KR20190070227A - 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성을 평가하는 방법 - Google Patents

엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성을 평가하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 평가 방법은 생물학적 용액으로부터 분리 정제된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성을 시험관내(in vitro) 조건에서 간편하면서도 신속하게 효율적으로 평가할 수 있다. 본 발명의 평가 방법은 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성을 간편하면서 신속하게 정량적으로 평가할 수 있어 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 각 생산 단계별 품질 관리 및 최종 생산품의 품질 관리에 적합하다. 또한, 본 발명의 평가 방법은 전술한 바와 같은 기능적 활성 평가를 통해 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 임상 내지는 산업적으로 적용가능한 품질(quality)을 갖는지 여부를 간편하면서도 신뢰도 높게 평가할 수 있다.

Description

엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성을 평가하는 방법 {A method to evaluate functional activity of exosome and/or extracellular vesicle}
본 발명은 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성을 평가하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 생물학적 용액으로부터 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성을 시험관내(in vitro) 조건에서 간편하면서도 신속하게 효율적으로 평가할 수 있는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 각 생산 단계별 품질 관리 및 최종 생산품의 품질 관리를 위해, 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성을 간편하면서 신속하게 정량적으로 평가할 수 있는 방법에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 전술한 바와 같은 기능적 활성 평가를 통해 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 임상 내지는 산업적으로 적용가능한 품질(quality)을 갖는지 여부를 간편하면서도 높은 수준의 신뢰도로 평가하는 방법에 관한 것이다.
최근 세포 분비물(secretome)에 세포의 거동을 제어하는 다양한 생체활성인자가 포함되어 있다는 연구가 보고되고 있으며, 특히 세포 분비물 내에는 세포 간 신호전달 기능을 갖는 나노소포체인 '엑소좀(exosome)' 또는 '세포외 소포체(extracellular vesicle)'가 포함되어 있어 그 성분과 기능에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다.
세포는 세포외 환경에 다양한 막(membrane) 유형의 소포체를 방출하는데, 통상 이러한 방출 소포체들을 세포외 소포체(Extracellular vesicles, EV)라고 부르고 있다. 세포외 소포체는 세포막 유래 소포체, 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 엑소좀 등으로 불려지기도 하며, 경우에 따라서는 엑소좀과는 구별되어 사용되기도 한다.
엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, mRNA, miRNA, DNA 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 거동을 조절한다고 알려져 있다. 엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있다. 증식하는 줄기세포 유래 엑소좀의 경우 세포의 이동, 증식 및 분화와 같은 세포 거동, 조직 재생과 관련된 줄기세포의 특성이 반영되어 있다(Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).
엑소좀 및/또는 세포외 소포체는 다양한 동물, 식물, 균류(fungi), 조류(algae) 등의 세포로부터 방출 또는 분비되고, 예를 들어 세포 배양액, 세포 배양 상청액, 줄기세포 배양액, 줄기세포 배양 상청액, 전혈, 혈청, 제대혈, 혈장, 복수액, 뇌 및 뇌척수액, 태반 추출액 및 골수 흡입물 등과 같은 생물학적 용액 내에 분산, 현탁, 침전, 부유 또는 혼합되어 있다. 이와 같이 생물학적 용액 내에 존재하는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는 다양한 분리방법에 의해 분리 및 정제될 수 있다. 지금까지 알려진 엑소좀 또는 세포외 소포체를 분리하는 방법으로는 예를 들어, 초원심분리법(ultracentrifugation), 밀도구배원심법(density gradient centrifugation), 초미세여과법(ultrafiltration), 사이즈 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 이온교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography), 면역친화성 분리법(immunoaffinity capture), 미세유체기술 분리법(microfluidics-based isolation), 침전법(exosome precipitation), 총엑소좀 추출 키트(total exosome isolation kit), 또는 폴리머 기반 침전법(polymer based precipitation) 등이 있다.
그런데, 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는 세포의 기원 및 종류, 세포의 생장, 증식, 분화, 사멸, 불멸화 등의 상태에 따라 그 특성이나 기능 등이 다른 것으로 알려져 있다. 또한, 세포의 배양 상태, 배양 조건, 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 분리 방법 및 조건 등에 의해서도 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 특성이나 기능 등이 달라질 수 있다. 예를 들어, 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 분리에 통상 사용되는 초원심분리법(ultracentrifugation)은 분리과정에서 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 손상을 줄 수 있다. 따라서, 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능이나 활성을 유지하면서 분리 정제하는 것은 매우 중요하며, 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 특성, 기능 및 품질을 관리하고 평가하는 것 역시 중요하다.
엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 이용하여 특정 질병을 진단하거나 특정 질병의 치료에 응용하고자 하는 연구들이 있다. 그러나 질병 진단이나 치료에 응용되는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 특성, 기능 및 품질을 평가하는 표준화된 방법은 없다. 지금까지는 분리 정제된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 입자 크기 및 입자수 측정, 마커 분석, miRNA와 같은 카고 분석을 통해 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 특성화(characterization)하고 있지만, 마커나 miRNA의 기능 및 역할에 대해서는 보다 심층적인 연구가 필요한 상황이다.
특히, 임상이나 산업적 응용을 위해서는 분리 정제된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 품질(quality)을 신뢰도 높게 객관적으로 평가하는 것이 필요하다. 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 객관적인 품질 평가를 위해서는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 형태, 크기, 수 등의 물리적 성질, 표면 마커나 내부 마커 등의 생물학적 성질, 단백질 함량 등의 생화학적 성질, 잔류 불순물의 양 뿐만 아니라 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성 평가(functional activity test)가 매우 중요하다. 특히, 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 산업적으로 응용하기 위해서는 각 생산 단계별 품질 관리 뿐만 아니라 최종적으로 생산된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성 평가가 필수불가결한 요소이다. 그러나, 현재까지 산업적으로 이용가능한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성 평가 방법에 대한 연구는 매우 미진한 상황이다.
한편, 상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 본 발명의 "선행 기술"로서 이용될 수 있다는 승인으로서 인용한 것은 아님을 이해하여야 한다.
대한민국 공개특허공보 제10-2015-0145720호 (2015.12.30) 대한민국 공개특허공보 제10-2016-0116802호 (2016.10.10) 국제공개공보 WO 2015/131153 (2015.09.03)
Lotvall et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 2014;3:26931 (2014.12.22)
본 발명의 목적은 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성을 평가하는 방법을 제공하는데 있다. 구체적으로, 본 발명의 목적은 생물학적 용액으로부터 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성을 시험관내(in vitro) 조건에서 간편하면서도 신속하게 효율적으로 평가할 수 있는 방법을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 각 생산 단계별 품질 관리 및 최종 생산품의 품질 관리를 위해, 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성을 간편하면서 신속하게 정량적으로 평가할 수 있는 방법을 제공하는데 있다.
추가로, 본 발명의 또 다른 목적은 전술한 바와 같은 기능적 활성 평가를 통해 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 임상 내지는 산업적으로 적용가능한 품질(quality)을 갖는지 여부를 간편하면서도 높은 수준의 신뢰도로 평가하는 방법을 제공하는데 있다.
그러나, 전술한 바와 같은 본 발명의 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포 밖의 자극유발인자에 의한 자극에 의해 NO(nitric oxide)를 생성할 수 있는 세포를 준비하는 단계와, 상기 세포에 상기 자극유발인자를 처리하는 단계와, 상기 자극유발인자의 처리와 동시에 또는 처리 전후에 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 상기 세포에 처리하는 단계와, 시험관내(in vitro) 조건 하에서 상기 세포에 의해 생성되는 NO(nitric oxide) 생성량의 변화를 측정하는 단계를 포함하는, 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성 평가 방법을 제공한다.
본 명세서에서 용어, "세포외 소포체(Extracellular vesicles, EV)"는 세포막 유래 소포체(membrane vesicles), 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 또는 이의 등가물을 포괄하는 의미로 사용된다.
