KR20200142045A - 세포 타입 특이적인 엑소좀 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 고도로 특정화된 단리된 엑소좀, 상기한 엑소좀의 제조 방법, 및 신경퇴행성 질환과 같은 질환 치료에 있어 상기한 엑소좀의 이용 방법을 제공한다.

Description

세포 타입 특이적인 엑소좀 및 그 용도
본 발명의 내용은, 세포 타입이 하나 이상의 신경영양 인자 (NTF)를 분비하도록 유도된 분화된 간엽 줄기 세포 (MSC)를 포함하는, 단리된 세포 타입 특이적인 엑소좀에 관한 것이다. 분화된 세포는 "MSC-NTF", MSC-NTF 세포 또는 NurOwn®로 지칭된다. 또한, 본원은 특이적인 유익한 분자들을 포함하는, MSC로부터 유래된 변형된 단리된 엑소좀을 개시한다. 이들 단리된 MSC-NTF 엑소좀 및 변형된 MSC 엑소좀은 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 질환, 전두측두엽 치매 (FTD), 파킨슨병 (PD), 다계통 위축증 (MSA), 척수근 위축증 (SMA), 다발성 경화증 (MS), 알츠하이머병 (AD), 레트 증후군, 뇌성마비 (CP), 자폐범주성 장애 (ASD) 및 간질 등의 신경퇴행성 질환을 치료하는데 이용될 수 있다.
신경퇴행성 질환은 뇌 및/또는 척수에서 신경 세포의 소실과 관련있는 기능부전을 특징으로 한다. 급성 신경퇴행은 뇌졸중 또는 외상과 같은 일시적인 개별 손상으로 발생할 수 있으며, 상해 부위에서 뉴런의 국소적인 소실로 이어질 수 있다. 만성 신경퇴행은 장기간에 걸쳐 진행될 수 있으며, 특정 뉴런 서브타입의 소실 또는 뉴런 집단의 전반적인 소실이 발생할 수 있다. 뇌에서, 알츠하이머 질환 (AD) 및 전두측두엽 치매 (FTD)는 광범위한 뉴런 소실을 일으키는 반면, 파킨슨 질환 (PD)은 흑질에서 도파민성 (DA) 뉴런의 국소적이고 특이적인 소실을 수반한다. 뇌간 및 척수에서, 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 및 척수근 위축증 (SMA)은 운동 뉴런 (MN)의 변성 및 소실을 수반한다. 다발성 경화증 (MS)은 뇌 및 척수에서 신경 세포가 손상되는 탈수초 질환이다. 부가적인 신경퇴행성 질환으로는 알츠하이머병 (AD), 레트 증후군, 뇌성마비 (CP), 자폐범주 장애 (ASD) 및 간질 등이 있다. AD는 뇌 세포를 손상시켜 궁극적으로 파괴하여, 기억 감소 및 사고 및 기타 뇌 기능의 변화를 야기하는 진행성 뇌 장애이다. 레트 증후군은 X 염색체에 위치한 MECP2 유전자의 돌연변이에 의해 거의 대부분 발샐되는 신경발달성 병태이다. CP는 어린이의 뇌가 발달하는 중에 발생하는 기형 또는 비-진행성 뇌 손상에 의해 유발되는 신경 장애로 간주된다. ASD는 가장 유전성이 높은 정신 질환으로 간주된다. ASD 뇌를 조사한 결과, 회색질과 백질의 붕괴, 뉴런의 수적 증가, 뉴런 세포체 (neuronal soma)의 부피 감소 및 신경망 증가 등의 전반적인 변화가 드러났으며, 신경망 증가는 수상세포의 가지 (dendritic spine), 뇌 혈관구조 및 교세포의 밀도 변화를 반영한다. 간질은 급성 전신성 또는 신경 손상에 의해 유발되지 않는 재발성 발작을 특징으로 하는 중추 신경계 장애이다.
이들 병태들 모두 독특한 뉴런 병증을 보이고 뉴런 소실에 대한 실제 기전이 복잡함에도 불구하고, 다수의 신경퇴행성 질환들은 단백질 축적, 미토콘드리아 기능부전, 산화 스트레스, 염증 및 세포자살성 사멸 등의 공통적인 병리생리학적 과정을 보인다. 현행 치료는 흔히 대증적 (symptomatic)이며, 신경퇴행성 진행을 중단 또는 서행시키진 못한다. 흥미롭게도, MSC 세포는 다수의 여러가지 신경퇴행성 질환의 치료에서 연구되어 왔다 (Lo Furno et al (2018) J Cell Physiol. 233:3982-3999).
간엽 줄기 세포 (MSC)는 숙주 세포와의 다이나믹한 파라크린 상호작용을 통한 신경보호 및 면역조절 효과로 인해 임상 실험에 사용되는 성체 줄기 세포의 가장 일반적인 타입이다. MSC의 특징은 군 CD45, CD34, CD14 또는 CD11b, CD79a 또는 CD19, 및 HLA-DR로부터 선택되는 세포 표면 막 마커의 발현 결핍을 포함할 수 있다 (Dominici M, Le Blanc K, Mueller I et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy 2006;8:315-317). 따라서, MSC는 세포 표면에 마커가 없는 것으로 정의될 수 있다 (음성 마커).
NurOwn®은 또한 MSC-NTF 세포로도 알려져 있으며, 특히 VEGF, HGF, GDNF 및 BDNF 등의 뉴런 생장과 생존을 뒷받침하는 신경영양 인자 (NTF)를 높은 수준으로 생산하도록 전용 배양 조건 하에 유도된, 자가 골수 유래 MSC이다. MSC-NTF 세포는 또한 MSC에 의해 매우 적게 발현되거나 또는 발현되지 않는 NTF, 예를 들어 LIF, G-CSF, BMP-2 및 TSG-6를 높은 수준으로 분비한다. 아울러, MSC-NTF 세포는, 신경발생과 신경-염증을 조절할 수 있는 미분화된 MSC와 비교해, 독특한 유전자, 단백질 및 miRNA를 발현한다.
MSC-NTF 세포 요법은 ALS 환자에서 I상 및 IIa상 오픈-라벨 시험을 진행한 바 있으며, 최근에는 미국에서 2상 다기관, 무작위 이중 맹검 위약-대조군 시험이 진행되었다. 이들 시험에서 척수강내 (IT) 또는 근육내 (IM)에 의해 또는 2가지 경로의 조합에 의해 투여된 MSC-NTF 세포의 안전성과 관용성이 검증되었다. 유의한 임상 효과가 특히 MSC-NTF 세포를 1회 투여한 후 신속한 진행성 ALS 참가자들에서 관찰되었다. 또한, 이식 후 2주간, MSC-NTF 세포-특이적인 NTF가 현저하게 증가하는 것으로 처리 환자의 뇌척수액 (CSF)에서 검출되었지만, 위약 환자에서는 그렇지 않았다. 아울러, MSC-NTF 세포-처리된 환자의 경우, CSF에서 NTF 증가와 염증성 마커의 감소 간에 통계학적으로 유의한 역 상관관계가 확인되었지만, 위약-처리 환자에서는 그렇지 않았다. 또한, 시험 참가자들의 CSF에서 동정된 세포-특이적인 및 ALS 특징적인 miRNA 분석은, 항-염증성 및 신경영양성 작동 기전을 뒷받침해주었다. MSC-NTF 세포에 대한 다기관 ALS 3상 이중 맹검 위약 대조군 다중투여 실험이 현재 미국 의학 센터 6곳에서 진행 중에 있다.
MSC-NTF 세포에 실질적인 이점을 제공함으로써 요법을 개선함과 동시에 MSC-NTF 세포의 치료학적 잠재성을 유지하는 요법을 확보하는 것이 ALS, 파킨슨병 및 다발성 경화증과 같은 신경퇴행성 질환을 앓고 있는 개체에게 유익할 것이다.
엑소좀은 MSC 등의 여러가지 세포 타입들에 의해 분리되는 나노 크기 (통상적으로 30-150 nm 직경)의 세포로부터 분비되는 소낭이다. 엑소좀은 다소포체 바디 (multivesicular bodies)로부터 기원하며, 원형질막에 융합된 후 세포외 환경으로 분비된다. 엑소좀은 이의 오리진 세포로부터 miRNA, mRNA, 지질 및 단백질을 함유할 수 있는 카고 (cargo)를 전달함으로써 세포-세포 교류에 참여하며, 궁극적으로 염증, 혈관신생 및 뉴런 생존 및 분화 조절 등의 다수의 세포 과정에 조절 기능을 제공한다.
엑소좀-기반의 요법은 세포 기반 요법 (예, MSC 요법)에 비해 몇가지 실질적인 이점을 가진다. 그중 한가지는 혈액 뇌 장벽 (BBB)을 신속하게 통과하여, 심층적인 CNS 조직으로 침투하지만 (Alvarez-Erviti, 2011 Neurobiol Dis. 42 (3):360-7), 온전한 세포 (intact cell)는 그렇지 않다는 것이다. 엑소좀의 다른 이점은, 엑소좀이 본래 불활성이므로 제조 안정성이 높은 반면, 살아있는 세포는 유효 기간이 짧아 계속적인 조절이 필요하다는 것이다. 엑소좀의 또 다른 이점은, 예를 들어 고 용량 및 고 농도로 투여하도록 제형화하기 매우 용이하여, 이의 치료학적 효과를 강화할 수 있다는 점이다 (Kalra, 2013 Proteomics. 13(22):3354-64). 엑소좀의 또 다른 이점은 면역원성이 낮으며, 예를 들어 면역 시스템에 의한 소거 또는 변성으로부터 벗어날 수 있는 능력이 강화되어, 반복 투여가 가능하다는 것이다 (Luca, 2014 Mol Neurobiol 49(1) 113-119). 면역원성이 낮거나 없는 엑소좀은, 세포 요법과는 완전히 대조적으로, 치료학적 제품을 상업적으로 사전-생산, 특정화, 검사 및 보관할 수 있는 옵션을 제공해주며, 이들 제품을 면역학적-매칭 없이 임의 수용자에게 추가적으로 투여할 수 있다는 점에서, 중요하다. 옴니-공여자-옴니-수용자 (omni-donor-omni-recipient) 치료제는, 폐쇄된 "환자 자신의 세포를 투여하는" 시스템을 필요로 하는 모든 세포-기반의 요법을 능가하는 상당한 이점을 가진다.
나아가, 세포와는 대조적으로, 엑소좀은 여러가지 계통의 세포로 전환-분화 (transdifferentiation)될 가능성이 없고, DNA 형질전환될 가능성도 없다. 또한, 엑소좀은 저분자량 치료제, 핵산 및 단백질의 기능적 수송을 위한 생체적합한 나노담체 특성과 이상적인 본질적인 구조 특성을 가진다.
본원은, 일 측면에서, 신경영양 인자 (NTF)를 포함하는 하나 이상의 카고 단백질을 대조군 MSC로부터 유래된 단리된 엑소좀 집단 내 하나 이상의 카고 단백질의 양과 비교해 증가된 양으로 포함하는, 신경영양 인자-분비성 간엽 줄기 세포 (MSC-NTF 세포)로부터 유래된 단리된 엑소좀 집단을 개시한다.
관련 측면에서, NTF는 백혈병 저해 인자 (LIF) 단백질, 혈관 내피 성장인자 A (VEGFA) 단백질 또는 성장 분화 인자 15 (GDF15) 단백질, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 다른 관련 측면에서, 하나 이상의 카고 단백질은 NTF 및 하나 이상의 부가적인 단백질을 포함한다. 추가적인 관련 측면에서, 부가적인 단백질은 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 1 (CXCL1) 단백질 또는 인터루킨 13 (IL13) 단백질, 또는 이들의 조합을 포함한다. 다른 관련 측면에서, LIF 단백질의 양은 적어도 50배 증가하거나, 또는 CXCL1 단백질의 양은 적어도 30배 증가하거나, 또는 IL13 단백질의 양은 적어도 5배 증가하거나, 또는 VEGFA의 양은 적어도 5배 증가하거나, 또는 GDF15의 양은 적어도 2배 증가하거나, 또는 이들의 임의 조합이다. 다른 관련 측면에서, 하나 이상의 부가적인 단백질은 IL36A, CCL7, MMP10, PIFG, CXCL8, LTA, CXCL6, MMP3, CHI3L1, IL11, FGF2, CXCL5, GAS1, JAML, TGFBR3, MEPE, IL6, PDGFA, CCL4, CCL21, CCL2, MIF, PLAU, ANGPTL4, CTSB, BSG, CCL5, TPO, IL23, IL1RL1, SPP1, F11R, INHBA, FAP, SPINT2, IL36G, TNFRSF10B 또는 TNFSF14 단백질, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다.
다른 측면에서, 단리된 엑소좀 집단은 분화 클러스터 (CD)9, CD29, CD63, CD81, CD44, CD49, CD73, CD90, CD105, CD61, CD271, ALIX, 종양 감수성 유전자 (TSG)101 및 이들의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 더 포함하거나; 또는 CD3, CD5, CD14, CD19, CD20, CD34, CD45, CD11B, FMC7, 칼넥신, HLA-DR (human leukocyte antigen - antigen D related) 및 이들의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커가 결여된 것이거나; 또는 이들의 임의 조합이다.
관련 측면에서, MSC는 골수 MSC, 지방세포 MSC, 치수 MSC, 태반 MSC, 활막 MSC, 말초혈 MSC, 구강 점막 MSC, 치근막 MSC, 자궁내막 MSC, 탯줄 MSC 및 제대혈 MSC로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 관련 측면에서, 단리된 엑소좀 집단은 간세포 성장인자 (HGF), 과립구 자극 인자 (G-CSF), 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF), 종양 괴사 인자-유발성 유전자 6 단백질 (TSG-6; TNF-자극된 유전자 6 단백질이라고도 함), 골 형태형성 단백질 2 (BMP2) 및 섬유모세포 성장인자 2 (FGF2), 및 이들의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 신경영양 인자 (NTF)를 더 포함한다. 추가적인 관련 측면에서, 단리된 엑소좀 집단은 miRNA (miR)-3663-3p, miR-132-3p, miR-150-3p, miR-762, miR-4327, miR-3665, miR-34a-5p, miR-1915, miR-34a-39, miR-34b-5p, miR-874, miR-4281, miR-1207-5p, miR-30b-5p, miR-29b-3p, miR-199b-5p, miR-30e-5p, miR-26a-5p 및 miR-4324, 및 이들의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA 분자를 더 포함하거나; 또는 단리된 엑소좀 집단은 miR-503, miR-3659, miR-3529-3p, miR-320b, miR-1275, miR-3132, miR-320a, miR-495, miR-181b-5p, miR-222-3p, miR-424-5p, miR-4284, miR-574-5p, miR-143-3p, miR-106a-5p, miR-455-3p, miR-20a-5p, miR-145-5p, miR-324-3p, miR-130b-3p, miR-1305 및 miR-140-3p, 및 이들의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA 분자가 결여되거나; 또는 이들의 임의 조합이다.
본원은, 일 측면에서, 신경영양 인자 (NTF)를 포함하는 하나 이상의 카고 단백질을 대조군 MSC로부터 유래된 단리된 엑소좀 집단 내 하나 이상의 카고 단백질과 비교해 증가된 양으로 포함하는, 신경영양 인자를 분비하는 간엽 줄기 세포 (MSC-NTF 세포) 유래 단리된 엑소좀 집단; 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 약학적 조성물을 기술한다.
일 측면에서, 본원은, 신경퇴행성 질환의 치료 방법에 사용하기 위한, 신경영양 인자 (NTF)를 포함하는 하나 이상의 카고 단백질을 대조군 MSC로부터 유래된 단리된 엑소좀 집단 내 하나 이상의 카고 단백질의 양과 비교해 증가된 양으로 포함하는, 신경영양 인자를 분비하는 간엽 줄기 세포 (MSC-NTF 세포)로부터 유래된 단리된 엑소좀 집단을 포함하는 약학적 조성물을 개시한다.
관련 측면에서, 이용하는 방법은 CD4+ T 세포 증식 감소, T 조절성 (T-reg) 세포 유도, IFN-γ 분비 감소, TNF-α 분비 감소 및 이들의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역조절 효과를 포함한다.
관련 측면에서, 신경퇴행성 질환은 근위축성 측색 경화증 (ALS), 전두측두엽 치매 (FTD), 파킨슨병, 다발 계통 위축 (MSA), 척수근 위축증 (SMA), 다발성 경화증 (MS), 알츠하이머병 (AD), 레트 증후군, 뇌성마비 (CP), 자폐범주성 장애 (ASD) 및 간질로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 측면에서, 본원은, 하나 이상의 카고 단백질을 증가된 양으로 포함하는 단리된 엑소좀 집단의 제조 방법으로서, (a) 인간 간엽 줄기 세포 (MSC)를 수득하는 단계, (b) 부착성 간엽 줄기 세포 (MSC)를 단리하는 단계, (c) 다이부티릴 사이클릭 아데노신 모노포스페이트, 인간 염기성 섬유모세포 성장인자, 인간 혈소판-유래 성장인자 및 인간 헤레굴린-β1으로 보충된 무혈청성 DMEM 배지에서 부착성 단핵 세포를 배양하는 단계, 및 (d) 무혈청 DMEM 배지에서 엑소좀 집단을 단리하는 단계를 포함하고, 상기 증가된 양이 미분화된 MSC 유래 단리된 엑소좀 집단 내 하나 이상의 카고 단백질의 양과 비교되는, 방법을 개시한다.
관련 측면에서, MSC는 골수 MSC, 지방세포 MSC, 치수 MSC, 태반 MSC, 활막 MSC, 말초혈 MSC, 구강 점막 MSC, 치근막 MSC, 자궁내막 MSC, 탯줄 MSC 및 제대혈 MSC로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가적인 관련 측면에서, MSC가 골수 MSC, 말초혈 MSC 또는 제대혈 MSC를 포함하는 경우, 단계 (a)는 골수 또는 혈액으로부터 인간 단핵 세포를 분리하는 것을 더 포함하고, 단계 (b)는 단핵 집단으로부터 단리된 부착성 MSC를 단리하는 것을 더 포함한다.
관련 측면에서, 단계 (b)는 200 mM L-글루타민, 100 mM 소듐 피루베이트, 2 IU/ml 헤파린 및 10% 혈소판 라이세이트가 보충된 글루코스 저 농도 DMEM 배지에서 부착성 단핵 세포를 증식시키는 것을 더 포함한다.
관련 측면에서, 단계 (c)에서 무혈청성 DMEM 배지에는 1 mM 다이부티릴 사이클릭 아데노신 모노포스페이트, 20 ng/mL 인간 염기성 섬유모세포 성장인자, 5 ng/mL 인간 혈소판-유래 성장인자 및 50 ng/mL 인간 헤레굴린-β1이 보충된다.
관련 측면에서, 단계 (d)는 단계 (c) 후 3일 경과시 수행된다.
일 측면에서, 본원은, 단리된 엑소좀이 하나 이상의 카고 단백질을 대조군 MSC로부터 유래된 단리된 엑소좀 집단 내 하나 이상의 카고 단백질의 양에 비해 증가된 양으로 포함하고; 카고 단백질이 NTF를 포함하고; 단리된 엑소좀 집단이 하기 단계를 포함하는 방법으로 제조되는, 신경영양 인자-분비성 간엽 줄기 세포 (MSC-NTF 세포)로부터 유래된 단리된 엑소좀 집단을 개시한다: (a) 인간 간엽 줄기 세포 (MSC)를 수득하는 단계, (b) 부착성 간엽 줄기 세포 (MSC)를 단리하는 단계, (c) 다이부티릴 사이클릭 아데노신 모노포스페이트, 인간 염기성 섬유모세포 성장인자, 인간 혈소판-유래 성장인자 및 인간 헤레굴린-β1으로 보충된 무혈청성 DMEM 배지에서 부착성 단핵 세포를 배양하는 단계, 및 (d) 무혈청 DMEM 배지에서 엑소좀 집단을 단리하는 단계.
발명의 내용인 단리된 엑소좀, 이의 단리 방법 및 그 용도는 본 명세서의 결론부에서 구체적으로 지적되면 명확하게 주장된다. 그러나, 단리된 엑소좀, 단리 방법 및 그 용도는 첨부된 도면과 함께 숙지할 경우 후술한 상세한 설명을 참조하여 가장 잘 이해될 것이다:
도 1은 엑소좀 크기 (직경, nm) 및 개수 분포를 도시한 선 그래프이다. 엑소좀 크기 및 개수는 나노입자 추적 분석 (tracking analysis)에 의해 측정하였다. MSC-NTF 세포로부터 단리된 엑소좀의 평균 직경은 약 130 nm이었다.
도 2A-2B는 MSC-NTF 세포 배양 배지로부터 접선 흐름 여과 (TFF)에 의해 단리한 엑소좀을 보여주는 전자 현미경 사진 2종이다. 엑소좀은 2% 파라포름알데하이드 및 2% 글루타르알데하이드에서 고정하고, 200 mesh lacey Formvar 탄소-코팅 그리드 상에 탑재하여 에탄 (gas)에서 급속 냉동하였다.
도 3A-3B는 배양된 뉴런에 의한 엑소좀 흡수 결과를 나타낸 것이다. 엑소좀은 RNA 선택 염료 (도 3A) 또는 막 염색 (도 3B)으로 염색하고, iPSC 인간 뉴런과 12시간 공동-배양하였다. 흡수는 형광 현미경 (도 3A, 배율 x10) 및 FACS 분석 (도 3B; SS는 측면 산란 (Side Scatter)이고, FL1은 형광 채널 1-480 nm임)으로 평가하였다.
도 4A-4E는 MSC-NTF 엑소좀의 면역조절 효과를 나타낸 것이다. 활성화된 PBMC를 엑소좀 (3.3x1010/ml)과 함께 또는 엑소좀 없이 96시간 배양하고, 96시간 후 CD4+ T 세포 증식 (도 4A), 96시간 후 IFN-γ 분비 유도 (도 4B) 및 96시간 후 TNF-α 분비 유도 (도 4C)를 조사하였다. (*p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001, n=3±SD). 도 4D는 2명의 건강한 공여자 유래 PBMC를 MSC-NTF 엑소좀과 2가지 농도 (4.6x109 및 2.3x109)로 3일간 공동-배양하였을 때 유세포 측정에 의해 측정된 CD4+CD25+FoxP3+ T-reg 농도 증가를 나타낸 것이다. 도 4E는 PBMC로부터 CD4+CD25+FoxP3+ (T-reg) 세포 유도와 MSC-NTF 엑소좀 간의 상관관계를 나타낸 것이다. 점 그래프는 FoxP3 및 CD25 양성 세포의 분포를 나타낸다. 엑소좀은 2가지 농도 (4.6x109 및 2.3x109)에서 PBMC와 3일간 공동-배양하였으며, T-reg의 표현형을 조사하였다. 대조군은 PBS + PBMC이다. 모든 세포는 CD4+이다.
도 5A-5C는 단리된 엑소좀에 대한 뉴런 세포의 기능적 반응을 나타낸 것이다. 도 5A는 MSC-NTF 엑소좀 1, 10 또는 20 ㎕ 첨가된 DCX-GFP 신경 전구체에서 6시간 간격으로 모니터링한, 신경돌기의 길이 변화에 의해 측정된 신경돌기 성장 (outgrowth) 유도를 조사한 실험의 결과를 도시한다 (PBS 처리 세포 - 대조군). 도 5B는 MSC-NTF 엑소좀의 신경보호 효과를 예시한 것이다. iPSC 유래 신경 전구 세포는 뉴런 분화 및 성숙 배지를 이용해 14일 동안 성숙한 뉴런으로 분화하였다. 15일에, 배지를 엑소좀 (입자 2-4x109) 또는 PBS (대조군)가 첨가된 신경영양-인자-결핍 배지로 교체하였다. 세포를 7일간 더 배양 유지하였다. 이 기간 동안 6시간 간격으로 세포의 사진을 촬영하였다. 신경돌기의 길이 변화를 뉴로트랙 모듈 (Neurotrack module)을 사용해 계산하였다. 도 5C는 MSC 엑소좀 및 MSC-NTF 엑소좀의 신경돌기 성장 효과를 예시한 것이다. SH-SY5Y 세포를 96웰 플레이트에 35,000 세포/cm2 밀도로 10% FBS 첨가된 DMEM F12 배지에 접종하였다. 24시간 후, 배지를 무혈청성 DMEM F12로 교체하고, 각 웰에 엑소좀 (입자 ~2x109)을 첨가하였다. 대조군은 PBS이다. 2시간 간격으로 세포의 사진을 촬영하였다. 신경돌기의 길이를 뉴로트랙 모듈을 사용해 계산하였다.
도 6은 엑소좀 마커 CD9 및 소포체 (ER) 마커 칼넥신에 대한 웨스턴-블롯 분석에 따른, MSC-NTF 세포의 2D 배양 컨디셔닝화된 배지 및 MSC-NTF 세포의 생물반응기 컨디셔닝화된 배지로부터 단리된 엑소좀의 순도를 MSC-NTF 세포 용해물과 비교해 나타낸 것이다.
도 7은 MSC 및 MSC-NTF 세포 배양으로 컨디셔닝화된 매질로부터 단리된 엑소좀 내 엑소좀 마커 CD81, CD63 및 CD9의 발현 수준과, MHC-I 및 MHC-II 발현 수준을 나타낸 것이다. 마우스 IgG를 음성 대조군으로 사용하였다. MSC-NTF 세포는 확인되는 바와 같이 2D 및 3D 배양으로 배양하였다.
도 8은 MSC 및 MSC-NTF 유래 엑소좀을 비교한 항체 어레이 데이터의 볼카노 플롯 (Volcano plot)이다. 모든 단백질들에 대한 데이터는 내림차순으로 배수 변화 (x 축) 대 p 값 (y 축)으로 그래프로 작성하였다. 유의한 p 값 (<0.05)의 역치는 점선으로 표시된다. p 값은 데이터 분포에 따라 윌콕슨 또는 스튜던트 t-검정을 이용해 계산하였다. 변화도가 낮은 (0.5-2배) 단백질은 검정색 원으로 표시하고, 변화도가 높은 (0.5배 미만 또는 2배 초과) 단백질은 연녹색 원으로 표시한다.
후술한 상세한 설명에서, 단리된 엑소좀, 이의 단리 방법 및 그 용도에 대해 충분한 이해를 제공하기 위해 다수의 구체적인 상세 내용이 기술된다. 다른 예로, 잘 알려진 방법, 공정 및 구성성분은 단리된 엑소좀, 그 단리 방법 및 그 용도가 모호해지지 않도록 하기 위해 상세히 기술하진 않는다.
본원은 단리된 "세포-타입 특이적인" 엑소좀을 기술하며, 여기서 세포-타입은 하나 이상의 신경영양 인자 (NTF)를 분비하도록 유도된 분화된 간엽 줄기 세포 (MSC)를 포함한다. 이러한 세포는 본원에서 "MSC-NTF" 또는 "MSC-NTF 세포"로 명명된다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "MSC-NTF 세포"가 본원에서 모두 동일한 특성 및 의미를 가지는 "MSC-NTF" 또는 "NurOwn®"와 상호 호환적으로 사용됨을 알 것이다.
구체적으로, 본원은 MSC-NTF 세포로부터 엑소좀의 제조 방법을 기술한다. MSC-NTF 세포로부터 단리된 엑소좀은, MSC-NTF 세포 없이도, 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 질환, 전두측두엽 치매 (FTD), 파킨슨병 (PD), 다계통 위축증 (MSA), 척수근 위축증 (SMA), 다발성 경화증 (MS), 알츠하이머병 (AD), 레트 증후군, 뇌성마비 (CP), 자폐범주성 장애 (ASD) 및 간질 등의 신경퇴행성 질환을 치료하기 위해, 사용할 수 있다.
단리된 MSC-NTF 엑소좀의 특징으로는, MSC-NTF 세포를 정의하며 특징이 되는, 마커 서브세트를 적어도 포함한다. 이들 마커는 막 마커, NTF 및 miRNA를 포함할 수 있다. 나아가, 이들 마커는 미분화된 MSC와 비교해 MSC-NTF에서 변형될 수 있으며, 또한 MSC의 단리된 엑소좀과 비교해 MSC-NTF의 단리된 엑소좀에서 변형될 수 있다. 아울러, 엑소좀은 유용한 "카고 (cargo)" 인자, 예를 들어 인슐린-유사 성장인자 (IGF)-1 및 -2, 또는 GDF-5, 또는 갈렉틴-1을 탑재함으로써, 변형될 수 있다. 다른 예시적인 "카고" 인자는 취약한 (vulnerable) 운동 뉴런을 타겟팅하는 것으로 알려진 분자, 예를 들어 매트릭스 메탈로프로테나제-9 (MMP-9) 및 miR-7을 타겟팅하는 siRNA 또는 miRNA일 수 있다.
또한, 본원은 신경퇴행성 질환 치료에 유익한 하나 이상의 분자를 포함하도록 변형된 간엽 줄기 세포 (MSC)로부터 단리된 엑소좀을 기술한다. 이들 단리된 MSC 엑소좀에는, 비-제한적인 예로, IGF-1, IGF-2, GDF-5, 갈렉틴-1, MM9 mRNA에 상보적인 뉴클레오티드를 코딩하는 siRNA 또는 이의 일부, 또는 miR-7, 또는 이들의 임의 조합 등의 유익한 분자가 함유되도록 탑재될 수 있다. 이들 변형된 MSC 엑소좀은 또한 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 질환, 전두측두엽 치매 (FTD), 파킨슨병 (PD), 다계통 위축증 (MSA), 척수근 위축증 (SMA), 다발성 경화증 (MS), 알츠하이머병 (AD), 레트 증후군, 뇌성마비 (CP), 자폐범주성 장애 (ASD) 및 간질 등의 신경퇴행성 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 구체적으로, 본원은 하나 이상의 유익한 분자를 포함하는 변형된 MSC 엑소좀의 제조 방법을 기술한다.
MSC-NTF 또는 MSC 유래 엑소좀에 유익한 분자를 탑재할 경우의 이점은, 이들 탑재되는 엑소좀이 이들이 단리된 세포 타입의 이점과 이에 탑재된 (즉, 변형된) 특이적으로 선택된 분자의 이점을 둘다 제공한다는 것이다. 엑소좀의 탑재는 당해 기술 분야에 공지된 방법, 예를 들어, 전기천공 (electroporation)을 이용하여 단리된 엑소좀 수준에서 직접 이루어지거나, 또는 엑소좀을 단리하기에 앞서 MSC 또는 MSC-NTF 세포가 하나 이상의 유익한 분자를 고도로 발현하거나 발현하도록 변형시켜, 단리된 엑소좀이 생성되었을 때 유익한 분자를 함유하게 할 수도 있다.
일부 구현예에서, 본원은 단리된 세포-타입 특이적인 엑소좀을 기술하며, 여기서 세포-타입은 하나 이상의 신경영양 인자 (NTF)를 분비하도록 유도된 분화된 MSC, MSC-NTF 세포를 포함하며, 하나 이상의 NTF의 기저 분비 (basal secretion) 수준은 미분화된 MSC에서 하나 이상의 NTF의 기저 분비 수준과 비교해 MSC-NTF에서 더 높다. 세포-타입 특이적인 엑소좀의 단리에 따른 이점은 MSC-NTF에 존재하는 구성성분으로부터 제공되는 이점으로서, 일부 구현예에서, 이들 세포로부터 단리된 엑소좀에도 존재할 수 있으며, 따라서 유익한 구성성분을 포함하는 요법이 확립되어, 세포 요법에서 발생할 수 있는 문제가 생기지 않는다.
본원에서 용어 "기저 분비"는 자극제의 첨가를 수반하지 않은 경우의 분비를 의미한다. MSC-NTF 세포는 본원에 기술된 방법을 사용해 미분화된 MSC로부터 제조할 수 있다. 따라서, 전형적으로, 미분화된 간엽 줄기 세포는 MSC-NTF 세포에서와 동일한 배지 내에 존재하지만, 분화 물질은 첨가되지 않는다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "단리된"은 생체내 단리로부터 획득되는 세포 (예, 비-제한적으로, 골수, 신경 조직, 지방세포 조직, 치수, 태반, 활막, 말초혈, 구강 점막, 치근막, 자궁내막, 탯줄 및 제대혈)를 지칭한다. 일 구현예에서, 단리된 세포에는 생체내 위치에서는 존재하는 기타 물질 (예, 다른 세포 타입)이 실질적으로 없다.
나아가, 당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "단리된"이 세포, 예를 들어 MSC 또는 분화된 MSC 세포로부터 단리된 엑소좀을 지칭함을 알 것이다. 일부 구현예에서, MSC의 프로파일과 이 세포로부터 단리된 엑소좀 간에는, 예를 들어 막 마커와 내부 카고 측면에서 강력한 연관성이 존재한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF의 프로파일과 이 세포로부터 단리된 엑소좀 간에는 강력한 연관성이 존재한다. 특히, 일부 구현예에서, 단리된 또는 정제된 엑소좀에 존재하는 NTF 및/또는 miRNA 분자의 프로파일과 엑소좀이 단리되는 대응되는 MSC-NTF 세포의 NTF 및/또는 miRNA 프로파일 간에는 연관성이 존재한다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "단리된 엑소좀"이, 일부 구현예에서, 모두 동일한 의미 및 특성을 가지는 "정제된 엑소좀" 또는 "정제된 엑소좀 분획"과 상호 호환적으로 사용될 수 있음을 알 것이다.
본원에서, 단수 형태 정관사 및 부정관사 ("a", "an" 및 "the")는 문맥상 그렇지 않은 것으로 명시되지 않은 한 복수의 지칭을 포함한다. 예를 들어, 용어 "엑소좀" 또는 "하나 이상의 엑소좀"은 복수의 엑소좀을 포함할 수 있다.
다른 구현예들에서, 유전자 변형된 MSC 세포에서 고도로 발현되는 분자의 프로파일과 유전자 변형된 MSC 세포로부터 단리된 엑소좀에서의 이들 분자들의 내용, 예를 들어 고도로 발현될 수 있는 성장인자 간에는 연관성이 존재한다. 다른 구현예들에서, 유전자 변형된 MSC에서 특이적으로 발현되는 siRNA 분자의 프로파일과 유전자 변형된 MSC로부터 단리된 엑소좀에서의 이들 siRNA 분자의 내용 간에는 연관성이 존재한다. siRNA 분자의 예로는 신경퇴행성 질환에 관여하는 타겟 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 감소시킬 수 있는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 또는 정제된 엑소좀에 존재하는 MSC 마커 분자의 프로파일과 단리된 대응되는 MSC의 마커 분자 프로파일 간에는 연관성이 존재한다.
다른 구현예들에서, MSC-NTF 세포 (MSC-NTF)에서 고도로 발현되는 분자의 프로파일과 MSC-NTF로부터 단리된 엑소좀에서의 이들 분자의 양 사이에는 연관성이 존재하며, 예를 들어 성장인자는 MSC-NTF 세포에서 고도로 발현될 수 있으며 이 세포로부터 유래된 엑소좀에서 다량으로 검출할 수 있다. 일부 구현예에서, MSC-NTF는 신경퇴행성 질환의 치료에 유익한 분자를 고도로 발현하도록 유전자 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 신경퇴행성 질환의 치료에 유익한 분자는 미분화된 MSC와 비교해 MSC-NTF에서 고도로 발현된다. 다른 구현예들에서, 유전자 변형된 MSC-NTF에서 특이적으로 발현되는 siRNA 분자의 프로파일과 MSC-NTF로부터 단리된 엑소좀에서의 siRNA 분자 간에는 연관성이 존재하며, 예를 들어 siRNA 분자는 신경퇴행성 질환에 관여하는 폴리펩타이드의 타겟 펩타이드를 감소시킨다. 일부 구현예에서, 단리된 또는 정제된 엑소좀에 존재하는 MSC-NTF 마커 분자의 프로파일과 단리된 대응되는 MSC-NTF의 마커 분자 프로파일 간에는 연관성이 존재한다.
본원에서, 일부 구현예에서, 용어 "발현한다"는 본원에 기술된 바와 같이 신경영양 인자 (NTF), miRNA 또는 siRNA의 합성 및/또는 분비를 포괄할 수 있다. 일부 구현예에서, 용어 "발현한다"는 본원에 기술된 바와 같이 miRNA의 합성 및/또는 분비를 포괄할 수 있다. 일부 구현예에서, 용어 "발현한다"는 본원에 기술된 바와 같이 siRNA의 합성 및/또는 분비를 포괄할 수 있다. 일부 구현예에서, MSC-NTF에서 NTF, miRNA 또는 siRNA의 발현시, NTF, miRNA 또는 siRNA를 발현하지 않는 MSC 또는 MSC-NTF로부터 단리된 엑소좀과 비교해, MSC-NTF로부터 단리된 엑소좀에서 NTF, miRNA 또는 siRNA의 양적 증가가 달성된다. 일부 구현예에서, 유전자 변형된 MSC에서 성장인자, miRNA 또는 siRNA의 발현시, 성장인자, miRNA 또는 siRNA를 발현하도록 유전자 변형되지 않은 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해, 유전자 변형된 MSC로부터 단리된 엑소좀에서 NTF, miRNA 또는 siRNA의 양적 증가가 달성된다. 일부 구현예에서, 발현은 고도의 발현을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현은 높은 수준으로의 발현을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원은 MSC-NTF 및/또는 MSC의 마커를 개시하며, 이들 마커는 유전자 명을 이용해 식별된다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 유전자 명을 이용해 마커를 식별하고, 마커 자체가 폴리펩타이드이고 유전자 발현의 증가 및 감소로 식별된 폴리펩타이드의 수준이 각각 증가 및 감소될 수 있음을, 알 것이다.
본원에 제시된 내용은 광의적으로 단리된 엑소좀, 엑소좀의 제조 방법, 이의 조성물 및 신경퇴행성 장애 등의 특정 질환 또는 장애의 치료에 있어 이의 이용 방법에 관한 것이다.
간엽 줄기 세포 ( MSC ) & 분화된 간엽 줄기 세포 ( MSC - NTF )
용어 "간엽 줄기 세포" "간엽 기질 세포", "다능성 기질 세포", "MSC", 또는 "MSCs"는, 분열하여 줄기 세포인 세포를 만들 수 있는 최종적으로 분화되지 않은, 또는 비가역적으로 분화하여 간엽 세포 계통의 세포가 되거나 또는 신경 계통과 같은 기타 비-중배엽 계통의 세포로 전환 분화하는, 성체 세포에 대해 상호 호환적으로 사용된다.
MSC의 소스는 건강한 개체로부터 유래하거나 또는 치료할 개체로부터 유래하거나 또는 치료할 개체와 면역학적으로-매칭되거나 또는 면역학적으로-매칭되지 않은 공여자로부터 유래할 수 있다. 일부 구현예에서, MSC의 소스는 신경퇴행성 질환을 앓고 있는 개체로부터 유래할 수 있다. 일부 구현예에서, MSC는 자가 세포를 포함한다. 대안적인 구현예에서, MSC는 동종이계 세포를 포함한다. 본원에 예시된 바와 같이, MSC 엑소좀 및 MSC-NTF 엑소좀은 엑소좀과 다수의 인간 수용자 (human recipients redundant) 간에 면역학적으로-매칭시킬 수 있는 MHC-I 및 MHC-II 분자를 거의 발현하지 않는다 (도 7).
MSC는 거의 모든 조직들에서 발견할 수 있으며, 다양한 조직들로부터 단리할 수 있다. 골수 (BM)가 가장 널리 인지되는 MSC 소스이지만, 최근 연구에서 지방세포 조직 (AT), 태반, 치수, 활막, 말초혈, 구강 점막, 치근막, 자궁내막, 탯줄 (UC) 및 제대혈 (UCB) 등의 MSC의 대안적인 소스들도 동정되었다. 실제, 증거에 따르면, MSC는 전신의 임의 혈관형성된 조직들에 사실상 존재할 수 있는 것으로 보인다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 MSC는 이것이 동정된 임의 조직으로부터 단리된다. 일부 구현예에서, MSC가 단리될 수 있는 조직으로는 골수, 지방세포 조직, 태반, 치수, 활막, 말초혈, 구강 점막, 치근막, 자궁내막, 탯줄 및 제대혈을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
말초혈로부터 MSC의 단리 방법은 Kassis et al (Bone Marrow Transplant. 2006 May; 37(10):967-76)에 의해 기술되어 있다. 태반 조직으로부터 MSC 단리 방법은 Semenov et al. (Semenov OV et al. Am J Obstet Gynecol. 2010 Feb;202(2):193)에 설명되어 있다. 지방세포 조직, 태반 및 제대혈 MSC의 단리 및 배양 방법은 Kern et al (Stem Cells, 2006; 24:1294-1301)에 설명되어 있다. 일부 구현예에서, 당해 기술 분야에 공지된 임의 방법은 MSC가 동정된 조직으로부터 MSC를 단리하는데 이용할 수 있다.
본원에 기술된 MSC는 임의의 줄기 세포로부터 유래될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 일 구현예에서, MSC 세포는 골수 MSC를 포함한다. 다른 구현예에서, MSC 세포는 지방세포 MSC를 포함한다. 다른 구현예에서, MSC 세포는 치수 MSC를 포함한다. 다른 구현예에서, MSC 세포는 힘줄로부터 수득되는 MSC를 포함한다. 다른 구현예에서, MSC 세포는 태반으로부터 수득되는 MSC를 포함한다. 다른 구현예에서, MSC 세포는 탯줄으로부터 수득되는 MSC를 포함한다. 다른 구현예에서, MSC 세포는 지방세포 조직으로부터 수득되는 MSC를 포함한다. 다른 구현예에서, MSC 세포는 활막으로부터 수득되는 MSC를 포함한다. 다른 구현예에서, MSC 세포는 말초혈으로부터 수득되는 MSC를 포함한다. 다른 구현예에서, MSC 세포는 치근막으로부터 수득되는 MSC를 포함한다. 다른 구현예에서, MSC 세포는 구강 점막으로부터 수득되는 MSC를 포함한다. 다른 구현예에서, MSC 세포는 자궁내막으로부터 수득되는 MSC를 포함한다. 다른 구현예에서, MSC 세포는 제대혈로부터 수득되는 MSC를 포함한다. 다른 구현예에서, MSC는 배아 줄기 (ES) 세포로부터 유래하지 않는다. 다른 구현예에서, MSC는 성체 줄기 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, MSC는 인간의 것이다. 일부 구현예에서, MSC는 개체 자가의 것이다. 일부 구현예에서, MSC는 개체와 면역학적으로-매칭된다. 다른 구현예들에서, MSC는 개체에 대해 비-자가의 것이다. 다른 구현예에서, MSC는 개체에 대해 동종이계의 것이다.
