CN105473772A

CN105473772A - 预后分类与治疗腺体癌症的方法

Info

Publication number: CN105473772A
Application number: CN201480028768.8A
Authority: CN
Inventors: 蔡坤志; 李其融; 徐中济
Original assignee: National Health Research Institutes
Current assignee: National Health Research Institutes
Priority date: 2013-05-17
Filing date: 2014-05-16
Publication date: 2016-04-06
Also published as: EP2997181A1; WO2014186773A1; TW201504438A; US20160090638A1; JP2016525883A; EP2997181A4; TWI560275B

Abstract

本揭露包含分子标记的鉴定，包括ASPM、ATP9A、ACOX3、CDC45L、SLC40A1、AGR2、以及表2所示者，此与胰脏癌的分化和临床预后相关。更特定地，本揭露包含基因标记组的鉴定，基因标记组的表达量可用来从具较低程度分化的胰脏癌细胞区别具较高程度分化的胰脏癌。这些标记可用于评估胰脏癌的临床预后，包括宿主的疾病进展、复发或死亡。本揭露也提供治疗腺体癌症的方法与用于测定腺体癌症的试剂盒，像是胰脏癌、乳癌、和前列腺癌，此系藉由抑制ASPM的表达或是抑制其活化或维持Wnt讯息活性之能力及/或腺体癌症的癌症干细胞群集的能力。

Description

预后分类与治疗腺体癌症的方法

【技术领域】

相关申请案之交互参照

本申请案主张于2013年5月17日申请之美国临时申请号61/824,679之效益，其于此并入作为参考。

本揭露包含用以分类胰脏癌及腺体癌症并评估疾病进展、复发、及死亡之系统、方法、及试剂盒。本揭露也包含用于治疗胰脏癌及腺体癌症之方法及试剂盒。

【先前技术】

胰腺导管腺癌(Pancreaticductaladenocarcinoma,PDAC)是致命性的恶性肿瘤。由于疾病早期之症状缺乏以及肿瘤的侵袭特性，少于20％患有PDAC之病患在诊断时期呈现局部及可切除之病症。即使施以根除治疗性手术，大多数有初期局部肿瘤的病患仍然会发展为复发或转移性病症，且只有小部份(18-26％)的病患可以达到长期存活(Ahmad等人，2001年；Oettle等人，2007年)。因此，对患有局部PDAC病患的预后方面，进一步改善可能需依赖阐明出可指引病患个人化治疗方案之潜在肿瘤复发的发病机制以及临床上可靠的预后评估。

腺体上皮(glandularepithelium)的恶性转化包含渐进与变动之正常腺体结构的损失。因此，在腺体分化中人类胰脏癌频繁地展现显著地肿瘤内异质性，像是广泛地用于腺体癌症的病理分类之因子，前列腺癌的格里森分级系统(Gleasongradingsystem)(Gleason,1992)。因此，腺体分化被用于其它种类源自腺体的恶性肿瘤的组织病理评估，包含乳癌和胰脏癌(Adsay等人，2005年；Gleason，1992年；Hruban及Fukushima，2007年；Rakha等人，2008年)。然而，形态基础的病理分类系统只是非侵入性之预后指标，且无法对具相似组织病理特征的胰脏癌作风险分层。组织结构的评估并无法对所观察的肿瘤变异提供功能或机制检视。故在胰脏癌临床结果的评估中，对于具改善之准确度的路径获知以及分子基础诊断测定上存在迫切需求。

近来，高通量的基因组分析技术使人类恶性肿瘤包含胰脏癌在内的分子特性更加明了(Glinsky等人，2004年；Henshall等人，2003年；Singh等人，2002年；Stratford等人，2010年；van'tVeer等人，2002年；vandeVijver等人，2002年)。这些基因组标记的强大预后效用示明肿瘤的本质分子特征系作为临床行为的关键决定因素(Ramaswamy等人，2003年)。举例来说，在早期PDAC病患的存活评估中，藉由比较转移的PDAC和初期PDAC的基因表达模式，Stratford和同事鉴定出6个基因之转移相关联的印记(signature)(Stratford等人，2010年)。借着比较27个显微解剖的PDAC组织的转录体(transcriptomes)，Collisson和同事确定出称为“PDAssigner”之62个基因之印记，此可以用以诊断PDAC的分子亚型(Collisson等人，2011年)。

应当注记的是以上提到的分子模式是自临床的胰脏肿瘤切片来鉴定，且仅可反映确切的肿瘤特征而并未提供在这些肿瘤变异的病理中潜在的机制。在这方面，以知识为基础的方法提供一个机会来鉴定有利于临床决策和治疗进展的更多合理标记或分类系统。这样的方法已经用于在数种固体肿瘤中建立与肿瘤祖细胞、基质活化(stromalactivation)或组织分化相关的基因谱(geneprofile)的预后任务(Chang等人，2004年；Fournier等人，2006年；Liu等人，2007年；Sotiriou等人，2006年)。

肿瘤形成的目前现行模式系提出组织分化和肿瘤进展共有相似的基因调控和分子路径。在活体内研究与腺体上皮的分化过程相关的分子变化可能很困难。然而，生理相关的三维器官培养模式已经被用于概括乳腺腺泡、正常哺乳类上皮的基本构造单元的结构及功能分化过程(Debnath及Brugge，2005年；Lee等人，2007年)。相似的模式已经成功地概括胰脏、胰腺上皮及肺上皮的形态演发和分化过程(Gutierrez-Barrera等人，2007年；Mondrinos等人，2006年；Webber等人，1997年)。使用这个发展模式的比较基因表达分析引导了基因表达谱和标记基因的鉴定，其显示和乳癌预后显著的相关联(Fournier等人，2006年；Kenny等人，2007年)。相同的示范模式是否能被应用在胰脏癌仍不清楚。

人类的ASPM基因编码大型(409.8Da)及多功能蛋白质，此蛋白质在神经生成、神经元移行和神经胶质瘤干细胞的增殖中扮演了关键角色(Bikeye等人，2010年；Buchman等人，2011年)。ASPM初始被确定为调控神经生成和脑尺寸的中心体蛋白质(Bond等人，2003年；Kouprina等人，2005年)。然而，ASPM现在已知广泛地表达在中枢神经系统外的各种胎儿和成人组织(Bruning-Richardson等人，2011年；Kouprina等人，2005年)。近来的研究也演示APSM表达为上调控(up-regulated)且在恶性肿瘤的多种类型里是重要的预后。举例来说，ASPM表达与神经胶质瘤的病理分级呈正向相关，且在复发肿瘤里为上调控(Bikeye等人，2010年)。ASPM表达也与罹患卵巢癌或肝细胞癌的病患的病理分级及低存活率具有正相关性(Bikeye等人，2010年；Bruning-Richardson等人，2011；Lin等人，2008年)。有趣地，这些研究也演示了ASPM在间期(interphase)时同时于细胞质与细胞核中局部化，且其细胞质表达量在肿瘤之间存在有高度变异性(Bruning-Richardson等人，2011年)，这意味着其在恶性组织内具有多种不同生物功能。

相应地，部份实施方式的标的系为提供临床上可靠的预后评估，其可对患有胰脏癌或腺体癌症的个体病患指示个人化治疗方案。这藉由提供诊断标记的图表(panels)及其使用方法，以及藉由提供用于治疗胰脏癌或腺体癌症之例示性方法及试剂盒而实现。

【发明内容】

本揭露包含与胰脏癌组织分化程度相关之表2所列的基因标记的鉴定，以及使用这些标记以评估胰脏癌的临床预后。更特定地，本揭露包含基因标记组的鉴定，基因标记组的表达量能用于从较低程度分化的胰脏癌中区分出较高程度分化的胰脏癌。另外，在本揭露中所鉴定的基因标记的转录或蛋白质表达量能用于评估胰脏癌的临床预后，包含胰脏癌受试者的疾病进展、复发或死亡。本揭露也包含ASPM的使用以评估其它种类的腺体癌症，像是乳癌、前列腺癌、结肠癌和胃癌的临床预后。另外，本揭露包含一种藉由抑制ASPM的表达或是ASPM活化或维持Wnt讯息活动及/或所述腺体癌症的癌症干细胞群集的能力，而用于治疗腺体癌症，像是胰脏癌、乳癌、和前列腺癌之方法。

在上述方法的特定实施方式里，胰脏癌的评估临床预后包含在从活体组织切片或外科方法所取得的胰脏肿瘤切片中，测定ASPM、ATP9A、ACOX3、CDC45L、SLC40A1、AGR2和表2中所示者或任何其组合之转录或蛋白质的表达量，并运用此些表达量之组合，以评估有所述胰脏肿瘤的受试者的结果。

在特定实施方式里，测定所述基因标记的转录表达量包含对冷冻或福尔马林固定的石蜡包埋(formalinfixedparaffinembedded,FFPE)胰脏肿瘤切片上作聚合酶链反应(polymerasechainreaction)、Northern印迹(northernblotting)、核糖核酸酶保护测定(RNaseprotectionassay)、或互补脱氧核糖核酸(cDNA)或寡核苷酸微阵列分析(oligonucleotidemicroarrayanalysis)。

在另一个实施方式，测定所述基因标记的蛋白质表达量包含免疫印迹(immunoblotting)、免疫组织化学法(immunohistochemistry)、蛋白质阵列(proteinarray)或二维蛋白质电泳(two-dimensionalproteinelectrophoresis)和质谱分析(massspectroscopyanalysis)。

在上述方法的实施方式里，测定蛋白质表达量包含对所述标记具特异性的抗体之应用、以及在冷冻或FFPE胰脏肿瘤组织上作免疫组织化学染色。

在另一实施方式中，本揭露说明藉由使用特定抗体和免疫组织化学染色，对从活体组织切片或外科方法所取得的冷冻或FFPE胰脏肿瘤组织切片进行ASPM、ATP9A、ACOX3、CDC45L、SLC40A1或AGR2或其任何组合的蛋白质表达量之测定，来进行胰脏癌预后的评估。

本揭露也提供用以评估胰脏癌临床预后的试剂盒，包含用以侦测在肿瘤内ASPM、ATP9A、ACOX3、CDC45L、SLC40A1、AGR2，和表2所示者或上述任何组合的蛋白质转录的工具。

在一实施方式中，用以评估临床预后的胰脏癌的试剂盒包含用于在肿瘤内侦测ASPM、ATP9A、ACOX3、CDC45L、SLC40A1或AGR2或其任何组合的蛋白质的特定抗体。

本揭露另外提供对ASPM、ATP9A、ACOX3、CDC45L、SLC40A1、AGR2，和表2所示者、或一或多个管家基因(housekeepinggene)或其任何组合的转录本具特异性之核酸探针的阵列，以评估胰脏癌的临床预后。

另一实施方式提供对ASPM、ATP9A、ACOX3、CDC45L、SLC40A1、AGR2，和表2所示者、或一或多个管家基因或其任何组合的蛋白质具特异性之抗体或适配体的阵列，以评估胰脏癌的临床预后。

特定实施方式系关于ASPM的利用，以评估其它种类的腺体癌症，像是乳癌、前列腺癌、结肠癌和胃癌的临床预后。在特定实施方式中，评估腺体癌症的临床预后包含从活体组织切片或外科方法所取得的肿瘤切片中，对ASPM的转录表达量或蛋白质表达量进行测定并使用所述表达量的组合，以评估有所述腺体癌症的受试者的结果。特定实施方式系关于藉由在从活体组织切片或外科方法所取得的冷冻或FFPE肿瘤切片中，使用特定抗体和免疫组织化学染色来测定ASPM的蛋白质表达量，而进行腺体癌症预后的评估。

特定实施方式提供一种藉由抑制在所述癌症内ASPM的表达及/或活性来治疗胰脏癌或其它腺体癌症种类的方法。在一实施方式中，这些方法包含ASPM表达的抑制，此系藉由对有所述癌症的个体施以互补至ASPMmRNA的核酸，包含siRNA、shRNA、microRNA、或反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotide)。

在一实施方式中，抑制ASPM的活性包含施予对ASPMmRNA互补的核酸，包括siRNA、shRNA、microRNA、或反义寡核苷酸，其足以抑制ASPM在所述癌症里活化Wnt信号通路及/或癌症干细胞群集的能力。

在另一实施方式中，抑制ASPM的活性包含施予对ASPMmRNA互补的核酸，包括siRNA、shRNA、microRNA、或反义寡核苷酸，其足以抑制ASPM促进或维持癌症干细胞群集之能力或其肿瘤起始及/或促进转移之能力。

特定实施方式包含测定ASPM量以评估胰脏癌的风险、存在、阶段、或严重性的试剂盒，其中该试剂盒包含能够在受试者的生物样本和测试基质中侦测ASPM量的试剂；以及用以接触试剂或基质与来自受试者的样本的说明书、及用以对受试者的胰脏癌评估风险、易感性、或预后的说明书，其中增加的ASPM量表示增加的风险、增加的易感性或预后不良性。

随附的目的及优点将一部分在下列描述中阐述，且一部分将自描述中显而易见或可通过本揭露各方面的实践来习知。所揭露的目的及优点将藉由在所附的申请专利范围中所特别指出的元素及组合的手段来实现和达成。

应当理解的是，前面的概略描述和下面的详细描述皆仅作为例示性和说明性，而非用于对申请专利范围所主张的本发明进行限制。

【图式简单说明】

第1图包含关于使用三维培养模式的胰腺上皮细胞组织结构的几个图表。显示为在三维重建基底膜基质内，HPDE细胞丛(培养48小时形成；i、ii、v、vi)及小管(培养6天形成；iii、iv、vii、viii)的代表共焦图像。这些结构以基底表面标记α6-整合素(α6-integrin)(红色)及黏着连接标记(adherenjunctionmarker)β-连环蛋白(β-catenin)(绿色)作免疫染色。细胞核以DAPI(蓝色)复染。星号：无细胞管腔(cell-freelumen)。小图：低层级人类PDAC组织的代表性组织切片(H&E；放大倍率400×)。比例尺，100μm。

第2图包含相关于关于HPDE小管形态发生及结构分化的分子变化之几个图表。(A)显示在HPDE小管形态发生期间620个差异地表达的基因(differentiallyexpressedgenes,DEGs)的表达模式。也显示在PANC-1细胞丛或球体内的表达模式。热图描述在对数空间(logspace)中以培养基为基准的基因表达之高度(红色)及低度(绿色)相对量。(B)显示借着qRT-PCR分析测量在CEL、CA9、MUC1、AGR2、及MUC20的转录量之倍数变化。(C)显示在HPDE或PANC-1类器官(organoid)内的脂酶、碳酸酐酶9(carbonicanhydrase9)或黏蛋白-1(mucin-1)的Western印迹法分析。β-微管蛋白(β-tubulin)被含入以作为内参(loadingcontrol)。

第3图显示具最高一致性指数(concordanceindex,C-index)之28个基因基因组的挑选，用以对UCSF定群(cohort)内PDAC病患的手术后存活率作评估。在HPDE小管形态发生期间在620个差异地表达的基因组别内的基因根据Cox回归P值被排序排名。基因的多组藉由从递降排序清单的顶部每次重复地加入一或多个基因，而从排序于前的前三名基因开始产生。对于选取的各个探针组，C-index系用于在存活分析中评估评估准确度。C-index统计分析使用统计程序语言R内的survcomp封包(cran.r-project.org)而进行。

第4图显示比较局部PDAC病患的三个独立定群(UCSF定群、JHMI定群、及NW/NSU定群)中术后存活之Kaplan-Meier存活曲线。病患被分级成两群，基于借着范例2所述的28个基因预后印记所计算的复发评估风险(风险分数；RS)。P值使用对数秩检定(log-ranktest)来计算。右边显示的是根据Cox比例风险分析之RS及临床病理标准的死亡风险比例(具95％信赖区间)。*，P<0.05；**，P<0.01。

第5图显示比较UCSF定群中PDAC病患的总存活率之Kaplan-Meier存活曲线。病患基于表2所选取之排序前面(Cox回归P<0.01)的基因标记之转录丰度等级(transcriptabundancelevel)而被分为两群。相对于结果为群组之间最佳区辨的截止值(Cut-offvalue)系根据最大约登指数(Youden’sindex)来判定。P值使用对数秩检定来计算。

第6图显示比较UCSF、JHMI、及NW/NSU定群中PDAC病患的总存活率之Kaplan-Meier存活曲线。病患基于ASPM的转录丰度等级被分为两群。相对于结果为群组之间最佳区辨的截止值系根据最大约登指数来判定。P值使用对数秩检定被计算。

