CN106030304A

CN106030304A - 用于分离外来体的方法和组合物

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Publication number: CN106030304A
Application number: CN201580010649.4A
Authority: CN
Inventors: A·J·施洛特; P·E·特洛佩; S·P·M·富希
Original assignee: Peregrine Pharmaceuticals Inc; University of Texas System
Current assignee: University of Texas System; Avid Bioservices Inc
Priority date: 2014-02-27
Filing date: 2015-02-27
Publication date: 2016-10-12
Anticipated expiration: 2035-02-27
Also published as: CA2940823A1; CN106030304B; HK1224376A1; NZ723336A; AU2015222755B2; US9835626B2; CA2940823C; US20150241431A1; KR101738117B1; IL247413A; JP2017509332A; EP3111212A1; EP3111212B1; AU2015222755A1; SG11201606702SA; KR20160115988A; JP6156962B2; WO2015131153A1

Abstract

本发明公开了用于分离细胞外微泡，例如外来体，特别是疾病‑相关的和磷脂酰丝氨酸(PS)‑阳性的细胞外微泡，例如肿瘤‑和病毒‑衍生的外来体)的惊人的新方法和组合物。本发明的方法是快速、高效、成本有效的，并且重要地，本发明的方法适用于大量的生物流体，并产生抗原性完整的细胞外微泡和外来体。所述的方法和组合物是基于在不破坏细胞外微泡的形态学特征或功能特征或者抗原性的条件下，醋酸盐缓冲剂从溶液中分离大量的细胞外微泡的惊人用途。

Description

用于分离外来体的方法和组合物

背景技术

1.相关申请的交叉引用

本申请要求2014年2月27日提交的共同待审的第一美国临时申请系列No.61/945,718和2014年3月26日提交的共同待审的第二美国临时申请系列No.61/970,529的优先权，这些申请的全部公开内容(包括说明书、权利要求书和附图)在不具有免责声明的情况下以引用方式并入本文。

2.技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是细胞外微泡，例如外来体。本发明提供了用于分离疾病相关的和磷脂酰丝氨酸(PS)-阳性的细胞外微泡，例如肿瘤-和病毒-衍生的外来体，特别是肿瘤-衍生的外来体的惊人的新方法和组合物，该新方法和组合物特别适用于与大量的生物流体一起使用，并产生抗原性完整的细胞外微泡和外来体。

3.相关领域的描述

细胞外微泡是由细胞释放或分泌的一类膜结合成分，包括外来体(exosome)、核外颗粒体(ectosome)、微颗粒或微泡、以及凋亡小体或小泡(et al.,2011；Simpson&Mathivanan,2012)。在这类细胞外微泡中，近年来外来体获得了特别的关注。

外来体通常描述为40-50至100纳米大小的膜衍生的囊泡，并且已知其是由细胞在体内和体外主动分泌的。它们通过内体膜的向内出芽和分裂而由次级内体生成，从而产生包含腔内囊泡的多泡体(MVB)。这些外来体在MVB与细胞内质膜融合时与细胞外空间有关。由于它们来源于细胞的细胞质膜，并由内体膜的内陷而形成，所以分泌的外来体具有细胞质膜和囊封细胞溶质衍生的水性空间的内体蛋白质。

细胞外微泡(例如外来体)例如通过起分子信使(其传递不同细胞类型之间的信息)的作用而发挥广泛的重要的生理机能。例如外来体递送蛋白质、脂质和可溶性因子，包括RNA和microRNA(Theryet al.,2009)，它们根据来源而参与可以影响凋亡(Andreola et al.,2002；Huber et al.,2005；Kim et al.,2005)，转移(Parolini et al.,2009)，血管生成(Kim et al.,2005；Iero et al.,2008)，肿瘤进展(Keller et al.,2009；Thery et al.,2002)，血栓症(Aharon&Brenner,2009；AlNedawi et al.,2005)，以及免疫力(通过使T细胞定向于免疫活化)(Andre et al.,2004；Chaput et al.,2005)或免疫抑制(Szajnik et al.,2010；Valenti et al.,2007；Wieckowski et al.,2009)的信号传导途径。

已经描述用于从不同来源(包括得自癌症患者的癌性积水和外周血，以及得自体外培养的细胞系和肿瘤细胞的上清液)分离和纯化细胞外微泡和外来体群体的多种技术。这些方法包括差式离心，包括超速离心步骤(Thery et al.,2006)；亲和层析(Taylor&Gercel-Taylor,2008)；聚合物介导的沉淀(Taylor et al.,2011)，特别是使用不同分子量的聚乙二醇(PEG)，包括得自Life Technologies Corporation的Total Exosome Isolation Reagents(美国专利号8,901,284)和ExoQuick^TM(US 2013/0337440A1)；以及在定义的孔径膜上的捕获(Grant et al.,2011)，例如ExoMir^TM，其通常使用系列连接的不同孔径的2种过滤器(US 2013/0052647 A1)。

但是，可利用的技术在2个重要的方面中受到缺点的限制。首先，通常在用于细胞外微泡和外来体制备时，所述的技术是耗时的、繁琐的和/或昂贵的，并且可以被加工的材料的量是有限的。具体而言，目前用于分离细胞外微泡和外来体的技术均需要体积显著减少，从而获得用于研究或使用的足够的浓度。在继续外来体分离之前，使用超速离心来浓缩生物介质的典型方法是极其耗时的，并且需要特定的试验室设备。

其次，由于目前的技术应用于肿瘤衍生的细胞外微泡和外来体，所以它们是特别有限的。例如已经提出从癌症患者的循环体外除去外来体，其中患者的血液被泵送通过凝集素亲和柱，然后返回至患者(美国专利号8,288,172)。还报道可以使用顺磁珠纯化肿瘤衍生的外来体，其中所述的顺磁珠是使用针对肿瘤特异性蛋白质例如HER2/neu(Koga et al.,2005)的抗体涂敷。还可以使用利用磁珠以捕获特定外来体的试剂盒，例如Exo-Flow^TM试剂盒。除了上文所述的一般缺点以外，此类方法和试剂盒是极其有限的，需要在抗体结合中利用的特定的外来体表面标志物以及所述的方案中许多详细的技术步骤的有利知识，例如生物素化的捕获抗体的制备和利用。

因此，本领域仍需要分离细胞外微泡，例如外来体，特别是疾病相关的和肿瘤衍生的外来体的新的且改进的方法。对分离形态学和抗原性完整的细胞外微泡和外来体的、简单且成本有效的新方法的鉴定是重要的进展。真正需要的是以下方法：经过装配从而处理大量的生物材料，而无需专门的试验室设备，并且无需早期的超速离心步骤，并且真正需要的是可以用于优选地分离疾病相关的且肿瘤衍生的外来体的方法。

发明概述

本发明通过提供用于分离细胞外微泡，例如外来体，特别是疾病相关的和磷脂酰丝氨酸(PS)-阳性的外来体，包括肿瘤衍生的外来体的新方法和组合物来解决现有技术的上述的和其他的需要，其中所述的方法是快速、高效、成本有效的，且适用于大量的生物流体。这些方法是基于醋酸盐缓冲剂从溶液中分离细胞外微泡例如外来体的意外用途。本发明提供了分离大量细胞外微泡和外来体，特别是抗原性完整的、疾病相关的和PS-阳性的外来体，例如肿瘤衍生的外来体的能力，其中所述的外来体不能与通过目前的超速离心方法制备的那些外来体区分开，超速离心方法是耗时的、繁琐的并且是体积有限的。

本发明的方法特别适用于分离或纯化通常与非脂质的膜成分(例如膜蛋白质)结合的疾病-相关的、病毒-和肿瘤-衍生的外来体，其在表面上表达了负电荷的磷脂磷脂酰丝氨酸(PS)。醋酸盐缓冲剂意外地中和了细胞外微泡和外来体的表面电荷，由此除去了溶液中的这种表面电荷，而未破坏所得的细胞外微泡和外来体的形态学特征或功能特征，并且特别地，同时保持了它们的原始抗原图谱，这样它们是“抗原性完整的”。这种疾病-相关的外来体包括得自被病毒或细胞内寄生虫或病原体感染的细胞的那些，它们使得宿主细胞外化PS，并且是优选的肿瘤-衍生的外来体，它们在表面上通常包含大量的PS。

本发明广泛适用的实施方案是从生物流体中分离疾病-相关的细胞外微泡的方法，其中疾病-相关的细胞外微泡在其表面上具有带负电荷的磷脂酰丝氨酸；该方法包括将生物流体样品与以有效地使疾病-相关的细胞外微泡从生物流体中沉淀出来的pH和浓度的醋酸盐缓冲剂接触，以及从沉淀物中收集疾病-相关的细胞外微泡，从而分离疾病-相关的细胞外微泡。

此类方法包括从病毒感染的细胞分离细胞外微泡的那些，包括将包含病毒-衍生的细胞外微泡的生物流体与以有效地使病毒-衍生的细胞外微泡从生物流体中沉淀出来的pH和浓度的醋酸盐缓冲剂接触；以及从沉淀物中收集病毒-衍生的细胞外微泡，从而分离病毒-衍生的细胞外微泡。病毒方法优选地分离基本上不具有感染性病毒的细胞外病毒-衍生的微泡。

本发明的方法进一步包括从生物流体中分离肿瘤-衍生的细胞外微泡的那些，包括将生物流体的样品与以有效地使肿瘤-衍生的细胞外微泡从生物流体中沉淀出来的pH和浓度的醋酸盐缓冲剂接触；以及从沉淀物中收集肿瘤-衍生的细胞外微泡，从而分离肿瘤-衍生的细胞外微泡。

病毒-相关的细胞外微泡的其他实例为衍生自被细胞内寄生虫或病原体感染的细胞的那些。

在上述方法中，病毒-相关的、病毒-衍生的以及肿瘤-衍生的细胞外微泡优选为病毒-相关的、病毒-衍生的和肿瘤-衍生的外来体。优选地，分离疾病-相关的、病毒-衍生的以及肿瘤-衍生的细胞外微泡和外来体，而不会实质上破坏它们的形态学特征或功能特征或者细胞表面抗原。人类细胞外微泡(例如人类肿瘤外来体)可以通过本发明分离。

通过将本发明应用于所有疾病-相关的细胞外微泡，例如疾病-相关的外来体，磷脂酰丝氨酸优选地存在于细胞外微泡的表面上，更优选地与非脂质的膜成分相连(association)，其中非脂质的膜成分包括膜蛋白质。就此而言，据信醋酸盐缓冲剂能够中和疾病-相关的细胞外微泡上的磷脂酰丝氨酸的表面电荷，由此使疾病-相关的细胞外微泡从生物流体中沉淀出来。

因此，本发明特别提供了使用生物流体的方法，其中所述的生物流体包含包括疾病-相关的和正常的细胞外微泡的细胞外微泡的混合群体，其中所述的方法从混合群体中选择性地沉淀疾病-相关的细胞外微泡(与正常的细胞外微泡相反)。该实施方案为使用生物流体的方法，其中所述的生物流体包含包括肿瘤-衍生的和正常的外来体的外来体的混合群体，其中所述的方法从混合群体中选择性地沉淀肿瘤-衍生的外来体(与正常的外来体相反)。

此类方法可以包括：

(a)获得生物流体，该生物流体包含包括肿瘤-衍生的外来体和非-肿瘤外来体的外来体的混合群体；

(b)将生物流体与以有效地使肿瘤-衍生的外来体而不是非肿瘤的外来体从生物流体中沉淀出来的pH和浓度的醋酸盐缓冲剂接触；

(c)从步骤(b)收集沉淀物，其中所述的沉淀物选择性地包含肿瘤-衍生的外来体；以及

(d)在大约中性的pH下，使沉淀物再次悬浮于基本上不含醋酸盐的缓冲剂中，从而提供实质上不具有非肿瘤外来体的肿瘤-衍生的外来体的纯化群体。

更详细而言，这些实施方案可以包括：

(b)对生物流体实施第一低速离心，从而提供实质上不具有细胞、细胞碎片和大的膜囊泡的澄清的流体；

(c)在有效地提供浑浊悬液的pH和浓度下、以及在有效地提供浑浊悬液的时间内，将澄清的流体与醋酸盐缓冲剂温育，其中所述的浑浊悬液包含选择性沉淀的肿瘤-衍生的外来体，但是基本上不包含沉淀的非-肿瘤的外来体；

(d)对浑浊悬液进行低速离心，从而提供沉淀物和上清液，其中所述的沉淀物选择性地包含肿瘤-衍生的外来体；

(e)收集包含肿瘤-衍生的外来体的沉淀物；

(f)在大约中性pH下，将沉淀物再次悬浮于基本上不含醋酸盐的缓冲剂中，由此提供纯化的外来体群体，该群体包含肿瘤-衍生的外来体，并且实质上不具有非-肿瘤的外来体；以及可任选地

(g)对纯化的外来体群体进行进一步的离心，从而提供包含非-外来体的成分的压粒，并除去压粒，由此提供肿瘤-衍生的外来体的基本纯的组合物，其中所述的组合物基本上不具有非-肿瘤的外来体和非-外来体成分。

由于本发明有效地从包含细胞外微泡的混合群体的生物流体分离疾病-相关的细胞外微泡，所以本发明进一步提供了在存在包含正常细胞外微泡的血清中培养的生病的或肿瘤细胞的上清液中获得疾病-相关的、优选为肿瘤-衍生的细胞外微泡的方法，优选地其中所述的疾病-相关的或肿瘤-衍生的细胞外微泡在其表面上具有负电荷磷脂酰丝氨酸。这些方法包括将上清液与以有效地选择性地从上清液中沉淀疾病-相关的、优选为肿瘤-衍生的细胞外微泡的pH和浓度的醋酸盐缓冲剂接触；以及收集沉淀物，由此从上清液中获得疾病-相关的、优选为肿瘤-相关的细胞外微泡，而基本上不被血清中的正常的细胞外微泡污染。特定的实例为其中小鼠或人类肿瘤细胞在牛血清或胎牛血清存在下培养。

另一个分离实施方案为制备基本上不具有疾病-相关的、优选为肿瘤-衍生的细胞外微泡的血清的方法，其中所述的疾病-相关的或肿瘤-衍生的细胞外微泡在其表面上具有带负电荷的磷脂酰丝氨酸(“耗尽血清(depleted serum)”)；所述的方法包括：

(a)获得疑似包含疾病-相关的、优选为肿瘤-衍生的细胞外微泡的血清；

(b)将血清与以有效地从血清中沉淀疾病-相关的、优选为肿瘤-衍生的细胞外微泡的pH和浓度的醋酸盐缓冲剂接触；以及

(c)从血清中除去在步骤(b)中形成的沉淀物，其中所述的沉淀物包含疾病-相关的、优选为肿瘤-衍生的细胞外微泡，由此提供基本上不具有疾病-相关的、优选为肿瘤-衍生的细胞外微泡的血清。

这些方法适用于病毒感染的细胞，并且包括制备血液、血清或血浆的方法(例如可以在输血前实施)，其中所述的血液、血清或血浆基本上不具有感染性病毒以及从病毒感染的细胞衍生的细胞外微泡，所述的方法包括：

(a)获得疑似包含感染性病毒和从病毒感染的细胞衍生的细胞外微泡的血液、血清或血浆；

(b)将血液、血清或血浆与以从血液、血清或血浆中有效地灭活或沉淀感染性病毒、以及沉淀细胞外微泡的pH和浓度的醋酸盐缓冲剂接触；以及

(c)血液、血清或血浆中除去在步骤(b)中形成的沉淀物，其中所述的沉淀物包含灭活的或沉淀的病毒，以及沉淀的细胞外微泡，由此提供基本上不具有感染性病毒以及从病毒感染的细胞衍生的细胞外微泡的血液、血清或血浆。

在其他的实施方案中，本发明提供了在澄清的生物流体中检测疾病-相关的、优选为肿瘤-衍生的细胞外微泡的方法，其中所述的疾病-相关的或肿瘤细胞外微泡在其表面上具有带负电荷的磷脂酰丝氨酸。这些方法包括将澄清的生物流体与以有效地从澄清的生物流体选择性地沉淀疾病-相关的、优选为肿瘤-衍生的细胞外微泡的pH和浓度的醋酸盐缓冲剂接触；以及在所得的生物流体中测定存在的浑浊度，其可以目测检测；其中在所得的生物流体中存在的浑浊度表明检测到疾病-相关的、优选为肿瘤-衍生的细胞外微泡。

在其他的实施方案中，本发明提供了诊断至少患有第一疾病(例如癌症)的动物或患者的方法，其中所述的疾病可以表征为存在疾病-相关的细胞外微泡，该细胞外微泡在其表面上具有带负电荷的磷脂酰丝氨酸。这些方法包括检测从患者得到的生物流体中存在的疾病-相关的、优选为肿瘤-衍生的细胞外微泡，由此诊断所述的患者患有第一疾病，例如癌症。优选地，疾病-相关的或肿瘤-衍生的细胞外微泡是通过以下方法检测的，其中所述的方法包括：

