CN113106053A - 治疗性汇集的血液凋亡细胞制剂与其用途 - Google Patents

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Abstract

描述了包含汇集和富集的单个核凋亡细胞群体的细胞制备物，以及制备这种细胞制备物的方法。汇集的单个核凋亡细胞制备物可以获自汇集的异基因白血细胞部分，所述部分在诱导凋亡之前或之后汇集。此外，本文描述了使用这些汇集的凋亡细胞制备物用于治疗对象的免疫疾病、发炎性疾病、自体免疫疾病或不孕症的方法。举例来说，汇集的凋亡细胞制备物可以用于治疗异基因对象的移植物抗宿主疾病(GVHD)。

Description

治疗性汇集的血液凋亡细胞制剂与其用途
本申请为申请日为2016年4月21日、申请号为201680029277.4、发明名称为“治疗性汇集的血液凋亡细胞制剂与其用途”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本申请是针对包含汇集和富集的单个核凋亡细胞群体的细胞制备物以及制备所述细胞制备物的方法。此外，本文描述了这些汇集的细胞制备物用于治疗对象的免疫疾病、发炎性疾病、细胞因子释放综合症(CRS)、细胞因子风暴或自体免疫疾病的用途。
背景技术
特征为病理性免疫反应的疾病包括与显著的死亡率和发病率相关联的许多疾病，特别是自体免疫疾病，诸如全身性红斑狼疮(SLE)，和移植相关疾病，诸如移植物抗宿主疾病(GVHD)。自体免疫疾病一般可以分成两种一般类型，即全身性自体免疫疾病(例如，SLE和硬皮病)，和器官特异性自体免疫疾病，诸如多发性硬化症和糖尿病。
免疫遏制药物已经用于治疗或预防移植的器官和组织(例如，骨髓、心、肾、肝)的排斥反应；用于治疗自体免疫疾病或最可能是自体免疫起源的疾病的疾病(例如，类风湿性关节炎、多发性硬化症、重症肌无力、全身性红斑狼疮、肉状瘤病、克罗恩氏病(Crohn'sdisease)、白塞氏病(Behcet's Disease)、天疱疮、葡萄膜炎以及溃疡性结肠炎)；治疗一些其它非自体免疫发炎性疾病(例如，长期过敏性哮喘控制)以及移植相关疾病(例如，GVHD)。然而，免疫遏制药物治疗可以导致许多并发症，并且需要用于处理病理性免疫反应的改进方法。
在异基因骨髓移植(alloBMT)中，供体骨髓输注至患者体内需要来自两个免疫系统的细胞的相互作用。用于接受异基因移植物的患者的预处理方案通过遏制免疫系统允许供体干细胞植入患者中。一旦在患者体内建立供体的免疫细胞，这些免疫细胞可以识别患者自身的组织和细胞，包括任何残留癌细胞，因为是不同的或外来的。免疫系统然后可以对诸如肝、胃肠道或皮肤的某些器官造成损害；这种效应被称为移植物抗宿主疾病(GVHD)。
截止今天，GVHD预防包含免疫遏制药物的组合，包括钙调神经磷酸酶抑制剂(calcineurin inhibitor，CNI)、环孢霉素(cyclosporine)或他克莫司(tacrolimus)，和甲氨蝶呤(methotrexate)、吗替霉酚酸酯(mycophenolate mofetil，MMF)或西罗莫司(sirolimus)。然而，急性GVHD仍然在从人类白细胞抗原(HLA)相合的同胞接受移植物的35％至70％的BMT患者中发生，并且在无关供体移植物接受体中甚至更加频繁。
尽管钙调神经磷酸酶抑制剂(CNI)部分地抑制急性GVHD，但其通过抑制T细胞发育并且增加疾病复发的风险可以削弱免疫重建。因此，经历异基因BMT的患有血液恶性病的患者需要GVHD预防，这将使CNI的使用减至最低，防止GVHD，并且保留功能免疫系统，包括有益的移植物抗肿瘤效应。
凋亡细胞是能够直接和间接诱导对树突状细胞和巨噬细胞的免疫耐受性的免疫调节细胞。许多动物实验证实了独立于基因配型的免疫调节作用。启发性地，来自基因不相合的小鼠的凋亡细胞与来自基因相合的小鼠(同基因)一样有效。组合基因不相合的凋亡血液样品的能力，其中创建来自从患者或供体收集的外周细胞(白细胞去除术)的具有高的致耐受潜力(具有免疫耐受性)的稳定凋亡细胞的过程是高度可再现的，可以提供用于在对象中诱导免疫耐受性的独特的和成本有效的来源。
不过，不相合的白血细胞(WBC)的使用引起两个潜在问题。第一个是对抗凋亡细胞的可能免疫反应(在细胞死亡的过程中)。第二个将是来自在凋亡细胞的任何汇集池中留下的活细胞部分的反应，这是因为并非所有经过诱导以创建凋亡群体的WBC必须变成凋亡的。因此，所施用的凋亡WBC的一部分将含有一些活细胞。活细胞可以在接受体中引发GVHD。
当前，在以色列从供体每天加工约1,000个血液单位，大多数通过红大卫盾会(Magen David Adom，MDA)。WBC部分是未加工的或被加工成血沉棕黄层供研究使用。有可能在袋中接收这个WBC部分，其中存在接近2×107个白血细胞，当中约0.7×107个是单个核细胞，这对于凋亡细胞产生是优选的。根据当前估计，产生效率为约50％。
对用于治疗或预防包括自体免疫和发炎性疾病的免疫病症以及移植相关疾病的组合物和方法仍然存在未满足的需要。举例来说，估计的发生率是30％-70％的GVHD仍然是成功的异基因血液或骨髓移植的主要障碍，并且尚未建立GVHD预防的最佳方法。特别地，至关重要的是获得以安全、可靠、可再现以及有效的方式预防或改善GVHD的组合物和方法。
本文中在下文描述的细胞制备物和其组合物通过提供包含获自多个个别血液供体或个别血液捐献的汇集的凋亡细胞的通用产物来解决这个需要。此外，汇集的凋亡细胞制备物可以用于治疗包括自体免疫和发炎性疾病的免疫病症、移植相关疾病和病状、细胞因子释放综合症(CRS)、细胞因子风暴以及不孕症。
发明内容
在一个方面，本文公开了一种包含处于早期凋亡状态中的单个核细胞的汇集的单个核凋亡细胞制备物，其中所述汇集的单个核凋亡细胞制备物包含汇集的个别单个核细胞群体，并且其中所述汇集的单个核凋亡细胞制备物包含
百分比减少的非休眠非凋亡细胞；
细胞活化遏制的任何活的非凋亡细胞；或
增殖降低的任何活的非凋亡细胞；
或其任何组合。
在一个相关方面，所述汇集的个别单个核细胞群体包含在诱导所述个别单个核细胞群体的凋亡之前或诱导所述个别单个核细胞群体的凋亡之后汇集的个别单个核细胞群体。在另一个方面，汇集的个别单个核细胞群体包含独立于所述个别单个核细胞群体的HLA标志的HLA配型而汇集的群体。在另一个方面，所获得的汇集的单个核凋亡细胞制备物包含获自存在于介于约2个与25个之间的血液单位中的细胞的单个核细胞群体。在另一个方面，血液包含来自血液捐献的白血细胞(WBC)部分。在另一个方面，个别单个核细胞群体包含选自由以下组成的群组的至少一种细胞类型：淋巴细胞、单核白细胞、树突状细胞以及天然杀伤细胞。在进一步方面，个别单个核细胞群体包含来自对于接受体对象而言HLA相合的来源或HLA不相合的来源的异基因细胞。
在一个相关方面，汇集的个别单个核细胞群体包含有包含非活性T细胞受体或降低的免疫活性的细胞。在另一个方面，汇集的个别单个核细胞群体包含受辐照的细胞群体。在另一个方面，辐照包含γ辐照或UV辐照。在另一个方面，汇集的个别单个核细胞群体包含在所述辐照之前或所述辐照之后汇集的群体。在另一个方面，与未受辐照的细胞群体相比，受辐照的细胞群体包含每个群体的百分比减少的非休眠非凋亡细胞。
在一个方面，本文描述了一种医药组合物，其包含如本文所公开的细胞制备物。
在一个方面，本文公开了一种产生包含有包含处于早期凋亡状态中的汇集的个别单个核细胞群体的汇集的单个核凋亡细胞制备物的医药组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)获得外周血液的个别单个核富集的细胞群体；
(b)在包含抗凝剂的冷冻介质中冷冻所述单个核富集的细胞群体；
(c)解冻所述单个核富集的细胞群体；
(d)在包含约10-100μg/mL最终浓度的甲基强的松龙(methylprednisolone)和抗凝剂的凋亡诱导孵育介质中孵育所述单个核富集的细胞群体；
(e)使所述凋亡细胞群体再悬浮于施用介质中；以及
(f)灭活所述单个核富集的群体，其中所述灭活在任何步骤(a)至(e)之后发生；以及
(g)汇集所述单个核富集的群体，其中所述汇集在任何步骤(a)至(f)之后发生；
其中所述方法产生包含有包含处于早期凋亡状态中的汇集的个别单个核细胞群体的汇集的单个核凋亡细胞制备物的医药组合物。
在一个相关方面，灭活步骤包括在所述汇集的单个核凋亡细胞制备物内减少非休眠非凋亡细胞的百分比，遏制任何活的非凋亡细胞的细胞活化，或降低任何活的非凋亡细胞的增殖，或其任何组合。在另一个方面，获得所述个别单个核富集的细胞群体包括通过白细胞去除术从多个个别供体获得白血细胞(WBC)部分。在另一个方面，白血细胞(WBC)部分包含获自血库的WBC部分。在另一个方面，白血细胞(WBC)部分包含选自由淋巴细胞、单核白细胞、树突状细胞以及天然杀伤细胞组成的群组的至少一种细胞类型。在另一个方面，白血细胞(WBC)部分从约2至25个血液单位收集。在另一个方面，所述单个核富集的细胞群体的获得不受所述个别单个核富集的细胞群体的HLA配型的限制。在另一个方面，孵育历时约2-12小时。在另一个方面，个别单个核富集的细胞群体包含来自对于接受体对象而言HLA相合的来源或HLA不相合的来源的异基因细胞。
在一个相关方面，步骤(f)灭活所述单个核富集的群体包括遏制或消除所述个别群体中的免疫反应，遏制或消除所述个别群体之间的交叉反应性，或降低或消除所述个别群体中的T细胞受体活性，并且其中包含所述汇集的单个核凋亡细胞制备物的所述产生的医药组合物包含在所述细胞制备物内百分比减少的活的非凋亡细胞、细胞活化遏制的任何活的非凋亡细胞、或增殖降低的任何活的非凋亡细胞，或其任何组合。在另一个方面，灭活所述单个核富集的群体包括辐照所述单个核富集的群体。在另一个方面，辐照包含γ辐照或UV辐照。在另一个方面，辐照包含约25-30戈瑞单位(Grey unit，Gy)。
在一个方面，本文公开了一种在有需要的对象中治疗、预防、改善、抑制免疫疾病、自体免疫疾病、细胞因子释放综合症(CRS)、细胞因子风暴或发炎性疾病或降低免疫疾病、自体免疫疾病、细胞因子释放综合症(CRS)、细胞因子风暴或发炎性疾病的发生率的方法，其包括向对象施用包含如本文所描述的汇集的单个核凋亡细胞制备物的医药组合物，或本文所描述的组合物，或通过本文所描述的方法制备的组合物。在一个方面，免疫疾病选自包含GVHD、关节炎、痛风或炎症性肠病的群组。在另一个方面，对象罹患造血恶性病，保留移植物抗肿瘤或移植物抗白血病(GVL)效应，经历造血干细胞移植(HSCT)，或经历实体器官移植。在另一个方面，HSCT是异基因HSCT并且所述医药组合物包含获自与所述对象或与所述供体的HLA不相合的多个异基因供体的细胞。在另一个方面，医药组合物的施用在所述移植之前至多24小时进行，与移植同时进行，或在所述移植之后直至15天施用。在进一步方面，医药组合物通过静脉内注射来施用。
附图说明
视为本文所公开的主题在说明书的结论部分特别地指出并且清楚地要求。然而，组织和操作方法连同其目标、特征以及优点通过参考以下详细描述当与附图一起阅读时可以最好地了解，在附图中：
图1呈现了显示来自多个个别供体(蓝色)的单次凋亡细胞制备物注射对存活的明确作用(p<0.01)的图。所呈现的图是在用来自多个个别供体的单剂量受辐照的汇集的凋亡细胞制备物处理的GvHD小鼠模型中的卡普兰-梅尔(Kaplan-Meier)存活曲线。
图2呈现了显示来自多个个别供体(蓝色)的单次凋亡细胞制备物注射对2个比较组的重量损失百分数的明确作用(p<0.01)的图。
图3呈现了显示使用诱导的GvHD的小鼠模型在施用单剂量的单供体与多供体凋亡细胞制备物+/-辐照之间对存活％的比较的图。
图4A-B呈现了通过HLA-DR的表达测量，显示在与凋亡细胞相互作用之后树突状细胞(DC)成熟的抑制的效力测试的结果。图4A.新鲜的最终产物A(t0)的HLA DR平均荧光。图4B.在2-8℃下24小时后最终产物A的HLA DR平均荧光。
图5A-B呈现了通过CD86的表达测量，显示在与凋亡细胞相互作用之后树突状细胞(DC)成熟的抑制的效力测试的结果。图5A.新鲜的最终产物A(t0)的CD86平均荧光。图5B.在2-8℃下24小时后最终产物A的CD86平均荧光。
应了解，为说明简单和清楚起见，图式中显示的要素不一定按比例绘制。举例来说，为清楚起见，一些要素的尺寸相对于其它要素可以放大。此外，在认为适当之处，参考数字在图式当中可以重复以指示相应或类似的要素。
具体实施方式
本申请要求2015年4月21日提交的美国专利临时申请号62/150,305的权利。
在以下详细描述中，陈述众多特定细节以提供本文中的公开的透彻了解。然而，本领域的技术人员应了解，细胞制备物、制造细胞制备物的方法以及使用这些细胞制备物的方法可以在无这些特定细节的情况下实施。在其它情况下，并未详细描述所熟知的方法、程序以及组分以不模糊本文所呈现的公开。
在一个实施方案中，本公开提供了一种包含处于早期凋亡状态中的单个核细胞的汇集的单个核凋亡细胞制备物，其中所述汇集的单个核凋亡细胞制备物包含汇集的个别单个核细胞群体，并且其中所述汇集的单个核凋亡细胞制备物包含百分比减少的活的非凋亡细胞、细胞活化遏制的任何活的非凋亡细胞、或增殖降低的任何活的非凋亡细胞，或其任何组合。在另一个实施方案中，汇集的单个核凋亡细胞已经受辐照。在另一个实施方案中，本公开提供了一种汇集的单个核凋亡细胞制备物，在一些实施方案中，所述细胞制备物使用获自捐献的血液的白血细胞部分(WBC)。这种WBC部分常常在血库中被抛弃或旨在用于研究中。
在一个实施方案中，细胞制备物被灭活。在另一个实施方案中，灭活包含辐照。在另一个实施方案中，灭活包含T细胞受体灭活。在另一个实施方案中，灭活包含T细胞受体编辑。在另一个实施方案中，灭活包含遏制或消除所述制备物中的免疫反应。在另一个实施方案中，灭活包含遏制或消除包含于制备物中的多个个别群体之间的交叉反应性。在其它实施方案中，灭活包含降低或消除包含于制备物中的多个个别群体之间的T细胞受体活性。在另一个实施方案中，灭活的细胞制备物包含百分比减少的活的非凋亡细胞、细胞活化遏制的任何活的非凋亡细胞、或增殖降低的任何活的非凋亡细胞，或其任何组合。在另一个实施方案中，灭活的细胞制备物包含与未受辐射的细胞制备物相比数目减少的非休眠非凋亡细胞。
在另一个实施方案中，辐照包含γ辐照或UV辐照。在又一个实施方案中，受辐照的制备物具有与未受辐照的细胞制备物相比数目减少的非休眠非凋亡细胞。
在另一个实施方案中，汇集的单个核凋亡细胞已经经历T细胞受体灭活。在另一个实施方案中，汇集的单个核凋亡细胞已经经历T细胞受体编辑。
在一个实施方案中，汇集的血液包含来自对于接受体而言HLA相合的来源或HLA不相合的来源的第三方血液。
在一个实施方案中，本公开提供了产生包含有包含处于早期凋亡状态中的汇集的个别单个核细胞群体的汇集的单个核凋亡细胞制备物的医药组合物的方法，其中所述组合物包含百分比减少的活的非凋亡细胞、具有细胞活化遏制的任何活的非凋亡细胞的制备物、或具有增殖降低的任何活的非凋亡细胞的制备物，或其任何组合。在另一个实施方案中，所述方法提供了包含有包含处于早期凋亡状态中的汇集的个别单个核细胞群体的汇集的单个核凋亡细胞制备物的医药组合物，其中所述组合物包含百分比减少的非休眠非凋亡细胞。
在另一个实施方案中，本公开提供了使用如本文所描述的包含处于早期凋亡状态中的单个核细胞的汇集的单个核凋亡细胞制备物用于在有需要的对象中治疗、预防、改善、抑制免疫疾病、自体免疫疾病、发炎性疾病、细胞因子释放综合症(CRS)、细胞因子风暴或不孕症或降低免疫疾病、自体免疫疾病、发炎性疾病、细胞因子释放综合症(CRS)、细胞因子风暴或不孕症的发生率的方法。在另一个实施方案中，本文公开了一种汇集的单个核凋亡细胞制备物，其中这种细胞制备物的使用在某些实施方案中不需要供体与接受体配型相合，例如通过HLA分型。
汇集的单个核凋亡细胞制备物
在一个实施方案中，本公开提供了一种包含处于早期凋亡状态中的单个核细胞的汇集的单个核凋亡细胞制备物，其中所述汇集的单个核凋亡细胞制备物包含汇集的个别单个核细胞群体，并且其中所述汇集的单个核凋亡细胞制备物包含
百分比减少的非休眠非凋亡细胞；
细胞活化遏制的任何活的非凋亡细胞；或
增殖降低的任何活的非凋亡细胞；
或其任何组合。
在另一个实施方案中，一种包含处于早期凋亡状态中的单个核细胞的汇集的单个核凋亡细胞制备物，其中所述汇集的单个核凋亡细胞制备物包含汇集的个别单个核细胞群体，并且其中所述汇集的单个核凋亡细胞制备物包含数目减少的非休眠非凋亡细胞。
技术人员应了解，在一个实施方案中，术语“汇集”涵盖从多个个别供体收集、制备并且可能储存以供稍后使用的血液，其中获自多个个别供体的血液的单个核富集的细胞群体被组合，例如，在获得外周血液的个别单个核富集的细胞群体之后在制备的任何步骤之后或同时被组合。或者，在另一个实施方案中，汇集在冷冻所述单个核富集的细胞群体之后或同时发生。在另一个实施方案中，汇集在解冻所述单个核富集的细胞群体之后或同时发生。在另一个实施方案中，汇集在孵育以诱导凋亡之后或同时发生。在又一个实施方案中，汇集在使细胞的凋亡群体再悬浮之后或同时发生。在另一个实施方案中，汇集在灭活单个核细胞群体的步骤之后或同时发生。
然后可以继续加工单个核富集的细胞群体的组合的汇集池以产生如本文所描述的汇集的单个核凋亡细胞制备物。
在另一个实施方案中，技术人员应认识到，术语“汇集”涵盖从个别供体收集、个别地制备成凋亡细胞制备物并且可能储存的血液，其中所述制备物在凋亡细胞制备物再悬浮的时候“汇集”。在另一个实施方案中，从个别供体收集的血液的制备是同时和平行的。在另一个实施方案中，从个别供体收集的血液的制备不是同时的。
在另一个实施方案中，细胞在临近下文的制备方法中所描述的孵育步骤之前汇集，其中凋亡被诱导。在另一个实施方案中，如下文的制备方法中所描述，细胞在孵育步骤之后在再悬浮的步骤处汇集。在另一个实施方案中，细胞在临近辐照步骤之前汇集。在另一个实施方案中，细胞在灭活步骤之后汇集。在另一个实施方案中，细胞在辐照步骤之后汇集。在另一个实施方案中，细胞在下文的制备方法中所描述的任何步骤处汇集。在又一个实施方案中，如本文所描述的汇集的单个核凋亡细胞制备物包含在诱导所述个别单个核细胞群体的凋亡之前或诱导所述个别单个核细胞群体的凋亡之后汇集的个别单个核细胞群体。
在另一个实施方案中，汇集的单个核凋亡细胞制备物确保单个核凋亡细胞的现成供给可供用于在对象中治疗、预防、改善、抑制免疫疾病、自体免疫疾病、发炎性疾病、细胞因子释放综合症(CRS)或细胞因子风暴或降低免疫疾病、自体免疫疾病、发炎性疾病、细胞因子释放综合症(CRS)或细胞因子风暴的发生率。
在一个实施方案中，汇集的凋亡细胞制备物获自存在于介于约2个与25个之间的血液单位中的细胞。在另一个实施方案中，所述汇集的凋亡细胞制备物由存在于介于约2-5、2-10、2-15、2-20、5-10、5-15、5-20、5-25、10-15、10-20、10-25、6-13或6-25个之间的血液单位中的细胞组成。在另一个实施方案中，所述汇集的凋亡细胞制备物由存在于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个血液单位中的细胞组成。所需要的血液单位的数目也取决于从血液回收WBC的效率。举例来说，低效率的WBC回收将导致需要额外的单位，对比高效率的WBC回收将导致需要更少的单位。在一些实施方案中，每个单位是血袋。在另一个实施方案中，汇集的凋亡细胞制备物由存在于至少25个血液单位、至少50个血液单位或至少100个血液单位中的细胞组成。
在一个实施方案中，血液单位包含来自血液捐献的白血细胞(WBC)部分。在另一个实施方案中，捐献可以来自血液中心或血库。在另一个实施方案中，捐献可以来自医院中在制备汇集的凋亡细胞制备物的时候采集的供体。在另一个实施方案中，包含来自多个个别供体的WBC的血液单位在创建用于如本文所公开的目的的独立血库中保存并维护。在另一个实施方案中，开发用于如本文所公开的能够供给包含来自多个个别供体的WBC的血液单位的目的的血库包含白细胞去除术单位。
在一个实施方案中，汇集的WBC的单位不受HLA配型的限制。因此，所得汇集的凋亡细胞制备物包含不受HLA配型的限制的细胞群体。因此，在某些实施方案中，汇集的单个核凋亡细胞制备物包含异基因细胞。
虽然人类对象的单体型配型常规地在本领域中在治疗性移植的情形中实施，并且通常涉及HLA-A、HLA-B以及HLA-DR等位基因的配型，但获自不受HLA配型的限制的汇集的WBC的如本文所公开的汇集的单个核凋亡细胞制备物的优点是WBC的现成来源和获得WBC的降低成本。
在一个实施方案中，汇集的血液包含独立于HLA配型的来自多个个别供体的血液。在另一个实施方案中，汇集的血液包含来自多个个别供体的血液，其中已经考虑到与接受体的HLA配型。举例来说，其中1个HLA等位基因、2个HLA等位基因、3个HLA等位基因、4个HLA等位基因、5个HLA等位基因、6个HLA等位基因或7个HLA等位基因已经在供体与接受体之间相合。在另一个实施方案中，如本文所公开，多个个别供体部分地相合，例如一些供体已经HLA相合，其中1个HLA等位基因、2个HLA等位基因、3个HLA等位基因、4个HLA等位基因、5个HLA等位基因、6个HLA等位基因或7个HLA等位基因已经在一些供体与接受体之间相合。
