FR3117872A1 - Procédé et système pour produire des cellules mononucléées apoptotiques - Google Patents
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Abstract
Procédé et système pour produire des cellules mononucléées apoptotiques. L’invention concerne un procédé pour produire des cellules mononucléées apoptotiques contenues dans une fraction de sang périphérique d’un donneur, ledit procédé comprenant l’étape consistant à soumettre ladite fraction de sang à une irradiation ultraviolette ayant une longueur d’onde comprise entre 200 nm et 320 nm, ladite irradiation étant agencée pour induire une différence entre le taux d’apoptose des cellules irradiées et celui des cellules non irradiées supérieure à 15%, 48 heures après l’irradiation, de sorte à obtenir des cellules mononucléées apoptotiques capables de moduler la réponse immunitaire chez un patient. Figure à publier avec l’abrégé : Fig. 1
Description
L’invention concerne un procédé et un système pour produire des cellules mononucléées apoptotiques contenues dans une fraction de sang périphérique d’un donneur, ainsi que l’utilisation de ces cellules pour le traitement de pathologies associées à un dysfonctionnement du système immunitaire.
Elle s’applique aux domaines de la thérapie cellulaire et de l’immunothérapie, notamment à celui de la photo-immunothérapie extracorporelle.
La photophérèse encore appelée photochimiothérapie extracorporelle (PEC), est une technique de thérapie cellulaire qui a émergé dans les années 80 suite aux travaux d’Edelson dans le traitement des lymphomes cutanés à cellules T (LCCT) (Edelson et al., 1987). Elle consiste à prélever du sang chez un patient, à séparer par centrifugation les cellules mononucléées (CMN) du sang de ce patient, à traiter ces cellules par une irradiation aux ultraviolets A (UVA) en présence d’un agent intercalant photoactivable appelé 8-méthoxypsoralène (8-MOP), puis à réinjecter les cellules activées au patient. Le traitement des cellules est réalisé ex vivo.
La PEC a fait ses preuves dans le traitement de pathologies liées à un dysfonctionnement du système immunitaire, soit en situation autologue (propre au patient) par exemple pour des pathologies tumorales ou auto immunes, soit en situation allogénique (relation donneur-receveur) dans le cas d’une greffe d’organe solide ou de cellules souches hématopoïétiques (CSH) pouvant être associée à une complication majeure telle que la maladie du greffon contre l’hôte (Graft versus Host Disease ou GvHD).
L’innocuité et l’efficacité obtenues grâce à cette thérapie poussent aujourd’hui les cliniciens à élargir le champ d’application thérapeutique de la PEC notamment dans le traitement de pathologies auto-immunes (Adamski et al., 2015).
Le mode d’action de la PEC n’est pas complètement élucidé. Cependant, il est admis que le 8-MOP passe à travers la membrane cellulaire et s’intercale entre les deux brins d’ADN. Après irradiation aux UVA, le 8-MOP est activé entrainant un processus de photo-addition (Jeantet, 2004). Ce processus a pour conséquence de bloquer la réplication et la transcription de l’ADN induisant l’arrêt de la prolifération et l’apoptose des cellules. Parmi les cellules mononucléées traitées lors de la PEC, la population des lymphocytes T est la population la plus touchée par l’apoptose (Heshmati, 2014). L’apoptose est une mort cellulaire programmée hautement régulée par l’organisme, l’autre type de mort cellulaire étant la nécrose, mort dite « accidentelle » survenant après une perturbation de l’environnement.
Une fois réinjectés chez le patient, les lymphocytes T traités par PEC vont entrer en apoptose et être phagocytés par les cellules présentatrices d’antigènes (CPA), aussi appelées cellules dendritiques, ce qui active le système immunitaire soit vers une réponse immunotolérante (GvHD, rejet de greffe), soit vers une réponse immunoactive (lymphome T cutané).
Plus particulièrement, la PEC stimule la différenciation des monocytes en cellules dendritiques qui vont ensuite phagocyter les corps apoptotiques des lymphocytes T. Les cellules dendritiques ont pour rôle de présenter à leur surface les peptides de l’élément phagocyté pour signaler la présence d’un corps étranger ou activer des cellules T spécialisées et induire une réponse immunitaire associée à la libération de cytokines pro-inflammatoires ou tolérogène.
Deux types de procédures pour la PEC sont aujourd’hui utilisées selon les établissements.
La technique « fermée » ou « on-line » proposée par la société Therakos est la technique pour laquelle les étapes de prélèvement, séparation des cellules, traitement et réinjection sont réalisées avec un système unique, en une seule opération et en système clos (système Cellex).
La technique « ouverte » ou « off-line » proposée par la société Maco Pharma est une technique pour laquelle les étapes de prélèvement/séparation et traitement sont réalisées sur des appareils différents, nécessitant plusieurs opérations.
Ces deux techniques restent cependant relativement longues et complexes à mettre en œuvre et il existe un besoin constant de simplifier la PEC.
Le document WO 2020/139495 propose ainsi différents systèmes et méthodes pour réaliser une PEC sur des petits volumes (inférieurs à 500 ml) en réduisant notamment le nombre de dispositifs à manipuler. Ces systèmes et méthodes nécessitent cependant toujours l’utilisation de 8-MOP et une irradiation aux UVA.
Pour pallier à l’éventuel risque de développer des tumeurs cutanées malignes après l’utilisation de psoralène activé par irradiation aux UVA, le document WO 2015/162279 propose d’utiliser l’acide 5-aminolévulinique (5-ALA), un précurseur de la protoporphyrine X, à la place du 8-MOP. La technique comprend cependant les mêmes multiples étapes que pour la PEC avec le 8-MOP/UVA.
Le document WO 2017/005700 divulgue une méthode alternative à la méthode PEC, sans agent apoptotique, permettant d’obtenir des monocytes activés et stimulés pour se différentier en CPA. La méthode consiste à soumettre une force de cisaillement à un échantillon de sang d’un patient comprenant des monocytes, en faisant circuler l’échantillon de sang dans une chambre d’écoulement.
Enfin, le document Buchele, Vera, and Holger Hackstein. "A simplified extracorporeal photopheresis procedure based on single high‐dose ultraviolet A light irradiation shows similar in vitro efficacy." Transfusion (2020) propose de réaliser une PEC sans 8-MOP en soumettant les cellules mononucléées du sang à une irradiation aux UVA à haute dose (5 J/cm2).
L’invention propose un procédé plus simple et plus rapide visant à mimer les effets de la PEC sur les cellules mononucléées en l’absence d’agent photoactivable.
