KR20170138534A - 치료적 혼주된 혈액 아폽토시스 세포 제제 및 이의 용도 - Google Patents

치료적 혼주된 혈액 아폽토시스 세포 제제 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

혼주되고 농축된, 단핵 아폽토시스 세포 집단을 포함하는 세포 제제, 및 이러한 세포 제제의 제조 방법이 기재된다. 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제는 아폽토시스의 유도 전 또는 후에 혼주되는 혼주된, 동종이계 백혈구 분획으로부터 수득될 수 있다. 추가로, 대상체에서 면역 질환, 염증성 질환, 자가면역 질환, 또는 불임을 치료하기 위한 이들 혼주된 아폽토시스 세포 제제의 사용 방법이 본 명세서에 기재된다. 예를 들면, 혼주된 아폽토시스 세포 제제는 동종이계 대상체에서 이식편대숙주 질환(GVHD)을 치료하는데 사용될 수 있다.

Description

치료적 혼주된 혈액 아폽토시스 세포 제제 및 이의 용도
본 출원은 혼주(pooling)되고 농축된 단핵 아폽토시스(apoptosis) 세포 집단을 포함하는 세포 제제 및 상기 세포 제제의 제조 방법에 관한 것이다. 추가로, 대상체에서 면역 질환, 염증성 질환, 사이토카인 방출 증후군(CRS), 사이토카인 스톰(cytokine storm), 또는 자가면역 질환을 치료하기 위한 이들 혼주된 세포 제제의 용도가 본 명세서에 기재된다.
병리학적 면역 반응을 특징으로 하는 질환은 유의미한 사망률 및 질병률과 연관된 많은 질환, 특히 자가면역 질환, 예를 들면, 전신성 홍반성 낭창(SLE), 및 이식 관련 질환, 예를 들면, 이식편대숙주 질환(GVHD)를 포함한다. 자가면역 질환은 일반적으로 2개의 일반적인 유형, 즉 전신성 자가면역 질환(예를 들면, SLE 및 경피증), 및 장기 특이적 자가면역 질환, 예를 들면, 다발성 경화증, 및 당뇨병으로 나눌 수 있다.
면역억제성 약물은 이식된 장기 및 조직(예를 들면, 골수, 심장, 신장, 간) 거부의 치료 또는 예방; 자가면역 질환 또는 아마도 자가면역이 원인인 질환(예를 들면, 류머티스성 관절염, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 전신성 홍반성 낭창, 유육종증, 크론병, 베체트병, 수포창, 포도막염 및 궤양성 대장염)의 치료; 몇몇 다른 비자가면역 염증성 질환(예를 들면, 장기간 알레르기성 천식 조절)뿐만 아니라 이식 관련 질환(예를 들면, GVHD)의 치료에 사용되어 왔다. 그러나, 면역억제 약물 치료는 많은 합병증을 야기할 수 있고, 병리학적 면역 반응을 다루는 개선된 방법이 필요하다.
동종이계 골수 이식(alloBMT)에서, 환자의 신체로의 공여자 골수의 주입은 두 면역계로부터의 세포 상호작용을 수반한다. 동종이예 이식을 수용하는 환자에 대한 조건화 계획은 면역계를 억제함으로써 공여자 줄기 세포를 환자에서 생착시킨다. 공여자의 면역 세포가 환자의 신체에서 확립된 후, 이들은 상이하거나 외래이기 때문에 잔여 암 세포를 포함한 환자 자신의 조직 및 세포를 인식할 수 있다. 그 다음, 면역계는 간, 위장관 또는 피부와 같은 특정한 장기에 손상을 야기할 수 있고; 이러한 효과는 이식편대숙주 질환(GVHD)으로 알려져 있다.
오늘부로, GVHD 예방은 칼시뉴린 저해제(CNI), 사이클로스포린 또는 타크롤리무스, 및 메토트렉세이트, 마이코페놀레이트 모페틸(MMF), 또는 시롤리무스를 포함하는 면역억제성 약물의 조합을 포함한다. 그러나, 급성 GVHD는 여전히 인간 백혈구 항원(HLA)-일치(matching)하는 형제로부터의 이식을 수용하는 BMT 환자의 35% 내지 70%로 발생하고, 관련이 없는 공여자 이식 수용자에서는 매우 더 자주 발생한다.
칼시뉴린 저해제(CNI)가 급성 GVHD를 부분적으로 억제함에도 불구하고, 이들은 T-세포 발달을 억제하고 질환 재발의 위험성을 증가시킴에 따라 면역 재구성을 손상시킬 수 있다. 따라서, 동종이계 BMT를 받은 혈액암 환자는 GVHD 예방의 필요가 있고, 이는 CNI의 사용을 최소화하고, GVHD를 예방하고, 유리한 이식편대종양 효과를 포함한 기능적 면역계를 유지할 것이다.
아폽토시스 세포는 수지상 세포 및 대식세포에 대한 면역 관용을 직접적으로 및 간접적으로 유도할 수 있는 면역조절 세포이다. 많은 동물 실험은 유전적 일치와 독립적인 면역조절 효과를 증명하였다. 암시적으로, 비유전적으로 일치하는 마우스로부터의 아폽토시스 세포는 유전적으로 일치하는 마우스(동계)만큼 효과적이었다. 환자 또는 공여자로부터 수집된 말초 세포(백혈구성분채집술)로부터 높은 관용유발 가능성이 있는(면역관용을 갖는) 안정한 아폽토시스 세포를 생성하는 방법이 매우 재생가능한, 비유전적으로 일치하는 아폽토시스 혈액 샘플을 조합하는 능력은 대상체에서 면역 관용을 유도하기 위한 유일하고 비용 효율적인 공급원을 제공할 수 있다.
그렇지만, 일치되지 않은 백혈구(WBC)의 사용은 두 가지 잠재적인 문제를 야기시킨다. 첫번째는 아폽토시스 세포에 대항하는 가능한 면역 반응이다(세포 사멸의 과정에서). 두번째는, 아폽토시스 집단을 생성하도록 유도된 WBC의 전부가 반드시 아폽토시스가 되는 것은 아니기 때문에, 아폽토시스 세포의 임의의 풀에 남아있는 살아있는 세포의 분획으로부터의 반응일 것이다. 따라서, 투여된 아폽토시스 WBC의 분획은 일부 살아있는 세포를 함유할 것이다. 살아있는 세포는 수용자에서 GVHD를 유발할 수 있다.
현재, 대부분 매건 데이비드 아돈(Magen David Adorn)(MDA)을 통해 공여자로부터 이스라엘에서 일당 약 1,000개 혈액 단위가 가공된다. WBC 분획은 가공되지 않거나 연구 용도로 연층으로서 가공된다. 백(bag) 속에 이러한 WBC 분획을 수용하는 것이 가능한데, 여기에는 거의 2×107개의 백혈구가 존재하고, 이의 약 0.7×107개가 단핵구이며, 이는 아폽토시스 세포 제조에 바람직하다. 현재 추정에 따르면, 제조 효율은 대략 50%이다.
자가면역 및 염증성 질환 및 이식 관련 질환을 포함하는 면역 장애를 치료하거나 예방하는 조성물 및 방법에 대한 미충족 요구가 남아있다. 예를 들면, 30%-70%의 발생 정도가 추정되는 GVHD는 성공적인 동종이계 혈액 또는 골수 이식에 주요 장벽으로 남아있고, GVHD 예방을 위한 최적의 접근법은 아직 확립되지 않았다. 특히, 안전하고 신뢰성 있고 재생 가능하며 효과적인 방식으로 GVHD를 예방하거나 완화시키는 조성물 및 방법을 수득하는 것은 매우 중요하다.
하기 본 명세서에 기재된 세포 제제 및 이의 조성물은 다수의 개별적인 혈액 공여자 또는 개별적인 혈액 공여로부터 수득된 혼주된 아폽토시스 세포를 포함하는 보편적인 제품을 제공함으로써 이러한 요구를 해결한다. 추가로, 혼주된 아폽토시스 세포 제제는 자가면역 및 염증성 질환, 이식 관련 질환 및 병태, 사이토카인 방출 증후군(CRS), 사이토카인 스톰, 및 불임을 포함하는 면역 장애를 치료하는데 사용될 수 있다.
일 양상에서, 초기-아폽토시스 상태의 단핵 세포를 포함하는 혼주된 핵 아폽토시스 세포 제제가 본 명세서에 기재되고, 여기서 상기 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제는 혼주된 개별적인 단핵 세포 집단을 포함하고, 여기서 상기 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제는,
비휴지기(non-quiescent) 비아폽토시스 세포의 백분율의 감소;
임의의 살아있는 비아폽토시스 세포의 억제된 세포 활성화; 또는
임의의 살아있는 비아폽토시스 세포의 증식의 감소;
또는 임의의 이들의 조합을 포함한다.
관련된 양상에서, 상기 혼주된 개별적인 단핵 세포 집단은 상기 개별적인 단핵 세포 집단의 아폽토시스의 유도 전에 또는 아폽토시스의 유도 후에 혼주된 개별적인 단핵 세포 집단을 포함한다. 또 다른 양상에서, 혼주된 개별적인 단핵 세포 집단은 상기 개별적인 단핵 세포 집단의 HLA 마커의 HLA 일치와 독립적인 혼주된 집단을 포함한다. 또 다른 양상에서, 수득된 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제는 약 2개 내지 25개의 혈액 단위로 존재하는 세포로부터 수득된 단핵 세포 집단을 포함한다. 또 다른 양상에서, 혈액은 헌혈로부터의 백혈구(WBC) 분획을 포함한다. 또 다른 양상에서, 개별적인 단핵 세포 집단은 림프구, 단핵구, 수지상 세포 및 자연 살해 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 세포 유형을 포함한다. 추가의 양상에서, 개별적인 단핵 세포 집단은 수용자 대상체에 대하여 HLA 일치된 또는 HLA 일치하지 않는 공급원으로부터의 동종이계 세포를 포함한다.
관련된 양상에서, 혼주된 개별적인 단핵 세포 집단은 불활성 T 세포 수용체를 포함하는 세포를 포함하거나, 면역 활성을 감소시킨다. 또 다른 양상에서, 혼주된 개별적인 단핵 세포 집단은 조사된 세포 집단을 포함한다. 또 다른 양상에서, 조사는 감마선 조사 또는 UV 조사를 포함한다. 또 다른 양상에서, 혼주된 개별적인 단핵 세포 집단은 상기 조사 전에 또는 상기 조사 후에 혼주된 집단을 포함한다. 또 다른 양상에서, 조사된 세포 집단은 비조사된 세포 집단과 비교하여 집단에 대한 비휴지기 비아폽토시스 세포의 백분율의 감소를 포함한다.
일 양상에서, 본 명세서에 공지된 바와 같은 세포 제제를 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에 기재된다.
일 양상에서, 초기 아폽토시스 상태의 혼주된 개별적인 단핵 세포 집단을 포함하는 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제를 포함하는 약제학적 조성물을 제조하는 방법이 본 명세서에 기재되되, 상기 방법은,
(a) 말초 혈액의 개별적인 단핵-풍부화 세포 집단(mononuclear-enriched cell population)을 수득하는 단계;
(b) 항응고제를 포함하는 냉동 매질 중에 상기 단핵-풍부화 세포 집단을 냉동시키는 단계;
(c) 상기 단핵-풍부화 세포 집단을 해동시키는 단계;
(d) 최종 농도 약 10 내지 100㎍/㎖의 메틸프레드니솔론 및 항응고제를 포함하는 아폽토시스 유도 배양 매질 중에 상기 단핵-풍부화 세포 집단을 배양하는 단계;
(e) 상기 아폽토시스 세포 집단을 투여 매질 중에 재현탁시키는 단계; 및
(f) 상기 단핵 풍부화 집단을 불활화시키는 단계로서, 상기 불활화가 임의의 단계 (a) 내지 (e) 후에 발생하는, 상기 불활화시키는 단계; 및
(g) 상기 단핵 풍부화 집단을 혼주시키는 단계로서, 상기 혼주는 임의의 단계 (a) 내지 (f) 후에 발생되는, 상기 혼주시키는 단계를 포함하며,
여기서, 상기 방법은 초기 아폽토시스 상태의 혼주된 개별적인 단핵 세포 집단을 포함하는 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제를 포함하는 약제학적 조성물을 제조한다.
관련된 양상에서, 불활화 단계는 상기 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제 내에 비휴지기 비아폽토시스 세포의 백분율의 감소, 임의의 살아있는 비아폽토시스 세포의 세포 활성화의 억제, 임의의 살아있는 비아폽토시스 세포의 증식의 감소, 또는 임의의 이들의 조합을 포함한다. 또 다른 양상에서, 상기 개별적인 단핵-풍부화 세포 집단을 수득하는 것은 백혈구성분채집술에 의해 다수의 개별적인 공여자로부터 백혈구(WBC) 분획을 수득하는 것을 포함한다. 또 다른 양상에서, 백혈구(WBC) 분획은 혈액 은행으로부터 수득된 WBC 분획을 포함한다. 또 다른 양상에서, 백혈구(WBC) 분획은 림프구, 단핵구, 수지상 세포 및 자연 살해 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 세포 유형을 포함한다. 또 다른 양상에서, 백혈구(WBC) 분획은 약 2개 내지 25개의 혈액의 단위로부터 수집되었다. 또 다른 양상에서, 상기 단핵-풍부화 세포 집단의 수득은 상기 개별적인 단핵-풍부화 세포 집단을 HLA 일치시키는 것에 의해 제한되지 않는다. 또 다른 양상에서, 배양은 약 2 내지 12시간 동안이다. 또 다른 양상에서, 개별적인 단핵-풍부화 세포 집단은 수용자 대상체에 대하여 HLA 일치된 또는 HLA 일치하지 않는 공급원으로부터의 동종이계 세포를 포함한다.
관련된 양상에서, 상기 단핵 풍부화 집단의 불활화시키는 단계 (f)는 상기 개별적인 집단에서 면역 반응을 억제하거나 제거하는 것, 상기 개별적인 집단 사이의 교차반응성을 억제하거나 제거하는 것, 또는 상기 개별적인 집단에서 T-세포 수용체 활성을 감소시키거나 제거하는 것을 포함하고, 여기서 상기 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제를 포함하는 상기 제조된 약제학적 조성물은 상기 세포 제제 내에 살아있는 비아폽토시스 세포의 백분율의 감소, 임의의 살아있는 비아폽토시스 세포의 세포 활성화의 억제, 또는 임의의 살아있는 비아폽토시스 세포의 증식의 감소, 또는 임의의 이들의 조합을 포함한다. 또 다른 양상에서, 불활화 상기 단핵 풍부화 집단은 상기 단핵 풍부화 집단을 조사하는 것을 포함한다. 또 다른 양상에서, 조사는 감마선 조사 또는 UV 조사를 포함한다. 또 다른 양상에서, 조사는 약 25 내지 30 그레이 단위(Grey unit)(Gy)를 포함한다.
일 양상에서, 대상체에게 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제를 포함하는 약제학적 조성물, 또는 본 명세서에 기재된 조성물, 또는 본 명세서에 기재된 방법에 의해 제조된 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 이의 필요가 있는 대상체에서 면역 질환, 자가면역 질환, 사이토카인 방출 증후군(CRS), 사이토카인 스톰 또는 염증성 질환의 치료, 예방, 완화, 억제, 또는 발생률의 감소 방법이 본 명세서에 기재된다. 일 양상에서, 면역 질환은 GVHD, 관절염, 통풍 또는 염증성 장 질환을 포함하는 군으로부터 선택된다. 또 다른 양상에서, 대상체는 조혈 악성종양을 앓고 있거나, 이식편대종양 또는 이식편대백혈병(GVL) 효과를 보유하거나, 조혈 줄기 세포 이식(HSCT)을 받고 있거나, 또는 고형 장기 이식을 받고 있다. 또 다른 양상에서, HSCT는 동종이계 HSCT이고, 상기 약제학적 조성물은 상기 대상체 또는 상기 공여자와 HLA 일치하지 않는 다수의 동종이계 공여자로부터 수득된 세포를 포함한다. 또 다른 양상에서, 약제학적 조성물의 투여는 상기 이식 전 24시간 이하에 수행되거나, 이식과 동시에 투여되거나, 상기 이식 후에 15일까지 투여된다. 추가의 양상에서, 약제학적 조성물은 정맥 주사에 의해 투여된다.
본 명세서에 기재된 바와 관련된 주제는 특히 명세서의 결론 부분에서 지적되며 명백하게 청구된다. 그러나, 목적물, 특징, 및 이의 장점과 함께 작업의 조직화 및 방법은 첨부된 도면을 읽을 때 하기 상세한 설명을 참조로 하여 가장 잘 이해될 수 있고:
도 1은 생존에 대한 다수의 개별적인 공여자(청색)로부터의 단일 아폽토시스 세포 제제 주사의 분명한 효과(p<0.01)를 나타내는 그래프를 도시한다. 도시된 그래프는 다수의 개별적인 공여자로부터의 단일 용량 조사된 혼주된 아폽토시스 세포 제제로 처리된 GvHD 마우스 모델에서의 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 곡선이다.
도 2는 2개의 비교군의 중량 손실의 백분율에 대한 다수의 개별적인 공여자(청색)로부터의 단일 아폽토시스 세포 제제 주사의 분명한 효과(p<0.01)를 나타내는 그래프를 도시한다.
도 3은 유도된 GvHD의 마우스 모델을 사용하는 생존율(%)에 대한 단일-공여자 및 다수의-공여자 아폽토시스 세포 제제 +/- 조사의 단일 용량의 투여의 비교를 나타내는 그래프를 도시한다.
도 4A 내지 도 4B는 HLA-DR의 발현에 의해 측정된, 아폽토시스 세포(ApoCell)와의 상호작용 후에 수지상 세포(DC)의 성숙의 억제를 나타내는 효능 시험의 결과를 도시한다. 도 4A. 신선한 최종 생성물 A(tO)의 HLA DR 평균 형광. 도 4B. 2 내지 8℃에서 24h 후, 최종 생성물 A의 HLA DR 평균 형광
도 5A 내지 도 5B는 CD86의 발현에 의해 측정된, 아폽토시스 세포와의 상호작용 후에 수지상 세포(DC)의 성숙의 억제를 나타내는 효능 시험의 결과를 도시한다. 도 5A. 신선한 최종 생성물 A(tO)의 CD86 평균 형광. 도 5B. 2 내지 8℃에서 24h 후, 최종 생성물 A의 CD86 평균 형광.
묘사의 단순함과 명확함을 위하여 도면에 나타낸 요소들은 반드시 일정한 비율로 그려진 것은 아니라는 것이 인식될 것이다. 예를 들면, 몇몇 요소의 치수는 명확성을 위하여 다른 요소에 비하여 과장될 수 있다. 추가로, 적절하게 간주되는 경우, 참조 숫자는 도면 중에서 상응하거나 동일한 요소를 지시하기 위하여 반복될 수 있다.
이러한 출원은 2015년 4월 21일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/150,305호의 유익을 주장한다.
하기 상세한 설명에서, 다수의 특정한 세부사항은 본 명세서의 기재내용의 철저한 이해를 제공하기 위하여 기재된다. 그러나, 당해 분야의 숙련가는 세포 제제, 세포 제제의 제조 방법 및 이들 세포 제제를 사용하는 방법이 이들 특정한 세부사항 없이 실시될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 다른 예에서, 잘 알려진 방법, 절차, 및 구성원은 본 명세서에 나타낸 기재내용을 모호하게 만들지 않기 위하여 상세하게 기재되지 않았다.
이러한 기재내용은 일 실시형태에서 초기 아폽토시스 상태의 단핵 세포를 포함하는 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제를 제공하고, 여기서 상기 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제는 혼주된 개별적인 단핵 세포 집단을 포함하고, 여기서 상기 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제는 살아있는 비아폽토시스 세포의 백분율의 감소, 임의의 살아있는 비아폽토시스 세포의 억제된 세포 활성화, 또는 임의의 살아있는 비아폽토시스 세포의 증식의 감소, 또는 임의의 이들의 조합을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 혼주된 단핵 아폽토시스 세포는 조사되었다. 또 다른 실시형태에서, 이러한 기재내용은, 몇몇 실시형태에서, 공여된 혈액으로부터 수득된 백혈구 분획(WBC)을 사용하는 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제를 제공한다. 종종 이러한 WBC 분획은 혈액 은행에서 폐기되거나, 연구에서 사용을 목표로 한다.
일 실시형태에서, 세포 제제는 불활화된다. 또 다른 실시형태에서, 불활화는 조사를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 불활화는 T-세포 수용체 불활화를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 불활화는 T-세포 수용체 편집(editing)을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 불활화는 상기 제제에서 면역 반응을 억제하거나 제거하는 것을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 불활화는 제제에 포함된 다수의 개별적인 집단 사이의 교차반응성을 억제하거나 제거하는 것을 포함한다. 다른 실시형태에서, 불활화는 제제에 포함된 다수의 개별적인 집단 사이의 T-세포 수용체 활성을 감소시키거나 제거하는 것을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 불활화된 세포 제제는 살아있는 비아폽토시스 세포의 백분율의 감소, 임의의 살아있는 비아폽토시스 세포의 억제된 세포 활성화, 또는 임의의 살아있는 비아폽토시스 세포의 증식의 감소, 또는 임의의 이들의 조합을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 불활화된 세포 제제는 비-방사된 세포 제제와 비교하여 비휴지기 비아폽토시스 세포의 감소된 수를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 조사는 감마선 조사 또는 UV 조사를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 조사된 제제는 비조사된 세포 제제와 비교하여 비휴지기 비아폽토시스 세포의 감소된 수를 갖는다.
또 다른 실시형태에서, 혼주된 단핵 아폽토시스 세포는 T-세포 수용체 불활화를 경험하였다. 또 다른 실시형태에서, 혼주된 단핵 아폽토시스 세포는 T-세포 수용체 편집을 경험하였다.
일 실시형태에서, 혼주된 혈액은 수용자에 관하여 HLA 일치된 또는 HLA 일치하지 않는 공급원 이외의 제3자 혈액을 포함한다.
일 실시형태에서, 이러한 기재내용은 초기 아폽토시스 상태의 혼주된 개별적인 단핵 세포 집단을 포함하는 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제를 포함하는 약제학적 조성물을 제조하는 방법을 제공하고, 여기서 상기 조성물은 살아있는 비아폽토시스 세포의 백분율의 감소, 임의의 살아있는 비아폽토시스 세포의 억제된 세포 활성화을 갖는 제제, 또는 임의의 살아있는 비아폽토시스 세포의 증식의 감소을 갖는 제제, 또는 임의의 이들의 조합을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 방법은 초기 아폽토시스 상태에서 혼주된 개별적인 단핵 세포 집단을 포함하는 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하고, 여기서 상기 조성물은 비휴지기 비아폽토시스 세포의 백분율의 감소를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 이러한 기재내용은 이의 필요가 있는 대상체에서 면역 질환, 자가면역 질환, 염증성 질환, 사이토카인 방출 증후군(CRS), 사이토카인 스톰, 또는 불임의 치료, 예방, 완화, 억제, 또는 발생률의 감소를 위한, 본 명세서에 기재된 바와 같은 초기 아폽토시스 상태의 단핵 세포를 포함하는 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제의 사용 방법을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제가 본 명세서에 기재되고, 여기서 특정한 실시형태에서 이러한 세포 제제의 사용은 공여자 및 수용자의 일치, 예를 들면, HLA 타이핑(typing)이 필요하지 않다.
혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제
일 실시형태에서, 이러한 기재내용은 초기 아폽토시스 상태의 단핵 세포를 포함하는 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제를 제공하고, 여기서 상기 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제는 혼주된 개별적인 단핵 세포 집단을 포함하고, 상기 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제는,
비휴지기 비아폽토시스 세포의 백분율의 감소;
임의의 살아있는 비아폽토시스 세포의 억제된 세포 활성화; 또는
임의의 살아있는 비아폽토시스 세포의 증식의 감소;
또는 임의의 이들의 조합을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 초기 아폽토시스 상태의 단핵 세포를 포함하는 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제로서, 여기서 상기 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제는 혼주된 개별적인 단핵 세포 집단을 포함하고, 여기서 상기 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제는 비휴지기 비아폽토시스 세포의 감소된 수를 포함한다.
숙련가는 용어 "혼주된"이, 일 실시형태에서, 다수의 개별적인 공여자로부터 수집되고, 제조되고, 가능하게는 나중의 사용을 위하여 저장된 혈액을 포함한다는 것을 인식할 것이고, 여기서 다수의 개별적인 공여자의 혈액으로부터 수득된 단핵-풍부화 세포 집단은, 예를 들면, 말초 혈액의 개별적인 단핵-풍부화 세포 집단을 수득한 후에, 제제의 임의 단계 후에 또는 이와 동시에 조합될 수 있다. 대안적으로, 또 다른 실시형태에서, 혼주는 상기 단핵-풍부화 세포 집단의 냉동 후에 또는 이와 동시에 발생한다. 또 다른 실시형태에서, 혼주는 상기 단핵-풍부화 세포 집단의 해동 후에 또는 이와 동시에 발생한다. 또 다른 실시형태에서, 혼주는 아폽토시스를 유도하는 배양 후에 또는 이와 동시에 발생한다. 또 다른 실시형태에서, 혼주는 세포의 아폽토시스 집단의 재현탁 후에 또는 이와 동시에 발생한다. 또 다른 실시형태에서, 혼주는 단핵 세포 집단의 불활화 단계 후에 또는 이와 동시에 발생한다.
그 다음, 단핵-풍부화 세포 집단의 조합된 풀의 가공을 계속하여 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제를 제조할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 숙련가는 용어 "혼주된"이 개별적인 공여자로부터 수집되고, 아폽토시스 세포 제제로서 개별적으로 제조되고, 가능하게는 저장된, 혈액을 포함한다는 것을 인식할 것이고, 여기서 상기 제제는 아폽토시스 제제의 재현탁 시간에 "혼주"된다. 또 다른 실시형태에서, 개별적인 공여자로부터 수집된 혈액의 제조는 동시적이고 평행적이다. 또 다른 실시형태에서, 개별적인 공여자로부터 수집된 혈액의 제조는 동시적이지 않다.
또 다른 실시형태에서, 세포는 하기 제조 방법에 기재된 배양 단계 직전에 혼주되고, 여기서 아폽토시스가 유도된다. 또 다른 실시형태에서, 세포는 하기 제조 방법에 기재된 바와 같은 재현탁 단계에서 배양 단계 후에 혼주된다. 또 다른 실시형태에서, 세포는 조사 단계 직전에 혼주된다. 또 다른 실시형태에서, 세포는 불활화 단계 후에 혼주된다. 또 다른 실시형태에서, 세포는 조사 단계 후에 혼주된다. 또 다른 실시형태에서, 세포는 하기 제조 방법에 기재된 임의의 단계에서 혼주된다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제는 상기 개별적인 단핵 세포 집단의 아폽토시스의 유도 전에 또는 아폽토시스의 유도 후에 혼주된 개별적인 단핵 세포 집단을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제는 단핵 아폽토시스 세포의 용이하게 이용 가능한 공급이 대상체에서 면역 질환, 자가면역 질환, 염증성 질환, 사이토카인 방출 증후군(CRS), 또는 사이토카인 스톰의 치료, 예방, 완화, 억제, 또는 발생률의 감소를 사용하는데 이용 가능할 수 있다는 것을 보장한다.
일 실시형태에서, 혼주된 아폽토시스 세포 제제는 약 2개 내지 25개의 혈액 단위로 존재하는 세포로부터 수득된다. 또 다른 실시형태에서, 상기 혼주된 아폽토시스 세포 제제는 약 2개 내지 5개, 2개 내지 10개, 2개 내지 15개, 2개 내지 20개, 5개 내지 10개, 5개 내지 15개, 5개 내지 20개, 5개 내지 25개, 10개 내지 15개, 10개 내지 20개, 10개 내지 25개, 6개 내지 13개, 또는 6개 내지 25개의 혈액 단위로 존재하는 세포로 구성된다. 또 다른 실시형태에서, 상기 혼주된 아폽토시스 세포 제제는 약 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개 또는 25개의 혈액 단위로 존재하는 세포로 구성된다. 필요한 혈액 단위의 수는 또한 혈액으로부터의 WBC 회수의 효율에 따라 좌우된다. 예를 들면, 저효율 WBC 회수는 추가의 필요한 단위를 야기할 것인 반면 고효율 WBC 회수는 더 적은 필요한 단위를 야기할 것이다. 몇몇 실시형태에서, 각각의 단위는 혈액 백이다. 또 다른 실시형태에서, 혼주된 아폽토시스 세포 제제는 적어도 25개의 혈액 단위, 적어도 50개의 혈액 단위, 또는 적어도 100개의 혈액 단위로 존재하는 세포로 구성된다.
일 실시형태에서, 혈액 단위는 헌혈로부터의 백혈구(WBC) 분획을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 공여는 혈액 센터 또는 혈액 은행으로부터의 것일 수 있다. 다른 실시형태에서, 공여는 혼주된 아폽토시스 세포 제제의 제조 시간에 모아진 병원에서 공여자로부터의 것일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 다수의 개별적인 공여자로부터의 WBC를 포함하는 혈액 단위는 본 명세서에 기재된 바와 같은 목적을 위하여 생성된 독립적인 혈액 은행에 저장되고 유지된다. 또 다른 실시형태에서, 다수의 개별적인 공여자로부터의 WBC를 포함하는 혈액 단위를 공급할 수 있는 본 명세서에 기재된 바와 같은 목적을 위하여 개발된 혈액 은행은 백혈구성분채집술 단위를 포함한다.
일 실시형태에서, 혼주된 WBC의 단위는 HLA 일치에 의해 제한되지 않는다. 그러므로, 수득된 혼주된 아폽토시스 세포 제제는 HLA 일치에 의해 제한되지 않는 세포 집단을 포함한다. 따라서, 특정한 실시형태에서 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제는 동종이계 세포를 포함한다.
인간 대상체의 일배체형-일치가 치료적 이식의 맥락에서 당해 분야에서 일상적으로 실시되고, 일반적으로 HLA-A, HLA-B, 및 HLA-DR 대립유전자의 일치를 포함하는 반면, HLA 일치에 의해 제한되지 않는 혼주된 WBC로부터 수득되는 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제의 장점은 WBC의 용이하게 이용 가능한 공급원 및 WBC를 수득하는 감소된 비용이다.
