TW201504438A - 預後分類之方法及套組與以核酸製備治療腺體癌症的醫藥組合物之用途 - Google Patents

預後分類之方法及套組與以核酸製備治療腺體癌症的醫藥組合物之用途 Download PDF

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Abstract

本揭露包含分子標記的鑑定，包括ASPM、ATP9A、ACOX3、CDC45L、SLC40A1、AGR2、以及表2所示者，此與胰臟癌的分化和臨床預後相關。更特定地，本揭露包含基因標記組的鑑定，基因標記組的表現量可用來從具較低程度分化的胰臟癌細胞區別具較高程度分化的胰臟癌。這些標記可用於評估胰臟癌的臨床預後，包括宿主的疾病進展、復發或死亡。本揭露也提供治療腺體癌症的方法與用於測定腺體癌症的套組，像是胰臟癌、乳癌、和攝護腺癌，此係藉由抑制ASPM的表現或是抑制其活化或維持Wnt訊息活性之能力及/或腺體癌症的癌症幹細胞群集的能力。

Description

預後分類與治療腺體癌症的方法
相關申請案之交互參照
本申請案主張於2013年5月17日申請之美國臨時申請號61/824,679之效益，其於此併入作為參考。
本揭露包含用以分類胰臟癌及腺體癌症並評估疾病進展、復發、及死亡之系統、方法、及套組。本揭露也包含用於治療胰臟癌及腺體癌症之方法及套組。
胰腺導管腺癌(Pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)是致命性的惡性腫瘤。由於疾病早期之症狀缺乏以及腫瘤的侵襲特性，少於20%患有PDAC之病患在診斷時期呈現局部及可切除之病症。即使施以根除治療性手術，大多數有初期局部腫瘤的病患仍然會發展為復發或轉移性病症，且只有小部份(18-26%)的病患可以達到長期存活(Ahmad等人，2001年；Oettle等人，2007年)。因此，對患有局部PDAC病患的預後方面，進一步改善可能需依賴闡明出可指引病患個人化治療方案之潛在腫瘤復發的發病機制以及臨床上可靠的預後評估。
腺體上皮(glandular epithelium)的惡性轉化包含漸進與變動之正常腺體結構的損失。因此，在腺體分化中人類胰臟癌頻繁地展現顯著地腫瘤內異質性，像是廣泛地用於腺體癌症的病理分類之因子，攝護腺癌的格里森分級系統(Gleason grading system) (Gleason, 1992)。因此，腺體分化被用於其他種類源自腺體的惡性腫瘤的組織病理評估，包含乳癌和胰臟癌(Adsay等人，2005年；Gleason，1992年；Hruban及Fukushima，2007年；Rakha等人，2008年)。然而，形態基礎的病理分類系統只是非侵入性之預後指標，且無法對具相似組織病理特徵的胰臟癌作風險分層。組織結構的評估並無法對所觀察的腫瘤變異提供功能或機制檢視。故在胰臟癌臨床結果的評估中，對於具改善之準確度的路徑獲知以及分子基礎診斷測定上存在迫切需求。
近來，高通量的基因體分析技術使人類惡性腫瘤包含胰臟癌在內的分子特性更加明瞭(Glinsky等人，2004年；Henshall等人，2003年；Singh等人，2002年；Stratford等人，2010年；van 't Veer等人，2002年；van de Vijver等人，2002年)。這些基因體標記的強大預後效用示明腫瘤的本質分子特徵係作為臨床行為的關鍵決定因素(Ramaswamy等人，2003年)。舉例來說，在早期PDAC病患的存活評估中，藉由比較轉移的PDAC和初期PDAC的基因表現模式， Stratford和同事鑑定出6個基因之轉移相關聯的印記(signature)(Stratford等人，2010年)。藉著比較27個顯微解剖的PDAC組織的轉錄體(transcriptomes)，Collisson和同事確定出稱為「PDAssigner」之62個基因之印記，此可以用以診斷PDAC的分子亞型(Collisson 等人，2011年)。
應當註記的是以上提到的分子模式是自臨床的胰臟腫瘤切片來鑑定，且僅可反映確切的腫瘤特徵而並未提供在這些腫瘤變異的病理中潛在的機制。在這方面，以知識為基礎的方法提供一個機會來鑑定有利於臨床決策和治療進展的更多合理標記或分類系統。這樣的方法已經用於在數種固體腫瘤中建立與腫瘤祖細胞、基質活化(stromal activation)或組織分化相關的基因譜(gene profile)的預後任務( Chang等人，2004年； Fournier等人，2006年； Liu等人，2007年； Sotiriou等人，2006年)。
腫瘤形成的目前現行模式係提出組織分化和腫瘤進展共有相似的基因調控和分子路徑。在活體內研究與腺體上皮的分化過程相關的分子變化可能很困難。然而，生理相關的三維器官培養模式已經被用於概括乳腺腺泡、正常哺乳類上皮的基本構造單元的結構及功能分化過程(Debnath及Brugge，2005年；Lee等人，2007年)。相似的模式已經成功地概括胰臟、胰腺上皮及肺上皮的形態演發和分化過程(Gutierrez-Barrera等人，2007年；Mondrinos等人，2006年；Webber等人，1997年)。使用這個發展模式的比較基因表現分析引導了基因表達譜和標記基因的鑑定，其顯示和乳癌預後顯著的相關聯(Fournier等人，2006年； Kenny等人，2007年)。相同的示範模式是否能被應用在胰臟癌仍不清楚。
人類的ASPM 基因編碼大型(409.8Da)及多功能蛋白質，此蛋白質在神經生成、神經元移行和神經膠瘤幹細胞的增殖中扮演了關鍵角色(Bikeye 等人，2010年； Buchman等人，2011年)。ASPM初始被確定為調控神經生成和腦尺寸的中心體蛋白質(Bond等人，2003年；Kouprina等人，2005年)。然而，ASPM現在已知廣泛地表現在中樞神經系統外的各種胎兒和成人組織(Bruning-Richardson等人，2011年；Kouprina等人，2005年)。近來的研究也演示APSM表現為上調控(up-regulated)且在惡性腫瘤的多種類型裡是重要的預後。舉例來說，ASPM表現與神經膠瘤的病理分級呈正向相關，且在復發腫瘤裡為上調控(Bikeye等人，2010年)。ASPM表現也與罹患卵巢癌或肝細胞癌的病患的病理分級及低存活率具有正相關性(Bikeye等人，2010年；Bruning-Richardson等人，2011；Lin等人，2008年)。有趣地，這些研究也演示了ASPM在間期(interphase)時同時於細胞質與細胞核中局部化，且其細胞質表現量在腫瘤之間存在有高度變異性(Bruning-Richardson等人，2011年)，這意味著其在惡性組織內具有多種不同生物功能。
相應地，部份實施例的標的係為提供臨床上可靠的預後評估，其可對患有胰臟癌或腺體癌症的個體病患指示個人化治療方案。這藉由提供診斷標記的圖表(panels)及其使用方法，以及藉由提供用於治療胰臟癌或腺體癌症之例示性方法及套組而實現。
本揭露包含與胰臟癌組織分化程度相關之表2所列的基因標記的鑑定，以及使用這些標記以評估胰臟癌的臨床預後。更特定地，本揭露包含基因標記組的鑑定，基因標記組的表現量能用於從較低程度分化的胰臟癌中區分出較高程度分化的胰臟癌。另外，在本揭露中所鑑定的基因標記的轉錄或蛋白質表現量能用於評估胰臟癌的臨床預後，包含胰臟癌受試者的疾病進展、復發或死亡。本揭露也包含ASPM的使用以評估其他種類的腺體癌症，像是乳癌、攝護腺癌、結腸癌和胃癌的臨床預後。另外，本揭露包含一種藉由抑制ASPM的表現或是ASPM活化或維持Wnt訊息活動及/或所述腺體癌症的癌症幹細胞群集的能力，而用於治療腺體癌症，像是胰臟癌、乳癌、和攝護腺癌之方法。
在上述方法的特定實施例裡，胰臟癌的評估臨床預後包含在從活體組織切片或外科方法所取得的胰臟腫瘤切片中，測定ASPM、ATP9A、ACOX3、CDC45L、SLC40A1、AGR2和表2中所示者或任何其組合之轉錄或蛋白質的表現量，並運用此些表現量之組合，以評估有所述胰臟腫瘤的受試者的結果。
在特定實施例裡，測定所述基因標記的轉錄表現量包含對冷凍或福馬林固定的石蠟包埋(formalin fixed paraffin embedded, FFPE)胰臟腫瘤切片上作聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction)、北方印漬術(northern blotting)、核糖核酸酶保護測定(RNase protection assay)、或互補去氧核糖核酸(cDNA)或寡核苷酸微陣列分析(oligonucleotide microarray analysis)。
在另一個實施例，測定所述基因標記的蛋白質表現量包含免疫印漬術(immunoblotting)、免疫組織化學法(immunohistochemistry)、蛋白質陣列(protein array)或二維蛋白質電泳(two-dimensional protein electrophoresis)和質譜分析(mass spectroscopy analysis)。
在上述方法的實施例裡，測定蛋白質表現量包含對所述標記具特異性的抗體之應用、以及在冷凍或FFPE胰臟腫瘤組織上作免疫組織化學染色。
在另一實施例中，本揭露說明藉由使用特定抗體和免疫組織化學染色，對從活體組織切片或外科方法所取得的冷凍或FFPE胰臟腫瘤組織切片進行ASPM、ATP9A、ACOX3、CDC45L、SLC40A1或AGR2或其任何組合的蛋白質表現量之測定，來進行胰臟癌預後的評估。
本揭露也提供用以評估胰臟癌臨床預後的套組，包含用以偵測在腫瘤內ASPM、ATP9A、ACOX3、CDC45L、SLC40A1、AGR2，和表2所示者或上述任何組合的蛋白質轉錄的工具。
在一實施例中，用以評估臨床預後的胰臟癌的套組包含用於在腫瘤內偵測ASPM、ATP9A、ACOX3、CDC45L、SLC40A1或AGR2或其任何組合的蛋白質的特定抗體。
本揭露另外提供對ASPM、ATP9A、ACOX3、CDC45L、SLC40A1、AGR2，和表2所示者、或一或多個管家基因(housekeeping gene)或其任何組合的轉錄本具特異性之核酸探針的陣列，以評估胰臟癌的臨床預後。
另一實施例提供對ASPM、ATP9A、ACOX3、CDC45L、SLC40A1、AGR2，和表2所示者、或一或多個管家基因或其任何組合的蛋白質具特異性之抗體或適配體的陣列，以評估胰臟癌的臨床預後。
特定實施例係關於ASPM的利用，以評估其他種類的腺體癌症，像是乳癌、攝護腺癌、結腸癌和胃癌的臨床預後。在特定實施例中，評估腺體癌症的臨床預後包含從活體組織切片或外科方法所取得的腫瘤切片中，對ASPM的轉錄表現量或蛋白質表現量進行測定並使用所述表現量的組合，以評估有所述腺體癌症的受試者的結果。特定實施例係關於藉由在從活體組織切片或外科方法所取得的冷凍或FFPE腫瘤切片中，使用特定抗體和免疫組織化學染色來測定ASPM的蛋白質表現量，而進行腺體癌症預後的評估。
特定實施例提供一種藉由抑制在所述癌症內ASPM的表現及/或活性來治療胰臟癌或其他腺體癌症種類的方法。在一實施例中，這些方法包含ASPM表現的抑制，此係藉由對有所述癌症的個體施以互補至ASPM mRNA的核酸，包含siRNA、shRNA、microRNA、或反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide)。
在一實施例中，抑制ASPM的活性包含施予對ASPM mRNA互補的核酸，包括siRNA、shRNA、microRNA、或反義寡核苷酸，其足以抑制ASPM在所述癌症裡活化Wnt訊息路徑及/或癌症幹細胞群集的能力。
在另一實施例中，抑制ASPM的活性包含施予對ASPM mRNA互補的核酸，包括siRNA、shRNA、microRNA、或反義寡核苷酸，其足以抑制ASPM促進或維持癌症幹細胞群集之能力或其腫瘤起始及/或促進轉移之能力。
特定實施例包含測定ASPM量以評估胰臟癌的風險、存在、階段、或嚴重性的套組，其中該套組包含能夠在受試者的生物樣本和測試基質中偵測ASPM量的試劑；以及用以接觸試劑或基質與來自受試者的樣本的說明書、及用以對受試者的胰臟癌評估風險、易感性、或預後的說明書，其中增加的ASPM量表示增加的風險、增加的易感性或預後不良性。
隨附的目的及優點將一部分在下列描述中闡述，且一部分將自描述中顯而易見或可通過本揭露各態樣的實踐來習知。所揭露的目的及優點將藉由在所附的申請專利範圍中所特別指出的元素及組合的手段來實現和達成。
應當理解的是，前面的概略描述和下面的詳細描述皆僅作為例示性和說明性，而非用於對申請專利範圍所主張的本發明進行限制。
本揭露包括一種在任何具有懷疑為或已知為癌症之胰臟組織，例如，胰臟癌組織之受試者所取得之生物樣本中，藉由檢測分子標記(不論是蛋白質或編碼該蛋白質的RNA)來診斷胰臟癌分化程度並評估臨床預後的方法，分子標記包含ATP9A、ASPM、ACOX3、CDC45L、SLC40A1、AGR2、以及表2所示者，或其組合物，包含野生型、截斷或選擇性剪接之形式。除了其他的事項以外，在本揭露中提供的方法能夠對任何胰臟癌受試者作包含疾病復發、轉移、治療反應、及總存活率之臨床診斷的評估。因此，特定實施例可用於篩檢胰臟癌受試者的不良臨床預後，包括，例如，治療後疾病之復發，而可指引胰臟癌受試者的治療決策和治療模式選擇。因此，受試者(例如，胰臟癌病患)及護理人員可針對是否要進行手術(例如，根治性胰臟切除術)、新佐劑(即，手術前)、佐劑治療(即，手術後)作出更明智的決策，包括但不限於：放射治療、化學療法治療、使用生物製劑治療、激素療法、及/或其他替代治療法。
本揭露的方法涉及測定病患的多肽量或多核苷酸量，然後比較此量值與臨界參考基準或範圍之量值。通常，臨界參考值是大量胰臟癌個體或組織內多肽或多核苷酸的代表值，且其臨床預後數據是可取得的，例如藉由使用組織樣本或活體組織切片或其他生物樣本，像是細胞、血清或血液來測量。所述的臨界參考值係藉由界定量值來判定，其中其腫瘤具高於上述臨界參考基準的標記表現量的受試者，相較於低於上述臨界參考基準的表現量，會被評估為具有較高程度或較低程度的分化、或臨床預後不良或疾病進展的風險。相較於表現量低於所述臨界參考基準，多肽量或多核苷酸量與參考範圍(無論是上或下)的差異表示病患具有較高程度或較低程度分化、或臨床預後不良或疾病進展的風險。
在特定實施例中，該方法包括取得來自受試者的一或多個腫瘤樣本內一或多種標記基因的轉錄量或蛋白質表現量的計量。在特定實施例中，腫瘤樣本可藉由抽吸、活體組織切片或手術切除的方法來取得。在特定實施例中，腫瘤樣本可以是新鮮的樣本、冷凍的樣本、或固定的、石蠟包埋的樣本。
基於ASPM、ATP9A、ACOX3、CDC45L、SLC40A1、AGR2、和表2中所示者的表現量對胰臟癌受試者評估臨床預後的方法亦可能涉及統計方法的使用，包括，但不限於，使用非監督式方法(例如，k平均數、階層式集群分析法、主成分分析(principle component)、非負矩陣因式分解或多維尺度)(Hastie等人，2009)、監督式方法(例如，判別分析、支持向量機、或k最近鄰演算法)或半監督式方法、或使用Cox迴歸模型評估結果(例如，免於復發之存活、疾病進展、或總存活)(Kalbfleisch及Prentice，2002年)、加速失敗時間模式(accelerated failure time model)、貝式存活模式(Bayesian survival model)、或對存活數據平滑分析(Wand，2003年)，來區分級別。