在一个实施方案中，包含汇集的个别单个核细胞群体的本文所描述的细胞制备物包含独立于个别单个核细胞群体的HLA标志的任何HLA配型而汇集的群体。在另一个实施方案中，包含汇集的个别单个核细胞群体的如本文所公开的细胞制备物包含来自对于接受体对象而言HLA相合的来源或HLA不相合的来源的同种异体细胞。
在下文的实施例中解决的一个问题是实验室动物(例如，GvHD的鼠类模型)对如本文所公开的汇集的单个核凋亡细胞制备物的反应。在某些实施方案中，一些有活力的非凋亡细胞(可能是抗凋亡细胞)在下文所描述的诱导凋亡步骤之后仍存在。
在一个实施方案中，有活力的非凋亡细胞包含活细胞，其为膜联蛋白V(AnnexinV)阴性和碘化丙锭(Propidium Iodide)阴性的。本领域的技术人员应了解，术语“有活力的非凋亡细胞”可以与“非休眠非凋亡细胞”互换使用。因此，技术人员应了解，非休眠非凋亡细胞是膜联蛋白V阴性和碘化丙锭阴性的。
这些有活力的非凋亡细胞可能能够增殖或被活化。在移植的情况下，汇集的单个核凋亡细胞制备物的细胞可以连同新移植物一起施用。在某个实施方案中，获自多个个别供体的汇集的单个核凋亡细胞制备物可以针对宿主活化并且另外可以针对彼此活化。在某些实施方案中，所施用的约10-20％有活力的非凋亡细胞可以变成植入的并且有功能性。
在一个实施方案中，如本文所公开的汇集的单个核凋亡细胞制备物包含灭活的细胞制备物。在另一个实施方案中，灭活的细胞制备物包含有包含非活性T细胞受体的细胞。在另一个实施方案中，灭活的细胞制备物包含有包含降低的免疫反应的细胞。在另一个实施方案中，灭活的细胞制备物包含有包含非活性T细胞受体或降低的免疫反应的细胞。在另一个实施方案中，灭活的细胞制备物包含多个个别单个核群体，在所述群体之间具有遏制或消除的交叉反应性。在另一个实施方案中，灭活的细胞制备物包含具有降低或消除的T细胞受体活性的多个个别单个核群体。在另一个实施方案中，灭活的细胞制备物包含数目减少的休眠非凋亡细胞。在另一个实施方案中，灭活的细胞制备物包含降低或消除的免疫反应。在另一个实施方案中，灭活的细胞制备物包含一个对另一个具有降低或消除的交叉反应性的汇集的个别单个核群体。在另一个实施方案中，包含汇集的个别单个核细胞群体的灭活的细胞制备物包含受辐照的细胞群体。
在一个实施方案中，如本文所公开的受辐照的细胞制备物或细胞群体具有与未受辐照的细胞制备物或群体相比遏制的细胞活化和降低的增殖。在另一个实施方案中，辐照包含γ辐照或UV辐照。在另一个实施方案中，受辐照的细胞制备物或群体具有与未受辐照的细胞制备物相比百分比减少的非休眠非凋亡细胞。在另一个实施方案中，受辐照的细胞制备物或群体具有与未受辐照的细胞制备物相比数目减少的非休眠非凋亡细胞。在另一个实施方案中，受辐照的细胞制备物包含彼此具有降低或消除的交叉反应性的汇集的个别单个核群体。
在另一个实施方案中，辐照包含约15戈瑞单位(Gy)。在另一个方面，辐照包含约20戈瑞单位(Gy)。在另一个方面，辐照包含约25戈瑞单位(Gy)。在另一个方面，辐照包含约30戈瑞单位(Gy)。在另一个方面，辐照包含约35戈瑞单位(Gy)。在另一个方面，辐照包含约40戈瑞单位(Gy)。在另一个方面，辐照包含约45戈瑞单位(Gy)。在另一个方面，辐照包含约50戈瑞单位(Gy)。在另一个方面，辐照包含约55戈瑞单位(Gy)。在另一个方面，辐照包含约60戈瑞单位(Gy)。在另一个方面，辐照包含约65戈瑞单位(Gy)。在另一个实施方案中，辐照包含至多2500Gy。在另一个实施方案中，辐照包含约15-25戈瑞单位(Gy)。在另一个实施方案中，辐照包含约25-30戈瑞单位(Gy)。在另一个实施方案中，辐照包含约30-40戈瑞单位(Gy)。在另一个实施方案中，辐照包含约40-50戈瑞单位(Gy)。在另一个实施方案中，辐照包含约50-65戈瑞单位(Gy)。
在另一个实施方案中，受辐照的汇集的凋亡细胞制备物维持与未受辐照的汇集的凋亡细胞制备物相同或类似的凋亡型态、稳定性以及功效。在另一个实施方案中，受辐照的汇集的凋亡细胞制备物维持相同或类似的细胞类型分布型态。
在再一个实施方案中，如本文所描述的汇集的单个核凋亡细胞制备物包含在个别单个核细胞群体的灭活之前或灭活之后汇集的所述个别单个核细胞群体。在另一个实施方案中，如本文所描述的汇集的单个核凋亡细胞制备物包含在个别单个核细胞群体的辐照之前或辐照之后汇集的所述个别单个核细胞群体。
在一个实施方案中，如本文所公开的汇集的单个核凋亡细胞制备物稳定至多24小时。在另一个实施方案中，汇集的单个核凋亡细胞制备物稳定至少24小时。在另一个实施方案中，汇集的单个核凋亡细胞制备物稳定超过24小时。在又一个实施方案中，如本文所公开的汇集的单个核凋亡细胞制备物稳定至多36小时。在再一个实施方案中，汇集的单个核凋亡细胞制备物稳定至少36小时。在进一步实施方案中，汇集的单个核凋亡细胞制备物稳定超过36小时。在另一个实施方案中，如本文所公开的汇集的单个核凋亡细胞制备物稳定至多48小时。在另一个实施方案中，汇集的单个核凋亡细胞制备物稳定至少48小时。在另一个实施方案中，汇集的单个核凋亡细胞制备物稳定超过48小时。
技术人员应了解，术语“稳定”涵盖早期凋亡细胞的百分比(％)在灭活之后，例如在一个实施方案中在辐照之后不会降低的制备物。在一个实施方案中，如本文所公开的细胞制备物中早期凋亡细胞的百分比(％)不会降低超过约1％。在另一个实施方案中，如本文所公开的细胞制备物中早期凋亡细胞的百分比(％)不会降低超过约2％。在另一个实施方案中，如本文所公开的细胞制备物中早期凋亡细胞的百分比(％)不会降低超过约3％。在另一个实施方案中，如本文所公开的细胞制备物中早期凋亡细胞的百分比(％)不会降低超过约4％。在另一个实施方案中，如本文所公开的细胞制备物中早期凋亡细胞的百分比(％)不会降低超过约5％。在另一个实施方案中，如本文所公开的细胞制备物中早期凋亡细胞的百分比(％)不会降低超过约6％。在另一个实施方案中，如本文所公开的细胞制备物中早期凋亡细胞的百分比(％)不会降低超过约7％。在另一个实施方案中，如本文所公开的细胞制备物中早期凋亡细胞的百分比(％)不会降低超过约8％。在另一个实施方案中，如本文所公开的细胞制备物中早期凋亡细胞的百分比(％)不会降低超过约9％。在另一个实施方案中，如本文所公开的细胞制备物中早期凋亡细胞的百分比(％)不会降低超过约10％。在另一个实施方案中，如本文所公开的细胞制备物中早期凋亡细胞的百分比(％)不会降低超过约20％。
在一个实施方案中，包括辐照步骤的产生汇集的细胞制备物的方法保持获自单一相合的供体的凋亡细胞制备物(其中细胞制备物可以不包括辐照步骤)中观测到的早期凋亡、免疫调节以及稳定性特性制备物。在另一个实施方案中，如本文所公开的汇集的单个核凋亡细胞制备物不引发移植物抗宿主疾病(GVHD)反应。
细胞制备物的辐照在本领域中被认为是安全的。辐照程序当前在常规基础上对捐献的血液进行以防止对WBC的反应。
在另一个实施方案中，如本文所公开的汇集的单个核凋亡细胞制备物中凋亡细胞的百分比接近于100％，从而降低细胞制备物中活的非凋亡细胞的部分。在一个实施方案中，凋亡细胞的百分比是至少20％。在另一个实施方案中，凋亡细胞的百分比是至少30％。在另一个实施方案中，凋亡细胞的百分比是至少40％。在另一个实施方案中，凋亡细胞的百分比是至少50％。在又一个实施方案中，凋亡细胞的百分比是至少60％。在再一个实施方案中，凋亡细胞的百分比是至少70％。在进一步实施方案中，凋亡细胞的百分比是至少80％。在另一个实施方案中，凋亡细胞的百分比是至少90％。在又一个实施方案中，凋亡细胞的百分比是至少99％。因此，在一个实施方案中，包含活的非凋亡细胞的降低或不生存或休眠或不可活化的部分的细胞制备物可以提供在接受体中不引发GVHD的汇集的单个核凋亡细胞制备物。
或者，在另一个实施方案中，通过特定地移除活细胞群体，例如通过靶向沉淀来降低活的非凋亡WBC的百分数。在另一个实施方案中，可以使用结合至磷脂酰丝氨酸的磁珠来降低活的非凋亡细胞的百分比。在另一个实施方案中，可以使用结合非凋亡细胞而不是凋亡细胞的细胞表面上的标志的磁珠来降低活的非凋亡细胞的百分比。或者相反，可以使用结合至凋亡细胞而不是非凋亡细胞的细胞表面上的标志的磁珠来选择凋亡细胞用于进一步制备。在又一个实施方案中，通过使用超声来降低活的非凋亡WBC的百分数。
在一个实施方案中，凋亡细胞来自汇集的第三方供体。在另一个实施方案中，凋亡细胞来自汇集的第四方供体。在另一个实施方案中，凋亡细胞来自汇集的第五方供体。在另一个实施方案中，凋亡细胞来自汇集的N方供体，其中N代表给定的汇集的细胞制备物中来源的数目，例如个别供体或个别血液单位。举例来说，如果汇集的细胞制备物包含来自十(10)个个别来源供体的单个核细胞，那么N是10。
在一个实施方案中，汇集的细胞制备物包含选自由以下组成的群组的至少一种细胞类型：淋巴细胞、单核白细胞、树突状细胞以及天然杀伤细胞。在另一个实施方案中，汇集的细胞制备物包含富集的单个核细胞群体。在一个实施方案中，汇集的单个核是单个核富集的细胞制备物，其包含选自由以下组成的群组的细胞类型：淋巴细胞、单核白细胞、树突状细胞以及天然杀伤细胞。在另一个实施方案中，单个核富集的细胞制备物包含不超过15％、或者不超过10％、通常不超过5％的多形核白细胞(polymorphonuclear leukocyte)，也称为粒细胞(即，嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞以及嗜酸性粒细胞)。在另一个实施方案中，汇集的单个核细胞制备物缺乏粒细胞。
在另一个实施方案中，汇集的单个核富集的细胞制备物包含不超过15％、或者不超过10％、通常不超过5％的CD15高表达细胞。在一个实施方案中，汇集的凋亡细胞制备物包含小于15％的CD15高表达细胞。
在一个实施方案中，汇集的单个核富集的细胞制备物包含至少60％的单个核细胞、至少70％、至少80％、至少85％的单个核细胞、或者至少90％的单个核细胞、或至少95％的单个核细胞，其中每种可能性是独立的实施方案。在一个实施方案中，汇集的单个核富集的细胞制备物包含至少85％的单个核细胞。
在一个实施方案中，汇集的单个核凋亡细胞制备物包含汇集具有增加的多核细胞(polynuclear cell,PMN)的细胞制备物与具有高单个核细胞的细胞制备物。
本领域的一般技术人员应了解，术语“单个核细胞”可以涵盖具有一个分叶核(lobed nucleus)的白细胞。在另一个实施方案中，如本文所公开的汇集的凋亡细胞制备物包含小于5％的多形核白细胞。
医药组合物和其制备
从单一相合的供体制备凋亡细胞的方法和其用途已经详细描述于国际公布号WO2014/087408中-例如参看实施例11-15，和国际申请号PCT/IL2016/050194中-例如参看实施例1-2，这些文献借此以全文并入本文中。
技术人员应了解，如本文所公开的术语“组合物”和“医药组合物”可互换使用，其具有全部相同的意义和性质，并且在一个实施方案中涵盖包含如上文详细描述的汇集的单个核凋亡细胞制备物的组合物。在一个实施方案中，医药组合物涵盖包含本文所公开的汇集的细胞制备物的组合物，并且进一步包含抗凝剂。技术人员应了解，术语“组合物”可以涵盖包含再悬浮于最终悬浮介质中的如本文所公开的汇集的细胞制备物的组合物，所述悬浮介质用于将细胞制备物施用于接受体对象，例如有需要的患者。技术人员应进一步了解，如本文所用的术语“最终悬浮介质”和“施用介质”可互换使用并且可以涵盖用于将本文所公开的汇集的细胞制备物施用于接受体对象的介质。
在一个实施方案中，如本文所公开的医药组合物包含有包含处于早期凋亡状态中的单个核细胞的汇集的单个核凋亡细胞制备物，其中所述汇集的单个核凋亡细胞制备物包含汇集的个别单个核细胞群体，并且其中所述汇集的单个核凋亡细胞制备物包含百分比减少的活的非凋亡细胞；细胞活化遏制的任何活的非凋亡细胞；或增殖降低的任何活的非凋亡细胞；或其任何组合。在另一个实施方案中，医药组合物包含本文所公开的汇集的单个核凋亡细胞制备物。
在另一个实施方案中，组合物中所述汇集的单个核凋亡细胞制备物包含如本文所公开的灭活制备物，例如受辐照的制备物或所述个别细胞群体已经受辐照的制备物。在另一个实施方案中，组合物进一步包含抗凝剂。
在一个实施方案中，本文公开了一种产生包含有包含处于早期凋亡状态中的汇集的个别单个核细胞群体的汇集的单个核凋亡细胞制备物的医药组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)获得外周血液的个别单个核富集的细胞群体；
(b)在包含抗凝剂的冷冻介质中冷冻所述单个核富集的细胞群体；
(c)解冻所述单个核富集的细胞群体；
(d)在包含约10-100μg/mL最终浓度的甲基强的松龙和抗凝剂的凋亡诱导孵育介质中孵育所述单个核富集的细胞群体；
(e)使所述凋亡细胞群体再悬浮于施用介质中；以及
(f)灭活所述单个核富集的群体，其中所述灭活在任何步骤(a)至(e)之后发生；以及
(g)汇集所述单个核富集的群体，其中所述汇集在任何步骤(a)至(f)之后发生；
其中所述方法产生包含有包含处于早期凋亡状态中的汇集的个别单个核细胞群体的汇集的单个核凋亡细胞制备物的医药组合物。
在一个实施方案中，灭活步骤(f)包括在所述汇集的单个核凋亡细胞制备物内减少非休眠非凋亡细胞的百分比，遏制任何活的非凋亡细胞的细胞活化，或降低任何活的非凋亡细胞的增殖，或其任何组合。
在一个实施方案中，获得单个核富集的细胞群体包括通过白细胞去除术从多个个别供体获得白血细胞(WBC)部分。在另一个实施方案中，获得单个核富集的细胞群体包括获得白血细胞(WBC)部分，所述部分包含获自血库的WBC部分。在另一个实施方案中，所收集的WBC可以基于获得其的来源而备用。
技术人员应了解，术语“白细胞去除术”可以涵盖从供体的血液分离白细胞的单采(apheresis)程序。在一个实施方案中，供体的血液经历白细胞去除术并且因此根据产生方法获得单个核富集的细胞组合物。应注意，如本领域中所知，在白细胞去除术期间需要使用至少一种抗凝剂，以防止所收集的细胞凝结。
在一个实施方案中，白细胞去除术程序经过配置以允许根据产生方法收集单个核富集的细胞组合物。在一个实施方案中，通过白细胞去除术获得的细胞集合包含至少40％、50％、60％、65％、70％或80％的单个核细胞。在一个实施方案中，与根据产生方法获得单个核富集的细胞组合物平行地收集来自细胞供体的血浆。在一个实施方案中，与根据产生方法获得单个核富集的细胞组合物平行地收集来自细胞供体的约300-600ml血浆。在一个实施方案中，与根据产生方法获得单个核富集的细胞组合物平行收集的血浆用作冷冻和/或孵育介质的一部分。
应注意，在一个实施方案中，虽然在细胞收集时单个核富集的细胞制备物包含至少40％、50％、60％、65％、70％或至少80％的单个核细胞，但在产生方法之后最终医药组合物包含至少70％、80％、85％、90％或至少95％的单个核细胞。在另一个实施方案中，在细胞收集时单个核富集的细胞制备物包含比使用如本文所公开的方法产生的最终产物更低百分比的单个核细胞。在另一个实施方案中，汇集的单个核凋亡细胞制备物包含比初始单个核富集的细胞制备物，例如通过白细胞去除术收集的那些制备物更高百分比的单个核细胞。
根据某些实施方案，用于产生组合物的单个核富集的细胞制备物在细胞收集时包含至少50％的单个核细胞。在另一个实施方案中，用于产生本文所公开的组合物的单个核富集的细胞制备物在细胞收集时包含介于约40-60％之间的单个核细胞。根据某些实施方案，本公开提供了一种产生医药组合物的方法，其中所述方法包括从供体的外周血液获得单个核富集的细胞制备物，所述单个核富集的细胞制备物包含至少50％的单个核细胞。在另一个实施方案中，一种产生医药组合物的方法，其中所述方法包括从供体的外周血液获得单个核富集的细胞制备物，所述单个核富集的细胞制备物包含约40-60％的单个核细胞。根据某些实施方案，本公开提供了一种产生医药组合物的方法，其中所述方法包括冷冻包含至少40％、50％或60％的单个核细胞的单个核富集的细胞制备物。
在一个实施方案中，血液单位包含0.35×107个细胞。在另一个实施方案中，获得介于1×106个与1×107个之间的细胞。在另一个实施方案中，所获得的细胞备用于如本文所公开的制备物中。在另一个实施方案中，白血细胞(WBC)部分从约2至25个血液单位收集。在另一个实施方案中，白血细胞(WBC)部分从约1至250个血液单位收集。在另一个实施方案中，白血细胞(WBC)部分从约1至500个血液单位收集。在另一个实施方案中，白血细胞(WBC)部分从约1至1000个血液单位收集。在另一个实施方案中，白血细胞(WBC)部分从约1至2000个血液单位收集。
在另一个实施方案中，可以在一天中收集2-25个血液单位用于制备本文中的组合物。在另一个实施方案中，可以在一天中收集1-250个血液单位用于制备本文中的组合物。在另一个实施方案中，可以在一天中收集1-500个血液单位用于制备本文中的组合物。在另一个实施方案中，可以在一天中收集500-1000个血液单位用于制备本文中的组合物。在又一个实施方案中，可以在一天中收集500-2000个血液单位用于制备本文中的组合物。在另一个实施方案中，可以在一天中收集1000个血液单位用于制备本文中的组合物。
在一个实施方案中，获得3500亿汇集的血细胞用于制备本文所描述的组合物。在另一个实施方案中，获得1000-5000亿汇集的血细胞用于制备本文所描述的组合物。在另一个实施方案中，获得约1000亿、约2000亿、约3000亿、约4000亿、约5000亿、约6000亿、约7000亿、约8000亿或约9000亿细胞用于制备本文所描述的组合物。
在一个实施方案中，本文所描述的组合物的剂量包含每公斤对象3500-7000万汇集的单个核凋亡细胞。因此，以3500亿细胞的汇集池开始，一次可以制备80-150个剂量单位。在一个实施方案中，平均10个汇集的血液单位产生单一治疗剂量。这个计算是基于当前产生式白细胞去除术而不考虑产生效率的可能改进，等等。
在一个实施方案中，如本文所公开的组合物可以用于重复给药。
在一个实施方案中，如本文所公开的制备方法包括制备包含从约2至25个血液单位收集的白血细胞(WBC)部分的汇集的单个核富集的细胞群体。在另一个实施方案中，白血细胞(WBC)部分从约13至25个血液单位收集。在又一个实施方案中，白血细胞(WBC)部分从约10个血液单位收集。在另一个实施方案中，所述WBC部分从介于约2-5、2-10、2-15、2-20、5-10、5-15、5-20、5-25、10-15、10-20、10-25、6-13或6-25个之间的血液单位收集。在另一个实施方案中，所述WBC部分从约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个血液单位收集。所需要的血液单位的数目也取决于从血液回收WBC的效率。举例来说，低效率的WBC回收将导致需要额外的单位，对比高效率的WBC回收将导致需要更少的单位。在一些实施方案中，每个单位是血袋。在另一个实施方案中，汇集的凋亡细胞制备物包括存在于至少25个血液单位、至少50个血液单位或至少100个血液单位中的细胞。在更进一步实施方案中，汇集的单个核富集的凋亡细胞群体的制备包含与由进行制备的技术人员测定的一样多的单位的WBC。
在一个实施方案中，产生组合物的方法包括独立于HLA配型而收集的WBC部分。在另一个实施方案中，所述WBC部分通过白细胞去除术从多个个别供体获得。在另一个实施方案中，白血细胞(WBC)部分获自血库。在另一个实施方案中，产生本文所公开的组合物的方法包括不受所述个别单个核富集的细胞群体的HLA配型限制获得所述单个核富集的细胞群体。
在一个实施方案中，医药组合物中的肝素以介于0.001U/ml与3U/ml之间、通常介于0.01ml与2.5U/ml之间的浓度存在。在另一个实施方案中，医药组合物中的肝素以介于0.005U/ml与2.5U/ml之间的浓度存在。根据其它实施方案，医药组合物中的肝素以介于0.01U/ml与1U/ml之间的浓度存在。在一个实施方案中，医药组合物中的ACD配方A以0.01％-6％v/v的浓度存在。根据其它实施方案，医药组合物中的ACD配方A以0.05％-5％v/v的浓度存在。根据其它实施方案，医药组合物中的ACD配方A以0.01％-10％v/v的浓度存在。此外，包含单个核凋亡细胞的组合物和其制备已经描述于WO 2014/087408中，这个文献全部并入本文中。
在一个实施方案中，医药组合物进一步包含残余的甲基强的松龙。在一个实施方案中，医药组合物进一步包含浓度不超过30μg/ml的甲基强的松龙。在一个实施方案中，医药组合物进一步包含抗凝剂。在一个实施方案中，抗凝剂选自由以下组成的群组：肝素、ACD配方A以及其组合。