第7图包含相关于胰脏组织及PDAC细胞株中之ASPM表达量的几个图表。(A)显示使用Oncomine(肿瘤微阵列数据库)(https://www.oncomine.com/resource/login.html)所查询之显微解剖正常胰腺管内(n＝11)及PDAC组织内(n＝11)ASPM相对转录量的盒形图。*，P<0.05。(B)显示借着qRT-PCR分析所计算之HPDE细胞及多种PDAC细胞株内的ASPM转录量。数据以平均值±SEM表示。n＝3。**，P<0.01；***，P<0.001。

第8图包含相关于PDAC细胞增生及移行之ASPM功能重要性之几个图表。(A)显示藉由Western印迹分析AsPC-1或PANC-1细胞里ASPMshRNA媒介的沉默效应。β-微管蛋白被含入以作为内参。(B)显示对照的生长速率或ASPMshRNA转导的AsPC-1或PANC-1细胞的生长速率。n＝3。*，P<0.05；***，P<0.001对对照shRNA细胞。(C)显示弱化AsPC-1或PANC-1细胞迁移能力的ASPM表达之沉默，针对于修饰博伊登室测定(Boydenchamberassay)的胰脏星状细胞。n＝3。*，P<0.05；***，P<0.001。

第9图包含关于活体内胰脏癌侵袭性的ASPM角色的几个图表。(A)代表在胰脏尾端以ffLuc标记植入的对照或ASPMshRNA转导的AsPC-1细胞在细胞植入后指定时间点之NOD-SCID小鼠的生物发光图像(bioluminescenceimages,BLI)。(B)显示为作为时间函数以BLI标准化光子计数所量化的肿瘤容积。数据以平均数±SEM表示。n＝6。*，P<0.05；**，P<0.01。(C)显示以控制shRNA转导之AsPC-1细胞或ASPMshRNA转导细胞植入的小鼠在细胞植入后六周所测量之腹水量。n＝3。**，P<0.01。(D)显示作为时间函数之(A)所述的小鼠存活百分比。P值使用对数秩检定来计算。

第10图包含关于Wnt信号通路的ASPM角色的几个图表。(A)显示基因组富集分析(GeneSetEnrichmentAnalysis)的富集图，其中显示KEGGWnt信号通路对于对照shRNA转导的AsPC-1细胞而言在ASPMshRNA的分化基因表达谱中为富集的。(B)显示对照或ASPMshRNA转导AsPC-1细胞内倍数之Wnt媒介荧光素酶表达。相对于以Wnt-3a或载体(vehicle)处理细胞16小时后的基底活性来测量细胞荧光素酶活性。数据以平均数±SEM表示。n＝3。***，P<0.001。

第11图包含关于调控β-连环蛋白的ASPM角色的几个图表。(A)显示在对照-或ASPMshRNA转导的AsPC-1或PANC-1细胞内的β-连环蛋白之蛋白质丰度的Western印迹分析。β-微管蛋白被使用以作为内参。(B)显示以对照或有无S33Yβ-连环蛋白突变共表达的ASPMshRNA所转导之AsPC-1细胞在群集倍增速率(左)及迁移(右)上的倍数变化。n＝3。**，P<0.05；***，P<0.001对对照shRNA细胞。

第12图包含关于胰脏癌干细胞内ASPM角色的几个图表。(A)显示基因组富集分析，其显示相对于对照AsPC-1细胞之ASPM缺失的分化基因表达谱中，核心胚胎类干细胞模块基因组(coreembryonicstemcell-likemodulegeneset)的显著富集。(B)显示代表性图式，其显示表达ASPMshRNA或对照shRNA的AsPC-1细胞之CD44及CD24染色的模式，依癌细胞百分比显示之框围CD44+CD24+细胞群集的频率。(C)显示三个独立测量的CD44+CD24+细胞群集的平均数(±SEM)百分比。*，P<0.05。(D)显示以对照-或ASPM-shRNA-转导的CD44+CD24low/-AsPC-1细胞所形成的肿瘤球(tumorshpere)的代表相对比图像。比例尺，100μm。(E)显示(D)内的肿瘤球直径之长条图。**，P<0.01。

第13图显示比较局部PDAC病患于三个独立定群(UCSF定群、JHMI定群、及NW/NSU定群)中术后存活之Kaplan-Meier存活曲线。病患基于评估的复发风险(风险分数；RS)被分级成两组，复发风险以范例7所述的12-基因(ATP9A、ASPM、ACOX3、CDC45L、SLC40A1、AGR2、ATP11C、FAM72A、PLA2G10、MATN2、APITD1、及KIF11)预后印记来计算。P值使用对数秩检定来计算。

第14图显示比较局部PDAC病患在三个独立定群(UCSF定群、JHMI定群、和NW/NSU定群)中术后存活之Kaplan-Meier存活曲线。病患基于评估的复发风险(风险分数；RS)被分级成两组，复发风险以范例8所述的六-基因(ASPM、ATP9A、ACOX3、CDC45L、SLC40A1、及AGR2)预后印记来计算。P值使用对数秩检定来计算。

第15图显示比较局部PDAC病患在三个独立定群(UCSF定群、JHMI定群、及NW/NSU定群)中术后存活之Kaplan-Meier存活曲线。病患基于评估的复发风险(风险分数；RS)被分级成两组，复发风险以范例9所述的三-基因(ASPM、ATP9A、及ACOX3)预后印记来计算。P值使用对数秩检定来计算。

第16图显示从Oncomine(www.oncomine.org)所查询的多重乳癌转录体数据组中的ASPM转录量(Curtis等人，2012年；Ma等人，2009年；Richardson等人，2006年)。***，P<0.001对一般组。DCIS，导管原位癌(ductalcarcinomainsitu)；IDC，浸润性导管癌(invasiveductalcarcinoma)；ILC，浸润性小叶癌(invasivelobularcarcinoma)；TCGA，癌症基因组图谱(TheCancerGenomeAtlas)。

第17图显示比较乳癌病患之不同大型定群内完全或免于复发存活之Kaplan-Meier存活曲线(Curtis等人，2012；Pawitan等人，2005；Wang等人，2005))。病患根据ASPM转录丰度被分组成四分。对数秩检定系用于计算P值。

第18图包含关于乳癌细胞增生、细胞迁移、及Wnt活性的ASPM功能重要性的几个图表。(A)显示藉由Western印迹分析在乳癌HCC-1954细胞中ASPMshRNA媒介沉默的效应。β-微管蛋白被包含以作为内参。(B)显示以对照或ASPMshRNA-转导的MDA-MD-436或HCC-1954细胞的生长速率。n＝3。**，P<0.01；***，P<0.001对对照shRNA细胞。(C)显示于修饰波伊登室测定中针对初级乳房肿瘤相关纤维母细胞会衰减MDA-MD-436或HCC-1954细胞移动能力之ASPM表达沉默。n＝3。***，P<0.001。(D)显示对照-或ASPM-shRNA-转导的MDA-MD-436或HCC-1954细胞之Wnt-媒介荧光素酶表达。数据以平均值±SEM(n＝3)表示。*，P<0.05对控制shRNA。

第19图包含关于在乳房癌干细胞内ASPM角色的几个图表。(A)显示代表图式，代表图式显示表达ASPMshRNA或控制shRNA的MDA-MB-436的CD44及CD24染色的模式，依癌细胞百分比显示框围的CD44+CD24-low/细胞群集的频率。(B)显示三个独立测量的CD44+CD24-/low细胞群集的平均数(±SEM)百分比。***，P<0.001。(C)显示借着对照-或ASPM-shRNA-转导CD44+CD24low/-MDA-MB-436细胞所形成的肿瘤球的代表相位对比图像。比例尺，100μm。(D)，长条图显示(C)的肿瘤球直径。***，P<0.001。

第20图包含关于活体内乳房肿瘤生成的ASPM角色的几个图表。(A)显示以萤火虫荧光素酶标记对照或ASPMshRNA-转导乳癌MDA-MB-436细胞植入乳腺脂肪垫之NOD-SCID小鼠在细胞植入后指定时间点的代表性生物发光图像(BLI)。(B)显示作为时间函数以BLI标准化光子计量所定量的肿瘤容积。数据以平均数±SEM(在各组n＝6)表示。*，P<0.05；***，P<0.001对对照shRNA。

第21图包含关于人类前列腺癌组织内ASPM表达量的几个图表。(A)显示人类组织cDNA阵列里(进阶生物科技，Origene)藉由定量逆转录聚合酶链反应分析所计算之正常前列腺(n＝9)及前列腺癌组织(n＝73)之ASPM转录量。GS，格里森分数。***，P<0.001对正常组织。(B)显示自Oncomine(www.oncomine.org)所查询的多重转录体数据组内初始及转移前列腺癌的ASPM转录量(Chandran等人，2007；Grasso等人，2012；Varambally等人，2005)。**，P<0.01；***，P<0.001对初始前列腺癌。

第22图包含关于前列腺癌增生、迁移及Wnt活性之ASPM功能重要性的几个图表。(A)显示借着Western印迹分析在前列腺癌PC-3细胞内ASPMshRNA-媒介的沉默效应。β-微管蛋白被包含以作为内参。(B)显示对照或ASPMshRNA-转导的PC-3细胞的生长速率。n＝3。**，P<0.01；***，P<0.001对对照shRNA细胞。(C)显示在修饰波伊登室测定内针对含有生长培养基的血清衰减PC-3迁移能力之沉默ASPM表达。n＝3。***，P<0.001。(D)显示于对照-或ASPM-shRNA-转导的PC-3细胞内Wnt-媒介的荧光素酶表达。数据以平均值±SEM表示(n＝3)。***，P<0.001对对照shRNA。

第23图包含关于前列腺癌干细胞内的ASPM角色的几个图表。(A)显示代表图式，代表图式显示表达ASPMshRNA或对照shRNA的PC-3细胞之CD133及CD44染色的模式，依癌细胞百分比显示框围的CD133+CD44+细胞群集的频率。(B)显示三个独立测量的CD133+CD44+细胞群集的平均数(±SEM)百分比。**，P<0.01对对照shRNA。

【发明详述】

本揭露包括一种在任何具有怀疑为或已知为癌症之胰脏组织，例如，胰脏癌组织之受试者所取得之生物样本中，藉由检测分子标记(不论是蛋白质或编码该蛋白质的RNA)来诊断胰脏癌分化程度并评估临床预后的方法，分子标记包含ATP9A、ASPM、ACOX3、CDC45L、SLC40A1、AGR2、以及表2所示者，或其组合物，包含野生型、截断或选择性剪接之形式。除了其它的事项以外，在本揭露中提供的方法能够对任何胰脏癌受试者作包含疾病复发、转移、治疗反应、及总存活率之临床诊断的评估。因此，特定实施方式可用于筛检胰脏癌受试者的不良临床预后，包括，例如，治疗后疾病之复发，而可指引胰脏癌受试者的治疗决策和治疗模式选择。因此，受试者(例如，胰脏癌病患)及护理人员可针对是否要进行手术(例如，根治性胰脏切除术)、新佐剂(即，手术前)、佐剂治疗(即，手术后)作出更明智的决策，包括但不限于：放射治疗、化学疗法治疗、使用生物制剂治疗、激素疗法、及/或其它替代治疗法。

本揭露的方法涉及测定病患的多肽量或多核苷酸量，然后比较此量值与临界参考基准或范围之量值。通常，临界参考值是大量胰脏癌个体或组织内多肽或多核苷酸的代表值，且其临床预后数据是可取得的，例如藉由使用组织样本或活体组织切片或其它生物样本，像是细胞、血清或血液来测量。所述的临界参考值系藉由界定量值来判定，其中其肿瘤具高于上述临界参考基准的标记表达量的受试者，相较于低于上述临界参考基准的表达量，会被评估为具有较高程度或较低程度的分化、或临床预后不良或疾病进展的风险。相较于表达量低于所述临界参考基准，多肽量或多核苷酸量与参考范围(无论是上或下)的差异表示病患具有较高程度或较低程度分化、或临床预后不良或疾病进展的风险。

在特定实施方式中，该方法包括取得来自受试者的一或多个肿瘤样本内一或多种标记基因的转录量或蛋白质表达量的计量。在特定实施方式中，肿瘤样本可藉由抽吸、活体组织切片或手术切除的方法来取得。在特定实施方式中，肿瘤样本可以是新鲜的样本、冷冻的样本、或固定的、石蜡包埋的样本。

基于ASPM、ATP9A、ACOX3、CDC45L、SLC40A1、AGR2、和表2中所示者的表达量对胰脏癌受试者评估临床预后的方法亦可能涉及统计方法的使用，包括，但不限于，使用非监督式方法(例如，k平均数、阶层式集群分析法、主成分分析(principlecomponent)、非负矩阵因式分解或多维尺度)(Hastie等人，2009)、监督式方法(例如，判别分析、支持向量机、或k最近邻算法)或半监督式方法、或使用Cox回归模型评估结果(例如，免于复发之存活、疾病进展、或总存活)(Kalbfleisch及Prentice，2002年)、加速失败时间模式(acceleratedfailuretimemodel)、贝式存活模式(Bayesiansurvivalmodel)、或对存活数据平滑分析(Wand，2003年)，来区分级别。

在特定实施方式中，对胰脏癌诊断分化程度及评估临床预后的方法包含在来自胰脏癌受试者的生物样本中检测一或多个基因标记的表达量，基因标记包含ASPM、ATP9A、ACOX3、CDC45L、SLC40A1、AGR2，和表2所示者。在揭露的方法中应用的标记包含表2中之任何单一标记，或其二或多个标记的任何组合(例如，任何表2的任两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个或全部28个标记，或表2的至少二个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、或至少27个标记)。

特定实施方式系关于藉由测定来自胰脏癌受试者的生物样本内的ASPM、ATP9A、或ACOX3或其任何组合(例如，任何两个、或全部三个标记、或这些标记的至少两种)的蛋白质表达量进行胰脏癌预后之评估。

特定实施方式系关于藉由测定来自胰脏癌受试者的生物样本内的ASPM、ATP9A、ACOX3、CDC45L、SLC40A1、或AGR2或其任何组合(例如，任何两个、任何三个、任何四个、任何五个或全部六个标记、或这些标记的至少两个、至少三个、至少四个、或至少五个)的蛋白质表达量进行胰脏癌预后之评估。

特定实施方式系关于藉由测定来自胰脏癌受试者的生物样本内的ASPM、ATP9A、ACOX3、CDC45L、SLC40A1、AGR2、ATP11C、FAM72A、PLA2G10、MATN2、APITD1、或KIF11或任何其组合(例如，任何两个、任何三个、任何四个、任何五个、任何六个、任何七个、任何八个、任何九个、任何10个、任何11个或全部12个标记，或这些标记的至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少10个、或至少11个)的蛋白质表达量进行胰脏癌预后之评估。

在特定实施方式里，作评估的临床预后可包括可测量的一或多个肿瘤病灶的数目、大小、或体积的变化。在特定实施方式中，评估或评价肿瘤病灶的数量、大小或体积可包括在诊断或手术之前或期间不同时间点或之后对肿瘤或胰脏癌进行目测、放射、及/或病理的检查。

在例示性方法中，测定蛋白质表达量包含对所述基因标记具特异性的抗体的使用以及在固定的(例如，福尔马林固定的)和/或蜡包埋的(例如，石蜡包埋的)胰脏肿瘤组织上作免疫组织化学染色。组织制备或细胞的固定剂系为本领域所习知，且包含福尔马林、戊二醛、甲醇、或类似物(Carson，(组织技术学：自学指示本)(Histotechology:ASelf-InstructionalText)，芝加哥：ASCP出版社(Chicago:ASCPPress)，1997年)。免疫组织化学方法可以手动或以自动方式执行。