일부 구현예에서, MSC는 건강한 개체로부터 수득된다. 일부 구현예에서, MSC는 신경퇴행성 질환을 앓고 있는 개체로부터 수득된다. 일부 구현예에서, MSC는 근위축성 측색 경화증 (ALS), 전두측두엽 치매 (FTD), 파킨슨병 (PD), 다발 계통 위축 (MSA), 척수근 위축증 (SMA), 다발성 경화증 (MS), 알츠하이머병 (AD), 레트 증후군, 뇌성마비 (CP), 자폐범주성 장애 (ASD) 또는 간질을 포함하는 신경퇴행성 질환을 앓고 있는 개체로부터 수득된다. 일부 구현예에서, MSC는 ALS를 앓고 있는 개체로부터 수득된다. 일부 구현예에서, MSC는 FTD를 앓고 있는 개체로부터 수득된다. 일부 구현예에서, MSC는 PD를 앓고 있는 개체로부터 수득된다. 일부 구현예에서, MSC는 MSA를 앓고 있는 개체로부터 수득된다. 일부 구현예에서, MSC는 MS를 앓고 있는 개체로부터 수득된다. 일부 구현예에서, MSC는 AD를 앓고 있는 개체로부터 수득된다. 일부 구현예에서, MSC는 레트 증후군을 앓고 있는 개체로부터 수득된다. 일부 구현예에서, MSC는 CP를 앓고 있는 개체로부터 수득된다. 일부 구현예에서, MSC는 ASD를 앓고 있는 개체로부터 수득된다. 일부 구현예에서, MSC는 간질을 앓고 있는 개체로부터 수득된다.
일부 구현예에서, MSC는 유전자 변형되지 않거나, 또는 비-유전자 변형된 것이다. 일부 구현예에서, MSC는 인간 세포이다. 일 구현예에서, 골수는 흡인 (aspiration)에 의해 개체의 장골릉으로부터 단리될 수 있다. BM 단핵 세포 (BMMNC)는, 예를 들어, FICOLL-PAQUE 밀도 농도구배 원심분리에 의해 분리될 수 있다. MSC를 수득하기 위해, MSC를 포함하는 세포 집단 (예, BMMNC)을, 예를 들어, 혈소판 라이세이트의 존재 하에 세포를 유지 및/또는 증폭시킬 수 있는 증식 배지에서 배양할 수 있다. 일부 구현예에서, 집단을 폴리스티렌 플라스틱 표면 (예, 조직 배양 플라스크)에 접종하고, 비-부착성 세포를 제거함으로써 MSC를 단리한다. 일부 구현예에서, 집단을 생물반응기의 챔버 안에 존재하는 폴리머 표면에 접종하고, 생물반응기 챔버 안에서 비-부착성 세포를 제거함으로써 MSC를 단리한다. 일부 구현예에서, 집단을 생물반응기의 챔버 안에 있는 부착성 세포 증식을 실시할 수 있는 표면에 접종하고, 생물반응기 챔버 안에서 비-부착성 세포를 제거함으로써 MSC를 단리한다. 대안적으로, MSC는 MSC 마커에 대한 항체를 이용하여 FACS 분류에 의해 단리할 수 있다.
일부 구현예에서, MSC는 신경퇴행성 질환을 치료하는데 유익한 하나 이상의 분자를 발현하도록 변형된다. 세포에서 외인성 분자를 발현하는 방법은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 일부 구현예에서, MSC는 신경퇴행성 질환을 치료하는데 유익한 하나 이상의 분자를 발현하도록 유전자 변형된다. 일부 구현예에서, MSC는 신경퇴행성 질환을 치료하는데 유익한 하나 이상의 분자를 고 수준으로 발현하도록 유전자 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 신경퇴행성 질환을 치료하는데 유익한 분자는 성장인자, miRNA 및/또는 siRNA를 포함한다.
다른 구현예에서, MSC 및/또는 MSC-NTF 세포는 생물반응기에서 3D 배양으로 배양한다. MSC-NTF 세포 증식에 사용될 수 있는 생물반응기의 예는 PBS 버티컬-휠 생물반응기 (Vertical-Wheel Bioreactor)이다. PBS 버티컬-휠 생물반응기는 미세담체 비드들을 균질하게 혼합하는 수직-교반 기법을 구비한다. PBS 버티컬-휠 생물반응기는 통제된 환경에서 부착성 세포 집단으로부터 생산을 스케일링 (scaling)할 수 있으며, 고도로 일체화된 1회용 장치를 현행 우수 제조 관리 기준에 부합하도록 수정할 수 있다.
다른 구현예에서, MSC 및/또는 MSC-NTF 세포를 부착성 세포의 고밀도 증식을 위해 고안된 생물반응기에서 배양한다. 일부 구현예에서, 고밀도 증식은 전단 응력이 낮거나 또는 거품 발생 및 버블링이 없거나, 또는 산소 제한이 없거나, 또는 이들의 임의 조합을 갖춘 시스템을 포함한다. 고밀도 증식 및 고-생산성을 위해 고안된 생물반응기의 일 예는 VacciXcell 사의 CelCradle™이다. 일부 구현예에서, 고밀도 반응기 시스템은 1회용 생물반응기를 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 및/또는 MSC-NTF 세포를 고밀도 생물반응기 시스템에서 배양할 경우, 정제된 엑소좀의 수율이 증가한다. 일부 구현예에서, MSC 및/또는 MSC-NTF 세포를 3차원 증식 (3D 증식)을 포함하는 생물반응기 시스템에서 배양할 경우, 정제된 엑소좀의 수율이 증가한다. 일부 구현예에서, MSC 및/또는 MSC-NTF 세포를 3차원 증식을 포함하는 고밀도 생물반응기 시스템에서 배양할 경우, 정제된 엑소좀의 수율이 증가한다. 일부 구현예에서, 2D 증식 조건 및 3D 증식 조건에서 배양한 MSC-NTF로부터 단리된 엑소좀은 비슷한 카고 프로파일을 가진다. 일부 구현예에서, 2D 증식 조건 및 3D 증식 조건에서 배양한 MSC-NTF로부터 단리된 엑소좀은 비슷한 기능적 특성을 가진다.
일부 구현예에서, 엑소좀을 분비하는 세포를 3차원 배양 증식 조건에서 배양할 경우, 2차원 배양 조건과 비교해, 정제된 엑소좀의 수율이 증가한다 (실시예 1 참조). 일부 구현예에서, 3차원 배양 증식 조건에서 배양할 경우, 2차원 배양 조건과 비교해, 세포로부터 엑소좀의 분비가 증가한다.
일부 구현예에서, 엑소좀의 대량 생산 및 정제 방법은 고밀도 생물반응기 시스템에서 MSC-NTF 세포를 배양하는 단계, 또는 MSC-NTF 세포의 3차원 배양 단계, 또는 세포의 3차원 배양을 포함하는 고밀도 생물반응기 시스템에서 MSC-NTF 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 엑소좀의 대량 생산 및 정제 방법은 고밀도 생물반응기 시스템에서 MSC 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 엑소좀의 대량 생산 및 정제 방법은 MSC의 3차원 배양 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 엑소좀의 대량 생산 및 정제 방법은 세포의 3차원 배양을 포함하는 고밀도 생물반응기 시스템에서 MSC를 배양하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 엑소좀을 생산 및 정제하기 위한 세포 샘플의 제공은 고밀도 생물반응기 시스템에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 샘플의 제공은 세포의 3차원 배양 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 샘플의 제공은 세포의 3차원 배양을 포함하는 고밀도 생물반응기 시스템에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 제공되는 세포 샘플은 분화된 MSC 세포 또는 미분화된 MSC 세포 또는 유전자 변형되고 분화된 MSC 세포, 또는 유전자 변형된 미분화된 MSC를 포함한다.
일부 구현예에서, 분화 단계에 앞서 생물반응기를 사용해 세포를 확대 (expansion) 및 증폭시킨다. 생물반응기는 세포 배양에 이용될 수 있으며, 생물반응기 조건은 세포 고 농축에 적합하다. 다른 구현예에서, 생물반응기는 세포 확대를 위한 폐쇄된 시스템을 제공한다. 다른 구현예에서, 복수의 생물반응기들이 세포 확대 단계에서 연속적으로 사용된다. 다른 구현예에서, 생물반응기는 유전자 변형된 MSC의 증폭 방법에 사용된다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 사용되는 생물반응기는 1회용 생물반응기이다. 다른 구현예에서, 사용되는 생물반응기는 다회용 생물반응기이다. 또 다른 구현예에서, 생물반응기는 공정의 파라미터를 모니터링 및 통제하기 위한 통제 유닛을 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 및/또는 유전자 변형된 MSC는 생물반응기에서 확대 및 증폭된다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포 및/또는 유전자 변형된 MSC-NTF 세포는 생물반응기에서 분화 유도된다. 일부 구현예에서, 유전자 변형된 MSC를 확대하고, 유전자 변형된 MSC-NTF로 분화 유도한다.
일부 구현예에서, 확대 및/또는 분화 유도는 생물반응기에서 수행된다. 세포는 단리 후, 예를 들어, 혈소판 라이세이트의 존재 하에 단리된 세포를 생체외 유지 및/또는 확대할 수 있는 증식 배지에서 배양함으로써 전형적으로 확대한다. 일부 구현예에서, 증식 배지는 DMEM, α-MEM 또는 DMEM/F12를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, MSC가 인간의 것일 경우, 혈소판 라이세이트 역시 인간 세포로부터 수득된다. 일 구현예에서, 배지에는 이종 오염원 (xeno contaminant)이 없으며, 즉 동물 유래 성분이 없다. MSC 단리 및 증폭 프로토콜은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 국제 특허 WO 2018/015945의 실시예 1을 참조하며, 이는 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
단리된 (및 선택적으로 증폭된) 세포 집단이 MSC를 포함한다는 검증은 표현형 및 기능 척도의 식별에 의해 수행할 수 있다. 표현형 척도는 특이적인 표면 항원의 발현: CD73, CD90 및 CD105 (≥95% 양성)과, CD-3 (T 세포 표면 마커), CD14 (단핵구 표면 마커), CD19 (B 세포), CD34 (조혈 줄기 세포), CD45 (조혈 세포), CD5, CD11B, CD20, FMC7 및 HLA-DR (인간 클래스 II 조직적합성 항원)를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커의 부재 (<2%)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, MSC에는 CD3, CD14, CD19, CD34, CD45, CD5, CD11B, CD20, FMC7 또는 HLA-DR, 또는 이들의 임의 조합이 결핍되어 있다. 일부 구현예에서, MSC 세포에는 마커 CD3, CD14, CD19, CD34, CD45, CD5, CD11B, CD20, FMC7 또는 HLA-DR 중 하나 이상이 결핍되어 있다. 일부 구현예에서, MSC 세포에는 마커 CD3, CD14, CD19, CD34, CD45, CD5, CD11B, CD20, FMC7 또는 HLA-DR 중 2개 이상이 결핍되어 있다. 일부 구현예에서, MSC 세포에는 마커 CD3, CD14, CD19, CD34, CD45, CD5, CD11B, CD20, FMC7 또는 HLA-DR 중 3개 이상이 결핍되어 있다. 일부 구현예에서, MSC 세포에는 마커 CD3, CD14, CD19, CD34, CD45, CD5, CD11B, CD20, FMC7 또는 HLA-DR 중 4개 이상이 결핍되어 있다. 일부 구현예에서, MSC 세포에는 마커 CD3, CD14, CD19, CD34, CD45, CD5, CD11B, CD20, FMC7 또는 HLA-DR 중 5개 이상이 결핍되어 있다. 일부 구현예에서, MSC 세포에는 마커 CD3, CD14, CD19, CD34, CD45, CD5, CD11B, CD20, FMC7 또는 HLA-DR 중 6개 이상이 결핍되어 있다. 일부 구현예에서, MSC 세포에는 마커 CD3, CD14, CD19, CD34, CD45, CD5, CD11B, CD20, FMC7 또는 HLA-DR 중 7개 이상이 결핍되어 있다. 일부 구현예에서, MSC 세포에는 마커 CD3, CD14, CD19, CD34, CD45, CD5, CD11B, CD20, FMC7 또는 HLA-DR 중 8개 이상이 결핍되어 있다. 일부 구현예에서, MSC 세포에는 마커 CD3, CD14, CD19, CD34, CD45, CD5, CD11B, CD20, FMC7 또는 HLA-DR 중 9개 이상이 결핍되어 있다. 일부 구현예에서, MSC 세포에는 마커 CD3, CD14, CD19, CD34, CD45, CD5, CD11B, CD20, FMC7 또는 HLA-DR이 모두 결핍되어 있다. 일부 구현예에서, MSC 세포에는 마커 CD3, CD14, CD19, CD34, CD45, CD5, CD11B, CD20, FMC7 또는 HLA-DR 중 1-3개가 결핍되어 있다. 일부 구현예에서, MSC 세포에는 마커 CD3, CD14, CD19, CD34, CD45, CD5, CD11B, CD20, FMC7 또는 HLA-DR 중 1-4개가 결핍되어 있다. 일부 구현예에서, MSC 세포에는 마커 CD3, CD14, CD19, CD34, CD45, CD5, CD11B, CD20, FMC7 또는 HLA-DR 중 1-5개가 결핍되어 있다. 일부 구현예에서, MSC 세포에는 마커 CD3, CD14, CD19, CD34, CD45, CD5, CD11B, CD20, FMC7 또는 HLA-DR 중 2-4개가 결핍되어 있다. 일부 구현예에서, MSC 세포에는 마커 CD3, CD14, CD19, CD34, CD45, CD5, CD11B, CD20, FMC7 또는 HLA-DR 중 3-5개가 결핍되어 있다. 이들 세포의 표면 발현은 당해 기술 분야에 공지된 방법을 이용해, 예를 들어 유세포 측정으로 분석할 수 있다.
MSC 및 MSC-NTF 세포의 표현형은, 일부 구현예에서, 유사한 형태학적 및/또는 구성성분 표현형을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기술된 MSC-NTF 세포는 MSC와 비슷한 형태 (스핀들-유사 형태)를 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, MSC-NTF는 유래된 소스 MSC와는 다른 형태를 포함한다. 대안적으로 또는 부가적으로, 본원에 기술된 세포는 MSC에 전형적이지만 네이티브 성상 세포에는 비정형적인 마커 (예, 표면 마커)를 발현할 수 있다. MSC-NTF 세포 표면 마커의 예로는, 비-제한적으로 CD105, CD29, CD44, CD90, CD73, CD271 및 CD49를 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포는, 비-제한적으로, CD105, CD29, CD44, CD90, CD73, CD271 또는 CD49, 또는 이들의 임의 조합 등의 하나 이상의 세포 표면 마커를 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포에는 CD34, CD45, CD19, CD5, CD20, CD11B, CD3, CD14, HLA-DR 또는 FMC7, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 세포 표면 마커 또는 마커들이 결핍되어 있다. 일부 구현예에서, MSC에는 CD34, CD45, CD19, CD5, CD20, CD11B, CD3, CD14, HLA-DR 또는 FMC7, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 세포 표면 마커 또는 마커들이 결핍되어 있다.
일부 구현예에서, MSC-NTF는 CD105, CD29, CD44, CD90, CD73, CD271 또는 CD49, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 막 마커를 포함하며; CD34, CD45, CD19, CD5, CD20, CD11B, CD3, CD14, HLA-DR 및 FMC7, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커 또는 마커들의 조합을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 유전자 변형된 MSC는 MSC 막 마커를 보유한다. 일부 구현예에서, 유전자 변형된 MSC에는 CD34, CD45, CD19, CD5, CD20, CD11B, CD3, CD14, HLA-DR 및 FMC7, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포 표면 마커 또는 마커들의 조합이 결핍되어 있다.
MSC의 존재 또는 부재를 검증하기 위해 사용될 수 있는 항체의 예로는, 예를 들어, 비-제한적으로, CD73 PE 접합체 (BD Pharmingen), CD90 PE-Cy5 접합체 (eBioscience) CD105 PE 접합체 (Beckman Coulter) CD14 FITC 접합체 (eBioscience) CD19 PE-Cy5 접합체 (eBioscience) CD34 FITC 접합체 (Beckman Coulter), CD45 PE 접합체 (eBioscience) 및 HLA-DR PE-Cy5 접합체 (BD Pharmingen)를 포함한다.
MSC의 존재를 검증하기 위한 다른 방법은, 세포가 예를 들어 지방세포, 골세포 및 연골 세포와 같은 다중-계통으로 분화할 수 있음을 확인하는 것이다. 이는, 예를 들어, 인간 MSC 기능 식별 키트 (R&D Systems)를 사용함으로써 수행할 수 있다.
본원에 기술된 바와 같이, 혈소판 라이세이트 함유 배지에서 MSC를 증폭시킨 후, 신경퇴행성 장애를 치료하는데 유용한 세포를 생성하기 위한 분화 배지에서 세포를 분화시킬 수 있다.
분화 배지 및 그 성분은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 분화 배지의 성분들은 필요한 세포 표현형에 따라 선택되는 것으로 이해될 것이다.
일부 구현예에서, MSC-NTF는 CD105, CD29, CD44, CD90, CD73, CD271 또는 CD49, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 막 마커를 포함하고; CD34, CD45, CD19, CD5, CD20, CD11B, CD3, CD14, HLA-DR 및 FMC7을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커 또는 마커들의 임의 조합을 포함하지 않는다. 분화된 MSC로부터 단리된 엑소좀은, 따라서, CD105, CD29, CD44, CD90, CD73, CD271 또는 CD49, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 막 마커를 포함하지만; CD34, CD45, CD19, CD5, CD20, CD11B, CD3, CD14, HLA-DR, 칼넥신 및 FMC7을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커 또는 마커들의 임의 조합을 포함하지 않을 것으로 예상된다.
일부 구현예에서, MSC는 하나 이상의 신경영양 인자 (NTF)를 분비하도록 유도되며, 이러한 세포 집단은 "MSC-NTF 세포" 또는 "MSC-NTF"로 언급된다.
본원에서, 용어 "신경영양 인자" ("NTF")는 뉴런에 대한 증식, 분화, 기능적 유지 및/또는 생존 효과를 포함하는 중추 신경계에 작용하는 세포-분비성 인자를 지칭한다. 신경영양 인자의 예로는, 예를 들어, 비-제한적으로, 혈관 내피 성장인자 (VEGF), 간세포 성장인자 (HGF), 백혈병 저해 인자 (LIF), 신경교 유래 신경영양 인자 (GDNF), 뉴로트로핀-3 (NT-3), 뉴로트로핀-4/5, 뉴르투린 (Neurturin, NTN), 뉴로트로핀-4, 퍼세핀 (Persephin), 아르테민 (artemin, ART), 섬모 신경영양 인자 (CNTF), 인슐린 성장인자-I (IGF-1), 증식 및 분화 인자 (GDF-15), 과립구 자극 인자 (G-CSF), 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF), 종양 괴사 인자-유발성 유전자 6 단백질 (TSG-6; TNF-자극된 유전자 6 단백질이라고도 함), 골 형태형성 단백질 2 (BMP2) 및 섬유모세포 성장 인자 2 (FGF2)를 포함한다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "단백질" 및 "폴리펩타이드"가 본원에서 상호 호환적으로 사용되고 이들 모두 동일한 의미 및 특성을 가짐을 알 것이다. 일부 구현예에서, "폴리펩타이드" 또는 "단백질"는 본원에서 네이티브 폴리펩타이드 (분해 산물, 합성 폴리펩타이드 또는 재조합 폴리펩타이드) 및 펩타이드 모방체 (전형적으로, 합성 폴리펩타이드)뿐 아니라, 일부 구현예에서, 폴리펩타이드를 신체에서 더 안정적이게 만들거나 또는 세포에 더 잘 침투할 수 있게 만드는 변형을 포함하는, 폴리펩타이드 유사체인 펩토이드 및 세미펩토이드를 포괄하는 것으로, 이해될 것이다. 일부 구현예에서, 단백질은 달리 정의되거나 또는 지정되지 않은 한 최소 길이로 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 단백질은 그 자체가 신경퇴행성 질환의 타겟일 수 있는 세포에 존재하는 펩타이드, 예를 들어 자연적으로 생기는 펩타이드를 포함한다.
일 구현예에서, NTF는 VEGF, HGF, LIF, GDNF, NT-3, 뉴로트로핀-4/5, NTN, 뉴로트로핀-4, 퍼세핀, ART, CNTF, IGF-1, GDF-15, G-CSF, BDNF, TSG-6, BMP2 및 FGF2를 포함하는 군, 또는 이들의 임의 조합으로부터 선택된다.
다른 구현예에서, NTF는 VEGF이다. 다른 구현예에서, NTF는 HGF이다. 다른 구현예에서, NTF는 LIF이다. 다른 구현예에서, NTF는 GDNF이다. 다른 구현예에서, NTF는 NT-3이다. 다른 구현예에서, NTF는 뉴로트로핀-4/5이다. 다른 구현예에서, NTF는 NTN이다. 다른 구현예에서, NTF는 뉴로트로핀-4이다. 다른 구현예에서, NTF는 퍼세핀 또는 ART이다. 다른 구현예에서, NTF는 CNTF이다. 다른 구현예에서, NTF는 IGF-1이다. 다른 구현예에서, NTF는 GDF-15이다. 다른 구현예에서, NTF는 G-CSF이다. 다른 구현예에서, NTF는 BDNF이다. 다른 구현예에서, NTF는 TSG-6이다. 다른 구현예에서, NTF는 BMP2이다. 다른 구현예에서, NTF는 FGF2이다.
다른 구현예에서, MSC-NTF 세포는, VEGF, HGF, LIF, GDNF, NT-3, 뉴로트로핀-4/5, NTN, 뉴로트로핀-4, 퍼세핀, ART, CNTF, IGF-1, GDF-15, G-CSF, BDNF, TSG-6, BMP2 및 FGF2를 포함하는 군, 또는 이들의 임의 조합으로부터 선택되는, 하나 이상의 NTF를 분비한다.
다른 구현예에서, MSC-NTF 세포는 VEGF를 분비한다. 다른 구현예에서, MSC-NTF 세포는 HGF를 분비한다. 다른 구현예에서, MSC-NTF 세포는 LIF를 분비한다. 다른 구현예에서, MSC-NTF 세포는 GDNF를 분비한다. 다른 구현예에서, MSC-NTF 세포는 NT-3를 분비한다. 다른 구현예에서, MSC-NTF 세포는 뉴로트로핀-4/5를 분비한다. 다른 구현예에서, MSC-NTF 세포는 NTN을 분비한다. 다른 구현예에서, MSC-NTF 세포는 뉴로트로핀-4를 분비한다. 다른 구현예에서, MSC-NTF 세포는 퍼세핀을 분비한다. 다른 구현예에서, MSC-NTF 세포는 ART를 분비한다. 다른 구현예에서, MSC-NTF 세포는 CNTF를 분비한다. 다른 구현예에서, MSC-NTF 세포는 IGF-1을 분비한다. 다른 구현예에서, MSC-NTF 세포는 GDF-15을 분비한다. 다른 구현예에서, MSC-NTF 세포는 G-CSF를 분비한다. 다른 구현예에서, MSC-NTF 세포는 BDNF를 분비한다. 다른 구현예에서, MSC-NTF 세포는 TSG-6를 분비한다. 다른 구현예에서, MSC-NTF 세포는 BMP2를 분비한다. 다른 구현예에서, MSC-NTF 세포는 FGF2를 분비한다.
다른 구현예에서, MSC-NTF 세포는 적어도 2종의 NTF를 분비한다. 다른 구현예에서, MSC-NTF 세포는 적어도 3종의 NTF를 분비한다. 다른 구현예에서, MSC-NTF 세포는 적어도 4종의 NTF를 분비한다. 다른 구현예에서, MSC-NTF 세포는 적어도 5종의 NTF를 분비한다.
신경영양 인자-분비성 인간 간엽 기질 줄기 세포는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, PCT 국제 특허 WO 2014/024183 및 WO 2015/121859; Gothelf et al., 2014, Clin Transl Med., 3:21; Petrou et al. 2014; Muscle & Nerve. 49(3):455-457; 및 Petrou et al., 2016, JAMA Neurol. 73(3):337-44에 충분히 기술되어 있으며, 이들 모두 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
일 구현예에서, 본원에 기술된 MSC-NTF 세포는 혈관 내피 성장인자 (VEGF), 간세포 성장인자 (HGF), 백혈병 저해 인자 (LIF), 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF), 종양 괴사 인자-유발성 유전자 6 단백질 (TSG-6; TNF-자극된 유전자 6 단백질이라고도 함), 골 형태형성 단백질 2 (BMP2), 섬유모세포 성장 인자 2 (FGF2), 또는 과립구 자극 인자 (G-CSF), 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 NTF를 분비한다.
다른 구현예에서, 본원에 기술된 MSC-NTF 세포는 혈관 내피 성장인자 (VEGF), 간세포 성장인자 및 백혈병 저해 인자 (LIF)를 포함하는 군으로부터 선택되는 NTF를 분비한다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 MSC-NTF 세포는 혈관 내피 성장인자 (VEGF), 간세포 성장인자, 백혈병 저해 인자 (LIF), 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF), 종양 괴사 인자-유발성 유전자 6 단백질 (TSG-6; TNF-자극된 유전자 6 단백질이라고도 함), 골 형태형성 단백질 2 (BMP2), 섬유모세포 성장 인자 2 (FGF2) 및 과립구 자극 인자 (G-CSF)를 포함하는 군으로부터 선택되는 NTF를 분비한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 MSC-NTF 세포 집단들 중 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 그 이상이 하나 이상의 NTF를 발현한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 MSC-NTF 세포 집단들 중 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 그 이상이 하나 이상의 NTF를 분비한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포로부터 단리된 엑소좀은 MSC-NTF 세포에 의해 분비되는 하나 이상의 NTF를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 MSC-NTF 세포는 하나 이상의 miRNA 분자를 발현한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 MSC-NTF 세포는 하나 이상의 miRNA 분자를 발현 및 분비한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 miRNA는 생물학적 샘플에 존재한다. HumMSC-NTF 세포가 분비하는 특이적인 Micro-RNA들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, Gothelf et al., (2017) Stem Cell Research & Therapy 8:249에 충분히 기술되어 있다.
특정 구현예에서, 대조군 MSC 세포는 미분화된 MSC이다. 특정 구현예에서, 대조군 MSC 세포는 NTF를 증가된 양으로 분비하지 않는다.
일부 구현예에서, MSC-NTF 세포에서 하나 이상의 miRNA 분자의 발현은 대조군 MSC에서 관찰되는 수준보다 높다. 일부 구현예에서, MSC-NTF를 투여받은 개체로부터 유래된 생물학적 샘플, 예를 들어 CSF 생물학적 샘플에서 하나 이상의 miRNA 분자의 농도는 등가의 대조군 생물학적 샘플에서 관찰되는 수준보다 높다. 일부 구현예에서, MSC-NTF를 투여받은 개체로부터 유래된 생물학적 샘플, 예를 들어 뇨 생물학적 샘플에서 하나 이상의 miRNA 분자의 농도는 등가의 대조군 생물학적 샘플에서 관찰되는 수준보다 높다. 일부 구현예에서, MSC-NTF를 투여받은 개체로부터 유래된 생물학적 샘플, 예를 들어 혈액 생물학적 샘플에서 하나 이상의 miRNA 분자의 농도는 등가의 대조군 생물학적 샘플에서 관찰되는 수준보다 높다. 일부 구현예에서, MSC-NTF를 투여받은 개체로부터 유래된 생물학적 샘플, 예를 들어 혈액 혈청 생물학적 샘플에서 하나 이상의 miRNA 분자의 농도는 등가의 대조군 생물학적 샘플에서 관찰되는 수준보다 높다. 일부 구현예에서, miRNA는 예를 들어 엑소좀 방식에 의해 MSC-NTF 세포로부터 배출될 수 있다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포로부터 하나 이상의 miRNA 분자의 발현 및/또는 분비는 대조군 MSC에서 관찰되는 수준보다 높다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포로부터 단리된 엑소좀은 MSC-NTF 세포에서 발현되는 하나 이상의 miRNA 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 MSC-NTF 세포는 대조군 MSC와 비교해 하나 이상의 miRNA의 발현이 감소되거나 또는 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 MSC-NTF 세포는 대조군 MSC와 비교해 하나 이상의 miRNA의 분비가 감소되거나 또는 분비하지 않는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 MSC-NTF 세포는 대조군 MSC와 비교해 하나 이상의 miRNA의 발현 또는 분비가 감소되거나 또는 발생하지 않는다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 MSC-NTF 세포는 다른 세포에서 하나 이상의 miRNA 분자의 발현을 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 MSC-NTF 세포는 다른 세포에서 하나 이상의 miRNA 분자의 발현을 유도할 수 있다. 세포가 신호를 생성하여 인접 세포에 변화를 유도하고 이로써 이들 세포의 거동을 변형시키는 세포-세포 교류를, 일부 구현예에서, "파라크린 반응"으로 지칭할 수 있다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "miRNA", "miR" 및 "micro RNA"가 상호 호환적으로 사용될 수 있으며 이들 모두 동일한 의미와 특성을 가지며, 짧은 비-코딩 RNA를 포괄함을 알 것이다. 일부 구현예에서, miRNA는 약 21-25개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, miRNA는 약 21-24개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, miRNA는 21, 22, 23, 24 또는 25개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, miRNA는 단백질 코딩 유전자의 번역을 억제하거나 또는 타겟 mRNA를 절단하여 이의 변성을 유도함으로써 세포 유전자 발현을 조절하는데 중요한 역할을 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, miRNA는 파라크린 신호전달 매개인자로서 이용할 수 있다. 일부 구현예에서, miRNA는 MSC-NTF 세포에서 증가 또는 감소될 수 있다.
미분화된 MSC와 비교해 MSC-NTF 세포에서 증가될 수 있는 miRNA의 예로는, 예를 들어, 비-제한적으로 miR-3663-3p, miR-132-3p, miR-150-3p, miR-762, miR-4327, miR-3665, miR-34a-5p, miR-1915, miR-34a-39, miR-34b-5p, miR-874, miR-4281, miR-1207-5p, miR-30b-5p, miR-29b-3p, miR-199b-5p, miR-30e-5p, miR-26a-5p 또는 miR-4324, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 미분화된 MSC와 비교해 MSC-NTF 세포에서 감소될 수 있는 miRNA의 예로는, 예를 들어, 비-제한적으로 miR-503, miR-3659, miR-3529-3p, miR-320b, miR-1275, miR-3132, miR-320a, miR-495, miR-181b-5p, miR-222-3p, miR-424-5p, miR-4284, miR-574-5p, miR-143-3p, miR-106a-5p, miR-455-3p, miR-20a-5p, miR-145-5p, miR-324-3p, miR-130b-3p, miR-1305 또는 miR-140-3p, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 MSC-NTF 세포는 miR-3663-3p, miR-132-3p, miR-150-3p, miR-762, miR-4327, miR-3665, miR-34a-5p, miR-1915, miR-34a-39, miR-34b-5p, miR-874, miR-4281, miR-1207-5p, miR-30b-5p, miR-29b-3p, miR-199b-5p, miR-30e-5p, miR-26a-5p, 또는 miR-4324, miR-503, miR-3659, miR-3529-3p, miR-320b, miR-1275, miR-3132, miR-320a, miR-495, miR-181b-5p, miR-222-3p, miR-424-5p, miR-4284, miR-574-5p, miR-143-3p, miR-106a-5p, miR-455-3p, miR-20a-5p, miR-145-5p, miR-324-3p, miR-130b-3p, miR-1305 또는 miR-140-3p 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA를 발현하며, 이러한 발현은 미분화된 MSC와 비교해 증가 또는 감소된다.
일부 구현예에서, MSC-NTF는 MSC-NTF로부터 단리된 엑소좀에서 miRNA의 양을 증가시키기 위한 일환으로 miRNA를 발현하도록 유전자 변형된다. 일부 구현예에서, MSC는 miRNA를 발현하도록 유전자 변형된다. 일부 구현예에서, MSC-NTF는 miRNA를 발현하도록 유전자 변형된다. 일부 구현예에서, miRNA는 miR-7이다.
일부 구현예에서, MSC는 MSC로부터 단리된 엑소좀에서 miRNA의 양을 증가시키기 위한 일환으로 miRNA를 발현하도록 유전자 변형된다. 일부 구현예에서, miRNA는 miR-7이다.
일부 구현예에서, 유전자 변형된 MSC에서 miRNA 발현은 유전자 비-변형된 MSC와 비교해 증가한다.
일부 구현예에서, 유전자-변형된 MSC 세포로부터 단리된 엑소좀은 유전자 변형되지 않은 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 증가된 양으로 miRNA를 포함한다.
일부 구현예에서, MSC-NTF 세포에서 miRNA 발현은 미분화된 MSC와 비교해 상승한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포에서 miRNA 발현은 미분화된 MSC와 비교해 감소한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포에서 miRNA 발현은 미분화된 MSC와 비교해 소실된다.
일부 구현예에서, MSC-NTF 세포로부터 단리된 엑소좀은 미분화된 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 miRNA를 증가된 양으로 포함한다. 다른 구현예들에서, MSC-NTF 세포로부터 단리된 엑소좀은 미분화된 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 miRNA를 감소된 양으로 포함한다.
일부 구현예에서, MSC-NTF 세포 또는 엑소좀은 miR-3663-3p를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포 또는 엑소좀은 miR-132-3p를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포 또는 엑소좀은 miR-150-3p를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포 또는 엑소좀은 miR-762를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포 또는 엑소좀은 miR-4327을 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포 또는 엑소좀은 miR-3665를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포 또는 엑소좀은 miR-34a-5p를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포 또는 엑소좀은 miR-1915를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포 또는 엑소좀은 miR-34a-39를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포 또는 엑소좀은 miR-34b-5p를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포 또는 엑소좀은 miR-874를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포 또는 엑소좀은 miR-4281을 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포 또는 엑소좀은 miR-1207-5p를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포 또는 엑소좀은 miR-30b-5p를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포 또는 엑소좀은 miR-29b-3p를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포 또는 엑소좀은 miR-199b-5p를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포 또는 엑소좀은 miR-30e-5p를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF는 miR-26a-5p를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포 또는 엑소좀은 miR-4324를 증가된 양으로 포함한다.
일부 구현예에서, MSC-NTF 세포는 미분화된 MSC와 비교해 하나 이상의 miRNA를 발현하지 않거나 낮은 수준으로 발현한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF는 미분화된 MSC와 비교해 하나 이상의 miRNA 분자를 감소된 양으로 포함하며, 여기서 하나 이상의 miRNA 분자는 miR-503, miR-3659, miR-3529-3p, miR-320b, miR-1275, miR-3132, miR-320a, miR-495, miR-181b-5p, miR-222-3p, miR-424-5p, miR-4284, miR-574-5p, miR-143-3p, miR-106a-5p, miR-455-3p, miR-20a-5p, miR-145-5p, miR-324-3p, miR-130b-3p, miR-1305 또는 miR-140-3p, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포는 miR-503을 발현하지 않거나 또는 낮은 수준으로 발현한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포는 miR-3659를 발현하지 않거나 또는 낮은 수준으로 발현한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포는 miR-3529-3p를 발현하지 않거나 또는 낮은 수준으로 발현한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포는 miR-320b를 발현하지 않거나 또는 낮은 수준으로 발현한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포는 miR-1275를 발현하지 않거나 또는 낮은 수준으로 발현한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포는 miR-3132를 발현하지 않거나 또는 낮은 수준으로 발현한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포는 miR-320a를 발현하지 않거나 또는 낮은 수준으로 발현한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포는 miR-495를 발현하지 않거나 또는 낮은 수준으로 발현한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포는 miR-181b-5p를 발현하지 않거나 또는 낮은 수준으로 발현한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포는 miR-222-3p를 발현하지 않거나 또는 낮은 수준으로 발현한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포는 miR-424-5p를 발현하지 않거나 또는 낮은 수준으로 발현한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포는 miR-4284를 발현하지 않거나 또는 낮은 수준으로 발현한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포는 miR-574-5p를 발현하지 않거나 또는 낮은 수준으로 발현한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포는 miR-143-3p를 발현하지 않거나 또는 낮은 수준으로 발현한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포는 miR-106a-5p를 발현하지 않거나 또는 낮은 수준으로 발현한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포는 miR-455-3p를 발현하지 않거나 또는 낮은 수준으로 발현한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포는 miR-20a-5p를 발현하지 않거나 또는 낮은 수준으로 발현한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포는 miR-145-5p를 발현하지 않거나 또는 낮은 수준으로 발현한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포는 miR-324-3p를 발현하지 않거나 또는 낮은 수준으로 발현한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포는 miR-130b-3p를 발현하지 않거나 또는 낮은 수준으로 발현한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포는 miR-1305를 발현하지 않거나 또는 낮은 수준으로 발현한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포는 miR-140-3p를 발현하지 않거나 또는 낮은 수준으로 발현한다.
일부 구현예에서, miRNA는 ALS 환자의 운동 뉴런에서 전반적으로 하향-조절된다.
일 구현예에서, MSC-NTF 세포는 하나 이상의 MSC 마커를 발현하는 MSC로부터 생체외 분화된다. 일부 구현예에서, 분화는 유전자 변형을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 MSC는 본원에 기술된 세포 집단 및 분화된 세포를 구축하도록 유전자 조작 (즉, 발현 구조체로 형질전환)되지 않는다.
다른 구현예에서, 하나 이상의 NTF, 예를 들어 VEGF, GDNF, LIF, G-CSF, BDNF, TGS-6, BMP2, FGF2 또는 HGF, 또는 이들의 임의 조합을 분비하여 하나 이상의 MSC 표현형을 포함하는 MSC-NTF 세포를 포함하는 단리된 인간 세포는, 미분화된 MSC (대조군 MSC)에서 NTF의 기저 분비 수준보다 높은 수준으로 NTF의 기저 분비를 포함한다.
일부 구현예에서, MSC-NTF 세포는, 위약 대조군과 비교해, 치료받은 AKS 환자의 CSF에서 특이적인 신경영양 인자의 증가 및 염증성 바이오마커의 감소를 유도한다. 예를 들어, 국제 특허 WO 2018/015945의 실시예 2를 참조하며, 이 문헌의 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
일부 구현예에서, MSC-NTF 세포로부터 발현되는 바이오마커는 TOP2A, RAB27b, WNT5A, SNAP25, AREG, SLC1A1, SLC16A6, MEST, SLC1A3, PCSK1 또는 TUBB3 중 어느 하나, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포는 토포이소머라제 2-α (TOP2A), 섬유모세포 성장인자 2 (FGF2), 중배엽-특이적인 전사 상동체 (MEST), 용질 캐리어 패밀리 1 멤버 1 (solute carrier family 1 member 1, SLC1A1) 또는 β-III-투불린 (TUBB3) 중 어느 하나, 또는 이들의 임의 조합의 발현 감소를 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포는 골 형태형성 단백질 2 (BMP2), 백혈병 저해 인자 (LIF), Wnt 패밀리 멤버 5A (WNT5A), 암피레굴린 (amphiregulin, AREG), 간세포 성장인자 (HGF), 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF), 프로단백질 컨버타제 1 (PCSK1), 뇌의 ras (RAB)27B, 시냅토솜-부속 단백질 25 (synaptosomal-associated　protein　25, SNAP25), 용질 캐리어 패밀리 1 멤버 3( SLC1A3) 또는 용질 캐리어 패밀리 16 멤버 6 (SLC16A6) 중 어느 하나, 또는 이들의 임의 조합의 발현 증가를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 MSC는 유전자 조작된다 (즉, 발현 구조체로 형질전환됨). 생체외 분화 전 또는 분화 후 MSC 세포의 유전자 변형을 이용해, MSC 또는 분화된 MSC-NTF로부터 단리된 엑소좀에서 존재하는 것이 바람직한 분자의 양을 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 이 분자는 신경퇴행성 질환의 치료에 유익하다. 일부 구현예에서, 바람직한 분자는 성장인자이다. 일부 구현예에서, 바람직한 분자는 갈렉틴-1 분자이다. 일부 구현예에서, 바람직한 분자는 siRNA 또는 miRNA이다. 일부 구현예에서, 성장인자는 성장 분화 인자 (GDF) 5를 포함한다. 일부 구현예에서, 성장인자는 인슐린-유사 성장인자 (IGF)-1을 포함한다. 일부 구현예에서, 성장인자는 인슐린-유사 성장인자 (IGF)-2를 포함한다. 일부 구현예에서, 성장인자는 인간 성장인자이다. 일부 구현예에서, 갈렉틴-1 분자는 인간 갈렉틴-1 분자이다. 일부 구현예에서, siRNA는 MMP9 또는 이의 일부에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 코딩한다. 일부 구현예에서, miRNA는 miR-7을 포함한다. 일부 구현예에서, 바람직한 분자는 성장인자, miRNA 및 siRNA의 임의 조합이다.