(a)将生物流体与以从生物流体中有效地选择性地沉淀疾病-相关的、优选为肿瘤-衍生的细胞外微泡的pH和浓度的醋酸盐缓冲剂接触；以及

(b)测定所得的生物流体中沉淀物的存在；其中在所得的生物流体中沉淀物的存在表明检测到疾病-相关的、优选为肿瘤-衍生的细胞外微泡；以及

(c)可任选地，其中将第一此类疾病与第二此类疾病识别开或区别开，例如其中癌症将与病毒感染识别开或区别开，第一疾病的存在是通过检验第一疾病的其他的和/或独立的生物标志物或临床迹象(例如癌症的其他的和/或独立的生物标志物或临床迹象)来证实的。

本发明的其他方法为监测患有第一疾病的患者的疾病负担(例如监测癌症患者的肿瘤-负担)的方法，其中所述的第一疾病是通过疾病-相关的细胞外微泡的量来表征的，其中所述的疾病-相关的细胞外微泡在其表面上具有带负电荷的磷脂酰丝氨酸。这些方法包括测量从患者得到的生物流体中的疾病-相关的、优选为肿瘤-衍生的细胞外微泡的量，其中所述的疾病-相关的、优选为肿瘤-衍生的细胞外微泡的量是通过以下方法测量的，其中所述的方法包括：

(b)测量沉淀物中疾病-相关的、优选为肿瘤-衍生的细胞外微泡的量。

例如监测癌症患者的肿瘤-负担的方法包括：

(a)在多个时间点，从患者获得一系列生物流体样品；

(b)通过以下方法，测量一系列生物流体中的肿瘤-衍生的细胞外微泡的量，其中所述的方法包括：

(i)将一系列生物流体样品与以有效地从一系列生物流体样品中沉淀肿瘤-衍生的细胞外微泡的pH和浓度的醋酸盐缓冲剂接触；以及

(ii)测量沉淀物中的肿瘤-衍生的细胞外微泡的量。

其中肿瘤-衍生的细胞外微泡的量的增加表明增加的肿瘤-负担，并且肿瘤-衍生的细胞外微泡的量的减少表明降低的肿瘤-负担。

在其他的实施方案中，本发明提供了通过从生物流体中沉淀疾病相关的、优选为肿瘤-衍生的细胞外微泡(其表面上具有带负电荷的磷脂酰丝氨酸)而有效地用于诊断的醋酸盐缓冲剂、醋酸盐缓冲剂的组合物、以及pH和浓度。本发明还提供了通过从生物流体中沉淀疾病-相关的、优选为肿瘤-衍生的细胞外微泡(其表面上具有带负电荷的磷脂酰丝氨酸)而有效地用于治疗的醋酸盐缓冲剂、醋酸盐缓冲剂的组合物、以及pH和浓度。

本发明的其他实施方案为用于从生物流体中分离疾病-相关的、优选为肿瘤-衍生的细胞外微泡的试剂盒，其中所述的疾病-相关的细胞外微泡在其表面上具有带负电荷的磷脂酰丝氨酸。此类试剂盒包含以有效地从生物流体中沉淀疾病-相关的、优选为肿瘤-衍生的细胞外微泡的pH和浓度的醋酸盐缓冲剂；以及优选地进一步包含使用说明书。此类试剂盒还可以进一步包含用于鉴定或定量疾病-相关的细胞外微泡(优选为外来体)中的一种或多种生物标志物的；和/或用于鉴定或定量一种或多种其他的和/或独立的用于鉴定特定疾病或区分疾病的生物标志物的至少第一试剂。

在本发明的所有的方法、组合物和试剂盒中，醋酸盐缓冲剂均为有效地从生物流体中选择性地沉淀疾病-相关的、优选为肿瘤-衍生的细胞外微泡(例如外来体)的pH和浓度。这些包括pH为大约4.25至大约5.25；更优选为pH为大约4.5至大约5.0；并且最优选为pH为大约4.75的醋酸盐缓冲剂；并且生物流体样品中的醋酸盐缓冲剂的最终浓度为大约0.05M至大约0.25M；更优选为大约0.05M至大约0.1M。

包含醋酸钠和醋酸钾两者以及它们的混合物的醋酸盐缓冲剂是有效的。在某些实施方案中，醋酸盐缓冲剂实质上不具有除了聚合物(例如聚乙二醇)以外的体积(volume)。示例性的优选的实施方案为pH为大约4.75并且样品中的最终浓度为大约0.1M的醋酸盐缓冲剂。

附图简述

以下附图形成了本说明书的一部分，并且包含这些附图以便进一步说明本发明的某些方面。通过参照这些附图的一幅或多幅，并结合本文提供的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。美国专利或申请文件至少包含用彩色完成的一个附图。在索取并支付必需的费用时，具有彩色附图(多幅)的这种美国专利或专利申请公开的拷贝从官方提供。

图1A、图1B和图1C.与肿瘤外来体的分离有关的盐和pH。图1A和图1B，如所示，将初清的K1735上清液的4.5mL等分液与1/10体积(0.5mL)的10X浓缩缓冲剂溶液混合(●，0.5M；○，0.367M；■，0.233M；□，0.1M；+，0.05M)。将悬液在冰上温育60min，并在5000g离心10min。然后将压粒溶解，并返回至它们的初始体积，并通过Bradford测定法来评估蛋白质。图1C，将从CELLine烧瓶(左侧)的上方容器收集的K1735上清液(右侧)或对照培养基与1/10体积1.0M醋酸盐pH 4.75混合，并在冰上温育5min后进行拍照。

图2A和图2B.与肿瘤外来体分离有关的温度。图2A，将0.1mL的1M醋酸Na与0.9mL初清的K1735上清液快速混合，并在所示的温度下温育(■，0℃；○，20℃；●，37℃)，同时监测浑浊度。箭头示出在0℃和37℃下温育的样品分别转移至37℃和0℃的时间。图2B，如图2A所示来制备醋酸盐/外来体的混合物。将等分液稀释2倍，用于OD测量，并将剩余的悬液在5000g离心10min。通过Bradford测定法来定量沉淀的蛋白质。

图3A和图3B.从细胞上清液和消耗培养基得到的肿瘤外来体的差示分离。从CELLine烧瓶下方(●，细胞)和上方(○，培养基)容器得到的等分液进行初清处理，并在所示的pH下与1/10体积的1.0M醋酸盐混合。在冰上温育1hr后，在600nm下评估浑浊度(图3A)，以及再溶解的离心的(5000g；10min)压粒中的蛋白质(图3B)。

图4A和图4B.醋酸盐导致肿瘤外来体沉淀。图4A，沉淀是由于醋酸盐，而不是pH。在4℃下，将澄清的组织培养物上清液与1/10体积的1.0M所示的缓冲剂溶液(甘氨酸HCl，柠檬酸盐，醋酸盐和对照)混合1hr。然后将悬液在5000g离心15min。收集上清液，在100000g离心1hr，并通过Bradford测定法来测定压粒中蛋白质的浓度。图4B，沉淀是由于醋酸盐，而不是抗衡离子。将从4T1乳腺癌细胞得到的组织培养物上清液(底部，管2和4)或培养基(顶部，管1和3)单独与1/10体积的10X醋酸钠(管1和2)或10X醋酸钾(管3和4)在大约pH 4.75混合，并放置30min。

图5A和图5B.使用醋酸盐对比100000g超速离心分离的肿瘤外来体的比较产率。在与醋酸盐温育60min后，将50mL初清的细胞上清液在100000g离心1hr，或者在5000g离心10min。将压粒再次悬浮于HBS中。示出使用alix抗体(图5A；同种型对照，黑色(左侧)线；100000g，红色(中间)线；醋酸盐，蓝色(右侧)线)和膜联蛋白5(图5B；无Ca²⁺，黑色(最左侧)线；100000g，红色线；醋酸盐，蓝色线)染色的外来体的流式分析(红色线的曲线延伸至蓝色线的曲线的左侧和右侧)。

图6.肿瘤外来体的表征。通过透射电子显微镜观察通过100000g超速离心或使用醋酸盐纯化的、负染色的黑素瘤-衍生的外来体。

图7A、图7B和图7C.在正常的和肿瘤外来体中PS的膜分布。图7A，将从正常的间皮细胞衍生的以及从卵巢癌细胞(这些细胞得自同一患者)衍生的外来体与FITC-膜联蛋白V乳胶珠缀合，并进行FACS分析。红色线(左侧)，正常的间皮细胞-衍生的外来体；蓝色线(右侧)，卵巢癌-衍生的外来体。图7B，与作为阴性对照的BSA(红色线，左侧)相比，从4T1乳腺癌细胞衍生的外来体为PS-阳性的(蓝色线，右侧)。图7C，与作为阴性对照的BSA(红色线，左侧)相比，从B16黑素瘤细胞衍生的外来体是PS-阳性的(蓝色线，右侧)。

图8.醋酸盐缓冲剂不能沉淀纯的磷脂脂质体。将从卵磷脂(PC)或PC/PS混合物(2比1的比例)制备的荧光标记的脂质体的制备物在5000g离心5min，从而除去任何大的可沉淀的脂质体。除去上清液，并将从各制备物得到的0.4mL等分成2个管。将0.5mL PBS加入至各管中，然后分别加入0.1mL的PBS或醋酸盐缓冲剂(1.0M，pH 5.7)。将管混合，在冰上温育1hr，涡流处理，并除去0.1mL等分液，从而测定总的荧光。然后，将各管在5000g离心5min，并取从上清液得到的0.1mL等分液，从而测定残余的(未沉淀的)荧光。

图9A和图9B.从外来体的混合物得到的PS-阳性外来体的选择性分离。图9A，起始材料的表征。左侧面板，阳性和阴性对照：与醛-活化的乳胶珠(黑色线(右侧))和BSA-封闭的乳胶珠(红色线(左侧))共价缀合的膜联蛋白5。右侧面板，在1mM的Ca²⁺存在下，与醛-活化的乳胶珠缀合的并使用FITC-膜联蛋白5标记的外来体：从4T1乳腺癌细胞得到的PS-阳性外来体(黑色线(右侧))和从对应细胞得到的PS-阴性外来体(红色线(左侧))。图9B，外来体群体和混合物的FACS分析。将红色荧光(N-Rho-PE)标记的、PS-阴性外来体和绿色荧光(N-NBD-PE)标记的、PS-阳性外来体与醛-活化的乳胶珠缀合，并通过FACS分析。顶部一行，未经过醋酸盐沉淀的外来体(对照)；底部一行，溶解的醋酸盐-沉淀的外来体(醋酸盐)。左侧柱，PS-阴性外来体群体(Rho PS-ve)；中间柱，PS-阳性外来体群体(NBDPS+ve)；右侧柱，等量的PS-阳性和PS-阴性外来体的混合物(RhoPS-ve NBD PS+ve)。

图10A、图10B和图10C.得自病毒感染的细胞和病毒培养物的细胞外微泡(例如外来体)的分离。猴肾细胞的分开的群体被模拟感染(阴性对照，图10A)，或者被SV40(图10B)或HSV-1(图10C)病毒感染。收获模拟、SV40或HSV-1感染物，并通过与1/10体积的1.0M醋酸钠pH 4.75混合而对感染物进行醋酸盐沉淀。描绘醋酸盐沉淀后的离心管，具有从SV40(图10B)和HSV-1(图10C)感染物得到的澄清可见的压粒，这与模拟感染相反(图10A)。

图11A、图11B和图11C.图11A、图11B和图11C.从病毒感染的细胞分离得到的细胞外微泡和外来体的FACS分析。猴肾细胞的分开的群体被模拟感染(Vero，阴性对照)，或者被SV40(SV40)或HSV-1病毒感染，收获这些细胞群体，使其经过醋酸盐沉淀，并将任何压粒再次悬浮。将从HSV-1感染物得到的再次悬浮的压粒经过梯度分离，产生2个级份(HSV F5和HSV F15)。使从模拟(Vero)、SV40以及HSV F5和HSV F15材料得到的样品与乳胶珠结合，并通过FACS分析，从而检测对SV40或HSV-1具有特异性的病毒抗原(图11A)；CD63，外来体的标志物(图11B)；以及PS，其通过膜联蛋白V检测。与模拟感染(Vero)相比，来呈现结果。

本发明实施方案的详细描述

近十年来可见，与细胞外微泡(例如外来体)有关的大量研究和出版物呈指数增多。这些研究的范围从细胞外微泡的分离方法直至某些细胞外微泡(特别是外来体)在癌症诊断中的用途和它们介导免疫应答的能力。细胞外微泡的释放在原核生物和真核生物中发生，并且在广泛的生理学和病理学过程中是重要的。

A.细胞外微泡

细胞外微泡为细胞-衍生的且细胞-分泌的微泡，其作为一类，包括外来体、外来体-样囊泡、核外颗粒体(其得自囊泡的出芽，囊泡直接得自质膜)、微颗粒、微泡、脱落微泡(SMV)、纳米颗粒以及甚至(大的)凋亡小泡或凋亡小体(得自细胞死亡)、或者膜颗粒，因为这些术语在本领域中交换使用(et al.,2011；Simpson&Mathivanan,2012)。

如本文所用，“细胞外微泡”包括用于过去命名的术语所指的细胞外微泡，包括基于样品来源的术语，细胞外微泡衍生自所述的样品来源。当特定用于肿瘤-衍生的外来体时，使用术语肿瘤细胞源(tex)和癌小体，并且这些术语包含在本文中，而且还包含反映癌细胞的特定类型的术语，例如前列腺癌细胞-衍生的外来体称为前列腺体。此外，从树突状细胞分离得到的外来体称为dexosome(dex)，并且已经使用其他的系统命名法，例如epididimosome、argosome、promininosome、prostasome和archeosome(Simpson&Mathivanan,2012)。

上述实体、以及它们的混合物和不纯的制备物的每一种均包含在术语“细胞外微泡”中。事实上，当细胞和组织的细胞外环境包含同时存在的不同类型的细胞外微泡时，细胞外微泡的混合物是本发明的重要的一部分。但是，由于存在多种技术和标志物以鉴定特定类型的细胞外微泡(不同于其他类型的细胞外微泡)，所以本发明因此涵盖了特定类型的细胞外微泡的基本纯的制备物。

尽管本发明中包含旧的术语，但是优选的是使用越来越标准化的系统命名法(通过共同的共识所精炼的)来定义“细胞外微泡”。细胞外微泡的命名优选考虑了3个已知的机制，通过这些机制，膜囊泡被释放至细胞外微环境中：多泡体的细胞外融合，得到“外来体”；直接得自质膜的囊泡的出芽，得到“核外颗粒体”；以及细胞死亡，导致“凋亡小泡”。

近来，细胞外微泡被描述为具有2种主要的类型：微泡或微颗粒，其本身一起被称为“MV”和“外来体”。微泡、微颗粒或MV通常被描述为活化的-或凋亡-诱导的微泡或微颗粒。第三种类型的细胞外微泡为凋亡小泡、凋亡小体和相关的实体。

细胞外微泡的生源论基本将“外来体”与微泡/MV和凋亡小体区分开，如下文中详细所述。还参见et al.,2011中的表1。

如细胞外微泡领域中所用，术语“微颗粒”也涵盖在本发明中，但是是次优选的术语，因为“颗粒”表明了固态的颗粒状的结构，而不是囊泡结构。因此，在表明膜-限定的结构中，名称“微泡”是优选的。但是，内皮细胞-和血小板-衍生的微颗粒被描述为“内皮微颗粒(EMP)”和“血小板微颗粒(PMP)”，其被包含在本发明中，如同所有的微泡、囊泡结构和膜囊泡共同落入在术语细胞外微泡中。

如本文所用，术语“微泡”和“MV”通常是指被磷脂双层包围的较大的细胞外膜囊泡或结构，其直径为大约100nm至大约1000nm，或者在血浆中为大约100nm至大约400nm。微泡/MV是通过质膜的出芽或小泡的调节释放而形成的。

在细胞外微泡的种类内，重要的成分为“外来体”本身，其优选地被描述为直径为大约40至50nm和大约100nm，并且为胞吞来源的膜状囊泡，即，被磷脂双层包围的囊泡，其得自细胞外融合或多泡体(MVB)的“胞吐作用”(et al.,2011；Simpson&Mathivanan,2012)。较不常见的，但是包含在内的术语还为“囊泡形成”和“胞啃作用”。

如所提及的那样，细胞外微泡的生源论基本上将“外来体”与MV和凋亡小体区分开。外来体是以构成性的方式并且在诱导时由细胞在体内和体外主动分泌的，并且特别是通过向内出芽(“内陷”)和将从内体膜的芽分裂至腔体中而从后者内体形成的，从而创建包含腔内囊泡的MVB。在MVB与质膜融合时，外来体被释放至细胞外空间中(例如参见Simons&Raposo,2009的图2；以及Schorey&Bhatnagar,2008的图1)。由于外来体起源于细胞的质膜，并且是通过内体膜的内陷而形成的，所以分泌的外来体具有包膜细胞溶质-衍生的水性空间的质膜以及内体或内体蛋白质。