应了解，在一个实施方案中，本文所公开的细胞制备物中单个核细胞的高百分数在如本文所描述的多步制造方案(包括白细胞去除术和血液单位的汇集、使用冷冻保存的早期凋亡诱导和与甲基强的松龙一起孵育以及各种洗涤步骤)之后达成。
技术人员应了解，术语“早期凋亡”在一个实施方案中指的是细胞的凋亡群体，其中至少85％的细胞保持有活力的(膜联蛋白V阳性)并且小于15％通过碘化丙锭(PI)检验被认为死亡或正在死亡(PI阴性)。在另一个实施方案中，“早期凋亡”指的是细胞群体，其中至少85％的细胞保持有活力的并且小于15％的细胞表达CD15高。
技术人员应了解，术语“早期凋亡状态”可以涵盖显示早期凋亡征象而无晚期凋亡征象的细胞。细胞中早期凋亡征象的实例包括磷脂酰丝氨酸(PS)暴露和线粒体膜电位损失。晚期事件的实例包括碘化丙锭(PI)进入细胞中和最终DNA切割。为了证明细胞处于“早期凋亡”状态中，在一个实施方案中，使用通过膜联蛋白V和PI染色的PS暴露检测，并且被膜联蛋白V而未被PI染色的细胞被认为是“早期凋亡细胞”。在另一个实施方案中，被膜联蛋白V FITC与PI染色的细胞被认为是“晚期凋亡细胞”。在另一个实施方案中，不被膜联蛋白V与PI染色的细胞被认为是非凋亡的有活力的细胞(活细胞)。
在一个实施方案中，凋亡细胞包含处于早期凋亡状态中的细胞。在另一个实施方案中，凋亡细胞包含细胞，其中至少90％的所述细胞处于早期凋亡状态中。在另一个实施方案中，凋亡细胞包含细胞，其中至少80％的所述细胞处于早期凋亡状态中。在另一个实施方案中，凋亡细胞包含细胞，其中至少70％的所述细胞处于早期凋亡状态中。在另一个实施方案中，凋亡细胞包含细胞，其中至少60％的所述细胞处于早期凋亡状态中。在另一个实施方案中，凋亡细胞包含细胞，其中至少50％的所述细胞处于早期凋亡状态中。在另一个实施方案中，凋亡细胞包含细胞，其中至少40％的所述细胞处于早期凋亡状态中。
在一个实施方案中，产生汇集的单个核凋亡细胞制备物的方法包括白血细胞(WBC)部分，所述部分包含选自由淋巴细胞、单核白细胞、树突状细胞以及天然杀伤细胞组成的群组的至少一种细胞类型。
在一个实施方案中，单个核富集的细胞制备物包含低浓度的非单核白细胞，诸如(但不限于)多形核白细胞和嗜中性粒细胞。在一个实施方案中，汇集的单个核富集的细胞制备物缺乏粒细胞。在一个实施方案中，粒细胞在产生方法的各种步骤期间崩解。在一个实施方案中，组合物包含不超过15％、或者不超过10％、通常不超过5％的粒细胞。
在一个实施方案中，粒细胞在产生方法的冷冻和解冻步骤之后很大程度上崩解。在一个实施方案中，粒细胞在产生方法的冷冻和解冻步骤之后很大程度上崩解，并且在冷冻和/或解冻步骤之后在洗涤步骤期间从制备物洗去。
在一个实施方案中，崩解的粒细胞在产生方法的各种洗涤步骤期间从细胞制备物洗去。在一个实施方案中，组合物包含不超过15％、可能不超过10％、通常不超过5％的多形核白细胞。
在一个实施方案中，组合物包含不超过5％的多形核白细胞。在一个实施方案中，组合物包含不超过15％、或者不超过10％、通常不超过5％的CD15高表达细胞。
在一个实施方案中，组合物包含不超过5％的CD15高表达细胞。
技术人员应了解，术语“CD15高”表达细胞可以涵盖粒细胞。
凋亡的早期特征是原生质膜的形态变化。这种变化涉及膜磷脂磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜的内层至外层的易位。在钙离子存在下，膜联蛋白V对PS具有高特异性和亲和力。因此，膜联蛋白V与具有暴露的PS的细胞的结合提供了一种检测早期细胞凋亡的极灵敏方法。
因此，在一个实施方案中，如本文所用的细胞的“早期凋亡状态”或“早期凋亡细胞”指的是仍然具有完整细胞膜，但已经开始经历DNA裂解并且已经开始经历磷脂酰丝氨酸易位的细胞群体。如本文所用的早期凋亡细胞或处于早期凋亡状态的细胞是使用膜联蛋白V阳性染色并且用碘化丙锭(PI)阴性染色的细胞。用于早期凋亡检测的方法在本领域中是已知的，诸如通过流式细胞术的膜联蛋白V阳性和碘化丙锭(PI)阴性的早期凋亡细胞检测。在产生如本文所公开的组合物的方法的一个实施方案中，辐照步骤并不显著改变细胞制备物的早期凋亡表型(即，％PS阳性和PI阴性)。
在一个实施方案中，处于晚期凋亡状态中的细胞可以通过使用膜联蛋白V的阳性染色和使用PI的阳性染色来检测，如可以使用流式细胞术显出。应注意，PI是不可透过膜的并且因此仅能够进入细胞膜的完整度已经受损的细胞，诸如晚期凋亡或坏死细胞。在一个实施方案中，坏死细胞显示PI的强染色，如可以使用流式细胞术显出。
在一些实施方案中，细胞制备物包含悬浮中的细胞。
技术人员应了解，术语细胞的“活力”可以涵盖不经历坏死、早期凋亡或晚期凋亡的细胞。因此，如本文所用的术语“有活力的细胞”指的是不经历坏死的细胞或不处于早期或晚期凋亡状态中的细胞。在一个实施方案中，术语“有活力的细胞”指的是具有完整原生质膜的细胞。用于测定细胞活力的检验在本领域中是已知的，诸如使用可以通过流式细胞术检测的碘化丙锭(PI)染色。因此，在一个实施方案中，有活力的细胞是不显示碘化丙锭吸入并且不表达磷脂酰丝氨酸的细胞。坏死可以通过使用光、荧光或电子显微镜技术，或经由染料台盼蓝的吸收来进一步鉴别。
凋亡，是不同于坏死的细胞死亡过程，是例如在正常细胞和组织发育期间发生的细胞的程序性和有序的生理消除、病原体感染的细胞的T淋巴细胞杀死、以及突变损害的细胞的自消除。凋亡细胞的特征为细胞质和细胞核的独特形态改变、在有规律间隔的位点处的染色质裂解、以及在核小体间位点处基因组DNA的内切核苷酸裂解。用于测定细胞凋亡的检验在本领域中是已知的，诸如使用膜联蛋白V。另一方面，坏死是通常但不完全由致命的细胞损伤之后酶的不受控渐进式降解作用引起的细胞死亡的固有病理性和促炎性过程。坏死细胞通常特征为线粒体肿胀、核絮凝、细胞溶解、膜完整性损失以及最终细胞死亡。
在一个实施方案中，细胞制备物包含至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％的有活力的细胞，或至少97％的有活力的细胞。
在额外实施方案中，细胞制备物中高百分数的有活力的细胞在制备之后保持至少24小时。在一个实施方案中，坏死细胞和/或处于晚期凋亡状态中的细胞崩解并且因此在产生方法的洗涤步骤期间从最终细胞制备物实质上消除。
在如本文所公开的一个实施方案中，为了在诸如GVHD的自体免疫疾病中诱导治疗性免疫耐受性，细胞制备物中的治疗性单个核富集的细胞获自异基因个体。在另一个实施方案中，使用本文所公开的方法制备的汇集的单个核凋亡细胞制备物包含来自对于接受体对象而言HLA相合的来源或HLA不相合的来源的异基因细胞。在另一个实施方案中，异基因细胞包含对于接受体对象而言HLA相合的来源。在另一个实施方案中，异基因细胞包含对于接受体对象而言HLA不相合的来源。
在一个实施方案中，医药组合物包含汇集的细胞制备物并且进一步包含抗凝剂。
技术人员应了解，术语“汇集的细胞制备物”、“细胞制备物”、“汇集的单个核凋亡细胞制备物”、“单个核富集的凋亡细胞制备物”以及“单个核凋亡细胞制备物”在一个实施方案中可互换使用，其具有全部相同的意义和性质。
在一个实施方案中，医药组合物包含细胞制备物并且进一步包含残余的甲基强的松龙。根据其它实施方案，医药组合物包含细胞制备物并且进一步包含抗凝剂和残余的甲基强的松龙。在一个实施方案中，残余的甲基强的松龙指的是在使用产生方法之后保留于组合物中的甲基强的松龙。
在一个实施方案中，组合物包含抗凝剂。如本领域中所知，如本文所用的抗凝剂指的是防止或减少血液凝结的物质。在一个实施方案中，抗凝剂是肝素。根据其它实施方案，抗凝剂是酸-柠檬酸盐-葡萄糖(ACD)配方A。在一个实施方案中，抗凝剂是包含ACD配方A和肝素的组合物。在一个实施方案中，抗凝剂是含有约10U/ml浓度的肝素的ACD配方A。在一个实施方案中，抗凝剂选自由以下组成的群组：肝素、ACD配方A以及其组合。在一个实施方案中，组合物中抗凝剂的存在是归因于在组合物的产生过程的冷冻和/或孵育和/或洗涤阶段期间抗凝剂的添加。在一个实施方案中，在组合物产生期间抗凝剂的存在不会不利地影响如本文所描述的凋亡诱导。
在一个实施方案中，组合物包含肝素。在一个实施方案中，肝素选自由以下组成的群组：硫酸化杂多糖肝素、未分级肝素(UFH)、低分子量肝素(LMWH)以及其组合。根据其它实施方案，肝素是合成肝素，诸如(但不限于)磺达肝素(Fondaparinaux)。
在一个实施方案中，组合物包含浓度介于0.001U/ml与3U/ml之间、或者介于0.005U/ml与2.5U/ml之间、通常介于0.01U/ml与1U/ml之间的肝素。根据其它实施方案，组合物包含浓度介于0.001-2.5U/ml之间、或者介于0.001-1U/ml之间、可能介于0.001-0.5U/ml之间的肝素。
根据其它实施方案，组合物包含浓度介于0.005-1U/ml之间、或者介于0.005-0.6U/ml之间、可能介于0.005-0.5U/ml之间的肝素。根据其它实施方案，组合物包含浓度介于0.01-3U/ml之间、或者介于0.01-2U/ml之间或介于0.01-0.6U/ml之间的肝素。在一个实施方案中，组合物包含浓度介于0.01-0.5U/ml之间的肝素。在一个实施方案中，组合物包含浓度介于0.05U/ml与0.25U/ml之间的肝素。根据某些实施方案，组合物包含浓度介于0.01U/ml与0.6U/ml之间的肝素。
在一个实施方案中，组合物包含至多3U/ml肝素、通常至多2.5U/ml肝素、可能至多1U/ml肝素、或者至多0.5U/ml肝素。在一个实施方案中，组合物包含至少0.001U/ml肝素、或者至少0.005U/ml肝素、可能至少0.01肝素。在一个实施方案中，组合物包含至多300U、或者至多150U、可能至多75U的肝素。根据某些实施方案，组合物包含至多180U的肝素。
在一个实施方案中，包含于组合物中的肝素指的是包含细胞制备物和用于将细胞制备物施用于患者的最终悬浮介质的组合物中的肝素。在一个实施方案中，包含于组合物中的ACD配方A指的是包含细胞制备物和用于将细胞制备物施用于患者的最终悬浮介质的组合物中的肝素。
在一个实施方案中，组合物包含介于0.5-500U之间的肝素、可能介于0.5-500U之间的肝素、或者介于7-180U之间的肝素。
在一个实施方案中，组合物包含ACD配方A。在一个实施方案中，ACD配方A包含柠檬酸、葡萄糖以及柠檬酸钠。在一个实施方案中，ACD配方A包含0.73g/100ml浓度的无水柠檬酸、2.45g/100ml浓度的一水葡萄糖以及2.20g/100ml浓度的脱水柠檬酸钠。
在一个实施方案中，组合物包含浓度介于0.01-10v/v之间、或者介于0.05-6v/v之间、可能介于0.1％-5％v/v之间的ACD配方A。根据其它实施方案，组合物包含浓度介于0.05-10v/v之间、可能0.05-6v/v、或者介于0.05-5v/v之间的ACD配方A。
根据替代性实施方案，组合物包含浓度介于0.1-10v/v之间、或者介于0.1％-6％之间、可能介于0.1％-5％v/v之间的ACD配方A。在一个实施方案中，组合物包含浓度介于0.5％-2.5％v/v之间的ACD配方A。根据某些实施方案，组合物包含浓度介于0.05-6v/v之间、通常介于0.1％-6％v/v之间的ACD配方A。
在一个实施方案中，组合物包含至多15ml、或者至多9ml、可能至多7.5ml的ACD配方A。根据某些实施方案，组合物包含至多18ml的ACD配方A。
在一个实施方案中，组合物包含介于0.05-40ml之间的ACD配方A之间、可能介于0.1-25ml之间的ACD配方A、或者介于0.7-18ml之间的ACD配方A。
在一个实施方案中，组合物进一步包含甲基强的松龙。在一个实施方案中，组合物中残余的甲基强的松龙的存在是归因于在细胞制备物的产生过程的孵育阶段期间甲基强的松龙的使用。在一个实施方案中，在细胞制备物的产生期间使用甲基强的松龙，作为诱导细胞进入早期凋亡状态的程序的一部分。
在一个实施方案中，组合物进一步包含浓度介于0.5-30μg/ml之间、可能1-25μg/ml、通常介于3-22μg/ml之间的甲基强的松龙。在一个实施方案中，组合物包含浓度介于3.7-21.9μg/ml之间的甲基强的松龙。
在一个实施方案中，组合物进一步包含浓度不超过30μg/ml的甲基强的松龙。在一个实施方案中，组合物进一步包含浓度不超过30μg/ml、可能不超过25μg/ml、通常不超过21.9μg/ml的甲基强的松龙。
在一个实施方案中，组合物进一步包含浓度介于0.5-60μg/ml之间、可能1.12-60μg/ml的甲基强的松龙。在一个实施方案中，组合物进一步包含浓度不超过60μg/ml的甲基强的松龙。
在一个实施方案中，组合物包含至少0.5μg/ml、可能至少1μg/ml、或者至少3μg/ml的甲基强的松龙。在一个实施方案中，组合物包含至少3.5μg/ml的甲基强的松龙。在一个实施方案中，组合物包含至少3.7μg/ml的甲基强的松龙。
在一个实施方案中，组合物进一步包含介于0.1-25mg之间的甲基强的松龙、可能介于0.4-20mg之间的甲基强的松龙、或者介于0.67-18mg之间的甲基强的松龙。在一个实施方案中，组合物进一步包含不超过25mg、通常20mg、或者18mg的量的甲基强的松龙。根据某些实施方案，组合物进一步包含不超过15mg的量的甲基强的松龙。
在一个实施方案中，医药组合物中的肝素以介于0.005U/ml与2.5U/ml之间的浓度存在。根据其它实施方案，医药组合物中的ACD配方A以0.01％-10％v/v或者0.05％-5％v/v的浓度存在。
在特定实施方案中，医药组合物以每公斤体重约30×106至300×106个细胞、每公斤体重100×106至300×106个细胞、或者每公斤体重约120×106至250×106个细胞的剂量施用。在另一个实施方案中，如本文所公开的剂量包含每公斤对象体重来自汇集的单个核凋亡细胞制备物的约30×106、35×106、40×106、45×106、50×106、55×106、60×106、65×106、70×106或75×106个细胞。
在特定实施方案中，医药组合物以每公斤体重约35×106个细胞的剂量施用。在一个实施方案中，医药组合物以每公斤体重约140×106至210×106个细胞的剂量施用。根据一个特定实施方案，医药组合物以每公斤体重约140×106个细胞的剂量施用。根据另一个特定实施方案，医药组合物以每公斤体重约210×106个细胞的剂量施用。根据另一个特定实施方案，医药组合物以每公斤体重约35×106至210×106个细胞的剂量施用。根据另一个特定实施方案，医药组合物以每公斤体重约250×106个细胞的剂量施用。在其它实施方案中，医药组合物以每公斤体重约5×106个细胞的剂量施用。应了解，所述低剂量适合于本文所公开的组合物的局部注射，诸如局部注射至关节用于治疗关节炎。
在一个实施方案中，治疗性汇集的单个核富集的细胞制备物经由静脉内途径全身施用于对象。或者，治疗性单个核富集的细胞可以根据各种其它途径施用于对象，这些途径包括(但不限于)肠道外、腹膜内、关节内、肌肉内以及皮下途径。在另一个实施方案中，治疗性单个核富集的细胞悬浮于适合的生理缓冲液中施用于对象，这种生理缓冲液诸如(但不限于)盐水溶液、PBS、HBSS等等。另外，悬浮介质可以进一步包含有益于维持细胞活力的补充剂。在另一个实施方案中，悬浮介质包含有益于维持细胞的早期凋亡状态的补充剂。
在一个实施方案中，根据产生方法获得的单个核富集的细胞组合物经历在冷冻介质中冷冻。
在一个实施方案中，冷冻是逐步的。在一个实施方案中，在收集之后将细胞维持于室温下直至冷冻。在一个实施方案中，细胞制备物在细胞收集之后和冷冻之前经历在洗涤介质中的至少一个洗涤步骤。
技术人员应了解，术语“获得细胞”和“细胞收集”可互换使用。在一个实施方案中，在收集的3-6小时内冷冻细胞制备物的细胞。在一个实施方案中，在细胞收集的至多6小时内冷冻细胞制备物。在一个实施方案中，在收集的1、2、3、4、5、6、7、8小时内冷冻细胞制备物的细胞。根据其它实施方案，冷冻细胞制备物的细胞至多收集的8、12、24、48、72小时。根据其它实施方案，在收集之后将细胞维持于2-8℃下直至冷冻。
在一个实施方案中，根据产生方法的冷冻包括：在约-18℃至-25℃下冷冻细胞制备物，继而在约-80℃下冷冻细胞制备物并且最终在液氮中冷冻细胞制备物直至解冻。在一个实施方案中，根据产生方法的冷冻包括：在约-18℃至-25℃下冷冻细胞制备物至少2小时，在约-80℃下冷冻细胞制备物至少2小时并且最终在液氮中冷冻细胞制备物直至解冻。在一个实施方案中，在解冻之前将细胞保持于液氮中至少8、10或12小时。在一个实施方案中，将细胞制备物的细胞保持于液氮中直至解冻并与凋亡诱导孵育介质一起孵育。在一个实施方案中，将细胞制备物的细胞保持于液氮中直至造血干细胞移植当天。根据非限制性实例，从细胞收集和冷冻至制备最终组合物的时间可以介于1-50天之间或者介于6-30天之间。根据替代性实施方案，细胞制备物可以在液氮中保持更长的时间段，诸如至少数月。
在一个实施方案中，根据产生方法的冷冻包括在约-18℃至-25℃下冷冻细胞制备物至少0.5、1、2、4小时。在一个实施方案中，根据产生方法的冷冻包括在约-18℃至-25℃下冷冻细胞制备物约2小时。在一个实施方案中，根据产生方法的冷冻包括在约-80℃下冷冻细胞制备物至少0.5、1、2、4、12小时。
在一个实施方案中，单个核富集的细胞组合物可以保持冷冻至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、20个月。在一个实施方案中，单个核富集的细胞组合物可以保持冷冻至少0.5、1、2、3、4、5年。根据某些实施方案，单个核富集的细胞组合物可以保持冷冻至少20个月。
在一个实施方案中，单个核富集的细胞组合物冷冻至少8、10、12、18、24小时。根据某些实施方案，冷冻单个核富集的细胞组合物至少8小时的时段。在一个实施方案中，单个核富集的细胞组合物冷冻至少约10小时。在一个实施方案中，单个核富集的细胞组合物冷冻至少约12小时。在一个实施方案中，单个核富集的细胞组合物冷冻约12小时。在一个实施方案中，单个核富集的细胞组合物(在约-18℃至-25℃下、在约-80℃下以及在液氮中)的总冷冻时间是至少8、10、12、18、24小时。
在一个实施方案中，冷冻至少部分诱导单个核富集的细胞组合物的细胞的早期凋亡状态。在一个实施方案中，冷冻介质包括包含L-谷氨酰胺、Hepes、Hes、二甲亚砜(DMSO)以及血浆的RPMI 1640介质。在一个实施方案中，冷冻介质包括包含2mM L-谷氨酰胺、10mMHepes、5％Hes、10％二甲亚砜以及20％v/v血浆的RPMI 1640介质。
在一个实施方案中，冷冻介质包含抗凝剂。根据某些实施方案，在产生方法期间使用的介质，包括冷冻介质、孵育介质以及洗涤介质中的至少一些包含抗凝剂。根据某些实施方案，在产生方法期间使用的包含抗凝剂的所有介质包含相同浓度的抗凝剂。在一个实施方案中，抗凝剂不添加至细胞组合物的最终悬浮介质中。
在一个实施方案中，抗凝剂至少添加至冷冻介质中改进了细胞制备物的产率。根据其它实施方案，抗凝剂添加至冷冻介质中改进了在高甘油三酯水平存在下细胞制备物的产率。如本文所用的细胞制备物的产率的改进涉及以下至少一者的改进：出自冷冻细胞的有活力的细胞的百分数、出自有活力的细胞的早期状态凋亡细胞的百分数以及其组合。
在一个实施方案中，抗凝剂添加至冷冻介质中促成在医药组合物的不同制备物之间高的和稳定的产率。根据优选实施方案，抗凝剂至少添加至冷冻介质和孵育介质中得到在医药组合物的不同制备物之间高的和稳定的产率，与所使用的细胞收集方案无关。
在一个实施方案中，冷冻介质包含选自由以下组成的群组的抗凝剂：肝素、ACD配方A以及其组合。在一个实施方案中，用于冷冻介质中的抗凝剂是含有10U/ml浓度的肝素的ACD配方A。在一个实施方案中，冷冻介质包括包含10U/ml浓度的肝素的5％v/v ACD配方A溶液。
在一个实施方案中，冷冻介质包含肝素。在一个实施方案中，冷冻介质中的肝素浓度介于0.1-2.5U/ml之间。在一个实施方案中，冷冻介质中的肝素浓度介于0.1-2.5U/ml之间、可能介于0.3-0.7U/ml之间、通常约0.5U/ml。根据某些实施方案，冷冻介质中的肝素浓度为约0.5U/ml。
在一个实施方案中，冷冻介质包含ACD配方A。在一个实施方案中，冷冻介质中的ACD配方A浓度介于1％-15％v/v之间。在一个实施方案中，冷冻介质中的ACD配方A浓度介于1％-15％v/v之间、可能介于4％-7％v/v之间、通常约5％v/v。在一个实施方案中，冷冻介质中的ACD配方A浓度为约5％v/v。
在一个实施方案中，单个核富集的细胞组合物在细胞收集之后和再悬浮于冷冻介质中并冷冻之前经历至少一个洗涤步骤。在一个实施方案中，单个核富集的细胞组合物在冷冻和解冻之后经历至少一个洗涤步骤。在一个实施方案中，洗涤步骤包括单个核富集的细胞组合物的离心，继而上清液提取和再悬浮于洗涤介质中。