일부 구현예에서, MSC는 프로모터 또는 프로모터/인핸서 조합에 작동가능하게 연결된 대상 단백질 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 벡터로 형질전환된다. 일부 구현예에서, 벡터는 프로모터 또는 프로모터/인핸서 조합에 작동가능하게 연결된 선별 마커 유전자를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 구성적 프로모터 (constitutive promoter)이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 pCAG, EFlOC, PGK, CMV 및 SFFV를 포함하는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 벡터는 프로-바이러스 서열을 더 포함한다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 대상 단백질 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 전이유전자 카세트는 MSC에서 전달 및 안정적인 발현을 위해 다양한 바이러스성 및 비-바이러스성 벡터에 통합될 수 있음을 알 것이다.
일부 구현예에서, MSC는 바이러스 형질감염 또는 바이러스 형질전이에 의해 유전자 변형된다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 α-레트로바이러스, γ-레트로바이러스, (인간 및 비-인간) 렌티바이러스 및 아데노바이러스를 포함하는 군으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 시스템은 대상 전이유전자, 즉 단백질 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 영역과 벡터 DNA의 삽입 및 역 전사에 필수적인 모든 서열 요소를 운반하지만 gag-, pol- 및 env-유전자와 같은 모든 또는 대부분의 바이러스 유전자는 결여된, 전달 벡터 백본을 포함한다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터는, 3' LTR-영역이 바이러스 프로모터 활성을 차단하고 숙주 세포 게놈에서 이웃 유전자의 트랜스활성화를 방지하기 위해 일부 또는 완전히 제거된, 자기-불활성화 (SIN) 벡터로서 특별한 안전성 변형 (special safety modification)을 가진다.
바이러스 입자를 제조하기 위해, 구조 단백질, 효소 및 외막 단백질을 트랜스로 제공하는 다양한 수의 헬퍼 플라스미드가 필요하다. 외래 외막 당단백질을 운반하는 바이러스 입자를 제조할 수 있다. 이 공정을 슈도-타입핑 (pseudo-typing)이라하며, 벡터 입자의 트로피즘 (tropism)을 변형할 수 있으며, 일부 경우에 벡터 역가를 높일 수 있다.
일부 구현예에서, MSC의 유전자 변형은 비-바이러스성 벡터 시스템을 이용하여 달성된다. 일부 구현예에서, 비-바이러스성 벡터 시스템은 플라스미드 트랜스퍼 (transfer), 파지 인테그라제 (integrase) 및 트랜스포존을 포함한다.
일부 구현예에서, MSC는 화학적 형질감염 방법에 의해 유전자 변형된다. 일부 구현예에서, 화학적 형질감염 방법은 리포펙션, 양이온성 폴리머의 사용을 포함하는 방법, 고도로 분지화된 유기 화합물을 이용하는 방법, 칼슘 포스페이트를 이용하는 방법 및 Fugene 비-리포좀 시약을 이용하는 방법을 포함하는 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, MSC는 물리적 형질감염 방법에 의해 유전자 변형된다. 일부 구현예에서, 물리적 형질감염 방법은 전기천공, 세포 스퀴징 (cell squeezing), 소노로포레이션 (sonoroporation), 광학 형질감염, 원형질체 융합, 임팔레펙션 (impalefection) 및 유체역학적 전달을 포함하는 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, MSC는 입자-기반의 형질감염 방법에 의해 유전자 변형된다. 일부 구현예에서, 입자-기반의 형질감염 방법은 유전자 총 방법, 자기-보조 형질감염 (magnet-assisted transfection) 및 임팔레펙션을 포함하는 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, MSC는 안정적으로 형질감염되며, 즉, 형질감염된 벡터는 MSC 게놈에 삽입된다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 형질감염된 벡터가 세포 게놈에 삼입됨으로써, 염색체 외 벡터를 가진 유전자 변형된 줄기 세포보다 더 안정적인 유전자 변형된 간엽 줄기 세포를 생산할 수 있음을 알 것이다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 형질감염 후, 안정적으로 형질감염된 세포를 당해 기술 분야에 공지된 방법에 의해 선별할 수 있음을 알 것이다. 일부 구현예에서, MSC는 구성적인 프로모터 또는 프로모터/인핸서 조합에 작동가능하게 연결된 선별 마커 유전자를 더 포함할 수 있다. 선별 마커 유전자는 푸로마이신, 네오마이신 또는 오우아바인에 대해 내성을 부여하는 유전자와 같은 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있다. 항생제 내성 유전자는 항생제 존재 하에 유전자 변형된 MSC를 선별하기 위해 이용할 수 있다. 또한, 또는 대안으로서, 항생제 내성 유전자, 표면 마커 단백질을 코딩하는 유전자를 사용할 수 있으며, 이는 유전자 변형된 MSC의 표면 상에서만 발현된다. 표면 마커 단백질을 인지하는 특이적인 항체를 보유한 (harboring) 자기 비드를 유전자 변형된 MSC를 선별하는데 이용할 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 변형된 MSC 세포 또는 유전자 변형된 MSC-NTF 세포는 유익한 대상 분자를 발현한다. 일부 구현예에서, 유익한 대상 분자는 단백질 또는 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 대상 단백질 또는 폴리펩타이드는 신경영양 인자를 포함한다. 일부 구현예에서, 대상 단백질 또는 폴리펩타이드는 IGF-1을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상 단백질 또는 폴리펩타이드는 IGF-2를 포함한다. 일부 구현예에서, 대상 단백질 또는 폴리펩타이드는 GDF-5를 포함한다. 일부 구현예에서, 대상 단백질 또는 폴리펩타이드는 갈렉틴-1을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 miRNA 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 miRNA-7 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 siRNA 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 MMP-9 siRNA 서열 또는 그 일부를 포함한다.
MSC & MSC - NTF 유래 엑소좀
엑소좀은 분비되는 나노 크기의 세포 소낭 (세포외 소낭)이다. 소낭은 후기 엔도좀의 내측 출아 (inward budding)에 의해 형성된 다음 원형질막과의 융합시 세포외 환경으로 분비된다. 엑소좀은 천연적으로 RNA를 포함하고 세포들 간에 RNA를 수송하므로, 이러한 특성이 유전자 요법에 유용할 수 있다. 일부 구현예에서, MSC-NTF-단리된 엑소좀을 이용해 RNA 분자를 세포로, 예를 들어 siRNA 또는 miRNA를 전달할 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자 변형된 MSC로부터 단리된 변형된 MSC 엑소좀을 이용해, RNA 분자를 세포에 전달할 수 있다. 예를 들어, siRNA 또는 miRNA 분자는 유전자 변형된 MSC에서 발현되거나, 또는 과다 발현되거나 또는 고도로 발현된다. 일부 구현예에서, MSC 세포로부터 단리된 엑소좀을 이용해, MSC-유래 엑소좀을 먼저 RNA 분자, 예를 들어 siRNA 또는 miRNA를 포함하도록 변형함으로써, 세포로 RNA 분자를 전달할 수 있다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "엑소좀" 및 "엑소좀들"이 본원에서 상호 호환적으로 사용될 수 있으며 이들 모두 동일한 의미 및 특성을 가짐을 알 것이다. 따라서, 일부 구현예에서, 용어 엑소좀은, 엑소좀 수율이 정제된 엑소좀 4 x 1011 대 정제된 엑소좀 약 7 x 1010으로 기술되는 바와 같이 (실시예 1 참조) 또는 본원의 방법에서 엑소좀의 사용을 기술하는 경우 다수의 엑소좀들을 포함한다.
일부 구현예에서, MSC-NTF 세포로부터 유래된 단리된 엑소좀은 단리된 엑소좀 집단으로 지칭된다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "단리된 MSC-NTF 유래 엑소좀", "단리된 MSC-NTF 세포 유래 엑소좀", "단리된 MSC-NTF 유래 엑소좀 집단", "단리된 MSC-NTF 세포 유래 엑소좀 집단", "단리된 MSC-NTF 엑소좀", "단리된 MSC-NTF 세포 엑소좀", "단리된 MSC-NTF 엑소좀 집단", 및 "단리된 MSC-NTF 세포 엑소좀 집단"이 본원에서 상호 호환적으로 사용될 수 있으며, 이들 모두 동일한 의미와 특성을 가짐을 알 것이다. 본원의 맥락에서, 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 유래 엑소좀은 "단리된 엑소좀"으로 지칭된다. 이는, 일부 구현예에서, 대조군 엑소좀으로 지칭되는 대조군 MSC 세포로부터 단리된 엑소좀과 대비된다.
MSC로부터 단리된 엑소좀의 내용물 (content)은 일정하지 않으며, 오히려 MSC 조직 또는 기원의 산물, 이의 활성 및 MSC의 직접적인 세포간 이웃 (immediate intercellular neighbors of the MSC)이다. 일부 구현예에서, 엑소좀의 내용물은 MSC의 유전자 변형 산물일 수 있다. MSC-유래 엑소좀은 사이토카인 및 성장인자, 신호전달 지질, mRNA 및 조절성 miRNA를 포함하는 내용물을 가진다. 나아가, 환자에게 전달되어 치료학적 이점을 나타내는 MSC의 효과는, MSC로부터 정제된 엑소좀이 MSC-기반의 치료와 비슷한 효과를 촉구할 수 있으므로, 엑소좀-유래일 수 있다.
마찬가지로, 본원에 기술된 분화된 MSC로부터 유래된 엑소좀, 예를 들어 MSC-NTF로부터 단리된 엑소좀은, 특정 구현예에서, MSC-NTF 세포 또는 유전자 변형된 MSC-NTF와 동일한 또는 비슷한 내용물을 포함할 수 있다. 나아가, MSC-NTF-유래 엑소좀의 환자 전달은, 일부 구현예에서, 동일한 치료학적 이점을 제공하면서, 유익하게는 혈액 뇌 장벽을 통과할 수 있으며, 안정적이고, 추가적인 유익한 인자를 탑재 (loading)할 수 있으며, 면역원성이 낮다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 엑소좀은 30-300 nm의 크기, 예를 들어 직경을 가진다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 엑소좀은 30-250 nm이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 엑소좀은 30-200 nm이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 엑소좀은 30-175 nm이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 엑소좀은 30-150 nm이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 엑소좀은 40-150 nm이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 엑소좀은 50-150 nm이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 엑소좀은 30-100 nm이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 엑소좀은 100-150 nm이다. 특정 구현예에서, 엑소좀 집단의 크기 중앙값은 약 116 nm 내지 약 148 nm이다. 특정 구현예에서, 엑소좀 집단의 크기 중앙값은 약 132 nm이다. 특정 구현예에서, 엑소좀 집단의 크기 평균은 약 117 nm 내지 약 147 nm이다. 특정 구현예에서, 엑소좀 집단의 크기 평균은 약 132 nm이다.
일부 구현예에서, 본원은, 세포 타입이 하나 이상의 신경영양 인자 (NTF)를 분비하도록 유도된 분화된 MSC (MSC)를 포함하는, 즉 MSC-NTF 세포로 지칭되며, 하나 이상의 NTF의 기저 분비 수준이 미분화된 MSC에서의 하나 이상의 NTF의 기저 분비 수준과 비교해 MSC-NTF에서 높은, 단리된 세포 타입 특이적인 엑소좀을 개시한다. MSC-NTF 세포는 상기에서 상세히 기술되었다.
일부 구현예에서, MSC-NTF 세포 유래 엑소좀 집단은 카고로서 MSC-NTF 세포에 의해 분비되는 하나 이상의 NTF를 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포 유래 엑소좀 집단은 카고로서 MSC-NTF 세포에 의해 분비되는 2종 이상의 NTF를 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포 유래 엑소좀 집단은 카고로서 MSC-NTF 세포에 의해 분비되는 3종 이상의 NTF를 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포 유래 엑소좀 집단은 카고로서 MSC-NTF 세포에 의해 분비되는 4종 이상의 NTF를 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포 유래 엑소좀 집단은 카고로서 MSC-NTF 세포에 의해 분비되는 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10종의 NTF를 포함한다.
일부 구현예에서, MSC-NTF 세포 유래 엑소좀 집단은 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 카고로서 1종 이상의 NTF를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포 유래 엑소좀 집단은 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 카고로서 2종 이상의 NTF를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포 유래 엑소좀 집단은 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 카고로서 3종 이상의 NTF를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포 유래 엑소좀 집단은 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 카고로서 4종 이상의 NTF를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포 유래 엑소좀 집단은 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 카고로서 적어도 5, 6, 7, 8, 9 또는 10종의 NTF를 증가된 양으로 포함한다.
일부 구현예에서, MSC-NTF 세포 유래 엑소좀 집단은 카고로서 LIF 단백질을 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포 유래 엑소좀 집단은 카고로서 GDF15 단백질을 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포 유래 엑소좀 집단은 카고로서 VEGF 또는 VEGFA 단백질을 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포 유래 엑소좀 집단은 카고로서 LIF 단백질, 또는 GDF15 단백질, 또는 VEGF, 또는 VEGFA 단백질을 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포 유래 엑소좀 집단은 카고로서 LIF 단백질, 및 GDF15 단백질, 및 VEGF 또는 VEGFA 단백질을 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포 유래 엑소좀 집단은 카고로서 LIF 단백질, 또는 GDF15 단백질, 또는 VEGF 또는 VEGFA 단백질로 된 임의 조합을 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 증가된 양으로 포함한다.
일부 구현예에서, MSC-NTF 세포로부터 단리된 엑소좀은 MSC 대조군 세포로부터 단리된 엑소좀과 비교해 NTF를 증가된 양으로 포함한다. 예를 들어, 비-제한적으로, 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포로부터 단리된 엑소좀은 VEGF, HGF, LIF, GDNF, NT-3, 뉴로트로핀-4/5, NTN, 뉴로트로핀-4, 퍼세핀, ART, CNTF, IGF-1, GDF-15, G-CSF, BDNF, TSG-6, BMP2 및 FGF2로부터 선택되는 NTF, 또는 이들의 임의 조합을 증가된 양으로 포함한다.
일부 구현예에서, 본원은 단리된 세포 타입 특이적인 엑소좀을 개시하며, 여기서 세포-타입은 MSC 또는 유전자 변형된 MSC를 포함한다.
일부 구현예에서, MSC-NTF 엑소좀은 MSC-NTF의 막 마커 또는 내용물 중 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 엑소좀은, 비-제한적으로 CD9, CD61, CD81, ALIX 또는 TSG101, 또는 이들의 임의 조합 등의 엔도좀 마커를 포함한다. ALIX는 또한 PDCD6IP (Programmed Cell Death 6 Interacting Protein)로도 알려져 있다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 엑소좀은 MSC-NTF의 막 마커 및 특이적인 엑소좀 마커를 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 엑소좀은 분화 클러스터 (CD)9, CD63, CD44, CD73, CD90, CD105, CD9, CD61, CD81, ALIX 또는 종양 감수성 유전자 (TSG)101을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 막 마커, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 엑소좀은 MSC의 내용물 중 일부 또는 막 마커를 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 엑소좀은 비-제한적인 예로, CD9, CD61, CD81, ALIX 또는 TSG101, 또는 이들의 임의 조합 등의 엔도좀 마커를 포함한다. ALIX는 또한 PDCD6IP (Programmed Cell Death 6 Interacting Protein)로도 알려져 있다. 일부 구현예에서, MSC 엑소좀은 MSC의 막 마커 및 특이적인 엔도좀 마커를 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 엑소좀은 분화 클러스터 (CD)9, CD63, CD44, CD73, CD90, CD105, CD61, CD81, ALIX 또는 종양 감수성 유전자 (TSG)101을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 막 마커 또는 이들의 임의 조합을 포함한다.
칼넥신은 소포체의 내부 막 단백질로서, 엑소좀 막 내에 존재할 것으로 예상되지 않는다. 마찬가지로, MSC 또는 MSC-NTF에 존재하지 않는 막 마커는 엑소좀 막 내에 존재할 것으로 예상되지 않는다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC 또는 MSC-NTF 엑소좀은 CD34, CD45, CD19, CD5, CD20, CD11B, CD3, CD14, HLA-DR, 칼넥신 및 FMC7을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC 또는 MSC-NTF 엑소좀은 CD34, CD45, CD19, CD5, CD20, CD11B, CD3, CD14, HLA-DR, 칼넥신 및 FMC7을 포함하는 군으로부터 선택되는 마커들의 임의 조합을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 분화 클러스터 (CD)9, CD63, CD44, CD73, CD90, CD105, CD61, CD81, ALIX 또는 종양 감수성 유전자 (TSG)101을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 막 마커, 또는 이들의 임의 조합을 포함하며; CD34, CD45, CD19, CD5, CD20, CD11B, CD3, CD14, HLA-DR, 칼넥신 및 FMC7을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 CD34, CD45, CD19, CD5, CD20, CD11B, CD3, CD14, HLA-DR, 칼넥신 및 FMC7을 포함하는 군으로부터 선택되는 마커들의 임의 조합을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 단리된 MSC 엑소좀은 분화 클러스터 (CD)9, CD63, CD44, CD73, CD90, CD105, CD61, CD81, ALIX 또는 종양 감수성 유전자 (TSG)101을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 막 마커, 또는 이들의 임의 조합을 포함하며; CD34, CD45, CD19, CD5, CD20, CD11B, CD3, CD14, HLA-DR, 칼넥신 및 FMC7을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커, 또는 이들의 임의 조합을 포함하지 않는다.
MSC 엑소좀 집단에서 발견되는 마커 패턴, 막 등과 유사하게, 엑소좀 집단의 내용물은 일부 구현예에서, 이것이 단리된 MSC의 내용물을 반영할 수 있다.
MSC-NTF 엑소좀 집단에서 발견되는 마커 패턴, 막 등과 유사하게, 엑소좀 집단의 내용물은, 일부 구현예에서, 이것이 단리된 MSC-NTF의 내용물을 반영할 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 엑소좀은 미분화된 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 MSC-NTF에서 증가된 양으로 하나 이상의 NTF를 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 엑소좀에서 증가되는 신경영양 인자 (NTF)는 VEGF, HGF, LIF, GDNF, NT-3, 뉴로트로핀-4/5, NTN, 뉴로트로핀-4, 퍼세핀, ART, CNTF, IGF-1, GDF-15, G-CSF, BDNF, TSG-6, BMP2 및 FGF2, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 엑소좀은 VEGF를 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 엑소좀은 HGF를 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 엑소좀은 LIF를 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 엑소좀은 G-CSF를 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 엑소좀은 BDNF를 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 엑소좀은 TNF-자극된 유전자 6 단백질이라고도 하는 TSG-6를 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 엑소좀은 BMP2를 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 엑소좀은 FGF2를 포함한다.
일부 구현예에서, MSC-NTF 세포로부터 유래된 단리된 엑소좀 집단은 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 VEGF, HGF, LIF, G-CSF, BDNF, TSG-6, BMP2 및 FGF2 중 어느 하나를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 부가적인 카고가 MSC-NTF 유래 엑소좀 안에 포함될 수 있다 (예, 실시예 4의 표 1 참조).
일부 구현예에서, 단리된 엑소좀은 미분화된 MSC에서 단리된 엑소좀과 비교해 MSC-NTF에서 증가된 하나 이상의 miRNA를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 엑소좀은 미분화된 MSC에서 단리된 엑소좀과 비교해 MSC-NTF에서 감소된 하나 이상의 miRNA를 감소된 양으로 포함한다.
일부 구현예에서, 단리된 엑소좀은 유전자 비-변형된 MSC 세포로부터 단리된 엑소좀과 비교해 유전자-변형된 MSC 세포에서 증가되는 하나 이상의 miRNA를 증가된 양으로 포함한다.
일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 미분화된 MSC에서 단리된 엑소좀과 비교해 하나 이상의 micro-RNA (miRNA) 분자를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 미분화된 MSC에서 단리된 엑소좀과 비교해 하나 이상의 micro-RNA (miRNA) 분자를 증가된 양으로 포함하며, 여기서 하나 이상의 miRNA 분자는 miRNA (miR)-3663-3p, miR-132-3p, miR-150-3p, miR-762, miR-4327, miR-3665, miR-34a-5p, miR-1915, miR-34a-39, miR-34b-5p, miR-874, miR-4281, miR-1207-5p, miR-30b-5p, miR-29b-3p, miR-199b-5p, miR-30e-5p, miR-26a-5p 또는 miR-4324, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 miR-3663-3p를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 miR-132-3p를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 miR-150-3p를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 miR-762를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 miR-4327를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 miR-3665를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 miR-34a-5p를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 miR-1915를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 miR-34a-39를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 miR-34b-5p를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 miR-874를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 miR-4281을 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 miR-1207-5p를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 miR-30b-5p를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 miR-29b-3p를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 miR-199b-5p를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 miR-30e-5p를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 miR-26a-5p를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 miR-4324를 증가된 양으로 포함한다.
일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 미분화된 MSC에서 단리된 엑소좀과 비교해 하나 이상의 micro-RNA (miRNA) 분자를 감소된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 미분화된 MSC에서 단리된 엑소좀과 비교해 하나 이상의 micro-RNA (miRNA) 분자를 감소된 양으로 포함하며, 여기서 하나 이상의 miRNA 분자는 miR-503, miR-3659, miR-3529-3p, miR-320b, miR-1275, miR-3132, miR-320a, miR-495, miR-181b-5p, miR-222-3p, miR-424-5p, miR-4284, miR-574-5p, miR-143-3p, miR-106a-5p, miR-455-3p, miR-20a-5p, miR-145-5p, miR-324-3p, miR-130b-3p, miR-1305 또는 miR-140-3p, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 miR-503을 감소된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 miR-3659를 감소된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 miR-3529-3p를 감소된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 miR-320b를 감소된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 miR-1275를 감소된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 miR-3132를 감소된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 miR-320a를 감소된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 miR-495를 감소된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 miR-181b-5p를 감소된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 miR-222-3p를 감소된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 miR-424-5p를 감소된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 miR-4284를 감소된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 miR-574-5p를 감소된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 miR-143-3p를 감소된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 miR-106a-5p를 감소된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 miR-455-3p를 감소된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 miR-20a-5p를 감소된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 miR-145-5p를 감소된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 miR-324-3p를 감소된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 miR-130b-3p를 감소된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 miR-1305를 감소된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 miR-140-3p를 감소된 양으로 포함한다.
일부 구현예에서, 단리된 MSC 엑소좀에는 MSC에서 정상적으로 또는 천연적으로 존재하지 않는 분자가 탑재될 수 있다. 따라서, 이러한 MSC 엑소좀은 부가적인 분자가 탑재되지 않은 동일한 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 변형된 MSC 엑소좀을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC 엑소좀은 신경퇴행성 질환을 치료하는데 유익한 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC 엑소좀에는 신경퇴행성 질환을 치료하는데 유익한 분자가 탑재될 수 있다.
일부 구현예에서, MSC, 유전자 변형된 MSC, MSC-NTF 또는 유전자 변형된 MSC-NTF로부터 단리된 본원에 기술된 엑소좀에는, 치료학적 miRNA, siRNA 및/또는 치료학적 인자와 같은 외인성 카고가 탑재될 수 있다. 탑재는 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이 외인적인 수단을 통해 이루어질 수 있거나, 또는 MSC 또는 MSC-NTF 세포에서 miRNA, 치료학적 인자 또는 siRNA를 발현 또는 고도로 발현한 결과일 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 단리된 엑소좀에는 치료학적 인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 탑재될 수 있으며, 여기서 뉴클레오티드 서열은 타겟 세포에서 번역된다. 일부 구현예에서, 변형된 엑소좀에 포함되는 뉴클레오티드 서열은 타겟 세포에서 발현된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 siRNA, miRNA를 포함하거나 또는 치료학적 인자, 예를 들어 비-제한적으로, 성장인자를 코딩한다. 당해 기술 분야의 당업자에게 이해되는 바와 같이, 용어 "타겟 세포"는 일반적으로 엑소좀과 접촉되거나 또는 궁극적으로 접촉될 세포를 지칭한다.
일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀에는 MSC-NTF 세포에 정상적으로 존재하지 않는 분자가 탑재될 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀에는 MSC-NTF로부터 단리된 엑소좀에는 천연적으로 존재하지 않는 분자가 탑재될 수 있다. 일부 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 신경퇴행성 질환을 치료하는데 유익한 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, 단리된 MSC 엑소좀에는 MSC 세포에는 정상적으로 존재하지 않는 분자가 탑재될 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC 엑소좀에는 MSC로부터 단리된 엑소좀에는 천연적으로 존재하지 않는 분자가 탑재될 수 있다. 일부 구현예에서, 이들 변형된 단리된 MSC 엑소좀은 신경퇴행성 질환을 치료하는데 유익한 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 단리된 엑소좀에는 치료학적 miRNA, siRNA 및/또는 치료학적 인자와 같은 외인성 카고가 탑재될 수 있다. 탑재는, 당해 기술 분야에서 공지된 바와 같은 외인적인 수단을 통해 이루어질 수 있거나, 또는 MSC 또는 MSC-NTF 세포에서 miRNA, 치료학적 인자 또는 siRNA를 발현하거나 또는 고도로 발현한 결과일 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 단리된 엑소좀에는 치료학적 인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 탑재될 수 있으며, 여기서 뉴클레오티드 서열은 타겟 세포에서 번역된다.
일부 구현예에서, 엑소좀에는 나노규모의 용도에 적합한 전기천공 (electroporation) 프로토콜을 이용해 외인성 카고를 탑재할 수 있다 (예, Alvarez-Erviti et al. 2011, Nat Biotechnol 29: 341). 대안적으로, El-Andaloussi et al. (Nature Protocols 7,2112-2126(2012))에는 배양한 세포로부터 유래된 엑소좀을 siRNA의 시험관내 및 생체내 전달에 이용하는 방법이 기술되어 있다. 엑소좀의 부가적인 수동 또는 능동 탑재 방법은 문헌들, 예를 들어, 비-제한적으로, Xin Luan et al (2017) Acta Pharmacologica Sinica volume 38, pages 754-763; Dinh Ha et al., (2016) Acta Pharmaceutica Sinica B 6(4):287-296; Lamichhane et al., Mol. Pharmaceutics 12, 10, 3650-3657; 및 Shtam et al., (2013) Cell Communication and Signaling 11:88에 기술되어 있다.
외인성 카고가 탑재된 단리된 MSC-NTF 엑소좀 또는 단리된 변형된 MSC 엑소좀은 나노-담체로서 사용할 수 있으며, MSC 및 MSC-NTF 유래 엑소좀은 오리진의 오리지널 세포의 치료학적 잠재성을 유지한다. 따라서, MSC 및 MSC-NTF 유래 엑소좀은 다수의 환자에게 유익하도록 확대된 치료학적 옵션을 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, (하나 이상의 외인성 카고가 탑재된) 변형된 MSC 엑소좀을 본원에 기술된 방법에 사용해, 필요한 개체를 치료한다. 일부 구현예에서, (하나 이상의 외인성 카고가 탑재된) 변형된 MSC-NTF 엑소좀은 본원에 기술된 방법에 사용해, 필요한 개체를 치료한다.
일부 구현예에서, 엑소좀에는 신경퇴행성 질환을 특이적으로 타겟팅하기 위해 외인성 카고가 탑재된다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 이들 엑소좀이 하나 이상의 부가적인 카고를 이미 포함하고 있어 MSC 또는 MSC-NTF로부터 단리된 엑소좀과의 관계 (relationship)가 변형됨을 알 것이다. 일부 구현예에서, 엑소좀에는 신경퇴행성 질환을 치료하는 방법에 사용하기 위한 외인성 카고가 탑재된다. 일부 구현예에서, 엑소좀에는 근위축성 측삭 경화증 (ALS)을 치료하는 방법에 사용하기 위한 외인성 카고가 탑재된다. 일부 구현예에서, 엑소좀에는 전두측두엽 치매 (FTD)를 치료하는 방법에 사용하기 위한 외인성 카고가 탑재된다. 일부 구현예에서, 엑소좀에는 파킨슨병 (PD)을 치료하는 방법에 사용하기 위한 외인성 카고가 탑재된다. 일부 구현예에서, 엑소좀에는 다계통 위축증 (MSA)을 치료하는 방법에 사용하기 위한 외인성 카고가 탑재된다. 일부 구현예에서, 엑소좀에는 척수근 위축증 (SMA)을 치료하는 방법에 사용하기 위한 외인성 카고가 탑재된다. 일부 구현예에서, 엑소좀에는 다발성 경화증 (MS)을 치료하는 방법에 사용하기 위한 외인성 카고가 탑재된다. 일부 구현예에서, 엑소좀에는 알츠하이머병 (AD)을 치료하는 방법에 사용하기 위한 외인성 카고가 탑재된다. 일부 구현예에서, 엑소좀에는 레트 증후군을 치료하는 방법에 사용하기 위한 외인성 카고가 탑재된다. 일부 구현예에서, 엑소좀에는 뇌성마비 (CP)를 치료하는 방법에 사용하기 위한 외인성 카고가 탑재된다. 일부 구현예에서, 엑소좀에는 자폐범주성 장애 (ASD)를 치료하는 방법에 사용하기 위한 외인성 카고가 탑재된다. 일부 구현예에서, 엑소좀에는 간질을 치료하는 방법에 사용하기 위한 외인성 카고가 탑재된다.
본원에 기술된 바와 같이, 엑소좀은 MSC에 본래 존재하는 분자, 유전자 변형된 MSC에서 고도로 발현되거나 또는 새롭게 발현된 분자, 또는 외인성으로 탑재된 카고, 또는 이들의 임의 조합을 포함할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 본원에서 예상되는 바와 같이, 일부 구현예에서, 엑소좀이 이것이 단리된 MSC에 존재하는 요소를 포함하며, 또한 이후 단계에서 엑소좀에 첨가되는 부가적인 요소를 포함할 수 있음을, 알 것이다.
마찬가지로, 본원에 기술된 바와 같이, 엑소좀은 MSC-NTF 세포에 본래 존재하는 하나 이상의 NTF 또는 외인성으로 탑재된 카고를 포함할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 본원에서 예상되는 바와 같이, 일부 구현예에서, 엑소좀이 이것이 단리된 MSC-NTF에 존재하는 요소를 포함하고 또한 이후 단계에서 엑소좀에 첨가되는 부가적인 요소를 포함할 수 있음을, 알 것이다. 예를 들어, 선택적인 운동 뉴런 (MN) 취약성 (vulnerability)은 ALS 환자의 운동 시스템에서 여러가지 수준에서 발생한다. 중뇌에 위치하며 안구 움직임을 제어하는, 동안 (oculomotor) (OMNs; CNIII), 활차 (trochlear) (CNIV) 및 외전 (abducens) (CNVI) 핵의 뉴런은, 취약성 구배 (gradient of vulnerability)를 나타내는 것으로 확인된 바 있다. 운동 단위 (motor unit)는 수축 특성에 따라 빠른-피로 (fast fatigable, FF), 빠른-피로-내성 (fast-fatigue-resistant, FR) 또는 느린 (slow, S)로 분류된다. ALS에서, S 운동 뉴런은 더 강하게 저항하여 후기 단계에서만 축삭 변성되는 반면, FF 운동 뉴런이 가장 취약하다.
OMN의 선택적 내성 (selective resistance)은 특정 뉴런 서브세트를 더욱 내성으로 만드는 분자 시그니처를 의미할 수 있다. 뉴런 취약성은 특정한 본질적인 유익한 요인의 결핍뿐 아니라 유해 분자의 존재에 의해 좌우되는 것으로 밝혀졌다. 인슐린-유사 성장인자 (IGF)-1 및 2는 내성 운동 뉴런 (resistant motor neuron)에 풍부한 것으로 식별된 주요 분자인 반면, 매트릭스 메탈로프로테나제-9 (MMP-9)는 취약성 운동 뉴런 (vulnerable motor neuron)에서 확인되었다.
인슐린-유사 성장인자-1 (IGF-1)은 운동 신경의 악화를 방지하고, 운동 신경 축삭의 성장 및 재생과 이의 근육으로의 신경 지배를 촉진한다. 바이러스-매개되는 IGF-1 전달은 ALS 설치류에서 MN 개수를 증가시키고, 악력을 개선하고, 진행을 지연시키고, 생존을 연장한다. IGF-1 수용체 (IGF-1R)는 IGF 결합시 생존 경로를 매개하는 것으로서, 안구운동 뉴런에서, 그리고 외안근 종판 (extraocular muscle endplate) 상에서 고도로 발현된다. 임상에서, ALS 환자에게 피하 (SC) IGF-1 투여시 치료학적 효과는 나타나지 않았다. 그러나, SC 투여에 의해 처리된 인간의 CSF 및 뇌 실질에서 생체이용성이 매우 낮아, IGF-1을 허용가능한 수준으로 말초 전달하는데 실패한 것일 수 있는 것으로 알려져 있다.
인슐린-유사 성장인자-2 (IGF-2)는 ALS 환자 운동 뉴런을 시험관내에서 보호하는 것으로 밝혀졌다. IGF-1과 유사하게, SOD1G93A ALS 마우스의 근육으로 바이러스-매개 IGF-2 전달은, 운동 뉴런을 보존하고 운동 축삭 재생을 유도하면서, 마우스의 수명을 10% 연장하였다. IGF-2는 말기 ALS 환자의 조직에서 안구운동 뉴런에 선호적으로 잔류하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 이 성장인자가 질환에서 이들 내성 운동 뉴런에 보호 역할을 수행할 수 있음을 의미한다.
성장 분화 인자-5 (GDF5)는 TGFβ 슈퍼패밀리에 속하며, 골 형태형성 (BMP) 단백질 슈퍼패밀리에 속한다. 이것은 시험관내 및 생체내에서 흑질 선조체의 도파민 뉴런에 대해 신경영양 및 보호 역할을 담당한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 단리된 변형된 MSC 엑소좀은 성장인자를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 단리된 변형된 MSC 엑소좀은 유전자 비-변형된 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 성장인자를 증가된 양으로 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 단리된 변형된 MSC 엑소좀은, IGF-1, IGF-2 또는 GDF5, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는, 성장인자를 포함한다. 일부 구현예에서, 성장인자는 인간 성장인자이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 단리된 변형된 MSC 엑소좀은 유전자 비-변형된 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 성장인자를 증가된 양으로 포함하고, 이러한 성장인자는 IGF-1, IGF-2 또는 GDF5, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 변형된 MSC 엑소좀은 IGF-1을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 변형된 MSC 엑소좀은 유전자 비-변형된 MSC와 비교해 IGF-1을 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 변형된 MSC 엑소좀은 IGF-2를 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 변형된 MSC 엑소좀은 유전자 비-변형된 MSC와 비교해 IGF-2를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 변형된 MSC 엑소좀은 GDF5를 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 변형된 MSC 엑소좀은 유전자 비-변형된 MSC와 비교해 GDF5를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, IGF-1, IGF-2 및 GDF-5는 각각 인간 IGF-1, 인간 IGF-2 및 인간 GDF-5이다.
일부 구현예에서, IGF-1을 포함하는 단리된 변형된 MSC 엑소좀은 IGF-1을 발현하는 유전자 변형된 MSC로부터 단리된다. 일부 구현예에서, IGF-2를 포함하는 단리된 변형된 MSC 엑소좀은 IGF-2를 발현하는 유전자 변형된 MSC 세포로부터 단리된다. 일부 구현예에서, GDF-5를 포함하는 단리된 변형된 MSC 엑소좀은 GDF-5를 발현하는 유전자 변형된 MSC로부터 단리된다.
일부 구현예에서, IGF-1을 포함하는 단리된 변형된 MSC 엑소좀은 IGF-1을 고도로 발현하는 유전자 변형된 MSC로부터 단리된다. 일부 구현예에서, IGF-2를 포함하는 단리된 변형된 MSC 엑소좀은 IGF-2를 고도로 발현하는 유전자 변형된 MSC로부터 단리된다. 일부 구현예에서, GDF-5를 포함하는 단리된 변형된 MSC 엑소좀은 GDF-5를 고도로 발현하는 유전자 변형된 MSC로부터 단리된다.
일부 구현예에서, IGF-1을 포함하는 단리된 변형된 MSC 엑소좀은 악화 중인 운동 신경을 보호하는데 유용할 수 있으며, 운동 신경 축삭의 성장 및 재생을 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, IGF-2를 포함하는 단리된 변형된 MSC 엑소좀은 운동 뉴런을 보호하고 운동 축삭 재생을 유도하는데 유용할 수 있다. 일부 구현예에서, GDF-5를 포함하는 단리된 변형된 MSC 엑소좀은 뉴런을 보호하고 신경발생을 강화하는데 유용할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 성장인자를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 미분화된 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 성장인자를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 NTF를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 미분화된 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 NTF를 증가된 양으로 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 단리된 MSC-NTF 엑소좀은, IGF-1, IGF-2 또는 GDF5, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는, 성장인자를 포함한다. 일부 구현예에서, 성장인자는 인간 성장인자이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 미분화된 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 성장인자를 증가된 양으로 포함하며, 이러한 성장인자는 IGF-1, IGF-2 또는 GDF5, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 IGF-1을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 미분화된 MSC와 비교해 IGF-1을 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 IGF-2를 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 미분화된 MSC와 비교해 IGF-2를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 GDF5를 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 미분화된 MSC와 비교해 GDF5를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, IGF-1, IGF-2 및 GDF-5는 각각 인간 IGF-1, 인간 IGF-2 및 인간 GDF-5이다.
일부 구현예에서, IGF-1을 포함하는 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 IGF-1을 발현하는 MSC-NTF 세포로부터 단리된다. 일부 구현예에서, IGF-2를 포함하는 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 IGF-2를 발현하는 MSC-NTF 세포로부터 단리된다. 일부 구현예에서, GDF-5를 포함하는 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 GDF-5를 발현하는 MSC-NTF 세포로부터 단리된다.
일부 구현예에서, IGF-1을 포함하는 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 IGF-1을 고도로 발현하는 MSC-NTF 세포로부터 단리된다. 일부 구현예에서, IGF-2를 포함하는 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 IGF-2를 고도로 발현하는 MSC-NTF 세포로부터 단리된다. 일부 구현예에서, GDF-5를 포함하는 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 GDF-5를 고도로 발현하는 MSC-NTF 세포로부터 단리된다.
일부 구현예에서, IGF-1을 포함하는 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 악화 중인 운동 신경을 보호하는데 유용할 수 있으며, 운동 신경 축삭의 성장과 재생을 촉진하기 위해 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, IGF-2를 포함하는 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 운동 뉴런을 보호하고 운동 축삭 재생을 촉진하는데 유용할 수 있다. 일부 구현예에서, GDF-5를 포함하는 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 뉴런을 보호하고 신생발생을 강화하는데 유용할 수 있다.
일부 구현예에서, 단리된 변형된 MSC-NTF 엑소좀은 갈렉틴-1 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 변형된 MSC 엑소좀은 갈렉틴-1 분자를 포함한다.
갈렉틴-1 (LGALS1)은 갈락토스-결합성 렉틴으로서, 세포 부착, 세포 증식 및 프로그래밍된 세포 사멸을 조절하는데 관여하는 다기능성 분자이다. 신경계에서, 갈렉틴-1은 뉴런 줄기 세포의 증식, 신경돌기 성장 (neurite outgrowth) 및 세포의 레독스 상태 적응에 관여하며, 아울러 NR1 서브유닛과의 상호작용을 통한 글루타메이트 독성 조절에도 관여한다. α-시누클레인-강화된 세포 모델에서, 갈렉틴-1은 응집된 α-시누클레인의 전달 제어 (transmission control)에서 중요한 역할을 담당하였다. 갈렉틴-1 처리는 클라트린 (clathrin) 및 EEA1의 발현은 현저하게 낮추고, NR1의 발현은 증가시키고, 동시에 NMDA 수용체 결합성을 증가시켰으며, 이는 내재화된 사이토졸 α-시누클레인의 수준 감소로 이어졌다 (Oh et al., 2016, Cell Reports 14, 835-849).
일부 구현예에서, 본원에 기술된 단리된 변형된 MSC 엑소좀은 갈렉틴-1을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 단리된 변형된 MSC 엑소좀은 유전자 비-변형된 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 갈렉틴-1을 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 단리된 변형된 MSC 엑소좀은 인간 갈렉틴-1을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 단리된 변형된 MSC 엑소좀은 유전자 비-변형된 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 인간 갈렉틴-1을 증가된 양으로 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 단리된 변형된 MSC-NTF 엑소좀은 갈렉틴-1을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 단리된 변형된 MSC-NTF 엑소좀은 유전자 비-변형된 MSC-NTF로부터 단리된 엑소좀과 비교해 갈렉틴-1을 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 단리된 변형된 MSC-NTF 엑소좀은 인간 갈렉틴-1을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 단리된 변형된 MSC-NTF 엑소좀은 유전자 비-변형된 MSC-NTF로부터 단리된 엑소좀과 비교해 인간 갈렉틴-1을 증가된 양으로 포함한다.
일부 구현예에서, 갈렉틴-1을 포함하는 단리된 변형된 MSC 엑소좀은 갈렉틴-1을 발현하는 유전자 변형된 MSC로부터 단리된다. 일부 구현예에서, 상기한 유전자 변형된 MSC 세포는 갈렉틴-1을 고도로 발현한다. 일부 구현예에서, 갈렉틴-1을 포함하는 단리된 변형된 MSC-NTF 엑소좀은 갈렉틴-1을 발현하는 유전자 변형된 MSC-NTF 세포로부터 단리된다. 일부 구현예에서, 상기한 유전자 변형된 MSC-NTF 세포는 갈렉틴-1을 고도로 발현한다.
일부 구현예에서, 갈렉틴-1 분자를 포함하는 단리된 변형된 MSC 엑소좀은 악화 중인 운동 신경을 보호하는데 유용할 수 있으며, 운동 신경 축삭의 성장 및 재생을 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 갈렉틴-1 분자를 포함하는 단리된 변형된 MSC-NTF 엑소좀은 운동 뉴런을 보호하고 운동 축삭 재생을 유도하는데 유용할 수 있다.