外来体引入了放映亲代细胞的性质的多种细胞溶质和膜成分。例如外来体的腔体包含从细胞溶质诱捕的多种成分，包括表示疾病的数据特征的RNA和miRNA，该数据特征用于检测瘤形成和特定肿瘤类型的鉴定(Taylor&Gercel-Taylor,2008；Taylor et al.,2011；Rabinowits et al.,2009；Skog et al.,2008)。外来体膜包含I和II类MHC(Iero et al.,2008)；热休克蛋白质70(Hsp 70(Cho et al.,2009))，其上调节Th1介导的免疫应答；以及许多细胞表面成分，在肿瘤-衍生的外来体的情况下，包括从亲代细胞的质膜得到的肿瘤抗原。这些观察表明肿瘤外来体可以用作治疗癌症的免疫疗法。事实上，近来的临床试验表明，使用肿瘤外来体进行“免疫”具有最小的副作用，是良好耐受的，并且激发了特异性的细胞毒T细胞应答(Escudier et al.,2005；Dai et al.,2008)。

由于外来体表面膜反映了它们亲代细胞的质膜，所以从生病的或畸变的细胞得到的外来体特征在于它们表面上的磷脂酰丝氨酸(PS)，这与从正常细胞得到的外来体相反。因此，本发明可以有利地用于分离其表面上暴露有PS的疾病-相关的外来体，优选为以下疾病-相关的外来体，其中其表面上暴露的PS以与非-脂质膜成分相连和/或接近、或者可操作的相连和/或密切接近的方式存在，优选为与膜蛋白质联合和/或接近、或者可操作的联合和/或密切接近。如下文中详细描述的那样，此类疾病-相关的外来体包括得自被病毒或细胞内寄生虫感染的细胞的那些，其中所述的病毒或细胞内寄生虫导致宿主细胞将PS外化，并且优选为肿瘤-衍生的外来体，其通常在表面上包含大量的PS。

“外来体-样囊泡”(其与外来体具有共同的起源)通常描述为具有不同于外来体的尺寸和沉降性质，特别是缺乏脂筏微结构域。

如本文所用，“核外颗粒体”通常为嗜中性粒细胞-或单核细胞-衍生的微泡。

如本文所用，“膜颗粒”(MP)通常为大约50-80nm的直径，并且起源于质膜。“细胞外膜结构”还包括线性的或折叠的膜片段，例如得自坏死性死亡；以及得自其他细胞来源的膜结构，包括分泌的溶酶体和纳米管。

如本文所用，“凋亡小泡和凋亡小体”通常为大约1至5μm的直径，并且在发生凋亡时以细胞小泡的形式释放，即，生病的、无用的和/或异常的细胞。它们的特征是PS外化，并且可以包含碎片的DNA。

B.醋酸盐沉淀的纯化技术和益处

文献中广泛接受的是，尽管进行了大量的研究，但是对细胞外微泡的快速出现研究领域仍存在技术上的困难。例如et al.,2011回顾了与细胞外微泡的制备和测量关联的主要挑战、问题和缺陷，包括与分离此类材料关联的困难。

用于纯化细胞外微泡(例如外来体)最初描述的和最广泛使用的方法涉及除去细胞和细胞碎片的逐步放大的离心步骤，然后用于使细胞外微泡和外来体形成压粒的在100000g的超速离心步骤(Thery etal.,2006)。其他技术包括过滤通过所定义孔径的膜(Grant et al.,2011)；聚合物基沉淀(Taylor et al.,2011)，包括PEG(例如美国专利号8,901,284和US 2013/0337440A1)；以及在ELISA平板(Logozzi et al.,2009)或抗体涂敷的珠(Clayton et al.,2001)上的捕获。高度专用的方法和试剂盒可以用于使用针对肿瘤-特异性蛋白质(例如HER2/neu(Koga et al.,2005)，或其他外来体表面标志物(例如Exo-Flow^TM试剂盒))的抗体涂敷的磁珠来纯化肿瘤-衍生的外来体。

尽管大部分的这些方法在原则上可以适应于大体积的材料，但是由于这些方法是费力的、极其耗时的并且需要特定的试验室设备，所以它们在实践中是受限的。由于绝大多数的研究需要将外来体从大体积的组织培养物上清液中分离，所以获得用于研究的足够浓度所需体积的大幅减少是所有目前技术中的限制。

因此本发明人寻求研究用于从培养物上清液和生物流体纯化或分离细胞外微泡，例如外来体，特别是疾病-相关的和肿瘤-衍生的外来体的新方法。他们基于醋酸盐缓冲剂的惊人的用途(实施例I和实施例II)而研发出新的且有利的技术。与之前的方法相反，本发明提供了快速且高效的分离过程，从而产生与超速离心所获得那些难以区分的外来体。重要的是，新方法容易适应于极大体积的材料，并且细胞外微泡(例如外来体)的纯化可以在无需专用的设备并且以最低成本完成。

由于细胞外微泡存在于原核生物和真核生物中，并且跨越所有的进化(et al.,2011)，所以本发明可以使用得自原核生物、真核生物、细菌、真菌、酵母、无脊椎动物、脊椎动物、爬行动物、鱼、昆虫、植物或动物(包括哺乳动物，例如啮齿动物和灵长目动物)的任何生物流体。例如生物流体可以为小鸡血清、小鼠血清、大鼠血清、兔血清、山羊血清、羔羊血清、绵羊血清、马血清、猪血清、牛血清(胎牛血清)和人类血清。生物流体的优选的实例为鼠、牛或人类生物流体，其用于制备分别为鼠、牛或人类的细胞外微泡，例如外来体。

合适的生物流体(或生物流体)的实例为细胞培养物上清液、全血、血清、血浆、腹水、脑液和脑脊液、骨髓穿刺液、支气管肺泡洗液、尿、精液、阴道液、黏液、唾液、痰和得自生物组织样品的澄清的裂解液。还可以使用母乳、眼泪、汗、关节液或滑液、羊水、滤泡液以及粪便或粪液。生物流体可以是新鲜的或事先冷冻的，然后解冻。

用于本发明的优选的生物流体为细胞培养物上清液、血清、血浆和腹水。对于细胞培养物上清液和条件培养基而言，细胞或细胞群体(包括致敏细胞)是在允许细胞释放和/或分泌细胞外微泡(例如外来体)的条件下培养的。

在某些实施方案中，生物流体为“澄清的”生物流体，例如澄清的细胞培养物上清液，其是指其已经经过低速离心。但是，在其他的实施方案中，作为本发明的一部分，生物流体可以经过低速离心，从而除去细胞、细胞碎片和大的膜囊泡，然后与醋酸盐缓冲剂接触。

生物流体可以得自生病的细胞或组织，这在下文中更详细的描述。就癌症而言，可以使用任何恶性肿瘤，包括实体肿瘤和癌，并且示例性肿瘤包括但不限于肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、喉癌、食道癌、睾丸癌、肝癌、腮腺癌、胆道癌、结肠癌、直肠癌、子宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、甲状腺癌、鳞状细胞癌、腺癌、小细胞癌、黑素瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、成神经细胞瘤等。从这些实例中，通常使用得自黑素瘤、结肠直肠癌、肺癌、胰腺癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌的样品。

在将生物流体与醋酸盐接触从而形成沉淀物(该沉淀物包含细胞外微泡，例如外来体)后，优选通过低速离心来收集沉淀物。如果需要，细胞外微泡(例如外来体)的分离的群体可以进一步离心，从而除去任何污染性成分，由此提供细胞外微泡(例如外来体)的基本纯的组合物。

优选地洗涤分离的细胞外微泡，例如外来体，从而除去残余的培养基，并且在大约中性pH、生理学pH(例如大约pH 7.35至7.45)和/或任何标准的试验室pH(例如大约pH 7.5或7.6等)的不含醋酸盐的缓冲剂中再次悬浮时，进一步优选地“再次溶解”分离的细胞外微泡。

本发明的方法能够有利地从生物流体(例如培养物上清液)回收大量的细胞外微泡，例如外来体，例如能够从培养物上清液回收至少大约一半的细胞外微泡，例如外来体，直至并且包括从培养物上清液回收基本全部的细胞外微泡，例如外来体。

这种简单的且成本有效的方法显著地增加了从无限量的培养物上清液得到细胞外微泡(例如外来体)的产率。还显示通过这种技术分离的细胞外微泡(例如外来体)与通过直接超速离心回收的细胞外微泡是难以区分的(实施例III)，并且基本上是抗原性完整的(例如实施例III和实施例XIII)。考虑到细胞外微泡(例如外来体，特别是跨越物种的肿瘤-衍生的外来体)的共同特征，本发明可以用于从多种来源的细胞和流体分离外来体，包括从保藏的肿瘤细胞系(例如实施例IV)，以及从起源于鼠和其他啮齿动物、牛和人类来源的细胞和流体(例如实施例V中所示)。

尽管据信不是必须的，但是实施例I和实施例IV(特别是在实施例IV中使用的的沉积的肿瘤细胞系)的方案可以用作参照实施例，用于比较本发明，包括定量参照实施例。

据信用于分离细胞外微泡例如外来体的醋酸盐缓冲剂的本发明的用途是通过“电荷中和”而发挥作用的，其中涉及负电荷的磷脂、磷脂酰丝氨酸(PS)，其存在于细胞外微泡和外来体的表面上，特别是疾病-相关的外来体，例如肿瘤-衍生的外来体(Keller et al.,2009；Tayloret al.,2011；Grant et al.,2011)。如本发明的脂质体的研究所示(实施例VIII)，即使在表面上具有PS，同样使用醋酸盐也不会单独地沉淀脂质囊泡。因此，据信PS是必需的，但是不足以用于囊泡的分离，并且本发明有效地用于分离疾病-相关的细胞外微泡，例如外来体，这是因为它们的表面上具有PS，并与非脂质的膜成分相关，特别是膜蛋白质。

细胞外微泡(例如外来体)的膜表面反映了衍生该细胞外微泡的细胞的质膜。由于PS保持在健康的或正常细胞的内侧上，从正常细胞衍生得到的细胞外微泡是PS-阴性的。例如，Connor et al.(2010)报告大部分的循环血小板-衍生的细胞外微泡不能结合膜联蛋白V，并且是PS-阴性。相反，在疾病和/或细胞活化的多种状态下，PS暴露于细胞的外侧，因此细胞外微泡(例如从生病的、感染的、过度活化的或其他异常的细胞衍生得到的外来体)是PS-阳性的，如下文中更详细的描述。

没必要理解导致醋酸盐-基外来体沉淀和分离从而成功地实施本发明的精确机制。但是，提供以下观察和领悟。所述的机制并未显示是由于在等电点的沉淀，这是因为细胞外微泡(例如外来体)在使用HCl或柠檬酸盐酸化溶液时，不能沉淀。有趣的是，回顾过去40年的文献，本发明人注意到通过红细胞脱辅基蛋白(Zwaal&van Deenen,1970)的再结合而形成的囊泡的沉淀取决于负电荷磷脂酸或PS的存在。因此，本发明人认为造成细胞外微泡(例如外来体)的沉淀和分离的原理机制是醋酸盐-介导的对囊泡或外来体水化层的去除，这促进了疏水性相互作用，从而使得聚集和伴随的沉淀增加。在优选的pH范围的任一端(4.25至5.25，优选为4.5至5.0，最佳为4.75)，沉淀的减少可能是由于正的或负的表面电荷的增多，这增强了水化层，由此一定减少了影响相同的沉淀程度的盐。

除了特定的醋酸盐缓冲剂的意外用途，使用能够有效地分离细胞外微泡(例如外来体，特别是形态学完整的细胞外微泡和外来体)的、pH范围为大约4至大约6的任何缓冲剂与文献中关于使用能够完全裂解外来体(美国专利号8,530,228中的裂解溶液1和2)的、该pH范围内的缓冲剂的信息相反地运行。但是，本发明确实提供了形态学完整的细胞外微泡(例如外来体)的制备，其中所述的细胞外微泡与通过其他技术制备的外来体是难区分的。

通过流式细胞仪、EM、SDS-PAGE和蛋白质印迹(使用Alix和Hsp70抗体)对酸化的与超速离心的细胞外微泡和外来体群体的比较表明这2个群体彼此是难以区分的。尽管在从K1735黑素瘤细胞得到的醋酸盐-沉淀的外来体群体中α2-巨球蛋白(在大约160kDa处的条带)增多，但是这并未限制本发明。首先，外来蛋白质沉淀最可能地取决于来源细胞的类型，并且已知α2-巨球蛋白是从一些黑素瘤和肉瘤细胞生产的(Morgan,1984；Bizik et al.,1986)。事实上，α2-巨球蛋白在衍生自B16黑素瘤或TRAMP前列腺癌细胞的细胞外微泡和外来体是不可检测的(实施例IV)。其次，尽管一些外来蛋白质沉淀并不干扰核酸基外来体的诊断测定法，但是这些外来蛋白质可以以任何方式容易地除去，在免疫疗法应用之前除去外来蛋白质是优选的。在这种情况下，一旦使用醋酸盐将大体积的培养物上清液减少至易处理的体积，100000g离心再次溶解的沉淀物可以容易地除去任何污染的蛋白质。

初步研究还显示，醋酸盐缓冲剂可以用于从人类全血分离细胞外微泡，例如外来体(实施例VI)。使用掺杂有已知量的纯化的肿瘤-衍生的、外来体的全血，醋酸盐沉淀分别从凝结血清样品和EGTA-血浆回收大约40％和大约100％加入的外来体。回收的蛋白质的量存在差异，据信这是由于血浆样品中纤维蛋白原的沉淀。例如可以通过在56℃下预温育3min而容易地除去任何此类的纤维蛋白原(Millar etal.,1971；Marx et al.,2008)。事实上，该步骤将醋酸盐沉淀的样品中的外来蛋白质的水平减少至针对血清样品所获得的外来蛋白质相当的水平，并且外来体基本无损失。如上文所讨论，外来体制备物中一些外来蛋白质的存在不应该对转录组分析造成任何问题。就作为免疫原或其他疗法中的用途而言，一旦体积减少至可以使用醋酸盐处理的体积，则可以通过超速离心容易地除去非外来体蛋白质。

本发明的一个重要的方面是用于沉淀疾病-相关的细胞外微泡(例如外来体，特别是病毒-和肿瘤-衍生的细胞外微泡和外来体)的特异性，这与得自正常细胞和流体的细胞外微泡和外来体相反(实施例VII和实施例IX)。这对于实践试验研究、以及诊断检验和试剂盒具有意义。

本发明的特异性得到大量的实施方案，其中细胞外微泡(例如外来体)的特定群体的制备“基本上不具有”其他的成分。例如基本上不具有非-疾病-相关的细胞外微泡或外来体(例如得自正常细胞)的疾病-相关的细胞外微泡，例如外来体；基本上不具有非-肿瘤-衍生的细胞外微泡或外来体(例如得自正常细胞)的肿瘤-衍生的细胞外微泡，例如外来体；基本上不具有非-病毒-衍生的细胞外微泡或外来体(例如得自正常细胞)的病毒-衍生的细胞外微泡，例如外来体；流体，例如基本上不具有疾病-相关的、肿瘤-衍生的和/或病毒-衍生的细胞外微泡(例如外来体)的血清；流体，例如基本上不具有感染性病毒和衍生自病毒感染的细胞的细胞外微泡(例如外来体)的血清；基本上不具有感染性病毒的病毒-衍生的细胞外微泡，例如外来体；基本上不具有非-疾病-相关的、非-肿瘤-衍生的和/或非-病毒-衍生的细胞外微泡或外来体、以及非-外来体成分或污染物的、疾病-相关的、肿瘤-衍生的和/或病毒-衍生的细胞外微泡，例如外来体。

在所有此类的内容中，“基本上不具有”和“实质上不具有”其他列举成分的组合物用于指这样的组合物，其基本上不具有其他列举的成分，使得其他列举的成分在实质上对组合物不具有实质的作用，直至并包括无可检测的作用，这可以例如在针对此类其他列举的成分进行标准的定量或优选的功能测定法中进行测量。换言之，其他列举的成分)不会实质上地、或者甚至可测量地干扰组合物的功能，或者以其他方式导致任何意外的反映、性质或其中的缺陷，这可以例如在针对组合物的活性成分进行标准的定量或优选的功能测定法中进行测量。