抗体试剂可在测定中用以使用本领域技术人员已知的任何多种免疫测定法，在病患样本内检测ASPM、ATP9A、ACOX3、CDC45L、SLC40A1、AGR2、和/或表2中所示者的表达量。免疫测定技术及指南系概略描述于Price和Newman，“免疫测定技术的原则和实践”(PrinciplesandPracticeofImmunoassay)，第2版，树林字典(Grove'sDictionaries)，1997年；以及Gosling，“免疫测定：实用方法(Immunoassays:APracticalApproach)”，牛津大学出版社(OxfordUniversityPress)，2000年)。能使用多种免疫测定技术，包括竞争性和非竞争性免疫测定。参见，例如，Self等人，生物技术当前观点期刊(Curr.Opin.Biotechnol)，7:60-65(1996年)。免疫测定之用词涵盖技术包括但不限于，酶免疫分析(enzymeimmunoassay,EIA)像是酶倍增免疫测定技术(enzymemultipliedimmunoassaytechnique,EMIT)、连结酶免疫吸收测定(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)、抗体IgM捕获ELISA(IgMantibodycaptureELISA,MACELISA)、及微粒子酶免疫分析法(microparticleenzymeimmunoassay,MEIA)；毛细管电泳免疫分析(capillaryelectrophoresisimmunoassay,CEIA)；放射性免疫分析(radioimmunoassay,RIA)；免疫放射测定(immunoradiometricassays,IRMA)；荧光偏极免疫分析(fluorescencepolarizationimmunoassays,FPIA)；以及化学发光测定法(chemiluminescenceassays,CL)。如果需要的话，这样的免疫测定可为自动化。免疫测定亦能与雷射光诱发的荧光结合使用。参见，例如，舒马(Schmalzing)等人，电泳期刊(Electrophoresis)，18:2184-93(1997年)；Bao，色谱杂志，生物医学科学(J.Chromatogr.B.Biomed.)，SCI，699:463-80(1997年))。脂质体免疫测定法，像是流动注射脂质体免疫测定(flow-injectionliposomeimmunoassay)以及脂质体免疫传感器(liposomeimmunosensor)亦适用于在特定实施方式中使用。参见，例如，Rongen等人，免疫学方法期刊(J.Immunol.Methods)，204:105-133(1997年))。另外，散射比浊测定法，其中蛋白质/抗体复合物之形成会致使光散射之增加，光散射被转换为作为标记浓度的函数之峰值速率讯号(peakratesignal)，系适用于在本方法的特定实施方式中使用。散射比浊测定可购自贝克曼库尔特公司(BeckmanCoulter)(布雷亚，加州；试剂盒#449430)(Brea，CA；Kit#449430)且能使用贝林浊度仪分析器(BehringNephelometerAnalyzer)执行(Fink等人，临床化学和临床生物化学(J.Clin.Chem.Clin.Biochem.)，27:261-276(1989年))。

抗体对核酸的特异性免疫结合可被直接或间接地检测。直接卷标包括连接至抗体之荧光或发光标签、金属、染料、放射性核种等。用碘-125(125I)标签的抗体可被使用。使用对核酸具特异性的化学发光抗体的化学发光测定法系适用于蛋白质量的敏感性、非放射性侦测。以荧光染料标签的抗体也适用。荧光染料的示例包括，但不限于，DAPI、荧光素(fluorescein)、赫斯特染色33258(Hoechst33258)、R-藻蓝素(R-phycocyanin)、B-藻红素(B-phycoerythrin)、R-藻红素(R-phycoerythrin)、罗丹明(rhodamine)、得克萨斯红(Texasred)、以及丽丝胺(lissamine)。间接标签包括在本领域中习知的各种酶，像是山葵过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)、碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,AP)、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)、尿素酶(urease)及其类似物。山葵过氧化物酶侦测系统可与例如显色基质(chromogenicsubstrate)四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)一起使用，而在过氧化氢存在下产生在450nm下可被侦测之水溶性产物。碱性磷酸酶侦测系统能与，举例，产生在405nm下易被侦测的水溶性产物之显色基质磷酸对硝基苯酯(p-nitrophenylphosphate)一起使用。相似地、β-半乳糖苷酶侦测系统可与显色基质邻-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside,ONPG)使用，其在410nm时产生可侦测的水溶性产物。尿素酶侦测系统能与基质像是尿素-溴甲酚紫(urea-bromocresolpurple)一起使用(西格玛免疫化学公司；圣路易，密苏里州(SigmaImmunochemicals；St.Louis,MO))。

来自直接或间接卷标的讯号可被分析，例如，使用分光光度计来侦测来自显色基质的颜色；使用辐射计数器(radiationcounter)来侦测辐射，像是用以作125I检测的γ射线计数器；或使用荧光计(fluorometer)以侦测在特定波长光存在下的荧光。对于连结酶抗体的侦测，定量分析可依照制造商说明而使用分光光度计来进行，像是EMAX微盘分析仪(MicroplateReader)(分子仪器；门洛帕克，加州(MolecularDevices；MenloPark,CA))。如果有需要的话，特定实施方式的测定可自动化或以机器人执行，且来自多个样品的讯号可同时被侦测。

抗体可以棒、海绵、纸、孔盘及类似物的物理形式固定在各种固体支持物上，像是磁性或色谱介质颗粒、测定平板的表面(例如，微量滴定孔盘)、固体基底材料或膜(例如塑料、尼龙、纸)片段。测试试纸(strip)可借着在固体支持物上以阵列涂布抗体或复数个抗体来制备。这试纸接着可被浸入测试样本里，并透过洗涤和侦测步骤迅速处理以产生可测量的讯号，像是色斑。

另外，在测定中可使用核酸结合分子像是探针、寡核苷酸、寡核甘酸阵列、和引物，以在病患样本里侦测ASPM、ATP9A、ACOX3、CDC45L、SLC40A1、AGR2及/或表2所示者的差别RNA表达，例如，RT-PCR。在一实施方式中，RT-PCR根据本领域已知的标准方法来使用。在另一实施方式中，像是从例如应用生物系统公司(AppliedBiosystems)可取得的泰格门测定(assays)之PCR测定可被使用以侦测核酸和其变异。在另一实施方式，qPCR和核酸微阵列可被使用于侦测核酸。结合至选取的癌症生物标记的试剂可根据本领域普通技术人员已知的方法被制备或可于商业购得。

核酸分析可使用常规技术，像是南方分析法、反转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)来达成，或基于杂交至与编码序列之标记之一部分互补的核酸序列的任何其它方法(例如，狭缝杂交(slotblothybridization))亦在特定实施方式的范畴里。可应用的PCR扩增技术描述于，例如，PCR指南：方法和应用手册(Innis等人，编，1990年)。一般核酸杂交方法被描述于Anderson，“核酸杂交”，生物科学出版社(BIOSScientificPublishers)，1999年。复数个核酸序列(例如，基因组DNA、mRNA或cDNA)的扩增或杂合也可从排列为阵列之mRNA或cDNA序列来执行。微阵列方法一般描述于Hardiman，“微阵列方法和应用：基础细节”(MicroarraysMethodsandApplications:Nuts&Bolts)，DNA出版(DNAPress)，2003年；以及Baldi等人，“DNA微阵列及基因表达：从实验到数据分析及模型”(DNAMicroarraysandGeneExpression:FromExperimentstoDataAnalysisandModeling)，剑桥大学出版社(CambridgeUniversityPress)，2002年。

核酸标记及其变异的分析可使用本领域已知的技术执行，包含但不限于微阵列、聚合酶链反应(PCR)-系列的分析、序列分析、及电泳分析。PCR-系列分析之非限制性范例包含得自应用生物系统公司的对偶之歧异测定。序列分析之非限制性范例包含Maxam-Gilbert定序(Maxam-Gilbertsequencing)、桑格定序(Sangersequencing)、毛细管阵列DNA定序(capillaryarrayDNAsequencing)、热循环定序(Sears等人，生物技术期刊(Biotechniques)，13:626-633(1992年))、固相定序(solid-phasesequencing)(Zimmerman等人，分子与细胞生物学方法期刊(MethodsMol.CellBiol.)，3:39-42(1992年))、以质谱分析法(massspectrometry)定序像是基质辅助雷射脱附/游离之飞行时间质谱分析法(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtime-of-flightmassspectrometry)(MALDI-TOF/MS；Fu等人，自然生物技术期刊(Nat.Biotechnol.)，16:381-384(1998年))、以及藉由杂交定序。(Chee等人，科学期刊(Science)，274:610-614(1996年)；Drmanac等人，科学期刊(Science)，260:1649-1652(1993年)；Drmanac等人，自然生物技术期刊(Nat.Biotechnol.)，16:54-58(1998年))。电泳分析之非限制性范例包含平板凝胶电泳(slabgelelectrophoresis)，像是琼脂凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳、以及变性梯度凝胶电泳。其它用以侦测核酸变异的方法包含、例如，来自第三波科技公司(ThirdWaveTechnologies,Inc)的assay、限制片段长度多型性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)分析、对偶基因特异性寡核苷酸杂合(allele-specificoligonucleotidehybridization)、异源双链迁移率分析(heteroduplexmobilityassay)、单股购形多型性(singlestrandconformationalpolymorphism,SSCP)分析、单核苷酸引物延伸(single-nucleotideprimerextension,SNUPE)以及焦磷酸定序(pyrosequencing)。

可侦测部分可在于此描述的测定中使用。可侦测部分的各种差异可被利用，标签选择取决于所需要的敏锐度、与抗体结合的容易性、稳定性的需求、以及可使用的仪器及处理规定。合适的可侦测部分包括，但不限于，放射性核素、荧光染料(例如，荧光素、荧光异硫氰酸盐(fluoresceinisothiocyanate,FITC)、俄勒冈绿(OregonGreen^TM)、罗丹明、得克萨斯红、四甲基异硫氰酸罗丹明(tetrarhodimineisothiocynate,TRITC)、Cy3、Cy5等)、荧光标记(例如，绿荧光蛋白(GFP)、藻蓝素等)、受到肿瘤相关蛋白酶活化的自动淬火荧光化合物(autoquenchedfluorescentcompound)、酶(例如、荧光素酶、山葵过氧化氢酶、碱性磷酸酶等)、奈米颗粒、生物素(biotin)、长叶毛地黄配质(digoxigenin)及其类似物。

有用的物理形式包含具有复数个离散可寻址位置的表面，以用于复数个相异标记的侦测。这样的形式包括微阵列和某些毛细管仪器。参见，例如，Ng等人，细胞与分子医学期刊(J.CellMol.Med.)，6:329-340(2002年)；美国专利号6019944(U.S.Pat.No.6,019,944)。在这些实施方式中，每个离散表面位置可包含抗体用于固定一或多种标记以在每个位置进行侦测。表面可选替地包括固定在表面离散位置的一或多个离散颗粒(例如，微粒或奈米颗粒)，其中微粒包括抗体以固定用于侦测的一或多种标记。其它有用的物理形式包括棒、孔盘、海绵及其类似物。

分析可以多种物理型式进行。例如，微量滴定盘的使用或自动化可用于协助大量测试样本的处理。另外，可发展单一采样型式以协助诊断或及时预后。

另外，特定实施方式的抗体或核酸探针可应用于固定在显微镜载玻片上的病患样本。染色或原位杂合模式所得到的抗体可使用本领域中已知的各种光学或荧光显微方法的任何一个而可视化。

蛋白质或核酸分析亦可实现，例如，藉由单以高压液相层析仪(highpressureliquidchromatography,HPLC)或与质谱分析法(例如，MALDI/MS、MALDI-TOF/MS、串联式MS等)组合。

例示性分子标记

1.三磷酸腺苷酶，第二类，9A型(ATPase,classII,type9A,ATP9A)

人类的三磷酸腺苷酶、第二类、9A型(ATP9A)基因(NCBIEntrezGene10079)位在第20对染色体上，在基因图谱基因座20q13.1且编码912氨基酸。这基因的功能仍不清楚，且只有一个剪接形式。例示性ATP9A序列是公开可取得的，举例，从GenBank(例如，登录号NM_006045.1(mRNA)和NP_006036.1(蛋白质))，或UniProtKB(例如，Q2NLD0)。

2.Asp(异常纺锤体)同源物，小头畸形(microcephaly)相关基因(ASPM)

人类Asp(异常纺锤体)同源物，小头畸形相关(ASPM)基因(NCBIEntrezGene259266)是黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)的“异常纺锤体”基因(asp)的人类异种同源物(ortholog)，其位在第1对染色体基因图谱基因座1q31且分子量为410kD。此基因角色对于胚胎神经母细胞在正常有丝分裂纺锤体功能及有丝分裂纺锤体调控上是不可或缺的。两个选择式剪接变体被鉴定。ASPM序列为公开可取得的，举例，GenBank(例如，登录号NM_001206846.1、和NM_018136.4(mRNAs)以及NP_001193775.1，和NP_060606.3(蛋白质)或UniProtKB(例如，Q8IZT6)。

3.酰基辅酶A氧化酶3(Acyl-CoenzymeAoxidase3)，降植烷(pristanoyl)(ACOX3)

人类酰基辅酶A氧化酶3，降植烷(ACOX3)基因(NCBIEntrezGene8310)位在第4对染色体之图谱基因座4p15.3上。ACOX3在过氧化体内参与2-甲基支链脂肪酸(2-methylbranchedfattyacids)的去饱和。据知该酶只在特殊情况下表达，像是在特定发育阶段期间、或是在特定组织里。ACOX3有两个选择式剪接变体。例示性ACOX3序列为公开可取得的，举例，从GenBank(例如，登录号NM_001101667.1及NM_003501.2(mRNA)以及NP_001095137.1及NP_003492.2(蛋白质))，或UniProtKB(例如，O15254)。

4.CDC45细胞分裂周期调控蛋白45-类似物(celldivisioncycle45-like)(CDC45L)

人类CDC45细胞分裂周期调控蛋白45(CDC45L)基因(NCBIEntrezGene259266)位在第22对染色体之图谱基因座22q11.21上。CDC45L是高度保留性多蛋白复合物的成员，多蛋白复合物包含Cdc6/Cdc18、微小染色体维持蛋白(minichromosomemaintenanceproteins,MCMs)及DNA聚合酶，对于真核生物DNA复制的早期步骤来说是不可或缺的。在CDC45L发现编码不同异构物的多种选择式剪接转录变体。例示性的CDC45L序列为公开可取得的，举例而言，从GenBank(例如，登录号NM_001178010.1、NM_001178011.1、及NM_003504.3(mRNAs)以及NP_001171481.1、NP_001171482.1、及NP_003495.1(蛋白质))，或UniProtKB(例如，O75419)。

5.溶质载体家族(Solutecarrierfamily)40(铁调控转运蛋白((iron-regulatedtransporter))，成员1(SLC40A1)

人类溶质载体家族40(铁调控转运蛋白)，成员1(SLC40A1)基因(NCBIEntrezGene30061)位在第2对染色体之基因图谱基因座2q32上。SLC40A1基因编码细胞膜蛋白，细胞膜蛋白可参与十二指肠上皮细胞之铁离子传输且对铁过度郁积疾病遗传血色素沉着病(hemochromatosis)作上调控。只有一种剪接形式被鉴定。例示性SLC40A1序列为公开可取得的，举例，从GenBank(例如，登录号NM_014585.5(mRNA)和NP_997512.1(蛋白质))，或UniProtKB(例如，Q9NP59)。

6.前梯度同源物2(Anteriorgradienthomolog2,AGR2)

人类前梯度同源物2(AGR2)基因(NCBIEntrezGene10551)位在第7对染色体之图谱基因座7p21.3上。AGR2mRNA及蛋白质在乳癌组织内展现相似的表达模式。AGR2之表达显示与雌激素受器之表达有正相关性，且与EGF受器之表达有负相关性。例示性AGR2序列为公开可取得的，举例而言，自GenBank(例如，登录号NM_006408.3(mRNA)及NP_006399.1(蛋白质))，或UniProtKB(例如，Q4JM47)。

7.三磷酸腺苷酶、第六类、11C型(ATPase,classVI,type11C(ATP11C)

人类三磷酸腺苷酶、第六类、11C型(ATP11C)基因(NCBIEntrezGene10079)位在X染色体之基因图谱基因座Xq27.1上，且编码1132个氨基酸。此基因的功能仍不清楚。有两个选择式剪接形式被鉴定。例示性ATP11C序列为公开可取得的，举例，自GenBank(例如，登录号NM_001010986.2、及NM_173694.4(mRNA)以及NP_001010986.1、及NP_775965.2(蛋白质))，或UniProtKB(例如，Q8NB49)。

8.序列相似性家族72，成员A(Familywithsequencesimilarity72,memberA(FAM72A)