일부 구현예에서, 갈렉틴-1을 포함하는 단리된 변형된 MSC 엑소좀은 갈렉틴-1을 발현하는 변형된 MSC 세포로부터 단리된다. 일부 구현예에서, 갈렉틴-1을 포함하는 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 갈렉틴-1을 발현하는 MSC-NTF 세포로부터 단리된다. 일부 구현예에서, 갈렉틴-1을 포함하는 단리된 변형된 MSC 엑소좀은 갈렉틴-1을 고도로 발현하는 변형된 MSC 세포로부터 단리된다. 일부 구현예에서, 갈렉틴-1을 포함하는 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 갈렉틴-1을 고도로 발현하는 MSC-NTF 세포로부터 단리된다.
miR-7은 주로 뉴런에서 발현되며, α-시누클레인 단백질 수준을 억제하고, 세포를 산화 스트레스로부터 보호하고, 뉴런을 MPP+ 유도된 세포 사멸로부터 보호하고, 도파민 뉴런을 nod-유사 수용체 단백질 3 (NLRP3) 인플라마좀-매개된 신경염증의 억제를 통해 PD-유사 변성으로부터 보호하는 것으로 알려져 있다.
질환 또는 장애에서 유해한 것으로 알려진 타겟 단백질의 양을 낮추기 위한 한가지 방법은 특정 단백질 또는 펩타이드를 타겟팅하는 miRNA를 이용함으로써 이루어진다. miRNA 분자의 사용은 타겟 단백질 또는 펩타이드의 발현을 하향 조절하거나 또는 중단할 수 있다.
일부 구현예에서, 단리된 변형된 MSC 엑소좀은 신경퇴행성 질환에서 치료 타겟으로 알려진 단백질을 타겟팅하는 miRNA 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 변형된 MSC 엑소좀은 신경퇴행성 질환에서 치료 타겟으로 알려진 단백질을 타겟팅하는 miRNA 분자를 유전자 비-변형된 MSC와 비교해 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, miRNA 분자의 사용은 타겟 단백질의 발현을 하향 조절하거나 또는 발현을 저해한다.
일부 구현예에서, 단리된 변형된 MSC 엑소좀은 miR-7 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 유전자 비-변형된 MSC와 비교해 miR-7을 증가된 양으로 포함한다.
일부 구현예에서, miR-7을 포함하는 단리된 변형된 MSC 엑소좀은 miR-7을 고도로 발현하는 유전자 변형된 MSC 세포로부터 단리된다. 일부 구현예에서, miR-7을 포함하는 단리된 변형된 MSC 엑소좀은 miR-7을 발현하는 유전자 변형된 MSC 세포로부터 단리된다.
일부 구현예에서, miR-7을 포함하는 단리된 변형된 MSC 엑소좀은 α-시누클레인 단백질 수준을 억제하고, 세포를 산화 스트레스로부터 보호하고, MPP+ 유도성 세포 사멸로부터 뉴런을 보호하고, 도파민 뉴런을 nod-유사 수용체 단백질 3 (NLRP3) 인플라마좀-매개 신경염증을 통한 PD-유사 변성으로부터 보호하는데 유용할 수 있다.
일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 신경퇴행성 질환에서 치료 타겟으로 알려진 단백질을 타겟팅하는 miRNA 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 신경퇴행성 질환에서 치료 타겟으로 알려진 단백질을 타겟팅하는 miRNA 분자를 미분화된 MSC와 비교해 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, miRNA 분자의 사용은 타겟 단백질의 발현을 하향 조절하거나 또는 발현을 중단시킨다.
일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 miR-7 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 미분화된 MSC와 비교해 miR-7을 증가된 양으로 포함한다.
일부 구현예에서, miR-7을 포함하는 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 miR-7을 고도로 발현하는 MSC-NTF 세포로부터 단리된다. 일부 구현예에서, miR-7을 포함하는 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 miR-7을 발현하는 MSC-NTF 세포로부터 단리된다.
일부 구현예에서, miR-7을 포함하는 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 α-시누클레인 단백질 수준을 억제하고, 세포를 산화 스트레스로부터 보호하고, MPP+ 유도성 세포 사멸로부터 뉴런을 보호하고, 도파민 뉴런을 nod-유사 수용체 단백질 3 (NLRP3) 인플라마좀-매개 신경염증을 통한 PD-유사 변성으로부터 보호하는데 유용할 수 있다.
매트릭스 메탈로프로테이나제-9 (MMP-9)은 세포외 기질의 변성에 참여하는 효소 매트릭신 (matrixin)이다. MMP-9은 대부분의 뇌 및 척추 운동 뉴런에 의해 강하게 발현되며, 안구운동 (oculomotor) 및 Onuf의 핵 (인간 척수의 천골 영역의 전각 (anterior horn)의 복부 파트 (추궁판 IX)에 위치한 구분되는 뉴런 군)에는 없다. 놀랍게도, 이는 척수의 S 운동 뉴런에서도 검출불가능하였다. 이는, MMP-9이 모든 ALS-취약성 운동 뉴런에서 기대되는 마커임을 시사한다. 기능적으로, SOD1 마우스에서 심지어 MMP-9 수준의 일부 감소는 근육 탈신경 (muscle denervation)의 현저한 지연 및 수명의 현저한 연장으로 이어진다. 아울러, MMP-9은 질환 프로세스의 초기에 작용하며, 서브타입-특이적인 ER 스트레스의 개시를 촉진한다. 마우스에 MMP-9의 선택적인 도입이 fast MN의 변성을 유도하는데 충분한 것으로 입증되었으며, 이는 메탈로프로테이나제의 부정적인 역할을 검증해준다. 흥미롭게도, MMP9은 미세아교세포 활성화를 유도하는 것으로 또한 밝혀졌다. 따라서, MMP-9은 신경퇴행성 질환, 예를 들어 비-제한적으로, ALS 및 PD에 대한 강력한 치료학적 타겟 후보일 수 있다.
MMP-9 발현은 PD 동물 모델의 흑질 및 선조체에서 증가된다. 아울러, MMP-9-발현성 미세아교세포 및 성상 세포는 현저한 염증과 동시에 증가한다. MMP-9 넉아웃은 기능성 도파민 뉴런의 수 증가와 관련된, 활성 미세아교세포의 수를 감소시킨다.
질환 또는 장애에서 유해한 것으로 알려진 타겟 단백질의 양을 줄이는 한가지 방법은, 단백질을 코딩하는 mRNA에 상보적인 siRNA의 사용을 통해 이루어진다. siRNA의 사용은 이후 타겟 폴리펩타이드의 발현을 하향 조절하거나 또는 발현을 중단시킨다.
일부 구현예에서, 단리된 변형된 MSC 엑소좀은 siRNA 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, siRNA 분자는 신경퇴행성 질환의 공지된 타겟을 코딩하는 mRNA에 상보적이다. 일부 구현예에서, siRNA는 신경퇴행성 질환의 공지된 타겟의 발현 감소 또는 소거를 목표로 한다.
일부 구현예에서, 단리된 변형된 MSC 엑소좀은 인간 메탈로프로테이나제-9 (MMP-9)에 상보적인 siRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 변형된 MSC 엑소좀은 인간 메탈로프로테이나제-9 (MMP-9)의 일부에 상보적인 siRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, siRNA를 포함하는 단리된 변형된 MSC 엑소좀은 MMP-9의 수준을 감소시켜, 운동 뉴런을 보호하는데 유용할 수 있다.
일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 siRNA 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, siRNA 분자는 신경퇴행성 질환의 공지된 타겟을 코딩하는 mRNA에 상보적이다. 일부 구현예에서, siRNA는 신경퇴행성 질환의 공지된 타겟의 발현의 감소 또는 소거를 목표로 한다.
일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 인간 메탈로프로테이나제-9 (MMP-9)에 상보적인 siRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 인간 메탈로프로테이나제-9 (MMP-9)의 일부에 상보적인 siRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, siRNA를 포함하는 단리된 MSC-NTF 엑소좀은 MMP-9 수준을 감소시켜, 운동 뉴런을 보호하는데 유용할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은, 본원에 기술된 단리된 변형된 MSC 엑소좀 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 약학적 조성물을 개시한다. 일부 구현예에서, "약학적 조성물"은 본원에 기술된 하나 이상의 활성 성분이 생리학적으로 적합한 담체 및 부형제와 같은 다른 화학적 성분과 함께 구성된 조제물을 포괄한다. 약학적 조성물의 목적은 활성 성분을 유기체에 용이하게 투여하기 위한 것이다.
일부 구현예에서, "활성 성분"은 생물학적 효과를 담당하는 MSC-NTF 세포로부터 유래된 단리된 엑소좀을 지칭한다.
다른 구현예에서, 표현 "약제학적으로 허용가능한 담체"는 유기체에게 유의한 자극을 유발하지 않으며; 투여된 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 해치지 않는 담체 또는 희석제를 포괄한다.
일부 구현예에서, 조성물은 단리된 변형된 MSC 엑소좀을 포함하되, 조성물은 엑스트라-엑소좀 (extra-exosomal) 물질은 기본적으로 포함하지 않는다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 엑스트라-엑소좀 물질이, 비-제한적으로, 정상적으로는 엑소좀 안에서 발견되지 않는 핵산-단백질 복합체, 핵산 및/또는 단백질을 포함함을, 알 것이다. 일부 구현예에서, 단리된 변형된 MSC 엑소좀으로 된 조성물은 MSC와 같은 세포 또는 이의 세포 단편을 함유하지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 컨디셔닝화된 매질 (conditioned media)을 실질적으로 함유하지 않을 수 있다. 전형적으로, 단리된 엑소좀은 비-조작된 컨디셔닝화된 매질에 존재하는 엑소좀보다 더 높은 농도로 조성물에 제공된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 단리된 변형된 MSC 엑소좀을 포함하는 약학적 조성물은 MSC 또는 MSC-NTF 세포와 조합하여 투여할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 단리된 MSC-NTF 엑소좀을 포함하는 약학적 조성물을 기술한다. 일부 구현예에서, 조성물은 단리된 MSC-NTF 엑소좀을 포함하되, 조성물에는 엑스트라-엑소좀 물질이 기본적으로 존재하지 않는다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 엑스트라-엑소좀 물질이 비-제한적으로 엑소좀 안에서는 정상적으로 발견되지 않는 핵산-단백질 복합체, 핵산 및/또는 단백질을 포함함을, 알 것이다. 일부 구현예에서, 단리된 엑소좀으로 된 조성물에는 MSC 또는 MSC-NTF와 같은 세포 또는 이의 세포 단편이 존재하지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 컨디셔닝화된 매질을 함유하지 않거나 또는 실질적으로 함유하지 않을 수 있다. 전형적으로, 단리된 엑소좀은 비-조작된 컨디셔닝화된 매질에 존재하는 엑소좀보다 더 높은 농도로 조성물에 제공된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 단리된 MSC-NTF 엑소좀을 포함하는 약학적 조성물은 MSC-NTF 세포와 조합하여 투여할 수 있다. 특정 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀 및 MSC-NTF 세포는 각각 별개의 조성물에 포함된다. 특정 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀 및 MSC-NTF 세포는 각각 분리하여 투여된다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함한다. 이러한 조제물은 통상적으로 염, 완충화제, 보존제, 혼용가능한 (compatible) 담체를 일부 약제학적으로 허용가능한 농도로 함유할 수 있으며, 선택적으로 다른 (즉, 제2) 치료학적 물질을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제는, 예방학적 또는 치료학적 활성 물질을 운반 또는 수송하는데 관여하는, 약제학적으로 허용가능한 물질, 조성물 또는 비히클, 예를 들어 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질이다. 각각의 담체는 제형의 다른 성분들과 혼용가능하며 개체에게 유해하지 않다는 의미에서 "허용가능"하여야 한다. 약제학적으로 허용가능한 담체로서 이용될 수 있는 물질에 대한 일부 예로는 당, 예를 들어 락토스, 글루코스 및 슈크로스; 글리콜, 예를 들어 프로필렌 글리콜; 폴리올, 예를 들어 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 에스테르, 예를 들어 에틸 올리에이트 및 에틸 라우레이트; 완충화제, 예를 들어 마그네슘 하이드록사이드 및 알루미늄 하이드록사이드; 발열원 제거 수 (pyrogen-free water); 등장성 염수; 링거액; 에틸 알코올; 포스페이트 완충제 용액; 및 그외 약학적 제형에 사용되는 혼용가능한 물질 등이 있다.
조성물은 수용성 현탁제, 용액제 또는 오일성 또는 수성 비히클 중의 에멀젼과 같은 형태를 취할 수 있으며, 현탁화제, 안정제 및/또는 분산화제와 같은 제형보조제 (formulatory agent)를 함유할 수 있다. 적절한 친지성 용매 또는 비히클로는 지방 오일, 예를 들어 참깨 오일, 또는 합성 지방산 에스테르, 예를 들어 에틸 올리에이트 또는 트리글리세라이드 등이 있다. 수성 주사 현탁제는 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 또는 덱스트란과 같은 현탁제의 점성을 높이는 물질을 함유할 수 있다. 선택적으로, 현탁제는 적절한 안정제 또는 용해성을 높이는 물질을 또한 함유할 수 있다. 대안적으로, 엑소좀은 사용 전에 적절한 비히클, 예를 들어, 무균성 발열원 제거수를 사용해 구성 (constitution)하기 위한 동결건조된 또는 그외 분말 또는 고체 형태일 수 있다.
일부 구현예에서, MSC-NTF 세포로부터 유래된 단리된 엑소좀 집단은 LIF 단백질, CXCL1 단백질, IL13 단백질, VEGFA 단백질 또는 GDF15 단백질, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 하나 이상의 카고 단백질을, 대조군 MSC로부터 유래된 단리된 엑소좀 집단 내 하나 이상의 카고 단백질의 양과 비교해, 증가된 양으로 포함한다.
일부 구현예에서, MSC-NTF 세포로부터 유래된 단리된 엑소좀 집단은, LIF 단백질, CXCL1 단백질, IL13 단백질, VEGFA 단백질 또는 GDF15 단백질, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 2종 이상의 카고 단백질을, 대조군 MSC로부터 유래된 단리된 엑소좀 집단 내 하나 이상의 카고 단백질의 양과 비교해, 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포로부터 유래된 단리된 엑소좀 집단은, LIF 단백질, CXCL1 단백질, IL13 단백질, VEGFA 단백질 또는 GDF15 단백질, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 적어도 3, 4 또는 5종의 카고 단백질을, 대조군 MSC로부터 유래된 단리된 엑소좀 집단 내 하나 이상의 카고 단백질의 양과 비교해, 증가된 양으로 포함한다.
본원에 제시된 기술은, 일부 구현예에서, SPINT2, IL36G 및 TNFRSF10B로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 포함하는 단리된 엑소좀을 제공한다.
특정 구현예에서, 단리된 엑소좀은 단백질 SPINT2를 포함한다. 특정 구현예에서, 단리된 엑소좀은 단백질 IL36G를 포함한다. 특정 구현예에서, 단리된 엑소좀은 단백질 TNFRSF10B를 포함한다. 특정 구현예에서, 단리된 엑소좀은 단백질 SPINT2 및 IL36G를 포함한다. 특정 구현예에서, 단리된 엑소좀은 단백질 IL36G 및 TNFRSF10B를 포함한다. 특정 구현예에서, 단리된 엑소좀은 단백질 SPINT2 및 TNFRSF10B를 포함한다. 특정 구현예에서, 단리된 엑소좀은 단백질 SPINT2, IL36G 및 TNFRSF10B를 포함한다.
특정 구현예에서, 엑소좀은 단백질 TNFSF14를 포함한다.
특정 구현예에서, MSC-NTF 유래 엑소좀 집단은 IL36A, CCL7, MMP10, PIFG, CXCL8, LTA, CXCL6, MMP3, CHI3L1, IL11, FGF2, CXCL5, GAS1, JAML, TGFBR3, MEPE, IL6, PDGFA, CCL4, CCL21, CCL2, MIF, PLAU, ANGPTL4, CTSB, BSG, CCL5, TPO, IL23, IL1RL1, SPP1, F11R, INHBA, FAP 및 이들의 임의 조합을 포함하는 하나 이상의 부가적인 단백질을 더 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 유래 엑소좀 집단은 LYVE1, FRZB, CCL11, C5a, 및 이들의 임의 조합을 포함하는 하나 이상의 부가적인 단백질을 더 포함한다.
특정 구현예에서, 엑소좀은 LIF 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 CXCL1 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 IL36A 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 VEGFA 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 GDF15 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 CCL7 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 MMP10 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 PIFG 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 CXCL8 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 LTA 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 CXCL6 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 MMP3 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 CHI3L1 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은IL11 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 FGF2 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 CXCL5 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 GAS1 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 JAML 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 TGFBR3 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 MEPE 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 IL6 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 PDGFA 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 CCL4 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 CCL21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 IL13 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 VEGFA 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 CCL2 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 MIF 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 GDF15 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 PLAU 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 NGPTL4 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 CTSB 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 BSG 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 CCL5 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 TPO 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 IL23 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 IL1RL1 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 SPP1 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 F11R 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 INHBA 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 FAP 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 LYVE1 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 FRZB 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 CCL11 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 C5a 단백질을 포함한다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 단리된 MSC-NTF 유래 엑소좀 집단이 대조군 MSC 세포로부터 유래된 엑소좀과 비교해 증가된 양으로 특정 단백질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 유래 엑소좀 집단에 존재하는 카고 단백질은 대조군 MSC 세포로부터 유래된 엑소좀과 비교해 증가된 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 증가된 양은 배수 증가를 포함한다.
일부 구현예에서, 카고 단백질의 증가된 양은 대조군 MSC 세포로부터 단리된 엑소좀과 비교해 2배 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 카고 단백질의 증가된 양은 대조군 MSC 세포로부터 단리된 엑소좀과 비교해 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30배 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 카고 단백질의 증가된 양은 대조군 MSC 세포로부터 단리된 엑소좀과 비교해 적어도 2배 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 카고 단백질의 증가된 양은 대조군 MSC 세포로부터 단리된 엑소좀과 비교해 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30배 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 카고 단백질의 증가된 양은 대조군 MSC 세포로부터 단리된 엑소좀과 비교해 30배를 초과하는 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 카고 단백질의 증가된 양은 대조군 MSC 세포로부터 단리된 엑소좀과 비교해 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50배 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 카고 단백질의 증가된 양은 대조군 MSC 세포로부터 단리된 엑소좀과 비교해 적어도 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50배 증가를 포함한다.
본 출원 전체에서, 다양한 구현예들이 범위 형태로 제시될 수 있다. 범위 형태의 설명은 주로 편의성 및 간결성을 목적으로 하는 것일 뿐 본 발명의 범위에 대한 고정된 제한으로서 해석되어서는 안 되는 것으로 이해되어야 한다. 즉, 범위의 기술은 범위에 포함된 모든 하위 범위뿐 아니라 그 범위에 속하는 개별 수치 값을 기술하는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1-6과 같은 범위의 기술은 구체적으로 하위 범위, 예를 들어 1-3, 1-4, 1-5, 2-4, 2-6, 3-6 등 뿐만 아니라 범위에 속하는 개별 수치, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 및 6을 기술하는 것으로 간주되어야 한다. 이는 범위의 폭과 무관하게 적용된다.
수치 범위가 본원에 기술된 경우, 이는 언급된 범위 내에 속하는 임의의 인용된 수치 (분수 또는 정수)를 포함하는 것을 의미한다. 제1 지정된 수치 내지 제2 지정된 수치"의 범위/범위"와, 제1 지정된 수치에서 제2 지정된 수치까지"의 범위/범위"는 본원에서 상호 호환적으로 사용되며, 이는 제1 지정된 수치와 제2 지정된 수치를 포함하고, 그 사이에 존재하는 모든 분수 및 정수를 포함하는 것을 의미한다.
특정 구현예에서, 엑소좀은 분화 클러스터 (CD)9, CD29, CD63, CD81, CD44, CD49, CD73, CD90, CD105, CD61, CD271, ALIX, 종양 감수성 유전자 (TSG)101 및 이들의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 더 포함한다.
특정 구현예에서, 엑소좀은 마커 CD9을 더 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 마커 CD29을 더 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 마커 CD63를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 마커 CD81을 더 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 마커 CD44를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 마커 CD49을 더 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 마커 CD73를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 마커 CD90를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 마커 CD105를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 마커 CD61을 더 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 마커 CD271을 더 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 마커 ALIX를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 마커 TSG101을 더 포함한다.
특정 구현예에서, 엑소좀에는 CD3, CD5, CD14, CD19, CD20, CD34, CD45, CD11B, FMC7, 칼넥신, HLA-DR (human leukocyte antigen - antigen D related) 및 이들의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커가 존재하지 않는다.
특정 구현예에서, 엑소좀에는 마커 CD3가 존재하지 않는다. 특정 구현예에서, 엑소좀에는 마커 CD5가 존재하지 않는다. 특정 구현예에서, 엑소좀에는 마커 CD14이 존재하지 않는다. 특정 구현예에서, 엑소좀에는 마커 CD19이 존재하지 않는다. 특정 구현예에서, 엑소좀에는 마커 CD20가 존재하지 않는다. 특정 구현예에서, 엑소좀에는 마커 CD34가 존재하지 않는다. 특정 구현예에서, 엑소좀에는 마커 CD45가 존재하지 않는다. 특정 구현예에서, 엑소좀에는 마커 CD11B가 존재하지 않는다. 특정 구현예에서, 엑소좀에는 마커 FMC7이 존재하지 않는다. 특정 구현예에서, 엑소좀에는 마커 칼넥신이 존재하지 않는다. 특정 구현예에서, 엑소좀에는 마커 HLA-DR이 존재하지 않는다.
특정 구현예에서, 엑소좀은 SPINT2, TNFSF14, IL36G, TNFRSF10B, IL36A, CCL7, MMP10, PIFG, CXCL8, LTA, LIF, CXCL1, CXCL6, MMP3, CHI3L1, IL11, FGF2, CXCL5, GAS1, JAML, TGFBR3, MEPE, IL6, PDGFA, CCL4, CCL21, IL13, VEGFA, CCL2, MIF, GDF15, PLAU, ANGPTL4, CTSB, BSG, CCL5, TPO, IL23, IL1RL1, SPP1, F11R, INHBA 및 FAP로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질, 및 이들의 임의 조합을, 대조군 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해, 증가된 수준으로 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 LYVE1, FRZB, CCL11, C5a 및 이들의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 대조군 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해 감소된 수준으로 포함한다.
일부 구현예에서, 단리된 엑소좀 집단에서 양적으로 증가되는 단백질은 NTF를 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 단백질, 예를 들어 NTF를 대조군 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해 더 높은 수준으로 포함한다. 일부 구현예에서, 증가된 양으로 존재하는 NTF는 LIF 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 증가된 양으로 존재하는 NTF는 VEGF 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 증가된 양으로 존재하는 NTF는 VEGFA 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 증가된 양으로 존재하는 NTF는 GDF15 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 증가된 양으로 존재하는 NTF는 FGF2 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 증가된 양으로 존재하는 NTF는 LIF, VEGF, VEGFA, GDF15 및 FGF2 단백질로부터 선택되는 NTF 조합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 증가된 양으로 존재하는 NTF는 LIF, VEGF, VEGFA, GDF15 및 FGF2 단백질을 포함하는 NTF 조합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 증가된 양으로 존재하는 NTF는 LIF 및 VEGFA 및 GDF15 단백질을 포함하는 NTF 조합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 증가된 양으로 존재하는 NTF는 LIF 및 VEGFA 단백질을 포함하는 NTF 조합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 증가된 양으로 존재하는 NTF는 LIF 및 GDF15 단백질을 포함하는 NTF 조합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 증가된 양으로 존재하는 NTF는 VEGFA 및 GDF15 단백질을 포함하는 NTF 조합물을 포함한다. 용어 "MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀" 또는 "대조군 엑소좀"은, 본원에서, 당해 기술 분야의 당업자라면 임의의 특정 단백질을 포함하거나 또는 결핍되도록 분화 또는 조작되지 않은, 대조군 MSC로부터 분비된 엑소좀으로서 이해할 것이다.
특정 구현예에서, 엑소좀은 대조군 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해 SPINT2를 증가된 수준으로 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 대조군 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해 TNFSF14을 증가된 수준으로 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 대조군 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해 IL36G를 증가된 수준으로 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 대조군 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해 TNFRSF10B를 증가된 수준으로 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 대조군 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해 IL36A를 증가된 수준으로 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 대조군 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해 CCL7을 증가된 수준으로 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 대조군 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해 MMP10을 증가된 수준으로 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 대조군 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해 PIFG를 증가된 수준으로 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 대조군 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해 CXCL8을 증가된 수준으로 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 대조군 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해 LTA를 증가된 수준으로 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해 LIF를 더 높은 수준으로 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 대조군 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해 CXCL1을 더 높은 수준으로 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 대조군 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해 CXCL6를 더 높은 수준으로 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 대조군 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해 MMP3를 더 높은 수준으로 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 대조군 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해 CHI3L1을 더 높은 수준으로 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 대조군 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해 IL11을 더 높은 수준으로 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 대조군 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해 FGF2를 더 높은 수준으로 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 대조군 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해 CXCL5를 더 높은 수준으로 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 대조군 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해 GAS1을 더 높은 수준으로 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 대조군 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해 JAML을 더 높은 수준으로 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 대조군 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해 TGFBR3를 더 높은 수준으로 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 대조군 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해 MEPE를 더 높은 수준으로 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 대조군 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해 IL6를 더 높은 수준으로 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 대조군 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해 PDGFA를 더 높은 수준으로 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 대조군 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해 CCL4를 더 높은 수준으로 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 대조군 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해 CCL21을 더 높은 수준으로 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 대조군 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해 IL13를 더 높은 수준으로 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 대조군 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해 VEGFA를 더 높은 수준으로 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 대조군 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해 CCL2를 더 높은 수준으로 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 대조군 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해 MIF를 더 높은 수준으로 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 대조군 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해 GDF15을 더 높은 수준으로 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 대조군 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해 PLAU를 더 높은 수준으로 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 대조군 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해 ANGPTL4를 더 높은 수준으로 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 대조군 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해 CTSB를 더 높은 수준으로 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 대조군 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해 BSG를 더 높은 수준으로 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 대조군 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해 CCL5를 더 높은 수준으로 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 대조군 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해 TPO를 더 높은 수준으로 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 대조군 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해 IL23를 더 높은 수준으로 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 대조군 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해 IL1RL1을 더 높은 수준으로 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 대조군 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해 SPP1을 더 높은 수준으로 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 대조군 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해 F11R을 더 높은 수준으로 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 대조군 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해 INHBA를 더 높은 수준으로 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 대조군 MSC로부터 유래된 대응되는 엑소좀에서의 동일 단백질의 수준과 비교해 FAP를 더 높은 수준으로 포함한다.
특정 구현예에서, MSC는 골수 MSC, 지방세포 MSC, 치수 MSC, 태반 MSC, 활막 MSC, 말초혈 MSC, 구강 점막 MSC, 치근막 MSC, 자궁내막 MSC, 탯줄 MSC 및 제대혈 MSC로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, MSC는 골수 MSC이다. 특정 구현예에서, MSC는 지방세포 MSC이다. 특정 구현예에서, MSC는 치수 MSC이다. 특정 구현예에서, MSC는 태반 MSC이다. 특정 구현예에서, MSC는 활막 MSC이다. 특정 구현예에서, MSC는 말초혈 MSC이다. 특정 구현예에서, MSC는 구강 점막 MSC이다. 특정 구현예에서, MSC는 치근막 MSC이다. 특정 구현예에서, MSC는 자궁내막 MSC이다. 특정 구현예에서, MSC는 탯줄 MSC이다. 특정 구현예에서, MSC는 제대혈 MSC이다.
특정 구현예에서, 엑소좀은 VEGF, HGF, LIF, GDNF, NT-3, 뉴로트로핀-4/5, NTN, 뉴로트로핀-4, 퍼세핀, ART, CNTF, IGF-1, GDF-15, G-CSF, BDNF, TSG-6, BMP2 및 FGF2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 신경영양 인자 (NTF), 또는 이들의 임의 조합을 더 포함한다.
특정 구현예에서, 엑소좀은 VEGF를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 HGF를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 LIF를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 G-CSF를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 BDNF를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 TSG-6를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 BMP2를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 FGF2를 더 포함한다.
특정 구현예에서, 엑소좀은 miRNA (miR)-3663-3p, miR-132-3p, miR-150-3p, miR-762, miR-4327, miR-3665, miR-34a-5p, miR-1915, miR-34a-39, miR-34b-5p, miR-874, miR-4281, miR-1207-5p, miR-30b-5p, miR-29b-3p, miR-199b-5p, miR-30e-5p, miR-26a-5p, miR-4324 및 이들의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA 분자를 더 포함한다.
특정 구현예에서, 엑소좀은 miR-3663-3p를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 miR-132-3p를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 miR-150-3p를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 miR-762를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 miR-4327을 더 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 miR-3665를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 miR-34a-5p를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 miR-1915를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 miR-34a-39를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 miR-34b-5p를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 miR-874를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 miR-4281을 더 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 miR-1207-5p를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 miR-30b-5p를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 miR-29b-3p를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 miR-199b-5p를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 miR-30e-5p를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 miR-26a-5p를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 miR-4324를 더 포함한다.
특정 구현예에서, 엑소좀에는 miR-503, miR-3659, miR-3529-3p, miR-320b, miR-1275, miR-3132, miR-320a, miR-495, miR-181b-5p, miR-222-3p, miR-424-5p, miR-4284, miR-574-5p, miR-143-3p, miR-106a-5p, miR-455-3p, miR-20a-5p, miR-145-5p, miR-324-3p, miR-130b-3p, miR-1305, miR-140-3p 및 이들의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA 분자가 존재하지 않는다.
특정 구현예에서, 엑소좀에는 miR-503가 존재하지 않는다. 특정 구현예에서, 엑소좀에는 miR-3659가 존재하지 않는다. 특정 구현예에서, 엑소좀에는 miR-3529-3p가 존재하지 않는다. 특정 구현예에서, 엑소좀에는 miR-320b가 존재하지 않는다. 특정 구현예에서, 엑소좀에는 miR-1275가 존재하지 않는다. 특정 구현예에서, 엑소좀에는 miR-3132가 존재하지 않는다. 특정 구현예에서, 엑소좀에는 miR-320a가 존재하지 않는다. 특정 구현예에서, 엑소좀에는 miR-495가 존재하지 않는다. 특정 구현예에서, 엑소좀에는 miR-181b-5p가 존재하지 않는다. 특정 구현예에서, 엑소좀에는 miR-222-3p가 존재하지 않는다. 특정 구현예에서, 엑소좀에는 miR-424-5p가 존재하지 않는다. 특정 구현예에서, 엑소좀에는 miR-4284가 존재하지 않는다. 특정 구현예에서, 엑소좀에는 miR-574-5p가 존재하지 않는다. 특정 구현예에서, 엑소좀에는 miR-143-3p가 존재하지 않는다. 특정 구현예에서, 엑소좀에는 miR-106a-5p가 존재하지 않는다. 특정 구현예에서, 엑소좀에는 miR-455-3p가 존재하지 않는다. 특정 구현예에서, 엑소좀에는 miR-20a-5p가 존재하지 않는다. 특정 구현예에서, 엑소좀에는 miR-145-5p가 존재하지 않는다. 특정 구현예에서, 엑소좀에는 miR-324-3p가 존재하지 않는다. 특정 구현예에서, 엑소좀에는 miR-130b-3p가 존재하지 않는다. 특정 구현예에서, 엑소좀에는 miR-1305가 존재하지 않는다. 특정 구현예에서, 엑소좀에는 miR-140-3p가 존재하지 않는다.
본원에 제공된 기술은, 다른 구현예에서, 전술한 단리된 MSC-NTF 엑소좀 집단을 포함하는 약학적 조성물을 추가적으로 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은, 백혈병 저해 인자 (LIF) 단백질, 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 1 (CXCL1) 단백질, 인터루킨 13 (IL13) 단백질, 혈관 내피 성장인자 A (VEGFA) 단백질 또는 성장 분화 인자 15 (GDF15) 단백질, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 하나 이상의 카고 단백질을, 대조군 MSC로부터 유래된 단리된 엑소좀 집단 내 하나 이상의 카고 단백질의 양과 비교해, 증가된 양으로 포함하는, 분화된 MSC-신경영양 인자 (MSC-NTF) 세포로부터 유래된 단리된 엑소좀 집단을 포함하는 약학적 조성물을 개시한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은, 백혈병 저해 인자 (LIF) 단백질, 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 1 (CXCL1) 단백질, 인터루킨 13 (IL13) 단백질, 혈관 내피 성장인자 A (VEGFA) 단백질 또는 성장 분화 인자 15 (GDF15) 단백질, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 카고 단백질 2종 이상을 대조군 MSC로부터 유래된 단리된 엑소좀 집단 내 하나 이상의 카고 단백질의 양과 비교해 증가된 양으로 포함하는, MSC-NTF 세포로부터 유래된 단리된 엑소좀 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은, 백혈병 저해 인자 (LIF) 단백질, 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 1 (CXCL1) 단백질, 인터루킨 13 (IL13) 단백질, 혈관 내피 성장인자 A (VEGFA) 단백질 또는 성장 분화 인자 15 (GDF15) 단백질, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 카고 단백질 적어도 3, 4 또는 5종을 대조군 MSC로부터 유래된 단리된 엑소좀 집단 내 하나 이상의 카고 단백질의 양과 비교해 증가된 양으로 포함하는, MSC-NTF 세포로부터 유래된 단리된 엑소좀 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은, LIF 단백질, CXCL1 단백질, IL13 단백질, VEGFA 단백질 및 GDF15 단백질을, 대조군 MSC로부터 유래된 단리된 엑소좀 집단 내 하나 이상의 카고 단백질의 양과 비교해 증가된 양으로 포함하는, MSC-NTF 세포로부터 유래된 단리된 엑소좀 집단을 포함한다.
특정 구현예에서, 약학적 조성물에는 온전한 세포, 파괴된 세포, 온전한 세포 소기관 및/또는 파괴된 세포 소기관이 실질적으로 존재하지 않는다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물에는 온전한 세포, 파괴된 세포, 온전한 세포 소기관 및/또는 파괴된 세포 소기관이 존재하지 않는다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물에는 온전한 세포가 존재하지 않는다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물에는 파괴된 세포가 존재하지 않는다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물에는 온전한 세포 소기관이 존재하지 않는다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물에는 파괴된 세포 소기관이 존재하지 않는다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물에는 온전한 세포, 파괴된 세포, 온전한 세포 소기관 및 파괴된 세포 소기관이 존재하지 않는다.
본원에서, 용어 "실질적으로 존재하지 않는"다는 것은 당해 기술 분야의 당업자에게 "결핍" 및 "미량 함유"를 포함하는 것으로 이해된다.
특정 구현예에서, 약학적 조성물 내 단리된 엑소좀의 순도는 적어도 50% 수준이다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물 내 단리된 엑소좀의 순도는 적어도 55% 수준이다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물 내 단리된 엑소좀의 순도는 적어도 60% 수준이다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물 내 단리된 엑소좀의 순도는 적어도 65% 수준이다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물 내 단리된 엑소좀의 순도는 적어도 70% 수준이다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물 내 단리된 엑소좀의 순도는 적어도 75% 수준이다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물 내 단리된 엑소좀의 순도는 적어도 80% 수준이다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물 내 단리된 엑소좀의 순도는 적어도 85% 수준이다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물 내 단리된 엑소좀의 순도는 적어도 90% 수준이다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물 내 단리된 엑소좀의 순도는 적어도 95% 수준이다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물 내 단리된 엑소좀의 순도는 적어도 99% 수준이다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 순도 수준을 당해 기술 분야에 공지된 다양한 방법으로 측정할 수 있음을 알 것이다.
단리된 MSC & MSC - NTF 엑소좀의 제조 방법
단리된 변형된 MSC 엑소좀의 제조 방법은 MSC 또는 유전자 변형된 MSC와 같은 단일 세포 타입으로부터 유래된 엑소좀의 단리 및 정제를 포함한다.
단리된 MSC-NTF 엑소좀의 제조 방법은 MSC-NTF 또는 유전자 변형된 MSC-NTF와 같은 단일 세포 타입으로부터 유래된 엑소좀의 단리 및 정제를 포함한다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 단리된 엑소좀이 정제된 엑소좀을 포괄함을 알 것이다. 일부 구현예에서, 단리된 엑소좀은 정제된 엑소좀을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 엑소좀은 정제된 엑소좀을 포함하는 조성물을 포함한다.
일부 구현예에서, 단리된 엑소좀은 천연 환경으로부터 물리적으로 분리된 것이다. 단리된 엑소좀은, MSC 또는 MSC-NTF를 비롯하여, 자연적으로 존재하는 조직 또는 세포로부터 완전히 또는 부분적으로 물리적으로 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 엑소좀의 조성물에는 세포, 예를 들어 MSC 또는 MSC-NTF가 없을 수 있거나, 또는 컨디셔닝화된 매질이 실질적으로 없을 수 있다.
일부 구현예에서, 엑소좀은 MSC-NTF 세포의 배양물로부터 컨디셔닝화된 매질로부터 단리될 수 있다. 일부 구현예에서, 엑소좀은 MSC의 배양물로부터 컨디셔닝화된 매질로부터 단리될 수 있다. 엑소좀의 단리 및/또는 회수 방법은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 방법은 규정된 기공 크기의 나일론 막 필터를 통한 차별적인 여과 (differential filtration)의 적용을 포함할 수 있다. 큰 기공을 통한 1차 여과시 세포 단편과 파편은 체류될 것이다. 작은 기공을 통한 후속적인 여과시 엑소좀은 체류되어 더 작은 크기의 오염물질로부터 정제될 것이다.
일부 구현예에서, 단리된 엑소좀의 제조 방법은 30-300 nm 크기의 엑소좀을 제조한다. 일부 구현예에서, 제조된 엑소좀은 30-250 nm이다. 일부 구현예에서, 제조된 엑소좀은 30-200 nm이다. 일부 구현예에서, 제조된 엑소좀은 30-175 nm이다. 일부 구현예에서, 제조된 엑소좀은 30-150 nm이다. 일부 구현예에서, 제조된 엑소좀은 40-150 nm이다. 일부 구현예에서, 제조된 엑소좀은 50-150 nm이다. 일부 구현예에서, 제조된 엑소좀은 30-100 nm이다. 일부 구현예에서, 제조된 엑소좀은 100-150 nm이다.
일부 구현예에서, 엑소좀은 골수 MSC, 지방세포 MSC, 치수 MSC, 태반 MSC, 활막 MSC, 말초혈 MSC, 구강 점막 MSC, 치근막 MSC, 자궁내막 MSC, 탯줄 MSC 또는 제대혈 MSC로부터 단리된다.
일부 구현예에서, 엑소좀은 골수 MSC-NTF, 지방세포 MSC-NTF, 치수 MSC-NTF, 태반 MSC-NTF, 활막 MSC-NTF, 말초혈 MSC-NTF, 구강 점막 MSC-NTF, 치근막 MSC-NTF, 자궁내막 MSC-NTF, 탯줄 MSC-NTF 또는 제대혈 MSC-NTF로부터 단리된다.
하기 실시예 4는 2종의 엑소좀 집단들이 서로 다른 카고를 가진 MSC-NTF로부터 단리되는 엑소좀의 제조 방법을 명확하게 보여준다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포로부터 단리된 엑소좀 집단의 제조 방법은 대조군 MSC로부터 제조된 단리된 엑소좀과 비교해 하나 이상의 카고 단백질을 증가된 양으로 포함하는 단리된 엑소좀 집단을 생산한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포로부터 단리된 엑소좀 집단의 제조 방법은 대조군 MSC로부터 제조된 단리된 엑소좀과 비교해 2 이상의 카고 단백질을 증가된 양으로 포함하는 단리된 엑소좀 집단을 생산한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 세포로부터 단리된 엑소좀 집단의 제조 방법은 대조군 MSC로부터 제조된 단리된 엑소좀과 비교해 적어도 3, 4 또는 5종의 카고 단백질을 증가된 양으로 포함하는 단리된 엑소좀 집단을 생산한다.
일부 구현예에서, MSC는 humMSC이다. 일부 구현예에서, humMSC는 유전자 변형되지 않는다. 일부 구현예에서, humMSC는 유전자 변형된다. 일부 구현예에서, MSC는 건강한 개체로부터 수득된 것이다. 일부 구현예에서, 분화된 MSC는 신경퇴행성 질환을 앓고 있는 개체로부터 수득된 것이다. 일부 구현예에서, 신경퇴행성 질환은 ALS, FTD, MSA, SMA, MS, PD. AD, 레트 증후군, CP, ASD 및 간질로부터 선택된다.
일부 구현예에서, MSC-NTF는 humMSC-NTF이다. 일부 구현예에서, humMSC-NTF는 유전자 변형되지 않는다. 일부 구현예에서, humMSC-NTF는 유전자 변형된다. 일부 구현예에서, 분화된 MSC는 건강한 개체로부터 수득된 것이다. 일부 구현예에서, 분화된 MSC는 신경퇴행성 질환을 앓고 있는 개체로부터 수득된 것이다. 일부 구현예에서, 신경퇴행성 질환은 ALS, FTD, MSA, SMA, MS, PD. AD, 레트 증후군, CP, ASD 및 간질로부터 선택된다.
당해 기술 분야에 공지된 방법으로는, 비-제한적으로, US 공개공보 20170258840 (실시예 파트), Lamparski et al., J Immunol Methods. 2002; 270:211-226.; 미국 특허 9,877,989 (실시예 파트), Corso et al., Sci Rep 7, 11561 (2017), 및 Lai et al., (2015) Semin Cell Dev Bio. 140:82-88에 언급된 방법을 포함한다.