基本上不具有醋酸盐的缓冲剂、基本上不具有细胞和基本上不具有除了聚合物(例如聚乙二醇)以外的体积的术语中，相似的含义归结为“基本上不具有”和“实质上不具有”。

如当试验室中用于大部分细胞的标准生长培养基包含动物血清(例如牛血清或胎牛血清)时，培养基中的血清通常包含得自该动物来源的大量的细胞外微泡，例如外来体。这些培养基-衍生的细胞外微泡和外来体可以干扰以分析培养细胞分泌的细胞外微泡和外来体为目的研究。解决该问题的选择是包括耗尽得自培养基/血清的外来体的额外的步骤，或者购买和使用外来体-耗尽的生长补充剂，例如外来体-耗尽的胎牛血清(例如Exo-FBS^TM)。

但是，由于本发明提供了将肿瘤-衍生的细胞外微泡(例如外来体)单独地与衍生自正常细胞(所谓的“正常的”细胞外微泡和“正常的”外来体)的细胞外微泡和外来体的能力，所以当使用本发明直接从培养的肿瘤细胞来分离肿瘤-衍生的细胞外微泡(例如肿瘤-衍生的外来体)时，不再需要这种费力的和/或昂贵的过程。

此外，如本发明提供的将肿瘤-衍生的细胞外微泡(例如肿瘤-衍生的外来体)与正常的细胞外微泡和外来体分开的能力对于诊断检验和试剂盒具有重要性，包括针对肿瘤-衍生的细胞外微泡和外来体的存在情况来检验得自人类患者的流体的那些。就此而言，可以将沉淀肿瘤-衍生的细胞外微泡(例如肿瘤-衍生的外来体)的简单的检验加入至在医生随访中常规获得的血液样品上所实施的一连串检验中。此类检验中的初始阳性随后跟随沉淀的肿瘤-衍生的细胞外微泡(例如肿瘤-衍生的外来体)的进一步分析，特别是检验生物标志物(例如RNA、micro RNA、DNA或蛋白质生物标志物)，以及患者的进一步的临床评估。

为了进一步分析分离的细胞外微泡，例如肿瘤-衍生的外来体，已知多种生物标志物，例如在et al.,2011中所述，这些文件的任意一份或多份都可以评估作为本发明的一部分。例如外来体生物标志物包括Alix和hsp70、CD63和小窝蛋白-1(Logozzi et al.,2009)、CD81和CD82。所分析的生物标志物可以为非-外来体的，例如肿瘤或病毒标志物。可以通过任何手段(例如电泳分离、免疫分离、色谱或它们的组合)来分离生物标志物，并且可以通过任何手段(例如免疫测试，质谱或它们的组合，包括MALDI MS和免疫测试，例如蛋白质印迹、酶联免疫测试(ELISA)、放射性免疫测试(RIA)或竞争性结合测试)进行定量。

关于分离的细胞外微泡(例如肿瘤-衍生的外来体)是否用于科学研究和/或临床诊断和预后目的的进一步分析，本发明特别有利的是分离的细胞外微泡(例如外来体)基本上是“抗原性完整的”，这样它们以“抗体-结合形式”基本保持了它们的原始的表面标志物和抗原。此外，基本上抗原性完整的细胞外微泡(例如外来体)可以用于免疫，从而产生抗体，包括在免疫试验动物中获得新的治疗抗体，例如人源化的或人类抗体，该抗体识别在细胞外微泡或外来体上保持的保守性抗原或标志物，特别是肿瘤或病毒抗原或标志物。

然而，关于分离的细胞外微泡和外来体的内部，可能的是分离方法的相对低的pH还酸化了囊泡的内部。因此，为了例如通过RT-PCR来对核酸生物标志物的分析，优选的是细胞外微泡和外来体至少在分析之前、并且更优选地在分离后和/或任何储存或冷冻之前及时地恢复至中性pH、生理学pH(例如大约pH 7.35至7.45)，或者任何标准的试验室pH(例如大约pH 7.5或7.6)。将分离的细胞外微泡(例如外来体)再次悬浮于pH为大约7.0至大约pH 7.6的无醋酸盐的缓冲剂中无论如何都是优选的，但是据信对于核酸分析是更重要的。

C.醋酸盐缓冲剂

如实施例I以及图1A和图1B所示，如本发明提供的分离细胞外微泡例如外来体的“盐析”或沉淀方法在醋酸盐缓冲剂的整个范围内都是有效的。特别地，注意“醋酸盐缓冲剂”的真实本性具有大约pH3.7至大约pH 5.8的pH范围，例如大约pH 3.75至大约pH 5.75的pH范围，或者大约pH 3.7至大约pH 5.6的pH范围。

例如特别参照醋酸钠，诸如the Buffer Reference Center of之类的公知的来源显示醋酸钠-醋酸缓冲剂溶液的有用的pH范围为大约pH 3.7至大约pH 5.6(还参见Dawson,1986)。以下缓冲剂表描述了醋酸钠三水合物(CH3COONa·3H₂O,M.wt.136.09)，其中0.2M溶液包含27.22g/l，并且其中x ml 0.2M-NaOAc和y ml 0.2M-HOAc混合。

本发明适用于例如具有一价或二价阳离子的多种醋酸盐缓冲剂，例如醋酸钠、醋酸钾(例如参见实施例II和图4B)、醋酸铵和它们的混合物，并且醋酸钠和醋酸钾是优选的，并且醋酸钠是特别优选的。这些其他的醋酸盐缓冲剂(例如醋酸钾和醋酸铵)也在大约pH 3.7至大约pH 5.8的一般pH范围内，例如具有大约pH 3.75至大约pH 5.75的pH范围内，或者大约pH 3.7至大约pH 5.6的pH范围内。

如实施例I以及图1A和图1B所示，盐和pH条件的整个范围在沉淀细胞外微泡(例如肿瘤-衍生的外来体)中是有效的，并且从所有的检验条件下回收有意义的水平的蛋白质。例如图1A中通过对数据点拟合曲线，可见pH 3.75至pH 5.75、以及0.05M至0.5M的醋酸盐缓冲剂是有效的。实际数据点显示，在跨越0.05M至0.5M的整个浓度范围内，在pH 4.14、pH 4.39、pH4.64、pH 4.89、pH 5.14和pH 5.64下发生有效的沉淀(图1A)。在所检验的各浓度下，即，0.05M、0.1M、0.233M、0.367M和0.5M，也发生有效的沉淀(图1A)。通过对数据点拟合曲线，可以如下测定各浓度下的最佳pH：在0.05M下pH 4.65；在0.1M下pH 4.75；在0.233M下pH 4.80；在0.367M下pH 4.77；以及在0.5M下pH 4.78(图1B)。

然而，尽管在pH和浓度的整个范围的醋酸盐缓冲剂是有效的，但是可以选择某些优选的范围。如图1A所示，本发明使用pH为大约pH 4.14至大约pH 5.25、或者大约4.25至大约5.25、优选为pH为大约4.5至大约5.0，以及浓度为大约0.05M至大约0.25M(例如0.05M,0.1M和0.233M，并且浓度为大约0.05M至大约0.1M是优选的)的醋酸盐缓冲剂是有效的。例如本发明示出了具有0.1M醋酸盐、至pH4.75的组织培养物上清液的效价，从而使得几乎所有的外来体立刻沉淀。

因此，本发明包括pH为大约4.14、4.25、4.3、4.39、4.35、4.4、4.45、4.5、4.55、4.6、4.64、4.65、4.7、4.75、4.8、4.85、4.89、4.9、4.95、5.0、5.05、5.1、5.14、5.15、5.2、5.25、5.64或大约5.75；更优选为pH为大约4.5、4.55、4.6、4.65、4.7、4.75、4.8、4.85、4.9、4.95或5.0；并且最优选地，pH为大约4.65、4.7、4.75、4.8或4.85的醋酸盐缓冲剂的使用。

因此，本发明包括浓度为大约0.01M、0.02M、0.03M、0.04M、0.05M、0.06M、0.07M、0.08M、0.09M、0.10M、0.11M、0.12M、0.13M、0.14M、0.15M、0.16M、0.17M、0.18M、0.19M、0.20M、0.21M、0.22M、0.23M、0.233M、0.24M、0.25M、0.26M、0.27M、0.28M、0.29M、0.30M、0.31M、0.32M、0.33M、0.34M、0.35M、0.36M、0.367M、0.37M、0.38M、0.39M、0.40M、0.41M、0.42M、0.43M、0.44M、0.45M、0.46M、0.47M、0.48M、0.49M、0.50M、0.51M、0.52M、0.53M、0.54M或0.55M；并且更优选地浓度为大约0.05M、0.06M、0.07M、0.08M、0.09M、0.10M、0.11M、0.12M、0.13M、0.14M、0.15M、0.16M、0.17M、0.18M、0.19M、0.20M、0.21M、0.22M、0.23M、0.233M、0.24M或0.25M；以及甚至更优选地浓度为大约0.05M、0.06M、0.07M、0.08M、0.09M或0.10M的醋酸盐缓冲剂的使用。

从图1A中相同数据的空间填充(或3D)模型，pH范围为大约pH 4.14至大约pH 5.25、大约pH4.14至大约pH 5.0、大约pH 4.39至大约pH 5.4、大约pH 4.39至大约pH 5.25、以及大约pH 4.39至大约pH 5.14，并且浓度为大约0.05M至0.25M、大约0.05M至0.233M、以及大约0.05M至0.15M是优选的；并且pH范围为大约pH 4.5至大约pH 5.4、大约pH 4.5至大约pH 5.25、以及大约pH 4.5至大约pH 5.0，并且浓度为大约0.05M至0.233M、大约0.05M至0.15M、以及大约0.05M至0.1M是特别优选的。

即使更优选的范围由此为大约pH 4.5至大约pH 5.25、或者大约pH 4.5至大约pH 5.0，并且浓度为大约0.05M至0.15M、或者大约0.05M至0.1M。

任何pH范围或数字可以与任何浓度范围或数字结合。例如在优选的实施方案内，醋酸盐缓冲剂的pH可以为大约4.25至大约5.25，并且样品中的最终浓度为大约0.05M至大约0.25M；并且更优选地，醋酸盐缓冲剂的pH为大约4.5至大约5.0，并且样品中的最终浓度为大约0.05M至大约0.1M。目前最优选的实施方案为使用浓度为大约0.1M且pH为大约4.75的醋酸钠缓冲剂。

如本文所用，在整篇“浓度”的讨论中，有效浓度以生物流体的样品的“最终浓度”列出，这样通常将1/10体积的10X浓缩的醋酸盐缓冲剂加入至生物流体的样品中。例如加入1/10体积的1.0M醋酸盐缓冲剂，从而在0.1M样品中得到最终浓度。

在某些实施方案中，用于本发明的醋酸盐缓冲剂优选地实质上不具有除了聚合物，例如聚乙二醇(PEG)；葡聚糖，例如硫酸葡聚糖和醋酸葡聚糖；以及亲水性聚合物，例如聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯或聚乙烯硫酸酯以外的体积。

D.疾病中磷脂酰丝氨酸的暴露

从肿瘤分离细胞外微泡例如外来体是本发明的重要方面。除了肿瘤-衍生的细胞外微泡和外来体以外，由于这些组合物反映了来源细胞，所以可以使用本发明分离的PS-阳性细胞外微泡和外来体的其他来源为得自被多种病原体感染的细胞的那些。

例如细胞内寄生虫，例如寄生原生动物，亚马孙利什曼原虫(Leishmania amazonensis)(Zandbergen et al.,2006；Wanderley et al.,2009；Wanderley et al.,2013)；恶性疟疾(Plasmodium falciparum)，其导致疟疾(Eda&Sherman,2002；Pattanapanyasat et al.,2010；U.S.Patent No.7,262,167)；以及美洲锥虫(Trypanosoma cruzi)，一种寄生原生动物(DaMatta et al.,2007))均使得PS暴露。同样，血吸虫(寄生的扁形虫)也暴露PS(van der Kleij et al.,2002)，刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)也如此(Seabra et al.,2004)。

PS暴露还显示在被细胞内细菌病原体(例如鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)和土拉弗氏菌(Francisella tularensis)，它们均分别导致瘟疫和野兔病)感染后的外部细胞表面上(Lonsdale et al.,2011)。单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)还促进具有exofacialPS的膜-衍生的囊泡从感染的宿主细胞上的释放(Czuczman et al.,2014)。类似地，被导致脑膜炎的病原体(脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis))感染的内皮细胞展现出PS迁移至细胞表面上(Schubert-Unkmeir et al.,2007)。结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)(其在巨噬细胞内进行细胞内复制)的感染与结节病变中嗜中性粒细胞的PS外化有关(Francis et al.,2014)。类似地，嗜肺性军团病杆菌(Legionella pneumophila)(一种兼性细胞内寄生虫)在人类单核细胞中诱导PS外化(et al.,1998)。

因此，上文详述的对于兼性细胞内寄生虫而言普通的PS外化在其他此类病原体(例如沙门氏菌和布鲁氏菌)中可能发生。对于专性细胞内寄生虫(例如衣原体属的物种)的感染也有文件记载，其中PS外化对于病原体而言是重要的，并且已经显示在感染的上皮细胞、内皮细胞、粒细胞和单核细胞上(Goth&Stephens,2001)。

事实上，宿主细胞上的PS外化目前是响应于多种细胞和病原体感染的公认的显现(Wandler et al.,2010)。这进一步包括幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)，其侵入胃的上皮细胞(Petersen&Krogfelt,2003)，并且在与这些细胞直接接触时，诱导PS外化至宿主质膜的外部小叶上(Murata-Kamiya et al.,2010)。

导致宿主细胞外化PS的主要的病原体为病毒(例如美国专利号7,790,159；美国专利号7,906,115；Soares et al.,2008；Mercer和Helenius,2008；Moody et al.,2010；Morizono et al.,2011；Meertens etal.,2012；Best,2013；Bhattacharyya et al.,2013；Jemielity et al.,2013；Moller-Tank&Maury,2014)。事实上，PS和PS受体作为包膜的病毒进入和感染的增强剂的作用目前已经在文件中良好地记载(例如参见Moller-Tank&Maury,2014中的表1；并且还参见本发明的实施例X)。细胞外微泡(例如外来体)与病毒感染之间的关联近年来也越来越明显(Meckes&Raab-Traub,2011；Sims et al.,2014)，并且再次适用于多种病毒(例如Walker et al.,2009；Meckes et al.,2010；Izquierdo-Useros et al.,2010；Meckes&Raab-Traub,2011)。

此外，PS、病毒和PS-阳性的病毒-衍生的细胞外微泡之间的关联不限于包膜的病毒，而且扩展至非-包膜的病毒(Clayson,et al.,1989；Chen et al.,2015)。具体而言，参见Chen et al.,2015在Cell上的文章的封面图，其示出了“PS脂质囊泡”，并且附有显示PS囊泡能够使肠道病毒高效地整体传送的数据。

本发明成功地用于从病毒-感染的细胞和病毒培养物分离细胞外微泡，例如外来体(实施例XI和实施例XIII，图10A、图10B和图10C)，其显示实质上不具有感染性病毒(实施例XII)。总之，这些数据显示从被包膜的(例如HSV-1)和非-包膜的病毒(例如SV40)感染的细胞分离实质上为非-感染的PS-阳性的细胞外微泡。

尽管不被上述这些所束缚，但是以下评论解释了本发明在从包膜的和非-包膜的病毒沉淀细胞外微泡中的用途的基本原理。所有病毒协调(orchestrate)成熟病毒粒子从宿主细胞定时离开，从而确保成功地干扰新的宿主细胞。包膜的病毒利用宿主细胞质膜来嵌入病毒蛋白质，该病毒蛋白质介导了后代病毒粒子高效地进入下一宿主细胞。在病毒感染的细胞的外部上发现PS，然后病毒释放，并且包膜的病毒在离开宿主细胞时将PS引入病毒的包膜中(例如实施例X)。

未将包膜引入至它们成熟的病毒粒子的病毒通过其他的机制留在宿主细胞中。非-包膜的病毒所用的从细胞释放新的病毒粒子的一些策略包括细胞的裂解，其可以通过对感染细胞(T细胞或巨噬细胞)的宿主免疫应答而直接导致，或者由于病毒对宿主细胞蛋白质合成或细胞结构的直接活性。病毒改变细胞结构从而诱导细胞裂解的实例为腺病毒。腺病毒在感染的晚期表达多种蛋白质，所述的蛋白质通过破坏丝形网络和蛋白质合成而改变细胞结构的整体性(Flint,2000)。一些非-包膜的病毒能够通过非破坏性的机制释放它们的后代病毒，而不会产生任何细胞病变的结果。尽管脊髓灰质炎病毒诱导细胞快速裂解(大约8小时)，但是其在能够感染新的宿主细胞的PS脂质囊泡中从细胞释放。PS-囊泡中的脊髓灰质炎颗粒能够比除去PS-囊泡的病毒颗粒更高效地感染HeLa细胞和原始巨噬细胞，并且封闭具有膜联蛋白V的囊泡会以剂量依赖性的方式抑制从感染的细胞得到的囊泡，表明PS脂质为脊髓灰质炎病毒感染的辅助因子。除了脊髓灰质炎病毒以外，柯萨基病毒B3和鼻病毒颗粒也被释放至PS脂质囊泡中(Chen et al.,2015)，表明肠病毒在未使细胞裂解的条件下选择性地释放成分颗粒所采用的普通机制。