序列相似性家族72，成员A(FAM72A)基因(NCBIEntrezGene729533)为序列相似性家族72，成员A的人类异种同源物，其位在第1对染色体之基因图谱基因座1p11上。FAM72A基因编码具149kD分子量的蛋白质。FAM72A相较于相对之正常组织在数种常见癌症中进行上调控。FAM72A之仅一种剪接形式已经被鉴定。例示性FAM72A序列为公开可取得的，举例来说，自GenBank(例如，登录号NM_00123168.1(mRNA)以及NP_001116640.1(蛋白质))，或UniProtKB(例如，Q5TYM5)。

9.磷脂酶A2，X组(PhospholipaseA2,groupX)(PLA2G10)

人类磷脂酶A2，X组(PLA2G10)基因(NCBIEntrezGene8399)位在第16对染色体之基因图谱基因座16p13.12上，且编码由42个氨基酸所组成的蛋白质。PLA2G10基因的功能仍不清楚，且只有一个剪接形式被鉴定。例示性ATP9A序列为公开可取得的，举例来说，自GenBank(例如，登录号NM_003561.1(mRNA)以及NP_003552.1(蛋白质))，或UniProtKB(例如，O15496)。

10.胞外基质蛋白2(Matrilin2)(MATN2)

人类胞外基质蛋白2(MATN2)基因(NCBIEntrezGene4147)位在第8对染色体之基因图谱基因座8q22上，且编码由956个氨基酸所组成的蛋白质。MATN2基因的两种mRNA转录本已经被鉴定。例示性MATN2序列为公开可取得的，举例来说，自GenBank(例如，登录号NM_002380.3，及NM_030583.2(mRNA)以及NP_002371.3、及NP_085072.2(蛋白质))，或UniProtKB(例如，O00339)。

11.细胞凋亡诱导，TAF9-样结构域1(Apoptosis-inducing,TAF9-likedomain1(APITD1)

人类细胞凋亡诱导，TAF9-样结构域1(APITD1)基因(NCBIEntrezGene378708)被鉴定位在染色体1p36上之神经母细胞瘤肿瘤抑制候选区域内。其包含为p53媒介转录活化所需要之TFIID-31结构域，相似于TATA盒结合蛋白相关因子(TATAbox-bindingprotein-associatedfactor)内发现的TAF(II)31。此基因在神经母细胞瘤肿瘤内表达为低量，且在神经母细胞瘤内展现为会减少细胞生长，提示着其在细胞死亡途径中可具有一定作用。多种选择式剪接转录变体已被鉴定。例示性APITD1序列为公开可取得的，举例来说，自GenBank(例如，登录号NM_001270517.1、NM_198544.3、NM_199006.2及NM_001243768.1(mRNA)以及NP_001257446.1、NP_940946.1、及NP_950171.2、以及NP_001230697.1(蛋白质))，或UniProtKB(例如，H2PXZ6)。

12.驱动蛋白家族成员(Kinesinfamilymember11)(KIF11)

人类驱动蛋白家族成员11(KIF11)基因(NCBIEntrezGene3832)位在第10对染色体之基因图谱基因座10q24.1上。KIF11编码马达蛋白(motorprotein)，马达蛋白(motorprotein)属于致动类蛋白家族。此蛋白家族成员已知参与各种纺锤体动力学。KIF11功能包含细胞有丝分裂期间之染色体定位、中心体分离及建立双极纺锤体。只有一种KIF11的剪接形式。例示性KIF11序列为公开可取得的，举例来说，自GenBank(例如，登录号NM_004523.3(mRNA)以及NP_004514.2(蛋白质))，或UniProtKB(例如，P52732)。

例示性试剂盒、设备、及组成

A.试剂盒

设想为试剂盒有用于协助本揭露方法之特定实施方式的实行。在一实施方式中，试剂盒系被提供用于侦测表2中所揭露的一或多个基因(像是，表2中所揭露之至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、或至少27个或全部28个基因)。在一实施方式中，试剂盒系提供用以至少侦测ASPM和ATP9A核酸或蛋白质分子，举例来说，与一或多个管家基因或蛋白质组合(例如，β-肌动蛋白(β-actin)、GAPDH、RPL13A、微管蛋白(tubulin)及蛋白质生物化学领域内熟知的其它类似物)。在另一个实施方式中，试剂盒被提供用以至少侦测ASPM、ATP9A及ACOX3核酸或蛋白质分子，举例来说，与一至多个管家基因或蛋白质组合。侦测器或侦测方法可包含基因组变化的侦测器，包括像是mRNA或蛋白质之基因及/或基因表达产物。侦测器可包含但不限于，对包括所述揭露基因的基因组序列具特异性的核酸探针、对由上述基因编码的转录本(例如，mRNA)具特异性的核酸探针、对所述揭露基因具扩增特异性的一对引物、对由所述揭露基因编码的蛋白质具特异性的抗体或抗体片段、或对由所述揭露基因编码的蛋白质具特异性的适配体。在特定的实施方式中，试剂盒可包括从对ASPM转录本具特异性的核酸探针、对ATP9A转录本具特异性的核酸探针、对ACOX3转录本具特异性的核酸探针、以及对表2中列出的其它基因的转录本具特异性的核酸探针、对ASPM具扩增特异性的一对引物、对ATP9A具扩增特异性的一对引物、对ACOX3具扩增特异性的一对引物、以及对表2中列出的其它基因的转录本具扩增特异性的一对引物、对ATP9A蛋白质具特异性的抗体、对ASPM蛋白质具特异性的抗体、对ACOX3蛋白质具特异性的抗体、以及对由表2中列出的基因编码的蛋白质具特异性的抗体中所挑选的一或多种(例如，两个、三个或四个)侦测器。特定试剂盒实施方式可进一步包括，例如，从对管家转录本具特异性的核酸探针、对管家转录本具扩增特异性的一对引物、以及对一或多种管家蛋白具特异性的抗体中所挑选的一或多种(例如，两个、三个或四个)侦测器。

在一些实施方式中，一级侦测装置(例如，核酸探针、核酸引物、或抗体)可直接以荧光团、发色团、或能够产生可侦测产物的酶(例如，碱性磷酸酶、山葵过氧化物酶及其它本领域所一般习知者)来标签。在另一实施方式中，试剂盒被设置包含第二侦测装置，像是二级抗体或非抗体半抗原结合分子(non-antibodyhapten-bindingmolecule)(例如，抗生物素蛋白(avidin)或链亲和素(streptavidin)。在某些这样的实例中，二级侦测装置将直接以可侦测部分来标签。在其它情况中，二级或更高级别抗体可结合至半抗原(例如，生物素、DNP、或FITC)，半抗原藉由同源半抗原结合分子(例如、链亲和素山葵过氧化物酶、链亲和素碱性磷酸酶、或链亲和素QDotTM)来侦测。某些试剂盒实施方式可包含比色试剂在合适容器内以与一级、二级或更高级别侦测装置一起使用，这些侦测装置以对这模拟色试剂显影之酶所标签。

在一个实施方式中，试剂盒包括阳性或阴性对照样本，像是相应于或不相应于表2中列出的基因转录本的核酸样本，含有或不含有由表2列出的基因所编码的蛋白质或片段蛋白质的蛋白质溶解产物(proteinlysate)、及/或表达或不表达表2中列出的基因或基因产物之已知细胞株或组织。

本文提供的方法中所使用的核酸探针或引物可从市售来源获得，或者可使用本领域中已知技术来制备。核酸探针和引物为能够与标靶核酸分子(例如，基因组的标靶核酸分子)杂合的核酸分子。例如，对ASPM、ATP9A、ACOX3或表2中列出的基因具特异性之探针，当杂合至标靶时，系能够被直接或间接地侦测。对ASPM、ATP9A、ACOX3或表2中列出的基因具特异性的引物，当杂合至标靶时，系能够扩增该标靶基因，且生成之扩增物能够被直接或间接地侦测。

本文提供的方法中所使用的抗体或适配体，可从市售来源获得，或者可使用本领域中已知技术来制备。抗体是免疫球蛋白分子(或其组合)，抗体系特异性结合至特定抗原或免疫地与特定抗原反应，且包括多克隆、单克隆、抗体的基因工程及其它修饰形式，包括但不限于嵌合抗体(chimericantibodies)、人源化抗体(humanizedantibody)、异源缀合抗体(hetero-conjugateantibody)、单链Fv抗体(singlechainFvantibody)、含有足以使特定抗原结合至多肽的至少一部分免疫球蛋白的多肽、以及抗体的抗原结合片段。抗体片段包括蛋白水解抗体片段、重组抗体片段、互补性决定区域片段、骆驼抗体(例如，美国专利号6015695；6005079；5874541；5840526；5800988；和5759808)、以及透过软骨和硬骨鱼产生的抗体及其分离的结合结构域。

抗体的市售来源包括西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)(圣路易，密苏里州，美国)、圣塔克鲁兹(SantaCruz)(圣塔克鲁兹，加州，美国(SantaCruz,CA,USA))、亚诺法(Abnova)(台北，台湾)、SDIX(纽瓦克，德拉瓦州，美国(Neward,DE,USA))、EMD密理博(EMDMillipore)(比尔里卡，麻州，美国(Billerica,MA,USA))、GeneTex(尔湾，加州，美国(Irvine,CA,USA))、Epitomics(伯灵格姆，加州，美国(Burlingame,CA,USA))、LSBio(西雅图，华盛顿州，美国(Seattle,WA,USA))及其它抗体提供者。表1显示例示性市售之针对ATP9A、ASPM、ACOX3、CDC45L、SLC40A1及AGR2的抗体来源。

表1，例示性抗体市售来源

产生抗体(例如，单克隆或多克隆抗体)的方法在本领域中为习知的(例如，Harlow和Lane，抗体：实验室手册(Antibodies:ALaboratoryManual)，冷泉港实验室，纽约(ColdSpringHarborLaboratory,NewYork)，1988年)。例如，在表2中所列的蛋白质，像是ASPM、ATP9A、ACOX3、CDC45L、SLC40A1、或AGR2之一的胜肽片段，可被偶联至载体分子(或编码这些表位(epitope)的核酸)，可注入到非人类哺乳动物(例如，小鼠或兔子)，随后加强注射以产生抗体反应。从免疫动物分离的血清可分离出包含在其中的多克隆抗体，或者来自免疫动物的脾脏可用于融合瘤(hybridomas)及单克隆抗体的生产。抗体可在使用前进一步纯化。

本文揭露的方法中所使用的适配体包含单股核酸分子(例如DNA或RNA)，其呈现一或多个特定的序列特异性形状且以高亲和力及特异性结合至表2中所列的基因蛋白质产物之一。在另一范例中，适配体是以高亲和力及特异性结合至表2中列出的基因蛋白产物之一的胜肽适配体。胜肽适配体包括胜肽环(peptideloop)，其对于蛋白质支架附接在两端之标靶蛋白具特异性。该支架可以是稳定的、可溶的、小的、及无毒的任何蛋白质。胜肽适配体选择可使用不同系统进行，像是酵母双杂合系统或LexA相互作用陷阱系统(LexAinteractiontrapsystem)。

在特定实施方式中，试剂盒可包括载体装置，如盒、袋、瓶、管、手提袋、塑料箱、包装、或其它容器。在一些例子中，试剂盒组件将被封闭在可具有隔室之单一包装单元内，试剂盒的一或多个组件可放置于其中。在其它范例中，试剂盒包括一或多个容器，其可保留，例如，一或多种待进行测试的生物样本。在一些实施方式中，试剂盒可包括缓冲剂及可用于特定揭露方法实践中的其它试剂。这样的试剂盒及适宜内容系为本领域技术人员所习知。

B.阵列

设想用于协助本揭露方法的实践之微阵列。对基因或蛋白质作侦测的微阵列在本领域中为习知的。微阵列包括一固体表面(例如，玻璃载玻片)，其上固定有多个(例如，几百或几千)特异性结合剂(例如，cDNA探针、mRNA探针、或抗体)。该特异性结合剂在阵列上依可寻址(例如，网格)之形式而清楚地定位。该特异性结合剂与样本中存在的同源标靶相互作用。所有固定试剂之标靶结合模式提供了基因表达的分析。代表性微阵列描述于例如，美国专利号5412087、5445934、5744305、6897073、7247469、7166431、7060431、7033754、6998274、6942968、6890764、6858394、6770441、6620584、6544732、6429027、6396995及6355431。

本文揭露对表2列出的基因或基因产物之至少三个作检测的核酸或蛋白质阵列。在特定实施方式中，揭露的阵列由对至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个或全部28个揭露基因具特异性之结合剂组成。在特定的实施方式，阵列由对ASPM、ATP9A和ACOX3具特异性的核酸探针或抗体组成。在另一特定实施方式中，阵列由对ASPM、ATP9A、ACOX3、CDC45L、SLC40A1及AGR2具特异性的核酸探针或抗体组成。在另一特定实施方式中，阵列由对ASPM、ATP9A、ACOX3、CDC45L、SLC40A1、AGR2、ATP11C、FAM72A、PLA2G10、MATN2、APITD1及KIF11具特异性的核酸探针或抗体组成。其它阵列实施方式由对表2所列的28个基因之每一个具特异性的核酸探针或抗体所组成，包括ASPM、ATP9A、ACOX3、CDC45L、SLC40A1、AGR2、ATP11C、FAM72A、PLA2G10、MATN2、APITD1、KIF11、HPGD、HMMR、ELF3、PTTG1、UPP1、CCNB2、CREG1、ARSD、CENPN、SMC4、DLGAP5、PIK3AP1、TLR3、TWIST1、GCLM及CTSS。在特定实施方式中，阵列还包括对一或多个管家基因或其基因产物，像是mRNA、cDNA或蛋白质，具特异性之核酸探针或抗体。

形成阵列的核酸探针或抗体可直接连结至支持物或藉由寡核苷酸或作用为固体支持物的间隔物或连接物的其它分子而附接至支持物。

阵列固体支持物可为玻璃载玻片或由有机聚合物所形成。各种阵列型式可依据特定实施方式来执行。举例而言，寡核苷酸条带的线性阵列、离散细胞的二维图案、或其它型式(例如，美国专利号5981185)。

合适的阵列可藉以各种方法来制备。在一个范例中，寡核苷酸或蛋白质序列系分别合成，然后附着到固体支持物(例如，美国专利号6013789)。在另一个例子中，序列被直接合成到支持物上，以设置期望阵列(例如，美国专利号5554501)。寡核苷酸探针可透过寡核苷酸的3'端或寡核苷酸的5'端被结合到支持物。

定义

如本文所使用，“胰脏癌”指恶性哺乳动物癌症，特别是，源自外分泌胰腺组织内上皮细胞之腺体癌症。在本申请中所涵盖的胰脏癌包括转移性及非转移性癌症。

如本文所使用，“腺体癌症”指源于腺上皮的恶性肿瘤，其中包括但不限于外分泌胰腺(胰腺癌)、乳腺(乳癌)、前列腺腺体(前列腺癌)、结肠上皮(结肠癌)、胃上皮(胃癌)、唾液腺(唾液腺癌)、肾上腺(肾上腺癌)及甲状腺(甲状腺癌)。

术语“分化”指于发育期间器官或组织的结构或功能之一般性或特异性变化。分化概念在本领域为习知的，且不需要在此进一步说明。例如，胰脏细胞分化表示其中包括正常胰腺腺体的腺体结构形成之过程，及/或激素或分泌功能之获得。

术语“癌症干细胞”指的是可自我更新、在肿瘤肿块产生多种细胞、或在宿主内起始肿瘤之癌症细胞亚族群。

如本文所使用，术语“临床预后”指患有胰脏癌之受试者之结果，包括肿瘤复发之似然度、存活、疾病进展、及对治疗的反应。胰脏癌治疗(例如，胰脏切除术)后的复发表示了较具侵袭性的癌症、宿主(例如，胰脏癌病患)的较短存活期、肿瘤大小、体积或数目的增加似然度、及/或治疗失败的增加似然度。

如本文所使用，术语“评估临床预后”指提供胰脏癌的可能病程或结果的评估，包括转移、多重抗药性、无发病存活、总存活、复发等的评估。该方法也能用来拟出用于治疗癌症的合适疗法，例如，藉由指出癌症是否仍处于早期阶段，或者癌症已经进程到积极治疗(aggressivetherapy)将无效之阶段。