在一个实施方案中，细胞收集指的是获得单个核富集的细胞组合物。在一个实施方案中，在产生方法期间进行的洗涤步骤在洗涤介质中进行。根据某些实施方案，进行直至产生方法的孵育步骤为止的洗涤步骤在洗涤介质中进行。在一个实施方案中，洗涤介质包含补充有L-谷氨酰胺和Hepes的RPMI 1640介质。在一个实施方案中，洗涤介质包含补充有2mM L-谷氨酰胺和10mM Hepes的RPMI 1640介质。
在一个实施方案中，洗涤介质包含抗凝剂。在一个实施方案中，洗涤介质包含选自由以下组成的群组的抗凝剂：肝素、ACD配方A以及其组合。在一个实施方案中，洗涤介质中抗凝剂的浓度与冷冻介质中的浓度相同。在一个实施方案中，洗涤介质中抗凝剂的浓度与孵育介质中的浓度相同。在一个实施方案中，用于洗涤介质中的抗凝剂是含有10U/ml浓度的肝素的ACD配方A。
在一个实施方案中，洗涤介质包含肝素。在一个实施方案中，洗涤介质中的肝素浓度介于0.1-2.5U/ml之间。在一个实施方案中，洗涤介质中的肝素浓度介于0.1-2.5U/ml之间、可能介于0.3-0.7U/ml之间、通常约0.5U/ml。根据某些实施方案，洗涤介质中的肝素浓度为约0.5U/ml。
在一个实施方案中，洗涤介质包含ACD配方A。在一个实施方案中，洗涤介质中的ACD配方A浓度介于1％-15％v/v之间。在一个实施方案中，洗涤介质中的ACD配方A浓度介于1％-15％v/v之间、可能介于4％-7％v/v之间、通常约5％v/v。在一个实施方案中，洗涤介质中的ACD配方A浓度为约5％v/v。
在一个实施方案中，汇集的单个核富集的细胞组合物在组合物预期施用于对象之前数小时解冻。在一个实施方案中，单个核富集的细胞组合物在约33℃-39℃下解冻。在一个实施方案中，单个核富集的细胞组合物解冻约30-240秒、优选地40-180秒、最优选地50-120秒。
在一个实施方案中，汇集的单个核富集的细胞组合物在组合物的预期施用之前至少10小时解冻，或者在组合物的预期施用之前至少20、30、40或50小时解冻。在一个实施方案中，单个核富集的细胞组合物在组合物的预期施用之前至少15-24小时解冻。在一个实施方案中，单个核富集的细胞组合物在组合物的预期施用之前至少约24小时解冻。在一个实施方案中，单个核富集的细胞组合物在组合物的预期施用之前至少20小时解冻。在一个实施方案中，单个核富集的细胞组合物在组合物的预期施用之前30小时解冻。在一个实施方案中，单个核富集的细胞组合物在组合物的预期施用之前至少24小时解冻。在一个实施方案中，单个核富集的细胞组合物在解冻之前和/或之后经历在洗涤介质中洗涤的至少一个步骤。
在一个实施方案中，汇集的单个核富集的细胞组合物在冷冻和解冻之后在孵育介质中孵育。在一个实施方案中，在解冻与孵育之间存在至少一个洗涤步骤。如本文所用的术语“孵育介质”和“凋亡诱导孵育介质”可互换使用。在一个实施方案中，孵育介质包含补充有L-谷氨酰胺、Hepes、甲基强的松龙以及血浆的RPMI 1640介质。在一个实施方案中，洗涤介质包含2mM L-谷氨酰胺、10mM Hepes以及10％v/v血浆。在一个实施方案中，孵育介质中的血浆获自与获得细胞制备物的细胞的供体相同的供体。在一个实施方案中，在孵育当天将血浆添加至孵育介质中。在一个实施方案中，在37℃下进行孵育。
在一个实施方案中，孵育介质包含甲基强的松龙。在一个实施方案中，孵育介质内的甲基强的松龙进一步诱导单个核富集的细胞组合物中的细胞进入早期凋亡状态。在一个实施方案中，通过冷冻与在甲基强的松龙存在下孵育诱导单个核富集的细胞组合物中的细胞进入早期凋亡状态。在一个实施方案中，产生方法有利地允许诱导早期凋亡状态而实质上并不诱导坏死，其中在制备之后细胞在所述早期凋亡状态下保持稳定约24小时。
在一个实施方案中，孵育介质包含约10-100μg/ml浓度的甲基强的松龙。在一个实施方案中，孵育介质包含约40-60μg/ml或者约45-55μg/ml浓度的甲基强的松龙。在一个实施方案中，孵育介质包含50μg/ml浓度的甲基强的松龙。
在一个实施方案中，孵育历时约2-12小时、可能4-8小时、通常历时约5-7小时。在一个实施方案中，孵育历时约6小时。在一个实施方案中，孵育历时至少6小时。根据一个优选实施方案，孵育历时6小时。
在一个实施方案中，孵育介质包含抗凝剂。在一个实施方案中，抗凝剂添加至孵育介质中改进了细胞制备物的产率。在一个实施方案中，孵育介质中的抗凝剂具有与冷冻介质内相同的浓度。在一个实施方案中，孵育介质包含选自由以下组成的群组的抗凝剂：肝素、ACD配方A以及其组合。在一个实施方案中，用于孵育介质中的抗凝剂是含有10U/ml浓度的肝素的ACD配方A。
在一个实施方案中，孵育介质包含肝素。在一个实施方案中，孵育介质中的肝素浓度介于0.1-2.5U/ml之间。在一个实施方案中，孵育介质中的肝素浓度介于0.1-2.5U/ml之间、可能介于0.3-0.7U/ml之间、通常约0.5U/ml。根据某些实施方案，孵育介质中的肝素浓度为约0.5U/ml。
在一个实施方案中，孵育介质包含ACD配方A。在一个实施方案中，孵育介质中的ACD配方A浓度介于1％-15％v/v之间。在一个实施方案中，孵育介质中的ACD配方A浓度介于1％-15％v/v之间、可能介于4％-7％v/v之间、通常约5％v/v。在一个实施方案中，孵育介质中的ACD配方A浓度为约5％v/v。
在一个实施方案中，冷冻介质与孵育介质都包含抗凝剂。在一个实施方案中，抗凝剂添加至孵育介质与冷冻介质中都得到在组合物的不同制备物之间高的和稳定的细胞产率，与细胞收集条件无关，这些条件诸如(但不限于)在细胞收集期间添加的抗凝剂的时机和/或类型。在一个实施方案中，抗凝剂添加至孵育介质与冷冻介质中都得到细胞制备物的高的和稳定的产率，与在白细胞去除术期间添加的抗凝剂的时机和/或类型无关。
在一个实施方案中，具有高甘油三酯水平的供体血液将从汇集的单个核富集的制备物排除。在一个实施方案中，术语“高甘油三酯水平”指的是高于相同性别和年龄的健康对象的正常水平的甘油三酯水平。在一个实施方案中，术语“高甘油三酯水平”指的是高于约1.7毫摩尔/升的甘油三酯水平。
技术人员应了解，高的和稳定的产率指的是组合物中的细胞产率，其足够高以能够制备当施用于对象时将展示治疗效率的剂量。在一个实施方案中，治疗效率指的是治疗、预防或改善对象的免疫疾病、自体免疫疾病或发炎性疾病的能力。在一个实施方案中，高的和稳定的细胞产率是出自初始冷冻的细胞的组合物中至少30％、可能至少40％、通常至少50％的细胞的细胞产率。
在一个实施方案中，抗凝剂添加至孵育介质和/或冷冻介质中得到组合物内高的和稳定的细胞产率，与供体血液中的甘油三酯水平无关。在一个实施方案中，抗凝剂添加至孵育介质和/或冷冻介质中得到当获自具有正常或高甘油三酯水平的供体血液时组合物内高的和稳定的细胞产率。在一个实施方案中，抗凝剂至少添加至孵育介质中得到组合物内高的和稳定的细胞产率，与供体血液中的甘油三酯水平无关。在一个实施方案中，抗凝剂添加至冷冻介质和孵育介质中得到组合物内高的和稳定的细胞产率，与供体血液中的甘油三酯水平无关。
在一个实施方案中，冷冻介质和/或孵育介质和/或洗涤介质包含至少0.1U/ml、可能至少0.3U/ml、通常至少0.5U/ml浓度的肝素。在一个实施方案中，冷冻介质和/或孵育介质和/或洗涤介质包含至少1％v/v、可能至少3％v/v、通常至少5％v/v浓度的ACD配方A。
在一个实施方案中，单个核富集的细胞组合物在产生方法的每个阶段之间经历至少一个洗涤步骤。在一个实施方案中，在整个产生方法中在洗涤步骤期间将抗凝剂添加至洗涤介质中。在一个实施方案中，单个核富集的细胞组合物在孵育之后经历至少一个洗涤步骤。在一个实施方案中，单个核富集的细胞组合物在孵育之后使用PBS经历至少一个洗涤步骤。在一个实施方案中，在细胞制备物再悬浮于施用介质中之前不添加抗凝剂至最终洗涤步骤中。在一个实施方案中，在细胞制备物再悬浮于施用介质中之前不添加抗凝剂至用于最终洗涤步骤中的PBS中。根据某些实施方案，不添加抗凝剂至施用介质中。
在一个实施方案中，在孵育期间的细胞浓度为约5×106个细胞/毫升。
在一个实施方案中，在冷冻、解冻以及孵育之后使汇集的单个核富集的细胞组合物悬浮于施用介质中，从而得到医药组合物。在一个实施方案中，施用介质包含适合的生理缓冲液。适合的生理缓冲液的非限制性实例是：盐水溶液、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、汉克氏平衡盐溶液(Hank's Balanced Salt Solution，HBSS)，等等。在一个实施方案中，施用介质包含PBS。在一个实施方案中，施用介质包含有益于维持细胞活力的补充剂。在一个实施方案中，在施用之前过滤单个核富集的细胞组合物。在一个实施方案中，在施用之前使用至少200μm的过滤器过滤单个核富集的细胞组合物。
在一个实施方案中，使汇集的单个核富集的细胞组合物再悬浮于施用介质中，这样所得细胞制备物的最终体积介于100-1000ml之间、可能介于200-800ml之间、通常介于300-600ml之间。
在一个实施方案中，产生医药组合物的方法进一步包括获得如上文所描述的汇集的单个核富集的细胞组合物。
在一个实施方案中，本公开提供了细胞制备物，其中所述细胞制备物通过产生方法产生。在一个实施方案中，如本文所公开的组合物包含100％异基因细胞。在另一个实施方案中，组合物包含小于100％的异基因细胞。
在一个实施方案中，包括灭活所述单个核富集的群体的产生汇集的单个核凋亡细胞制备物的方法的步骤(f)包括遏制或消除所述个别群体中的免疫反应，遏制或消除所述个别群体之间的交叉反应性，或降低或消除所述个别群体中的T细胞受体活性，并且其中包含所述汇集的单个核凋亡细胞制备物的所述产生的医药组合物包含在所述细胞制备物内百分比减少的非休眠非凋亡细胞、细胞活化遏制的任何活的非凋亡细胞、或增殖降低的任何活的非凋亡细胞，或其任何组合。
在一个实施方案中，制备细胞制备物的方法包括辐照步骤。在另一个实施方案中，制备汇集的凋亡细胞制备物的方法包括遏制存在于所述细胞制备物中的非凋亡细胞的活化或增殖。在一些实施方案中，所述遏制包括辐照细胞制备物。
在一个实施方案中，包括在所述再悬浮的细胞群体内减少非休眠非凋亡细胞的百分比、遏制任何活的非凋亡细胞的细胞活化、或降低任何活的非凋亡细胞的增殖或其任何组合的步骤(f)“灭活”包括辐照细胞制备物的步骤。在另一个实施方案中，灭活所述单个核富集的群体包括辐照所述单个核富集的群体。在另一个实施方案中，辐照步骤在施用所述制备物后有效地降低能够引起例如GVHD的细胞的百分比。在另一个实施方案中，与未受辐照的细胞制备物相比，辐照步骤降低制备物非休眠非凋亡细胞的实际数目。在另一个实施方案中，与未受辐照的细胞制备物相比，辐照步骤降低制备物非休眠非凋亡细胞的百分比。
在另一个实施方案中，包括辐照的产生医药组合物的方法包括γ辐照或UV辐照。在另一个实施方案中，包括辐照的产生医药组合物的方法包括约15戈瑞单位(Gy)辐照。在另一个方面，辐照包含约20戈瑞单位(Gy)。在另一个方面，辐照包含约25戈瑞单位(Gy)。在另一个方面，辐照包含约30戈瑞单位(Gy)。在另一个方面，辐照包含约35戈瑞单位(Gy)。在另一个方面，辐照包含约40戈瑞单位(Gy)。在另一个方面，辐照包含约45戈瑞单位(Gy)。在另一个方面，辐照包含约50戈瑞单位(Gy)。在另一个方面，辐照包含约55戈瑞单位(Gy)。在另一个方面，辐照包含约60戈瑞单位(Gy)。在另一个方面，辐照包含约65戈瑞单位(Gy)。在另一个实施方案中，辐照包含至多2500Gy。在另一个实施方案中，辐照包含约15-25戈瑞单位(Gy)。在另一个实施方案中，辐照包含约25-30戈瑞单位(Gy)。在另一个实施方案中，辐照包含约30-40戈瑞单位(Gy)。在另一个实施方案中，辐照包含约40-50戈瑞单位(Gy)。在另一个实施方案中，辐照包含约50-65戈瑞单位(Gy)。
在一个实施方案中，如本文所公开的组合物可以冷冻，然后解冻并且在医疗中心施用于对象。在另一个实施方案中，通过白细胞去除术收集的汇集的单个核细胞在使用时间之前可以冷冻并储存于液氮中，其中汇集的单个核细胞解冻并且如上文所描述诱导早期凋亡，继而制备细胞悬浮液组合物用于在医疗中心施用于对象。在另一个实施方案中，如本文所公开的组合物可以呈“备用”形式，其中其在介于约2-8℃之间冷藏并且稳定以供在24小时内使用。
汇集的单个核凋亡细胞制备物的用途
在一个实施方案中，本公开提供了一种在有需要的对象中治疗、预防、改善、抑制免疫疾病、自体免疫疾病、细胞因子释放综合症(CRS)、细胞因子风暴或发炎性疾病或降低免疫疾病、自体免疫疾病、细胞因子释放综合症(CRS)、细胞因子风暴或发炎性疾病的发生率的方法，其包括向对象施用如上文详细描述的治疗、预防、改善、抑制或降低发生率的包含汇集的单个核凋亡细胞制备物的医药组合物。在另一个实施方案中，在施用汇集的单个核凋亡细胞制备物之后有效地清除凋亡细胞。
技术人员应了解，术语“治疗(treatment/treat)”涵盖治疗处理与预防或防御措施，包括疾病或病状的改善，其中目标在于预防或减轻如上文所描述的靶向病理性病状或病症。因此，在一个实施方案中，治疗可以包括直接影响或治愈、遏制、抑制、预防、降低与疾病、病症或病状相关联的症状的严重性，延迟所述症状的发作，减少所述症状，或其组合。因此，在一个实施方案中，“治疗”尤其指的是延迟进展、促进缓解、诱导缓解、增进缓解、加速恢复、增加替代性治疗剂的功效或减少对替代性治疗剂的抗性，或其组合。在一个实施方案中，“预防”尤其指的是延迟症状的发作、预防疾病的复发、减少复发事件的数目或频率、增加有症状事件之间的潜伏期，或其组合。在一个实施方案中，“遏制”或“抑制”尤其指的是降低症状的严重性、降低急性事件的严重性、降低症状的数目、降低疾病相关症状的发生率、减少症状的潜伏期、改善症状、减少继发症状、减少继发感染、延长患者存活期，或其组合。
在一个实施方案中，如本文所公开的使用方法的对象是成年人类。在另一个实施方案中，如本文所公开的使用方法的对象是人类儿童。在另一个实施方案中，使用方法的对象是人类婴儿。
在一个实施方案中，通过本文所公开的方法治疗的免疫疾病选自包含GvHD、关节炎、痛风或炎症性肠病的群组。
在一个实施方案中，根据本文所公开的方法在富集的汇集的单个核细胞制备物中诱导早期凋亡提供了凋亡的HLA不相合的异基因供体细胞的临床级群体，所述群体当与获自骨髓的细胞一起输注时影响与移植相关联的重要因素，并且有效地降低患有血液恶性病的对象的GVHD的发生率。
GvHD
特别地，在移植后100天，II-IV级GVHD的发生率在用所制备的凋亡供体细胞治疗的HSC移植物接受体中可能降低并且非复发的存活率显著增加。早期凋亡细胞制备物的使用细节在WO 2014/087408中公开，这个文献全部并入本文中。
此外，在另一个实施方案中，根据方法制备的凋亡供体细胞的输注有效降低HSC植入的时间并且明显降低HSC移植物接受体的肝中毒的发生率。
在一个实施方案中，本公开提供了一种在经历HSCT的对象中治疗、预防、改善、抑制GVHD或降低GVHD的发生率的方法，其包括向对象施用医药组合物。在另一个实施方案中，本公开提供了一种治疗对象的不孕症的方法。
在一个实施方案中，本公开提供了一种在经历HSCT的对象中预防、改善、抑制GVHD或降低GVHD的发生率的方法，其包括向对象施用医药组合物。在一个实施方案中，本公开提供了一种在经历HSCT的对象中治疗、预防、改善、抑制GVHD或降低GVHD的发生率的方法，其包括向对象施用如本文详细描述的包含汇集的单个核凋亡细胞制备物或其医药组合物的医药组合物，如本文中在上文详细描述。在一个实施方案中，本公开提供了一种在经历HSCT的对象中治疗、治疗、预防、改善、抑制GVHD或降低GVHD的发生率、改善、抑制GVHD或降低的GVHD的发生率的方法，其包括向对象施用如本文中在上文详细公开的医药组合物。
在一个实施方案中，本公开提供了一种在经历HSCT的对象中治疗、预防、改善、抑制GVHD或降低GVHD的发生率的方法，其包括向对象施用如上文详细公开的包含有包含汇集的单个核富集的细胞的细胞制备物的医药组合物；并且其中所述医药组合物包含选自由以下组成的群组的抗凝剂：肝素、ACD配方A以及其组合。
在一个实施方案中，本公开提供了一种在经历HSCT的对象中治疗、预防、改善、抑制GVHD或降低GVHD的发生率的方法，其包括向对象施用如本文详细描述的包含汇集的单个核凋亡细胞制备物或其医药组合物的医药组合物，如本文中在上文详细公开；并且其中所述医药组合物包含选自由以下组成的群组的抗凝剂：肝素、ACD配方A以及其组合。
在一个实施方案中，本公开提供了一种在经历HSCT的对象中治疗、预防、改善、抑制GVHD或降低GVHD的发生率的方法，其包括向对象施用如本文中在上文详细公开的包含有包含汇集的单个核富集的细胞的细胞制备物的医药组合物，并且其中所述制备物包含浓度不超过30μg/ml的甲基强的松龙。在一个实施方案中治疗、预防、改善、抑制或降低发生率。
在一个实施方案中治疗、预防、改善、抑制或降低发生率。在一个实施方案中治疗、预防、改善、抑制或降低如本文详细描述的汇集的单个核凋亡细胞制备物或其医药组合物的发生率。
在一个实施方案中治疗、预防、改善、抑制或降低发生率。在一个实施方案中治疗、预防、改善、抑制或降低发生率。在一个实施方案中，本公开提供了医药组合物，其用于在经历HSCT的对象中治疗、预防、改善、抑制GVHD或降低GVHD的发生率、治疗、预防、改善、抑制GVHD或降低GVHD的发生率。在另一个实施方案中，所述HSCT包含异基因HSCT并且所述医药组合物包含获自与所述接受体对象的HLA不相合的多个异基因供体的细胞；也不是来自彼此HLA相合的所述多个异基因供体的细胞。
在一个实施方案中，GVHD是高级GVHD。根据特定实施方案，高级GVHD是II-IV级GVHD。根据另一个特定实施方案，高级GVHD是III-IV级GVHD。根据一个特定实施方案，医药组合物诱导从高级GVHD转变至I级GVHD。
根据另一个实施方案，GVHD是急性GVHD。根据又一个实施方案，GVHD是慢性GVHD。根据另一个特定实施方案，医药组合物所施用的对象保留移植物抗肿瘤(GVTS)或移植物抗白血病(GVL)效应。
在一个实施方案中，GVHD是对象的肝中的GVHD。异基因HSCT接受体的肝功能障碍可能归因于多种因素，包括来自预备方案和其它药物的毒性、感染、静脉闭塞疾病(VOD)以及肝的急性和慢性移植物抗宿主疾病(GVHD)。
根据另一个实施方案，医药组合物减少与GVHD相关联的肝中毒。在一个实施方案中，细胞制备物减少与GVHD相关联的肝中毒。肝中毒的常见症状和并发症包括淋巴腺炎、发热、红血细胞沉降速率增加的高胆红素水平以及发热性嗜中性粒细胞减少症。
免疫疾病、自体免疫疾病、发炎性疾病、细胞因子释放综合症(CRS)以及细胞因子风暴
在一个实施方案中，本公开提供了一种在有需要的对象中治疗、预防、改善、抑制免疫疾病或自体免疫疾病或发炎性疾病或细胞因子释放综合症(CRS)或细胞因子风暴或降低免疫疾病或自体免疫疾病或发炎性疾病或细胞因子释放综合症(CRS)或细胞因子风暴的发生率的方法，其包括向对象施用本文中在上文详细公开的包含细胞制备物的医药组合物。在一个实施方案中，本公开提供了一种在有需要的对象中治疗、预防、改善、抑制免疫疾病或自体免疫疾病或发炎性疾病或细胞因子释放综合症(CRS)或细胞因子风暴或降低免疫疾病或自体免疫疾病或发炎性疾病或细胞因子释放综合症(CRS)或细胞因子风暴的发生率的方法，其包括向对象施用如本文中在上文详细描述的医药组合物。
在一个实施方案中，本公开提供了汇集的细胞制备物，其用于在有需要的对象中治疗、预防、改善、抑制免疫疾病或自体免疫疾病或发炎性疾病或细胞因子释放综合症(CRS)或细胞因子风暴或降低免疫疾病或自体免疫疾病或发炎性疾病或细胞因子释放综合症(CRS)或细胞因子风暴的发生率制备物。在一个实施方案中，本公开提供了医药组合物，其用于在有需要的对象中治疗、预防、改善、抑制免疫疾病或自体免疫疾病或发炎性疾病或细胞因子释放综合症(CRS)或细胞因子风暴或降低免疫疾病或自体免疫疾病或发炎性疾病或细胞因子释放综合症(CRS)或细胞因子风暴的发生率。
在一个实施方案中，免疫疾病是GVHD。在一个实施方案中，本公开提供了医药组合物，其用于在有需要的对象中治疗、预防、改善、抑制GVHD或降低GVHD的发生率。
在一个实施方案中，本公开提供了一种治疗、预防、改善、抑制造血恶性病或降低造血恶性病的发生率的方法，其包括向有需要的对象施用医药组合物。根据特定实施方案，对象罹患造血恶性病。