A cet effet et selon un premier aspect, l’invention propose un procédé pour produire des cellules mononucléées apoptotiques contenues dans une fraction de sang périphérique d’un donneur, ledit procédé comprenant l’étape consistant à soumettre ladite fraction de sang à une irradiation ultraviolette ayant une longueur d’onde comprise entre 200 nm et 320 nm, ladite irradiation étant agencée pour induire une différence entre le taux d’apoptose des cellules irradiées et celui des cellules non irradiées supérieure à 15%, 48 heures après l’irradiation, notamment 24 heures après l’irradiation, de sorte à obtenir des cellules mononucléées apoptotiques capables de moduler la réponse immunitaire chez un patient.
Selon un second aspect, l’invention consiste en un système pour produire des cellules mononucléées apoptotiques contenues dans une fraction de sang périphérique d’un donneur, ledit système comprenant
(a) d’une part un récipient d’irradiation destiné à recevoir des cellules mononucléées contenues dans une fraction de sang périphérique, ledit récipient d’irradiation étant perméable aux rayons ayant une longueur d’onde comprise entre 200 et 320 nm, et
(b) d’autre part un appareil d’irradiation configuré pour être associé audit récipient d’irradiation, l’appareil d’irradiation comprenant une source de lumière ultraviolette émettant une irradiation ayant une longueur d’onde comprise entre 200 et 320 nm et une unité de pilotage configurée pour soumettre cette fraction de sang à ladite irradiation ultraviolette, ladite irradiation ultraviolette étant agencée pour induire une différence entre le taux d’apoptose des cellules irradiées et celui des cellules non irradiées supérieure à 15%, 48 heures après l’irradiation, notamment 24 heures après l’irradiation,.
(a) d’une part un récipient d’irradiation destiné à recevoir des cellules mononucléées contenues dans une fraction de sang périphérique, ledit récipient d’irradiation étant perméable aux rayons ayant une longueur d’onde comprise entre 200 et 320 nm, et
(b) d’autre part un appareil d’irradiation configuré pour être associé audit récipient d’irradiation, l’appareil d’irradiation comprenant une source de lumière ultraviolette émettant une irradiation ayant une longueur d’onde comprise entre 200 et 320 nm et une unité de pilotage configurée pour soumettre cette fraction de sang à ladite irradiation ultraviolette, ladite irradiation ultraviolette étant agencée pour induire une différence entre le taux d’apoptose des cellules irradiées et celui des cellules non irradiées supérieure à 15%, 48 heures après l’irradiation, notamment 24 heures après l’irradiation,.
Selon un autre aspect, l’invention propose un procédé pour faire fonctionner le système selon le second aspect pour produire des cellules mononucléées apoptotiques contenues dans une fraction de sang périphérique d’un donneur, ledit procédé comprenant les étapes de
(a) fournir un récipient d’irradiation comprenant une fraction de sang périphérique d’un donneur contenant des cellules mononucléées,
(b) placer ledit récipient d’irradiation dans un appareil d’irradiation comprenant une source de lumière ultraviolette émettant une irradiation ayant une longueur d’onde comprise entre 200 et 320 nm ;
(c) irradier ledit récipient d’irradiation dans ledit appareil d’irradiation avec ladite irradiation ultraviolette, ladite irradiation étant agencée pour induire une différence entre le taux d’apoptose des cellules irradiées et celui des cellules non irradiées supérieure à 15%, 48 heures après l’irradiation, notamment 24 heures après l’irradiation,.
(a) fournir un récipient d’irradiation comprenant une fraction de sang périphérique d’un donneur contenant des cellules mononucléées,
(b) placer ledit récipient d’irradiation dans un appareil d’irradiation comprenant une source de lumière ultraviolette émettant une irradiation ayant une longueur d’onde comprise entre 200 et 320 nm ;
(c) irradier ledit récipient d’irradiation dans ledit appareil d’irradiation avec ladite irradiation ultraviolette, ladite irradiation étant agencée pour induire une différence entre le taux d’apoptose des cellules irradiées et celui des cellules non irradiées supérieure à 15%, 48 heures après l’irradiation, notamment 24 heures après l’irradiation,.
Un autre aspect de l’invention porte sur l’utilisation des cellules mononucléées apoptotiques obtenues par le procédé selon le premier aspect, pour le traitement des pathologies associées à un dysfonctionnement du système immunitaire.
D’autres objets et avantages apparaîtront au cours de la description qui suit.
L’invention propose un procédé visant à obtenir une réponse cellulaire comparable à celle obtenue par la PEC classique (8-MOP/UVA), en l’absence d’agent photoactivable tel que le 8-MOP ou les dérivés de porphyrines, et notamment à l’aide de la lumière seulement.
Selon un premier aspect, l’invention concerne un procédé pour produire des cellules mononucléées apoptotiques contenues dans une fraction de sang périphérique d’un donneur. Le procédé comprend une étape d’irradiation ultraviolette.
Les cellules mononucléées (CMN) du sang périphérique (ou parfois dites « cellules mononucléaires périphériques sanguines » sont toutes les cellules du sang périphérique ayant un seul noyau. Ces cellules sont constituées de lymphocytes (cellules T, cellules B, cellules NK) et de monocytes. Les érythrocytes et les plaquettes n'ont pas de noyau, et les granulocytes (neutrophiles, basophiles et éosinophiles) ont des noyaux multi-lobés.
La fraction de sang périphérique d’un donneur contenant les cellules mononuclées a été obtenue, préalablement à la mise en œuvre du procédé de l’invention, par leucaphérèse, c’est-à-dire à l’aide d’un appareil d’aphérèse qui va prélever le sang du donneur, le séparer par centrifugation en plasma, globules rouges et couche leuco-plaquettaire, réinjecter au donneur le plasma et les globules rouges, et isoler la fraction enrichie en leucocytes comprenant lesdites cellules mononucléées. Le produit de leucaphérèse constitue la fraction de sang périphérique contenant les cellules mononucléées. Cette fraction enrichie en leucocytes possède notamment un volume compris entre 150 et 200 ml. Elle comprend plus de 90% de cellules mononucléées en suspension dans du plasma.
En alternative, la fraction du sang périphérique contenant les cellules mononucléées a été obtenue, préalablement à la mise en œuvre du procédé, en isolant la couche leuco-plaquettaire d’un échantillon de sang total. L’échantillon de sang total est alors soumis à une centrifugation pour séparer le sang en plasma, globules rouges et couche leuco-plaquettaire. La couche leuco-plaquettaire isolée constitue la fraction de sang périphérique contenant les cellules mononucléées en suspension dans du plasma. Le volume de sang total de départ est notamment compris entre 100 et 500 ml. Dans le cas d’un échantillon de sang total compris entre 100 et 200 ml, la fraction de sang périphérique contenant les cellules mononuclées possède un volume compris entre 6 et 10 ml. Dans le cas d’un échantillon de sang total compris entre 450 et 500 ml, la fraction de sang périphérique contenant les cellules mononuclées possède un volume compris entre 40 et 50 ml.
