KR20220131902A - 세포외 소포 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

중간엽 줄기 세포로부터 강한 세포외 소포 집단을 단리시키기 위한 방법이 제공된다. 특히, 본 발명은 MSC-유래된 EV 집단에 대해 특이적인 단백질 프로파일을 확인하였다. 또한, 본원은 만성 또는 급성 폐 질환, 예컨대 폐 고혈압, ARDS를 포함한 다양한 질환 및 병태 및 혈관병증, 감소된 혈관신생, 세포자살, 미토콘드리아 기능장애, 급성 염증, 섬유증, 또는 만성 염증이 특징인 질환 및 병태의 치료에서 단리된 세포외 소포의 용도를 개시한다.

Description

세포외 소포 및 이의 용도
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2019년 12월 4일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/943,555호 및 2020년 4월 1일자로 출원된 제63/003,521호에 대한 우선권을 주장하며, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
사용 분야
본 출원은 엑소좀을 포함하는 세포외 소포, 강한 세포외 소포를 단리, 조작, 또는 합성하는 방법, 및 폐 고혈압, 폐동맥 고혈압(PAH), 및 기관지폐형성이상을 포함하는 급성 및 만성 폐 질환, 및 염증, 감소된 혈관신생, 세포자살, 미토콘드리아 기능장애, 및 혈관병증과 연관된 병태 및 질환의 치료에서 세포외 소포의 용도에 관한 것이다. 본 출원은 추가로 엑소좀을 포함하는 세포외 소포를 사용하여 급성 호흡곤란 증후군(ARDS) 또는 급성 폐 손상(ALI)을 치료 또는 예방하고 섬유증을 치료 또는 예방하는 것에 관한 것이다.
배경
중간엽 줄기 세포(MSC)는, 비제한적으로, 골수, 지방, 골격근, 심장, 탯줄, 및 태반을 포함하는 많은 인간 조직으로부터 단리될 수 있는 세포의 이종 섬유아세포-유사 집단이다. MSC는 조직 손상 부위로 이주 후, 조직 수복 및 재생에서 이들의 분화 가능성 및 활동적 참여로 인해 과학자 및 임상의의 관심을 끌었다. 적절한 신호에 의해 자극되었을 때, MSC는 다수의 특화된 세포 유형, 예컨대 지방세포, 조골세포, 연골세포, 및 덜 빈번하게는 내피세포 및 심근세포로 분화될 수 있다. MSC는 또한 동종이계 이식을 잘 받아들이고 면역특권이 있어, 생체내(in vivo)에서 큰 수용을 제공한다.
또한, MSC는 세포-세포 접촉 및 다양한 시그널링 인자의 생산 둘 다에 의해 매개되는 강한 면역억제 및 면역조절 특성을 보유한다. 중간엽 줄기 세포(MSC)는 염증성 사이토카인을 감지함으로써 염증/손상의 부위를 향해 이주할 수 있다. 이들 세포는 항-염증성 가용성 인자뿐 아니라, 엑소좀을 포함하는 세포외 소포(EV)를 방출함으로써 염증성 환경을 면역조절하는 것으로 가정된다(주변분비 효과). 또한, EV는 이들 자체가 혈관신생을 촉진하고, 세포자살을 예방하고, 염증을 감소시키고, 미토콘드리아 기능을 개선하는 것과 같이 생물학적 활성을 촉진한다.
기관지폐형성이상(BPD)은 미숙아의 만성 폐 질환이다. 이는 연장된 폐 염증, 폐포의 수에서의 감소 및 얇아진 폐포 격막, 원위 혈관의 "축소"를 갖는 비정상적 혈관 성장, 및 제한된 대사 및 항산화제 용량이 특징이다. 미국에서 매년 14,000 개의 새로운 경우의 BPD가 있다. 중요하게는, BPD의 진단은 보통 청소년 동안 PH, 폐기종, 천식, 심혈관 이환율 및 후기-신생아 사망률 증가, 증가된 신경발달 장애 및 뇌성마비, 폐기종을 포함하는 다른 추가 병태를 야기한다. 현재, BPD에 대한 표준 요법은 없다. 일부 BPD 환자는 가벼운 환기요법 및 코르티코스테로이드로 치료되지만, 이들 치료는 신경 결과 또는 사망에 대해 효과를 나타내지 않는다.
폐 고혈압은 폐 혈관구조에서 증가된 압력이 특징인 진행성이고 보통 치명적인 질환이다. 폐 혈관구조의 협착은 우심에 대한 증가된 스트레스를 야기하고, 이는 우측 심부전으로 발달될 수 있다. 현재 표준 하의 정의에 의해, 만성 폐 고혈압의 경우에 평균 폐동맥압(mPAP)은 휴식시 >25 mmHg이거나 운동 동안 >30 mmHg(보통 값 <20 mmHg)이다. 미치료된 폐동맥 고혈압은 평균적으로 진단 후 2.8 내지 5 년 이내에 사망을 야기한다(Keily et al. (2013) BMJ 346:f2028). 폐동맥 고혈압의 병태생리는 폐 혈관의 혈관수축 및 리모델링이 특징이다. 만성 PAH에서, 초기에 비근육화된 폐 혈관의 근육신생이 있고, 이미 근육화된 혈관의 혈관 근육은 원주가 증가한다. 폐동맥압에서의 이 생성된 증가는 우심에 대한 진행성 스트레스를 야기하고, 이는 우심으로부터의 감소된 박출량을 야기하고 결국 우측 심부전으로 끝난다(M. Humbert et al., J. Am. Coll. Cardiol. 2004, 43, 13S-24S).
PAH는 100만명 당 1-2 명의 유병률을 갖는 드문 장애이다. 환자의 평균 연령은 36 세인 것으로 추산되었고, 환자 중 10%만이 60 세를 초과하였다. 뚜렷하게 남성에 비해 여성이 많이 영향을 받는다(G. E. D'Alonzo et al., Ann. Intern. Med. 1991, 115, 343-349).
많은 메커니즘이 PAH의 발병에 연루되었다. 중요하게는, 글로벌 대사의 억제가 이 질환에서 일탈적인 미토콘드리아 글루코오스 산화의 후속에서 기재되어 왔다. 약화된 미토콘드리아 기능은 PAH에서 많은 분명히 관련 없는 이상, 예컨대 다수의 세포 유형의 관여, 폐 혈관 세포의 암-유사 증식, 및 세포자살에 대한 이들 세포의 내성을 통합할 수 있다. PAH에서 미토콘드리아 기능장애의 역할을 지지하는 증거에도 불구하고, 미토콘드리아 기능의 치료적 표적화는 어려운 것으로 입증되었다.
급성 호흡곤란 증후군(ARDS)은 폐의 폐포에서 유체 축적이 특징인 보통-치명적인 병태이다. 유체 축적은 폐의 적절한 산소화를 예방하고 사망을 야기할 수 있다. ARDS는 예를 들어, 감염(바이러스 또는 세균), 패혈증, 산 흡인, 또는 트라우마에 의해 야기될 수 있다. 예를 들어, ARDS의 경우는 패혈증 및 폐렴과 자주 연관된다. 최근에, ARDS는 SARS-CoV-2 감염의 결과로서 COVID-19과 연관된 일차 치명적 병리학으로서 제시되었다. ARDS의 증상은 숨가쁨, 빠른 호흡, 감소된 혈압, 착란, 및/또는 무기력증을 포함한다. ARDS는 최근 매우 적은 치료 옵션을 갖는 병태인 원발성 섬유증을 야기할 수 있다.
ARDS의 치료는 통상적으로 유체 축적으로부터 야기된 산소화의 결여를 해결하는 것을 주로 지원하고 이를 목표로 한다. 따라서, 일반적인 치료는 보충용 산소 및 필요할 때, 기계적 인공호흡을 포함한다. 의학적 돌봄 제공자는 또한 기저 병리학, 예를 들어 감염 또는 손상을 해결할 수 있다.
폐 섬유증은 폐 조직이 손상되거나 상처가 생기는 것이 특징이며, 이는 폐 조직의 정상 기능을 예방한다. 상처는 때때로 특정 손상에 대해 역추적될 수 있으나, 일반적인, 폐 섬유증의 원인이 결정될 수 없을 때, 병태는 특발성 폐 섬유증으로 지칭된다. 증상은 숨가쁨, 피로, 및 마른 기침을 포함한다. 증상의 중증도는 크게 달라지고, 일부 경우에, 특히 진행성 폐 섬유증에서, 병태는 치명적일 수 있다.
따라서, BPD 및 혈관병증, 예컨대 폐 고혈압, 바이러스(예컨대, 코로나바이러스) 또는 세균 감염에 의해 야기된 ARDS 및 폐 섬유증을 포함한 ARDS 및 폐 섬유증을 치료하기 위한 개선된 치료 조성물 및 방법을 개발할 필요성이 존재한다. 특히, 혈관신생 촉진, 세포자살, 염증 예방, 및/또는 환자에서 미토콘드리아 기능 개선을 위한 개선된 효능을 갖는 EV를 개발할 큰 필요성이 있다.
발명의 요약
본 발명은 KRT19, TUBB, TUBB2A, TUBB2B, TUBB2C, TUBB3, TUBB4B, TUBB6, CFL1(HEL-S-15), VIM, EEF1A1, EEF1A1P5, PTI-1, EEF1A1L14, EEFA2, ENPP1, NT5E, HSPA8(HEL-S-72p), RAB10, CD44, MMP2, CD109 및 DKFZp686P132로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 함유하는 단리된 세포외 소포(EV)에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, EV는 CD44, CD109, NT5E, MMP2 및 HSPA8로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 함유한다.
일부 실시양태에서, 단리된 EV는 하나 이상의 단백질을 함유하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 단리된 EV는 세포로부터 얻어진다. 일부 실시양태에서, 세포는 불멸화된 세포주 또는 일차 세포로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 세포는 중간엽 줄기 세포(MSC)이다. 일부 실시양태에서, 세포는 비-MSC이다. 일부 실시양태에서, 비-MSC는 섬유아세포 또는 대식세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, 단리된 EV는 MSC로부터 얻어진 모든 EV에서의 평균 양과 비교하여 하나 이상의 단백질 마커의 증가된 양을 갖는다. 일부 실시양태에서, 단리된 EV는 MSC로부터 얻어진 모든 EV에서의 평균 양과 비교하여 하나 이상의 단백질 마커의 적어도 20% 증가된 양을 함유한다.
일부 실시양태에서, MSC는 와튼 젤리(Wharton's jelly), 제대혈, 태반, 말초 혈액, 골수, 기관지폐포 세척(BAL), 또는 지방 조직으로부터 단리된다.
일부 실시양태에서, 단리된 EV는 시험관내(in vitro)에서 생산된 합성 엑소좀이다.
일부 실시양태에서, 합성 엑소좀은 합성 리포솜이다.
일부 실시양태에서, 단리된 EV는 Syntenin-1, Flotillin-1, CD105, 및/또는 주조직적합성 복합체 클래스 I 중 하나 이상을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 단리된 EV는 테트라스패닌(tetraspanin) 패밀리의 멤버를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 테트라스패닌 패밀리의 멤버는 CD63, CD81 및 CD9를 포함한다.
다른 양태에서, 본발명은 KRT19, TUBB, TUBB2A, TUBB2B, TUBB2C, TUBB3, TUBB4B, TUBB6, CFL1(HEL-S-15), VIM, EEF1A1, EEF1A1P5, PTI-1, EEF1A1L14, EEFA2, ENPP1, NT5E, HSPA8(HEL-S-72p), RAB10, CD44, MMP2, CD109 및 DKFZp686P132로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 발현하도록 EV를 조작하는 단계를 포함하는, 증가된 효능을 갖는 세포외 소포(EV)를 단리시키는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, EV는 CD44, CD109, NT5E, MMP2 및 HSPA8로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 발현한다.
일부 실시양태에서, 조작하는 단계는 하나 이상의 단백질의 증가된 양을 나타내는 EV를 선택하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 조작하는 단계는 하나 이상의 단백질을 함유하도록 EV를 생산하는 세포를 유전적으로 조작하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, EV를 생산하는 세포는 불멸화된 세포주, 일차 세포, 중간엽 줄기 세포(MSC), 섬유아세포 또는 대식세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, 조작하는 단계는 하나 이상의 단백질을 함유하는 합성 EV를 시험관내에서 생산하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 단리된 EV는 약 100 nm의 평균 직경을 갖는다.
일부 실시양태에서, 단리된 EV 중 적어도 70%는 50 nm 내지 350 nm의 크기를 갖는다.
일부 실시양태에서, 단리된 EV는 Syntenin-1, Flotillin-1, CD105 및/또는 주조직적합성 복합체 클래스 I을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 단리된 EV는 테트라스패닌 패밀리의 멤버를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 테트라스패닌 패밀리의 멤버는 CD63, CD81 및 CD9를 포함한다.
일부 실시양태에서, EV의 증가된 효능은 증가된 피루베이트 키나아제 활성을 포함한다.
일부 실시양태에서, EV의 증가된 효능은 증가된 ATPase 활성을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 폐 질환 치료를 필요로 하는 대상체에 중간엽 기질 세포로부터 얻어진 단리된 세포외 소포(EV)를 투여하는 단계를 포함하고, 이때 단리된 세포외 소포가 KRT19, TUBB, TUBB2A, TUBB2B, TUBB2C, TUBB3, TUBB4B, TUBB6, CFL1(HEL-S-15), VIM, EEF1A1, EEF1A1P5, PTI-1, EEF1A1L14, EEFA2, ENPP1, NT5E, HSPA8(HEL-S-72p), RAB10, CD44, MMP2, CD109 및 DKFZp686P132로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 증가된 양을 갖는 세포외 소포를 포함하는 것인, 폐 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, EV는 CD44, CD109, NT5E, MMP2 및 HSPA8로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 발현한다.
일부 실시양태에서, 폐 질환은 만성 폐 질환 또는 급성 폐 질환을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폐 질환은 기관지폐형성이상이다.
다른 양태에서, 본 발명은 감소된 혈관신생, 급성 염증, 만성 염증, 세포자살, 미토콘드리아 기능장애, 또는 혈관병증과 연관된 질환 또는 병태 치료를 필요로 하는 대상체에 중간엽 기질 세포로부터 얻어진 단리된 세포외 소포를 투여하는 단계를 포함하고, 이때 단리된 세포외 소포가 KRT19, TUBB, TUBB2A, TUBB2B, TUBB2C, TUBB3, TUBB4B, TUBB6, CFL1(HEL-S-15), VIM, EEF1A1, EEF1A1P5, PTI-1, EEF1A1L14, EEFA2, ENPP1, NT5E, HSPA8(HEL-S-72p), RAB10, CD44, MMP2, CD109, 및 DKFZp686P132로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 중 하나 이상의 증가된 발현을 갖는 세포외 소포를 포함하는 것인, 혈관신생, 급성 염증, 만성 염증, 세포자살, 미토콘드리아 기능장애, 또는 혈관병증과 연관된 질환 또는 병태를 치료하는 방법에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, EV는 CD44, CD109, NT5E 및 HSPA8로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단리된 세포외 소포는 대상체의 폐 조직에서 글루코오스 산화를 정상화한다.
일부 실시양태에서, 미토콘드리아 기능장애와 연관된 질환 또는 병태는 대상체에서 감소된 미토콘드리아 글루코오스 산화와 연관된다.
일부 실시양태에서, 미토콘드리아 기능장애와 연관된 질환 또는 병태는 프리드리히 실조(Friedreich's ataxia), 레베르 유전성 시신경병증(Leber's Hereditary Optic Neuropathy), 컨스-세이어 증후군(Kearns-Sayre Syndrome), 젖산 산증 및 뇌졸중양 증상을 갖는 미토콘드리아 뇌근병증, 리 증후군(Leigh syndrome), 비만, 죽상경화증, 근위축성 측삭 경화증, 파킨슨병(Parkinson's Disease), 암, 심부전, 심근경색증(MI), 알츠하이머병(Alzheimer's Disease), 헌팅턴병(Huntington's Disease), 조현병, 양극성 장애, 취약 X 증후군 및 만성 피로 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 양태에서, 본 발명은 골수 중간엽 줄기 세포(MSC)로부터 단리된 세포외 소포(EV)를 포함하고, EV가 (i) EV 내에 세포소기관 또는 세포소기관 단편이 실질적으로 없고; (ii) 지질, 단백질, 핵산, 및 세포 대사물질을 포함하고; (iii) 200-300 nm의 가중 평균 직경을 갖고; (iv) KRT19, TUBB, TUBB2A, TUBB2B, TUBB2C, TUBB3, TUBB4B, TUBB6, CFL1(HEL-S-15), 및 VIM으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 발현하는, 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, EV는 EEF1A1, EEF1A1P5, PTI-1, EEF1A1L14, 및 EEFA2로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 추가로 발현한다. 일부 실시양태에서, EV는 ENPP1 및 NT5E로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 추가로 발현한다. 일부 실시양태에서, EV는 HSPA8을 추가로 발현한다. 일부 실시양태에서, EV는 CD44를 추가로 발현한다. 일부 실시양태에서, EV는 MMP2를 추가로 발현한다. 일부 실시양태에서, EV는 CD109를 추가로 발현한다.
다른 양태에서, 본 발명은 골수 중간엽 줄기 세포(MSC)로부터 단리된 세포외 소포(EV)를 포함하고, EV가 (i) EV 내에 세포소기관 또는 세포소기관 단편이 실질적으로 없고; (ii) 지질, 단백질, 핵산, 및 세포 대사물질을 포함하고; (iii) 200-300 nm의 가중 평균 직경을 갖고; (iv) KRT19, TUBB, TUBB2A, TUBB2B, TUBB2C, TUBB3, TUBB4B, TUBB6, CFL1(HEL-S-15), VIM, EEF1A1, EEF1A1P5, PTI-1, EEF1A1L14, EEFA2, ENPP1, NT5E, SPA8(HEL-S-72p), RAB10, CD44, MMP2, CD109, 및 DKFZp686P132로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 발현하는, 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, EV는 CD44, CD109, NT5E, MMP2 및 HSPA8로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 상기 실시양태 중 임의의 것의 단리된 세포외 소포(EV)의 유효 용량을 급성 호흡곤란 증후군(ARDS) 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 급성 호흡곤란 증후군(ARDS)을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 단리된 EV는 KRT19, TUBB, TUBB2A, TUBB2B, TUBB2C, TUBB3, TUBB4B, TUBB6, CFL1(HEL-S-15), VIM, EEF1A1, EEF1A1P5, PTI-1, EEF1A1L14, EEFA2, ENPP1, NT5E, HSPA8(HEL-S-72p), RAB10, CD44, MMP2, CD109 및 DKFZp686P132로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 발현한다.
일부 실시양태에서, 방법은 감염, 패혈증, 산 흡인 또는 트라우마로부터 야기된 ARDS를 치료한다. 일부 실시양태에서, 감염은 바이러스 감염 또는 세균 감염이다. 일부 실시양태에서, 감염은 코로나바이러스에 의해 야기된다. 일부 실시양태에서, 코로나바이러스는 인간 코로나바이러스 229E, 인간 코로나바이러스 OC43, SARS-CoV, HCoV NL63, HKU1, MERS-CoV, 또는 SARS-CoV-2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폐 섬유증은 SARS-CoV-2 감염의 결과이다.
일부 실시양태에서, 방법은 COVID-19로부터 야기된 ARDS를 치료한다.
일부 실시양태에서, 방법은 ARDS를 예방하거나 이의 중증도를 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 대상체는 ALI 또는 ARDS 발달 위험이 있다.
일부 실시양태에서, 단리된 EV는 비경구적으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 단리된 EV의 유효 용량은 EV의 인지질 약 20 내지 약 500 pmol/치료되는 대상체의 kg이다.
일부 실시양태에서, 방법은 포스포디에스테라아제 5-형(PDE5) 억제제, 프로스타사이클린 작용제, 또는 엔도텔린 수용체 길항제 중 하나 이상을 포함하는 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, PDE5 억제제는 실데나필, 바르데나필, 자프라비스트, 운데나필, 다산타필, 아바나필, 미로데나필 또는 로데나필을 포함한다.
일부 실시양태에서, PDE5 억제제는 실데나필이다.
일부 실시양태에서, 프로스타사이클린 작용제는 에포프로스테놀 소듐, 트레프로스티닐, 베라프로스트, 일프로스트 및 PGI2 수용체 작용제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 단리된 EV 및 포스포디에스테라아제 5-형(PDE5) 억제제는 별도 조성물로, 동시에 또는 순차적으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 단리된 EV 및 포스포디에스테라아제 5-형(PDE5) 억제제는 동일한 조성물로 투여된다.
일부 실시양태에서, 단리된 EV는 1 회 이상의 용량으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 단리된 EV는 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 4 일, 5, 일, 6 일 또는 주 당 1 회의 간격으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 단리된 EV는 2 회 용량, 3 회 용량, 4, 회 용량, 5 회 용량, 6 회 용량, 7 회 용량, 8 회 용량, 9 회 용량, 12 회 용량, 15 회 용량 또는 18 회 용량으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 단리된 EV 및 치료제는 동일한 조성물로 투여된다. 일부 실시양태에서, 단리된 EV 및 PDE5 억제제는 1 회 이상의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 단리된 EV 및 프로스타사이클린 작용제는 1 회 이상의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 단리된 EV 및 엔도텔린 수용체 작용제는 1 회 이상의 용량으로 투여된다. 용량은 동시에 또는 시간이 분리되어 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 단리된 EV 및 치료제는 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 4 일, 5, 일, 6 일 또는 주 당 1 회의 간격으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 단리된 EV 및 PDE5 억제제는 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 4 일, 5, 일, 6 일 또는 주 당 1 회의 간격으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 단리된 EV 및 프로스타사이클린 작용제는 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 4 일, 5, 일, 6 일 또는 주 당 1 회의 간격으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 단리된 EV 및 엔도텔린 수용체는 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 4 일, 5, 일, 6 일 또는 주 당 1 회의 간격으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 단리된 EV는 2 회 용량, 3 회 용량, 4, 회 용량, 5 회 용량, 6 회 용량, 7 회 용량, 8 회 용량, 9 회 용량, 12 회 용량, 15 회 용량 또는 18 회 용량으로 투여되고, PDE5 억제제는 16 회 용량, 19 회 용량, 21 회 용량, 24 회 용량, 27 회 용량, 30 회 용량, 33 회 용량, 36 회 용량, 39 회 용량, 42 회 용량, 45 회 용량, 48 회 용량, 51 회 용량, 54 회 용량, 57 회 용량, 60 회 용량, 63 회 용량 또는 66 회 용량으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 단리된 EV는 2 일 동안, 3 일 동안, 4 일 동안, 5 일 동안, 6 일 동안 또는 1 주일 동안 매일 1 회 투여된다.