MSC 컨디셔닝화된 매질로부터 엑소좀을 단리하는 방법은, 일부 구현예에서, MSC 세포를 포함하는 샘플을 컨디셔닝화된 매질에 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 단리 방법에서 사용되는 MSC는 본원에 기술된 유전자 변형된 MSC 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, MSC는 유전자 변형되지 않는다. 일부 구현예에서, MSC는 본원에 기술된 바와 같이 성장인자, miRNA 또는 siRNA, 또는 이들의 조합을 발현하거나, 또는 고도로 발현하도록 유전자 변형된다.
MSC 컨디셔닝화된 매질에 샘플이 제공되면, 엑소좀 단리 방법은 MSC 유래 엑소좀 (정제된 엑소좀)이 농화된 분획을 단리하는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 정제된 엑소좀 분획은 MSC 컨디셔닝화된 매질로부터 단리된다. 일부 구현예에서, 정제된 엑소좀 분획은 예를 들어 여과에 의해 세포 파편 및 거대 소낭이 제거된 MSC 컨디셔닝화된 매질로부터 단리된다. 일부 구현예에서, 세포 컨디셔닝화된 매질을 0.22 μm 필터를 통해 여과한다. 일부 구현예에서, 추가적인 여과는 접선 흐름 여과 (TFF)의 이용을 포함할 수 있다. 수집된 여과물은 정제된 엑소좀 분획을 포함한다.
일부 구현예에서, 정제된 엑소좀 분획에서 MSC 마커를 분석한다.
MSC-NTF로부터 엑소좀의 단리 방법은, 일부 구현예에서, 분화된 MSC 세포를 포함하는 샘플을 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 단리 방법에 사용되는 분화된 MSC 세포 (MSC-NTF)는 본원에 기술된 모든 분화된 MSC-NTF를 포함한다. 일부 구현예에서, MSC-NTF는 유전자 변형되지 않은 것이다. 일부 구현예에서, MSC-NTF는 본원에 기술된 바와 같이 성장인자, 갈렉틴-1 분자, miRNA 또는 siRNA를 발현 또는 고도로 발현하도록 유전자 변형된 것이다.
MSC-NTF 컨디셔닝화된 매질에 세포가 제공되면, 엑소좀 단리 방법은 MSC-NTF 유래 엑소좀 (정제된 엑소좀)으로 농화된 분획을 단리하는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 정제된 엑소좀 분획은 MSC-NTF 컨디셔닝화된 매질로부터 단리된다. 일부 구현예에서, 정제된 엑소좀 분획은 예를 들어 여과에 의해 세포 파편 및 거대 소낭이 제거된 MSC-NTF 컨디셔닝화된 매질로부터 단리된다. 일부 구현예에서, 세포 컨디셔닝화된 매질을 0.22 μm 필터를 통해 여과한다. 일부 구현예에서, 추가적인 여과는 접선 흐름 여과 (TFF)의 이용을 포함할 수 있다. 수집된 여과물은 정제된 엑소좀 분획을 포함한다.
일부 구현예에서, 정제된 엑소좀 분획에서 MSC 마커를 분석한다. 일부 구현예에서, 정제된 엑소좀 분획에서 MSC-NTF 마커를 분석한다. MSC-NTF 세포에서 발현되는 NTF 분자는 상기에서 상세히 기술하였다. 이들 NTF들의 임의 조합이 정제된 엑소좀 분획에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 정제된 엑소좀 분획은 비-제한적인 예로 VEGF, HGF, LIF, G-CSF, BDNF, TSG-6, BMP2 또는 FGF2 중 어느 하나 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀의 집단을 제조하기 위한 본원에 기술된 방법은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10종의 NTF를 증가된 양으로 포함하는 엑소좀을 생산한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀 집단을 제조하기 위한 본원에 기술된 방법은 적어도 1종의 NTF를 증가된 양으로 포함하는 엑소좀을 생산한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀 집단을 제조하기 위한 본원에 기술된 방법은 적어도 2종의 NTF를 증가된 양으로 포함하는 엑소좀을 생산한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀 집단을 제조하기 위한 본원에 기술된 방법은 적어도 3종의 NTF를 증가된 양으로 포함하는 엑소좀을 생산한다.
일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀 집단을 제조하기 위한 본원에 기술된 방법은 본원에 기술된 임의의 NTF를 포함하는 NTF 카고 단백질을 증가된 양으로 포함하는 엑소좀을 생산한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀 집단을 제조하기 위한 본원에 기술된 방법은 LIF, VEGFA 또는 GDF15, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 NTF 카고 단백질을 증가된 양으로 포함하는 엑소좀을 생산한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀 집단을 제조하기 위한 본원에 기술된 방법은 LIF 및 VEGFA를 포함하는 NTF 카고 단백질을 증가된 양으로 포함하는 엑소좀을 생산한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀 집단을 제조하기 위한 본원에 기술된 방법은 LIF 및 GDF15을 포함하는 NTF 카고 단백질을 증가된 양으로 포함하는 엑소좀을 생산한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀 집단을 제조하기 위한 본원에 기술된 방법은 VEGFA 및 GDF15을 포함하는 NTF 카고 단백질을 증가된 양으로 포함하는 엑소좀을 생산한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀 집단을 제조하기 위한 본원에 기술된 방법은 LIF, VEGFA 및 GDF15을 포함하는 NTF 카고 단백질을 증가된 양으로 포함하는 엑소좀을 생산한다.
일부 구현예에서, 부가적인 카고 단백질, 예를 들어, 비-제한적으로, 단백질 IL36A, CCL7, MMP10, PIFG, CXCL8, LTA, LIF, CXCL1, CXCL6, MMP3, CHI3L1, IL11, FGF2, CXCL5, GAS1, JAML, TGFBR3, MEPE, IL6, PDGFA, CCL4, CCL21, IL13, VEGFA, CCL2, MIF, GDF15, PLAU, ANGPTL4, CTSB, BSG, CCL5, TPO, IL23, IL1RL1, SPP1, F11R, INHBA 및 FAP 중 어느 하나, 또는 이들의 임의 조합이 본원에 기술된 방법을 이용해 MSC-NTF 세포로부터 단리된 엑소좀 집단에서 증가될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법을 이용하여 MSC-NTF 세포부터 단리된 엑소좀 집단에서 증가될 수 있는 부가적인 카고 단백질은 CXCL1 단백질 또는 IL13 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법을 이용하여 MSC-NTF 세포부터 단리된 엑소좀 집단에서 증가될 수 있는 부가적인 카고 단백질은 CXCL1 단백질 및 IL13 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 카고 단백질의 양이 증가된 MSC-NTF 엑소좀의 제조 방법은 대조군 MSC 세포로부터 단리된 엑소좀과 비교해 2배 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 카고 단백질의 증가된 양은 대조군 MSC 세포로부터 단리된 엑소좀과 비교해 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30배 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 카고 단백질의 양이 증가된 MSC-NTF 엑소좀의 제조 방법은 대조군 MSC 세포로부터 단리된 엑소좀과 비교해 카고 단백질을 적어도 2배 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 카고 단백질의 양이 증가된 MSC-NTF 엑소좀의 제조 방법은 대조군 MSC 세포로부터 단리된 엑소좀과 비교해 카고 단백질을 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30배 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 카고 단백질의 양이 증가된 MSC-NTF 엑소좀의 제조 방법은 대조군 MSC 세포로부터 단리된 엑소좀과 비교해 카고 단백질을 30배보다 더 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 카고 단백질의 양이 증가된 MSC-NTF 엑소좀의 제조 방법은 대조군 MSC 세포로부터 단리된 엑소좀과 비교해 카고 단백질을 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50배 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 카고 단백질의 양이 증가된 MSC-NTF 엑소좀의 제조 방법은 대조군 MSC 세포로부터 단리된 엑소좀과 비교해 카고 단백질을 적어도 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50배 증가된 양으로 포함한다.
일부 구현예에서, 정제된 분획에서 다음과 같은 마커들 중 어느 하나를 분석하며: CD44, CD73, CD90, CD105, 또는 이들의 조합, 이들 마커는 MSC 및 MSC-NTF 상에 존재한다. 일부 구현예에서, 정제된 엑소좀 분획을 성장인자, 갈렉틴-1 분자, miRNA 또는 siRNA, 또는 이들의 조합에 대해 분석하며, 여기서 MSC-NTF는 성장인자, miRNA, siRNA 또는 성장인자를 코팅하는 뉴클레오티드를 포함하도록 유전자 변형된 것이다. 일부 구현예에서, 정제된 엑소좀 분획을 성장인자, 갈렉틴-1 분자, miRNA, siRNA 또는 이들의 임의 조합에 대해 분석하며, 여기서 MSC는 성장인자, 갈렉틴-1 분자, miRNA, siRNA 또는 이들의 조합을 포함하도록 유전자 변형된 것이다. 일부 구현예에서, 정제된 엑소좀 분획을 엑소좀 마커에 대해 분석한다. 일부 구현예에서, 정제된 엑소좀 분획에서 (CD)9, CD63, CD9, CD61, CD81, ALIX 또는 종양 감수성 유전자 (TSG)101, 또는 이들의 조합을 포함하는 엑소좀 마커들 중 어느 하나에 대해 분석한다.
일부 구현예에서, 정제된 엑소좀 분획은 MSC 또는 MSC-NTF 상에서 발견되지 않는 마커는 포함하지 않는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 정제된 엑소좀 분획은 칼넥신, CD34, CD45, CD19, CD5, CD20, CD11B, CD3, CD14, HLA-DR 및 FMC7 중 하나 이상, 또는 이들의 임의 조합을 포함하지 않는다.
MSC-NTF 세포에서 증가된 양으로 존재하는 miRNA는 상기에 상세히 기술되어 있다. 정제된 엑소좀 분획은 이들 miRNA의 임의 조합, 예를 들어, 비-제한적으로, miRNA (miR)-3663-3p, miR-132-3p, miR-150-3p, miR-762, miR-4327, miR-3665, miR-34a-5p, miR-1915, miR-34a-39, miR-34b-5p, miR-874, miR-4281, miR-1207-5p, miR-30b-5p, miR-29b-3p, miR-199b-5p, miR-30e-5p, miR-26a-5p 또는 miR-4324, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 miRNA를 포함할 수 있다.
MSC-NTF 세포에서 감소된 양으로 존재하는 miRNA는 상기에 상세히 기술되어 있다. 정제된 엑소좀 분획은 이들 miRNA의 임의 조합, 예를 들어, 비-제한적으로, miRNA (miR)-3663-3p, miR-132-3p, miR-150-3p, miR-762, miR-4327, miR-3665, miR-34a-5p, miR-1915, miR-34a-39, miR-34b-5p, miR-874, miR-4281, miR-1207-5p, miR-30b-5p, miR-29b-3p, miR-199b-5p, miR-30e-5p, miR-26a-5p 또는 miR-4324, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 miRNA를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 정제된 엑소좀 분획은 하나 이상의 miRNA를 증가된 양으로 포함하고, 하나 이상의 miRNA를 감소된 양으로 포함한다.
일부 구현예에서, 단리된 변형된 MSC 엑소좀의 제조 방법은 하나 이상의 엑소좀 특이 마커 및 하나 이상의 MSC 특이 마커를 포함하는 엑소좀 정제된 분획을 수집하는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 MSC-NTF 엑소좀의 제조 방법은 하나 이상의 엑소좀 특이 마커 및 하나 이상의 MSC-NTF 특이 마커를 포함하는 엑소좀 정제된 분획을 수집하는 단계를 더 포함한다.
일부 구현예에서, MSC-NTF 세포-타입에 특이적인 엑소좀의 제조 방법은 하나 이상의 신경영양 인자 (NTF)를 분비하도록 유도된 분화된 MSC ("MSC-NTF 세포")를 포함하는 샘플을 제공하는 단계로서, MSC-NTF 세포에서 하나 이상의 NTF의 기저 분비 수준이 미분화된 MSC에서 하나 이상의 NTF의 기저 분비 수준과 비교해 더 강한, 단계; MSC-NTF로부터 엑소좀 정제된 분획을 단리하는 단계로서, 엑소좀 정제된 분획이 정제된 엑소좀을 포함하고, 정제된 엑소좀에서 하나 이상의 엑소좀 특이 마커 또는 하나 이상의 MSC-NTF 특이 마커 또는 이들의 조합을 분석하는, 단계; 및 하나 이상의 엑소좀 특이 마커 및 하나 이상의 MSC-NTF 특이 마커를 포함하는 엑소좀 정제된 분획을 수집하여, MSC-NTF 세포-타입에 특이적인 엑소좀을 제조하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 엑소좀 정제된 분획을 수집한 후, 시험관내 방법으로 상기에서 상세히 기술된 바와 같이, 외인성 화합물, 예를 들어 성장인자, 갈렉틴-1 분자, miRNA, siRNA 또는 이들의 조합을 엑소좀에 탑재한다.
일부 구현예에서, 엑소좀 정제된 분획에는 성장인자가 탑재된다. 일부 구현예에서, 엑소좀 정제된 분획에는 IGF-1이 탑재된다. 일부 구현예에서, 엑소좀 정제된 분획에는 IGF-2가 탑재된다. 일부 구현예에서, 엑소좀 정제된 분획에는 GDF-5가 탑재된다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 엑소좀 제조 방법은 엑소좀의 정제된 분획에 IGF-1, IGF-2, GDF-5 또는 이들의 임의 조합을 탑재하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 정제된 분획의 엑소좀에는 갈렉틴-1 분자가 탑재된다. 일부 구현예에서, 변형된 MSC 정제된 분획의 엑소좀에는 갈렉틴-1 분자가 탑재된다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 정제된 분획의 엑소좀에는 갈렉틴-1 분자가 탑재된다. 일부 구현예에서, MSC-NTF 엑소좀 제조 방법은 엑소좀의 정제된 분획에 갈렉틴-1 분자를 탑재하는 단계를 포함하다. 일부 구현예에서, 변형된 MSC 엑소좀의 제조 방법은 엑소좀의 정제된 분획에 갈렉틴-1 분자를 탑재하는 단계를 포함한다.
따라서, 본원에 기술된 바와 같이, 단리된 엑소좀은, 일부 구현예에서, 이를 단리하는 MSC 또는 MSC-NTF 세포에 존재하는 NTF, NTF를 코딩하는 핵산, 성장인자, 갈렉틴-1, miRNA 및 siRNA, 또는 이들의 임의 조합 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 엑소좀은 아울러 엑소좀이 단리되는 유전자 변형된 MSC 또는 MSC-NTF에 존재하거나 또는 엑소좀에 나중에 탑재되는, 성장인자, 갈렉틴-1 분자, miRNA 또는 siRNA, 또는 이들의 임의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 정제된 분획의 엑소좀에 siRNA가 탑재된다. 일부 구현예에서, siRNA는 MMP-9 siRNA 또는 이의 일부를 포함한다.
일부 구현예에서, 정제된 분획의 엑소좀에는 miRNA가 탑재된다. 일부 구현예에서, miRNA는 miR-7 miRNA를 포함한다.
본원에 제공된 기술은, 다른 측면에서, MSC-NTF 세포로부터 유래된 단리된 엑소좀 집단의 제조 방법을 추가적으로 제공하며, 여기서 엑소좀 집단은 대조군 MSC로부터 유래된 엑소좀과 비교해 하나 이상의 단백질을 증가된 양으로 포함한다. 단리된 MSC-NTF 엑소좀 집단은 상기에 상세히 기술되어 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 임의의 MSC-NTF 엑소좀 집단은 아래 및 실시예에서 기술된 제조 방법을 이용해 제조할 수 있다.
본원에 제공된 기술은, 일부 구현예에서, humMSC를 입수하는 단계; MSC로부터 부착성 단핵 세포를 단리하는 단계; 부착성 단핵 세포를, 다이부티릴 사이클릭 아데노신 모노포스페이트, 인간 염기성 섬유모세포 성장인자, 인간 혈소판-유래 성장인자 및 인간 헤레굴린-β1을 포함하는 무-혈청성 DMEM 배지로 배양하는 단계; 및 무-혈청성 DMEM 배지로부터 엑소좀을 단리하는 단계를 포함하는, 단리된 엑소좀 집단의 제조 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, MSC가 골수, 말초혈, 탯줄 또는 제대혈로부터 제조 및 단리되는 경우, 입수 단계는 골수 또는 혈액 샘플로부터 인간 단핵 세포를 분리한 다음 단핵 집단으로부터 부착성 MSC를 단리하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, MSC가 지방세포, 치수, 태반. 활막, 구강 점막, 치근막 또는 자궁내막으로부터 제조 및 단리되는 경우, 입수 단계는 조직을 수득하고, 이를 당해 기술 분야에 잘 알려진 물리적 및 효소적 방법을 이용해 분해한 다음 전체 세포 집단으로부터 부착성 MSC를 단리하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 제조된 단리된 엑소좀 집단은 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 NTF를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 제조된 단리된 엑소좀 집단은 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 NTF, 및 적어도 다른 단백질을 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, NTF는 VEGF, HGF, LIF, GDNF, NT-3, 뉴로트로핀-4/5, NTN, 뉴로트로핀-4, 퍼세핀, ART, CNTF, IGF-1, GDF-15, G-CSF BDNF, TSG-6, BMP2 및 FGF2, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 다른 단백질은 IL36A, CCL7, MMP10, PIFG, CXCL8, LTA, CXCL6, MMP3, CHI3L1, IL11, FGF2, CXCL5, GAS1, JAML, TGFBR3, MEPE, IL6, PDGFA, CCL4, CCL21, CCL2, MIF, PLAU, ANGPTL4, CTSB, BSG, CCL5, TPO, IL23, IL1RL1, SPP1, F11R, INHBA, FAP, SPINT2, IL36G, TNFRSF10B 또는 TNFSF14 또는 이들의 임의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 제조된 단리된 엑소좀 집단은 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 LIF 단백질을 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 제조된 단리된 엑소좀 집단은 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 VEGFA 단백질을 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 제조된 단리된 엑소좀 집단은 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 GDF15 단백질을 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 제조된 단리된 엑소좀 집단은 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 LIF 및 VEGFA 단백질을 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 제조된 단리된 엑소좀 집단은 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 LIF 및 GDF15 단백질을 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 제조된 단리된 엑소좀 집단은 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 VEGFA 및 GDF15 단백질을 증가된 양으로 포함한다.
일부 구현예에서, 제조된 단리된 엑소좀 집단은 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 NTF 및 적어도 다른 단백질을 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 제조된 단리된 엑소좀 집단은 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 LIF, 또는 VEGFA, 또는 GDF15 단백질, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 NTF; 및 적어도 다른 단백질을 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 제조된 단리된 엑소좀 집단은 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 NTF; 및 IL13 또는 CXCL1, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 적어도 다른 단백질을 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 제조된 단리된 엑소좀 집단은 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 LIF, 또는 VEGFA, 또는 GDF15 단백질, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 NTF; 및 IL13 또는 CXCL1, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 적어도 다른 단백질을 증가된 양으로 포함한다.
특정 구현예에서, 단계 (a)는 건강한 성인 공여자의 후방 장골릉 (posterior iliac crest)으로부터 골수 천자에 의해 골수 샘플을 헤파린 함유 용기로 수집하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 단계 (b)는 200 mM L-글루타민, 100 mM 소듐 피루베이트, 2 IU/ml 헤파린 및 10% 혈소판 라이세이트가 첨가된 글루코스 저-농도 DMEM에서 부착성 단핵 세포를 증폭하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 단계 (b)는 MSC로부터 단핵 세포를 단리하고, 단핵 세포로부터 부착성 세포를 단리하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 무-혈청성 DMEM 배지는 0.1-10 mM 다이부티릴 사이클릭 아데노신 모노포스페이트, 2-200 ng/mL 인간 염기성 섬유모세포 성장인자, 0.5-50 ng/mL 인간 혈소판-유래 성장인자 및 5-500 ng/mL 인간 헤레굴린-β1을 함유한다. 특정 구현예에서, 무-혈청성 DMEM 배지는 1 mM 다이부티릴 사이클릭 아데노신 모노포스페이트, 20 ng/mL 인간 염기성 섬유모세포 성장인자, 5 ng/mL 인간 혈소판-유래 성장인자 및 50 ng/mL 인간 헤레굴린-β1 (S2M)을 함유한다.
특정 구현예에서, 단계 (d)는 단계 (c) 후 1-10일 경과시 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (d)는 단계 (c) 후 1일 경과시 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (d)는 단계 (c) 후 2일 경과시 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (d)는 단계 (c) 후 3일 경과시 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (d)는 단계 (c) 후 4일 경과시 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (d)는 단계 (c) 후 5일 경과시 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (d)는 단계 (c) 후 6일 경과시 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (d)는 단계 (c) 후 7일 경과시 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (d)는 단계 (c) 후 8일 경과시 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (d)는 단계 (c) 후 9일 경과시 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (d)는 단계 (c) 후 10일 경과시 수행된다.
특정 구현예에서, 단계 (d)는 무-혈청성 DMEM 배지로부터 엑소좀을 접선 흐름 여과 (TFF)에 의해 단리하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 단계 (d)는 접선 흐름 여과 (TFF) 및 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 방법은 단계 (c)의 부착성 단핵 세포 또는 단계 (d)에서 단리된 엑소좀에 하나 이상의 카고 분자를 탑재하는 것을 더 포함한다.
특정 구현예에서, 카고 분자는 소형 간섭 RNA (siRNA), micro RNA (miRNA), 성장인자, 신경영양 인자 및 이들의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 카고 분자는 소형 간섭 RNA (siRNA)이다. 특정 구현예에서, 카고 분자는 micro RNA (miRNA)이다. 특정 구현예에서, 카고 분자는 성장인자이다. 특정 구현예에서, 카고 분자는 신경영양 인자이다.
특정 구현예에서, 전술한 단리된 엑소좀은 인간 MSC 수득, MSC로부터 단핵 세포의 단리, 단핵 세포로부터 부착성 세포의 단리, 1 mM 다이부티릴 사이클릭 아데노신 모노포스페이트, 20 ng/mL 인간 염기성 섬유모세포 성장인자, 5 ng/mL 인간 혈소판-유래 성장인자 및 50 ng/mL 인간 헤레굴린-β1을 함유한 무-혈청성 DMEM 배지에서 단핵 세포의 3일간 배양, 및 무-혈청성 DMEM 배지로부터 엑소좀의 단리를 포함하는 방법에 의해 수득가능하다.
특정 구현예에서, 전술한 단리된 엑소좀은 인간 MSC 수득, MSC로부터 단핵 세포의 단리, 단핵 세포로부터 부착성 세포의 단리, 1 mM 다이부티릴 사이클릭 아데노신 모노포스페이트, 20 ng/mL 인간 염기성 섬유모세포 성장인자, 5 ng/mL 인간 혈소판-유래 성장인자 및 50 ng/mL 인간 헤레굴린-β1을 함유한 무-혈청성 DMEM 배지에서 단핵 세포의 3일간 배양, 및 무-혈청성 DMEM 배지로부터 엑소좀의 단리를 포함하는 방법에 의해 수득된다.
치료 방법
일부 구현예에서, 본 발명은, 개체에게 단리된 변형된 MSC 엑소좀을 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 필요한 개체에서 신경퇴행성 질환의 치료 방법을 개시한다. 일부 구현예에서, 신경퇴행성 질환의 치료 방법은 상기에서 상세히 기술된 MSC-NTF 단리된 엑소좀 집단의 치료학적 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명은, 단리된 세포-타입 특이적인 엑소좀을 치료학적 유효량으로 개체에게 투여하는 것을 포함하며, 세포-타입이 하나 이상의 신경영양 인자 (NTF)를 분비하도록 유도된 분화된 MSC (MSC) (MSC-NTF 세포로 지칭됨)를 포함하는, 필요한 개체에서 신경퇴행성 질환의 치료 방법을 개시한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 NTF의 기저 분비 수준은 미분화된 MSC에서 하나 이상의 NTF의 기저 분비 수준과 비교해 MSC-NTF에서 더 높다.
일부 구현예에서, 단리된 변형된 MSC 엑소좀은 개체에서 신경퇴행성 질환을 치료하기 위해 사용되는 부가적인 치료 또는 요법과 조합하여 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 세포-타입 특이적인 엑소좀은 개체에서 신경퇴행성 질환을 치료하기 위해 사용되는 부가적인 치료 또는 요법과 조합하여 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 부가적인 치료는 MSC 세포의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 부가적인 치료는 MSC-NTF 세포의 투여를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포의 투여를 포함하는 임의의 부가적인 치료는 엑소좀 및 세포의 분리 투여를 포함한다. 특정 구현예에서, 엑소좀과 세포의 분리 투여는 각각 별개의 조성물에 포함되고, 별개의 시점에 투여되고, 별개의 위치에서 투여되고, 이들의 임의 조합을 포함한다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 일 구현예에서, 용어 "투여하는" 및 이의 문법상 동의어, 예를 들어 투여가 본원에서 용어 "이식 (transplanting)"과 상호 호환적으로 사용될 수 있으며, 이들 모두 동일한 의미와 특성을 가짐을 알 것이다. 일부 구현예에서, 이식은 본원에 기술된 조성물을 필요한 개체에게 주사함으로써 수행된다. 일부 구현예에서, 이식은 본원에 기술된 단리된 세포-타입 특이적인 엑소좀을 필요한 개체에게 주사함으로써 수행된다.
다른 구현예에서, 신경퇴행성 질환은 근위축성 측색 경화증 (ALS)을 포함한다. 다른 구현예에서, 신경퇴행성 질환은 전두측두엽 치매 (FTD)를 포함한다. 다른 구현예에서, 신경퇴행성 질환은 파킨슨병 (PD)을 포함한다. 다른 구현예에서, 신경퇴행성 질환은 다발 계통 위축증 (MSA)을 포함한다. 다른 구현예에서, 신경퇴행성 질환은 헌팅턴 질환을 포함한다. 다른 구현예에서, 신경퇴행성 질환은 알츠하이머 질환을 포함한다. 다른 구현예에서, 신경퇴행성 질환은 레트 증후군을 포함한다. 다른 구현예에서, 신경퇴행성 질환은 리소좀 축적 질환을 포함한다. 다른 구현예에서, 신경퇴행성 질환은 "백질 질환 (white matter disease)" 또는 신경교/탈수초화 질환, 예로 산필리포 (Sanfilippo) 증후군을 포함한다. 다른 구현예에서, 신경퇴행성 질환은 고셰 질환을 포함한다. 다른 구현예에서, 신경퇴행성 질환은 테이 삭스 질환 (β 헥소스아미니다제 결핍)을 포함한다. 다른 구현예에서, 신경퇴행성 질환은 다발성 경화증 (MS)을 포함한다. 다른 구현예에서, 신경퇴행성 질환은 시신경 척수염 (NMO)을 포함한다. 다른 구현예에서, 신경퇴행성 질환은 NMO 스펙트럼 질환을 포함한다. 다른 구현예에서, 신경퇴행성 질환은 허혈증, 사고 또는 환경적인 영향 (environmental insult)으로 인한 뇌 손상 또는 외상을 포함한다. 다른 구현예에서, 신경퇴행성 장애는 뇌졸중을 포함한다. 다른 구현예에서, 신경퇴행성 장애는 뇌성마비 (CP)를 포함한다. 다른 구현예에서, 신경퇴행성 질환은 자폐증 또는 자폐증 스펙트럼 장애 (ASD), 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 다른 구현예에서, 신경퇴행성 질환은 척수 손상을 포함한다. 다른 구현예에서, 신경퇴행성 질환은 운동실조를 포함한다. 다른 구현예에서, 신경퇴행성 질환은 간질을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 정제된 엑소좀 또는 이의 조성물을 투여한 후, 처리된 개체로부터 유래된 생물학적 샘플은 대조군 개체로부터 유래된 생물학적 샘플과 비교해 하나 이상의 신경영양 인자를 증가된 양으로 포함한다. 일 구현예에서, 대조군 개체는 무처리 개체이다. 일 구현예에서, 대조군 개체는 위약을 투여받는 개체이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 단리된 엑소좀 또는 이의 조성물의 투여 후, 생물학적 샘플은 대조군 개체로부터 유래된 생물학적 샘플과 비교해 하나 이상의 miRNA를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 대조군 생물학적 샘플은 위약을 투여받는 대조군 개체로부터 유래되는 샘플을 포함한다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 처치받고 있는 개체로부터 수득되는 샘플을 포함하며, 이때 대조군 생물학적 샘플은 단리된 엑소좀을 투여하기 전에 수득된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 정제된 엑소좀 또는 이의 조성물의 투여로 개체에서 면역조절 효과가 달성된다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "면역조절 효과"가 자극에 반응하여 면역 시스템을 조절함으로써 질환의 유해한 영향을 완화하는 것을 포괄할 수 있다. 즉, 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같이 질환의 치료는 면역조절 효과를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역조절 효과는 CD4+ T 세포 증식의 감소, 또는 T-조절성 (T-reg) 세포의 유도, 또는 IFN-γ의 분비 감소, 또는 TNF α의 분비 감소, 또는 이들의 조합을 포함한다.
이에, 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같이, 필요한 개체에서 신경퇴행성 질환의 치료는, 개체에서 면역조절 효과, 예를 들어, 비-제한적으로, CD4+ T 세포 증식의 감소, 또는 T-조절성 (T-reg) 세포의 유도, 또는 IFN-γ의 분비 감소, 또는 TNF α의 분비 감소, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 정제된 엑소좀 또는 이의 조성물의 투여 방법은 조절성 T (T-reg) 세포의 유도를 제공한다. 일부 구현예에서, 정제된 엑소좀 또는 이의 조성물의 투여 방법은 CD4+ T 세포의 증식 감소를 제공한다. 일부 구현예에서, 정제된 엑소좀 또는 이의 조성물의 투여 방법은 IFN-γ의 분비 감소를 제공한다. 일부 구현예에서, 정제된 엑소좀 또는 이의 조성물의 투여 방법은 TNF-α의 분비 감소를 제공한다. 일부 구현예에서, 정제된 엑소좀 또는 이의 조성물의 투여 방법은 조절성 T (T-reg) 세포의 유도, CD4+ T 세포의 증식 감소, IFN-γ의 분비 감소, 또는 TNF-α의 분비 감소, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 면역조절 효과들의 조합을 제공한다. 일부 구현예에서, 정제된 엑소좀 또는 이의 조성물의 투여 방법은 조절성 T (T-reg) 세포의 유도, CD4+ T 세포의 증식 감소, IFN-γ의 분비 감소 및 TNF-α의 분비 감소를 포함하는 면역조절 효과들의 조합을 제공한다.
일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 혈액 샘플, 혈청 샘플, 뇨 샘플 또는 뇌척수액 (CSF) 샘플을 포함한다. 일부 구현예에서, 생체외 대조군 샘플은 하나 이상의 NTF를 증가된 수준으로 분비하도록 유도되지 않은 동일한 개체로부터 유래된 MSC 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 대조군 샘플은 하나 이상의 NTF를 증가된 수준으로 분비하도록 유도되지 않거나 또는 부가적인 분자를 포함하도록 변형되지 않은 동일한 개체로부터 유래된 미분화된 MSC 세포로부터 유래되는 단리된 엑소좀을 포함한다.
당해 기술 분야의 당업자라면, MSC 및 MSC-NTF로부터 단리된 엑소좀이 둘다 동일한 하나 이상의 NTF를 함유할 수 있으며, MSC-NTF 세포의 기원이 되는 MSC와 비교해 MSC-NTF 세포가 하나 이상의 NTF를 증가된 수준으로 분비하도록 변형된 것임을 알 것이다. 일부 구현예에서, 생체외 대조군 샘플은 치료할 개체로부터 유래되는 미분화된 MSC를 포함한다. 일부 구현예에서, 대조군 샘플은 생체외 분석을 위한 것이다. 일부 구현예에서, 대조군 샘플은 생체내 분석을 위한 것이다.
일부 구현예에서, 생체외 대조군은 변형된 MSC 엑소좀이 유래된 동일한 공여자/환자의 MSC 세포로부터 단리된 엑소좀을 포함하지만, 이 엑소좀에 부가적인 분자는 탑재되지 않은 것이다. 일부 구현예에서, 대조군 생물학적 샘플은 유전자 변형된 MSC가 유래된 동일한 공여자/환자의 MSC 세포로부터 단리된 엑소좀을 포함한다. 일부 구현예에서, 대조군 생물학적 샘플은 MSC-NTF 세포가 유래된 동일한 공여자/환자의 MSC 세포로부터 단리된 엑소좀을 포함한다. 일부 구현예에서, 대조군 생물학적 샘플은 단리된 엑소좀을 처치받는 환자로부터 처치 전 수득된 샘플을 포함한다. 일부 구현예에서, 대조군 샘플은 무처리 환자의 샘플을 포함한다. 일부 구현예에서, 대조군 샘플은 위약 처리된 환자의 샘플을 포함한다.
다른 구현예에서, 이러한 투여 후, 생물학적 샘플은 하나 이상의 신경영양 인자 (NTF)를 증가된 수준으로 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 NTF는 VEGF, HGF, LIF, GDNF, NT-3, 뉴로트로핀-4/5, NTN, 뉴로트로핀-4, 퍼세핀, ART, CNTF, IGF-1, GDF-15, G-CSF BDNF, TSG-6, BMP2 및 FGF2를 포함하는 군, 또는 이들의 임의 조합으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 이러한 투여 후, 생물학적 샘플은 염증성 인자 또는 세포자살 유도 인자 (pro-apoptotic factor) 또는 염증성 인자에 영향을 미치는 인자 중 하나 이상을 대조군 개체의 생물학적 샘플과 비교해 감소된 양으로 포함한다. 다른 구현예에서, 염증성 인자 또는 세포자살 유도 인자 또는 염증성 인자에 영향을 미치는 인자는 Chitotriosidase 1 (CHIT1), C-반응성 단백질 (CRP), 단핵구 주화성 단백질 1 (MCP1), 기질 유래 인자 1 (SDF-1), 대식세포 염증성 단백질 (MIP-1) 또는 카스파제 3 (CASP3), 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 이러한 투여 후, 생물학적 샘플은 대조군 개체의 생물학적 샘플과 비교해 하나 이상의 신경영양 인자를 증가된 수준으로, 하나 이상의 염증성 인자 또는 세포자살 유도 인자 또는 염증성 인자에 영향을 미치는 인자를 감소된 수준으로 포함한다.
일부 구현예에서, 단리된 변형된 MSC 엑소좀 또는 이의 조성물은 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 임의의 적절한 방법을 통해 투여할 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 세포-타입 특이적인 엑소좀 또는 이의 조성물은 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 임의의 적절한 방법을 통해 투여할 수 있다. 이러한 방법의 예로는, 비-제한적으로, 척수강내, 근육내, 진피내, 복막내, 정맥내, 피하 및/또는 경구 경로를 포함한다. 또한, 투여는 본원에 기술된 조성물의 전신 또는 국소 투여를 포함할 수 있다.
또한, 투여는 개체에게 단리된 변형된 MSC 엑소좀 또는 단리된 세포 타입 특이적인 엑소좀의 외과적 투여, 이식, 삽입 또는 주사를 포괄할 수 있다. 단리된 변형된 MSC 엑소좀 또는 단리된 세포 타입 특이적인 엑소좀은 척수강내로, 피하로, 근육내로 중추 신경계 (CNS)에 위치될 수 있거나, 또는 엑소좀이 의도한 기능을 수행할 수 있는 다른 신체 부위에 위치될 수 있다. 적절한 투여 부위는 의학 전문가가 쉽게 결정할 수 있다.
일 구현예에서, 단리된 변형된 MSC 엑소좀 또는 단리된 세포 타입 특이적인 엑소좀 (MSC-NTF 엑소좀)은 개체의 CSF에 척수강내로 투여된다. 다른 구현예에서, 단리된 변형된 MSC 엑소좀 또는 단리된 세포 타입 특이적인 엑소좀은 개체의 근육으로 투여된다. 추가적인 구현예에서, 투여는 개체의 뇌척수액으로의 투여를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 투여는 개체의 중추 신경계로의 투여를 포함한다. 다른 구현예에서, 투여는 개체의 뇌척수액 또는 중추 신경계 또는 이들의 임의 조합으로의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 개체의 CSF 또는 CNS로의 투여는 정제된 변형된 MSC 엑소좀 또는 정제된 MSC-NTF 엑소좀 또는 이의 조성물을 치료학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "중추 신경계"가 뇌 및 척수를 포괄할 수 있음을 알 것이다. 일부 구현예에서, 투여는 뇌 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 투여는 척수 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 투여는 뇌 및 척수 투여를 포함한다.
일 구현예에서, 투여는 근육내 (IM) 주사, 또는 척수강내 (IT) 주사, 또는 정맥내 (IV) 주사, 또는 이들의 조합을 포함한다.
다른 구현예에서, IM 투여는 동일 시점 (same time point)에 수회 주사를 포함한다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 동일 시점에 수회 주사가 소정의 시점에 한 곳에 주사한 다음 다른 곳에 주사하는 것을 포괄할 수 있다. 다른 구현예에서, IM 투여는 약 20회 주사를 포함한다. 다른 구현예에서, IM 투여는 약 21회 주사를 포함한다. 다른 구현예에서, IM 투여는 약 22회 주사를 포함한다. 다른 구현예에서, IM 투여는 약 23회 주사를 포함한다. 다른 구현예에서, IM 투여는 약 24회 주사를 포함한다. 다른 구현예에서, IM 투여는 약 25회 주사를 포함한다. 다른 구현예에서, IM 투여는 약 26회 주사를 포함한다. 다른 구현예에서, IM 투여는 약 27회 주사를 포함한다. 다른 구현예에서, IM 투여는 약 28회 주사를 포함한다. 다른 구현예에서, IM 투여는 약 29회 주사를 포함한다. 다른 구현예에서, IM 투여는 약 30회 주사를 포함한다.
일부 구현예에서, 투여는 치료학적으로 유효한 시점 횟수 (therapeutically effective number of time points)를 포함한다. 일부 구현예에서, 주사는 매달 투여된다. 일부 구현예에서, 주사는 2달 간격으로 투여된다. 일부 구현예에서, 주사는 3달 간격으로 투여된다. 일부 구현예에서, 주사는 필요시 투여된다. 일부 구현예에서, 각 투여시 수회 주사가 제공된다. 일부 구현예에서, 각 투여시 주사 2-30회가 제공된다. 일부 구현예에서, 각 투여시 주사 2-20회가 제공된다. 일부 구현예에서, 각 투여시 주사 20-30회가 제공된다. 일부 구현예에서, 각 투여시 주사 10-20회가 제공된다. 일부 구현예에서, 각 투여시 주사 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30회가 제공된다.
일 구현예에서, IT 주사 또는 IM 주사는 단리된 세포 타입 특이적인 엑소좀을 치료학적 유효량으로 포함한다.
일 구현예에서, 투여는 단일 시점 (single time point)을 포함한다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 치료가 본원에 기술된 단리된 변형된 MSC 엑소좀 또는 세포 타입 특이적인 단리된 엑소좀의 후속 투여 (follow-up administration)를 포괄할 수 있음을, 알 것이다. 다른 구현예에서, 투여는 적어도 2회 시점을 포함한다. 다른 구현예에서, 투여는 2회 시점을 포함한다. 제2 또는 추가적인 시점의 투여 시기는, 본원에 기술된 바와 같이, 개체로부터 수집되고, NTF 및/또는 염증성 인자에 대해 분석되는, 생물학적 샘플의 분석을 포괄할 수 있다. 일부 구현예에서, 투여는 치료학적 효능이 필요한 만큼 다회 시점을 포함한다. 일부 구현예에서, 치료학적 효능은, 본원에 상세히 기술된 바와 같이, 하나 이상의 NTF 및/또는 하나 이상의 염증성 인자 또는 세포자살 유도 인자 또는 염증성 인자에 영향을 미치는 인자의 분석을 토대로 결정할 수 있다.
다른 구현예에서, 후속적인 투여는 신경퇴행성 질환의 치료를 강화한다. 다른 구현예에서, 반복 투약 (repeat dose)은 첫 치료 후 약 8-12주차에 2차 투여를 포함한다. 다른 구현예에서, 반복 투약은 약 7주차에 2차 투여를 포함한다. 다른 구현예에서, 반복 투약은 약 8주차에 2차 투여를 포함한다. 다른 구현예에서, 반복 투약은 약 9주차에 2차 투여를 포함한다. 다른 구현예에서, 반복 투약은 약 10주차에 2차 투여를 포함한다. 다른 구현예에서, 반복 투약은 약 11주차에 2차 투여를 포함한다. 다른 구현예에서, 반복 투약은 약 12주차에 2차 투여를 포함한다. 다른 구현예에서, 반복 투약은 약 13주차에 2차 투여를 포함한다. 다른 구현예에서, 반복 투약은 약 14주차에 2차 투여를 포함한다. 다른 구현예에서, 투여는 대략적으로 3회 시점 이상으로 반복 투여를 포함한다. 다른 구현예에서, 투여는 대략적으로 4회 시점 이상으로 반복 투여를 포함한다. 다른 구현예에서, 투여는 대략적으로 5회 시점 이상으로 반복 투여를 포함한다. 다른 구현예에서, 투여는 5회 시점 보다 높은 횟수로의 반복 투여를 포함한다. 다른 구현예에서, 투여는 10회 시점 보다 높은 횟수로의 반복 투여를 포함한다. 다른 구현예에서, 투여는 질환 또는 장애의 지속 기간 동안 후속적인 시점에 반복 투약을 포함한다.
본원에 기술된 이용 방법에 의해 치료되는 신경퇴행성 질환 또는 병태는 상기에 기술되어 있다. 일 구현예에서, 본원에 기술된 이용 방법에 의해 치료되는 신경퇴행성 질환 또는 병태는 ALS, FTD, PD, MSA, SMA, MS, AD, 레트 증후군, CP, ASD 및 간질을 포함하나, 이것으로 한정되는 것은 아니다.