본 명세서에서 용어, "엑소좀(exosomes)"은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터(바람직하게는 대략 30~200 nm) 크기의 소포체를 의미하며(단, 분리 대상이 되는 줄기세포 종류, 분리 방법 및 측정방법에 따라 엑소좀의 입자 크기는 가변될 수 있음)(Vasiliy S. Chernyshev et al., "Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes", Anal Bioanal Chem, (2015) DOI 10.1007/s00216-015-8535-3), 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, mRNA, miRNA, DNA 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 거동을 조절한다고 알려져 있다.
본 발명의 명세서에서 사용된 용어, "생물학적 용액"은 생물기원의 액체 용액으로서 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 분산, 현탁, 침전, 부유 또는 혼합되어 있는 용액을 의미하고, 예를 들어 세포 배양액, 세포 배양 상청액, 줄기세포 배양액, 줄기세포 배양 상청액, 전혈, 혈청, 제대혈, 혈장, 복수액, 뇌 및 뇌척수액, 태반 추출액 및 골수 흡입물 등을 들 수 있다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니고 다양한 동물, 식물, 균류(fungi), 조류(algae) 등 다양한 생물 기원의 용액을 배제하는 것이 아님은 물론이다. "생물학적 용액"은 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 방출 및/또는 분비시키는 조건 하에서 배양 또는 인큐베이션될 수 있고, 냉동 및 해동될 수도 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성 평가 방법은, 상기 세포를 배양한 후 세포 배양액에 상기 자극유발인자 및 상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 첨가하고, 시험관내(in vitro) 조건 하에서 상기 세포에 의해 생성되는 NO(nitric oxide) 생성량이 변화하는지 여부를 분석하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성 평가 방법에 있어서, 상기 NO(nitric oxide) 생성량은 상기 세포 배양액으로 분비된 NO(nitric oxide) 양을 측정하여 산출할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성 평가 방법에 있어서, 상기 NO(nitric oxide) 생성량이 감소 또는 증가하면 상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 기능적 활성을 갖는 것으로 평가할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성 평가 방법에 있어서, 상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 기능적 활성을 갖는 경우, 상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는 농도의존적으로 상기 NO(nitric oxide) 생성량을 감소 또는 증가시킬 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성 평가 방법에 있어서, 상기 자극유발인자는 염증유발인자일 수 있다. 본 발명을 한정하지 않는 예시로서, 상기 자극유발인자는 LPS(Lipopolysaccharide), 펩티도글리칸, 사이토카인(cytokines), L-아르기닌(L-arginine), 브래디키닌(bradykinin), 뒤틀림 스트레스(sheer stress), 히스타민(histamine), 트롬빈(thrombin), ADP, 아세틸콜린(acetylcholine), 산화제(oxidant), 알레르겐(allergen), 세균 및 바이러스로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성 평가 방법에 있어서, 상기 세포는 인간 또는 동물 유래의 마크로파지, 인간 또는 동물 유래의 모노사이트, RAW264.7 세포, 인간 유래 모노사이트 세포주인 THP-1, 인간 유래 마크로파지 세포주인 U937, 또는 기타 외부 자극에 의해 NO(nitric oxide)를 생산할 수 있는 세포, 예를 들어 NOS(nitric oxide synthase)를 갖는 세포 중 적어도 1종일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성 평가 방법에 있어서, 상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는 생물학적 용액, 예를 들어 세포 배양액으로부터 분리된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성 평가 방법에 있어서, 상기 생물학적 용액은 세포 배양액, 세포 배양 상청액, 줄기세포 배양액, 줄기세포 배양 상청액, 전혈, 혈청, 제대혈, 혈장, 복수액, 뇌 및 뇌척수액, 태반 추출액 및 골수 흡입물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성 평가 방법에 있어서, 서로 다른 배치(batch)의 세포 배양액으로부터 각기 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는, 서로에 대해 동일 내지는 유사한 수준으로 NO(nitric oxide) 생성을 농도의존적으로 변화시키는 것이 바람직하다. 이 경우, 상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는 생산 배치에 관계없이 기능적 활성을 갖는 것으로 평가할 수 있다. 또한, 이 경우 각 배치별로 생산된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성을 상대비교할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성 평가 방법에 있어서, 단일 배치로부터 각기 소분(小分)된 세포 배양액으로부터 각기 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는, 서로에 대해 동일 내지는 유사한 수준으로 NO(nitric oxide) 생성을 농도의존적으로 변화시키는 것이 바람직하다. 이 경우, 상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는 세포 배양액의 소분 여부에 관계없이 기능적 활성을 갖는 것으로 평가할 수 있다. 또한, 각각 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성을 상대비교할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성 평가 방법에 있어서, 서로 다른 생산주기에서 배양된 세포 배양액으로부터 각기 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는, 서로에 대해 동일 내지는 유사한 수준으로 NO(nitric oxide) 생성을 농도의존적으로 변화시키는 것이 바람직하다. 이 경우, 상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는 생산 주기에 관계없이 기능적 활성을 갖는 것으로 평가할 수 있다. 또한, 각 생산주기별로 생산된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성을 상대비교할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성 평가 방법은, 상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 입자수, 입자크기, 입자 크기 분포, 또는 총단백질양 중 적어도 하나를 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성 평가 방법에 있어서, 상기 측정은 NTA(nanoparticle tracking analysis), TRPS(tunable resistive pulse sensing), TEM(transmitted electron microscopy), SEM(Scanning electron microscopy), DLS(Dynamic light scattering), Cryo-TEM(Cryo-transmission electron microscopy), DMA(Differential mobility analysis) 및 단백질 정량법으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성 평가 방법에 있어서, 상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 기능적 활성을 갖는 경우, 상기 입자 크기 분포는 균일한 것이 바람직하다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성 평가 방법은, 상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 세포 독성을 분석하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성 평가 방법에 있어서, 상기 줄기세포의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 지방, 골수, 제대 또는 제대혈 유래 줄기세포일 수 있으며, 보다 바람직하게는 지방 유래 줄기세포일 수 있다. 상기 지방 유래 줄기세포의 종류는 병원체에 의한 감염의 위험이 없고 면역 거부 반응을 일으키지 않는 것이라면 제한되지 않으나, 바람직하게는 인간지방 유래 줄기세포일 수 있다.
본 발명의 다른 구체예는 전술한 바와 같은 기능적 활성 평가 방법을 이용하여 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성을 정량적으로 분석하는 단계를 포함하는, 생산 단계별 및 최종 생산품의 품질 관리 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예는 전술한 바와 같은 기능적 활성 평가 방법을 이용한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성 평가를 통해 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 임상 내지는 산업적으로 적용가능한 품질(quality)을 갖는지 여부를 분석하는 단계를 포함하는 품질 관리(quality control) 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 생물학적 용액으로부터 분리 정제된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성을 시험관내(in vitro) 조건에서 간편하면서도 신속하게 효율적으로 평가할 수 있다. 본 발명의 평가 방법은 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성을 간편하면서 신속하게 정량적으로 평가할 수 있어 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 각 생산 단계별 품질 관리 및 최종 생산품의 품질 관리에 적합하다.
또한, 본 발명의 평가 방법은 전술한 바와 같은 기능적 활성 평가를 통해 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 임상 내지는 산업적으로 적용가능한 품질(quality)을 갖는지 여부를 간편하면서도 신뢰도 높게 평가할 수 있다. 따라서, 본 발명의 평가 방법은, 염증반응, 면역반응, 피부노화, 피부재생 및 다양한 질환과 관련된 NO(nitric oxide) 생성 변화의 측정 결과에 기초하여 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 진단 및 치료 분야 등으로의 응용을 가능하게 한다.
한편, 전술한 바와 같은 효과들에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 구체예의 평가 방법에 따라 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성을 평가하기 위해, 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 NO 형성 감소 효과를 확인한 실험 결과를 도시한다. 도 1에서 PBS는 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline), DEX는 덱사메타손(dexamethasone), EXO는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체(Exosome and/or EV), CM은 줄기세포 배양액(conditioned media), CM-EXO는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 제거된 줄기세포 배양액(exosome-depeleted conditioned media)을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 구체예의 평가 방법에 따라 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성을 평가하기 위해, 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 2개의 서로 다른 배치로 생산한 배양액에서 각각 분리 정제하고, 이와 같이 분리 정제된 각 배치의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 의한 NO 형성의 감소 효과를 비교하여 확인한 실험 결과를 도시한다. C는 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline), DEX는 덱사메타손(dexamethasone), Harvest 1과 2는 배치(batch) 1에서 1차 및 2차에 걸쳐 생산된 배양액에서 각각 분리 정제한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 사용하였음을 의미한다.