일 실시형태에서, 혼주된 혈액은 HLA 일치와 독립적인 다수의 개별적인 공여자로부터의 혈액을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 혼주된 혈액은 수용자와 HLA 일치가 고려되었던 다수의 개별적인 공여자로부터의 혈액을 포함한다. 예를 들면, 1 HLA 대립유전자, 2 HLA 대립유전자, 3 HLA 대립유전자, 4 HLA 대립유전자, 5 HLA 대립유전자, 6 HLA 대립유전자, 또는 7 HLA 대립유전자가 공여자와 수용자 사이에서 일치되었다. 또 다른 실시형태에서, 다수의 개별적인 공여자는 부분적으로 일치하고, 예를 들면, 몇몇 공여자는 HLA 일치하였고, 여기서 1 HLA 대립유전자, 2 HLA 대립유전자, 3 HLA 대립유전자, 4 HLA 대립유전자, 5 HLA 대립유전자, 6 HLA 대립유전자, 또는 7 HLA 대립유전자는 본 명세서에 기재된 바와 같이 몇몇 공여자와 수용자의 사이에서 일치하였다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 세포 제제는 개별적인 단핵 세포 집단의 HLA 마커의 임의의 HLA 일치와 독립적인 혼주된 집단을 포함하는 혼주된 개별적인 단핵 세포 집단을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 혼주된 개별적인 단핵 세포 집단을 포함하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포 제제는 수용자 대상체에 관하여 HLA 일치된 또는 HLA 일치하지 않는 공급원으로부터의 동종 세포를 포함한다.
하기 실시예에 해결되는 하나의 문제점은 본 명세서에 기재된 바와 같이 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제에 대한 실험실 동물(예를 들면, GvHD의 뮤린 모델)의 반응이다. 특정한 실시형태에서, 몇몇 생존 가능한 비아폽토시스 세포(가능하게는 아폽토시스 내성 세포)는 하기 기재된 아폽토시스 단계의 유도 후에 남아있을 수 있다.
일 실시형태에서 생존 가능한 비아폽토시스 세포는 아넥신(Annexin) V 음성 및 프로피디움 아이오다이드 음성인 살아있는 세포를 포함한다. 당해 분야의 숙련가는 용어 "생존 가능한 비아폽토시스 세포"가 "비휴지기 비아폽토시스 세포"와 상호교환적으로 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 숙련가는 비휴지기 비아폽토시스 세포가 아넥신 V 음성 및 프로피디움 아이오다이드 음성이라는 것을 인식할 것이다.
이들 생존 가능한 비아폽토시스 세포는 증식할 수 있거나 활성화될 수 있다. 이식의 경우에, 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제의 세포는 새로운 이식과 함께 투여될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 다수의 개별적인 공여자로부터 수득된 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제는 호스트에 대항하여 활성화될 수 있고, 추가로 서로에 대하여 활성화될 수 있따. 특정한 실시형태에서, 투여된 생존 가능한 비아폽토시스 세포의 약 10 내지 20%가 생착될 수 있고 작용성일 수 있다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제는 불활화된 세포 제제를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 불활화된 세포 제제는 불활성 T-세포 수용체를 포함하는 세포를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 불활화된 세포 제제는 감소된 면역 반응을 포함하는 세포를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 불활화된 세포 제제는 불활성 T-세포 수용체 또는 감소된 면역 반응을 포함하는 세포를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 불활화된 세포 제제는 상기 집단 사이의 억제되거나 제거된 교차반응성을 갖는 다수의 개별적인 단핵 집단을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 불활화된 세포 제제는 감소되거나 제거된 T-세포 수용체 활성을 갖는 다수의 개별적인 단핵 집단을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 불활화된 세포 제제는 휴지기 비아폽토시스 세포의 감소된 수를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 불활화된 세포 제제는 감소되거나 제거된 면역 반응을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 불활화된 세포 제제는 서로 감소되거나 제거된 교차반응성을 갖는 혼주된 개별적인 단핵 집단을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 불활화된 세포 제제는 조사된 세포 집단을 포함하는 혼주된 개별적인 단핵 세포 집단을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조사된 세포 제제 또는 세포의 집단은 비조사된 세포 제제 또는 집단과 비교하여 억제된 세포 활성화 및 감소된 증식을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 조사는 감마선 조사 또는 UV 조사를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 조사된 세포 제제 또는 집단은 비조사된 세포 제제와 비교하여 비휴지기 비아폽토시스 세포의 백분율의 감소를 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 조사된 세포 제제 또는 집단은 비조사된 세포 제제와 비교하여 비휴지기 비아폽토시스 세포의 감소된 수를 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 조사된 세포 제제는 서로 감소되거나 제거된 교차반응성을 갖는 혼주된 개별적인 단핵 집단을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 조사는 약 15 그레이 단위(Gy)를 포함한다. 또 다른 양상에서, 조사는 약 20 그레이 단위(Gy)를 포함한다. 또 다른 양상에서, 조사는 약 25 그레이 단위(Gy). 또 다른 양상에서, 조사는 약 30 그레이 단위(Gy)를 포함한다. 또 다른 양상에서, 조사는 약 35 그레이 단위(Gy)를 포함한다. 또 다른 양상에서, 조사는 약 40 그레이 단위(Gy)를 포함한다. 또 다른 양상에서, 조사는 약 45 그레이 단위(Gy)를 포함한다. 또 다른 양상에서, 조사는 약 50 그레이 단위(Gy)를 포함한다. 또 다른 양상에서, 조사는 약 55 그레이 단위(Gy)를 포함한다. 또 다른 양상에서, 조사는 약 60 그레이 단위(Gy)를 포함한다. 또 다른 양상에서, 조사는 약 65 그레이 단위(Gy)를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 조사는 2500 Gy 이하를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 조사는 약 15-25 그레이 단위(Gy)를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 조사는 약 25-30 그레이 단위(Gy)를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 조사는 약 30-40 그레이 단위(Gy)를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 조사는 약 40-50 그레이 단위(Gy)를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 조사는 약 50-65 그레이 단위(Gy)를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 조사된 혼주된 아폽토시스 세포 제제는 비조사된 혼주된 아폽토시스 세포 제제로서 동일하거나 유사한 아폽토시스 프로파일, 안정성 및 효능을 유지한다. 또 다른 실시형태에서, 조사된 혼주된 아폽토시스 세포 제제는 동일하거나 유사한 세포 유형 분포 프로파일을 유지한다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제는 상기 개별적인 단핵 세포 집단의 불활화 전에 또는 불활화 후에 혼주된 개별적인 단핵 세포 집단을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제는 상기 개별적인 단핵 세포 집단의 조사 전에 또는 후에 혼주된 개별적인 단핵 세포 집단을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제는 24시간 이하 동안 안정적이다. 또 다른 실시형태에서, 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제는 적어도 24시간 동안 안정적이다. 또 다른 실시형태에서, 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제는 24시간 이상 동안 안정적이다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제는 36시간 이하 동안 안정적이다. 또 다른 실시형태에서, 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제는 적어도 36시간 동안 안정적이다. 추가의 실시형태에서, 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제는 36시간 이상 동안 안정적이다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제는 48시간 이하 동안 안정적이다. 또 다른 실시형태에서, 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제는 적어도 48시간 동안 안정적이다. 또 다른 실시형태에서, 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제는 48시간 이상 동안 안정적이다.
숙련가는 용어 "안정적인"(혹은 안정한)은 초기 아폽토시스 세포의 백분율(%)이 불활화 후, 예를 들면, 일 실시형태에서, 조사 후 감소되지 않는 제제를 포함한다는 것을 인식할 것이다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포 제제 중의 초기 아폽토시스 세포의 백분율(%)은 약 1% 이상 감소되지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 세포 제제 중의 초기 아폽토시스 세포의 백분율(%)은 약 2% 이상 감소되지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포 제제 중의 초기 아폽토시스 세포의 백분율(%)은 약 3% 이상 감소되지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포 제제 중의 초기 아폽토시스 세포의 백분율(%)은 약 4% 이상 감소되지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포 제제 중의 초기 아폽토시스 세포의 백분율(%)은 약 5% 이상 감소되지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포 제제 중의 초기 아폽토시스 세포의 백분율(%)은 약 6% 이상 감소되지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포 제제 중의 초기 아폽토시스 세포의 백분율(%)은 약 7% 이상 감소되지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포 제제 중의 초기 아폽토시스 세포의 백분율(%)은 약 8% 이상 감소되지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포 제제 중의 초기 아폽토시스 세포의 백분율(%)은 약 9% 이상 감소되지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포 제제 중의 초기 아폽토시스 세포의 백분율(%)은 약 10% 이상 감소되지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포 제제 중의 초기 아폽토시스 세포의 백분율(%)은 약 20% 이상 감소되지 않는다.
일 실시형태에서, 조사 단계를 포함하는 혼주된 세포 제제의 제조 방법은 단일 일치 공여자로부터 수득된 아폽토시스 제제에서 관찰되는 초기 아폽토시스, 면역 조절, 및 안정성 성질을 보존하고, 여기서 세포 제제는 조사 단계를 포함하지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제는 이식편대숙주 질환(GVHD) 반응을 야기하지 않는다.
세포 제제의 조사는 당해 분야에서 안전하다고 간주된다. 조사 과정는 현재 공여된 혈액에 대한 일상적인 기초로 수행되어 WBC에 대한 반응을 예방한다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제 중의 아폽토시스 세포의 백분율은 100%에 가깝고, 따라서 세포 제제 중의 살아있는 비아폽토시스 세포의 분획을 감소시킨다. 일 실시형태에서, 아폽토시스 세포의 백분율은 적어도 20%이다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포의 백분율은 적어도 30%이다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포의 백분율은 적어도 40%이다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포의 백분율은 적어도 50%이다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포의 백분율은 적어도 60%이다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포의 백분율은 적어도 70%이다. 추가의 실시형태에서, 아폽토시스 세포의 백분율은 적어도 80%이다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포의 백분율은 적어도 90%이다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포의 백분율은 적어도 99%이다. 따라서, 살아있는 비아폽토시스 세포의 감소되거나 존재하지 않는 또는 휴지기 또는 활성 가능하지 않은 분획을 포함하는 세포 제제는 일 실시형태에서 수용자에서 GVHD를 야기하지 않는 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제를 제공할 수 있다.
대안적으로, 또 다른 실시형태에서, 살아있는 비아폽토시스 WBC의 백분율은 특히 살아있는 세포 집단을 제거함으로써 감소되고, 예를 들면, 또 다른 실시형태에서 표적화된 침전에 의해, 살아있는 비아폽토시스 세포의 백분율은 포스파티딜세린에 결합하는 자성 비드를 사용하여 감소될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 살아있는 비아폽토시스 세포의 백분율은 아폽토시스 세포가 아닌 비아폽토시스 세포의 세포 표면 위의 마커와 결합하는 자성 비드를 사용하여 감소될 수 있다. 또는 그 반대로, 아폽토시스 세포는 비아폽토시스 세포가 아닌 아폽토시스 세포의 세포 표면 위의 마커와 결합하는 자성 비드를 사용하는 추가의 제조를 위하여 선택될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 살아있는 비아폽토시스 WBC의 백분율은 초음파의 사용에 의해 감소된다.
일 실시형태에서 아폽토시스 세포는 혼주된 제3 단체 공여자로부터의 것이다. 또 다른 실시형태에서 아폽토시스 세포는 혼주된 제4 단체 공여자로부터의 것이다. 또 다른 실시형태에서 아폽토시스 세포는 혼주된 제5 단체 공여자로부터의 것이다. 또 다른 실시형태에서 아폽토시스 세포는 혼주된 N-단체 공여자로부터의 것이고, 여기서 N은 제공된 혼주된 세포 제제, 예를 들면, 개별적인 공여자 또는 개별적인 혈액 단위 중의 공급원의 숫자를 나타낸다. 예를 들면, 혼주된 세포 제제가 열(10)명의 개별적인 공급 공여자로부터의 단핵 세포를 포함하는 경우, N은 10이다.
일 실시형태에서, 혼주된 세포 제제는 림프구, 단핵구, 수지상 세포 및 자연 살해 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 세포 유형을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 혼주된 세포 제제는 단핵 세포의 농축된 집단을 포함한다. 일 실시형태에서, 혼주된 단핵은 림프구, 단핵구, 수지상 세포 및 자연 살해 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포 유형을 포함하는 단핵-풍부화 세포 제제이다. 또 다른 실시형태에서, 단핵-풍부화 세포 제제는 15% 이하, 대안적으로 10% 이하, 전형적으로 5% 이하의, 또한 과립구(즉, 호중구, 호염구 및 호산구)로도 알려진, 다형핵 백혈구를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 혼주된 단핵 세포 제제는 과립구가 결여되어 있다.
또 다른 실시형태에서, 혼주된 단핵-풍부화 세포 제제는 15% 이하, 대안적으로 10% 이하, 전형적으로 5% 이하의 CD15high 발현 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 혼주된 아폽토시스 세포 제제는 15% 미만의 CD15 고 발현 세포를 포함한다.
일 실시형태에서, 혼주된 단핵-풍부화 세포 제제는 적어도 60% 단핵 세포, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85% 단핵 세포, 대안적으로 적어도 90% 단핵 세포, 또는 적어도 95% 단핵 세포를 포함하고, 여기서 각각의 가능성은 분리된 실시형태이다. 일 실시형태에서, 혼주된 단핵-풍부화 세포 제제는 적어도 85% 단핵 세포를 포함한다.
일 실시형태에서, 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제는 세포 제제가 고 단핵 세포를 갖는, 증가된 다핵 세포(PMN)를 갖는 세포 제제를 혼주시키는 것을 포함한다.
당해 분야의 숙련가는 용어 "단핵 세포"가 하나의 로브형 핵을 갖는 백혈구를 포함할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 아폽토시스 세포 제제는 5% 미만의 다형핵 백혈구를 포함한다.
약제학적 조성물 및 이의 제조
단일 일치된 공여자로부터의 아폽토시스 세포의 제조 방법 및 이의 용도는 본 명세서에 그 전문이 참고로 인용되는 국제 공개 제WO 2014/087408호(예를 들면, 실시예 11 내지 15 참조), 및 국제 출원 제PCT/IL2016/050194호(예를 들면, 실시예 1 내지 2 참조)에 상세하게 설명되어 있다.
숙련가는 본 명세서에 기재된 용어 "조성물" 및 "약제학적 조성물"이 모든 동일한 의미 및 품질을 갖고 상호교환적으로 사용된다는 것을 인식할 것이고, 일 실시형태에서, 상기 상세하게 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제를 포함하는 조성물을 포함한다. 일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 혼주된 세포 제제를 포함하는 조성물을 포함하고, 추가로 항응고제를 포함한다. 숙련가는 용어 "조성물"이 수용자 대상체, 예를 들면, 필요한 환자에게 세포 제제의 투여를 위하여 사용되는 최종 현탁액 매질 중에 재현탁된 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 세포 제제를 포함하는 조성물을 포함할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 숙련가는 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "최종 현탁액 매질" 및 "투여 매질"이 상호교환적으로 사용되고, 수용자 대상체에게 본 명세서에 기재된 혼주된 세포 제제의 투여에 사용된 매질을 포함할 수 있다는 것을 추가로 인식할 것이다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물은 초기 아폽토시스 상태의 단핵 세포를 포함하는 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제를 포함하고, 여기서 상기 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제는 혼주된 개별적인 단핵 세포 집단을 포함하고, 여기서 상기 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제는 살아있는 비아폽토시스 세포의 백분율의 감소; 임의의 살아있는 비아폽토시스 세포의 억제된 세포 활성화; 또는 임의의 살아있는 비아폽토시스 세포의 증식의 감소; 또는 임의의 이들의 조합을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 조성물 중에서 상기 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제는 본 명세서에 기재된 바와 같은 불활화 제제, 예를 들면, 조사된 제제 또는 상기 개별적인 세포 집단이 조사되었던 제제를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 조성물은 추가로 항응고제를 포함한다.
일 실시형태에서, 초기 아폽토시스 상태의 혼주된 개별적인 단핵 세포 집단을 포함하는 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제를 포함하는 약제학적 조성물을 제조하는 방법이 본 명세서에 기재되되, 상기 방법은
(a) 말초 혈액의 개별적인 단핵-풍부화 세포 집단을 수득하는 단계;
(b) 항응고제를 포함하는 냉동 매질 중에 상기 단핵-풍부화 세포 집단을 냉동시키는 단계;
(c) 상기 단핵-풍부화 세포 집단을 해동시키는 단계;
(d) 최종 농도 약 10 내지 100㎍/㎖의 메틸프레드니솔론 및 항응고제를 포함하는 아폽토시스 유도 배양 매질 중에 상기 단핵-풍부화 세포 집단을 배양하는 단계;
(e) 상기 아폽토시스 세포 집단을 투여 매질 중에 재현탁시키는 단계; 및
(f) 상기 단핵 풍부화 집단을 불활화시키는 단계로서, 상기 불활화가 임의의 단계 (a) 내지 (e) 후에 발생하는, 상기 불활화시키는 단계; 및
(g) 상기 단핵 풍부화 집단을 혼주시키는 단계로서, 상기 혼주는 임의의 단계 (a) 내지 (f) 후에 발생되는, 상기 혼주시키는 단계를 포함하며,
여기서, 상기 방법은 초기 아폽토시스 상태의 혼주된 개별적인 단핵 세포 집단을 포함하는 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제를 포함하는 약제학적 조성물을 제조한다.
일 실시형태에서, 불활화 단계 (f)는 상기 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제 내에 비휴지기 비아폽토시스 세포의 백분율을 감소시키는 것, 임의의 살아있는 비아폽토시스 세포의 세포 활성화를 억제하는 것, 또는 임의의 살아있는 비아폽토시스 세포의 증식을 감소시키는 것, 또는 임의의 이들의 조합을 포함한다.
일 실시형태에서, 단핵-풍부화 세포 집단을 수득하는 것은 백혈구성분채집술에 의해 다수의 개별적인 공여자로부터의 백혈구(WBC) 분획을 수득하는 것을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 단핵-풍부화 세포 집단을 수득하는 것은 혈액 은행으로부터 수득된 WBC 분획을 포함하는 백혈구(WBC) 분획을 수득하는 것을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 수집된 WBC는 이들이 수득된 공급원을 기준으로 사용할 준비가 될 수 있다.
숙련가는 용어 "백혈구성분채집술"은 백혈구가 공여자의 혈액으로부터 분리되는 성분채집술 과정을 포함할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 일 실시형태에서, 공여자의 혈액은 백혈구성분채집술을 받고, 따라서 단핵-풍부화 세포 조성물은 제조 방법에 따라 수득된다. 백혈구성분채집술 동안 적어도 하나의 항응고제의 사용이 수집된 세포의 응고를 방지하기 위하여 당해 분야에 알려진 바와 같이 필요하다는 것을 주의한다.
일 실시형태에서, 백혈구성분채집술 과정은 제조 방법에 따른 단핵-풍부화 세포 조성물의 수집을 허용하도록 구성된다. 일 실시형태에서, 백혈구성분채집술에 의해 수득된 세포 수집은 적어도 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 또는 80% 단핵 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포-공여자로부터의 혈장은 제조 방법에 따른 단핵-풍부화 세포 조성물의 수득과 평행하게 수집된다. 일 실시형태에서, 세포-공여자로부터의 혈장 약 300 내지 600㎖는 제조 방법에 따른 단핵-풍부화 세포 조성물의 수득과 평행하게 수집된다. 일 실시형태에서, 제조 방법에 따른 단핵-풍부화 세포 조성물의 수득과 평행하게 수집된 혈장은 냉동 및/또는 배양 매질의 부분으로서 사용된다.
일 실시형태에서, 세포 수집시 단핵-풍부화 세포 제제는 적어도 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 또는 적어도 80%의 단핵 세포를 포함하는 반면, 제조 방법에 따른 최종 약제학적 조성물은 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95%의 단핵 세포를 포함한다는 것을 주의한다. 또 다른 실시형태에서, 세포 수집시 단핵-풍부화 세포 제제는 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 제조된 최종 생성물보다 낮은 백분율의 단핵세포를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제는 초기 단핵-풍부화 세포 제제, 예를 들면, 백혈구성분채집술에 의해 수집된 이들 제제보다 높은 백분율의 단핵 세포를 포함한다.
특정한 실시형태에 따라, 조성물의 제조에 사용된 단핵-풍부화 세포 제제는 세포 수집시 적어도 50%의 단핵 세포를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물의 제조에 사용된 단핵-풍부화 세포 제제는 세포 수집시 약 40 내지 60%의 단핵 세포를 포함한다. 특정한 실시형태에 따라, 본 기재내용은 공여자의 말초 혈액으로부터의 단핵-풍부화 세포 제제를 수득하는 것을 포함하고, 단핵-풍부화 세포 제제는 적어도 50%의 단핵 세포를 포함하는, 약제학적 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 방법이 공여자의 말초 혈액으로부터 단핵-풍부화 세포 제제를 수득하는 것을 포함하고, 단핵-풍부화 세포 제제는 약 40-60%의 단핵 세포를 포함하는, 약제학적 조성물을 제조하는 방법. 특정한 실시형태에 따라, 본 발명의 기재내용은 방법이 적어도 40%, 50%, 또는 60%의 단핵 세포를 포함하는 단핵-풍부화 세포 제제를 냉동하는 것을 포함하는 약제학적 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
일 실시형태에서, 혈액 단위는 0.35×107 세포를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 1×106 내지 1×107 세포가 수득된다. 또 다른 실시형태에서, 수득된 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같은 제제로 사용할 준비가 된다. 또 다른 실시형태에서, 백혈구(WBC) 분획은 약 2개 내지 25개의 혈액 단위로 수집된다. 또 다른 실시형태에서, 백혈구(WBC) 분획은 약 1개 내지 250개의 혈액 단위로 수집된다. 또 다른 실시형태에서, 백혈구(WBC) 분획은 약 1개 내지 500개의 혈액 단위로 수집된다. 또 다른 실시형태에서, 백혈구(WBC) 분획은 약 1개 내지 1000개의 혈액 단위로부터 수집된다. 또 다른 실시형태에서, 백혈구(WBC) 분획은 약 1개 내지 2000개의 혈액 단위로 수집된다.
또 다른 실시형태에서, 2개 내지 25개의 혈액 단위가 본 명세서에서 조성물의 제조에 있어서 1일 동안 수집될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 1개 내지 250개의 혈액 단위가 본 명세서에서 조성물의 제조에 있어서 1일 동안 수집될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 1개 내지 500개의 혈액 단위가 본 명세서에서 조성물의 제조에 있어서 1일 동안 수집될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 500개 내지 1000개의 혈액 단위가 본 명세서에서 조성물의 제조에 있어서 1일 동안 수집될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 500개 내지 2000개의 혈액 단위가 본 명세서에서 조성물의 제조에 있어서 1일 동안 수집될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 1000개의 혈액 단위가 본 명세서에서 조성물의 제조에 있어서 1일 동안 수집될 수 있다.
일 실시형태에서, 3500억개의 혼주된 혈액 세포가 본 명세서에 기재된 조성물의 제제에 있어서 수득된다. 또 다른 실시형태에서, 100-5000억개의 혼주된 혈액 세포가 본 명세서에 기재된 조성물의 제제에 있어서 수득된다. 또 다른 실시형태에서, 약 1000억, 약 2000억, 약 3000억, 약 4000억, 약 5000억, 약 6000억, 약 7000억, 약 8000억, 또는 약 9000억 세포가 본 명세서에 기재된 조성물의 제제에 있어서 수득된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물의 투여량은 대상체 킬로당 3500만 내지 7000만 혼주된 단핵 아폽토시스 세포를 포함한다. 따라서, 3500억 세포의 풀로 출발하여, 80 내지 150 투여량 단위는 한번에 제조될 수 있다. 일 실시형태에서, 평균적으로 10 단위의 혼주된 혈액은 단일 치료제 용량을 제조한다. 이러한 계산은 제조 효능 등에서 가능한 개선을 고려하지 않으면서 현재 제조 백혈구성분채집술을 기반으로 한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물은 반복된 투약을 위하여 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 제조 방법은 약 2 내지 25개의 혈액 단위로부터 수집된 백혈구(WBC) 분획을 포함하는 혼주된 단핵-풍부화 세포 집단을 제조하는 것을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 백혈구(WBC) 분획은 약 13개 내지 25개의 혈액 단위로 수집되었다. 또 다른 실시형태에서, 백혈구(WBC) 분획은 약 10개의 혈액 단위로 수집되었다. 또 다른 실시형태에서, 상기 WBC 분획은 약 2개 내지 5개, 2개 내지 10개, 2개 내지 15개, 2개 내지 20개, 5개 내지 10개, 5개 내지 15개, 5개 내지 20개, 5개 내지 25개, 10개 내지 15개, 10개 내지 20개, 10개 내지 25개, 6개 내지 13개, 또는 6개 내지 25개의 혈액 단위로부터 수집되었다. 또 다른 실시형태에서, 상기 WBC 분획은 약 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개 또는 25개의 혈액 단위로 수집되었다. 필요한 혈액 단위의 수는 또한 혈액으로부터의 WBC 회수 효율에 따라 좌우된다. 예를 들면, 저효율 WBC 회수는 추가의 필요한 단위를 야기할 것인 반면, 고효율 WBC 회수는 더 적은 필요한 단위를 야기할 것이다. 몇몇 실시형태에서, 각각의 단위는 혈액 백이다. 또 다른 실시형태에서, 혼주된 아폽토시스 세포 제제는 적어도 25개의 혈액 단위, 적어도 50개의 혈액 단위, 또는 적어도 100개의 혈액 단위로 존재하는 세포로 구성된다. 추가의 실시형태에서, 혼주된 단핵 풍부화 아폽토시스 세포 집단의 제제는 제조를 수행하는 숙련가에 의해 결정된 만큼의 단위의 WBC를 포함한다.
일 실시형태에서, 조성물의 제조 방법은 HLA 일치에 따라 수집된 WBC 분획을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 WBC 분획은 백혈구성분채집술에 의해 다수의 개별적인 공여자로부터 수득된다. 또 다른 실시형태에서, 백혈구(WBC) 분획은 혈액 은행으로부터 수득된다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물의 제조 방법은 상기 개별적인 단핵-풍부화 세포 집단을 HLA 일치시키는 것에 의해 제한되지 않는 상기 단핵-풍부화 세포 집단을 수득하는 것을 포함한다.
일 실시형태에서, 약제학적 조성물 중의 헤파린은 0.001U/㎖ 내지 3U/㎖, 전형적으로 0.01㎖ 내지 2.5U/㎖의 농도로 존재한다. 또 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물 중의 헤파린은 0.005U/㎖ 내지 2.5U/㎖의 농도로 존재한다. 다른 실시형태에 따라, 약제학적 조성물 중의 헤파린은 0.01U/㎖ 내지 1U/㎖의 농도로 존재한다. 일 실시형태에서, 약제학적 조성물 중의 ACD 포뮬라 A는 0.01% 내지 6% v/v의 농도로 존재한다. 다른 실시형태에 따라, 약제학적 조성물 중의 ACD 포뮬라 A는 0.05% 내지 5% v/v의 농도로 존재한다. 다른 실시형태에 따라, 약제학적 조성물 중의 ACD 포뮬라 A는 0.01% 내지 10% v/v의 농도로 존재한다. 추가로, 단핵 아폽토시스 세포를 포함하는 조성물 및 동일한 제제가 본 명세서에 전문이 참조로서 인용되는 제WO 2014/087408호에 기재되어 있다.
일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 추가로 잔여 메틸프레드니솔론을 포함한다. 일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 추가로 30㎍/㎖을 초과하지 않는 농도로 메틸프레드니솔론을 포함한다. 일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 추가로 항응고제를 포함한다. 일 실시형태에서, 항응고제는 헤파린, ACD 포뮬라 A 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 세포 제제 중의 단핵 세포의 높은 백분율은 본 명세서에 기재된 바와 같은 다단계 제조 프로토콜에 따라 달성된다는 것이 인식되어야 한다(혈액 단위의 백혈구성분채집술 및 혼주, 동결보존 및 메틸프레드니솔론과의 배양 및 다양한 세척 단계를 사용하는 초기-아폽토시스 유도를 포함한다).
숙련가는 용어 "초기 아폽토시스"가 일 실시형태에서 세포의 적어도 85%가 생존 가능하게 남아있고(아넥신 V 양성), 15% 미만이 프로피디움 아이오다이드(PI) 분석에 의해 죽었거나 죽고 있는 것으로 간주되는(PI 음성) 세포의 아폽토시스 집단을 의미한다는 것을 인식할 것이다. 또 다른 실시형태에서, "초기 아폽토시스"는 세포의 적어도 85%가 생존 가능하게 남아있고, 15% 미만의 세포가 CD15high를 발현하는 세포 집단을 의미한다.
숙련가는 용어 "초기 아폽토시스 상태"가 아폽토시스의 후기 징후 없이 아폽토시스의 초기 징후를 나타내는 세포를 포함할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 세포 중의 아폽토시스의 초기 징후의 예는 포스파티딜세린(PS)의 노출 및 미토콘드리아 막 전위의 손실을 포함한다. 후기 사건의 예는 세포 내로의 프로피디움 아이오다이드(PI)의 도입 및 최종 DNA 절단을 포함한다. 세포가 "초기 아폽토시스" 상태인 것을 입증하기 위하여, 일 실시형태에서, 아넥신-V 및 PI 염색에 의한 PS 노출 검출이 사용되고, 아넥신 V로 염색되지만 PI로 염색되지 않는 세포는 "초기 아폽토시스 세포"로 간주된다. 또 다른 실시형태에서, 아넥신-V FITC 및 PI 둘 다로 염색되는 세포는 "후기 아폽토시스 세포"로 간주된다. 또 다른 실시형태에서, 아넥신-V 또는 PI로 염색되지 않은 세포는 비아폽토시스 생존 가능한 세포(살아있는 세포)로 간주된다.
일 실시형태에서, 아폽토시스 세포는 초기 아폽토시스 상태의 세포를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포는 상기 세포의 적어도 90%가 초기 아폽토시스 상태인 세포를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포는 상기 세포의 적어도 80%가 초기 아폽토시스 상태인 세포를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포는 상기 세포의 적어도 70%가 초기 아폽토시스 상태인 세포를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포는 상기 세포의 적어도 60%가 초기 아폽토시스 상태인 세포를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포는 상기 세포의 적어도 50%가 초기 아폽토시스 상태인 세포를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포가 상기 세포의 적어도 40%가 초기 아폽토시스 상태인 세포를 포함한다.
일 실시형태에서, 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제의 제조 방법은 림프구, 단핵구, 수지상 세포 및 자연 살해 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 세포 유형을 포함하는 백혈구(WBC) 분획을 포함한다.