일부 실시양태에서, 방법은 대상체에서 심장수축 폐동맥압(SPAP)을 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 방법은 대상체에서 폐의 폐포 표면적을 증가시키고/시키거나 폐포 손상을 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 방법은 대상체에서 혈액 산소의 농도를 증가시킨다.
일부 실시양태에서, 방법은 대상체에서 폐에서의 염증을 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 방법은 기관지폐포 세척액에서 세포외 기질의 침착을 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 방법은 풀톤 지수(Fulton's index) 또는 폐 혈관 리모델링을 개선한다.
일부 실시양태에서, 대상체는 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 소, 양, 말, 토끼, 마우스 또는 래트이다.
다른 양태에서, 본 발명은 폐 섬유증 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에 단리된 세포외 소포(EV)의 유효 용량을 투여하는 단계를 포함하고, 이때 단리된 EV가 KRT19, TUBB, TUBB2A, TUBB2B, TUBB2C, TUBB3, TUBB4B, TUBB6, CFL1(HEL-S-15), VIM, EEF1A1, EEF1A1P5, PTI-1, EEF1A1L14, EEFA2, ENPP1, NT5E, HSPA8(HEL-S-72p), RAB10, CD44, MMP2, CD109 및 DKFZp686P132로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 함유하는 것인, 폐 섬유증을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 폐 섬유증은 특발성 폐 섬유증이다.
일부 실시양태에서, 폐 섬유증은 감염의 결과이다. 일부 실시양태에서, 감염은 코로나바이러스에 의해 야기된다. 일부 실시양태에서, 코로나바이러스는 인간 코로나바이러스 229E, 인간 코로나바이러스 OC43, SARS-CoV, HCoV NL63, HKU1, MERS-CoV, 또는 SARS-CoV-2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폐 섬유증은 SARS-CoV-2 감염의 결과이다.
일부 실시양태에서, 방법은 폐 섬유증 발달 위험이 있는 환자에 EV를 투여하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 호흡기 질환 또는 장애 치료를 필요로 하는 대상체에 단리된 세포외 소포(EV) 및 포스포디에스테라아제 5-형(PDE5) 억제제의 유효 용량을 투여하는 단계를 포함하고, 이때 단리된 EV가 KRT19, TUBB, TUBB2A, TUBB2B, TUBB2C, TUBB3, TUBB4B, TUBB6, CFL1(HEL-S-15), VIM, EEF1A1, EEF1A1P5, PTI-1, EEF1A1L14, EEFA2, ENPP1, NT5E, HSPA8(HEL-S-72p), RAB10, CD44, MMP2, CD109 및 DKFZp686P132로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 함유하는 것인, 호흡기 질환 또는 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 호흡기 질환 또는 장애는 급성 호흡곤란 증후군(ADRS), 급성 폐 질환, 급성 폐 손상(ALI), 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환, 낭성 섬유증, 폐렴, 폐 섬유증, 급성 폐 손상, 기관지염, 폐기종, 폐쇄세기관지염, 또는 기관지폐형성이상(BPD)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 COVID-19로부터 야기된 호흡기 질환 또는 장애를 치료 또는 예방한다.
일부 실시양태에서, 폐 섬유증은 특발성 폐 섬유증이다.
일부 실시양태에서, 호흡기 질환 또는 장애는 감염의 결과이다.
일부 실시양태에서, 호흡기 질환 또는 장애는 SARS-CoV-2 감염의 결과이다.
일부 실시양태에서, 방법은 호흡기 질환 또는 장애 발달 위험이 있는 환자에 EV를 투여하는 단계를 포함한다.
도면의 간단한 설명
제공된 도면은, 비제한적으로, 개시된 주제를 예시한다.
도 1은 골수 중간엽 줄기 세포(MSC)의 세포 배양 상청액으로부터의 UNEX-42 발달 등급 세포외 소포(EV)의 단리를 나타낸다. 도 1a는 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 정제 단계 동안 생성된 UNEX-42 EV 및 100 nm(Phosphorex™, 4002) 및 200 nm(Phosphorex™, 2202)의 직경을 갖는 기준 폴리스티렌 비드의 크로마토그래피 프로파일을 나타낸다. 도 1b는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 단리된 상이한 EV 집단의 크로마토그래피 프로파일을 나타낸다.
도 2는 나노입자 추적 분석(NTA)에 의해 생성된 UNEX-42 EV의 UNEX18-015 배치(batch)로부터의 대표적인 크기 분포를 나타낸다.
도 3은 UNEX-42 EV 배치의 인지질 함량이 입자 계수에 비례한다는 것을 나타내는 그래프이다.
도 4는 UPLC-MS/MS 질량 분석법에 의해 생성된 UNEX-42 EV 발달-등급 배치의 단백질체 프로파일링을 나타낸다. 도 4a는 질량 분석법 결과의 열 지도 분석을 나타낸다. 도 4b는 UNEX-42 EV 특이적 단백질을 결정하기 위한 모든 UNEX-42 EV 배치 중에서 일반적인 것으로 밝혀진 142 개 서열과 섬유아세포-유래된 EV에 존재하는 단백질의 비교를 나타낸다.
도 5는 UNEX-42 EV 배치에서 테트라스패닌-양성 입자의 빈도를 도시하는 히스토그램을 나타낸다.
도 6은 UNEX-42 EV의 예시적 구조적 도식을 나타낸다.
도 7은 UNEX-42 EV가 고산소 노출 후 시토크롬 C 방출 및 세포 사멸을 예방한다는 것을 나타낸다. PBS는 인산염 완충 생리식염수에 대한 약자이다. * p<0.05는 정상산소 처치와 비교한 고산소를 나타낸다. # p<0.05는 고산소와 비교한 고산소 + UNEX-42 처치를 나타낸다.
도 8은 UNEX-42 EV가 시험관내에서 미세혈관 네트워크 형성을 촉진한다는 것을 나타낸다. PBS는 인산염 완충 생리식염수에 대한 약자이다. * p<0.05는 정상산소 및 UNEX-42 처치와 비교한 정상산소를 나타낸다.
도 9는 UNEX-42 EV가 고산소 노출 후 HPEAC 네트워크 저하를 예방한다는 것을 나타낸다. * p<0.05는 정상산소 처치와 비교한 고산소를 나타낸다. # p<0.05는 고산소와 비교한 고산소 및 UNEX-42 처치를 나타낸다.
도 10은 UNEX-42 EV가 고산소 노출 후 MMP-2 분비 및 활성을 보존한다는 것을 나타낸다. MMP2는 기질 금속단백질분해효소 2의 약자이다. * p<0.05는 정상산소 처치와 비교한 고산소를 나타낸다. # p<0.05는 고산소와 비교한 고산소 + UNEX-42 처치를 나타낸다.
도 11은 UNEX-42 EV가 산소 소비 및 글루코오스 흡수를 증가시키고 락테이트 축적을 감소시킨다는 것을 나타낸다. FCCP는 카보닐 사이아나이드 p-트리플루오로메톡시페닐하이드라존에 대한 약자이고; Gluc는 글루코오스에 대한 약자이고; H는 정상산소/저산소의 비이고; H+E는 저산소 + UNEX-42/저산소의 비이고; Lac는 락테이트의 약자이고; OCR은 산소 소비율에 대한 약자이고; Pyr은 피루베이트에 대한 약자이고; Rot-AA는 로테논/안티마이신 A에 대한 약자이다. a는 정상산소 처치와 비교한 저산소, p<0.05를 나타낸다. b는 저산소와 비교한 저산소 + UNEX-42 처치, p<0.05를 나타낸다.
도 12는 UNEX-42 EV가 종양 괴사 인자 알파의 고산소-유도된 분비를 억제한다는 것을 나타낸다. PBS는 인산염 완충 생리식염수에 대한 약자이고; TNFa는 종양 괴사 인자 알파에 대한 약자이다. * p<0.05는 정상산소 처치 와 비교한 고산소를 나타낸다. # p<0.05는 고산소와 비교한 고산소 + UNEX-42 처치를 나타낸다.
도 13은 UNEX-42 EV가 LPS-유도된 종양 괴사 인자 알파(TNFα)를 억제한다는 것을 나타낸다. 도 13a는 UNEX-42 농도의 함수로서 TNFα 억제를 도시하는 그래프를 나타낸다. 도 13b는 LPS 처치시 TNFα 분비를 나타내는 히스토그램이다. LPS는 지질다당류에 대한 약자이고; TNFα는 종양 괴사 인자 알파에 대한 약자이다. *p<0.05는 정상산소 처치와 비교한 고산소를 나타낸다. #p<0.05는 고산소 + UNEX-42 처치를 나타낸다.
도 14는 고산소 노출 후 BAL에서의 총 세포 계수를 도시하는 그래프를 나타낸다. UNEX-42는 고산소 후 BAL에서 총 세포 계수를 감소시키는 경향이 있다. BAL은 기관지폐포 세척액에 대한 약자이다. * p<0.05는 정상산소 처치와 비교한 고산소를 나타낸다.
도 15는 UNEX-42 EV가 고산소 노출 10 일 후 풀톤 지수를 개선한다는 것을 나타낸다. * p<0.05는 정상산소 처치와 비교한 고산소를 나타낸다. # p<0.05는 고산소와 비교한 고산소 + UNEX-42 처치를 나타낸다.
도 16은 UNEX-42 EV가 고산소 노출 후 폐 조직학을 개선한다는 것을 나타낸다.
도 17은 UNEX-42 EV가 고산소 노출 후 MLI를 개선한다는 것을 나타낸다. MLI는 평균 선형 절편에 대한 약자이다. * p<0.05는 정상산소 처치와 비교한 고산소를 나타낸다. # p<0.05는 고산소와 비교한 고산소 + UNEX-42 처치를 나타낸다.
도 18은 UNEX-42 EV가 고산소 노출 후 일회 호흡량을 개선한다는 것을 나타낸다. TVb는 일회 호흡량에 대한 약자이다. * p<0.05는 정상산소 처치와 비교한 고산소를 나타낸다. # p<0.05는 고산소와 비교한 고산소 + UNEX-42 처치를 나타낸다.
도 19는 심장수축 폐동맥압(SPAP)에 대한 UNEX-42 EV 및 실데나필의 효과를 나타낸다. SPAP를 세막시닙/저산소 래트 모델에서 측정하였다. G1은 DMSO 질환 대조군을 나타낸다. G2-G7은 세막시닙 및 저산소에 노출된 래트의 그룹을 나타낸다. G3은 실데나필 처치를 나타낸다. G4-G6은 UNEX-42 EV의 나타낸 투여량으로 처치된 그룹을 나타낸다. G7은 UNEX-42 EV 및 실데나필의 조합 처치를 나타낸다.
도 20은 심장수축 폐동맥압(SPAP)에 대한 UNEX-42 EV 및 실데나필의 효과를 나타낸다. SPAP를 세막시닙/저산소 래트 모델에서 측정하였다. G1은 DMSO 질환 대조군을 나타낸다. G2-G7은 세막시닙 및 저산소에 노출된 래트의 그룹을 나타낸다. G3은 실데나필 처치를 나타낸다. G4-G6은 나타낸 바와 같은 UNEX-42 EV의 다양한 용량을 갖는 UNEX-42 EV 및 실데나필의 조합으로 처치된 그룹을 나타낸다. G7은 나타낸 투여량의 UNEX42 EV만으로 처치된 그룹을 나타낸다.
도 21은 UNEX-42 EV가 고산소 노출 후 MLI를 개선하고(a) 고산소 후 혈액 산소 수준을 증가시켰다(b)는 것을 나타낸다. MLI는 평균 선형 절편에 대한 약자이다.
도 22는 UNEX-42 EV가 특발성 폐 섬유증(IPF)에 대한 블레오마이신(Bleo) 모델에서 기관지폐포 세척(BAL)을 침투하는 면역 세포의 수를 감소시킨다는 것을 나타낸다.
도 23은 UNEX-42 EV가 폐 섬유증에 대한 실리카 모델에서 기관지폐포 세척액(BALF)을 침투하는 세포의 총 수(a) 및 대식세포, 림프구, 및 호중구의 수(b)를 감소시킨다는 것을 나타낸다.
도 24는 UNEX-42 EV가 TNFa의 고산소-유도된 분비(a), 고산소-유도된 IL6의 분비(b), 및 고산소-유도된 IL3의 분비(c)를 억제한다는 것을 나타낸다.
도 25는 UNEX-42 EV가 LPS-유도된 케모카인(C-X-C 모티프) 리간드 1(GRO)을 약화시킨다는 것을 나타낸다.
도 26은 UNEX-42 EV가 LPS-유도된 케모카인(C-C 모티프) 리간드 21(6CKine)을 약화시킨다는 것을 나타낸다.
도 27은 UNEX-42 EV가 LPS-유도된 과립구 주화성 단백질 2(GCP2)를 약화시킨다는 것을 나타낸다.
도 28은 UNEX-42 EV가 LPS-유도된 케모카인(C-X-C 모티프) 리간드 16(CXCL16)을 약화시킨다는 것을 나타낸다.
도 29는 UNEX-42 EV가 마우스 단핵구에서 LPS-유도된 TNFa 분비를 억제한다는 것을 나타낸다.
도 30은 UNEX-42 EV가 래트 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 LPS-유도된 TNFa 및 케모카인(C-X-C 모티프) 리간드 1(GRO) 분비를 억제한다는 것을 나타낸다.
도 31은 UNEX-42 EV가 인간 THP1 단핵구에서 인터류킨 1 베타(IL1β)(a) 및 인터류킨 12 베타(IL12β)(b)의 LPS-유도된 mRNA 발현을 약화시켰다는 것을 나타낸다. 도 31(c)는 UNEX-42 EV가 전-염증성 사이토카인 대식세포 염증성 단백질 1 알파(MIP1α) 및 베타(MIP1β)의 분비를 약화시켰다는 것을 나타낸다.
도 32는 UNEX-42(19-017) EV가 고산소 노출 후 MLI를 개선한다는 것을 나타낸다. MLI는 평균 선형 절편에 대한 약자이다. UNEX-42 EV를 125 nM 인지질의 용량으로 투여하였다.
도 33은 UNEX-42 EV 처치가 항-염증성 CD206 mRNA(a) 및 IL10 mRNA(b)의 발현을 유도한다는 것을 나타낸다.
도 34는 UNEX-42 EV 처치가 특발성 폐 섬유증(IPF)에 대한 블레오마이신(Bleo) 모델에서 기관지폐포 세척(BAL) 중 총 세포 계수(a) 및 대식세포, 림프구, 및 호중구의 수(b)를 개선한다는 것을 나타낸다.
도 35는 UNEX-42 EV 처치가 특발성 폐 섬유증(IPF)에 대한 블레오마이신(Bleo) 모델에서 기관지폐포 세척(BAL) 중 가용성 콜라겐을 감소시켰다는 것을 나타낸다.
도 36은 UNEX-42 EV 처치가 고산소 노출 8 일 후 풀톤 지수를 개선한다는 것을 나타낸다.
상세한 설명
중간엽 줄기 세포(MSC)로부터의 세포외 소포(EV)는 다수의 잠재적으로 유익한 생리학적 효과를 가질 수 있다. 구체적으로, EV는 글루코오스 산화를 향상시키고 미토콘드리아 기능을 정상화할 수 있다. 폐 생리학의 맥락에서, EV는 심장수축 폐동맥압(SPAP)을 감소시키고, 폐포 표면적을 증가시키고, 혈액 산소를 증가시키고, 세포외 기질 단백질의 침착을 감소시키고, 풀톤 지수를 개선하고, 대상체의 폐에서 염증을 감소시킬 수 있다. 따라서, 이들 세포외 소포는 폐동맥 고혈압(PAH), 호흡곤란 질환 또는 병태, 예컨대 ARDS 및 폐 섬유증, 및 미토콘드리아 기능장애와 연관된 질환 또는 병태에서 치료적 이득을 부여할 수 있다. 본 발명은 EV, EV를 얻는 방법, 및 이들 EV를 사용하여 호흡곤란 질환 또는 병태, 예컨대 COVID-19 또는 SARS-CoV 또는 관련된 코로나바이러스 감염과 연관된 ARDS 및 폐 섬유증을 포함한 ARDS 및 폐 섬유증, 및 다양한 다른 질환 및 병태를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 본 발명은 특발성 폐 섬유증을 치료 또는 예방하기 위한 방법을 제공한다.
특히, 본 발명자들은 MSC로부터 EV를 조작하고 단리시키고 EV로부터 유래된 EV의 단백질체 분석을 수행하여, EV의 구조를 설명하고 효능에 영향을 주는 구성요소를 확인하였다. MSC로부터 유래된 EV에 차등적으로 함유된 단백질의 확인은 EV로부터 유래된 이들 세포를 모방할 수 있는 생물학적으로-조작된 EV 또는 합성 EV의 생산을 가능하게 한다.
MSC로부터 유래된 EV에 차등적으로 함유된 단백질은 하나 이상의 세포골격 단백질, 하나 이상의 유전자 전사/번역 관련 단백질, 하나 이상의 뉴클레아제 또는 뉴클레오티다아제, 하나 이상의 열충격 단백질, 하나 이상의 소포 수송 관련 단백질, 하나 이상의 세포외 기질(ECM) 관련 단백질, 하나 이상의 단백질분해 관련 단백질, 및 하나 이상의 세포 시그널링 단백질을 포함할 수 있다. 실시예 1.4에서 표 3을 참고한다. 특히, MSC-유래된 EV 및 엑소좀에 차등적으로 함유된 것으로 확인된 하나 이상의 세포골격 단백질은 케라틴 I 형 세포골격 19(KRT19), 튜불린 베타 사슬(TUBB), 튜불린 베타 사슬 2A(TUBB2A), 튜불린 베타 사슬(TUBB2B), 튜불린 베타 사슬 2C(TUBB2C), 튜불린 베타 사슬 3(TUBB3), 튜불린 베타 사슬 4B(TUBB4B), 튜불린 베타 사슬 6(TUBB6), 코필린 1(CFL1 또는 HEL-S-15), 및 비멘틴(VIM)을 포함한다. MSC-유래된 EV 및 엑소좀에 차등적으로 함유된 것으로 확인된 하나 이상의 유전자 전사 관련 단백질은 진핵생물 신장 인자 1(EEF1A1), 진핵생물 신장 인자 1 알파 위유전자 5(EEF1A1P5), 전립선 종양 유발 1(PTI-1), 진핵생물 신장 인자 1 알파 1-유사 14(EEF1A1L14), 및 진핵생물 신장 인자 알파 2(EEFA2)를 포함한다. MSC-유래된 EV 및 엑소좀에 차등적으로 함유된 것으로 확인된 하나 이상의 뉴클레아제는 엑토뉴클레오티드 피로포스파타아제/포스포디에스테라아제 1(ENPP1), 및 5'-뉴클레오티다아제 엑토(NT5E)를 포함한다. MSC-유래된 EV 및 엑소좀에 차등적으로 함유된 것으로 확인된 다른 단백질은 열충격 단백질 A8(HSPA8 또는 HEL-S-72p 또는 Hsc70), RAB10(소포 수송에 관련된 작은 GTPase 단백질), CD44(히알루로난과 같은 세포외 기질 구성요소와 상호작용하는 세포 표면 부착 수용체), 기질 금속단백질분해효소 2(MMP2), CD109(TGF-베타 수용체 시그널링의 억제제), 및 알려지지 않은 단백질 DKFZp686P132를 포함한다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명은 KRT19, TUBB, TUBB2A, TUBB2B, TUBB2C, TUBB3, TUBB4B, TUBB6, CFL1(HEL-S-15), VIM, EEF1A1, EEF1A1P5, PTI-1, EEF1A1L14, EEFA2, ENPP1, NT5E, HSPA8(HEL-S-72p), RAB10, CD44, MMP2, CD109, 및 DKFZp686P132로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 함유하는, 단리된 EV를 제공한다. 일부 바람직한 실시양태에서, EV는 CD44, CD109, NT5E, 및 HSPA8로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 함유한다.
다른 양태에서, 본 발명은 골수 중간엽 줄기 세포(MSC)로부터 단리된 세포외 소포(EV)를 포함하고, EV가 (i) EV 내에 세포소기관 또는 세포소기관 단편이 실질적으로 없고; (ii) 지질, 단백질, 핵산, 및 세포 대사물질을 포함하고; (iii) 200-300 nm의 가중 평균 직경을 갖고; (iv) KRT19, TUBB, TUBB2A, TUBB2B, TUBB2C, TUBB3, TUBB4B, TUBB6, CFL1(HEL-S-15), 및 VIM으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 함유하는, 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, EV는 EEF1A1, EEF1A1P5, PTI-1, EEF1A1L14, 및 EEFA2로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 추가로 함유한다. 일부 실시양태에서, EV는 ENPP1 및 NT5E로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 추가로 함유한다. 일부 실시양태에서, EV는 HSPA8을 추가로 함유한다. 일부 실시양태에서, EV는 CD44를 추가로 함유한다. 일부 실시양태에서, EV는 MMP2를 추가로 함유한다. 일부 실시양태에서, EV는 CD109를 추가로 함유한다.