도 3은 본 발명의 일 구체예의 평가 방법에 따라 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성을 평가하기 위해, 단일 배치로 생산된 배양액을 3회에 걸쳐 나누어 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리 정제하고, 이와 같이 분리 정제된 각 회차의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 의한 NO 형성의 감소 효과를 비교하여 확인한 실험 결과를 도시한다. C는 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline)을 의미한다.
도 4는 본 발명의 일 구체예의 평가 방법에 따라 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성을 평가하기 위해, 서로 다른 생산 주기(campaign)에서 생산된 배양액으로부터 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리 정제하고, 이와 같이 분리 정제된 각 주기의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 의한 NO 형성의 감소 효과를 비교하여 확인한 실험 결과를 도시한다. NO 형성의 감소 정도는 인산염 완충용액과 덱사메타손을 처리한 대조군에서 형성된 NO에 대하여 각각의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 처리 농도별로 감소한 NO 양을 백분율(%)로 표시하였다.
도 5는 본 발명의 일 구체예의 평가 방법의 유효성을 검증하기 위해, 실시예 2에 따라 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 의한 NO 형성 감소 효과와, 침전법(PPT)에 의해 분리된 세포외 소포체에 의한 NO 형성 감소 효과를 비교한 실험 결과를 도시한다. A는 침전법에 의해 분리된 세포외 소포체의 NTA 분석 결과이고, B는 실시예 2에 의해 분리 정제된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 NTA 분석 결과이며, C는 NO 형성 감소 효과를 비교 도시한 그래프이다. NO 형성의 감소 정도는 양성대조군인 덱사메타손(Dex)에 의한 NO 형성 감소 정도에 대한 상대 비율(%)로 표시하였다.
도 6은 본 발명의 일 구체예의 평가 방법에 따라 기능적 활성이 확인된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 아토피가 유발된 마우스(피부염 유발 동물모델 1)에 처리한 결과, 아토피 증상이 임상적으로 완화되는 것을 확인한 결과를 도시한다. "A"는 각 실험군의 아토피 임상 스코어를 도식화한 그래프이다. "B"는 각 실험군에서 측정된 귀의 두께를 정상군과 비교하여 상대적인 변화량을 도시한 그래프이다. "C"는 각 실험군에서 채취한 귀 조직에서 염증성 사이토카인인 IL-4 mRNA의 변화량을 확인한 리얼타임 PCR 결과를 도시한 그래프이다. "D"는 각 실험군에서 채취한 귀 조직에서 염증성 사이토카인인 IL-31 mRNA의 변화량을 확인한 리얼타임 PCR 결과를 도시한 그래프이다.
도 7은 아토피가 유발된 마우스(피부염 유발 동물모델 2)에서 본 발명의 일 구체예의 평가 방법에 따라 기능적 활성이 확인된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 처리한 결과, 투여한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 용량 의존적으로 아토피 증상이 완화됨을 확인한 결과를 도시한다.
도 8은 아토피가 유발된 마우스에 기능적 활성 평가 대상이 되는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 처리한 후 귀 조직을 톨루이딘 블루로 염색한 결과의 사진과 마스트 세포(비만세포)의 수를 측정하여 도시한 그래프이다.
도 9는 아토피가 유발된 마우스에 본 발명의 일 구체예의 평가 방법에 따라 기능적 활성이 확인된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 처리한 후 혈액 내에 존재하는 (A) IgE, (B) 백혈구(white blood cells), 및 (C) 호산구(eosinophils)를 측정하여 도시한 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일 구체예의 평가 방법의 유효성을 검증하기 위해, 기능적 활성 평가 대상이 되는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 물리적 특성을 분석한 결과를 도시한 것이다. "A"는 TRPS(tunable resistive pulse sensing) 분석에 의한 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "B"는 NTA(nanoparticle tracking analysis) 분석에 의한 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "C"는 TEM(transmitted electron microscopy) 분석에 의한 입자 이미지를 배율에 따라 도시하였다. "D"는 기능적 활성 평가 대상이 되는 엑소좀 및/또는 세포외 세포체의 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. "E"는 기능적 활성 평가 대상이 되는 엑소좀 및/또는 세포외 세포체에 대한 마커 분석에 있어서 CD63 및 CD81에 대한 유세포분석 결과를 나타낸다.
도 11은 본 발명의 일 구체예의 평가 방법의 유효성을 검증하기 위해, 부형제 첨가에 따라 균일하고 순도가 높은 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 수득되는 것을 보여주는 입자 크기 분포(균일한 분포)에 관한 NTA 분석 결과를 도시한다. 첨가된 부형제의 양이 증가함에 따라 단일한 피크를 갖는 입자 크기 분포 결과를 얻을 수 있다.
도 12는 본 발명의 일 구체예의 평가 방법의 유효성을 검증하기 위해, 기능적 활성 평가 대상이 되는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체, 및/또는 이를 포함하는 분획물의 제조과정에서 부형제 첨가 여부에 따른 입자 크기 분포를 나타내는 NTA 분석 결과를 도시한다. "A"는 제조 과정 전과정에서 부형제를 첨가한 경우, B는 세포 배양액을 동결 보관하였다가 해동한 후 부형제를 첨가한 경우, "C"는 부형제를 첨가하지 않고 제조한 결과를 나타낸다. "D"에는 A 내지 C 방법에 의하여 분리한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 상대적인 생산성(Relative productivity)과 상대 농도(Relative concentration)를 비교한 결과를 도시하였다. "E"에는 A 내지 C 방법에 의하여 분리한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 평균 입자크기(Mean size)를 도시하였다.
도 13의 A는 본 발명의 일 구체예의 평가 방법에 따라 기능적 활성이 확인된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 인체 피부 섬유아세포에 처리한 결과, 콜라겐 합성이 농도의존적으로 촉진되는 것을 확인한 결과를 도시한다. 도 13의 B는 본 발명의 일 구체예의 평가 방법의 유효성을 검증하기 위해, 실시예 2에 따라 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 의한 콜라겐 생성량 증가와, 침전법(PPT)에 의해 분리된 세포외 소포체에 의한 콜라겐 생성량 증가를 비교한 실험 결과를 도시한다.
이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌들은 본 발명에 참고로서 통합된다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
실시예
실시예 1: 세포의 배양
마우스 대식세포주인 Raw 264.7은 한국세포주은행에서 구입하여 배양하였다. 세포 배양을 위해 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum: Thermo Scientific에서 구입) 및 1% 항생제-항진균제 (antibiotics-antimycotics: Thermo Scientific에서 구입)가 함유된 DMEM (Thermo Scientific에서 구입) 배지에 5% CO2, 37℃ 조건에서 계대 배양하였다.
인체 피부 섬유아세포(human dermal fibroblast)인 HS68 세포는 ATCC에서 구입하여, 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum: Thermo Scientific에서 구입) 및 1% 항생제-항진균제 (antibiotics-antimycotics: Thermo Scientific에서 구입)가 함유된 DMEM (Thermo Scientific에서 구입) 배지에 5% CO2, 37℃ 조건에서 계대 배양하였다. 또한, HDF(Human dermal fibroblast) 세포 및 배지는 (주)세포바이오 (대한민국 서울특별시 소재)에서 구입하여 5% CO2, 37℃ 조건에서 계대 배양하였다.
당해 발명이 속하는 기술분야에 알려진 세포배양 방법에 따라 5% CO2, 37℃ 조건에서 지방 유래 줄기세포를 배양하였다. 그 다음, 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline; PBS,Thermo Scientific에서 구입)으로 세척 후, 무혈청, 무페놀레드 배지로 교체하여 1일 내지 10일간 배양하고 그 상층액(이하, 배양액)을 회수하였다.