如本文所用的术语“造血恶性病”指的是任何血细胞癌，特征为血细胞的不受控的异常生长。术语“造血恶性病”包括(但不限于)白血病、骨髓增生异常综合症、淋巴瘤以及多发性骨髓瘤(浆细胞恶液质)。术语“白血病”指的是血液形成器官的疾病，特征为在身体组织中白细胞数目的异常增加伴有或不伴有在循环血液中那些白细胞的相应增加(例如，急性成淋巴细胞性白血病，ALL；急性骨髓性白血病，AML；慢性骨髓性白血病，CML；等等)。术语“骨髓增生异常综合症”指的是骨髓显示出表明白血病前期过程的定性和定量变化，但具有不一定以急性白血病终止的慢性进程的病状。术语“淋巴瘤”指的是获自B或T淋巴细胞的成淋巴细胞的恶性肿瘤(例如，霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)，HL；非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)，NHL；等等)。术语“浆细胞恶液质”指的是归因于浆细胞增殖的浆细胞增多症(例如，多发性骨髓瘤，MM；浆细胞白血病，PCL；等等)。
根据例示性实施方案，所述造血恶性病选自由MDS、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓系白血病(AML)以及慢性骨髓性白血病(CML)组成的群组。
某些类型的供体血细胞(诸如T淋巴细胞)的输注也可以刺激移植物抗白血病效应。这种效应已经在患有慢性髓系白血病(CML)的患者中最佳地观测到。在CML中，在移植后复发的75％的患者重新进入缓解期。对于诸如急性髓系白血病(AML)和骨髓增生异常综合症(MDS)的其它病症，这种效应不太明显；约20％的患者的AML和MDS进入缓解期。对于患有急性成淋巴细胞性白血病(ALL)的患者，移植物抗白血病效应的存在并不明确，不过少量的患者据报道已经至少短暂得益于这种效应。
在其它方面，汇集的供体免疫细胞可以将残留的白血病、淋巴瘤或癌细胞识别成不同的并且破坏这些细胞。回顾性研究已经证实了发展急性或慢性GVHD的患者比不发展GVHD的患者具有更低的疾病复发率。这个发现是移植物抗肿瘤效应的间接指示。
术语“预处理的处理”指的是在移植之前移植物接受体用各种预处理方案的预备处理，所述方案包括放射线、免疫血清、化学疗法和/或免疫遏制备物。移植预处理在骨髓移植之前极为常见。
技术人员应了解，术语“对象”、“患者”、“接受体”以及“有需要的对象”可以互换使用并且可以涵盖需要施用医药组合物的对象。
在一个实施方案中，将医药组合物施用于已经经历或将要经历HSCT的对象。在一个实施方案中，有需要的对象是经历HSCT的对象。在一个实施方案中，移植至有需要的对象中的造血干细胞(HSC)和医药组合物的细胞获自相同的供体。
根据另一个实施方案，医药组合物的施用在HSCT之前至多24小时进行。在一个实施方案中，医药组合物的施用在HSCT之前约24-30小时进行。根据又一个实施方案，医药组合物的施用与HSCT同时进行。在一个实施方案中，医药组合物的施用在HSCT之后至多15天进行。根据额外实施方案，用于HSCT中的HSC是异基因HSC。根据非限制性实例，用于HSCT中的HSC可以获自骨髓、外周血液或脐带血。根据另一个实施方案，医药组合物以单剂量施用。
炎症性肠病(IBD)特征为慢性肠道炎症伴有胃肠道中的粘膜免疫系统失调，表现为克罗恩氏病(Crohn's disease)和溃疡性结肠炎。如本文所用的术语IBD指的是克罗恩氏病、溃疡性结肠炎或其组合。遗传因素和包括肠道菌群与诸如葡聚糖硫酸钠(DSS)的危险信号的环境因素全部显示出会诱导肠道炎症。TNFa和IFNy阻断和抗IL-Ιβ策略以及抗生素治疗能够改善结肠炎诱导，这表明固有层中巨噬细胞和树突状细胞的核因子-κB(NF-κΒ)和炎性体抑制的作用。
在一个实施方案中，汇集的凋亡细胞组合物在体外与体内负向调控NLRP3炎性体，并且能够下调造血细胞中经由NLRP3炎性体诱导的促炎性反应。
在一个实施方案中，本公开提供了一种在有需要的对象中治疗、预防、改善、抑制IBD或降低IBD的发生率的方法，其包括向对象施用医药组合物。在一个实施方案中，本公开提供了用于在有需要的对象中治疗、预防、改善、抑制IBD或降低IBD的发生率的医药组合物。
在一个实施方案中，本公开提供了一种在有需要的对象中治疗、预防、改善、抑制IBD或降低IBD的发生率的方法，其包括向对象施用如本文详细描述的包含汇集的单个核凋亡细胞制备物或其医药组合物的医药组合物，包含不超过15％的多形核白细胞；并且其中所述医药组合物包含选自由以下组成的群组的抗凝剂：肝素、ACD配方A以及其组合。
在一个实施方案中，本公开提供了一种在有需要的对象中治疗、预防、改善、抑制IBD或降低IBD的发生率的方法，其包括向对象施用如本文详细描述的包含汇集的单个核凋亡细胞制备物或其医药组合物的医药组合物。
在一个实施方案中，治疗、预防、改善、抑制免疫疾病或降低免疫疾病的发生率的方法包括将如本文所公开的组合物施用于经历实体器官移植的对象。在一个实施方案中，器官选自由肺、心、肾、胰、肝、皮肤以及小肠组成的群组。在另一个实施方案中，实体器官包含β细胞。在另一个实施方案中，实体器官是肢。
在如本文所公开的方法的组合物的一个实施方案中，医药组合物的施用在所述移植之前至多24小时进行。在另一个实施方案中，医药组合物的施用与移植同时进行。在又一个实施方案中，如本文所公开的组合物在所述移植之后直至15天施用。在另一个实施方案中，施用包括单次施用。在再一个实施方案中，施用包括用如本文所公开的组合物重复给药。在另一个实施方案中，重复给药显示增加的有效性。
在一个实施方案中，监控对如本文所公开的组合物的施用的免疫原性反应。在另一个实施方案中，如本文所公开的组合物的施用响应负免疫反应而停止，例如其中产生负向影响施用和所述对象的治疗的抗体。在另一个实施方案中，针对中和抗体监控对如本文所公开的组合物的施用的免疫反应。
在一个实施方案中，用如本文所公开的组合物治疗的发炎性疾病是关节炎。在另一个实施方案中，用如本文所公开的组合物治疗的发炎性疾病是痛风。在又一个实施方案中，发炎性疾病是炎症性肠病。
在一个实施方案中，用如本文所公开的组合物治疗的炎症性肠病选自由以下组成的群组：克罗恩氏病、溃疡性结肠炎以及其组合。
细胞因子风暴和细胞因子释放综合症
在一个实施方案中，如本文所公开的方法包括提供如本文详细描述的汇集的单个核凋亡细胞制备物，以减少在对象中可能发生的毒性细胞因子释放或“细胞因子释放综合症”(CRS)或“严重细胞因子释放综合症”(sCRS)或“细胞因子风暴”。在另一个实施方案中，CRS、sCRS或细胞因子风暴作为施用免疫细胞的结果而发生。在另一个实施方案中，CRS、sCRS或细胞因子风暴是独立于免疫细胞的刺激、病状或综合症的结果(见下文)。在另一个实施方案中，细胞因子风暴、细胞因子级联或高细胞因子血症是细胞因子释放综合症的更严重形式。
技术人员应了解，减少毒性细胞因子释放或毒性细胞因子水平包括减少或抑制对象中毒性细胞因子水平的产生，或抑制或降低对象的细胞因子释放综合症或细胞因子风暴的发生率。在另一个实施方案中，在CRS或细胞因子风暴期间降低毒性细胞因子水平。在另一个实施方案中，减少或抑制毒性细胞因子水平的产生包括治疗CRS或细胞因子风暴。在另一个实施方案中，减少或抑制毒性细胞因子水平的产生包括预防CRS或细胞因子风暴。在另一个实施方案中，减少或抑制毒性细胞因子水平的产生包括缓和CRS或细胞因子风暴。在另一个实施方案中，减少或抑制毒性细胞因子水平的产生包括改善CRS或细胞因子风暴。在另一个实施方案中，毒性细胞因子包含促炎性细胞因子。在另一个实施方案中，促炎性细胞因子包含IL-6。在另一个实施方案中，促炎性细胞因子包含IL-1β。在另一个实施方案中，促炎性细胞因子包含TNF-α。在另一个实施方案中，促炎性细胞因子包含IL-6、IL-1β或TNF-α，或其任何组合。
在一个实施方案中，细胞因子释放综合症的特征为对象中若干炎性细胞因子的水平升高和不良身体反应，诸如低血压、高热以及颤抖。在另一个实施方案中，炎性细胞因子包含IL-6、IL-1β以及TNF-α。在另一个实施方案中，CRS的特征为IL-6、IL-1β或TNF-α的水平升高，或其任何组合。在另一个实施方案中，CRS的特征为IL-8或IL-13的水平升高，或其任何组合。在另一个实施方案中，细胞因子风暴的特征为TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、GM-CSF、IL-5、分形趋化因子(fracktalkine)的增加，或其组合或其子组。在又一个实施方案中，IL-6包含CRS或细胞因子风暴的标志。在另一个实施方案中，IFN-γ包含CRS或细胞因子风暴的标志。在另一个实施方案中，具有更高肿瘤负荷的患者具有细胞因子释放综合症的更高发生率和严重性。
在另一个实施方案中，在人类和小鼠的CRS或细胞因子风暴中增加的细胞因子可以包含下表1和2中所列的细胞因子的任何组合。
表1：在人类和/或小鼠的CRS或细胞因子风暴中增加的细胞因子组
Figure BDA0003017722560000451
Figure BDA0003017722560000461
在一个实施方案中，表1的细胞因子Flt-3L、分形趋化因子、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-2Rα、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12以及IL-13被认为在CRS或细胞因子风暴中是显著的。在另一个实施方案中，表1的IFN-α、IFN-β、IL-1以及IL-1Rα在CRS或细胞因子风暴中似乎是重要的。在另一个实施方案中，M-CSF具有未知的重要性。在另一个实施方案中，表1中所列的任何细胞因子或其组合可以用作CRS或细胞因子风暴的标志。
表2：在人类和/或小鼠的CRS或细胞因子风暴中增加的细胞因子组
Figure BDA0003017722560000462
在一个实施方案中，表2的IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-22、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β以及TNF-α被认为在CRS或细胞因子风暴中是显著的。在另一个实施方案中，表2的IL-27、MCP-3、PGE2、RANTES、TGF-β、TNF-αR1以及MIG在CRS或细胞因子风暴中似乎是重要的。在另一个实施方案中，IL-23和IL-25具有未知的重要性。在另一个实施方案中，表2中所列的任何细胞因子或其组合可以用作CRS或细胞因子风暴的标志。
技术人员应了解，术语“细胞因子”可以涵盖细胞因子(例如，干扰素γ、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、肿瘤坏死因子α)、趋化因子(例如，MIP 1α、MIP 1β、RANTES)，以及炎症的其它可溶性介体，诸如反应性氧物质和一氧化氮。
在一个实施方案中，特定细胞因子的释放增加，无论是显著的、重要的或具有未知的重要性，并不先验地意味着特定细胞因子是细胞因子风暴的一部分。在一个实施方案中，至少一种细胞因子的增加不是细胞因子风暴或CRS的结果。在另一个实施方案中，CAR T细胞可以是特定细胞因子或细胞因子群组的水平增加的来源。
在另一个实施方案中，细胞因子释放综合症的特征为以下症状中的任一者或全部：发热伴有或不伴有寒颤、不适、疲劳、厌食、肌痛、关节痛、恶心、呕吐、头痛皮疹、恶心、呕吐、腹泻、呼吸急促、低氧血症心血管心动过速、脉搏压变宽、血压过低、心输出量增加(早期)、心输出量潜在减少(晚期)、D-二聚体升高、低纤维蛋白原血症伴有或不伴有出血、氮质血症肝转氨酶升高、高胆红素血症、头痛、精神状态变化、混乱、谵妄、唤词困难或弗兰克失语症(frank aphasia)、幻觉、震颤、辨距障碍、步态改变、癫痫。在另一个实施方案中，细胞因子风暴的特征为IL-2释放和淋巴细胞增殖。在另一个实施方案中，细胞因子风暴的特征为由CAR T细胞释放的细胞因子增加。在另一个实施方案中，细胞因子风暴的特征为由除了CAR T细胞以外的细胞释放的细胞因子增加。
在另一个实施方案中，细胞因子风暴导致潜在威胁生命的并发症，包括心功能障碍、成人呼吸窘迫综合症、神经中毒、肾和/或肝衰竭以及弥散性血管内凝血。
技术人员应了解，细胞因子释放综合症(CRS)或细胞因子风暴的特征据估计在对CRS或细胞因子风暴触发之后几天至数周发生。在一个实施方案中，CAR T细胞是CRS或细胞因子风暴的触发剂。在另一个实施方案中，CRS或细胞因子风暴的触发剂不是CAR T细胞。
在一个实施方案中，作为细胞因子风暴的指标的细胞因子水平或浓度的测量可以表示为细胞因子水平或浓度的倍数增加、百分比(％)增加、净增加或变化速率。在另一个实施方案中，高于某一水平或浓度的绝对细胞因子水平或浓度可以是经历或正要经受细胞因子风暴的对象的指示。在另一个实施方案中，处于某一水平或浓度下的绝对细胞因子水平或浓度，例如在不经历CAR-T细胞疗法的对照对象中通常发现的水平或浓度，可以是抑制或降低经历CAR T细胞的对象的细胞因子风暴的发生率的方法的指示。
技术人员应了解，术语“细胞因子水平”可以涵盖浓度的量度、倍数变化的量度、百分比(％)变化的量度或速率变化的量度。此外，测量血液、唾液、血清、尿液以及血浆中的细胞因子的方法在本领域中是众所周知的。
在一个实施方案中，尽管认识到细胞因子风暴与若干炎性细胞因子的升高相关联，但IL-6水平可以用作细胞因子风暴的常用量度和/或用作细胞因子风暴的治疗有效性的常用量度。技术人员应了解，其它细胞因子可以用作细胞因子风暴的标志，例如TNF-α、IB-1α、IL-6、IL-8、IL-13或INF-γ中的任一者或上述任何组合可以用作CRS或细胞因子风暴的标志。此外，测量细胞因子的检验方法在本领域中是众所周知的。技术人员应了解，影响细胞因子风暴的方法可以类似地影响细胞因子释放综合症(CRS)。
在一个实施方案中，本文公开了一种减少或抑制经受细胞因子释放综合症或细胞因子风暴的对象中的细胞因子产生的方法。在另一个实施方案中，本文公开了一种减少或抑制易感细胞因子释放综合症或细胞因子风暴的对象中的细胞因子产生的方法。在另一个实施方案中，本文所公开的方法减少或抑制经受细胞因子释放综合症或细胞因子风暴的对象中的细胞因子产生，其中表1和/或2中所列的任何细胞因子或细胞因子群组的产生被减少或抑制。在另一个实施方案中，细胞因子IL-6的产生被减少或抑制。在另一个实施方案中，细胞因子IL-β1的产生被减少或抑制。在另一个实施方案中，细胞因子IL-8的产生被减少或抑制。在另一个实施方案中，细胞因子IL-13的产生被减少或抑制。在另一个实施方案中，细胞因子TNF-α的产生被减少或抑制。在另一个实施方案中，细胞因子IL-6的产生、IL-1β的产生或TNF-α的产生或其任何组合被减少或抑制。
在一个实施方案中，细胞因子释放综合症被分级。在另一个实施方案中，1级描述了症状不威胁生命并且仅需要对症治疗的细胞因子释放综合症，例如，发热、恶心、疲劳、头痛、肌痛、不适。在另一个实施方案中，2级症状需要并且响应适度干预，诸如氧气、流体或用于血压过低的血管加压药。在另一个实施方案中，3级症状需要并且响应积极干预(aggressive intervention)。在另一个实施方案中，4级症状是威胁生命的症状并且需要呼吸器并且患者展现器官毒性。
在另一个实施方案中，细胞因子风暴的特征为IL-6和干扰素γ释放。在另一个实施方案中，细胞因子风暴的特征为IL-6释放。在另一个实施方案中，细胞因子风暴的特征为干扰素γ释放。在另一个实施方案中，细胞因子风暴的特征为表1和2中所列的任何细胞因子或其组合的释放。在另一个实施方案中，细胞因子风暴的特征为本领域中所知的任何细胞因子或其组合的释放。
在一个实施方案中，症状发作在输注开始之后数分钟至数小时开始。在另一个实施方案中，症状与峰值细胞因子水平一致。
在一个实施方案中，抑制或降低经历CAR T细胞癌症疗法的对象的细胞因子释放综合症(CRS)或细胞因子风暴的发生率的方法包括施用如本文所公开的汇集的单个核凋亡细胞制备物或其医药组合物。
在一个实施方案中，在经历CAR T细胞癌症疗法的对象中治疗、预防、改善、抑制细胞因子释放综合症(CRS)或细胞因子风暴或降低细胞因子释放综合症(CRS)或细胞因子风暴的发生率的方法不影响CAR T细胞疗法的功效。在另一个实施方案中，在经历CAR T细胞癌症疗法的对象中治疗、预防、改善、抑制CRS或细胞因子风暴或降低CRS或细胞因子风暴的发生率的方法不使CAR T细胞疗法的功效降低超过约5％。在另一个实施方案中，在经历CART细胞癌症疗法的对象中治疗、预防、改善、抑制CRS或细胞因子风暴或降低CRS或细胞因子风暴的发生率的方法不使CAR T细胞疗法的功效降低超过约10％。在另一个实施方案中，在经历CAR T细胞癌症疗法的对象中治疗、预防、改善、抑制CRS或细胞因子风暴或降低CRS或细胞因子风暴的发生率的方法不使CAR T细胞疗法的功效降低超过约15％。在另一个实施方案中，在经历CAR T细胞癌症疗法的对象中治疗、预防、改善、抑制CRS或细胞因子风暴或降低CRS或细胞因子风暴的发生率的方法不使CAR T细胞疗法的功效降低超过约20％。
定量细胞毒性的任何适当方法可以用于确定经过修饰以表达CAR的免疫细胞的活性是否保持实质上不变。举例来说，细胞毒性可以使用基于细胞培养的检验，诸如实施例中所描述的细胞毒性检验来定量。细胞毒性检验可以采用优先染色死细胞的DNA的染料。在其它情况下，可以使用测量细胞群体中活细胞和死细胞的相对数目的荧光和发光检验。对于这类检验，蛋白酶活性充当细胞活力和细胞毒性的标志，并且标记的细胞渗透肽产生与样品中有活力的细胞的数目成比例的荧光信号。用于各种细胞毒性检验的试剂盒可购自制造商，诸如Promega和Life Technologies。在另一个实施方案中，细胞毒性的量度可以是定性的。在另一个实施方案中，细胞毒性的量度可以是定量的。在进一步实施方案中，细胞毒性的量度可以与细胞毒性细胞因子的表达的变化有关。
与CAR T细胞疗法相关联的细胞因子释放
在一个实施方案中，细胞因子释放在施用诸如CAR T细胞疗法的免疫疗法之后几天至2周之间发生。在一个实施方案中，血压过低和其它症状紧跟在细胞因子释放之后，即从几天至几周。因此，在一个实施方案中，将如本文中在上文详细公开的汇集的单个核凋亡细胞制备物或其组合物与免疫疗法同时施用于对象以作预防。在另一个实施方案中，在施用免疫疗法之后2-3天将凋亡细胞或上清液施用于对象。在另一个实施方案中，在施用免疫疗法之后7天将凋亡细胞或上清液施用于对象。在另一个实施方案中，在施用免疫疗法之后10天将凋亡细胞或上清液施用于对象。在另一个实施方案中，在施用免疫疗法之后14天将凋亡细胞或上清液施用于对象。在另一个实施方案中，在施用免疫疗法之后2-14天将凋亡细胞或上清液施用于对象。
在另一个实施方案中，在施用免疫疗法之后2-3小时将如本文中在上文详细公开的汇集的单个核凋亡细胞制备物或其组合物施用于对象。在另一个实施方案中，在施用免疫疗法之后7小时将凋亡细胞或上清液施用于对象。在另一个实施方案中，在施用免疫疗法之后10小时将凋亡细胞或上清液施用于对象。在另一个实施方案中，在施用免疫疗法之后14小时将凋亡细胞或上清液施用于对象。在另一个实施方案中，在施用免疫疗法之后2-14小时将凋亡细胞或上清液施用于对象。
在一个替代性实施方案中，在免疫疗法之前将如本文中在上文详细公开的汇集的单个核凋亡细胞制备物或其组合物施用于对象以作预防。在另一个实施方案中，在施用免疫疗法之前1天将凋亡细胞或上清液施用于对象。在另一个实施方案中，在施用免疫疗法之前2-3天将凋亡细胞或上清液施用于对象。在另一个实施方案中，在施用免疫疗法之前7天将凋亡细胞或上清液施用于对象。在另一个实施方案中，在施用免疫疗法之前10天将凋亡细胞或上清液施用于对象。在另一个实施方案中，在施用免疫疗法之前14天将凋亡细胞或上清液施用于对象。在另一个实施方案中，在施用免疫疗法之前2-14天将凋亡细胞或上清液施用于对象。
在另一个实施方案中，在施用免疫疗法之前2-3小时将如本文中在上文详细公开的汇集的单个核凋亡细胞制备物或其组合物施用于对象。在另一个实施方案中，在施用免疫疗法之前7小时将凋亡细胞或上清液施用于对象。在另一个实施方案中，在施用免疫疗法之前10小时将凋亡细胞或上清液施用于对象。在另一个实施方案中，在施用免疫疗法之前14小时将凋亡细胞或上清液施用于对象。在另一个实施方案中，在施用免疫疗法之前2-14小时将凋亡细胞或上清液施用于对象。
在另一个实施方案中，一旦细胞因子释放综合症已经发生，可以治疗性地施用如本文中在上文详细公开的汇集的单个核凋亡细胞制备物或其组合物。在一个实施方案中，一旦检测到导致或证明细胞因子释放综合症开始的细胞因子释放，可以施用凋亡细胞或上清液。在一个实施方案中，凋亡细胞或上清液可以终止增加的细胞因子水平或细胞因子释放综合症，并且避免其后遗症。