일 실시형태에서, 단핵-풍부화 세포 제제는 저농도의 비-단핵 백혈구, 예를 들면, 이로써 제한되지는 않지만, 다형핵 백혈구 및 호중구를 포함한다. 일 실시형태에서, 혼주된 단핵-풍부화 세포 제제는 과립구가 결여되어 있다. 일 실시형태에서, 과립구는 제조 방법의 다양한 단계 동안 분해된다. 일 실시형태에서, 조성물은 15% 이하, 대안적으로 10% 이하, 전형적으로 5% 이하의 과립구를 포함한다.
일 실시형태에서, 과립구는 제조 방법의 냉동 및 해동 단계 후 유의미한 정도로 분해된다. 일 실시형태에서, 과립구는 제조 방법의 냉동 및 해동 후 유의미한 정도로 분해되고, 냉동 및/또는 해동 단계 후 세척 단계 동안 제제로부터 세척된다.
일 실시형태에서, 분해된 과립구는 제조 방법의 다양한 단계 동안 세포 제제로부터 세척된다. 일 실시형태에서, 조성물은 15% 이하, 가능하게는 10% 이하, 전형적으로 5% 이하의 다형핵 백혈구를 포함한다.
일 실시형태에서, 조성물은 5% 이하의 다형핵 백혈구를 포함한다. 일 실시형태에서, 조성물은 15% 이하, 대안적으로 10% 이하, 전형적으로 5% 이하의 CD15high 발현 세포를 포함한다.
일 실시형태에서, 조성물은 5% 이하의 CD15high 발현 세포를 포함한다.
숙련가는 용어 "CD15high" 발현 세포가 과립구를 포함할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
아폽토시스의 초기 특징은 혈장 막에서의 형태학적 변화이다. 이러한 변화는 세포 막의 내부 층으로부터 외부 층으로의 막 인지질 포스파티딜세린(PS)의 자리이동을 포함한다. 칼슘 이온의 존재에서, 아넥신 V는 PS에 대한 높은 특이성과 친화력을 갖는다. 따라서, 노출된 PS를 갖는 세포에 아넥신 V를 결합시키는 것은 초기 세포 아폽토시스를 검출하는 매우 민감한 방법을 제공한다.
따라서, 일 실시형태에서, 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 세포의 "초기 아폽토시스 상태" 또는 "초기 아폽토시스 세포"는 DNA 절단을 받기 시작하고 포스파티딜세린의 자리이동을 경험하기 시작했지만 여전히 온전한 세포 막을 갖고 있는 세포 집단을 의미한다. 사용되는 바와 같이, 초기 아폽토시스 세포, 또는 초기 아폽토시스 상태의 세포는 아넥신 V을 사용하여 양성 염색되고, 프로피디움 아이오다이드(PI)로 음성 염색되는 세포이다. 초기 아폽토시스의 검출 방법은 유동 세포측정 분석에 의한 아넥신 V 양성 및 프로피디움 아이오다이드(PI) 음성의 초기 아폽토시스 세포 검출 방법과 같이 당해 분야에 공지되어 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물의 제조 방법의 일 실시형태에서, 조사 단계는 세포 제제의 초기 아폽토시스 표현형(즉, %PS 양성 및 PI 음성)을 유의미하게 변화시키지 않는다.
일 실시형태에서, 후기 아폽토시스 상태인 세포는 유동 세포측정 분석기를 사용하여 증명될 수 있는 바와 같이, 아넥신 V를 사용하는 양성 염색 및 PI를 사용하는 음성 염색에 의해 검출될 수 있다. PI는 막 불투과성이고, 따라서 후기 아폽토시스 또는 괴사 세포와 같이 세포 막의 온전함이 취약한 세포로만 들어갈 수 있다는 것을 주의한다. 일 실시형태에서, 괴사 세포는 유동 세포측정 분석기를 사용하여 증명될 수 있는 바와 같이, PI에 대하여 강한 염색을 나타낸다.
몇몇 실시형태에서, 세포 제제는 현탁액 중의 세포를 포함한다.
숙련가는 세포의 "생존능"이라는 용어는 괴사, 초기 아폽토시스, 또는 후기 아폽토시스를 경험하지 않은 세포를 포함할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 본 명세서에서 용어 "생존 가능한 세포"는 괴사를 경험하지 않은 세포 또는 초기 또는 후기 아폽토시스 상태가 아닌 세포를 의미한다. 일 실시형태에서, 용어 "생존 가능한 세포"는 온전한 혈장 막을 갖는 세포를 의미한다. 세포 생존능의 측정하기 위한 분석은 유동 세포측정 분석기에 의해 검출될 수 있는 프로피디움 아이오다이드(PI) 염색을 사용하는 것과 같이 당해 분야에 알려져 있다. 따라서, 일 실시형태에서, 생존 가능한 세포는 프로피디움 아이오다이드 흡입을 보이지 않으며 포스파티딜세린을 발현하지 않는 세포이다. 괴사는 빛, 형광 또는 전자 현미경 기술에 의해, 또는 염료 트리판 블루의 흡입을 통해 추가로 확인될 수 있다.
괴사와는 구별되는 세포 사멸 과정인 아폽토시스는, 예를 들면, 정상 세포 및 조직 발달, 병원체-감염된 세포의 T-림프구 살해, 및 돌연변이적으로 손상된 세포의 자기-제거 동안, 발생하는 세포의 설정되고 정돈된 병리학적 제거이다. 아폽토시스 세포는 규칙적으로 떨어진 위치에서 세포질 및 핵, 염색질 절단, 및 뉴클레오솜 사이 부위에서 게놈 DNA의 엔도뉴클레오틱 절단에서 구별된 형태학적 변경을 특징으로 한다. 세포 아폽토시스를 측정하기 위한 분석은 아넥신 V를 사용하는 것과 같이 당해 분야에 알려져 있다. 다른 한편으로는, 괴사는 전적으로는 아니지만 전형적으로, 치명적인 세포 부상 후 효소의 제어되지 않는, 점진적인 작용에 의하여 유발되는 세포 사멸의 선천적으로 병리적이고 전염증성 과정이다. 괴사 세포는 전형적으로 미토콘드리아 팽창, 핵 응집, 세포 용해, 막 완결성의 손실, 및 궁극적으로 세포 사멸을 특징으로 한다.
일 실시형태에서, 세포 제제는 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 생존 가능한 세포, 또는 적어도 97%의 생존 가능한 세포를 포함한다.
추가의 실시형태에서, 세포 제제 중의 생존 가능한 세포의 높은 백분율은 제조 후 적어도 24시간 동안 남아있다. 일 실시형태에서, 괴사 세포 및/또는 후기 아폽토시스 상태의 세포는 분해되고, 따라서 제조 방법의 세척 단계 동안 최종 세포-제조로부터 실질적으로 제거된다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 일 실시형태에서, 자가면역 질환, 예를 들면, GVHD에서 치료적 면역 관용을 유도하기 위하여, 세포 제제 중의 치료적 단핵-풍부화 세포는 동종이계 개체로부터 수득된다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 제조된 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제는 수용자 대상체에 관하여 HLA 일치된 또는 HLA 일치하지 않는 공급원으로부터의 동종이계 세포를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 동종이계 세포는 수용자 대상체에 관하여 HLA 일치된 공급원을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 동종이계 세포는 수용자 대상체에 관하여 HLA 일치하지 않는 공급원을 포함한다.
일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 혼주된 세포 제제를 포함하고 항응고제를 추가로 포함한다.
숙련가는 용어 "혼주된 세포 제제", "세포 제제", "혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제", "단핵 풍부화 아폽토시스 세포 제제", 및 "단핵 아폽토시스 세포 제제"가 일 실시형태에서 모든 동일한 의미 및 품질을 갖고 상호교환적으로 사용된다는 것을 인식할 것이다.
일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 세포 제제를 포함하고, 잔여 메틸프레드니솔론을 추가로 포함한다. 다른 실시형태에 따라, 약제학적 조성물은 세포 제제를 포함하고, 항응고제 및 잔여 메틸프레드니솔론을 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 잔여 메틸프레드니솔론은 제조 방법의 사용 후 조성물 중에 남아있는 메틸프레드니솔론을 의미한다.
일 실시형태에서, 조성물은 항응고제를 포함한다. 당해 분야에 알려진 바와 같이, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 항응고제는 혈액 응고를 예방하거나 감소시키는 성분을 의미한다. 일 실시형태에서, 항응고제는 헤파린이다. 다른 실시형태에 따라, 항응고제는 산-시트레이트-덱스트로스(ACD), 포뮬라 A이다. 일 실시형태에서, 항응고제는 ACD 포뮬라 A 및 헤파린을 포함하는 조성물이다. 일 실시형태에서, 항응고제는 헤파린을 약 10U/㎖의 농도로 함유하는 ACD 포뮬라 A이다. 일 실시형태에서, 항응고제는 헤파린, ACD 포뮬라 A 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 조성물 중의 항응고제의 존재는 조성물의 제조 방법의 냉동 및/또는 배양 및/또는 세척 단계 동안 항응고제의 첨가로 인한 것이다. 일 실시형태에서, 조성물의 제조 동안 항응고제의 존재는 본 명세서에 기재된 바와 같은 아폽토시스 유도에 나쁜 영향을 미치지 않는다.
일 실시형태에서, 조성물은 헤파린을 포함한다. 일 실시형태에서, 헤파린은 설페이티드 헤테로다당류, 헤파린, 미분획 헤파린(UFH), 저분자량 헤파린(LMWH) 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시형태에 따라, 헤파린은 합성 헤파린, 예를 들면, 이로써 제한되지 않지만, 폰다파리나욱스(Fondaparinaux)이다.
일 실시형태에서, 조성물은 헤파린을 0.001U/㎖ 내지 3U/㎖, 대안적으로 0.005U/㎖ 내지 2.5U/㎖, 전형적으로 0.01U/㎖ 내지 1U/㎖의 농도로 포함한다. 다른 실시형태에 따라, 조성물은 헤파린을 0.001 내지 2.5U/㎖, 대안적으로 0.001 내지 1U/㎖, 가능하게는 0.001 내지 0.5U/㎖의 농도로 포함한다.
다른 실시형태에 따라, 조성물은 헤파린을 0.005 내지 1U/㎖, 대안적으로 0.005 내지 0.6U/㎖, 가능하게는 0.005 내지 0.5U/㎖의 농도로 포함한다. 다른 실시형태에 따라, 조성물은 헤파린을 0.01 내지 3U/㎖, 대안적으로 0.01 내지 2U/㎖ 또는 0.01 내지 0.6U/㎖의 농도로 포함한다. 일 실시형태에서, 조성물은 헤파린을 0.01 내지 0.5U/㎖의 농도로 포함한다. 일 실시형태에서, 조성물은 헤파린을 0.05U/㎖ 내지 0.25U/㎖ 농도로 포함한다. 특정한 실시형태에 따라, 조성물은 헤파린을 0.01U/㎖ 내지 0.6U/㎖ 농도로 포함한다.
일 실시형태에서, 조성물은 3U/㎖ 이하의 헤파린, 전형적으로 2.5U/㎖ 이하의 헤파린, 가능하게는 1U/㎖ 이하의 헤파린, 대안적으로 0.5U/㎖ 이하의 헤파린을 포함한다. 일 실시형태에서, 조성물은 적어도 0.001U/㎖ 헤파린, 대안적으로 적어도 0.005U/㎖ 헤파린, 가능하게는 적어도 0.01 헤파린을 포함한다. 일 실시형태에서, 조성물은 300 U 이하, 대안적으로 150 U 이하, 가능하게는 75 U 이하의 헤파린을 포함한다. 특정한 실시형태에 따라, 조성물은 180 U 이하의 헤파린을 포함한다.
일 실시형태에서, 조성물 중에 포함된 헤파린은 세포 제제를 포함하는 조성물 및 환자에게 세포 제제의 투여를 위하여 사용되는 최종 현탁액 매질 중의 헤파린을 의미한다. 일 실시형태에서, 조성물 중에 포함된 ACD 포뮬라 A는 세포 제제를 포함하는 조성물 및 환자에게 세포 제제의 투여를 위하여 사용되는 최종 현탁액 매질 중의 헤파린을 의미한다.
일 실시형태에서, 조성물은 0.5 내지 500 U의 헤파린, 가능하게는 0.5 내지 500 U의 헤파린, 대안적으로 7 내지 180 U의 헤파린을 포함한다.
일 실시형태에서, 조성물은 ACD 포뮬라 A를 포함한다. 일 실시형태에서, ACD 포뮬라 A는 시트르산, 덱스트로스 및 시트르산나트륨을 포함한다. 일 실시형태에서, ACD 포뮬라 A는 0.73g/100㎖ 농도의 무수 시트르산, 2.45g/100㎖ 농도의 덱스트로스 일수화물 및 2.20g/100㎖ 농도의 시트르산나트륨 데하이드레이트를 포함한다.
일 실시형태에서, 조성물은 ACD 포뮬라 A를 0.01-10 v/v, 대안적으로 0.05-6 v/v, 가능하게는 0.1%-5% v/v의 농도로 포함한다. 다른 실시형태에 따라, 조성물은 ACD 포뮬라 A를 0.05-10 v/v, 가능하게는 0.05-6 v/v, 대안적으로 0.05-5 v/v의 농도로 포함한다.
대안적인 실시형태에 따라, 조성물은 ACD 포뮬라 A를 0.1 내지 10 v/v, 대안적으로 0.1% 내지 6%, 가능하게는 0.1% 내지 5% v/v 농도로 포함한다. 일 실시형태에서, 조성물은 ACD 포뮬라 A를 0.5% 내지 2.5% v/v 농도로 포함한다. 특정한 실시형태에 따라, 조성물은 ACD 포뮬라 A를 0.05 내지 6 v/v, 전형적으로 0.1% 내지 6% v/v 농도로 포함한다.
일 실시형태에서, 조성물은 15㎖ 이하, 대안적으로 9㎖ 이하, 가능하게는 7.5㎖ 이하의 ACD 포뮬라 A를 포함한다. 특정한 실시형태에 따라, 조성물은 18㎖ 이하의 ACD 포뮬라 A를 포함한다.
일 실시형태에서, 조성물은 0.05 내지 40㎖의 ACD 포뮬라 A, 가능하게는 0.1 내지 25㎖의 ACD 포뮬라 A, 대안적으로 0.7 내지 18㎖의 ACD 포뮬라 A를 포함한다.
일 실시형태에서, 조성물은 추가로 메틸프레드니솔론을 포함한다. 일 실시형태에서, 조성물 중의 잔여 메틸프레드니솔론의 존재는 세포 제제의 제조 공정의 배양 단계 동안 메틸프레드니솔론의 사용으로 인한 것이다. 일 실시형태에서, 메틸프레드니솔론은 세포가 초기 아폽토시스 상태로 진입하는 것이 유도되는 과정의 부분으로서 세포 제제의 제조 동안 사용된다.
일 실시형태에서, 조성물은 추가로 메틸프레드니솔론을 0.5 내지 30㎍/㎖, 가능하게는 1 내지 25㎍/㎖, 전형적으로 3 내지 22㎍/㎖ 농도로 포함한다. 일 실시형태에서, 조성물은 3.7 내지 21.9㎍/㎖ 농도의 메틸프레드니솔론을 포함한다.
일 실시형태에서, 조성물은 추가로 메틸프레드니솔론을 30㎍/㎖를 초과하지 않는 농도로 포함한다. 일 실시형태에서, 조성물은 추가로 메틸프레드니솔론을 30㎍/㎖를 초과하지 않는 농도로, 가능하게는 25㎍/㎖를 초과하지 않는 농도로, 전형적으로 21.9㎍/㎖를 초과하지 않는 농도로 포함한다.
일 실시형태에서, 조성물은 추가로 메틸프레드니솔론을 0.5 내지 60㎍/㎖, 가능하게는 1.12 내지 60㎍/㎖ 농도로 포함한다. 일 실시형태에서, 조성물은 추가로 메틸프레드니솔론을 60㎍/㎖를 초과하지 않는 농도로 포함한다.
일 실시형태에서, 조성물은 적어도 0.5㎍/㎖, 가능하게는 적어도 1㎍/㎖, 대안적으로 적어도 3㎍/㎖의 메틸프레드니솔론을 포함한다. 일 실시형태에서, 조성물은 적어도 3.5㎍/㎖의 메틸프레드니솔론을 포함한다. 일 실시형태에서, 조성물은 적어도 3.7㎍/㎖의 메틸프레드니솔론을 포함한다.
일 실시형태에서, 조성물은 추가로 0.1 내지 25㎎의 메틸프레드니솔론, 가능하게는 0.4 내지 20㎎의 메틸프레드니솔론, 대안적으로 0.67 내지 18㎎의 메틸프레드니솔론을 포함한다. 일 실시형태에서, 조성물은 추가로 메틸프레드니솔론을 25㎎, 전형적으로 20㎎, 대안적으로 18㎎을 초과하지 않는 양으로 포함한다. 특정한 실시형태에 따라, 조성물은 추가로 메틸프레드니솔론 15㎎을 초과하지 않는 양으로 포함한다.
일 실시형태에서, 약제학적 조성물 중의 헤파린은 0.005 U/㎖ 내지 2.5U/㎖ 농도로 존재한다. 다른 실시형태에 따라, 약제학적 조성물 중의 ACD 포뮬라 A는 0.01% 내지 10% v/v, 대안적으로 0.05% 내지 5% v/v의 농도로 존재한다.
특정한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 30×106 내지 300×106 세포/kg 체중, 100×106 내지 300×106 세포/kg 체중, 대안적으로 약 120×106 내지 250×106 세포/kg 체중의 투여량으로 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 투여량은 대상체의 킬로그램 체중당 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제로부터 약 30×106, 35×106, 40×106, 45×106, 50×106, 55×106, 60×106, 65×106, 70×106, 또는 75×106 세포를 포함한다.
특정한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 35×106 세포/kg 체중의 투여량으로 투여된다. 일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 140×106 내지 210×106 세포/kg 체중의 투여량으로 투여된다. 특정한 실시형태에 따라, 약제학적 조성물은 약 140×106 세포/kg 체중의 투여량으로 투여된다. 또 다른 특정한 실시형태에 따라, 약제학적 조성물은 약 210×106 세포/kg 체중의 투여량으로 투여된다. 또 다른 특정한 실시형태에 따라, 약제학적 조성물은 약 35×106 내지 210×106 세포/kg 체중의 투여량으로 투여된다. 또 다른 특정한 실시형태에 따라, 약제학적 조성물은 약 250×106 세포/kg 체중의 투여량으로 투여된다. 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 5×106 세포/kg 체중의 투여량으로 투여된다. 상기 낮은 투여량이 본 명세서에 기재된 조성물의 국소 주사, 예를 들면, 관절염 치료용 관절로의 국소 주사에 적합하다는 것을 인식하여야 한다.
일 실시형태에서, 치료적 혼주된 단핵-풍부화 세포 제제는 대상체에 전신적으로, 정맥내 경로를 통해 투여된다. 대안적으로, 치료적 단핵-풍부화 세포는 비경구, 복강내, 관절내, 근육내 및 피하 경로를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 다른 경로에 따라 대상체에 투여될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 치료적 단핵-풍부화 세포는 적합한 생리학적 버퍼, 예를 들면, 이로써 제한되지 않지만, 식염수, PBS, HBSS 등에 현탁되어 대상체로 투여된다. 추가로 현탁액 매질은 추가로 세포의 생존능을 유지하는데 도움이 되는 보충물을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 현탁액 매질은 세포의 초기 아폽토시스 상태를 유지하는데 도움이 되는 보충물을 포함한다.
일 실시형태에서, 제조 방법에 따라 수득된 단핵-풍부화 세포 조성물은 냉동 매질 중에서 냉동된다.
일 실시형태에서, 냉동은 점진적이다. 일 실시형태에서, 수집 후 세포는 냉동까지 실온에서 유지된다. 일 실시형태에서, 세포-제제는, 세포-수집 후 및 냉동 전, 세척 매질 중에서 적어도 하나의 세척 단계를 거친다.
숙련가는 용어 "세포를 수득하는 것" 및 "세포 수집"이 상호교환적으로 사용된다는 것을 인식할 것이다. 일 실시형태에서, 세포 제제의 세포는 수집 3 내지 6시간 내에 냉동된다. 일 실시형태에서, 세포 제제는 세포 수집 6시간 이하 내에 냉동된다. 일 실시형태에서, 세포 제제의 세포는 수집 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8시간 내에 냉동된다. 다른 실시형태에 따라, 세포 제제의 세포는 수집 8, 12, 24, 48, 72시간 이하에 냉동된다. 다른 실시형태에 따라, 수집 후 세포는 냉동까지 2 내지 8℃로 유지된다.
일 실시형태에서, 제조 방법에 따른 냉동은 세포 제제를 약 -18℃ 내지 -25℃에서 냉동 한 후, 세포 제제를 약 -80℃에서 냉동하고, 최종적으로 세포 제제를 해동까지 액체 질소 중에 냉동하는 것을 포함한다. 일 실시형태에서, 제조 방법에 따른 냉동은 세포 제제를 약 -18℃ 내지 -25℃에서 적어도 2시간 동안 냉동하고, 세포 제제를 약 -80℃에서 적어도 2시간 동안 냉동하고, 최종적으로 세포 제제를 해동까지 액체 질소 중에서 냉동하는 것을 포함한다. 일 실시형태에서, 세포를 해동 전까지 액체 질소 중에서 적어도 8, 10 또는 12시간 동안 유지한다. 일 실시형태에서, 세포 제제의 세포를 해동 및 아폽토시스-유도 배양 매질과 배양까지 액체 질소 중에서 유지한다. 일 실시형태에서, 세포 제제의 세포를 조혈 줄기 세포 이식의 날까지 액체 질소 중에서 유지한다. 비제한적인 예에 따라, 세포 수집 및 냉동으로부터 최종 조성물의 제조까지의 시간은 1 내지 50일, 대안적으로 6 내지 30일일 수 있다. 대안적인 실시형태에 따라, 세포 제제는 액체 질소 중에서 더 긴 기간, 예를 들면, 적어도 수개월 동안 유지될 수 있다.
일 실시형태에서, 제조 방법에 따른 냉동은 세포 제제를 약 -18℃ 내지 -25℃에서 적어도 0.5, 1, 2, 4시간을 포함한다. 일 실시형태에서, 제조 방법에 따른 냉동은 세포 제제를 약 -18℃ 내지 -25℃에서 약 2시간 동안 냉동하는 것을 포함한다. 일 실시형태에서, 제조 방법에 따른 냉동은 세포 제제를 약 -80℃에서 적어도 0.5, 1, 2, 4, 12시간 동안 냉동하는 것을 포함한다.
일 실시형태에서, 단핵-풍부화 세포 조성물은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 20개월 동안 냉동된 채로 남아있을 수 있다. 일 실시형태에서, 단핵-풍부화 세포 조성물은 적어도 0.5, 1, 2, 3, 4, 5년 동안 냉동된 채로 남아있을 수 있다. 특정한 실시형태에 따라, 단핵-풍부화 세포 조성물은 적어도 20개월 동안 냉동된 채로 남아있을 수 있다.
일 실시형태에서, 단핵-풍부화 세포 조성물은 적어도 8, 10, 12, 18, 24시간 동안 냉동된다. 특정한 실시형태에 따라, 단핵-풍부화 세포 조성물의 냉동은 적어도 8시간의 기간 동안이다. 일 실시형태에서, 단핵-풍부화 세포 조성물은 적어도 약 10시간 동안 냉동된다. 일 실시형태에서, 단핵-풍부화 세포 조성물은 적어도 약 12시간 동안 냉동된다. 일 실시형태에서, 단핵-풍부화 세포 조성물은 약 12시간 동안 냉동된다. 일 실시형태에서, 단핵-풍부화 세포 조성물의 전체 냉동 시간(약 -18℃ 내지 -25℃, 약 -80℃에서, 액체 질소 중에서)은 적어도 8, 10, 12, 18, 24시간이다.
일 실시형태에서, 냉동은 단핵-풍부화 세포 조성물 중의 세포에서 적어도 부분적으로 초기 아폽토시스 상태를 유도한다. 일 실시형태에서, 냉동 매질은 L-글루타민, Hepes, Hes, 디메틸 설폭사이드(DMSO) 및 혈장을 포함하는 RPMI 1640 매질을 포함한다. 일 실시형태에서, 냉동 매질은 2mM L-글루타민, 10mM Hepes, 5% Hes, 10% 디메틸 설폭사이드 및 20% v/v 혈장을 포함하는 RPMI 1640 매질을 포함한다.
일 실시형태에서, 냉동 매질은 항응고제를 포함한다. 특정한 실시형태에 따라, 냉동 매질, 배양 매질 및 세척 매질을 포함하는 제조 공정 동안 사용되는 적어도 몇몇 매질은 항응고제를 포함한다. 특정한 실시형태에 따라, 항응고제를 포함하는 제조 공정 동안 사용되는 모든 매질은 동일한 농도의 항응고제를 포함한다. 일 실시형태에서, 항응고제는 세포 조성물의 최종 현탁액 매질에 첨가되지 않는다.
일 실시형태에서, 적어도 냉동 매질에 대한 항응고제의 첨가는 세포-제제의 수득을 개선시킨다. 다른 실시형태에 따라, 냉동 매질에 대한 항응고제의 첨가는 높은 트리글리세라이드 수치의 존재하에 세포-제제의 수득을 개선시킨다. 본우너에서 사용되는 바와 같이, 세포-제제의 수득의 개선은 냉동된 세포 중의 생존 가능한 세포의 백분율, 생존 가능한 세포 중의 초기-상태 아폽토시스 세포의 백분율 및 이들의 조합 중 적어도 하나에서의 개선에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 냉동 매질에 대한 항응고제의 첨가는 약제학적 조성물의 상이한 제제 사이의 높고 안정한 수율에 기여한다. 바람직한 실시형태에 따라, 적어도 냉동 매질 및 배양 매질에 대한 항응고제의 첨가는, 사용된 세포 수집 프로토콜과 관계 없이, 약제학적 조성물의 상이한 제제 사이의 높고 안정한 수율에 기여한다.
일 실시형태에서, 냉동 매질은 헤파린, ACD 포뮬라 A 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 항응고제를 포함한다. 일 실시형태에서, 냉동 매질 중에 사용된 항응고제는 10U/㎖의 농도로 헤파린을 함유하는 ACD 포뮬라 A이다. 일 실시형태에서, 냉동 매질은 10U/㎖의 농도로 헤파린을 포함하는 ACD 포뮬라 A 용액 5% v/v를 포함한다.
일 실시형태에서, 냉동 매질은 헤파린을 포함한다. 일 실시형태에서, 냉동 매질 중의 헤파린은 0.1 내지 2.5U/㎖의 농도이다. 일 실시형태에서, 냉동 매질 중의 헤파린은 0.1 내지 2.5U/㎖, 가능하게는 0.3 내지 0.7U/㎖, 전형적으로 약 0.5U/㎖ 농도이다. 특정한 실시형태에 따라, 냉동 매질 중의 헤파린은 약 0.5U/㎖ 농도이다.
일 실시형태에서, 냉동 매질은 ACD 포뮬라 A를 포함한다. 일 실시형태에서, 냉동 매질 중의 ACD 포뮬라 A는 1% 내지 15% v/v 농도이다. 일 실시형태에서, 냉동 매질 중의 ACD 포뮬라 A는 1% 내지 15% v/v, 가능하게는 4% 내지 7% v/v, 전형적으로 약 5% v/v의 농도이다. 일 실시형태에서, 냉동 매질 중의 ACD 포뮬라 A는 약 5% v/v의 농도이다.
일 실시형태에서, 단핵-풍부화 세포 조성물은 세포 수집 후 및 냉동 매질 중에 재현탁되기 전에 적어도 하나의 세척 단계를 거쳐, 냉동된다. 일 실시형태에서, 단핵-풍부화 세포 조성물은 냉동 및 해동 후에 적어도 하나의 세척 단계를 거친다. 일 실시형태에서, 세척 단계는 단핵-풍부화 세포 조성물의 원심분리 후, 상청액 추출 및 세척 매질 중의 재현탁액을 포함한다.
일 실시형태에서, 세포 수집은 단핵-풍부화 세포 조성물을 수득하는 것을 이미한다. 일 실시형태에서, 제조 공정 동안의 세척 단계는 세척 매질 중에서 수행된다. 특정한 실시형태에 따라, 제조 공정의 배양 단계까지 수행된 세척 단계는 세척 매질 중에서 수행된다. 일 실시형태에서, 세척 매질은 L-글루타민 및 Hepes로 보충된 RPMI 1640 매질을 포함한다. 일 실시형태에서, 세척 매질은 2mM L-글루타민 및 10mM Hepes로 보충된 RPMI 1640 매질을 포함한다.
일 실시형태에서, 세척 매질은 항응고제를 포함한다. 일 실시형태에서, 세척 매질은 헤파린, ACD 포뮬라 A 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 항응고제를 포함한다. 일 실시형태에서, 세척 매질 중의 항응고제의 농도는 냉동 매질 중의 농도와 동일하다. 일 실시형태에서, 세척 매질 중의 항응고제의 농도는 배양 매질 중의 농도와 동일하다. 일 실시형태에서, 세척 매질 중에 사용된 항응고제는 10U/㎖의 농도의 헤파린을 함유하는 ACD 포뮬라 A이다.
일 실시형태에서, 세척 매질은 헤파린을 포함한다. 일 실시형태에서, 세척 매질 중의 헤파린은 0.1 내지 2.5U/㎖의 농도이다. 일 실시형태에서, 세척 매질 중의 헤파린은 0.1 내지 2.5U/㎖, 가능하게는 0.3 내지 0.7U/㎖, 전형적으로 약 0.5U/㎖의 농도이다. 특정한 실시형태에 따라, 세척 매질 중의 헤파린은 약 0.5U/㎖의 농도이다.
일 실시형태에서, 세척 매질은 ACD 포뮬라 A를 포함한다. 일 실시형태에서, 세척 매질 중의 ACD 포뮬라 A는 1% 내지 15% v/v의 농도이다. 일 실시형태에서, 세척 매질 중의 ACD 포뮬라 A는 1% 내지 15% v/v, 가능하게는 4% 내지 7% v/v, 전형적으로 약 5% v/v 농도이다. 일 실시형태에서, 세척 매질 중의 ACD 포뮬라 A는 약 5% v/v 농도이다.
일 실시형태에서, 혼주된 단핵-풍부화 세포 조성물은 대상체로의 조성물의 의도된 투여 몇 시간 전에 해동된다. 일 실시형태에서, 단핵-풍부화 세포 조성물은 약 33℃ 내지 39℃에서 해동된다. 일 실시형태에서, 단핵-풍부화 세포 조성물은 약 30 내지 240초, 바람직하게는 40 내지 180초, 가장 바람직하게는 50 내지 120초 동안 해동된다.