일부 구현예에서, ALS의 치료에 사용되는 엑소좀은 IGF-1, IGF-2, 갈렉틴-1 분자 또는 MMP-9 siRNA, 또는 이들의 임의 조합을 증가된 양으로 포함한다.
일부 구현예에서, 신경퇴행성 질환 또는 병태의 치료는 MMP-9을 타겟팅하는 siRNA를 포함하는 단리된 변형된 MSC 엑소좀의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 신경퇴행성 질환 또는 병태의 치료는 miR-7을 포함하는 단리된 변형된 MSC 엑소좀의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 신경퇴행성 질환 또는 병태의 치료는 IGF-1 또는 IGF-2 또는 갈렉틴-1, 또는 이들의 조합을 포함하는 단리된 변형된 MSC 엑소좀의 사용을 포함한다.
일부 구현예에서, 신경퇴행성 질환 또는 병태의 치료는 MMP-9을 타겟팅하는 siRNA를 포함하는 단리된 MSC-NTF 엑소좀의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 신경퇴행성 질환 또는 병태의 치료는 miR-7을 포함하는 단리된 MSC-NTF 엑소좀의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 신경퇴행성 질환 또는 병태의 치료는 IGF-1 또는 IGF-2 또는 갈렉틴-1, 또는 이들의 조합을 포함하는 단리된 MSC-NTF 엑소좀의 사용을 포함한다.
일부 구현예에서, PD의 치료에 사용되는 엑소좀은 GDF-5, 갈렉틴-1 분자, miR-7, 또는 MMP-9 siRNA, 또는 이들의 임의 조합을 증가된 양으로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 방법은 ALS와 관련된 바이오마커 또는 ALS의 진행을 식별하는 바이오마커, 또는 이들의 조합을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, ALS와 관련된 바이오마커는 CHIT1, MCP-1, VEGF, HGF, LIF, miR19, miR146a, miR-34a, miR-376-a 또는 miR-132, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 일반적인 염증성 마커를 이용해 신경퇴행성 질환의 진행을 식별한다. 일부 구현예에서, 신경염증성 마커를 사용해 신경퇴행성 질환의 진행을 식별한다. 일부 구현예에서, 일반적인 염증성 마커를 사용해 ALS, FTD, MSA, SMA, MS, PD, AD, 레트 증후군, CP, ASD 및 간질 중 어느 하나를 포함하는 신경퇴행성 질환의 진행을 식별한다. 일부 구현예에서, 신경염증성 마커를 사용해 ALS, FTD, MSA, SMA, MS, PD, AD, 레트 증후군, CP, ASD 및 간질 중 임의의 것을 포함하는 신경퇴행성 질환의 진행을 식별한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 일반적인 염증성 마커가 신경퇴행성 질환에서 달라진다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 일반적인 염증성 마커가 ALS, FTD, MSA, SMA, MS, PD, AD, 레트 증후군, CP, ASD 및 간질 중 임의의 질환에서 달라진다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 신경염증성 마커가 신경퇴행성 질환에서 달라진다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 신경염증성 마커가 ALS, FTD, MSA, SMA, MS, PD, AD, 레트 증후군, CP, ASD 및 간질 중 임의의 질환에서 달라진다.
일부 구현예에서, 신경퇴행성 질환에서 달라지는 일반적인 염증성 마커는 MHCII, IBA-1 또는 CD163, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, MHCII, IBA-1 및 CD163, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 일반적인 염증성 마커가 ALS, FTD, MSA, SMA, MS, PD, AD, 레트 증후군, CP, ASD 및 간질에서 달라진다.
일부 구현예에서, MHCII, IBA-1 및 CD163, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 일반적인 염증성 마커를 이용해, ALS, FTD, MSA, SMA, MS, PD, AD, 레트 증후군, CP, ASD 및 간질 등의 신경퇴행성 질환의 진행을 식별한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같이, 개체에서 신경영양 인자 또는 염증성 인자 또는 세포자살 유도 인자 또는 염증성 인자에 영향을 미치는 인자를 조절하는 방법은, 본원에 기술된 엑소좀 또는 이의 조성물을 치료학적 유효량으로 투여하는 것을 포함하며, 투여는 개체에게 면역조절 효과를 제공한다.
일부 구현예에서, 면역조절 효과는 CD4+ T 세포의 증식 감소, 또는 T-조절성 (T-reg) 세포의 유도, 또는 IFN-γ의 분비 감소, 또는 TNF α의 분비 감소, 또는 이들의 조합을 포함한다.
이에, 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같이, 필요한 개체에서 신경영양 인자 또는 염증성 인자 또는 세포자살 유도 인자 또는 염증성 인자에 영향을 미치는 인자의 조절 방법은, 개체에서 면역조절 효과, 예를 들어, 비-제한적으로, CD4+ T 세포의 증식 감소, 또는 T-조절성 (T-reg) 세포의 유도, 또는 IFN-γ의 분비 감소, 또는 TNF α의 분비 감소, 또는 이들의 조합을 제공하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 정제된 엑소좀 또는 이의 조성물의 투여 방법은 조절성 T (T-reg)의 유도를 제공한다. 일부 구현예에서, 정제된 엑소좀 또는 이의 조성물의 투여 방법은 CD4+ T 세포의 증식 감소를 제공한다. 일부 구현예에서, 정제된 엑소좀 또는 이의 조성물의 투여 방법은 IFN-γ의 분비 감소를 제공한다. 일부 구현예에서, 정제된 엑소좀 또는 이의 조성물의 투여 방법은 TNF-α의 분비 감소를 제공한다. 일부 구현예에서, 정제된 엑소좀 또는 이의 조성물의 투여 방법은 조절성 T (T-reg) 세포의 유도, CD4+ T 세포의 증식 감소, IFN-γ의 분비 감소 또는 TNF-α의 분비 감소, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 면역조절 효과들의 조합을 제공한다. 일부 구현예에서, 정제된 엑소좀 또는 이의 조성물의 투여 방법은 조절성 T (T-reg) 세포의 유도, CD4+ T 세포의 증식 감소, IFN-γ의 분비 감소 및 TNF-α의 분비 감소를 포함하는 면역조절 효과들의 조합을 제공한다.
신경염증 장애는 뇌염 (감염성 및 자가면역성), 탈수초 장애, 면역-매개 운동 장애, 유전학적 자가염증성 CNS 장애, 혈관염 및 기타 여러가지 장애 등의 광범위한 다양한 장애 범주에 해당한다. 신경염증 장애의 마커 (신경염증성 바이오마커)로는, 비-제한적으로, sCD27 수용체, 키티나제 3-유사-1 단백질 및 키티나제 3-유사-2 단백질 등이 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "키티나제 3-유사-1 단백질"은 "YKL-40" 또는 "CHI3L1로부터 발현된 폴리펩타이드"와 상호 호환적으로 사용될 수 있으며, 이들 모두 동일한 의미와 특성을 가짐을, 알 것이다.
일부 구현예에서, 일반적인 염증성 바이오마커 또는 신경염증성 바이오마커 또는 이들의 조합의 검출은, 단리된 세포-타입 특이적인 엑소좀이 염증을 감소시키는지를 측정한다. 일부 구현예에서, 일반적인 염증성 바이오마커 또는 신경염증성 바이오마커 또는 이들의 조합의 검출은, 단리된 세포-타입 특이적인 엑소좀의 투여가 피질, 또는 해마, 또는 편도체, 또는 이들의 조합에서 α-시누클레인 봉입체 (α-synuclein inclusion)의 개수를 감소시키는지를 측정한다. 일부 구현예에서, 일반적인 염증성 바이오마커 또는 신경염증성 바이오마커, 또는 이들의 조합의 검출은, α-시누클레인 봉입체-유도성 거동 결함 (α-synuclein inclusion-induced behavior defect)의 발생을 감소시키는지를 측정한다. 일부 구현예에서, 일반적인 염증성 바이오마커 또는 신경염증성 바이오마커, 또는 이들의 조합의 검출은, 단리된 변형된 MSC 엑소좀 또는 단리된 세포-타입 특이적인 엑소좀이 TH+ 및 Nissl+ 뉴런에서 도파민성 터미널 (dopaminergic terminal)의 소실을 변형시키는지를 측정한다.
일부 구현예에서, 본 발명은, 단리된 변형된 MSC 엑소좀을 치료학적 유효량으로 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 신경영양 또는 염증성 인자 또는 세포자살 유도 인자 또는 염증성 인자에 영향을 미치는 인자를 조절하는 방법을 개시한다.
일부 구현예에서, 본 발명은, 단리된 세포-타입 특이적인 엑소좀을 치료학적 유효량으로 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 신경영양 또는 염증성 인자 또는 세포자살 유도 인자 또는 염증성 인자에 영향을 미치는 인자를 조절하는 방법을 개시하며, 여기서 세포 타입은 하나 이상의 신경영양 인자 (NTF)를 분비하도록 유도된 분화된 MSC, 즉 MSC-NTF 세포를 포함하며, 하나 이상의 NTF의 기저 분비 수준은 미분화된 MSC에서 하나 이상의 NTF의 기저 분비 수준과 비교해 MSC-NTF에서 더 높다.
본원에서, 용어 "치료한다" 및 "치료"는, 질환 또는 병태와 관련된 부적절한 생리학적 변화를 방지 또는 늦추(약화)는 것을 목표로 하는, 예방학적 또는 방지적 조처를 포함한, 치료학적 치료를 포괄할 수 있다. 유익한 또는 바람직한 임상 성과는, 비-제한적으로, 검출가능한 또는 검출 불가능하든 간에, 증상의 완화, 질환 또는 병태의 규모 감소, 질환 또는 병태의 안정화 (즉, 질환 또는 병태가 악화되지 않음), 질환 또는 병태의 진행 지연 또는 서행, 질환 또는 병태의 경감 또는 일시적 완화 (palliation), 및 질환 또는 병태의 (일부 또는 완전) 관해를 포함한다. 또한, "치료"는 치료를 받지 않을 경우에 예상되는 생존과 비교해 생존 연장을 의미할 수 있다. 치료가 필요한 개체는 이미 질환 또는 병태를 앓고 있는 개체뿐 아니라 질환 또는 병태에 걸리기 쉬운 개체 또는 질환 또는 병태를 예방하여야 하는 개체를 포함한다.
본원에 제공된 기술은, 다른 측면에서, 상기에서 상세히 기술된 바와 같이, MSC-NTF 세포로부터 유래된 단리된 엑소좀 집단을 치료학적 유효량으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 필요한 개체에서 신경퇴행성 질환을 치료하는 방법을 추가적으로 제공한다.
일부 구현예에서, 신경퇴행성 질환의 치료 방법에서 투여되는 단리된 엑소좀 집단은 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 NTF를 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 신경퇴행성 질환의 치료 방법에서 투여되는 단리된 엑소좀 집단은 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 NTF; 및 적어도 다른 단백질을 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, NTF는 혈관 내피 성장인자 (VEGF), 간세포 성장인자 (HGF), 백혈병 저해 인자 (LIF), 신경교 유래 신경영양 인자 (GDNF), 뉴로트로핀-3 (NT-3), 뉴로트로핀-4/5, 뉴르투린 (NTN), 뉴로트로핀-4, 퍼세핀, 아르테민 (ART), 섬모 신경영양 인자 (CNTF), 인슐린 성장인자-I (IGF-1), 증식 및 분화 인자 (GDF-15), 과립구 자극 인자 (G-CSF), 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF), 종양 괴사 인자-유발성 유전자 6 단백질 (TSG-6; TNF-자극된 유전자 6 단백질이라고도 함), 골 형태형성 단백질 2 (BMP2) 및 섬유모세포 성장 인자 2 (FGF2)를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 다른 단백질은 IL36A, CCL7, MMP10, PIFG, CXCL8, LTA, CXCL6, MMP3, CHI3L1, IL11, FGF2, CXCL5, GAS1, JAML, TGFBR3, MEPE, IL6, PDGFA, CCL4, CCL21, CCL2, MIF, PLAU, ANGPTL4, CTSB, BSG, CCL5, TPO, IL23, IL1RL1, SPP1, F11R, INHBA, FAP, SPINT2, IL36G, TNFRSF10B 또는 TNFSF14, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 신경퇴행성 질환의 치료 방법에서 투여되는 단리된 엑소좀 집단은 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 LIF 단백질을 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 신경퇴행성 질환의 치료 방법에서 투여되는 단리된 엑소좀 집단은 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 VEGFA 단백질을 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 신경퇴행성 질환의 치료 방법에서 투여되는 단리된 엑소좀 집단은 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 GDF15 단백질을 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 신경퇴행성 질환의 치료 방법에서 투여되는 단리된 엑소좀 집단은 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 LIF 및 VEGFA 단백질을 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 신경퇴행성 질환의 치료 방법에서 투여되는 단리된 엑소좀 집단은 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 LIF 및 GDF15 단백질을 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 신경퇴행성 질환의 치료 방법에서 투여되는 단리된 엑소좀 집단은 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 VEGFA 및 GDF15 단백질을 증가된 양으로 포함한다.
일부 구현예에서, 신경퇴행성 질환의 치료 방법에서 투여되는 단리된 엑소좀 집단은 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 NTF; 및 적어도 다른 단백질을 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 신경퇴행성 질환의 치료 방법에서 투여되는 단리된 엑소좀 집단은 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 LIF, 또는 VEGFA, 또는 GDF15 단백질, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 NTF; 및 적어도 다른 단백질을 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 신경퇴행성 질환의 치료 방법에서 투여되는 단리된 엑소좀 집단은 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 NTF; 및 IL13 또는 CXCL1, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 적어도 다른 단백질을 증가된 양으로 포함한다. 일부 구현예에서, 신경퇴행성 질환의 치료 방법에서 투여되는 단리된 엑소좀 집단은 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 LIF, 또는 VEGFA, 또는 GDF15 단백질, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 NTF; 및 IL13 또는 CXCL1, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 적어도 다른 단백질을 증가된 양으로 포함한다.
또한, 본 발명은, 일부 구현예에서, 상기에서 상세히 기술된 바와 같은 MSC-NTF 세포로부터 유래된 단리된 엑소좀 집단을 치료학적 유효량으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 NTF를 증가된 양으로 포함하는 단리된 엑소좀 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 NTF; 및 적어도 다른 단백질을 증가된 양으로 포함하는 단리된 엑소좀 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, NTF는 혈관 내피 성장인자 (VEGF), 간세포 성장인자 (HGF), 백혈병 저해 인자 (LIF), 신경교 유래 신경영양 인자 (GDNF), 뉴로트로핀-3 (NT-3), 뉴로트로핀-4/5, 뉴르투린 (NTN), 뉴로트로핀-4, 퍼세핀, 아르테민 (ART), 섬모 신경영양 인자 (CNTF), 인슐린 성장인자-I (IGF-1), 증식 및 분화 인자 (GDF-15), 과립구 자극 인자 (G-CSF), 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF), 종양 괴사 인자-유발성 유전자 6 단백질 (TSG-6; TNF-자극된 유전자 6 단백질이라고도 함), 골 형태형성 단백질 2 (BMP2) 및 섬유모세포 성장 인자 2 (FGF2)를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 다른 단백질은 IL36A, CCL7, MMP10, PIFG, CXCL8, LTA, CXCL6, MMP3, CHI3L1, IL11, FGF2, CXCL5, GAS1, JAML, TGFBR3, MEPE, IL6, PDGFA, CCL4, CCL21, CCL2, MIF, PLAU, ANGPTL4, CTSB, BSG, CCL5, TPO, IL23, IL1RL1, SPP1, F11R, INHBA, FAP, SPINT2, IL36G, TNFRSF10B 또는 TNFSF14, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 LIF 단백질을 증가된 양으로 포함하는 단리된 엑소좀 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 VEGFA 단백질을 증가된 양으로 포함하는 단리된 엑소좀 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 GDF15 단백질을 증가된 양으로 포함하는 단리된 엑소좀 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 LIF 및 VEGFA 단백질을 증가된 양으로 포함하는 단리된 엑소좀 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 LIF 및 GDF15 단백질을 증가된 양으로 포함하는 단리된 엑소좀 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 VEGFA 및 GDF15 단백질을 증가된 양으로 포함하는 단리된 엑소좀 집단을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 NTF; 및 적어도 다른 단백질을 증가된 양으로 포함하는 단리된 엑소좀 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 LIF 또는 VEGFA 또는 GDF15 단백질 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 NTF; 및 적어도 다른 단백질을 증가된 양으로 포함하는 단리된 엑소좀 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 NTF; 및 IL13 또는 CXCL1 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 적어도 다른 단백질을 증가된 양으로 포함하는 단리된 엑소좀 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 LIF 또는 VEGFA 또는 GDF15 단백질 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 NTF; 및 IL13 또는 CXCL1 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 적어도 다른 단백질을 증가된 양으로 포함하는 단리된 엑소좀 집단을 포함한다.
본원에 제공된 기술은, 다른 측면에서, 단백질을 포함하는 단리된 엑소좀을 세포와 접촉시키는 단계를 포함하며, 단백질이 NTF를 포함하는, 세포에서 단백질의 수준을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 NTF를 증가된 양으로 포함하는 단리된 엑소좀 집단에 세포를 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 NTF들의 조합물을 증가된 양으로 포함하는 단리된 엑소좀 집단에 세포를 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, NTF는 VEGF, HGF, LIF, GDNF, NT-3, 뉴로트로핀-4/5, NTN, 뉴로트로핀-4, 퍼세핀, ART, CNTF, IGF-1, GDF-15, G-CSF BDNF, TSG-6, BMP2 및 FGF2, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, NTF는 LIF, GDF15 및 VEGFA의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, NTF는 LIF와 VEGFA의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, NTF는 GDF15와 VEGFA의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 방법은, 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 NTF; 및 적어도 다른 단백질을 증가된 양으로 포함하는 단리된 엑소좀 집단을, 세포와 접촉시키는 단계를, 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 다른 단백질은 IL36A, CCL7, MMP10, PIFG, CXCL8, LTA, CXCL6, MMP3, CHI3L1, IL11, FGF2, CXCL5, GAS1, JAML, TGFBR3, MEPE, IL6, PDGFA, CCL4, CCL21, CCL2, MIF, PLAU, ANGPTL4, CTSB, BSG, CCL5, TPO, IL23, IL1RL1, SPP1, F11R, INHBA, FAP, SPINT2, IL36G, TNFRSF10B 또는 TNFSF14, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, NTF는 LIF, GDF15 및 VEGFA의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, NTF는 LIF 및 VEGFA의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, NTF는 GDF15 및 VEGFA의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, NTF는 LIF, GDF15 및 VEGFA의 조합을 포함하고, 적어도 다른 단백질은 IL13 또는 CXCL1 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, NTF는 LIF, GDF15 및 VEGFA의 조합을 포함하고, 적어도 다른 단백질은 IL13 및 CXCL1 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, NTF는 LIF 및 VEGFA의 조합을 포함하고, 적어도 다른 단백질은 IL13 또는/및 CXCL1 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, NTF는 GDF15 및 VEGFA의 조합을 포함하고, 적어도 다른 단백질은 IL13 및/또는 CXCL1 단백질을 포함한다.
특정 구현예에서, 세포는 인체에 존재한다. 특정 구현예에서, 세포는 생체외이다.
특정 구현예에서, 상기 단백질은 단백질 TNFSF14를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질은 단백질 IL36A를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질은 단백질 CCL7을 더 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질은 단백질 MMP10을 더 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질은 단백질 PIFG를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질은 단백질 CXCL8을 더 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질은 단백질 LTA를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질은 단백질 LIF를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질은 단백질 CXCL1을 더 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질은 단백질 CXCL6를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질은 단백질 MMP3를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질은 단백질 CHI3L1을 더 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질은 단백질 IL11을 더 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질은 단백질 FGF2를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질은 단백질 CXCL5를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질은 단백질 GAS1을 더 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질은 단백질 JAML을 더 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질은 단백질 TGFBR3를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질은 단백질 MEPE를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질은 단백질 IL6를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질은 단백질 PDGFA를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질은 단백질 CCL4를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질은 단백질 CCL21을 더 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질은 단백질 IL13를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질은 단백질 VEGFA를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질은 단백질 CCL2를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질은 단백질 MIF를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질은 단백질 GDF15을 더 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질은 단백질 PLAU를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질은 단백질 ANGPTL4를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질은 단백질 CTSB를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질은 단백질 BSG를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질은 단백질 CCL5를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질은 단백질 TPO를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질은 단백질 IL23를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질은 단백질 IL1RL1을 더 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질은 단백질 SPP1을 더 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질은 단백질 F11R을 더 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질은 단백질 INHBA를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질은 단백질 FAP를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질은 단백질 IL36A, CCL7, MMP10, PIFG, CXCL8, LTA, LIF, CXCL1, CXCL6, MMP3, CHI3L1, IL11, FGF2, CXCL5, GAS1, JAML, TGFBR3, MEPE, IL6, PDGFA, CCL4, CCL21, IL13, VEGFA, CCL2, MIF, GDF15, PLAU, ANGPTL4, CTSB, BSG, CCL5, TPO, IL23, IL1RL1, SPP1, F11R, INHBA 및 FAP를 더 포함한다.
본원에 제공된 기술은, 다른 측면에서, 상기 기술된 바와 같은 임의의 단리된 엑소좀 집단을 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포에서 유전자의 발현 수준을 조절하는 방법을 추가적으로 제공하며, 발현 수준이 조절되는 유전자는 ENSG00000204711, ENSG00000134668, ENSG00000175899, ENSG00000278910, ENSG00000131095, ENSG00000102359, ENSG00000261371, ENSG00000091583, ENSG00000197632, ENSG00000113263, ENSG00000250993, ENSG00000259070, ENSG00000117318, ENSG00000266928, ENSG00000196639, ENSG00000164850, ENSG00000188404, ENSG00000105825, ENSG00000198796, ENSG00000165899, ENSG00000204277, ENSG00000142748, ENSG00000248461, ENSG00000188501, ENSG00000250538, ENSG00000136869, ENSG00000125968, ENSG00000131094, ENSG00000105559, ENSG00000135547, ENSG00000140853, ENSG00000134531, ENSG00000108691, ENSG00000235884, ENSG00000205403, ENSG00000267280, ENSG00000165985, ENSG00000172548, ENSG00000257446, ENSG00000180801, ENSG00000138798, ENSG00000116745, ENSG00000107984, ENSG00000122585, ENSG00000128283, ENSG00000089327, ENSG00000139155, ENSG00000183691, ENSG00000147041, ENSG00000184557, ENSG00000121068, ENSG00000101825, ENSG00000137834, ENSG00000087510, ENSG00000185149, ENSG00000163251, ENSG00000153976, ENSG00000099860, ENSG00000106366, ENSG00000128342, ENSG00000026508, ENSG00000164488, ENSG00000109099, ENSG00000177337, ENSG00000168874, ENSG00000262001, ENSG00000175445, ENSG00000131203, ENSG00000268089, ENSG00000138316, ENSG00000122420, ENSG00000167306, ENSG00000109846, ENSG00000131724, ENSG00000106823, ENSG00000142089, ENSG00000100311, ENSG00000222041, ENSG00000267519, ENSG00000152049, ENSG00000115844, ENSG00000172965, ENSG00000197467, ENSG00000203805, ENSG00000183230, ENSG00000154274, ENSG00000121236, ENSG00000177359, ENSG00000166106, ENSG00000145623, ENSG00000182601, ENSG00000213694, ENSG00000005059, ENSG00000078081, ENSG00000135406, ENSG00000138496, ENSG00000116132, ENSG00000105974, ENSG00000138829, ENSG00000119917, ENSG00000110852, ENSG00000262484, ENSG00000080644, ENSG00000197847, ENSG00000213654, ENSG00000203688, ENSG00000196218, ENSG00000221818, ENSG00000106327, ENSG00000279232, ENSG00000144485, ENSG00000260941, ENSG00000215595, ENSG00000251161, ENSG00000182348, ENSG00000131480, ENSG00000245904, ENSG00000143355, ENSG00000089847, ENSG00000258701, ENSG00000205038, ENSG00000224420, ENSG00000276445, ENSG00000099139, ENSG00000244151, ENSG00000135248, ENSG00000162692, ENSG00000204839, ENSG00000196104, ENSG00000143110, ENSG00000133246, ENSG00000179846, ENSG00000198105, ENSG00000215475, ENSG00000197584, ENSG00000170381, ENSG00000100346, ENSG00000171786, ENSG00000244242, ENSG00000280422, ENSG00000102057, ENSG00000091536, ENSG00000100024, ENSG00000130222, ENSG00000168952, ENSG00000111644, ENSG00000115556, ENSG00000180422, ENSG00000007372, ENSG00000272449, ENSG00000038295, ENSG00000262223, ENSG00000111218, ENSG00000272549, ENSG00000172828, ENSG00000107736, ENSG00000166359, ENSG00000268041, ENSG00000099769, ENSG00000233198, ENSG00000280229, ENSG00000172232, ENSG00000131471, ENSG00000260695, ENSG00000255031, ENSG00000180549, ENSG00000169836, ENSG00000260978, ENSG00000134595, ENSG00000270393, ENSG00000188425, ENSG00000162496, ENSG00000118729, ENSG00000213981, ENSG00000234350, ENSG00000237250, ENSG00000273064, ENSG00000058335, ENSG00000179564, ENSG00000272866, ENSG00000174611, ENSG00000132692, ENSG00000100060, ENSG00000275812, ENSG00000101203, ENSG00000143858, ENSG00000129757, ENSG00000197921, ENSG00000154080, ENSG00000170989, ENSG00000165805, ENSG00000237941, ENSG00000226476, ENSG00000018625, ENSG00000198732, ENSG00000148734, ENSG00000173673, ENSG00000231827, ENSG00000142494, ENSG00000112238, ENSG00000184221, ENSG00000177468 및 이들의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 세포에 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 NTF를 증가된 양으로 포함하는 단리된 엑소좀을 접촉시킨다. 일부 구현예에서, 세포에 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 NTF와 적어도 다른 단백질을 증가된 양으로 포함하는 단리된 엑소좀을 접촉시킨다. 일부 구현예에서, NTF는 VEGF, HGF, LIF, GDNF, NT-3, 뉴로트로핀-4/5, NTN, 뉴로트로핀-4, 퍼세핀, ART, CNTF, IGF-1, GDF-15, G-CSF BDNF, TSG-6, BMP2 및 FGF2, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 다른 단백질은 IL36A, CCL7, MMP10, PIFG, CXCL8, LTA, CXCL6, MMP3, CHI3L1, IL11, FGF2, CXCL5, GAS1, JAML, TGFBR3, MEPE, IL6, PDGFA, CCL4, CCL21, CCL2, MIF, PLAU, ANGPTL4, CTSB, BSG, CCL5, TPO, IL23, IL1RL1, SPP1, F11R, INHBA, FAP, SPINT2, IL36G, TNFRSF10B 또는 TNFSF14, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 LIF 단백질을 증가된 양으로 포함하는 단리된 엑소좀과 접촉된다. 일부 구현예에서, 세포는 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 VEGFA 단백질을 증가된 양으로 포함하는 단리된 엑소좀과 접촉된다. 일부 구현예에서, 세포는 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 GDF15 단백질을 증가된 양으로 포함하는 단리된 엑소좀과 접촉된다. 일부 구현예에서, 세포는 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 LIF 및 VEGFA 단백질을 증가된 양으로 포함하는 단리된 엑소좀과 접촉된다. 일부 구현예에서, 세포는 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 LIF 및 GDF15 단백질을 증가된 양으로 포함하는 단리된 엑소좀과 접촉된다. 일부 구현예에서, 세포는 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 VEGFA 및 GDF15 단백질을 증가된 양으로 포함하는 단리된 엑소좀과 접촉된다.
일부 구현예에서, 세포는 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 NTF; 및 적어도 다른 단백질을 증가된 양으로 포함하는 단리된 엑소좀과 접촉된다. 일부 구현예에서, 세포는 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 LIF 또는 VEGFA 또는 GDF15 단백질 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 NTF; 및 적어도 다른 단백질을 증가된 양으로 포함하는 단리된 엑소좀과 접촉된다. 일부 구현예에서, 세포는 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 NTF; 및 IL13 또는 CXCL1 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 적어도 다른 단백질을 증가된 양으로 포함하는 단리된 엑소좀과 접촉된다. 일부 구현예에서, 세포는 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 LIF 또는 VEGFA 또는 GDF15 단백질 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 NTF; 및 IL13 또는 CXCL1 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 적어도 다른 단백질을 증가된 양으로 포함하는 단리된 엑소좀과 접촉된다.
특정 구현예에서, 세포는 인체에 존재한다. 특정 구현예에서, 세포는 생체외이다.
특정 구현예에서, 본 방법은 ENSG00000204711, ENSG00000134668, ENSG00000175899, ENSG00000278910, ENSG00000131095, ENSG00000102359, ENSG00000261371, ENSG00000091583, ENSG00000197632, ENSG00000113263, ENSG00000250993, ENSG00000259070, ENSG00000117318, ENSG00000266928, ENSG00000196639, ENSG00000164850, ENSG00000188404, ENSG00000105825, ENSG00000198796, ENSG00000165899, ENSG00000204277, ENSG00000142748, ENSG00000248461, ENSG00000188501, ENSG00000250538, ENSG00000136869, ENSG00000125968, ENSG00000131094, ENSG00000105559, ENSG00000135547, ENSG00000140853, ENSG00000134531, ENSG00000108691, ENSG00000235884, ENSG00000205403, ENSG00000267280, ENSG00000165985, ENSG00000172548, ENSG00000257446, ENSG00000180801, ENSG00000138798, ENSG00000116745, ENSG00000107984, ENSG00000122585, ENSG00000128283, ENSG00000089327, ENSG00000139155, ENSG00000183691, ENSG00000147041, ENSG00000184557, ENSG00000121068, ENSG00000101825, ENSG00000137834, ENSG00000087510, ENSG00000185149, ENSG00000163251, ENSG00000153976, ENSG00000099860, ENSG00000106366, ENSG00000128342, ENSG00000026508, ENSG00000164488, ENSG00000109099, ENSG00000177337, ENSG00000168874, ENSG00000262001, ENSG00000175445, ENSG00000131203, ENSG00000268089, ENSG00000138316, ENSG00000122420, ENSG00000167306, ENSG00000109846, ENSG00000131724, ENSG00000106823, ENSG00000142089, ENSG00000100311, ENSG00000222041, ENSG00000267519, ENSG00000152049, ENSG00000115844, ENSG00000172965, ENSG00000197467, ENSG00000203805, ENSG00000183230, ENSG00000154274, ENSG00000121236, ENSG00000177359, ENSG00000166106, ENSG00000145623, ENSG00000182601, ENSG00000213694, ENSG00000005059, ENSG00000078081, ENSG00000135406, ENSG00000138496, ENSG00000116132, ENSG00000105974, ENSG00000138829, ENSG00000119917, ENSG00000110852, 및 이들의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 발현 수준을 증가시키는 것을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 방법은 ENSG00000262484, ENSG00000080644, ENSG00000197847, ENSG00000213654, ENSG00000203688, ENSG00000196218, ENSG00000221818, ENSG00000106327, ENSG00000279232, ENSG00000144485, ENSG00000260941, ENSG00000215595, ENSG00000251161, ENSG00000182348, ENSG00000131480, ENSG00000245904, ENSG00000143355, ENSG00000089847, ENSG00000258701, ENSG00000205038, ENSG00000224420, ENSG00000276445, ENSG00000099139, ENSG00000244151, ENSG00000135248, ENSG00000162692, ENSG00000204839, ENSG00000196104, ENSG00000143110, ENSG00000133246, ENSG00000179846, ENSG00000198105, ENSG00000215475, ENSG00000197584, ENSG00000170381, ENSG00000100346, ENSG00000171786, ENSG00000244242, ENSG00000280422, ENSG00000102057, ENSG00000091536, ENSG00000100024, ENSG00000130222, ENSG00000168952, ENSG00000111644, ENSG00000115556, ENSG00000180422, ENSG00000007372, ENSG00000272449, ENSG00000038295, ENSG00000262223, ENSG00000111218, ENSG00000272549, ENSG00000172828, ENSG00000107736, ENSG00000166359, ENSG00000268041, ENSG00000099769, ENSG00000233198, ENSG00000280229, ENSG00000172232, ENSG00000131471, ENSG00000260695, ENSG00000255031, ENSG00000180549, ENSG00000169836, ENSG00000260978, ENSG00000134595, ENSG00000270393, ENSG00000188425, ENSG00000162496, ENSG00000118729, ENSG00000213981, ENSG00000234350, ENSG00000237250, ENSG00000273064, ENSG00000058335, ENSG00000179564, ENSG00000272866, ENSG00000174611, ENSG00000132692, ENSG00000100060, ENSG00000275812, ENSG00000101203, ENSG00000143858, ENSG00000129757, ENSG00000197921, ENSG00000154080, ENSG00000170989, ENSG00000165805, ENSG00000237941, ENSG00000226476, ENSG00000018625, ENSG00000198732, ENSG00000148734, ENSG00000173673, ENSG00000231827, ENSG00000142494, ENSG00000112238, ENSG00000184221, ENSG00000177468, 및 이들의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 발현 수준을 감소시키는 것을 포함한다.
본원에 제공된 기술은, 다른 측면에서, 세포를 상기에서 상세히 기술된 MSC-NTF 세포로부터 유래된 단리된 엑소좀 집단과 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포에서 KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 경로를 조절하는 방법을 추가적으로 제공한다.
KEGG 경로는 hsa04510, hsa04512, hsa04115, hsa05200, hsa04110, hsa05222, hsa05224, hsa05100, hsa05412, hsa04151, hsa05205, hsa04141, hsa05215, hsa04933, hsa04520, hsa04390, hsa05161, hsa01521, hsa04210, hsa03460, hsa04142 및 이들의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 세포는 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 NTF를 증가된 양으로 포함하는 단리된 엑소좀과 접촉된다. 일부 구현예에서, 세포는 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 NTF와 적어도 다른 단백질을 증가된 양으로 포함하는 단리된 엑소좀과 접촉된다. 일부 구현예에서, NTF는 VEGF, HGF, LIF, GDNF, NT-3, 뉴로트로핀-4/5, NTN, 뉴로트로핀-4, 퍼세핀, ART, CNTF, IGF-1, GDF-15, G-CSF BDNF, TSG-6, BMP2 및 FGF2, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 다른 단백질은 IL36A, CCL7, MMP10, PIFG, CXCL8, LTA, CXCL6, MMP3, CHI3L1, IL11, FGF2, CXCL5, GAS1, JAML, TGFBR3, MEPE, IL6, PDGFA, CCL4, CCL21, CCL2, MIF, PLAU, ANGPTL4, CTSB, BSG, CCL5, TPO, IL23, IL1RL1, SPP1, F11R, INHBA, FAP, SPINT2, IL36G, TNFRSF10B 또는 TNFSF14, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 LIF 단백질을 증가된 양으로 포함하는 단리된 엑소좀과 접촉된다. 일부 구현예에서, 세포는 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 VEGFA 단백질을 증가된 양으로 포함하는 단리된 엑소좀과 접촉된다. 일부 구현예에서, 세포는 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 GDF15 단백질을 증가된 양으로 포함하는 단리된 엑소좀과 접촉된다. 일부 구현예에서, 세포는 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 LIF 및 VEGFA 단백질을 증가된 양으로 포함하는 단리된 엑소좀과 접촉된다. 일부 구현예에서, 세포는 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 LIF 및 GDF15 단백질을 증가된 양으로 포함하는 단리된 엑소좀과 접촉된다. 일부 구현예에서, 세포는 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 VEGFA 및 GDF15 단백질을 증가된 양으로 포함하는 단리된 엑소좀과 접촉된다.
일부 구현예에서, 세포는 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 NTF와 적어도 다른 단백질을 증가된 양으로 포함하는 단리된 엑소좀과 접촉된다. 일부 구현예에서, 세포는 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 LIF 또는 VEGFA 또는 GDF15 단백질 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 NTF와 적어도 다른 단백질을 증가된 양으로 포함하는 단리된 엑소좀과 접촉된다. 일부 구현예에서, 세포는 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 NTF와, IL13 또는 CXCL1 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 적어도 다른 단백질을 증가된 양으로 포함하는 단리된 엑소좀과 접촉된다. 일부 구현예에서, 세포는 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀과 비교해 LIF 또는 VEGFA 또는 GDF15 단백질 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 NTF와, IL13 또는 CXCL1 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 적어도 다른 단백질을 증가된 양으로 포함하는 단리된 엑소좀과 접촉된다.
특정 구현예에서, 세포는 인체에 존재한다. 특정 구현예에서, 세포는 생체외이다.
특정 구현예에서, KEGG 경로는 hsa04510이다. 특정 구현예에서, KEGG 경로는 hsa04512이다. 특정 구현예에서, KEGG 경로는 hsa04115이다. 특정 구현예에서, KEGG 경로는 hsa05200이다. 특정 구현예에서, KEGG 경로는 hsa04110이다. 특정 구현예에서, KEGG 경로는 hsa05222이다. 특정 구현예에서, KEGG 경로는 hsa05224이다. 특정 구현예에서, KEGG 경로는 hsa05100이다. 특정 구현예에서, KEGG 경로는 hsa05412이다. 특정 구현예에서, KEGG 경로는 hsa04151이다. 특정 구현예에서, KEGG 경로는 hsa05205이다. 특정 구현예에서, KEGG 경로는 hsa04141이다. 특정 구현예에서, KEGG 경로는 hsa05215이다. 특정 구현예에서, KEGG 경로는 hsa04933이다. 특정 구현예에서, KEGG 경로는 hsa04520이다. 특정 구현예에서, KEGG 경로는 hsa04390이다. 특정 구현예에서, KEGG 경로는 hsa05161이다. 특정 구현예에서, KEGG 경로는 hsa01521이다. 특정 구현예에서, KEGG 경로는 hsa04210이다. 특정 구현예에서, KEGG 경로는 hsa03460이다. 특정 구현예에서, KEGG 경로는 hsa04142이다.
실시예
실시예 1
MSC - NTF 엑소좀의 제조, 정제 및 특정화
목적: 세포-타입 특이적인 MSC-NTF 엑소좀 제조. 본 실시예는 에프 엑소좀의 제조를 설명하지만, MSC 유래 엑소좀을 본원에 기술된 방법 및 MSC 또는 유전자 변형된 MSC를 이용해 유사하게 단리할 수 있을 것으로 예상된다.
방법:
분화된 인간 BM- MSC ( MSC - NTF )의 제조 및 엑소좀 제조 & 정제
인간 골수-MSC (BM-MSC)의 단리 방법은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있으며, 국제 특허 출원 WO 2015/121859 및 WO 2014/024183에 충분히 기술되어 있으며, 이들 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
골수 샘플 (50-100 ml)을 골수 천자에 의해 건강한 성인 공여자의 후방 장골릉으로부터 헤파린-함유 시험관으로 수집하였다. 골수 천자물을 DMEM으로 1:1 희석하고, Ficoll (Ficoll-Paque PREMIUM) 함유 시험관에서 밀도 원심분리 (1000 xg, 20분)에 의해 단핵 세포를 분리하였다. 단핵 세포 분획을 수집하여, DMEM에서 헹구었다. 세포를 10% 혈소판 라이세이트 (PM; 하기 참조)를 함유한 배양 배지에 재현탁하고, 트리판 블루 배제 염료를 사용해 계수한 다음 2-챔버 CellStacks에 최대 300,000 세포/cm2 밀도로 접종하였다. 플라스크를 37℃ 가습 인큐베이터에서 5% CO2 하에 인큐베이션하였다.
PM 배양 배지는 200 mM L-글루타민 용액 (Sigma, Aldrich), 100 mM 소듐 피루베이트 용액 (Sigma, Aldrich), 2 IU/ml 헤파린 (APP Pharmaceuticals) 및 10% 혈소판 라이세이트가 첨가된, 글루코스 저-농도의 둘베코의 변형된 이글스 배지 (Sigma, Aldrich)로 구성된다. 16-24시간 후, PM 배지를 흡입하여 플라스크에서 비-부착성 세포를 제거하고, 부착성 세포는 DMEM 10 ml로 부드럽게 헹구었으며, 신선한 PM 30 ml을 플라스크에 첨가하였다. hMSC 세포를 PM 배지에서 12-15일간 배양하고, 배지를 주 당 2-3회 교체하였다. 12-15일 후 또는 플라스크가 컨플루언스에 도달하였을 때, 모든 배양 배지를 제거하고, 37℃ 인큐베이터에서 5분간 TrypLE.™ 용액 (Invitrogen)에서 인큐베이션하여, 세포를 회수하였다. 그런 후, 세포를 DMEM에서 헹구고, 계수한 다음 10% DMSO/PM에서 15 x 106 세포/ml/저온바이얼 농도로 저온 보존하였다. 저온 보존은 액체 질소에서 이루어진다.
골수 천자의 반복 수행을 방지하기 위해, 일부 경우에, MSC는 P0, P1 또는 P2 계대에서 저온 보존하였으며, 저온 보존된 MSC로부터 복수의 신선한 MSC-NTF 세포를 준비하였으며, 이는 MSC-NTF 세포로 유도하기 전에 해동 및 증폭하였다.
해동한 MSC 배양물을 PM 배지에 재현탁하고, 이를 2000 세포/cm2 밀도로 CellStacks에 접종하였으며, 4일 후 배양 배지 (PM)를 1 mM 다이부티릴 사이클릭 아데노신 모노포스페이트, 20 ng/mL 인간 염기성 섬유모세포 성장인자, 5 ng/mL 인간 혈소판-유래 성장인자 및 50 ng/mL 인간 헤레굴린-β1 (S2M)을 함유한 무-혈청성 DMEM 배지로 교체하여 3일간 분화를 유도하였다.
그런 후, 상기한 분화된 세포 (MSC-NTF 세포)로부터 배양액 (culture medium)을 수집한 다음, 0.22 ㎛ 필터를 통해 세포 파편과 큰 소낭을 여과 제거하였다. 엑소좀이 함유된 여과물을 무균 조건에서 수집하고, 접선 흐름 여과 (TFF; GE Healthcare Life Sciences)를 수행하였다.