다른 양태에서, 본 발명은 골수 중간엽 줄기 세포(MSC)로부터 단리된 세포외 소포(EV)를 포함하고, EV가 (i) EV 내에 세포소기관 또는 세포소기관 단편이 실질적으로 없고; (ii) 지질, 단백질, 핵산, 및 세포 대사물질을 포함하고; (iii) 200-300 nm의 가중 평균 직경을 갖고; (iv) KRT19, TUBB, TUBB2A, TUBB2B, TUBB2C, TUBB3, TUBB4B, TUBB6, CFL1(HEL-S-15), VIM, EEF1A1, EEF1A1P5, PTI-1, EEF1A1L14, EEFA2, ENPP1, NT5E, SPA8(HEL-S-72p), RAB10, CD44, MMP2, CD109, 및 DKFZp686P132로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 함유하는, 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, EV는 CD44, CD109, NT5E, MMP2 및 HSPA8로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 함유한다.
본 발명은 임의의 호흡기 질환 또는 장애 치료에 적용될 수 있다는 것이 또한 본원에서 고려된다. 예를 들어, 호흡기 질환 또는 장애는 급성 호흡곤란 증후군(ADRS), 급성 폐 질환, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환, 낭성 섬유증, 폐렴, 폐 섬유증, 급성 폐 손상, 기관지염, 폐기종, 폐쇄세기관지염, 또는 기관지폐형성이상(BPD)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 코로나바이러스 감염 또는 COVID-19로부터 야기된 호흡기 질환 또는 장애를 치료 또는 예방한다. EV로부터의 생리학적 효과 때문에, EV는 폐 기능장애에 의해 야기된 염증성 과정 또는 혈액의 감소된 산소화가 특징인 폐 병태를 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다.
A. 정의
달리 나타내지 않는 경우, "a" 또는 "an"은 "하나 이상"을 의미한다.
달리 구체적으로 정의되지 않는 경우, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는 것으로 여겨져야 한다.
달리 나타내지 않는 경우, 본 발명에 이용된 분자 생물학, 재조합 단백질, 세포 배양, 및 면역학적 기술은 통상의 기술자에게 잘 알려진 표준 절차이다. 이러한 기술은 자료의 참고문헌, 예컨대 J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T. A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D. M. Glover and B. D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), and F. M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, including all updates until present), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), 및 J. E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (현재까지의 모든 업데이트를 포함함)에 걸쳐 기재되고 설명되며, 참고로 본원에 포함된다.
이들 관심 단백질을 함유한 EV를 얻는 과정은 일반적으로 본원에서 KRT19, TUBB, TUBB2A, TUBB2B, TUBB2C, TUBB3, TUBB4B, TUBB6, CFL1(HEL-S-15), VIM, EEF1A1, EEF1A1P5, PTI-1, EEF1A1L14, EEFA2, ENPP1, NT5E, HSPA8(HEL-S-72p), RAB10, CD44, MMP2, CD109, 및 DKFZp686P132로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 포함하는 하나 이상의 소망하는 단백질을 함유하도록 EV를 "조작하는 것"으로서 지칭된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "조작하는 것"은 소망하는 단백질을 함유하는 EV를 얻는 임의의 가능한 수단을 광범위하게 지칭하는 것을 의미한다. 용어 "조작하는 것"은 MSC로부터 유래된 EV에 차등적으로 함유된 것으로 확인된 본원의 단백질 중 하나 이상의 증가된 수준을 함유하는 EV를 생성하기 위한 EV의 직접, 또는 EV가 유래되는 공여체 세포의 조작, 선택, 단리, 배양, 또는 정제의 임의의 형태를 포함한다. 소망하는 단백질을 함유하도록 EV를 조작하는 예시적 실시양태는 아래에 추가로 기재된다.
본원에 사용된 바와 같이, ARDS는 급성 호흡곤란 증후군을 의미한다. ARDS는 예를 들어, 감염(바이러스 또는 세균), 패혈증, 산 흡인, 또는 트라우마에 의해 야기될 수 있다. ARDS는 알려지지 않은 원인을 가질 수 있다. ARDS는 COVID-19 또는 SARS-CoV 감염과 연관될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 폐 섬유증은 폐 조직에 대한 상처 또는 손상이 특징인 병태를 지칭한다. 폐 섬유증은 임의의 원인 또는 알려지지 않은 원인(특발성 폐 섬유증)을 갖는 섬유증을 포함한다. 폐 섬유증은 COVID-19 감염 또는 SARS-CoV 감염과 연관될 수 있다.
ARDS, 폐 섬유증 또는 관련 호흡기 질환 또는 장애는 또한 코로나바이러스에 의한 감염과 연관될 수 있다. 일부 실시양태에서, 코로나바이러스는 인간 코로나바이러스 229E, 인간 코로나바이러스 OC43, SARS-CoV, HCoV NL63, HKU1, MERS-CoV, 또는 SARS-CoV-2를 포함한다. 일부 실시양태에서, ARDS, 폐 섬유증 또는 관련 호흡기 질환 또는 장애는 임의의 감염성 질환 또는 장애와 연관될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"(본원에서 "환자"로도 지칭됨)는 정온 동물, 바람직하게는 인간을 포함한 포유동물을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 대상체는 영장류이다. 더욱 더 바람직한 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하는 것", "치료하다", 또는 "치료"는 질환 또는 병태의 적어도 하나의 증상을 감소, 완화, 또는 제거하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "예방하는 것", "예방하다" 또는 "예방"은 혈관병증과 같은 질환 또는 병태의 적어도 하나의 증상의 출현 또는 존재를 중지 또는 저해하는 것을 포함한다. 대안적으로, 용어 "예방하는 것", "예방하다" 또는 "예방"은 기능장애 혈관신생, 세포자살, 염증, 미토콘드리아 기능장애와 같은 질환 또는 병태의 적어도 하나의 증상의 출현 또는 존재를 중지 또는 저해하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "발현"은 하나 이상의 유전자의 RNA 발현 및/또는 단백질 발현 수준을 의미한다. 다시 말해, 용어 "발현"은 RNA 발현 또는 단백질 발현 또는 둘의 조합을 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 함유하다 또는 함유하는 것은 단백질 및/또는 RNA 발현을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "저산소"는 대기 O2 농도, 21% 미만의 산소(O2) 농도를 갖는 조건을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 저산소는 0% 내지 10%, 0% 내지 5% O2, 5% 내지 10%, 또는 5% 내지 15%인 O2 농도를 갖는 조건을 지칭한다. 일 실시양태에서, 저산소는 약 10% O2의 산소의 농도를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "장상산소"는 산소의 정상 대기 농도, 대략 20% 내지 21% O2를 갖는 조건을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단리시키는 것" 또는 "단리된 것"은 세포 배양액 또는 배지로부터 단리된 세포외 소포의 맥락에서 사용될 때, 사람의 손에 의해 이의 천연 환경 외에 존재하는 세포외 소포를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, EV로 축약되는 용어 "세포외 소포"는 엑소좀을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "세포외 소포" 및 "EV"는 일부 실시양태에서, 약 10 nm 내지 약 5000 nm, 더욱 통상적으로 30 nm 내지 1000 nm, 가장 통상적으로 약 50 nm 내지 750 nm의 직경(또는 입자가 구형이 아닌 경우, 최대 직경)을 갖는 막 입자를 지칭할 수 있다. 가장 일반적으로, EV는 공여체 세포의 크기의 최대 5%인 크기(평균 직경)를 가질 것이다. 따라서, 특히 고려되는 EV는 세포로부터 떨어진 것을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "세포외 소포의 집단"은 별개의 특징 또는 특징들의 세트를 갖는 세포외 소포의 집단을 지칭한다. 용어 "세포외 소포의 집단" 및 "세포외 소포"는 별개의 특징 또는 특징들의 세트를 갖는 세포외 소포의 집단을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "중간엽 기질 세포"는 중간엽 줄기 세포를 포함한다. 중간엽 줄기 세포는 골수, 혈액, 치수 세포, 지방 조직, 피부, 비장, 췌장, 뇌, 신장, 간, 심장, 망막, 뇌, 모공, 장, 폐, 림프절, 흉선, 뼈, 인대, 힘줄, 골격근, 진피, 및 골막에서 발견되는 세포이다. 중간엽 줄기 세포는, 비제한적으로, 지방, 뼈, 연골, 탄성, 근육, 및 섬유성 결합 조직을 포함한 많은 수의 세포 유형으로 분화될 수 있다. 중간엽 줄기 세포에 의해 내부로 도입되는 특정 계통-헌신 및 분화 경로는 기계적 영향 및/또는 내인성 생물활성 인자, 예컨대 성장 인자, 사이토카인, 및/또는 숙주 조직에 의해 수립된 국소 미세 환경 조건을 포함하는 다양한 영향에 의존한다. 따라서, 중간엽 줄기 세포는 결국 표현형 세포를 산출하도록 비가역적으로 분화될 줄기 세포 또는 전구 세포인 딸 세포를 산출하도록 분열되는 비-조혈 간세포이다.
본 발명의 일부 실시양태는 광범위하게는 중간엽 기질 세포 세포외 소포에 관한 것이고, 이는 중간엽 기질 세포 세포외 소포, 또는 MSC 세포외 소포, 또는 세포외 소포로 상호교환적으로 지칭된다.
EV는 합성 엑소좀을 포함한다는 것이 또한 본원에서 고려된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "합성 엑소좀"은 세포에 의하지 않고 시험관내에서 생산되는 엑소좀을 지칭한다. 예를 들어, 합성 엑소좀은 둘러싸인 지질 이중층 또는 집합체의 생성에 의해 형성된 리포솜일 수 있다. 리포솜은 일반적으로 인지질을 포함하는 이중층 막, 및 일반적으로 수성 조성물을 포함하는 내부 배지를 갖는 갖는 소포 구조를 갖는 것이 특징일 수 있다.
B. 세포외 소포
i. MSC-특이적 단백질을 함유하도록 EV를 조작하는 것
본 발명은 PAH, PH, BPD, 또는 미토콘드리아 기능장애, 감소된 혈관신생, 세포자살 또는 염증과 연관된 장애를 치료하기 위한 증가된 효능을 갖는 MSC 유래된 EV를 조작하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, EV는 임의의 세포 유형으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, EV는 불멸화된 세포 또는 불멸 세포주로서 수립된 세포로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, EV는 일차 세포로부터 유래될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "일차 세포"는 대상체 또는 공여체로부터 직접 얻어지는 세포를 의미하고, 일차 세포는 불멸화되지 않았고/않았거나 불멸 세포주로서 수립되지 않았다. 일부 바람직한 실시양태에서, EV는 중간엽 줄기 세포(MSC)로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 KRT19, TUBB, TUBB2A, TUBB2B, TUBB2C, TUBB3, TUBB4B, TUBB6, CFL1(HEL-S-15), VIM, EEF1A1, EEF1A1P5, PTI-1, EEF1A1L14, EEFA2, ENPP1, NT5E, HSPA8(HEL-S-72p), RAB10, CD44, MMP2, CD109 및 DKFZp686P132로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 함유하도록 EV를 조작하는 단계를 포함하는, 증가된 효능을 갖는 세포외 소포(EV)를 단리시키는 방법을 제공하거나, 더욱 바람직하게는 EV는 CD44, CD109, NT5E, MMP2 및 HSPA8로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 함유하도록 조작될 수 있다.
일부 실시양태에서, 공여체 세포는 MSC이고 EV는 선택을 위한 마커로서 차등적으로 함유된 단백질을 사용함으로써 단리된다. 예를 들어, EV는 유세포분석 또는 패닝 또는 MSC로부터 유래된 모든 EV의 평균과 비교하여 KRT19, TUBB, TUBB2A, TUBB2B, TUBB2C, TUBB3, TUBB4B, TUBB6, CFL1(HEL-S-15), VIM, EEF1A1, EEF1A1P5, PTI-1, EEF1A1L14, EEFA2, ENPP1, NT5E, HSPA8(HEL-S-72p), RAB10, CD44, MMP2, CD109, 및 DKFZp686P132로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 증가된 수준을 함유하는 EV를 단리시키기 위한 임의의 다른 잘 알려진 면역선택 방법을 사용함으로써 MSC 배양액으로부터 선택될 수 있다. 일부 바람직한 실시양태에서, EV는 MSC로부터 유래된 모든 EV의 평균 수준과 비교하여 CD44, CD109, NT5E, MMP2 및 HSPA8로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 증가된 수준을 함유하도록 조작될 수 있다.
다른 양태에서, EV를 유도하기 위해 사용되는 공여체 세포는 MSC가 아닐 수 있고 임의의 관심 단백질을 함유하지 않을 수 있다. 오히려, 비-MSC 공여체 세포는 본원의 다른 곳에서 참조되는 바와 같은 표준 분자 생물학 기술을 사용함으로써 관심 단백질 중 하나 이상을 함유하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, EV는 KRT19, TUBB, TUBB2A, TUBB2B, TUBB2C, TUBB3, TUBB4B, TUBB6, CFL1(HEL-S-15), VIM, EEF1A1, EEF1A1P5, PTI-1, EEF1A1L14, EEFA2, ENPP1, NT5E, HSPA8(HEL-S-72p), RAB10, CD44, MMP2, CD109, 및 DKFZp686P132로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 함유하도록 유전적으로 조작된 비-MSC 세포로부터 유래될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, EV는 CD44, CD109, NT5E, MMP2 및 HSPA8로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 함유하도록 유전적으로 조작된 비-MSC 세포로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 EV를 유도하기 위한 공여체로서 사용되는 세포는 임의의 유형의 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-MSC 세포는 섬유아세포 또는 대식세포일 수 있다.
다른 양태에서, EV는 관심 단백질을 함유하도록 직접 조작될 수 있다. 관심 단백질을 함유하도록 엑소좀을 직접 조작하는 다양한 방법이 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, EV는 단리되거나 정제된 관심 단백질과 항온처리될 수 있다. EV는 단리되거나 정제된 관심 단백질과 함께 수동적으로 항온처리될 수 있다. EV에 관심 단백질을 로딩시키는 효율성을 개선하기 위해, EV 및 단리된 관심 단백질의 혼합물은 초음파처리되어, 막 무결성을 손상시킨 다음에, EV가 막에 내장된 관심 단백질로 회복되게 할 수 있다. EV는 또한 추출 프로토콜에 의해 관심 단백질을 함유하도록 조작될 수 있으며, 이때 EV는 관심 단백질과 혼합되고, 이어서 시린지-기반 지질 추출기에 로딩되어, 엑소좀 및 관심 단백질을 격렬히 혼합한다.
일부 실시양태에서, EV는 EV를 관심 단백질과 혼합하고, 이어서 혼합물을 반복적으로 냉동 및 해동함으로써 관심 단백질을 함유하도록 조작된다. EV는 또한 전기천공에 의해 또는 당업계에 잘 알려진 투과제와의 항온처리에 의해 관심 단백질을 함유하도록 조작될 수 있다.
일부 실시양태에서, EV는 클릭 화학 접근법을 사용함으로써 관심 단백질을 함유하도록 조작된다. 예를 들어, 구리-촉매화된 아지드 알킨 첨가환화가 사용되어, 관심 단백질을 EV에 접합할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이 관심 단백질을 함유하도록 EV를 조작하는 방법을 사용함으로써, 합성 EV 또는 엑소좀, 예컨대 리포솜이 또한 KRT19, TUBB, TUBB2A, TUBB2B, TUBB2C, TUBB3, TUBB4B, TUBB6, CFL1(HEL-S-15), VIM, EEF1A1, EEF1A1P5, PTI-1, EEF1A1L14, EEFA2, ENPP1, NT5E, HSPA8(HEL-S-72p), RAB10, CD44, MMP2, CD109, 및 DKFZp686P132로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 함유하거나, 바람직한 실시양태에서, CD44, CD109, NT5E, MMP2 및 HSPA8로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 함유하도록 조작될 수 있다.
EV는 단백질 마커인 Syntenin-1, Flotillin-1, CD105, 주조직적합성 복합체 클래스 I, 및 테트라스패닌 패밀리의 멤버를 함유하는지에 대해 추가로 평가될 수 있다. 따라서, 단리된 EV는 Syntenin-1, Flotillin-1, CD105, 및/또는 주조직적합성 복합체 클래스 I을 추가로 포함한다. 일부 추가 실시양태에서, 단리된 EV는 테트라스패닌 패밀리의 멤버를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 테트라스패닌 패밀리의 멤버는 CD63, CD81, 및 CD9를 포함한다.
ii. 세포로부터 세포외 소포를 얻는 것
본 발명의 세포외 소포(EV)는 임의의 세포 공급원으로부터 얻어질 수 있다. 일부 실시양태에서, EV는 중간엽 기질 세포로부터 방출되는 막(예를 들어, 지질 이중층) 소포이다. 이들은 예를 들어, 약 30 nm 내지 1000 nm, 약 30 nm 내지 약 500 nm, 약 50 nm 내지 약 350 nm, 또는 약 30 nm 내지 약 100 nm 범위의 직경을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 세포외 소포는 약 100 nm, 약 150 nm, 약 200 nm, 약 250 nm 약 300 nm, 또는 약 350 nm의 평균 직경을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 단리된 세포외 소포는 약 100 nm의 평균 직경을 갖는다. 다른 실시양태에서, 단리된 세포외 소포 중 적어도 70%는 50 nm 내지 350 nm의 크기를 갖는다.
전자 현미경에 의해, 세포외 소포는 컵-형상 형태학을 갖는 것으로 나타날 수 있다. 이들은 예를 들어, 약 100,000 x g에서 침전되고 약 1.10 내지 약 1.21 g/mL의 수크로오스 중 부유 밀도를 가질 수 있다.
중간엽 기질 세포는, 비제한적으로, 골수, 혈액, 골막, 진피, 제대혈 및/또는 기질(예를 들어, 와튼 젤리), 및 태반을 포함한 다수의 공급원으로부터 수집될 수 있다. 중간엽 줄기 세포의 수집을 위한 방법은 실시예에서 더욱 상세히 기재된다. 또한, 본 발명에 사용될 수 있는 다른 수집 방법에 대한 참고는 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제5,486,359에 대해 이루어질 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용하기 위해 고려되는 중간엽 기질 세포, 및 이에 따른 세포외 소포는 치료될 동일한 대상체로부터 얻어질 수 있거나(따라서, 대상체에 대해 자가로 지칭될 것임), 이들은 상이한 대상체, 바람직하게는 동일한 종의 대상체로부터 얻어질 수 있다(따라서, 대상체에 대해 동종이계로 지칭될 것임).
본원에 사용된 바와 같이, 본 발명의 양태 및 실시양태는 달리 나타내지 않는 경우, 세포뿐 아니라, 세포 집단에 관한 것이라는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 세포가 원용되는 경우, 달리 나타내지 않는 경우, 세포 집단이 또한 고려된다는 것이 이해되어야 한다.
본 발명의 일부 양태는 단리된 세포외 소포를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 단리된 세포외 소포는 이의 천연 환경으로부터 물리적으로 분리된 것이다. 단리된 세포외 소포는 중간엽 기질 세포를 포함하여, 그것이 자연적으로 존재하는 조직 또는 세포 환경으로부터 전체적으로 또는 부분적으로 물리적으로 분리될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 단리된 세포외 소포의 조성물은 중간엽 기질 세포와 같은 세포가 없을 수 있거나, 이는 조건부 배지가 없거나 실질적으로 없을 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 세포외 소포는 비-조작된 조건부 배지에 존재하는 세포외 소포에 비해 높은 농도로 제공될 수 있다. 세포외 소포는 중간엽 기질 세포 배양액으로부터의 조건부 배지로부터 단리될 수 있다.
일반적으로, 세포외 소포를 정제 및/또는 풍부화하기 위한 임의의 적합한 방법, 예컨대 자성 입자, 여과, 투석, 초원심분리, ExoQuick™(Systems Biosciences, CA, USA), 및/또는 크로마토그래피를 포함하는 방법이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포외 소포는 원심분리 및/또는 초원심분리에 의해 단리될 수 있다. 세포외 소포는 또한 투명화된 조건부 배지의 초원심분리에 의해 정제될 수 있다. 이들은 또한 초원심분리에 의해 수크로오스 쿠션으로 정제될 수 있다. 프로토콜은 예를 들어, Thery et al. Current Protocols in Cell Biol. (2006) 3.22에 기재되어 있으며, 이는 본원에 참고로 포함된다. 일부 실시양태에서, 세포외 소포는 단일 단계 크기 배제 크로마토그래피에 의해 단리된다. 프로토콜은 예를 들어, Boing et al. Journal of Extracellular Vesicles (2014) 3:23430에 기재되어 있으며, 이는 본원에 참고로 포함된다. 중간엽 기질 세포 또는 중간엽 줄기 세포로부터 세포외 소포의 수집을 위한 상세한 방법은 실시예에서 제공된다.