在另一个实施方案中，在多个时间点处可以治疗性地施用如本文中在上文详细公开的汇集的单个核凋亡细胞制备物或其组合物。在另一个实施方案中，如本文中在上文详细公开的汇集的单个核凋亡细胞制备物或其组合物的施用至少在本文所描述的两个时间点处。在另一个实施方案中，如本文中在上文详细公开的汇集的单个核凋亡细胞制备物或其组合物的施用至少在本文所描述的三个时间点处。在另一个实施方案中，如本文中在上文详细公开的汇集的单个核凋亡细胞制备物或其组合物的施用是在CRS或细胞因子风暴之前和一旦细胞因子释放综合症已经发生时，以及其任何组合。
在一个实施方案中，嵌合抗原受体表达T细胞(CAR T细胞)疗法和如本文中在上文详细公开的汇集的单个核凋亡细胞制备物或其组合物一起施用。在另一个实施方案中，在凋亡细胞疗法或上清液之后施用CAR T细胞疗法。在另一个实施方案中，在凋亡细胞疗法或上清液之前施用CAR T细胞疗法。根据这个方面并且在一个实施方案中，在CAR T细胞疗法之后约2-3周施用凋亡细胞疗法或上清液。在另一个实施方案中，在CAR T细胞疗法之后约6-7周施用凋亡细胞疗法或上清液。在另一个实施方案中，在CAR T细胞疗法之后约9周施用凋亡细胞疗法或上清液。在另一个实施方案中，在CAR T细胞疗法之后至多数月施用凋亡细胞疗法。
因此，在一个实施方案中，将如本文中在上文详细公开的汇集的单个核凋亡细胞制备物或其组合物与免疫疗法同时施用于对象以作预防。在另一个实施方案中，在施用免疫疗法之后2-3天将凋亡细胞或上清液施用于对象。在另一个实施方案中，在施用免疫疗法之后7天将凋亡细胞或上清液施用于对象。在另一个实施方案中，在施用免疫疗法之后10天将凋亡细胞或上清液施用于对象。在另一个实施方案中，在施用免疫疗法之后14天将凋亡细胞或上清液施用于对象。在另一个实施方案中，在施用免疫疗法之后2-14天将凋亡细胞或上清液施用于对象。
在另一个实施方案中，在施用免疫疗法之后2-3小时将如本文中在上文详细公开的汇集的单个核凋亡细胞制备物或其组合物施用于对象。在另一个实施方案中，在施用免疫疗法之后7小时将凋亡细胞或上清液施用于对象。在另一个实施方案中，在施用免疫疗法之后10小时将凋亡细胞或上清液施用于对象。在另一个实施方案中，在施用免疫疗法之后14小时将凋亡细胞或上清液施用于对象。在另一个实施方案中，在施用免疫疗法之后2-14小时将凋亡细胞或上清液施用于对象。
在一个替代性实施方案中，在免疫疗法之前将如本文中在上文详细公开的汇集的单个核凋亡细胞制备物或其组合物施用于对象以作预防。在另一个实施方案中，在施用免疫疗法之前1天将凋亡细胞或上清液施用于对象。在另一个实施方案中，在施用免疫疗法之前2-3天将凋亡细胞或上清液施用于对象。在另一个实施方案中，在施用免疫疗法之前7天将凋亡细胞或上清液施用于对象。在另一个实施方案中，在施用免疫疗法之前10天将凋亡细胞或上清液施用于对象。在另一个实施方案中，在施用免疫疗法之前14天将凋亡细胞或上清液施用于对象。在另一个实施方案中，在施用免疫疗法之前2-14天将凋亡细胞或上清液施用于对象。
在另一个实施方案中，在施用免疫疗法之前2-3小时将如本文中在上文详细公开的汇集的单个核凋亡细胞制备物或其组合物施用于对象。在另一个实施方案中，在施用免疫疗法之前7小时将凋亡细胞或上清液施用于对象。在另一个实施方案中，在施用免疫疗法之前10小时将凋亡细胞或上清液施用于对象。在另一个实施方案中，在施用免疫疗法之前14小时将凋亡细胞或上清液施用于对象。在另一个实施方案中，在施用免疫疗法之前2-14小时将凋亡细胞或上清液施用于对象。
在另一个实施方案中，一旦细胞因子释放综合症已经发生，可以治疗性地施用如本文中在上文详细公开的汇集的单个核凋亡细胞制备物或其组合物。在一个实施方案中，一旦检测到导致或证明细胞因子释放综合症开始的细胞因子释放，可以施用如本文中在上文详细公开的汇集的单个核凋亡细胞制备物或其组合物。在一个实施方案中，凋亡细胞或上清液可以终止增加的细胞因子水平或细胞因子释放综合症，并且避免其后遗症。
在另一个实施方案中，在多个时间点处可以治疗性地施用如本文中在上文详细公开的汇集的单个核凋亡细胞制备物或其组合物。在另一个实施方案中，如本文中在上文详细公开的汇集的单个核凋亡细胞制备物或其组合物的施用至少在本文所描述的两个时间点处。在另一个实施方案中，如本文中在上文详细公开的汇集的单个核凋亡细胞制备物或其组合物的施用至少在本文所描述的三个时间点处。在另一个实施方案中，如本文中在上文详细公开的汇集的单个核凋亡细胞制备物或其组合物的施用是在CRS或细胞因子风暴之前和一旦细胞因子释放综合症已经发生时，以及其任何组合。
在一个实施方案中，嵌合抗原受体表达T细胞(CAR T细胞)疗法和如本文中在上文详细公开的汇集的单个核凋亡细胞制备物或其组合物一起施用。在另一个实施方案中，在如本文中在上文详细公开的汇集的单个核凋亡细胞制备物或其组合物之后施用CAR T细胞疗法。在另一个实施方案中，在如本文中在上文详细公开的汇集的单个核凋亡细胞制备物或其组合物之前施用CAR T细胞疗法。根据这个方面并且在一个实施方案中，在CAR T细胞疗法之后约2-3周施用如本文中在上文详细公开的汇集的单个核凋亡细胞制备物或其组合物。在另一个实施方案中，在CAR T细胞疗法之后约6-7周施用凋亡细胞疗法或上清液。在另一个实施方案中，在CAR T细胞疗法之后约9周施用凋亡细胞疗法或上清液。在另一个实施方案中，在CAR T细胞疗法之后至多数月施用凋亡细胞疗法。
在一个实施方案中，CAR T细胞对于对象是异源的。在一个实施方案中，CAR T细胞获自一个或多个供体。在一个实施方案中，CAR T细胞获自一个或多个骨髓供体。在另一个实施方案中，CAR T细胞获自一个或多个血库捐献。在一个实施方案中，供体是相合的供体。在一个实施方案中，CAR T细胞是通用的异基因CAR T细胞。在另一个实施方案中，CAR T细胞是同基因CAR T细胞。在另一个实施方案中，CAR T细胞来自非相合的第三方供体。在另一个实施方案中，CAR T细胞来自汇集的第三方供体T细胞。在一个实施方案中，供体是骨髓供体。在另一个实施方案中，供体是血库供体。在一个实施方案中，如本文所公开的组合物和方法的CAR T细胞包含一个或多个MHC无限制的针对肿瘤的嵌合受体。在一个实施方案中，可以根据本领域中已知的方案工程改造或施用非自体T细胞以防止或最小化自体免疫反应，诸如美国专利申请公布号20130156794中所描述，这个专利以全文引用的方式并入本文中。
在另一个实施方案中，CAR T细胞对于对象是自体的。在一个实施方案中，使用患者自身的细胞。在这个实施方案中，如果使用患者自身的细胞，那么在汇集的单个核凋亡细胞制备物或其组合物之后施用CAR T细胞疗法。
在一个实施方案中，以局部而非全身方式施用制备物，例如，经由将制备物直接注射至患者身体的特定区域中。在另一个实施方案中，特定区域包含肿瘤或癌症。
在某些实施方案中，CAR T细胞疗法包括施用本文所公开的包含CAR T细胞和汇集的单个核凋亡细胞制备物或其组合物的组合物。
与非CAR T细胞应用相关联的细胞因子释放
在一个实施方案中，本文公开了一种减少或抑制经受细胞因子释放综合症或细胞因子风暴或易感细胞因子释放综合症或细胞因子风暴的对象中的细胞因子产生的方法，其包括将包含如本文中在上文详细公开的汇集的单个核凋亡细胞制备物或其组合物的组合物施用于所述对象的步骤，其中所述施用减少或抑制所述对象中的细胞因子产生。在另一个实施方案中，将细胞因子产生的减少或抑制与经受细胞因子释放综合症或细胞因子风暴或易感细胞因子释放综合症或细胞因子风暴并且未施用如本文中在上文详细公开的汇集的单个核凋亡细胞制备物或其组合物的对象相比较。在另一个实施方案中，减少或抑制细胞因子产生的方法减少或抑制促炎性细胞因子的产生。在另一个实施方案中，减少或抑制细胞因子产生的方法减少或抑制至少一种促炎性细胞因子的产生。在另一个实施方案中，减少或抑制细胞因子产生的方法减少或抑制至少细胞因子IL-6的产生。在另一个实施方案中，减少或抑制细胞因子产生的方法减少或抑制至少细胞因子IL-1β的产生。在另一个实施方案中，减少或抑制细胞因子产生的方法减少或抑制至少细胞因子TNF-α的产生。在另一个实施方案中，本文所公开的减少或抑制细胞因子产生的方法使得与经受细胞因子释放综合症或细胞因子风暴或易感细胞因子释放综合症或细胞因子风暴并且未施用如本文中在上文详细公开的汇集的单个核凋亡细胞制备物或其组合物的对象相比，所述对象中细胞因子IL-6、IL-1β或TNF-α的产生或任何组合降低或抑制。
癌症或肿瘤还可以影响包括促炎性细胞因子的细胞因子的绝对水平。对象中肿瘤负荷的水平可以影响细胞因子水平，特别是促炎性细胞因子。技术人员应了解，短语“减少或抑制”或其语法变型可以涵盖细胞因子产生的倍数减少或抑制、或细胞因子产生的净减少或抑制、或百分比(％)减少或抑制，或可以涵盖细胞因子产生的减少或抑制的变化速率。
在另一个实施方案中，本文公开了一种减少或抑制经受细胞因子释放综合症或细胞因子风暴或易感细胞因子释放综合症或细胞因子风暴的对象中的细胞因子产生的方法，其包括将如本文中在上文详细公开的汇集的单个核凋亡细胞制备物或其组合物施用于所述对象的步骤。
在另一个实施方案中，本文公开了一种减少或抑制经受细胞因子释放综合症或细胞因子风暴或易感细胞因子释放综合症或细胞因子风暴的对象中的细胞因子产生的方法，其包括将如本文中在上文详细公开的汇集的单个核凋亡细胞制备物或其组合物施用于所述对象的步骤。
在一个实施方案中，感染引起对象的细胞因子释放综合症或细胞因子风暴。在一个实施方案中，感染是流感感染。在一个实施方案中，流感感染是H1N1。在另一个实施方案中，流感感染是H5N1禽流感。在另一个实施方案中，感染是严重急性呼吸道综合症(SARS)。在另一个实施方案中，对象患有爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)相关的噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)。在另一个实施方案中，感染是败血症。在一个实施方案中，败血症是革兰氏阴性的。在另一个实施方案中，感染是疟疾。在另一个实施方案中，感染是伊波拉病毒感染(Ebola virus infection)。在另一个实施方案中，感染是天花病毒。在另一个实施方案中，感染是全身革兰氏阴性细菌感染。在另一个实施方案中，感染是雅里希-赫克斯海默综合症(Jarisch-Herxheimer syndrome)。
在一个实施方案中，对象的细胞因子释放综合症或细胞因子风暴的病因是噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)。在另一个实施方案中，HLH是散发性HLH。在另一个实施方案中，HLH是巨噬细胞活化综合症(MAS)。在另一个实施方案中，对象的细胞因子释放综合症或细胞因子风暴的病因是MAS。
在一个实施方案中，对象的细胞因子释放综合症或细胞因子风暴的病因是慢性关节炎。在另一个实施方案中，对象的细胞因子释放综合症或细胞因子风暴的病因是全身型幼年特发性关节炎(sJIA)，也称为斯蒂尔氏病(Still's Disease)。
在一个实施方案中，对象的细胞因子释放综合症或细胞因子风暴的病因是隐热蛋白(Cryopyrin)相关周期综合症(CAPS)。在另一个实施方案中，CAPS包含家族性冷因性自体发炎综合症(FCAS)，也称为家族性冷因性荨麻疹(FCU)。在另一个实施方案中，CAPS包含穆-韦二氏综合症(Muckle-Well Syndrome，MWS)。在另一个实施方案中，CAPS包含慢性婴儿神经皮肤关节(CINCA)综合症。在又一个实施方案中，CAPS包含FCAS、FCU、MWS或CINCA综合症，或其任何组合。在另一个实施方案中，对象的细胞因子释放综合症或细胞因子风暴的病因是FCAS。在另一个实施方案中，对象的细胞因子释放综合症或细胞因子风暴的病因是FCU。在另一个实施方案中，对象的细胞因子释放综合症或细胞因子风暴的病因是MWS。在另一个实施方案中，对象的细胞因子释放综合症或细胞因子风暴的病因是CINCA综合症。在再一个实施方案中，对象的细胞因子释放综合症或细胞因子风暴的病因是FCAS、FCU、MWS或CINCA综合症，或其任何组合。
在另一个实施方案中，对象的细胞因子释放综合症或细胞因子风暴的病因是隐热蛋白病(cryopyrinopathy)，其包含NLRP3基因，也称为CIASI基因的遗传性或重新功能获得突变。
在一个实施方案中，对象的细胞因子释放综合症或细胞因子风暴的病因是遗传性自体发炎病症。
在一个实施方案中，炎性细胞因子释放的触发剂是脂多糖(LPS)、革兰氏阳性毒素、真菌毒素、糖基磷脂酰肌醇(GPI)，或RIG-1基因表达的调节。
在另一个实施方案中，经受细胞因子释放综合症或细胞因子风暴的对象并不患有传染病。在一个实施方案中，对象患有急性胰腺炎。在另一个实施方案中，对象患有组织损伤，所述组织损伤在一个实施方案中是严重灼伤或创伤。在另一个实施方案中，对象患有急性呼吸窘迫综合症。在另一个实施方案中，对象患有继发于药剂使用的细胞因子释放综合症或细胞因子风暴。在另一个实施方案中，对象患有继发于毒素吸入的细胞因子释放综合症或细胞因子风暴。
在另一个实施方案中，对象患有继发于接受免疫疗法的细胞因子释放综合症或细胞因子风暴，所述免疫疗法在一个实施方案中是使用超激动CD28特异性单克隆抗体(CD28SA)的免疫疗法。在一个实施方案中，CD28SA是TGN1412。在另一个实施方案中，免疫疗法是CAR T细胞疗法。在另一个实施方案中，免疫疗法是树突状细胞疗法。
在另一个实施方案中，如本文中在上文详细公开的汇集的单个核凋亡细胞制备物或其组合物可以用于控制由医药组合物的施用引起的细胞因子释放综合症或细胞因子风暴。
在另一个实施方案中，如本文中在上文详细公开的汇集的单个核凋亡细胞制备物或其组合物可以用于控制由抗体的施用引起的细胞因子释放综合症或细胞因子风暴。在一个实施方案中，抗体是单克隆的。在另一个实施方案中，抗体是多克隆的。在一个实施方案中，抗体是利妥昔单抗(rituximab)。在另一个实施方案中，抗体是Orthoclone OKT3(莫罗单抗-CD3(muromonab-CD3))。在另一个实施方案中，抗体是阿仑单抗(alemtuzumab)、托西珠单抗(tosituzumab)、CP-870,893、LO-CD2a/BTI-322或TGN1412。
在另一个实施方案中，炎性细胞因子产生的控制可能有益的疾病的实例包括癌症、过敏、任何类型的感染、中毒性休克综合症、败血症、任何类型的自体免疫疾病、关节炎、克罗恩氏病、狼疮、牛皮癣，或标志性特征是在对象中造成有害影响的毒性细胞因子释放的任何其它疾病。
呈现以下实施例以更全面地说明实施方案。然而，这些实施例应决不解释为限制广泛的范围。
实施例
实施例1：单一来源早期凋亡细胞的产生
含有从来自同胞HLA相合的供体的单个核富集的细胞部分产生的凋亡细胞的早期凋亡细胞产物已经详细描述于WO 2014/087408中，参看例如实施例章节，其中WO 2014/087408申请全部并入本文中。供体的合格准则包括以下：成年男性或女性供体，18-65岁；供体和接受体必须在HLA A、B、C以及DR基因座处具有至少7/8HLA相合；40kg以上；除了捐献用于HSCT以外愿意捐献造血单个核细胞用于产生早期凋亡细胞。合格供体约在第-19天返回门诊部用于根据当地SOP使用白细胞去除术程序(
Figure BDA0003017722560000592
SpectraTM,Gambro BCT,Lakewood,CO,USA)进行外周血液单个核收集。
在约2.5小时的白细胞去除术期间，加工7L血液并且在室温下将单个核细胞收集至转移包中。来自供体的富集的单个核细胞部分的估计产率是在100-140ml估计体积中的1.0×1010个细胞。由白细胞去除术产生的细胞集合中单个核细胞部分的平均百分数是88±8％(范围介于65-96％之间)。细胞产率取决于供体可变性而变化。
从HLA相合的供体收集的单个核富集的细胞部分经历顺序过程用于经由多步程序诱导早期凋亡，所述多步程序包括冷冻和解冻细胞，继而与甲基强的松龙一起孵育(下文详述)。早期凋亡最终细胞悬浮液含有至少40％的早期凋亡细胞。在现行优良制造程序(cGMP)下制备用于输注的细胞悬浮液。在HSCT之前24-30小时并且在制备完成的8小时内进行输注。将细胞储存于2-8℃下直至施用。
与甲基强的松龙一起孵育
在制备早期凋亡细胞产物期间，将富集的单个核细胞部分在包含50μg/mL甲基强的松龙的凋亡诱导介质中孵育六小时。在凋亡诱导结束时，洗涤细胞并且再悬浮于PBS中。在收集质量控制样品之后早期凋亡细胞产物的最终体积是300ml。在从三个运作制备的最终产物上测定早期凋亡细胞最终产物的上清液中甲基强的松龙的残余量。使用反相液相色谱法(HPLC)测定甲基强的松龙水平。由Spectrolab Analytical Laboratory(Rehovot,Israel)授权并进行检验。早期凋亡细胞最终产物中残余的甲基强的松龙的水平呈现于下表3中。
表3.早期凋亡最终细胞产物中残余的甲基强的松龙
Figure BDA0003017722560000591
Figure BDA0003017722560000601
最终产物中残余的甲基强的松龙浓度的范围是在早期凋亡细胞产物的最低细胞剂量中3.7mg/L和在最高细胞剂量中21.9mg/L。最终剂量中总甲基强的松龙的范围是与早期凋亡剂量相关的1.11-6.57mg。结果证实了存在于早期凋亡细胞产物中的甲基强的松龙的量(包括最高组群中)相对于在骨髓移植期间作为一般治疗方案的一部分由患者接受的甲基强的松龙的剂量是可忽略的。
制造过程描述
富集的单个核细胞部分和血浆从健康的合格供体的收集在单采中心经由单采机和无菌的一次性试剂盒进行。将细胞收集至细胞收集袋中并将自体血浆收集至血浆收集袋中。来自供体的富集的单个核细胞部分的估计产率预期是在250-350mL中的约1.5×1010个细胞。在单采期间，也收集约400-600mL供体自体血浆。将所收集的细胞和血浆储存于室温下直至进一步加工并且准备在平均从收集完成起的3-6小时内低温保存。
冷冻程序：
细胞：
在袋中制备冷冻介质且在cGMP条件下在封闭系统中进行冷冻程序。
在单采当天新鲜制备用于细胞冷冻的介质，所述介质提前预冷却并且由以下配方组成：
混合物1：注射用勃脉力A(PlasmaLyte A)pH 7.4、5％人血清白蛋白以及经10U\ml肝素接种的5％抗凝剂柠檬酸盐葡萄糖(ACD)配方A溶液。
混合物2：注射用勃脉力A pH 7.4、10％DMSO以及经10U\ml肝素接种的5％ACD配方A溶液。
在白细胞去除术程序完成之后，用补充有经10U\ml肝素接种的5％ACD配方A溶液的预冷却的注射用勃脉力A pH 7.4洗涤细胞。在洗涤之后，移除上清液且用混合物1使细胞沉淀再悬浮。然后对细胞计数且分析活力。
表4.在收集期间和冷冻过程之前收集的细胞的说明
测试 方法 说明
细胞计数 血液分析仪 至少10<sup>9</sup>个总细胞
细胞活力 经由光学显微镜的台盼蓝阳性细胞计数 至少85％台盼蓝阴性细胞
身份/纯度 血液分析仪 至少50％单个核细胞
根据细胞计数，计算所收集的细胞的总数。根据50-65×106个细胞\毫升的浓度确定细胞冷冻袋的数目。然后将混合物1进一步添加至细胞中达到50％最终冷冻体积的体积。然后将细胞转移至冷冻袋中，并且将混合物2添加至每个袋中达到50％最终冷冻体积的体积。
将每个冷冻袋放置于预冷却的冷冻盒中并且转移至-18-(-25)℃冷冻机中维持2小时。在-18-(-25)℃下两小时后，将盒转移至-80℃冷冻机中再维持两小时。在-80℃下两小时后，将盒转移至液氮冷冻机中以供长期储存直至需要用于制造为止。
血浆：
将血浆分成50ml等分试样，储存于150ml转移包容器(命名为“血浆冷冻袋”)中。
在等分完成之后，将所有血浆冷冻袋转移至-80℃冷冻机中维持2小时。在-80℃下2小时后，将血浆冷冻袋转移至-18-(-25)℃冷冻机中长期储存。
凋亡细胞(早期凋亡)制造
在cGMP条件下在封闭系统中进行这个过程。
制造过程
介质制备：
制造过程包括三种介质类型，全部在袋中制得：
(1)解冻洗涤介质
(2)诱导溶液
(3)乳酸林格氏溶液(lactated ringer's solution)
解冻洗涤介质用于解冻之后的细胞洗涤。解冻洗涤介质的最终配方是补充有2mML-谷氨酰胺、10mM Hepes以及经10U\ml肝素接种的5％ACD配方A溶液的RPMI 1640。诱导溶液用于凋亡诱导并且其配方是补充有2mM L-谷氨酰胺和10mM Hepes、10％自体血浆、50μg\ml甲基强的松龙以及经10U\ml肝素接种的5％ACD配方A溶液的RPMI 1640。
介质在使用前预加温。
解冻和凋亡诱导：
将含有冷冻细胞浓缩物的冷冻袋从液氮储存冷冻机转移并且浸入35-38℃循环水浴中。使细胞浓缩物解冻至完全同时缓缓混合约120秒。然后从水浴移出细胞冷冻袋并且通过在70％异丙醇中冲洗来消毒并且擦干。
将解冻的冷冻袋连接至预加温的解冻洗涤介质袋并且将解冻的细胞通过重力流转移至转移包中。对于每个额外的冷冻袋重复这个过程。