일 실시형태에서, 혼주된 단핵-풍부화 세포 조성물은 조성물의 의도된 투여 적어도 10시간 전에, 대안적으로 조성물의 의도된 투여 적어도 20, 30, 40 또는 50시간 전에 해동된다. 일 실시형태에서, 단핵-풍부화 세포 조성물은 조성물의 의도된 투여 적어도 15-24시간 전에 해동된다. 일 실시형태에서, 단핵-풍부화 세포 조성물은 조성물의 의도된 투여 적어도 약 24시간 전에 해동된다. 일 실시형태에서, 단핵-풍부화 세포 조성물은 조성물의 의도된 투여 적어도 20시간 전에 해동된다. 일 실시형태에서, 단핵-풍부화 세포 조성물은 조성물의 의도된 투여 30시간 전에 해동된다. 일 실시형태에서, 단핵-풍부화 세포 조성물은 조성물의 의도된 투여 적어도 24시간 전에 해동된다. 일 실시형태에서, 단핵-풍부화 세포 조성물은 해동 전 및/또는 후에 적어도 하나의 세척 단계를 거친다.
일 실시형태에서, 혼주된 단핵-풍부화 세포 조성물은 냉동 및 해동 후 배양 매질 중에서 배양된다. 일 실시형태에서, 해동과 배양 사이에 적어도 하나의 세척 단계가 존재한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "배양 매질" 및 "아폽토시스 유도 배양 매질"은 상호교환적으로 사용된다. 일 실시형태에서, 배양 매질은 L-글루타민, Hepes 메틸프레드니솔론 및 혈장으로 보충된 RPMI 1640 매질을 포함한다. 일 실시형태에서, 세척 매질은 2mM L-글루타민, 10mM Hepes 및 10% v/v 혈장을 포함한다. 일 실시형태에서, 배양 매질 중의 혈장은 세포 제제의 세포가 수득된 동일한 공여자로부터 수득된다. 일 실시형태에서, 혈장은 배양 날에 배양 매질에 첨가된다. 일 실시형태에서, 배양은 37℃에서 수행된다.
일 실시형태에서, 배양 매질은 메틸프레드니솔론을 포함한다. 일 실시형태에서, 배양 매질 내의 메틸프레드니솔론은 추가로 단핵-풍부화 세포 조성물 중의 세포가 초기 아폽토시스 상태로 진입하는 것을 유도한다. 일 실시형태에서, 단핵-풍부화 세포 조성물 중의 세포는 메틸프레드니솔론의 존재하에 냉동 및 배양 둘 다에 의해 초기 아폽토시스 상태로 진입하도록 유도된다. 일 실시형태에서, 제조 공정은 유리하게는 실질적으로 괴사의 유도 없이 초기 아폽토시스 상태의 유도를 허용하고, 세포는 제조 후 약 24시간 동안 상기 초기 아폽토시스 상태에서 안정한 채로 남아 있는다.
일 실시형태에서, 배양 매질은 약 10 내지 100㎍/㎖ 농도의 메틸프레드니솔론을 포함한다. 일 실시형태에서, 배양 매질은 약 40 내지 60㎍/㎖, 대안적으로 약 45 내지 55㎍/㎖ 농도의 메틸프레드니솔론을 포함한다. 일 실시형태에서, 배양 매질은 50 Hg/㎖ 농도의 메틸프레드니솔론을 포함한다.
일 실시형태에서, 배양은 약 2 내지 12시간, 가능하게는 4 내지 8시간, 전형적으로 약 5 내지 7시간 동안이다. 일 실시형태에서, 배양은 약 6시간 동안이다. 일 실시형태에서, 배양은 적어도 6시간 동안이다. 바람직한 실시형태에 따라, 배양은 6시간 동안이다.
일 실시형태에서, 배양 매질은 항응고제를 포함한다. 일 실시형태에서, 배양 매질에 대한 항응고제의 첨가는 세포-제제의 수율을 개선시킨다. 일 실시형태에서, 배양 매질 중의 항응고제는 냉동 매질 중의 농도와 동일한 농도이다. 일 실시형태에서, 배양 매질은 헤파린, ACD 포뮬라 A 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 항응고제를 포함한다. 일 실시형태에서, 배양 매질 중에 사용된 항응고제는 10U/㎖의 농도로 헤파린을 함유하는 ACD 포뮬라 A이다.
일 실시형태에서, 배양 매질은 헤파린을 포함한다. 일 실시형태에서, 배양 매질 중의 헤파린은 0.1 내지 2.5U/㎖의 농도이다. 일 실시형태에서, 배양 매질 중의 헤파린은 0.1 내지 2.5U/㎖, 가능하게는 0.3 내지 0.7U/㎖, 전형적으로 약 0.5U/㎖의 농도이다. 특정한 실시형태에 따라, 배양 매질 중의 헤파린은 약 0.5U/㎖의 농도이다.
일 실시형태에서, 배양 매질은 ACD 포뮬라 A를 포함한다. 일 실시형태에서, 배양 매질 중의 ACD 포뮬라 A는 1% 내지 15% v/v 농도이다. 일 실시형태에서, 배양 매질 중의 ACD 포뮬라 A는 1% 내지 15% v/v, 가능하게는 4% 내지 7% v/v, 전형적으로 약 5% v/v의 농도이다. 일 실시형태에서, 배양 매질 중의 ACD 포뮬라 A는 약 5% v/v의 농도이다.
일 실시형태에서, 냉동 매질 및 배양 매질은 둘 다 항응고제를 포함한다. 일 실시형태에서, 배양 매질 및 냉동 매질 둘 다에 대한 항응고제의 첨가는 세포-수집 조건, 예를 들면, 이로써 제한되지는 않지만, 세포 수집 동안 첨가된 항응고제의 시기 및/또는 유형과 관계 없이 조성물의 상이한 제제 사이의 높고 안정한 세포-수율을 야기한다. 일 실시형태에서, 배양 매질 및 냉동 매질 둘 다에 대한 항응고제의 첨가는 백혈구성분채집술 동안 첨가된 항응고제의 시기 및/또는 유형과 관계 없이 세포-제제의 높고 안정한 수율을 야기한다.
일 실시형태에서, 높은 트리글리세라이드 수치를 갖는 공여자의 혈액은 혼주된 단핵 풍부화 제제로부터 제외될 것이다. 일 실시형태에서, 용어 "높은 트리글리세라이드 수치"는 동일한 성별 및 연력의 건강한 대상체의 정상 수치를 넘는 트리글리세라이드 수치를 의미한다. 일 실시형태에서, 용어 "높은 트리글리세라이드 수치"는 약 1.7 밀리몰/리터를 넘는 트리글리세라이드 수치를 의미한다.
숙련가는 높고 안정한 수율이 대상체에 투여시 치료적 효율을 입증할 것인 용량의 제제가 가능하도록 충분히 높은 조성물 중의 세포 수율을 의미한다는 것을 인식할 것이다. 일 실시형태에서, 치료적 효율은 대상체에서 면역 질환, 자가면역 질환 또는 염증성 질환을 치료하거나 예방하거나 완화시키는 능력을 의미한다. 일 실시형태에서, 높고 안정한 세포 수율은 초기 냉동된 세포의 조성물 중의 세포의 적어도 30%, 가능하게는 적어도 40%, 전형적으로 적어도 50%의 세포 수율이다.
일 실시형태에서, 배양 매질 및/또는 냉동 매질에 대한 항응고제의 첨가는 공여자의 혈액 중의 트리글리세라이드 수치와 관계 없이 조성물 내에 높고 안정한 세포 수율을 야기한다. 일 실시형태에서, 배양 매질 및/또는 냉동 매질에 대한 항응고제의 첨가는 정상 또는 높은 트리글리세라이드 수치를 갖는 공여자의 혈액으로부터 수득시 조성물 내에 높고 안정한 세포 수율을 야기한다. 일 실시형태에서, 항응고제 적어도 배양 매질에 대한 항응고제의 첨가는 공여자의 혈액에서의 트리글리세라이드 수치와 관계 없이 조성물 내에 높고 안정한 세포 수율을 야기한다. 일 실시형태에서, 냉동 매질 및 배양 매질에 대한 항응고제의 첨가는 공여자의 혈액에서의 트리글리세라이드 수치와 관계 없이 조성물 내에 높고 안정한 세포 수율을 야기한다.
일 실시형태에서, 냉동 매질 및/또는 배양 매질 및/또는 세척 매질은 적어도 0.1U/㎖, 가능하게는 적어도 0.3U/㎖, 전형적으로 적어도 0.5U/㎖ 농도의 헤파린을 포함한다. 일 실시형태에서, 냉동 매질 및/또는 배양 매질 및/또는 세척 매질은 적어도 1% v/v, 가능하게는 적어도 3% v/v, 전형적으로 적어도 5% v/v 농도의 ACD 포뮬라 A를 포함한다.
일 실시형태에서, 단핵-풍부화 세포 조성물은 제조 공정의 각 단계 사이에서 적어도 하나의 세척 단계를 거친다. 일 실시형태에서, 항응고제는 제조 공정 전체에서 세척 단계 동안 세척 매질에 첨가도니다. 일 실시형태에서, 단핵-풍부화 세포 조성물은 배양 후 적어도 하나의 세척 단계를 거친다. 일 실시형태에서, 단핵-풍부화 세포 조성물은 PBS를 사용한 배양 후 적어도 하나의 세척 단계를 거친다. 일 실시형태에서, 항응고제는 투여 매질 중에서 세포-제제의 재현탁 전에 최종 세척 단계에 첨가되지 않는다. 일 실시형태에서, 항응고제는 투여 매질 중에 세포-제제의 재현탁 전에 최종 세척 단계에서 사용된 PBS에 첨가되지 않는다. 특정한 실시형태에 따라, 항응고제는 투여 매질에 첨가되지 않는다.
일 실시형태에서, 배양 동안 세포 농도는 약 5×106 세포/㎖이다.
일 실시형태에서, 혼주된 단핵-풍부화 세포 조성물은 냉동, 해동 및 배양 후, 투여 매질 중에 현탁되고, 따라서 약제학적 조성물을 야기한다. 일 실시형태에서, 투여 매질은 적합한 생리학적 버퍼를 포함한다. 적합한 생리학적 버퍼의 비제한적인 예는 식염수, 인산염 완충 식염수(PBS), 행크 균형 염 용액(HBSS) 등이다. 일 실시형태에서, 투여 매질은 PBS를 포함한다. 일 실시형태에서, 투여 매질은 세포의 생존능을 유지하는데 도움이 되는 보충물을 포함한다. 일 실시형태에서, 단핵-풍부화 세포 조성물은 투여 전에 여과된다. 일 실시형태에서, 단핵-풍부화 세포 조성물은 적어도 200㎛의 필터를 사용하여 투여 전에 여과된다.
일 실시형태에서, 혼주된 단핵-풍부화 세포 조성물은 수득된 세포-제제의 최종 용적이 100 내지 1000㎖, 가능하게는 200 내지 800㎖, 전형적으로 300 내지 600㎖가 되도록 투여 매질 중에 재현탁된다.
일 실시형태에서, 약제학적 조성물을 제조하는 방법은 추가로 상기 기재된 바와 같은 혼주된 단핵-풍부화 세포 조성물을 수득하는 것을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 기재내용은 세포-제제를 제공하고, 여기서 세포-제제는 제조 방법에 의해 제조된다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물은 100% 동종이계 세포를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 조성물은 100% 미만의 동종이계 세포를 포함한다.
일 실시형태에서, 불활화 상기 단핵 풍부화 집단을 포함하는 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제의 제조 방법의 단계 (f)는 상기 개별적인 집단에서 면역 반응을 억제하거나 제거하는 것, 상기 개별적인 집단 사이의 교차반응성을 억제하거나 제거하는 것, 또는 상기 개별적인 집단에서 T-세포 수용체 활성을 감소시키거나 제거하는 것을 포함하고, 여기서 상기 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제를 포함하는 상기 제조된 약제학적 조성물은 상기 세포 제제 내에 비휴지기 비아폽토시스 세포의 백분율의 감소, 임의의 살아있는 비아폽토시스 세포의 세포 활성화의 억제, 또는 임의의 살아있는 비아폽토시스 세포의 증식의 감소, 또는 임의의 이들의 조합을 포함한다.
일 실시형태에서, 세포 제제의 제조 방법은 조사 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 혼주된 아폽토시스 세포 제제의 제조 방법은 상기 세포 제제에 존재하는 비아폽토시스 세포의 활성화 또는 증식을 억제하는 것을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 억제는 세포 제제를 조사하는 것을 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 재현탁된 세포 집단 내에 비휴지기 비아폽토시스 세포의 백분율을 감소시키는 것, 임의의 살아있는 비아폽토시스 세포의 세포 활성화를 억제하는 것, 또는 임의의 살아있는 비아폽토시스 세포의 증식을 감소시키는 것, 또는 임의의 이들의 조합을 포함하는 "불활화" 단계 (f)는 세포 제제를 조사하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 불활화 상기 단핵 풍부화 집단은 상기 단핵 풍부화 집단을 조사하는 것을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 조사 단계는 상기 제제의 투여시, 예를 들면, GVHD를 야기할 수 있는 세포의 백분율을 효율적으로 감소시킨다. 또 다른 실시형태에서, 조사 단계는 비조사된 세포 제제와 비교하여 비휴지기 비아폽토시스 세포의 실제 수를 감소시킨다. 또 다른 실시형태에서, 조사 단계는 비조사된 세포 제제와 비교하여 비휴지기 비아폽토시스 세포의 백분율을 감소시킨다.
또 다른 실시형태에서, 조사를 포함하는 약제학적 조성물을 제조하는 방법은 감마선 조사 또는 UV 조사를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 조사를 포함하는 약제학적 조성물을 제조하는 방법은 약 15 그레이 단위(Gy) 조사를 포함한다. 또 다른 양상에서, 조사는 약 20 그레이 단위(Gy)를 포함한다. 또 다른 양상에서, 조사는 약 25 그레이 단위(Gy)를 포함한다. 또 다른 양상에서, 조사는 약 30 그레이 단위(Gy)를 포함한다. 또 다른 양상에서, 조사는 약 35 그레이 단위(Gy)를 포함한다. 또 다른 양상에서, 조사는 약 40 그레이 단위(Gy)를 포함한다. 또 다른 양상에서, 조사는 약 45 그레이 단위(Gy)를 포함한다. 또 다른 양상에서, 조사는 약 50 그레이 단위(Gy)를 포함한다. 또 다른 양상에서, 조사는 약 55 그레이 단위(Gy)를 포함한다. 또 다른 양상에서, 조사는 약 60 그레이 단위(Gy)를 포함한다. 또 다른 양상에서, 조사는 약 65 그레이 단위(Gy)를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 조사는 2500 Gy 이하를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 조사는 약 15-25 그레이 단위(Gy)를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 조사는 약 25-30 그레이 단위(Gy)를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 조사는 약 30 내지 40 그레이 단위(Gy)를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 조사는 약 40 내지 50 그레이 단위(Gy)를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 조사는 약 50 내지 65 그레이 단위(Gy)를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 냉동된 후 해동되고, 의학 센터에서 대상체에 투여될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 백혈구성분채집술에 의해 수집된 혼주된 단핵 세포는 냉동될 수 있고 사용 전에 액체 질소 중에 저장될 수 있고, 여기서 혼주된 단핵 세포는 해동되고, 초기 아폽토시스는 상기 기재된 바와 같이 유도된 후, 의학 센터에서 대상체에 투여하기 위한 세포 현탁액 조성물로 제조된다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 "사용 준비된" 형태일 수 있고, 여기서 약 2 내지 8℃ 사이에 냉장되고, 24시간 내에 사용에 안정적이다.
혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제의 사용
일 실시형태에서, 이러한 기재내용은 이의 필요가 있는 대상체에서 면역 질환, 자가면역 질환, 사이토카인 방출 증후군(CRS), 사이토카인 스톰 또는 염증성 질환의 치료, 예방, 완화, 억제, 또는 발생률의 감소 방법을 제공하고, 이는 대상체에게 상기 상세하게 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제 치료, 예방, 완화, 억제, 또는 발생률의 감소를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포는 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제의 투여 후 효율적으로 제거된다.
숙련가는 용어 "치료" 또는 "치료함"이 질환 또는 병태의 완화를 포함하는 치료적 치료 및 예방학적 또는 예방적 방안 둘 다를 포함한다는 것을 인식할 것이고, 여기서 목적은 상기 본 명세서에 기재된 바와 같은 표적화된 병리학적 상태 또는 장애를 에방하거나 경감시키는 것이다. 따라서, 일 실시형태에서, 치료는 질환, 장애 또는 병태, 또는 이들의 조합에 직접적으로 영향을 미치거나 이를 치유하거나, 억제하거나, 저해하거나, 예방하거나, 이의 중증도를 감소시키거나, 이의 개시를 지연시키거나, 이와 연관된 증상을 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, "치료함"은 그 중에서도 진행을 지연시키는 것, 관해를 신속하게 하는 것, 관해를 유도하는 것, 관해를 증대시키는 것, 회복을 빠르게 하는 것, 대안적인 치료제의 효능을 증가시키거나 이에 대한 내성을 감소시키는 것, 또는 이들의 조합을 의미한다. 일 실시형태에서, "예방함"은 그 중에서도 증상의 개시를 지연시키는 것, 질환의 재발을 예방하는 것, 재발 에피소드의 숫자와 빈도를 감소시키는 것, 증상 에피소드 사이의 잠복을 증가시키는 것, 또는 이들의 조합을 의미한다. 일 실시형태에서, "억제함" 또는 "저해함"은 그 중에서도 증상의 중증도를 감소시키는 것, 급성 에피소드의 중증도를 감소시키는 것, 증상의 수를 감소시키는 것, 질환 관련 증상의 발생률을 감소시키는 것, 증상의 잠복을 감소시키는 것, 증상을 완화시키는 것, 2차 증상을 감소시키는 것, 2차 감염을 감소시키는 것, 환자 생존을 연장시키는 것, 또는 이들의 조합을 의미한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 사용 방법의 대상체는 인간 성인이다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 사용 방법의 대상체는 인간 어린이이다. 또 다른 실시형태에서, 사용 방법의 대상체는 인간 유아이다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 치료된 면역 질환은 GvHD, 관절염, 통풍 또는 염증성 장 질환을 포함하는 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따른 농축된 혼주된 단핵 세포 제제에서 초기-아폽토시스의 유도는 골수 수득된 세포가 주입되는 경우, 이식과 관련된 중요한 인자에 영향을 주고, 혈액 악성종양이 있는 대상체에서 GVHD의 발생률을 효과적으로 감소시키는 아폽토시스 비-HLA 일치된 동종이계 공여자 세포의 임상 등급 집단을 제공한다.
GvHD
특히, 이식 후 100일에, 등급 II-IV GVHD의 발생률은 제조된 아폽토시스 공여자 세포로 처리된 HSC 이식 수용자에서 감소할 수 있고, 비-재발 생존율은 유의미하게 증가하였다. 초기 아폽토시스 세포 제제의 사용의 세부사항은 전문이 본 명세서에 인용되는 제WO 2014/087408호에 기재된다.
추가로, 또 다른 실시형태에서, 방법에 따라 제조된 아폽토시스 공여자 세포의 주입은 HSC 이식 수용자에서 HSC의 생착 시간의 감소 및 간독성의 놀랄만한 발생률의 감소에 효과적이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 기재내용은 대상체에게 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, HSCT를 받고 있는 대상체에서 GVHD의 치료, 예방, 완화, 억제, 또는 발생률의 감소의 방법을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 기재내용은 대상체에서 불임을 치료하는 방법을 제공한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 기재내용은 대상체에게 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, HSCT를 받고 있는 대상체에서 GVHD의 예방, 완화, 저해, 또는 발생률의 감소 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 기재내용은 대상체에게 본 명세서에 상기 상세하게 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제를 포함하는 약제학적 조성물 또는 이의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, HSCT를 받고 있는 대상체에서 GVHD의 치료, 예방, 완화, 억제, 또는 발생률의 감소 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 기재내용은 대상체에게 상기 상세하게 본 명세서에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, HSCT를 받고 있는 대상체에서 GVHD의 치료, 예방, 완화, 억제, 또는 발생률의 감소, 완화, 저해, 또는 발생률의 감소 방법을 제공한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 기재내용은 대상체에게 상기 상세하게 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵-풍부화 세포를 포함하는 세포 제제를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, HSCT를 받고 있는 대상체에서 GVHD의 치료, 예방, 완화, 억제, 또는 발생률의 감소 of, 완화, 저해, 또는 발생률의 감소 방법을 제공하고; 약제학적 조성물은 헤파린, ACD 포뮬라 A 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 항응고제를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 기재내용은 대상체에게 상기 상세하게 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제를 포함하는 약제학적 조성물 또는 이의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, HSCT를 받고 있는 대상체에서 GVHD의 치료, 예방, 완화, 억제, 또는 발생률의 감소 방법을 제공하고, 여기서 약제학적 조성물은 헤파린, ACD 포뮬라 A 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 항응고제를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 기재내용은 대상체에게 상기 상세하게 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵-풍부화 세포를 포함하는 세포 제제를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, HSCT를 받고 있는 대상체에서 GVHD의 치료, 예방, 완화, 억제, 또는 발생률의 감소 방법을 제공하고, 여기서 제제는 메틸프레드니솔론을 30㎍/㎖를 초과하지 않는 농도로 포함한다. 일 실시형태에서, 치료, 예방, 완화, 억제, 또는 발생률의 감소.
일 실시형태에서, 본 명세서에 상세하게 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제 또는 이의 약제학적 조성물의 치료, 예방, 완화, 억제, 또는 발생률의 감소.
일 실시형태에서, 본 발명의 기재내용은 HSCT를 받고 있는 대상체에서 GVHD의 치료, 예방, 완화, 억제, 또는 발생률의 감소에서 사용하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 HSCT는 동종이계 HSCT를 포함하고, 상기 약제학적 조성물은 상기 수용자 대상체와 HLA 일치되지 않거나 서로 일치된 상기 다수의 동종이계 공여자 HLA로부터의 세포가 아닌 다수의 동종이계 공여자로부터 수득된 세포를 포함한다.
일 실시형태에서, GVHD는 높은 등급 GVHD이다. 특정한 실시형태에 따라, 높은 등급 GVHD는 등급 II 내지 IV GVHD이다. 또 다른 특정한 실시형태에 따라, 높은 등급 GVHD는 등급 III 내지 IV GVHD이다. 특정한 실시형태에 따라, 약제학적 조성물은 높은 등급 GVHD로부터 등급 I GVHD로의 이동을 포함한다.
또 다른 실시형태에 따라, GVHD는 급성 GVHD이다. 또 다른 실시형태에 따라, GVHD는 만성 GVHD이다. 또 다른 특정한 실시형태에 따라, 약제학적 조성물이 투여되는 대상체는 이식편대종양(GVTS) 또는 이식편대백혈병(GVL) 효과를 보유한다.
일 실시형태에서, GVHD는 대상체의 간에서의 GVHD이다. 동종이계 HSCT 수용자에서 간 기능이상은 예비 양생법 및 다른 약제로부터의 독성, 감염, 정맥폐쇄질환(VOD), 및 간의 급성 및 만성 이식편대숙주 질환(GVHD)을 포함하는 다양한 인자로 인한 것일 수 있다.
또 다른 실시형태에 따라, 약제학적 조성물은 GVHD와 연관된 간독성을 감소시킨다. 일 실시형태에서, 세포 제제는 GVHD와 연관된 간독성을 감소시킨다. 간독성의 일반적인 증상 및 합병증은 임파선염, 열, 증가된 적혈구 침강 속도, 높은 빌리루빈 수치 및 열성 호중구감소증을 포함한다.
면역 질환, 자가면역 질환, 염증성 질환, 사이토카인 방출 증후군(CRS), & 사이토카인 스톰
일 실시형태에서, 본 발명의 기재내용은 대상체에게 상기 상세하게 본 명세서에 기재된 세포 제제를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 이의 필요가 있는 대상체에서 사이토카인 방출 증후군(CRS) 또는 사이토카인 스톰의 면역 질환 또는 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 치료, 예방, 완화, 저해, 또는 발생률의 감소 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 기재내용은 대상체에게 상기 본 명세서에 상세하게 기재된 바와 같은 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 이의 필요가 있는 대상체에서, 사이토카인 방출 증후군(CRS) 또는 사이토카인 스톰의 면역 질환 또는 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 치료, 예방, 완화, 억제, 또는 발생률의 감소 방법을 제공한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 기재내용은 이의 필요가 있는 대상체에서 사이토카인 방출 증후군(CRS) 또는 사이토카인 스톰의 면역 질환 또는 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 치료, 예방, 완화, 억제, 또는 발생률의 감소에서 사용을 위한 혼주된 세포 제제를 제공한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 기재내용은 이의 필요가 있는 대상체에서 사이토카인 방출 증후군(CRS) 또는 사이토카인 스톰의 면역 질환 또는 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 치료, 예방, 완화, 억제, 또는 발생률의 감소에서 사용을 위한 약제학적 조성물을 제공한다.
일 실시형태에서, 면역 질환은 GVHD이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 기재내용은 이의 필요가 있는 대상체에서 GVHD의 치료, 예방, 완화, 억제, 또는 발생률의 감소에서 사용을 위한 약제학적 조성물을 제공한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 기재내용은 이의 필요가 있는 대상체에게 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 조혈 악성종양의 치료, 예방, 완화, 억제, 또는 발생률의 감소 방법을 제공한다. 특정한 실시형태에 따라, 대상체는 조혈 악성종양을 앓고 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "조혈 악성종양"은 혈액 세포의 제어되지 않는 비정상적인 성장을 특징으로 하는 임의의 혈액 세포 암을 의미한다. 용어 "조혈 악성종양"은 백혈병, 골수이형성증후군, 림프종, 및 다수의 골수종(혈장 세포 이혼화증)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 용어 "백혈병"은 혈액의 순환에서 이들의 상응하는 증가와 함께 또는 이들 없이 신체 조직에서 백혈구의 수의 비정상적인 증가를 특징으로 하는 혈액 형성 기관의 질환(예를 들면, 급성 림프아구 백혈병, ALL; 급성 골수성 백혈병, AML; 만성 골수성 백혈병, CML; 등)을 의미한다. 용어 "골수이형성증후군"은 골수가 전백혈병 과정의 정성적 및 정량적 변화를 보이지만 반드시 급성 백혈병을 종결시키지는 않는 만성 과정을 갖는 병태를 의미한다. 용어 "림프종"은 B 또는 T 림프구로부터 수득된 림프아구의 악성 종양(예를 들면, 호지킨 림프종, HL; 비-호지킨 림프종, NHL 등)을 의미한다. 용어 "혈장 세포 이혼화증"은 혈장 세포 증식으로 인한 형질세포증가증(예를 들면, 다수의 골수종, MM; 혈장 세포 백혈병, PCL 등)을 의미한다.
예시적인 실시형태에 따라, 상기 조혈 악성종양은 MDS, 급성 림프아구 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML) 및 만성 골수성 백혈병(CML)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정한 유형의 공여자 혈액 세포, 예를 들면, T-림프구의 주입은 또한 이식편대백혈병 효과를 자극할 수 있다. 이러한 효과는 만성 골수성 백혈병(CML)이 있는 환자에서 가장 잘 관찰되었다. CML에서, 이식 후 재발하는 환자의 75 백분율은 다시 관해된다. 다른 질병, 예를 들면, 급성 골수성 백혈병(AML) 및 골수이형성증후군(MDS)에 있어서, 효과는 덜 확연하고; 환자의 약 20 백분율에서 AML 및 MDS는 관해된다. 급성 림프아구 백혈병(ALL) 환자에 있어서, 소수의 환자가 적어도 일시적으로, 효과로부터 반복적으로 이득을 얻었음에도 불구하고, 이식편대백혈병 효과의 존재는 분명하지 않다.
다른 방식에서, 혼주된 공여자 면역 세포는 상이하기 때문에 잔여 백혈병, 림프종 또는 암 세포를 인식하고 이들을 파괴할 수 있다. 회고적인 연구는 급성 또는 만성 GVHD가 발달한 환자는 GVHD가 발달하지 않은 환자보다 낮은 질환 재발율을 갖는다는 것을 증명하였다. 이러한 발견은 이식편대종양 효과의 간접적인 징후이다.
용어 "컨디셔닝 처리"는 이식 전에, 방사선, 면역 혈청, 화학요법, 및/또는 면역억제제를 포함하는 다양한 컨디셔닝 섭생법에 의한 이식 수용자의 예비적인 처리를 의미한다. 이식 컨디셔닝은 골수 이식 전에 매우 흔하다.
숙련가는 용어 "대상체", "환자", "수용자", 및 "이의 필요가 있는 대상체"가 상호교환적으로 사용될 수 있고, 약제학적 조성물의 투여가 필요한 대상체를 포함할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 HSCT를 받았거나 받을 것인 대상체에게 투여된다. 일 실시형태에서, 이의 필요가 있는 대상체는 HSCT를 받고 있는 대상체이다. 일 실시형태에서, 조혈 줄기 세포(HSC)는 이의 필요가 있는 대상체로 이식되고, 약제학적 조성물의 세포는 동일한 공여자로부터 수득된다.
또 다른 실시형태에 따라, 약제학적 조성물의 투여는 HSCT 24시간 이하 전에 수행된다. 일 실시형태에서, 약제학적 조성물의 투여는 HSCT 약 24 내지 30시간 전에 수행된다. 또 다른 실시형태에 따라, 약제학적 조성물의 투여는 HSCT와 동일한 시간에 수행된다. 일 실시형태에서, 약제학적 조성물의 투여는 HSCT 15일 이하 후 수행된다. 추가의 실시형태에 따라, HSCT에서 사용되는 HSC는 동종이계 HSC이다. 비제한적인 예에 따라, HSCT에서 사용된 HSC는 골수, 말초 혈액, 또는 탯줄 혈액으로부터 수득될 수 있다. 또 다른 실시형태에 따라, 약제학적 조성물은 단일 용량으로 투여된다.
염증성 장 질환(IBD)은 크론병 및 궤양성 대장염으로 드러난 위장관에서 점막 면역계의 조절장애로 만성 장염을 특징으로 한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 IBD는 크론병, 궤양성 대장염 또는 이들의 조합을 의미한다. 장내균총 및 위험 신호, 예를 들면, 덱스트란 나트륨 설페이트(DSS) 둘 다를 포함하는 유전적 인자 및 환경적 인자는 모두 장염을 유도하는 것으로 나타났다. TNFa 및 IFNy 봉쇄 및 항-IL-1β 전략뿐만 아니라, 항생제 치료는 고유판에서 대식세포 및 수지상 세포의 핵인자-카파 B(NF-κB) 및 인플라솜 저해에 대한 역할을 제시하는 대장염 유도를 완화시킬 수 있었다.