在特定實施例中，對胰臟癌診斷分化程度及評估臨床預後的方法包含在來自胰臟癌受試者的生物樣本中檢測一或多個基因標記的表現量，基因標記包含ASPM、ATP9A、ACOX3、 CDC45L、SLC40A1、AGR2，和表2所示者。在揭露的方法中應用的標記包含表2中之任何單一標記，或其二或多個標記的任何組合(例如，任何表2的任兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個或全部28個標記，或表2的至少二個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個、至少25個、至少26個、或至少27個標記)。
特定實施例係關於藉由測定來自胰臟癌受試者的生物樣本內的ASPM、ATP9A、或ACOX3或其任何組合(例如，任何兩個、或全部三個標記、或這些標記的至少兩種)的蛋白質表現量進行胰臟癌預後之評估。
特定實施例係關於藉由測定來自胰臟癌受試者的生物樣本內的ASPM、ATP9A、ACOX3、CDC45L、SLC40A1、或AGR2或其任何組合(例如，任何兩個、任何三個、任何四個、任何五個或全部六個標記、或這些標記的至少兩個、至少三個、至少四個、或至少五個)的蛋白質表現量進行胰臟癌預後之評估。
特定實施例係關於藉由測定來自胰臟癌受試者的生物樣本內的ASPM、ATP9A、ACOX3、CDC45L、SLC40A1、AGR2、ATP11C、FAM72A、PLA2G10、MATN2、APITD1、或KIF11或任何其組合(例如，任何兩個、任何三個、任何四個、任何五個、任何六個、任何七個、任何八個、任何九個、任何10個、任何11個或全部12個標記，或這些標記的至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個、至少10個、或至少11個)的蛋白質表現量進行胰臟癌預後之評估。
在特定實施例裡，作評估的臨床預後可包括可測量的一或多個腫瘤病灶的數目、大小、或體積的變化。在特定實施例中，評估或評價腫瘤病灶的數量、大小或體積可包括在診斷或手術之前或期間不同時間點或之後對腫瘤或胰臟癌進行目測、放射、及/或病理的檢查。
在例示性方法中，測定蛋白質表現量包含對所述基因標記具特異性的抗體的使用以及在固定的(例如，福馬林固定的)和/或蠟包埋的(例如，石蠟包埋的)胰臟腫瘤組織上作免疫組織化學染色。組織製備或細胞的固定劑係為本領域所習知，且包含福馬林、戊二醛、甲醇、或類似物(Carson，(組織技術學：自學指示本)(Histotechology: A Self-Instructional Text)，芝加哥：ASCP出版社(Chicago: ASCP Press)，1997年)。免疫組織化學方法可以手動或以自動方式執行。
抗體試劑可在測定中用以使用本領域技術人員已知的任何多種免疫測定法，在病患樣本內檢測ASPM、ATP9A、ACOX3、CDC45L、SLC40A1、AGR2、和/或表2中所示者的表現量。免疫測定技術及指南係概略描述於Price和Newman，「免疫測定技術的原則和實踐」(Principles and Practice of Immunoassay)，第2版，樹林字典(Grove's Dictionaries)，1997年；以及Gosling，「免疫測定：實用方法(Immunoassays: A Practical Approach)」，牛津大學出版社(Oxford University Press)，2000年)。能使用多種免疫測定技術，包括競爭性和非競爭性免疫測定。參見，例如，Self等人，生物技術當前觀點期刊(Curr. Opin. Biotechnol)，7: 60-65(1996年)。免疫測定之用詞涵蓋技術包括但不限於，酵素免疫分析(enzyme immunoassay, EIA)像是酵素倍增免疫測定技術(enzyme multiplied immunoassay technique, EMIT)、連結酶免疫吸收測定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、抗體IgM捕獲ELISA (IgM antibody capture ELISA, MAC ELISA)、及微粒子酵素免疫分析法(microparticle enzyme immunoassay, MEIA)；毛細管電泳免疫分析(capillary electrophoresis immunoassay, CEIA)；放射性免疫分析(radioimmunoassay, RIA)；免疫放射測定(immunoradiometric assays, IRMA)；螢光偏極免疫分析(fluorescence polarization immunoassays, FPIA)；以及化學發光測定法(chemiluminescence assays, CL)。如果需要的話，這樣的免疫測定可為自動化。免疫測定亦能與雷射光誘發的螢光結合使用。參見，例如，舒馬(Schmalzing)等人，電泳期刊(Electrophoresis)，18:2184-93(1997年)；Bao，色譜雜誌，生物醫學科學(J. Chromatogr. B. Biomed.)，SCI，699:463-80(1997年))。脂質體免疫測定法，像是流動注射脂質體免疫測定(flow-injection liposome immunoassay)以及脂質體免疫傳感器(liposome immunosensor)亦適用於在特定實施例中使用。參見，例如，Rongen等人，免疫學方法期刊(J. Immunol. Methods)，204:105-133(1997年))。另外，散射比濁測定法，其中蛋白質/抗體複合物之形成會致使光散射之增加，光散射被轉換為作為標記濃度的函數之峰值速率訊號(peak rate signal)，係適用於在本方法的特定實施例中使用。散射比濁測定可購自貝克曼庫爾特公司(Beckman Coulter)(布雷亞，加州；套組#449430)(Brea，CA；Kit#449430)且能使用貝林濁度儀分析器(Behring Nephelometer Analyzer)執行(Fink等人，臨床化學和臨床生物化學(J. Clin. Chem. Clin. Biochem.)，27:261-276(1989年))。
抗體對核酸的特異性免疫結合可被直接或間接地檢測。直接標籤包括連接至抗體之螢光或發光標籤、金屬、染料、放射性核種等。用碘-125(125 I)標籤的抗體可被使用。使用對核酸具特異性的化學發光抗體的化學發光測定法係適用於蛋白質量的敏感性、非放射性偵測。以螢光染料標籤的抗體也適用。螢光染料的示例包括，但不限於，DAPI、螢光素(fluorescein)、赫斯特染色33258(Hoechst 33258)、R-藻藍素(R-phycocyanin)、B-藻紅素(B-phycoerythrin)、R-藻紅素(R-phycoerythrin)、羅丹明(rhodamine)、德克薩斯紅(Texas red)、以及麗絲胺(lissamine)。間接標籤包括在本領域中習知的各種酶，像是山葵過氧化酶(horseradish peroxidase, HRP)、鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)、尿素酶(urease)及其類似物。山葵過氧化酶偵測系統可與例如顯色基質(chromogenic substrate)四甲基聯苯胺(tetramethylbenzidine, TMB)一起使用，而在過氧化氫存在下產生在450nm下可被偵測之水溶性產物。鹼性磷酸酶偵測系統能與，舉例，產生在405nm下易被偵測的水溶性產物之顯色基質磷酸對硝基苯酯(p-nitrophenyl phosphate)一起使用。相似地、β-半乳糖苷酶偵測系統可與顯色基質鄰-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside, ONPG)使用，其在410nm時產生可偵測的水溶性產物。尿素酶偵測系統能與基質像是尿素-溴甲酚紫(urea-bromocresol purple)一起使用(西格瑪免疫化學公司；聖路易，密蘇里州(Sigma Immunochemicals; St. Louis, MO))。
來自直接或間接標籤的訊號可被分析，例如，使用分光光度計來偵測來自顯色基質的顏色；使用輻射計數器(radiation counter)來偵測輻射，像是用以作125 I檢測的γ射線計數器；或使用螢光計(fluorometer)以偵測在特定波長光存在下的螢光。對於連結酶抗體的偵測，定量分析可依照製造商說明而使用分光光度計來進行，像是EMAX微盤分析儀(Microplate Reader)(分子儀器；門洛帕克，加州(Molecular Devices; Menlo Park, CA))。如果有需要的話，特定實施例的測定可自動化或以機器人執行，且來自多個樣品的訊號可同時被偵測。
抗體可以棒、海綿、紙、孔盤及類似物的物理形式固定在各種固體支持物上，像是磁性或色譜介質顆粒、測定平板的表面(例如，微量滴定孔盤)、固體基底材料或膜(例如塑料、尼龍、紙)片段。測試試紙(strip)可藉著在固體支持物上以陣列塗佈抗體或複數個抗體來製備。這試紙接著可被浸入測試樣本裡，並透過洗滌和偵測步驟迅速處理以產生可測量的訊號，像是色斑。
另外，在測定中可使用核酸結合分子像是探針、寡核苷酸、寡核甘酸陣列、和引子，以在病患樣本裡偵測ASPM、ATP9A、ACOX3、CDC45L、SLC40A1、AGR2及/或表2所示者的差別RNA表現，例如，RT-PCR。在一實施例中，RT-PCR根據本領域已知的標準方法來使用。在另一實施例中，像是從例如應用生物系統公司(Applied Biosystems)可取得的泰格門測定(Taqman® assays)之PCR測定可被使用以偵測核酸和其變異。在另一實施例，qPCR和核酸微陣列可被使用於偵測核酸。結合至選取的癌症生物標記的試劑可根據本領域普通技術人員已知的方法被製備或可於商業購得。
核酸分析可使用常規技術，像是南方分析法、反轉錄酶-聚合酶連鎖反應(RT-PCR)來達成，或基於雜交至與編碼序列之標記之一部分互補的核酸序列的任何其他方法(例如，狹縫雜交(slot blot hybridization))亦在特定實施例的範疇裡。可應用的PCR增幅技術描述於，例如，PCR指南：方法和應用手冊(Innis等人，編，1990年)。一般核酸雜交方法被描述於Anderson，「核酸雜交」，生物科學出版社(BIOS Scientific Publishers)，1999年。複數個核酸序列(例如，基因體DNA、mRNA或cDNA)的增幅或雜合也可從排列為陣列之mRNA或cDNA序列來執行。微陣列方法一般描述於Hardiman，「微陣列方法和應用：基礎細節」(Microarrays Methods and Applications: Nuts & Bolts)，DNA出版(DNA Press)，2003年；以及Baldi等人，「DNA微陣列及基因表現：從實驗到數據分析及模型」(DNA Microarrays and Gene Expression: From Experiments to Data Analysis and Modeling)，劍橋大學出版社(Cambridge University Press)，2002年。
核酸標記及其變異的分析可使用本領域已知的技術執行，包含但不限於微陣列、聚合酶連鎖反應(PCR)-系列的分析、序列分析、及電泳分析。PCR-系列分析之非限制性範例包含得自應用生物系統公司的Taqman®對偶之歧異測定。序列分析之非限制性範例包含Maxam-Gilbert定序(Maxam-Gilbert sequencing)、桑格定序(Sanger sequencing)、毛細管陣列DNA定序(capillary array DNA sequencing)、熱循環定序(Sears 等人，生物技術期刊(Biotechniques)，13:626-633(1992年))、固相定序(solid-phase sequencing) (Zimmerman 等人，分子與細胞生物學方法期刊(Methods Mol. Cell Biol.)，3:39-42 (1992年))、以質譜分析法(mass spectrometry)定序像是基質輔助雷射脫附/游離之飛行時間質譜分析法(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry) (MALDI-TOF/MS；Fu 等人，自然生物技術期刊(Nat. Biotechnol.)，16:381-384 (1998年))、以及藉由雜交定序。(Chee 等人，科學期刊(Science)，274:610-614 (1996年)；Drmanac 等人，科學期刊(Science)，260:1649-1652 (1993年)；Drmanac等人，自然生物技術期刊(Nat. Biotechnol.)，16:54-58 (1998年))。電泳分析之非限制性範例包含平板凝膠電泳(slab gel electrophoresis)，像是瓊脂凝膠電泳或聚丙烯醯胺凝膠電泳、毛細管電泳、以及變性梯度凝膠電泳。其他用以偵測核酸變異的方法包含、例如，來自第三波科技公司(Third Wave Technologies, Inc)的INVADER® assay、限制片段長度多型性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)分析、對偶基因特異性寡核苷酸雜合(allele-specific oligonucleotide hybridization)、異源雙鏈遷移率分析(heteroduplex mobility assay)、單股購形多型性(single strand conformational polymorphism, SSCP)分析、單核苷酸引子延伸(single-nucleotide primer extension, SNUPE)以及焦磷酸定序(pyrosequencing)。
可偵測部分可在於此描述的測定中使用。可偵測部分的各種差異可被利用，標籤選擇取決於所需要的敏銳度、與抗體結合的容易性、穩定性的需求、以及可使用的儀器及處理規定。合適的可偵測部分包括，但不限於，放射性核素、螢光染料(例如，螢光素、螢光異硫氰酸鹽(fluorescein isothiocyanate, FITC)、俄勒岡綠(Oregon Green™)、羅丹明、德克薩斯紅、四甲基異硫氰酸羅丹明(tetrarhodimine isothiocynate, TRITC)、Cy3、Cy5等)、螢光標記(例如，綠螢光蛋白(GFP)、藻藍素等)、受到腫瘤相關蛋白酶活化的自動淬火螢光化合物(autoquenched fluorescent compound)、酵素(例如、螢光素酶、山葵過氧化氫酶、鹼性磷酸酶等)、奈米顆粒、生物素(biotin)、長葉毛地黃配質(digoxigenin)及其類似物。
有用的物理形式包含具有複數個離散可定址位置的表面，以用於複數個相異標記的偵測。這樣的形式包括微陣列和某些毛細管儀器。參見，例如，Ng等人，細胞與分子醫學期刊(J. Cell Mol. Med.)，6:329-340(2002年)；美國專利號6019944 (U.S. Pat. No. 6,019,944)。在這些實施例中，每個離散表面位置可包含抗體用於固定一或多種標記以在每個位置進行偵測。表面可選替地包括固定在表面離散位置的一或多個離散顆粒(例如，微粒或奈米顆粒)，其中微粒包括抗體以固定用於偵測的一或多種標記。其他有用的物理形式包括棒、孔盤、海綿及其類似物。
分析可以多種物理型式進行。例如，微量滴定盤的使用或自動化可用於協助大量測試樣本的處理。另外，可發展單一採樣型式以協助診斷或及時預後。