EV는 즉시 사용되거나 사용 전에 저온보존된 상태와 같이 단기 또는 장기로 저장될 수 있다. 단백질분해효소 억제제는 통상적으로 냉동 배지에 포함되며, 이는 이들이 장기 저장 동안 세포외 소포 무결성을 제공하기 때문이다. -20℃에서의 냉동은 바람직하지 않으며, 이는 세포외 소포 활성의 증가된 손실과 연관되기 때문이다. -80℃에서의 급속 냉동이 더욱 바람직하며, 이는 활성을 보존하기 때문이다. 예를 들어, Kidney International (2006) 69, 1471-1476을 참고하며, 이는 본원에 참고로 포함된다. 냉동 배지에 대한 첨가제가 세포외 소포 생물학적 활성의 보존을 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 이러한 첨가제는 온전한 세포의 저온보존을 위해 사용되는 것과 유사할 것이고, 비제한적으로, DMSO, 글리세롤 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함할 수 있다.
iii. 합성 EV
본 실시양태에 따라 사용되는 합성 EV 또는 엑소좀은 통상의 기술자에게 알려진 상이한 방법에 의해 제조될 수 있다. 합성 엑소좀은 지질을 이중층 구조(엑소좀의 막과 유사함)로 조립하는 단계 및 소포 표면을 단백질로 기능화하는 단계, 또는 표적 세포 수용체와의 직접 접촉을 통한 메시지의 수송에 의해, 또는 친수성 분자를 부착하여, 이의 혈액 순환을 증가시킴으로써 이의 표면을 변형시키는 단계에 의해 형성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 합성 EV 또는 엑소좀은 리포솜을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "리포솜"은 적어도 하나의 지질 이중층을 갖는 구형 소포를 지칭한다. 리포솜은 다중판 집합체를 올리고- 또는 단일판 이중층 소포로 붕괴하기 위해 극성 용매, 예컨대 물에서 지질, 예컨대 인지질의 분산액에 충분한 에너지를 공급한 후 형성될 수 있다. 따라서, 리포솜은 물에서 양극성 지질, 예컨대 인지질의 분산액을 초음파처리함으로써 생성될 수 있다.
리포솜의 주요 유형은 다중판 소포(MLV, 몇몇 판 상 지질 이중층을 가짐), 작은 단일판 리포솜 소포(SUV, 하나의 지질 이중층을 가짐), 큰 단일판 소포(LUV), 및 달팽이관 소포이다. 낮은 전단율은 다중판 리포솜을 생성한다. 양파와 같이 많은 층을 갖는 원래의 집합체는 이에 의해 점차 작아지고 최종적으로 작은 단일판 리포솜 소포 또는 SUV를 형성한다(이는 보통 이들의 작은 크기 및 초음파처리-생성된 결함으로 인해 불안정함). 초음파처리에 대한 대안으로서, 추출 및 모자파리 방법(Mozafari method)이 이용되어, 인간 용도를 위한 물질을 생산할 수 있다. 포스파티딜콜린 이외의 지질을 사용하는 것은 리포솜 제조를 매우 용이하게 할 수 있다.
특히, 작은 단일판 소포(SUV)는 천연 EV와의 이들의 유사성(크기 범위 및 막 배치)으로 인해 EV를 모방할 수 있는 소포의 제조를 위한 이상적인 전구체이다. 따라서, SUV 리포솜의 제조를 위해 사용되는 잘 알려진 기술(예를 들어, 박막 수화법, 역상 증발법, 에탄올 주사법, 에테르 주사법, 미세유체-기반 방법, 추출 기술, 모자파리 등)을 적용함으로써, 천연 EV의 것과 유사한 크기 범위를 갖는 리포솜이 얻어질 수 있다.
리포솜은 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 막의 외부를 코팅함으로써 신체의 면역계의 검출을 회피하도록 추가로 변형될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 합성 EV는 PEG로 코팅된다.
C. 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하기 위해 본 발명의 EV를 사용하는 방법
본원에 기재된 EV는 호흡기 질환 또는 장애의 치료 또는 예방시 특정 용도, 예컨대 상기 기재된 바와 같은 급성 호흡곤란 증후군(ARDS) 또는 폐 섬유증을 치료 또는 예방하는 방법의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 폐 섬유증은 특발성 폐 섬유증이다. 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 EV는 대상체에서 심장수축 폐동맥압(SPAP)을 감소시키거나, 대상체에서 폐의 폐포 표면적을 증가시키거나, 대상체에서 혈액 산소의 농도를 증가시키거나, 세포외 기질 침착(예컨대, 가용성 콜라겐)을 감소시키거나, 풀톤 지수를 개선하거나, 대상체에서 폐에서의 염증을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
EV는 또한 혈관병증, 예컨대 PAH 또는 PH; BPD; 또는 미토콘드리아 기능장애, 감소된 혈관신생, 세포자살, 또는 염증과 연관된 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 EV는 인간 대상체를 포함하여, 미토콘드리아 기능 변경을 필요로 하는 대상체에서 미토콘드리아 기능을 변경하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 EV는 폐의 면역조절 능력을 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 EV는 염증을 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 EV는 폐에서 혈관신생을 촉진할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 EV는 폐의 미토콘드리아 대사를 증가시킬 수 있다.
i. 기관지폐형성이상
기관지폐형성이상(BPD)은 미숙아의 만성 폐 질환이다. 이는 연장된 폐 염증, 폐포의 수에서의 감소 및 얇아진 폐포 격막, 원위 혈관의 "축소"를 갖는 비정상적 혈관 성장, 및 제한된 대사 및 항산화제 용량이 특징이다. 미국에서 매년 14,000 개의 새로운 BPD 사례가 있다. 중요하게는, BPD의 진단은 보통 청소년 동안 PAH, 폐기종, 천식, 심혈관 이환율 및 후기-신생아 사망률 증가, 증가된 신경발달 장애 및 뇌성마비, 폐기종을 포함하는 다른 추가 병태를 야기한다. 현재, BPD에 대한 표준 요법은 없다. 일부 BPD 환자는 가벼운 환기요법 및 코르티코스테로이드로 치료되지만, 이들 치료는 신경 결과 또는 사망에 대해 효과를 나타내지 않는다. BPD에 대한 일차 위험은 소낭 발달의 시작 기간에 대응하는 출생 후 24-28 주의 유아에 존재한다. 고위험의 유아는 1.3 내지 2.2 파운드이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 EV는 대상체에서 BPD를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
ii. 혈관병증
혈관병증 구성요소를 갖는 질환 및 병태는, 비제한적으로, 폐 고혈압, 폐동맥 고혈압(PAH), 말초 혈관 질환(PVD), 중증 하지 허혈(CLI), 관상 동맥 질환, 및 당뇨병성 혈관병증을 포함한다.
폐 고혈압, 예를 들어 폐동맥 고혈압(PAH)은 폐 순환에서의 압력이 증가하여, 결국 심부전 및 사망을 야기하는 병태를 지칭한다. 많은 원인 및 조건이 PAH와 연관된 것으로 발견되지만, 이들 중 많은 수가 일반적인 몇몇 근본적인 병리학적 특징을 공유한다. 이들 과정 중 하나의 특징은 모든 혈관 벽의 내부 세포층인 내피의 기능장애이고, 이는 보통 혈관 톤(vessel tone)을 조절하고 응고 형성을 수복하고 억제하는 물질의 큰 배열의 생산 및 대사를 담당한다. PAH의 환경에서, 내피 기능장애는 유해 물질의 과잉 생산 및 보호 물질의 손상된 생산을 야기할 수 있다. 이것이 PAH의 발달에서 주된 사건이거나 후속 캐스케이드의 일부가 알려지지 않은 채로 남아있는 경우에, 이는 질환을 특징짓는 진행성 혈관수축 및 혈관 증식에서의 인자인 것으로 여겨진다. 따라서, 본원에 기재된 세포외 소포는 PAH를 포함하는 폐 고혈압을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
용어 말초 혈관 질환(PVD)은 말초 동맥 및 정맥 내의 손상, 기능장애 또는 차단을 지칭한다. 말초 동맥 질환은 PVD의 가장 일반적인 형태이다. 말초 혈관 질환은 동맥의 가장 일반적인 질환이고 미국에서 매우 일반적인 병태이다. 이는 주로 50 세 초과의 사람들에서 발생한다. 말초 혈관 질환은 50 세 초과의 사람들뿐 아니라, 당뇨병을 앓는 사람들에서 장애의 선도적인 원인이다. 미국에서 약 1000만명의 사람들이 말초 혈관 질환을 가지며, 이는 50 세 초과의 사람 중 약 5%로 해석된다. 상기 병태를 앓는 사람들의 수는 집단이 노화될수록 성장할 것으로 예상된다. 남성은 여성에 비해 약간 더 말초 혈관 질환을 갖기 쉽다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 EV는 인간 대상체를 포함하는 대상체에서 PVD를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
후기 말초 동맥 폐쇄로 인한 중증 하지 허혈(CLI)은 휴식시 감소된 혈액 흐름 및 산소 전달이 특징이며, 휴식시 근육 통증 및 비-치유 피부 궤양 또는 괴저를 야기한다(Rissanen et al., Eur. J. Clin. Invest. 31:651-666 (2001); Dormandy and Rutherford, J. Vasc. Surg. 31:S1-S296 (2000)). 중증 하지 허혈은 1 년에 100만명 당 500 내지 1000명에서 발생하는 것으로 추산된다("Second European Consensus Document on Chronic Critical Leg Ischemia", Circulation 84(4 Suppl.) IV 1-26 (1991)). 중증 하지 허혈을 앓는 환자에서, 절단은 이의 연관된 이환율, 사망률 및 기능적 영향에도 불구하고, 보통 장애 증상에 대한 해법으로서 권고된다(M. R. Tyrrell et al., Br. J. Surg. 80: 177-180 (1993); M. Eneroth et al., Int. Orthop. 16: 383-387 (1992)). 중증 하지 허혈에 대한 최적의 의학 요법은 존재하지 않는다(Circulation 84(4 Suppl.): IV 1-26 (1991)). 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 EV는 인간 대상체를 포함하는 대상체에서 중증 하지 허혈을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
관상 동맥 질환(죽상경화증)은 인간에서 진행성 질환이며, 이때 하나 이상의 관상 동맥은 점차 플라크의 축적을 통해 폐쇄된다. 이 질환을 갖는 환자의 관상 동맥은 보통 풍선 혈관성형 또는 스텐트의 삽입에 의해 치료되어, 부분적으로 폐쇄된 혈관을 개방한다. 궁극적으로, 이들 환자는 큰 비용과 위험의 관상 동맥 우회로조성술을 받도록 요구된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 EV는 인간 대상체를 포함하는 대상체에서 관상 동맥 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
iii. 감소된 혈관신생
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "혈관신생"은 혈관형성의 초기 단계에서 형성된 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관이 형성되는 것을 통한 생리학적 과정을 지칭한다. 혈관신생 활성은 내피관 분기점을 측정함으로써 평가될 수 있다. 본 발명은 MSC로부터 유래된 EV가 인간 내피세포에서 관 형성을 촉진하고 인간 내피세포에서 고산소-매개된 관 네트워크 손실을 예방한다는 것을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 EV는 내피관 분기점을 측정함으로써 결정된 바와 같이 혈관신생을 촉진할 수 있다.
iv. 세포자살
조산아에서, 높은 산소 수준 및 기계적 인공호흡은 폐 상피에서 세포 스트레스를 야기할 수 있다. 산화 스트레스는 호흡곤란을 나타내는 미숙아에서 세포자살 또는 세포 사멸을 야기할 수 있고, 이는 기관지폐형성이상(BPD)의 발달을 야기할 수 있다. 산화 스트레스는 시토크롬 C의 미토콘드리아 방출을 유도하여, 세포자살을 야기하는 시그널링 캐스케이드를 개시한다. 따라서, 본원에 개시된 MSC로부터 유래된 EV에 의한 세포 구제는 시토크롬 C 방출을 측정함으로써 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 EV는 세포자살을 예방하거나 세포 및 조직을 구제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 EV는 시토크롬 C의 미토콘드리아 방출을 예방하여, 세포자살을 예방할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 EV는 미숙아에서 BPD를 치료할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 EV는 폐 상피에서 세포자살을 예방할 수 있다.
v. 염증
염증성 사이토카인은 면역 세포 및 염증을 촉진하는 특정 다른 세포 유형으로부터 분비되는 사이토카인의 유형이다. 염증은 세포 스트레스, 예컨대 산화 스트레스에 의해 야기될 수 있다.
염증성 사이토카인은 대부분 T 헬퍼 세포(Th) 및 대식세포에 의해 생산되고 염증 반응의 상향조절에 관련된다. 염증 질환을 치료하기 위한 요법은 염증성 사이토카인 또는 이들의 수용체를 중화시키는 단클론 항체를 포함한다.
염증성 사이토카인 또는 케모카인은 인터류킨-1(IL-1), IL-3, IL-6 및 IL-18, 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), 인터페론 감마(IFNγ), 및 과립구-대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF), 케모카인(C-X-C 모티프) 리간드 1(GRO), 케모카인(C-C 모티프) 리간드 21(6Ckine), 과립구 주화성 단백질 2(GCP2), 또는 케모카인(C-X-C 모티프) 리간드 16(CXCL16), 대식세포 염증성 단백질 1a(MIP1a), 대식세포 염증성 단백질 1b(MIP1b), 인터류킨 1 베타(IL1β), 인터류킨 12 베타(IL12β), 또는 인터페론-유도성 T-세포 알파 주화인자(ITAC)를 포함한다. 폐의 이 염증 상태는 기계적 인공호흡과 연관된 바로트라우마, 및 높은 산소 보충으로부터 야기되는 산화 스트레스에 기인한다. 따라서, MSC로부터 유래된 EV의 면역조절 활성은 IL-3 또는 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)와 같은 전-염증성 사이토카인의 수준을 측정함으로써 평가될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 EV는 전-염증성 사이토카인의 분비를 예방할 수 있다. 일부 실시양태에서, 전-염증성 사이토카인은 IL-3 또는 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 EV는 급성 염증을 치료할 수 있다. EV는 항-염증성 사이토카인, 예컨대 만노오스 수용체(CD206) 및 인터류킨 10(IL10)의 존재 또는 활성화를 향상시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 EV는 만성 염증을 치료할 수 있다.
BPD는 폐에서 전-염증성 사이토카인의 지속적인 상승과 연관된다. 따라서, 본 발명의 EV는 BPD와 연관된 염증을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
vi. 미토콘드리아 기능장애
미토콘드리아는 다수의 대사 변환 및 조절 기능을 담당하는 세포내 세포소기관이다. 이들은 진핵 세포에 의해 이용되는 많은 ATP를 생산한다. 이들은 또한 산화 스트레스를 야기하는 자유 라디칼 및 반응 산소 종의 주요 공급원이다. 결과적으로, 미토콘드리아 결함은 특히 신경 및 근육 조직에 손상을 주며, 이는 높은 에너지 수준 수요를 갖는다. 따라서, 에너지 결함은 운동 장애, 심근증, 근육병, 실명, 및 난청의 형태에 연루되었음이 나타났다(DiMauro et al. (2001) Am. J. Med. Genet.106, 18-26; Leonard et al. (2000) Lancet.355, 299-304). 미토콘드리아 기능장애는 증가된 락테이트 생산, 약화된 호흡 및 ATP 생산을 포함할 수 있다. 미토콘드리아 기능장애는 산화 스트레스에서 나타날 수 있다.
저발달된 폐 및 미성숙한 호흡 조절은 보통 저산소 사건을 야기하고, 이는 BPD 환자에서 만성적으로 낮은 O2 비축 및 낮은 혈액 산소 포화를 야기할 수 있다. 개선된 대사 기능은 저산소에 노출된 폐 동맥 민무늬근 세포(PASMC)에서 글루코오스 대사 및 미토콘드리아 산소 소비를 측정함으로써 평가될 수 있다. 특히, 미토콘드리아 대사를 증가시키는 EV의 능력은 피루베이트 키나아제 활성 또는 ATPase 활성을 측정함으로써 평가될 수 있다.
본 발명은 미토콘드리아 기능장애와 연관된 질환 또는 병태를 치료하기 위한 방법을 제공한다. 미토콘드리아 기능장애는 대상체에서 감소된 미토콘드리아 글루코오스 산화와 연관될 수 있다.
일부 실시양태에서, 미토콘드리아 기능장애와 연관된 질환 또는 병태는 프리드리히 실조, 레베르 유전성 시신경병증, 컨스-세이어 증후군, 젖산 산증 및 뇌졸중양 증상을 갖는 미토콘드리아 뇌근병증, 리 증후군, 비만, 죽상경화증, 근위축성 측삭 경화증, 파킨슨병, 암, 심부전, 심근경색증(MI), 알츠하이머병, 헌팅턴병, 조현병, 양극성 장애, 취약 X 증후군, 및 만성 피로 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
미토콘드리아 에너지 생산
본원에 제공된 EV는 또한 피루베이트 키나아제 또는 ATPase의 발현을 증가시킴으로써 미토콘드리아 에너지 생산을 개선할 수 있는 것으로 고려된다. 진핵 생물에서의 세포는 세포 과정을 수행하기 위해 에너지를 요구한다. 이러한 에너지는 주로 아데노신 5 '-트리포스페이트("ATP")의 포스페이트 결합에 저장된다. (1) 해당과정; (2) TCA 회로(크렙스 회로(Krebs Cycle) 또는 시트르산 회로로도 지칭됨); 및 (3) 산화적 인산화를 포함하여, 진핵 생물에서 에너지를 생성하는 특정 경로가 있다. 합성될 ATP에 대해, 탄수화물은 단당류(예를 들어, 글루코오스)로 처음 가수분해되고, 지질은 지방산 및 글리세롤로 가수분해된다. 유사하게는, 단백질은 아미노산으로 가수분해된다. 그 다음에, 이들 가수분해된 분자의 화학적 결합에서 에너지는 방출되고 세포에 의해 이용되어, 많은 이화 경로를 통해 ATP 분자를 형성한다.
살아있는 유기체를 위한 에너지의 주요 공급원은 글루코오스이다. 글루코오스 분해시, 글루코오스 분자의 화학적 결합에서의 에너지가 방출되고 세포에 의해 이용되어, ATP 분자를 형성할 수 있다. 이것이 발생하는 과정은 몇몇 단계로 구성된다. 첫번째는 글루코오스 분자가 피루브산으로 지칭되는 2 개의 소분자로 분해되는 해당과정으로 지칭된다.
해당과정에서, 글루코오스 및 글리세롤은 해당 경로를 통해 피루베이트로 대사된다. 이 과정 동안, 2 개의 ATP 분자가 생성된다. NADH의 2 개의 분자가 또한 생산되고, 이는 전자전달계를 통해 추가로 산화되고 추가 ATP 분자의 생성을 야기할 수 있다.
해당과정은 글루코오스(및 다른 단당류)를 2 개의 피루베이트 분자로 분해하는 많은 효소-촉매화된 단계를 포함한다. 반응으로, 경로는 총 2 개의 ATP 분자의 생성을 야기한다. 해당 경로로부터 생성된 피루베이트 분자는 세포기질로부터 미토콘드라이로 들어간다. 그 다음에, 분자는 TCA 회로 내로의 진입을 위해 아세틸 코엔자임 A(아세틸-CoA)로 전환된다. TCA 회로는 시트레이트를 형성하기 위한 아세틸 코엔자임-A와 옥살로아세테이트의 결합으로 구성된다. 그 다음에, 형성된 시트레이트는 일련의 효소-촉매화된 단계를 통해 분해되어, 추가 ATP 분자를 생성한다.
미토콘드리아 기질에서 TCA 회로로부터 방출된 에너지는 NADH(복합체 I) 및 FADH2(복합체 II)와 같은 미토콘드리아 전자전달계로 들어간다. 이들은 ATP 생산에 관련된 5 개의 단백질 복합체 중 첫번째 2 개이고, 이들 전부는 내부 미토콘드리아 막에 위치한다. NADH(NADH-특이적 탈수소효소와의 산화에 의함) 및 FAD¾(숙시네이트 탈수소효소와의 산화에 의함)로부터 유래된 전자는 호흡사슬로 이동하고, 미토콘드리아 기질로부터 막간 공간으로 양성자의 활성 수송(즉, 내부 미토콘드리아 막을 통함)을 구동함으로써 별개의 단계에서 이들의 에너지를 방출한다. 호흡사슬에서의 전자 담체는 플라빈, 단백질-결합된 철-황 중심, 퀴논, 시토크롬 및 구리를 포함한다. 복합체 사이에 전자를 수송하는 2 개의 분자가 있다: 코엔자임 Q(복합체 I→ III, 및 복합체 II→ III) 및 시토크롬 c(복합체 III→ IV). 호흡사슬에서의 최종 전자 수용체는 ¾이고, 이는 복합체 IV에서 ¾로 전환된다.
이론에 구애됨 없이, 본원에 제공된 EV는 피루베이트 키나아제 활성 및/또는 ATPase 활성을 증가시켜, 미토콘드리아 에너지 생산을 향상시킬 수 있는 것으로 여겨진다.
D. 세포외 소포의 효능의 평가
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "효능"은 단리된 EV의 생물활성을 지칭한다.
본원에 기재된 EV의 효능은 개선된 폐 구조의 측정으로서 평균 선형 절편을 측정함으로써 평가될 수 있다. 평균 선형 절편(MLI)의 측정은 폐포 크기를 정량화하기 위해 사용되는 도구이며, 이때 높은 MLI는 감소된 폐포 표면적을 암시한다. 일부 실시양태에서, 세포외 소포의 강한 집단은 EV로 미처치된 채 남겨진 대조군과 비교하여 대상체에서 MLI를 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 감소시킬 수 있다.
본원에 기재된 EV의 효능은 전-염증성 사이토카인의 분비를 측정함으로써 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포외 소포의 강한 집단은 EV로 미처치된 채 남겨진 대조군과 비교하여 대상체에서 전-염증성 사이토카인의 수준을 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 감소시킬 수 있다. 측정된 전-염증성 사이토카인은 예를 들어, 종양 괴사 인자 알파 또는 인터류킨-3일 수 있다.
본원에 기재된 EV의 효능은 항-염증성 사이토카인의 mRNA 발현을 측정함으로써 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포외 소포의 강한 집단은 EV로 미처치된 채 남겨진 대조군과 비교하여 대상체에서 항-염증성 사이토카인의 수준을 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% 이상 증가시킬 수 있다. 측정된 전-염증성 사이토카인은 예를 들어, CD206 또는 인터류킨-10(IL10)일 수 있다.