关于本文所用的SV40，SV40也可以以上述的PS-脂质囊泡的类型从细胞释放。尽管这没有被公开，但是已经报道发现SV40颗粒可以在诱导细胞病理作用之前从细胞释放(Clayson et al.,989)。此外，在感染后48小时，在细胞质光滑囊泡中观察到SV40病毒粒子，并且SV40颗粒的释放受到莫能菌素(其为一种通过阻断跨越脂质膜的阳离子运输来阻断细胞内蛋白质运输的钠离子载体)的抑制。

在本发明的其他实施方案中，由于据信醋酸盐缓冲剂分离细胞外微泡例如外来体的用途涉及非-脂质的膜成分(特别是膜蛋白质)相连的表面PS，并且由于外来体和病毒是相同大小的范围(例如参见et al.,2011)，所以本发明包括使用醋酸盐缓冲剂分离病毒的方法和组合物。由于pH为大约5.25至大约4.25(包括pH为大约4.75)的缓冲剂的使用可能将病毒灭活(由于相对低的pH)，所以所述的方法目前不建议用于分离感染性病毒。但是，所述的方法更适用于分离适合在例如表征、抗原-分类和相关分析中使用的非-感染性病毒。可行的是，所述的方法还可以用于分离感染性病毒，特别是在对于更高端值的有效pH范围内使用时，更具体而言，在不必或需要高产率的条件下时。然而，如上文所列，本发明的方法和组合物更好地适用于分离得自病毒的细胞外微泡(例如外来体)，其中本发明有利的是适用于分离基本上不具有感染性病毒的病毒细胞外微泡，例如外来体。

已知多种其他的疾病和紊乱，其中宿主细胞暴露于PS，和/或其中PS-阳性细胞外微泡和外来体在文件中记载。例如在镰刀形细胞疾病和危机中，30-40％红细胞是过早衰老的，并且是PS-阳性的(“镰刀形红细胞”)，这与健康人中仅大约1％的情况是相对的。PS-阳性的镰刀形红细胞保持循环，附着在内皮，并且它们暴露于PS起到用于起始凝血级联(导致凝块扩展)的平台的作用(Kennedy et al.,2015)。

粥样硬化斑块也释放PS-阳性的细胞外微泡(Mallat et al.,1999)。1型和2型糖尿病患者具有PS-阳性的细胞外微泡，如从膜联蛋白V-阳性所示(Sabatier et al.,2002)。在Alzheimer疾病中，脑的外来体包含PS和淀粉样β-肽(Aβ)，其为该疾病的致病剂(Yuyama et al.,2012)。PS-阳性的细胞外微泡还涉及脓毒病，其中它们是脓毒病-诱导的微血管功能障碍和免疫抑制的标志物和调控剂(Souza et al.,2015)。因此，本发明可以适用于从所有此类疾病和紊乱分离PS-阳性的细胞外微泡。

包含以下实施例以证明本发明的优选的实施方案。本领域的那些技术人员应该理解的是以下实施例中公开的技术代表了本发明人发现的在本发明的实践中良好地发挥作用的技术，并因此可以被认为构成了用于实践的优选的模式。但是，根据本发明公开，本领域的那些技术人员应该理解的是在具体的实施方案(经公开，并且在不脱离本发明的精神和范围的条件下仍获得可能的或类似的结果)中可以形成许多改变。

实施例I

使用醋酸盐缓冲剂来分离肿瘤-衍生的外来体

本实施例显示使用醋酸盐缓冲剂分离细胞外微泡，例如外来体，特别是肿瘤-衍生的外来体的有利方法。

A.材料和方法

以下材料和方法与实施例I、实施例II和实施例III中报告的结果相关。

1.组织培养物

在最低必需培养基(MEM)中培养K1735P鼠科黑素瘤(肿瘤)细胞(从I.J.Fidler,M.D.Anderson Cancer Center,Houston,TX提供，而且至少是广泛使用的)，其中所述的培养基补充有L-谷氨酰胺(2mM)、丙酮酸钠(1mM)、青霉素(100U/mL)、链霉素(100μg/mL)、非必需氨基酸和胎牛血清(10％)。将细胞(在15mL培养基中大约25x10⁶)接种于CELLine AD 1000烧瓶(Integra Biosciences AG)的下方容器中，其中所述的烧瓶的上方容器装有250mL培养基(Mitchell etal.,2008)。每周从下方容器收集条件培养基(大约15mL)。使用15mL磷酸盐-缓冲的生理盐水(PBS)将隔室洗涤1次，并与条件培养基合并。然后，将新鲜的培养基加入至下方容器中。通过使用新鲜的培养基替换大约100mL消耗的培养基每周对上方容器进行补充。每周的收集物经过醋酸盐缓冲剂的沉淀方案，通常得到75-125μg纯化的外来体/mL条件培养基(参见下文的结果)。

2.肿瘤-衍生的外来体的分离

超速离心——通过在500g 30min、然后在12000g再30min的顺序离心清除细胞条件培养基中的细胞、细胞碎片和大的膜囊泡。在100000g超速离心1hr后，从澄清的上清液收集外来体。将压粒再次悬浮于大约2mL的HEPES-生理盐水(HBS；NaCl 150mM,HEPES20mM,EGTA 2mM,pH 7.6)中。通过BCA蛋白质测定法来估计外来体定量。

醋酸盐缓冲剂沉淀方案(标准)——通过顺序离心，清除细胞条件培养基中的细胞、细胞碎片和大的膜的囊泡。将细胞条件培养基在500g离心30min(或者在250g离心10min)，并收集上清液，然后在12000g至13000g再离心30min。这些步骤提供了清澈的或澄清的上清液。制备1.0M醋酸钠在水中形成的溶液，并使用冰醋酸滴定至pH 4.75，再将1/10体积的这种醋酸钠缓冲剂与澄清的上清液混合，并在冰上放置30-60min。通常，随后将混合物转移至37℃并再持续5min(但是这是可任选的)。将所得的浑浊的悬液在2000g至5000g(通常在5000g)离心10min，弃去上清液，并使用0.1M醋酸钠缓冲剂将所得的压粒洗涤1次。将再次悬浮的压粒在大约2000g再次离心10min，并最终的压粒“溶解于”HEPES-缓冲的生理盐水(HBS)或TRIS-缓冲的生理盐水(TBS)(其为不含醋酸盐的缓冲剂的实例)中。可任选地，可以通过在大约2000g离心10min来除去任何剩余的不溶性的材料，和/或通过另一轮的沉淀而取得进一步的纯化。将纯化的外来体储存在4℃下。

3.流式细胞仪

将处于0.5mL PBS中的肿瘤外来体(10μg蛋白质)在4℃下与5μL的4μM醛-活化的乳胶珠(4％w/v)(Invitrogen)混合过夜。然后通过在1hr内加入0.5mL的1％牛血清白蛋白(BSA)、然后再在1小时内加入0.1mL的100mM甘氨酸来封闭所述的所述珠。接着洗涤所述珠并将其再次悬浮于PBS中。抗体包括兔抗-alix(sc-99010；SantaCruz)和兔抗-微管蛋白(sc-5546；Santa Cruz)作为同种型对照，还包括CY3-标记的驴抗-兔Ig。将初级抗体与所述珠在冰上温育1hr，洗涤2次，然后与标记的二级抗体再温育1hr。再次洗涤所述珠并分析。如制造商所述，使用异硫氰酸荧光素(FITC)-膜联蛋白5(BDBiosciences)。样品包括BSA-封闭的珠和在Ca²⁺(1mM)存在和缺乏下，与膜联蛋白5温育的外来体-珠。

4.电子显微镜

使用根据Thery et al.,2006所述的稍微修改的过程，制备分离的外来体用于通过透射电子显微镜进行检查。简言之，将25μl外来体悬液放置于封口膜上，并将碳-涂敷的网格朝下在悬液上悬浮1min。然后，将网格通过3个连续的通路在水上洗涤，每次1min。然后，通过将网格在25μl微滴的2％铀酰醋酸盐上放置1min来染色，在如上文所述在水中再次洗涤。通过在滤纸上印迹而除去过量的水。然后，将网格空气干燥几分钟。使用JEOL 1200EX电子显微镜检查样品。

5.凝胶电泳和蛋白质印迹

在95℃下，将外来体在包含5％β-巯基乙醇的等体积的Laemmli样品缓冲剂(Bio-Rad)中溶解5min。等分液(20μg蛋白质)通过复制'Ready Cast'10％丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad)进行电泳。使用考马斯亮蓝染色一个凝胶，并在4℃下将复制品转移至PVDF膜上过夜。使用处于TRIS-缓冲的生理盐水(TBS)(包含1％Tween-20)中的5％脱脂牛奶来封闭膜。在1hr内加入所示的初级抗体(抗-Alix，抗-hsp70；SantaCruz)，然后使用TBS进行3次洗涤。使用合适的HRP-缀合的二级抗体来评估抗体的结合，并通过增强的化学发光进行观察。

B.pH和浓度范围

在高效的CELLline AD组织培养物系统中建立肿瘤细胞培养物(Mitchell et al.,2008)。上清液取自下方的包含细胞的容器，并通过分别在500g和12000g离心而除去完整的细胞和细胞碎片。然后，将澄清的上清液的小等分液(4.5mL)与1/10体积的浓度增加的10X醋酸盐混合，其中所述的醋酸盐使用醋酸滴定至所示的pH。

图1A和图1B示出了跨越该醋酸盐缓冲剂范围内的肿瘤-衍生的外来体的有效分离。可见完整范围的盐和pH条件在沉淀肿瘤外来体中是有效的，并且从所有的检验条件下回收有意义水平的蛋白质。还应该注意该研究被设计用于容易地提供广泛的比较数据，并非设计用于使产率达到最优的任何尝试。在有效条件的范围内，沉淀基本上是瞬时的，并且是清晰可见的(例如如图1C所示，使用pH 4.75以及0.1M醋酸盐)。

通过对数据点拟合曲线，从图1A可见在盐和pH条件的完整范围(包括pH 3.75至pH 5.75，并且0.05M至0.5M)的醋酸盐缓冲剂在沉淀肿瘤外来体中是有效的。实际数据点显示，在0.05M至0.5M的整个浓度范围内，有效的沉淀在pH 4.14、pH 4.39、pH 4.64、pH 4.89、pH 5.14和pH 5.64发生(图1A)。有效的沉淀还在所检验的各个浓度发生，即，0.05M、0.1M、0.233M、0.367M和0.5M(图1A)。通过对数据点拟合曲线，测定各浓度的最佳pH如下：在0.05M为pH4.65；在0.1M为pH 4.75；在0.233M为pH 4.80；在0.367M为pH 4.77；以及在0.5M为pH 4.78(图1B)。

然而，尽管在pH和浓度的完整范围的醋酸盐缓冲剂是有效的，但是这种“盐析”或沉淀方法受到pH和盐浓度的影响。图1A显示大约pH 4.14至大约pH 5.25、或者大约pH 4.25至大约pH 5.25、更具体而言为大约pH 4.5至大约pH 5.0的范围、以及大约0.05M至0.25M、更具体而言为大约0.05M至0.1M醋酸盐的浓度是最有效的。使用这些相同数据的空间填充(或3D)模型，pH范围为大约pH 4.14至大约pH 5.25、大约pH4.14至大约pH 5.0、大约pH 4.39至大约pH5.4、大约pH 4.39至大约pH 5.25，以及大约pH 4.39至大约pH 5.14，并且浓度为大约0.05M至0.25M、大约0.05M至0.233M、以及大约0.05M至0.15M；并且更具体而言，pH范围为大约pH 4.5至大约pH 5.4、大约pH 4.5至大约pH 5.25、以及大约pH 4.5至大约pH 5.0，并且浓度为大约0.05M至0.233M、大约0.05M至0.15M、以及大约0.05M至0.1M是最优选的。

从图1A和相同数据的空间填充模型，优选的范围为大约pH 4.5至大约pH 5.25，或者大约pH 4.5至大约pH 5.0，并且浓度为大约0.05M至0.15M、或者大约0.05M至0.1M。在这些有效的范围内，在这些研究中使用0.1M醋酸盐的最大沉淀在大约pH 4.75发生。因此，选择它们作为用于进一步研究的方便的标准的条件，包括下文以及在随后的实施例中所报告的那些。

C.产率

以大约25x10⁶K1735P细胞为起始，在上述条件下培养2周，然后第一次收集条件培养基，并如上文所述进行醋酸盐沉淀(使用pH4.75的0.1M醋酸钠)，得到产率为大约75-125μg纯化的外来体/mL的条件培养基。如上文所述将这些细胞保持在培养物中，并使用新鲜的培养基补充消耗的培养基，提供了所谓的“完全饱和的”细胞条件培养基的恒定来源(但是得自数量未知的细胞)，从该培养基，可以使用醋酸盐缓冲剂沉淀方案每周获得大约75-125μg/mL(通常为大约100-125μg/mL)纯化的外来体。

如所注释的那样，从少的样品生成图1A和图1B中的数据，从而显示条件的比较，但是目的不在于描述典型的产率。已经观察到，当使用完全饱和的培养基时，产率％增加，这样浓度较低的少的样品相对。

实施例II

肿瘤外来体分离的进一步表征

本实施例进一步表征了用于疾病-相关的细胞外微泡(例如外来体)的分离方法学，并突显在参考肿瘤外来体的技术中醋酸盐缓冲剂的重要性。

A.温度独立性

本研究显示肿瘤外来体的沉淀实质上是温度独立性的。但是，分析温度的作用显示浑浊度的发展是温度依赖性的。

直接的温度-依赖性会增加在加入醋酸盐时形成的浑浊度，然后浑浊度开始平稳。连续的温育显示在0℃至20℃之间速率中等地增加大约2倍。但是，在温度从20℃增加至37℃时，观察到速率无显著性差异(图2A)。有趣地，一旦反应在0℃下达到稳定期，将温度增加至37℃导致浑浊度立即升高至达到样品在37℃下温育完整时间的样品的浑浊度水平(图2A)。相反，降低在37℃下温育的样品的温度则无作用(图2A)。

无论浑浊度如何，在压粒的沉淀物中回收的蛋白质的量在实质上是一致的(图2B)，表明肿瘤外来体的沉淀是温度-独立性的，并且在更高的温度下形成更大的聚集物。

B.pH依赖性

为了进一步评估肿瘤-衍生的外来体沉淀物的pH依赖性，将从相同的Integra烧瓶得到的消耗的培养基和澄清的细胞上清液在0.1M醋酸钠缓冲剂中温育1hr。在600nm下评估浑浊度，并通过Bradford测定法来评估沉淀的蛋白质(外来体)。

如图3A和图3B所示，使用上清液获得pH-依赖的浑浊度(图3A)和沉淀的蛋白质(图3B)，而使用对照培养基观察到基本无浑浊度或沉淀物。在有效的pH范围内，在大约pH 4.75下再次获得从本研究中的上清液得到的最大浑浊度和沉淀的蛋白质。

C.沉淀取决于醋酸盐而非pH

通过这些酸化研究显示醋酸盐(而非pH本身)在沉淀肿瘤-衍生的外来体中的重要性。发现沉淀取决于醋酸盐的存在，而非仅仅酸化，这是因为使用甘氨酸盐酸盐或柠檬酸盐酸化的上清液不发生沉淀(图4A)。

D.沉淀取决于醋酸盐，而非抗衡离子

尽管肿瘤外来体的沉淀取决于醋酸盐的存在，但是可以使用其他的醋酸盐缓冲剂(醋酸钾或醋酸铵)取代标准的醋酸钠。这些受控的研究显示抗衡离子的不相关性，其中通过醋酸钾的沉淀显示与通过醋酸钠的沉淀是相当的。

将4T1乳腺癌细胞培养于CELLline AD组织培养物系统中。从底部包含细胞的容器收回上清液，并从顶部容器得到培养基，顶部容器通过透析膜与底部细胞容器分离。将从底部容器得到的等体积的上清液样品和从顶部容器得到的培养基在pH 4.75下分开地与1/10体积的10X醋酸钠或者10X醋酸钾混合，并放置30min。

图4B显示醋酸钾的用途与醋酸钠的用途是难区分的。使用这2种醋酸盐缓冲剂，从底部容器的上清液得到的外来体的沉淀是清晰可见的，并且是相当的。如所预计的那样，使用醋酸盐缓冲剂观察到从顶部容器的培养基未得到的沉淀，这是因为外来体太大而不能通过透析膜，从而保持在底部细胞容器中。澄清可见的浑浊悬液经离心并形成外来体压粒，这些压粒在醋酸钾和醋酸钠之间是明显难以区分的。