MSC - NTF 세포 제조 및 엑소좀 제조 & 정제의 규모 확장
엑소좀 제조, 분비 및 수율의 규모를 확장하기 위해, 해동한 MSC 배양물을 PM 배지에 재현탁하고, (수일간) 증폭시키기 위해 CellStacks에 접종하였다. 그런 후, MSC를 회수하고, BioNocII Macrocarriers (EscoVacciXcell, Singapore) 상의 CelCradle™ 생물반응기 용기에 2,000-2,600 세포/cm2의 밀도로 PM 500 ml 중에 다시 접종하여 4일간 배양하였다. PM을 2일 후 교체하였다. 일부 구현예에서, 4일 후, 3일간 분화를 유도하기 위해 PM을 S2M으로 교체하였다. 분화 공정 종료시, 컨디셔닝화된 매질을 수집하고, 0.22 ㎛ 필터를 통해 세포 파편 및 큰 소낭을 여과 제거하였다.
엑소좀 함유 여과물을 무균 조건에서 수집하고, 접선 흐름 여과 (TFF; GE Healthcare Life Sciences)를 수행하였다. 정제된 엑소좀의 수율은 약 3-4x1011 범위였으며, 이는 CellStacks 단독을 이용한 공정에서 수득한 수율 (약 7x1010)의 최대 약 4-5배였다.
엑소좀 제조 및 정제 방법과는 독립적으로, 혈소판 라이세이트 유래 엑소좀의 교란 작용 (confounding effect) 가능성을 방지하기 위해, 10% 엑소좀 고갈된 혈소판 라이세이트 (exosomes depleted platelet lysate)를 첨가한 DMEM을 사용해 MSC 세포로부터 대조군 엑소좀을 제조하였다. 결과에 대한 교란 작용을 방지하기 위해, PL로부터 혈소판 라이세이트-유래 엑소좀을 제거하였다.
흥미롭게도, 3차원 (3D) 세포 제조 공정 (전술한 생물반응기 용기 내 담체 상)은 MSC-NTF 세포로부터 엑소좀의 분비 증가를 유발하고, 각각 CellStacks 단독을 이용한 2D 배양 방법으로부터 정제된 엑소좀과 비교해 약 3-4x1011 정제된 엑소좀 대 약 7x1010 정제된 엑소좀으로, 엑소좀의 최종 정제 수율 증가를 유발하였다. 비슷한 세포 수를 접종한 컨디셔닝화된 매질로부터 정제된 엑소좀에는 개수에 현저한 차이가 존재하였다.
혈소판 라이세이트의 제조
혈소판 라이세이트를 당해 기술 분야에 공지된 임의 방법을 이용해 제조하였다. 예를 들어, 일 구현예에서, 혈소판 라이세이트는 후술한 냉동-해동 프로토콜을 이용해 제조할 수 있다.
혈소판 풍부 혈장 (PRP)을 감염성 물질 (즉, HIV, HTLV, HCV, HBsAg)이 없는 것으로 확인된 혈액 은행 채혈물로부터 유래할 수 있다. 백에 든 PRP는 -80℃에서 보관하였으며, 37℃ 수조에서 해동하였다. 해동 후, 복수의 기증자의 혈소판 풍부 혈장을 합치고, 혼합하여 10분간 14000 xg로 원심분리하여, 혈소판 입자 및 막을 제거하였다. 그런 후, 혈소판 라이세이트 상층액을 수집하여, 사용시까지 -80℃에서 냉동하였다. 혈소판 라이세이트에서 내독소, 헤모글로빈, pH, 총 단백질, 알부민, 삼투질 농도, 무균성 및 마이코플라스마를 검사하였다.
MSC - NTF 세포-특이적인 엑소좀의 단리
접선 흐름 여과 (TFF) - 100, 300, 500 kD MWCO 멤브레인 (Spectrum Lab)을 사용하였다. 엑소좀-함유 샘플 (여과물)을 파이버 시스템을 통해 연속적으로 펌핑하여, 재순환시켰다. 멤브레인 소낭 안에 함유 또는 조합되지 않은 유리 단백질 등의 소형 분자를 멤브레인 구멍을 통과시킨 후, 투과물 (permeate)로서 용출시킨 다음 궁극적으로 폐기하였다. 너무 커서 구멍을 통과하지 못하는 분자, 예를 들어 엑소좀 (또는 큰 미세소낭)은 체류물로서 순환되도록 하였다. 샘플에서 kDMWCO 멤브레인보다 작은 오염물질을 추가적으로 제거하기 위해, 샘플에 대해 정용여과를 5회 수행하였다. 정용여과 마지막 사이클에서, 샘플의 부피가 ~10 ml로 감소하였다.
크기 배제 크로마토그래피 (SEC) - 고순도 엑소좀의 경우, TFF 이후에 SEC (Exo-spin™ 미디 컬럼; Cell Guidance Systems Ltd)를 제조사의 지침에 따라 수행하였다. 대안적으로, 엑소좀을 단리하기 위해 SEC는 수행하지 않았으며 TFF 단계만으로도 충분하였다.
회수율이 낮을 경우, 입자 혼합물이 흐름 방향에 대해 직각인 채널을 통해 추진되어 현탁물에 존재하는 입자가 분리되는, 용액 중의 입자의 층류를 토대로 하는 장-흐름 분획법 (FFF)을 사용하였다. SEC와 마찬가지로, FFF 분리는 엑소좀 유체역학적 직경에 좌우되지만, 이 방법은 다른 분리 방법과 비교해 넓은 콜로이드 입자 범위에 걸쳐 구성성분들을 분리할 수 있어, 독창적이다.
정제된 엑소좀의 특정화를 정량화, 표현형 및 카고 함량 등의 여러 수준에서 수행하였다.
나노입자 추적 분석
입자의 양 및 크기를, 브라운 운동 중인 개별 나노입자의 움직임을 추적하는 레이저 산란 비디오 현미경인 ZetaView 나노입자 추적 분석기 (ParticleMetrix)를 사용해 측정하였다. 11곳의 측정 위치에서 5회 노출을 각 샘플에서 기록하였다. 입자 크기를 스토크-아인스타인 등식에 따라 ZetaView software (ZetaView 8.02.28)로 계산하였다.
투과 전자 현미경 ( TEM )
엑소좀을 2% 파라포름알데하이드 및 2% 글루타르알데하이드에서 고정하고, 200 mesh Lacey Formvar 탄소-코팅 그리드 (Ted Pella, Inc.)에 탑재한 다음 즉시 에탄 (가스)에서 냉동하였다.
웨스턴 블록 분석
엑소좀의 단백질 샘플을 프로테아제 저해제가 첨가된 RIPA 완충제에 의해 준비하였다. 웨스턴 블롯 분석은 엑소좀-특이 마커, 예를 들어 CD9, CD63 및 TSG101에 대해 수행하였다. 발현되어 세포 소포체에만 위치하고 엑소좀에는 존재하지 않는 칼넥신을 음성 마커로서 검사하였다.
miRNA 발현 분석
엑소좀 총 단백질을 mirVana™ miRNA 분리 키트 (Life technologies, Carlsbad, California)를 사용해 준비하였다. 제조사의 표준 분리 공정은 다음과 같다.
총 엑소좀 RNA를 제조사의 지침에 따른 인간 NanoString nCounter miRNA 분석 (Nanostring Technologies, Seattle, WA, USA)에 사용하였다. NanoString 데이터를 검증하기 위해, qRT-PCR 분석을 수행하였다.
단백질 어레이
엑소좀의 단백질 샘플을 세포 라이시스 완충제 (RayBiotech, Inc., GA)에 의해 준비하고, RayBio 인간 어레이 Q440 (RayBiotech) 또는 유사 어레이에 사용해, 440종의 인간 인자, 예를 들어 사이토카인, 케모카인, 신경영양 인자 및 성장인자를 정량적으로 측정하였다. 분석은 제조사의 지침에 따라 수행하거나 또는 제조사 서비스를 이용함으로써 수행하였다.
결과:
엑소좀 크기 및 정량
MSC-NTF 세포의 컨디셔닝화된 매질로부터 TFF 방법을 이용해 엑소좀을 단리하였다. 엑소좀의 크기 및 총 수를 ZetaView (Particle Metrix) 및 해당 소프트웨어 (ZetaView 8.02.28)를 사용해 분석하였다. 샘플을 PBS에서 희석하여, ZetaView 셀에 탑재하고, 각 샘플에서 11곳에서 장치료 측정하였다. 샘플의 평균, 중앙값, (직경으로 표시된) 크기 및 농도를 계산하였다 (도 1). 중앙값은 132 nm ± 16이고, 평균은 132.1 nm ± 15이었다. 각각의 측정시, 장치의 사전-획득 파라미터를 23℃ 및 민감도 75로 설정하였다 (제조사에서 권고하는 최적의 임의 측정).
엑소좀의 투과 전자 현미경 ( TEM ) 분석
MSC-NTF-유래 엑소좀의 직경은 예상한 엑소좀 범위 (30-150 nm)에 해당함을 확인한 후, 그 형태와 완전성을, 나노입자 검증을 위해 널리-용인된 기법인 TEM이미징을 이용해 검증하였다. 엠소좀을 2% 파라포름알데하이드 및 2% 글루타르알데하이드에서 고정한 다음 200 mesh Lacey Formvar 탄소-코팅 그리드 (Ted Pella, Inc.)에 로딩하여 에탄 (가스)에서 즉시 냉동하였다. 도 2A-2B에 나타낸 이미지는 엑소좀의 고전적인 형태를 가진 입자가 측정된 크기 범위에 해당함을 보여준다.
뉴런에 의한 엑소좀 흡수
엑소좀의 1차 기능은 수용자 세포 안에 카고를 축적시키는 능력이다. 엑소좀의 세포 도입 능력을 조사하기 위해, 엑소좀을 2종의 형광 염료, RNA 선별 염료 (SYTO® RNASelect™; Life Technologies) 또는 세포외 소낭을 수동적으로 도입하기 전까지는 비-형광성이나 도입된 후 활성화되어 형광을 띠는 Calcein AM (Life Technologies)을 이용한 멤브레인 염색에 의해 염색하였다. 결합되지 않은 염료를 제거하기 위해, 엑소좀 및 대조군을 10k DMWCO Amicon으로 옮겼다. 대조군으로서 동일한 프로토콜을 따라 엑소좀없이 PBS에 염료를 첨가하엿다.
수용자 세포 내 엑소좀 흡수를 분석하기 위해, iPSC 운동 뉴런 (TDP43 돌연변이 보유)을 밤새 염색된 엑소좀과 함께 인큐베이션한 다음 FACS 분석 및 형광 현미경에 의해 조사하였으며, 세포의 70%에서 형광 엑소좀의 흡수가 검증되었다 (도 3A-3B).
효능 분석: 면역 조절
MSC-NTF 유래 엑소좀의 면역조절 잠재성을 평가하기 위해, 미토겐-유도된 T 세포 증식에 대한 효과를 측정하였다. 카복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE)가 미리 탑재된 풀링한 PBMC를 미토겐 피토헴어글루티닌 (PHA)으로 자극하고, 24웰 플레이트 (1x106 PBMC/웰)에서 4일간 MSC-NTF 유래 엑소좀의 양을 증가시키면서 배양하였다. T 세포 증식율을 세포 분열을 통한 CFSE 강도 감소에 의해 측정하였다.
나아가, T 조절성 세포 (T-regs)의 유도에 대한 MSC-NTF 유래 엑소좀의 면역조절 효과를 또한 평가하였다. PBMC는 3일간 MSC-NTF 엑소좀의 존재하 또는 부재하에 배양한 다음 T-reg 수준을 유세포 측정에 의해 측정하였다.
정제된 엑소좀의 면역조절 효능을 분석하기 위해, 활성화된 PBMC를 엑소좀 (3.3 x 1010/ml)과 함께 또는 엑소좀 없이 96시간 배양한 다음 CD4+ T 세포 증식 (도 4A), IFN-γ 분비 (도 4B) 및 TNF-α 분비 (도 4C)을 조사하였다. 도 4D는, 3일간 MSC-NTF 유래 엑소좀 (4.6x109 및 2.3x109)과 함께 공 배양한 2명의 건강한 공여자로부터 유래된 PBMC에서, 유세포 측정에 의해 확인된, 농도-의존적인 T-reg 수준 증가를 보여준다. 도 4E는 MSC-NTF 엑소좀과 단독 공여자 PMBC 유래의 CD4+CD25+FoxP3+ (T-reg) 세포의 유도 간의 농도-의존적인 상관관계를 보여준다.
PHA-유도된 PBMC를 MSC-NTF 유래 엑소좀의 존재 하에 배양하였을 때, T 세포 증식의 용량-의존적인 저해 (93-23%)가 관찰되었으며, 이는 엑소좀의 양 증가와 관련성이 있었다 (도 4A). 비슷한 범위의 농도 의존적인 저해, 즉 IFN γ 분비 저해 (범위 32-0.15%) 및 TNFα 분비 저해 (범위 13-84%)가 ELISA에 의해 측정되었다 (도 4B, 4C). MSC-NTF와 엑소좀을 96시간 배양한 후 IFN γ 및 TNFα 수준을 측정하였다.
결론: 엑소좀은 MSC-NTF 세포부터 쉽게 단리할 수 있으며, 다양한 용도로 유익하게 만드는 여러가지 특성을 가진 것으로 확인할 수 있다. 중요하게는, 이들 특성은 MSC-NTF 세포를 제조하는데 어떠한 영향도 미치지 않으면서 단리된 엑소좀에서 입증되었다.
실시예 2
MSC 또는 MSC - NTF 엑소좀 카고의 변형
목적: siRNA, miRNA 또는 단백질에 대한 나노-담체로서 사용하기 위한 변형된 MSC 또는 MSC-NTF 유래 엑소좀을 제조하고, 즉 MSC-NTF 유래 엑소좀의 타겟화된 집단을 제조하기 위함. 멤브레인 안에 분자를 캡슐화함으로써, 엑소좀은 단백질 또는 RNA를 변성으로부터 보호할 수 있다. 아울러, 특이적인 타겟에 대한 나노-담체로서 이용하면서도, MSC 또는 MSC-NTF 유래 엑소좀은 여전히 본래의 치료학적 잠재성을 유지한다.
siRNA, miRNA 또는 단백질 전달을 위한 나노-담체로서 엑소좀의 사용은 놀라운 이점을 가진다. 예를 들어, siRNA 및 siRNA-탑재된 엑소좀의 뉴런 또는 마우스 뇌로의 전달을 비교함으로써, siRNA-탑재된 엑소좀의 우수한 분포성 및 효능이 입증된 바 있다 (Didiot et al., (2016) Exosome-mediated Delivery of Hydrophobically Modified siRNA for Huntingtin mRNA Silencing. Mol Ther. 24(10)1836-1847; Alvarez-Erviti et al., (2011) Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosome. Nat Biotechnol. 29:341-345).
기능 소실 및 기능 획득을 위한 MSC 또는 MSC-NTF 유래 엑소좀을 준비하였다.
방법:
기능 소실 ( 침묵화 )
자연적으로 분비된 세포외 소낭 내 합성 siRNA의 탑재가 수용자 세포에서 타겟 유전자 침묵화 및 세포 흡수를 촉진하는 것으로 입증된 바 있다. 당해 기술 분야에 공지된 방법을 사용해, MSC 또는 MSC-NTF-유래 엑소좀에 siRNA를 탑재하였다. 예를 들어, S El-Andaloussi et al., (2012) Exosome-medicated delivery of siRNA in vitro and in vivo. Nat Protoc. 7(12):2112-2126)에 제시된 방법을 참조한다.
마우스 및 humMMP9에서 공통적인 코딩 서열에 대해 여러가지 siRNA 서열들을 설계하였다. 엑소좀에 형광 태그된 siRNA를 전기천공 및 엑소좀 탑재에 의해 탑재한 다음 탑재되지 않은 siRNA는 울트라-여과에 의해 제거하고 Qubit 3.0 형광측정기 (Thermo)로 분석하였다. 엑소좀을 전기천공하지 않고 siRNA와 혼합한 경우는 대조군으로 사용하였다.
iPSC 유래 운동 뉴런을 이용해, siRNA가 탑재된 엑소좀이 카고를 시험관내에서 특이적으로 전달할 수 있는 지를 분석하였다. 흡수는 상기 실시예 1에 기술된 바와 같이 형광 현미경 (Olympus) 및 유세포 측정기를 사용해 분석하였다. RT-PCR 분석을 이용해, 타겟화된 엑소좀을 이용한 전달이 수용자 세포에서 상응하는 유전자 넉아웃을 달성하는 지를 입증하였다.
변형된 MSC 또는 MSC-NTF-유래 엑소좀은 전술한 기능성 모델에서 대조군 비-변형된 MSC 또는 MSC-NTF 및 대조군 MSC 유래 엑소좀과 기능적으로 비교하였다.
기능 획득 (과다 발현)
단백질 또는 miRNA를 당해 기술 분야에 잘 알려진 바와 같이 직접 또는 공여자 MSC 세포의 유전자 조작을 통해 엑소좀에 탑재하며, 이로써 세포는 삽입된 유전자 또는 핵산 서열에 의해 코딩된 단백질 또는 펩타이드를 합성하고 이들 단백질 또는 펩타이드는 이후 세포외 소낭 (엑소좀)으로 분비된다.
엑소좀으로 직접 단백질을 탑재하기 위한 여러가지 방법들, 예를 들어 실온에서 인큐베이션, 사포닌을 이용한 투과화, 냉동-해동 사이클, 초음파 처리 또는 압출 (예, Haney et al., (2015) Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy. J Control Release, 10(207)18-30에 기술된 방법)이 제안되어 있다.
사포닌을 이용한 투과화 또는 초음파 처리 (이 2가지 방법이 가장 효과적인 것으로 입증됨)에 의해 MSC 또는 MSC-NTF-유래 엑소좀에 임의의 miRNA-7, GDF5, IGF-1 또는 IGF-2, 또는 이들의 조합의 직접 탑재 효율을 수행하였다. miRNA 또는 인자가 탑재된 엑소좀을 크기 배제 크로마토그래피 (SEC; ExoSpin)를 이용해 유리 인자 또는 miRNA로부터 정제하였다. GDF5, IGF-1 또는 IGF-2 함유량을 ELISA (R&D systems)로 측정하고, miRNA-7 함유량을 RT-PCR에 의해 측정하였다.
엑소좀에 단백질의 직접 형질도입이 저 효율이면, miRNA-7, GDF5, IGF-1 또는 IGF-2는 XPack technology (SBI)을 이용하여 MSC 세포에서 고도로 발현시켰다.
변형된 MSC 또는 MSC-NTF-유래 엑소좀을, 상기 기능 소실 엑소좀에서 기술된 기능성 모델에서 대조군 비-변형된 MSC 또는 MSC-NTF 세포 및 대조군 MSC 유래 엑소좀과 기능적으로 비교하였다.
결과:
상기한 방법으로 특이적인 기능 소실 및 기능 획득성 MSC 또는 MSC-NTF-유래 엑소좀이 제조되는 것으로 예상되었다.
결론: 단리된 엑소좀은, 이의 천연적인 고유한 특성 외에도, 부가적인 카고 분자를, 예를 들어, 멤브레인 또는 내부 체적에 통합하여, 새로운 유익한 특성을 수득하거나 또는 유익한 천연적인 특성을 강화할 수 있다.
실시예 3
변형된 및 비-변형된 MSC 또는 MSC - NTF 엑소좀의 시험관내 & 생체내 특정화
목적: 변형된 MSC 또는 MSC-NTF 유래 엑소좀의 시험관내 및 생체내 생물학적 기능 특정화
방법:
MSC, 유전자 변형된 MSC, MSC 유래 엑소좀, 변형된 MSC 유래 엑소좀, MSC-NTF 유래 엑소좀 및 변형된 MSC-NTF 유래 엑소좀의, 신경보호, 염증 억제 및 기능 회복 개선 등의 다양한 생물학적 기능을 여러가지 모델들에서 평가하였다.
엑소좀 표지 및 수용자 세포에 의한 흡수
엑소좀의 1차 기능은 수용자 세포 안에 카고를 축적하는 능력이다. 변형된 엑소좀의 세포 도입 능력을 조사하기 위해, 변형된 엑소좀을 비-변형된 MSC-NTF 유래 엑소좀에 대한 실시예 1에서와 같이 2종의 형광 염료, 즉 RNA 선별 염료 (SYTO® RNASelect™; Life Technologies) 또는 세포외 소낭을 수동적으로 도입하기 전까지는 비-형광성이나 도입된 후 활성화되어 형광을 띠는 Calcein AM (Life Technologies)을 이용한 멤브레인 염색에 의해 표지하였다. 변형된 MSC 또는 MSC-NTF 유래 엑소좀을 운동 뉴런과 3-24시간 공 배양하고, 형광 현미경 (Olympus)과 유세포 측정기 (FACS; FC500, Beckman Coulter)를 사용해 흡수를 분석하였다.
시험관내 면역조절
신경-염증은 ALS의 두드러진 홀마커들 중 하나로, 변형된 MSC, 변형된 MSC-NTF 유래 및 대조군 MSC 유래 엑소좀의 면역조절 잠재성을 (비-변형된 MSC-NTF 유래 엑소좀에 대해 도 4A-4E에 나타낸 바와 같이) 활성화된 PBMC 분석을 이용해 확인하였다. 3가지 파라미터를 검사하였다: FACS 분석을 이용한 CFSE 분석에 의한 CD4+ 세포의 증식 저해, FACS 분석을 이용한 CD4+CD25+FoxP3+ T 조절성 세포의 유도 및 특이적인 ELISA 키트 (R&D systems)를 이용한 염증성 사이토카인, 예를 들어 IFN-γ 및 TNF-α의 저해. 비-대응 t-검정 (Unpaired t-test) 또는 ANOVA를 통계학적 분석에서 수행하였다.
여러가지 세포 타입들에서 시험관내 신경-기능성 분석
인간 신경 전구 줄기 세포
세포는 배아 줄기 세포 (줄기 세포 기법) 또는 iPSC (미성숙 또는 성속 뉴런, 도파민 뉴런 및 신경교 세포로 분화할 수 있는 ATCC는 신경발생 및 신경보호를 위한 양호한 분석으로서 이용됨)로부터 기원한다. 이들 신경 전구 줄기 세포를 MSC, 변형된 MSC 유래 엑소좀, MSC-NTF 유래 엑소좀, 또는 변형된 MSC-NTF 유래 엑소좀와 함께 공 배양하거나 또는 없이 배양하였다.
다음과 같은 파라미터를 조사하였다:
A. 여러가지 공-배양 시간대에 유전자 및 miRNA 발현 (Affimetrix GeneChip arrays, RT-PCR)
B. 신경돌기 연장 (IncuCyte®, NeuroTrack™ 분석 소프트웨어)
인간 DCX-GFP 세포 (ATCC)는, GFP가 성체 신경발생 코스에서 일시적으로 발현되는 세포골격-부속 단백질인 더블코르틴 (Doublecortin, DCX) 프로모터 하에 발현되는, 신경 선조 세포 (progenitor cell)이다. DCX-GFP 세포를 CellMatrix로 코팅된 96웰 플레이트에 세포 밀도 5,000 세포/웰로 증폭 배지 (ATCC) 중에 접종하였다. 접종한지 24시간 후, PBS 20 ㎕ 또는 MSC-NTF 엑소좀 20 ㎕ 또는 엑소좀 10 ㎕ + PBS 10 ㎕ 또는 MSC-NTF 엑소좀 1 ㎕ (엑소좀 농도: 1.1 x 107 엑소좀/㎕)가 첨가되거나 또는 비-첨가된 도파민성 분화 배지 (ATCC, 100 ㎕/웰)로 배지를 교체하였다.
신경돌기 성장을 개별 신경돌기의 총 길이로서 측정하였으며, IncuCyte S3 라이브 이미징 시스템 (Essen Bioscience)을 사용해 6시간 간격으로 모니터링하였다 (도 5A). 도 5B는, MSC-NTF 엑소좀이 신경영양-인자 고갈 유도된 세포 사멸로부터 뉴런을 구조함을, 보여준다. iPSC (StemCell technologies Cat#70901)로부터 유래된 신경 선조 세포를 뉴런 분화 및 성숙 배지 (Stemcell Technologies)를 사용해 14일간 성숙한 뉴런으로 분화시켰다. 15일차에, MSC-NTF 유래 엑소좀 (입자 2-4x109개) 또는 PBS가 첨가된 신경영양 인자-고갈된 배지로 배지를 교체하였다. 7일간 더 세포를 배양 유지하였다. 세포를 6시간 간격으로 Incucyte S3 라이브 이미징 시스템을 사용해 이미지를 촬영하였다. 신경돌기 길이를 Neurotrack 모듈을 사용해 계산하였다. 도 5C는, MSC-NTF 엑소좀이 신경돌기 성장을 유도함을, 보여준다. SH-SY5Y 세포를 96웰 플레이트에, 10% FBS가 첨가된 DMEM F12 중에 세포 밀도 35000 세포/cm2로 접종하였다. 24시간 후, 배지를 무혈청성 DMEM F12 배지로 교체하고, 엑소좀 (입자 ~2x109개)을 각 웰에 첨가하였다. 세포를 2시간 간격으로 Incucyte S3 라이브 이미징 시스템을 사용해 이미지를 촬영하였다. 신경돌기 길이를 Neurotrack 모듈을 사용해 계산하였다.
결론: MSC 엑소좀과 마찬가지로, MSC-NTF 엑소좀 역시 신경보호 효과를 가진다. 그러나, MSC-NTF 엑소좀의 신경보호 효과가 MSC 엑소좀의 신경보호 효과와 비교해 현저하게 우수하였다.
A. H2O2 및 6-OHDA를 이용해, LDH 분비 분석과 미토콘드리아 활성-MTS 분석으로 신경독성에 대한 보호를 평가하였다. 인간 신경 선조 세포 (StemCell Technologies)를 1주일간 뉴런 분화 배지에서 배양한 다음 폴리-L-오르니틴 (PLO) 및 라미닌 (laminin)으로 코팅된 96웰 플레이트에 세포 밀도 20,000 세포/웰로 접종하고, 뉴런 성숙 배지 (StemCell technologies)에서 배양하였다. 신경 성숙화 동안에, 세포에 PBS 20 ㎕, MSC-NTF 엑소좀 20 ㎕, MSC-NTF 엑소좀 10 ㎕ 또는 MSC-NTF 엑소좀 1 ㎕ (MSC-NTF 엑소좀 농도: 4.5x106 엑소좀/㎕)를 처리하였다. 5일간 뉴런 성숙화 후, H2O2를 농도를 증가시키면서 (10 μM, 20 μM, 40 μM 또는 60 μM)를 첨가한 F12 배지로 배지를 교체하였다. 18시간 후, MTS 분석 (Abcam)을 수행하여 MSC-NTF 엑소좀의 보호 효과를 결정하기 위해 세포 생존성을 분석하였다.
B. 이용가능한 경우 뉴런 (Tuj1), 미세아교세포 (IBA-1) 및 성상 세포 (GFAP)의 마커를 이용해, 형광 현미경으로 엑소좀을 가시화하고, 정량하였다.
iPSC -유래 운동 뉴런 (MN); ALS의 유전자 및 특발성 모델
ALS 환자의 iPSC로부터 유래한 MN은 특이적인 질환-관련 표현형을 가지고 있는 것으로 밝혀져, ALS의 분자적 기반을 조사하고 약물 개발을 위한 새로운 탐색 플랫폼을 개발하기 위한 이러한 시스템의 이용이 검증된 바 있다. ALS 환자의 MN iPSC 플랫폼을 이용해, 변형된 MSC 유래 엑소좀, MSC-NTF 유래 엑소좀, 변형된 MSC-NTF 유래 엑소좀 및 대조군 MSC 유래 엑소좀의 신경-보호 잠재성을, TDP-43 돌연변이 (M337V 및 Q331K)를 가진 iPSC-유래 MN 및 iPSC-유래 MN 이소제닉 대조군 (isogenic control) (Cellular Dynamics)에서 조사하였다. 또한, C9ORF72 돌연변이 및 특발성 ALS (New York Stem Cell Foundation) 환자로부터 기원한 iPSC-유래 운동 뉴런을 조사하였다.
다음과 같은 파라미터를 조사하였다: A: 여러가지 배양 시간대의 유전자 및 miRNA 발현 (Affimetrix GeneChip arrays, RT-PCR); B: 생리학적 활성-아세틸 콜린 분비 (비색 분석); C: 세포 사멸 평가 (LDH 분비; 비색 분석); D: 세포독성 (LDH 분비) 및 미토콘드리아 활성 (MTS 분석)과 비교하여, 카스파제-3를 활성화함으로써 세포자살을 유도하고 단백질 키나제를 저해하는 것으로 알려진 스타우로스포린 (STS)을 이용하여, 건강한 세포 대 돌연변이 세포의 민감성 조사; 및 E: 필요에 따라 뉴런 마커 (Tuj1), 운동 뉴런 마커 (Isl-1), 미세아교세포 마커 (IBA-1) 및 성상 세포 마커 (GFAP)를 이용한 형광 현미경에 의한 시각화 및 정량화.
1차 랫 뉴런 배양; PD에서 α- 시누클레인 봉입체 모델
1차 랫 뉴런 배양에서 MSC, 변형된 MSC 유래 엑소좀, MSC-NTF 유래 엑소좀 및 변형된 MSC-NTF 유래 엑소좀의 α-시누클레인 봉입체 형성 저해 및 뉴런 기능 결함을 다음과 같이 확인하였다: A: 1차 랫 뉴런 배양물을 스프레그-다울리 랫으로부터 준비하였다; B: 1차 랫 뉴런 배양물을 마우스 α 시누클레인 피브릴과 함께 총 2, 4, 7, 10, 14, 21일간 대조군 MSC, 변형된 MSC, MSC-NTF 및 변형된 MSC-NTF -유래 엑소좀을 3가지 농도로 첨가하거나, 또는 엑소좀 첨가없이, 배양하였다; C: 1% Tx-100 및 이후 2% SDS로 순차적으로 추출한 뉴런의 면역형광 및 면역블롯에 의한 인산화된 α-시누클레인 봉입체의 함유량을 정량하였다; D: AAV-SynapsinI-GCamp6를 이용한 칼슘 이미징으로, 엑소좀이 봉입체에 의해 유발된 칼슘 신호전달 손상을 방지하는 지를 확인하였다; E: 랫의 피질, 해마 및 편도체에서 α-시누클레인 봉입체의 형성 감소 및 도파민 뉴런 감소에 대한, MSC, 변형된 MSC, MSC-NTF 또는 변형된 MSC-NTF -유래 엑소좀의 척수강내 전달 결과를 확인하였다.
생체내 실험
ALD에 대한 SOD-1 G93A 뮤라인 모델
SOD1 돌연변이 마우스는 인간에서 ALS를 연상시키는 표현형을 나타낸다. 몇가지 실험들에서, MSC 세포뿐 아니라 MSC 배양액이 돌연변이 SOD1/G93A 마우스의 생존성 및 운동 기능을 개선하는 것으로 입증되어 있다. 이에, Gly93Ala 치환 (SOD1/G93A)을 가진 돌연변이 인간 SOD1을 고 카피수로 발현하는 B6SJL-TgN SOD1/G93A1 마우스와 야생형 인간 SOD1 (SOD1)을 발현하는 B6SJL-TgN (SOD1) 마우스 (Jackson Laboratories)를 이용해, 질환 진행, 증상의 개시 및 수명에 대한 변형된 MSC, MSC-NTF, 변형된 MSC-NTF 및 대조군 MSC-유래 엑소좀의 효과를 분석하였다.
변형된 MSC, MSC-NTF, 변형된 MSC-NTF, 또는 대조군 MSC-유래 엑소좀을, 효과를 최대화하고 전신 부작용을 방지하기 위해, 척수강내 또는 비강내로 투여하였다.
운동 기능에 대한 여러가지 엑소좀 집단의 효과는 로타로드 (Rotarod), 운동 결함 스코어 (motor deficit score) 및 체중에 의해 조사하며, 이들 모두 SOD1/G93A 동물을 평가하기 위해 일반적으로 사용되는 방법이다 (Weydt et al.,(2003) Assesing disease onset and progression in the SOD1 mouse model of ALS. Neuroreport. 3; 14(7):1051-1054).
투여 후 6-48시간 후 척수 및 뇌 실질에서 엑소좀의 분포를 가시화하기 위해, 변형된 MSC, MSC-NTF, 변형된 MSC-NTF 또는 대조군 MSC-유래 엑소좀을 PKH26 또는 BODIPY TR 세라마이드 염료로 표지하였다. 전체 뇌 및 척수의 일련의 조직 단편들을 뉴런 마커 (뉴런 핵 항원 (NeuN)), 미세아교세포 마커 (IBA-1) 및 성상 세포 마커 (GFAP)를 이용한 공초점 현미경 (Olympus)에 의한 면역형광에 대해 처리한다. 올림푸스 이미지 브라우저를 사용해 이미지를 분석하였다.
파킨슨병 (PD)에 대한 α- 시누클레인 모델
초음파 처리된 마우스 PFF, α-시누클레인 모노머 또는 PBS를 선조체에 일측 주사 (unilateral injection)한 스프레그-다울리 랫을 이용해, 대조군 MSC, MSC, 유전자 변형된 MSC, MSC-NTF 또는 유전자 변형된-MSC-NTF 세포로부터 유래된 (탑재된) 엑소좀 또는 변형된 엑소좀의 척수강내 전달이 랫의 피질, 해마 및 편도체에서 α-시누클레인 봉입체 형성 및 도파민 뉴런 감소를 낮추는 지를 확인하였다. 분석은 하기를 포함할 수 있다: A. 편도체, 흑질 치밀부, 선조체, 해마 및 피질에서, 인산화된 α-시누클레인에 대한 항체를 이용한 면역조직화학 및 Nissl 대조염색 및 세포 총 수 및 세포내 인산화된 α-시누클레인 봉입체의 총 수에 대한 비-편향적인 입체분석적 카운팅 (unbiased stereological count)을 수행한다; B. 흑질 치밀부의 조직 단편에서 티로신 하이드록실라제에 대한 면역조직화학적 분석. TH+ 및 Nissl+ 뉴런을 카운팅하기 위한 입체분석 및 선조체에서 도파민 트랜스포터와 TH에 대한 면역형광 분석, 및 도파민성 터미널의 감소가 존재하는 지를 확인하기 위한 면역형광 신호 정량을 수행한다; C. 오픈 필드 검사 (open field test), 실린더 검사 및 초음파 울음 (ultrasonic vocalization) 등의 거동 검사를 수행하여, MSC 및 MSC-NTF-유래 엑소좀의 척수강내 전달이 α-시누클레인 봉입체-유도된 거동 결함의 발생을 감소시키는 지를 확인한다; D. MHCII, IBA-1 또는 CD163, 또는 이들의 조합에 대한 면역형광을 이용해, MSC, 유전자 변형된 MSC, MSC-NTF 및 변형된 MSC-NTF 세포로부터 유래된 (탑재된) 엑소좀 또는 변형된 엑소좀의 척수강내 전달이 랫의 피질, 해마 및 편도체에서 α-시누클레인 봉입체의 형성으로 유발되는 염증을 감소시키는 지를 확인한다; 및/또는 E. sCD27, 키티나제 3-유사-1 단백질, 키티나제 3-유사-2 단백질 또는 NfL, 또는 이들의 조합에 대한 면역형광을 이용해, MSC, 유전자 변형된 MSC, MSC-NTF 및 변형된 MSC-NTF 세포로부터 유래된 (탑재된) 엑소좀 또는 변형된 엑소좀의 척수강내 전달이 랫의 피질, 해마 및 편도체에서 α-시누클레인 봉입체의 형성으로 유발되는 신경염증을 감소시키는 지를 확인한다.
결론: MSC-NTF 세포로부터 단리된 엑소좀의 유익한 한가지 특성은 이의 신경보호 효과이다. 이 특성은 신경퇴행성 질환을 퇴치하는데 이용할 수 있다. 중요하게는, 이러한 특성은 실시예 2에 기술된 바와 같이 부가적인 신경보호성 카고 분자를 단리된 엑소좀에 탑재함으로써 더욱 강화할 수 있다.
실시예 4
분화된 인간 BM- MSC ( MSC - NTF )의 제조 및 엑소좀 제조 & 정제
인간 골수-MSC (BM-MSC)의 단리 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 국제 특허 출원 공개공보 WO 2015/121859 및 WO 2014/024183에 충분히 기술되어 있다.
골수 샘플 (50-100 ml)을 골수 천자에 의해 건강한 성인 공여자의 후방 장골릉으로부터 헤파린-함유 시험관으로 수집하였다. 골수 천자물을 DMEM으로 1:1 희석하고, Ficoll (Ficoll-Paque PREMIUM) 함유 시험관에서 밀도 원심분리 (1000 xg, 20분)에 의해 단핵 세포를 분리하였다. 단핵 세포 분획을 수집하여, DMEM에서 헹구었다. 세포를 10% 혈소판 라이세이트 (PM; 하기 참조)를 함유한 배양 배지에 재현탁하고, 트리판 블루 배제 염료를 사용해 계수한 다음 2-챔버 CellStacks에 최대 300,000 세포/cm2 밀도로 접종하였다. 플라스크를 37℃ 가습 인큐베이터에서 5% CO2 하에 인큐베이션하였다.
PM 배양 배지는 200 mM L-글루타민 용액 (Sigma, Aldrich), 100 mM 소듐 피루베이트 용액 (Sigma, Aldrich), 2 IU/ml 헤파린 (APP Pharmaceuticals) 및 10% 혈소판 라이세이트가 첨가된, 글루코스 저-농도의 둘베코의 변형된 이글스 배지 (Sigma, Aldrich)로 구성된다. 16-24시간 후, PM 배지를 흡입하여 플라스크에서 비-부착성 세포를 제거하고, 부착성 세포는 DMEM 10 ml로 부드럽게 헹구었으며, 신선한 PM 30 ml을 플라스크에 첨가하였다. hMSC 세포를 PM 배지에서 12-15일간 증식시켰으며, 배지를 주 당 2-3회 교체하였다. 12-15일 후 또는 플라스크가 컨플루언스에 도달하였을 때, 모든 배양 배지를 제거하고, 37℃ 인큐베이터에서 5분간 TrypLE.TM 용액 (Invitrogen)에서 인큐베이션하여, 세포를 회수하였다. 그런 후, 세포를 DMEM에서 헹구고, 계수한 다음 10% DMSO/PM에서 15 x 106 세포/ml/저온바이얼 농도로 저온 보존하였다. 저온 보존은 액체 질소에서 이루어졌다.
골수 천자의 반복 수행을 방지하기 위해, 일부 구현예에서, MSC는 P0, P1 또는 P2 계대에서 저온 보존하였으며, 저온 보존된 MSC로부터 복수의 신선한 MSC-NTF 세포를 준비하였으며, 이는 MSC-NTF 세포로 유도하기 전에 해동 및 증폭시켰다.
해동한 MSC 배양물을 PM 배지에 재현탁하고, 이를 2000 세포/cm2 밀도로 CellStacks에 접종하였으며, 4일 후 배양 배지 (PM)를 1 mM 다이부티릴 사이클릭 아데노신 모노포스페이트, 20 ng/mL 인간 염기성 섬유모세포 성장인자, 5 ng/mL 인간 혈소판-유래 성장인자 및 50 ng/mL 인간 헤레굴린-β1 (S2M)을 함유한 무-혈청성 DMEM 배지로 교체하여 3일간 분화를 유도하였다.
그런 후, 상기한 분화된 세포 (MSC-NTF 세포)로부터 배양액 (culture medium)을 수집한 다음, 1.2 ㎛ 필터를 통해 세포 파편과 큰 소낭을 여과 제거하였다. 엑소좀이 함유된 여과물을 무균 조건에서 수집하고, 접선 흐름 여과 (TFF; GE Healthcare Life Sciences)를 수행하였다.
MSC - NTF 세포 집단 및 엑소좀 제조 & 정제의 규모 확장
엑소좀 제조, 분비 및 수율의 규모를 확장하기 위해, 해동한 MSC 배양물을 PM 배지에 재현탁하고, (수일간) 배양하기 위해 CellStacks에 접종하였다. 그런 후, MSC를 회수하고, BioNocII Macrocarriers (EscoVacciXcell, Singapore) 상의 CelCradle™ 생물반응기 용기에 2,000-2,600 세포/cm2의 밀도로 PM 500 ml 중에 다시 접종하여 4-6일간 배양하였다. PM을 2일 후 교체하거나, 또는 관류 시스템을 이용해 500-1500 ml/day의 속도로 순환시켰다. 일부 구현예에서, 4-6일 후, 3일 또는 4일간 분화를 유도하기 위해 PM을 S2M으로 교체하였다. 분화 종료시 또는 분화 공정 중의 여러 시점에, 컨디셔닝화된 매질을 수집하고, 0.2-1.2 ㎛ 필터를 통해 세포 파편 및 큰 소낭을 여과 제거하였다. 분화 공정 중에 매질을 여러번 수집하여, 엑소좀 총 수율을 최대 2배로 높였다.
엑소좀 함유 여과물을 무균 조건에서 수집하고, 접선 흐름 여과 (TFF; GE Healthcare Life Sciences)를 수행하였으며, 컬럼을 이용한 크기 배제 크로마토그래피 (SEC, GE Healthcare Life Sciences) 또는 멤브레인 크로마토그래피를 이용해 용액으로부터 단백질을 제거하거나 또는 제거하지 않았다. 정제된 엑소좀의 수율은 약 3-4x1011 범위였으며, 이는 CellStacks을 이용한 공정에서 수득되는 수율 (약 7x1010)의 최대 약 4-5배였다.