한편, 기능적 활성의 평가 대상이 되는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는 다양한 분리 방법에 의해 수득될 수 있다. 이하에서는 본 발명의 평가 방법의 대상이 되는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리하는 과정을 하나의 예시로서 설명한다. 예를 들어, 분리 과정에서 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 수득하기 위하여 배양액에 부형제를 첨가할 수 있다. 부형제로서는 자당(sucrose), 트레할로오스(trehalose), 유당(lactose), 락툴로오스, 말토오스, 셀로비오스, 이소말토오스, 투라노오스, 포도당(dextrose), 글루코오스, 갈락토오스, 프룩토오스, 탈로오스, 만노오스, 타가토오스, 프시코오스, 에리트로오스, 에리트룰로오스, 트레오스, 에리스리톨(erythritol), 아라비노오스, 자일로오스, 릭소오스, 리보오스, 리불로오스, 자일룰로스, 알도헵토오스, 헵툴로오스, 옥툴로오스, 겐티아노스, 움벨리페로스, 플란테오스, 이소리크노오스, 라피노오스, 리크노오스, 스타키오스, 베르바스코오스(verbascose), 만니톨(manitol), 말티톨, 락티톨, 말토트리오스, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 자일리톨, 소르비톨(sorbitol), 전분 분해당, 전분 분해당 환원 알콜, 비이온성 계면활성제 (예를 들어, Tween-20, Triton X-100, Pluonic F-68 등), 글리신(glycine), 히스티딘(histidine), 글리세롤(glycerol) 및 콜레스테롤(cholesterol)로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종을 0.01 내지 30 중량% 첨가하였다. 부형제를 첨가한 후 배양액을 0.22 μm 필터로 여과하여 세포 잔해물, 노폐물 및 거대 입자 등의 불순물을 제거해 주었다. 여과된 배양액은 즉시 분리 과정을 통해 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리하였다. 또한, 여과된 배양액은 냉장고(영상 10℃ 이하)에서 보관한 후 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 분리에 사용하였다. 또한, 여과된 배양액은 -60℃ 이하의 초저온 냉동고에서 동결 보관하였다가 해동시킨 후 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 분리를 수행하였다. 이후, 배양액으로부터 접선흐름여과장치(Tangential Flow Filtration; TFF)를 이용하여 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리하였다.
실시예 2: TFF 방법에 의한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 분리 및 정제
이하에서는 본 발명의 평가 방법을 설명하기 위한 하나의 예시로서, 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 분리 및 정제 과정을 설명한다. 실시예 1에서 0.22 μm 필터로 여과된 배양액으로부터 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리, 농축, 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 위해 TFF(Tangential Flow Filtration) 방법을 사용하였다. TFF 방법을 이용하여 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리, 농축하기 전 배양액을 초음파처리(sonication)하여 잠재적인 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 덩어리를 풀어주었다. TFF 방법을 위한 필터로는 카트리지 필터(cartridge filter, 일명 hollow fiber filter; GE Healthcare 또는 Spectrum Labs에서 구입) 또는 카세트 필터(cassette filter; Pall 또는 Sartorius 또는 Merck Millipore에서 구입)를 사용하였다. TFF 필터는 다양한 분자량 차단(molecular weight cutoff; MWCO)에 의해 선택될 수 있다. 선택된 MWCO에 의해 선별적으로 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리, 농축하였고, MWCO보다 작은 입자나 단백질, 지질, 핵산, 저분자 화합물 등은 제거하였다.
엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리, 농축하기 위하여 MWCO 100,000 Da(Dalton), 300,000 Da, 500,000 Da 또는 750,000 Da의 TFF 필터, 또는 0.05 μm 크기의 TFF 필터를 사용하였다. 배양액을 TFF 방법을 이용하여 1/100 내지 1/25 정도의 부피가 될 때까지 농축하면서, MWCO보다 작은 물질들은 제거하여 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리하였다.
분리, 농축된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 용액은 TFF 방법을 이용하여 추가로 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 수행하였다. 이때, 탈염과 버퍼교환은 연속적으로 수행(continuous diafiltration)하거나 단속적으로 수행(discontinuous diafiltration)하였으며, 시작 부피(starting volume)에 대하여 적어도 4배, 바람직하게는 6배 내지는 10배 이상, 보다 바람직하게는 12배 이상의 부피를 갖는 완충용액을 이용하여 수행하였다. 완충용액에는 균일하고 순도가 높은 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 수득하기 위하여 부형제를 첨가하였다.
그러나 본 발명의 평가 방법은 다양한 분리 방법에 의해 수득된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성 내지는 품질을 평가하기 위한 것으로서, 전술한 바와 같은 방법에 의해 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 대한 평가 방법으로 해석되어서는 안된다. 상기와 같은 분리방법은 본 발명의 평가 방법의 대상이 되는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리하는 방법의 일례로서 이해되어야 하며, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 명백히 밝혀 둔다.
실시예 3: 마크로파지 세포주에서의 NO 생성 감소 분석을 통한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성 평가
마우스의 대식세포주인 Raw 264.7 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM 배지에 현탁시키고 이를 멀티웰 플레이트(multiwell plate)의 각 웰에 80 내지 90%의 밀집도(confluency)를 갖도록 분주하였다. 다음 날 LPS가 포함된 새로운 배지에 희석한 기능적 활성 평가 대상이 되는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체(실시예 2에서 준비된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체)를 적정 농도로 24시간 동안 처리하여 배양하였다. 배양이 끝난 배양상층액을 취하고 배양액 내에 존재하는 NO를 측정하여 평가 대상이 되는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성(예를 들어, 염증반응 감소, 면역반응 감소, 피부노화 방지, 피부재생 등)을 분석하였다. 배양액 내의 NO 생성량은 NO 검출키트(detection kit)(인트론바이오에서 구입)를 이용하여 측정하였다. 양성대조군으로 덱사메타손(dexamethasone) (Sigma에서 구입)을 처리하였다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성의 평가 방법에 사용되는 NO(nitrogen oxide)는 세포내에서 아르기닌(L-arginine)으로부터 산화질소 합성효소(nitric oxide synthase, NOS)에 의해 생성되는 물질이다. NO(nitrogen oxide)는 인슐린 분비, 연동운동, 혈관생성, 신경계의 발생과 관련이 있고, 염증을 포함한 여러 면역반응에 관여하는 물질이다. NO의 증가는 생체 방어와 자유 라디칼(free radical)에 의해 유발된 조직 손상에 기여한다고 알려져 있고, 다양한 염증성 질환이 있을 때 증가된다. NO(nitrogen oxide)는 혈액응고, 혈압조절 기능, 암세포에 대한 면역 기능 등에 중요한 역할을 하고, 단백질 및 지질의 과산화를 유도하며 세포독성을 야기하는 강력한 산화제인 과산화 질산염(peroxynitrite)을 생산한다. 또한, NO(nitrogen oxide)는 염증과 같은 면역반응이나 노화 뿐만 아니라 동맥경화와 같은 뇌혈관계 질환, 고혈압과 같은 심혈관계질환, 발암 등의 주요 질환의 원인으로서 그 관심이 증가하고 있다. 따라서, 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성을 평가하는 방법으로서 시험관 조건에서 NO(nitrogen oxide)의 생성량의 변화를 분석하는 것은 유효한 방법이라고 할 수 있다.
도 1에 도시된 바와 같이, 생쥐의 대식세포인 RAW264.7 세포에 LPS 존재 하에서 기능적 활성 평가 대상이 되는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체(실시예 2에서 준비한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체)를 처리한 결과 LPS에 의해 유도되는 염증 반응인 NO 생성을 농도의존적으로 감소시킴을 확인하였다. 따라서, 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 염증 반응 감소 등의 기능적 활성을 평가하는 방법으로서 시험관 조건에서 NO(nitrogen oxide)의 생성량의 변화를 분석하는 것은 유효한 방법이라고 할 수 있다.