实施例III

形态学证明的肿瘤外来体的当量产率

本实施例显示使用醋酸盐缓冲剂分离的疾病-相关的细胞外微泡(例如外来体)的产率相当于从典型的超速离心方法得到的产率，甚至醋酸盐方法更简单且快速。醋酸盐-纯化的外来体(例如肿瘤外来体)还显示与通过传统的超速离心制备的那些是形态学难以区分的，并且是抗原性完整的。

A.当量产率

在2个群体中，通过评估Alix和PS来定量使用醋酸盐分离和使用常规的100000g超速离心获得的肿瘤外来体的相对产率。使用Cy3-标记的Alix抗体对Alix(图5A)和使用FITC-标记的膜联蛋白5对PS(图5B)进行的流式细胞仪分析表明2种方法产生相似量的外来体。

在使用醋酸盐分离与使用常规100000g超速离心所获得的蛋白质产率的直接比较中，通过2种方法分离K1735上清液的相等的等分液。此外，从100000g超速离心和醋酸盐方案得到的上清液分别经过另一轮的醋酸盐pH 4.75和超速离心的分离(在使溶液达到pH 7.5之后)。

使用醋酸盐方案的蛋白质产率是超速离心方法的大约2倍(167.0μg/ml对比88.1μg/ml)。在对中和的醋酸盐上清液进行超速离心后，不能回收到其他的蛋白质，表明使用醋酸盐沉淀了几乎所有的外来体。另一方面，100000g超速离心上清液的醋酸盐处理回收到额外的533μg蛋白质(39.5μg/ml)，表明醋酸盐能够非特异性地沉淀非-外来体蛋白质。从醋酸盐沉淀和100000g沉淀回收的外来体的SDS-PAGE显示相似的蛋白质图谱，不同之处在于在醋酸盐泳道的顶部具有其他的条带。质谱分析表明醋酸盐样品中的这上方的条带(大约160kDa)为α2-巨球蛋白，已知其为一些黑素瘤细胞分泌的蛋白质(Morgan et al.,1984)。

在使用醋酸盐沉淀来从B16黑素瘤或TRAMP前列腺癌细胞纯化外来体的分开的研究中，在所得的外来体中未检测到α2-巨球蛋白(实施IV)。

关于在从K1735细胞得到的醋酸盐-沉淀的外来体中的较高浓度的α2-巨球蛋白(其可能是由于与外来体沉淀无关的酸依赖的共沉淀的结果)，其可以通过对中和的醋酸盐-沉淀的外来体洗涤1次而在100000g容易地除去。事实上，洗涤的外来体的SDS-PAGE表明大部分的α2-巨球蛋白被除去。

B.形态学难以区分的外来体

使用醋酸盐及通过传统的超速离心而纯化的肿瘤外来体通过电子显微镜，并通过蛋白质印迹对于外来体-有关的特征标志物而进行分析。已经测定使用醋酸盐回收的外来体与通过超速离心收集的外来体是形态学难以区分的。2个群体均包含相同尺寸的囊泡，并且具有封闭腔体空间的典型的双层膜(图6)。

蛋白质印迹分析证明2种制备物均包含外来体标志物Alix和Hsp70。在蛋白质印迹中与抗体的结合由此显示分离的外来体是抗原性完整的。

实施例IV

从沉淀的肿瘤细胞系分离外来体

在本实施例中，醋酸盐沉淀用于从其他的肿瘤细胞系纯化疾病-相关的细胞外微泡，特别是肿瘤外来体。这些包括保藏于the AmericanType Culture Collection的肿瘤细胞系，并因此可以容易地获得标准品用于比较研究。

4T1乳腺癌细胞得自ATCC的CRL-2539^TM。B16黑素瘤细胞得自ATCC的B16-F0(CRL-6322^TM),B16-F1(CRL-6323^TM)和B16-F10(CRL-6475^TM)。TRAMP细胞(其为转基因小鼠前列腺癌细胞)得自ATCC的CRL-2730^TM、CRL-2731^TM和CRL-2732^TM。C4细胞为得自LNCaP细胞系的雄性激素-敏感型人类前列腺腺癌细胞(Wu et al.,1994)，并且可广泛获得。

将均得自ATCC的4T1、B16和TRAMP细胞以及C4细胞分别在最低必需培养基(MEM)中培养，其中所述的培养基补充有L-谷氨酰胺(2mM)、丙酮酸钠(1mM)、青霉素(100U/mL)、链霉素(100μg/mL)、非必需氨基酸和胎牛血清(10％)。将在15mL培养基中大约25x10⁶个各种类型的细胞(4T1、B16、TRAMP和C4)接种于CELLine AD1000烧瓶(Integra Biosciences AG)的下方容器中(第0天)，其中所述的烧瓶的上方容器装有250mL培养基(Mitchell et al.、2008)。接种后的2周开始，从下方容器收集条件培养基(大约15mL)，并且此后每周连续收集。每次都使用15mL磷酸盐-缓冲的生理盐水(PBS)将隔室洗涤1次，并与条件培养基合并。然后，将新鲜的培养基加入至下方容器中。通过使用新鲜的培养基替换大约100mL消耗的培养基每周补充上方容器。

通过顺序离心，清除所收集的条件培养基(在与PBS洗液合并时总计大约30mL)中的细胞、细胞碎片和大的膜囊泡。换言之，将细胞条件培养基首先在500g离心30min(或者在250g离心10min)，并收集上清液，然后对上清液在12000g至13000g下再离心30min。这些步骤提供了清澈的或澄清的上清液。

通过在上述条件下培养大约25x10⁶个4T1、B16、TRAMP、C4(或K1735P)细胞，在培养大约2周后收集总计大约30mL条件培养基(当与PBS洗液合并时)和/或此后每隔一周，通过与1/10体积的醋酸钠缓冲剂(1.0M；pH 4.75)在冰上混合大约30-60min使澄清的上清液沉淀，以及在2000g至5000g离心10min 1次或2次，本发明提供了蛋白质浓度为大约75-125μg/mL的基本纯化的外来体群体。

该方案已经成功地用于K1735P、4T1、B16、TRAMP和C4肿瘤细胞上。还通过FACS分析从此类细胞纯化的肿瘤外来体，并显示是磷脂酰丝氨酸阳性的，如实施例VII和实施例IX中详细描述的那样。

由于至少4T1、B16和TRAMP细胞保藏在ATCC，所以这些细胞与用作使用所述的方案进行比较研究的标准品。在使用醋酸盐沉淀从B16和TRAMP细胞纯化肿瘤外来体中，在所得的外来体中未检测到α2-巨球蛋白(这与K1735细胞相反)。由于B16和TRAMP细胞保藏在ATCC，并且使用醋酸盐沉淀方法得到基本上不具有外来或污染的蛋白质的纯化的外来体，所以认为B16和TRAMP细胞可以特别用作使用本发明的醋酸盐沉淀方法用于比较研究的参照例或标准品。

实施例V

人类肿瘤外来体的分离

本实施例提供了证明醋酸盐缓冲剂的使用在分离人类疾病-相关的细胞外微泡(例如外来体，特别是得自人类患者的肿瘤-衍生的外来体)中是有效的。

A.得自组织培养物的人类肿瘤外来体

从得自人类肿瘤细胞的组织培养物上清液分离外来体。将从腹水分离的人类卵巢癌细胞在CELLine AD1000烧瓶的下方细胞容器中培养。每周收集从下方装有细胞的隔室得到的条件培养基。通过分别在500g和12000g下顺序离心，除去包含外来体的培养基中的细胞、细胞碎片和大的膜囊泡。将1/10体积的醋酸钠缓冲剂(1.0M；pH 4.75)与澄清的上清液混合，并在冰上放置30-60min，然后转移至37℃，再放置5min。将浑浊的悬液在5000g离心10min，并用0.1M醋酸钠缓冲剂将所得的压粒洗涤1次。将悬液再次离心，并将压粒“溶解于”包含2mM EGTA的Hepes-缓冲的生理盐水(pH 7.5)中。将纯化的外来体储存在4℃下。

B.得自患者的人类肿瘤外来体

从得自卵巢癌人类患者的腹水来分离外来体。将腹水(至多～500mL)在500g和12000g离心，从而除去细胞和细胞碎片。在30min至1小时内将1/10体积的醋酸钠缓冲剂(1.0M；pH 4.75)加入至冰冷澄清的腹水中。通过离心来收集沉淀的外来体(5,000g,15min)。根据供者，产率为30至50μg/mL流体。

实施例VI

从血液样品进行肿瘤外来体的分离

本实施例显示醋酸盐缓冲剂的使用还可以用于从人类全血分离疾病-相关的细胞外微泡(例如外来体)，例如分离肿瘤外来体。

将收集于EDTA中的2.5mL人类全血与0.5mL的1.0mg/mL的纯化的肿瘤外来体混合(总计0.5mg)。然后将血液离心，并收集血浆。将一半的血浆保持在冰上，而另一半加热至56℃，并持续3min，从而使纤维蛋白原沉淀。将2种样品在500g离心10min，并收集上清液。加入1/10体积的醋酸钠缓冲剂(1.0M，pH 4.75)。在将样品在0℃下温育60min后，将该样品在500g离心15min，然后将压粒中的外来体溶解于包含2mM EGTA的Hepes-缓冲的生理盐水(pH 7.5)中，并对蛋白质进行定量。

在从掺有500μg肿瘤外来体的全血进行外来体回收的本研究中，从全血浆得到的总蛋白质回收为340μg，其包含肿瘤外来体和醋酸盐-沉淀的纤维蛋白原。从加热的不含纤维蛋白原的血浆得到的总的蛋白质回收为201μg，其代表了总的校正的肿瘤外来体回收。这显示大约40％的肿瘤外来体被回收(从500μg掺杂的外来体得到201μg)。

在另一个研究中，将纯化的外来体直接加入至不含细胞的血浆中，重复上述方案，但是加入260μg纯化的肿瘤外来体。从全血浆得到的蛋白质回收为405μg，其包括肿瘤外来体和醋酸盐-沉淀的纤维蛋白原。从加热的不含纤维蛋白原的血浆得到的蛋白质回收显示基本上100％的肿瘤外来体回收(实际值为288μg蛋白质，对于该初始研究而言，其在试验误差范围内，和/或可以表明额外的血浆蛋白质的沉淀)。

这些研究显示，回收的蛋白质的量的差异很大程度上是由于血浆样品中纤维蛋白原的沉淀。事实上，通过预温育步骤(56℃，3min；Millar et al.,1971；Marx et al.,2008)除去纤维蛋白原将醋酸盐沉淀的样品中的外来蛋白质的水平降低至与针对血清样品获得的相当的水平，并且实质上未损失外来体。如实施例III中关于α2-巨球蛋白所讨论的那样，一旦使用醋酸盐将体积减少至可以处理的体积，则可以通过超速离心容易地除去肿瘤外来体沉淀物中的任何外来的蛋白质。

实施例VII

肿瘤-衍生的外来体的选择性分离

本实施例显示醋酸盐缓冲剂沉淀疾病-相关的细胞外微泡(例如外来体，例如肿瘤-衍生的外来体，其与得自正常细胞的外来体相对)的特异性。该特异性提供了试验室技术以及用于诊断检验和试剂盒的重要的新用途。

从人类患者得到的卵巢癌(肿瘤)细胞和从相同患者得到的正常间皮细胞保持在组织培养物中。在该初始研究中，通过在100000g超速离心1hr的一个步骤，从各个组织培养物上清液回收外来体。超速离心的压粒包含离心的外来体和残余的组织培养物培养基。

将超速离心的压粒再次悬浮于生理盐水中，并通过Bradford测定法定量蛋白质。将从各个再次悬浮的材料得到的等分液放置一旁，从而评估外来体表面上磷脂酰丝氨酸(PS)的存在情况，其通过使用FITC-标记的膜联蛋白5(一种特异的PS标志物)的FACS分析。然后，将从各个再次悬浮的材料得到的分开的等分液与醋酸盐缓冲剂(0.1M,pH 4.75)在0℃下加热1hr。将醋酸盐-沉淀的压粒再次悬浮于生理盐水中至初始体积，并通过Bradford测定法再次定量蛋白质。结果示于表1中。

如表1所示，醋酸盐缓冲剂从卵巢癌细胞特异性地沉淀肿瘤-衍生的外来体，并且实质上未回收到得自正常细胞的外来体。还应该注意，由于本初始研究中仅使用了一个超速离心步骤，所以外来体悬液包含残余的组织培养基。由于醋酸盐沉淀方案为肿瘤外来体-特异性的，所以卵巢癌细胞所引用的回收％是低估的。

使用放置在一旁的等分液，将通过对正常的间皮细胞和从卵巢癌细胞得到的上清液进行超速离心获得的外来体与FITC-膜联蛋白V乳胶珠缀合，并经过FACS分析，从而评估外来体表面上PS的存在情况。如所预计的那样，肿瘤-衍生的外来体在其表面上具有PS，与如图7A中红线(正常的间皮细胞-衍生的外来体)向左迁移相比，这通过蓝线(卵巢癌-衍生的外来体)向右迁移显示。

在相关的研究中，使用醋酸盐沉淀从4T1乳房癌细胞和B16黑素瘤细胞纯化的外来体还经过FACS分析，从而检测表面PS。如图7B和图7C中所示，分别从4T1和B16细胞得到的纯化的外来体实际上是PS-阳性的。

由于这些外来体反映了衍生这些外来体的PS-阳性肿瘤细胞，所以本研究由此证明了醋酸盐缓冲剂通过电荷中和(与负电荷的PS有关，该负电荷的PS存在于肿瘤-衍生的外来体的表面上)而发挥作用的本发明人的推理。在正常的细胞中，PS保持在质膜的内部小叶中，这样从正常细胞衍生的外来体的表面很大程度上缺乏PS。

实施例VIII

PS-阳性的外来体的选择性分离

本实施例显示醋酸盐缓冲剂在沉淀PS-阳性细胞外微泡和外来体(例如疾病-相关的和肿瘤-衍生的细胞外微泡和外来体，适用于外来体，但不适用于PS-阳性的脂质体)中的特异性。

在第一研究中，醋酸盐分离方法(其成功地用于肿瘤-衍生的外来体)适用于从纯的磷脂酰丝氨酸和卵磷脂生成的PS-阳性脂质体。如之前的实例中所示，醋酸盐缓冲剂在沉淀肿瘤-衍生的外来体(其表面上具有PS)中是有效的。相反，将相同的方法学用于其表面上具有PS的相当的脂质体样品不会产生任何明显-可检测的沉淀。

在第二研究中，使用荧光脂质标记PS-阴性和PS-阳性的脂质体群体，从而允许所沉淀的任何量的脂质体被定量。本研究证明即使磷脂脂质体是PS-阳性时，醋酸盐缓冲剂也不会沉淀任何有意义的量的磷脂脂质体。

在本第二研究中，制备荧光脂质体的2个群体：一个群体得自卵磷脂(PC)，而另一个群体得自卵磷脂和磷脂酰丝氨酸的混合物(PC/PS)。通过将1mg卵磷脂与0.1μg荧光成分(N-玫瑰精-磷脂酰乙醇胺(N-rho-PE))在CHCl₃中混合来制备PC脂质体。蒸发溶剂，并将干燥的脂质在20℃在1.0mL的PBS中再次水合30min。对水合的脂质混合物进行涡流处理，然后进行超声处理，从而产生小的单层囊泡。通过相同的技术来制备PC/PS脂质体，不同之处在于起始材料将0.66mg PC和0.33mg二油酰磷脂酰丝氨酸(32mol％)在CHCl₃中与0.1μg N-rho-PE混合。

在分开的PC和PC/PS脂质体的制备物在5000g离心5min，从而除去任何大的可沉淀的脂质体。除去上清液，并将从各制备物得到的0.4mL等分至2个管。分别将0.5mL PBS加入至各管中，然后加入0.1mL的PBS或醋酸盐缓冲剂(1.0M；pH 5.7)。将各管混合，在冰上温育1hr，涡流处理，并除去0.1mL等分液，从而测定总的荧光。接着，将各管在5000g离心5min，并除去从上清液得到的0.1mL等分液，从而测定残余的(非-沉淀的)荧光。

结果示于图8中，其示出即使在磷脂脂质体包含大量的PS时，醋酸盐缓冲剂也不能沉淀磷脂脂质体。

总之，本实施例的数据表明需要PS，但是不足以用于醋酸盐缓冲剂沉淀磷脂囊泡，并且表明用于分离PS-阳性的微泡和外来体(特别是疾病-相关的和肿瘤-衍生的微泡和外来体)的特异性源于醋酸盐缓冲剂与独特的微泡/外来体组合物的相互作用，其中PS在细胞上表达，并且与非-脂质的膜成分(特别是膜蛋白质)有关。这支持了微泡和外来体是细胞-衍生的和/或细胞-分泌的微泡、而不是合成的脂质囊泡的理解。