Dans une variante, la fraction de sang périphérique est cryoconservée avant d’être réchauffée pur être soumise à l’irradiation ultraviolette. Par exemple, les cellules mononucléées sont conservées à -80°C dans une solution de cryoconservation comprenant du sulfoxyde de diméthyle (DMSO), de l’albumine de sérum et de hydroxyéthylamidon.
En particulier, le taux d’hématocrite de la fraction du sang périphérique allant de 0 à 8%, en particulier de 1 à 4%, et encore plus particulièrement est d’environ 2%. En effet, la présence de globules rouges affecte la dose de lumière ultraviolette adsorbée par les cellules mononucléées, en formant un écran aux cellules mononuclées.
Afin d’obtenir un taux d’hématocrite acceptable, la fraction de sang périphérique contenant les cellules mononucléées est diluée avant l’irradiation.
La dilution est réalisée avec du plasma et/une solution biocompatible telle qu’une solution saline ou une solution tampon. Avantageusement, la dilution est réalisée avec une solution saline uniquement.
Selon une réalisation, la fraction de sang périphérique présente un volume compris entre 6 et 200 ml, et après dilution, présente un volume compris entre 200 et 500 ml, notamment de l’ordre de 300 ml.
Le taux de plasma de la fraction du sang périphérique contenant les cellules mononucléées est compris avantageusement entre 30 et 50%. En effet, la présence de lipide et/ou bilirubine trop importante dans le plasma affecte la clarté du plasma, ce qui limite l’absorption de la lumière ultraviolette par les cellules mononucléées. Réduire la quantité de plasma dans la fraction de sang périphérique limite le risque d’un plasma trop absorbant.
La fraction du sang périphérique contenant les cellules mononucléées et soumise à l’irradiation ultraviolette est dépourvue d’agent photoactif ou d’agent induisant l’apoptose tel que le méthylprednisolone. L’absence de tels agents simplifie et sécurise le procédé par rapport à une PEC classique, puisque, après avoir obtenu la fraction de sang périphérique à irradier, le procédé peut être réalisé entièrement en système clos.
Selon une réalisation, le procédé est autologue, c’est-à-dire que la fraction de sang périphérique contenant les cellules mononucléées est obtenue du patient destiné à être traité par lesdites cellules mononucléées induites en apoptose.
Le procédé de l’invention est mis en œuvre de façon extracorporelle, une fois la fraction de sang périphérique isolée du sang total. La fraction de sang périphérique est placée dans un récipient, séparé et isolé du donneur.
Le procédé selon le premier aspect de l’invention comprend l’étape consistant à soumettre ladite fraction de sang à une irradiation ultraviolette ayant une longueur d’onde comprise entre 200 nm et 320 nm.
En particulier, l’irradiation ultraviolette possède une longueur d’onde comprise entre 200 et 280 nm, notamment 255 nm. En alternative, l’irradiation ultraviolette possède une longueur d’onde comprise entre 280 et 320 nm, notamment de l’ordre de 310 nm.
Selon une réalisation, l’irradiation ultraviolette de la fraction de sang périphérique est réalisée en flux continu lors de l’écoulement continu de la fraction de sang périphérique dans un tube ou une poche formant un chemin d’écoulement en serpentin.
Selon une autre réalisation, l’irradiation ultraviolette de la fraction de sang périphérique est réalisée en discontinu avec la fraction de sang périphérique présente dans un récipient.
Afin d’obtenir une irradiation homogène des cellules mononuclées dans la fraction de sang périphérique, cette fraction de sang périphérique est agitée pendant l’irradiation.
Selon le procédé de l’invention, l’irradiation ultraviolette est agencée pour induire une différence entre le taux d’apoptose des cellules irradiées et celui des cellules non irradiées supérieure à 15%, 48 heures après l’irradiation, notamment 24 heures après l’irradiation.
La différence entre le taux d’apoptose des cellules irradiées et celui des cellules non irradiées est appelée Delta-apoptose. Le Delta-apoptose est déterminé en calculant la différence entre le taux d’apoptose des cellules irradiées et le taux d’apoptose des cellules non irradiées.
En particulier, le Delta-apoptose est supérieure à 15%, 24 heures après l’irradiation.
Avec un telle irradiation ultraviolette ayant une longueur d’onde comprise entre 200 et 320 nm, et plus particulièrement comprise entre 280 et 320 nm, il est possible d’obtenir des cellules mononucléées apoptotiques capables de moduler la réponse immunitaire chez un patient.
L’étude de l’apoptose ou mort cellulaire programmée est généralement réalisée à l’aide d’un double marquage des cellules à l’annexine-V couplée à un fluorophore FITC et à l’iodure de propidium (IP). L’analyse des cellules marquées s’effectue notamment par cytométrie en flux.
L’annexine-V est une protéine qui présente une forte affinité pour les phosphatidylsérines, protéines membranaires des cellules. Lorsque la cellule est viable, les phosphatidylsérines membranaires se situent du côté intracellulaire ce qui empêche la fixation de l’annexine-V. Dès que la cellule entre en apoptose, ces protéines s’externalisent, et s’expriment des deux côtés de la membrane. Les cellules apoptotiques sont donc marquées par l’annexine-V.
L’utilisation conjointe de l’IP qui est un agent intercalant de l’ADN permet la distinction des cellules apoptotiques par rapport aux cellules nécrotiques. En effet, la nécrose des cellules s’accompagne de la perte d’intégrité de la membrane ce qui n’est pas le cas d’une cellule en apoptose. Cela permet à l’IP de pénétrer dans la cellule et de s’intercaler à l’ADN. Ce double marquage permet de distinguer les cellules viables, nécrotiques et apoptotiques : les cellules viables sont négatives à l’IP et négatives à l’annexine V, les cellules nécrotiques sont positives à l’IP et négatives à l’annexine V, les cellules apoptotiques précoces sont négatives à l’IP et positives à l’annexine V, et les cellules apoptotiques tardives sont positives à l’IP et positives à l’annexine V.
La cytométrie en flux est une technique qui permet d’analyser les caractéristiques physiques et biologiques de chaque cellule et donc de différencier les populations cellulaires d’une suspension (Carmaux, 2008). L’analyse morphologique permet de distinguer les populations cellulaires selon deux paramètres: la taille (Foward scatter FSC) et la granularité (Side scatter SSC). On obtient un diagramme en nuage de points où chaque point correspond à une cellule. Les zones denses et homogènes correspondent à une population, ces zones peuvent ensuite être délimitées par un logiciel tel que le logiciel Accuri. Cela permet d’identifier et analyser la population cellulaire souhaitée.
Il est avantageux que les cellules mononucléées irradiées continuent d’être en apoptose une fois réinjectées chez le patient. Ainsi, l’irradiation est agencée pour induire un Delta-apoptose 48 heures après l’irradiation supérieur au Delta-Apoptose 24 heures après l’irradiation.