한편, 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 임상 및 산업적으로 이용하기 위해서는 매 생산마다 생산된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성을 객관적이고 신뢰도 높게 평가하는 것이 필수적이다. 본 발명의 일 구체예의 기능적 활성 평가 방법에 따라 안정적으로 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성을 평가할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여 서로 다른 배치의 세포 배양액에서 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리 정제하고 이를 RAW264.7 세포에 LPS와 함께 처리하여 NO 생성 저하 여부를 확인하였다. 도 2에서 도시한 바와 같이, 서로 다른 배치의 줄기세포 배양으로부터 1회 또는 2회에 걸쳐 생산된 줄기세포 배양액에서 분리 정제된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 동일한 농도로 RAW264.7 세포에 LPS와 함께 처리하고 LPS에 의해 유도된 NO의 생성 감소 효과를 비교함으로써, 품질 평가 대상이 되는 각 배치의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성이 실질적으로 동일 내지는 유사한 지 여부를 간편하면서도 신속하게 그리고 정량적으로 평가할 수 있었다. 본 발명을 한정하지 않는 하나의 예시로서, 실시예 2에 따라 준비된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 경우 생산 배치와 관계없이 실질적으로 동일 내지는 유사한 정도로, RAW264.7 세포에서 LPS에 의해 유도되는 NO 생성을 농도의존적으로 감소시키는 기능적 활성을 갖는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 하나의 줄기세포 배양 배치에서 생산된 줄기세포 배양액은 필요에 따라 소분한 후 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 분리 정제를 수행할 수 있다. 이와 같이 반복적인 분리 정제 과정마다 수득된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성을 비교 평가하는 것은 일관된 품질의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 안정적으로 생산하는 데 있어 매우 중요하다. 도 3에 도시된 바와 같이, 하나의 배치로 생산된 줄기세포 배양액을 3회에 걸쳐 나누어 분리 정제를 수행하여 얻어진 각 회차의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 동일한 농도로 RAW264.7 세포에 처리한 후, LPS에 의해 유도된 NO 생성 억제 정도를 비교함으로써, 품질 평가 대상이 되는 각 회차의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성이 실질적으로 동일 내지는 유사한 지 여부를 간편하면서도 신속하게 그리고 정량적으로 평가할 수 있었다. 본 발명을 한정하지 않는 하나의 예시로서, 실시예 2에 따라 준비된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 경우 소분 여부와 관계없이 실질적으로 동일 내지는 유사한 정도로, RAW264.7 세포에서 LPS에 의해 유도되는 NO 생성을 농도의존적으로 감소시키는 기능적 활성을 갖는 것을 확인할 수 있었다.
뿐만 아니라, 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 산업적으로 이용하기 위해서는 줄기세포 배양과 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 분리 정제가 주기적으로 이루어져야 하며, 이때 각 주기(campaign)에서 얻어진 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성이 동일하게 유지되고 있음도 반드시 확인하여야 한다. 도 4에 도시된 바와 같이, 주기별로 생산된 각 주기의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 동일한 농도로 RAW264.7 세포에 처리한 후, LPS에 의해 유도된 NO 생성 억제 정도를 비교함으로써, 품질 평가 대상이 되는 각 주기의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성이 실질적으로 동일 내지는 유사한 지 여부를 간편하면서도 신속하게 그리고 정량적으로 평가할 수 있었다. 본 발명을 한정하지 않는 하나의 예시로서, 실시예 2에 따라 준비된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 경우 생산 주기와 관계없이 실질적으로 동일 내지는 유사한 정도로, RAW264.7 세포에서 LPS에 의해 유도되는 NO 생성을 농도의존적으로 감소시키는 기능적 활성을 갖는 것을 확인할 수 있었다.
상기한 결과들로부터, 본 발명의 평가 방법은 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성을 시험관 조건에서 간편하면서도 신속하게 효율적으로 평가할 수 있고, 생산 배치, 생산 주기 및 배양액 소분에 따른 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생산 단계별 품질 관리 및 최종 생산품의 품질 관리에 적합하다는 것을 알 수 있다.
실시예 4: 마크로파지 세포주에서의 NO 생성 감소 분석을 통한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성 비교
본 발명의 일 구체예의 평가 방법의 객관성 및 유효성을 검증하기 위해, 분리 방법을 달리하여 수득된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 NO 형성 감소 효과를 비교하였다. 이를 위하여 실시예 2의 TFF 분리 정제에 의해 얻어진 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 이외에 침전법에 의해 분리된 세포외 소포체를 준비하였다. 침전법은 제조사(System Biosciences)의 프로토콜에 따라 시행하였다. 침전법에 의해 분리된 세포외 소포체(도 5A 참조)는 실시예 2의 TFF 방법에 의해 분리 정제된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체(도 5B 참조)와 비교하여 균일도가 낮고 다양한 크기를 갖는 것을 확인하였다. 또한, 도 5C에 도시한 바와 같이 실시예 2의 TFF 방법에 의해 분리 정제된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는 침전법에 의해 얻어진 세포외 소포체에 비해 훨씬 높은 수준으로 NO 형성을 억제함을 확인하였다. 이러한 결과들은 본 발명의 평가 방법이 입자 분포의 균일성 결과와 부합되고 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성 평가에 있어 유효한 것임을 강력히 시사한다.
실시예 5: 피부염 유발 동물모델을 통한 본 발명의 평가 방법의 검증
본 발명의 일 구체예의 평가 방법에 의하여 기능적 활성이 확인된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 실제로 생체내에서 염증 반응을 억제할 수 있는지 확인하기 위하여 피부염 유발 동물 모델 1 및 2를 사용하였다.
실시예 5-1: 피부염 유발 동물모델 1
수컷 NC/Nga 생쥐 (16-18 g, 5주령; 중앙실험동물에서 구입)를 구매하여 7일 동안의 적응기를 통해 본 실험에 사용하였다. 적응기를 거친 생쥐는 피부염 유발 후 아래와 같이 각각 5군으로 분류하였다.
(1) Normal: 정상 대조군
(2) Vehicle (피부염 유발군): 집먼지 진드기 추출물로 피부염을 유발한 음성 대조군
(3) IV: 집먼지 진드기 추출물로 피부염 유발 후 실시예 2에서 준비된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 개체 당 2.8 μg을 주 3회씩 2주간 혈관 내 투여(IV: intravenous injection)한 실험군
(4) SC: 집먼지 진드기 추출물로 피부염 유발 후 실시예 2에서 준비된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 개체 당 2.8 μg을 주 3회씩 2주간 피하 투여(SC: subcutaneous injection)한 실험군
(5) Pred: 집먼지 진드기 추출물로 피부염 유발 후 프레드니솔론(prednisolone)을 매일 경구투여한 실험군
NC/Nga 마우스(중앙실험동물에서 구입)의 귓바퀴부분을 면도기로 제모한 후, 제모제를 적량 도포하여 제모하였다. 제모제를 닦아낸 후 AD 유발시약(집먼지 진드기 추출물; BioStir Inc.에서 구입)을 마이크로 파이펫 팁(micro pipet tip)을 이용하여 귓바퀴 부분에 균일하게 도포하였다. 필요에 따라 면도기로 제모한 후, 4% SDS 수용액 150 μL를 마이크로 파이펫 팁(micro pipet tip)을 이용하여 귓바퀴부분에 균일하게 도포하였다. 드라이어를 이용하여 냉풍으로 건조시킨 후, 약 2-3 시간 동안 자연건조시킨 다음, AD 유발시약을 마이크로 파이펫 팁(micro pipet tip)을 이용하여 귓바퀴 부분에 균일하게 도포하였다. 모든 전 처리는 1주간 2회, 총 3주간 6회 처리로 진행하였다.
실시예 2에서 준비된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체(본 발명의 평가 방법에 따라 기능적 활성이 유효한 것으로 평가된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체)의 투여개시 전 피부 임상지수 평가를 실시하여 순위화한 점수에 따라 각 군의 평균 점수가 최대한 균일하게 분포하도록 무작위법으로 분배하여 군을 분리하였다. 상기 실험을 통하여, 본 발명의 평가 방법에 의해 기능적 활성이 유효한 것으로 평가된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 처리된 군(Exosome, IV 그룹 및 Exosome, SC 그룹 모두)에서 피부 임상지수와 귀 두께가 감소됨을 확인하였다(도 6A 및 도 6B).