实施例IX

PS-阳性肿瘤外来体从混合物中的分离

本实施例突显了醋酸盐沉淀方法从包含细胞外微泡和外来体的混合物的样品选择性地分离PS-阳性细胞外微泡，例如外来体，例如肿瘤-衍生的外来体的能力。还显示醋酸盐缓冲剂沉淀肿瘤-衍生的外来体的特异性取决于外来体外膜小叶上PS的表达。

PS-阳性外来体得自表达PS的4T1乳房癌细胞，而PS-阴性外来体得自对应的细胞。通过离心纯化外来体，并使用FITC-膜联蛋白通过FACS分析证明是PS-阳性的或是PS-阴性的(图9A)。

图9A的左图显示膜联蛋白5与醛-活化的乳胶珠(阳性对照)和BSA-封闭的乳胶珠(阴性对照)共价缀合形式的阳性和阴性对照。如图9A的右图所示，当不同的外来体群体与乳胶珠缀合并使用FITC-膜联蛋白5进行标记时，从4T1乳房癌细胞得到的PS-阳性外来体反映了膜联蛋白5珠的阳性对照，而PS-阴性外来体映射了BSA对照的概况，从而显示它们实际上是PS-阴性的。

在进一步超速离心后，使用N-玫瑰精-磷脂酰乙醇胺(N-Rho-PE,红色荧光)标记PS-阴性外来体群体，并使用N-NBD-磷脂酰乙醇胺(N-NBD PE,绿色荧光)标记PS-阳性外来体群体。2个群体经过离心，从而除去残余的未引入的探针，并将样品放置一旁用于FACS分析。

然后，单独地将各种外来体群体、以及PS-阳性和PS-阳性外来体的混合群体与1/10体积的1M的醋酸盐(pH 4.75)在冰上温育1小时。将悬液在2000g离心5分钟，再次溶解于磷酸盐缓冲的生理盐水中，并与醛乳胶珠缀合用于FACS分析(图9B)。

图9B显示在醋酸盐处理之前，单独的和混合群体的强烈的荧光强度(上面一行)。换言之，PS-阴性外来体显示强烈的红色荧光(上方左图的上方左侧一角)，PS-阳性外来体显示强烈的绿色荧光(上方中图的下方右侧一角)，外来体的混合群体是双-阳性的，并且红色荧光和绿色荧光发生迁移(上方右图的上方右侧一角)。但是，在醋酸盐沉淀后，仅回收得到PS-阳性的外来体群体(图9B，下方一行)。可见在沉淀后缺乏红色的PS-阴性群体，即，在醋酸盐中不沉淀(在底部左图中无红色荧光)，而从醋酸盐沉淀物回收得到绿色的PS-群体(在底部中图中的强烈的绿色荧光)。非常重要的是，仅从混合的制备物回收得到PS-阳性外来体(在底部右图中的强烈的绿色荧光，在相应的顶部右图中未见红色荧光)。

因此，这些数据清楚地证明肿瘤外来体的醋酸盐-介导的沉淀取决于外来体表面上PS的表达。

实施例X

磷脂酰丝氨酸在病毒中的表达和重要性

本实施例显示磷脂酰丝氨酸(PS)的存在在使用醋酸盐缓冲剂选择性地分离肿瘤-衍生的细胞外微泡和外来体(与正常的外来体相对)中是重要的区别因素。本实施例概括了从本发明人及其同事得到的数据，证明在正常细胞表面上缺乏的PS暴露于病毒感染的细胞和病毒上，并且在病毒感染中具有重要的作用。

在证明病毒粒子和病毒-感染的细胞的表面上存在PS而使用的方法为流式细胞仪/FACS分析、ELISA、珠消耗、免疫标记、PCR(包括RT-PCR和Q RT-PCR)以及免疫荧光显微镜(表2A和表2B)。这些方法按照下文所列来实施。

在使用与PS结合或靶向PS的抗体(下文称为“靶向PS的抗体”)中，可以利用2类抗体：与PS直接结合的那些(例如Ran et al.,2002中的9D2抗体)，以及与PS间接结合(即，通过血清蛋白质)的那些(例如β₂-糖蛋白I，例如Huang et al.,2005的3G4抗体)，其中抗体、血清蛋白质和PS一起形成紧密结合的复合物。在以下研究中，在血清存在下(或者还可以使用血清蛋白质)实施所有的结合步骤，从而确保2种类型的靶向PS的抗体有效地结合，包括间接结合抗体。

A.流式细胞仪/FACS分析

允许细胞被病毒感染，并且在感染后确定的时间，将细胞与靶向PS的抗体(初级抗体)温育，然后与二级抗体温育，从而检测初级抗体(抗-小鼠或抗-人类)，其中二级抗体与Fluor(例如FITC或TexasRed)缀合。然后，使用甲醛固定细胞，并使用流式细胞仪分析，从而检测荧光事件(因为初级抗体与感染细胞结合)。未被病毒感染的细胞用作阴性对照，从而测定与病毒感染无关的任何背景PS的外化。

B.ELISA(除了埃博拉病毒)

将靶向PS的抗体(初级抗体)涂敷在聚苯乙烯微孔板上。然后洗涤平板，并使用牛血清白蛋白或非加热的灭活的人类血清封闭，从而封闭平板上非-特异性的结合位点，并大规模洗涤。将病毒的稀释液加入至平板中，并使其在室温下结合3小时。然后洗涤平板，并通过加入生物素-缀合的病毒蛋白质-特异性抗体，洗涤，然后加入辣根过氧化物酶来检测与抗体涂敷的平板结合的病毒。使用分光光度计采用比色法来进行过氧化酶活性的定量(其相当于病毒蛋白质的水平)，并与对照标准品比较。

C.ELISA(埃博拉病毒)

将活的埃博拉萨伊病毒(毒株ME718；EBOV)涂敷到聚苯乙烯微板上。将靶向PS的抗体(人类IgG)的稀释液加入至EBOV-涂敷的平板上，并使其在37℃下结合1-2小时。然后，通过加入HRP-缀合的、山羊抗-人IgG来检测结合的靶向PS的抗体。使用分光光度计采用比色法来进行过氧化酶活性的定量(其相当于结合的靶向PS的抗体的水平)，并与同种型匹配的对照比较。

D.珠的耗尽

洗涤涂敷有抗-小鼠的或抗-人的抗体的磁珠，然后分别与小鼠或人类靶向PS的抗体温育。然后，将涂敷的磁珠与纯化的病毒温育。除去磁珠，并通过标准的空斑测试成功在允许细胞上测定溶液中剩余的形成空斑的单位。

E.免疫金标记

通过聚乙二醇(PEG)沉淀来沉淀从感染细胞的上清液得到的病毒粒子，并通过超速离心在蔗糖垫上分离。通过将颗粒与靶向PS的抗体(与6nm的金颗粒缀合)和病毒-特异性抗体(与10nm的金颗粒缀合)温育来测定被靶向PS的抗体对固定化的病毒的结合。对样品进行处理以用于透射电子显微镜，从而显示2种尺寸的金颗粒呈阳性的病毒颗粒。

F.PCR、RT-PCR、Q RT-PCR

将靶向PS的抗体涂敷至聚苯乙烯微量滴定板上。然后洗涤所述的平板，并加入牛血清白蛋白和非-热灭活的人类血清，从而封闭平板上的非-特异性结合位点，然后强烈洗涤。加入病毒的稀释液，并使其在室温下结合3小时。然后洗涤平板，并分离和纯化从病毒(与抗体涂敷的平板连接)得到的病毒核酸(DNA或RNA)。使用病毒-特异性的序列引物，通过PCR/RT-PCR、Q RT-PCR进行病毒基因组的定量。

G.免疫荧光显微镜

附着在盖玻片上的细胞被病毒感染，并通过活细胞与靶向PS的或对照抗体温育、然后通过使用缓冲剂洗涤来除去未结合的抗体，进行靶向PS的或对照的抗体与感染细胞的结合。通过与生物素-缀合的二级抗体温育、然后与FITC-缀合的链霉亲和素温育，来测定靶向PS的和对照抗体的定位。然后，使Triton X-100渗透细胞，并使用与Alexa-594缀合的病毒-特异性抗体(红色)检测病毒颗粒。使用核染色(DAPI)来固封盖玻片，并通过共聚焦显微镜针对各个荧光信号来观察载玻片。

上述方法用于证明PS在从广泛的病毒科得到的病毒和病毒-感染的细胞表面上的存在情况，如表2A和表2B中列出的那样。此外，从本发明人及其同事得到的数据示于表2C和表2D中，从而证明在病毒和病毒-感染的细胞上的这种PS暴露不仅是偶然的，而且在病毒感染中具有重要的作用。其还示出通过靶向PS的抗体在抑制多种病毒科在体外和体内的感染中的用途。

实施例XI

使用醋酸盐缓冲剂分离病毒微泡

本实施例显示使用醋酸盐缓冲剂分离细胞外微泡例如外来体的方法在从病毒-感染的细胞和病毒培养物沉淀细胞外微泡(例如外来体)中也是有效的。

将大约2.5x10⁸个猴肾细胞培养在病毒感染的培养基(DMEM，2％胎牛血清，以及抗生素和杀真菌药)中，并且平均分成3个群体(各群体总计1000mL培养基，对于各群体，分散至大约25个T225烧瓶中)。在2天中大约2倍增后，第一细胞群体被模拟感染，作为阴性对照；第二细胞群体以0.1感染复数(MOI)，被猿猴空泡病毒40(SV40)毒株Pa-57,LN L1412A感染；以及第三细胞群体以0.05MOI，被单纯疱疹病毒-1(HSV-1)毒株F,LN H1411B感染。SV40为多瘤病毒科的非-包膜的病毒，并且HSV-1为疱疹病毒科的包膜病毒。

分别在感染后的第4、7和3天收获模拟、SV40和HSV-1感染。首先通过低速离心除去细胞和细胞碎片(1000g，30min)，通过在12000g进一步离心30min从这些上清液中除去大的颗粒。从各感染物得到的上清液的等分液放置一旁用于定量感染性病毒。

从模拟、SV40和HSV-1感染物得到的各个澄清的上清液分别与1/10体积的醋酸钠(1.0M；pH 4.75)混合，在冰上放置60min，然后在12000g离心30min。模拟、SV40和HSV-1上清液均分别保持，并使用1M NaOH中和。将从模拟、SV40和HSV-1感染物得到的任何醋酸盐-沉淀的压粒分别再次悬浮于最终体积为大约2ml的再次悬浮缓冲剂(10mM Tris,pH 7.5,115mM NaCl,1mM EGTA)中，注意酸性被完全中和(如果需要，包括通过额外的悬浮和离心步骤)。从这些醋酸盐沉淀物得到的上清液和再次悬浮的压粒的等分液放置一旁，用于定量感染性病毒。

从醋酸盐沉淀物(施加于模拟、SV40和HSV-1感染物中)得到的可视结果分别示于图10A、图10B和图10C中。可见，在从模拟的感染物中几乎未见到压粒(图10A)，醋酸盐沉淀方案产生了从SV40(图10B)和HSV-1(图10C)感染物得到的相当大的可见的压粒。

实施例XII

分离的病毒微泡在很大程度上是无病毒的

本实施例显示通过醋酸盐沉淀从病毒-感染的细胞和病毒培养物得到的细胞外微泡(例如外来体)实质上不具有感染性病毒。

在之前实施例的研究中，使用TCID₅₀测试法(其检验感染性)定量在醋酸盐沉淀之前感染的SV40和HSV-1病毒的量、以及在醋酸盐沉淀后上清液和压粒中剩余的感染性病毒的量。TCID₅₀为感染性病毒效价的量度。这种终点稀释测试法定量了在50％接种的组织培养物细胞中产生细胞病变作用所需的病毒的量(在这种情况下为猴肾细胞)。TCID₅₀与空斑形成单位(PFU)之间的理论关系为1TCID₅₀等于0.69PFU。结果列于表3中。

如表3所示，可见1000ml包含SV40的培养基具有总计5.8x10¹¹的IU的病毒。在经过醋酸盐沉淀后，合并的上清液和压粒中的病毒的量为2.15x10⁹，表明在上述过程中除去和/或灭活了5.7785x10¹¹IU的SV40病毒。因此，在醋酸盐沉淀过程中除去和/或灭活了99.63％感染的SV40病毒。在醋酸盐沉淀后剩余的0.37％感染的SV40病毒中，92.5％处于上清液中，这样，在原始的起始材料中，仅0.028％的感染的SV40病毒存在于压粒中。

类似地，如表3中针对HSV-1所示，1000ml包含HSV-1的培养基具有总计5.8x10¹⁰IU的病毒。在经过醋酸盐沉淀后，合并的上清液和压粒中的病毒的量为1.063x10⁹，表明在上述过程中除去和/或灭活了5.694x10¹⁰IU的HSV-1病毒。在这种情况下，在醋酸盐沉淀过程中，除去和/或灭活了98.17％的感染的HSV-1病毒。在醋酸盐沉淀后剩余的1.83％感染的HSV-1病毒中，93.7％处于上清液中，这样在原始的起始材料中，仅0.11％感染的HSV-1病毒存在于压粒中。

为了通过醋酸盐沉淀方法制备病毒-衍生的外来体和/或微泡，因此有利的是在图10B和图10C中观察的相当大的压粒在实质上均是不具有感染性病毒的。

实施例XIII

分离的病毒微泡的进一步表征

本实施例报告了使用醋酸盐沉淀分离的病毒-衍生的细胞外微泡和外来体的初步表征结果。

A.梯度纯化

尽管使用不同的术语，Szilagyi和Cunningham(1991)报告了目前被称为病毒-衍生的外来体或微泡的、非-感染的、HSV-1薄膜颗粒的存在。使用HSV-1的5-15％梯度纯化，他们观察到颗粒的2个条带：锐的下方条带，和更弥漫的上方条带(参见Szilagyi andCunningham,1991中的图1)。报告下方条带(称为重的或H颗粒)包含几乎专门的HSV-1病毒粒子，而上方条带据说包含主要的非感染性包膜颗粒(称为轻的或L颗粒)，但是交叉污染有0.1至0.5％感染性H颗粒(参见Szilagyi and Cunningham,1991中的表1)。报告L颗粒在外观上类似于病毒粒子，但是缺乏病毒核壳体，并且不受感染性的。正是这些“L颗粒”现在被称为病毒-衍生的微泡或外来体。

通常根据Szilagyi和Cunningham(1991)的技术，使从HSV-1感染的醋酸盐沉淀得到的再次悬浮的压粒样品实施5-15％梯度。再次悬浮的压粒材料分层至5-15％400的35ml预形成的梯度中，其中所述的5-15％400悬浮于改进培养基中，并且在4℃下在26000g离心2小时。观察到在5％Ficoll级份(F5)的上方存在1个条带，并且在15％级份(F15)的上方观察到1个条带，2个条带都是肉眼可见的。它们类似于Szilagyi and Cunningham(1991)所报告的轻带(F5)和重带(F15)，不同之处在于本研究中的F15条带是更弥漫的。

通过使用注射器上的针刺穿管的侧面，从而分别除去2个条带中的材料。使用上文所述的相同的TCID₅₀测试法，取得等分液用于定量感染性病毒。在加载至梯度的感染性病毒中，仅从轻的F5级份除去大约0.2％。

B.FACS分析

然后，将从模拟和SV40感染的醋酸盐沉淀得到的再次悬浮的压粒样品、以及从HSV-1醋酸盐沉淀的分离得到的2个级份(F5和F15)经过FACS分析。将不同的级份(均为15μg蛋白质)与乳胶珠结合，并使用以下检测试剂通过FACS分析。

对于SV40病毒抗原而言，使用SV40VP1的兔多克隆抗体，其为主要的衣壳蛋白；而对于HSV-1病毒抗原而言，使用HSV gB的小鼠单克隆抗体，其为已知在病毒粒子(H)和所谓的L颗粒中存在的表面糖蛋白。使用与荧光探针别藻蓝蛋白(APC)缀合的抗-兔和抗-小鼠抗体，分别检测SV40和HSV-1抗体。由于CD63为外来体中存在的膜结合的蛋白质，所以使用与藻红蛋白(PE)缀合的抗CD63抗体，检测微泡或外来体。使用与FITC缀合的膜联蛋白V来检测PS。阴性对照包括与PE或APC缀合的BSA-乳胶珠和同种型对照抗体。

从模拟感染(标记的猴肾细胞)、SV40感染、以及得自HSV-1感染的F5和F15级份得到的醋酸盐压粒FACS分析的比较结果示于图11A、图11B和图11C中。从图11A可见醋酸盐沉淀的样品保持对各个病毒抗原的阳性(HSV gB和SV40VP1)。与从模拟感染测定的背景相比，SV40和HSV-1醋酸盐沉淀物均对外来体标志物(CD63(图11B)和PS)也是阳性的，如与膜联蛋白V的结合所示(图11C)。对于HSV-1再次悬浮的醋酸盐压粒(其进一步分级成重带(F15)和轻带(F5))，在F5级份中识别CD63和PS，其与文献中报告的L颗粒匹配(Szilagyi and Cunningham,1991)。