Pour obtenir un effet immunomodulatoire chez le patient, les cellules mononucléées sont dans un état d’apoptose et non pas de nécrose. Ainsi, dans le procédé de l’invention, l’irradiation est agencée pour induire un taux de nécrose inférieur à 5%, notamment inférieur à 1%.
Un autre effet de la PEC sur les cellules est l’inhibition de la prolifération cellulaire, et notamment des lymphocytes T.
Dans le procédé selon le premier aspect, l’irradiation est notamment agencée pour induire en outre un taux d’inhibition de la prolifération cellulaire supérieure à 70% trois jours après irradiation. En particulier, le taux d’inhibition de la prolifération cellulaire est supérieure à 90% trois jours après irradiation.
Le taux d’inhibition de la prolifération cellulaire est déterminé en divisant la différence entre le taux de prolifération des cellules contrôles non irradiées et le taux de prolifération des cellules irradiées par le taux de prolifération des cellules contrôles non irradiées, le taux de prolifération cellulaire étant déterminé en divisant est le nombre total de cellules finales par le nombre total de cellules de départ. Le taux d’inhibition de la prolifération est déterminée 3 jours après l’irradiation et après mise en culture des cellules.
La dose de lumière ultraviolette devant être délivrée aux cellules mononucléées pour obtenir le Delta-apoptose approprié dépend de nombreux facteurs. Ces facteurs sont intrinsèques, liés à la composition de la fraction de sang périphérique, tels que par exemple l’hématocrite, la quantité de plasma et la clarté du plasma, et/ou extrinsèques, liés au système utilisé pour l’irradiation, tel que par exemple la forme et transparence à la lumière ultraviolette du récipient d’irradiation recevant la fraction de sang périphérique, la configuration de la source de lumière ultraviolette (irradiation d’un côté ou des deux côtés du récipient d’irradiation), le type et a vitesse d’agitation du récipient d’irradiation et l’épaisseur de la fraction de sang périphérique dans le récipient d’irradiation.
Selon une réalisation particulière, afin de déterminer la dose appropriée de lumière ultraviolette à appliquer à la fraction de sang périphérique contenant les cellules mononuclées, on utilise un modèle cellulaire comprenant les cellules JURKAT.
Les cellules JURKAT sont une lignée cellulaire immortalisée de lymphocytes T CD4 humains, qui a été établie vers la fin des années 1970 à partir du sang d'un garçon de quatorze ans atteint d'une leucémie.
Cette lignée présente l’intérêt d’être à la fois disponible et ciblée par la PEC puisque ce sont des cellules T. Comme les cellules mononucléées, les cellules JURKAT montrent une augmentation progressive de la mort cellulaire après traitement avec du 8-MOP et irradiation aux UVA (Cunderlíková, 2014 ; Lauhlé, 2019).
Pour déterminer la dose de lumière ultraviolette à appliquer à la fraction de sang périphérique, on soumet les cellules JURKAT à une irradiation ultraviolette ayant une longueur d’onde comprise entre 200 et 320 nm, plus particulièrement entre 280 et 320 nm, et on détermine la dose de lumière suffisante pour induire un Delta-apoptose compris entre 30 et 40%, 24 heures après l’irradiation. Plus particulièrement, on détermine la dose de lumière suffisante pour induire en outre un Delta-apoptose compris entre 60 et 70%, 48 heures après irradiation.
Selon une première réalisation, les cellules JURKAT sont mises en suspension dans une solution saline de type PBS.
Dans une autre réalisation, les cellules JURKAT sont mises en suspension dans une solution à 2% d’hématocrite comprenant du plasma, notamment entre 30 et 40 % de plasma.
L’irradiation ultraviolette possède une longueur d’onde comprise entre 280 et 320 nm, notamment 310 nm, ou bien une longueur d’onde comprise entre 200 et 280 nm, notamment 255 nm.
Avantageusement, on détermine la dose d’irradiation suffisante pour en outre induire un taux d’inhibition de la prolifération des cellules JURKAT supérieure à 70% trois jours après l’irradiation.
Selon un autre aspect, l’invention concerne un système pour produire des cellules mononucléées apoptotiques contenues dans une fraction de sang périphérique d’un donneur, ledit système comprenant
(a) d’une part un récipient d’irradiation destiné à recevoir une fraction de sang périphérique contenant des cellules mononucléées, ledit récipient d’irradiation étant perméable aux rayons ayant une longueur d’onde comprise entre 200 et 320 nm, et
(b) d’autre part un appareil d’irradiation configuré pour être associé audit récipient d’irradiation, l’appareil d’irradiation comprenant une source de lumière ultraviolette émettant une irradiation ayant une longueur d’onde comprise entre 200 et 320 nm et une unité de pilotage configurée pour soumettre la fraction de sang périphérique contenue dans ledit récipient d’irradiation à ladite irradiation ultraviolette, ladite irradiation ultraviolette étant agencée pour induire une différence entre le taux d’apoptose des cellules irradiées et celui des cellules non irradiées supérieure à 15%, 48 heures après l’irradiation, notamment 24 heures après l’irradiation.
(a) d’une part un récipient d’irradiation destiné à recevoir une fraction de sang périphérique contenant des cellules mononucléées, ledit récipient d’irradiation étant perméable aux rayons ayant une longueur d’onde comprise entre 200 et 320 nm, et
(b) d’autre part un appareil d’irradiation configuré pour être associé audit récipient d’irradiation, l’appareil d’irradiation comprenant une source de lumière ultraviolette émettant une irradiation ayant une longueur d’onde comprise entre 200 et 320 nm et une unité de pilotage configurée pour soumettre la fraction de sang périphérique contenue dans ledit récipient d’irradiation à ladite irradiation ultraviolette, ladite irradiation ultraviolette étant agencée pour induire une différence entre le taux d’apoptose des cellules irradiées et celui des cellules non irradiées supérieure à 15%, 48 heures après l’irradiation, notamment 24 heures après l’irradiation.
Le récipient d’irradiation est destiné à recevoir la fraction de sang périphérique contenant les cellules mononucléées à irradier. Le récipient d’irradiation est en particulier apte à contenir et / ou transporter le fluide à irradier. Le récipient d’irradiation est souple ou solide.
Dans le cas d’une irradiation en flux continu, le récipient d’irradiation se présente par exemple sous la forme d’un tube, d’une poche formant un chemin d’écoulement en serpentin ou d’une cassette d’écoulement.
Dans le cas d’une irradiation en discontinu, le récipient d’irradiation est avantageusement sous forme d’une poche d’irradiation.
Un exemple d’une telle poche d’irradiation est représenté sur la . La poche 1 d’irradiation est réalisée dans un matériau perméable à la lumière ultraviolette telle que l’EVA. Sur la , la poche 1 d’irradiation comprend un orifice d’entrée 2 pour l’introduction de la fraction de sang périphérique dans la poche et un orifice de sortie 3. L’orifice d’entrée 2 est relié à une tubulure 4 se terminant par un perforateur 5. Le perforateur 5 est destiné à être connecté à une poche source contenant la fraction de sang comprenant les cellules mononucléées. La poche 1 d’irradiation comprend en outre un autre orifice d’accès 6 pour introduire une solution de dilution le cas échéant.