본원에 기재된 EV의 효능은 심실 비대 및 폐 혈관 리모델링의 측정치인 풀톤 지수를 측정함으로써 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포외 소포의 강한 집단은 EV로 미처치된 채 남겨진 대조군과 비교하여 대상체에서 풀톤 지수를 적어도 약 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% 이상 개선할 수 있다. 측정된 전-염증성 사이토카인은 예를 들어, CD206 또는 인터류킨-10(IL10)일 수 있다.
본원에 기재된 EV의 효능은 시토크롬 C의 분비를 측정함으로써 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포외 소포의 강한 집단은 EV로 미처치된 채 남겨진 대조군과 비교하여 대상체에서 시토크롬 C 방출의 수준을 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 감소시킬 수 있다.
본원에 기재된 EV의 효능은 폐 조직에서 혈관의 총 분기점을 측정함으로써 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포외 소포의 강한 집단은 EV로 미처치된 채 남겨진 대조군과 비교하여 대상체에서 폐 조직에서 혈관의 총 분기점을 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 증가시킬 수 있다.
마우스 모델에서 저산소 유도된 PAH의 세포외 소포 치료 효과의 우심실 수축기 압력(RVSP) 측정이 사용되어, 세포외 소포의 강한 집단을 확인할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포외 소포의 강한 집단은 3-주 만성 저산소 노출을 거치고 PBS 버퍼로 처치된 대조군 마우스와 비교하여 3-주 만성 저산소 노출을 거친 마우스의 RVSP를 적어도 약 10%, 12.5%, 15%, 17.5%, 20%, 22.5%, 25%, 27.5%, 또는 30% 감소시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포외 소포의 강한 집단은 델타 RVSP에 의해 확인될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 델타 RVSP는 세포외 소포로 처치된 저산소-노출된 마우스의 RVSP - 정상산소 마우스의 RVSP로서 정의된다. 일부 실시양태에서, 세포외 소포의 집단은 델타 RVSP가 약 6, 5, 4, 3, 또는 2 mmHg 미만인 경우 강하다.
일부 실시양태에서, 세포외 소포 집단의 효능은 민무늬근 세포(SMC) 용해물에 의한 O2 소비를 증가시키는 이들의 능력이 특징일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포외 소포의 강한 집단은 24-시간 저산소 노출을 거치고 PBS 대조군으로 처치된 대조군 SMC 세포 용해물과 비교하여 24-시간 저산소 노출을 거친 SMC 용해물에 의한 O2 소비를 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 또는 40% 증가시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포외 소포 집단의 효능은 이들의 PK 활성이 특징일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포외 소포의 강한 집단은 적어도 약 0.15 nmol/분/mL, 0.16 nmol/분/mL, 0.17 nmol/분/mL, 0.18 nmol/분/mL, 0.19 nmol/분/mL, 0.20 nmol/분/mL, 0.21 nmol/분/mL, 0.22 nmol/분/mL, 0.23 nmol/분/mL, 0.24 nmol/분/mL, 0.25 nmol/분/mL, 0.3 nmol/분/mL, 또는 0.4 nmol/분/mL의 PK 활성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 세포외 소포 집단의 효능은 이들의 LDH 활성이 특징일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포외 소포 집단의 효능은 저산소-노출된 SMC에 의해 분비된 LDH를 적어도 약 10%, 20%, 30%, 또는 40% 감소시키는 이들의 능력이 특징이다.
일부 실시양태에서, 단리된 세포외 소포는 중간엽 기질 세포의 모든 세포외 소포에서 KRT19, TUBB, TUBB2A, TUBB2B, TUBB2C, TUBB3, TUBB4B, TUBB6, CFL1(HEL-S-15), VIM, EEF1A1, EEF1A1P5, PTI-1, EEF1A1L14, EEFA2, ENPP1, NT5E, HSPA8(HEL-S-72p), RAB10, CD44, MMP2, CD109, 및 DKFZp686P132의 평균 수준에 비해 적어도 10%, 20%, 30%, 50%, 또는 100% 많은 KRT19, TUBB, TUBB2A, TUBB2B, TUBB2C, TUBB3, TUBB4B, TUBB6, CFL1(HEL-S-15), VIM, EEF1A1, EEF1A1P5, PTI-1, EEF1A1L14, EEFA2, ENPP1, NT5E, HSPA8(HEL-S-72p), RAB10, CD44, MMP2, CD109, 및 DKFZp686P132의 양을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단리된 세포외 소포는 감소된 MHCII 오염물질을 갖거나 MHCII 오염물질이 실질적으로 또는 완전히 없으며, 예컨대 중간엽 기질 세포의 모든 세포외 소포에서 MHCII 오염물질의 평균 수준에 비해 적어도 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 적은 MHCII 오염물질의 양을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단리된 세포외 소포는 감소된 피브로넥틴 함량을 갖거나 피브로넥틴이 실질적으로 또는 완전히 없으며, 예컨대 중간엽 기질 세포의 모든 세포외 소포에서 피브로넥틴의 평균 수준에 비해 적어도 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 적은 피브로넥틴의 양을 포함한다.
E. 세포외 소포를 사용한 치료
본 출원의 방법을 위해 유용한 조성물은 카테터 투여, 전신 주사, 국소화된 주사, 정맥내 주사, 자궁내 주사 또는 비경구적 투여를 포함하여, 특히 국소화된 주사를 통해 투여될 수 있다. 본원에 기재된 치료 조성물(예를 들어, 약학 조성물)을 투여할 때, 이는 일반적으로 단위 투여량 주사가능 형태(예를 들어, 용액, 현탁액, 또는 에멀젼)로 제형화될 것이다.
임의의 실시양태에서, 세포외 소포의 2, 3, 4, 5 회 이상의 투여를 포함하여, 세포외 소포의 단일 또는 반복 투여가 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 EV는 2 회 용량, 3 회 용량, 4 회 용량, 5 회 용량, 6 회 용량, 7, 회 용량, 8 회 용량, 9 회 용량, 12 회 용량, 15 회 용량, 18 회 용량 이상으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 단리된 EV는 1 주 이내에 2 회 용량, 3 회 용량, 4 회 용량, 5 회 용량, 6 회 용량, 7, 회 용량, 8 회 용량, 9 회 용량, 12 회 용량, 15 회 용량, 18 회 용량 이상으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 세포외 소포는 연속으로 투여될 수 있다. 반복 또는 연속 투여는 치료되는 병태의 중증도에 따라 수시간(예를 들어, 1-2, 1-3, 1-6, 1-12, 1-18, 또는 1-24 시간), 수일(예를 들어, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6 일, 또는 1-7 일) 또는 수주(예를 들어, 1-2 주, 1-3 주, 또는 1-4 주)의 기간에 걸쳐 발생할 수 있다. 투여가 반복되지만 연속적이지 않은 경우, 투여 사이의 시간은 시간(예를 들어, 4 시간, 6 시간, 또는 12 시간), 일(예를 들어, 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 또는 6 일), 또는 주(예를 들어, 1 주, 2 주, 3 주, 또는 4 주)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 EV는 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 4 일, 5, 일, 6 일, 또는 주 당 1 회의 간격으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 단리된 EV는 2 일 동안, 3 일 동안, 4 일 동안, 5 일 동안 또는 1 주일 동안 매일 1 회 투여된다. 투여 사이의 시간은 동일할 수 있거나 이들은 상이할 수 있다. 예를 들어, 질환의 증상이 악화되는 것으로 나타나는 경우, 세포외 소포는 더욱 빈번하게 투여된 다음에, 증상이 안정화되거나 약화되면, 세포외 소포는 덜 빈번하게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, EV는 호흡곤란, 예컨대 ARDS의 개시 시에 투여될 수 있고, 적어도 호흡곤란의 기간 동안 투여가 계속될 수 있다. 일부 실시양태에서, EV는 기계적 인공호흡의 기간 대부분 또는 전부 동안 투여될 수 있다. 이러한 투여는 기저 병태 또는 기계적 인공호흡 자체로부터 야기된 염증을 감소시킬 수 있다. 이러한 투여는 기계적 인공호흡의 유해 효과를 감소시킬 수 있다.
EV는 낮은 투여량 형태로 반복적으로 또는 높은 투여량 형태의 단일 투여로서 투여될 수 있다. 낮은 투여량 형태는, 비제한적으로, 1-50 ㎍/kg의 범위일 수 있는 한편, 높은 투여량 형태는, 비제한적으로, 51-1000 ㎍/kg의 범위일 수 있다. 질환의 중증도, 대상체의 건강, 및 투여의 경로에 따라, 특히 낮거나 높은 용량의 세포외 소포의 단일 또는 반복 투여가 고려된다는 것이 이해될 것이다.
EV의 단위 용량은 EV의 인지질/치료되는 대상체의 kg일 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 EV의 유효 용량은 EV의 인지질 50 pmol/치료되는 대상체의 kg(pmol/kg)이다. 일부 실시양태에서, 단리된 EV의 유효 용량은 EV의 인지질 20 내지 500 pmol/치료되는 대상체의 kg(pmol/kg)이다. 일부 실시양태에서, 단리된 EV의 유효 용량은 EV의 인지질 100 내지 500 pmol/치료되는 대상체의 kg(pmol/kg)이다. 일부 실시양태에서, 단리된 EV의 유효 용량은 EV의 인지질 200 내지 500 pmol/치료되는 대상체의 kg(pmol/kg)이다. 일부 실시양태에서, 단리된 EV의 유효 용량은 20-150 pmol/kg이다. 일부 실시양태에서, 단리된 EV의 유효 용량은 25-100 pmol/kg이다. 일부 실시양태에서, 단리된 EV의 유효 용량은 25-75 pmol/kg이다. 일부 실시양태에서, 단리된 EV의 유효 용량은 40-60 pmol/kg이다.
EV는 조합 치료에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, EV는 포스포디에스테라아제 5-형(PDE5) 억제제, 프로스타사이클린 작용제, 또는 엔도텔린 수용체 길항제 중 하나 이상을 포함하는 치료제와 함께 투여된다. 일부 실시양태에서, 단리된 EV 및 치료제는 동일한 조성물로 투여된다. 일부 실시양태에서, EV 및 치료제는 별도 조성물로 실질적으로 동시에 또는 순차적으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 단리된 EV 및 치료제는 6 시간, 12, 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 4 일, 5, 일, 6 일, 또는 주 당 1 회의 간격으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 방법은 치료제로서 포스포디에스테라아제 5-형(PDE5) 억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, PDE5 억제제는 실데나필, 바르데나필, 자프라비스트, 운데나필, 다산타필, 아바나필, 미로데나필, 또는 로데나필을 포함한다. 일부 실시양태에서, PDE5 억제제는 실데나필이다. 일부 실시양태에서, 단리된 EV 및 포스포디에스테라아제 5-형(PDE5) 억제제는 별도 조성물로 실질적으로 동시에 또는 순차적으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 단리된 EV 및 포스포디에스테라아제 5-형(PDE5) 억제제는 동일한 조성물로 투여된다. 일부 실시양태에서, 단리된 EV 및 PDE5 억제제는 1 회 이상의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 단리된 EV 및 PDE5 억제제는 6 시간, 12, 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 4 일, 5, 일, 6 일, 또는 주 당 1 회의 간격으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 단리된 EV는 2 회 용량, 3 회 용량, 4 회 용량, 5 회 용량, 6 회 용량, 7 회 용량, 8 회 용량, 9 회 용량, 12 회 용량, 15 회 용량, 18 회 용량 이상으로 투여되고, PDE5 억제제는 16 회 용량, 19 회 용량, 21 회 용량, 24 회 용량, 27 회 용량, 30 회 용량, 33 회 용량, 36 회 용량, 39 회 용량, 42 회 용량, 45 회 용량, 48 회 용량, 51 회 용량, 54 회 용량, 57 회 용량, 60 회 용량, 63 회 용량, 66 회 용량 이상으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 단리된 EV는 1 주 이내에 2 회 용량, 3 회 용량, 4 회 용량, 5 회 용량, 6 회 용량, 7 회 용량, 8 회 용량, 9 회 용량, 12 회 용량, 15 회 용량, 18 회 용량 이상으로 투여되고, PDE5 억제제는 1 주 이내에 16 회 용량, 19 회 용량, 21 회 용량, 24 회 용량, 27 회 용량, 30 회 용량, 33 회 용량, 36 회 용량, 39 회 용량, 42 회 용량, 45 회 용량, 48 회 용량, 51 회 용량, 54 회 용량, 57 회 용량, 60 회 용량, 63 회 용량, 66 회 용량 이상으로 투여된다.
일부 실시양태에서, EV는 프로스타사이클린 작용제와 함께 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로스타사이클린 작용제는 에포프로스테놀 소듐, 트레프로스티닐, 베라프로스트, 일프로스트, 및 PGI2 수용체 작용제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 EV 및 프로스타사이클린 작용제는 6 시간, 12, 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 4 일, 5, 일, 6 일, 또는 주 당 1 회의 간격으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 단리된 EV 및 프로스타사이클린 작용제는 1 회 이상의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 단리된 EV 및 프로스타사이클린 작용제는 별도 조성물로 실질적으로 동시에 또는 순차적으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 단리된 EV 및 프로스타사이클린 작용제는 동일한 조성물로 투여된다.
일부 실시양태에서, EV는 엔도텔린 수용체 작용제와 함께 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 EV 및 엔도텔린 수용체 작용제는 1 회 이상의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 단리된 EV 및 엔도텔린 수용체는 6 시간, 12, 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 4 일, 5, 일, 6 일, 또는 주 당 1 회의 간격으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 단리된 EV 및 엔도텔린 수용체 작용제는 별도 조성물로 실질적으로 동시에 또는 순차적으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 단리된 EV 및 엔도텔린 수용체 작용제는 동일한 조성물로 투여된다.
세포외 소포는 통상적으로 약학적 허용 담체와 조합될 때, 약학적 허용 제제(또는 약학적 허용 조성물)로 사용(예를 들어, 투여)될 수 있다. 어구 "약학적 허용"은 타당한 이득/위험 비와 비례하여, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 정통한 의학적 판단의 범위 내에서 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 투여량 형태를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 어구 "약학적-허용 담체"는 약학적-허용 물질, 조성물 또는 비히클, 예컨대 액체 또는 고체 필러, 희석제, 부형제, 또는 용매 캡슐화 물질을 의미한다.
이러한 제제는 일상적으로 약학적 허용 농도의 염, 완충제, 보존제, 양립가능한 담체를 함유할 수 있고, 선택적으로 다른(즉, 이차) 치료제를 포함할 수 있다. 약학적 허용 담체는 약학적 허용 물질, 조성물 또는 비히클, 예컨대 액체 또는 고체 필러, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질이고, 예방적 또는 치료적 활성제를 운반하거나 수송하는데 관련된다. 각각의 담체는 제형의 다른 성분과 양립가능하고 대상체에 손상을 주지 않는 의미에서 "허용가능"이어야 한다. 약학적 허용 담체로서 제공될 수 있는 물질의 일부 예는 당, 예컨대, 락토오스, 글루코오스 및 수크로오스; 염, 예컨대 염화나트륨; 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA); 글리콜, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜; 폴리올, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 에스테르, 예컨대 에틸 올리에이트 및 에틸 라우레이트; 완충제, 예컨대 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; 무-발열원 물; 등장성 식염수; 링거액(Ringer's solution); 에틸 알코올; 인산염 완충액; 및 약학 제형에 이용되는 다른 비독성 양립가능 물질을 포함한다.
제제는 유효량으로 투여된다. 유효량은 단독으로 소망하는 결과를 자극하는 약제의 양이다. 절대량은 투여가 단일 또는 다중 용량이든, 투여를 위해 선택된 물질, 및 연령, 신체적 상태, 크기, 체중, 및 질환의 단계를 포함한 개별 환자 파라미터를 포함한 다양한 인자에 의존할 것이다. 이들 인자는 통상의 기술자에게 잘 알려져 있고 일상적 실험을 초과하지 않고 해결될 수 있다.
다른 실시양태는 패키징되고 표지된 약학 제품을 포함한다. 제품 또는 키트의 이 글은 적절한 관 또는 용기, 예컨대 유리 바이알 또는 플라스틱 앰플 또는 완전 밀봉되는 다른 용기의 적절한 단위 투여량 형태를 포함한다. 단위 투여량 형태는 예를 들어 에어로졸에 의한 폐 전달에 적합해야 한다. 바람직하게는, 제품 또는 키트의 글은 약학 제품을 어떻게 투여하는지를 포함하여, 어떻게 사용하는지에 대한 설명서를 포함한다. 설명서는 의문의 질환 또는 장애를 어떻게 적절하게 예방 또는 치료하는지에 대해 의사, 의료기사 또는 대상체에 조언하는 정보 재료를 추가로 포함할 수 있다. 다시 말해, 제품의 글은, 비제한적으로, 실제 용량, 모니터링 절차, 및 다른 모니터링 정보를 포함하여, 사용을 위한 투여 요법을 나타내거나 제안하는 설명서를 포함한다.
임의의 약학 제품과 같이, 패키징 재료 및 용기는 저장 및 선적 동안 제품의 안정성을 보호하도록 설계된다. 키트는 직접 사용될 수 있거나 정맥내 주사 또는 네뷸라이저에서의 사용을 위해 생리식염수와 희석될 수 있는 멸균 수성 현탁액, 또는 희석액 또는 기관내 투여를 위한 계면활성제와의 조합으로 MSC 세포외 소포를 포함할 수 있다. 따라서, 키트는 또한 희석액 또는 희석제, 예컨대 식염수 또는 계면활성제를 포함할 수 있다.
실시예
다음 실시예는 통상의 기술자에게 어떻게 본원에 기재된 방법 및 조성물을 제조 및 사용하는지의 완전한 개시 및 기재를 제공하도록 의도되고, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1.1 - EV 집단을 단리시키는 일반 방법
이 실시예는 세포 배양 배지로부터 EV의 단리를 나타낸다.
여과: 중간엽 줄기 세포(MSC)로부터 얻어진 조건부 배지를 필터 라인을 통해 펌핑하여, 임의의 세포, 사멸된 세포, 및 세포 파편을 제거하였다. 그 다음에, 조건 배지에 25 mM HEPES 및 10 mM EDTA 버퍼를 보충하였다.
탄젠트 흐름 여과(Tangential flow filtration): 조건부 배지를 단일 100 kDa MWCO 카세트를 구비한 탄젠트 흐름 여과(TFF) 시스템에 의해 농축하였다. 농축액을 수집하고 0.22 um 필터를 사용하여 여과하였다. 여과액을 10 mL 분취량 샘플로 나누고 -80℃에서 냉동하였다.
정용여과: 샘플은 선택적으로 바람직하게는 TFF 단계 후 및 분획 단계 전에, 정용여과 단계를 거칠 수 있으며, 이는 버퍼 교환과 유사하다. EV의 소망하는 농도에 도달하면, PBS 버퍼를 저장소를 통해 샘플에 첨가하여, 부피를 유지하는 한편, TFF 카세트 필터로 펌프 작동을 계속하였다. 점차, PBS로 조건부 배지를 교체하였다. 가능한 완전한 교환을 달성하기 위해, 농축액으로 7 회의 총 부피 정용여과를 수행하였다. 이 단계는 EV에 영향을 주지 않으면서 농축액에서 일부 불순물을 제거하는 것을 돕는다. EV의 존재를 FLOT-1 웨스턴 블롯에 의해 입증하였고, 이는 총 단백질 및 인지질의 감소된 양을 나타낸다.
분획: 샘플을 대략 10 분 동안 37℃에서 해동하였다. 모든 샘플을 150 mL 코닝(corning) 병에 함께 모았다. Axichrom 70/500 칼럼을 Sepharose CL-2B 수지(GE)로 채웠다. Axichrom 70/500 칼럼을 AKTA Avant 150(GE)에 연결한다. 샘플을 샘플 라인을 통해 칼럼 내로 도입시켰다. 모든 샘플이 칼럼에 도입되면, 용출 단계를 개시하였다(설정: 9.0 mL/분의 유속). 공동 칼럼의 0.2 칼럼 부피(CV)를 용출한 다음에, 분획 수집기가 1 분/분획(각각의 분획에서 4.6 mL)의 속도로 분획을 수집하였다. 분획을 0.6 CV가 용출될 때(EV가 0.3 CV-0.4 CV로 용출될 때)까지 수집하였다. PBS를 전체 실험 동안 사용하였다. 분획 샘플을 덮개 아래에 덮고 4℃에서 저장하였다.
인지질 농도 측정: 인지질 시그널링을 EV 검출을 위해 사용하였다. 간단하게는, 분획 후, 각각의 EV 제제 20 uL 및 반응 혼합물(Sigma) 80 uL를 검정색 투명-바닥 96-웰 플레이트(Corning, Corning, NY) 내로 옮기고 빛으로부터 보호된 실온에서 30 분 동안 항온처리하였다. 형광 강도를 FLUOstar™ Omega 마이크로플레이트 판독기(BMG Labtech, Ortenberg, Germany)를 사용하여 530/585 nm에서 측정하였다. 나타낸 EV 생산 운영에서, A214 크로마토그램 및 인지질 둘 다를 EV 검출을 위해 이용하였다.
실시예 1.2 - 중간엽 줄기 세포(MSC)로부터 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 단리된 EV의 특징.
이 실시예는 MSC로부터 EV의 단리 및 MSC로부터 단리된 EV가 크로마토그래피 프로파일에 의해 섬유아세포-유래된 EV와 구별될 수 있다는 것을 나타낸다.