일 실시형태에서, 혼주된 아폽토시스 세포 조성물은 시험관내 및 생체내 둘 다에서 LRP3 인플라솜을 음성적으로 조절하고, 조혈 세포에서 LRP3 인플라솜을 통해 유도된 전염증성 반응을 하향조절할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 기재내용은 이의 필요가 있는 대상체에서, 대상체에게 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, IBD의 치료, 예방, 완화, 억제, 또는 발생률의 감소 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 기재내용은 이의 필요가 있는 대상체에서 IBD의 치료, 예방, 완화, 억제, 또는 발생률의 감소에서 사용을 위한 약제학적 조성물을 제공한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 기재내용은 대상체에게 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제를 포함하는 약제학적 조성물 또는 이의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 이의 필요가 있는 대상체에서 IBD의 치료, 예방, 완화, 억제, 또는 발생률의 감소 방법을 제공하고, 이는 15% 이하의 다형핵 백혈구를 포함하고; 여기서 약제학적 조성물은 헤파린, ACD 포뮬라 A 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 항응고제를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 기재내용은 대상체에게 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제를 포함하는 약제학적 조성물 또는 이의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 이의 필요가 있는 대상체에서 IBD의 치료, 예방, 완화, 억제, 또는 발생률의 감소 방법을 제공한다.
일 실시형태에서, 면역 질환의 치료, 예방, 완화, 억제, 또는 발생률의 감소 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물을 고형 장기 이식을 받은 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일 실시형태에서, 장기는 폐, 심장, 신장, 췌장, 간, 피부 및 소장으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 고형 장기는 베타 세포를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 고형 장기는 사지이다.
일 실시형태에서, 약제학적 조성물을 투여하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법의 조성물은 상기 이식 24시간 전에 수행된다. 또 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물의 투여는 이식과 동일한 시간에 수행된다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물은 상기 이식 15일 후까지 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 투여는 단일 투여를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 투여는 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물에 의한 반복 투여를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 반복 투여는 증가된 효능을 보여준다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물의 투여에 대한 면역원성 반응이 모니터링된다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물의 투여는 음성 면역 반응에 반응하여, 예를 들면, 투여 및 상기 대상체의 치료에 부정적으로 영향을 주는 항체가 제조되는 경우, 중단된다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물의 투여에 대한 면역 반응은 항체를 중화시키기 위하여 모니터링된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물로 치료되는 염증성 질환은 관절염이다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물로 치료되는 염증성 질환은 통풍이다. 또 다른 실시형태에서, 염증성 질환은 염증성 장 질환이다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물로 치료되는 염증성 장 질환은 크론병, 궤양성 대장염 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
사이토카인 스톰 및 사이토카인 방출 증후군
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 대상체에서 발생할 수 있는 독성 사이토카인 방출 또는 "사이토카인 방출 증후군"(CRS) 또는 "중증 사이토카인 방출 증후군"(sCRS) 또는 "사이토카인 스톰"을 감소시키는 본 명세서에 상세하게 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제를 제공하는 것을 포함한다. 또 다른 실시형태에서 CRS, sCRS 또는 사이토카인 스톰은 면역 세포의 투여의 결과로서 발생한다. 또 다른 실시형태에서, CRS, sCRS 또는 사이토카인 스톰은 면역 세포(하기 참조)와 별개의 자극, 병태, 또는 증후군의 결과이다. 또 다른 실시형태에서, 사이토카인 스톰, 사이토카인 케스케이드, 또는 사이토카인 과분비는 사이토카인 방출 증후군의 더 심각한 형태이다.
숙련가는 독성 사이토카인 방출 또는 독성 사이토카인 수치의 감소가 대상체에서 독성 사이토카인 수치의 생성의 감소 또는 저해, 또는 대상체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 스톰의 저해 또는 발생률의 감소를 포함한다는 것을 인식할 것이다. 또 다른 실시형태에서 독성 사이토카인 수치는 CRS 또는 사이토카인 스톰 동안 감소된다. 또 다른 실시형태에서, 독성 사이토카인 수치의 감소 또는 생성의 저해는 CRS 또는 사이토카인 스톰의 치료를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 독성 사이토카인 수치의 감소 또는 생성의 저해는 CRS 또는 사이토카인 스톰의 예방을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 독성 사이토카인 수치의 감소 또는 생성의 저해는 CRS 또는 사이토카인 스톰의 완화를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 독성 사이토카인 수치의 감소 또는 생성의 저해는 CRS 또는 사이토카인 스톰의 완화를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 독성 사이토카인은 전염증성 사이토카인을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 전염증성 사이토카인은 IL-6을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 전염증성 사이토카인은 IL-1β를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 전염증성 사이토카인은 TNF-α를 포함하고, 또 다른 실시형태에서, 전염증성 사이토카인은 IL-6, IL-1β, 또는 TNF-α, 또는 임의의 이들의 조합을 포함한다
일 실시형태에서, 사이토카인 방출 증후군은 몇몇 염증성 사이토카인의 상승된 수치 및 대상체에서 역 물리 반응, 예를 들면, 저혈압, 고열 및 떨림을 특징으로 한다. 또 다른 실시형태에서, 염증성 사이토카인은 IL-6, IL-1β, 및 TNF-α를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, CRS는 IL-6, IL-1β, 또는 TNF-α, 또는 임의의 이들의 조합의 상승된 수치를 특징으로 한다. 또 다른 실시형태에서, CRS는 IL-8, 또는 IL-13, 또는 임의의 이들의 조합이 상승된 수치를 특징으로 한다. 또 다른 실시형태에서, 사이토카인 스톰은 TNF-알파, IFN-감마, IL-1베타, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, GM-CSF, IL-5, 프락탈킨, 또는 이들의 조합 또는 이의 하위조합에서의 증가를 특징으로 한다. 또 다른 실시형태에서, IL-6은 CRS 또는 사이토카인 스톰의 마커를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, IFN-γ는 CRS 또는 사이토카인 스톰의 마커를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 더 큰 종양 덩어리를 가진 환자는 사이토카인 방출 증후군의 더 높은 발생률 및 중증도를 갖는다.
또 다른 실시형태에서, 인간 및 마우스에서 CRS 또는 사이토카인 스톰에서 증가된 사이토카인은 하기 표 1 및 2에 열거된 사이토카인의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
인간 및/또는 마우스에서 CRS 또는 사이토카인 스톰에서 증가된 사이토카인의 패널
사이토카인
(분석물)		 인간 모델(임상 시험) 마우스 모델(임상-전) 세포가 분비하는 사이토카인 주의/기타
CAR-T
(H) 기원		 마우스
기원		 특정되지 않음
Flt-3L * DC(?)
프락탈킨 * APC, 내피 세포(?) =CX3CL1, 뉴로탁틴(마우스)
M-CSF =CSF1
GM-CSF * *(시험관내) T 세포,
Figure pct00001
IFN-α * T 세포,
Figure pct00002
, 단핵구
IFN-β ? ? T 세포,
Figure pct00003
, 단핵구
IFN-γ * * *(시험관내) 세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, NK 세포,
Figure pct00004
, 단핵구, DC
IL-1α * 단핵구,
Figure pct00005
, 외피
IL-1β * * 대식세포, DC, 섬유아세포, 내피 세포, 간세포
IL-1Rα *
IL-2 * * *(시험관내) T 세포
IL-2Rα * 림프구
IL-4 * * *(시험관내) Th2 세포
IL-5 * * * T 세포
IL-6 * * * 단핵구, 대식세포, 수지상 세포, T 세포, 섬유아세포, 케라티노사이트, 내피 세포, 지방구, 지방세포, 미오사이트, 혈관사이세포, 및 골아세포
IL-7 * * 시험관내 BM 간질 세포
IL-8 * 대식세포, 단핵구
IL-9 * * T 세포, T 헬퍼
IL-10 * * * *(시험관내) 단핵구/대식세포, 비만 세포, B 세포, 조절 T 세포, 및 헬퍼 T 세포
IL-12 * *
Figure pct00006
, 단핵구, DC, 활성화된 림프구, 호중구		 = p70
(p40+p35)
IL-13 * * T 세포
일 실시형태에서, 표 1의 사이토카인 Flt-3L, 프락탈킨, GM-CSF, IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-2Rα, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, 및 IL-13은 CRS 또는 사이토카인 스톰에서 유의미한 것으로 간주된다. 또 다른 실시형태에서, 표 1의 IFN-α, IFN-β, IL-1, 및 IL-1Rα은 CRS 또는 사이토카인 스톰에서 중요한 것으로 나타난다. 또 다른 실시형태에서, M-CSF는 알려지지 않은 중요성을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 표 1에 열거된 임의의 사이토카인, 또는 이들의 조합은 CRS 또는 사이토카인 스톰의 마커로서 사용될 수 있다.
인간 및/또는 마우스에서 CRS 또는 사이토카인 스톰에서 증가된 사이토카인의 패널
사이토카인
(분석물)		 인간 모델(임상 시험) 마우스 모델(임상-전) 세포가 분비하는 사이토카인 주의/기타
CAR-T
(H) 기원		 마우스
기원		 특정되지 않음
IL-15 * * 섬유아세포, 단핵구(?) 22
IL-17 * * T 세포
IL-18 대식세포
IL-21 * T 헬퍼, NK 세포
IL-22 * 활성화된 DC 및 T 세포
IL-23
IL-25 보호?
IL-27 * APC
IP-10 * 단핵구(?)
MCP-1 * 내피, 섬유아세포, 외피, 단핵구 =CXCL10
MCP-3 * *(시험관내) PBMC,
Figure pct00007
(?)		 =CCL2
MIP-1α * T 세포 =CXCL9
MIP-1β * T 세포 =CCL3
PAF ? 혈소판, 내피 세포, 호중구, 단핵구, 및 대식세포, 혈관사이세포 =CCL4
PGE2 * * 위장관 점막 등
RANTES * 단핵구
TGF-β * *
Figure pct00008
, 림프구, 내피, 혈소판...		 =CCL5
TNF-α * * * *(시험관내) 대식세포, NK 세포, T 세포
TNF-αR1 *
HGF *
MIG * T 세포 화학유인물질, IFN-γ에 의해 유도됨
일 실시형태에서, 표 2의 IL-15, IL-17, IL-18, IL-21, IL-22, IP-10, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, 및 TNF-α는 CRS 또는 사이토카인 스톰에서 유의미한 것으로 간주된다. 또 다른 실시형태에서, 표 2의 IL-27, MCP-3, PGE2, RANTES, TGF-β, TNF-αR1, 및 MIG는 CRS 또는 사이토카인 스톰에서 중요한 것으로 나타난다. 또 다른 실시형태에서, IL-23 및 IL-25는 알려지지 않은 중요성을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 표 2에 열거된 사이토카인, 또는 이들의 조합은 CRS 또는 사이토카인 스톰의 마커로서 사용될 수 있다.
숙련가는 용어 "사이토카인"이 사이토카인(예를 들면, 인터페론 감마, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자, 종양 괴사 인자 알파), 케모킨(예를 들면, MIP 1 알파, MIP 1 베타, RANTES), 및 염증의 다른 가용성 매개체, 예를 들면, 반응성 산소 종 및 산화질소를 포함할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
일 실시형태에서, 특정한 사이토카인의 증가된 방출은, 유의미하거나 중요하거나 알려지지 않은 중요성을 갖는지 여부와 관계 없이, 특정한 사이토카인이 사이토카인 스톰의 부분이라는 연역적 의미를 갖지 않는다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 사이토카인의 증가는 사이토카인 스톰 또는 CRS의 결과가 아니다. 또 다른 실시형태에서, CAR T-세포는 특정한 사이토카인 또는 사이토카인의 그룹의 증가된 수치의 공급원일 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 사이토카인 방출 증후군은 하기 증후군 중 어느 하나 또는 모두를 특징으로 한다: 오한이 있거나 없는 열, 불안, 피로, 거식증, 근통, 관절통, 메스꺼움, 구토, 두통 피부 발진, 메스꺼움, 구토, 설사, 빈호흡, 저산소혈증 심혈관 심계항진, 확대된 맥압, 고혈압, 증가된 심박출량(초기), 잠재적으로 감소된 심박출량(후기), 상승된 D-다이머, 출혈이 있거나 없는 저섬유소혈증, 질소혈 간 트랜스아미니티스(Azotemia Hepatic Transaminitis), 고빌리루빈혈증, 두통, 정신 상태 변화, 혼란, 섬망, 단어 찾기 장애 또는 프랭크 실어증, 환각, 미진, 운동측정장애, 변경된 걸음걸이, 발작. 또 다른 실시형태에서, 사이토카인 스톰은 IL-2 방출 및 림프구과생성을 특징으로 한다. 또 다른 실시형태에서, 사이토카인 스톰은 CAR T-세포에 의해 방출된 사이토카인의 증가를 특징으로 한다. 또 다른 실시형태에서, 사이토카인 스톰은 CAR T-세포 이외의 세포에 의해 방출된 사이토카인의 증가를 특징으로 한다.
또 다른 실시형태에서, 사이토카인 스톰은 심장 기능이상, 성인 호흡 장애 증후군, 신경학적 독성, 신장 및/또는 간 부전, 및 파종성 혈관내 응고를 포함하는 잠재적으로 생명을 위협하는 합병증을 야기한다.
숙련가는 사이토카인 방출 증후군(CRS) 또는 사이토카인 스톰의 특성이 CRS 또는 사이토카인 스톰에 대한 트리거(trigger) 수일 내지 수주 후에 발생하는 것으로 추정된다는 것을 인식할 것이다. 일 실시형태에서, CAR T-세포는 CRS 또는 사이토카인 스톰에 대한 트리거이다. 또 다른 실시형태에서, CRS 또는 사이토카인 스톰에 대한 트리거는 CAR T-세포가 아니다.
일 실시형태에서, 사이토카인 스톰의 지표로서 사이토카인 수치 또는 농도의 측정은 사이토카인 수치 또는 농도의 -배 증가, 백분율(%) 증가, 총 증가 또는 증가율로서 표현될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 상기 특정한 수치 또는 농도에 대한 절대 사이토카인 수치 또는 농도는 사이토카인 스톰을 경험했거나 경험하는 대상체의 지표일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 특정한 수치 또는 농도에서의 절대 사이토카인 수치 또는 농도, 예를 들면, CAR-T 세포 요법을 겪지 않는 대조군 대상체에서 정상적으로 확인된 수치 또는 농도는 CAR T-세포를 겪고 있는 대상체에서 사이토카인 스톰의 저해 또는 발생률의 감소 방법의 지표일 수 있다.
숙련가는 용어 "사이토카인 수치"가 농도의 측정, 배수 변화의 측정, 백분율(%) 변화 측정, 또는 비율 변화 측정을 포함할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 추가로, 혈액, 타액, 혈청, 소변, 및 혈장 중의 사이토카인을 측정하는 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다.
일 실시형태에서, 사이토카인 스톰이 몇몇 염증성 사이토카인의 상승관 연관된 것을 인식됨에도 불구하고, IL-6 수치는 사이토카인 스톰의 일반적인 척도 및/또는 사이토카인 스톰에 대한 치료 효능의 일반적인 척도로서 사용될 수 있다. 숙련가는 다른 사이토카인이 사이토카인 스톰의 마커로서 사용될 수 있고, 예를 들면, 임의의 TNF-α, IB-1α, IL-6, IL-8, IL-13, 또는 INF-γ, 또는 상기 임의의 조합은 CRS 또는 사이토카인 스톰의 마커로서 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 추가로, 사이토카인을 측정하기 위한 분석 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 숙련가는 사이토카인 스톰에 영향을 미치는 방법은 유사하게 사이토카인 방출 증후군(CRS)에 영향을 줄 수 있다는 것을 인식할 것이다.
일 실시형태에서, 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 스톰을 경험하는 대상체에서 사이토카인 생성을 감소시키거나 저해하는 방법이 본 명세서에 기재된다. 또 다른 실시형태에서, 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 스톰을 경험하는데 취약한 대상체에서 사이토카인 생성을 감소시키거나 저해하는 방법이 본 명세서에 기재된다. 또 다른 실시형태에서, 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 스톰을 경험하는 대상체에서 사이토카인 생성을 감소시키거나 저해하는 방법이 본 명세서에 기재되고, 여기서 표 1 및/또는 표 2에 열거된 임의의 사이토카인 또는 사이토카인 그룹의 생성은 감소되거나 저해된다. 또 다른 실시형태에서, 사이토카인 IL-6 생성은 감소되거나 저해된다. 또 다른 실시형태에서, 사이토카인 IL-베타1 생성은 감소되거나 저해된다. 또 다른 실시형태에서, 사이토카인 IL-8 생성은 감소되거나 저해된다. 또 다른 실시형태에서, 사이토카인 IL-13 생성은 감소되거나 저해된다. 또 다른 실시형태에서, 사이토카인 TNF-알파 생성은 감소되거나 저해된다. 또 다른 실시형태에서, 사이토카인 IL-6 생성, IL-1베타 생성, 또는 TNF-알파 생성, 또는 임의의 이들의 조합은 감소되거나 저해된다.
일 실시형태에서, 사이토카인 방출 증후군은 등급이 나뉜다. 또 다른 실시형태에서, 등급 1은 증상이 생명을 위협하지 않고 오직 증상 치료만 필요한 경우, 예를 들면, 열, 메스꺼움, 피로, 두통, 근통, 불안인 사이토카인 방출 증후군을 나타낸다. 또 다른 실시형태에서, 등급 2 증상은 고혈압에 대하여 산소, 유체 또는 승압제와 같은 중도적 개입이 요구되고 이에 대응한다. 또 다른 실시형태에서, 등급 3 증상은 공격적 개입이 요구되고 이에 대응한다. 또 다른 실시형태에서, 등급 4 증상은 생명을 위협하는 증상이고, 산소호흡기가 요구되고 환자는 장기 독성을 나타낸다.
또 다른 실시형태에서, 사이토카인 스톰은 IL-6 및 인터페론 감마 방출을 특징으로 한다. 또 다른 실시형태에서, 사이토카인 스톰은 IL-6 방출을 특징으로 한다. 또 다른 실시형태에서, 사이토카인 스톰은 인터페론 감마 방출을 특징으로 한다. 또 다른 실시형태에서, 사이토카인 스톰은 표 1 및 표 2에 열거된 임의의 사이토카인 또는 이의 조합의 방출을 특징으로 한다. 또 다른 실시형태에서, 사이토카인 스톰은 당해 분야에 공지된 임의의 사이토카인 또는 이들의 조합의 방출을 특징으로 한다.
일 실시형태에서, 증상 개시는 주입 시작 후 수분 내지 수시간에 시작된다. 또 다른 실시형태에서, 증상은 피크 사이토카인 수치와 동시에 발생한다.
일 실시형태에서, CAR T-세포 암 요법을 받는 대상체에서 사이토카인 방출 증후군(CRS) 또는 사이토카인 스톰의 저해 또는 발생률의 감소 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같이 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제 또는 이의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
일 실시형태에서, CAR T-세포 암 요법을 받는 대상체에서 사이토카인 방출 증후군(CRS) 또는 사이토카인 스톰의 치료, 예방, 완화, 억제 또는 발생률의 감소 방법은 CAR T-세포 요법의 효능에 영향을 주지 않는다. 또 다른 실시형태에서, CAR T-세포 암 요법을 받는 대상체에서 CRS 또는 사이토카인 스톰의 치료, 예방, 완화, 억제 또는 발생률의 감소 방법은 CAR T-세포 요법의 효능을 약 5% 이하만큼 감소시킨다. 또 다른 실시형태에서, CAR T-세포 암 요법을 받는 대상체에서 CRS 또는 사이토카인 스톰의 치료, 예방, 완화, 억제 또는 발생률의 감소 방법은 CAR T-세포 요법의 효능을 약 10% 이하만큼 감소시킨다. 또 다른 실시형태에서, CAR T-세포 암 요법을 받는 대상체에서 CRS 또는 사이토카인 스톰의 치료, 예방, 완화, 억제 또는 발생률의 감소 방법은 CAR T-세포 요법의 효능을 약 15% 이하만큼 감소시킨다. 또 다른 실시형태에서, CAR T-세포 암 요법을 받는 대상체에서 CRS 또는 사이토카인 스톰의 치료, 예방, 완화, 억제 또는 발생률의 감소 방법은 CAR T-세포 요법의 효능을 약 20% 이하만큼 감소시킨다.
세포독성을 정량하는 임의의 적절한 방법은 CAR을 발현하도록 개질된 면역 세포에서 활성이 실질적으로 변화하지 않은 채로 남아 있는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 세포독성은 세포 배양 기반 분석, 예를 들면, 실시예에 기재된 세포독성 분석을 사용하여 정량될 수 있다. 세포독성 분석은 죽은 세포의 DNA를 우선적으로 염색하는 염료를 사용할 수 있다. 다른 경우에, 세포 집단에서 살아있는 및 죽은 세포의 상대적인 수를 측정하는 형광 및 발광 분석이 사용될 수 있다. 이러한 분석에 있어서, 프로테아제 활성은 세포 생존능 및 세포 독성에 대한 마커를 제공하고, 라벨링된 세포 투과성 펩타이드는 샘플 중의 생존 가능한 세포의 수에 비례하는 형광 신호를 생성한다. 다양한 세포독성 분석용 키트는 프로메가(Promega) 및 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)와 같은 제조사로부터 상업적으로 이용 가능하다. 또 다른 실시형태에서, 세포독성의 척도는 정성적일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 세포독성의 척도는 정량적일 수 있다. 추가로 실시형태에서 세포독성의 척도는 세포독성 사이토카인의 발현에서의 변화에 관한 것일 수 있다.
CAR T-세포 요법과 연관된 사이토카인 방출
일 실시형태에서, 사이토카인 방출은 CAR T-세포 요법과 같은 면역 요법의 투여 수일 내지 2주 후 발생한다. 일 실시형태에서, 고혈압 및 다른 증상은 사이토카인 방출 후, 즉, 수일 내지 수주 후이다. 그러므로, 일 실시형태에서, 상기 상세하게 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제 또는 이의 조성물은 예방으로서 면역 요법과 동일한 시간에 대상체에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포 또는 상청액은 면역 요법의 투여 2-3일 후에 대상체에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포 또는 상청액은 면역 요법의 투여 7일 후에 대상체에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포 또는 상청액은 면역 요법의 투여 10일 후에 대상체에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포 또는 상청액은 면역 요법의 투여 14일 후에 대상체에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포 또는 상청액은 면역 요법의 투여 2-14일 후에 대상체에 투여된다.
또 다른 실시형태에서, 상기 상세하게 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제 또는 이의 조성물은 면역 요법의 투여 2-3시간 후에 대상체에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포 또는 상청액은 면역 요법의 투여 7시간 후에 대상체에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포 또는 상청액은 면역 요법의 투여 10시간 후에 대상체에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포 또는 상청액은 면역 요법의 투여 14시간 후에 대상체에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포 또는 상청액은 면역 요법의 투여 2 내지 14시간 후에 대상체에 투여된다.
대안적인 실시형태에서, 상기 상세하게 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제 또는 이의 조성물은 예방으로서 면역 요법 전에 대상체에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포 또는 상청액은 면역 요법의 투여 1일 전에 대상체에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포 또는 상청액은 면역 요법의 투여 2 내지 3일 전에 대상체에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포 또는 상청액은 면역 요법의 투여 7일 전에 대상체에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포 또는 상청액은 면역 요법의 투여 10일 전에 대상체에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포 또는 상청액은 면역 요법의 투여 14일 전에 대상체에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포 또는 상청액은 면역 요법의 투여 2 내지 14일 전에 대상체에 투여된다.
또 다른 실시형태에서, 상기 상세하게 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제 또는 이의 조성물은 면역 요법의 투여 2-3시간 전에 대상체에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포 또는 상청액은 면역 요법의 투여 7시간 전에 대상체에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포 또는 상청액은 면역 요법의 투여 10시간 전에 대상체에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포 또는 상청액은 면역 요법의 투여 14시간 전에 대상체에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포 또는 상청액은 면역 요법의 투여 2 내지 14시간 전에 대상체에 투여된다.
또 다른 실시형태에서, 상기 상세하게 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제 또는 이의 조성물은 사이토카인 방출 증후군이 발생한 후, 치료적으로 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, 아폽토시스 세포 또는 상청액은, 사이토카인 방출 증후군의 개시를 야기하거나 증명하는 사이토카인 방출이 검출된 후, 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, 아폽토시스 세포 또는 상청액은 증가된 사이토카인 수치, 또는 사이토카인 방출 증후군을 종결시킬 수 있고, 이의 후유증을 회피할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 상기 상세하게 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제 또는 이의 조성물은 치료적으로, 다수의 시간점에서 투여될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 상기 상세하게 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제 또는 이의 조성물의 투여는 상기 상세하게 본 명세서에 기재된 바와 같은, 적어도 본 명세서에 기재된 2개의 시간점에 있다. 또 다른 실시형태에서, 상기 상세하게 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제 또는 이의 조성물의 투여는 적어도 본 명세서에 기재된 3개의 시간점에 있다. 또 다른 실시형태에서, 상기 상세하게 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제 또는 이의 조성물의 투여는 CRS 또는 사이토카인 스톰 전, 사이토카인 방출 증후군이 발생한 후, 및 임의의 이들의 조합이다.
일 실시형태에서, 키메라 항원 수용체-발현 T-세포(CAR T-세포) 요법 및 상기 상세하게 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제 또는 이의 조성물은 함께 투여된다. 또 다른 실시형태에서, CAR T-세포 요법은 아폽토시스 세포 요법 또는 상청액 후에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, CAR T-세포 요법은 아폽토시스 세포 요법 또는 상청액 전에 투여된다. 이러한 양상에 따라, 일 실시형태에서, 아폽토시스 세포 요법 또는 상청액은 CAR T-세포 요법 약 2-3주 후에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포 요법 또는 상청액은 CAR T-세포 요법 약 6 내지 7주 후에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포 요법 또는 상청액은 CAR T-세포 요법 약 9주 후에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포 요법은 CAR T-세포 요법 후 수개월 이하 후에 투여된다.
그러므로, 일 실시형태에서, 상기 상세하게 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제 또는 이의 조성물은 예방으로서 면역 요법과 동시에 대상체에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포 또는 상청액은은 면역 요법의 투여 2 내지 3일 후에 대상체에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포 또는 상청액은 면역 요법의 투여 7일 후에 대상체에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포 또는 상청액은 면역 요법의 투여 10일 후에 대상체에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포 또는 상청액은 면역 요법의 투여 14일 후에 대상체에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포 또는 상청액은 면역 요법의 투여 2 내지 14일 후에 대상체에 투여된다.
또 다른 실시형태에서, 상기 상세하게 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제 또는 이의 조성물은 면역 요법의 투여 2 내지 3시간 후에 대상체에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포 또는 상청액은 면역 요법의 투여 7시간 후에 대상체에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포 또는 상청액은 면역 요법의 투여 10시간 후에 대상체에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포 또는 상청액은 면역 요법의 투여 14시간 후에 대상체에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포 또는 상청액은 면역 요법의 투여 2 내지 14시간 후에 대상체에 투여된다.
대안적인 실시형태에서, 상기 상세하게 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제 또는 이의 조성물은 예방으로서 면역 요법 전에 대상체에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포 또는 상청액은 면역 요법의 투여 1일 전에 대상체에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포 또는 상청액은 면역 요법의 투여 2 내지 3일 전에 대상체에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포 또는 상청액은 면역 요법의 투여 7일 전에 대상체에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포 또는 상청액은 면역 요법의 투여 10일 전에 대상체에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포 또는 상청액은 면역 요법의 투여 14일 전에 대상체에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포 또는 상청액은 면역 요법의 투여 2 내지 14일 전에 대상체에 투여된다.
또 다른 실시형태에서, 상기 상세하게 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제 또는 이의 조성물은 면역 요법의 투여 2 내지 3시간 전에 대상체에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포 또는 상청액은 면역 요법의 투여 7시간 전에 대상체에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포 또는 상청액은 면역 요법의 투여 10시간 전에 대상체에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포 또는 상청액은 면역 요법의 투여 14시간 전에 대상체에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포 또는 상청액은 면역 요법의 투여 2 내지 14시간 전에 대상체에 투여된다.
또 다른 실시형태에서, 상기 상세하게 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제 또는 이의 조성물은 사이토카인 방출 증후군이 발생한 후, 치료적으로 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, 상기 상세하게 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제 또는 이의 조성물은 사이토카인 방출 증후군의 개시를 야기하거나 증명하는 사이토카인 방출이 검출된 후, 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, 아폽토시스 세포 또는 상청액은 증가된 사이토카인 수치, 또는 사이토카인 방출 증후군을 종결시킬 수 있고, 이의 후유증을 피할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 상기 상세하게 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제 또는 이의 조성물은 치료적으로, 다수의 시간점에서 투여될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 상기 상세하게 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제 또는 이의 조성물의 투여는 적어도 본 명세서에 기재된 2개의 시간점에 있다. 또 다른 실시형태에서, 상기 상세하게 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제 또는 이의 조성물의 투여는 적어도 본 명세서에 기재된 3개의 시간점에 있다. 또 다른 실시형태에서, 상기 상세하게 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제 또는 이의 조성물의 투여는 CRS 또는 사이토카인 스톰 전, 사이토카인 방출 증후군이 발생된 후, 및 임의의 이들의 조합이다.
일 실시형태에서, 키메라 항원 수용체-발현 T-세포(CAR T-세포) 요법 및 상기 상세하게 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제 또는 이의 조성물은 함께 투여된다. 또 다른 실시형태에서, CAR T-세포 요법은 상기 상세하게 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제 또는 이의 조성물 후에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, CAR T-세포 요법은 상기 상세하게 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제 또는 이의 조성물 후에 투여된다. 이러한 양상에 따라, 일 실시형태에서, 상기 상세하게 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제 또는 이의 조성물은 CAR T-세포 요법 약 2 내지 3주 후 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포 요법 또는 상청액은 CAR T-세포 요법 약 6-7주 후 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포 요법 또는 상청액은 CAR T-세포 요법 약 9주 후 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 아폽토시스 세포 요법은 CAR T-세포 요법 후 몇개월 후 투여된다.