另外，特定實施例的抗體或核酸探針可應用於固定在顯微鏡載玻片上的病患樣本。染色或原位雜合模式所得到的抗體可使用本領域中已知的各種光學或螢光顯微方法的任何一個而可視化。
蛋白質或核酸分析亦可實現，例如，藉由單以高壓液相層析儀(high pressure liquid chromatography, HPLC)或與質譜分析法(例如，MALDI/MS、MALDI-TOF/MS、串聯式MS等)組合。   例示性分子標記
1. 三磷酸腺苷酶，第二類，9A型(ATPase, class II, type 9A, ATP9A)
人類的三磷酸腺苷酶、第二類、9A型(ATP9A)基因(NCBI Entrez Gene 10079)位在第20對染色體上，在基因圖譜基因座20q13.1且編碼912胺基酸。這基因的功能仍不清楚，且只有一個剪接形式。例示性ATP9A序列是公開可取得的，舉例，從GenBank(例如，登錄號NM_006045.1(mRNA)和NP_006036.1(蛋白質))，或UniProtKB(例如，Q2NLD0)。
2. Asp(異常紡錘體)同源物，小頭畸形(microcephaly)相關基因(ASPM)
人類Asp(異常紡錘體)同源物，小頭畸形相關(ASPM)基因(NCBI Entrez Gene 259266)是黑腹果蠅(Drosophila melanogaster )的「異常紡錘體」基因(asp)的人類異種同源物(ortholog)，其位在第1對染色體基因圖譜基因座1q31且分子量為410kD。此基因角色對於胚胎神經母細胞在正常有絲分裂紡錘體功能及有絲分裂紡錘體調控上是不可或缺的。兩個選擇式剪接變體被鑑定。ASPM序列為公開可取得的，舉例，GenBank (例如，登錄號NM_001206846.1、和NM_018136.4 (mRNAs)以及NP_001193775.1，和NP_060606.3 (蛋白質)或UniProtKB (例如，Q8IZT6)。
3. 醯基輔酶A氧化酶3 (Acyl-Coenzyme A oxidase 3)，降植烷(pristanoyl) (ACOX3)
人類醯基輔酶A氧化酶3，降植烷(ACOX3)基因(NCBI Entrez Gene 8310)位在第4對染色體之圖譜基因座4p15.3上。ACOX3在過氧化體內參與2-甲基支鏈脂肪酸(2-methyl branched fatty acids)的去飽和。據知該酵素只在特殊情況下表現，像是在特定發育階段期間、或是在特定組織裡。ACOX3有兩個選擇式剪接變體。例示性ACOX3序列為公開可取得的，舉例，從GenBank(例如，登錄號NM_001101667.1及NM_003501.2 (mRNA)以及NP_001095137.1及NP_003492.2 (蛋白質))，或UniProtKB (例如，O15254)。
4. CDC45細胞分裂週期調控蛋白45-類似物(cell division cycle 45-like )(CDC45L)
人類CDC45細胞分裂週期調控蛋白45(CDC45L)基因(NCBI Entrez Gene 259266)位在第22對染色體之圖譜基因座22q11.21上。CDC45L是高度保留性多蛋白複合物的成員，多蛋白複合物包含Cdc6/Cdc18、微小染色體維持蛋白(minichromosome maintenance proteins, MCMs)及DNA聚合酶，對於真核生物DNA複製的早期步驟來說是不可或缺的。在CDC45L發現編碼不同異構物的多種選擇式剪接轉錄變體。例示性的CDC45L序列為公開可取得的，舉例而言，從GenBank (例如，登錄號NM_001178010.1、NM_001178011.1、及NM_003504.3 (mRNAs)以及NP_001171481.1、NP_001171482.1、及NP_003495.1 (蛋白質))，或UniProtKB (例如，O75419)。
5. 溶質載體家族(Solute carrier family) 40 (鐵調控轉運蛋白((iron-regulated transporter))，成員1 (SLC40A1)
人類溶質載體家族40 (鐵調控轉運蛋白)，成員1(SLC40A1)基因(NCBI Entrez Gene 30061)位在第2對染色體之基因圖譜基因座2q32上。SLC40A1基因編碼細胞膜蛋白，細胞膜蛋白可參與十二指腸上皮細胞之鐵離子傳輸且對鐵過度鬱積疾病遺傳血色素沉著病(hemochromatosis)作上調控。只有一種剪接形式被鑑定。例示性SLC40A1序列為公開可取得的，舉例，從GenBank (例如，登錄號NM_014585.5(mRNA)和NP_997512.1 (蛋白質))，或UniProtKB (例如，Q9NP59)。
6. 前梯度同源物2 (Anterior gradient homolog 2, AGR2)
人類前梯度同源物2 (AGR2)基因(NCBI Entrez Gene 10551)位在第7對染色體之圖譜基因座7p21.3上。AGR2 mRNA及蛋白質在乳癌組織內展現相似的表現模式。AGR2之表現顯示與雌激素受器之表現有正相關性，且與EGF受器之表現有負相關性。例示性AGR2序列為公開可取得的，舉例而言，自GenBank (例如，登錄號NM_006408.3(mRNA)及NP_006399.1(蛋白質))，或UniProtKB (例如，Q4JM47)。
7. 三磷酸腺苷酶、第六類、11C型(ATPase, class VI, type 11C (ATP11C)
人類三磷酸腺苷酶、第六類、11C型(ATP11C)基因(NCBI Entrez Gene 10079)位在X染色體之基因圖譜基因座Xq27.1上，且編碼1132個胺基酸。此基因的功能仍不清楚。有兩個選擇式剪接形式被鑑定。例示性ATP11C序列為公開可取得的，舉例，自GenBank (例如，登錄號NM_001010986.2、及NM_173694.4(mRNA)以及NP_001010986.1、及NP_775965.2(蛋白質))，或UniProtKB (例如，Q8NB49)。
8. 序列相似性家族72，成員A (Family with sequence similarity 72, member A (FAM72A)
序列相似性家族72，成員A (FAM72A)基因(NCBI Entrez Gene 729533)為序列相似性家族72，成員A的人類異種同源物，其位在第1對染色體之基因圖譜基因座1p11上。FAM72A基因編碼具149kD分子量的蛋白質。FAM72A相較於相對之正常組織在數種常見癌症中進行上調控。FAM72A之僅一種剪接形式已經被鑑定。例示性FAM72A序列為公開可取得的，舉例來說，自GenBank (例如，登錄號NM_00123168.1 (mRNA)以及NP_001116640.1 (蛋白質))，或UniProtKB (例如，Q5TYM5)。
9. 磷脂酶A2，X組 (Phospholipase A2, group X) (PLA2G10)
人類磷脂酶A2，X組(PLA2G10)基因(NCBI Entrez Gene 8399)位在第16對染色體之基因圖譜基因座16p13.12上，且編碼由42個胺基酸所組成的蛋白質。PLA2G10基因的功能仍不清楚，且只有一個剪接形式被鑑定。例示性ATP9A序列為公開可取得的，舉例來說，自GenBank (例如，登錄號NM_003561.1 (mRNA)以及NP_003552.1 (蛋白質))，或UniProtKB (例如，O15496)。
10. 胞外基質蛋白2(Matrilin 2)(MATN2)
人類胞外基質蛋白2 (MATN2)基因(NCBI Entrez Gene 4147)位在第8對染色體之基因圖譜基因座8q22上，且編碼由956個胺基酸所組成的蛋白質。MATN2基因的兩種mRNA轉錄本已經被鑑定。例示性MATN2序列為公開可取得的，舉例來說，自GenBank(例如，登錄號NM_002380.3，及NM_030583.2 (mRNA)以及NP_002371.3、及NP_085072.2 (蛋白質))，或UniProtKB (例如，O00339)。
11. 細胞凋亡誘導，TAF9-樣結構域1 (Apoptosis-inducing, TAF9-like domain 1 (APITD1)
人類細胞凋亡誘導，TAF9-樣結構域1 (APITD1)基因(NCBI Entrez Gene 378708)被鑑定位在染色體1p36上之神經母細胞瘤腫瘤抑制候選區域內。其包含為p53媒介轉錄活化所需要之TFIID-31 結構域，相似於TATA盒結合蛋白相關因子(TATA box-binding protein-associated factor)內發現的TAF(II)31。此基因在神經母細胞瘤腫瘤內表現為低量，且在神經母細胞瘤內展現為會減少細胞生長，提示著其在細胞死亡途徑中可具有一定作用。多種選擇式剪接轉錄變體已被鑑定。例示性APITD1序列為公開可取得的，舉例來說，自GenBank (例如，登錄號NM_001270517.1、 NM_198544.3、NM_199006.2及NM_001243768.1(mRNA)以及NP_001257446.1、NP_940946.1、及NP_950171.2、以及NP_001230697.1 (蛋白質))，或UniProtKB (例如，H2PXZ6)。
12. 致動蛋白家族成員(Kinesin family member 11) (KIF11)
人類致動蛋白家族成員11 (KIF11)基因(NCBI Entrez Gene 3832)位在第10對染色體之基因圖譜基因座10q24.1上。KIF11編碼馬達蛋白(motor protein)，馬達蛋白(motor protein)屬於致動類蛋白家族。此蛋白家族成員已知參與各種紡錘體動力學。KIF11功能包含細胞有絲分裂期間之染色體定位、中心體分離及建立雙極紡錘體。只有一種KIF11的剪接形式。例示性KIF11序列為公開可取得的，舉例來說，自GenBank (例如，登錄號NM_004523.3 (mRNA)以及NP_004514.2 (蛋白質))，或UniProtKB (例如，P52732)。   例示性套組、設備、及組成
A. 套組
設想為套組有用於協助本揭露方法之特定實施例的實行。在一實施例中，套組係被提供用於偵測表2中所揭露的一或多個基因(像是，表2中所揭露之至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個、至少25個、至少26個、或至少27個或全部28個基因)。在一實施例中，套組係提供用以至少偵測ASPM和ATP9A核酸或蛋白質分子，舉例來說，與一或多個管家基因或蛋白質組合(例如，b-肌動蛋白(b-actin)、GAPDH、RPL13A、微管蛋白(tubulin)及蛋白質生物化學領域內熟知的其他類似物)。在另一個實施例中，套組被提供用以至少偵測ASPM、ATP9A及ACOX3核酸或蛋白質分子，舉例來說，與一至多個管家基因或蛋白質組合。偵測器或偵測方法可包含基因體變化的偵測器，包括像是mRNA或蛋白質之基因及/或基因表現產物。偵測器可包含但不限於，對包括所述揭露基因的基因體序列具特異性的核酸探針、對由上述基因編碼的轉錄本(例如，mRNA)具特異性的核酸探針、對所述揭露基因具增幅特異性的一對引子、對由所述揭露基因編碼的蛋白質具特異性的抗體或抗體片段、或對由所述揭露基因編碼的蛋白質具特異性的適配體。在特定的實施例中，套組可包括從對ASPM轉錄本具特異性的核酸探針、對ATP9A轉錄本具特異性的核酸探針、對ACOX3轉錄本具特異性的核酸探針、以及對表2中列出的其他基因的轉錄本具特異性的核酸探針、對ASPM具增幅特異性的一對引子、對ATP9A具增幅特異性的一對引子、對ACOX3具增幅特異性的一對引子、以及對表2中列出的其他基因的轉錄本具增幅特異性的一對引子、對ATP9A蛋白質具特異性的抗體、對ASPM蛋白質具特異性的抗體、對ACOX3蛋白質具特異性的抗體、以及對由表2中列出的基因編碼的蛋白質具特異性的抗體中所挑選的一或多種(例如，兩個、三個或四個)偵測器。特定套組實施例可進一步包括，例如，從對管家轉錄本具特異性的核酸探針、對管家轉錄本具增幅特異性的一對引子、以及對一或多種管家蛋白具特異性的抗體中所挑選的一或多種(例如，兩個、三個或四個)偵測器。
在一些實施例中，一級偵測裝置(例如，核酸探針、核酸引子、或抗體)可直接以螢光團、發色團、或能夠產生可偵測產物的酵素(例如，鹼性磷酸酶、山葵過氧化酶及其他本領域所一般習知者)來標籤。在另一實施例中，套組被設置包含第二偵測裝置，像是二級抗體或非抗體半抗原結合分子(non-antibody hapten-binding molecule)(例如，抗生物素蛋白(avidin)或鏈親和素(streptavidin)。在某些這樣的實例中，二級偵測裝置將直接以可偵測部分來標籤。在其他情況中，二級或更高級別抗體可結合至半抗原(例如，生物素、DNP、或FITC)，半抗原藉由同源半抗原結合分子(例如、鏈親和素山葵過氧化酶、鏈親和素鹼性磷酸酶、或鏈親和素QDotTM )來偵測。某些套組實施例可包含比色試劑在合適容器內以與一級、二級或更高級別偵測裝置一起使用，這些偵測裝置以對這類比色試劑顯影之酵素所標籤。
在一個實施例中，套組包括陽性或陰性控制組樣本，像是相應於或不相應於表2中列出的基因轉錄本的核酸樣本，含有或不含有由表2列出的基因所編碼的蛋白質或片段蛋白質的蛋白質溶解產物(protein lysate)、及/或表現或不表現表2中列出的基因或基因產物之已知細胞株或組織。
本文提供的方法中所使用的核酸探針或引子可從市售來源獲得，或者可使用本領域中已知技術來製備。核酸探針和引子為能夠與標靶核酸分子(例如，基因體的標靶核酸分子)雜合的核酸分子。例如，對ASPM、ATP9A、ACOX3或表2中列出的基因具特異性之探針，當雜合至標靶時，係能夠被直接或間接地偵測。對ASPM、ATP9A、ACOX3或表2中列出的基因具特異性的引子，當雜合至標靶時，係能夠增幅該標靶基因，且生成之擴增物能夠被直接或間接地偵測。
本文提供的方法中所使用的抗體或適配體，可從市售來源獲得，或者可使用本領域中已知技術來製備。抗體是免疫球蛋白分子(或其組合)，抗體係特異性結合至特定抗原或免疫地與特定抗原反應，且包括多株、單株、抗體的基因工程及其他修飾形式，包括但不限於嵌合抗體(chimeric antibodies)、人源化抗體(humanized antibody)、雜共軛抗體(hetero-conjugate antibody)、單鏈Fv抗體(single chain Fv antibody)、含有足以使特定抗原結合至多肽的至少一部分免疫球蛋白的多肽、以及抗體的抗原結合片段。抗體片段包括蛋白水解抗體片段、重組抗體片段、互補性決定區域片段、駱駝抗體(例如，美國專利號6015695；6005079；5874541；5840526；5800988；和5759808)、以及透過軟骨和硬骨魚產生的抗體及其分離的結合結構域。
抗體的市售來源包括西格瑪-奧德里奇(Sigma-Aldrich)(聖路易，密蘇里州，美國)、聖塔克魯茲(Santa Cruz)(聖塔克魯茲，加州，美國(Santa Cruz, CA, USA))、亞諾法(Abnova)(臺北，臺灣)、SDIX(紐瓦克，德拉瓦州，美國(Neward, DE, USA))、EMD 密理博(EMD Millipore)(比爾里卡，麻州，美國(Billerica, MA, USA))、Gene Tex(爾灣，加州，美國(Irvine, CA, USA))、Epitomics(伯靈格姆，加州，美國(Burlingame, CA, USA))、LSBio(西雅圖，華盛頓州，美國(Seattle, WA, USA))及其他抗體提供者。表1顯示例示性市售之針對ATP9A、ASPM、ACOX3、CDC45L、SLC40A1及AGR2的抗體來源。