如本文所使用，术语“复发”指初始或后续处理后胰脏癌的再犯。代表性治疗包括任何手术形式(如胰头十二指肠切除术或惠尔普手术(Whippleprocedure)、远程胰脏切除术、部分胰脏切除术，以及和全胰脏切除术)、任何放射治疗形式、任何化学治疗或生物治疗形式，任何激素治疗形式。在一些实施方式中，胰脏癌的复发是由胰脏癌提升之血清或血浆标记所标明，像是醣类抗原19-9(CA19-9)(Koprowski等人，1981年)和癌胚抗原(CEA)(Gold和Freedman，1965年)，及/或藉由自胰脏癌受试者的任何生物样本作胰脏癌细胞的鉴定。

如本文所使用，术语“疾病进展”指虽给予治疗但其中胰脏癌的一或多个指数(例如，血清CA19-9或CEA量、可测量的肿瘤大小或体积、或者新的病灶)显示疾病仍正在进展之情况。

“ASPM”、“ATP9A”、“ACOX3”、“CDC45L”、“SLC40A1”、“AGR2”及其它在此陈述的分子标记，包括表2中所示者，系指核酸，例如，基因、pre-mRNA、mRNA、及多肽，多型变体、对偶基因、突变、及种间同源物，其中：(1)具有一氨基酸序列，其对于由本文描述之参考核酸或氨基酸序列所编码的多肽具大于约60％氨基酸序列相似性，65％、70％、75％、80％、85％、90％、优选地为91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的氨基酸序列相似性，优选地，至少超过约25、50、100、200、500、1000或更多氨基酸区域的区域；(2)特异接合至针对免疫原所培养之例如多克隆抗体的抗体，免疫原包括参考的氨基酸序列、其免疫原片段、及其保守性修饰变体；(3)在严苛杂合条件下得以特异性杂合至编码参考氨基酸序列的核酸、及其保守性修饰变体；(4)具有一核酸序列，对参考核酸序列具有大于约60％的核苷酸序列相似性、65％、70％、75％、80％、85％、90％、优选地91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的核苷酸序列相似性，优选地至少约10、15、20、25、50、100、200、500、1000、或更多核苷酸之区域。多核苷酸或多肽序列通常来自哺乳动物包括，但不限于，灵长类动物，例如，人；囓齿动物，例如大鼠、小鼠、仓鼠；牛、猪、马、羊、或任何哺乳动物。特定实施方式的核酸及蛋白质包括天然存在或重组的分子。这些抗原的截断和选择式剪接形式都包括在其定义中。

“差异地表达”或“差异地调控”之用语通常指相较于特定实施方式内容的至少一个其它样本，在一样本中过量表达(上调控)或压抑表达(underexpressed)(下调控)蛋白质或核酸。

术语“分子标记”、“基因标记”、“癌症相关抗原”、“肿瘤特异性标记”、“肿瘤标记”、“标记”或“生物标记”可互换地指在细胞中差异地表达之分子或基因(通常为蛋白质或核酸诸如RNA)，其相较于非癌细胞或其它癌细胞表达在癌细胞的表面上或由癌细胞分泌，并且对于癌症诊断是有用的，以提供预后及癌细胞药理学试剂的选定标靶。在特定实施方式中，癌症相关抗原是相较于非癌细胞或其它癌细胞在癌细胞内过量表达或压抑表达的分子，例如相较于非癌细胞具超过1倍的表达、2倍的过量表达、3倍的过量表达或更多，或例如相较于非癌细胞之20％、30％、40％、50％或更多之压抑表达。在特定实施方式中，与癌症相关的抗原是在癌症细胞内不适当地合成之分子，例如，相较于非癌细胞内表达的分子，包含缺失、添加或突变的分子。在特定实施方式中，与癌症相关的抗原将仅仅表达在癌细胞的细胞表面上，而不会在正常细胞的表面上被合成或表达。例示性的细胞表面之肿瘤标记包括醣类抗原19-9(CA19-9)(Koprowski等人，1981年)及癌胚抗原(CEA)(Gold和Freedman，1965年)。在特定实施方式中，与癌症相关的抗原将非主要在癌细胞的表面上表达。

将为本领域技术人员理解的是，标记可为了任何用途而单独或与其它标记组合来使用，例如，在本文揭露之多重抗药性癌症的诊断及预后。

“生物样本”包括组织之切片如活体组织切片及尸体剖检样本、以及用于组织学用途所取得的冷冻切片。这样的样本包括胰脏癌组织、血液和血液成分或产物(例如，血清、血浆、血小板、红血球及类似物)、痰、组织、培养细胞，例如，初代培养、外植体、及转型细胞、粪便、尿等。生物样本通常是从真核有机体取得，最优选的是哺乳动物，例如灵长类，如黑猩猩或人；牛；狗；猫；囓齿动物，例如，天竺鼠、大鼠、小鼠；兔子；或鸟；爬虫类；或鱼。

“活体组织切片”指用于诊断或预后评估之移除组织样本的过程，及其组织样本。任何本领域已知的活体组织切片技术可被应用于特定实施方式的诊断及预后方法。活体组织切片技术的应用，除去其它因素外，将取决于要进行评估之组织类型(例如，胰脏癌等)、肿瘤大小及类型。代表性活体组织切片技术包括但不限于切除式活体组织切片检查(excisionalbiopsy)、切开式活体组织切片检查(incisionalbiopsy)、穿刺活体组织切片检查(needlebiopsy)、手术活体组织切片检查、以及骨髓活体组织切片检查。“切除式活体组织切片检查”指对整个肿瘤肿块与其周围正常组织作小幅度的移除。“切开式活体组织切片检查”指包括肿瘤横截面直径之组织楔形切除。经内视镜或荧光检查作的诊断或预后可一般涉及从目标组织内的细胞悬浮液所获得之“粗针穿刺活体组织切片检查”或“细针穿刺活体组织切片检查”。活体组织切片技术被探讨于，例如，哈里森的内科医学原理(Harrison’sPrinciplesofInternalMedicine)，Kasper等人，编，第16版，2005年，第70章，以及整个第五部分(PartV)。

“核酸”指为单股或双股任一形式之脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物、及其互补物。该术语包括含有已知核苷酸类似物或修饰骨架基或键结之核酸，其为合成的、天然存在的及非天然存在的，具有如同参考核酸之类似结合特性，且以类似参考核苷酸的方式代谢。这些类似物的实例包括，但不限于，硫代磷酸酯(phosphorothioates)、磷酰胺酯(phosphoramidates)、甲基磷酸酯(methylphosphonates)、手性甲基磷酸酯(chiral-methylphosphonates)、2-O-甲基核糖核苷酸(2-O-methylribonucleotides)、肽核酸(peptide-nucleicacids,PNAs)。

除非另有说明，特定核酸序列也隐含地涵盖其保守性修饰变体(例如，简并密码子置换(degeneratecodonsubstitution))及互补序列、以及明确指出的序列。具体而言，简并密码子置换可透过产生序列来达成，其中一或多个所选的(或所有)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基(residue)置换(Batzer等人，核酸研究期刊(NucleicAcidRes.)，19:5081(1991年)；Ohtsuka等人，生物化学期刊(J.Biol.Chem)，260:2605-2608(1985年)；Rossolini等人，分子与细胞探针期刊(Mol.Cell.Probes)，8:91-98(1994年)。术语核酸与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸及多核苷酸系互换地使用。

特定核酸序列也隐含地涵盖“剪接变体”及编码癌症生物标记的截断形式之核酸序列。类似地，由核酸编码的特定蛋白质隐含涵盖由剪接变体或该核酸的截断形式所编码的任何蛋白质。“剪接变体”，顾名思义，是一个基因选择式剪接的产物。转录后，初始的核酸转录本可能被剪接，使得不同(交替)的核酸剪接产物编码不同的多肽。用于剪接变体生成的机制各不相同，但包括外显子的选择式剪接。源自由通读转录相同核酸的交替多肽也包括在这个定义中。剪接反应的任何产物，包括剪接产物的重组形式，都包括在这定义中。核酸可在5'端或3'端被截断。多肽可在其氨基末端(N-terminal)或羧基末端(C-terminal)被截断。核酸或多肽序列的截断形式可能天然地存在或由重组所创造。

术语“多肽”，“胜肽”和“蛋白质”在本文中可互换用于指氨基酸残基的聚合物。该术语应用于氨基酸聚合物，其中一或多个氨基酸残基系相应天然存在的氨基酸之人工化学仿真物(mimetics)，以及天然存在的氨基酸聚合物及非天然存在的氨基酸聚合物。

术语“氨基酸”是指天然存在及合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式作用之氨基酸类似物及氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸为由遗传密码所编码，且后来经修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸(hydroxyproline)、γ-羧基谷氨酸(γ-carboxyglutamate)及O-磷酸丝氨酸(O-phosphoserine)。氨基酸类似物系指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构之化合物，即，结合到氢、羧基、氨基、及R基团的α碳，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲基甲硫氨酸锍(methioninemethylsulfonium)。这种类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但以类似于天然存在的氨基酸之方式作用之化学化合物。

氨基酸可于此藉由通常习知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUBBiochemicalNomenclatureCommission)所建议的一单字母符号来指代。同样地，核苷酸可通过其普遍接受的单一字母码所表示。

“保守性修饰变体”适用于氨基酸和核酸序列。相对于特定核酸序列，保守性修饰变体指编码相同或基本相同的氨基酸序列之核酸，或其中所述核酸在不编码氨基酸序列时系为基本相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任意给定蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在其中藉由密码子指定为丙氨酸的每个位置中，该密码子可替换成任何相应描述的密码子而不会改变所编码的多肽。此类核酸变异是“沉默变异”，为保守性修饰变异的一种。本文中编码多肽的每一个核酸序列还描述了核酸的每种可能的沉默变异。技术人员将认知到在核酸中的每个密码子(除了AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子，及TGG，通常是色氨酸的唯一密码子)可被修饰以产生功能相同的分子。因此，核酸，相对于表达产物而非相对于实际的探针序列来编码多肽的核酸之每个沉默变异系隐含在每个描述序列内。

至于氨基酸序列，技术人员将认知到，对核酸、胜肽，多肽或蛋白质序列之个别取代、缺失或添加，在所编码的序列中改变、添加或删除单个氨基酸或氨基酸的一小部分是“保守性修饰变体”，其中变更致使氨基酸为化学上相似氨基酸的置换。提供功能相似氨基酸的保守置换在本领域为习知的。此类保守性修饰变体不单只有多型变体、种间同源物、及特定实施方式的对偶基因。

下列八组每个皆含有相对彼此为保守取代之氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天门冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见，例如，Creighton，蛋白质(Proteins)(1984年))。

一个“标签”或“可侦测部分”是藉由光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学、或其它物理方法可侦测的成份。例如，有用的标签包括可为可侦测的磷32(32P)、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如，在ELISA中通常使用的)、生物素、长叶毛地黄配质、或半抗原及蛋白质，例如，藉由并入放射性标签至胜肽或用于检测与胜肽特异性反应的抗体。

对于PCR而言，一般约36℃的温度系用于低严谨度扩增，尽管退火温度可能取决于引物长度而在约32℃及48℃之间变动。对于高严谨度PCR扩增来说，约62℃的温度为代表标准，尽管高严谨度退火温度范围取决于引物长度及特异性而可介于约50℃至约65℃。高低严谨度扩增的标准循环条件包括90℃-95℃的变性阶段(denaturationphase)30秒至2分钟、退火阶段(annealingphase)持续30秒至2分钟、以及约72℃的扩展阶段(extensionphase)1至2分钟。高低严谨度扩增反应的指南准则被提供于，例如，在Innis等人，(1990年)PCR指南，方法及应用指导(PCRProtocols,AGuidetoMethodsandApplication)，学术出版社，纽约(AcademicPress,Inc.N.Y.)。

“抗体”是指包含特异性地结合及辨识抗原之来自免疫球蛋白基因或其片段的骨架区域(frameworkregion)的多肽。辨识免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε及μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为κ或λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε，从而定义了免疫球蛋白分类，分别为IgG、IgM、IgA、IgD及IgE。通常，抗体的抗原结合区对于结合特异性及亲和力而言将为最关键处。

例示性的免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体(tetramer)。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每一对具有一个“轻”链(约25kD)、以及一个“重”链(约50-70kD)。每条链的氨基末端定义了主要负责抗原识别的可变区之约100至110或更多个氨基酸。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指这些轻链和重链。

抗体存在，例如，作为完整免疫球蛋白或作为数个由各种胜肽酶分解而产生的充分表征片段。因此，例如，胃蛋白酶消化枢纽区(hinge)之双硫键结(disulfidelinkage)以下的抗体以产生F(ab)'2，Fab二聚体，其自身透过双硫键(disulfidebond)而连接到VH-CH1的轻链。F(ab)'2可在温和条件下被还原以打破枢纽区内的双硫键结，从而将F(ab)'2二聚体转化为Fab'单体。所述Fab'单体实质上是Fab及枢纽区的一部分，参见基础免疫学(FundamentalImmunology)(Paul编，第3版，1993年)。虽然各种抗体片段系根据完整抗体的分解来定义，技术人员将理解的是这样的片段可以化学方法或透过使用重组DNA方法学来从头合成。因此，术语抗体，如本文所用，还包括抗体片段，无论是透过完整抗体的修饰来产生、或使用重组DNA方法学来从头合成(例如，单链Fv)，或使用噬菌体展示库(phagedisplaylibrary)来定义(参见，例如，McCafferty等人，自然期刊(Nature)，348:552-554(1990年))。

为了制备抗体，例如，重组、单克隆、或多克隆抗体，可使用多种本领域习知技术(参见，例如，Kohler及Milstein，自然期刊(Nature)，256:495-497(1975年)；Kozbor等人，今日免疫学期刊(ImmunologyToday)，4:72(1983年)；Cole等人，单克隆抗体和癌症治疗(MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy)第77-96页，AlanR.Liss公司(1985年)；Coligan，免疫学的通用指南(CurrentProtocolsinImmunology)(1991年)；Harlow及Lane，抗体，实验室手册(Antibodies,ALaboratoryManual)(1988年)；以及Goding，单克隆抗体：原理与实践(MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractic)(第2版，1986年)。编码感兴趣抗体的重链及轻链的基因可从一个细胞来复制，例如，编码单克隆抗体的基因可从融合瘤来复制，并且用于产生重组单克隆抗体。编码单克隆抗体的重链及轻链的基因库(genelibrary)也能从融合瘤或浆细胞来制造。重链及轻链基因产物的随机组合产生具有不同抗原特异性的大量抗体(参见，例如，Kuby，免疫学(Immunology)，(第3版，1997年))。用于单链抗体或重组抗体的生产技术(美国专利号4946778，美国专利号4816567)可适用于产生针对特定实施方式多肽之抗体。此外，转基因的小鼠、或其它有机体如其它哺乳类，可被用于表达人源化或人类抗体(参见，例如，美国专利号5545807、5545806、5569825、5625126、5633425、5661016；Marks等人，生物-技术期刊(Bio/Technology)，10:779-783(1992年)；Lonberg等人，自然期刊(Nature)，368:856-859(1994年)；Morrison，自然期刊(Nature)，368:812-13(1994年)；Fishwild等人，自然生物技术期刊(NatureBiotechnology)，14:845-51(1996年)；Neuberger，自然生物技术期刊(NatureBiotechnology)，14:826(1996年)；以及Lonberg及Huszar，国际免疫学期刊(Intern.Rev.Immunol)，13:65-93(1995年))。另外，噬菌体展示技术可用于鉴定特异性结合至选取抗原之抗体及异质Fab片段(参见，例如，McCafferty等人，自然期刊(Nature)，348:552-554(1990年)；Marks等人，生物-技术期刊(Bio/Technology)，10:779-783(1992))。抗体也可被制成双特异性，亦即，能够辨识两种不同的抗原(参见，例如，WO93/08829，Traunecker等人，欧洲分子生物学组织期刊(EMBOJ)，10:3655-3659(1991年)；以及Suresh等人，酶学方法(MethodsinEnzymology)，121:210(1986年))。抗体也可为异源耦联(heteroconjugates)，例如，两个共价连接抗体，或免疫毒素(参见，例如，美国专利号4676980，WO91/00360、WO92/200373；以及EP03089)。