Le système comprend en outre un appareil 7 d’irradiation configuré pour être associé audit récipient d’irradiation 1.
Selon la , l’appareil 7 d’irradiation est configuré pour être associé à une poche 1 d’irradiation. L’appareil 7 d’irradiation comprend par exemple un plateau 8 sur lequel la poche 1 d’irradiation est destinée à être posée. La partie centrale 9 du plateau 8 est avantageusement perméable à la lumière ultraviolette ayant une longueur d’onde comprise entre 200 et 320 nm, en particulier entre 280 et 320 nm, afin de pouvoir irradier la poche 1 d’irradiation de part et d’autre. La partie centrale 9 du plateau 8 est par exemple réalisée en quartz.
De façon avantageuse, le plateau 8 est un plateau agitateur. Le plateau agitateur effectue par exemple un mouvement de rotation orbitale afin d’irradier de façon homogène le contenu de la poche 1 d’irradiation.
Le mouvement de rotation du plateau 8 est assuré par un moteur 10.
L’appareil 7 d’irradiation comprend en outre une source 11 de lumière ultraviolette émettant une irradiation ayant une longueur d’onde comprise entre 200 et 320 nm, en particulier comprise entre 280 et 320 nm, et encore plus particulièrement de l’ordre de 310 nm.
Sur la , la source 11 de lumière comprend une pluralité de lampes émettant une lumière ultraviolette émettant un rayonnement ayant une longueur d’onde comprise entre 200 et 320 nm, en particulier entre 280 et 320 nm.
Sur la , l’appareil 7 d’irradiation comprend deux bancs de six lampes disposés de part et d’autre du plateau 8 afin d’irradier la poche 1 d’irradiation par le dessus et le dessous.
En variante, la source 11 de lumière est composée d’un ou deux bancs de diodes électroluminescentes.
Sur la , des réflecteurs 12 sont prévus pour réfléchir la lumière émise par la source 11 de lumière vers la poche d’irradiation.
L’appareil 7 d’irradiation comprend en outre une unité de pilotage configurée pour soumettre la fraction de sang à ladite irradiation ultraviolette ayant une longueur d’onde comprise entre 200 et 320 nm, ladite irradiation ultraviolette étant agencée pour induire une différence entre le taux d’apoptose des cellules irradiées et celui des cellules non irradiées supérieure à 15%, 48 heures après l’irradiation.
En particulier, l’appareil 7 d’irradiation délivre au récipient d’irradiation une dose d’irradiation ultraviolette ayant une longueur d’onde comprise entre 200 et 320 nm, apte à induire chez les cellules mononucléées un Delta-apoptose supérieur à 15%, 24 heures après l’irradiation.
En particulier, l’irradiation ultraviolette possède une longueur d’onde comprise entre 280 et 320 nm.
Afin de contrôler la dose d’irradiation délivrée au récipient d’irradiation par l’appareil 7 d’irradiation, l’appareil 7 d’irradiation comprend un ou plusieurs capteurs optiques disposés au niveau de la source 11 de lumière. Ces capteurs optiques détectent l’intensité de l’irradiation émise par la source de lumière.
L’unité de pilotage se présente sous la forme d’un système électronique et informatique qui comprend par exemple un microprocesseur conçu pour exécuter un programme de commandes. L'exécution de ce programme permet à l’unité de pilotage de piloter notamment la source de lumière ultraviolette, en fonction par exemple des signaux reçus par le ou les capteurs optiques. L’unité de pilotage détermine par exemple le temps d’irradiation nécessaire pour atteindre la dose cible en fonction de l’intensité lumineuse déterminée par les capteurs optiques.
Selon une réalisation, la dose d’irradiation est déterminée en utilisant le modèle cellulaire JURKAT décrit ci-dessus.
Plus particulièrement, la dose d’irradiation est déterminée en modélisant la réponse des cellules JURKAT en terme de delta-Apoptose à l’aide d’un modèle numérique sigmoïde. En effet, même sans traitement d’irradiation, les cellules vont entrer en apoptose. Lorsque des doses élevées vont être appliquées, le taux d’apoptose va saturer. Entre ces deux extrêmes, la fonction est monotone : le Delta-apoptose augmente lorsque la dose augmente.
On décrit maintenant un procédé pour faire fonctionner le système décrit ci-dessus pour produire des cellules mononucléées apoptotiques contenues dans une fraction de sang périphérique d’un donneur.
Le procédé pour faire fonctionner ledit système comprend les étapes de :
(a) fournir un récipient d’irradiation avec une fraction de sang périphérique d’un donneur contenant des cellules mononucléées,
(b) placer ledit récipient d’irradiation dans un appareil d’irradiation comprenant une source de lumière ultraviolette émettant une irradiation ayant une longueur d’onde comprise entre 200 et 320 nm ;
(c) irradier ledit récipient d’irradiation dans ledit appareil d’irradiation avec ladite irradiation ultraviolette, ladite irradiation étant agencée pour induire une différence entre le taux d’apoptose des cellules irradiées et celui des cellules non irradiées supérieure à 15%, 48 heures après l’irradiation, notamment 24 heures après l’irradiation.
(a) fournir un récipient d’irradiation avec une fraction de sang périphérique d’un donneur contenant des cellules mononucléées,
(b) placer ledit récipient d’irradiation dans un appareil d’irradiation comprenant une source de lumière ultraviolette émettant une irradiation ayant une longueur d’onde comprise entre 200 et 320 nm ;
(c) irradier ledit récipient d’irradiation dans ledit appareil d’irradiation avec ladite irradiation ultraviolette, ladite irradiation étant agencée pour induire une différence entre le taux d’apoptose des cellules irradiées et celui des cellules non irradiées supérieure à 15%, 48 heures après l’irradiation, notamment 24 heures après l’irradiation.
En particulier, la source de lumière ultraviolette possède une longueur d’onde comprise entre 280 et 320 nm et/ou l’irradiation est agencée pour induire un Delta-apoptose supérieur à 15%, 24 heures après l’irradiation.
Après irradiation ultraviolette selon le procédé de l’invention, les cellules mononucléées sont capables de moduler la réponse immunitaire chez un patient.
Ainsi, l’invention porte sur l’utilisation des cellules mononucléées apoptotiques obtenues par le procédé décrit ci-dessus, pour le traitement des pathologies associées à un dysfonctionnement du système immunitaire. Ces pathologies sont par exemple les lymphomes à cellules T cutanés (LCTC) dont le syndrome de Sézary, la maladie du greffon contre l’hôte (GvHD), le rejet de greffe d’organe solide, la sclérodermie systémique, la dermatite atopique, le psoriasis, le lupus érythémateux et la maladie de Crohn.