產生抗體(例如，單株或多株抗體)的方法在本領域中為習知的(例如，Harlow和Lane，抗體：實驗室手冊(Antibodies: A Laboratory Manual)，冷泉港實驗室，紐約(Cold Spring Harbor Laboratory, New York)，1988年)。例如，在表2中所列的蛋白質，像是ASPM、ATP9A、ACOX3、CDC45L、SLC40A1、或AGR2之一的胜肽片段，可被偶聯至載體分子(或編碼這些表位(epitope)的核酸)，可注入到非人類哺乳動物(例如，小鼠或兔子)，隨後加強注射以產生抗體反應。從免疫動物分離的血清可分離出包含在其中的多株抗體，或者來自免疫動物的脾臟可用於融合瘤(hybridomas)及單株抗體的生產。抗體可在使用前進一步純化。
本文揭露的方法中所使用的適配體包含單股核酸分子(例如DNA或RNA)，其呈現一或多個特定的序列特異性形狀且以高親和力及特異性結合至表2中所列的基因蛋白質產物之一。在另一範例中，適配體是以高親和力及特異性結合至表2中列出的基因蛋白產物之一的胜肽適配體。胜肽適配體包括胜肽環(peptide loop)，其對於蛋白質支架附接在兩端之標靶蛋白具特異性。該支架可以是穩定的、可溶的、小的、及無毒的任何蛋白質。胜肽適配體選擇可使用不同系統進行，像是酵母雙雜合系統或Lex A相互作用陷阱系統(Lex A interaction trap system)。
在特定實施例中，套組可包括載體裝置，如盒、袋、瓶、管、手提袋、塑料箱、包裝、或其他容器。在一些例子中，套組組件將被封閉在可具有隔室之單一包裝單元內，套組的一或多個組件可放置於其中。在其他範例中，套組包括一或多個容器，其可保留，例如，一或多種待進行測試的生物樣本。在一些實施例中，套組可包括緩衝劑及可用於特定揭露方法實踐中的其他試劑。這樣的套組及適宜內容係為本領域技術人員所習知。
B. 陣列
設想用於協助本揭露方法的實踐之微陣列。對基因或蛋白質作偵測的微陣列在本領域中為習知的。微陣列包括一固體表面(例如，玻璃載玻片)，其上固定有多個(例如，幾百或幾千)特異性結合劑(例如，cDNA探針、mRNA探針、或抗體)。該特異性結合劑在陣列上依可定址(例如，網格)之形式而清楚地定位。該特異性結合劑與樣本中存在的同源標靶相互作用。所有固定試劑之標靶結合模式提供了基因表現的分析。代表性微陣列描述於例如，美國專利號5412087、5445934、5744305、6897073、7247469、7166431、7060431、7033754、6998274、6942968、6890764、6858394、6770441、6620584、6544732、6429027、6396995及6355431。
本文揭露對表2列出的基因或基因產物之至少三個作檢測的核酸或蛋白質陣列。在特定實施例中，揭露的陣列由對至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個、至少25個、至少26個、至少27個或全部28個揭露基因具特異性之結合劑組成。在特定的實施例，陣列由對ASPM、ATP9A和ACOX3具特異性的核酸探針或抗體組成。在另一特定實施例中，陣列由對ASPM、ATP9A、ACOX3、CDC45L、SLC40A1及AGR2具特異性的核酸探針或抗體組成。在另一特定實施例中，陣列由對ASPM、ATP9A、ACOX3、CDC45L、SLC40A1、AGR2、ATP11C、FAM72A、PLA2G10、MATN2、APITD1及KIF11具特異性的核酸探針或抗體組成。其他陣列實施例由對表2所列的28個基因之每一個具特異性的核酸探針或抗體所組成，包括ASPM、ATP9A、ACOX3、CDC45L、SLC40A1、AGR2、ATP11C、FAM72A、PLA2G10、MATN2、APITD1、KIF11、HPGD、HMMR、ELF3、PTTG1、UPP1、CCNB2、CREG1、ARSD、CENPN、SMC4、DLGAP5、PIK3AP1、TLR3、TWIST1、GCLM及CTSS。在特定實施例中，陣列還包括對一或多個管家基因或其基因產物，像是mRNA、cDNA或蛋白質，具特異性之核酸探針或抗體。
形成陣列的核酸探針或抗體可直接連結至支持物或藉由寡核苷酸或作用為固體支持物的間隔物或連接物的其他分子而附接至支持物。
陣列固體支持物可為玻璃載玻片或由有機聚合物所形成。各種陣列型式可依據特定實施例來執行。舉例而言，寡核苷酸條帶的線性陣列、離散細胞的二維圖案、或其他型式(例如，美國專利號5981185)。
合適的陣列可藉以各種方法來製備。在一個範例中，寡核苷酸或蛋白質序列係分別合成，然後附著到固體支持物(例如，美國專利號6013789)。在另一個例子中，序列被直接合成到支持物上，以設置期望陣列(例如，美國專利號5554501)。寡核苷酸探針可透過寡核苷酸的3'端或寡核苷酸的5'端被結合到支持物。   定義
如本文所使用，「胰臟癌」指惡性哺乳動物癌症，特別是，源自外分泌胰腺組織內上皮細胞之腺體癌症。在本申請中所涵蓋的胰臟癌包括轉移性及非轉移性癌症。
如本文所使用，「腺體癌症」指源於腺上皮的惡性腫瘤，其中包括但不限於外分泌胰腺(胰腺癌)、乳腺(乳癌)、攝護腺腺體(攝護腺癌)、結腸上皮(結腸癌)、胃上皮(胃癌)、唾液腺(唾液腺癌)、腎上腺(腎上腺癌)及甲狀腺(甲狀腺癌)。
術語「分化」指於發育期間器官或組織的結構或功能之一般性或特異性變化。分化概念在本領域為習知的，且不需要在此進一步說明。例如，胰臟細胞分化表示其中包括正常胰腺腺體的腺體結構形成之過程，及/或激素或分泌功能之獲得。
術語「癌症幹細胞」指的是可自我更新、在腫瘤腫塊產生多種細胞、或在宿主內起始腫瘤之癌症細胞亞族群。
如本文所使用，術語「臨床預後」指患有胰臟癌之受試者之結果，包括腫瘤復發之似然度、存活、疾病進展、及對治療的反應。胰臟癌治療(例如，胰臟切除術)後的復發表示了較具侵襲性的癌症、宿主(例如，胰臟癌病患)的較短存活期、腫瘤大小、體積或數目的增加似然度、及/或治療失敗的增加似然度。
如本文所使用，術語「評估臨床預後」指提供胰臟癌的可能病程或結果的評估，包括轉移、多重抗藥性、無發病存活、總存活、復發等的評估。該方法也能用來擬出用於治療癌症的合適療法，例如，藉由指出癌症是否仍處於早期階段，或者癌症已經進程到積極治療(aggressive therapy)將無效之階段。
如本文所使用，術語「復發」指初始或後續處理後胰臟癌的再犯。代表性治療包括任何手術形式(如胰頭十二指腸切除術或惠爾普手術(Whipple procedure)、遠端胰臟切除術、部分胰臟切除術，以及和全胰臟切除術)、任何放射治療形式、任何化學治療或生物治療形式，任何激素治療形式。在一些實施例中，胰臟癌的復發是由胰臟癌提昇之血清或血漿標記所標明，像是醣類抗原19-9(CA19-9)(Koprowski等人，1981年)和癌胚抗原(CEA)(Gold和Freedman，1965年)，及/或藉由自胰臟癌受試者的任何生物樣本作胰臟癌細胞的鑑定。
如本文所使用，術語「疾病進展」指雖給予治療但其中胰臟癌的一或多個指數(例如，血清CA19-9或CEA量、可測量的腫瘤大小或體積、或者新的病灶)顯示疾病仍正在進展之情況。
「ASPM」、「ATP9A」、「ACOX3」、「CDC45L」、「SLC40A1」、「AGR2」及其他在此陳述的分子標記，包括表2中所示者，係指核酸，例如，基因、pre-mRNA、mRNA、及多肽，多型變體、對偶基因、突變、及種間同源物，其中：(1)具有一胺基酸序列，其對於由本文描述之參考核酸或胺基酸序列所編碼的多肽具大於約60％胺基酸序列相似性，65％、70％、75％、80％、85％、90％、優選地為91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的胺基酸序列相似性，優選地，至少超過約25、50、100、200、500、1000或更多胺基酸區域的區域；(2)特異接合至針對免疫原所培養之例如多株抗體的抗體，免疫原包括參考的胺基酸序列、其免疫原片段、及其保守性修飾變體；(3)在嚴苛雜合條件下得以特異性雜合至編碼參考胺基酸序列的核酸、及其保守性修飾變體；(4)具有一核酸序列，對參考核酸序列具有大於約60％的核苷酸序列相似性、65％、70％、75％、80％、85％、90％、優選地91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的核苷酸序列相似性，優選地至少約10、15、20、25、50、100、200、500、1000、或更多核苷酸之區域。多核苷酸或多肽序列通常來自哺乳動物包括，但不限於，靈長類動物，例如，人；囓齒動物，例如大鼠、小鼠、倉鼠；牛、豬、馬、羊、或任何哺乳動物。特定實施例的核酸及蛋白質包括天然存在或重組的分子。這些抗原的截斷和選擇式剪接形式都包括在其定義中。
「差異地表現」或「差異地調控」之用語通常指相較於特定實施例內容的至少一個其他樣本，在一樣本中過量表現(上調控)或壓抑表現(underexpressed)(下調控)蛋白質或核酸。
術語「分子標記」、「基因標記」、「癌症相關抗原」、「腫瘤特異性標記」、「腫瘤標記」、「標記」或「生物標記」可互換地指在細胞中差異地表現之分子或基因(通常為蛋白質或核酸諸如RNA)，其相較於非癌細胞或其他癌細胞表現在癌細胞的表面上或由癌細胞分泌，並且對於癌症診斷是有用的，以提供預後及癌細胞藥理學試劑的選定標靶。在特定實施例中，癌症相關抗原是相較於非癌細胞或其他癌細胞在癌細胞內過量表現或壓抑表現的分子，例如相較於非癌細胞具超過1倍的表現、2倍的過量表現、3倍的過量表現或更多，或例如相較於非癌細胞之20％、30％、40％、50％或更多之壓抑表現。在特定實施例中，與癌症相關的抗原是在癌症細胞內不適當地合成之分子，例如，相較於非癌細胞內表現的分子，包含缺失、添加或突變的分子。在特定實施例中，與癌症相關的抗原將僅僅表現在癌細胞的細胞表面上，而不會在正常細胞的表面上被合成或表現。例示性的細胞表面之腫瘤標記包括醣類抗原19-9(CA19-9)(Koprowski等人，1981年)及癌胚抗原(CEA)(Gold和Freedman，1965年)。在特定實施例中，與癌症相關的抗原將非主要在癌細胞的表面上表現。
將為本領域技術人員理解的是，標記可為了任何用途而單獨或與其他標記組合來使用，例如，在本文揭露之多重抗藥性癌症的診斷及預後。
「生物樣本」包括組織之切片如活體組織切片及屍體剖檢樣本、以及用於組織學用途所取得的冷凍切片。這樣的樣本包括胰臟癌組織、血液和血液成分或產物(例如，血清、血漿、血小板、紅血球及類似物)、痰、組織、培養細胞，例如，初代培養、外植體、及轉型細胞、糞便、尿等。生物樣本通常是從真核有機體取得，最優選的是哺乳動物，例如靈長類，如黑猩猩或人；牛；狗；貓；囓齒動物，例如，天竺鼠、大鼠、小鼠；兔子；或鳥；爬蟲類；或魚。
「活體組織切片」指用於診斷或預後評估之移除組織樣本的過程，及其組織樣本。任何本領域已知的活體組織切片技術可被應用於特定實施例的診斷及預後方法。活體組織切片技術的應用，除去其他因素外，將取決於要進行評估之組織類型(例如，胰臟癌等)、腫瘤大小及類型。代表性活體組織切片技術包括但不限於切除式活體組織切片檢查(excisional biopsy)、切開式活體組織切片檢查(incisional biopsy)、穿刺活體組織切片檢查(needle biopsy)、手術活體組織切片檢查、以及骨髓活體組織切片檢查。「切除式活體組織切片檢查」指對整個腫瘤腫塊與其周圍正常組織作小幅度的移除。「切開式活體組織切片檢查」指包括腫瘤橫截面直徑之組織楔形切除。經內視鏡或螢光檢查作的診斷或預後可一般涉及從目標組織內的細胞懸浮液所獲得之「粗針穿刺活體組織切片檢查」或「細針穿刺活體組織切片檢查」。活體組織切片技術被探討於，例如，哈里森的內科醫學原理(Harrison’s Principles of Internal Medicine )，Kasper等人，編，第16版，2005年，第70章，以及整個第五部分(Part V)。
「核酸」指為單股或雙股任一形式之去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物、及其互補物。該術語包括含有已知核苷酸類似物或修飾骨架基或鍵結之核酸，其為​​合成的、天然存在的及非天然存在的，具有如同參考核酸之類似結合特性，且以類似參考核苷酸的方式代謝。這些類似物的實例包括，但不限於，硫代磷酸酯(phosphorothioates)、磷醯胺酯(phosphoramidates)、甲基磷酸酯(methyl phosphonates)、手性甲基磷酸酯(chiral-methyl phosphonates)、2-O-甲基核糖核苷酸(2-O-methyl ribonucleotides)、肽核酸(peptide-nucleic acids, PNAs)。
除非另有說明，特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守性修飾變體(例如，簡併密碼子置換(degenerate codon substitution))及互補序列、以及明確指出的序列。具體而言，簡併密碼子置換可透過產生序列來達成，其中一或多個所選的(或所有)密碼子的第三位置被混合鹼基和/或去氧肌苷殘基(residue)置換(Batzer等人，核酸研究期刊(Nucleic Acid Res.)，19:5081 (1991年)；Ohtsuka等人，生物化學期刊(J. Biol. Chem)，260:2605-2608(1985年)；Rossolini等人，分子與細胞探針期刊(Mol. Cell. Probes)，8:91-98(1994年)。術語核酸與基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸及多核苷酸係互換地使用。
特定核酸序列也隱含地涵蓋「剪接變體」及編碼癌症生物標記的截斷形式之核酸序列。類似地，由核酸編碼的特定蛋白質隱含涵蓋由剪接變體或該核酸的截斷形式所編碼的任何蛋白質。「剪接變體」，顧名思義，是一個基因選擇式剪接的產物。轉錄後，初始的核酸轉錄本可能被剪接，使得不同(交替)的核酸剪接產物編碼不同的多肽。用於剪接變體生成的機制各不相同，但包括外顯子的選擇式剪接。源自由通讀轉錄相同核酸的交替多肽也包括在這個定義中。剪接反應的任何產物，包括剪接產物的重組形式，都包括在這定義中。核酸可在5'端或3'端被截斷。多肽可在其胺基末端(N-terminal)或羧基末端(C-terminal)被截斷。核酸或多肽序列的截斷形式可能天然地存在或由重組所創造。
術語「多肽」，「胜肽」和「蛋白質」在本文中可互換用於指胺基酸殘基的聚合物。該術語應用於胺基酸聚合物，其中一或多個胺基酸殘基係相應天然存在的胺基酸之人工化學模擬物(mimetics)，以及天然存在的胺基酸聚合物及非天然存在的胺基酸聚合物。
術語「胺基酸」是指天然存在及合成的胺基酸，以及以類似於天然存在的胺基酸的方式作用之胺基酸類似物及胺基酸模擬物。天然存在的胺基酸為由遺傳密碼所編碼，且後來經修飾的那些胺基酸，例如羥脯胺酸(hydroxyproline)、γ-羧基谷胺酸(γ-carboxyglutamate)及O-磷酸絲胺酸(O-phosphoserine)。胺基酸類似物係指與天然存在的胺基酸具有相同基本化學結構之化合物，即，結合到氫、羧基、胺基、及R基團的α碳，例如，高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲基甲硫胺酸鋶(methionine methyl sulfonium)。這種類似物具有修飾的R基團(例如，正白胺酸)或修飾的胜肽骨架，但保留與天然存在的胺基酸相同的基本化學結構。胺基酸模擬物指具有與胺基酸的一般化學結構不同的結構，但以類似於天然存在的胺基酸之方式作用之化學化合物。