用以人源化或灵长类化(primatizing)非人类抗体的方法在本领域中为习知的。通常，人源化抗体具有从非人类来源引介至其内的一或多个氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基常被称为输入残基(importresidue)，其通常取自输入可变结构域(importvariabledomain)。人源化可基本上依照Winter及其同事的方法藉由置换囓齿动物互补性决定区(complementaritydeterminingregion,CDR)或CDR序列为人类抗体的相应序列而执行(参见，例如，Jones等人，自然期刊(Nature)，321:522-525(1986年)；Riechmann等人，自然期刊(Nature)，332:323-327(1988年)；Verhoeyen等人，科学期刊(Science)，239:1534-1536(1988年)以及Presta，结构生物学当前观点期刊(Curr.Op.Struct.Biol)，2:593-596(1992年))。因此，这样的人源化抗体为嵌合抗体(美国专利号4816567)，其中基本上少于一完整人类可变结构域系由源自非人类物种的相应序列所置换。在实践中，人源化抗体通常是人类抗体，在其中一些CDR残基及可能的一些基本骨架区域(FR)残基被来自囓齿动物抗体内类似位的残基所取代。

“嵌合抗体”是其中(a)恒定区或其一部分被改变、替换或交换之抗体分子，使得抗原结合位(antigen-bindingsite)(可变区)连接至不同或改变的类别、效器功能(effectorfunction)及/或物种的恒定区，或赋予嵌合抗体新属性之完全不同的分子，例如，酶、毒素、激素、生长因子、药物等；或(b)可变区或其一部分以具有不同或改变的抗原特异性的可变区被改变、替换或交换。

在一个实施方式中，所述抗体系缀合至“效器”部分。效器部分可为任何数目的分子，包括标签部分像是放射性卷标或荧光卷标、或可为治疗部分。在一个方面中，抗体调变蛋白质活性。

通常在蛋白质及其它生物制剂的异质群集中，当词组“特异性(或挑选性)结合”至抗体或“特异性(或挑选性)与…免疫反应”论及蛋白质或胜肽时，系指测定蛋白质存在的结合反应。因此，在指定免疫测定条件下，以背景至少两倍使指定抗体结合至特定蛋白质，且较通常以背景大于10至100倍。这样的条件下对抗体特异性结合可包括选择用以针对特定蛋白质之抗体。举例而言，多克隆抗体可被选择以获得仅特异性与选取抗原进行免疫反应且不会与其它蛋白质免疫反应的多克隆抗体。这个选择可藉由删去与其它分子交叉反应的抗体来达成。多种免疫测定型式可被使用，以选择与特定蛋白质特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定系常规地用于挑选与蛋白质特异性免疫反应的抗体(参见，Harlow及Lane，抗体，实验室手册(Antibodies,ALaboratoryManual)(1988年)，说明可用以测定特异性免疫反应的免疫测定型式及条件)。

实施例

下面的实施例仅被提供用于说明目的，而非旨在限制，除非另有说明。应当被本领域技术人员理解的是，在由发明人发现的下列技术实施例内所揭露的技术，在特定实施例的实践中运作良好。本领域的技术人员应当理解，许多变更可在所揭露之特定实施例内进行，且仍依获得相同或类似结果，而不脱离本揭露的精神及范畴。

实施例1

本实施例描述与胰腺上皮小管(pancreaticepithelialtubule)分化相关的基因表达谱之鉴定。

前列腺腺体的小管分化过程系藉由在生理相关的三维(3D)培养模式内培养永生化胰腺上皮细胞(HPDE细胞)而被概括，如之前(Weaver等人，1997年)中描述。为人类乳突状病毒-E6和-E7基因永生化的胰腺导管上皮细胞(Bello等人，1997年；Liu等人，1998年)之人类胰腺导管上皮(humanpancreaticductalepithelial,HPDE)细胞，系在组织培养塑料上被培育于角质细胞-SFM内(西格玛-奥德里奇公司，圣路易斯，密苏里州)，补充有牛脑垂体萃取物(bovinepituitaryextract)、10ng/ml的EGF、0.5％马血清和抗生素(Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加州(Invitrogen,Carlsbad,CA))。HPDE细胞被接种于厚层的3D重组基底膜凝胶(Matrigel，BD生物科学事业(BDBiosciences))的顶部。细胞相对高的接种密度(4×104/cm2)被用来促进细胞对细胞之相互作用以及随后的组织形态演发过程。将培养物维持在补充有牛脑垂体萃取物、10ng/ml的表皮生长因子及抗生素(均来自Invitrogen公司)的角质细胞-SFM内(西格玛-奥德里奇公司)。

如第1图所示，当在短期期间(48小时)背景下培养时，HPDE细胞长成无组织的丛块或缺乏细胞极化或组织架构的索状。依据三维培养延长时间(6-8天)，HPDE细胞发生结构组织化，致使会让人联想到在低层次PDAC中所发现之外分泌胰腺管或小管构造的分支小管样结构的形成。共焦图像分析揭示这些小管由单层极化细胞，其由基底表面标记α6-整合素(α6-integrin)及粘着连接蛋白β-连环蛋白的偏极表达表示、以及无细胞管腔所组成。

为剖析与此胰腺管分化过程相关的基因表达之变化，总体基因表达谱(globalgeneexpressionprofiling)实验在形成于早期培养的HPDE细胞丛以及形成于后期的小管上进行。简言之，总RNA样本使用TRIZOL(Invitrogen公司)来萃取，且接着使用RNeasy迷你试剂盒和DNase处理(凯杰(Qiagen))纯化。实验以三重复进行。基因谱分析按照生产商(Affymetrix公司)的指南在Affymetrix人类基因组U133A2.0PlusGeneChip平台上进行。杂合强度数据使用GeneChipOperating软件(Affymetrix公司)处理，且基因基于Affymetrix公司的P/A/M标志过滤，以保留存在于所述至少一个培养条件内的至少三个重复样本的基因。过滤标准(P<0.01，藉由司徒顿的t检定(Student’sttest)，倍数变化>2.0X)被用来选择在对照组内差异地表达的基因。

如第2A图显示，其转录量在HPDE细胞之小管形态演发期间具显著地变化之620个独特基因的清单系透过基因表达谱实验被鉴定。作为比较，只有少数基因(18个基因)在PANC-1肿瘤细胞球体的形成过程期间被发现为差异地表达。

如第2B图显示，指明胰腺外分泌功能的几个基因，包括CEL(胆盐刺激脂酶(bilesalt-stimulatedlipase))、CA9(碳酸酐酶9(carbonicanhydrase9))、MUC1(粘蛋白1)、AGR2(前梯度同源物2)、以及MUC20(粘蛋白20)，在小管形态演发期间(白色管柱)系显著地为上调控(高达26.9倍)，而其表达在肿瘤球形成期间则维持不变。免疫印迹分析证实在这些胰腺功能标记中小管生成-特异表达的变化(第2C图)。这些发现提供有力支持针对本组织组成模型系作为有效途径用以捕捉对外分泌胰腺上皮的结构及功能分化过程具特异性的分子讯号。

实施例2

本实施例基于与胰腺小管分化相关的分子分析描述胰脏癌28个基因之预后模型的鉴定。

由于组织微体系结构(microarchitecture)的破坏是包括PDAC的腺体癌症的标志特征之一(Adsay等人，2005年；Gleason，1992年；Rakha等人，2008年；Stamey等人，1999年)，故调查与胰腺上皮小管生成相关的基因表达谱是否可在PDAC中带出预后讯息。绘制了620个小管生成相关基因至UCSF的数据组)(Collisson等人，2011年)，并根据Cox模型建造“风险分数”来评估病患的总存活率。使用先前描述之经修改的监督方法(Wang等人，2005年)。简言之，对于每个基因，单变量Cox回归分析被使用，以测量基因的表达量(依log2标准)与病患生存长度之间的相关性。构建病患定群之1000笔自助抽样(bootstrap)的样本，并在每个样本上执行Cox回归分析。接着藉由计算1000笔自助抽样样本的中位数P值及中位数Cox系数，来对每个基因分别测定估计的P值和估计的标准Cox回归系数。择取基因系接着根据所估计的P值排序，并且透过每次重复地从递降排序列表的顶部添加一种以上的基因，从排序在前的前三名基因开始，来产生多组基因。然后计算出“风险分数”(方程式1)，以测量针对基因组之病患的死亡风险：

R i s k s c i r e = Σ_{i = 3}^{k} b_{i} x_{i}

(方程式1)

其中，k是探针组的探针数，bi是针对第i个探针之标准化Cox回归系数，而xi是针对第i个探针之log2表达量。

对每个选定探针组的一致性指数(C-指数)系用以在存活分析内评估评估精确度(Pencina和D’Agostino，2004年)。C指数统计分析，在统计程序语言R(cran.r-project.org)使用“survcomp”封包(package)进行。达到最大评估精确度而同时含有最少数目的基因之基因组系被选择为最佳的预后评估因子。

如第3图显示，透过此方法，挑选了28个基因的组别，其在预后评估中之表达当以C-指数来评估时系达到水平顶。

表2显示28个选取基因的鉴定。

表2，28个基因印记之基因描述

第4图显示，基于风险分数(方程式1)，这28个基因印记的表达谱可非常有效地藉由以Kaplan-Meier分析来分层PDAC病患的三个独立定群之死亡风险，其中包括UCSF定群、JHMI定群、以及NW/NSF定群(对数秩检定，P≤0.001)。例如，在UCSF数据组内，高危险群之病患具术后预后不良，总存活期中位数4.9个月，而低风险群之病患表现良好，总存活期中位数21.6个月。第4图也显示，根据多变量Cox比例风险分析，这28个基因印记是PDAC的这些病患定群中最有力的存活预后评估因子，且其评估显著地优于临床及病理准则，包括年龄、肿瘤病理分级、及肿瘤阶段或淋巴结状态。

如表3所示，多变量Cox回归分析表明，这28个基因模型针对PDAC在三个独立临床数据组中提供了有力且独立的预后信息。

表3，基于28个基因风险分数及临床病理准则来评估总存活率的多变量Cox回归模型

CI:信赖区间。

*P<0.05

**该临界以最大值Youden’s指数决定。

表4显示28个基因模型在三个独立数据组中明显地增进结合的临床模型之预后精确度，其包含临床及病理变量(P＝0.000-0.011)，且更优于先前报告的PDAC预后基因印记，包含62个基因的“PDAssigner”以及6个基因的“转移印记”(Collisson等人，2011年；Stratford等人，2010年)。

表4，以C指数评估之PDAC病患的三个独立定群中，不同预后评估模型的评估精确度

C指数：一致性指数；CI：信赖区间。

＊临床生理准则包含年龄、肿瘤分级、T阶段及N阶段状态。

＊＊PDAC据报的分子亚型依62个基因印记所定义，“PDAssigner”；CollissonEA等人，自然医学期刊，2011年；17:500-503(CollissonEA,etal.Nat.Med.2011；17:500-503)。

＊＊＊六个基因转移印记包含FBJ鼠类骨肉瘤病毒致癌基因同源物B(murineosteosarcomaviraloncogenehomologB,FOSB)、Kruppel类因子6(Kruppel-likefactor6,KLF6)、B细胞抑制子内κ轻多肽基因增强子的核因子ζ(nuclearfactorofkappalightpolypeptidegeneenhancerinB-cellsinhibitor,zeta,NFKBIZ)、三磷酸腺苷酶H+/K+交换(ATPaseH+/K+exchanging)、α多肽(alphapolypeptide,ATP4A)、生殖细胞相关基因1(germcellassociated1,GSG1)、以及唾液酸结合Ig类似物凝集蛋白11(sialicacidbindingIg-likelectin11,SIGLEC11)；StratfordJK等人，公共科学图书馆医学期刊(PLoSMed.)，2010年；7(7):e1000307。

实施例3

本范例描述人类PDAC内ASPM及表2所列出的选取标记的预后值。

第5图显示表2中所列的最上面12个选取基因标记可单独地区分PDAC病患为两群，其展现手术后死亡风险的显著差异(P＝0.001-0.045以对数秩检定)。

在表2的28个基因印记组成基因中，基因ASPM在胰腺小管分化期间展现最优异的转录变化。PDAC病患之ASPM的表达与临床结果相关，且发现其肿瘤表达ASPM高转录量之病患在纵跨三个独立的病患定群内表达不佳(P＝0.001-0.034以对数秩检定；第6图)。

实施例4

此范例描述胰脏癌预后的ASPM角色。

为了评估ASPM是否在胰腺肿瘤生成发挥作用，我们进行Oncomine表达分析(https://www.oncomine.com/resource/login.html)，并发现相对于正常胰腺导管ASPM的转录量在人类PDAC组织中显著地增加(第7A图)(Grutzmann等人，2004年)。调查胰腺上皮细胞株之片块的ASPM转录量，包括AsPC-1、BxPC-3、HPDA、MiaPaCa-2及PANC-1细胞。相对于HPDE细胞，在大部分PDAC细胞内ASPM表达为上调控(第7B图)。

为了进一步调查ASPM在PDAC细胞内的生物功能，稳定地藉由使用慢病毒媒介的RNA干扰(RNAi)来下调控其在PDAC细胞的表达。根据制造商规程，借着使用验证的短发夹RNA(shRNA)寡核苷酸在慢病毒载体(lentivector)pLKO.1-puro(MISSONshRNA慢病毒；西格玛-奥德里奇公司，圣路易斯，密苏里州)中使持续ASPM剔除(knockdown)得以实现。选取殖株是：ASPM(TRCN0000118905及TRCN0000291125)、以及非标靶对照(SHC002V)。第8A图显示藉由免疫印渍分析所验证的ASPM剔除量。

如第8B图显示，转移性AsPC-1细胞或原发肿瘤衍生PANC-1细胞中内生ASPM表达的剔除可分别衰减细胞的增殖。

为了获取在PDAC细胞的迁移能力上ASPM沉默的效应，进行了修饰的波伊登室测定。简言之，细胞被接种于Transwell小室(Transwellinsert)(康宁生命科学公司，图克斯伯里，麻州(Corning,Tewksbury,MA))，具PSCs接种于Transwell的下部隔室。于24小时培养期间后，侵入过滤器的细胞被固定并以DAPI染色。迁移的细胞系使用荧光显微镜进行计数。如示于第8C图，相应于胰腺星状细胞，ASPM表达沉默系显著地衰减AsPC-1及PANC-1细胞的细胞迁移。

ASPM在PDAC细胞中生长及迁移的角色引领至其可在活体内促使PDAC进展的可能性。为解释这种可能性，在对照或ASPMshRNA转导的AsPC-1细胞内稳定地表达萤火虫荧光素酶报导子(reporter)，并且原位(ortho-topically)植入至NOD-SCID小鼠的胰脏尾部。事实上，表达ASPMshRNA的肿瘤相较于对照肿瘤系显著地生长的较为缓慢，移植4周之后达到约对照肿瘤的三分之一大小(第9A图)。

如示于第9B图，与抱有对照肿瘤的小鼠相比，有ASPM缺陷肿瘤的动物展现出显著延长之存活率，使得这些动物具大于对照动物平均为37％(16.5天)之存活期(对数秩检定P<0.001)。

实施例5

本实施例描述Wnt信号通路中及PDAC细胞内β-连环蛋白蛋白质的稳定性中，ASPM的角色。

为了深入了解PDAC中ASPM致癌作用底下的分子机制，比较对照与ASPMshRNA转导的AsPC-1细胞中的转录体。借着使用基因组富集分析(GSEA)调查全基因表达谱，而发现KEGGWnt信号通路在分化基因表达谱(第10A图)内于基因组中为显著富集的(P<0.001)。

为评估是否ASPM调控Wnt路径活性，在AsPC-1细胞中表达Wnt报导(转殖)构造(construct)。细胞根据生产商的规程以CignalLentiTCF/LEF报导子(凯杰公司(Qiagen))所转导。在以重组人类Wnt-3a(250ng/mL16小时；R&D系统，明尼阿波利斯，明尼苏达州(R&DSystems,Minneapolis,MN))或载体之细胞刺激后，报导基因活性藉由使用ONE-GloTM荧光素酶测定系统来测量(Promega，麦迪逊，威斯康星州((Promega,Madison,WI))。

第10B图显示，当Wnt讯息在AsPC-1细胞内借着正则Wnt配位体Wnt-3a而活化时，ASPM耗乏的细胞展示出剧烈地减弱的Wnt媒介荧光素酶报导基因活性。这个结果证实，ASPM在PDAC细胞内对Wnt信号通路活性而言是功能重要的。

β-连环蛋白是Wnt信号通路的必要下游媒介，且其活化形式频繁地累积于PDAC组织中，而促成PDAC维持(PascadiMagliano等人，2007年；Wang等人，2009年)。为了评估ASPM是否藉由调控β-连环蛋白来调节Wnt信号通路活性，β-连环蛋白的表达系藉由Western印迹分析在对照细胞或ASPMshRNA转导细胞内探测。第11A图显示ASPM表达沉默造成β-连环蛋白的表达在AsPC-1及PANC-1细胞中皆降低。