다른 세포-분비된 인자로부터 세포외 소포(EV)를 분리하는, Sepharose®-기반 수지를 구비한 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 중간엽 줄기 세포(MSC)로부터의 세포 배양 상청액으로부터 EV를 정제하다. MSC로부터의 정제된 EV를 포함하는 약물 물질 배치를 UNEX 18-001, UNEX 18-002, UNEX 18-009, UNEX 18-011, 및 UNEX 18-015로 지칭하고, EV의 이들 발달 등급 배치를 종합적으로 UNEX-42로 지칭한다. 비교를 위해, EV를 또한 섬유아세포 배양액으로부터 단리하였고, 섬유아세포-유래된 EV를 포함하는 배치를 UNEX-18-014로 지칭한다. 이 정제 단계 동안, 과정내 크로마토그래피 프로파일을 칼럼으로부터 물질을 용출함에 따라 214 nm의 자외선(UV) 광 흡수(A214)를 기초로 하여 생성하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, EV 벌크 약물 물질은 대략 0.3 내지 0.5 칼럼 부피(CV)에서 관찰되는 흡수 피크와 일치한다. 100 nm(Phosphorex, 4002) 및 200 nm(Phosphorex, 2202)의 직경을 갖는 기준 폴리스티렌 비드를 동일한 크로마토그래피 조건 하에 운영하고, 이들의 프로파일을 도 1a에 나타낸 바와 같은 대표 정제 크로마토그램으로서 UNEX 18-015와 중첩시켰다. 최신 SEC 수지 및 파라미터는 100 nm와 200 nm 사이의 차이를 해결할 수 없는 한편, 이들 데이터는 단리된 EV의 입자 크기가 이들 기준 비드의 크기 범위와 유사하다는 것을 확인한다.
SEC를 사용하여 MSC로부터 단리된 EV 배치의 크로마토그래피 프로파일을 중첩시키고 도 1b에 나타낸 바와 같이 섬유아세포-유래된 EV와 비교하였다. 이들 데이터는 EV 정제의 일관성이 용출 부피, 피크 규모 및 곡선의 전체 형상/비대칭을 기초로 운영된다는 것을 나타낸다. 중요하게는, EV의 크로마토그램은 섬유아세포-유래된 EV와 별개인 프로파일을 드러낸다.
나노입자 추적 분석(NTA)은 광 산란 및 실시간 입자 이동을 기초로 하여 입자 크기 및 농도를 결정하는 비디오-기반 방법이다. NTA는 용액에서 EV 정량 및 크기 분포를 결정하기 위해 일반적으로 사용되는 도구이다. 분포 히스토그램을 생성하는 정립된 NTA 방법을 사용하여, EV의 발달-등급 배치는 아래 도 2 및 표 1에 나타낸 바와 같이 주로 대략 50 내지 350 nm 직경의 크기 범위의 입자를 함유하는 것으로 밝혀졌다. MSC-유래된 EV에 대해 도 2에 제시된 경험적 데이터를 기초로 한 공개된 연구결과와 일치하여, 본원의 MSC로부터 단리된 EV는 고도의 다분산계 집단을 나타낸다. 이 분포 프로파일을 기재하기 위해 캡처된 매트릭스는 측정된 입자가 전체 집단위 10, 50, 및 90 백분위 미만에 속하는 (1) 가중 평균, (2) 가중 방식, 및 (3) 크기를 포함한다. 크기 분포뿐 아니라, 입자 농도는 아래 표 1에 나타낸 바와 같이 중간엽 줄기 세포 유래된 EV 및 섬유아세포-유래된 EV의 발달-등급 배치 사이에 유사하다.
Figure pct00001
실시예 1.4 - MSC로부터 유래된 EV의 단백질 프로파일을 결정하기 위한 글로벌 단백질체 분석.
글로벌 단백질체 분석을 수행하여, MSC로부터 유래된 EV의 발달-등급 배치 각각에 대한 단백질 프로파일을 생성하였다. 프로파일을 배치 사이에 비교하여, 생산물 일관성을 결정하였고, 이들을 또한 섬유아세포-유래된 EV의 프로파일과 비교하여, MSC로부터 유래된 EV의 특정 단백질 프로파일을 확인하였다. 각각의 샘플을 트립신 분해 후, UPLC-MS/MS에 의한 펩티드 프로파일링을 위해 삼중으로 제출하였다. 배치 UNEX 18-011을 불충분한 판독으로 인해 판독으로부터 배제하였다. 이들 데이터를 기초로 하여, 도 4a에 제시된 바와 같이 MSC-유래된 EV와 섬유아세포-유래된 EV의 배치 사이에 최고 100 개의 상이하게 함유된 단백질을 나타내는 열 지도를 생성하였다. 이들 프로파일은 MSC-유래된 EV의 배치 사이에 높은 유사성이 있고, 이들의 함량은 섬유아세포-유래된 EV의 단백질 프로파일과 상이하다는 것을 나타낸다. 추가 분석을 수행하여, MSC-유래된 EV의 배치 사이의 가장 공통인 단백질을 결정하였다. 중요하게는, 142 개 서열이 분석된 MSC-유래된 EV의 4 개 배치 전부에 존재하는 것으로 확인되었다. 142 개 히트를 섬유아세포-유래된 EV와 비교하고, MSC-유래된 EV에 대해 특이적인 25 개 단백질의 세트를 아래 표 3에 제시된 세포 기능에 의해 그룹화된 완전 목록으로 확인하였다(도 4b).
Figure pct00002
실시예 1.5 - EV의 발달 등급 배치에 대한 특이적 마커의 분석.
EV 제제는 국제 세포외 소포 학회(International Society for Extracellular Vesicles)(ISEV)에 따른 적어도 3 개의 예상된 단백질의 반-정량적 또는 정량적 평가를 기초로 하여 최소로 특징지어져야 한다. 예상된 단백질은 1) 소포 내강 내에 위치되거나, 2) 소포 표면 상의 모이어티와 연합되거나, 3) 소수성 도메인을 통해 지질 이중층에 내장될 수 있다. 또한, EV 제제는 관심 집단에서 풍부화될 것으로 예상되지 않는 단백질의 부재에 대해 평가되어야 한다는 것이 권고된다. 반-정량적(예를 들어, 웨스턴 블롯) 또는 정량적(예를 들어, 효소-결합 면역흡착 분석[ELISA]) 단백질 분석 방법을 사용하여, MSC 유래된 EV 발달-등급 제제(UNEX-42로 지칭됨)를 예상된 및 비예상된 관심 단백질의 존재에 대해 분석하였다. 개별 UNEX-42 배치를 마커 분석의 결과를 제시하는 표 4에서 UNEX 18-001, UNEX 18-002, UNEX 18-009, UNEX 18-011, 및 UNEX 18-015로 지칭한다. 이들 결과를 UNEX 18-014로 지칭되는 섬유아세포-유래된 EV 배치와 비교하였다.
Figure pct00003
표 4는 섬유아세포-유래된 배치와 비교하여, UNEX-42 배치에서 Syntenin-1(또는 신데칸 결합 단백질, SDCBP), Anxa2, Flotillin(FLOT-1), CD105, MHC-I, 및 MHC-II의 양을 제시하였다.
Syntenin-1(또는 신데칸 결합 단백질, SDCBP)은 막관통 단백질 수송, 소포 선별, 및 엑소좀 생물발생에 관련된 어댑터 단백질이다. Syntenin-1은 수송 연관 엔도솜-선별 복합체(ESCRT) 기구의 구성요소와 간접적으로 연관되고 막관통 단백질의 테트라스패닌 클래스와 직접 연관된다. 표 4에 제시된 바와 같이 Syntenin-1은 웨스턴 블롯에 의해 MSC로부터 유래된 EV의 5 개 UNEX-42 발달-등급 배치 전부에서 검출되었으나, 섬유아세포-유래된 EV에서는 그렇지 않았다.
Annexin은 칼슘-의존적 인지질-결합 특성이 특징이고 막 지질 도메인을 조직하는 역할을 하는 단백질의 패밀리이다. Annexin A2는 EV의 외부 및 내부 엽상부 둘 다에 국소화될 수 있고, 포스파티딜 세린 지질 유동섬 및 콜레스테롤 마이크로도메인과 연합되는 것으로 나타났다. Annexin A2를 표 4에 제시된 바와 같이 MSC로부터 유래된 EV뿐 아니라, 섬유아세포-유래된 EV의 모든 UNEX-42 발달-등급 배치에서 웨스턴 블롯에 의해 검출하였다.
Flotillin 1(FLOT-1)은 내포작용 및 엔도솜 수송에 관련된 막-연관된 단백질이다. Flotillin 1은 EV에 대해 잘 정립된 단백질 마커이고, MSC로부터 유래된 EV뿐 아니라, 섬유아세포-유래된 EV의 모든 UNEX-42 발달-등급 배치에서 웨스턴 블롯에 의해 검출되었다(표 4). flotillin-1의 검출을 UNEX-42 약물 생산물의 방출 시험에 대해 수행하였다.
CD105(또는 엔도글린, ENG)는 시그널링 분자의 전환 성장 인자 베타(TGFβ) 수퍼패밀리에 대한 부수적 수용체이고, MSC의 원형질막 표면 상에 발현된다. EV는 이들의 원래 세포와 유사한 표면 마커 프로파일을 보유한 것으로 알려져 있고, MSC-유래된 EV는 이전에 CD105를 함유하는 것으로 나타났다. CD105의 단백질 수준을 표 4에 열거된 결과로 ELISA에 의해 UNEX-42 및 섬유아세포-유래된 EV의 발달-등급 배치에 대해 평가하였다. CD105를 MSC로부터 유래된 EV의 5 개의 UNEX-42 발달-등급 배치 전부에서 검출하였으나, 섬유아세포-유래된 EV에서는 그렇지 않았다(표 4). CD105 ELISA 방법을 UNEX-42 약물 물질 및 UNEX-42 약물 생산물 방출 시험 둘 다에 대해 확인 마커로서 수행하였다.
인간 백혈구 항원(HLA-) A, B, 및 C를 포함하는 주조직적합성 복합체 클래스 I(MHC-I) 단백질은 세포독성 T 림프구에 대한 시토솔 항원 제시를 용이하게 하는 세포 표면 단백질이다. MSC는 MHC-I 단백질의 다양한 수준을 발현하는 것으로 알려지고, 나아가, MHC-I 단백질은 골수 MSC-유래된 EV 상에 존재하는 것으로 예상되었다. MSC로부터 유래된 EV의 5 개의 UNEX-42 발달-등급 배치 전부는 MHC-I을 발현하는 것으로 밝혀졌지만, MHC-I은 섬유아세포-유래된 EV에서 검출되지 않았다(표 4).
HLA-DR 단백질 및 다른 것들을 포함하는 주조직적합성 복합체 클래스 II(MHC-II) 단백질은 헬퍼 T 림프구에 대한 외인성 항원 제시를 용이하게 한다. MHC-I과 달리, MSC는 MHC-II를 발현하지 않으며, 이는 동종이계 이식의 맥락에서 면역-특권의 일부 수준을 전달한다. 예상된 바와 같이, MSC로부터 유래된 EV의 UNEX-42 배치는 MHC-II를 발현하지 않을뿐 아니라, 이는 섬유아세포-유래된 EV에서도 검출되지 않는다(표 4).
MSC로부터 유래된 EV의 UNEX-42 배치는 또한 막관통 단백질의 테트라스패닌 패밀리의 멤버의 발현이 막 조직, 엔도솜 수송, 및 세포외 소포 생물발생과 관련된다는 것이 특징이었다. CD63, CD81, 및 CD9는 세포외 소포와 가장 일반적으로 연관된 테트라스패닌 단백질이다. CD63, CD81, 및 CD9의 존재 및 빈도를 ExoViewTM 분석 플랫폼(NanoView Biosciences)을 사용하여 결정하였으며, 이는 면역친화 미세배열의 특징을 향상된 광-산란 현미경과 조합한다. 간단하게는, EV를 우선 관심 캡처 항체, 구체적으로 CD63, CD81, 및 CD9를 사용하여 칩 배열 상에 고정하였다. 결합된 입자를 향상된 명시야 하에서 시각화하고 플랫폼 소프트웨어를 사용하여 계수하였다. 데이터의 요약이 도 5에 제시되어 있다. CD63은 MSC로부터 유래된 EV의 5 개의 UNEX-42 발달-등급 배치 전부에서 우세한 표면 마커였다. MSC로부터 유래된 EV의 UNEX-42 발달-등급 배치는 중간 양의 CD81 및 적은 양의 CD9를 함유하였다. 3 개의 테트라스패닌 전부를 섬유아세포-유래된 EV에서 최소로 검출하였다.
도 6은 상기 제시된 데이터를 기초로 하여 MSC로부터 유래된 UNEX-42 EV의 예시적 일반 도식을 나타낸다.
실시예 1.6 - MSC로부터 유래된 EV의 혈관신생 활성
MSC로부터 유래된 EV는 인간 내피세포에서 관 형성을 촉진하고, 인간 내피세포에서 고산소-매개된 관 네트워크 손실을 예방하는 것으로 나타났다.
혈관신생을 촉진하는 UNEX-42의 능력을 평가하기 위해, 인간 제정맥 내피세포(HUVEC)를 대략 80% 콘플루언스(confluence)로 Matrigel-코팅된 플레이트 상에서 성장시켰다. PBS 또는 UNEX-42를 이용한 3-시간 전처리 후, 내피관 분기점을 5 시간에 걸쳐 평가하였다. 도 8에 나타낸 바와 같이, UNEX-42는 총 분기점을 2-배 초과로 증가시켰으며, 이는 UNEX-42가 기관지폐형성이상(BPD) 발달에 대한 위험의 유아에서 미세혈관 네트워크 형성을 촉진할 수 있다는 것을 제시하였다.
또한, 정상 공기에 노출된 HPAEC는 배양액에서 네트워크를 형성시켰다. 그 다음에, 세포를 3 시간 동안 PBS 또는 UNEX-42에 노출시킨 후, 40 시간 동안 정상산소(21% O2) 또는 고산소(97% O2)에 노출시켜, 고산소-매개된 혈관 네트워크 손상을 모델링하였다. 관 분기점을 평가하였으며, 고산소에 대한 대조군 세포의 노출은 분기점에서의 감소에 의해 나타난 바와 같이 HPAEC 네트워크의 열화를 야기한 반면, UNEX-42 전처리는 도 9에 나타낸 바와 같이 이 열화를 완전히 예방하였다.
또한, 본원에 개시된 MSC로부터 유래된 EV가 정상 폐 발달을 위해 요구되는 기질 금속단백질분해효소(MMP)의 감소를 예방할 수 있는지 여부를 시험하였다. 본원에 개시된 MSC로부터 유래된 EV가 MMP2 수준의 감소를 예방할 수 있는지 여부를 평가하기 위해, HUVEC를 3 시간 동안 PBS 또는 UNEX-42 후, 24 시간의 정상산소 또는 고산소(97% O2)에 노출시킨 후, 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)을 사용함으로써 배지 내로 분비된 MMP2의 양을 측정하였다. 도 10에 나타낸 바와 같이, MMP-2 수준은 고산소 노출 후 감소되었으며, 이는 UNEX-42 전처리에 의해 예방되었다.
이들 결과는 본원에 개시된 MSC로부터 유래된 EV가 혈관신생 활성을 갖는다는 것을 나타낸다. 또한, 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 MSC로부터 유래된 EV는 BPD를 앓는 유아에서 혈관신생을 촉진하고 고산소 치료로부터 기존의 혈관을 보호함으로써 BDP를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
실시예 1.7 - MSC로부터 유래된 EV에 의한 세포 구제
이 실시예의 목적은 MSC로부터 유래된 EV가 산소 스트레스에 의해 야기된 시토크롬 C의 방출을 예방함으로써 호흡곤란을 나타내는 미숙아에서 기관지폐형성이상(BPD)을 예방하기 위한 치료로서 사용될 수 있는 경우를 시험하기 위한 것이다. BPD에서 나타나는 폐 상피 세포 손상을 모델링하기 위해, 시험관내 연구를 A549 세포를 사용하여 수행하였다.
A549 세포의 고산소 노출은 배양액에서 남아있는 총 핵산 함량에 의해 측정된 바와 같이 분비된 시토크롬 C의 극적인 유도 및 생존 세포의 손실를 야기한 반면, 도 7에 나타낸 바와 같이 UNEX-42 EV는 양측 효과를 예방하고, 정상 시토크롬 C 수준을 유지하고 생존 세포 손실을 감소시켰다. 특히, 도 7은 UNEX-42 EV가 시토크롬 C의 고산소 유도된 방출을 감소시키고(A) 정상산소 세포의 것에 대해 고산소 처치된 세포에서 시토크롬 C의 세포 수준을 유지하였다(B)는 것을 나타내었다.
따라서, MSC로부터 유래된 EV는 고산소에 노출된 A549 폐 암종 세포에서 시토크롬 C의 분비를 예방하고 생존 세포 손실을 감소시키는 것으로 나타났다.
이들 결과는 본원에 개시된 MSC로부터 유래된 EV가 세포 생존력을 구제하고, 산화 스트레스에 의해 야기된 시토크롬 C의 방출을 예방함으로써 호흡곤란을 나타내는 미숙아에서 기관지폐형성이상(BPD)을 예방하기 위한 치료로서 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 1.8 - MSC로부터 유래된 EV에 의한 개선된 대사 기능
MSC로부터 유래된 EV는 저산소에 노출된 폐 동맥 민무늬근 세포(PASMC)에서 글루코오스 대사를 증가시키고 미토콘드리아 산소 소비를 개선하는 것으로 나타났다.
산소 소비에 대한 MSC로부터 유래된 EV의 효과를 평가하기 위해, PASMC를 24 시간의 저산소에 노출시킨 후, 미토콘드리아 스트레스 시험이 이어졌으며, 이에 의해 일련의 화합물을 세포 배양 시스템에 주사하여, ATP 생산(올리고마이신), 최대 호흡(카보닐 사이아나이드 p-트리플루오로메톡시페닐하이드라존[FCCP]), 및 비-미토콘드리아 호흡(로테논/안티마이신 A)을 결정하였다. UNEX-42는 도 11a에 나타낸 바와 같이 미토콘드리아 스트레스 시험의 모든 단계 동안 용량-의존 방식으로 저산소 세포의 산소 소비를 증가시켰다. 이들 데이터는 저산소 노출 후 산소 소비를 증가시키는 UNEX-42의 가능성을 나타낸다.
추가 실험은 이 미토콘드리아 이점에 관련된 대사물질을 조사하였다. PASMC를 콘플루언스로 배양하고 세포를 PBS 또는 UNEX-42로 처치하였다. 세포를 2 주 동안 저산소(4% 산소)에서 유지하고, 배양 1, 4, 8, 및 11 일차에 UNEX-42 또는 PBS로 격주로 처치하였다. 대사물질 분석을 대사체학 프로파일링을 위해 초고성능 액체 크로마토그래피/이중 정확 질량 분석법(UHPLC/MS/MS) 및 mLIMS 대사물질 표준 라이브러리를 이용하는 글로벌 대사체학 플랫폼을 사용하여 수행하였다. 대사체학 데이터를 Metabolync 소프트웨어(Metabolon, Morrisville, NC)를 사용하여 분석하였다. 저산소는 피루베이트의 락테이트로의 극적인 전환을 야기하였고, 도 11b에 나타낸 바와 같이 PAH에서 나타난 해당 변화와 일치하는 배양 배지에서의 높은 락테이트 수준을 야기하였다. UNEX-42의 첨가는 배양 배지에서 글루코오스의 수준을 감소시켰고, 이는 글루코오스 흡수에서의 증가를 나타내었다. UNEX-42의 첨가는 또한 배양 배지에서 락테이트 수준에서의 감소를 야기하였고, 이는 미토콘드리아 내로의 피루베이트 진입, 이에 의한 락테이트 생산 감소를 나타내었다(도 11b). 이 조합된 효과는 만성 저산소 노출 동안 미토콘드리아 내로의 영양소 흐름에서의 증가를 반영하고 BPD 및 BPD-연관된 PH 둘 다의 맥락에서 UNEX-42의 치료적 이득을 지지한다.
실시예 1.9 - MSC로부터 유래된 EV의 면역조절 활성
MSC로부터 유래된 EV는 고산소에 노출된 A549 폐 암종 세포에서의 사이토카인 분비를 예방하고, 지질다당류 노출 후 생체내 설치류 모델에서 THP1 단핵구 백혈병 세포에서 시험관내에서 사이토카인 및 케모카인 분비를 감소시키는 것으로 나타났다.
산화 스트레스의 결과로서 전-염증성 사이토카인의 분비를 예방하는 본원에 개시된 MSC로부터 유래된 EV의 능력을 평가하기 위해, A549 세포를 3 시간 동안 UNEX-42로 준비시킨 다음에, 추가 44 시간 동안 정상산소(21% O2) 또는 고산소(97% O2)에서 배양하였다. 그 다음에, 상청액 배지를 수집하였고 도 12 및 도 13에 나타낸 바와 같이 전-염증성 사이토카인 종양 괴사 인자 알파(TNFα)의 분비에서의 변화, 고산소에 대한 노출은 이들 사이토카인 각각의 분비를 증가시킨 한편, UNEX-42를 이용한 전처리는 이들 수준을 약화시켰다. 특히, 도 12에 도시된 결과는 UNEX-42 EV가 종양 괴사 인자 알파의 고산소-유도된 분비를 억제한다는 것을 나타내었고, 도 13에 도시된 결과는 UNEX-42 EV가 LPS에 의해 유도된 종양 괴사 인자 알파의 분비를 억제할 수 있다는 것을 나타내었다.
고산소 유도된 염증을 거친 인간 폐포 상피 세포에서 전-염증성 사이토카인 TNFa, IL6, 및 IL3의 분비 억제에 대한 UNEX42 EV의 효과는 도 24에 나타낸 바와 같다.