Dans une réalisation particulière, les cellules mononucléées apoptotiques sont cryoconservées après l’irradiation ultraviolette pour être utilisées ultérieurement.
Exemples
Plusieurs expériences ont été réalisées afin de démontrer l’équivalence de la technique classique de PEC avec du 8-MOP/UVA en terme de réponse cellulaire et le procédé de l’invention.
1. Modèle cellulaire
Les cellules mononucléées de malades étant inaccessibles, une lignée de lymphocytes T issue de lymphomes humains appelée JURKAT a été choisie comme modèle cellulaire pour réaliser les expériences.
2. Les critères d’acceptation
Des critères permettant de valider l’efficacité in vitro d’une PEC classique (200-333 ng/ml de 8-MOP et 2 J/cm2d’UVA) sont l’apoptose des lymphocytes T et l’inhibition de la prolifération des lymphocytes T.
Dans le cas des cellules mononucléées d’un patient, les critères d’acceptation sont:
- un taux d’inhibition de la prolifération des cellules supérieur à 70% trois jours après la PEC et
- un Delta-apoptose supérieur à 15% 24 heures après la PEC (Taverna, 2015).
- un taux d’inhibition de la prolifération des cellules supérieur à 70% trois jours après la PEC et
- un Delta-apoptose supérieur à 15% 24 heures après la PEC (Taverna, 2015).
Sur le modèle cellulaire JURKAT, les critères d’acceptation sont
- un taux d’inhibition de la prolifération des cellules supérieur à 70% 3 jours après PEC et
- un Delta-apoptose supérieur à 30%, 24 heures après la PEC (Lauhlé, 2019).
- un taux d’inhibition de la prolifération des cellules supérieur à 70% 3 jours après PEC et
- un Delta-apoptose supérieur à 30%, 24 heures après la PEC (Lauhlé, 2019).
3. Préparation des cellules pour irradiation
Pour obtenir la quantité désirée de cellules JURKAT, celles-ci sont cultivées dans un milieu RPMI 1640 supplémenté en sérum de veau foetal (10% v/v) avec 1 % de L-Glutamine (Lonza), et 1% de Pénicilline-Streptomycine (Lonza). Les cellules sont cultivées en flacons de culture placés dans un incubateur à 37°C et 5% CO2. Le temps de doublement des JURKAT est d’environ 27 heures.
Selon les expériences, on utilise 10.106ou 400.106cellules JURKAT par récipient d’irradiation (boîtes de Petri ou poches d’irradiation).
Les cellules sont suspendues dans une solution de PBS (phosphate Buffer Saline) ou dans une solution à 2% d’hématocrite comprenant 1/14 de l’anticoagulant ACD-A, une mélange 50/50 v/v de NaCl et Plasma. Le volume final est tel que l’épaisseur de la suspension cellulaire dans le récipient est de l’ordre de 3 mm.
Dans le cas d’une irradiation aux UVA, la solution de cellules comprend en outre 200 ng/ml ou 333°ng/ml de 8-MOP.
3. Appareils d’irradiation
Trois types d’appareil d’irradiation ont été utilisés.
Le premier appareil est l’appareil d’irradiation Macogenic G2 de Maco Pharma (France) permettant d’irradier une poche. Il comprend six lampes délivrant des radiations UVA, disposées de part et d’autre d’un plateau en quartz, transparent aux UV. Le plateau agite la poche d’irradiation à une vitesse de 60 tours/minute pour assurer l’homogénéité de l’irradiation.
Le deuxième appareil est l’appareil d’irradiation Macotronic UV de Maco Pharma (France) permettant d’irradier une poche. Il comprend six lampes délivrant des radiations UVC (654 nm), disposées de part et d’autre d’un plateau en quartz, transparent aux UV. Le plateau agite la poche d’irradiation à une vitesse de 110 tours/minute pour assurer l’homogénéité de l’irradiation.
Le troisième appareil d’irradiation est l’irradiateur de hotte BS02 de chez Opsytec Dr Gröbel utilisé pour irradier une boîte de Petri. Cet irradiateur délivre des doses définies d’irradiation grâce à des lampes amovibles pouvant être placées à l’intérieur d’appareil. Les lampes utilisées sont des lampes UVA avec un pic à 352 nm, UVB avec un pic à 311 nm ou UVC avec un pic à 257nm. Un dosimètre contrôle le temps d’irradiation basé sur la dose d’irradiation mesurée par le capteur à l’intérieur de l’appareil. Pour assurer l’homogénéité de l’irradiation de la solution cellulaire, un agitateur orbital est placé à l’intérieur de la chambre d’irradiation de l’appareil. La vitesse d’agitation est d’environ 450 tours/minutes.
4. Caractérisation des cellules : tests d’apoptose et mesure de la prolifération cellulaire
A l’issue de l’étape d’irradiation, les solutions cellulaires avec un taux d’hématocrite à 2% sont lavées pour récupérer un maximum de cellules JURKAT pour les mettre en culture tout en ayant une faible contamination par les globules rouges. Pour cela, on réalise une séparation des composants par gradient de densité en utilisant une solution de ficoll (GE Healthcare).
Après isolement des JURKAT, trois lavages sont réalisés afin d’éliminer la solution de Ficoll. Les deux premiers lavages sont réalisés dans une solution de PBS avec 2 mM d’EDTA (Thermo Fisher) et le troisième dans une solution de PBS. Les cellules sont ensuite resuspendues dans du milieu RPMI supplémenté et sont comptées aux Vi-cell et à l’ABX afin d’estimer le nombre de JURKAT qui a pu être isolées et d’évaluer la quantité de globules rouges résiduelle.
Pour suivre les paramètres d’intérêts (apoptose et inhibition de la prolifération des JURKAT), les cellules sont mises culture à partir du comptage cellulaire. Pour cela, 5.106cellules traitées et 5.106cellules non traitées sont ensemencées dans un volume de 10 ml de milieu de culture.
4.1 Test d’apoptose
L’étude de l’apoptose est réalisée par cytométrie en flux, à l’aide d’un double marquage des cellules à l’annexine-V couplée à un fluorophore FITC et à l’iodure de propidium (IP).
On détermine le Delta-apoptose par la formule suivante : (%apoptose cellules traitées — %apoptose cellules non traitées)
4.2. Inhibition de la prolifération cellulaire
La population initiale des JURKAT est de 5.106cellules par flacon de culture. Le nombre de cellules par flacon de culture est ensuite compté au Vi-cell.
Pour cela, le milieu de culture avec les cellules est centrifugé à 1500 rpm pendant 5 minutes et le culot est resuspendu dans du milieu de culture RPMI supplémenté. Selon la densité cellulaire, une dilution au 1/10ème dans du PBS peut être effectuée.