使悬浮的解冻细胞在25℃下以290×g离心10分钟。在结束时，从离心机小心地移出洗涤的细胞并且移除上清液。
用预加温的诱导溶液使洗涤的细胞再悬浮并且缓缓混合直至形成均质悬浮液。
然后对细胞计数并且分析活力。
表5：用于解冻的收集的细胞预诱导的过程控制测试
测试 测试方法 说明
细胞计数 血液分析仪 每个取样袋的细胞数目需要是-30％≤或≤+10％来自冷冻
细胞活力 台盼蓝或等效物 至少85％有活力的细胞
基于细胞计数和合格对象所需的细胞剂量，制备适当数目的细胞培养袋使得每个袋的体积应维持于如由制造商确定的体积范围内。用诱导溶液使细胞达到约5×106个细胞\毫升的最终浓度，并且将细胞均匀地分配至与所需一样多的细胞培养袋。
将含有细胞与诱导溶液的细胞培养袋在37℃、5％CO2下孵育6小时。
体积缩减和最终产物的最终配制：
使用LOVO细胞加工系统自动地进行体积缩减和与施用缓冲液(乳酸林格氏溶液)的介质交换。
LOVO仪器加载有无菌的一次性试剂盒。施用缓冲液和细胞培养袋无菌地连接至试剂盒。经由LOVO使用5:1缩减率加工含有凋亡细胞的细胞培养袋，同时将最终配制直接进行至具有冷乳酸林格氏溶液的递送袋中达到450-500ml的最终体积。
收集样品用于释放和释放后测试
充分混合最终产物递送袋的内含物以确保均质混合物。移出约10％用于如下表6中详述的释放测试：
表6：早期凋亡细胞药物产物释放和释放后测试方法与说明
Figure BDA0003017722560000631
最终产物数据呈现于表7中。
表7.由Enlivex制造的批次的结果：细胞计数、活力、身份/纯度以及凋亡
Figure BDA0003017722560000632
Figure BDA0003017722560000641
用于输注的释放产物：
一旦最终产物通过释放测试，将最终早期凋亡细胞产物储存于2-8℃下并且输送至临床中心以供患者施用。将使用具有不小于200微米过滤器的输液器施用产物。基于初步稳定性数据，最终早期凋亡细胞产物的失效时间是从制备时间起的48小时。
实施例2：汇集的凋亡细胞制备物在GvHD白血病/淋巴瘤模型中的用途
在以下初步工作中，检查相同输注液在GvHD白血病/淋巴瘤模型中的作用。检查受辐照的多供体单一凋亡细胞输注液(汇集的单个核受辐照的凋亡细胞制备物)用于预防经历骨髓移植(BMT)的小鼠的急性GvHD的安全性和功效。在这个模型中，BMT救助受辐照的小鼠(80-100％)。
关于移植物抗白血病(GvL)效应可能损失的问题在潜在避免高级aGVHD的每个成功的治疗中出现，因为据发现这种效应与GVHD的严重性相关。
方法
按照上述实施例1制备凋亡细胞，例外的是在本实验中，同时从4个供体完成制备。在从4个供体制备之后，在最后一个步骤(在辐照之前)组合细胞制备物，之后立即受辐照，并且在辐照之后立即注射。辐照是25Gy。
结果
图1和2中呈现的两个图显示来自多个个别供体(三角形)的凋亡细胞的单次注射对存活与重量损失的明确作用(p<0.01)。图1是用来自多个个别供体的单剂量受辐照的凋亡细胞处理的GvHD小鼠模型的卡普兰-梅尔存活曲线，其中存活得到显著改善。图2是遵循并关联图1的发现的2个比较组的重量损失的百分比。
总之，多供体受辐照的凋亡细胞的单次输注成功并显著地改进GvHD的小鼠模型的预期寿命。
实施例3：来自多个个别供体的凋亡细胞的稳定性准则
这个研究的目标在于使用与未受辐照的HLA相合的凋亡细胞的比较性研究开发来自多个个别供体的凋亡细胞的稳定性准则(Mevorach等(2014)《血液和骨髓移植生物学(Biology of Blood and Marrow Transplantation)》20(1):58-65；Mevorach等(2015)《血液和骨髓移植生物学(Biology of Blood and Marrow Transplantation)》21(2):S339-S340)。
将在2至8℃下储存8、24、48以及60小时后在每个时间点取样来评估凋亡细胞最终产物制备物的细胞数目、活力、凋亡表型以及效力。将遵循标准操作程序(SOP)(实施例1；实施例5)和批记录(BR；即，特定制造程序)来制备凋亡细胞最终产物批次。对于效力评估，将测试早期凋亡细胞制备物最终产物批次的样品对脂多糖(LPS)诱导的MHC-II在未成熟树突状细胞(时间点0-24h)或单核白细胞(时间点0-6)上的表达上调的抑制并且将根据SOP进行并在BR上记录。将对分别源于多个个别供体和源于单一供体的制备物中的汇集和非汇集的产物进行这一系列的测试。
另外，将有文件证明CD3(T细胞)、CD19(B细胞)、CD14(单核白细胞)、CD15高(粒细胞)以及CD56(NK细胞)的流式细胞术分析。这些研究的目的在于证实与窄范围的结果的一致性。初步结果与这些目标一致并且注意到不偏离SOP并且未报告有技术问题。然而，需要进一步研究以推断有效治疗的范围和稳定性。初步结果显示所有这些参数中的等效性(实施例6，表3)。此外，单供体稳定性研究显示至少经过48小时时段的稳定性(实施例5；细胞制备物)。
实施例4：多供体受辐照的凋亡细胞作为急性移植物抗宿主疾病的预防的安全性和功效
目标：评估来自多个非相合供体的受辐照的凋亡细胞的单剂量施用用于预防经历异基因hla相合的造血干细胞移植的人类白细胞抗原相合的相关和无关患者的造血恶性病中的移植物抗宿主疾病的安全性、耐受性以及初步功效的1/2a期、多中心、开放标签研究
初级目标：在于确定多供体受辐照的凋亡细胞治疗的安全性和耐受性。
二级目标：在于确定来自多个个别供体的受辐照的凋亡细胞作为用于计划经历造血干细胞移植(HSCT)的患有造血恶性病的患者的急性GVHD(aGVHD)的预防措施的功效。出于这个研究的目的，HSCT可以是骨髓移植(BMT)或外周血液干细胞移植(PBSCT)。
治疗适应症：人类白细胞抗原(HLA)相合的相关和无关患者的造血恶性病的移植后移植物抗宿主疾病(GVHD)
研究设计：这是计划在完全清髓或减低强度清髓预处理方案之后经历来自HLA相合的相关或无关供体的HSCT(骨髓移植或外周血液干细胞移植)的诊断患有造血恶性病的患者中的开放标签研究、多中心、1/2a期研究。
在接受体患者签署知情同意书、供体筛选时段以及起始预处理方案前的细胞收集之后，将指定合格的接受体患者(通过预防处理并且以1:1比率的相关对无关移植物供体分层以在HSCT移植之前12-36小时接受静脉内(IV)注射以达成：
研究臂：在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中的受辐照的早期凋亡细胞/公斤体重的140×106 ±20％细胞/公斤(来自多个个别供体)的单剂量。
所有患者还将用机构照护标准(SOC)免疫遏制方案治疗：用于完全清髓的环孢霉素/甲氨蝶呤或他克莫司/甲氨蝶呤和用于减低强度的霉酚酸酯/环孢霉素或霉酚酸酯/他克莫司。患者如医疗上所指示将住院。
对于二级功效终点将追踪患者180天并且对于初级安全性和三级功效终点将追踪1年。参与这个研究的患者的随访次数将与处于病状中的患者惯常的那些随访次数是可比的。对于供体，研究特定的随访将用于在筛选时段期间的单采程序。
因为这些患者患有许多潜在的医学病状并且可能经受与aGVHD相容的症状，所以可能难以绝对地确定毒性是否与凋亡细胞有关，不过来自使用凋亡细胞用于GvHD预防的先前1-2a期研究的基本数据存在(Mevorach等(2014)《血液和骨髓移植生物学(Biology ofBlood and Marrow Transplantation)》20(1):58-65；《供体单个核早期凋亡细胞的单次输注作为用于清髓性HLA相合的异基因骨髓移植中的移植物抗宿主疾病的预防：I/IIa期临床试验(Single Infusion of Donor Mononuclear Early Apoptotic Cells asProphylaxis for Graft-versus-Host Disease in Myeloablative HLA-MatchedAllogeneic Bone Marrow Transplantation:A Phase I/IIa Clinical Trial)》.BBMT 20(1)58-65)。
数据安全性监控委员会(Data Safety Monitoring Board，DSMB)将满足DSMB章程中所规定的，包括在假定事先未提出安全性问题的计划期中分析(180天)的时间。
研究程序：
研究将包括筛选、治疗以及追踪时段。
1.筛选时段(第-60天至第-2天)
潜在接受体患者将在实施任何研究相关程序之前签署知情同意书。在批准之前的标准评定将在筛选时段期间由移植中心对供体进行并且通常包括：人口数据、病史、HLA配型状况验证(不需要配型)、身体检查、身高和体重、生命征象、妊娠测试(所有妇女)、血液学、血液化学、传染病筛选、ECG以及验尿。
接受体(研究患者)将在筛选时段期间经历以下评定：人口数据、病史、卡氏体能状况(Karnofsky performance status)、HLA配型验证、身体检查、身高和体重、生命征象、妊娠测试(所有妇女)、ECG、肺功能测试、血液学、血液化学、凝血标志、传染病筛选以及验尿。
在初始筛选评估之后，如果接受体参与研究是合格的，那么将在预处理方案的第一天指定接受体患者接受140×106±20％细胞/公斤的多供体凋亡细胞的单次IV输注。预处理方案将在计划用于第-1天研究的凋亡细胞输注之前某天或当天完成。
将对于每个接受体患者计算凋亡细胞剂量并且将因此决定假定的单采收集数目和供体数目。
对于外周干细胞移植物供体：介于第-6天至第-1天之间，供体将接受G-CSF的一次或多次的每天一次注射以动员祖细胞并且在第0天将经历单采以产生用于移植的供体造血干细胞。用于骨髓移植的造血干细胞的制备将根据中心标准惯例由受过训练的医务人员进行。用于HSCT的造血干细胞在施用之前将不加操纵或T细胞净除。
对于骨髓移植物供体：骨髓将按照中心标准惯例收集并制备并且将不以其它方式操纵。
2.治疗当天(第-1天)
第-1天(在HSCT之前12-36小时)，合格患者将接受140×106 ±20％细胞/公斤多个个别供体的受辐照的早期凋亡细胞的单次IV输注。将在输注期间每小时并且此后对于第一个24小时每4小时监控生命征象。将在输注之后立即评定治疗相关的AE。
第0天，患者将根据当地机构指南经历造血干细胞移植。
3.短期追踪时段(第0天至第180天)
将追踪患者至研究第180天用于评定初级终点安全性和耐受性以及二级和三级终点：aGVHD II-IV级的累积发生率(基于Przepiorka等的“修改的格鲁兹堡(modifiedGlucksberg)”共识，任何级别和高级aGVHD的累积发生率，即，aGVHD II-IV级的发展时间；GVHD的任何全身治疗，以及cGVHD的发展。
短期追踪随访将在为了移植而住院时(通常至少第-1至第+14天或更长时间)每天进行并且在出院之后第一个7周期间每周随访；第+7天、第+14天、第+21天、第+28天、第+35天、第+42天，然后在第60天、第100天、第140天及第180天。随访窗口对于每个周随访(第一个7周)将是±5天且对于后续追踪时段直至180天期间的两周或更长时间的随访是±5天。
将在第1天、第3天、第7天、第+7天、第+28天、第+42天、第60天、第100天、第140天以及第180天获得血液样品并且检查植入记录、免疫恢复、血浆和血清生物标志(“Michigan”)以及细胞子群体。
4.长期追踪时段(第181天至第365天/1年)
将在HSCT后历时一年追踪患者的更长期二级终点：非复发死亡率和总体存活率(OS)、复发发生率、无白血病存活率(LFS)以及慢性GVHD。将有至少两次长期追踪随访，最后一次是在HSCT之后12±1个月。
研究持续时间：对于每个参与患者，研究中的持续时间将直至14个月，如下：
A.筛选 直至60天(2个月)
B.治疗 1天
C.追踪 365天(12个月)，由以下组成：
D.短期 180天
E.长期 +180天
研究群体：按照中心标准惯例在清髓或减低强度预处理方案之后计划经历涉及至少15个无关供体的HSCT(骨髓移植或外周血液干细胞移植)的诊断患有血液恶性病的总共25个患者将包括于这个研究中并且将与历史对照相比较。
纳入/排除准则：
接受体患者排除准则
1.患者，年龄>18，对于以下恶性病的异基因HSCT是合格的：
A.急性髓系或未分化或双表型白血病，处于完全缓解(任何缓解)或更高程度，但由骨髓的形态分析具有<5％原始细胞。
B.处于完全缓解的急性髓系白血病(AML)，如果其已经从骨髓增生异常综合症(MDS)演化(在诊断急性髓系白血病之前至少3个月应存在有文件证明的MDS诊断)。或从真性红细胞增多症或原发性血小板增多症演化。
C.急性成淋巴细胞性白血病(ALL)，处于完全缓解(任何缓解)，由骨髓的形态分析具有<5％原始细胞。
D.慢性髓系白血病(CML)，处于慢性或加速期。
E.骨髓增生异常综合症-难治性血细胞减少症伴有多系发育异常(RCMD)、RA(难治性贫血)、具有环形铁粒幼红细胞的RA(RARS；所有<5％原始细胞)、具有过量原始细胞的RA(RAEB；5至20％原始细胞)。
移植物供体和接受体患者必须在HLA A、B、C、DQ以及DR基因座处具有至少8/8HLA相合并且无抗原或等位基因错配。然而，用于凋亡细胞形成的白细胞的供体不受HLA配型限制。
在筛选随访时至少70％的体能状况评分(对于成人是卡氏(Karnofsky)并且对于<16岁的接受体是兰氏(Lansky))。
在预处理起始的4周内成人的心脏左心室射血分数≥40％；如果有先前的蒽环类药物(anthracycline)暴露或心脏病史，那么需要MUGA扫描或心脏ECHO。
肺功能测试中DLCO1、FEV1(用力呼气量)以及FVC(用力肺活量)在预测值的60％以上。
在室内空气下至少90％的氧饱和度。
患者必须具有足够的器官功能，如下文所定义：
A.AST(SGOT)/ALT(SGPT)<3×正常值上限(ULN)。
B.血清肌酐<2.0mg/dL(成人，>16岁)或<0.8(1-2岁)、<1(3-4岁)、<1.2(5-9岁)、<1.6(10-13岁)以及1.8(14-15岁)。
C.血清胆红素<3mg/dL，除非因吉伯氏病(Gilbert's disease)或溶血所致。
由患者独立地或在少数情况下由监护人签署参与研究的知情同意书。
能够顺应研究的要求。
对于4周的持续时间(从第-1天起)，女性与男性都必须同意：
A.如果存在BMT相关的限制，那么持续第一个月或更长时间使用可接受的生育控制方法或手术节育。
Figure BDA0003017722560000701
B.不管生育潜力如何，需具有阴性妊娠测试结果。
接受体患者排除准则
纳入准则中未规定对于HSCT合格的所有疾病。
在筛选随访的30天内参与介入性研究试验。
患有进行性或控制不良的恶性病。
如果BMT计划包括T细胞净除的同种异体移植。
如果BMT计划包括抗胸腺细胞球蛋白(ATG)或阿仑单抗作为免疫遏制方案或高剂量环磷酰胺疗法的一部分用于在移植后预防GVHD。
在筛选随访的两周内不受控的感染，包括败血症、肺炎伴有低氧血症、持续性菌血症或脑膜炎。
受HBV或HCV的当前已知的活动性急性或慢性感染。
已知的人类免疫缺陷病毒(HIV)感染。
患有严重或有症状的限制性或阻塞性肺病或需要呼吸机支持的呼吸衰竭的患者。
患有可能威胁到参与研究的其它并发的严重和/或不受控的医学病状(即，活动性感染、不受控的糖尿病、不受控的高血压、充血性心脏衰竭、不稳定性心绞痛、室性心律失常、活动性缺血性心脏病、六个月内心肌梗塞、慢性肝或肾病、活动性上胃肠道溃疡)的患者。
易干扰研究产物效果的评估的任何慢性或急性病状。
在研究者的观点看来易干扰研究进行的任何形式的物质滥用(包括药物或酒精滥用)、精神病症或任何慢性病状。
器官同种异体移植或先前的干细胞移植历史(仅异基因)。
有生育潜力的妇女的母乳喂养。
可能在研究期间不顺应或不合作的患者。
研究产物途径和剂型
将在HSCT之前12-36小时以140×106±20％细胞/公斤的受辐照的多供体凋亡细胞产物的IV输注施用凋亡细胞。
凋亡细胞是由多个个别供体的凋亡细胞组成的基于细胞的治疗剂。产物含有呈具有至少40％早期凋亡细胞的液体悬浮液形式的异基因供体单个核富集的细胞。根据GMP规则用PBS溶液从多个个别供体制备悬浮液并且应储存于2-8℃下直至输注。最终产物将具有在不透明转移包中300-600mL的总体积并且将在制备之后用25Gy辐照。研究产物应在完成制造过程的48小时内施用于患者。
安全性结果/功效终点/结果量度
初级：
安全性和耐受性终点包括植入时间和身体检查以在第180天和第360天(1年)确定不良事件、伴随药物以及实验室安全性。此外，预期受辐照的汇集的凋亡细胞制备物将显示体外和体内细胞增殖的缺乏和体内活化的缺乏。这种显示将汇集的凋亡细胞制备物鉴别为使用安全的。
二级：
A.第180天的使用基于(Przepiorka等,1995)的“修改的格鲁兹堡”共识的aGVHDII-IV级的累积发生率
B.1年非复发死亡率和总体存活率(OS)
C.1年复发发生率
D.1年无白血病存活率(LFS)
E.在第一个180天内aGVHD的最大级别
F.III-IV级aGVHD的累积发生率
G.第180天和第360天(1年)的根据(Jagasia等,2015)的慢性GVHD的发生率
H.第20天至第180天用于治疗aGvHD的包括皮质类固醇(使用与否和累积剂量)的任何“全身治疗”
I.第+28天、第100天、第180天以及第360天(1年)涉及T、B、NK以及单核白细胞的免疫重建和功能
J.通过180天和1年的大感染率(包括需要住院的肺浸润、CMV再活化以及任何其它感染)
三级/探索性：
A.处于风险下的住院天数对总天数的百分比，或活着并离开医院的总天数。或在移植后直至第一次出院的总住院天数。
B.器官特异性GVHD
C.第180天的T regs、CD4 Tcon、CD8、NK以及B细胞水平
统计分析：
研究结果将与具有可比的基线特征的个体的历史对照相比较。
描述性统计将用于概括结果量度和基线特征。在这个分析中，将呈现所有可用数据而不对任何缺失数据进行插补。对象将贡献可用的数据直至退出或研究完成或死亡的点。诸如平均值、中值、标准偏差、最小值以及最大值的描述性统计将用于概括连续变量。接受凋亡细胞输注的所有对象将包括于安全性分析中。还接受HSCT的对象将包括于功效分析中。因为这个研究性质上是探索性的，所以计划专设的分析。
样品大小考虑
将包括总共25个患者，将录入至少15个相合的无关患者。凋亡细胞(活性将赋予所有，在GVHD预防方案上分层，以及相关对无关移植物供体)。
群体分析定义
所有功效分析将在意向治疗(ITT)群体上进行并且与足够的历史对照相比较。安全性群体将定义为接受研究药物的剂量的所有患者。
统计方法
患者、疾病以及移植物特征将在适当时使用频率和百分数或中值(范围)来描述。
安全性分析
描述性统计将用于概括安全性结果，其集中于在研究治疗输注与HSCT程序(24-30小时窗口)之间报告的AE。研究进行中的不变性将作为DSMB审查的结果而起始，包括样品大小调整。这样的话，将需要作为期中分析的结果的总体I型误差的无处罚调整。
二级终点分析
II-IV级aGVHD将使用累积发生率估计值来描述，在aGVHD之前死亡作为竞争事件。
嗜中性粒细胞和血小板恢复、III-IV级aGVHD、慢性GVHD、感染、复发以及移植相关死亡率将使用累积发生率来描述，复发作为TRM的竞争事件并且死亡作为所有其它的竞争事件。总体存活率和无白血病存活率将使用卡普兰-梅尔估计值来描述。在第一个180天内aGVHD的最大级别和180天对类固醇的需要将分别使用曼-惠特尼U测试(Mann-Whitney U-test)和卡方测试(chi-square test)使用频率和百分数来描述。每个细胞子组和TREG的免疫恢复将在每个时间点使用中值和范围曼-惠特尼测试来描述。
实施例5：在GvHD白血病/淋巴瘤模型中汇集的凋亡细胞制备物对单供体凋亡细胞制备物的比较
目标：比较获自单一供体的人类早期凋亡细胞对GvHD的鼠类模型的GvHD的严重性的有益临床作用与获自多个个别供体的人类早期凋亡细胞对GvHD的鼠类模型的GvHD的严重性的临床作用(如果有的话)，其中多个个别供体表示HLA不相合的异源供体。
上述实施例2显示了从多个个别供体汇集的受辐照的凋亡细胞的有益作用。图1和图2中所示的结果是令人惊讶的，因为技术人员可以认识到不相合的细胞的多个来源可能已经增加细胞抗原性的多样性，并且因此将已经预期临床作用的显著降低。意想不到地，早期凋亡细胞对GvHD严重性的降低并且因此对直至死亡的天数延长的已知的有益作用也由汇集的不相合的早期凋亡细胞减轻(图1)，所述早期凋亡细胞将据称由于汇集的多个不相合的来源细胞而具有增加的抗原性。
额外的目标在于了解在受辐照的早期凋亡细胞与未受辐照的凋亡细胞的使用之间是否存在差异。