인간 단핵구에서 전-염증성 사이토카인 케모카인(C-X-C 모티프) 리간드 1(GRO), 케모카인(C-C 모티프) 리간드 21(6CKine), 과립구 주화성 단백질 2(GCP2) 케모카인(C-X-C 모티프) 리간드 16(CXCL16)의 분비 억제에 대한 UNEX42 EV의 효과는 도 25-28에 나타나 있다. 또한, UNEX-42 EV는 각각 도 29 및 30에 나타낸 바와 같이 마우스 단핵구에서 LPS-유도된 TNFa 분비, 및 래트 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 LPS-유도된 TNFa 및 케모카인(C-X-C 모티프) 리간드 1(GRO) 분비를 억제하였다는 것이 또한 밝혀졌다.
각각 도 31(a) 및 (b)에 나타낸 바와 같이 LPS에 대한 노출은 인간 THP1 단핵구에서 인터류킨 1 베타(IL1β) 및 인터류킨 12 베타(IL12β)의 mRNA 발현을 증가시킨 한편, UNEX-42를 이용한 전처리는 둘 다의 mRNA 발현을 약화시켰다. IL1β 및 IL12β는 ARDS의 동물 모델에서 상향조절된 사이토카인-코딩 유전자이고, 이들 데이터는 UNEX-42에 대해 순환 단핵구의 염증성 활성을 감소시키는 가능성을 지지한다. 또한, UNEX-42는 도 31(c)에 나타낸 바와 같이 전-염증성 사이토카인 대식세포 염증성 단백질 1 알파(MIP1α) 및 베타(MIP1β)의 분비를 또한 약화시켰다.
항-염증성 사이토카인의 발현에 대한 UNEX-42 EV의 효과를 연구하기 위해, THP-1 단핵구를 IL-4 및 IL-13에 대한 노출을 통해 M0 대식세포, 그 다음에 M2 대식세포에 대해 양극화하였다. M2 양극화 후, UNEX-42를 첨가하고, 유전자 발현을 평가하였다. 도 33에 나타낸 바와 같이 M2 양극화는 만노오스 수용체(CD206) 및 인터류킨 10(IL10) 항-염증성 사이토카인의 mRNA 발현을 증가시켰고, 둘 다의 발현을 UNEX-42 처리에 의해 추가로 유도하였다.
이들 결과는 MSC로부터 유래된 EV가 예를 들어, 보충용 산소를 이용한 호흡의 환경에서 폐에서 전-염증성 사이토카인의 분비를 예방함으로써 면역조절 활성을 갖는다는 것을 나타내었다.
본원에 개시된 MSC로부터 유래된 EV의 면역조절 능력을 추가로 평가하기 위해, 단핵구 및 대식세포의 활성화에 대한 MSC로부터 유래된 EV의 효과를 생체내에서 평가하였다. 이 실험에서, 인간 단핵구를 핵 인자-카파 B (NF-κB)-매개된 염증성 사이토카인 생산의 잘 알려진 활성인자인 LPS의 첨가 전에 3 시간 동안 UNEX-42로 전처리하였다. UNEX-42는 도 13에 나타낸 바와 같이 TNFα의 약화를 나타내었다(도 13).
실시예 1.10 동물 모델에서 UNEX-42 처치의 연구
BPD의 래트 모델
BPD의 래트 모델을 마우스와 비교하여 출생시 이의 큰 크기로 인해 후속 연구를 위해 개발하였으며, 이는 더욱 믿을 수 있고 일관된 투여 및 조직 평가를 허용한다. PND 1에 Sprague Dawley 래트 새끼를 정상산소 또는 고산소(92.5% O2)에 수용하였다. 간호 어미를 정상산소와 고산소 그룹에서의 새끼 사이에 매일 순환시켜, 산소 독성을 회피하였다. 산소 농도를 대표적인 우리 내 실시간 모니터를 사용하여 모니터링하여, 산소 수준을 확인하였다. PBS 비히클 또는 UNEX-42를 제안된 임상 시험에서 사용될 투여 경로인 단일 50-uL IV 주사를 통해 투여하였다. 또한, 사전 데이터는 세포외 소포를 함유한 골수 MSC-유래된 조건부 배지의 단일 IV 용량이 BPD의 유사한 래트 모델에서 폐 구조에 대한 개선을 야기할 수 있다는 것을 나타내었다.
폐 염증에서의 감소를 나타내는 래트 연구
UNEX-42 활성을 평가하기 위한 연구를 설계하여, 폐 내로의 염증 세포의 침습을 측정하였다. 이 연구에서, 신생아 래트 새끼를 간호 어미와 함께 PND 1에 정상산소 또는 고산소(92.5% O2)로 무작위로 할당하였다(아래 표 6 참고). PND 2에 0.003X, 0.01X, 0.03X, 0.1X, 0.3X 또는 1X의 용량의 PBS 또는 UNEX-42를 단일 IV 주사로서 투여하였다. PND 8의 평가는 세포 계수 및 기관지폐포 세척(BAL)에서의 차이를 포함하였다.
Figure pct00004
고산소에 대한 신생아 래트의 노출은 도 14에 나타낸 바와 같이 BAL에서 총 세포 계수에서의 대략 11-배 증가를 야기하였고, UNEX-42의 증가된 용량의 투여는 고산소 대조군과 비교하여 총 세포 계수를 감소시켰다. 호중구 침습은 가장 큰 차이를 차지하였으나, 이들 변화는 통계적 유의미성에 도달하지 못하였다(아래 표 6 참고).
Figure pct00005
이 연구는 고산소가 폐에서 면역 세포 침습을 증가시켰고, UNEX-42가 일반적으로 용량 증가에 따라 이들 수를 감소시켰다는 것을 나타낸다.
폐 구조 및 폐 혈관구조에서 개선을 나타내는 래트 연구
MLI에 의해 정량화된 바와 같은 폐 구조에 대한 UNEX-42의 약역학적 효과의 추적 연구를 수행하여, UNEX-42의 용량-반응을 추가로 특징화하고, EC50을 생성하고, 광범위한 용량을 평가하였다(연구 보고서 UNT-IFBPD-17). 이 연구에서, 신생아 래트 새끼를 간호 어미와 함께 PND 1에 정상산소 또는 고산소(92.5% O2)로 무작위로 할당하였다. PND 2에 0.001X, 0.01X, 0.03X, 0.1X, 0.3X, 또는 1X(137 nM 인지질)의 용량의 PBS 또는 UNEX-42를 단일 IV 주사로서 투여하였다(표 7 참고). 평가는 사망률 우려로 인해 PND 10에 발생하였고 조직학 및 MLI를 통한 풀톤 지수 및 폐 구조를 포함하였고, 표 6에 상기 기재된 연구에서 사용된 말기 시점과 일치하였다.
Figure pct00006
UNEX-42 처치된 그룹에서 동물 생존은 고산소 대조군 그룹(그룹 2)에 비해 통계적으로 유의미하게 상이하지 않았다. 고산소에 대한 신생아 래트 새끼의 노출은 도 15에 나타낸 바와 같이 정상산소 대조군과 비교하여 풀톤 지수를 증가시켰다. UNEX-42는 시험된 모든 용량에서 풀톤 지수를 정상화하였으며, 따라서 고산소 대조군과 비교하여 최대 억제를 나타내었다. 폐 구조에 대해, 고산소 노출은 도 16에 나타낸 바와 같이 적거나 많은 폐포가 특징인 감소된 폐포화를 야기하였다. UNEX-42 처치는 도 16, 17, 및 32에 나타낸 바와 같이 시험된 모든 UNEX-42 용량에서 개선된 조직학적 외관 및 개선된 MLI 값을 통해 나타낸 바와 같이 이 표현형을 반전시켰다. 또한, 도 21에 나타낸 바와 같이, UNEX-42 다중-용량은 MLI 감소(도 21a) 및 혈액 산소 증가(도 21b)에서 가장 효과적이었다. 도 21에서의 실험을 위해 사용된 투여 요법은 아래 표 8에 나타나 있다. 중요하게는, UNEX-42는 용량-반응 방식으로 폐 구조에서의 변화를 개선하였으며, 각각 0.001X, 0.01X, 0.03X, 0.1X, 0.3X 및 1X의 UNEX-42 용량에서 고산소 대조군과 비교하여 22%, 29%, 32%, 40%, 35% 및 32%의 감소를 가졌다.
Figure pct00007
폐 기능에서 개선을 나타내는 래트 연구
BPD를 앓는 환자에게는 일회 호흡량 및 총 폐 용량에 의해 측정된 바와 같이 약화된 폐 기능이 존재한다. 따라서, UNEX-42의 잠재적인 기능적 이득을 일회 호흡량, 호흡률, 및 분당 호흡량의 측정을 포함한 전신 체적기록 측정을 사용하여 평가하였다. UNEX-42의 3 개의 용량을 선택하였다(0.01X, 0.1X, 및 1X). 이들 용량을 상기 기재된 이전 연구로부터의 최대 유효 용량을 기초로 하여 선택하였으며(0.1X), 이를 중간 용량으로서 설정하였다. 높은 용량 및 낮은 용량을 각각 10-배 높고 낮게 설정하였다.
신생아 래트 새끼를 간호 어미와 함께 PND 1에 연속 정상산소 또는 고산소(92.5% O2)로 무작위로 할당하였다(아래 표 9 참고). PND 2에 0.01X, 0.1X 또는 1X(137 nM 인지질)의 PBS 또는 UNEX-42를 단일 IV 주사로서 투여하였다. 일회 호흡량, 호흡률, 및 분당 호흡량을 PND 11에 평가하였고, 이는 폐 구조 및 혈관 리모델링을 시험한 이전 연구에서 표적 말기 시점과 일치하였다.
Figure pct00008
고산소에 대한 신생아 래트 새끼의 노출은 정상산소 대조군과 비교하여 일회 호흡량을 감소시켰고(도 18), UNEX-42는 모든 용량에서 이를 부분적으로 약화시켰고, 0.01X 및 1X는 고산소 대조군과 비교하여 통계적 유의미성에 도달하였다. 이들 데이터는 고산소 노출 후 폐 기능에서 UNEX-42-매개된 개선을 지지한다.
폐동맥 고혈압의 래트 모델
세막시닙/저산소(SU/저산소)에 대한 래트의 노출은 증가된 심장수축 폐동맥압(SPAP)을 야기하였다. SU/저산소 모델 래트를 UNEX-42 EV 단독 또는 포스포디에스테라아제 5-형(PDE5) 억제제 실데나필과의 조합으로 처치하였다. UNEX-42의 이득을 SPAP에 대한 처치의 효과를 측정함으로써 평가하였다. 도 19 및 20에 나타낸 바와 같이, UNEX-42 EV 및 실데나필의 조합은 실데나필 단독을 사용한 것에 비해 많이 SPAP를 감소시켰다. 도 19에 나타낸 결과에 대한 실험 설정이 아래 표 10에 나타나 있고, 도 20에 나타낸 결과에 대한 실험 설정이 아래 표 11에 나타나 있다.
Figure pct00009
Figure pct00010
블레오마이신 마우스 모델에서 특발성 폐 섬유증(IPF)의 치료에 대한 UNEX-42 EV의 이득의 연구
블레오마이신 유도된 섬유증을 IPF에 대한 모델 시스템으로서 사용하였다. 아래 표 12는 블레오마이신(Bleo) 모델에서 IPF를 치료하는 UNEX-42 EV를 시험하기 위한 연구 설계를 나타낸다. UNEX-42 EV는 도 22 및 도 34에 나타낸 바와 같이 IPF에 대한 블레오마이신 모델에서 기관지폐포 세척(BAL)을 침습한 면역 세포의 수를 감소시켰다. 특히, 도 22에 도시된 결과는 BAL에서 세포의 총 수를 나타내고, UNEX-42 EV가 블레오마이신 처치된 마우스에서 BAL에서의 총 수를 감소시켰다는 것을 나타내었다. 도 34는 블레오마이신 대조군 처치된 동물과 비교하였을 때, UNEX-42 EV의 투여가 BAL에서 총 세포 계수에서의 상당한 감소를 야기하였으며(도 34a), 이는 주로 호중구 및 림프구에서의 감소로 인한 것이었고, 대식세포에서 적은 감소를 가졌다(도 34b)는 것을 입증하는 데이터를 도시한다. 또한, 다중-용량 UNEX-42 EV 처치는 단일 용량 처치와 비교하여 알파-SMA(알파 민무늬근 액틴) 발현에서 작은 개선을 야기하였다는 것이 밝혀졌다.
급성 호흡곤란 증후군(ARDS)의 후기 단계는 세포외 기질 단백질, 특히 콜라겐의 과도한 침착이 특징이다. 가용성 콜라겐 함량을 기관지폐포 세척액에서 평가하였다. 블레오마이신 투여는 생리식염수 대조군과 비교하여 BAL 가용성 콜라겐을 23-배 증가시켰다(도 35 참고). UNEX-42는 질환 대조군과 비교하여 가용성 콜라겐을 감소시켰고, 0.1X 단일 용량 및 0.1X 및 1X 다중-용량 그룹은 통계적 유의미성에 도달하였다(도 35 참고). 단일 용량 0.1X UNEX-42는 블레오마이신 대조군과 비교하여 콜라겐 함량을 33%, 1X 단일 용량은 15%, 0.1X 다중-용량은 39% 및 1X 다중-용량은 40% 개선하였다(도 35 참고).
폐 혈관 리모델링에 대한 UNEX-42의 영향을 고산소 노출의 8 일 후 평가하였으며, 고산소는 정상산소 대조군을 초과하여 풀톤 지수를 증가시킨 한편, UNEX-42는 0.01X 이상의 용량에서 이 효과를 부분적으로 반전시켰다(도 36 참고). UNEX-42는 도 36에 나타낸 바와 같이 각각 0.003X, 0.01X, 0.03X, 0.1X, 0.3X 및 1X의 용량에서 풀톤 지수를 7, 12, 16, 13, 16 및 15% 개선하였다.
Figure pct00011
섬유증에 대한 실리카 마우스 모델
섬유증 치료에 대한 UNEX-42 EV의 이득이 또한 실리카 모델에서 나타났다. 실리카 모델 실험에 대한 연구 설계가 아래 표 13에 나타나 있다. 실리카의 투여는 BAL에서 총 세포 계수에서의 4.5-배 증가를 야기하였고, UNEX-42의 투여는 PBS의 투여와 비교하였을 때, 총 세포 계수를 감소시켰고, 1X 단일-용량 및 0.1X 다중-용량 그룹은 통계적 유의미성에 도달하였다(도 23a). 0.1X 단일-용량 및 1X 다중-용량 그룹은 PBS 처치와 비교하였을 때, 세포 계수에서의 감소를 나타내었으나, 통계적 유의미성에 도달하지 않았다. BAL 차등 세포 계수에서의 가장 큰 변화가 대식세포 및 호중구 계수에서 관찰되었다(도 23b). UNEX-42 EV 처치는 도 23에 나타낸 바와 같이 1X 단일 용량 및 0.1X 다중-용량 그룹에서 BALF(기관지폐포 세척액)에서의 총 세포 수를 감소시켰다.
또한, UNEX-42 EV는 0.1X 다중-용량 그룹에서 섬유증의 아쉬크로프트 스코어(Ashcroft score)를 감소시켰고, UNEX-42는 1X 및 0.1X 단일 용량 그룹에서 a-SMA(알파 민무늬근 액틴) 염색을 감소시켰다는 것이 밝혀졌다.
Figure pct00012
UNEX-42 EV 독성학의 연구를 수행하였다. UNEX-42 EV의 독성학 평가를 위한 연구 설계가 아래 표 14에 나타나 있다. UNEX-42 관련된 임상 징후, 체중, 혈액학 및 임상 화학 파라미터, 또는 장기 중량에서의 변화는 없었다. 유사하게는, UNEX-42-관련된 거시적 또는 미시적 변화는 없었다.
Figure pct00013
본 발명은 상기 실시양태와 함께 기재된 한편, 상기 기재 및 실시예는 본 발명을 예시하고 본 발명의 범위를 제한하지 않는 것으로 의도된다는 것을 이해해야 한다. 다른 양태에서, 본 발명의 범위 내의 이점 및 변형은 본 발명이 속하는 당업계의 통상의 기술자에게 명확할 것이다.
본원에 원용된 모든 특허, 특허 출원, 간행물 및 참고문헌은 이들이 개별적으로 참고로 포함되는 경우와 같은 정도로 그 전체가 참고로 포함된다.

Claims (147)

  1. KRT19, TUBB, TUBB2A, TUBB2B, TUBB2C, TUBB3, TUBB4B, TUBB6, CFL1(HEL-S-15), VIM, EEF1A1, EEF1A1P5, PTI-1, EEF1A1L14, EEFA2, ENPP1, NT5E, HSPA8(HEL-S-72p), RAB10, CD44, MMP2, CD109 및 DKFZp686P132로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 함유하는, 단리된 세포외 소포(EV).
  2. 제1항에 있어서,
    CD44, CD109, NT5E, MMP2 및 HSPA8로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 함유하는, 단리된 EV.
  3. 제1항에 있어서,
    하나 이상의 단백질을 함유하도록 조작되는, 단리된 EV.
  4. 제1항에 있어서,
    세포로부터 얻어지는, 단리된 EV.
  5. 제4항에 있어서,
    세포가 불멸화된 세포주 또는 일차 세포로부터 선택되는, 단리된 EV.
  6. 제4항에 있어서,
    세포가 중간엽 줄기 세포(MSC)인, 단리된 EV.
  7. 제1항에 있어서,
    세포가 비-MSC인, 단리된 EV.
  8. 제7항에 있어서,
    비-MSC가 섬유아세포 또는 대식세포를 포함하는, 단리된 EV.
  9. 제4항에 있어서,
    MSC로부터 얻어진 모든 EV에서의 평균 양과 비교하여 하나 이상의 단백질 마커의 증가된 양을 함유하는, 단리된 EV.
  10. 제9항에 있어서,
    하나 이상의 단백질 마커의 적어도 20% 증가된 양을 함유하는, 단리된 EV.
  11. 제6항에 있어서,
    MSC가 와튼 젤리(Wharton's jelly), 제대혈, 태반, 말초 혈액, 골수, 기관지폐포 세척(BAL) 또는 지방 조직으로부터 단리되는, 단리된 EV.
  12. 제1항에 있어서,
    시험관내(in vitro)에서 생산된 합성 엑소좀인, 단리된 EV.
  13. 제12항에 있어서,
    합성 엑소좀이 합성 리포솜인, 단리된 EV.
  14. 제1항에 있어서,
    Syntenin-1, Flotillin-1, CD105 및/또는 주조직적합성 복합체 클래스 I을 추가로 함유하는, 단리된 EV.
  15. 제1항에 있어서,
    테트라스패닌(tetraspanin) 패밀리의 멤버를 추가로 함유하는, 단리된 EV.
  16. 제15항에 있어서,
    테트라스패닌 패밀리의 멤버가 CD63, CD81 및 CD9를 함유하는, 단리된 EV.
  17. KRT19, TUBB, TUBB2A, TUBB2B, TUBB2C, TUBB3, TUBB4B, TUBB6, CFL1(HEL-S-15), VIM, EEF1A1, EEF1A1P5, PTI-1, EEF1A1L14, EEFA2, ENPP1, NT5E, HSPA8(HEL-S-72p), RAB10, CD44, MMP2, CD109 및 DKFZp686P132로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 함유하도록 EV를 조작하는 단계를 포함하는, 증가된 효능을 갖는 세포외 소포(EV)를 단리시키는 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    EV가 CD44, CD109, NT5E, MMP2 및 HSPA8로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 발현하는 것인, 방법.
  19. 제17항에 있어서,
    조작하는 단계가 하나 이상의 단백질의 증가된 양을 나타내는 EV를 선택하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  20. 제17항에 있어서,
    조작하는 단계가 하나 이상의 단백질을 발현하도록 EV를 생산하는 세포를 유전적으로 조작하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    EV를 생산하는 세포가 불멸화된 세포주, 일차 세포, 중간엽 줄기 세포(MSC), 섬유아세포 또는 대식세포를 포함하는 것인, 방법.
  22. 제17항에 있어서,
    조작하는 단계가 하나 이상의 단백질을 함유하는 합성 EV를 시험관내에서 생산하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  23. 제17항에 있어서,
    단리된 EV가 약 100 nm의 평균 직경을 갖는 것인, 방법.
  24. 제17항에 있어서,
    단리된 EV 중 적어도 70%가 50 nm 내지 350 nm의 크기를 갖는 것인, 방법.
  25. 제17항에 있어서,
    단리된 EV가 Syntenin-1, Flotillin-1, CD105 및/또는 주조직적합성 복합체 클래스 I을 추가로 포함하는 것인, 방법.
  26. 제17항에 있어서,
    단리된 EV가 테트라스패닌 패밀리의 멤버를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    테트라스패닌 패밀리의 멤버가 CD63, CD81 및 CD9를 포함하는 것인, 방법.
  28. 제17항에 있어서,
    EV의 증가된 효능은 증가된 피루베이트 키나아제 활성을 포함하는 것인, 방법.
  29. 제17항에 있어서,
    EV의 증가된 효능은 증가된 ATPase 활성을 포함하는 것인, 방법.
  30. 폐 질환 치료를 필요로 하는 대상체에 중간엽 기질 세포로부터 얻어진 단리된 세포외 소포(EV)를 투여하는 단계를 포함하고, 이때 단리된 세포외 소포가 KRT19, TUBB, TUBB2A, TUBB2B, TUBB2C, TUBB3, TUBB4B, TUBB6, CFL1(HEL-S-15), VIM, EEF1A1, EEF1A1P5, PTI-1, EEF1A1L14, EEFA2, ENPP1, NT5E, HSPA8(HEL-S-72p), RAB10, CD44, MMP2, CD109 및 DKFZp686P132로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 증가된 양을 갖는 세포외 소포를 포함하는 것인, 폐 질환을 치료하는 방법.