胺基酸可於此藉由通常習知的三字母符號或由IUPAC-IUB生物化學命名委員會(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)所建議的一單字母符號來指代。同樣地，核苷酸可通過其普遍接受的單一字母碼所表示。
「保守性修飾變體」適用於胺基酸和核酸序列。相對於特定核酸序列，保守性修飾變體指編碼相同或基本相同的胺基酸序列之核酸，或其中所述核酸在不編碼胺基酸序列時係為基本相同的序列。由於遺傳密碼的簡併性，大量功能相同的核酸編碼任意給定蛋白質。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼胺基酸丙胺酸。因此，在其中藉由密碼子指定為丙胺酸的每個位置中，該密碼子可替換成任何相應描述的密碼子而不會改變所編碼的多肽。此類核酸變異是「沉默變異」，為保守性修飾變異的一種。本文中編碼多肽的每一個核酸序列還描述了核酸的每種可能的沉默變異。技術人員將認知到在核酸中的每個密碼子(除了AUG，其通常是甲硫胺酸的唯一密碼子，及TGG，通常是色胺酸的唯一密碼子)可被修飾以產生功能相同的分子。因此，核酸，相對於表現產物而非相對於實際的探針序列來編碼多肽的核酸之每個沉默變異係隱含在每個描述序列內。
至於胺基酸序列，技術人員將認知到，對核酸、胜肽，多肽或蛋白質序列之個別取代、缺失或添加，在所編碼的序列中改變、添加或刪除單個胺基酸或胺基酸的一小部分是「保守性修飾變體」，其中變更致使胺基酸為化學上相似胺基酸的置換。提供功能相似胺基酸的保守置換在本領域為習知的。此類保守性修飾變體不單只有多型變體、種間同源物、及特定實施例的對偶基因。
下列八組每個皆含有相對彼此為保守取代之胺基酸：1)丙胺酸(A)、甘胺酸(G)；2)天冬胺酸(D)、谷胺酸(E)；3)天門冬醯胺(N)、穀氨醯胺(Q)；4)精胺酸(R)、賴氨酸(K)；5)異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)；6)苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)；7)絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；和8)半胱胺酸(C)、甲硫胺酸(M)(參見，例如，Creighton，蛋白質(Proteins)(1984年))。
一個「標籤」或「可偵測部分」是藉由光譜、光化學、生物化學、免疫化學、化學、或其他物理方法可偵測的成份。例如，有用的標籤包括可為可偵測的磷32 (32 P)、螢光染料、電子緻密試劑、酵素(例如，在ELISA中通常使用的)、生物素、長葉毛地黃配質、或半抗原及蛋白質，例如，藉由併入放射性標籤至胜肽或用於檢測與胜肽特異性反應的抗體。
對於PCR而言，一般約36℃的溫度係用於低嚴謹度增幅，儘管退火溫度可能取決於引子長度而在約32℃及48℃之間變動。對於高嚴謹度PCR增幅來說，約62℃的溫度為代表標準，儘管高嚴謹度退火溫度範圍取決於引子長度及特異性而可介於約50℃至約65℃。高低嚴謹度增幅的標準循環條件包括90℃-95℃的變性階段(denaturation phase)30秒至2分鐘、退火階段(annealing phase)持續30秒至2分鐘、以及約72℃的擴展階段(extension phase) 1至2分鐘。高低嚴謹度增幅反應的指南準則被提供於，例如，在Innis等人，(1990年)PCR指南，方法及應用指導(PCR Protocols, A Guide to Methods and Application)，學術出版社，紐約(Academic Press, Inc. N.Y.)。
「抗體」是指包含特異性地結合及辨識抗原之來自免疫球蛋白基因或其片段的骨架區域(framework region)的多肽。辨識免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε及μ恆定區基因，以及無數的免疫球蛋白可變區基因。輕鏈被分類為κ或λ。重鏈分為γ、μ、α、δ或ε，從而定義了免疫球蛋白分類，分別為IgG、IgM、IgA、IgD及IgE。通常，抗體的抗原結合區對於結合特異性及親和力而言將為最關鍵處。
例示性的免疫球蛋白(抗體)結構單元包含四聚體(tetramer)。每個四聚體由兩對相同的多肽鏈組成，每一對具有一個「輕」鏈(約25kD)、以及一個「重」鏈(約50-70kD)。每條鏈的胺基末端定義了主要負責抗原識別的可變區之約100至110或更多個胺基酸。術語可變輕鏈(VL )和可變重鏈(VH )分別指這些輕鏈和重鏈。
抗體存在，例如，作為完整免疫球蛋白或作為數個由各種胜肽酶分解而產生的充分表徵片段。因此，例如，胃蛋白酶消化樞紐區(hinge)之雙硫鍵結(disulfide linkage)以下的抗體以產生F(ab)'2 ，Fab二聚體，其自身透過雙硫鍵(disulfide bond)而連接到VH -CH 1的輕鏈。F(ab)'2 可在溫和條件下被還原以打破樞紐區內的雙硫鍵結，從而將F(ab)'2 二聚體轉化為Fab'單體。所述Fab'單體實質上是Fab及樞紐區的一部分，參見基礎免疫學(Fundamental Immunology)(Paul編，第3版，1993年)。雖然各種抗體片段係根據完整抗體的分解來定義，技術人員將理解的是這樣的片段可以化學方法或透過使用重組DNA方法學來從頭合成。因此，術語抗體，如本文所用，還包括抗體片段，無論是透過完整抗體的修飾來產生、或使用重組DNA方法學來從頭合成(例如，單鏈Fv)，或使用噬菌體展示庫(phage display library)來定義(參見，例如，McCafferty等人，自然期刊(Nature)，348:552-554 (1990年))。 【00140】    為了製備抗體，例如，重組、單株、或多株抗體，可使用多種本領域習知技術 (參見，例如，Kohler 及Milstein，自然期刊(Nature)，256:495-497(1975年)；Kozbor等人，今日免疫學期刊(Immunology Today)，4:72(1983年)；Cole等人，單株抗體和癌症治療(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy) 第77-96頁，Alan R. Liss公司(1985年)；Coligan，免疫學的通用指南(Current Protocols in Immunology)(1991年)；Harlow及Lane，抗體，實驗室手冊(Antibodies, A Laboratory Manual)(1988年)；以及Goding，單株抗體：原理與實踐(Monoclonal Antibodies: Principles and Practic)(第2版，1986年)。編碼感興趣抗體的重鏈及輕鏈的基因可從一個細胞來複製，例如，編碼單株抗體的基因可從融合瘤來複製，並且用於產生重組單株抗體。編碼單株抗體的重鏈及輕鏈的基因庫(gene library)也能從融合瘤或漿細胞來製造。重鏈及輕鏈基因產物的隨機組合產生具有不同抗原特異性的大量抗體(參見，例如，Kuby，免疫學(Immunology)，(第3版，1997年))。用於單鏈抗體或重組抗體的生產技術(美國專利號4946778，美國專利號4816567)可適用於產生針對特定實施例多肽之抗體。此外，基因轉殖的小鼠、或其他有機體如其他哺乳類，可被用於表現人源化或人類抗體(參見，例如，美國專利號5545807、5545806、5569825、5625126、5633425、5661016；Marks等人，生物-技術期刊(Bio/Technology)，10:779-783(1992年)；Lonberg等人，自然期刊(Nature)，368:856-859 (1994年)；Morrison，自然期刊(Nature)，368:812-13 (1994年)；Fishwild等人，自然生物技術期刊(Nature Biotechnology)，14:845-51(1996年)；Neuberger，自然生物技術期刊(Nature Biotechnology)，14:826 (1996年)；以及Lonberg及Huszar，國際免疫學期刊(Intern. Rev. Immunol)，13:65-93 (1995年))。另外，噬菌體展示技術可用於鑑定特異性結合至選取抗原之抗體及異質Fab片段(參見，例如，McCafferty等人，自然期刊(Nature)，348:552-554(1990年)；Marks等人，生物-技術期刊(Bio/Technology)，10:779-783(1992))。抗體也可被製成雙特異性，亦即，能夠辨識兩種不同的抗原(參見，例如，WO 93/08829，Traunecker等人，歐洲分子生物學組織期刊(EMBO J)，10:3655-3659(1991年)；以及Suresh等人，酵素學方法(Methods in Enzymology)，121:210(1986年))。抗體也可為異源耦聯(heteroconjugates)，例如，兩個共價連接抗體，或免疫毒素(參見，例如，美國專利號4676980，WO 91/00360、WO 92/200373；以及EP 03089)。
用以人源化或靈長類化(primatizing)非人類抗體的方法在本領域中為習知的。通常，人源化抗體具有從非人類來源引介至其內的一或多個胺基酸殘基。這些非人類胺基酸殘基常被稱為輸入殘基(import residue)，其通常取自輸入可變結構域(import variable domain)。人源化可基本上依照Winter及其同事的方法藉由置換囓齒動物互補性決定區(complementarity determining region, CDR)或CDR序列為人類抗體的相應序列而執行(參見，例如，Jones等人，自然期刊(Nature)，321:522-525 (1986年)；Riechmann等人，自然期刊(Nature)，332:323-327(1988年)；Verhoeyen 等人，科學期刊(Science)，239:1534-1536(1988年)以及Presta，結構生物學當前觀點期刊(Curr. Op. Struct. Biol)，2:593-596(1992年))。因此，這樣的人源化抗體為嵌合抗體(美國專利號4816567)，其中基本上少於一完整人類可變結構域係由源自非人類物種的相應序列所置換。在實踐中，人源化抗體通常是人類抗體，在其中一些CDR殘基及可能的一些基本骨架區域(FR)殘基被來自囓齒動物抗體內類似位的殘基所取代。
「嵌合抗體」是其中(a)恆定區或其一部分被改變、替換或交換之抗體分子，使得抗原結合位(antigen-binding site)(可變區)連接至不同或改變的類別、效器功能(effector function)及/或物種的恆定區，或賦予嵌合抗體新屬性之完全不同的分子，例如，酵素、毒素、激素、生長因子、藥物等；或(b)可變區或其一部分以具有不同或改變的抗原特異性的可變區被改變、替換或交換。
在一個實施例中，所述抗體係共軛至「效器」部分。效器部分可為任何數目的分子，包括標籤部分像是放射性標籤或螢光標籤、或可為治療部分。在一個態樣中，抗體調變蛋白質活性。
通常在蛋白質及其他生物製劑的異質群集中，當片語「特異性(或挑選性)結合」至抗體或「特異性(或挑選性)與…免疫反應」論及蛋白質或胜肽時，係指測定蛋白質存在的結合反應。因此，在指定免疫測定條件下，以背景至少兩倍使指定抗體結合至特定蛋白質，且較通常以背景大於10至100倍。這樣的條件下對抗體特異性結合可包括選擇用以針對特定蛋白質之抗體。舉例而言，多株抗體可被選擇以獲得僅​​特異性與選取抗原進行免疫反應且不會與其他蛋白質免疫反應的多株抗體。這個選擇可藉由刪去與其他分子交叉反應的抗體來達成。多種免疫測定型式可被使用，以選擇與特定蛋白質特異性免疫反應的抗體。例如，固相ELISA免疫測定係常規地用於挑選與蛋白質特異性免疫反應的抗體(參見，Harlow及Lane，抗體，實驗室手冊(Antibodies, A Laboratory Manual )(1988年)，說明可用以測定特異性免疫反應的免疫測定型式及條件)。   實施例
下面的實施例僅被提供用於說明目的，而非旨在限制，除非另有說明。應當被本領域技術人員理解的是，在由發明人發現的下列技術實施例內所揭露的技術，在特定實施例的實踐中運作良好。本領域的技術人員應當理解，許多變更可在所揭露之特定實施例內進行，且仍依獲得相同或類似結果，而不脫離本揭露的精神及範疇。 實施例1
本實施例描述與胰腺上皮小管(pancreatic epithelial tubule)分化相關的基因表現譜之鑑定。
攝護腺腺體的小管分化過程係藉由在生理相關的三維(3D)培養模式內培養永生化胰腺上皮細胞(HPDE細胞)而被概括，如之前(Weaver等人，1997年)中描述。為人類乳突狀病毒-E6和-E7基因永生化的胰腺導管上皮細胞(Bello等人，1997年；Liu等人，1998年)之人類胰腺導管上皮(human pancreatic ductal epithelial, HPDE)細胞，係在組織培養塑料上被培育於角質細胞-SFM內(西格瑪-奧德里奇公司，聖路易斯，密蘇里州)，補充有牛腦垂體萃取物(bovine pituitary extract)、10 ng/ml的EGF、0.5％馬血清和抗生素(Invitrogen公司，卡爾斯巴德，加州(Invitrogen, Carlsbad, CA))。HPDE細胞被接種於厚層的3D重組基底膜凝膠(Matrigel，BD生物科學事業(BD Biosciences))的頂部。細胞相對高的接種密度(4´104 /cm2 )被用來促進細胞對細胞之相互作用以及隨後的組織形態演發過程。將培養物維持在補充有牛腦垂體萃取物、10 ng/ml的表皮生長因子及抗生素(均來自Invitrogen公司)的角質細胞-SFM內(西格瑪-奧德里奇公司)。
如第1圖所示，當在短期期間(48小時)背景下培養時，HPDE細胞長成無組織的叢塊或缺乏細胞極化或組織架構的索狀。依據三維培養延長時間(6-8天)，HPDE細胞發生結構組織化，致使會讓人聯想到在低層次PDAC中所發現之外分泌胰腺管或小管構造的分支小管樣結構的形成。共焦圖像分析揭示這些小管由單層極化細胞，其由基底表面標記α6-整聯蛋白(α6-integrin)及粘著連接蛋白β-連環蛋白的偏極表現表示、以及無細胞管腔所組成。
為剖析與此胰腺管分化過程相關的基因表現之變化，總體基因表現譜(global gene expression profiling)實驗在形成於早期培養的HPDE細胞叢以及形成於後期的小管上進行。簡言之，總RNA樣本使用TRIZOL(Invitrogen公司)來萃取，且接著使用RNeasy迷你套組和DNase處理(凱杰(Qiagen))純化。實驗以三重複進行。基因譜分析按照生產商(Affymetrix公司)的指南在Affymetrix人類基因體U133A 2.0 Plus GeneChip平台上進行。雜合強度數據使用GeneChip Operating軟體(Affymetrix公司)處理，且基因基於Affymetrix公司的P/A/M標誌過濾，以保留存在於所述至少一個培養條件內的至少三個重複樣本的基因。過濾標準(P ＜0.01，藉由司徒頓的t 檢定(Student’st test)，倍數變化＞2.0X)被用來選擇在對照組內差異地表現的基因。