실시예 5-2: 피부염 유발 동물모델 2
본 발명의 일 구체예의 평가 방법에 의하여 기능적 활성이 확인된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 용량 의존적인 효과를 확인하기 위하여 실시예 5-1에서와 같이 피부염을 유발한 후 아래와 같이 9군으로 분류하였다.
(1) Normal: 정상 대조군
(2) Control (피부염 유발군): 집먼지 진드기 추출물로 피부염을 유발한 음성 대조군 (도 7에서 "C"로 표기)
(3) IV, L (exosome and/or EV, low): 집먼지 진드기 추출물로 피부염 유발 후 실시예 2에서 준비된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 개체 당 0.14 μg을 주 3회씩 4주간 혈관 내 투여(IV: intravenous injection)한 실험군
(4) IV, M (exosome and/or EV, medium): 집먼지 진드기 추출물로 피부염 유발 후 실시예 2에서 준비된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 개체 당 1.4 μg을 주 3회씩 4주간 혈관 내 투여(IV: intravenous injection)한 실험군
(5) IV, H (exosome and/or EV, high): 집먼지 진드기 추출물로 피부염 유발 후 실시예 2에서 준비된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 개체 당 10 μg을 주 3회씩 4주간 혈관 내 투여(IV: intravenous injection)한 실험군
(6) SC, L (exosome and/or EV, low): 집먼지 진드기 추출물로 피부염 유발 후 실시예 2에서 준비된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 개체 당 0.14 μg을 주 3회씩 4주간 피하 투여(SC: subcutaneous injection)한 실험군
(7) SC, M (exosome and/or EV, medium): 집먼지 진드기 추출물로 피부염 유발 후 실시예 2에서 준비된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 개체 당 1.4 μg을 주 3회씩 4주간 피하 투여(SC: subcutaneous injection)한 실험군
(8) SC, H (exosome and/or EV, high): 집먼지 진드기 추출물로 피부염 유발 후 실시예 2에서 준비된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 개체 당 10 μg을 주 3회씩 4주간 피하 투여(SC: subcutaneous injection)한 실험군
(9) Pred: 집먼지 진드기 추출물로 피부염 유발 후 프레드니솔론(prednisolone)을 매일 경구투여한 실험군 (도 7에서 "P"로 표기)
피부염 유발은 실시예 5-1에서와 같이 진행하였으며, AD 유발시약을 과량으로 도포하여 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 투여하는 시점에서 평균 피부 임상지수가 9가 되도록 하였다. 실시예 2에서 준비된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 투여개시 전 피부 임상지수 평가를 실시하여 순위화한 점수에 따라 각 군의 평균 점수가 최대한 균일하게 분포하도록 무작위법으로 분배하여 군을 분리하였다. 상기 실험을 통하여 본 발명의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 처리된 군(Exosome, IV 그룹 및 Exosome, SC 그룹 모두)에서 용량 의존적으로 피부 임상지수가 감소됨을 확인하였다(도 7).
상기 실시예 5-1 및 5-2의 동물실험 결과들로부터 본 발명의 평가 방법에 의하여 기능적 활성이 확인된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 실제로 생체내에서 염증 반응을 억제하는 것을 확인하였고, 이로부터 본 발명의 평가 방법은 엑소좀 및/소포외 소포체의 기능적 활성을 간편하면서 신속하게 확인할 수 있는 신뢰할 수 있는 방법임을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 평가 방법은 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 임상 내지는 산업적으로 적용가능한 품질을 갖는지 여부를 분석하는 품질 관리 방법에도 활용될 수 있다.
실시예 6: 사이토카인 양 측정을 통한 본 발명의 평가 방법의 검증
희생시킨 생쥐의 귀 피부 조직을 분쇄하여 원심분리 후 얻어진 상층액으로 단백질을 정량하였다. 조직으로부터 얻은 총 RNA로부터 cDNA를 제조하고 리얼타임 PCR 방법을 이용하여 염증성 사이토카인 mRNA 변화량을 측정하였다. 리얼타임 PCR에 사용한 프라이머의 종류와 서열은 하기 표 1과 같다.
리얼타임 PCR에 사용된 프라이머 종류 및 염기서열
Gene
name		 프라이머 염기서열 (5' → 3') Position
cDNA		 Gene Bank ID
IL-4 정방향 프라이머 (서열번호 1):
ACA GGA GAA GGG ACG CCA T
역방향 프라이머 (서열번호 2):
GAA GCC CTA CAG ACG AGC TCA		 180-198
254-274		 NM_021283.2
IL-31 정방향 프라이머 (서열번호 3):
CAC ACA GGA ACA ACG AAG CC
역방향 프라이머 (서열번호 4):
CGA TAT TGG GGC ACC GAA G		 62-81
136-154		 NM_029594.1
GAPDH 정방향 프라이머 (서열번호 5):
CAT GGC CTT CCG TGT TCC TA
역방향 프라이머 (서열번호 6):
CCT GCT TCA CCA CCT TCT TGA T		 1125-1144
1291-1312		 XM_017321385.1
상기 실험을 통하여 본 발명의 평가 방법에 따라 기능적 활성이 확인된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 처리된 군(Exosome, IV 그룹 및 Exosome, SC 그룹 모두)에서의 염증관련 사이토카인의 발현량이 감소됨을 확인하였다(도 6C 및 도 6D).
상기 결과로부터, 본 발명의 평가 방법에 의하여 기능적 활성이 확인된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 실제로 생체내의 염증성 사이토카인의 생성을 억제하는 것을 확인하였고, 이로부터 본 발명의 평가 방법이 엑소좀 및/소포외 소포체의 기능적 활성을 간편하면서 신속하게 확인할 수 있는 신뢰할 수 있는 방법임을 알 수 있다.
실시예 7: 마스트 세포의 유입량 측정을 통한 본 발명의 평가 방법의 검증
희생시킨 생쥐의 귀 피부 조직을 톨루이딘블루로 염색한 후, 염증 세포의 일종인 마스트 세포의 유입 정도를 측정하였다. 상기 실험을 통하여 본 발명의 평가방법에 의해 기능적 활성이 유효한 것으로 확인된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체(실시예 2에서 준비된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체)가 처리된 군(Exosome, IV 그룹 및 Exosome, SC 그룹 모두)에서의 마스트 세포의 유입이 감소됨을 확인하였다(도 8). 상기 결과로부터 본 발명의 평가 방법이 엑소좀 및/소포외 소포체의 기능적 활성을 간편하면서 신속하고 정확하게 확인할 수 있는 신뢰할 수 있는 방법임을 알 수 있다.
실시예 8:　혈액 분석을 통한 본 발명의 평가 방법의 검증　
희생시킨 생쥐의 혈액으로부터 혈장을 분리하여 혈중 면역글로빈 E (Immunoglobulin E; IgE)의 농도를 ELISA Kit를 이용하여 측정하였다. 상기 실험을 통하여 실시예 2에서 준비된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 처리된 군에서 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 용량 의존적으로 혈중 IgE 수준이 감소됨을 확인하였다(도 9A).
또한, 희생시킨 생쥐의 전혈을 이용하여 혈중 세포의 수를 측정하였다. 사이토스핀(ThermoFisher에서 구입)을 이용하여 일정한 양의 전혈 세포를 1,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후, 슬라이드 건조시킨 다음 Diff-Quik 염색을 실시한 후, 백혈구(white blood cells) 및 호산구(eosinophils)의 수를 측정하였다. 상기 실험을 통하여 실시예 2에서 준비된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 처리된 군에서 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 용량 의존적으로 혈중 백혈구 및 호산구의 수가 감소됨을 확인하였다(도 9B 및 도 9C).
상기와 같은 결과들로부터 본 발명의 평가 방법에 의하여 기능적 활성이 확인된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 실제로 염증반응 내지는 면역반응 인자인 혈중 IgE 수준을 감소시킬 뿐만 아니라 혈중 백혈구 및 호산구의 수를 감소시키는 것을 확인하였고, 이로부터 본 발명의 평가 방법이 엑소좀 및/소포외 소포체의 기능적 활성을 간편하면서 신속하게 확인할 수 있는 신뢰할 수 있는 방법임을 알 수 있다.