Le pourcentage d’inhibition de la prolifération cellulaire au jour n (Jn) est déterminé par la formule suivante :
dans laquelle %P(Jn) est le taux de prolifération cellulaire à n jours, déterminé par la formule suivante :
Exemple 1 : Comparaison des traitements 8-MOP/UVA, UVB et UVC sur les cellules JURKAT dans du PBS
Le but de cette expérience est de déterminer les doses d’irradiation pour chacune des radiations donnant lieu à (i) un taux de Delta-apoptose des cellules JURKAT entre 30% et 40%, un jour après irradiation et 50% et 60%, deux jours après irradiation, et (ii) un pourcentage d’inhibition de prolifération supérieur à 70%, 3 jours après irradiation.
Dans un premier temps, ces expériences ont été conduites sur des cellules suspendues dans du PBS (sans plasma, ni hématocrite) afin de déterminer la dose d’irradiation minimale nécessaire.
La suspension cellulaire de 2 ml comprenant 10.106cellules est placée dans une boîte de Petri. Uniquement pour l’irradiation aux UVA, 200 ng/ml de 8-MOP a été ajouté à la suspension cellulaire. La boîte de Petri est ensuite disposée dans l’appareil d’irradiation BS02 pour être irradiée par l’une des trois irradiations UVA, UVB ou UVC. L’agitation est fixée à 450 tours/minute.
a. PEC 8-MOP/UVA
Pour l’irradiation aux UVA, la suspension cellulaire de JURKAT comprend 200 ng/ml de 8-MOP. Dans une première série, des doses d’irradiation aux UVA entre 0,03 et 0,4 J/cm2 ont été testées. Dans une deuxième série de test et sur la base des résultats obtenus avec les premiers tests, trois doses (0,1 J/cm², 0,13 J/cm² et 0,16 J/cm²) ont été utilisées. La dose d’UVA à 0,13 J/cm² répond au deux critères d’acceptation en terme de Delta-apoptose et inhibition de la prolifération ( et 4).
Pour toutes les doses de radiations UVA testées, le taux de nécrose des cellules est resté inférieur à 1%.
b. Irradiation UVB
Après avoir testé des doses d’irradiation allant de 0,5 m J/cm² à 1 J/cm², les doses d’intérêt ont été resserrées entre 1 et 11 mJ/cm². La dose de 7 mJ/cm² a été identifiées comme répondant au deux critères d’acceptation en terme de Delta-apoptose et inhibition de la prolifération ( et 6).
24 heures après l’irradiation, pour une dose d’irradiation à 7 mJ/cm², environ 20% des cellules sont apoptotiques tardives et 40% sont apoptotiques précoces.
Pour toutes les doses d’irradiation aux UVB entre 0,5 mJ/cm² et 1 J/cm², le taux de nécrose des cellules est inférieur à 1%.
c. Irradiation UVC
Après avoir testé des doses d’irradiation allant de 0,5 à 3,5 mJ/cm², les doses d’intérêt entre 1 et 5 mJ/cm2 ont été re-testées ( et 8) pour finalement tester trois doses (2 mJ/cm2, 2,5 mJ/cm2 et 3 mJ/cm2). La dose d’irradiation aux UVC de 2,5 mJ/cm2 a été identifiée comme répondant aux deux critères d’acceptation en terme de Delta-apoptose et inhibition de la prolifération.
24 heures après l’irradiation, pour une dose d’irradiation à 2 mJ/cm², environ 40% des cellules sont apoptotiques tardives et 30% sont apoptotiques précoces.
Il est à noter que, contrairement aux irradiations UVA/8-MOP et UVB, le Delta-apoptose n’augmente pas entre le premier et le deuxième jour avec l’irradiation aux UVC pour la dose de 2 mJ/cm².
Pour toutes les doses d’UVC testées, le taux de nécrose des cellules est resté inférieur à 1%.
Exemple 2 : Comparaison des traitements 8-MOP/UVA et UVB sur les cellules JURKAT suspendues dans une solution plasma/saline avec un taux d’hématocrite à 2%.
L’objectif de cette expérience est de déterminer les doses d’irradiation pour chacune des radiations permettant d’atteindre les critères d’acceptation suivant :
- un Delta-apoptose des cellules JURKAT entre 30% et 40% à jour +1 et 50% et 60% à jour +2, et
- un taux d’inhibition de la prolifération supérieure à 70% à J+3.
- un Delta-apoptose des cellules JURKAT entre 30% et 40% à jour +1 et 50% et 60% à jour +2, et
- un taux d’inhibition de la prolifération supérieure à 70% à J+3.
On a préparé une solution de 2 ml contenant 10.106cellules JURKAT à 2% d’hématocrite, 1/14 ACD-A, 50/50 v/v solution saline et plasma. Uniquement pour l’irradiation aux UVA, 333 ng/ml de 8-MOP a été ajouté.
La suspension cellulaire de 2 ml comprenant 10.106cellules est placée dans une boîte de Petri, puis la boîte de Petri est disposée dans l’appareil d’irradiation BS02. Cet appareil est utilisé pour les deux types d’irradiation UVA ou UVB. L’agitation est fixée à 450 tours/minute.
a. 8-MOP/UVA
En terme de Delta-apoptose et d’inhibition de la prolifération, les critères d’acceptation sont atteints pour une irradiation à 4 J/cm2 pour le Delta-apoptose et à 3 J/cm² pour le taux d’inhibition de la prolifération ( et 10).
b. UVB
En terme de Delta-apoptose, le critère d’acceptation est atteint à partir d’une dose de 0,1 J/cm2, tandis qu’en terme d’inhibition de la prolifération, le critère d’acceptation est atteint à partir de 0,025 J/cm2 ( et 12).
24 heures après l’irradiation, pour une dose d’irradiation à 0,1 J/cm², environ 40% des cellules sont apoptotiques tardives et 25 % sont apoptotiques précoces.
Exemple 3 : Traitement UVC sur les cellules JURKAT suspendues dans une solution saline/plasma avec un taux d’hématocrite à 2%.
Dans cette expérience, les cellules JURKAT ont été suspendues dans une solution à 2% d’hématocrite, 1/14 ACD-A, 50/50 v/v solution saline et plasma. La suspension cellulaire contenant 400.106de cellules et ayant un volume 330-400 ml est placée dans une poche perméable aux UVC.
L’irradiation a été réalisée avec l’appareil Macotronic UV de Macopharma (France). Deux doses de 25 mJ/cm² et 50 mJ/cm² ont été étudiées.
Les résultats montrent que le Delta-apoptose reste constant entre le premier jour post irradiation et le deuxième jour post irradiation à un taux d’environ 50% pour la dose d’UVC à 25 mJ/cm² et d’environ 70% pour la dose d’UVC à 50 mJ/cm².
En terme d’inhibition de la prolifération cellulaire trois jours après irradiation, celui-ci est d’environ 65% pour la dose de 25 mJ/cm² et d’environ 80% pour la dose de 50 mJ/cm².