일 실시형태에서, CAR T-세포는 대상체에 이종이다. 일 실시형태에서, CAR T-세포는 1명 이상의 공여자로부터 수득된다. 일 실시형태에서, CAR T-세포는 1명 이상의 골수 공여자로부터 선택된다. 또 다른 실시형태에서, CAR T-세포는 하나 이상의 혈액 은행 공여로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 공여자는 일치된 공여자이다. 일 실시형태에서, CAR T-세포는 보편적인 동종이계 CAR T-세포이다. 또 다른 실시형태에서, CAR T-세포는 동계 CAR T-세포이다. 또 다른 실시형태에서, CAR T-세포는 일치되지 않은 제3 단체 공여자로부터의 것이다. 또 다른 실시형태에서, CAR T-세포는 혼주된 제3 단체 공여자 T-세포로부터의 것이다. 일 실시형태에서, 공여자는 골수 공여자이다. 또 다른 실시형태에서, 공여자는 혈액 은행 공여자이다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물 및 방법의 CAR T-세포는 하나 이상의 MHC 비제한적인 종양-관련 키메라 수용체를 포함한다. 일 실시형태에서, 비-자가 T-세포는 본 명세서에 그 전문이 참조로서 인용되는 비국 특허 출원 제20130156794호에 기재된 바와 같이, 자가면역 반응을 예방하거나 최소화하는 당해 분야에 공지된 프로토콜에 따라 조작되거나 투여될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, CAR T-세포는 대상체에 대하여 자가이다. 일 실시형태에서, 환자 자신의 세포가 사용된다. 이러한 실시형태에서, 환자 자신의 세포가 사용되는 경우, CAR T-세포 요법은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제 또는 이의 조성물 후 투여된다.
일 실시형태에서, 제제는 전신적 방식보다는 국소적으로, 예를 들면, 환자의 신체의 특정 부위에 직접적으로 제제의 주사를 통해 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 특정한 부위는 종양 또는 암을 포함한다.
특정한 실시형태에서, CAR T-세포 요법은 CAR T-세포를 포함하는 본 명세서에 기재된 조성물 및 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제 또는 이의 조성물의 투여를 포함한다.
비 CAR T-세포 적용과 연관된 사이토카인 방출
일 실시형태에서, 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 스톰을 경험하거나 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 스톰에 취약한 대상체에서 사이토카인 생성의 감소 또는 저해 방법이 본 명세서에 기재된다. 상기 상세하게 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제 또는 이의 조성물을 포함하는 조성물을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 투여는 상기 대상체에서 사이토카인 생성을 감소시키거나 저해한다. 또 다른 실시형태에서, 사이토카인 생성의 감소 또는 저해는 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 스톰을 경험하거나 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 스톰에 취약하고, 상기 상세하게 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제 또는 이의 조성물가 투여되지 않은 대상체와 비교된다. 또 다른 실시형태에서, 사이토카인 생성의 감소 또는 저해 방법은 전염증성 사이토카인 생성을 감소시키거나 저해한다. 또 다른 실시형태에서, 사이토카인 생성의 감소 또는 저해 방법은 적어도 하나의 전염증성 사이토카인의 생성을 감소시키거나 저해한다. 또 다른 실시형태에서, 사이토카인 생성의 감소 또는 저해 방법은 적어도 사이토카인 IL-6 생성을 감소시키거나 저해한다. 또 다른 실시형태에서, 사이토카인 생성의 감소 또는 저해 방법은 적어도 사이토카인 IL-1베타의 생성을 감소시키거나 저해한다. 또 다른 실시형태에서, 사이토카인 생성의 감소 또는 저해 방법은 적어도 사이토카인 TNF-알파의 생성을 감소시키거나 저해한다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 사이토카인 생성의 감소 또는 저해 방법은 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 스톰을 경험하거나 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 스톰에 취약하고, 상기 상세하게 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제 또는 이의 조성물이 투여되지 않은 대상체와 비교하여 상기 대상체에서 사이토카인 IL-6, IL-1β, 또는 TNF-α, 또는 이들의 조합물의 생성의 감소 또는 저해를 야기한다.
암 또는 종양은 또한 전염증성 사이토카인을 포함한 사이토카인의 절대 수치에 영향을 미칠 수 있다. 대상체에서 종양 덩어리의 수치는 사이토카인 수치, 특히 전염증성 사이토카인에 영향을 미칠 수 있다. 숙련가는 구 "감소 또는 저해" 또는 이의 문법적 변형이 사이토카인 생성의 배수 감소 또는 저해, 또는 사이토카인 생성의 순 감소 또는 저해, 또는 백분율(%) 감소 또는 저해를 포함할 수 있거나, 사이토카인 생성의 감소 또는 저해의 변화율을 포함할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
또 다른 실시형태에서, 상기 상세하게 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제 또는 이의 조성물을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 스톰을 경험하거나 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 스톰에 취약한 대상체에서 사이토카인 생성의 감소 또는 저해 방법이 본 명세서에 기재된다.
또 다른 실시형태에서, 상기 상세하게 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제 또는 이의 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 스톰을 경험하거나 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 스톰에 취약한 대상체에서 사이토카인 생성의 감소 또는 저해 방법이 본 명세서에 기재된다.
일 실시형태에서, 감염은 대상체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 스톰을 유발한다. 일 실시형태에서, 감염은 인플루엔자 감염이다. 일 실시형태에서, 인플루엔자 감염은 H1N1이다. 또 다른 실시형태에서, 인플루엔자 감염은 H5N1 조류 독감이다. 또 다른 실시형태에서, 감염은 중증 급성 호흡기 증후군(SARS)이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 엡스타인-바 바이러스-연관 적혈구포식성 림프조직구증식증(HLH)을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 감염은 패혈증이다. 일 실시형태에서, 패혈증은 그램-음성이다. 또 다른 실시형태에서, 감염은 말라리아이다. 또 다른 실시형태에서, 감염은 에볼라 바이러스 감염이다. 또 다른 실시형태에서, 감염은 천연두 바이러스이다. 또 다른 실시형태에서, 감염은 전신성 그램-음성 박테리아 감염이다. 또 다른 실시형태에서, 감염은 야리슈-헤르크스하이머 증후군이다.
일 실시형태에서, 대상체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 스톰의 원인은 적혈구포식성 림프조직구증식증(HLH)이다. 또 다른 실시형태에서, HLH은 산발성 HLH이다. 또 다른 실시형태에서, HLH는 대식세포 활성화 증후군(MAS)이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 스톰의 원인은 MAS이다.
일 실시형태에서, 대상체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 스톰의 원인은 만성 관절염이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 스톰의 원인은 스틸병이라고도 알려진 전신성 소아 특발성 관절염(sJIA)이다.
일 실시형태에서, 대상체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 스톰의 원인은 크리오피린-연관 주기 증후군(CAPS)이다. 또 다른 실시형태에서, CAPS는 가족성 한냉 두드러기(FCU)로도 알려진 가족성 한냉 자가-염증성 증후군(FCAS)을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, CAPS는 뮤클-웰 증후군(Muckle-Well Syndrome)(MWS)을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, CAPS는 만성 유아 신경 피부 및 관절(CFNCA) 증후군을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, CAPS는 FCAS, FCU, MWS, 또는 CFNCA 증후군, 또는 임의의 이들의 조합을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 대상체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 스톰의 원인은 FCAS이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 스톰의 원인은 FCU이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 스톰의 원인은 MWS이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 스톰의 원인은 CINCA 증후군이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 스톰의 원인은 FCAS, FCU, MWS, 또는 CINCA 증후군, 또는 임의의 이들의 조합이다.
또 다른 실시형태에서, 대상체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 스톰의 원인은 CIASI 유전자로도 알려진 NLRP3 유전자에서 기능 돌연변이의 후천성 또는 새로운 습득을 포함하는 크리오피라노패티(cryopyrinopathy)이다.
일 실시형태에서, 대상체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 스톰의 원인은 유전성 자가-염증 장애이다.
일 실시형태에서, 염증성 사이토카인의 방출에 대한 트리거는 리포다당류(LPS), 그램-양성 독소, 균류 독소, 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 또는 RIG-1 유전자 발현의 조절이다.
또 다른 실시형태에서, 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 스톰을 경험하는 대상체는 감염성 질환을 갖지 않는다. 일 실시형태에서, 대상체는 급성 췌장염을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 일 실시형태에서, 중증 화상 또는 트라우마인 조직 손상을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 급성 호흡기 곤란 증후군을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 제제 사용에 이차적인 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 스톰을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 독소 흡입에 이차적인 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 스톰을 갖는다.
또 다른 실시형태에서, 대상체는 면역요법의 수용자에게 이차적인 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 스톰을 갖고, 이는 일 실시형태에서 초작동제 CD28-특이적 단일클론 항체(CD28SA)에 의한 면역요법이다. 일 실시형태에서, CD28SA는 TGN1412이다. 또 다른 실시형태에서, 면역요법은 CAR T-세포 요법이다. 또 다른 실시형태에서, 면역요법은 수지상 세포 요법이다.
또 다른 실시형태에서, 상기 상세하게 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제 또는 이의 조성물은 약제학적 조성물의 투여가 원인인 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 스톰을 제어하는데 사용될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 상기 상세하게 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제 또는 이의 조성물은 항체 투여가 원인인 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 스톰을 제어하는데 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 항체는 단일클론이다. 또 다른 실시형태에서, 항체는 다중클론이다. 일 실시형태에서, 항체는 리툭시맙이다. 또 다른 실시형태에서, 항체는 오르토클론(Orthoclone) OKT3(뮤로모납-CD3)이다. 또 다른 실시형태에서, 항체는 알렘투주맙, 토시투주맙, CP-870,893, LO-CD2a/BTI-322 또는 TGN1412이다.
또 다른 실시형태에서, 염증성 사이토카인 생성의 제어가 유리할 수 있는 질환의 예는 암, 알레르기, 임의의 유형의 감염, 독성 쇼크 증후군, 패혈증, 임의의 유형의 자가면역 질환, 관절염, 크론병, 루푸스, 건선, 또는 전형적인 특징이 대상체의 해로운 효과를 야기하는 독성 사이토카인 방출인 임의의 다른 질환을 포함한다.
하기 실시예는 실시형태를 더 완전히 설명하기 위하여 나타낸다. 이들은 그러나 어떠한 방식으로도 넓은 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예
실시예 1: 단일 공급원 초기 아폽토시스 세포의 제조
형제자매 HLA 일치된 공여자로부터의 단핵-풍부화 세포 분획으로부터 제조된 아폽토시스 세포를 함유하는 초기 아폽토시스 세포 생성물은 제WO 2014/087408호에 상세히 기재되어 있고, 예를 들면, 실시예 부분을 참조하고, 여기서 제WO 2014/087408호 출원은 전문이 본 명세서에 인용된다. 공여자에 대한 자격 기준을 하기를 포함하였다: 성인 남성 또는 여성 공여자, 18 내지 65세 연령; 공여자 및 수용자는 반드시 적어도 HLA A, B, C, 및 DR 좌에서 7/8 HLA 일치를 가져야 하고; 40 kg 초과; HSCT에 대한 공여 이외에 초기 아폽토시스 세포 발생에 있어서 조혈 혈액 단핵 세포를 공여하는 의지. 자격이 있는 공여자는 지역 SOP에 따라 백혈구성분채집술 과정(Cobe® SpectraTM, Gambro BCT, 미국 콜로라도주 레이크우드 소재)을 사용하여 말초 혈액 단핵 수집에 있어서 약 -19일에 임상으로 돌아왔다.
백혈구성분채집술의 약 2.5시간 동안, 혈액 7 L를 처리하고, 단핵 세포를 실온에서 이동 팩으로 수집하였다. 공여자로부터의 농축된 단핵 세포 분획의 추정된 수율은 1.0×1010 세포이고, 추정 용적은 100 내지 140㎖이다. 백혈구성분채집술로부터 야기된 세포 수집에서 단핵 세포 분획의 평균 백분율은 88±8%(65 내지 96% 범위)이었다. 세포 수율은 공여자 가변성에 따라 다양하였다.
HLA 일치된 공여자로부터의 수집된 단핵-풍부화 세포 분획은 세포의 냉동 및 해동 후, 메틸프레드니솔론과의 배양(하기 설명)을 포함하는 다단계 과정을 통해 초기 아폽토시스를 유도하는 순차적인 과정을 거쳤다. 초기 아폽토시스 최종 세포 현탁액은 적어도 40%의 초기 아폽토시스 세포를 함유하였다. 주입용 세포 현탁액은 현행 우수 제조 과정(cGMP)하에 제조하였다. 주입은 HSCT 24 내지 30시간 전 및 제조의 완료 8시간 내에 수행하였다. 세포를 투여까지 2 내지 8℃에서 저장하였다.
메틸프레드니솔론과의 배양
초기 아폽토시스 세포 생성물의 제조 동안, 농축된 단핵 세포 분획을 메틸프레드니솔론 50 ㎍/㎖를 포함하는 아폽토시스 유도 매질 중에서 6시간 동안 배양하였다. 아폽토시스 유도의 끝에, 세포를 세척하고, PBS 중에 재현탁시켰다. 품질 조절 샘플의 수집 후 초기 아폽토시스 세포 생성물의 최종 용적은 300㎖였다. 초기 아폽토시스 세포 최종 생성물의 상청액 중의 메틸프레드니솔론의 잔여량은 3회 작동으로부터 제조된 최종 생성물에 대하여 측정하였다. 메틸프레드니솔론 수치는 역상 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 측정하였다. 분석은 스펙트로랩 아날리티컬 라보라토리(Spectrolab Analytical Laboratory, 이스라엘 레호보트 소재)를 사용하여 정성하고 수행하였다. 초기 아폽토시스 세포 최종 생성물 중의 잔여 메틸 프레드니솔론의 수치는 하기 표 3에 나타낸다.
초기 아폽토시스 최종 세포 생성물 중의 잔여 메틸프레드니솔론
최종 용량의 메틸프레드니솔론의 총량 메틸프레드니솔론의 잔여 농도 코호트 번호
(용량: 세포/kg) 		초기 아폽토시스 최종 생성물 용량의 세포의 총수 작동 번호
(배취(batch) ID 번호)
1.11㎎ 3.7 ㎎/L 1
(3.5×107 세포/kg)		 2.45×109 작동 1
(배취 ID: 0021)
3.3㎎ 11.2 ㎎/L 2
(1.4×108 세포/kg)		 7×109 작동 2
(배취 ID: 0024)
6.57㎎ 21.9 ㎎/L 3
(2.1×108 세포/kg)		 11.34×109 작동 3
(배취 ID: 0022)
최종 생성물 중의 잔여 메틸프레드니솔론 농도의 범위는 초기 아폽토시스 세포 생성물의 가장 낮은 세포 용량에서 3.7 ㎎/L이고, 가장 높은 세포 용량에서 21.9 ㎎/L였다. 최종 용량에서 총 메틸프레드니솔론의 범위는 1.11 내지 6.57㎎이었고, 초기 아폽토시스 용량과 상관관계가 있다. 결과는 가장 높은 코호트(cohort)에 포함된 초기 아폽토시스 세포 생성물 중에 존재하는 메틸프레드니솔론의 양이 골수 이식 동안 일반적인 치료 프로토콜의 부분으로서 환자에게 수용된 메틸프레드니솔론의 용량에 상대적으로 무시할 수 있다는 것을 증명하였다.
제조 공정 설명
건강한, 자격이 있는 공여자로부터의 농축된 단핵 세포 분획 및 혈장의 수집을 성분채집 기계 및 무균, 일회용 키트를 통해 성분채집 센터에서 수행하였다. 세포를 세포 수집 백에 수집하고, 자가 혈장을 혈장 수집 백에 수집하였다. 공여자로부터의 농축된 단핵 세포 분획의 추정된 수율은 250 내지 350㎖ 중의 약 1.5×1010 세포로 예상되었다. 성분채집술 동안 공여자 자가 혈장의 약 400 내지 600㎖를 또한 수집하였다. 수집된 세포 및 혈장을 추가로 가공할 때까지 실온에서 저장하였고, 수집 완료로부터 평균적으로 3 내지 6시간 내에 동결보존을 위하여 제조한다.
냉동 과정:
세포:
냉동 매질을 백 중에 제조하고, 냉동 과정을 cGMP 조건하에 폐쇄계에서 수행하였다.
세포 냉동을 위한 매질을 성분채집일에 신선하게 제조하고, 이를 사전에 미리 차갑게 하고 하기 제형으로 구성하였다:
Mix 1: pH 7.4의, 5% 인간 혈청 알부민 및 10U/㎖ 헤파린으로 접종된 5% 항응고제 시트레이트 덱스트로스(ACD) 포뮬라 A 용액의 주사용 플라스마라이트(PlasmaLyte) A.
Mix 2: pH 7.4의, 10% DMSO 및 10U/㎖ 헤파린으로 접종된 5% ACD 포뮬라 A 용액의 주사용 플라스마라이트 A.
백혈구성분채집 과정의 완료 후, 세포를 10U/㎖ 헤파린으로 접종된 5% ACD 포뮬라 A 용액으로 보충된, 미리 식힌 pH 7.4의 주사용 플라스마라이트 A로 세척하였다. 세척 후, 상청액을 제거하고, 세포 펠렛을 Mix 1과 재현탁시켰다. 그 다음, 세포를 계수하고 생존능에 대하여 분석하였다.
수집 동안 및 냉동 공정 전에 수집된 세포에 대한 세부사항
시험 방법 실험
세포 계수 혈액학 분석기 적어도 109 총 세포
세포 생존능 광학 현미경을 통한 트립판 블루 양성 세포 계수 적어도 85% 트립판 블루 음성 세포
확인/순도 혈액학 분석기 적어도 50% 단핵 세포
세포 계수에 따라, 수집된 세포의 총 수를 계산하였다. 세포 냉동 백의 수를 50 내지 65×106 세포/㎖의 농도에 따라 측정하였다. 그 다음, Mix 1을 추가로 세포에 최종 냉동 용적의 50%의 용적으로 가하였다. 그 다음, 세포를 냉동 백에 옮기고, Mix 2를 각각의 백에 최종 냉동 용적의 50%의 용적으로 가하였다.
각각의 냉동 백을 미리 식힌 냉동 카세트에 놓고, -18(-25)℃ 냉동기로 2시간 동안 옮겼다. -18-(-25)℃에서 2시간 후, 카세트를 -80℃ 냉동기로 추가 2시간 동안 옮겼다. -80℃에서 2시간 후, 제조가 필요할 때까지 카세트를 장기간 저장을 위하여 액체 질소 냉동기로 옮겼다.
혈장:
혈장을 150㎖ 이동 팩 용기에서 저장된 50㎖ 분취로 나누었다("혈장 냉동 백"으로 지정됨).
분취 완료 후, 모든 혈장 냉동 백을 -80℃ 냉동기로 2시간 동안 옮겼다. -80℃에서 2시간 후, 혈장 냉동 백을 -18(-25)℃ 냉동기에서 장기간 저장을 위하여 옮겼다.
아폽토시스 세포(초기 아폽토시스) 제조
공정은 cGMP 조건하에 폐쇄계에서 수행하였다.
제조 공정
매질의 제조:
제조 공정은 모두 백 중에 만들어진 3종의 매질 유형을 포함한다:
(1) 해동 세척 매질
(2) 유도 용액
(3) 락테이트 링거액
해동 세척 매질은 해동 후 세포 세척을 위하여 사용하였다. 해동 세척 매질의 최종 제형은 2mM L-글루타민, 10mM Hepes 및 10U/㎖ 헤파린으로 접종된 5% ACD 포뮬라 A 용액으로 보충된 RPMI 1640이었다. 유도 용액은 아폽토시스 유도를 위하여 사용하였고, 이의 제형은 2mM L-글루타민 및 10mM Hepes, 10% 자가 혈장, 50 ㎍/㎖ 메틸 프레드니솔론 및 10U/㎖ 헤파린으로 접종된 5% ACD 포뮬라 A 용액으로 보충된 RPMI 1640이다.
매질은 사용 전 미리 데워졌다.
해동 및 아폽토시스 유도:
냉동된 세포 농축물을 함유한 냉동 백을 액체 질소 저장 냉동기로부터 옮기고, 35 내지 380C 순환 물 욕조에 함침시켰다. 세포 농축물을 약 120초 동안 부드러운 혼합에 의한 완료까지 해동시켰다. 그 다음, 세포 냉동 백을 물 욕조로부터 제거하고, 70% 이소프로판올 중에 헹구어 소독하고 건조하게 닦아냈다.
해동된 냉동 백을 미리 데워진 해동 세척 매질 백에 연결하고, 해동된 세포를 중력 이동에 의해 이동 팩으로 옮겼다. 이러한 공정을 각각의 추가의 냉동 백에 대하여 반복하였다.
현탁된 해동된 세포를 290 x g에서 10분 동안 25℃에서 원심분리하였다. 끝난 후, 세척된 세포를 조심스럽게 원심분리로부터 제거하고, 상청액을 제거하였다.
세척된 세포를 미리 데워진 유도 용액과 함께 재현?k키고, 균질한 현탁액이 형성될 때까지 부드럽게 혼합하였다.
그 다음, 세포를 계수하고 생존능에 대하여 분석하였다.
공정에서 유도 전 해동되고 수집된 세포에 대한 제어 시험
시험 시험 방법 세부사항
세포 계수 혈액학 분석기 냉동으로부터 -30% ≤ 또는 ≤ +10%가 필요한 샘플 백당 세포 수
세포 생존능 트립판 블루 또는 등가물 적어도 85% 살아있는 세포
세포 계수 및 자격이 있는 대상체에 필요한 세포의 용량을 기반으로, 각각의 백의 용적이 제조자에 의해 결정된 바와 같은 용적 범위 내에 유지되도록 세포 배양 백의 적절한 수를 제조하였다. 세포는 유도 용액의 약 5×106 세포/㎖의 최종 농도를 유발하였고, 그 다음, 세포를 필요한 만큼의 세포 배양 백에 고르게 분산시켰다.
유도 용액과 함꼐 세포를 함유하는 세포 배양 백을 6시간 동안 37℃, 5% CO2에서 배양하였다.
용적 감소 및 최종 생성물 최종 제형:
용적 감소 및 투여 버퍼(락테이트 링거액)에 대한 매질 교환을 LOVO 세포 가공 시스템을 사용하여 자동적으로 수행하였다.
LOVO 장치에 무균, 1회용 키트를 로딩하였다. 투여 버퍼 및 세포 배양 백을 키트에 무균적으로 연결하였다. 아폽토시스 세포를 함유하는 세포 배양 백을 LOVO를 통해 5:1 감소율을 사용하여 처리하고, 최종 제형을 차가운 락테이트 링거액이 있는 전달 백에 최종 용적 450 내지 500㎖로 직접적으로 수행하였다.
방출 및 방출 후 시험을 위한 샘플의 수집
최종 생성물 전달 백의 내용물을 적절하게 혼합하여 균질한 혼합물을 보장하였다. 약 10%를 하기 표 6에 설명된 바와 같은 방출 시험을 위하여 제거하였다:
초기 아폽토시스 세포 약물 생성물 방출 및 방출 후 시험 방법 및 세부사항
시험 방법 세부사항
외양 육안 검사 -백색 내지 담적색 균질한 세포 현탁액
-소량 및 작은 백색 세포 클러스터가 보일 수 있음
세포 계수 혈액학 분석기 140×106±20% 환자 중량
세포 생존능 프로피디움 아이오다이드 음성 세포의 유동 세포측정 분석 적어도 85% 생존 가능
확인: 아폽토시스 아넥신 V 양성, 프로피디움 아이오다이드 음성 세포의 유동 세포측정 분석 적어도 40% 아폽토시스 세포(An+PI-)
그램 염색 음성
무균 직접적인 무균 시험 14일에 음성 성장
엔도톡신 1 EU/㎖ 미만
효능 단핵구 분석(방출 전 시험) 초기 아폽토시스 세포:CD14+의 적어도 하나의 비율에서 HLA-DR >20%의 LPS 상향조절의 저해
확인/순도 CD3, CD19, CD14, CD56, CD15high의 유동 세포측정 분석 -FSC/SSC WBC 100%
-CD3 리포트 결과
-CD19 리포트 결과
-CD14 리포트 결과
-CD56 리포트 결과
-CD15high<5%
최종 생성물 데이터를 표 7에 나타낸다.
엔리벡스( Enlivex)에 의해 제조된 로트로부터의 결과: 세포 계수, 생존능 , 확인/순도 및 아폽토시스
시험 세부사항 단핵 풍부화 분획의 성분채집시 해동시 초기 아폽토시스 세포
시간 0h 		초기 아폽토시스 세포
시간 24h 저장 		초기 아폽토시스 세포
시간 48h 저장
총 세포 계수의 변화
백분율 변화(최소-최대)		 >35.0% 100 90.0
(85.1-95.6)		 70.1
(66.5-74.8)		 68.0
(64.7-69.8)		 67.0
(64.8-68.8)
아폽토시스 세포의 변화
백분율 변화 범위(최소-최대)		 90.0±10.0% 100 97.2
(92.4-99.6)		 95.8
(92.5-98.3)
세포 생존능
PI 배제 백분율
생존 가능한 범위(최소-최대)		 >85.0% 99.8
(99.5-99.9)		 97.2
(95.5-98.4)		 94.0
(93.4-94.5)		 93.1
(91.7-94.9)		 93.3
(92.0-94.9)
강도/순도
세포 표현형의 분석
 CD3(T 세포) 69.3
(63.0-74.0)		 66.5
(60.1-70.1)		 62.3
(60.0-65.4)		 62.8
(60.0-65.5)		 62.9
(59.8-66.0)
CD19(B 세포) 10.8
(7.7-13)		 9.8
(8.6-12.0)		 10.9
(9.0-12.8)		 12.4
(11.5-13.2)		 12.7
(11.9-13.5)
평균(%)
범위
(최소-최대)		 CD14
(단핵구):		 8.9
(3.4-11.0)		 14.0
(8.8-22.1)		 14.3
(9.2-18.5)		 12.1
(8.5-15.6)		 12.5
(8.5-16.4)
CD15 high
(과립구):		 1.2
(0.8-2.3)		 0.46
(0.18-0.69)		 0.18
(0.09-0.3)		 0.06
(0.01-0.11)		 0.04
(0.0-0.08)
CD56(NK) 13.2
(5.6-19.7)		 10.1
(6.6-14.2)		 7.6
(5.1-10.4)		 8.5(7.1-9.9) 8.9
(6.9-10.8)
아폽토시스
(아넥신+PI-)
평균(%)
범위
(최소-최대)		 총 CD3 10.1
(6.6-14.2)		 ND 55.3
(52.4-60.7)		 44.8(38.0-62.2) 50.9
(47.4-56.5)		 38.7(37.9-39.5) 56.7(54.1-60.4) 53.8(50.9-56.7) 59.7
(57.7-63.3)		 57.2(56.9-57.6)
CD19 53.8(27.8-83.8) 47.2(40.7-54.0) 51.4(45.0-57.7) 49.5(45.0-57.7)
CD14 98.9(97.5-100) 98.5(97.9-99.0) 99.1(99.0-99.2) 98.1(97.5-98.7)
CD56 67.5(51.7-93.2) 65.8(49.5-82.0) 65.2(61.2-69.2) 58.5(50.5-66.4)
주입용 방출 생성물:
최종 생성물이 방출 시험을 통과한 후, 최종 초기 아폽토시스 세포 생성물을 2 내지 8℃에서 저장하고, 환자 투여를 위하여 임상 센터로 이송하였다. 생성물은 200 미크론 이상의 필터가 있는 주입 세트를 사용하여 투여될 것이다. 예비 안정성 데이터를 기반으로, 최종 초기 아폽토시스 세포 생성물에 대한 만료 시간은 제조 시간으로부터 48시간이었다.
실시예 2: GvHD 백혈병/림프종 모델에서 혼주된 아폽토시스 세포 제제의 사용
하기 예비 작업에서, GvHD 백혈병/림프종 모델에서 동일한 주입의 효과를 시험하였다. 골수 이식(BMT)을 받은 마우스에서 급성 GvHD의 예방을 위하여 조사된 다수의 공여자 단일 아폽토시스 세포 주입(혼주된 단핵 조사된 아폽토시스 세포 제제)의 안전성 및 효능을 시험하였다. 이러한 모델에서, BMT는 조사된 마우스(80 내지 100%)를 구하였다.
이식편대백혈병(GvL) 효과의 가능한 손실에 관한 문제는 이러한 효과가 GVHD의 중증도와 상관관계가 있는 것으로 확인되었기 때문에 높은 등급 aGVHD를 잠재적으로 회피하는 모든 성공적인 치료에서 증가한다.
방법
제조를 4명의 공여자로부터 동시에 수행하는 것을 제외하고, 아폽토시스 세포를 상기 실시예 1에 따라 제조하였다. 4명의 공여자로부터의 제조 후, 세포 제제를 마지막 단계 (조사 전)에서 조합하고, 직후 조사하고, 조사 직후 주사하였다. 조사는 25 Gy에서 행하였다.
결과
도 1 및 2에 나타낸 2개의 그래프는 생존 및 중량 손실 둘 다에 대한, 다수의 개별적인 공여자(삼각형)로부터의 아폽토시스 세포의 단일 주사의 분명한 효과(p<0.01)를 나타낸다. 도 1은 다수의 개별적인 공여자로부터의 단일 용량 조사된 아폽토시스 세포로 처리된 GvHD 마우스 모델에서 카플란-마이어 생존 곡선이고, 여기서 생존은 유의미하게 개선되었다. 도 2는 도 1의 발견에 따르고 이와 상관관계가 있는 2개의 비교군의 중량 손실의 백분율이다.
요약하면, 다수의-공여자 조사된 아폽토시스 세포의 단일 주입은 성공적으로 유의미하게 GvHD의 마우스 모델에서 기대 수명을 개선시켰다.
실시예 3: 다수의 개별적인 공여자로부터의 아폽토시스 세포에 대한 안정성 기준
이 연구의 목적은 비조사된 HLA 일치된 아폽토시스 세포(Mevorach et al.(2014) Biology of Blood and Marrow Transplantation 20(1): 58-65; Mevorach et al.(2015) Biology of Blood and Marrow Transplantation 21(2): S339-S340)에 대한 비교가능성 연구로 다수의 개별적인 공여자로부터의 아폽토시스 세포에 대한 안정성 기준을 개발하는 것이다.