실시예 9: 기능적 활성 평가 대상이 되는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 특성 분석
기능적 활성 평가 대상이 되는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체, 배양액, TFF 분리과정의 분획물에서 단백질의 양은 BCA 발색법(Thermo Fisher에서 구입) 또는 플루오로프로파일(FluoroProfile) 형광법(Sigma에서 구입)을 이용하여 측정하였다.
또한 기능적 활성 평가 대상이 되는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는 나노입자 트랙킹 분석(nanoparticle tracking analysis:　NTA; Malvern에서 구입) 또는 가변 저항펄스 감지(tunable resistive pulse sensing: TRPS; Izon Science에서 구입)에 의해 입자의 크기와 농도를 측정하였다. 본 발명의 평가 방법에 따라 기능적 활성이 유효한 것으로 확인된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체(실시예 2에 따라 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체)의 균일도와 크기는 투과전자현미경(transmitted electron microscopy: TEM)을 이용하여 분석하였다. 본 발명의 평가 방법에 따라 기능적 활성이 유효한 것으로 확인된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 TRPS, NTA, TEM 분석 결과는 각각 도 10A, 도 10B, 및 도 10C에 도시하였다.
도 10D는 본 발명의 평가 방법에 따라 기능적 활성이 유효한 것으로 확인된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 대해 웨스턴 블랏을 수행한 결과로서, CD9, CD63, CD81 및 TSG101 마커의 존재를 확인하였다. 각 마커에 대한 항체로는 각각 항-CD9 (Abcam에서 구입), 항-CD63 (System Biosciences에서 구입), 항-CD81 (System Biosciences에서 구입), 및 항-TSG101 (Abcam에서 구입)을 사용하였다. 도 10E는 본 발명의 평가 방법에 따라 기능적 활성이 유효한 것으로 확인된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 대해 유세포분석기를 이용하여 분석한 결과로서 CD63 및 CD81 마커의 존재를 확인하였다. CD63에 대해 양성(positive)인 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리하기 위하여 엑소좀-휴먼 CD63 분리/검출 키트(ThermoFisher Scientific에서 구입)를 제조사의 방법에 따라 사용하였고, PE-마우스 항-인간 CD63 (PE-Mouse anti-human CD63)(BD에서 구입) 및 PE-마우스 항-인간 CD81 (PE-mouse anti-human CD81)(BD에서 구입)을 사용하여 마커를 염색한 후, 유세포분석기 (ACEA Biosciences)를 이용하여 분석하였다.
상기 결과들로부터 본 발명의 평가 방법에 따라 기능적 활성이 유효한 것으로 확인된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는 입자크기 분포가 균일하고 특이적인 마커들에 대해 양성인 것이 확인되었다. 이는 앞에서 수행된 NO 생성 감소 정량을 통한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성 평가 방법과 부합되는 것임을 알 수 있다.
한편, TFF 방법으로 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리한 후, 부형제의 첨가 여부에 따른 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 크기 분포를 NTA 분석한 결과를 도 11에 도시하였다. 부형제가 존재하지 않는 상태에서 TFF 방법으로 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리한 경우, 300 nm 이상의 크기를 갖는 입자가 확인되는 반면, 부형제의 첨가양을 늘려주면 300 nm 이상의 크기를 갖는 입자가 줄어들고 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 크기 분포가 균일해지는 것을 확인하였다.
TFF 방법으로 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리하는 과정에 부형제의 첨가 여부를 추가로 조사하였다. 도 12에서 보는 바와 같이 TFF 전과정에 부형제를 첨가한 경우, 균일한 크기 분포를 갖는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 얻을 수 있었다(도 12A). 반면 부형제를 첨가하지 않고 동결 보관하였던 배양액을 사용한 경우나 부형제를 전혀 첨가하지 않고 TFF 과정을 진행한 경우, 크기가 큰 입자가 많이 포함된 불균일한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 얻었다(도 12B 및 도 12C).
분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 상대적인 생산성과 농도를 비교한 결과, TFF 전과정에 부형제를 첨가한 경우 매우 높은 생산성으로 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 얻을 수 있었으며, 얻어진 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 농도도 5배 이상 높았다(도 12D). NTA 분석 결과에서 나타난 바와 같이, 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 평균 크기도 TFF 전과정에 부형제를 첨가한 경우 200 nm로 균일하게 확인되었다(도 12E).
상기 결과들 역시 앞에서 수행된 NO 생성 감소 정량을 통한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성 평가 방법의 결과와 부합되는 것임을 알 수 있다.
실시예 10: 본 발명의 평가 방법에 따라 기능적 활성이 유효한 것으로 확인된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 독성 분석
Raw 264.7 세포에서 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 독성을 평가하기 위해 세포에 농도별로 엑소좀을 처리하고 세포의 증식률을 확인하였다. Raw 264.7 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM에 세포를 현탁시킨 후 80 내지 90%의 밀집도(confluency)를 갖도록 분주하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 24시간 후, 배양액을 제거하고 실시예 2에서 준비된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 농도 별로, 예를 들어 3×106 입자/ml, 1×107 입자/ml, 3×107 입자/ml, 1×108 입자/ml, 3×x108 입자/ml, 1×109 입자/ml의 농도로 처리하여 24 내지 72시간 동안 배양하면서 세포 생존율을 평가하거나, 총 단백질량을 기준으로 0.03 μg/mL, 0.1 μg/mL, 0.3 μg/mL, 1 μg/mL, 3 μg/mL, 10 μg/mL로 처리하여 24 내지 72 시간 동안 배양하면서 세포 생존율을 평가하였다. 세포 생존율을 WST-1 시약(WST-1 reagent)(Takara에서 구입), MTT 시약(Sigma에서 구입), 셀타이터-글로 시약(CellTiter-Glo reagent)(Promega에서 구입), 또는 아라마르 블루 시약(alamarBlue reagent)(Thermo Scientific에서 구입)과 마이크로플레이트 리더(microplate reader)(Molecular Devices에서 구입)를 이용하여 측정하였다.
비교군은 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 처리되지 않은 일반 세포배양배지에서 배양된 세포수를 기준으로 하였고, 본 발명의 일 구체예의 평가 방법에 따라 기능적 활성이 유효한 것을 확인한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는 시험된 농도 범위 내에서 세포 독성을 나타내지 않았다.
실시예 11: 피부 섬유아세포에서의 콜라겐 생성량 분석을 통한 본 발명의 평가 방법의 유효성 검증
이하에서는 기능적 활성 평가 대상이 되는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 콜라겐 생성 촉진 효과를 인체 피부 섬유아세포인 HDF(Human dermal fibroblast) 세포 또는 HS68 세포에서 확인하였다.
실시예 11-1: 농도의존적인 콜라겐 생성 촉진 확인
인체 피부 섬유아세포를 멀티웰 플레이트에 분주한 후 기능적 활성 평가 대상이 되는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체(실시예 2에서 준비된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체)를 농도 별(3μg/mL, 10μg/mL, 30μg/mL, 100μg/mL 및 300μg/mL)로 처리하여 배양하였다. 이후, 배양액을 회수하여 원심분리한 후, 원심분리된 배양액을 프로콜라겐 타입 I C-펩타이드(PIP)에 대한 EIA 키트(Takara에서 구입)를 이용하여 제조사의 권고 방법에 따라 인체 피부 섬유아세포로부터 합성되어 배양액에 축적된 콜라겐 양을 측정하였다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성의 평가 방법에 사용되는 NO(nitrogen oxide)는 피부 노화 및 염증 반응을 일으키고, 이러한 염증 반응로 인해서 MMP의 생합성이 증가하여 콜라겐 분해가 일어나며 피부탄력 감소와 피부주름 형성이 나타나게 된다. 따라서, 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 의한 NO 생성 감소는 피부노화 방지, 피부탄력 유지 내지는 개선, 주름 감소 등과 밀접한 관련을 갖는다.