技术人员应了解，不相合的受辐照的细胞保持如由APC机制并且因此由其已经输注的宿主的T细胞识别的其抗原型态。因此，当汇集异源不相合的细胞群体时的关注包括汇集的个别群体之间的交叉反应性、汇集群体的混合细胞淋巴系统反应、或可以减少或消除细胞的汇集群体之间的T细胞免疫反应，或其任何组合。
方法
小鼠模型：在错配的GVHD模型中雌性7-9周龄BALB/c小鼠(H-2d)用作接受体并且雌性8-9周龄C57BL/6小鼠(H-2b)用作供体。接受体是在骨髓和脾细胞移植之前24小时以850cGy辐照的全身。供体骨髓细胞用于骨髓重建。用RPMI 1640从股骨和胫骨提取骨髓细胞。使红血细胞溶解，然后洗涤细胞并且用PBS再悬浮。使用台盼蓝染料排除来评定活力(>90％活力)。供体脾细胞用于诱导GVHD。将脾移出并均化并且获得单一细胞悬浮液。使红血细胞溶解并且用PBS使脾细胞再悬浮。使用台盼蓝染料评定至少90％有活力的细胞。
早期凋亡细胞：类似于实施例1从健康供体通过单个核富集的细胞部分单采来产生凋亡细胞。简单地说：
经由白细胞去除术程序从健康的合格供体获得单个核细胞(MNC)的富集部分。除了400-600ml自体血浆以外，经由Spectra
Figure BDA0003017722560000751
单采系统从12升血液收集细胞。来自供体的富集的单个核细胞部分的估计产率预期为约1.2-1.5×1010个细胞。在白细胞去除术程序之前，测试供体并且确认对以下病毒载体呈阴性：
1.人类免疫缺陷病毒(HIV)1型和2型；
2.乙型肝炎病毒(HBV)；
3.丙型肝炎病毒(HCV)；
4.巨细胞病毒(CMV)；
5.梅毒螺旋体(Treponema pallidum)(梅毒)；
6.人类嗜T淋巴细胞病毒(HTLV)I型和II型
在细胞收集之后，用RPMI洗涤细胞并且如下冷冻。冷冻配方由注射用勃脉力A pH7.4、10％DMSO、5％人血清白蛋白以及经10U\ml肝素接种的5％抗凝剂柠檬酸盐葡萄糖溶液组成。
在袋中制备冷冻介质并且在cGMP条件下在封闭系统中进行冷冻程序。
在白细胞去除术程序完成之后，用勃脉力A洗涤富集的MNC部分并且用冰冷的冷冻介质再悬浮达到50-65×106个细胞\毫升的浓度。然后将细胞转移至冷冻袋中，将袋转移至预冷却的铝盒中并且将盒立即转移至-18-(-25)℃下维持两小时。
两小时后，将盒转移至-80℃下再维持2小时，然后转移至液氮中长期储存(>-135℃)。
将自体血浆分成50g等分试样。将血浆等分试样转移至-80℃下维持2小时，然后转移至-18-(-25)℃下长期储存。
对于凋亡诱导，将细胞解冻并且用含有10mM Hepes缓冲液、2mM L-谷氨酰胺以及经10U\ml肝素接种的5％抗凝剂柠檬酸盐葡萄糖溶液的预加温的RPMI1640洗涤。在上清液提取之后，使细胞以5×106/ml的最终浓度再悬浮于添加有10％自体血浆和50μg\ml甲基强的松龙以及经10U\ml肝素接种的5％抗凝剂柠檬酸盐葡萄糖溶液的补充有10mM Hepes、2mML-谷氨酰胺的RPMI 1640中。然后将细胞转移至细胞培养袋中，并且在加湿的孵育箱中在37℃、5％CO2下孵育6小时以稳定凋亡。
在孵育之后，收集细胞，用PBS洗涤并且再悬浮于PBS中。
从一个单一供体或组合的10个不同个别供体产生早期凋亡细胞产物，在不同供体的情况下细胞在临近辐照之前组合。因为在多供体产物中的组分之间，例如在活的非凋亡细胞之间可能发生干扰，所以将早期凋亡细胞产物细分并且在施用之前用2500cGy辐照将要体内测试的早期凋亡细胞的样品(下文的样品F)，并且储存于2-8℃下直至施用。下文实施例6的表3呈现了膜联蛋白V阳性/碘化丙锭阴性的比率和早期凋亡细胞产物的细胞表面标志的细节，确立施用于小鼠的凋亡细胞的一致性是被维持的。最终产物在2-8℃下稳定48小时。
在移植当天，小鼠接受5×106个骨髓细胞、3×106个脾细胞以及30×106个单供体或多供体早期凋亡细胞产物，根据以下实验设计：
A.辐照对照
B.重建对照-辐照+骨髓移植(BM)
C.GVHD对照-辐照+骨髓和脾细胞移植
D.单供体、受辐照的-辐照+骨髓和脾细胞移植+来自单一供体的受辐照的早期凋亡细胞产物
E.单供体、未受辐照的-辐照+骨髓和脾细胞移植+来自单一供体的未受辐照的早期凋亡细胞产物
F.多供体、受辐照的-辐照+骨髓和脾细胞移植+来自多个供体的受辐照的早期凋亡细胞产物
G.多供体、未受辐照的-辐照+骨髓和脾细胞移植+来自多个个别供体的未受辐照的早期凋亡细胞产物。
监控-将移植的小鼠加标签并且监控存活。实验的最初两周每两天评定体重并且然后每天评定体重。从初始体重损失35％确定为初级终点并且将小鼠处死并相应地更新存活曲线。体重结果与实施例3的图2中所观测的那些是可比的。
使用已知的评分系统(Cooke KR等,在骨髓移植之后特发性肺炎综合症的实验模型.I.次要H抗原和内毒素的作用(An experimental model of idiopathic pneumoniasyndrome after bone marrow transplantation.I.The roles of minor H antigensand endotoxin).《血液(Blood)》.1996；8:3230-3239)评定GVHD的严重性，所述评分系统结合五个临床参数：重量损失、姿势(弯腰驼背)、活动性、毛皮纹理以及皮肤完整性。评估小鼠并且对于每个准则从0至2分级。通过合计五个临床评分，产生临床指数值(指数数值随着GVHD的严重性而增加)。
结果
小鼠的不同群体的百分比存活以图形呈现于图3中。如从不接受骨髓重建的小鼠预期，仅辐照的对照小鼠在第8天与第12天之间死亡(n＝13)。大多数GVHD对照小鼠(接受骨髓和脾)在第6天与第27天之间死亡。一只小鼠并未死亡(n＝18)。在骨髓重建对照组(BM)中，7只小鼠中的3只在第6天与第8天之间死亡。在剩余的小鼠中，由供体骨髓重建骨髓并且小鼠保持活着(>50天)。
单供体、未受辐照的小鼠在第15天与第36天之间死亡。因此，如先前所示，单供体未受辐照的早期凋亡细胞具有有益作用并且延长存活(p＜0.01)。
单供体、受辐照的小鼠在第7天与第35天之间死亡，一只小鼠保持无疾病存活(>50天)。这证实了单供体受辐照的凋亡细胞也对于GVHD提供有益作用。因此，辐照并不损害早期凋亡细胞的免疫调节作用。与GVHD对照相比，所有对GVHD鼠类模型的存活都具有有益作用(p＜0.01)。
与GVHD对照相比，未受辐照的多供体治疗并未提供有益作用(n＝11)。存活模式类似于GVHD对照并且小鼠在第6天与第28天之间死亡(p＝NS-不显著)。令人惊讶地并且与未受辐照的凋亡细胞成对比，受辐照的多个个别供体凋亡细胞(治疗F)(n＝10)与GVHD对照相比具有类似于单一供体治疗的有益作用。GVHD症状出现明显更晚并且小鼠在第18天与第34天之间死亡(p＜0.01)。
受辐照的多个个别供体(n＝10)、受辐照的单一供体(n＝10)以及未受辐照的单一供体治疗(n＝10)具有类似的存活模式并且在这三个治疗组之间观测到对存活的作用无显著差异。
实验指示了在GVHD诱导的小鼠中凋亡细胞输注的明确作用。对于受辐照的多个个别供体以及受辐照和未受辐照的单供体凋亡细胞的治疗存在显著延长的存活作用。
多供体治疗当未受辐照时并不延长小鼠的存活，但在施用于小鼠之前凋亡细胞产物的辐照改善结果并且治疗具有与单供体治疗接近的存活模式。
如上文所陈述，图3示出了获自多个不相合的供体的未受辐照的凋亡细胞对GvHD和死亡率(％存活)的降低具有显著更低的正向临床作用，这与以下相比：(1)获自单一不相合的供体的未受辐照的凋亡细胞；(2)获自单一不相合的供体的受辐照的凋亡细胞；以及(3)获自多个不相合的供体的受辐照的凋亡细胞。另外，全部三者(未受辐照的早期凋亡细胞，单一供体；受辐照的早期凋亡细胞，单一供体；以及受辐照的早期凋亡细胞，多个个别供体)具有类似作用。
这个数据是令人惊讶的，因为获自多个个别供体的未受辐照的凋亡细胞的抗原性预期类似于获自多个个别供体的受辐照的凋亡细胞的抗原性，为何两者不都与植入的骨髓具有类似的敌对抗原反应，并且为何两者不都能够降低GvHD和死亡率？
如果抗原性在此是主要问题，那么预期观察到获自单一供体的未受辐照的凋亡细胞与获自单一供体的受辐照的凋亡细胞的临床作用之间的差异。然而，数据并未显示这种差异。
一个可能性在于从多个个别供体制备的未受辐照的汇集的凋亡细胞制备物的功效的缺乏，其是由存在于汇集的制备物中的个别单个核群体之间的交叉相互作用引起的。这些相互作用似乎并不直接归因于对宿主的抗原性，因为受辐照的细胞维持其抗原性但功效显著不同于未受辐照的细胞。因此，似乎意想不到地消除了接受辐照的汇集的早期凋亡细胞制备物中的交叉相互作用并且宿主充分响应细胞的施用。
如所示，受辐照的汇集的供体具有与单一未受辐照的供体基本上相同的作用。
实施例6：辐照对最终凋亡细胞产物的作用
凋亡细胞由于其固有的免疫调节和消炎特性越来越多地用于新颖治疗策略中。早期凋亡细胞制备物可以含有多达20-40％有活力的细胞(如由PS暴露的缺乏和无PI进入所测量；膜联蛋白V阴性和碘化丙锭阴性)，其中一些在输血中使用后可能导致凋亡，但一些将保持有活力的。在从相合的供体骨髓移植的情况下，有活力的细胞并不代表临床问题，因为接受体在实际移植中已经接受许多更有活力的细胞。然而，在第三方输血(或者如可以在汇集的单个核凋亡细胞制备物中表现的第四方或更多方)的情况下，包括有活力的细胞的凋亡细胞群体的使用可以引入第二种GvHD诱导剂。此外，迄今尚未评定辐照对早期凋亡细胞的免疫调节潜力的影响。技术人员可以考虑到早期凋亡细胞群体的额外辐照可以导致细胞进展至凋亡或坏死的更晚阶段。因为这似乎是关于临床应用的特别相关的问题，所以设计下文所呈现的实验以解决这个问题，其中至少一个目标在于改进功能性凋亡细胞的生物安全性。
因此，目的在于促进用于许多适应症的凋亡细胞的临床利用，其中凋亡细胞的效力可以依赖于旁观者效应而不是移植的细胞的植入。
目标：检查辐照对早期凋亡细胞的作用，其中辐照在诱导凋亡之后发生。
方法(简单地说)：相应地收集细胞并且基本上如实施例5中所描述制备早期凋亡细胞。
在不同日期制备三个独立的早期凋亡细胞批次(集合404-1、0044-1以及0043-1)。
将每个最终产物分成三个组：
未处理
2500rad
4000rad。
在辐照之后，立即(t0)测试早期凋亡细胞的细胞计数、膜联蛋白V阳性-PI阴性染色、细胞表面标志(不同细胞类型的％群体)以及效力(树突状细胞(DC))。在t0时检查之后，将早期凋亡细胞储存于2-8℃下24小时，并且第二天使用相同的测试组(t24h)检查(细胞计数、膜联蛋白V阳性-PI阴性染色以及细胞表面标志和效力)。
先前，开发释放后效力检验，其评定供体单个核早期凋亡细胞(早期凋亡细胞)诱导耐受性的能力(Mevorach等,BBMT 2014同上)。检验是基于使用在暴露于LPS之后iDC膜上的MHC-II类分子(HLA-DR)和共刺激分子(CD86)表达的流式细胞术评估。如先前和重复所示，致耐受性DC可以在与凋亡细胞相互作用后产生(Verbovetsky等,《实验医学杂志(J ExpMed)》2002；Krispin等,《血液(Blood)》2006)，并且LPS处理的DC的成熟的抑制(DR和CD86表达的抑制)以剂量依赖性方式发生。
在1/2a期早期凋亡细胞临床研究期间，对每个早期凋亡细胞批次进行释放后效力检验(总体结果n＝13)以评估每个批次诱导耐受性的能力(结果示于图1中，Mevorach等(2014)《血液和骨髓移植生物学(Biology of Blood and Marrow Transplantation)》20(1):58-65)。
对于每个早期凋亡细胞批次从新鲜的血沉棕黄层产生DC，从未知和无关的健康供体收集，并且与早期凋亡细胞以不同比率(分别是1:2、1:4以及1:8DC:早期凋亡细胞)组合。在与早期凋亡细胞一起孵育并且暴露于LPS之后，在DC:早期凋亡细胞的一个或多个比率下基于HLA DR或CD86的DC膜表达的下调来确定效力。在全部13个检验中，早期凋亡细胞展示致耐受作用，这在大多数DC:早期凋亡细胞比率下的制备物中并且对于两个标志都以剂量依赖性方式观察到。
从健康供体的外周血液PBMC产生获自单核白细胞的未成熟DC(iDC)并且在1％自体血浆、G-CSF以及IL-4存在下培养。然后将iDC与凋亡细胞一起以1:2、1:4以及1:8的比率预孵育2小时，所述凋亡细胞是新鲜制备的最终产物或在2-8℃下储存24小时的最终产物。同时检查两种最终产物以确定储存是否影响凋亡细胞的效力能力。在孵育之后，将LPS添加至指定孔中，再静置24小时。在孵育结束时，收集iDC，洗涤并且用DC-sign与HLA-DR或CD86染色以确定表达的变化。使用流式细胞仪分析细胞并且使用FCS-express软件从DC-sign阳性细胞闸门进行分析以确保仅对DC分析。
图4A-B和图5A-B示出了与未受辐照的单供体细胞相比受辐照的汇集的凋亡细胞的效力测试。
结果：
单供体制备物
表8呈现了未受辐射与受辐照的凋亡细胞的比较性结果；在24小时处的平均细胞损失(％)；在0小时和24小时处的膜联蛋白阳性(+)碘化丙锭(PI)阴性(-)％(早期凋亡细胞％)；在0小时和24小时处的膜联蛋白阳性(+)碘化丙锭(PI)阳性(+)％(晚期凋亡细胞％)；在0小时和24小时处的细胞表面抗原CD3(T细胞)、CD19(B细胞)、CD56(NK细胞)、CD14(单核白细胞)以及CD15高(粒细胞)的存在。
表8：
Figure BDA0003017722560000811
Figure BDA0003017722560000821
表8中的结果显示未受辐照的凋亡细胞与受辐照的凋亡细胞具有早期(第2行和第3行)和晚期(第4行和第5行)凋亡细胞的可比的百分数。因此，25或40Gy辐照并不加速在这个高水平的γ-辐照之前诱导的凋亡或坏死过程。此外，在受辐照的细胞群体对未受辐照的对照群体之间关于细胞类型存在一致性。
图4A-4B(HLA-DR表达)和图5A-5B(CD86表达)中呈现的效力检验的结果显示新鲜(图4A、图5A)和24小时储存(图4B、图5B)的受辐照的凋亡细胞的免疫调节能力与未受辐照的凋亡细胞相比不存在变化。
在图4A-B与图5A-B中，在暴露于成熟剂LPS之后HLA-DR与CD86表达都存在明确上调。在来自单一供体或受辐照的汇集供体的新鲜制备的凋亡细胞存在下观测到两个共刺激标志的显著(p<0.01)的剂量依赖性下调。另外，在2-8℃下储存24小时的凋亡细胞存在下在两个标志中都维持剂量依赖性下调，指示在24小时储存之后的最终产物稳定性和效力。
对树突状细胞的作用.为了测试凋亡细胞的免疫调节能力，使用释放后效力检验(Mevorach等,(2014)BBMT,同上)。观测到在树突状细胞的免疫调节检验中无变化。(数据未示出)
对混合淋巴细胞反应(MLR)的作用.为了进一步测试免疫调节作用，建立标准化的MLR检验。此处，刺激和应答细胞的共培养(即，MLR)得到强力并可靠的增殖。添加未受辐照的凋亡细胞至MLR之后，淋巴细胞增殖显著降低>5倍，明确证实了增殖的细胞抑制。在MLR中由受辐照的凋亡细胞介导的淋巴细胞增殖的抑制是完全可比的。(数据未示出)
下一个步骤是体内评估完全错配的小鼠模型中的受辐照和未受辐照的凋亡细胞。如图1-2中所示，受辐照和未受辐照的早期凋亡细胞制备物具有可比的体内有益作用。
单供体制备物总结：
总之，25Gy或40Gy的辐照在凋亡细胞的群体中并不显著加速凋亡或诱导坏死。显著地，这些群体在体外与体内都维持凋亡细胞的免疫调节作用。
多供体制备物
接下来，进行实验以验证用单一供体第三方制备物观测到的现象对于多个第三方供体也是真实的。意想不到地，当使用汇集的个别供体凋亡细胞制备物时，单一不相合的供体的有益作用损失(图3)。这并不归因于GvHD，因为每个供体的有益作用独立地维持(测试结果未示出)。一个可能性在于早期凋亡细胞制备物的有益作用归因于个别供体细胞彼此间的相互作用而损失。进一步检查不同供体的这种可能的相互作用是否可以通过γ辐照来避免。
如图3中所示，单供体的有益作用在γ辐照之后完全恢复，其中受辐照的多供体制备物和单供体制备物(受辐照的或未受辐照的)具有类似的存活模式。
总结：
此处首次显示当使用多供体第三方凋亡细胞的制备物时令人惊讶地辐照(和引起T细胞受体抑制的可能的任何方法)不仅避免T细胞的不当增殖和活化，而且允许免疫调节的有益作用。
虽然本文中已经说明和描述了某些特征，但许多修改、取代、变化以及等效物现在将为本领域的一般技术人员所想到。因此，应了解，随附权利要求书预期涵盖如处于本文中的公开的真正精神内的所有这类修改和变化。

Claims (17)

1.一种受辐照的单个核的、早期凋亡细胞制备物，其包含在诱导凋亡后被辐照的单个核的富集的早期凋亡细胞，其中与包含未受辐照的细胞群体的制备物相比，所述受辐照的单个核的、早期凋亡细胞制备物包含
(a)数目减少的非休眠非凋亡细胞；
(b)细胞活化遏制的任何活的非凋亡细胞；或
(c)增殖降低的任何活的非凋亡细胞；
或其任何组合。
2.如权利要求1所述的细胞制备物，其中所述单个核富集的早期凋亡细胞群体衍生自来自血液捐献的白血细胞(WBC)部分。
3.如权利要求1或2所述的细胞制备物，其中所述早期凋亡细胞包含来自对于接受体对象而言HLA相合的或HLA不相合的来源的异基因细胞。
4.如权利要求1至3中任一项所述的细胞制备物，其中所述辐照包含γ辐照或UV辐照。
5.一种医药组合物，其包含如权利要求1至4中任一项所述的细胞制备物。
6.一种产生包含有受辐照的单个核的富集的早期凋亡细胞制备物的医药组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)获得外周血液的单个核富集的细胞群体；
(b)在包含抗凝剂的冷冻介质中冷冻所述单个核富集的细胞群体；
(c)解冻所述单个核富集的细胞群体；
(d)在包含约10-100μg/mL最终浓度的甲基强的松龙和抗凝剂的凋亡诱导孵育介质中孵育所述单个核富集的细胞群体，其中孵育产生早期凋亡细胞群体；
(e)使在步骤(d)获得的所述诱导的早期凋亡细胞群体再悬浮于施用介质中；以及
(f)灭活来自步骤(e)的所述早期凋亡细胞群体，其中所述灭活包括辐照来自步骤(e)的所述早期凋亡细胞群体，以及其中所述辐照包括以约20-60 戈瑞单位(Gy)的γ辐照或UV辐照；
其中与包含未辐照的细胞群体的群体相比，在所述受辐照的、单个核富集的早期凋亡细胞群体包含
i.数目减少的非休眠非凋亡细胞；
ii.细胞活化遏制的任何活的非凋亡细胞；或
iii.增殖降低的任何活的非凋亡细胞；
iv.或其任何组合。
7.如权利要求6所述的方法，其中步骤(a)的所述获得包含获得白血细胞(WBC)部分。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述白血细胞(WBC)部分包含获自血库的WBC部分。
9.如权利要求7或8所述的方法，其中所述白血细胞(WBC)部分包含淋巴细胞或单核白细胞。
10.如权利要求6至9中任一项所述的方法，其中步骤(a)的所述单个核富集的细胞群体的获得不受所述单个核富集的细胞群体的HLA配型的限制。
11.如权利要求6至10中任一项所述的方法，其中步骤(b)的所述孵育历时2-12小时。
12.如权利要求6至10中任一项所述的方法，其中步骤(f)的所述辐照包含
(a)γ辐照或UV辐照；或
(b)25-30戈瑞单位(Gy)；或
其组合。
13.一种如权利要求1至4中任一项所述的受辐照的、单个核的、早期凋亡细胞制备物、或如权利要求5所述的组合物、或通过如权利要求6至12中任一项所述的方法制备的组合物在制备用以在有需要的对象中治疗、改善或抑制包括自体免疫疾病的免疫疾病、细胞因子释放综合症(CRS)、细胞因子风暴、癌症或与CRS或细胞因子风暴相关的发炎性疾病，或预防包括自体免疫疾病的免疫疾病、CRS、细胞因子风暴、或与CRS或细胞因子风暴相关的发炎性疾病或降低包括自体免疫疾病的免疫疾病、CRS、细胞因子风暴、或与CRS或细胞因子风暴相关的发炎性疾病的发生率的药物的用途。
14.如权利要求13所述的用途，其中
a.所述免疫疾病选自包含GVHD、关节炎、痛风或炎症性肠病的群组；
b.所述CRS或细胞因子风暴是感染的结果；
c.所述对象经历CAR T细胞癌症疗法；或
d.所述对象
-罹患造血恶性病；或
-罹患败血症；或
-保留移植物抗肿瘤或移植物抗白血病(GVL)效应；或
-经历造血干细胞移植(HSCT)；或
-经历实体器官移植。
15.如权利要求14所述的用途，其中所述HSCT是异基因HSCT并且所述医药组合物包含获自与所述对象或与所述供体的HLA不相合的异基因供体的细胞。
16.如权利要求14至15中任一项所述的用途，其中所述药物被配制用于在所述移植之前至多24小时、与所述移植同时或在所述移植之后直至15天施用。
17.如权利要求13-16任一项所述的用途，其中所述药物预期用于通过静脉内注射来施用。
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