为了进一步了解被ASPM沉默诱导的β-连环蛋白媒介细胞之影响的下调控，稳定地在ASPMshRNA转导的AsPC-1细胞内表达β-连环蛋白的组成性活性S33Y突变(Kolligs等人，1999年)。事实上，于ASPM-缺陷型细胞内β-连环蛋白的功能活化可恢复其增殖及迁移潜能(第11B图)。

实施例6

本实施例描述胰脏癌干细胞内ASPM的作用。

先前，研究已经指出ASPM在调控神经干细胞的作用(Buchman等人，2011；Horvath等人，2006年)。一致地，发现人类癌症中活化之核心干细胞类基因模块，在与沉默ASPM相关的基因谱(第12A图)(Wong等人，2008年)中以基因组富集分析(P<0.001)为显著富集。这一发现，连同Wnt讯号在肠胃道恶性肿瘤的干细胞样细胞内被报导的作用(PascadiMagliano等人，2007年；Vermeulen等人，2010年)，促使我们调查ASPM是否调控胰脏癌干细胞。

在对照细胞内或ASPMshRNA转导的AsPC-1细胞内，测量了共表达CD44及CD24之细胞比例，其在PDAC内含有富集的癌症干细胞样细胞(Li等人，2007年)。细胞被分离、抗体标记、并重新悬浮在如先前所述的含有DAPI之HBSS/2％FBS(Li等人，2007年)。使用的抗体包括PE抗-CD44，及AlexaFluor647抗-CD24(BD生物科学事业)。流动式细胞测量术(Flowcytometry)系使用FACSCantoII流式细胞仪(BD生物科学事业)来完成。

如第12B图及第12C图所显示，ASPM基因的剔除导致CD44+CD24+肿瘤细胞群集的大幅减少(57.1％)。ASPM维持癌症干性(stemness)的能力提供了其在PDAC内致癌作用之另外机制解释。

为了探讨上述发现的功能关联性，在如前所述的CD44+CD24+AsPC-1细胞流式分类上执行肿瘤球测定(Arensman等人，2013年)。根据制造商的说明书(Invitrogen)，细胞藉由FACS(BDFACSAria^TMIII细胞分选仪，BD生物科学事业)被分选，且肿瘤球于NeurobasalMedia中保持在超低附着板(ultra-lowadherentplate)上(康宁公司，洛厄尔，麻州，美国)。活细胞的相等数目被铺在超低附着板上以产生初级球体。7天后，该微球体的尺寸被测量且拍摄照片。第12D图及第12E图显示ASPM的剔除大幅降低了肿瘤球的生长及尺寸。共同地，这些数据指示ASPM是胰脏癌干性的重要调控物。

实施例7

本实施例描述基于ATP9A、ASPM、ACOX3、CDC45L、SLC40A1、AGR2、ATP11C、FAM72A、PLA2G10、MATN2、APITD1及KIF11表达量的PDAC之12个基因预后模型。

试图减缩PDAC预后印记，并调查是否能使用表2中排序前面之12个基因的表达量，包括ATP9A、ASPM、ACOX3、CDC45L、SLC40A1、AGR2、ATP11C、FAM72A、PLA2G10、MATN2、APITD1及KIF11(Cox回归P值≤0.01)，来建立PDAC的有效预后模型。在PDAC病患的独立定群中基于这些基因的转录量来计算风险分数(方程式1)，包括UCSF定群、JHMI定群、及NW/NSF定群。病患根据风险分数与由最大Youden’s指数所决定的临界值被分级为高风险组或低风险组。

如第13图所显示，基于风险分数，ATP9A、ASPM、ACOX3、CDC45L、SLC40A1、AGR2、ATP11C、FAM72A、PLA2G10、MATN2、APITD1及KIF11的转录量在各病患定群中藉由Kaplan-Meier分析可非常有效地分级死亡风险(对数秩检定，P＝0.001-0.006)。

如表5显示，多变量Cox回归分析表明，这12个基因模型于三个PDAC数据组之每一个中针对PDAC提供独立于临床及病理准则之外有力的预后信息。

表5，在PDAC病患的独立定群内藉由12个基因模型及临床病理准则评估总存活率之多变量Cox回归模型

CI，信赖区间。

*P<0.05

**临界值藉由最大值Youden’s指数来决定。

表6显示，根据C-指数值，在三个独立的数据组中，该12个基因模型的评估精确度优于组合的临床模型及几个先前报导的PDAC预后基因印记。

表6，PDAC病患的独立定群以12个基因模型及不同的预后评估模型由C-指数评估之评估精确度

C指数，一致性指数；CI，信赖区间。

＊临床生理准则包含年龄、肿瘤分级、T阶段及N阶段状态。

＊＊PDAC的报导分子亚型以62个基因印记定义，“PDAssigner”；CollissonEA等人，自然医学期刊，2011年；17:500-503(CollissonEA,etal.Nat.Med.2011；17:500-503)。

＊＊＊六个基因转移印记包含FBJ鼠类骨肉瘤病毒致癌基因同源物B(murineosteosarcomaviraloncogenehomologB,FOSB)、Kruppel类因子6(Kruppel-likefactor6,KLF6)、B细胞抑制子内κ轻多肽基因增强子核因子ζ(nuclearfactorofkappalightpolypeptidegeneenhancerinB-cellsinhibitor,zeta,NFKBIZ)、三磷酸腺苷酶H+/K+子交换(ATPaseH+/K+exchanging)、α多肽(alphapolypeptide,ATP4A)、生殖细胞相关基因1(germcellassociated1,GSG1)、以及唾液酸结合Ig类似物凝集蛋白11(sialicacidbindingIg-likelectin11,SIGLEC11)；StratfordJK等人，公共科学图书馆医学期刊(PLoSMed.)，2010年；7(7):e1000307)。

实施例8

本实施例描述基于ATP9A、ASPM、ACOX3、CDC45L、SLC40A1及AGR2表达量的PDAC之六个基因预后模型。

调查是否可用表2中排序前面的六个基因的表达量，包括ATP9A、ASPM、ACOX3、CDC45L、SLC40A1及AGR2(Cox回归P值<0.005)，来建立PDAC的有效预后模型。在PDAC病患的独立定群中，包括UCSF定群、JHMI定群、以及NW/NSF定群，基于这些基因的转录量来计算风险分数(方程式1)。病患根据风险分数与最大Youden’s指数所决定的临界值被分级为高风险组或低风险组。

如第14图所示，基于风险分数，ATP9A、ASPM、ACOX3、CDC45L、SLC40A1及AGR2的染色强度可在每一个病患定群内藉由Kaplan-Meier分析，而非常有效地分级出死亡风险(对数秩检定，P＝0.001-0.021)。

如在表7中，多变量Cox回归分析表明，这六个基因模型在三个PDAC数据组之每一个中针对PDAC提供独立于临床及病理准则之外有力的预后信息。

表7，PDAC病患之三个独立定群中藉由六个基因模型及临床病理准则来评估总存活率之多变量Cox回归模型

CI，信赖区间。

*P<0.05

**临界值藉由最大值Youden’s指数来决定。

表8显示，根据C-指数值，在三个独立的数据组内，六个基因模型的评估精确度优于组合的临床模型及几个先前报导的PDAC的预后基因印记。

表8显示，根据C-指数值，在三个独立的数据组内，六个基因模型的评估精确度优于组合的临床模型和几个先前报导的PDAC的预后基因印记。

表8，在三个PDAC病患的独立定群中六个基因模型及不同的预后评估模型由C-指数评估的评估精确度

C-指数，一致性指数；CI，信赖区间。

＊临床生理准则包含年龄、肿瘤分级、T阶段及N阶段状态。

＊＊PDAC报导分子亚型以62个基因印记定义，“PDAssigner”；CollissonEA等人，自然医学期刊，2011年；17:500-503(CollissonEA,etal.Nat.Med.2011；17:500-503)。

＊＊＊六个基因转移印记包含FBJ鼠类骨肉瘤病毒致癌基因同源物B(murineosteosarcomaviraloncogenehomologB,FOSB)、Kruppel类因子6(Kruppel-likefactor6,KLF6)、B细胞抑制子内κ轻多肽基因增强子核因子ζ(nuclearfactorofkappalightpolypeptidegeneenhancerinB-cellsinhibitor,zeta,NFKBIZ)、三磷酸腺苷酶H+/K+交换(ATPaseH+/K+exchanging)、α多肽(alphapolypeptide,ATP4A)、生殖细胞相关基因1(germcellassociated1,GSG1)、以及唾液酸结合Ig类似物凝集蛋白11(sialicacidbindingIg-likelectin11,SIGLEC11)；StratfordJK等人，公共科学图书馆医学期刊(PLoSMed.)，2010年；7(7):e1000307。

实施例9

本实施例描述基于ASPM、ATP9A、及ACOX3表达量之PDAC的三个基因预后模型。

调查是否可用表2中排序前面的三个基因的表达量，包括ASPM、ATP9A、及ACOX3，来建立PDAC的有效预后模型。在PDAC病患的独立定群中，包括UCSF定群、JHMI定群、以及NW/NSF定群，基于ASPM、ATP9A、及ACOX3转录量来计算风险分数(方程式1)。病患根据风险分数与最大Youden’s指数所决定的临界值被分级为高风险或低风险组。

如第15图，基于风险分数，ASPM、ATP9A、及ACOX3转录量可藉由在每一个病患定群内以Kaplan-Meier分析而有效地分级死亡风险(对数秩检定，P＝0.004-0.041)。

如表9所示，多变量Cox回归分析表明，这三个基因模型在三个数据组的每一个中针对PDAC提供独立于临床及病理准则之外有力的预后信息。

表9，在PDAC病患之独立定群内藉由三个基因模型及临床病理准则来评估总存活率之多变量Cox回归模型

CI，信赖区间。

*P<0.05

**临界值藉由最大值Youden’s指数来决定。

表10显示，根据C-指数值，在三个PDAC数据组的每一个中，三个基因模型的评估精确度优于组合的临床模型，包含年龄、肿瘤分级、及临床阶段。

表10，在三个PDAC病患的独立定群内三个基因模型及临床病理准则由C-指数评估的评估精确度

C-指数，一致性指数；CI，信赖区间。

＊临床病理准则包含年龄、肿瘤分级、T阶段及N阶段状态。

实施例10

本实施例系基于实施例2中所示的28个基因预后模型，描述针对胰脏癌病患的评估复发率及期望无复发存活的计算。

如实施例3中所述，可以基于择取基因组藉由计算风险分数(方程式1)来测量胰脏癌之给定病患手术后复发的风险。对于风险分数已知的病患，在时间t时所述病患的复发风险率可透过Cox回归来估计，且危险率可表示为：h(t)＝h0(t)exp(bx)，其中x是风险分数值，b是回归系数，而h0(t)为底线风险函数。在时间t时之评估存活率可得以估计，根据：

S(t)＝S0(t)exp(bx)(方程式2)

其中是底线风险函数。计算可藉由商业软件像是SPSS软件(IBM)等进行。此外，中位数存活时间可藉由方程式2依设定S(t)＝0.5来解出。

例如，在UCSF定群内给定病患的风险分数可基于所述受试者的28个基因标记的转录本丰度量来计算，如下：

x＝-4.792+(-5.608ATP9A+4.114ASPM-5.821ACOX3+12.814CDC45L-2.026SLC40A1-1.700AGR2+9.861ATP11C+4.137FAM72A//B//C//D-5.444PLA2G10-3.591MATN2+5.767APITD1+12.789KIF11-2.828HPGD+3.087HMMR-2.483ELF3+4.903PTTG1+10.213UPP1+7.367CCNB2-5.104CREG1-3.033ARSD+6.097CENPN+3.243SMC4+4.948DLGAP5-3.524PIK3AP1-7.569TLR3+2.415TWIST1+5.639GCLM-3.480CTSS)/28

(方程式3)

估计的Cox回归是h(t)＝h₀(t)exp(1.053x)。存活(率)函数可被表示为：

S(t)＝S₀(t)^exp(1.053x)(方程式4)

估计的S₀(t)值显示在表11。

表11，在UCSF定群内根据基于使用28个基因模型所计算的风险分数之Cox回归来估计之病患基准存活率

t	S₀(t)
		[0，0.055)	1.000
[0.055，0.123)	0.99436 -->
		[0.123，0.178)	0.989
[0.178，0.263)	0.982
		[0.263，0.394)	0.971
[0.394，0.402)	0.940
		[0.402，0.545)	0.871
[0.545，0.553)	0.795
		[0.553，0.643)	0.720
[0.643，0.936)	0.647
		[0.936，1.292)	0.576
[1.292，1.347)	0.504

[1.347,1.563)	0.433
		[1.563,1.574)	0.367
[1.574,1.73)	0.304
		[1.73,1.774)	0.241
[1.774,1.796)	0.182
		[1.796,2.311)	0.127
[2.311,2.538)	0.080
		[2.538,3.086)	0.045
[3.086,∞)	0.015

表12显示从UCSF定群中挑选的四个PDAC病患的观察及评估存活率

表12，以12个基因模型所评估之UCSF定群中选取病患的总存活率及一年存活率

*转录丰度量由人类GeneChipU133Plus2.0阵列(Affymetrix公司)来测定，并以探针杂合强度表示。此数据及相关临床信息系从基因表达数据库(GeneExpressionOmnibus)(GSE17891)下载(Collisson等人，2011年)。

实施例11

本范例描述基于实施例8所示之六个基因预后模型之胰脏癌病患的评估复发率及期望无复发存活率之计算。

在实施例10中相同原则可使用以如实施例8中所示的六个基因型，来评估UCSF定群内病患的复发率及期望无复发存活率。根据风险分数(方程式1)，基于所述病患肿瘤之ATP9A、ASPM、ACOX3、CDC45L、SLC40A1、及AGR2以H分数表示的染色强度，可使用下列方程式计算UCSF定群内的给定病患的风险分数：

x＝7.235+(-5.608ATP9A+4.114ASPM-5.821ACOX3+12.814CDC45L-2.026SLC40A1-1.7AGR2)/6)

(方程式5)

估计Cox回归是。存活函数可表示为：

S(t)＝1-S₀(t)^exp(0.580x)(方程式6)

表13显示估计的S₀(t)值：

表13，在UCSF定群内根据基于使用六个基因模型所计算的风险分数之Cox回归来估计之病患基准存活率

t

S₀(t)

[0,0.055)	1.000
		[0.055,0.123)	0.990
[0.123,0.178)	0.979
		[0.178,0.263)	0.968
[0.263,0.394)	0.949
		[0.394,0.402)	0.910
[0.402,0.545)	0.846
		[0.545,0.553)	0.780
[0.553,0.643)	0.713
		[0.643,0.936)	0.646
[0.936,1.292)	0.582
		[1.292,1.347)	0.519
[1.347,1.563)	0.458
		[1.563,1.574)	0.400
[1.574,1.73)	0.345
		[1.73,1.774)	0.292
[1.774,1.796)	0.241
		[1.796,2.311)	0.192
[2.311,2.538)	0.148
		[2.538,3.086)	0.10839 -->
[3.086,∞)	0.066

表14显示选自UCSF定群的四个PDAC病患的观察及评估存活率。

表14，以六个基因模型评估之UCSF定群的选定病患之总存活率及一年存活率

转录丰度量＊	病患1	病患2	病患3	病患4
					ATP9A	7.943	7.739	7.825	6.904
ASPM	4.220	4.091	4.711	5.717
					ACOX3	6.185	6.244	6.583	5.002
CDC45L	4.224	4.357	4.621	4.459
					SLC40A1	10.155	10.754	10.647	6.457
AGR2	10.283	11.284	10.873	7.109
					风险分数依六个基因模型	-2.900	-0.774	-0.042	5.177
观察存活率(年)	3.841	1.730	1.292	0.178
					评估存活率(年)	>3.086	1.730	1.347	0.263
一年之后死亡	否	否	否	是
					评估一年存活率	90.4％	70.8％	59.0％	<0.1％