도 13의 A에 도시된 바와 같이, 인체 피부 섬유아세포에 본 발명의 일 구체예의 평가 방법에 따라 기능적 활성(NO 생성 감소 효능)이 확인된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체(실시예 2에서 준비한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체)를 처리한 결과, 콜라겐 합성을 농도의존적으로 증가시킨 것을 확인할 수 있었고, 특히 상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 300μg/mL의 농도로 처리한 경우, 음성 대조군을 기준으로 약 4.5배 정도 콜라겐 합성을 증가시킨 것을 확인하였다. 전술한 바와 같이 NO 생성 억제가 콜라겐 분해 억제, 피부노화 억제 등과 관련이 있는 점을 감안할 때, 상기 결과는 앞에서 수행된 NO 생성 감소 정량을 통한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성 평가 방법의 결과와 부합되는 것임을 알 수 있다.
실시예 11-2: 분리 방법에 따른 콜라겐 생성량 증가의 비교
본 발명의 일 구체예의 평가 방법의 객관성 및 유효성을 검증하기 위해, 분리 방법을 달리하여 수득된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 콜라겐 생성 촉진 효과를 비교하였다. 이를 위하여 실시예 2의 TFF 분리 정제에 의해 얻어진 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 이외에 침전법에 의해 분리된 세포외 소포체를 준비하였다. 침전법은 제조사(System Biosciences)의 프로토콜에 따라 시행하였다.
인체 피부 섬유아세포를 멀티웰 플레이트에 분주한 후, 실시예 2에서 준비된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체와, 종래의 침전법에 의해 분리된 세포외 소포체를 각각 농도 별(3μg/mL 및 6μg/mL)로 처리하여 배양하였다. 그리고, 실시예 11-1에서 설명한 방법에 따라 콜라겐 생성량을 측정하여 비교하였다. 도 13의 B에 도시한 바와 같이, 실시예 2의 TFF 방법에 의해 분리 정제된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 인체 피부 섬유아세포에 6μg/mL 처리한 경우, 종래의 침전법에 의해 얻어진 세포외 소포체를 인체 피부 섬유아세포에 6μg/mL 처리한 경우에 비해 콜라겐 생성량이 약 1.55배 증가한 것을 확인하였다. 이러한 결과는 실시예 2에서 준비된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 종래의 침전법에 의해 얻어진 세포외 소포체 보다 NO 생성 억제 효능이 뛰어난 실시예 4의 결과와 부합되는 것이다.
상기 콜라겐 생성량 분석 결과들로부터 본 발명의 평가 방법에 의하여 기능적 활성이 확인된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 실제로 콜라겐 생성을 촉진하는 것을 확인하였고, 이로부터 본 발명의 평가 방법은 엑소좀 및/소포외 소포체의 기능적 활성, 예를 들어 피부노화 방지, 피부재생 등의 효능을 간편하면서 신속하게 확인할 수 있는 신뢰할 수 있는 방법임을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 평가 방법은 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 임상 내지는 산업적으로 적용가능한 품질을 갖는지 여부를 분석하는 품질 관리 방법에도 활용될 수 있다.
이상, 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.
<110> ExoCoBio Inc. <120> A method to evaluate functional activity of exosome and/or extracellular vesicle <130> P17-0036KR <150> KR 10-2017-0170668 <151> 2017-12-12 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-4 forward primer <400> 1 acaggagaag ggacgccat 19 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-4 reverse primer <400> 2 gaagccctac agacgagctc a 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-31 forward primer <400> 3 cacacaggaa caacgaagcc 20 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-31 reverse primer <400> 4 cgatattggg gcaccgaag 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 5 catggccttc cgtgttccta 20 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 6 cctgcttcac caccttcttg at 22

Claims (19)

  1. 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성 평가 방법으로서,
    세포 밖의 자극유발인자에 의한 자극에 의해 NO(nitric oxide)를 생성할 수 있는 세포를 준비하는 단계와,
    상기 세포에 상기 자극유발인자를 처리하는 단계와,
    상기 자극유발인자의 처리와 동시에 또는 처리 전후에 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 상기 세포에 처리하는 단계와,
    시험관내(in vitro) 조건 하에서 상기 세포에 의해 생성되는 NO(nitric oxide) 생성량의 변화를 측정하는 단계를 포함하는, 평가 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 세포를 배양한 후 세포 배양액에 상기 자극유발인자 및 상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 첨가하고, 시험관내(in vitro) 조건 하에서 상기 세포에 의해 생성되는 NO(nitric oxide) 생성량이 변화하는지 여부를 분석하는 것을 특징으로 하는, 평가 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 NO(nitric oxide) 생성량은 상기 세포 배양액으로 분비된 NO(nitric oxide) 양을 측정하여 산출하는 것을 특징으로 하는, 평가 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 NO(nitric oxide) 생성량이 변화하면 상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 기능적 활성을 갖는 것으로 평가하는 것을 특징으로 하는, 평가 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 기능적 활성을 갖는 경우, 상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는 농도의존적으로 상기 NO(nitric oxide) 생성량을 변화시키는 것을 특징으로 하는, 평가 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 자극유발인자는 염증유발인자인, 평가 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 자극유발인자는 LPS(Lipopolysaccharide), 펩티도글리칸, 사이토카인(cytokines), L-아르기닌(L-arginine), 브래디키닌(bradykinin), 뒤틀림 스트레스(sheer stress), 히스타민(histamine), 트롬빈(thrombin), ADP, 아세틸콜린(acetylcholine), 산화제(oxidant), 알레르겐(allergen), 세균 및 바이러스로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종인, 평가 방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 인간 또는 동물 유래의 마크로파지, 인간 또는 동물 유래의 모노사이트, RAW264.7 세포, 인간 유래 모노사이트 세포주인 THP-1, 인간 유래 마크로파지 세포주인 U937, 외부 자극에 의해 NO(nitric oxide)를 생산할 수 있는 세포, 또는 NOS(nitric oxide synthase)를 갖는 세포 중 적어도 1종인, 평가 방법.
  9. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    상기 세포 배양액은 줄기세포 배양액인 것을 특징으로 하는, 평가 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 줄기세포는 지방, 골수, 제대 또는 제대혈 유래 줄기세포인, 평가 방법.
  11. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    서로 다른 배치(batch)의 세포 배양액으로부터 각기 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 서로에 대해 동일 내지는 유사한 수준으로 NO(nitric oxide) 생성을 농도의존적으로 변화시키면, 상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는 생산 배치에 관계없이 기능적 활성을 갖는 것으로 평가하는 것을 특징으로 하는, 평가 방법.
  12. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    단일 배치로부터 각기 소분(小分)된 세포 배양액으로부터 각기 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 서로에 대해 동일 내지는 유사한 수준으로 NO(nitric oxide) 생성을 농도의존적으로 변화시키면, 상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는 세포 배양액의 소분 여부에 관계없이 기능적 활성을 갖는 것으로 평가하는 것을 특징으로 하는, 평가 방법.
  13. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    서로 다른 생산주기에서 배양된 세포 배양액으로부터 각기 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 서로에 대해 동일 내지는 유사한 수준으로 NO(nitric oxide) 생성을 농도의존적으로 변화시키면, 상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는 생산 주기에 관계없이 기능적 활성을 갖는 것으로 평가하는 것을 특징으로 하는, 평가 방법.
  14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 입자수, 입자크기, 입자 크기 분포, 또는 총단백질양 중 적어도 하나를 측정하는 단계를 더 포함하는, 평가 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 측정은 NTA(nanoparticle tracking analysis), TRPS(tunable resistive pulse sensing), TEM(transmitted electron microscopy), SEM(Scanning electron microscopy), DLS(Dynamic light scattering), Cryo-TEM(Cryo-transmission electron microscopy), DMA(Differential mobility analysis) 및 단백질 정량법으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는, 평가 방법.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 기능적 활성을 갖는 경우, 상기 입자 크기 분포는 균일한 것을 특징으로 하는, 평가 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 세포 독성을 분석하는 단계를 더 포함하는, 평가 방법.
  18. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 평가 방법을 이용하여 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성을 정량적으로 분석하는 단계를 포함하는, 생산 단계별 및 최종 생산품 품질 관리 방법.
  19. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 평가 방법을 이용한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능적 활성 평가를 통해 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 임상 내지는 산업적으로 적용가능한 품질을 갖는지 여부를 분석하는 것을 특징으로 하는, 품질 관리(quality control) 방법.
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