Exemple 4 : corrélation avec la technique PEC de Maco Pharma
En utilisant la même matrice que dans l’exemple 2, des cellules JURKAT (330. 106cellules dans 300 ml, 333 ng/ml de 8-MOP) ont été irradiées à l’aide du système PEC commercialisé par Maco Pharma.
Le système PEC de Maco Pharma est composé d’une poche perméable aux UVA et de l’appareil d’irradiation Macogenic G2 conçu pour délivrer une dose d’irradiation de 2 à 2,5 J/cm2en fonction de l’hématocrite de la solution contenue dans la poche à irradier. Le cycle d’irradiation dure environ 12 minutes.
Les critères d’acceptation en terme de Delta-apoptose et d’inhibition de la prolifération sont atteints à partir d’une dose de 2 J/cm2, ce qui correspond aux recommandations du système.
Afin de modéliser la réponse cellulaire en terme de Delta-apoptose, un modèle numérique sigmoïde est applicable.
La montre la représentation graphique des résultats obtenu avec une échelle logarithmique pour les doses d’irradiation.
Les critères d’acceptation dépendent du couple récipient/appareil d’irradiation et de la configuration optique du système. Par exemple une dose de 2,1 J/cm2en UVA délivrée avec la Macogenic G2 est équivalente à une dose de 4 J/cm2avec l’irradiateur BS02 en UVA ou 0,081 J/cm2avec l’irradiateur BS02 en UVB.
Exemple 4 : modèles splénocytes murins
Dans le cadre de la préparation d’une étude sur un modèle murin de GvH, une expérience a été menée afin de vérifier si les doses trouvées en irradiant les JURKAT (exemple 1) pourraient induire l’apoptose des splénocytes de souris.
Une suspension de splénocytes (Immune InsighT, France) contenant 5.106cellules a été irradiée avec l’irradiateur BS02 aux doses suivantes : 0,13 J/cm² pour les UVA/8-MOP, 7 mJ/cm² et 70 mJ/cm² pour les UVB et 2,5 mJ/cm² pour les UVC.
Dans le cas de l’irradiation avec des UVA, la suspension cellulaire contient 200 ng/ml de 8-MOP.
Chaque dose testée induit de l’apoptose. Il est à noter que le taux de Delta-apoptose diminue 2 jours après irradiation, ceci est dû à un fort taux d’apoptose mesuré chez le contrôle ( à 16).
Claims (15)
- Procédé pour produire des cellules mononucléées apoptotiques contenues dans une fraction de sang périphérique d’un donneur, ledit procédé comprenant l’étape consistant à soumettre ladite fraction de sang à une irradiation ultraviolette, caractérisé en ce que ladite irradiation ultraviolette possède une longueur d’onde comprise entre 200 nm et 320 nm, ladite irradiation étant agencée pour induire une différence entre le taux d’apoptose des cellules irradiées et celui des cellules non irradiées supérieure à 15%, 48 heures après l’irradiation, de sorte à obtenir des cellules mononucléées apoptotiques capables de moduler la réponse immunitaire chez un patient.
- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l’irradiation est agencée pour induire une différence entre le taux d’apoptose des cellules irradiées et celui des cellules non irradiées inférieure à 15%, 24 heures après l’irradiation.
- Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l’irradiation est agencée pour induire en outre un taux d’inhibition de la prolifération cellulaire supérieure à 70% trois jours après irradiation.
- Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l’irradiation ultraviolette possède une longueur d’onde comprise entre 280 et 320 nm, notamment 310 nm.
- Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ladite fraction du sang a été obtenue par leucaphérèse et/ou en isolant la couche leuco-plaquettaire d’un échantillon de sang total.
- Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la fraction de sang périphérique comprend plus de 90% de cellules mononucléées.
- Procédé selon l’une quelconque des revendication 1 à 6 caractérisé en ce que, préalablement à l’étape d’irradiation, le procédé comprend l’étape de diluer la fraction de sang périphérique avec une solution saline.
- Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la fraction du sang contient un taux d’hématocrite allant de 0 à 8% et/ou un taux de plasma compris entre 30 et 50%.
- Procédé selon l’une quelconque des revendication 1 à 8 caractérisé en ce que, la fraction de sang périphérique présente un volume compris entre 6 ml et 200 ml.
- Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la fraction du sang contenant les cellules mononucléées est agitée pendant l’irradiation.
- Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que la fraction du sang contenant les cellules mononucléées est dépourvue d’agent photoactif ou d’agent induisant l’apoptose.
- Système pour produire des cellules mononucléées apoptotiques contenues dans une fraction de sang périphérique d’un donneur selon le procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 11, ledit système comprenant :
(a) d’une part un récipient d’irradiation destiné à recevoir des cellules mononucléées contenues dans une fraction de sang périphérique, ledit récipient d’irradiation étant perméable aux rayons ayant une longueur d’onde comprise entre 200 et 320 nm, et d’autre part
(b) un appareil d’irradiation configuré pour être associé audit récipient d’irradiation, l’appareil d’irradiation comprenant une source de lumière ultraviolette émettant un rayonnement ayant une longueur d’onde comprise entre 200 et 320 nm et une unité de pilotage configurée pour soumettre cette fraction de sang périphérique contenue ledit récipient d’irradiation à ladite irradiation ultraviolette, ladite irradiation ultraviolette étant agencée pour induire une différence entre le taux d’apoptose des cellules irradiées et celui des cellules non irradiées supérieure à 15%, 48 heures après l’irradiation. - Système selon la revendication 12, caractérisé en ce que l’appareil d’irradiation comprend en outre un plateau agitateur.
- Procédé pour faire fonctionner un système selon la revendication 12 ou 13 pour produire des cellules mononucléées apoptotiques contenues dans une fraction de sang périphérique d’un donneur, ledit procédé comprenant les étapes de
(a) fournir un récipient d’irradiation comprenant une fraction de sang périphérique d’un donneur contenant des cellules mononucléées,
(b) placer ledit récipient d’irradiation dans un appareil d’irradiation comprenant une source de lumière ultraviolette émettant un rayonnement ayant une longueur d’onde comprise entre 200 et 320 nm ;
(c) irradier ledit récipient d’irradiation dans ledit appareil d’irradiation avec ladite irradiation ultraviolette, ladite irradiation étant agencée pour induire une différence entre le taux d’apoptose des cellules irradiées et celui des cellules non irradiées supérieure à 15%, 48 heures après l’irradiation. - Cellules mononucléées apoptotiques obtenues par le procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 11, pour le traitement des pathologies associées à un dysfonctionnement du système immunitaire telles que les lymphomes à cellules T cutanés (LCTC) dont le syndrome de Sézary, la maladie du greffon contre l’hôte (GvHD), le rejet de greffe d’organe solide, la sclérodermie systémique, la dermatite atopique, le psoriasis, le lupus érythémateux et la maladie de Crohn.
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2021
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