아폽토시스 세포 최종 생성물 제제를 2 내지 8℃에서 8, 24, 48, 및 60시간 저장 후 각각의 시간점에서 샘플링하여 세포 수, 생존능, 아폽토시스 표현형 및 효능에 대하여 평가할 것이다. 아폽토시스 세포 최종 생성물 로트는 표준 작동 과정(SOP)(실시예 1; 실시예 5) 및 배취 기록(BR; 즉, 특정한 제조 과정)에 따라 제조할 것이다. 효능 평가를 위하여, 초기 아폽토시스 세포 제제 최종 생성물 로트의 샘플을 미성숙 수지상 세포(시간점 0 내지 24h) 또는 단핵구(시간점 0 내지 6)에서 MHC-II 발현의 리포다당류(LPS) 유도된 상향조절의 저해에 대하여 시험할 것이고, SOP에 따라 수행하고 BR에 기록할 것이다. 이들 일련의 시험을 다수의 개별적인 공여자 및 단일 공여자로부터 각각 유래된 제제인 혼주된 및 비혼주된 생성물에 대하여 수행할 것이다.
추가로, CD3(T 세포), CD19(B 세포), CD14(단핵구), CD15high(과립구) 및 CD56(NK 세포)의 유동 세포측정 분석을 기록할 것이다. 이러한 연구의 목적은 결과의 좁은 범위와의 일관성을 증명하는 것이다. 예비 결과는 이들 목표와 일치하고, SOP로부터의 일탈이 기록되지 않고, 기술적 문제가 보고되지 않는다. 그러나, 효과적인 치료의 범위 및 안정성을 결론 내기 위하여 추가로 연구가 필요하다. 예비 결과는 이들 파라미터(실시예 6 표 3)에서 등가를 보여준다. 추가로, 단일 공여자 안정성 연구는 적어도 48시간 기간을 통해 안정성을 보여주었다(실시예 5; 세포 제제).
실시예 4: 급성 이식편대숙주 질환의 예방으로서 다수의 공여자 조사된 아폽토시스 세포의 안전성 및 효능
목적: 동종이계 HLA 일치된 조혈 줄기 세포 이식을 받은 인간 백혈구 항원-일치된, 관련된 및 관련되지 않은 환자에서 조혈 악성종양에서 이식편대숙주 질환의 예방에 있어서 다수의 일치되지 않은 공여자로부터의 조사된 아폽토시스 세포의 단일 용량 투여의 안전성, 내성 및 예비 효능을 평가하는 단계 1/2a, 다중심, 표지 개방 연구
1차 목적: 다수의 공여자 조사된 아폽토시스 세포 치료의 안전성 및 내성을 측정하는 것.
2차 목적: 조혈 줄기 세포 이식(HSCT)를 받도록 예정된 조혈 악성종양이 있는 환자에서 급성 GVHD(aGVHD)에 대한 예방 척도로서 다수의 개별적인 공여자로부터의 조사된 아폽토시스 세포의 효능을 측정하는 것. 이러한 연구의 목적을 위하여, HSCT는 골수 이식(BMT) 또는 말초 혈액 줄기 세포 이식(PBSCT)일 수 있다.
치료적 징후: 인간 백혈구 항원(HLA)-일치된, 관련된 및 관련되지 않은 환자에서 조혈 악성종양에서 이식-후 이식편대숙주 질환(GVHD)
연구 디자인: 이는 완전한 골수제거 또는 감소된 강도 골수제거 컨디셔닝 섭생법 후, HLA 일치된, 관련된 또는 관련되지 않은 공여자로부터의 HSCT(골수 이식 또는 말초 혈액 줄기 세포 이식)를 받도록 예정된 조혈 악성종양이 진단된 환자에서 개방 표지 연구, 다중심, 단계-1/2a 연구이다.
수용자 환자에 의한 사전 고지에 의한 동의에 서명, 컨디셔닝 섭생법 개시 전 공여자 스크리닝 기간 및 세포 수집 후, 자격이 있는 수용자 환자는 등록할 것이다(예방적 치료 및 HSCT 이식 전에 정맥내(IV) 주사 12 내지 36시간 수용하는 1:1 비율의 관련 대 비관련 이식 공여자에 의해 만족됨)
연구 암(Arm): 인산염 버퍼 용액(PBS) 중의 조사된 초기 아폽토시스 세포/kg 체중의 다수의 개별적인 공여자로부터의 140×106±20% 세포/kg의 단일 용량.
모든 환자는 또한 기관 치료 기준(SOC) 면역억제 섭생법으로 치료될 것이다: 감소된 강도에 있어서 완전한 골수제거 및 골수기능억제/사이클로스포린 또는 마이코페놀레이트/타크롤리누스에 대한 사이클로스포린/메토트렉세이트 또는 타크롤리무스/메토트렉세이트. 환자는 의학적 징후에 따라 입원할 것이다.
환자는 2차 효능 종점에 있어서 180일 동안 및 1차 안전성 및 3차 효능 종점에 있어서 1년 동안 추적될 것이다. 이러한 연구에 참여하는 환자의 방문수는 이들의 상태에서 환자에 대한 이들의 습관과 비슷할 것이다. 공여자에 있어서, 연구 특이적 방문은 스크리닝 기간 동안 성분채집술 과정을 위한 것일 것이다.
이들 환자는 많은 근본적인 의학적 병태를 갖고, aGVHD와 양립할 수 있는 증상을 경험할 수 있기 때문에, GvHD 예방을 위한 아폽토시스 세포를 사용하는 이전 단계 1-2a 연구(Mevorach et al. 2014) Biology of Blood and Marrow Transplantation 20(1): 58-65) Single Infusion of Donor Mononuclear Early Apoptotic Cells as Prophylaxis for Graft-versus-Host Disease in Myeloablative HLA-Matched Allogeneic Bone Marrow Transplantation: A Phase Vila Clinical Trial. BBMT 20(1)58-65)로부터 존재하는 기본 데이터에도 불구하고 독성이 아폽토시스 세포에 관한 것인지 아닌지를 절대적으로 측정하는 것이 어려울 수 있다.
데이터 안전성 모니터링 보드(DSMB)는 안전성 문제가 사전에 일어나지 않았음을 추정하는 예정된 중간 분석 시간(180일)을 포함하는 DSMB 헌장에 특정된 바를 만족시킬 것이다.
연구 과정:
연구는 스크리닝, 치료 및 추적 기간을 포함할 것이다.
1. 스크리닝 기간(-60일 내지 -2일)
잠재적인 수용자 환자는 임의의 연구 관련 과정을 수행하기 전에 사전에 고지된 동의에 서명할 것이다. 승인 전 표준 평가는 이식 센터에 의해 스크리닝 기간 동안 공여자에 대하여 수행될 것이고, 일반적으로 인구학적 데이터, 병력, HLA 일치 상태 확인(일치가 필요하지 않음), 신체 검사, 신장 및 체중, 생명 징후, 임신 검사(모든 여성), 혈액학, 혈액 화학, 감염성 질환 스크린, ECG 및 검뇨를 포함한다.
수용자(연구 환자)는 스크리닝 기간 동안 하기 평가를 받을 것이다: 인구학적 데이터, 병력, 카르노프스키 수행 상태, HLA 일치 확인, 신체 검사, 신장 및 체중, 생명 징후, 임신 검사(모든 여성), ECG, 폐 기능 검사, 혈액학, 혈액 화학, 응고 마커, 감염성 질환 스크린, 및 검뇨.
초기 스크리닝 평가 후, 수용자가 연구에 참여할 자격이 있는 경우, 수용자 환자는 다수의 공여자 아폽토시스 세포의 140×106±20% 세포/kg의 단일 IV 주입을 수용하는 컨디셔닝의 제1 일에 등록될 것이다. 아폽토시스 세포 주입 전일 또는 그 날에 완료되는 컨디셔닝 섭생법은 -1 연구일로 예정된다.
아폽토시스 세포 투여량이 각각의 수용자 환자 및 추정된 성분채집술 수집 수에 대하여 계산될 것이고, 공여자의 수는 따라서 결정될 것이다.
주변 줄기 세포 이식 공여자의 경우: -6일 내지 -1일에, 공여자는 전구 세포를 이동시키는 G-CSF의 1일 1회 이상 주사를 제공받고, 0일에 이식을 위한 공여자 조혈 혈액 줄기 세포 제조를 위한 성분채집술을 받을 것이다. 골수 이식을 위한 조혈 혈액 줄기 세포의 제조는 숙련된 병원 직원에 의해 센터 표준 실시에 따라 수행될 것이다. HSCT에 대한 조혈 혈액 줄기 세포는 투여 전 조작되지 않거나 T 세포-감손되지 않을 것이다.
골수 이식 공여자의 경우: 골수는 센터 표준 실시에 따라 수확되고 제조될 것이고, 달리 조작되지 않을 것이다.
2. 치료일(-1일)
-1일(HSCT 12-36시간 전)에, 자격이 있는 환자는 다수의 개별적인 공여자 조사된 초기 아폽토시스 세포의 140×106±20% 세포/kg의 단일 IV 주입을 수용할 것이다. 생명 징후는 주입 동안 매 시간마다, 그 후 처음 24시간 동안 4시간마다 모니터링될 것이다. 치료-관련된 AE는 주입 직후 평가될 것이다.
0일에, 환자는 지역 기관 지침에 따라 조혈 줄기 세포 이식을 받을 것이다.
3. 단기간 추적 기간(0일 내지 180일)
환자는 1차 종점 안전성 및 내성 및 2차 및 3차 종점의 평가를 위하여 연구 180일까지 추적될 것이다: aGVHD 등급 II 내지 IV(문헌[Przepiorka et al]을 기반으로 한 "변형된 글룩스버그(modified Glucksberg)" 합의의 누적 발생률, 임의의 등급 및 높은 등급 aGVHD의 누적 발생률), 즉, aGVHD의 발달까지의 시간, 등급 II-IV; GVHD의 임의의 전신 치료, 및 cGVHD의 발달).
단기간 추적 방문은 이식을 위해 입원한 동안(일반적으로 적어도 -1 내지 +14일 또는 그 이상) 매일일 것이고, 퇴원 후 처음 7주 동안 매주 방문: +7, +14, +21. +28, +35, +42일, 및 그 다음, 60, 100, 140, 및 180일일 것이다. 방문 윈도우는 각각의 매주 방문(처음 7주) 동안 ±5일일 것이고, 후속적인 180일까지의 추적 기간 동안 2주에 1회 또는 그 이상의 방문 동안 ±5일 것이다.
혈액 샘플은 1, 3, 7, +7, +28, +42, 60, 100, 140 및 180일에 수득될 것이고, 생착, 면역적 회복, 혈장 및 혈청 바이오마커("Michigan") 및 세포 하위집단의 서류화를 위하여 시험될 것이다.
4. 장기간 추적 기간(181일 내지 365일/1년)
환자는 더 긴 기간 2차 종점에 대하여 1년 동안 HSCT-후 추적될 것이다: 비재발 사망률 및 전체 생존(OS), 재발 발생률, 백혈병 없이 생존(LFS) 및 만성 GVHD. 적어도 2개의 장기간 추적 방문이 있을 것이고, 마지막 것은 HSCT 후 12±1개월일 것이다.
연구 기간: 각각의 참여 환자에 있어서, 연구 기간은 하기와 같이 14개월 이하일 것이다:
A. 스크리닝 60일(2개월)까지
B. 치료 1일
C. 추적 하기로 이루어진 365일(12개월)
D. 단기간 180일
E. 장기간 +180일
연구 집단: 센터 표준 실시에 따른 골수제거 또는 감소된 강도 컨디셔닝 섭생법 후, 적어도 15명의 관련되지 않은 공여자가 있는 HSCT(골수 이식 또는 말초 혈액 줄기 세포 이식)를 받도록 예정된 혈액 악성종양으로 진단된 총 25명의 환자가 이러한 연구에 포함될 것이고, 과거 대조군과 비교될 것이다.
포함/제외 기준:
수용자 환자 제외 기준
1. 환자, 연령 > 18, 악성종양 후 동종이계 HSCT에 대하여 자격이 있는 자:
A. 완전한 관해(임의의 관해) 또는 이를 초과하지만 골수에서 형태학적으로 5% 미만의 아세포가 있는 급성 골수성 또는 미분화되거나 또는 이중표현형, 백혈병.
B. 골수이형성증후군(MDS)으로부터 진화된 경우, 완전한 관해의 급성 골수성 백혈병(AML)(급성 골수성 백혈병 진단 적어도 3개월 전에 MDS 진단이 기록되어야 한다). 또는 진성다혈구증 또는 특발성 혈소판증가증로부터 진화됨.
C. 완전한 관해(임의의 관해)가 있고 골수에서 형태학적으로 5% 미만의 아세포가 있는 급성 림프아구 백혈병(ALL).
D. 만성 또는 가속기의 만성 골수성 백혈병(CML).
E. 골수이형성증후군 - 다계열 형성장애가 있는 내화성 혈구감소증(RCMD), RA(난치성 빈혈), 환상 철아세포가 있는 RA(RARS; 모두 5% 미만의 아세포), 과량의 아세포가 있는 RA(RAEB; 5 내지 20% 아세포).
이식 공여자 및 수용자 환자는 적어도 HLA A, B, C, DQ, 및 DR 좌에서 8/8 HLA 일치를 가져야 하고, 항원 또는 대립유전자 미스매치가 없어야 한다. 그러나 아폽토시스 세포 형성에 대한 백혈구의 공여자(들)는 HLA 일치에 의해 제한되지 않는다.
스크리닝 방문의 시간에 적어도 70%의 성능 상태 점수(성인에 대하여 카르노프스키 및 16세 미만의 연령의 수용자에 대하여 란스키).
컨디셔닝의 개시 4주 내에 성인에서 심장 좌심실 주사 분획 ≥ 40%; 심장 질환의 안트라사이클린 노출 또는 병력 전인 경우 필요한 MUGA 스캔 또는 심장 ECHO.
60% 이상의 DLCO1, FEV1(강제 호기량) 및 FVC(강제 폐활량)가 예상되는 폐 기능 검사.
실내 공기에서 적어도 90%의 산호 포화도.
환자는 반드시 하기 정의된 바와 같은 적절한 장기 기능을 가져야 한다:
A. AST(SGOT)/ALT(SGPT) < 3 x 정상의 상한(ULN).
B. 혈청 크레아티닌 < 2.0 ㎎/dL(성인, 16세 초과) 또는 < 0.8(1 내지 2세), < 1(3 내지 4세), < 1.2(5 내지 9세), < 1.6(10 내지 13세), 및 1.8(14 내지 15세).
C. 길버트병 또는 용혈으로 인한 것이 아닌 한, 혈청 빌리루빈 < 3 ㎎/dL.
환자, 또는 소수의 경우 보호자에 의해 서명된 독립적으로 연구에 참여하는 사전 고지에 의한 동의.
연구의 요구사항에 따르는 능력.
4주의 기간 동안(-1일부터), 여성 및 남성은 둘 다 하기에 동의하여야 한다:
A. BMT 관련 제한이 존재하는 경우, 처음 1개월 또는 그 이상 동안 허용 가능한 피임 방법의 사용 또는 수술적 피임.
B. 임신 가능성과 관계 없이 음성 임신 검사를 하는 것.
수용자 환자 제외 기준
제외 기준에서 특정되지 않은 HSCT에 자격이 있는 모든 질환.
스크리닝 방문 30일 내에 연구 시험에의 참여.
공격적인 또는 불량하게 제어된 악성종양을 가짐.
BMT 계획이 T-세포 결손 동종이식을 포함하는 경우.
이식 후 GVHD의 예방을 위한 면역억제 섭생법 또는 고용량 사이클로포스파미드 요법의 부분으로서 BMT 계획이 항흉선세포 글로불린(ATG) 또는 알렘투주맙을 포함하는 경우.
스크리닝 방문 2주 내에 패혈증, 저산소혈증이 있는 폐렴, 집요한 균혈증, 또는 수막염을 포함하는 제어되지 않은 감염.
HBV 또는 HCV이 있는 현재 공지된 활성 급성 또는 만성 감염.
공지된 인간 면역결핍 바이러스(HTV) 감염.
산소호흡기 도움이 필요한 중증 또는 증상적 제한성 또는 폐쇄성 폐 질환 또는 호흡기 부전이 있는 환자.
연구에 참여를 위태롭게 할 수 있는 다른 동시적인 중증 및/또는 제어되지 않는 의학적 상태(즉, 활성 감염, 제어되지 않은 당뇨병, 제어되지 않은 노혈압, 출혈성 심부전, 불안정 협심증, 심실 부정맥, 활성 허혈성 심장 질환, 6개월 이내 심근 경색, 만성 간 또는 신장 질환, 활성 상부 위장관 궤양)가 있는 환자.
연구 생성물 효과의 평가를 방해하는 취약한 임의의 만성 또는 급성 상태.
연구자의 의견으로, 연구 수행을 방해하도록 취약한 임의의 형태의 약물 남용(약물 또는 알코올 남용을 포함), 정신 질환 또는 임의의 만성 상태.
줄기 세포 이식의 장기 동종이식 또는 이전 병력(오직 동종이계만).
임신 가능성이 있는 여성의 수유.
연구 동안 순응하지 않거나 협조적이지 않을 가능성이 있는 환자.
연구 생성물 경로 및 투여 제형
아폽토시스 세포는 HSCT 12 내지 36시간 전 조사된 다수의 공여자 아폽토시스 세포 생성물 140×106±20% 세포/kg의 IV 주입으로서 투여될 것이다.
아폽토시스 세포는 다수의 개별적인 공여자 아폽토시스 세포로 구성된 세포 기반 치료제이다. 생성물은 적어도 40% 초기 아폽토시스 세포가 있는 액체 현탁액 형태로 동종이계 공여자 단핵-풍부화 세포를 함유한다. 현탁액은 다수의 개별적인 공여자로부터 GMP 조절에 따른 PBS 용액과 함께 제조되고, 이는 주입까지 2 내지 8℃에서 저장되어야 한다. 최종 생성물은 불투명 이송 팩에 총 용적 300 내지 600mL일 것이고, 제조 후 25 Gy로 조사될 것이다. 연구 생성물은 제조 공정 완료 48시간 내에 환자에게 투여되어야 한다.
안전성 결과/효능 종점/결과 측정
1차:
안전성 및 내성 종점은 180일 및 360일(1년)에 부작용, 수반 약제 및 안전성 실험을 측정하는 생착 및 신체 검사까지의 시간을 포함한다. 추가로, 조사된 혼주된 아폽토시스 세포 제제가 시험관내 및 생체내 세포 증식이 부족 및 생체내 활성의 부족을 나타낼 것으로 예상된다. 이러한 나타냄은 혼주된 아폽토시스 세포 제제를 사용하기에 안전한 것으로 확인시켜준다.
2차:
A. 180일에 문헌[Przepiorka et al., 1995]을 기반으로 한 "변형된 글룩스버그" 합의를 사용하는 aGVHD 등급 II-IV의 누적 발생률
B. 1년 비재발 사망률 및 전체 생존(OS)
C. 1년 재발 발생률
D. 1년 백혈병 없이 생존(LFS)
E. 처음 180일 내에 aGVFID의 최대 등급
F. 등급 III-IV aGVFID의 누적 발생률
G. 180 및 360일(1년)에 문헌[Jagasia et al., 2015]에 따른 만성 GVHD의 발생률
H. 20일 내지 180일에 aGvUD 치료를 위한 코르티코스테로이드(사용 또는 비사용 둘 다, 누적 투여량)를 포함한 임의의 "전신 치료"
I. +28, 100, 180 및 360일(1년)에 T, B, NEC, 및 단핵구에 관한 면역 재구성 및 기능
J. 180일 및 1년을 통해 주요 감염 비율(폐 침투, CMV 재활성화 및 입원이 요구되는 임의의 다른 감염을 포함)
3차/탐사:
A. 위험이 있는 총 일수, 또는 살아있고 병원 밖의 총 일수에 대한 입원 일수의 백분율. 또는 이식 후 처음 퇴원까지의 총 입원 일수.
B. 장기 특이적 GVHD
C. 180일에 T regs, CD4 Tcon, CD8, NK 및 B 세포 수치
통계적 분석:
연구 결과는 비교할만한 기본선 특징이 있는 개체의 과거 대조군에 비교될 것이다.
기술 통계학은 결과 척도 및 기준선 특징을 요약하는데 사용될 것이다. 이러한 분석에서 모든 이용 가능한 데이터는 임의의 손실 데이터에 대한 전가 없이 나타낼 것이다. 대상체는 철회 또는 연구 완료 또는 사망의 점까지 이용 가능한 데이터에 기여할 것이다. 기술 통계학, 예를 들면, 평균, 중앙값, 표준 편차, 최소 및 최대는 연속하는 변수를 요약하는데 사용될 것이다. 아폽토시스 세포 주입을 수용하는 모든 대상체는 안전성 분석에 포함될 것이다. HSCT를 수용하는 대상체는 또한 효능 분석에 포함될 것이다. 이러한 연구가 현실적으로 탐사됨으로써, ad hoc 분석이 계획된다.
샘플 크기 고려
총 25명의 환자는 등록되는 적어도 15명의 일치된 관련되지 않은 환자를 포함할 것이다. 아폽토시스 세포(활성은 모두, GVHD 예방 섭생법에 대한 만족, 및 관련 대 관련되지 않은 이식 공여자에게 제공될 것이다).
집단 분석 정의
모든 효능 분석은 치료 의향(Intent-to-Treat)(ITT) 집단에 대하여 수행될 것이고, 적절한 과거 대조군과 비교될 것이다. 안전성 집단은 연구 약물의 용량을 수용하는 모든 환자로서 정의될 것이다.
통계 방법
환자, 질환, 및 이식 특징은 적절한 경우 빈도 및 백분율 또는 중앙값(범위)을 사용하여 기재될 것이다.
안전성 분석
기술 통계학은 연구 치료 주입과 HSCT 과정(24 내지 30시간 창) 사이에 보고된 AEs에 집중된 안전성 결과를 요약하는데 사용될 것이다. 샘플 크기 조절을 포함하여 연구의 수행에서의 변경은 DSMB 리뷰의 결과로서 개시되지 않을 것이다. 이와 같이, 중간 분석의 결과로서 전체 유형 I 오류에서 페널티 조절이 필요하지 않을 것이다.
2차 종점 분석
등급 II 내지 IV aGVHD는 경쟁 사건으로서 aGVHD 전에 사망이 있는 누적 발생률 추정치를 사용하여 기재될 것이다.
호중구 및 혈소판 회복, 등급 III 내지 IV aGVHD, 만성 GVHD, 감염, 재발, 및 이식 관련 사망률은 TRM에 대하여 경쟁 사건으로서 재발 및 모든 것에 있어서 경쟁 사건으로서 사망이 있는 누적 발생률을 사용하여 기재될 것이다. 전체 생존 및 백혈병이 없는 생존은 카플란-마이어 추정치를 사용하여 기재될 것이다. 처음 180일 내에 aGVHD의 최대 등급 및 180일에 스테로이드에 대한 요구는 각각 만-휘트니(Mann-Whitney) U-시험 및 치-스퀘어(chi-square) 시험을 사용하여 빈도 및 백분율을 사용하여 기재될 것이다. 각각의 세포 하위세트의 면역 회복 및 TREG는 중앙값 및 범위 만-휘트니 시험을 사용하여 각각의 시간점에서 기재될 것이다.
실시예 5: GvHD에서 혼주된 아폽토시스 세포 제제 대 단일 공여자 아폽토시스 세포 제제의 비교
백혈병/림프종 모델
목적: GvHD의 뮤린 모델에서 GvHD의 중증도에 대한 단일 공여자로부터 수득된 인간 초기 아폽토시스 세포의 유리한 임상적 효과를 GvHD의 뮤린 모델에서 GvHD의 중증도에 대한 다수의 개별적인 공여자로부터 수득된 인간 초기 아폽토시스 세포의, 만약에 있다면, 임상적 효과에 대하여 비교하고, 여기서 다수의 개별적인 공여자는 HLA 일치하지 않는 이종 공여자를 나타낸다.
상기 실시예 2는 다수의 개별적인 공여자로부터 혼주된 조사된 아폽토시스 세포의 유리한 효과를 보여준다. 도 1 및 도 2에 도시된 결과는 놀랍게도 숙련가가 일치되지 않은 세포의 다수의 공급원이 세포의 항원성의 증가된 다양성을 가질 수 있다는 것을 인식할 수 있기 때문에 따라서 임상적 효과에서 극적인 감소가 예상될 것이라는 것이다. 예상외로, GvHD 중증도의 감소에 대한 초기 아폽토시스 세포의 공지된, 유리한 효과 및 그러므로 사망률까지의 일수의 연장은 알려진 대로 혼주된 다수의 일치되지 않은 공급원 세포로 인한 증가된 항원성을 가질 것인 혼주된 일치되지 않은 초기 아폽토시스 세포에 의해 또한 완화되었다(도 1).
추가의 목적은 조사된 초기 아폽토시스 세포와 비조사된 아폽토시스 세포의 사용의 차이가 존재하는 경우를 이해하는 것이었다.
숙련가는 일치되지 않은, 조사된 세포가 APC 메커니즘에 의해, 그리고 따라서 이들이 주입된 숙주의 T-세포에 의해 인식되는 바와 같은 이들의 항원성 프로파일을 유지한다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 세포의 이종 일치되지 않은 집단을 혼주시키는 경우 문제는 혼주된 집단의 혼주된, 혼합된-세포 림프 반응인 개별 집단 사이의 교차반응성, 또는 세포, 또는 임의의 이들의 조합을 감소시키거나 제거할 수 있는 혼주된 집단 사이의 T-세포 면역 반응에 포함하였다.
방법
마우스 모델: 일치하지 않는 GVHD 모델에서 암컷 7 내지 9주령의 BALB/c 마우스(H-2d)를 수용자로서 사용하고, 암컷 8 내지 9주령의 C57BL/6 마우스(H-2)를 공여자로서 사용하였다. 수용자는 골수 및 비장세포 이식 24시간 전에 850 cGy에서 전체 신체 조사되었다. 공여자 골수 세포는 골수 재구성을 위하여 사용하였다. 골수 세포를 RPMI 1640로 대퇴부 및 경골로부터 추출하였다. 적혈구를 용해시킨 다음, 세포를 세척하고 PBS로 재현탁시켰다. 트립판 블루 염료 배제를 사용하여 생존능을 평가하였다(90% 초과의 생존능). 공여자 비장세포를 GVHD의 유도를 위하여 사용하였다. 비장을 제거하고, 균질화시키고, 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 적혈구를 용해시키고, 비장세포를 PBS와 재현탁시켰다. 적어도 90% 생존 가능한 세포를 트립판 블루 염료를 사용하여 평가하였다.
초기 아폽토시스 세포: 아폽토시스 세포를 실시예 1과 유사한 건강한 공여자로부터의 단핵-풍부화 세포 분획 성분채집으로부터 제조하였다. 간략하게:
단핵 세포(MNC)의 농축된 분획을 건강한, 자격이 있는 공여자로부터 백혈구성분채집술 과정을 통해 수득하였다. 자가 혈장 400 내지 600㎖ 이외에, Spectra OPTIA® 성분채집술 시스템을 통해 세포를 혈액 12 리터로부터 수집하였다. 공여자로부터 농축된 단핵 세포 분획의 추정된 수율은 약 1.2 내지 1.5×1010 세포인 것으로 예상되었다. 백혈구성분채집술 과정 전에, 공여자를 시험하고 하기 바이러스 벡터에 음성인지를 확인한다:
1. 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 1형 및 2형;
2. B형 간염 바이러스(HBV);
3. C형 간염 바이러스(HCV);
4. 사이토메갈로바이러스(CMV);
5. 트레포네마 팔라듐(매독);
6. 인간 T-림프친화성 바이러스(HTLV), I형 및 II형.
세포 수집 후, 세포를 RPMI로 세척하고 하기와 같이 냉동시켰다. 냉동 제형을 pH 7.4, 10% DMSO, 5% 인간 혈청 알부민 및 10U/㎖ 헤파린으로 접종된 5% 항응고제 시트레이트 덱스트로스 용액을 갖는 주사용 플라스마라이트 A로 구성되었다.
냉동 매질을 백 중에 제조하고, 냉동 과정을 폐쇄계에서 cGMP 조건하에 수행하였다.
백혈구성분채집술 과정 완료 후, 농축된 MNC 분획은 플라스마라이트 A로 세척하고, 얼음처럼 차가운 냉동 매질에 50 내지 65×106 세포/㎖ 농도로 재현탁시켰다. 그 다음, 세포를 냉동 백으로 옮기고, 백을 미리 식힌 알루미늄 카세트로 옮기고, 카세트를 즉시 -18-(-25)℃로 2시간 동안 옮겼다.
2시간 후, 카세트를 -80℃로 추가 2시간 동안 옮긴 다음, 액체 질소(-135℃ 초과) 중에 장기간 저장하였다.
자가 혈장을 50 gr 분취액으로 나누었다. 혈장 분취액을 -80℃로 2시간 동안 옮긴 다음, -18-(-25)℃에서 장기간 저장하였다.
아폽토시스 유도 세포를 해동하고, 10mM Hepes 버퍼, 2mM L-글루타민 및 10U/㎖ 헤파린으로 접종된 5% 항응고제 시트레이트 덱스트로스 용액을 함유하는 미리 데워진 RPMI1640로 세척하였다. 상청액 추출 세포를 10% 자가 혈장 및 50 ㎍/㎖ 메틸 프레드니솔론 및 10U/㎖ 헤파린으로 접종된 5% 항응고제 시트레이트 덱스트로스 용액이 첨가된 10mM Hepes, 2mM L-글루타민으로 보충된 RPMI 1640 중에 5×106/㎖의 최종 농도로 재현탁시켰다. 그 다음, 세포를 세포 배양 백으로 옮기고, 습윤화된 인큐베이터 37℃, 5% CO2에서 6시간 동안 배양하여 아폽토시스를 안정화시켰다.
배양 세포를 수확한 후, PBS로 세척하고, PBS 중에 재현탁시켰다.
초기 아폽토시스 세포 생성물을 하나의 단일 공여자로부터 제조하거나 10명의 상이한 개별적인 공여자와 조합하고, 이러한 경우 세포를 조사 직전에 조합하였다. 다수의 공여자 생성물 중에 성분들, 예를 들면, 살아있는 비아폽토시스 세포들 사이에서 개입이 발생할 수 있기 때문에, 초기 아폽토시스 세포 생성물을 다시 나누었고, 생체내 시험되는 초기 아폽토시스 세포의 샘플을 투여 전에(하기 샘플 F) 2500 cGy로 조사하고, 투여까지 2 내지 8℃에서 저장하였다. 하기 실시예 6의 표 3은 아넥신 V 양성/프로피디움 아이오다이드 음성 비율 및 초기 아폽토시스 세포 생성물의 세포 표면 마커의 세부 사항을 나타내고, 이는 마우스에 투여된 아폽토시스 세포의 일관성이 유지된다는 것을 확립한다. 최종 생성물은 48시간 동안 2 내지 8℃에서 안정하였다.