如第2A圖顯示，其轉錄量在HPDE細胞之小管形態演發期間具顯著地變化之620個獨特基因的清單係透過基因表現譜實驗被鑑定。作為比較，只有少數基因(18個基因)在PANC-1腫瘤細胞球體的形成過程期間被發現為差異地表現。
如第2B圖顯示，指明胰腺外分泌功能的幾個基因，包括CEL(膽鹽刺激脂酶(bile salt-stimulated lipase))、CA9(碳酸酐酶9(carbonic anhydrase 9))、MUC1(粘蛋白1)、AGR2(前梯度同源物2)、以及MUC20(粘蛋白20)，在小管形態演發期間(白色管柱)係顯著地為上調控(高達26.9倍)，而其表現在腫瘤球形成期間則維持不變。免疫印漬術分析證實在這些胰腺功能標記中小管生成-特異表現的變化(第2C圖)。這些發現提供有力支持針對本組織組成模型係作為有效途徑用以捕捉對外分泌胰腺上皮的結構及功能分化過程具特異性的分子訊號。 實施例2
本實施例基於與胰腺小管分化相關的分子分析描述胰臟癌28個基因之預後模型的鑑定。
由於組織微體系結構(microarchitecture)的破壞是包括PDAC的腺體癌症的標誌特徵之一(Adsay等人，2005年；Gleason，1992年；Rakha等人，2008年；Stamey等人，1999年)，故調查與胰腺上皮小管生成相關的基因表現譜是否可在PDAC中帶出預後訊息。繪製了620個小管生成相關基因至UCSF的數據組)(Collisson等人，2011年)，並根據Cox模型建造「風險分數」來評估病患的總存活率。使用先前描述之經修改的監督方法(Wang等人，2005年)。簡言之，對於每個基因，單變數Cox迴歸分析被使用，以測量基因的表現量(依log2 標準)與病患生存長度之間的相關性。構建病患定群之1000筆自助抽樣(bootstrap)的樣本，並在每個樣本上執行Cox迴歸分析。接著藉由計算1000筆自助抽樣樣本的中位數P 值及中位數Cox係數，來對每個基因分別測定估計的P 值和估計的標準Cox迴歸係數。擇取基因係接著根據所估計的P 值排序，並且透過每次重複地從遞降排序列表的頂部添加一種以上的基因，從排序在前的前三名基因開始，來產生多組基因。然後計算出「風險分數」(方程式1)，以測量針對基因組之病患的死亡風險：
(方程式1)
其中，k 是探針組的探針數，bi 是針對第i 個探針之標準化Cox迴歸係數，而xi 是針對第i 個探針之log2 表現量。
對每個選定探針組的一致性指數(C -指數)係用以在存活分析內評估評估精確度(Pencina和D’Agostino，2004年)。C 指數統計分析，在統計程式語言R (cran.r-​​project.org)使用「survcomp」封包(package)進行。達到最大評估精確度而同時含有最少數目的基因之基因組係被選擇為最佳的預後評估因子。
如第3圖顯示，透過此方法，挑選了28個基因的組別，其在預後評估中之表現當以C -指數來評估時係達到水平頂。
表2顯示28個選取基因的鑑定。
第4圖顯示，基於風險分數(方程式1)，這28個基因印記的表現譜可非常有效地藉由以Kaplan-Meier分析來分層PDAC病患的三個獨立定群之死亡風險，其中包括UCSF定群、JHMI定群、以及NW/NSF定群(對數秩檢定，P £ 0.001)。例如，在UCSF數據組內，高危險群之病患具術後預後不良，總存活期中位數4.9個月，而低風險群之病患表現良好，總存活期中位數21.6個月。第4圖也顯示，根據多變數Cox比例風險分析，這28個基因印記是PDAC的這些病患定群中最有力的存活預後評估因子，且其評估顯著地優於臨床及病理準則，包括年齡、腫瘤病理分級、及腫瘤階段或淋巴結狀態。
如表3所示，多變量Cox迴歸分析表明，這28個基因模型針對PDAC在三個獨立臨床數據組中提供了有力且獨立的預後資訊。
表4顯示28個基因模型在三個獨立數據組中明顯地增進結合的臨床模型之預後精確度，其包含臨床及病理變量(P = 0.000-0.011)，且更優於先前報告的PDAC預後基因印記，包含62個基因的「PDAssigner」以及6個基因的「轉移印記」(Collisson等人，2011年；Stratford等人，2010年)。
實施例3
本範例描述人類PDAC內ASPM及表2所列出的選取標記的預後值。
第5圖顯示表2中所列的最上面12個選取基因標記可單獨地區分PDAC病患為兩群，其展現手術後死亡風險的顯著差異(P = 0.001-0.045以對數秩檢定)。
在表2的28個基因印記組成基因中，基因ASPM 在胰腺小管分化期間展現最優異的轉錄變化。PDAC病患之ASPM的表現與臨床結果相關，且發現其腫瘤表現ASPM 高轉錄量之病患在縱跨三個獨立的病患定群內表現不佳(P =0.001-0.034以對數秩檢定；第6圖)。   實施例4
此範例描述胰臟癌預後的ASPM角色。
為了評估ASPM是否在胰腺腫瘤生成發揮作用，我們進行Oncomine表現分析(https://www.oncomine.com/resource/login.html)，並發現相對於正常胰腺導管ASPM的轉錄量在人類PDAC組織中顯著地增加(第7A圖)(Grutzmann等人，2004年)。調查胰腺上皮細胞株之片塊的ASPM轉錄量，包括AsPC-1、BxPC-3、HPDA、MiaPaCa-2及PANC-1細胞。相對於HPDE細胞，在大部分PDAC細胞內ASPM表現為上調控(第7B圖)。
為了進一步調查ASPM在PDAC細胞內的生物功能，穩定地藉由使用慢病毒媒介的RNA干擾(RNAi)來下調控其在PDAC細胞的表現。根據製造商規程，藉著使用驗證的短髮夾RNA(shRNA)寡核苷酸在慢病毒載體(lentivector) pLKO.1-puro (MISSON shRNA 慢病毒；西格瑪-奧德里奇公司，聖路易斯，密蘇里州)中使持續ASPM剔除(knockdown)得以實現。選取殖株是：ASPM (TRCN0000118905及TRCN0000291125)、以及非標靶控制組(SHC002V)。第8A圖顯示藉由免疫印漬分析所驗證的ASPM剔除量。
如第8B圖顯示，轉移性AsPC-1細胞或原發腫瘤衍生PANC-1細胞中內生ASPM表現的剔除可分別衰減細胞的增殖。
為了獲取在PDAC細胞的遷移能力上ASPM沉默的效應，進行了修飾的波伊登室測定。簡言之，細胞被接種於Transwell小室(Transwell insert)(康寧生命科學公司，圖克斯伯里，麻州 (Corning, Tewksbury, MA))，具PSCs接種於​Transwell的下部隔室。於24小時培養期間後，侵入過濾器的細胞被固定並以DAPI染色。遷移的細胞係使用螢光顯微鏡進行計數。如示於第8C圖，相應於胰腺星狀細胞，ASPM表現靜默係顯著地衰減AsPC-1及PANC-1細胞的細胞遷移。
ASPM在PDAC細胞中生長及遷移的角色引領至其可在活體內促使PDAC進展的可能性。為解釋這種可能性，在控制組或ASPM shRNA轉導的AsPC-1細胞內穩定地表現螢火蟲螢光素酶報導子(reporter)，並且原位(ortho-topically)植入至NOD-SCID小鼠的胰臟尾部。事實上，表現ASPM shRNA的腫瘤相較於控制組腫瘤係顯著地生長的較為緩慢，移植4週之後達到約控制組腫瘤的三分之一大小(第9A圖)。
如示於第9B圖，與抱有控制組腫瘤的小鼠相比，有ASPM缺陷腫瘤的動物展現出顯著延長之存活率，使得這些動物具大於控制組動物平均為37％(16.5天)之存活期(對數秩檢定P ＜0.001)。   實施例5
本實施例描述Wnt訊息路徑中及PDAC細胞內β-連環蛋白蛋白質的穩定性中，ASPM的角色。
為了深入了解PDAC中ASPM致癌作用底下的分子機制，比較控制組與ASPM shRNA轉導的AsPC-1細胞中的轉錄體。藉著使用基因組富集分析(GSEA)調查全基因表現譜，而發現KEGG Wnt訊息路徑在分化基因表現譜(第10A圖)內於基因組中為顯著富集的(P ＜0.001)。
為評估是否ASPM調控Wnt路徑活性，在AsPC-1細胞中表現Wnt報導(轉殖)構造(construct)。細胞根據生產商的規程以Cignal Lenti TCF/LEF報導子(凱杰公司(Qiagen))所轉導。在以重組人類Wnt-3a(250 ng/mL 16小時；R＆D 系統，明尼阿波利斯，明尼蘇達州(R&D Systems, Minneapolis, MN))或載體之細胞刺激後，報導基因活性藉由使用ONE-GloTM 螢光素酶測定系統來測量(Promega，麥迪遜，威斯康辛州((Promega, Madison, WI))。
第10B圖顯示，當Wnt訊息在AsPC-1細胞內藉著正則Wnt配位體Wnt-3a而活化時，ASPM耗乏的細胞展示出劇烈地減弱的Wnt媒介螢光素酶報導基因活性。這個結果證實，ASPM在PDAC細胞內對Wnt訊息路徑活性而言是功能重要的。
β-連環蛋白是Wnt訊息路徑的必要下游媒介，且其活化形式頻繁地累積於PDAC組織中，而促成PDAC維持(Pasca di Magliano等人，2007年；Wang等人，2009年)。為了評估ASPM是否藉由調控β-連環蛋白來調節Wnt訊息路徑活性，β-連環蛋白的表現係藉由西方墨點轉漬分析在控制組細胞或ASPM shRNA轉導細胞內探測。第11A圖顯示ASPM表現沉默造成β-連環蛋白的表現在AsPC-1及PANC-1細胞中皆降低。
為了進一步了解被ASPM沉默誘導的β-連環蛋白媒介細胞之影響的下調控，穩定地在ASPM shRNA轉導的AsPC-1細胞內表現β-連環蛋白的組成性活性S33Y突變(Kolligs等人，1999年)。事實上，於ASPM-缺陷型細胞內β-連環蛋白的功能活化可恢復其增殖及遷移潛能(第11B圖)。   實施例6
本實施例描述胰臟癌幹細胞內ASPM的作用。
先前，研究已經指出ASPM在調控神經幹細胞的作用(Buchman等人，2011；Horvath等人，2006年)。一致地，發現人類癌症中活化之核心幹細胞類基因模組，在與靜默ASPM 相關的基因譜(第12A圖)(Wong等人，2008年)中以基因組富集分析(P ＜0.001)為顯著富集。這一發現，連同Wnt訊號在腸胃道惡性腫瘤的幹細胞樣細胞內被報導的作用(Pasca di Magliano等人，2007年；Vermeulen等人，2010年)，促使我們調查ASPM是否調控胰臟癌幹細胞。
在控制組細胞內或ASPM shRNA轉導的AsPC-1細胞內，測量了共表現CD44及CD24之細胞比例，其在PDAC內含有富集的癌症幹細胞樣細胞(Li等人，2007年)。細胞被分離、抗體標記、並重新懸浮在如先前所述的含有DAPI之HBSS/2％FBS(Li等人，2007年)。使用的抗體包括PE抗-CD44，及Alexa Fluor 647抗-CD24 (BD生物科學事業)。流動式細胞測量術(Flow cytometry)係使用FACSCanto II流式細胞儀(BD生物科學事業)來完成。
如第12B圖及第12C圖所顯示，ASPM基因的剔除導致CD44+ CD24+ 腫瘤細胞群集的大幅減少(57.1％)。ASPM維持癌症幹性(stemness)的能力提供了其在PDAC內致癌作用之另外機制解釋。
為了探討上述發現的功能關聯性，在如前所述的CD44+ CD24+ AsPC-1細胞流式分類上執行腫瘤球測定(Arensman等人，2013年)。根據製造商的說明書(Invitrogen)，細胞藉由FACS (BD FACSAria™III細胞分選儀，BD生物科學事業)被分選，且腫瘤球於Neurobasal Media中保持在超低附著板(ultra-low adherent plate)上(康寧公司，洛厄爾，麻州，美國)。活細胞的相等數目被鋪在超低附著板上以產生初級球體。7天後，該微球體的尺寸被測量且拍攝照片。第12D圖及第12E圖顯示ASPM的剔除大幅降低了腫瘤球的生長及尺寸。共同地，這些數據指示ASPM是胰臟癌幹性的重要調控物。   實施例7
本實施例描述基於ATP9A、ASPM、ACOX3、CDC45L、SLC40A1、AGR2、ATP11C、FAM72A、PLA2G10、MATN2、APITD1及KIF11表現量的PDAC之12個基因預後模型。
試圖減縮PDAC預後印記，並調查是否能使用表2中排序前面之12個基因的表現量，包括ATP9A、ASPM、ACOX3、CDC45L、SLC40A1、AGR2、ATP11C、FAM72A、PLA2G10、MATN2、APITD1及KIF11 (Cox迴歸P 值£ 0.01)，來建立PDAC的有效預後模型。在PDAC病患的獨立定群中基於這些基因的轉錄量來計算風險分數(方程式1)，包括UCSF定群、JHMI定群、及NW/NSF定群。病患根據風險分數與由最大Youden’s指數所決定的臨界值被分級為高風險組或低風險組。
如第13圖所顯示，基於風險分數，ATP9A、ASPM、ACOX3、CDC45L、SLC40A1、AGR2、ATP11C、FAM72A、PLA2G10、MATN2、APITD1及KIF11的轉錄量在各病患定群中藉由Kaplan-Meier分析可非常有效地分級死亡風險(對數秩檢定，P =0.001-0.006)。
如表5顯示，多變量Cox迴歸分析表明，這12個基因模型於三個PDAC數據組之每一個中針對PDAC提供獨立於臨床及病理準則之外有力的預後資訊。
 
表6顯示，根據C -指數值，在三個獨立的數據組中，該12個基因模型的評估精確度優於組合的臨床模型及幾個先前報導的PDAC預後基因印記。
實施例8
本實施例描述基於ATP9A、ASPM、ACOX3、CDC45L、SLC40A1及AGR2表現量的PDAC之六個基因預後模型。
調查是否可用表2中排序前面的六個基因的表現量，包括ATP9A、ASPM、ACOX3、CDC45L、SLC40A1及AGR2(Cox迴歸P 值＜0.005)，來建立PDAC的有效預後模型。在PDAC病患的獨立定群中，包括UCSF定群、JHMI定群、以及NW/NSF定群，基於這些基因的轉錄量來計算風險分數(方程式1)。病患根據風險分數與最大Youden’s指數所決定的臨界值被分級為高風險組或低風險組。
如第14圖所示，基於風險分數，ATP9A、ASPM、ACOX3、CDC45L、SLC40A1及AGR2的染色強度可在每一個病患定群內藉由Kaplan-Meier分析，而非常有效地分級出死亡風險(對數秩檢定，P =0.001-0.021)。
如在表7中，多變量Cox迴歸分析表明，這六個基因模型在三個PDAC數據組之每一個中針對PDAC提供獨立於臨床及病理準則之外有力的預後資訊。
表8顯示，根據C-指數值，在三個獨立的數據組內，六個基因模型的評估精確度優於組合的臨床模型及幾個先前報導的PDAC的預後基因印記。
表8顯示，根據C-指數值，在三個獨立的數據組內，六個基因模型的評估精確度優於組合的臨床模型和幾個先前報導的PDAC的預後基因印記。
實施例9
本實施例描述基於ASPM、ATP9A、及ACOX3表現量之PDAC的三個基因預後模型。
調查是否可用表2中排序前面的三個基因的表現量，包括ASPM、ATP9A、及ACOX3，來建立PDAC的有效預後模型。在PDAC病患的獨立定群中，包括UCSF定群、JHMI定群、以及NW/NSF定群，基於ASPM、ATP9A、及ACOX3轉錄量來計算風險分數(方程式1)。病患根據風險分數與最大Youden’s指數所決定的臨界值被分級為高風險或低風險組。
如第15圖，基於風險分數，ASPM、ATP9A、及ACOX3轉錄量可藉由在每一個病患定群內以Kaplan-Meier分析而有效地分級死亡風險(對數秩檢定，P =0.004-0.041)。