  31. 제30항에 있어서,
    EV가 CD44, CD109, NT5E, MMP2 및 HSPA8로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함하는 것인, 방법.
  32. 제30항에 있어서,
    폐 질환이 만성 폐 질환 또는 급성 폐 질환을 포함하는 것인, 방법.
  33. 제30항에 있어서,
    폐 질환이 기관지폐형성이상인, 방법.
  34. 감소된 혈관신생, 급성 염증, 만성 염증, 세포자살, 미토콘드리아 기능장애, 섬유증 또는 혈관병증과 연관된 질환 또는 병태 치료를 필요로 하는 대상체에 중간엽 기질 세포로부터 얻어진 단리된 세포외 소포를 투여하는 단계를 포함하고, 이때 단리된 세포외 소포가 KRT19, TUBB, TUBB2A, TUBB2B, TUBB2C, TUBB3, TUBB4B, TUBB6, CFL1(HEL-S-15), VIM, EEF1A1, EEF1A1P5, PTI-1, EEF1A1L14, EEFA2, ENPP1, NT5E, HSPA8(HEL-S-72p), RAB10, CD44, MMP2, CD109 및 DKFZp686P132로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 함유하는 세포외 소포(EV)를 포함하는 것인, 감소된 혈관신생, 급성 염증, 만성 염증, 세포자살, 미토콘드리아 기능장애, 섬유증 또는 혈관병증과 연관된 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
  35. 제34항에 있어서,
    EV가 CD44, CD109, NT5E 및 HSPA8로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함하는 것인, 방법.
  36. 제34항에 있어서,
    단리된 EV가 대상체의 폐 조직에서 글루코오스 산화를 정상화하는 것인, 방법.
  37. 제34항에 있어서,
    미토콘드리아 기능장애와 연관된 질환 또는 병태가 대상체에서 감소된 미토콘드리아 산화와 연관되는 것인, 방법.
  38. 제34항에 있어서,
    미토콘드리아 기능장애와 연관된 질환 또는 병태가 프리드리히 실조(Friedreich's ataxia), 레베르 유전성 시신경병증(Leber's Hereditary Optic Neuropathy), 컨스-세이어 증후군(Kearns-Sayre Syndrome), 젖산 산증 및 뇌졸중양 증상을 갖는 미토콘드리아 뇌근병증, 리 증후군(Leigh syndrome), 비만, 죽상경화증, 근위축성 측삭 경화증, 파킨슨병(Parkinson's Disease), 암, 심부전, 심근경색증(MI), 알츠하이머병(Alzheimer's Disease), 헌팅턴병(Huntington's Disease), 조현병, 양극성 장애, 취약 X 증후군 및 만성 피로 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  39. 급성 호흡곤란 증후군(ARDS) 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에 단리된 세포외 소포(EV)의 유효 용량을 투여하는 단계를 포함하고, 이때 단리된 EV가 KRT19, TUBB, TUBB2A, TUBB2B, TUBB2C, TUBB3, TUBB4B, TUBB6, CFL1(HEL-S-15), VIM, EEF1A1, EEF1A1P5, PTI-1, EEF1A1L14, EEFA2, ENPP1, NT5E, HSPA8(HEL-S-72p), RAB10, CD44, MMP2, CD109 및 DKFZp686P132로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 함유하는 것인, 급성 호흡곤란 증후군(ARDS)을 치료 또는 예방하는 방법.
  40. 제39항에 있어서,
    감염, 패혈증, 산 흡인 또는 트라우마로부터 야기된 ARDS를 치료하는 것인, 방법.
  41. 제40항에 있어서,
    감염이 세균 감염 또는 바이러스 감염인, 방법.
  42. 제39항에 있어서,
    COVID-19로부터 야기된 ARDS를 치료하는 것인, 방법.
  43. 제39항에 있어서,
    ARDS를 예방하거나 이의 중증도를 감소시키는 것인, 방법.
  44. 제39항에 있어서,
    EV가 CD44, CD109, NT5E, MMP2 및 HSPA8로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 함유하는 것인, 방법.
  45. 제39항에 있어서,
    단리된 EV가 하나 이상의 단백질을 함유하도록 조작되는 것인, 방법.
  46. 제39항에 있어서,
    단리된 EV가 세포로부터 얻어지는 것인, 방법.
  47. 제46항에 있어서,
    세포가 불멸화된 세포주 또는 일차 세포로부터 선택되는 것인, 방법.
  48. 제46항에 있어서,
    세포가 중간엽 줄기 세포(MSC)인, 방법.
  49. 제39항에 있어서,
    단리된 EV가 시험관내에서 생산된 합성 엑소좀인, 방법.
  50. 제49항에 있어서,
    합성 엑소좀이 합성 리포솜인, 방법.
  51. 제39항에 있어서,
    단리된 EV가 Syntenin-1, Flotillin-1, CD105 및/또는 주조직적합성 복합체 클래스 I을 추가로 포함하는 것인, 방법.
  52. 제39항에 있어서,
    단리된 EV가 테트라스패닌 패밀리의 멤버를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  53. 제52항에 있어서,
    테트라스패닌 패밀리의 멤버가 CD63, CD81 및 CD9를 함유하는 것인, 방법.
  54. 제39항에 있어서,
    대상체는 ALI 또는 ARDS 발달 위험이 있는 것인, 방법.
  55. 제39항에 있어서,
    단리된 EV가 비경구적으로 투여되는 것인, 방법.
  56. 제39항에 있어서,
    단리된 EV의 유효 용량이 EV의 인지질 약 20 내지 약 500 pmol/치료되는 대상체의 kg인, 방법.
  57. 제39항에 있어서,
    포스포디에스테라아제 5-형(PDE5) 억제제, 프로스타사이클린 작용제 및/또는 엔도텔린 수용체 길항제 중 하나 이상을 포함하는 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  58. 제57항에 있어서,
    PDE5 억제제가 실데나필, 바르데나필, 자프라비스트, 운데나필, 다산타필, 아바나필, 미로데나필 또는 로데나필을 포함하는 것인, 방법.
  59. 제57항에 있어서,
    PDE5 억제제가 실데나필인, 방법.
  60. 제57항에 있어서,
    단리된 EV 및 치료제가 별도 조성물로 실질적으로 동시에 또는 순차적으로 투여되는 것인, 방법.
  61. 제57항에 있어서,
    단리된 EV 및 치료제가 동일한 조성물로 투여되는 것인, 방법.
  62. 제39항에 있어서,
    단리된 EV가 1 회 이상의 용량으로 투여되는 것인, 방법.
  63. 제39항에 있어서,
    단리된 EV가 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 4 일, 5, 일, 6 일 또는 주 당 1 회의 간격으로 투여되는 것인, 방법.
  64. 제39항에 있어서,
    단리된 EV가 2 회 용량, 3 회 용량, 4, 회 용량, 5 회 용량, 6 회 용량, 7 회 용량, 8 회 용량, 9 회 용량, 12 회 용량, 15 회 용량 또는 18 회 용량으로 투여되는 것인, 방법.
  65. 제57항에 있어서,
    단리된 EV 및 치료제가 1 회 이상의 용량으로 투여되는 것인, 방법.
  66. 제57항에 있어서,
    치료제가 PDE5 억제제이고, 단리된 EV가 2 회 용량, 3 회 용량, 4, 회 용량, 5 회 용량, 6 회 용량, 7 회 용량, 8 회 용량, 9 회 용량, 12 회 용량, 15 회 용량 또는 18 회 용량으로 투여되고, PDE5 억제제가 16 회 용량, 19 회 용량, 21 회 용량, 24 회 용량, 27 회 용량, 30 회 용량, 33 회 용량, 36 회 용량, 39 회 용량, 42 회 용량, 45 회 용량, 48 회 용량, 51 회 용량, 54 회 용량, 57 회 용량, 60 회 용량, 63 회 용량 또는 66 회 용량으로 투여되는 것인, 방법.
  67. 제66항에 있어서,
    단리된 EV가 2 일 동안, 3 일 동안, 4 일 동안, 5 일 동안, 6 일 동안 또는 1 주일 동안 매일 1 회 투여되는 것인, 방법.
  68. 제39항에 있어서,
    대상체에서 심장수축 폐동맥압(SPAP)을 감소시키는 것인, 방법.
  69. 제39항에 있어서,
    대상체에서 폐의 폐포 표면적을 증가시키는 것인, 방법.
  70. 제39항에 있어서,
    대상체에서 혈액 산소의 농도를 증가시키는 것인, 방법.
  71. 제39항에 있어서,
    대상체에서 폐에서의 염증을 감소시키는 것인, 방법.
  72. 제39항에 있어서,
    기관지폐포 세척액에서 세포외 기질의 침착을 감소시키거나 폐에서 세포외 기질의 침착을 감소시키는 것인, 방법.
  73. 제39항에 있어서,
    풀톤 지수(Fulton's index)를 개선하는 것인, 방법.
  74. 제39항에 있어서,
    대상체가 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 소, 양, 말, 토끼, 마우스 또는 래트인, 방법.
  75. 제57항에 있어서,
    프로스타사이클린 작용제가 에포프로스테놀 소듐, 트레프로스티닐, 베라프로스트, 일프로스트 및 PGI2 수용체 작용제를 포함하는 것인, 방법.
  76. 폐 섬유증 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에 단리된 세포외 소포(EV)의 유효 용량을 투여하는 단계를 포함하고, 이때 단리된 EV가 KRT19, TUBB, TUBB2A, TUBB2B, TUBB2C, TUBB3, TUBB4B, TUBB6, CFL1(HEL-S-15), VIM, EEF1A1, EEF1A1P5, PTI-1, EEF1A1L14, EEFA2, ENPP1, NT5E, HSPA8(HEL-S-72p), RAB10, CD44, MMP2, CD109 및 DKFZp686P132로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 함유하는 것인, 폐 섬유증을 치료 또는 예방하는 방법.
  77. 제76항에 있어서,
    폐 섬유증이 특발성 폐 섬유증인, 방법.
  78. 제76항에 있어서,
    폐 섬유증이 감염의 결과인, 방법.
  79. 제76항에 있어서,
    폐 섬유증이 SARS-CoV-2 감염의 결과인, 방법.
  80. 제76항에 있어서,
    폐 섬유증 발달 위험이 있는 환자에 EV를 투여하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  81. 제76항에 있어서,
    단리된 EV의 유효 용량이 EV의 인지질 약 20 내지 약 500 pmol/치료되는 대상체의 kg인, 방법.
  82. 제76항에 있어서,
    단리된 EV가 CD44, CD109, NT5E, MMP2 및 HSPA8로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 함유하는 것인, 방법.
  83. 제76항에 있어서,
    단리된 EV가 하나 이상의 단백질을 함유하도록 조작되는 것인, 방법.
  84. 제76항에 있어서,
    단리된 EV가 세포로부터 얻어지는 것인, 방법.
  85. 제84항에 있어서,
    세포가 불멸화된 세포주 또는 일차 세포로부터 선택되는 것인, 방법.
  86. 제84항에 있어서,
    세포가 중간엽 줄기 세포(MSC)인, 방법.
  87. 제76항에 있어서,
    단리된 EV가 시험관내에서 생산된 합성 엑소좀인, 방법.
  88. 제87항에 있어서,
    합성 엑소좀이 합성 리포솜인, 방법.
  89. 제76항에 있어서,
    단리된 EV가 Syntenin-1, Flotillin-1, CD105 및/또는 주조직적합성 복합체 클래스 I을 추가로 포함하는 것인, 방법.
  90. 제76항에 있어서,
    단리된 EV가 테트라스패닌 패밀리의 멤버를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  91. 제90항에 있어서,
    테트라스패닌 패밀리의 멤버가 CD63, CD81 및 CD9를 포함하는 것인, 방법.
  92. 제76항에 있어서,
    단리된 EV가 비경구적으로 투여되는 것인, 방법.
  93. 제76항에 있어서,
    포스포디에스테라아제 5-형(PDE5) 억제제, 프로스타사이클린 작용제 및/또는 엔도텔린 수용체 길항제를 포함하는 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  94. 제93항에 있어서,
    PDE5 억제제가 실데나필, 바르데나필, 자프라비스트, 운데나필, 다산타필, 아바나필, 미로데나필 또는 로데나필을 포함하는 것인, 방법.
  95. 제93항에 있어서,
    PDE5 억제제가 실데나필인, 방법.
  96. 제93항에 있어서,
    단리된 EV 및 치료제가 별도 조성물로 실질적으로 동시에 또는 순차적으로 투여되는 것인, 방법.
  97. 제93항에 있어서,
    단리된 EV 및 치료제가 동일한 조성물로 투여되는 것인, 방법.
  98. 제76항에 있어서,
    단리된 EV가 1 회 이상의 용량으로 투여되는 것인, 방법.
  99. 제76항에 있어서,
    단리된 EV가 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 4 일, 5, 일, 6 일 또는 주 당 1 회의 간격으로 투여되는 것인, 방법.
  100. 제76항에 있어서,
    단리된 EV가 2 회 용량, 3 회 용량, 4, 회 용량, 5 회 용량, 6 회 용량, 7 회 용량, 8 회 용량, 9 회 용량, 12 회 용량, 15 회 용량 또는 18 회 용량으로 투여되는 것인, 방법.
  101. 제93항에 있어서,
    단리된 EV 및 치료제가 1 회 이상의 용량으로 투여되는 것인, 방법.
  102. 제93항에 있어서,
    단리된 EV 및 치료제가 6 시간, 12, 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 4 일, 5, 일, 6 일 또는 주 당 1 회의 간격으로 투여되는 것인, 방법.
  103. 제93항에 있어서,
    치료제가 PDE5 억제제이고, 단리된 EV가 2 회 용량, 3 회 용량, 4, 회 용량, 5 회 용량, 6 회 용량, 7 회 용량, 8 회 용량, 9 회 용량, 12 회 용량, 15 회 용량 또는 18 회 용량으로 투여되고, PDE5 억제제가 16 회 용량, 19 회 용량, 21 회 용량, 24 회 용량, 27 회 용량, 30 회 용량, 33 회 용량, 36 회 용량, 39 회 용량, 42 회 용량, 45 회 용량, 48 회 용량, 51 회 용량, 54 회 용량, 57 회 용량, 60 회 용량, 63 회 용량 또는 66 회 용량으로 투여되는 것인, 방법.
  104. 제76항에 있어서,
    단리된 EV가 2 일 동안, 3 일 동안, 4 일 동안, 5 일 동안, 6 일 동안 또는 1 주일 동안 매일 1 회 투여되는 것인, 방법.
  105. 제76항에 있어서,
    대상체에서 심장수축 폐동맥압(SPAP)을 감소시키는 것인, 방법.
  106. 제76항에 있어서,
    대상체에서 폐의 폐포 표면적을 증가시키거나 이의 손상 또는 부상을 감소시키는 것인, 방법.
  107. 제76항에 있어서,
    대상체에서 혈액 산소의 농도를 증가시키는 것인, 방법.
  108. 제76항에 있어서,
    대상체에서 폐에서의 염증을 감소시키는 것인, 방법.
  109. 제76항에 있어서,
    기관지폐포 세척액에서 세포외 기질의 침착을 감소시키거나 폐에서 세포외 기질 침착을 감소시키는 것인, 방법.
  110. 제76항에 있어서,
    풀톤 지수를 개선하는 것인, 방법.
  111. 제76항에 있어서,
    대상체가 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 소, 양, 말, 토끼, 마우스 또는 래트인, 방법.
  112. 제93항에 있어서,
    프로스타사이클린 작용제가 에포프로스테놀 소듐, 트레프로스티닐, 베라프로스트, 일프로스트 및 PGI2 수용체 작용제를 포함하는 것인, 방법.
  113. 호흡기 질환 또는 장애 치료를 필요로 하는 대상체에 단리된 세포외 소포(EV) 및 포스포디에스테라아제 5-형(PDE5) 억제제의 유효 용량을 투여하는 단계를 포함하고, 이때 단리된 EV가 KRT19, TUBB, TUBB2A, TUBB2B, TUBB2C, TUBB3, TUBB4B, TUBB6, CFL1(HEL-S-15), VIM, EEF1A1, EEF1A1P5, PTI-1, EEF1A1L14, EEFA2, ENPP1, NT5E, HSPA8(HEL-S-72p), RAB10, CD44, MMP2, CD109 및 DKFZp686P132로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 함유하는 것인, 호흡기 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
  114. 제113항에 있어서,
    호흡기 질환 또는 장애가 급성 호흡곤란 증후군(ARDS), 급성 폐 질환, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환, 낭성 섬유증, 폐렴, 폐 섬유증, 급성 폐 손상, 기관지염, 폐기종, 폐쇄세기관지염 또는 기관지폐형성이상(BPD)을 포함하는 것인, 방법.
  115. 제113항에 있어서,
    COVID-19로부터 야기된 호흡기 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 것인, 방법.
  116. 제114항에 있어서,
    폐 섬유증이 특발성 폐 섬유증인, 방법.
  117. 제113항에 있어서,
    호흡기 질환 또는 장애가 감염, 패혈증, 산 흡인 또는 트라우마의 결과인, 방법.
  118. 제113항에 있어서,
    감염이 세균 감염 또는 바이러스 감염인, 방법.
  119. 제113항에 있어서,
    호흡기 질환 또는 장애가 SARS-CoV-2 감염의 결과인, 방법.
  120. 제113항에 있어서,
    호흡기 질환 또는 장애 발달 위험이 있는 환자에 EV를 투여하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  121. 제113항에 있어서,
    단리된 EV의 용량이 EV의 인지질 20 내지 500 pmol/치료되는 대상체의 kg인, 방법.
  122. 제113항에 있어서,
    단리된 EV가 CD44, CD109, NT5E, MMP2 및 HSPA8로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 함유하는 것인, 방법.
  123. 제113항에 있어서,
    단리된 EV가 하나 이상의 단백질을 함유하도록 조작되는 것인, 방법.
  124. 제113항에 있어서,
    단리된 EV가 세포로부터 얻어지는 것인, 방법.
  125. 제124항에 있어서,
    세포가 불멸화된 세포주 또는 일차 세포로부터 선택되는 것인, 방법.
  126. 제124항에 있어서,
    세포가 중간엽 줄기 세포(MSC)인, 방법.
  127. 제113항에 있어서,
    단리된 EV가 시험관내에서 생산된 합성 엑소좀인, 방법.
  128. 제127항에 있어서,
    합성 엑소좀이 합성 리포솜인, 방법.
  129. 제113항에 있어서,
    단리된 EV가 Syntenin-1, Flotillin-1, CD105 및/또는 주조직적합성 복합체 클래스 I을 추가로 포함하는 것인, 방법.
  130. 제113항에 있어서,
    단리된 EV가 테트라스패닌 패밀리의 멤버를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  131. 제130항에 있어서,
    테트라스패닌 패밀리의 멤버가 CD63, CD81 및 CD9를 포함하는 것인, 방법.
  132. 제113항에 있어서,
    단리된 EV가 비경구적으로 투여되는 것인, 방법.
  133. 제113항에 있어서,
    PDE5 억제제가 실데나필, 바르데나필, 자프라비스트, 운데나필, 다산타필, 아바나필, 미로데나필 또는 로데나필을 포함하는 것인, 방법.
  134. 제113항에 있어서,
    PDE5 억제제가 실데나필인, 방법.
  135. 제113항에 있어서,
    단리된 EV 및 포스포디에스테라아제 5-형(PDE5) 억제제가 별도 조성물로 실질적으로 동시에 또는 순차적으로 투여되는 것인, 방법.
  136. 제113항에 있어서,
    단리된 EV 및 포스포디에스테라아제 5-형(PDE5) 억제제가 동일한 조성물로 투여되는 것인, 방법.
  137. 제113항에 있어서,
    단리된 EV 및 PDE5 억제제가 1 회 이상의 용량으로 투여되는 것인, 방법.
  138. 제113항에 있어서,
    단리된 EV 및 PDE5 억제제가 6 시간, 12, 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 4 일, 5, 일, 6 일 또는 주 당 1 회의 간격으로 투여되는 것인, 방법.
  139. 제113항에 있어서,
    단리된 EV가 2 회 용량, 3 회 용량, 4, 회 용량, 5 회 용량, 6 회 용량, 7 회 용량, 8 회 용량, 9 회 용량, 12 회 용량, 15 회 용량 또는 18 회 용량, 3 회 용량, 6 회 용량, 9 회 용량, 12 회 용량, 15 회 용량 또는 18 회 용량으로 투여되고, PDE5 억제제가 16 회 용량, 19 회 용량, 21 회 용량, 24 회 용량, 27 회 용량, 30 회 용량, 33 회 용량, 36 회 용량, 39 회 용량, 42 회 용량, 45 회 용량, 48 회 용량, 51 회 용량, 54 회 용량, 57 회 용량, 60 회 용량, 63 회 용량 또는 66 회 용량으로 투여되는 것인, 방법.
  140. 제113항에 있어서,
    단리된 EV가 2 일 동안, 3 일 동안, 4 일 동안, 5 일 동안, 6 일 동안 또는 1 주일 동안 매일 1 회 투여되는 것인, 방법.
  141. 제113항에 있어서,
    대상체에서 심장수축 폐동맥압(SPAP)을 감소시키는 것인, 방법.
  142. 제113항에 있어서,
    대상체에서 폐의 폐포 표면적을 증가시키는 것인, 방법.
  143. 제113항에 있어서,
    대상체에서 혈액 산소의 농도를 증가시키는 것인, 방법.
  144. 제113항에 있어서,
    대상체에서 폐에서의 염증을 감소시키는 것인, 방법.
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