实施例12

本实施例描述人类乳癌内ASPM的表达及预后值

如第16图显示，藉由从Oncomine(www.oncomine.org)查询公开的肿瘤转录体数据组，在乳癌病患的几个大定群中，揭露ASPM的转录量相对于正常乳房组织在人类乳癌的不同病理亚型中会显著增加。为了研究上调控的ASPM表达与乳癌病患的临床预后是否相关，查询源自乳癌病患的几个大定群(总共n＝2416)所衍生之公开乳癌转录体数据组之ASPM表达(Curtis等人，2012年；Pawitan等人，2005年；Wang等人，2005)。使ASPM表达量与这些病患的临床结果相互关联(总存活率或无复发存活)。

如第17图中所示，当Curtis定群之病患(Curtis等人，2012年)根据ASPM表达四分位而分组时，表达较高ASPM表达量的肿瘤之病患具显著地较短的总存活率，相较于表达中等或较低ASPM量的肿瘤而言(对数秩检定，P<0.0001)。

相同地，当Pawitan定群(Pawitan等人，2005年)的病患根据ASPM表达四分位被分组时，表达较高ASPM表达量的肿瘤的病患具显著地较短的整体或无复发存活率，相较于表达中等或较低ASPM量的肿瘤而言(对数秩检定，P<0.001)。同样地，ASPM表达量与存活率之间的逆相关性在其它乳癌病患的定群内被观察到(Wang等人，2005)，具对数秩P值小于0.001。

如表15所示，多变量Cox回归分析表明，相对于病理肿瘤分级及乳癌分子亚型，ASPM转录量对于术后疾病复发之风险比例达到4.428(P＝0.002)而言，提供了最有力且独立的预后信息。

表15，藉由ASPM表达量及肿瘤分级和乳癌分子亚型来评估无复发存活之多变量Cox回归模型

此分析包括斯德哥尔摩(Stockholm)定群内159个乳癌病患(Pawitan等人，2005年)。

CI，信赖区间。

＊ASPM的截止值藉由使用最大Youden指数来挑选。

如表16显示，多变量Cox回归分析表明，ASPM转录量针对乳癌提供独立于病理准则及乳癌分子亚型之外最有力的预后信息(风险比例＝3.669；P＝0.011)。

表16，藉由ASPM表达量以及肿瘤分级及乳癌分子亚型来评估总存活率之多变量Cox回归模型

	风险比例	95％CI	P-值
				ASPM(高vs.低)*	3.669	1.347-9.991	0.011
肿瘤分级
				2级vs.1级	2.164	0.469-9.984	0.322
3级vs.1级	1.828	0.374-8.924	0.456
				分子亚型
正常样&管状B型vs.管状A型	0.878	0.319-2.414	0.801
				基底细胞型&ERBB2+vs.管状A型	1.211	0.450-3.258	0.705

CI，信赖区间。

＊ASPM的截止值藉由使用最大Youden指数挑选。

实施例13

本实施例描述ASPM在乳癌增殖、迁移、Wnt活性及干性上之角色，以及ASPM抑制的治疗效应。

如实施例12所示鉴于ASPM是乳癌内强力及稳健的不良预后因素，评估ASPM是否亦在乳癌细胞的恶性行为及其Wnt活性中扮演一定角色。为此，藉由使用如实施例4中所述慢病毒媒介的RNAi，而稳定地下调控乳癌细胞内ASPM的表达。第18A图显示透过免疫印渍分析所检验的ASPM剔除量。第18B图显示，类似于PDAC细胞中的发现，转移性乳癌MDA-MB-436或原发肿瘤衍生HCC-1954细胞中内生ASPM表达的剔除可分别衰减细胞增殖。

为了获得ASPM沉默对乳癌细胞在迁移能力上的效应，进行了如实施例4中所述之改良波伊登室测定法。如第18C图所示，相较于乳房癌相关的纤维母细胞，ASPM表达沉默会显著地衰减MDA-MB-436细胞以及HCC-1954细胞的细胞迁移。

为了进一步评估ASPM是否调控乳癌细胞中Wnt路径的活性，表达Wnt报导子构建(construct)于MDA-MB-436细胞及HCC-1954细胞两者内，如实施例4所述。第18D图显示当在MDA-MB-436细胞或HCC-1954细胞内使Wnt讯号藉由Wnt-3a所活化时，沉默ASPM表达之细胞展现出大幅地减弱的Wnt媒介荧光素酶报导活性。这个结果证实，ASPM在乳癌细胞之Wnt讯号路径活性中亦为功能重要的。

乳癌细胞中ASPM亦支持增殖、迁移及Wnt活性的发现促使我们推测，其可能也在乳癌之干细胞样细胞调控中起关键作用。为此，在对照或ASPMshRNA转导的乳癌MDA-MB-436细胞内测定CD44+CD24-/low表型之细胞的比例，其中包含乳癌中富集的癌干细胞样细胞(Al-Hajj等人，2003年)。细胞被分离、抗体标签并重新悬浮在如先前所述含DAPI之HBSS/2％的FBS(Li等人，2007年)中。所使用的抗体包括PE抗-CD44、及AlexaFluor647抗-CD24(BD生命科学事业)。流动式细胞测量术使用FACSCantoII流式细胞仪(BD生命科学事业)进行。如第19A图及第19B图所示，ASPM的剔除致使CD44+CD24-/low肿瘤细胞群集的大幅减少(平均48.5％)。

为了探索上述发现的功能相关性，在分选的CD44+CD24-/lowMDA-MB-436细胞中执行肿瘤球测定。CD44hiCD24low及CD44hiCD24hi细胞透过FACS被分选(BDFACSAria^TMIII细胞分选仪，BD生命科学事业)，如先前所述(Ginestier等人，2007年)。简言之，根据制造商的说明书(干细胞技术有限公司(StemCellTechnologies))，肿瘤球于MammoCultMedia内被保持在超低附着板(康宁公司，洛厄尔，麻州，美国)(CorningInc.,Lowell,MA,USA)上。活细胞的相等数目被铺在超低附着板上以产生初级球体。7天后，该微球体的尺寸被测量并拍摄照片。第19C图及第19D图清楚地显示ASPM剔除会大幅降低肿瘤球的生长及尺寸。共同地，这些数据提示ASPM是乳癌干性的重要调控物。

ASPM在乳癌生长、迁移及干性的作用可能提高其在活体内促进乳癌发展的可能性。为了解开这种可能性，在对照或ASPMshRNA转导的乳癌细胞MDA-MB-436细胞内稳定地表达萤火虫荧光素酶报导(基因)，并且原位植入到NOD-SCID小鼠的乳腺脂肪垫。如第20图所示，移植后超过4周期间，ASPM的沉默完全瘫痪了活体内乳癌细胞用以初始肿瘤生长的能力，然而抱有对照shRNA肿瘤之动物则展现显著生长。

实施例14

本实施例描述ASPM在前列腺癌增殖及迁移中的角色以及ASPM抑制的治疗效应。

鉴于ASPM在PDAC及乳癌中是细胞增殖、迁移、干性及肿瘤进展的关键调节物，评估ASPM是否在前列腺癌细胞，腺源性癌症的另一种类型，的恶性行为中亦扮演一定角色。第21A图，藉由在一系列正常或恶性前列腺组织中测量ASPM的转录量，发现相比于正常组织，在前列腺癌中ASPM显著地为上调控。而且，借着从Oncomine(www.oncomine.org)查询公开的肿瘤转录体数据组，发现相较于原发肿瘤在转移性前列腺癌中ASPM转录量系显著地增加。这些临床相关性分析支持ASPM在前列腺癌的初始及发展中扮演重要角色的可能性。

为了解出ASPM在前列腺癌中的功能重要性，如实施例4中所述，稳定地借着使用慢病毒媒介RNAi下调控前列腺癌PC-3细胞内ASPM的表达。第22A图显示以免疫印渍分析所验证的ASPM剔除量。第22B图显示出类似于PDAC细胞内的发现，在PC-3细胞中内生性ASPM表达之剔除可分别衰减细胞的增殖。

为了获得在前列腺癌细胞的迁移能力上ASPM沉默的效应，进行改良波伊登室测定法，如实施例4中所述。如第22C图所示，相对于前列腺基质WPMY-1细胞(美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection))，ASPM表达沉默会显著地衰减PC-3细胞的细胞迁移。

为了评估ASPM是否调节Wnt路径活性，在前列腺癌PC-3细胞中表达Wnt报导基因建构(construct)。根据制造商的规程，细胞以CignalLentiTCF/LEF报导基因(凯杰公司)转导。随后以重组人类Wnt-3a(250ng/mL16小时，R&D系统，明尼阿波利斯，明尼苏达州)或载体之细胞进行刺激，报导基因活性系藉由使用ONE-GloTM荧光素酶检测系统(普洛麦格公司(Promega)，麦迪逊，威斯康星州)来测量。如第22D图所示，当Wnt讯号在PC-3细胞中透过正则Wnt配位体Wnt-3a而活化时，ASPM耗乏细胞展示大幅减弱的Wnt媒介荧光素酶报导基因活性。这个结果证实，ASPM在前列腺癌细胞内对Wnt信号通路活性是功能重要的。

为了进一步评估ASPM是否也在前列腺癌内对干细胞样细胞的调控上扮演关键角色，在对照shRNA或ASPMshRNA转导的前列腺癌PC-3细胞内，测量有CD133+CD44+表型的细胞之比例，其中包含乳癌中富集之癌症干细胞样细胞(Dubrovska等人，2009年)。细胞被分离、抗体标签并重新悬浮在含DAPI的HBSS/2％FBS内，如先前所述(Li等人，2007年)。所使用的抗体包括APC-抗-CD133以及PE-抗-CD44(BD生命科学事业)。流式细胞测量术使用FACSCantoII流式细胞仪(BD生命科学事业)来进行。如第23图所示，ASPM的剔除致使CD133+CD44+肿瘤细胞群集的大幅减少(平均51.7％)，表示ASPM确实促进了前列腺癌干性。

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本说明书按照说明书中所引用的参考文献的教示而极尽彻底地理解。本说明书中的实施例提供了本发明实施例的说明并且不应被解释为用于限制本发明的范畴。本领域技术人员得以轻易认知的是，许多其它实施例系被本发明所包括。本文中任何参考文献的引用均非认许这些参考文献为本发明之先前技术。

除非另有说明，否则在本说明书中包括发明申请专利范围所使用之所有表示成分的数量、反应条件等等的数字等，都应当被理解为近似值，且可取决于本发明所需求的理想性质而变动。在最低限度中，且并非试图对发明申请专利范围的范畴限制教示的应用下，每个数值参数应解读成按照有效位数的数目及普通的四舍五入方法。在本说明书中具有不同有效位数量的一系列数字的叙述不应被解释为意旨为，具较少给定有效位数之数字与具较多给定有效位数之数字具有相同的精确度。

用词“一”或“一个”之使用，当与术语“包括”结合用于发明专利申请范围及/或说明书内时，可表示“一个”，且也与“一或多个”、“至少一个”及“一个以上”的含义一致。除非明确指出仅指称替代品或替代品是相互排斥的，否则在发明专利申请范围中所使用的术语“或”系用于意指“及/或”，然而本揭露支持仅指称替代品及“及/或”之定义。

除非另有说明，否则前缀于一系列组件之术语“至少之一”应当被理解为指称该系列中的每个组件。本领域之技术人员将认知，或能够使用不超过常规的实验来确认许多等同于本文描述的本发明具体实施例之等效物。这样的等效物系旨在被下列发明申请专利范围所涵盖。

除非另有定义，否则本文所使用的所有技术及科学术语具有如同一般由本发明所属技术领域普通技术人员所通常理解之相同含义。虽然任何类似或等同于本文描述的方法及材料可用于本发明的实践或测试，然而优选方法及材料已于此时描述。

本文所讨论的这些出版物只提供早于本发明申请日之揭露内容。本文中没有任何内容应被理解为本发明在凭借优先权发明下不具早于此类出版物之权利的许可。此外，所提供的出版物日期可与实际出版日期有所差异，其可能需要个别地确认。

本发明的其它实施例将透过考虑说明书及本文所揭露发明之实践，而对本领域技术人员而言是显而易见的。其旨在认知说明书及实施例仅为例示性，落于由下列发明申请专利范围所指示的本发明之真正范畴及精神内。

Claims

1.一种评估具有腺体癌症的受试者的临床预后的方法，其包含：

(a)在来自受试者的一或多个肿瘤样本里取得一或多个标记基因的一转录表达量或一蛋白质表达量的计量，其中该一或多个标记基因系选自ASPM、ATP9A、ACOX3、CDC45L、SLC40A1、AGR2、及表2所示者；以及

(c)将该一或多个肿瘤样本里的该一或多个标记基因的表达量与一或多个临界参考基准进行比较。

2.权利要求1所述之方法，其进一步包含基于(c)步骤的比较，将肿瘤分配为一临床预后组的步骤。

3.权利要求1或2所述之方法，其进一步包含用于抑制ASPM的治疗有效量之试剂的给药。

4.权利要求1-3任一项所述之方法，其中测定该转录表达量包含聚合酶链反应、Northern印迹、核糖核酸酶保护测定或互补脱氧核糖核酸(cDNA)微阵列分析或寡核苷酸微阵列分析；且

测定该蛋白质表达量包含免疫印迹、免疫组织化学法、蛋白质阵列、或二维蛋白质电泳及质谱分析。

5.权利要求1-4任一项所述之方法，其中临床预后包含：

(a)疾病诊断或手术的日期与疾病复发或转移的日期之间的时间间隔；

(b)疾病诊断或手术的日期与受试者死亡的日期之间的时间间隔；或

(c)一或多个可测量肿瘤病灶在数目、大小、或体积上的变化。

6.权利要求1-5任一项所述之方法，其中测定该临界参考基准包含：

(a)自有胰脏癌且可取得临床预后数据的大量受试者取得一或多个肿瘤样本；

(b)测定该一或多个肿瘤样本里的该一或多个标记基因的表达量；

(c)根据该一或多个肿瘤样本或其组合的表达量，依递降次序排序大量受试者；以及

(d)测定该一或多个临界参考基准，其中肿瘤具有高于该一或多个临界参考基准的该一或多个标记基因的表达量的受试者，相较于具有低于该一或多个临界参考基准的表达量的受试者，系评估为具有临床预后不良或疾病进展的较高风险或较低风险。

7.一种评估具有腺体癌症的受试者的临床预后的方法，其包含：

(a)自患有腺体癌症的受试者取得一或多个肿瘤样本；

(b)测定ASPM的一转录表达量或一蛋白质表达量；

(c)将该一或多个肿瘤样本里的ASPM的表达量与一或多个临界参考基准进行比较；以及

(d)基于(c)的比较，将肿瘤分配为一临床预后组。

8.一种在个体上治疗腺体癌症的方法，该方法包含抑制腺体癌症里ASPM的表达或活性。

9.权利要求7-8任一项所述之方法，其中腺体癌症为乳癌、前列腺癌、结肠癌、胃癌、或任何种类源自人类正常腺体的恶性肿瘤。

10.权利要求8-9任一项所述之方法，如申请专利范围所述之方法，其中该方法包含施予个体互补至ASPMmRNA的核酸，包括小干扰RNA、小发夹RNA、微小RNA、或反义寡核苷酸。

11.权利要求8-10任一项所述之方法，其中该方法进一步包含施予个体互补至ASPMmRNA的核酸，其具有足以抑制ASPM增加一Wnt信号通路的活性的能力。

12.权利要求11所述之方法，其中该Wnt信号通路的活性系藉由β-连环蛋白量，或T细胞因子(TCF)或淋巴增强子结合因子1(LEF1)之活性来测量。

13.权利要求8所述之方法，其中该方法进一步包含施予个体互补至ASPMmRNA的核酸，其具有足以抑制ASPM增进或维持癌症干细胞群集之能力或肿瘤起始或促进转移的能力。

14.权利要求13所述之方法，其中癌症干细胞系以一或多个标记定义，包含CD44、CD24、人上皮特异性抗原(ESA)、CD133、趋化素(C-X-C功能域)受体4(CXCR4)、乙醛脱氢酶(ALDH)或上述的任何组合。

15.一种用于测定ASPM量以评估胰脏癌或腺体癌症的风险、存在、阶段或严重度之试剂盒，其中该试剂盒包含：

一试剂，能够侦测受试者的生物样本及一测试基质的ASPM量；以及

一选配说明书，用于接触该试剂或该测试基质与受试者的样本，并用于评估说明受试者对胰脏癌或腺体癌症之风险、易感性、或预后，其中增加的ASPM量表示增加的风险、增加的易感性或预后不良性。