨酯80降解物)和，对比例2试剂盒(用聚山梨酯80替换聚山梨酯80降解物)提取核酸的浓度与实施例2相比也有小幅度的下降。

4.2 OD260/280检测结果：

从表2可以看出，利用本发明实施例2、4和5所述试剂盒对8个样本进行OD260/280检测，比值均接近1.8，说明得到核酸纯度高，其中，以实施例2效果最佳。

值得说明的是，对比例1所述试剂盒(与实施例2相比，不含有聚山梨酯80降解物)提取得到的核酸经OD260/280检测，发现比值均＜1.60，证明对比例1试剂盒提取得到的核酸存在酚类或蛋白质污染。这说明，聚山梨酯80降解物的存在有利于提高核酸的提取纯度。而需要注意的是，对比例2(与实施例2相比，用聚山梨酯80替代聚山梨酯80降解物)所述试剂盒提取得到的核酸经OD260/280检测，比值均在1.60上下浮动，这说明，其提取得到的核酸纯度较实施例2有明显下降。

实施例3、对比例3和对比例4试剂盒的OD260/280值较实施例1远离1.8，但未＜1.6，说明，其提取得到的核酸纯度较实施例2有所下降。

4.3扩增效率：从表3中可以看出，实施例2、4和5试剂盒CT值均比其余各组靠前，说明其检测效率均好于其余各组试剂盒，其中，以实施例2试剂盒的CT值最靠前，检测效率最好，为本发明最佳实施例2。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种人类游离DNA提取试剂盒，其特征在于，包括磁珠预处理液、细胞裂解液、结合液、漂洗液Ⅰ、漂洗液Ⅱ、核酸洗脱液以及羧基化磁珠，所述结合液包括以下浓度的组分：0.1～0.3mmol/L聚山梨酯80降解物、12～26mmol/L聚乙二醇8000以及1～2mmol/L氯化钠。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述细胞裂解液为：20～100mmol/L Tris-Hcl、50～200mmol/L NaCl、10～100mmol/L乙二胺四乙酸二钠、1～10mol/L异硫氰酸胍、0.5～3mol/L醋酸钾、0.5％～5wt％曲拉通以及1～10wt％吐温20，PH值为4.0～6.8。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述漂洗液Ⅰ为：20～200mmol/L Tris-Hcl、50～250mmol/L NaCl、10～100mmol/L乙二胺四乙酸二钠、1～10mol/L盐酸胍、0.5～5wt％曲拉通、1～10wt％吐温20以及异丙醇30wt％，PH值为4.0～6.8。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述漂洗液Ⅱ为：70-80％的乙醇。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸洗脱液为：5～30mmol/L Tris-Hcl和0.2～2mmol/L EDTA，pH为6.5～8.0。

6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述聚山梨酸酯80降解物由以下步骤制得：

往100ml摇瓶内加入聚山梨酯80溶液，接种2～5wt％浓度为800～1000cfu/mL的绿色木霉，设置温度为30～35℃，转速为120r/min，培养15d，离心，取上清；依次对上清进行微滤、阳离子交换和灭菌，制得聚山梨酯80降解物。

7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述磁珠预处理液包括非极性氨基酸和低聚果糖，其中所述非极性氨基酸以200～1000ppm的浓度存在。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述非极性氨基酸选自亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸中的一种或两种以上。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述非极性氨基酸由亮氨酸和缬氨酸按1：(0.01～1)的重量比组成。

10.一种利用如上述权利要求书1～9任一所述的试剂盒提取人类游离DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A)将所述羧基化磁珠通过所述磁珠预处理液进行处理，备用；

B)在离心管中加入血浆/血清，细胞裂解液和结合液，上下颠倒混匀，加入上述经预处理后的羧基化磁珠，涡旋混匀，55～65℃水浴5～10min；

C)待冷却至室温，瞬时离心，将离心管置于磁力架上，进行磁珠分离，移去上清，保留磁珠；

D)往离心管中加入漂洗液Ⅰ，涡旋混匀，瞬时离心，将离心管置于磁力架上，进行磁珠分离，轻轻缓慢转动离心管2-3圈，弃去上清；

E)往离心管中加入漂洗液Ⅱ，涡旋混匀，瞬时离心，将离心管置于磁力架上，进行磁珠分离，轻轻缓慢转动离心管2-3圈，弃去上清；

F)将离心管置于磁力架上，晾干5～10min，加入洗脱液，涡旋混匀，使磁珠分散与溶液中，室温静置3～5min；瞬时离心，将离心管置于磁力架上进行磁珠分离，吸取上清液体，此液体即为提取的血浆/血清游离DNA。