总之，这些数据因此符合从被薄膜的和非-包膜的病毒感染的细胞分离实质上非-感染性的PS-阳性的细胞外微泡和外来体。

根据本发明公开，在无需过度试验的条件下可以制备和实施本文所公开和要求的所有组合物和方法。尽管根据优选的实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是对本领域的那些技术人员显而易见的是在不脱离本发明的概念、精神和范围的条件下，在本文所述的组合物、方法、以及方法的步骤或方法步骤的顺序中可以进行改变。更具体而言，显而易见的是化学和生理学相关的某些试剂可以取代本发明所述的试剂，同时取得相同的或相似的结果。认为所有这些对于本领域的那些技术人员显而易见的相似的取代和修改都在所附的权利要去书定义的本发明的精神、范围和概念之内。

参考文献

以下参考文献(其程度为它们提供了补充本发明列出的那些的示例性程序或其他详情)以引用方式特定地引入本文。

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Claims

1.一种从生物流体分离疾病-相关的细胞外微泡的方法，其中所述的疾病-相关的细胞外微泡在其表面上具有带负电荷的磷脂酰丝氨酸；所述的方法包括将所述的生物流体的样品与以有效地从所述的生物流体沉淀疾病-相关的细胞外微泡的pH和浓度的醋酸盐缓冲剂接触，以及从所述的沉淀物收集疾病-相关的细胞外微泡，从而分离所述的疾病-相关的细胞外微泡。

2.权利要求1所述的方法，其中在所述的疾病-相关的细胞外微泡的表面上的磷脂酰丝氨酸与非-脂质的膜成分相连存在，并且其中所述的非-脂质的膜成分包含膜蛋白。

3.权利要求1或2所述的方法，其中所述的醋酸盐缓冲剂中和所述的疾病-相关的细胞外微泡上的磷脂酰丝氨酸的表面电荷，由此从所述的生物流体沉淀所述的疾病-相关的细胞外微泡。

4.任何上述权利要求所述的方法，其中所述的生物流体包含细胞外微泡的混合群体，其中包括疾病-相关的和正常的细胞外微泡，并且其中所述的方法从所述的混合群体中选择性地沉淀所述的疾病-相关的细胞外微泡，这与所述的正常的细胞外微泡相反。

5.任何上述权利要求所述的方法，其中所述的疾病-相关的细胞外微泡在基本上不破坏其形态学特征或功能特征或者细胞表面抗原的条件下被分离。

6.任何上述权利要求所述的方法，其中所述的细胞外微泡为外来体。

7.权利要求1至6的任意一项所述的方法，其中所述的疾病-相关的细胞外微泡衍生自被细胞内寄生虫感染的细胞。

8.权利要求1至6的任意一项所述的方法，其中所述的疾病-相关的细胞外微泡衍生自病毒-感染的细胞。

9.权利要求8所述的方法，其中所述的方法从病毒-感染的细胞分离疾病-相关的细胞外微泡，其中所述的病毒-感染的细胞疾基本上不具有感染性病毒。

10.权利要求1至6的任意一项所述的方法，其中所述的疾病-相关的细胞外微泡为肿瘤-衍生的细胞外微泡。

11.权利要求10所述的方法，其中所述的肿瘤-衍生的细胞外微泡衍生自黑素瘤、结肠直肠癌、肺癌、胰腺癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌或卵巢癌。

12.权利要求10或11所述的方法，其中所述的肿瘤-衍生的细胞外微泡为肿瘤-衍生的外来体。

13.任何上述权利要求所述的方法，其中所述的疾病-相关的细胞外微泡为人类细胞外微泡。

14.任何上述权利要求所述的方法，其中所述的醋酸盐缓冲剂的pH为大约4.25至大约5.25。

15.权利要求14所述的方法，其中所述的醋酸盐缓冲剂的pH为大约4.5至大约5.0。

16.权利要求15所述的方法，其中所述的醋酸盐缓冲剂的pH为大约4.75。

17.任何上述权利要求所述的方法，其中所述的醋酸盐缓冲剂在所述的样品中的最终浓度为大约0.05M至大约0.25M。

18.权利要求17所述的方法，其中所述的醋酸盐缓冲剂在所述的样品中的最终浓度为大约0.05M至大约0.1M。

19.权利要求17所述的方法，其中将1/10体积的1.0M醋酸盐缓冲剂加入至所述的样品中。

20.任何上述权利要求所述的方法，其中所述的醋酸盐缓冲剂的pH为大约4.25至大约5.25，并且在所述的样品中的最终浓度为大约0.05M至大约0.25M。

21.任何上述权利要求所述的方法，其中所述的醋酸盐缓冲剂的pH为大约4.5至大约5.0，并且在所述的样品中的最终浓度为大约0.05M至大约0.1M。

22.任何上述权利要求所述的方法，其中所述的醋酸盐缓冲剂的pH为大约4.75，并且在所述的样品中的最终浓度为大约0.1M。

23.任何上述权利要求所述的方法，其中所述的醋酸盐缓冲剂包括醋酸钠。

24.任何上述权利要求所述的方法，其中所述的醋酸盐缓冲剂包括醋酸钾。

25.任何上述权利要求所述的方法，其中所述的醋酸盐缓冲剂实质上不具有除了聚合物以外的体积。

26.任何上述权利要求所述的方法，其中所述的醋酸盐缓冲剂实质上不具有聚乙二醇。

27.任何上述权利要求所述的方法，其中所述的醋酸盐缓冲剂为醋酸钠，pH为大约4.75，并且在所述的样品中的最终浓度为大约0.1M。

28.任何上述权利要求所述的方法，其中所述的生物流体为鼠、牛或人类生物流体。

29.任何上述权利要求所述的方法，其中所述的生物流体为细胞培养物上清液、全血、血清、血浆、腹水、脑脊液、骨髓穿刺液、支气管肺泡洗液、尿、精液、阴道分泌物、黏液、唾液、痰或者从生物组织样品得到的澄清的裂解液。

30.权利要求29所述的方法，其中所述的生物流体为细胞培养物上清液,血清,血浆或腹水。

31.权利要求29所述的方法，其中所述的生物流体为澄清的细胞培养物上清液，其已经经过低速离心。

32.权利要求29所述的方法，其中所述的生物流体为细胞培养物上清液，其得自在包含非-肿瘤细胞外微泡的血清存在下培养的肿瘤细胞。

33.权利要求29所述的方法，其中所述的生物流体为细胞培养物上清液，其得自在非-人类血清存在下培养的人类肿瘤细胞。

34.权利要求29所述的方法，其中所述的生物流体为细胞培养物上清液，其得自在牛或胎牛血清存在下培养的小鼠或人类肿瘤细胞。

35.任何上述权利要求所述的方法，其进一步包括以下步骤，将所述的生物流体经过低速离心从而除去细胞、细胞碎片和大的膜囊泡，然后与所述的醋酸盐缓冲剂接触。

36.任何上述权利要求所述的方法，其中包含所述的疾病-相关的细胞外微泡的沉淀物在与所述的醋酸盐缓冲剂接触后，通过低速离心收集。

37.任何上述权利要求所述的方法，其进一步包括将所收集的包含所述的疾病-相关的细胞外微泡的沉淀物再次悬浮于大约中性pH的基本上不具有醋酸盐的缓冲剂中，从而提供疾病-相关的细胞外微泡的分离群体。

38.权利要求37所述的方法，其进一步包括对所述的疾病-相关的细胞外微泡的分离群体进行离心，从而除去污染性成分，由此提供疾病-相关的细胞外微泡的基本纯的组合物。

39.权利要求12所述的方法，其中所述的方法包括：

(b)将所述的生物流体与以有效地从所述的生物流体选择性地沉淀肿瘤-衍生的外来体、而并非非-肿瘤外来体的pH和浓度的醋酸盐缓冲剂接触。

(c)从步骤(b)收集所述的沉淀物，其中所述的沉淀物选择性地包含所述的肿瘤-衍生的外来体；以及

(d)在大约中性的pH下，使所述的沉淀物再次悬浮于基本上不含醋酸盐的缓冲剂中，从而提供实质上不具有非肿瘤外来体的肿瘤-衍生的外来体的纯化群体。

40.权利要求39所述的方法，其中所述的方法包括：

(b)对所述的生物流体实施第一低速离心，从而提供实质上不具有细胞、细胞碎片和大的膜囊泡的澄清的流体；

(c)在有效地提供浑浊悬液的pH和浓度下、以及在有效地提供浑浊悬液的时间内，将所述的澄清的流体与醋酸盐缓冲剂温育，其中所述的悬液包含选择性沉淀的肿瘤-衍生的外来体，但是基本上不包含沉淀的非-肿瘤的外来体；

(d)对所述的浑浊悬液进行低速离心，从而提供沉淀物和上清液，其中所述的沉淀物选择性地包含所述的肿瘤-衍生的外来体；

(e)收集包含所述的肿瘤-衍生的外来体的沉淀物；

(f)在大约中性pH下，将所述的沉淀物再次悬浮于基本上不含醋酸盐的缓冲剂中，由此提供纯化的外来体群体，该群体包含肿瘤-衍生的外来体，并且实质上不具有非-肿瘤的外来体；以及可任选地

(g)对所述的纯化的外来体群体进行进一步的离心，从而提供包含非-外来体的成分的压粒，并除去所述的压粒，由此提供肿瘤-衍生的外来体的基本纯的组合物，其中所述的组合物基本上不具有非-肿瘤的外来体和非-外来体成分。

41.任何上述权利要求所述的方法，其进一步包括在所述的疾病-相关的细胞外微泡中识别或定量至少第一生物标志物。

42.权利要求41所述的方法，其中所述的生物标志物为RNA、micro RNA、DNA或蛋白质生物标志物。

43.一种从生病的细胞的上清液获得疾病-相关的细胞外微泡的方法，其中所述的生病的细胞是在包含正常的细胞外微泡的血清存在下培养的，其中所述的疾病-相关的细胞外微泡在其表面上具有带负电荷的磷脂酰丝氨酸；所述的方法包括将所述的上清液与以有效地从所述的上清液沉淀疾病-相关的细胞外微泡的pH和浓度的醋酸盐缓冲剂接触，以及收集所述的沉淀物，从而从所述的上清液获得疾病-相关的细胞外微泡，而基本上不被所述的血清中的正常的细胞外微泡污染。

44.权利要求43所述的方法，其中所述的生病的细胞为在牛或胎牛血清的存在下培养的小鼠或人类肿瘤细胞。

45.一种制备基本上不具有疾病-相关的细胞外微泡的血清的方法，其中所述的疾病-相关的细胞外微泡在其表面上具有带负电荷的磷脂酰丝氨酸；所述的方法包括：

(a)获得疑似包含疾病-相关的细胞外微泡的血清；

(b)将所述的血清与以有效地从所述的血清中沉淀疾病-相关的细胞外微泡的pH和浓度的醋酸盐缓冲剂接触；以及

(c)从所述的血清中除去在步骤(b)中形成的沉淀物，其中所述的沉淀物包含所述的疾病-相关的细胞外微泡，由此提供基本上不具有疾病-相关的细胞外微泡的血清。

46.权利要求43或45所述的方法，其中所述的疾病-相关的细胞外微泡衍生自病毒-感染的细胞。

47.权利要求43或45所述的方法，其中所述的疾病-相关的细胞外微泡为肿瘤-衍生的外来体。

48.一种制备基本上不具有感染性病毒和细胞外微泡的血液、血清或血浆的方法，其中所述的细胞外微泡衍生自病毒-感染的细胞，所述的方法包括：

(a)获得疑似包含感染性病毒和细胞外微泡的血液、血清或血浆，其中所述的细胞外微泡衍生自病毒-感染的细胞；

(b)将所述的血液、血清或血浆与以有效地灭活或沉淀所述的感染性病毒、以及从所述的血液、血清或血浆沉淀所述的细胞外微泡的pH和浓度的醋酸盐缓冲剂接触；以及

(c)从所述的血液、血清或血浆中除去在步骤(b)中形成的所述的沉淀物，其中所述的沉淀物包含灭活的或沉淀的病毒，和所述的沉淀的细胞外微泡，由此提供基本上不具有感染性病毒和细胞外微泡的血液、血清或血浆，其中所述的细胞外微泡衍生自病毒-感染的细胞。

49.权利要求48所述的方法，其中所述的方法是在输血之前实施的。

50.一种检测澄清的生物流体中的疾病-相关的细胞外微泡的方法，其中所述的疾病-相关的细胞外微泡在其表面上具有带负电荷的磷脂酰丝氨酸；所述的方法包括将所述的澄清的生物流体与以有效地从所述的澄清的生物流体选择性地沉淀疾病-相关的细胞外微泡的pH和浓度的醋酸盐缓冲剂接触，以及测定所得的生物流体中存在的浑浊度；其中所得的生物流体中存在的浑浊度表明检测到疾病-相关的细胞外微泡。

51.权利要求50所述的方法，其中在所得的生物流体中存在的浑浊度是目测的。

52.权利要求50所述的方法，其中所述的疾病-相关的细胞外微泡为肿瘤-衍生的外来体。

53.权利要求52所述的方法，其进一步包括从具有可检测的浑浊度的所得的生物流体中分离所述的肿瘤-衍生的外来体。

54.权利要求53所述的方法，其中所述的肿瘤-衍生的外来体是通过使用低速离心收集所述的沉淀物，从具有可检测的浑浊度的所得的生物流体分离得到的。

55.一种对患者进行诊断的方法，其中所述的患者具有通过存在疾病-相关的细胞外微泡来表征的第一疾病，其中所述的细胞外微泡在其表面上具有带负电荷的磷脂酰丝氨酸；所述的方法包括检测从所述的患者得到的生物流体中所述的疾病-相关的细胞外微泡的存在情况，由此将所述的患者诊断为患有所述的第一疾病；其中所述的疾病-相关的细胞外微泡是通过以下方法检测的：

(a)将所述的生物流体与以有效地从所述的生物流体选择性地沉淀所述的疾病-相关的细胞外微泡的pH和浓度的醋酸盐缓冲剂接触；以及

(b)测定所得的生物流体中所述的沉淀物的存在情况，其中所得的生物流体中所述的沉淀物的存在表明检测到所述的疾病-相关的细胞外微泡。

56.权利要求55所述的方法，其中所述的生物流体是澄清的生物流体，并且其中在所得的生物流体中所述的沉淀物的存在是通过所得的生物流体中存在的浑浊度来测定的。

57.权利要求55所述的方法，其中对所述的疾病-相关的细胞外微泡的量进行定量。

58.一种监测患者的疾病负担的方法，其中所述的患者具有通过存在疾病-相关的细胞外微泡来表征的第一疾病，其中所述的细胞外微泡在其表面上具有带负电荷的磷脂酰丝氨酸；所述的方法包括测量从所述的患者得到的生物流体中所述的疾病-相关的细胞外微泡的量；其中所述的疾病-相关的细胞外微泡的量是通过以下方法测量的：

(b)测量所述的沉淀物中所述的疾病-相关的细胞外微泡的量。

59.权利要求55或58所述的方法，其中所述的第一疾病的鉴定是通过检验所述的第一疾病的生物标志物或临床迹象来证实的。

60.权利要求55或58所述的方法，其中所述的第一疾病为病毒感染。

61.权利要求55或58所述的方法，其中所述的第一疾病为癌症，并且其中所述的疾病-相关的细胞外微泡为肿瘤-衍生的外来体。

62.权利要求61所述的方法，其中肿瘤-衍生的外来体的量是在一系列生物流体样品中测量的，其中所述的生物流体样品是在多个时间点从所述的患者得到的；并且其中肿瘤-衍生的外来体的量的增加表明肿瘤-负担增加，并且所述的肿瘤-衍生的外来体的量的降低表明肿瘤-负担降低。

63.一种以有效地用于诊断的pH和浓度的醋酸盐缓冲剂，其中所述的诊断是通过从生物流体沉淀疾病-相关的细胞外微泡进行的，其中所述的细胞外微泡在其表面上具有带负电荷的磷脂酰丝氨酸。

64.一种以有效地用于治疗的pH和浓度的醋酸盐缓冲剂，其中所述的治疗是通过从生物流体沉淀疾病-相关的细胞外微泡进行的，其中所述的细胞外微泡在其表面上具有带负电荷的磷脂酰丝氨酸。

65.一种用于从生物流体中分离疾病-相关的细胞外微泡的试剂盒，其中所述的疾病-相关的细胞外微泡在其表面上具有带负电荷的磷脂酰丝氨酸；所述的试剂盒包含以有效地从生物流体沉淀所述的疾病-相关的细胞外微泡的pH和浓度的醋酸盐缓冲剂，以及使用说明书。

66.权利要求65所述的试剂盒，其中所述的试剂盒至少进一步包含用于识别或定量疾病-相关的细胞外微泡中的一种或多种生物标志物的第一试剂。