엑소좀 제조 및 정제에 사용된 방법과는 독립적으로, 혈소판 라이세이트 유래 엑소좀의 교란 작용 가능성을 방지하기 위해, 10% 엑소좀-고갈된 혈소판 라이세이트가 첨가된 DMEM을 사용해 MSC 세포로부터 대조군 엑소좀을 준비하였다.
일부 경우에는, MSC를 증폭시키고, 퀀텀 세포 증폭 시스템 (Terumo BCT, USA)에서 MSC-NTF 세포로 분화하였다. 컨디셔닝화된 매질을 분화 공정 종료 시점에 수집하고, 상기한 엑소좀 단리 공정에 투입하였다.
엑소좀 제조 공정:
MSC-NTF 세포-특이적인 엑소좀의 단리
접선 흐름 여과 (TFF) - 100, 300, 500 kD MWCO 멤브레인 (Spectrum Lab)을 사용하였다. 엑소좀-함유 샘플을 파이버 시스템을 통해 연속적으로 펌핑하여, 재순환시켰다. 멤브레인 소낭 안에 함유 또는 조합되지 않은 유리 단백질 등의 소형 분자를 멤브레인 구멍을 통과시킨 후, 투과물로서 용출시킨 다음 궁극적으로 폐기하였다. 너무 커서 구멍을 통과하지 못하는 분자, 예를 들어 엑소좀 (또는 큰 미세소낭)은 체류물로서 순환되게 하였다. 샘플에서 kDMWCO 멤브레인보다 작은 오염물질을 추가적으로 제거하기 위해, 샘플에 대해 정용여과를 5회 수행하였다. 정용여과 마지막 사이클에서, 샘플의 부피가 ~10 ml로 감소하였다.
크기 배제 크로마토그래피 (SEC) - 고순도 엑소좀의 경우, TFF 다음으로 SEC를 수행하였다. 대안적으로, 엑소좀을 단리하기 위해 SEC는 수행하지 않았으며 TFF 단계만으로도 충분하였다.
정제된 엑소좀의 특정화를 정량화, 표현형 및 카고 함량 등의 여러 수준에서 수행하였다.
MSC-NTF 세포 용해물 (단백질 20 ㎍) 및 2D (CellStack) 또는 생물반응기 MSC-NTF 컨디셔닝화된 매질로부터 단리된 엑소좀 라이세이트 (단백질 20-40 ㎍)를, CD9에 대한 마우스 단일클론 항체 (1:500 희석; Cat# CBL162 Merck) 및 칼넥신에 대한 마우스 단일클론 항체 (1:500 희석; MAB3126, Merck)를 사용한 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. HRP-접합된 염소 항-마우스 IgG 항체 (1:5000 희석; Cat# AP308P, Merck)와 인큐베이션한 후, 멤브레인을 EZ-ECL 용액 (Biological Industries)으로 현상하였다. 도 6은 여러가지 방법에 의해 제조된 엑소좀의 순도를 나타낸다. 구체적으로, 엑소좀 샘플들에서 엑소좀 마커 CD9의 발현이 높고 ER 마커 칼넥신의 발현이 낮은 것은 이들 엑소좀 샘플에서 순도가 높다는 것을 검증해준다.
MSC 또는 MSC-NTF 세포로부터 단리된 엑소좀에서, 특이적인 항체를 통해 칩 표면에 결합된 나노입자를 검출할 수 있는 ExoView 플렛폼 (Nanoview Diagnostics)을 이용해 표면 마커 발현을 분석하였다. 도 7에 나타낸 결과는, MSC 및 MSC-NTF 세포로부터 유래된 엑소좀 둘다 특징적인 엑소좀 표면 마커 CD81, CD63 및 CD9을 발현함을 의미한다. 양쪽 엑소좀 집단에서 MHCI 또는 MHCII의 발현은 낮았다. 마우스 IgG를 음성 대조군으로 사용하였다.
MSC-NTF 유래 엑소좀에서 단백질 카고의 특징을 규명하고 카고를 대조군 MSC 유래 엑소좀과 비교하기 위해, 항체 어레이 (인간 사이토카인 어레이 Q440, Raybiotech)를 이용하였다. 이 어레이는 사이토카인 등의 단백질 440종의 발현을 정량적으로 측정할 수 있다.
MSC (n=4) 및 MSC-NTF (n=4) 유래 엑소좀의 단백질 어레이는, 대조군 MSC 유래 엑소좀과 비교해, 단백질 42종을 증가된 양으로 포함하고 (유의성 (p<0.05)), 단백질 4종은 MSC-NTF 유래 엑소좀에서 유의하게 감소하였다. 이들 단백질을 표 1에 열거하고, 도 8에 나타낸다.
표 1. 대조군 MSC 유래 엑소좀과 비교해 MSC - NTF 유래 엑소좀에서 조절되는 단백질
단백질 MSC 유래 엑소좀 (pg/ml) MSC - NTF 유래 엑소좀 ( pg /ml) 배수 변화
SPINT2 0 (0, 0) 77.09 (10.37, 214.74) 77090.77
TNFSF14 0 (0, 2.53) 29.52 (2.81, 48.8) 29523.43
IL36G 0 (0, 0) 10.37 (5.18, 89.58) 10375.74
TNFRSF10B 0 (0, 0) 4.44 (0.1, 19.19) 4445.95
IL36A 9.18 (0, 202.26) 2246.97 (403.46, 5107.29) 244.89
CCL7 1.47 (0.27, 2.9) 94.43 (52.85, 293.11) 64.12
MMP10 0.69 (0, 4.02) 43.8 (11.31, 108.93) 63.61
PIGF 1.63 (0, 3.51) 101.3 (49.95, 219.28) 62.02
CXCL8 2.03 (0.08, 3.99) 123.49 (87.74, 290.65) 60.86
LTA 3.38 (0, 61.46) 176.43 (71.31, 511.73) 52.25
LIF 1.35 (0, 2.7) 69.29 (7.71, 227.81) 51.5
CXCL1 3.99 (0, 7.95) 133.36 (44.16, 266.7) 33.38
CXCL6 31.63 (0.06, 34.95) 861.22 (701.76, 1290.23) 27.23
MMP3 224.37 (0, 512.42) 5592.18 (1711.54, 12122.95) 24.92
CHI3L1 111.84 (42.03, 220.77) 2689.19 (845.91, 14301.22) 24.04
IL11 95.69 (17.64, 129.96) 2130.81 (1320.08, 4939.7) 22.27
FGF2 50.04 (6.69, 70.06) 1036.66 (520.24, 3264.96) 20.72
CXCL5 19.28 (2.98, 39.51) 374.15 (193.66, 586.16) 19.41
GAS1 3.21 (2.01, 6.74) 59.35 (22.96, 185.67) 18.51
JAML 56.41 (0, 201.37) 869.05 (255.68, 3425.15) 15.41
TGFBR3 44.75 (15.37, 88.77) 602.39 (166.03, 1177.34) 13.46
MEPE 1.17 (0, 3.42) 15.08 (5.38, 41.83) 12.86
IL6 403.42 (142.77, 557.98) 4705.22 (1772.24, 10752.01) 11.66
PDGFA 33.55 (3.62, 58.16) 301.62 (185.37, 797.11) 8.99
CCL4 7.05 (4.43, 16.03) 59.97 (47.74, 193.62) 8.5
CCL21 178.02 (3.89, 187.1) 1397.78 (744.39, 2053.74) 7.85
IL13 72.13 ± 93.76 563.96 ± 319.38 7.82
VEGFA 179.04 (114.64, 191.93) 958.14 (344.01, 1518.78) 5.35
CCL2 62.82 (23.56, 87.13) 298.13 (206.28, 776.84) 4.75
MIF 186.63 ± 107.29 823.83 ± 324.6 4.41
GDF15 13.99 (0.61, 21.25) 59.09 (25.8, 892.19) 4.22
PLAU 855.86 ± 614.4 2887.03 ± 1294.71 3.37
ANGPTL4 2733.88 ± 3156.6 8730.48 ± 3478.53 3.19
CTSB 1294.9 (136.7, 2046.52) 3848.03 (3450.95, 9848) 2.97
BSG 271.93 ± 128.8 763.92 ± 252.65 2.81
CCL5 564.6 (393.17, 952.69) 1450.97 (1315.12, 4028.11) 2.57
TPO 439.13 (361.36, 621.12) 1053.65 (902.25, 2053.88) 2.4
IL23 264.05 ± 155.07 604.74 ± 170.89 2.29
IL1RL1 74.18 ± 38.51 168.96 ± 49.02 2.28
SPP1 4965.71 (4097.8, 5558.03) 11205.31 (7999.76, 19980.46) 2.26
F11R 44.97 ± 12.63 85.88 ± 23.08 1.91
INHBA 1940.18 (1342.74, 1995.82) 3607.83 (2127.15, 5991.64) 1.86
FAP 3405.6 ± 498.74 6176.57 ± 1596.01 1.81
LYVE1 1321.54 (1241.35, 1499.62) 1018.88 (511.04, 1227.35) 0.77
FRZB 5472.27 ± 2107.87 2223.38 ± 1456.01 0.41
CCL11 1.77 ± 0.83 0.49 ± 0.57 0.27
C5a 2476.45 (831.23, 4047.13) 285.25 (0, 715.8) 0.12
표 1은 대조군 MSC 유래 엑소좀과 비교해 MSC-NTF 유래 엑소좀에서 유의하게 (p<0.05) 증가 (>1) 또는 감소 (<1)된 단백질 리스트 (단백질 샘플 농도 950 ㎍/ml)를 제공한다 (pg/ml, 데이터 분포의 정규성 (normality)에 따라 평균 ± SD 또는 중앙값 (최소, 최대)). 정규 분포의 경우에는 평균 ± SD를, 정규성이 추정되지 않을 경우에는 중앙값 (최소, 최대)을 나타낸다. 단백질 명칭은 표면 단백질 명명법에 따른다.
결론: MSC 세포로부터 단리된 엑소좀과 비교해, MSC-NTF 세포로부터 고유한 엑소좀 집단을 단리할 수 있다. 이 고유한 엑소좀 집단은 현저하게 다른 단백질 카고 프로파일을 가진다. 이러한 차이로 MSC-NTF 엑소좀은 MSC 엑소좀과는 상이한 엔터티 (different entity) 및 상이한 치료학적 물질이 된다. 흥미롭게도, 비-제한적으로, 신경영양 인자 LIF, GDF15 및 VEGFA 등의, 신경퇴행성 병태를 치료하는데 이로운 것으로 간주되는 후보 단백질들이 증가된 카고 프로파일이 관찰되었다. 이로운 것으로 간주되는 다른 카고 단백질로 CXCL1 및 IL13를 포함하지만, 이로 제한되는 것은 아니다.
실시예 5
파킨슨병에서 MSC - NTF 엑소좀의 보호 효과
파킨슨병 (PD) 동물 모델에서 도파민 뉴런의 기능에 대한 엑소좀의 보호 효과를 조사하기 위해, 외과적으로 전달한 후 3-6주에 유의한 거동 및 도파민성 흑질 선조체 결함을 발생시키기 위해 실험적으로 결정된 PD의 AAV1/2 인간 A53T α 시누클레인 (AAVhA53TaSyn) 랫 모델에서 MSC-NTF 엑소좀을 평가하였다 (Koprich et al, PLoS One, 2011 Mar 7;6(3):e17698).
이 모델은, 랫에서 PD의 도파민성 변성의 원인이 되는 질환 프로세스를 모델링하는 단측 시누클레인 병증 (synucleinopathy)을 유발하기 위해, AAV1/2 유전자 전달 시스템을 채택하여 인간 돌연변이된 A53T-α-시누클레인 (AAV hA53T aSyn)을 전달하였다. 이 모델을 이용해, 흑질 선조체 경로를 통한 α 시누클레인의 과다 발현 및 Lewy-유사 병태를 발생시켰다. 아울러, 이러한 시누클레인 병증은 선조체 도파민 뉴런에서 35-45%, 흑질 도파민 뉴런에서 35-40%로 결함을 발생시켰다. 모델을 확립하기 위해, AAV hA53T aSyn 벡터를 1일 (D1)에 정위 수술 (stereotaxis surgery)에 의해 우측 흑질 (SN)에 단측으로 투여하였다.
생물분포 실험
엑소좀의 생체내 분포를 미리 확인하기 위해, PD의 α 시누클레인 모델에서, MSC-NTF 엑소좀 100 ㎕ (입자 약 109개)를 붕소-다이피로메텐 (BODIPY TR, 1 μM, Invitrogen)으로 37℃에서 20분간 표지하였다. 엑소좀 스핀 컬럼 (MW 3000, Invitrogen)을 사용해 유리 염료를 제거하였다. 엑소좀 염색을 검증하기 위해, SH-SY5Y 세포의 배양액에 염색한 엑소좀을 첨가하여 4시간 두었으며, PBS로 1회 헹구었다. 엑소좀을 첨가하고 24시간 후 Incucyte S3 이미징 시스템을 사용해 이미지를 포착하였다. 대조군 염색은 염료만 사용하고 엑소좀 첨가없이 수행하여, 염료는 엑소좀 스핀 컬럼을 사용해 클리닝하였다. 엑소좀 첨가한지 24시간 후에, 세포 100%에서 강력하고 특이적인 형광 신호가 관찰되었으며, 염료만 사용해 염색한 대조군 세포에서는 관찰되지 않았다.
엑소좀의 생체내 생물분포를 분석하기 위해, BODIPY로 형광 표지된 MSC-NTF 엑소좀을, 엑소좀을 1 ㎕/시간의 속도로 전달하도록 조정된 iPrecio 펌프 (Primetech)에 의해, 랫 α-시누클레인 모델에 3일간 주사하였다 (aSyn 벡터 투여 후 7-10일차). AAV1/2 시술 후 동물 (스프레그-다울리 랫 암컷) 6마리에 MSC-NTF 세포로부터 유래한 염색된 엑소좀을 주사하고, 6마리에는 건강한 동물에서 엑소좀의 생물분포 패턴과 비교하기 위해 AAV1/2 시술하지 않고 엑소좀만 주사하였다. D11에, 엑소좀의 3일 주사 기간을 종료하고 24시간 후에, 동물을 희생시켜 사후 분석과 생물분포 평가를 수행하였다.
대상 뇌 조직 단편을 먼저 표지물질의 존재에 대해 평가하고, 형광 표지물질이 파킨슨병의 랫 α 시누클레인 모델의 뉴런 및/또는 신경교 내에 존재하는 지를 확인하였다.
효능 실험
랫 α 시누클레인 모델에서 엑소좀의 생체내 보호 효과를 4-동물 그룹 실험, 동물 12마리/그룹으로 조사하였다. 대조군 하나에는 1일에 빈 벡터를 주사하고, 그룹 3종에는 AAV hA53T aSyn 함유 벡터를 주사하였다. MSC 및 MSC-NTF 엑소좀 (각각 그룹 3 및 그룹 4)을, 7일 (D7), D22 및 D32에 엑소좀을 각 시점에 1 ㎕/시간의 속도로 연속적으로 3일간 전달하도록 조정된 iPrecio 펌프 (Primetech)에 의해, (i.c.v.) 투여하였다.
수술 전 (베이스라인, D-3) AAV 투여 후 3주차 (D21) 및 AAV 투여 후 6주차 (D42)에 앞다리 비대칭성 (forelimb asymmetry)을 분석하기 위해, 실린더 검사 (cylinder test)로 거동 평가를 수행하였다.
선조체 도파민 및 대사산물 수준 (액체 크로마토그래피-질량 분광측정 LC/MS에 의함), 도파민 트랜스포터 (DAT) 수준 ([11c]RTI-121 자동방사선 촬영에 의함), 총 선조체 인간 (전이유전자-유래) α 시누클레인 발현 (ELISA에 의함) 및 흑질 치밀부 (SNc)에서 티로신 하이드록실라제 양성 (TH+ve) 세포의 수 평가 등의 사후 평가를 위해, D43에 동물을 희생시켰다. 그런 후, 미세아교세포 활성화 평가 및 더블 표지 카운팅 입체분석에 의한 SN에서 TH+/pSer129 aSyn+ 뉴런 : TH+/pSer129aSyn- 뉴런의 비율 확인 등의, 부가적인 파라미터를 평가하였다.
결론: MSC-NTF 엑소좀은, 예를 들어 파킨슨병을 퇴치하는데 치료학적 물질로서 2가지 이상의 이점을 가진다. 첫째, 이는 상당한 신경보호 효과를 가지며, 둘째, 이의 크기로 인해 혈액-뇌 장벽을 쉽게 통과하므로, 이의 투여는 전신성일 수 있으며, 두개내이어야 하는 것은 아니다.
실시예 6
RNA 서열분석에 의한 MSC - NTF 엑소좀의 효과
MSC-NTF 세포의 엑소좀에 의해 뉴런에서 조절되는 유전자 및 경로를 조사하기 위해, iPSC (Stemcell Technologies)로부터 유래된 신경 선조 세포를 14일 동안 뉴런 분화 및 성숙 배지 (Stemcell Technologies Cat#70901)를 이용해 성숙한 뉴론으로 분화시켰다. 15일차에, 엑소좀 (입자 2-4x109개) 또는 PBS가 첨가된 신경영양 인자 고갈 배지로 배지를 교체하였다. 처리한 지 3일 후, 세포로부터 mini RNA 단리 키트 (Zymo Research)를 사용해 총 RNA를 단리하였다. NextSeq500 (Illumina)을 사용해 차세대 서열분석 (NGS)을 수행하였다. 차별적으로 발현되는 유전자 (DEG) 총 3687종이 동정되었다 (p-adj<0.05). 상위 상향 조절되는 유전자 및 상휘 하향 조절되는 유전자를 표 2에 요약 개시한다 (p-adj<0.05)("NA" - 이용불가; "새로운 전사체" - 신규 동정된 전사체). WebGestalt 툴을 사용해 경로 강화 (pathway enrichment)를 DEG 리스트에서 분석하였다. 엑소좀이 세포외 기질 및 부착 단백질을 조절하는데 현저한 효과를 보이는 강화된 KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 경로를 (호모 사피엔스 (인간)에서) 표 3에 요약 개시한다.
표 2: 상위 상향 조절되는 유전자 및 상휘 하향 조절되는 유전자.
PBS 대비 엑소좀에서 상향 조절되는 유전자 유전자 기호 주석
"ENSG00000204711" "C9orf135" 염색체 9 오픈 리딩 프래임 135 [소스: HGNC Symbol;Acc:HGNC:31422]
"ENSG00000134668" "SPOCD1" SPOC 도메인 함유 1 [소스: HGNC Symbol;Acc:HGNC:26338]
"ENSG00000175899" "A2M" α-2-마크로글로불린 [소스: HGNC Symbol;Acc:HGNC:7]
"ENSG00000278910" NA BRAF-활성화된 비-단백질 코딩 RNA [소스: HGNC Symbol;Acc:HGNC:43877]
"ENSG00000131095" "GFAP" 신경교 원섬유성 산성 단백질 [소스: HGNC Symbol;Acc:HGNC:4235]
"ENSG00000102359" "SRPX2" sushi 반복을 함유한 단백질 X-연결된 2 [소스: HGNC Symbol;Acc:HGNC:30668]
"ENSG00000261371" "PECAM1" 혈소판 및 내피 세포 부착 분자 1 [소스: HGNC Symbol;Acc:HGNC:8823]
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"ENSG00000268041" "LOC390937" Ets2 억제 인자-유사 [소스: NCBI gene;Acc:390937]
"ENSG00000099769" "IGFALS" 인슐린 유사 성장인자 결합 단백질 산-민감성 서브유닛 [소스: HGNC Symbol;Acc:HGNC:5468]
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"ENSG00000280229" NA TEC
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"ENSG00000131471" "AOC3" 아민 옥시다제 구리 함유 3 [소스: HGNC Symbol;Acc:HGNC:550]
"ENSG00000260695" NA 새로운 전사체
"ENSG00000255031" NA 새로운 전사체 안티센스 to CHKA
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"ENSG00000169836" "TACR3" 타키키닌 (tachykinin) 수용체 3 [소스: HGNC Symbol;Acc:HGNC:11528]
"ENSG00000260978" NA MKRN3 안티센스 RNA 1
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"ENSG00000270393" NA POM121 막관통 뉴클레오포린 (POM121) 슈도진
"ENSG00000188425" "NANOS2" nanos C2HC-타입 징크 핑거 2 [소스: HGNC Symbol;Acc:HGNC:23292]
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"ENSG00000118729" "CASQ2" 칼세퀘스트린 2(calsequestrin 2) [소스: HGNC Symbol;Acc:HGNC:1513]
"ENSG00000213981" NA 새로운 전사체 안티센스 to MYO3B
"ENSG00000234350" NA 새로운 전사체 (FLJ13453)
"ENSG00000237250" "LOC100130331" POTE 안키린 도메인 패밀리 멤버 F 슈도진 [소스: NCBI gene;Acc:100130331]
"ENSG00000273064" NA 새로운 전사체
"ENSG00000058335" "RASGRF1" Ras 단백질 특이적인 구아닌 뉴클레오티드 분비 인자 1 [소스: HGNC Symbol;Acc:HGNC:9875]
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"ENSG00000174611" "KY" 후측만증 펩티다제 [소스: HGNC Symbol;Acc:HGNC:26576]
"ENSG00000132692" "BCAN" 브레비칸 [소스: HGNC Symbol;Acc:HGNC:23059]
"ENSG00000100060" "MFNG" MFNG O-푸코실펩타이드 3-β-N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 [소스: HGNC Symbol;Acc:HGNC:7038]
"ENSG00000275812" NA SRMS에 대한 새로운 전사체 안티센스
"ENSG00000101203" "COL20A1" 콜라겐 타입 XX α 1 chain [소스: HGNC Symbol;Acc:HGNC:14670]
"ENSG00000143858" "SYT2" 시냅토태그민 2 [소스: HGNC Symbol;Acc:HGNC:11510]
"ENSG00000129757" "CDKN1C" 사이클린 의존적인 키나제 저해제 1C [소스: HGNC Symbol;Acc:HGNC:1786]
"ENSG00000197921" "HES5" hes 패밀리 bHLH 전사 인자 5 [소스: HGNC Symbol;Acc:HGNC:19764]
"ENSG00000154080" "CHST9" 탄수화물 설포트랜스퍼라제 9 [소스: HGNC Symbol;Acc:HGNC:19898]
"ENSG00000170989" "S1PR1" 스핑고신-1-포스페이트 수용체 1 [소스: HGNC Symbol;Acc:HGNC:3165]
"ENSG00000165805" "C12orf50" 염색체 12 오픈 리딩 프래임 50 [소스: HGNC Symbol;Acc:HGNC:26665]
"ENSG00000237941" "KCNQ1DN" KCNQ1 하류 네이버 (downstream neighbor) [소스: HGNC Symbol;Acc:HGNC:13335]
"ENSG00000226476" "LINC01748" 긴 유전자-사이 비-단백질을 코딩하는 RNA 1748 [소스: HGNC Symbol;Acc:HGNC:52535]
"ENSG00000018625" "ATP1A2" ATPase Na+/K+ 수송 서브유닛 α 2 [소스: HGNC Symbol;Acc:HGNC:800]
"ENSG00000198732" "SMOC1" SPARC 관련 모듈러 칼슘 결합성 1 [소스: HGNC Symbol;Acc:HGNC:20318]
"ENSG00000148734" "NPFFR1" 신경펩타이드 FF 수용체 1 [소스: HGNC Symbol;Acc:HGNC:17425]
"ENSG00000173673" "HES3" hes 패밀리 bHLH 전사 인자 3 [소스: HGNC Symbol;Acc:HGNC:26226]
"ENSG00000231827" "LOC343052" 면역글로불린 슈퍼패밀리 DCC 서브클래스 멤버 3 슈도진 [소스: NCBI gene;Acc:343052]
"ENSG00000142494" "SLC47A1" 용질 캐리어 패밀리 47 멤버 1 [소스: HGNC Symbol;Acc:HGNC:25588]
"ENSG00000112238" "PRDM13" PR/SET 도메인 13 [소스: HGNC Symbol;Acc:HGNC:13998]
"ENSG00000184221" "OLIG1" 희소돌기신경교 전사 인자 1 [소스: HGNC Symbol;Acc:HGNC:16983]
"ENSG00000177468" "OLIG3" 희소돌기신경교 전사 인자 3 [소스: HGNC Symbol;Acc:HGNC:18003]
* Ensembl (European Bioinformatics Institute and the Wellcome Trust Sanger Institute) 데이터베이스에 따른 유전자의 Ensembl ID 식별자
표 3: 세포외 기질 및 부착 단백질의 조절에 대한 엑소좀 효과.
ID 명칭 유전자 # FDR
hsa04510 국소 접착 51 1.81E-04
hsa04512 ECM-수용체 상호작용 27 1.81E-04
hsa04115 p53 신호전달 경로 24 1.81E-04
hsa05200 암에서의 경로 83 1.81E-04
hsa04110 세포 주기 35 1.97E-04
hsa05222 소-세포 폐암 25 2.41E-03
hsa05224 유방암 36 2.67E-03
hsa05100 상피 세포의 박테리아 침입 23 2.82E-03
hsa05412 부정맥유발 우심실 심근증 (ARVC) 22 3.12E-03
hsa04151 PI3K-Akt 신호전달 경로 66 8.89E-03
hsa05205 암에서의 프로테오글리칸 44 8.89E-03
hsa04141 소포체에서 단백질 프로세싱 37 1.12E-02
hsa05215 전립선 암 23 1.47E-02
hsa04933 당뇨병 합병증에서 AGE-RAGE 신호전달 경로 25 1.53E-02
hsa04520 접합 정션 (Adherens junction) 20 1.53E-02
hsa04390 Hippo 신호전달 경로 34 1.68E-02
hsa05161 간염 B 32 2.52E-02
hsa01521 EGFR 티로신 키나제 저해제 내성 20 4.24E-02
hsa04210 세포자살 30 4.51E-02
hsa03460 판코니 빈혈 경로 15 4.55E-02
hsa04142 리소좀 27 4.55E-02
결론: MSC-NTF 세포로부터 단리된 엑소좀은 고유한 단백질 카고 프로파일을 가지며, 고유한 유익한 생물학적 특성을 가진다. 이러한 툴은 현재 예를 들어 대상 타겟 세포에서 유전자 발현 수준 및 생물학적 경로의 조절 등의 다양한 용도에서 활용할 수 있다. 이러한 세포 효과는 인간 환자에서 유익한 치료학적 효과를 발휘할 수 있다.
본원의 내용에 대한 일부 특징들이 본원에 예시 및 기술되었지만, 당해 기술 분야의 당업자라면 다수의 수정, 치환, 변화 및 등가를 생각할 수 있을 것이다. 따라서, 첨부된 청구항은 본 발명의 진정한 사상에 포함되는 이러한 모든 수정 및 변화를 포괄하는 것으로 이해되어야 한다.

Claims (36)

  1. 신경영양 인자-분비성 간엽 줄기 세포 (mesenchymal stem cells secreting-neurotrophic factors, MSC-NTF 세포)로부터 유래된 단리된 엑소좀 집단 (isolated exosome population)으로서,
    상기 단리된 엑소좀이, 신경영양 인자 (NTF)를 포함하는 하나 이상의 카고 (cargo) 단백질을, 대조군 MSC으로부터 유래된 단리된 엑소좀 집단 내 상기 하나 이상의 카고 단백질의 양과 비교해, 증가된 양으로 포함하는, 단리된 엑소좀 집단.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 NTF가 백혈병 저해 인자 (leukemia inhibitory factor, LIF) 단백질, 혈관 내피 성장인자 A (vascular endothelial growth factor, VEGFA) 단백질 또는 성장 분화 인자 15 (growth differentiation factor 15, GDF15) 단백질, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는, 단리된 엑소좀 집단.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 하나 이상의 카고 단백질이 NTF 및 하나 이상의 부가적인 단백질을 포함하는, 단리된 엑소좀 집단.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 부가적인 단백질이 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 1 (CXCL1) 단백질 또는 인터루킨 13 (IL13) 단백질 또는 이들의 조합을 포함하는, 단리된 엑소좀 집단.
  5. 제4항에 있어서,
    LIF 단백질의 양이 적어도 50배 증가하거나, 또는 CXCL1 단백질의 양이 적어도 30배 증가하거나, 또는 IL13 단백질의 양이 적어도 5배 증가하거나, 또는 VEGFA의 양이 적어도 5배 증가하거나, 또는 GDF15의 양이 적어도 2배 증가하거나, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는, 단리된 엑소좀 집단.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 부가적인 단백질이 IL36A, CCL7, MMP10, PIFG, CXCL8, LTA, CXCL6, MMP3, CHI3L1, IL11, FGF2, CXCL5, GAS1, JAML, TGFBR3, MEPE, IL6, PDGFA, CCL4, CCL21, CCL2, MIF, PLAU, ANGPTL4, CTSB, BSG, CCL5, TPO, IL23, IL1RL1, SPP1, F11R, INHBA, FAP, SPINT2, IL36G, TNFRSF10B 또는 TNFSF14 단백질, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는, 단리된 엑소좀 집단.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단리된 엑소좀 집단이 분화 클러스터 (CD)9, CD29, CD63, CD81, CD44, CD49, CD73, CD90, CD105, CD61, CD271, ALIX, 종양 감수성 유전자 (TSG)101 및 이들의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 더 포함하거나, 또는 CD3, CD5, CD14, CD19, CD20, CD34, CD45, CD11B, FMC7, 칼넥신 (calnexin), HLA-DR (human leukocyte antigen - antigen D related) 및 이들의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커가 결핍된, 단리된 엑소좀 집단.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    MSC가 골수 MSC, 지방세포 MSC, 치수 MSC, 태반 MSC, 활막 MSC, 말초혈 MSC, 구강 점막 MSC, 치근막 MSC, 자궁내막 MSC, 탯줄 MSC 및 제대혈 MSC로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단리된 엑소좀 집단.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단리된 엑소좀 집단이 간세포 성장인자 (HGF), 과립구 자극 인자 (G-CSF), 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF), 종양 괴사 인자-유발성 유전자 6 단백질 (TSG-6; TNF-자극된 유전자 6 단백질이라고도 함), 골 형태형성 단백질 2 (BMP2) 및 섬유모세포 성장인자 2 (FGF2), 및 이들의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 신경영양 인자 (NTF)를 더 포함하는, 단리된 엑소좀 집단.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단리된 엑소좀 집단이 miRNA (miR)-3663-3p, miR-132-3p, miR-150-3p, miR-762, miR-4327, miR-3665, miR-34a-5p, miR-1915, miR-34a-39, miR-34b-5p, miR-874, miR-4281, miR-1207-5p, miR-30b-5p, miR-29b-3p, miR-199b-5p, miR-30e-5p, miR-26a-5p 및 miR-4324, 및 이들의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA 분자를 더 포함하거나; 또는
    상기 단리된 엑소좀 집단에는 miR-503, miR-3659, miR-3529-3p, miR-320b, miR-1275, miR-3132, miR-320a, miR-495, miR-181b-5p, miR-222-3p, miR-424-5p, miR-4284, miR-574-5p, miR-143-3p, miR-106a-5p, miR-455-3p, miR-20a-5p, miR-145-5p, miR-324-3p, miR-130b-3p, miR-1305 및 miR-140-3p, 및 이들의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA 분자가 결핍되거나; 또는
    이들의 임의 조합을 포함하는, 단리된 엑소좀 집단.
  11. 신경영양 인자-분비성 간엽 줄기 세포 (MSC-NTF 세포)로부터 유래된 단리된 엑소좀 집단; 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물로서,
    상기 단리된 엑소좀이, 대조군 MSC로부터 유래된 단리된 엑소좀 집단 내 하나 이상의 카고 단백질의 양과 비교해, 증가된 양으로 신경영양 인자 (NTF)를 포함하는 하나 이상의 카고 단백질을 포함하는, 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 NTF가 백혈병 저해 인자 (LIF) 단백질, 혈관 내피 성장인자 A (VEGFA) 단백질 또는 성장 분화 인자 15 (GDF15) 단백질, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는, 약학적 조성물.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    상기 하나 이상의 카고 단백질이 NTF 및 하나 이상의 부가적인 단백질을 포함하는, 약학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 부가적인 단백질이 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 1 (CXCL1) 단백질 또는 인터루킨 13 (IL13) 단백질, 또는 이들의 조합을 포함하는, 약학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    LIF 단백질의 양이 적어도 50배 증가하거나, 또는 CXCL1 단백질의 양이 적어도 30배 증가하거나, 또는 IL13 단백질의 양이 적어도 5배 증가하거나, 또는 VEGFA의 양이 적어도 5배 증가하거나, 또는 GDF15의 양이 적어도 2배 증가하거나, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는, 약학적 조성물.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 부가적인 단백질이 IL36A, CCL7, MMP10, PIFG, CXCL8, LTA, CXCL6, MMP3, CHI3L1, IL11, FGF2, CXCL5, GAS1, JAML, TGFBR3, MEPE, IL6, PDGFA, CCL4, CCL21, CCL2, MIF, PLAU, ANGPTL4, CTSB, BSG, CCL5, TPO, IL23, IL1RL1, SPP1, F11R, INHBA, FAP, SPINT2, IL36G, TNFRSF10B 또는 TNFSF14 단백질, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는, 약학적 조성물.
  17. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단리된 엑소좀 집단이 분화 클러스터 (CD)9, CD29, CD63, CD81, CD44, CD49, CD73, CD90, CD105, CD61, CD271, ALIX 및 종양 감수성 유전자 (TSG)101, 및 이들의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 더 포함하거나; 또는
    상기 단리된 엑소좀 집단에는 CD3, CD5, CD14, CD19, CD20, CD34, CD45, CD11B, FMC7, 칼넥신 및 HLA-DR (human leukocyte antigen - antigen D related), 및 이들의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커가 결핍되거나; 또는
    이의 임의 조합을 포함하는, 약학적 조성물.
  18. 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC가 골수 MSC, 지방세포 MSC, 치수 MSC, 태반 MSC, 활막 MSC, 말초혈 MSC, 구강 점막 MSC, 치근막 MSC, 자궁내막 MSC, 탯줄 MSC 및 제대혈 MSC로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약학적 조성물.
  19. 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단리된 엑소좀의 순도가 크기에 따라 95% 이상인, 약학적 조성물.
  20. 신경퇴행성 질환의 치료 방법에 사용하기 위한 약학적 조성물로서,
    상기 약학적 조성물이 신경영양 인자-분비성 간엽 줄기 세포 (MSC-NTF 세포)로부터 유래된 단리된 엑소좀 집단을 포함하고,
    상기 단리된 엑소좀이 신경영양 인자 (NTF)를 포함하는 하나 이상의 카고 단백질을 대조군 MSC로부터 유래된 단리된 엑소좀 집단에서의 하나 이상의 카고 단백질의 양과 비교해 증가된 양으로 포함하는, 약학적 조성물.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 NTF가 백혈병 저해 인자 (LIF) 단백질, 혈관 내피 성장인자 A (VEGFA) 단백질 또는 성장 분화 인자 15 (GDF15) 단백질, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는, 약학적 조성물.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서,
    상기 하나 이상의 카고 단백질이 NTF 및 하나 이상의 부가적인 단백질을 포함하는, 약학적 조성물.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 부가적인 단백질이 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 1 (CXCL1) 단백질 또는 인터루킨 13 (IL13) 단백질, 또는 이들의 조합을 포함하는, 약학적 조성물.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 LIF 단백질의 양이 적어도 50배 증가하거나, 또는 CXCL1 단백질의 양이 적어도 30배 증가하거나, 또는 IL13 단백질의 양이 적어도 5배 증가하거나, 또는 VEGFA의 양이 적어도 5배 증가하거나 또는 GDF15의 양이 적어도 2배 증가하거나, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는, 약학적 조성물.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 부가적인 단백질이 IL36A, CCL7, MMP10, PIFG, CXCL8, LTA, CXCL6, MMP3, CHI3L1, IL11, FGF2, CXCL5, GAS1, JAML, TGFBR3, MEPE, IL6, PDGFA, CCL4, CCL21, CCL2, MIF, PLAU, ANGPTL4, CTSB, BSG, CCL5, TPO, IL23, IL1RL1, SPP1, F11R, INHBA, FAP, SPINT2, IL36G, TNFRSF10B 또는 TNFSF14 단백질, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는, 약학적 조성물.
  26. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단리된, MSC-NTF 세포 유래 엑소좀 집단이 분화 클러스터 (CD)9, CD29, CD63, CD81, CD44, CD49, CD73, CD90, CD105, CD61, CD271, ALIX 및 종양 감수성 유전자 (TSG)101, 및 이들의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 더 포함하거나; 또는
    상기 단리된, MSC-NTF 세포 유래 엑소좀 집단에는 CD3, CD5, CD14, CD19, CD20, CD34, CD45, CD11B, FMC7, 칼넥신, HLA-DR (human leukocyte antigen - antigen D related), 및 이들의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커가 결핍되거나; 또는
    이들의 임의 조합을 포함하는, 약학적 조성물.
  27. 제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MSC가 골수 MSC, 지방세포 MSC, 치수 MSC, 태반 MSC, 활막 MSC, 말초혈 MSC, 구강 점막 MSC, 치근막 MSC, 자궁내막 MSC, 탯줄 MSC 및 제대혈 MSC로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약학적 조성물.
  28. 제20항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 사용이 CD4+ T 세포 증식 감소, T 조절성 (T-reg) 세포 유도, IFN-γ 분비 감소, TNF-α 분비 감소 및 이들의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역조절 효과를 포함하는, 약학적 조성물.
  29. 제20항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 신경퇴행성 질환이 근위축성 측색 경화증 (ALS), 전두측두엽 치매 (FTD), 파킨슨병, 다발 계통 위축 (MSA), 척수근 위축증 (SMA), 다발성 경화증 (MS), 알츠하이머병 (AD), 레트 증후군, 뇌성마비 (CP), 자폐범주성 장애 (ASD) 및 간질로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약학적 조성물.
  30. 하나 이상의 카고 단백질을 증가된 양으로 포함하는 단리된 엑소좀 집단의 제조 방법으로서,
    상기 카고 단백질이 NTF를 포함하고,
    상기 방법이
    (a) 인간 간엽 줄기 세포 (MSC)를 수득하는 단계,
    (b) 부착성 MSC를 단리하는 단계,
    (c) 다이부티릴 사이클릭 아데노신 모노포스페이트, 인간 염기성 섬유모세포 성장인자, 인간 혈소판-유래 성장인자 및 인간 헤레굴린-β1으로 보충된 무혈청성 DMEM 배지에서 상기 부착성 MSC를 배양하는 단계, 및
    (d) 무혈청 DMEM 배지에서 엑소좀 집단을 단리하는 단계
    를 포함하고;
    상기 증가된 양은 미분화된 MSC 유래 단리된 엑소좀 집단에서의 하나 이상의 카고 단백질의 양과 비교되는, 방법.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 MSC가 골수 MSC, 지방세포 MSC, 치수 MSC, 태반 MSC, 활막 MSC, 말초혈 MSC, 구강 점막 MSC, 치근막 MSC, 자궁내막 MSC, 탯줄 MSC 및 제대혈 MSC로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  32. 제31항에 있어서,
    상기 MSC가 골수 MSC, 말초혈 MSC, 탯줄 MSC 또는 제대혈 MSC를 포함하는 경우, 상기 단계 (a)는 골수 또는 혈액 샘플로부터 인간 단핵 세포를 분리하는 것을 포함하고, 상기 단계 (b)는 상기 단핵 집단으로부터 부착성 MSC를 단리하는 것을 포함하고;
    상기 MSC가 지방세포 MSC, 치수 MSC, 태반 MSC, 활막 MSC, 구강 점막 MSC, 치근막 MSC 또는 자궁내막 MSC를 포함하는 경우, 상기 단계 (a)는 조직을 수득하여 조직을 물리적 및 효소적 방법으로 분해하는 것을 포함하고, 단계 (b)는 전체 조직 세포 집단으로부터 부착성 MSC를 단리하는 것을 포함하는, 방법.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (b)가 200 mM L-글루타민, 100 mM 소듐 피루베이트, 2 IU/ml 헤파린 및 10% 혈소판 라이세이트 (platelet lysate)가 첨가된 글루코스 저농도 DMEM 배지에서 부착성 단핵 세포를 배양하는 것을 더 포함하는, 방법.
  34. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (c)에서 상기 무혈청성 DMEM 배지에 1 mM 다이부티릴 사이클릭 아데노신 모노포스페이트, 20 ng/mL 인간 염기성 섬유모세포 성장인자, 5 ng/mL 인간 혈소판-유래 성장인자 및 50 ng/mL 인간 헤레굴린-β1이 첨가되는, 방법.
  35. 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (d)는 단계 (c) 후 3일 경과시 수행되는, 방법.
  36. 신경영양 인자-분비성 간엽 줄기 세포 (MSC-NTF 세포)로부터 유래된 단리된 엑소좀 집단으로서,
    상기 단리된 엑소좀이 하나 이상의 카고 단백질을 대조군 MSC로부터 단리된 엑소좀 집단 내 상기 하나 이상의 카고 단백질의 양과 비교해 증가된 양으로 포함하고,
    상기 카고 단백질이 NTF를 포함하고,
    상기 단리된 엑소좀 집단이 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는, 방법:
    (a) 인간 간엽 줄기 세포 (MSC)를 수득하는 단계,
    (b) 부착성 MSC를 단리하는 단계,
    (c) 다이부티릴 사이클릭 아데노신 모노포스페이트, 인간 염기성 섬유모세포 성장인자, 인간 혈소판-유래 성장인자 및 인간 헤레굴린-β1이 첨가된 무혈청성 DMEM 배지에서 상기 부착성 MSC를 배양하는 단계, 및
    (d) 무혈청 DMEM 배지에서 엑소좀 집단을 단리하는 단계.
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