이식일에, 하기 실험 디자인에 따라 마우스에 5×106 골수 세포, 3×106 비장세포 및 30×106 단일 또는 다수의 공여자 초기 아폽토시스 세포 생성물을 제공하였다:
A. 조사 대조군
B. 재구성 대조군 - 조사 + 골수 이식(BM)
C. GVHD 대조군 - 조사 + 골수 및 비장세포 이식
D. 단일 공여자, 조사된 - 조사 + 골수 및 비장세포 이식 + 단일 공여자로부터의 조사된 초기 아폽토시스 세포 생성물
E. 단일 공여자, 비조사된 - 조사 + 골수 및 비장세포 이식 + 단일 공여자로부터의 비조사된 초기 아폽토시스 세포 생성물
F. 다수의 공여자, 조사된 - 조사 + 골수 및 비장세포 이식 + 다수의 공여자로부터의 조사된 초기 아폽토시스 세포 생성물
G. 다수의 공여자, 비조사된 - 조사 + 골수 및 비장세포 이식 + 다수의 개별적인 공여자로부터의 비조사된 초기 아폽토시스 세포 생성물.
모니터링 - 이식된 마우스를 태깅하고 생존을 모니터링하였다. 체중을 실험 첫 2주 동안 2일 마다, 그 다음, 매일 평가하였다. 초기 체중으로부터 35% 손실이 1차 종점에서 측정되었고, 마우스를 희생시키고, 생존 곡선을 따라서 업데이트하였다. 체중 결과를 실시예 3 도 2에서 관찰된 것들과 비교하였다.
GVHD의 중증도를 5개의 임상적 파라미터: 중량 손실, 자세(구부림), 활성, 털 감촉 및 피부 완결성을 포함하는 공지된 점수화 시스템(Cooke KR, et al. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation. I. The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 1996; 8:3230-3239)을 사용하여 평가하였다. 마우스를 평가하고 각 기준에 대하여 0 내지 2로 등급화하였다. 5개의 임상 점수의 요약에 의해 임상 지표값이 발생하였다(지표 숫자는 GVHD의 중증도와 함께 증가한다).
결과
마우스의 상이한 집단의 생존율(%)을 도 3에서 도식적으로 나타낸다. 골수 재구성을 수용하지 않은 마우스로부터 예상되는 바와 같이, 조사만 받은 대조군 마우스는 8일과 12일(n=13) 사이에 사망하였다. 대부분의 GVHD 대조군 마우스(골수 및 비장 수용)는 6일과 27일 사이에 사망하였다. 1마리의 마우스는 사망하지 않았다(n=18). 골수 재구성 대조군(BM)에서 7마리 마우스 중 3마리가 6일과 8일 사이에 사망하였다. 남은 마우스에서, 골수는 공여자 골수 및 살아남은 마우스에 의해 재구성되었다(50일 초과).
단일 공여자, 비조사된 마우스는 15일과 36일 사이에 사망하였다. 따라서, 미리 보여진 바와 같이, 단일 공여자 비조사된 초기 아폽토시스 세포는 유리한 효과를 가졌고, 생존이 연장되었다(p < 0.01).
단일 공여자, 조사된 마우스는 7일과 35일 사이에 사망하였고, 1마리의 마우스는 질환 없이 생존한 채로 남았다(50일 초과). 이는 단일 공여자 조사된 아폽토시스 세포가 또한 GVHD에 관하여 유리한 효과를 제공하였다는 것을 증명하였다. 따라서, 조사는 초기 아폽토시스 세포의 면역조절 효과를 해치지 않았다. 모두 GVHD 대조군에 비하여 GVHD 뮤린 모델에서 생존에 대한 유리한 효과를 가졌다(p < 0.01).
비조사된 다수의 공여자 치료는 GVHD 대조군(n=11)에 비하여 유리한 효과를 제공하지 않았다. 생존 패턴은 GVHD 대조군과 유사하였고, 마우스는 6일과 28일 사이에 사망하였다(p=NS-유의미하지 않음). 놀랍게도, 그리고 비조사된 아폽토시스 세포와 대조적으로, 조사된-다수의 개별적인 공여자 아폽토시스 세포(치료 F)(n=10)는 GVHD 대조군과 비교하여 단일 공여자 치료와 유사한 유리한 효과를 가졌다. GVHD 증상은 유의미하게 후기에 나타났고, 마우스는 18일과 34일 사이에 사망하였다(p < 0.01).
조사된-다수의 개별적인 공여자(n=10), 조사된 단일 공여자(n=10) 및 비조사된 단일 공여자 치료(n=10)는 유사한 생존 패턴을 갖고, 이들 세 치료 그룹 사이에서 생존에 대한 효과에서 유의미한 차이가 관찰되지 않았다.
실험은 GVHD 유도된 마우스에서 아폽토시스 세포 주입의 분명한 효과를 지시하였다. 조사된 다수의 개별적인 공여자 및 조사된 및 비조사된 단일 공여자 아폽토시스 세포의 치료에 대한 유의미한 연장된 생존 효과가 존재하였다.
다수의 공여자 치료는 조사되지 않은 경우 마우스의 생존을 연장시키지 않았지만, 마우스에 투여 전 아폽토시스 세포 생성물의 조사는 결과를 개선시키고, 치료는 단일 공여자 치료에 가까운 생존 패턴을 가졌다.
상기 기재된 바와 같이, 도 3은 다수의 일치되지 않은 공여자로부터 수득된 비조사된 아폽토시스 세포가 (1) 단일 일치되지 않은 공여자로부터 수득된 비조사된 아폽토시스 세포; (2) 단일 일치되지 않은 공여자로부터 수득된 조사된 아폽토시스 세포; 및 (3) 다수의 일치되지 않은 공여자로부터 수득된 조사된 아폽토시스 세포와 비교하여, GvHD 및 사망률(% 생존)에서 감소에 대한 유의미하게 낮은 양성 임상 효과를 갖는다는 것을 보여준다. 추가로, 모든 셋(비조사된 초기 아폽토시스 세포, 단일 공여자; 조사된 초기 아폽토시스 세포, 단일 공여자; 및 조사된 초기 아폽토시스 세포, 다수의 개별적인 공여자)은 유사한 효과를 갖는다.
이러한 데이터는 다수의 개별적인 공여자로부터 수득된 비조사된 아폽토시스 세포의 항원성이 다수의 개별적인 공여자로부터 수득된 조사된 아폽토시스 세포의 것과 유사할 것으로 예상되었기 때문에 놀라웠고, 모두 이식된 골수와의 유사한 적대적인 항원성 반응을 갖지 않을까, 왜 모두 GvHD 및 사망률을 감소시킬 수 없을까?
항원성이 주요 문제로 여기에 남는 경우, 단일 공여자로부터 수득된 비조사된 아폽토시스 세포와 단일 공여자로부터의 조사된 아폽토시스 세포의 임상적 효과 사이의 차이를 보는 것이 예상되었다. 그러나 데이터는 이러한 차이를 보이지 않는다.
한 가지 가능성은 다수의 개별적인 공여자로부터 제조된 비조사된 혼주된 아폽토시스 세포 제제의 효능의 부족이 혼주된 제제에 존재하는 개별적인 단핵 집단 사이의 교차-상호작용으로부터 야기된다는 것이다. 조사된 세포가 이들의 항원성을 유지하지만 비조사된 세포로부터 유의미하게 상이한 효능을 갖기 때문에, 이들 상호작용은 숙주에 대한 항원성에 직접적으로 기여하는 것으로 보이지 않는다. 그러므로, 이는 조사를 수용하는 혼주된 초기 아폽토시스 세포 제제에서 교차-상호작용이 예상외로 제거되었고, 숙주가 세포의 투여에 잘 반응하였다는 것으로 보인다.
나타낸 바와 같이, 조사된 혼주된 공여자는 본질적으로 단일 비조사된 공여자와 동일한 효과를 가졌다.
실싯예 6: 최종 아폽토시스 세포 생성물에 대한 조사의 효과
아폽토시스 세포는 이들의 고유한 면역조절 및 항-염증성 성질로 인하여 신규한 치료적 전략에서 갈수록 더 많이 사용된다. 초기 아폽토시스 세포 제제는 투입에서 사용 후 일부는 아폽토시스가 부여될 수 있지만 일부는 생존 가능한 채로 남을 것인 20 내지 40% 생존 가능한 세포(PS 노출의 부족 및 PI 입장 없음; 아넥신 V 음성 및 프로피디움 아이오다이드 음성에 의해 측정됨)만큼 함유할 수 있다. 일치된 공여자로부터의 골수 이식의 경우, 생존 가능한 세포는 수용자가 실제 이식에서 많이 더 생존 가능한 세포를 이미 수용하기 때문에 임상적 문제를 나타내지 않는다. 그러나, 생존 가능한 세포를 포함하는 아폽토시스 세포 집단의 제3 단체 투입(또는 제4 단체 또는 그 이상이 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제에서 나타날 수 있음) 사용의 경우는 제2 GvHD 인듀서를 도입할 수 있다. 추가로, 초기 아폽토시스 세포의 면역조절 가능성에 대한 조사의 영향은 어느 정도까지 평가되지 않았다. 숙련가는 초기 아폽토시스 세포 집단의 추가의 조사가 세포를 아폽토시스의 후기 단계 또는 괴사로 진행하도록 야기하는 것을 고려할 수 있다. 이는 임상 적용에 관하여 특히 관련 문제를 나타낼 수 있기 때문에, 하기 나타낸 실험은 이러한 문제를 해결하도록 설계되고, 적어도 하나의 목표는 기능성 아폽토시스 세포의 생물안전성을 개선시키는 것이다.
따라서, 목표는 많은 징후에 대한 아폽토시스 세포의 임상적 이용을 촉진시키는 것이고, 여기서 아폽토시스 세포의 효능은 이식된 세포의 생착보다는 방관자 효과에 의존할 수 있다.
목적: 초기 아폽토시스 세포에 대한 조사의 효과를 시험하는 것으로, 여기서 조사는 아폽토시스의 유도 후 발생한다.
방법(간략하게): 세포를 이에 따라 수집하고, 초기 아폽토시스 세포를 실시예 5에 기재된 바와 같이 본질적으로 제조하였다.
3개의 분리된 초기 아폽토시스 세포 배취를 상이한 데이터에 대하여 제조하였다(수집 404-1, 0044-1 및 0043-1).
각각의 최종 생성물을 세 그룹으로 나누었다:
미처리
2500rad
4000rad.
조사 후, 초기 아폽토시스 세포를 세포 계수, 아넥신 V 양성-PI 음성 염색, 세포 표면 마커(상이한 세포 유형의 % 집단) 및 효능(수지상 세포(DC))에 대하여 즉시 시험하였다. 시험 후, 초기 아폽토시스 세포를 2 내지 8℃에서 24시간 동안 저장하고, 다음날 동일한 시험 패널(t24h)(세포 계수, 아넥신 V 양성-PI 음성 염색, 및 세포 표면 마커 및 효능)을 사용하여 시험하였다.
이전에, 방출-후 효능 분석을 진행시키고, 이는 내성(Mevorach et al, BBMT 2014 ibid)을 유도하는 공여자 단핵 초기 아폽토시스 세포(초기 아폽토시스 세포)의 능력을 평가한다. 분석은 LPS에 대한 노출 후 iDC 막에 대한 MHC-클래스 II 분자(HLA-DR) 및 상호자극적 분자(CD86) 발현의 유동 세포측정 평가의 사용을 기반으로 한다. 이전에 반복적으로 나타낸 바와 같이, 관용유발 DC는 아폽토시스 세포(Verbovetsky et al., J Exp Med 2002, Krispin et al., Blood2006)와의 상호작용에서 발생될 수 있고, LPS-처리된 DC(DR 및 CD86 발현의 억제)의 성숙의 억제는 용량 의존적 방식으로 발생한다.
각각의 배취의 내성을 유도하는 능력을 평가하기 위하여 초기 아폽토시스 세포 임상 연구의 단계 1/2a 동안, 방출-후 효능 분석을 각각의 초기 아폽토시스 세포 배취(전체 결과 n=13)에 대하여 수행하였다(결과를 도 1에 나타냄, Mevorach et al.(2014) Biology of Blood and Marrow Transplantation 20(1): 58-65).
DC를 알려지지 않고 관련되지 않은 건강한 공여자로부터 수집된 신선한 연막으로부터 각각의 초기 아폽토시스 세포 배취에 대하여 생성하고, 초기 아폽토시스 세포와 상이한 비(1:2, 1:4 및 1:8 DC:초기 아폽토시스 세포, 각각)로 조합하였다. 초기 아폽토시스 세포와의 배양 및 LPS에 대한 노출 후, 효능을 DC:초기 아폽토시스 세포의 1 이상의 비로 HLA DR 또는 CD86의 DC 막 발현의 하향조절을 기반으로 측정하였다. 모든 13개의 분석에서, 초기 아폽토시스 세포는 대부분의 DC:초기 아폽토시스 세포 비에서 제제와 함께 두 마커에서, 용량 의존적 방식으로 보인 관용유발 효과를 증명하였다.
미성숙 DC(iDC)로부터 수득한 단핵구를 건강한 공여자의 말초 혈액 PBMC로부터 발생시키고, 1% 자가 혈장, G-CSF 및 IL-4의 존재하에 배양하였다. 그 다음, iDC를 신선하게 제조된 최종 생성물 또는 2 내지 8℃에서 24시간 동안 저장된 최종 생성물인 아폽토시스 세포와 함께 2시간 동안 1:2, 1:4 및 1:8 비로 전배양하였다. 저장이 아폽토시스 세포의 효능 능력에 영향을 미치는지 여부를 측정하기 위하여 두 최종 생성물을 동시에 시험하였다. 배양 후, LPS를 지정된 웰에 가하고 추가 24시간 동안 남겨두었다. 배양 끝에, iDCS를 수집하고, 세척하고, 발현에서의 변화를 측정하기 위하여 둘 다 DC-sign 및 HLA-DR 또는 CD86로 염색하였다. 유동 세포측정기를 사용하여 세포를 분석하고, 분석은 DC 단독에 대한 분석을 보장하기 위하여 DC-sign 양성 세포 게이트로부터의 FCS-발현 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.
도 4A 내지 도 4B 및 도 5A 내지 도 5B는 비조사된 단일 공여자 세포와 비교하여 조사된 혼주된 아폽토시스 세포의 효능 시험을 보인다.
결과:
단일 공여자 제제
표 8은 비-방사된 및 조사된 아폽토시스 세포; 24시간에 평균 세포 손실(%); 0시간 및 24시간에 아넥신 양성(+) 프로피디움 아이오다이드(PI) 음성(")(초기 아폽토시스 세포의 %); 0시간 및 24시간에 아넥신 양성(+) 프로피디움 아이오다이드(PI) 양성(+)%(후기 아폽토시스 세포의 %); 0시간 및 24시간에 세포 표면 항원 CD3(T 세포), CD19(B 세포), CD56(NK 세포), CD14(단핵구), 및 CD15(과립구)의 존재의 비교 결과를 나타낸다.
최종 생설물 설명 아폽토시스 세포 아폽토시스 세포
2500rad		 아폽토시스 세포
4000rad
An + PI - t0(%)
범위(최소-최대)		 59.2
(52.6-66.1)		 59.6
(51.6-68.7)		 58.4
(50.4-65.1)
An + PI - t24(%)
범위(최소-최대)		 62.6
(53.6-76.3)		 68.1
(52.0-81.3)		 66.7
(52.9-77.1)
An + PI + t0(%)
범위(최소-최대)		 4.9
(3.2-7.0)		 6.0
(5.2-7.4)		 6.1
(4.0-9.1)
An + PI + t24(%)
범위(최소-최대)		 7.3
(5.0-11.8)		 8.6
(6.4-11.8)		 9.0
(6.0-14.9)
CD3+ t0(%)
범위(최소-최대)		 56.9
(47.4-66.3)		 58.3
(48.8-67.7)		 57.5
(48.6-66.4)
CD3+ t24(%)
범위(최소-최대)		 56.8
(49.6-64.0)		 57.1
(48.0-66.1)		 56.6
(49.7-63.4)
CD19+ t0(%)
범위(최소-최대)		 10.6
(10.1-11.0)		 9.5
(7.7-11.3)		 9.6
(8.5-10.7)
CD19+ t24(%)
범위(최소-최대)		 11.8
(10.2-13.4)		 9.2
(6.9-11.5)		 8.8
(7.5-10.1)
CD56+ t0(%)
범위(최소-최대)		 12.2
(7.0-17.3)		 13.0
(7.6-18.4)		 14.4
(21.2-7.6)
CD56+ t24(%)
범위(최소-최대)		 12.9
(8.8-13.4)		 14.1
(10.4-17.8)		 17.1
(10.0-24.1)
CD14+ t0(%)
범위(최소-최대)		 23.1
(13.1-33.1)		 25.2
(13.8-36.5)		 24.6
(14.0-35.2)
CD14+ t24(%)
범위(최소-최대)		 21.9
(13.8-30.0)		 23.7
(13.8-33.6)		 24.4
(15.4-33.4)
CD15 high t0(%)
범위(최소-최대)		 0.0 0.0 0.01
(0.0-0.02)
CD15 high t24(%)
범위(최소-최대)		 0.0 0.0 0.01
(0.0-0.02)
표 8의 결과는 비조사된 아폽토시스 세포 및 조사된 아폽토시스 세포가 둘 다 초기(2 및 3열) 및 후기(4 및 5열) 아폽토시스 세포의 비슷한 백분율을 가졌다는 것을 나타낸다. 따라서, 25 또는 40 Gy 조사는 감마-조사의 이러한 높은 수치 전에 유도된 아폽토시스 또는 괴사 과정을 가속화하지 않았다. 추가로, 세포 유형에 관하여 조사된 세포 집단 대 대조군 비조사된 집단 사이의 일관성이 존재하였다.
도 4A 내지 도 4B(HLA-DR 발현) 및 도 5A 내지 도 5B(CD86 발현)에서 나타낸 효능 분석의 결과는 비조사된 아폽토시스 세포와 비교시 신선한(도 4A, 도 5A) 및 24시간 저장된(도 4B, 도 5B) 조사 아폽토시스 세포의 면역 조절 능력에서의 변화가 없었다는 것을 나타낸다.
도 4A 내지 도 4B 및 도 5A 내지 도 5B 둘 다에서, 돌연변이 제제 LPS에 대한 노출 후, HLA-DR 및 CD86 발현 둘 다에서 분명한 상향조절이 존재한다. 동시자극적 마커 둘 다의 유의미한(p < 0.01), 용량-의존성 하향조절은 단일 공여자 또는 조사된 혼주된 공여자 둘 다로부터의 신선하게 제조된 아폽토시스 세포의 존재에서 관찰되었다. 추가로, 용량 의존적 하향조절은 2 내지 8℃에서 24시간 동안 저장된 아폽토시스 세포의 존재하에 두 마커에서 유지되었고, 이는 저장 24시간 후, 최종 생성물 안정성 및 효능을 지시한다.
수지상 세포에 대한 효과. 아폽토시스 세포의 면역조절 능력을 시험하기 위하여, 방출 후 효능 분석을 사용하였다(Mevorach et al.,(2014) BBMT, ibid). 수지상 세포에서 면역 조절 분석에서의 변화는 관찰되지 않았다(데이터 나타내지 않음).
혼합된 림프구 반응(MLR)에 대한 효과. 추가로 면역조절 효과를 시험하기 위하여, 표준화된 MLR 분석을 확립하였다. 여기서, 자극제 및 반응 세포, 즉, MLR의 공동배양은 강하고 신뢰성 있는 증식을 수득하였다. MLR에 대한 비조사된 아폽토시스 세포의 첨가하에, 림프구 증식은 > 5배로 유의미하게 감소하였고, 이는 증식의 세포 저해를 분명하게 입증한다. 조사된 아폽토시스 세포에 의해 매개된 MLR에서의 림프구 증식의 저해는 완전하게 비슷하였다(데이터 나타내지 않음).
다음 단계는 완전하게 일치하지 않는 마우스 모델에서 생체 내, 조사된 및 비조사된 아폽토시스 세포를 평가하는 것이었다. 도 1 내지 도 2에 도시된 바와 같이, 조사된 및 비조사된 초기 아폽토시스 세포 제제는 생체내 유리한 효과에서 비슷하였다.
단일 공여자 제제 결론:
결론적으로, 25 Gy 또는 40 Gy의 조사는 아폽토시스 세포의 집단에서 아폽토시스 또는 유도된 괴사를 유의미하게 가속화시키지 않았다. 유의미하게, 이들 집단은 시험관내 미 생체내 아폽토시스 세포의 면역조절 효과를 유지하였다.
다수의 공여자 제제
다음, 실험은 단일 공여자, 제3 단체 제제에서 관찰된 현상이 또한 다수의 제3 단체 공여자에 있어서도 사실이라는 것을 확인하기 위하여 수행하였다. 예삿ㅇ외로, 혼주된 개별적인 공여자 아폽토시스 세포 제제를 사용하는 경우, 단일 일치되지 않은 공여자의 유리한 효과는 손실되었다(도 3). 각각 공여자의 유리한 효과가 별개로 유지되기 때문에 이는 GvHD로 인한 것이 아니었다(시험 결과는 나탄지 않음). 한 가지 가능성은 그들 중에서 개별적인 공여자 세포의 상호작용으로 인하여 초기 아폽토시스 세포 제제의 유리한 효과가 손실되었다는 것이다. 상이한 공여자의 이러한 가능한 상호작용은 감마선 조사에 의해 회피될 수 있는지 여부를 추가로 시험하였다.
도 3에 도시된 바와 같이, 단일 공여자의 유리한 효과는 감마선 조사 후 완전하게 회복되었고, 여기서 조사된 다수의 공여자 제제 및 단일 공여자 제제(조사된 또는 비조사된)는 유사한 생존 패턴을 가졌다.
결론:
놀랍게도 조사(및 가능하게는 T-세포 수용체 저해를 햐기하는 임의의 방법)가 T-세포의 원하지 않는 증식 및 활성을 회피할 뿐만 아니라 다수의 공여자 제3 단체 아폽토시스 세포의 제제를 사용하는 경우, 면역 조절의 유리한 효과를 허용한다는 것이 본 명세서에 처음으로 나타난다.
특정한 특징이 본 명세서에 도시되고 기재되었지만, 많은 변형, 치환, 변화, 및 등가물이 당해 분야의 숙련가들에게 이제 발생할 것이다. 그러므로, 첨부된 청구항이 본 명세서에서 기재내용의 진정한 취지 내에 속하는 모든 이러한 변형 및 변화를 포함하는 것을 의도한다는 것이 이해된다.

Claims (32)

  1. 초기 아폽토시스 상태의 단핵 세포를 포함하는 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제(pooled mononuclear apoptotic cell preparation)로서, 상기 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제는 혼주된 개별적인 단핵 세포 집단을 포함하고, 상기 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제는,
    (a) 비휴지기 비아폽토시스 세포의 감소;
    (b) 임의의 살아있는 비아폽토시스 세포의 억제된 세포 활성화; 또는
    (c) 임의의 살아있는 비아폽토시스 세포의 증식의 감소;
    또는 임의의 이들의 조합을 포함하는, 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 혼주된 개별적인 단핵 세포 집단은 상기 개별적인 단핵 세포 집단의 아폽토시스의 유도 전에 또는 아폽토시스의 유도 후에 혼주된 개별적인 단핵 세포 집단을 포함하는, 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 혼주된 개별적인 단핵 세포 집단은 상기 개별적인 단핵 세포 집단의 HLA 마커의 HLA 일치와 독립적인 혼주된 집단을 포함하는, 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 수득된 상기 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제는 약 2개 내지 25개의 혈액 단위로 존재하는 세포로부터 수득된 단핵 세포 집단을 포함하는, 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제.
  5. 제4항에 있어서, 상기 혈액은 헌혈로부터의 백혈구(WBC) 분획을 포함하는, 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개별적인 단핵 세포 집단은 림프구, 단핵구, 수지상 세포 및 자연 살해 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 세포 유형을 포함하는, 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개별적인 단핵 세포 집단은 수용자 대상체에 관하여 HLA 일치된 또는 HLA 일치하지 않는 공급원으로부터의 동종이계 세포를 포함하는, 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼주된 개별적인 단핵 세포 집단은 불활성 T 세포 수용체 또는 감소된 면역 활성을 포함하는 세포를 포함하는, 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼주된 개별적인 단핵 세포 집단은 조사된 세포 집단을 포함하는, 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제.
  10. 제9항에 있어서, 상기 조사는 감마선 조사 또는 UV 조사를 포함하는, 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 혼주된 개별적인 단핵 세포 집단은 상기 조사 전에 또는 상기 조사 후에 혼주된 집단을 포함하는, 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조사된 세포 집단은 비조사된 세포 집단과 비교하여 집단에 대하여 비휴지기 비아폽토시스 세포의 백분율의 감소를 포함하는, 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 세포 제제를 포함하는 약제학적 조성물.
  14. 초기 아폽토시스 상태의 혼주된 개별적인 단핵 세포 집단을 포함하는 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제를 포함하는 약제학적 조성물을 제조하는 방법으로서,
    (a) 말초 혈액의 개별적인 단핵-풍부화 세포 집단(mononuclear-enriched cell population)을 수득하는 단계;
    (b) 항응고제를 포함하는 냉동 매질 중에 상기 단핵-풍부화 세포 집단을 냉동하는 단계;
    (c) 상기 단핵-풍부화 세포 집단을 해동하는 단계;
    (d) 약 10 내지 100㎍/㎖의 최종 농도의 메틸프레드니솔론 및 항응고제를 포함하는 아폽토시스 유도 배양 매질 중에 상기 단핵-풍부화 세포 집단을 배양하는 단계;
    (e) 상기 아폽토시스 세포 집단을 투여 매질 중에 재현탁시키는 단계;
    (f) 상기 단핵 풍부화 집단을 불활화시키는 단계로서, 상기 불활화는 임의의 단계 (a) 내지 (e) 후 발생되는, 상기 불활화시키는 단계; 및
    (g) 상기 단핵 풍부화 집단을 혼주시키는 단계로서, 상기 혼주는 임의의 단계 (a) 내지 (f) 후 발생되는, 상기 혼주시키는 단계를 포함하되,
    상기 방법은 초기 아폽토시스 상태의 혼주된 개별적인 단핵 세포 집단을 포함하는 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제를 포함하는 약제학적 조성물을 제조하는, 약제학적 조성물을 제조하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 불활화는 상기 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제 내에 비휴지기 비아폽토시스 세포의 백분율을 감소시키는 것, 임의의 살아있는 비아폽토시스 세포의 세포 활성화를 억제하는 것, 또는 임의의 살아있는 비아폽토시스 세포의 증식을 감소시키는 것, 또는 임의의 이들의 조합을 포함하는, 약제학적 조성물을 제조하는 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 개별적인 단핵-풍부화 세포 집단을 수득하는 단계는 백혈구성분채집술에 의해 다수의 개별적인 공여자로부터 백혈구(WBC) 분획을 수득하는 단계를 포함하는, 약제학적 조성물을 제조하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 백혈구(WBC) 분획은 혈액 은행으로부터 수득된 WBC 분획을 포함하는, 약제학적 조성물을 제조하는 방법.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 백혈구(WBC) 분획은 림프구, 단핵구, 수지상 세포 및 자연 살해 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 세포 유형을 포함하는, 약제학적 조성물을 제조하는 방법.
  19. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 백혈구(WBC) 분획은 약 2 내지 25개의 혈액 단위로 수집되는, 약제학적 조성물을 제조하는 방법.
  20. 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단핵-풍부화 세포 집단을 수득하는 단계는 상기 개별적인 단핵-풍부화 세포 집단을 HLA 일치시키는 것에 의해 제한되지 않는, 약제학적 조성물을 제조하는 방법.
  21. 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양하는 단계는 약 2 내지 12시간인, 약제학적 조성물을 제조하는 방법.
  22. 제14항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개별적인 단핵-풍부화 세포 집단은 수용자 대상체에 관하여 HLA 일치된 또는 HLA 일치하지 않는 공급원으로부터 동종이계 세포를 포함하는, 약제학적 조성물을 제조하는 방법.
  23. 제14항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단핵 풍부화 집단을 불활화시키는 상기 단계 (f)는 상기 개별적인 집단에서 면역 반응을 억제하거나 제거하는 것, 상기 개별적인 집단 사이의 교차반응성을 억제하거나 제거하는 것, 또는 상기 개별적인 집단에서 T-세포 수용체 활성을 감소시키거나 제거하는 것을 포함하고, 상기 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제를 포함하는 상기 제조된 약제학적 조성물은 상기 세포 제제 내에 살아있는 비아폽토시스 세포의 백분율의 감소, 임의의 살아있는 비아폽토시스 세포의 세포 활성화의 억제, 또는 임의의 살아있는 비아폽토시스 세포의 증식의 감소, 또는 임의의 이들의 조합을 포함하는, 약제학적 조성물을 제조하는 방법.
  24. 제14항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단핵 풍부화 집단의 상기 불활화 단계는 상기 단핵 풍부화 집단을 조사하는 단계를 포함하는, 약제학적 조성물을 제조하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 조사는 감마선 조사 또는 UV 조사를 포함하는, 약제학적 조성물을 제조하는 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 조사는 약 25 내지 30 그레이 단위(Gy)를 포함하는, 약제학적 조성물을 제조하는 방법.
  27. 필요로 하는 대상체에서 면역 질환, 자가면역 질환, 사이토카인 방출 증후군(CRS), 사이토카인 스톰 또는 염증성 질환의 치료, 예방, 완화, 억제, 또는 이의 발생률의 감소 방법으로서, 상기 대상체에게 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 혼주된 단핵 아폽토시스 세포 제제를 포함하는 약제학적 조성물, 또는 제13항의 상기 조성물, 또는 제14항 내지 제26항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 면역 질환은 GVHD, 관절염, 통풍 또는 염증성 장 질환을 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 대상체는 조혈 악성종양을 앓고 있거나, 이식편대종양 또는 이식편대백혈병(GVL) 효과를 보유하거나, 조혈 줄기 세포 이식(HSCT)을 받고 있거나, 또는 고형 장기 이식을 받고 있는, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 HSCT는 동종이계 HSCT이고, 상기 약제학적 조성물은 상기 대상체 또는 상기 공여자와 HLA 일치하지 않는 다수의 동종이계 공여자로부터 수득된 세포를 포함하는, 방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 약제학적 조성물의 투여는 상기 이식 24시간 이하 전에 수행되거나, 상기 이식과 동시에 수행되거나, 또는 상기 이식 후 15일까지 투여되는, 방법.
  32. 제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 정맥내 주사에 의해 투여되는, 방법.
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