如表9所示，多變量Cox迴歸分析表明，這三個基因模型在三個數據組的每一個中針對PDAC提供獨立於臨床及病理準則之外有力的預後資訊。
表9，在PDAC病患之獨立定群內藉由三個基因模型及臨床病理
表10顯示，根據C-指數值，在三個PDAC數據組的每一個中，三個基因模型的評估精確度優於組合的臨床模型，包含年齡、腫瘤分級、及臨床階段。
實施例10
本實施例係基於實施例2中所示的28個基因預後模型，描述針對胰臟癌病患的評估復發率及期望無復發存活的計算。
如實施例3中所述，可以基於擇取基因組藉由計算風險分數(方程式1)來測量胰臟癌之給定病患手術後復發的風險。對於風險分數已知的病患，在時間t時所述病患的復發風險率可透過Cox迴歸來估計，且危險率可表示為：h (t )=h 0 (t )exp(bx )，其中x 是風險分數值，b 是迴歸係數，而h 0 (t )為底線風險函數。在時間t時之評估存活率可得以估計，根據：
S (t ) =S 0 (t )exp(bx ) (方程式2)
其中 是底線風險函數。計算可藉由商業軟體像是SPSS軟體(IBM)等進行。此外，中位數存活時間可藉由方程式2依設定S (t)= 0.5來解出。
例如，在UCSF定群內給定病患的風險分數可基於所述受試者的28個基因標記的轉錄本豐度量來計算，如下：
(方程式3)
估計的Cox迴歸是 )。存活(率)函數可被表示為：
(方程式4)
估計的 值顯示在表11。
表12顯示從UCSF定群中挑選的四個PDAC病患的觀察及評估存活率
實施例11
本範例描述基於實施例8所示之六個基因預後模型之胰臟癌病患的評估復發率及期望無復發存活率之計算。
在實施例10中相同原則可使用以如實施例8中所示的六個基因型，來評估UCSF定群內病患的復發率及期望無復發存活率。根據風險分數(方程式1)，基於所述病患腫瘤之ATP9A、ASPM、ACOX3、CDC45L、SLC40A1、及AGR2以H分數表示的染色強度，可使用下列方程式計算UCSF定群內的給定病患的風險分數：
)  (方程式5)
估計Cox迴歸是 。存活函數可表示為：
(方程式6)
表13顯示估計的 值：
表14顯示選自UCSF定群的四個PDAC病患的觀察及評估存活率。
實施例12
本實施例描述人類乳癌內ASPM的表現及預後值
如第16圖顯示，藉由從Oncomine (www.oncomine.org)查詢公開的腫瘤轉錄體數據組，在乳癌病患的幾個大定群中，揭露ASPM的轉錄量相對於正常乳房組織在人類乳癌的不同病理亞型中會顯著增加。為了研究上調控的ASPM表現與乳癌病患的臨床預後是否相關，查詢源自乳癌病患的幾個大定群(總共n=2416)所衍生之公開乳癌轉錄體數據組之ASPM表現(Curtis等人，2012年；Pawitan等人，2005年；Wang等人，2005)。使ASPM表現量與這些病患的臨床結果相互關聯(總存活率或無復發存活)。
如第17圖中所示，當Curtis定群之病患(Curtis等人，2012年)根據ASPM表現四分位而分組時，表現較高ASPM 表現量的腫瘤之病患具顯著地較短的總存活率，相較於表現中等或較低ASPM量的腫瘤而言(對數秩檢定，P ＜0.0001)。
相同地，當Pawitan定群(Pawitan等人，2005年)的病患根據ASPM表現四分位被分組時，表現較高ASPM 表現量的腫瘤的病患具顯著地較短的整體或無復發存活率，相較於表現中等或較低ASPM量的腫瘤而言(對數秩檢定，P ＜0.001)。同樣地，ASPM表現量與存活率之間的逆相關性在其他乳癌病患的定群內被觀察到(Wang等人，2005)，具對數秩P 值小於0.001。
如表15所示，多變量Cox迴歸分析表明，相對於病理腫瘤分級及乳癌分子亞型，ASPM轉錄量對於術後疾病復發之風險比例達到4.428(P =0.002)而言，提供了最有力且獨立的預後資訊。
如表16顯示，多變量Cox迴歸分析表明，ASPM轉錄量針對乳癌提供獨立於病理準則及乳癌分子亞型之外最有力的預後資訊(風險比例=3.669；P =0.011)。
實施例13
本實施例描述ASPM在乳癌增殖、遷移、Wnt活性及幹性上之角色，以及ASPM抑制的治療效應。
如實施例12所示鑑於ASPM是乳癌內強力及穩健的不良預後因素，評估ASPM是否亦在乳癌細胞的惡性行為及其Wnt活性中扮演一定角色。為此，藉由使用如實施例4中所述慢病毒媒介的RNAi，而穩定地下調控乳癌細胞內ASPM的表現。第18A圖顯示透過免疫印漬分析所檢驗的ASPM剔除量。第18B圖顯示，類似於PDAC細胞中的發現，轉移性乳癌MDA-MB-436或原發腫瘤衍生HCC-1954細胞中內生ASPM表現的剔除可分別衰減細胞增殖。
為了獲得ASPM靜默對乳癌細胞在遷移能力上的效應，進行了如實施例4中所述之改良波伊登室測定法。如第18C圖所示，相較於乳房癌相關的纖維母細胞，ASPM表現靜默會顯著地衰減MDA-MB-436細胞以及HCC-1954細胞的細胞遷移。
為了進一步評估ASPM是否調控乳癌細胞中Wnt路徑的活性，表現Wnt報導子構建(construct)於MDA-MB-436細胞及HCC-1954細胞兩者內，如實施例4所述。第18D圖顯示當在MDA-MB-436細胞或HCC-1954細胞內使Wnt訊號藉由Wnt-3a所活化時，靜默ASPM表現之細胞展現出大幅地減弱的Wnt媒介螢光素酶報導活性。這個結果證實，ASPM在乳癌細胞之Wnt訊號路徑活性中亦為功能重要的。
乳癌細胞中ASPM亦支持增殖、遷移及Wnt活性的發現促使我們推測，其可能也在乳癌之幹細胞樣細胞調控中起關鍵作用。為此，在控制組或ASPM shRNA轉導的乳癌MDA-MB-436細胞內測定CD44+ CD24-/low 表現型之細胞的比例，其中包含乳癌中富集的癌幹細胞樣細胞(Al-Hajj等人，2003年)。細胞被分離、抗體標籤並重新懸浮在如先前所述含DAPI之HBSS/2％的FBS(Li等人，2007年)中。所使用的抗體包括PE抗-CD44、及Alexa Fluor 647抗-CD24 (BD生命科學事業)。流動式細胞測量術使用FACSCanto II流式細胞儀(BD生命科學事業)進行。如第19A圖及第19B圖所示，ASPM的剔除致使CD44+ CD24-/low 腫瘤細胞群集的大幅減少(平均48.5％)。
為了探索上述發現的功能相關性，在分選的CD44+ CD24-/low MDA-MB-436細胞中執行腫瘤球測定。CD44hi CD24low 及CD44hi CD24hi 細胞透過FACS被分選(BD FACSAria™III細胞分選儀，BD生命科學事業)，如先前所述(Ginestier等人，2007年)。簡言之，根據製造商的說明書(幹細胞技術有限公司(StemCell Technologies))，腫瘤球於MammoCult Media內被保持在超低附著板(康寧公司，洛厄爾，麻州，美國)(Corning Inc., Lowell, MA, USA)上。活細胞的相等數目被鋪在超低附著板上以產生初級球體。7天後，該微球體的尺寸被測量並拍攝照片。第19C圖及第19D圖清楚地顯示ASPM剔除會大幅降低腫瘤球的生長及尺寸。共同地，這些數據提示ASPM是乳癌幹性的重要調控物。
ASPM在乳癌生長、遷移及幹性的作用可能提高其在活體內促進乳癌發展的可能性。為了解開這種可能性，在控制組或ASPM shRNA轉導的乳癌細胞MDA-MB-436細胞內穩定地表現螢火蟲螢光素酶報導(基因)，並且原位植入到NOD-SCID小鼠的乳腺脂肪墊。如第20圖所示，移植後超過4週期間，ASPM的靜默完全癱瘓了活體內乳癌細胞用以初始腫瘤生長的能力，然而抱有控制組shRNA腫瘤之動物則展現顯著生長。 實施例14
本實施例描述ASPM在攝護腺癌增殖及遷移中的角色以及ASPM抑制的治療效應。
鑑於ASPM在PDAC及乳癌中是細胞增殖、遷移、幹性及腫瘤進展的關鍵調節物，評估ASPM是否在攝護腺癌細胞，腺源性癌症的另一種類型，的惡性行為中亦扮演一定角色。第21A圖，藉由在一系列正常或惡性攝護腺組織中測量ASPM的轉錄量，發現相比於正常組織，在攝護腺癌中ASPM顯著地為上調控。而且，藉著從Oncomine(www.oncomine.org)查詢公開的腫瘤轉錄體數據組，發現相較於原發腫瘤在轉移性攝護腺癌中ASPM轉錄量係顯著地增加。這些臨床相關性分析支持ASPM在攝護腺癌的初始及發展中扮演重要角色的可能性。
為了解出ASPM在攝護腺癌中的功能重要性，如實施例4中所述，穩定地藉著使用慢病毒媒介RNAi下調控攝護腺癌PC-3細胞內ASPM的表現。第22A圖顯示以免疫印漬分析所驗證的ASPM剔除量。第22B圖顯示出類似於PDAC細胞內的發現，在PC-3細胞中內生性ASPM表現之剔除可分別衰減細胞的增殖。
為了獲得在攝護腺癌細胞的遷移能力上ASPM靜默的效應，進行改良波伊登室測定法，如實施例4中所述。如第22C圖所示，相對於攝護腺基質WPMY-1細胞(美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection))，ASPM表現靜默會顯著地衰減PC-3細胞的細胞遷移。
為了評估ASPM是否調節Wnt路徑活性，在攝護腺癌PC-3細胞中表現Wnt報導基因建構(construct)。根據製造商的規程，細胞以Cignal Lenti TCF/LEF報導基因(凱杰公司)轉導。隨後以重組人類Wnt-3a(250 ng/mL 16小時，R＆D系統，明尼阿波利斯，明尼蘇達州)或載體之細胞進行刺激，報導基因活性係藉由使用ONE-GloTM 螢光素酶檢測系統(普洛麥格公司(Promega)，麥迪遜，威斯康辛州)來測量。如第22D圖所示，當Wnt訊號在PC-3細胞中透過正則Wnt配位體Wnt-3a而活化時，ASPM耗乏細胞展示大幅減弱的Wnt媒介螢光素酶報導基因活性。這個結果證實，ASPM在攝護腺癌細胞內對Wnt訊息路徑活性是功能重要的。
為了進一步評估ASPM是否也在攝護腺癌內對幹細胞樣細胞的調控上扮演關鍵角色，在控制組shRNA或ASPM shRNA轉導的攝護腺癌PC-3細胞內，測量有CD133+ CD44+ 表現型的細胞之比例，其中包含乳癌中富集之癌症幹細胞樣細胞(Dubrovska等人，2009年)。細胞被分離、抗體標籤並重新懸浮在含DAPI的HBSS/2％FBS內，如先前所述(Li等人，2007年)。所使用的抗體包括APC-抗-CD133以及PE-抗-CD44(BD生命科學事業)。流式細胞測量術使用FACSCanto II流式細胞儀(BD生命科學事業)來進行。如第23圖所示，ASPM的剔除致使CD133+ CD44+ 腫瘤細胞群集的大幅減少(平均51.7％)，表示ASPM確實促進了攝護腺癌幹性。   參考文獻
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本說明書按照說明書中所引用的參考文獻的教示而極盡徹底地理解。本說明書中的實施例提供了本發明實施例的說明並且不應被解釋為用於限制本發明的範疇。本領域技術人員得以輕易認知的是，許多其他實施例係被本發明所包括。本文中任何參考文獻的引用均非認許這些參考文獻為本發明之先前技術。
除非另有說明，否則在本說明書中包括發明申請專利範圍所使用之所有表示成分的數量、反應條件等等的數字等，都應當被理解為近似值，且可取決於本發明所需求的理想性質而變動。在最低限度中，且並非試圖對發明申請專利範圍的範疇限制教示的應用下，每個數值參數應解讀成按照有效位數的數目及普通的四捨五入方法。在本說明書中具有不同有效位數量的一系列數字的敘述不應被解釋為意旨為，具較少給定有效位數之數字與具較多給定有效位數之數字具有相同的精確度。
用詞「一」或「一個」之使用，當與術語「包括」結合用於發明專利申請範圍及/或說明書內時，可表示「一個」，且也與「一或多個」、「至少一個」及「一個以上」的含義一致。除非明確指出僅指稱替代品或替代品是相互排斥的，否則在發明專利申請範圍中所使用的術語「或」係用於意指「及/或」，然而本揭露支持僅指稱替代品及「及/或」之定義。
除非另有說明，否則前綴於一系列元件之術語「至少之一」應當被理解為指稱該系列中的每個元件。本領域之技術人員將認知，或能夠使用不超過常規的實驗來確認許多等同於本文描述的本發明具體實施例之等效物。這樣的等效物係旨在被下列發明申請專利範圍所涵蓋。
除非另有定義，否則本文所使用的所有技術及科學術語具有如同一般由本發明所屬技術領域普通技術人員所通常理解之相同含義。雖然任何類似或等同於本文描述的方法及材料可用於本發明的實踐或測試，然而優選方法及材料已於此時描述。
本文所討論的這些出版物只提供早於本發明申請日之揭露內容。本文中沒有任何內容應被理解為本發明在憑藉優先權發明下不具早於此類出版物之權利的許可。此外，所提供的出版物日期可與實際出版日期有所差異，其可能需要個別地確認。
本發明的其他實施例將透過考量說明書及本文所揭露發明之實踐，而對本領域技術人員而言是顯而易見的。其旨在認知說明書及實施例僅為例示性，落於由下列發明申請專利範圍所指示的本發明之真正範疇及精神內。
第1圖包含關於使用三維培養模式的胰腺上皮細胞組織結構的幾個圖表。顯示為在三維重建基底膜基質內，HPDE細胞叢(培養48小時形成；i 、ii 、v 、vi )及小管(培養6天形成；iii 、iv 、vii 、viii )的代表共焦圖像。這些結構以基底表面標記a6-整合素(a6-integrin)(紅色)及黏著連接標記(adheren junction marker) β-連環蛋白(β-catenin)(綠色)作免疫染色。細胞核以DAPI(藍色)複染。星號：無細胞管腔(cell-free lumen)。小圖：低層級人類PDAC組織的代表性組織切片(H & E；放大倍率400×)。比例尺，100 mm。
第2圖包含相關於關於HPDE小管形態發生及結構分化的分子變化之幾個圖表。(A)顯示在HPDE小管形態發生期間620個差異地表現的基因(differentially expressed genes, DEGs)的表現模式。也顯示在PANC-1細胞叢或球體內的表現模式。熱圖描述在對數空間(log space)中以培養基為基準的基因表現之高度(紅色)及低度(綠色)相對量。(B)顯示藉著qRT-PCR分析測量在CEL 、CA9 、MUC1 、AGR2 、及MUC20 的轉錄量之倍數變化。(C)顯示在HPDE或PANC-1類器官(organoid)內的脂酶、碳酸酐酶9(carbonic anhydrase 9)或黏蛋白-1 (mucin-1)的西方墨點轉漬法分析。β-微管蛋白(β-tubulin)被含入以作為內參(loading control)。
第3圖顯示具最高一致性指數(concordance index,C -index)之 28個基因基因組的挑選，用以對UCSF定群(cohort)內PDAC病患的手術後存活率作評估。在HPDE小管形態發生期間在620個差異地表現的基因組別內的基因根據Cox迴歸P值被排序排名。基因的多組藉由從遞降排序清單的頂部每次重複地加入一或多個基因，而從排序於前的前三名基因開始產生。對於選取的各個探針組，C -index係用於在存活分析中評估評估準確度。C-index統計分析使用統計程式語言R內的survcomp封包(cran.r-project.org)而進行。
第4圖顯示比較局部PDAC病患的三個獨立定群(UCSF定群、JHMI定群、及NW/NSU定群)中術後存活之Kaplan-Meier存活曲線。病患被分級成兩群，基於藉著範例2所述的28個基因預後印記所計算的復發評估風險(風險分數；RS)。P 值使用對數秩檢定(log-rank test)來計算。右邊顯示的是根據Cox比例風險分析之RS及臨床病理標準的死亡風險比例(具95%信賴區間)。*，P ＜ 0.05；**，P ＜ 0.01。
第5圖顯示比較UCSF定群中PDAC病患的總存活率之Kaplan-Meier存活曲線。病患基於表2所選取之排序前面(Cox迴歸P ＜0.01)的基因標記之轉錄豐度等級(transcript abundance level)而被分為兩群。相對於結果為群組之間最佳區辨的截止值(Cut-off value)係根據最大約登指數(Youden’s index)來判定。P 值使用對數秩檢定來計算。
第6圖顯示比較UCSF、JHMI、及NW/NSU定群中PDAC病患的總存活率之Kaplan-Meier存活曲線。病患基於ASPM的轉錄豐度等級被分為兩群。相對於結果為群組之間最佳區辨的截止值係根據最大約登指數來判定。P 值使用對數秩檢定被計算。
第7圖包含相關於胰臟組織及PDAC細胞株中之ASPM表現量的幾個圖表。(A)顯示使用Oncomine (腫瘤微陣列資料庫)(https://www.oncomine.com/resource/login.html)所查詢之顯微解剖正常胰腺管內(n=11)及PDAC組織內(n=11)ASPM 相對轉錄量的盒形圖。*，P ＜ 0.05。(B)顯示藉著qRT-PCR分析所計算之HPDE細胞及多種PDAC細胞株內的ASPM 轉錄量。數據以平均值±SEM表示。n = 3。**，P ＜ 0.01；***，P ＜ 0.001。
第8圖包含相關於PDAC細胞增生及移行之ASPM功能重要性之幾個圖表。(A)顯示藉由西方墨點轉漬分析AsPC-1 或PANC-1細胞裡ASPM shRNA媒介的靜默效應。β-微管蛋白被含入以作為內參。(B)顯示控制組的生長速率或ASPM shRNA轉導的AsPC-1或PANC-1細胞的生長速率。n = 3。*，P ＜ 0.05；***，P ＜ 0.001對控制組shRNA細胞。(C)顯示弱化AsPC-1或PANC-1細胞遷移能力的ASPM表現之靜默，針對於修飾博伊登室測定(Boyden chamber assay)的胰臟星狀細胞。n = 3。*，P ＜ 0.05；***，P ＜ 0.001。
第9圖包含關於活體內胰臟癌侵襲性的ASPM角色的幾個圖表。(A)代表在胰臟尾端以ffLuc標記植入的控制組或ASPM shRNA轉導的AsPC-1細胞在細胞植入後指定時間點之NOD-SCID小鼠的生物發光圖像(bioluminescence images, BLI)。(B)顯示為作為時間函數以BLI標準化光子計數所量化的腫瘤容積。數據以平均數±SEM表示。n = 6。*，P ＜ 0.05；**，P ＜ 0.01。(C)顯示以控制shRNA轉導之AsPC-1細胞或ASPM shRNA轉導細胞植入的小鼠在細胞植入後六周所測量之腹水量。n = 3。**，P ＜ 0.01。(D)顯示作為時間函數之(A)所述的小鼠存活百分比。P 值使用對數秩檢定來計算。
第10圖包含關於Wnt訊息路徑的ASPM角色的幾個圖表。(A)顯示基因組富集分析(Gene Set Enrichment Analysis)的富集圖，其中顯示KEGG Wnt訊息路徑對於控制組shRNA轉導的AsPC-1細胞而言在ASPM shRNA的分化基因表現譜中為富集的。(B)顯示控制組或ASPM shRNA轉導AsPC-1細胞內倍數之Wnt媒介螢光素酶表現。相對於以Wnt-3a或載體(vehicle)處理細胞16小時後的基底活性來測量細胞螢光素酶活性。數據以平均數±SEM表示。n = 3。***，P ＜ 0.001。
第11圖包含關於調控β-連環蛋白的ASPM角色的幾個圖表。(A)顯示在控制組-或ASPM shRNA轉導的AsPC-1或PANC-1細胞內的β-連環蛋白之蛋白質豐度的西方墨點轉漬分析。β-微管蛋白被使用以作為內參。(B)顯示以控制組或有無S33Y β-連環蛋白突變共表現的ASPM shRNA所轉導之AsPC-1細胞在群集倍增速率(左)及遷移(右)上的倍數變化。n = 3。**，P ＜ 0.05；***，P ＜ 0.001對控制組shRNA細胞。
第12圖包含關於胰臟癌幹細胞內ASPM角色的幾個圖表。(A)顯示基因組富集分析，其顯示相對於控制組AsPC-1細胞之ASPM缺失的分化基因表現譜中，核心胚胎類幹細胞模組基因組(core embryonic stem cell-like module gene set)的顯著富集。(B)顯示代表性圖式，其顯示表現ASPM shRNA或控制組shRNA的AsPC-1細胞之CD44及CD24染色的模式，依癌細胞百分比顯示之框圍CD44+ CD24+ 細胞群集的頻率。(C)顯示三個獨立測量的CD44+ CD24+ 細胞群集的平均數(±SEM)百分比。*，P ＜ 0.05。(D)顯示以控制組-或ASPM-shRNA-轉導的CD44+ CD24low/- AsPC-1細胞所形成的腫瘤球(tumorshpere)的代表相對比圖像。比例尺，100μm。(E)顯示(D)內的腫瘤球直徑之長條圖。**，P ＜ 0.01。
第13圖顯示比較局部PDAC病患於三個獨立定群(UCSF定群、JHMI定群、及NW/NSU定群)中術後存活之Kaplan-Meier存活曲線。病患基於評估的復發風險(風險分數；RS)被分級成兩組，復發風險以範例7所述的12-基因(ATP9A、ASPM、ACOX3、CDC45L、SLC40A1、AGR2、ATP11C、FAM72A、PLA2G10、MATN2、APITD1、及KIF11)預後印記來計算。P 值使用對數秩檢定來計算。
第14圖顯示比較局部PDAC病患在三個獨立定群(UCSF定群、JHMI定群、和NW/NSU定群)中術後存活之Kaplan-Meier存活曲線。病患基於評估的復發風險(風險分數；RS)被分級成兩組，復發風險以範例8所述的六-基因(ASPM、ATP9A、ACOX3、CDC45L、SLC40A1、及AGR2)預後印記來計算。P 值使用對數秩檢定來計算。
第15圖顯示比較局部PDAC病患在三個獨立定群(UCSF定群、JHMI定群、及NW/NSU定群)中術後存活之Kaplan-Meier存活曲線。病患基於評估的復發風險(風險分數；RS)被分級成兩組，復發風險以範例9所述的三-基因(ASPM、ATP9A、及ACOX3)預後印記來計算。P 值使用對數秩檢定來計算。
第16圖顯示從Oncomine(www.oncomine.org)所查詢的多重乳癌轉錄體數據組中的ASPM轉錄量(Curtis 等人，2012年；Ma 等人，2009年；Richardson等人，2006年)。***，P ＜ 0.001對一般組。DCIS，導管原位癌(ductal carcinoma in situ)；IDC，浸潤性導管癌(invasive ductal carcinoma)；ILC，浸潤性小葉癌(invasive lobular carcinoma)；TCGA，癌症基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas)。
第17圖顯示比較乳癌病患之不同大型定群內完全或免於復發存活之Kaplan-Meier存活曲線(Curtis 等人，2012； Pawitan等人，2005；Wang等人，2005))。病患根據ASPM轉錄豐度被分組成四分。對數秩檢定係用於計算P 值。
第18圖包含關於乳癌細胞增生、細胞遷移、及Wnt活性的ASPM功能重要性的幾個圖表。(A)顯示藉由西方墨點轉漬分析在乳癌HCC-1954細胞中ASPM shRNA媒介靜默的效應。β-微管蛋白被包含以作為內參。(B)顯示以控制組或ASPM shRNA-轉導的MDA-MD-436或HCC-1954細胞的生長速率。n = 3。**，P ＜ 0.01；***，P ＜ 0.001對控制組shRNA細胞。(C)顯示於修飾波伊登室測定中針對初級乳房腫瘤相關纖維母細胞會衰減MDA-MD-436或HCC-1954細胞移動能力之ASPM表現靜默。n = 3。***，P ＜ 0.001。(D)顯示控制組-或ASPM-shRNA-轉導的MDA-MD-436或HCC-1954細胞之Wnt-媒介螢光素酶表現。數據以平均值±SEM(n = 3)表示。*，P ＜ 0.05對控制shRNA。
第19圖包含關於在乳房癌幹細胞內ASPM角色的幾個圖表。(A)顯示代表圖式，代表圖式顯示表現ASPM shRNA或控制shRNA的MDA-MB-436的CD44及CD24染色的模式，依癌細胞百分比顯示框圍的CD44+ CD24-low/ 細胞群集的頻率。(B)顯示三個獨立測量的CD44+ CD24-/low 細胞群集的平均數(±SEM)百分比。***，P ＜ 0.001。(C)顯示藉著控制組-或ASPM-shRNA-轉導CD44+ CD24low/- MDA-MB-436細胞所形成的腫瘤球的代表相位對比圖像。比例尺，100 μm。(D)，長條圖顯示(C)的腫瘤球直徑。***，P ＜ 0.001。
第20圖包含關於活體內乳房腫瘤生成的ASPM角色的幾個圖表。(A)顯示以螢火蟲螢光素酶標記控制組或ASPM shRNA-轉導乳癌MDA-MB-436細胞植入乳腺脂肪墊之NOD-SCID小鼠在細胞植入後指定時間點的代表性生物發光圖像(BLI)。(B)顯示作為時間函數以BLI標準化光子計量所定量的腫瘤容積。數據以平均數±SEM(在各組n=6)表示。*，P ＜ 0.05；***，P ＜ 0.001對控制組shRNA。
第21圖包含關於人類攝護腺癌組織內ASPM表現量的幾個圖表。(A)顯示人類組織cDNA陣列裡(進階生物科技，Origene)藉由定量逆轉錄聚合酶連鎖反應分析所計算之正常攝護腺(n=9)及攝護腺癌組織(n=73)之ASPM轉錄量。GS，格里森分數。***，P ＜ 0.001對正常組織。(B)顯示自Oncomine(www.oncomine.org)所查詢的多重轉錄體數據組內初始及轉移攝護腺癌的ASPM轉錄量(Chandran 等人，2007；Grasso等人，2012；Varambally等人，2005)。**，P ＜ 0.01；***，P ＜ 0.001對初始攝護腺癌。
第22圖包含關於攝護腺癌增生、遷移及Wnt活性之ASPM功能重要性的幾個圖表。(A)顯示藉著西方墨點轉漬分析在攝護腺癌PC-3細胞內ASPM shRNA-媒介的靜默效應。β-微管蛋白被包含以作為內參。(B)顯示控制組或ASPM shRNA-轉導的PC-3細胞的生長速率。n = 3。**，P ＜ 0.01；***，P ＜ 0.001對控制組shRNA細胞。(C)顯示在修飾波伊登室測定內針對含有生長培養基的血清衰減PC-3遷移能力之靜默ASPM表現。n = 3。***，P ＜ 0.001。(D)顯示於控制組-或ASPM-shRNA-轉導的PC-3細胞內Wnt-媒介的螢光素酶表現。數據以平均值±SEM表示(n =3)。***，P ＜ 0.001對控制組shRNA。
第23圖包含關於攝護腺癌幹細胞內的ASPM角色的幾個圖表。(A)顯示代表圖式，代表圖式顯示表現ASPM shRNA或控制組shRNA的PC-3細胞之CD133及CD44染色的模式，依癌細胞百分比顯示框圍的CD133+ CD44+ 細胞群集的頻率。(B)顯示三個獨立測量的CD133+ CD44+ 細胞群集的平均數(±SEM)百分比。**，P ＜ 0.01對控制組shRNA。

Claims (15)

  1. 一種評估具有腺體癌症的受試者的臨床預後的方法，其包含： (a)在來自受試者的一或多個腫瘤樣本裡取得一或多個標記基因的一轉錄表現量或一蛋白質表現量的計量，其中該一或多個標記基因係選自ASPM、ATP9A、ACOX3、CDC45L、SLC40A1、AGR2、及表2所示者；以及 (c)將該一或多個腫瘤樣本裡的該一或多個標記基因的表現量與一或多個臨界參考基準進行比較。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其進一步包含基於(c)步驟的比較，將腫瘤分配為一臨床預後組的步驟。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項之任一項所述之方法，其進一步包含用於抑制ASPM的治療有效量之試劑的給藥。
  4. 如申請專利範圍第1項至第3項之任一項所述之方法，其中測定該轉錄表現量包含聚合酶連鎖反應、北方印漬術、核糖核酸酶保護測定、或互補去氧核糖核酸(cDNA)微陣列分析或寡核苷酸微陣列分析；且 測定該蛋白質表現量包含免疫印漬術、免疫組織化學法、蛋白質陣列、或二維蛋白質電泳及質譜分析。
  5. 如申請專利範圍第1項至第4項之任一項所述之方法，其中臨床預後包含： (a)疾病診斷或手術的日期與疾病復發或轉移的日期之間的時間間隔； (b)疾病診斷或手術的日期與受試者死亡的日期之間的時間間隔；或 (c)一或多個可測量腫瘤病灶在數目、大小、或體積上的變化。
  6. 如申請專利範圍第1項至第5項之任一項所述之方法，其中測定該臨界參考基準包含： (a)自有胰臟癌且可取得臨床預後數據的大量受試者取得一或多個腫瘤樣本； (b)測定該一或多個腫瘤樣本裡的該一或多個標記基因的表現量； (c)根據該一或多個腫瘤樣本或其組合的表現量，依遞降次序排序大量受試者；以及 (d)測定該一或多個臨界參考基準，其中腫瘤具有高於該一或多個臨界參考基準的該一或多個標記基因的表現量的受試者，相較於具有低於該一或多個臨界參考基準的表現量的受試者，係評估為具有臨床預後不良或疾病進展的較高風險或較低風險。
  7. 一種評估具有腺體癌症的受試者的臨床預後的方法，其包含： (a)自患有腺體癌症的受試者取得一或多個腫瘤樣本； (b)測定ASPM的一轉錄表現量或一蛋白質表現量； (c)將該一或多個腫瘤樣本裡的ASPM的表現量與一或多個臨界參考基準進行比較；以及 (d)基於(c)的比較，將腫瘤分配為一臨床預後組。
  8. 一種在個體上治療腺體癌症的方法，該方法包含抑制腺體癌症裡ASPM的表現或活性。
  9. 如申請專利範圍第7項至第8項之任一項所述之方法，其中腺體癌症為乳癌、攝護腺癌、結腸癌、胃癌、或任何種類源自人類正常腺體的惡性腫瘤。
  10. 如申請專利範圍第8項至第9項之任一項所述之方法，其中該方法包含施予個體互補至ASPM mRNA的核酸，包括小干擾RNA、小髮夾RNA、微小RNA、或反義寡核苷酸。
  11. 如申請專利範圍第8項至第10項之任一項所述之方法，其中該方法進一步包含施予個體互補至ASPM mRNA的核酸，其具有足以抑制ASPM增加一Wnt訊息路徑的活性的能力。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之方法，其中該Wnt訊息路徑的活性係藉由β-連環蛋白量，或T細胞因子(TCF)或淋巴增強子結合因子1(LEF1)之活性來測量。
  13. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中該方法進一步包含施予個體互補至ASPM mRNA的核酸，其具有足以抑制ASPM增進或維持癌症幹細胞群集之能力或腫瘤起始或促進轉移的能力。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之方法，其中癌症幹細胞係以一或多個標記定義，包含CD44、CD24、人上皮特異性抗原(ESA)、CD133、趨化素(C-X-C功能域)受體4 (CXCR4)、乙醛脫氫酶(ALDH)或上述的任何組合。
  15. 一種用於測定ASPM量以評估胰臟癌或腺體癌症的風險、存在、階段或嚴重度之套組，其中該套組包含： 一試劑，能夠偵測受試者的生物樣本及一測試基質的ASPM量；以及 一選配說明書，用於接觸該試劑或該測試基質與受試者的樣本，並用於評估說明受試者對胰臟癌或腺體癌症之風險、易感性、或預後，其中增加的ASPM量表示增加的風險、增加的易感性或預後不良性。
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